DE60207036T2

DE60207036T2 - Detektionsverfahren für Escherichia coli

Info

Publication number: DE60207036T2
Application number: DE60207036T
Authority: DE
Inventors: Lu-Yieng Industrial Park Liu; Te-Yu Industrial Park Chung; Harn-Jing Industrial Park Terng
Original assignee: DR Chip Biotechnology Inc
Current assignee: DR Chip Biotechnology Inc
Priority date: 2001-12-19
Filing date: 2002-08-22
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2022-08-23
Also published as: DE60207036D1; EP1321530B9; US7041811B2; US20030113731A1; EP1321530A3; EP1321530B1; ATE308625T1; EP1321530A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Escherichia coli in einer Probe, welches umfasst, Amplifizieren der in einer Probe befindlichen Nukleinsäure mit einem Satz von hierin beschriebenen Nukleinsäuren und Erfassen eines Amplifikationsprodukts, wobei die Bildung eines Amplifikationsprodukts einen Hinweis auf die Anwesenheit von Escherichia coli in der Probe gibt. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls den Satz von Nukleinsäuren, der bei der selektiven Amplifikation von E. coli DNA nützlich ist.
Herkömmliche Verfahren zum Erfassen von Mikroorganismen in einer Probe beruhen auf zeitaufwendigem Wachstum in Kulturmedien, gefolgt durch Isolation und biochemischer oder serologischer Identifikation. Der gesamte Vorgang benötigt gewöhnlich 24–48 Stunden. Zahlreiche Verfahren für einen schnellen Nachweis von Mikroorganismen wurden kürzlich entwickelt, einschließlich miniaturisierter biochemischer Analysen, Antikörper- und DNA basierende Tests und modifizierter herkömmlicher Assays. Einer der Nachteile der gegenwärtig verfügbaren Verfahren besteht jedoch darin, dass die meisten von jenen nicht eine Vielfalt verschiedener E. coli-Stämme erfassen können, sondern lediglich auf gewisse spezifische konzentriert sind.
Der Nachweis des Mikroorganismus Escherichia coli in Wasser oder Nahrung wurde als Hinweis auf die mögliche Anwesenheit von enterischen bzw. den Darm besiedelnden Pathogenen angesehen. Tatsächlich sind bestimmte E. coli-Stämme selbst pathogen. Eine schnelle und genaue Identifikation von E. coli erscheint somit für die öffentliche Gesundheitspflege wichtig.
Folglich besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung im Bereitstellen eines schnellen und verlässlichen Verfahrens zum Nachweisen von E. coli in einer Probe, das die Nachteile des Standes der Technik beseitigt.
Diese Aufgabe wurde durch Bereitstellen spezifischer Nukleinsäuresequenzen zum Nachweis von Escherichia coli gelöst. Folglich weist, gemäß einer Ausführungsform, die vorliegende Erfindung einen Satz Nukleinsäuren auf, der eine erste Nukleinsäure, die die SEQ ID No. 1 oder 3 umfasst, und eine zweite Nukleinsäure, die die SEQ ID No. 2 oder 4 umfasst, wobei jede Nukleinsäure eine Länge von 18–40 Nukleotiden aufweist. Jene Nukleinsäuren können als PCR-Primer zum Nachweis von E. coli verwendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erste Nukleinsäure SEQ ID No. 1, die zweite Nukleinsäure SEQ ID No. 2 und jede Nukleinsäure weist eine Länge von 18–40 (bspw. 18–30) Nukleotiden auf. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die erste Nukleinsäure SEQ ID No. 3, die zweite Nukleinsäure SEQ ID No. 4 und jede Nukleinsäure weist eine Länge von 24–40 (bspw. 24–32) Nukleotiden auf.
Gemäß noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform liegen die Nukleinsäuren wie durch SEQ ID No. 1 bis 4 festgelegt vor.
In einer anderen Ausführungsform weist die Erfindung eine Nukleinsäure auf, die durch Amplifikation einer Nukleinsäurematrize von Escherichia coli mit einem stromaufwärts Primer, umfassend SEQ ID No. 1 oder 3, und einem stromabwärts Primer, umfassend SEQ ID No. 2 oder 4, erhalten wird, wobei jeder Primer eine Länge von 18–40 Nukleotiden aufweist. Das Amplifikationsprodukt kann als eine Hybridisierungssonde für einen E. coli Nachweis verwendet werden. Gemäß einer Ausführungsform umfasst der stromaufwärts Primer SEQ ID No. 1 oder liegt als SEQ ID No. 1 vor, umfasst der stromabwärts Primer SEQ ID No. 2 oder liegt als SEQ ID No. 2 vor und jeder Primer ist 18–40, vorzugsweise 18–30 Nukleotide, lang. Gemäß noch einer anderen Ausführungsform umfasst der stromaufwärts Primer SEQ ID No. 3 oder liegt als SEQ ID No. 3 vor, umfasst der stromabwärts Primer SEQ ID No. 4 oder liegt als SEQ ID No. 4 vor und jeder Primer weist eine Länge von 24–40, vorzugsweise 24–32 Nukleotide, auf.
