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Hintergrund
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Der
Nachweis von coliformen Bakterien ist eine wichtige Methode, um
Wasser und andere auch feste Lebensmittel auf bakterielle Verunreinigungen
zu überprüfen. Da
die coliformen Bakterien Rückschlüsse auf fäkale Verunreinigungen
zulassen, trägt
ihr Nachweis einem erhöhten
Sicherheitsbedürfnis
Rechnung. Der Gesamt-Coliformen-Nachweis
kann Probleme mit Aufbereitungsbarrieren oder im Verteilungssystem
anzeigen. in der neuen deutschen Trinkwasserverordnung (TVO 2001)
wurde die alte 95%-Regel durch einen Nullgrenzwert ersetzt.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung sind die coliformen Bakterien definiert als Gruppe der
Enterobacteriaceae, die eine funktionsfähige β-Galaktosidase exprimieren.
Diese Definition ist konsistent mit der internationalen Norm ISO9308-1,
in welcher insbesondere auf die Gasbildung als Nachweismerkmal der
Coliformen verzichtet wird, da viele der gesundheitlich relevanten
Stämme
kein Gas bilden (z. B. bei E. coli 10%).
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Der
klassische Nachweis von coliformen Bakterien erfolgte in der Vergangenheit
durch nur teilweise selektive Nährmedien,
denen z. B. Gallensalze und Indikatorfarbstoffe zugesetzt wurden.
Dabei ist zu beachten, dass etwaige positive Ergebnisse (Gas- und
Säurebildung),
die durch Anreicherung in Laktose- oder Lauryl-Tryptose-Bouillon
erhalten werden, präsumtiv
sind und durch eine zweite Anreicherung in einem stärker selektiven
Medium bestätigt
werden müssen.
Die „Multiple-Tube-Fermentation”, die dazu
dient in einer Reihenverdünnung
den Titer der Coliformen zu bestimmen, wird durch nicht-coliforme
Bakterien beeinträchtigt.
Außerdem
können
die Nährmedien
eine inhibitorische Wirkung entfalten. Ein weiterer Nachteil dieser
Kultivierungs- Nachweisverfahren
liegt in ihrem hohen Zeitaufwand, da die Kultivierungsphasen jeweils
bis zu 48 Stunden dauern.
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Aufgrund
der genannten Nachteile wird seit ca. 50 Jahren das Membranfiltrationsverfahren
als Alternative zur „Multiple-Tube-Fermentation” in der
Wasseranalytik verwendet. Dabei wird eine Wasserprobe durch ein
Filter mit z. B. 0,45 μm
Porenweite geleitet. Anschließend
wird der Filter auf einem selektiven, in der Regel festen Nährmedium
bebrütet
und die Kolonien ausgezählt.
Als feste Nährmedien
sind in Nordamerika solche vom Typ m-Endo und in Europa vom Typ
Tergitol TTC am gebräuchlichsten.
Auf Grund der geringen Spezifität müssen auch
auf diesen Nährböden präsumtive
Kolonien bestätigt
werden. Außerdem
kann eine hohe Begleitflora zu einer geringen Sensitivität führen. Nach
Schets et al. (Lett. Appl. Microbiol., 2002, 34: 227–231) kann deshalb
das aktuelle ISO-Verfahren 9308-1 zum Nachweis von Gesamt-Coliformen
mit Laktose-TTC-Agar nur auf sehr klare Trinkwasserproben angewandt
werden.
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Häufig wird
der Nachweis von Enzymaktivitäten
als kennzeichnendes Merkmal der Coliformen herangezogen. Insbesondere
wurden Farbstoffe entwickelt, die die Aktivität der β-Galaktosidase (ONPG, X-Gal)
und der β-Glukuronidase
(MUGlu) nachweisen.
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Auch
der enzymatische Nachweis der β-Galaktosidase
erwies sich als nicht spezifisch. Dies liegt darin begründet, dass
das β-Galaktosidase-Gen
auch in nicht-coliformen Bakterien vorkommt. So wurden beim Nachweis
von Gesamt-Coliformen falsch-positive Reaktionen beschrieben, die
durch andere β-Galaktosidase exprimierende
Bakterien, insbesondere Vertreter der Gattung Aeromonas (Landre
et al., 1998, Lett. Appl. Microbiol. 26: 352–354, Tryland und Fiksdal,
1998, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1018–1023, Geissler et al., 2000, J.
Appl. Microbiol. 88: 280–285),
aber auch durch Algen und Pflanzen verursacht werden.
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Da
die coliformen Bakterien keine phylogenetische, sondern nur eine
phänotypische
Einheit bilden, ist ein PCR-Nachweis basierend auf verwandtschaftlicher
Nähe nicht
möglich.
Andererseits definieren sich die coliformen Bakterien als Untergruppe
der Enterobakterien über
das Vorhandensein des LacZ-Gens, das jedoch auch bei einigen verbreiteten
nicht-coliformen Bakterienarten vorkommt.
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Mit
dieser Erfindung wird ein PCR-Nachweis zur spezifischen Detektion
von coliformen Bakterien beschrieben. In der Vergangenheit wurde
bereits versucht vergleichbar spezifische Nachweismethoden zu entwickeln.
Diese hatten jedoch häufig
insbesondere den Nachteil die Gattung Aeromonas falsch-positiv nachzuweisen.
Aeromonas ist jedoch in der Umwelt weit verbreitet und verursacht
deshalb besonders häufig falsch-positive Ergebnisse
beim Nachweis von coliformen Bakterien (Grabow und du Preez, 1979,
Appl. Environ. Microbiol. 38: 351–358, Landre et al., 1998,
Lett. Appl. Microbiol. 26: 352–354).
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Bej
et al. (Appl Environ Microbiol. 1991 Aug; 57(8): 2429–32) verwendeten
einen PCR-Nachweis
zur Detektion von Coliformen in Wasser basierend auf der Amplifikation
des LacZ-Gens. Tabelle I dieser Publikation ist zu entnehmen, dass
dieser Nachweis signifikante Abweichungen von den entsprechenden
Wachstumsversuchen aufweist. Auch werden in dieser Arbeit nur sehr
wenige relevante Kontrollen, wie z. B. Aeromonas-Stämme,
verwendet. Eine Verwendbarkeit des Tests auf feste Lebensmittel
wird nicht erwähnt.
Demgegenüber
wird im letzten Absatz konstatiert, dass eine größere Anzahl von Proben getestet
werden müsse,
um diese Methode zu etablieren. Fricker & Fricker (1994 Let. Appl. Microbiol.
19: 44–46)
zeigten, dass mit diesem PCR-System nur ca. 70% der Coliformen erfasst
werden