In noch einer anderen Ausführungsform weist diese Erfindung eine Nukleinsäure auf, die eine Länge von 26–1000, vorzugsweise 26–500, 26–200 oder 26–50 Nukleotide aufweist, die irgendeine von SEQ ID No. 5, 6, 7 oder 8 oder deren komplementären Sequenzen umfasst. Die Nukleinsäure kann einfach als SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7 oder SEQ ID No. 8 oder deren komplementären Sequenzen vorliegen. Diese Nukleinsäuren können als Hybridisierungssonden zum Nachweis von E. coli verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis von Escherichia coli bereit, bei dem zwei oder mehrere der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren verwendet werden. Das Verfahren umfasst (1) Bereitstellen einer Probe, bspw. einer biologischen Probe, die eine Nukleinsäure von einem unbekannten Mikroorganismus aufweist, (2) Amplifizieren der Nukleinsäure mit einem stromaufwärts Primer, der SEQ ID No. 1 oder 3 umfasst, und einem stromabwärts Primer, der SEQ ID No. 2 oder 4 umfasst, wobei jeder Primer eine Länge von 18–40 Nukleotiden aufweist, und (3) Nachweisen eines Amplifikationsprodukts. Der Nachweis eines erwarteten Amplifikationsprodukts gibt einen Hinweis auf die Anwesenheit von Escherichia coli.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst der Nachweisschritt ein Hybridisieren des Amplifikationsprodukts an eine Nukleinsäuresonde, die mit einer Länge von 26–1000 (bspw. 26–500, 26–200 oder 26–50) Nukleotiden vorliegt, und SEQ ID No. 5, 6, 7 oder 8 oder deren komplementären Sequenzen umfasst.
Weiterhin liegt im Umfang dieser Erfindung ein Kit zum Nachweis von E. coli. Der Kit umfasst eine oder mehrere der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren. Er kann andere Bestandteile, wie beispielsweise eine DNA-Polymerase, einen PCR-Puffer oder einen festen Träger umfassen, auf dem eine oder mehrere der vorstehend beschriebenen Sonden immobilisiert vorliegen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein schnelles, genaues und empfindliches Verfahren zum Nachweis von E. coli bereit. Insbesondere wird eine Nukleinsäurematrize einer Probe, die verdächtigt wird E. coli zu beinhalten, mit einem Paar von E. coli spezifischen Primern amplifiziert. Nicht beschränkende Beispiele für derartige Proben stellen Nahrungsmaterial oder Wasser oder von einem Patienten dar. Das Amplifikationsprodukt wird, wenn eines vorliegt, sowohl durch Gelelektrophorese als auch Färbung, bspw. Ethidiumbromid, oder durch Sondenhybridisierung nachgewiesen. Der Nachweis eines erwarteten Amplifikationsprodukts gibt einen Hinweis auf die Anwesenheit von E. coli in der Probe.
Die Nukleinsäurematrize kann DNA (bspw. ein genomisches Fragment oder ein Restriktionsfragment) oder RNA in einer gereinigten oder nicht gereinigten Form sein.
Erfindungsgemäß werden E. coli spezifische Primer bereitgestellt, die von der Nukleotidsequenz zwischen 81889 und 83238 des E. coli Genoms (GenBank Zugangsnummer AP002562) ausgewählt wurden. Dieser Bereich umfasst drei offene Leseraster (ORFs), d.h. ECs3458, ECs3459 und ECs3460, die drei hypothetische Proteine mit unbekannten Funktionen kodieren. Die gegenwärtigen Erfinder haben nun festgestellt, dass die DNA-Sequenz in diesem Bereich in sowohl pathogenen als auch nicht-pathogenen E. coli Gruppen konserviert vorliegt, was sie zu einem geeigneten Mittel für einen Nachweis von E. coli im allgemeinen, d.h. eine Vielfalt unterschiedlicher Stämme umfassend, machen sollte.
In einem der ausgewählten Primerpaare liegt der Vorwärts-Primer als ein 24 Oligonukleotid N1 (5'-TGAATGCGCAAGCTGAAAAAGTAG-3'; SEQ ID No. 3, die den Nukleotiden 82568–82591 der GenBank Zugangsnummer AP002562 entspricht), vor und der Rückwärts-Primer liegt als ein anderes 24 Oligonukleotid N2 (5'-ACGCCGTTAGGTGTATTGATTGTG-3'; SEQ ID No. 4, die einer komplementären Sequenz der Nukleotide 83075–83052 von GenBank Zugangsnummer AP002562 entspricht), vor.
In einem anderen ausgewählten Primerpaar liegt der Vorwärts-Primer (SEQ ID No. 1) als ein 18 Oligonukleotid vor, das an dem 3'-Ende von N1 angeordnet ist, und in ähnlicher Weise liegt der Rückwärts-Primer (SEQ ID No. 2) als ein 18 Oligonukleotid an dem 3'-Ende von N2 angeordnet vor. Eine GenBank-Suche zeigte an, dass jene zwei Primer E. coli spezifisch sind.
In zwei zusätzlichen Beispielen wird SEQ ID No. 1 mit SEQ ID No. 4 gepaart und SEQ ID No. 2 wird mit SEQ ID No. 3 gepaart.
Gewöhnlich weist ein Primer eine Länge (PCR Application Manual, Boehringer Mannheim, 1995, Seite 37) von 14–40 Nukleotiden auf. In dieser Erfindung können Primer, die SEQ ID No. 1, 2, 3 oder 4 umfassen, und eine Länge von 18–40 (bspw. 18–32) Nukleotiden aufweisen zum Amplifizieren einer E. coli-Matrize verwendet werden.
E. coli Sequenzen können entweder an das 5'-Ende oder das 3'-Ende von SEQ ID No. 1, 2, 3 oder 4 angefügt werden, wobei an das 5'-Ende von SEQ ID No. 1, 2, 3 oder 4 nicht-E. coli Sequenzen angefügt werden können. Beispielhaft für eine nicht-E. coli Sequenz ist eine Sequenz, die eine Restriktionsstelle umfasst, welche dazu verwendet werden kann ein Klonieren des Amplifikationsprodukts zu fördern.
Die vorliegende Erfindung weist ebenfalls vier E. coli spezifische Sonden auf, die aus dem mit den vorstehend beschriebenen Primern N1 und N2 amplifizierten Bereich, ausgewählt wurden.

(a) Von dem Sense-Strang der amplifizierten Nukleinsäuresequenz: N1-1: 5'-AATACATAACAGAAACCTGAAACACAA-3' (SEQ ID No. 5), die den Nukleotiden 82618–82644 der GenBank Zugangsnummer AP002562 entspricht; und N1-2: 5'-AAAACACCTCTTCCTGCGATTTCTCAC-3' (SEQ ID No. 6), die den Nukleotiden 82758–82784 von der Genbank Zugangsnummer AP002562 entspricht.
(b) Von dem Antisense-Strang der amplifizierten Nukleinsäuresequenz: N2-1: 5'-ATTTTACCTCTTGTCTTCCCGTCTTGG-3' (SEQ ID No. 7), die eine komplementäre Sequenz der Nukleotide 82894–82868 der GenBank Zugangsnummer AP002562 ist, und N2-2: 5'-GTTATGTATTGCTGCTGTTTGCGGCG-3' (SEQ ID No. 8), die eine komplementäre Sequenz der Nukleotide 82626–82602 der GenBank Zugangsnummer AP002562 ist.

N1-1, N1-2, N2-1, N2-2 und längere Sonden, die N1-1, N1-2, N2-1 oder N2-2 umfassen und eine Länge von 26–1000 (bspw. 10–500, 10–200 und 10–50) Nukleotiden aufweisen, können jeweils durch Hybridisieren an eine nicht amplifizierte E. coli Nukleinsäure oder eine mit den vorstehend beschriebenen Primerpaaren amplifizierte E. coli Nukleinsäure zum Nachweisen von E. coli verwendet werden. Das vorstehend beschriebene Amplifikationsprodukt stellt beispielsweise eine von derartigen Sonden dar. Eine GenBank-Suche zeigte an, dass die mit den Primern N1 und N2 amplifizierte Nukleinsäuresequenz spezifisch für E. coli ist.
Die Sonden können an der Oberfläche eines festen Trägers, wie beispielsweise einer Membran (einer Nylon-Membran oder einer Nitrocellulose-Membran), einem Glas oder einem Kunststoffpolymer immobilisiert werden. Die Sondenimmobilisierung an eine Membran kann durch herkömmliche Mittel, wie beispielsweise Backen bei 80°C oder UV-Vernetzen erreicht werden. Die Sonden können ebenfalls an ein Material (bspw. Polylysin), das auf die Oberfläche eines Glases beschichtet wurde, kovalent gebunden werden. Außerdem wurde kürzlich ein neues Verfahren zum Immobilisieren von Sonden an ein Kunststoffpolymer entwickelt. Siehe US-Anmeldung Seriennr. 09/906,207. Alternativ können die Sonden an bestimmten Positionen auf dem festen Substrat de novo synthetisiert werden. Siehe Schena, et al., Science, 270 (1995), 467; Kozal, et al., Nature Medicine, 2 (7) (1996), 753; Cheng, et al., Nucleic Acids Res., 24 (2) (1996); 380; Lipshutz, et al., Bio Techniques 19 (3), (1995), 442; Pease, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91 (1994), 5022; Fodor, et al., Nature 364 (1993), 555 und Fodor et al., WO 92/10092.
Ein vorstehend beschriebenes Ziel-Amplifikationsprodukt kann dadurch nachgewiesen werden, dass es an eine immobilisierte Sonde gebunden wird. Um einen Nachweis zu fördern, kann ein markiertes Amplifikationsprodukt mit einem markierten Amplifikationsprimer erzeugt werden. Alternativ kann das Markieren chemisch oder enzymatisch nach der Amplifikation ausgeführt werden. Beispielhaft umfassen Markierungsreagenzien, sind jedoch nicht beschränkt auf, ein Fluoreszenzmolekül (bspw. Fluorescein und Rhodamin), ein radioaktives Isotop (bspw. ³²P und ¹²⁵I), eine kolorimetrisches Reagenz und ein chemilumineszierendes Reagenz. Biotin und Digoxigenin werden häufig zum kolorimetrischen Nachweis auf einer Membran oder einem Kunststoffpolymer verwendet. Fluoreszenzmarker, wie beispielsweise Cy3 und Cy5, werden weithin zum Nachweis auf einem Glas verwendet. Zusätzlich können künstliche Markierungsschwänze bzw. Taggingschwänze (bspw. ein Protein oder dessen Antikörper) an das 5'-Ende der Primer oder an eines der Enden der Sonden konjugiert werden. Siehe Stetsenko und Gait, J. Org. Chem. 65 (16) (2000), 4900.
Die Spezifität des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens für E. coli ist unerwartet hoch. Es werden mit den ausgewählten Primern lediglich E. coli-Matrizen amplifiziert und es findet keine Amplifikation von Nukleinsäurematrizen von anderen Bakterien, wie beispielsweise Salmonella spp., Shigella spp., Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus und Streptococcus aglactiae (siehe nachfolgendes Beispiel 1), stellt. Am überraschensten ist die Fähigkeit der ausgewählten Primer eine E. coli-Matrize von einer Shigella spp. Matrize zu unterscheiden, was im Stand der Technik bisher nicht erreicht wurde (cf. Hellyer et al., US-P-6,207,818). Außerdem wird die Amplifikation einer E. coli-Matrize durch die Anwesenheit von Nukleinsäurematrizen anderer Bakterien (siehe nachfolgendes Beispiel 3) oder Verunreinigungen in einer rohen Probe (siehe nachfolgendes Beispiel 4) nicht beeinflusst.
Die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens für E. coli ist ebenfalls unerwartet hoch. Insbesondere können 1 ng und sogar 1 fg einer genomischer DNA von E. coli nach 20 beziehungsweise 30 Amplifikationszyklen auf einem Agarosegel (siehe nachfolgendes Beispiel 2) nachgewiesen werden.
Eine Hybridisierung, die auf eine PCR-Amplifikation folgt, erhöht weiterhin die Empfindlichkeit 5–50-fach (siehe nachfolgendes Beispiel 5). In der Tat kann gemäß der erfindungsgemäßen Lehre genomische DNA von E. coli, die einem Extrakt aus 1 ml einer 1 cfu/ml Kultur äquivalent ist (siehe nachfolgende Beispiele 2 und 5), nachgewiesen werden.
Ebenfalls innerhalb des Umfangs dieser Erfindung liegt die Verwendung von vorstehend beschriebenen E. coli spezifischen Sequenzen in Kombination mit anderen Spezies-spezifischen Nukleinsäuresequenzen zur gleichzeitigen Identifikation mehrerer Mikroorganismen.
Weiterhin sind an Positionen, an denen einzelne Nukleotidpolymorphismen auftreten, Nukleotidänderungen in den in dieser Erfindung beschriebenen Primern und Sonden gestattet. Da einzelne Nukleotidpolymorphismen mit einem bestimmten Genotyp oder Phänotyp assoziiert sein können, können diese Primer und Sonden dazu verwendet werden unterschiedliche E. coli-Stämme zu unterscheiden und zu klassifizieren.
Die nachfolgenden Beispiele sind lediglich zur Erläuterung ausgelegt und nicht, um den Rest der Offenbarung in irgendeiner, wie auch immer gestalteten Weise zu beschränken. Es wird angenommen, dass ein Fachmann, basierend auf der hierin erfolgten Beschreibung, ohne weitere ausführliche Darstellung die vorliegende Erfindung bis zu deren weitesten Umfang verwenden kann.
Beispiel 1:
Amplifikation und Nachweis von Escherichia coli unter Verwendung spezifischer Oligonukleotidprimer
(1) Bakterienstämme
Alle in diesem Beispiel verwendeten Bakterienstämme sind in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführt. Die verwendeten Escherichia coli-Stämme schließen nicht-pathogene und pathogene Subtypen, wie beispielsweise ETEC-, EIEC-, EPEC-, EAggEC- und EHEC-Stämme, ein. Getestete nicht E. coli Bakterien schließen einige coliforme Bakterien und verbreitete, von Nahrungsmitteln stammende, pathogene Bakterien ein. Diese Bakterienstämme wurden von verschiedenen Quellen, wie beispielsweise dem Culture Collection und Research Center (CCRC), Hsin-Chu, Taiwan; dem National Laboratory für Food and Drungs (NLFD), Taipei, Taiwan; der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA; dem United States Department of Agriculture (USDA), Washington, DC, USA; dem Center of Vaccine Development (CVD), University of Maryland, Baltimore, MD, USA und der Pingtung University of Technology (PT), Pingtung, Taiwan erhalten.
Eine Öse von Teststämmen wurde auf einem Luria-Bertani Agar (LB, 0,5% Hefeextrakt, 1% Trypton, 0,5% NaCl, 1,5–2% Agar) ausgestrichen und über Nacht (14 Std.) bei 37°C inkubiert. Eine Einzelkolonie wurde gepickt und in 10 ml sterile LB-Brühe inokuliert. Die Kultur wurde über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Kolonie- bildende Einheit (cfu) wurde nach seriellen Verdünnungen berechnet und bakterielle genomische DNA wurde wie nachfolgend beschrieben präpariert.
(2) Herstellung bakterieller genomischer DNA
Genomische DNA wurde aus 1 ml einer bakteriellen Übernachtkultur präpariert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 6.000 g für 5 Minuten geerntet und in 50 ml STET-Puffer (0,1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8.0, 1 mM EDTA, 0,05 mg Lysozym und 5% Triton X-100) resuspendiert. Die Zellen wurden anschließend an eine Inkubation von 15 Minuten bei 37°C, gefolgt durch 10 Minuten Kochen lysiert. Der DNA-haltige Überstand wurde nach 5 Minuten des Zentrifugierens grob von dem Zellschrott getrennt. Die genomische DNA wurde durch Behandlung mit Phenol/Chloroform (1:1) und Zentrifugation bei 10.000 g für 10 Minuten weiter gereinigt. Die obere Schicht des Extraktionsgemisches, ca. 40 ml, wurde in ein neues Eppendorfröhrchen überführt und war bereit, um amplifiziert zu werden.
(3) Amplifikation und Nachweis bakterieller genomischer DNA mit spezifischen Oligonukleotidprimern
50 μl eines Amplifikationsreaktionsgemisches umfasst 5 ml 10 X Taq DNA Polymerasepuffer, 5 ml 25 mM MgCl₂, 4 ml mM dNTPs (Promega, Madison, WI, USA)
Tabelle 1 Bakterienstämme
1 μl von dem 20 μM Oligonukleotidprimer N1, 1 μl von dem 20 μM Oligonukleotidprimer N2, 1 μl DNA Matrize, 0,1 E Taq DNA Polymerase (Promega, Madison, WI, U.S.A.) und sterilisiertes dH₂O.
Die Amplifikation wurde unter Verwendung von Peltier-Effekt thermalen Zyklisiereinrichtungen (PTC-100, MJ Research Inc., MA, U.S.A.) wie folgt ausgeführt: 95°C für 2 Minuten, 30 Zyklen von 95°C für 40 s, 55°C für 40 s, 72°C für 40 s und einer Enderstreckung bei 72°C für 6 Minuten.
Alle amplifizierten Produkte (50 μl) wurden durch eine Elektrophorese auf einem 2% Agarosegel in TAE-Puffer (40 mM Tris, 20 mM Natriumacetat, 2 mM EDTA, pH-Wert mit Eisessig eingestellt) analysiert und mit Ethidiumbromid gefärbt.
Die experimentellen Ergebnisse, die in Tabelle 2 zusammengefasst sind, zeigen, dass die ausgewählten Oligonukleotidprimer hoch spezifisch für einen Nachweis von E. coli sind. Das erwartete amplifizierte Produkt (Molekulargewicht von 500 bp) konnte lediglich für alle 64 E. coli-Spezies, einschließlich von 8 nicht-pathogenen und 56 pathogenen Subtypen oder Serotypen nachgewiesen werden. Es wurde für die anderen 68 Bakterienstämme kein Amplifikationsprodukt beobachtet. Insbesondere fand keine Kreuzreaktion zwischen E. coli und den getesteten 4 Shigella spp.-Stämmen statt, was hinsichtlich der vorstehend beschriebenen auf PCR-Gel basierenden Verfahren unerwartet war.
Beispiel 2:
Nachweisempfindlichkeit der PCR Gelansalyse
(1) Bakterielle genomische DNA-Menge, die für 30 thermale PCR-Zyklen erforderlich ist
Die Nachweisempfindlichkeit des PCR-Gelanalyseverfahrens wurde durch Titrieren der für eine Amplifikation erforderlichen Menge genomischer DNA bestimmt. E. coli-DNA wurde extrahiert und unter Verwendung des QIAamp DNA Mini-Kits (QIAGEN, Hilden, Germany) gereinigt. Die Quantifizierung der gereinigten genomischen DNA wurde durch das elektrophoretische Agarosegelverfahren durchgeführt. Der auf das gleiche Agarosegel geladene DNA-Marker (Gene Mark, Taiwan, R. O. C.) wurde als eine Referenz zur Quantifizierung verwendet. Abgesehen von der in dem Amplifikationsreaktionsgemisch befindlichen DNA-Matrize waren alle Bestandteile, wie in Beispiel 1, Abschnitt 3, die gleichen. Die getestete genomische DNA-Menge lag in dem Bereich von 100 ng bis 0,1 fg. Nach Amplifikation unter Verwendung des ausgewählten Oligonukleotidprimerpaars wurde unerwarteterweise so wenig wie 1 fg genomischer DNA von E. coli nachgewiesen.
(2) Bakterielle genomische DNA-Menge, die für 20 thermale PCR-Zyklen erforderlich ist
Eine geringere Zyklenanzahl für die Amplifikationsreaktion bedeutet, dass für einen Nachweis von E. coli weniger Zeit benötigt wird. Zwanzig Amplifikationszyklen könnten gegenüber dreizig Amplifikationszyklen ungefähr 30 Minuten einsparen und die Nachweisempfindlichkeit sollte für diesen Zweck eines Nachweises von E. coli in der Lebensmittelindustrie hoch genug sein. Somit wurde versucht die Nachweisgrenzen von genomischer DNA und lebenden Zellen (cfu, siehe nachfolgenden Abschnitt 3), die für 20 Amplifikationszyklen erforderlich sind, zu bestimmen.
Tabelle 2 Nachweis von Escherichia coli unter Verwendung spezifischer Oligonukleotidprimer
Die Amplifikation wurde, wie in Abschnitt 1 dieses Beispiels beschrieben, ausgeführt, abgesehen davon, dass 20 Amplifikationszyklen statt 30 Zyklen ausgeführt wurden. Die Menge der getesteten genomischen DNA lag in dem Bereich von 100 ng bis 0,1 fg. Es wurde unerwarteterweise so wenig wie 1 ng genomischer DNA von E. coli nachgewiesen.
(3) Anzahl von Bakterienzellen, die für 20 thermale PCR-Zyklen erforderlich sind
Eine Übernachtkultur pathogener E. coli O157:H7 (H Typ, CCRC 14825) wurde in LB-Brühe bei 37°C gezüchtet und die Zellkonzentration, die Kolonie-bildende Einheit/ml (cfu/ml) wurde bestimmt. Es wurde genomische DNA aus 1 ml einer 10⁹ cfu/ml Kultur extrahiert und bis zu Konzentrationen seriell verdünnt, die Extrakten von 1 ml von 0–10⁷ cfu/ml Kulturen glichen. Die Amplifikation wurde, wie in Abschnitt 2 dieses Beispiels beschrieben, ausgeführt. Es wurde unerwarteterweise E. coli-DNA nachgewiesen, die einem Extrakt von 1 ml einer 1 cfu/ml Kultur glich.
Beispiel 3:
Nachweis von Escherichia coli in einem Bakteriengemisch
Der Nachweis von Escherichia coli in einem Bakteriengemisch umfasst: Staphylococcus aureus (CCRC 10780), Salmonella typhimurium (CCRC 10747), Escherichia coli (CCRC14825), Streptococcus agalactea (CCRC10787), Bacillus cereus (CCRC11827), Shigella dysenteria (CCRC13983), Vibrio parahaemolyticus (CCRC10806) und Listeria monocytogenes (CCRC14930). Es wurde von jedem Stamm eine einzelne Kolonie gepickt und in 5 ml LB-Brühe für eine Übernachtkultur bei 37°C mit Schütteln bei 100 Upm inokuliert. Die genomische DNA wurde wie in Beispiel 1 beschrieben präpariert und amplifiziert. Ein erwartetes Amplifikationsprodukt (500 bp) wurde lediglich auf einem Agarosegel nachgewiesen, wenn E. coli in dem Gemisch anwesend war. Die Empfindlichkeit und Spezifität des ausgewählten Amplifikationsprimerpaares wurde nicht von DNA anderer Bakterienspezies beeinflusst.
Beispiel 4:
Nachweis von Escherichia coli in einer Milchprobe
Gesamtmilchproben wurden von einem örtlichen Supermarkt erworben und wurden pasteurisiert. Die pathogene E. coli O157:H7 (H Typ, CCRC14825) Kultur wurde in einer Konzentration von 10⁶ cfu/ml inokuliert und bei 10.000 g für 5 Minuten zentrifugiert. Die genomische DNA wurde extrahiert und bis zu Konzentrationen seriell verdünnt, die Extrakten von 1 ml von 0–10⁶ cfu/ml Kulturen glichen. Die Amplifikation wurde, wie in Beispiel 2, Abschnitt 2 beschrieben, ausgeführt.
Das erwartete Amplifikationsprodukt (500 bp) wurde auf einem Agarosegel nachgewiesen. Die Empfindlichkeit und Spezifität des ausgewählten Amplifikationsprimerpaares wurde nicht durch das einfache DNA Präparationsverfahren, oder durch die Anwesenheit anderer Mikroorganismen und somatischer Rinderzellen in der Milch, beeinflusst.
Beispiel 5:
Nachweis von Escherichia coli durch Hybridisierung nach der Amplifikation
(1) Sondengestaltung
Vier Typen von Oligonukleotidsonden wurden für eine Hybridisierung gestaltet.
Typ 1: Vier Oligonukleotide (d.h. N1-1, N1-2, N2-1 und N2-2) wurden von dem Bereich ausgewählt, der mit E. coli spezifischen Oligonukleotidprimern N1 und N2 amplifiziert wurde.
Typ 2: Eine DNA-Sonde als Positivkontrolle der Hybridisierung.
Pco: 5'-(T)₂₅-GAGCGGGAAATCGTGCGCGACATCAAGGAG-3' (SEQ ID No. 9)
Typ 3: DNA-Sonden als Negativkontrollen der Hybridisierung, die irgendwelche nicht-komplementären Sequenzen gegen die Zielnukleinsäure sein können und ungefähr 25 Basen aufweisen.
Nco1: 5'-(T)₂₅-ATGAAGCAYGTCAGGGCRTGGATACCTCG-3' (SEQ ID No. 10)
Nco2: dH₂O
Typ 4: Eine Orientierungssonde, ein kurzes Oligonukleotid, das mit Biotinmarkierungen an dem 5'-Ende versehen ist. Die Sequenz lautet 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (SEQ ID No. 11).
(2) Hybridisierung
Jede Oligonukleotidsonde wurde in einer Sonden- bzw. Testlösung (Dr. Probsol, Dr. Chip Biotechnology Inc., Taiwan) bis zu einer Endkonzentration von 10 μM gelöst, gepunktet und auf einem festen Substrat (Dr. Chip Biotechnology, Taiwan) immobilisiert. Die Amplifikation wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, abgesehen davon ausgeführt, dass beide Primer mit Biotin an dem 5'-Ende markiert wurden. Das Amplifikationsreaktionsgemisch wurde mit einem Hybridisierungspuffer in einem Verhältnis von 1:(50–100) verdünnt. Das verdünnte Gemisch wurde für 5 Minuten gekocht, auf Eis abgekühlt und auf den festen Träger aufgebracht. Die Hybridisierung wurde bei 50–55°C für 1–2 Stunden in einem Ofen ausgeführt. Der feste Träger wurde dann mit einem Waschpuffer (0,5 ml) (DR. Wash von Dr. Chip Biotechnology Inc., Taiwan) mindestens dreimal gewaschen. Es wurde dann ein Biotin spezifischer kolorimetrischer Nachweis ausgeführt, bei dem das feste Substrat in einem Blockierungsreagenz (Roche) inkubiert wurde, das alkalische Phosphatase konjugiertes Streptavidin (Promega) umfasste. Das feste Substrat wurde anschließend dreimal mit dem Waschpuffer gewaschen und mit einer NBT/BCIP-Lösung (Roche), die mit einem Detektionspuffer in einem vom Anbieter empfohlenen Verhältnis verdünnt wurde, für 10 Minuten im Dunkeln inkubiert. Gefärbte Typ 1 Sondenflecken zeigten die Anwesenheit eines Amplifikationsprodukts von genomischer DNA von E. coli an. Typ 2 Sonden waren in allen Hybridisierungsreaktionen gefärbt. Es wurde kein Signal von Typ 3 Sonden festgestellt.
(3) Nachweisspezifität
Isolierte genomische DNA von E. coli, 8 andere Bakterienstämme und eine gemischte Bakterienkultur, die E. coli beinhaltete wurden amplifiziert und mit den Sonden hybridisiert. Lediglich Proben, die die E. coli-DNA-Matrize beinhalteten, führten zu gefärbten Flecken auf dem festen Substrat. Sonde N2-1 zeigte unter den vorstehend beschriebenen Hybridisierungsbedingungen die höchste Signalintensität von allen Typ-1 Sonden. Es wurde kein Signal für die 8 anderen Bakterienproben festgestellt.
(4) Nachweisempfindlichkeit
Ein Fünftel (1/5) Volumen des Amplifikationsgemischs war ausreichend für eine Hybridisierungsanalyse. E. coli-DNA-Matrizen, die Extrakten von 1 ml von 10⁰–10⁷ cfu/ml Kulturen glichen, wurden amplifiziert und mit den Sonden hybridisiert. Die DNA-Menge, die nachgewiesen werden konnte glich einem Extrakt von 1 ml einer 1 cfu/ml Kultur.
Weiterhin wurden 0,2 ng und 0,02 fg genomische DNA von E. coli nach 20 beziehungsweise 30 Zyklen einer Amplifikation nachgewiesen. Die Hybridisierungsanalyse ist somit unerwarteterweise 5–50-fach empfindlicher als Analysen auf einem Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel.
Der Fachmann kann von der vorstehenden Beschreibung verschiedene Änderungen und Modifikationen der Erfindung ausführen, um sie unterschiedlichen Verwendungen und Bedingungen anzupassen. Somit liegen andere Ausführungsformen ebenfalls innerhalb des Umfangs der folgenden Ansprüche.
SEQUENCE LISTING

Claims

Satz von Nukleinsäuren, welcher umfasst: eine erste Nukleinsäure, welche eine Sequenz enthält, die ausgewählt ist, aus SEQ ID NO: 1 oder 3, und eine zweite Nukleinsäure, welche eine Sequenz enthält, die ausgewählt ist, aus SEQ ID NO: 2 oder 4, wobei jede Nukleinsäure eine Länge von 18–40 Nukleotiden aufweist.
Satz von Nukleinsäuren nach Anspruch 1, worin die erste Nukleinsäure SEQ ID NO: 1 enthält und die zweite Nukleinsäure SEQ ID NO: 2 enthält, oder die erste Nukleinsäure SEQ ID NO: 3 enthält und die zweite Nukleinsäure SEQ ID NO: 4 enthält.
Satz von Nukleinsäuren nach Anspruch 1 oder 2, worin jede Nukleinsäure eine Länge von 18–30 oder 24–32 Nukleotiden aufweist.
Nukleinsäure, die erhalten wird, durch Amplifikation eines Escherichia coli Nukleinsäure-Templats mit einem Satz von Nukleinsäuren nach einem der vorstehenden Ansprüche, oder ein Fragment hiervon, worin die Nukleinsäure oder das Fragment hiervon eine Länge von 26–1000 Nukleotiden aufweist, umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 5–8, oder eine hierzu komplementäre Sequenz.
Nukleinsäure nach Anspruch 4, worin die Nukleinsäure aufweist, eine Länge von 26–500 Nukleotiden, vorzugsweise von 26–200 Nukleotiden, bevorzugterweise von 26–50 Nukleotiden.
Verfahren zum Nachweis von Escherichia coli in einer Probe, welches umfasst: Bereitstellen einer Probe; Amplifizieren der darin enthaltenen Nukleinsäure mit einem Satz von Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 3; und Nachweisen eines Amplifikationsprodukts; wobei ein Nachweis eines Amplifikationsprodukts das Vorliegen von Escherichia coli anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der Nachweisschritt umfasst, Hybridisieren des Amplifikationsprodukts mit einer Nukleinsäuresonde, welche eine Länge von 26–1000 Nukleotiden aufweist und enthält, eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 5–8, oder eine hierzu komplementäre Sequenz.
Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Nukleinsäuresonde eine Länge von 26–50 Nukleotiden aufweist.
Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für den Nachweis von E. coli.
Kit zum Nachweisen des Vorliegens von E. coli in einer Probe, welcher umfasst einen Satz von Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 3; und Puffer, Enzyme oder einen Träger, die (der) für den Nachweisschritt geeignet sind (ist).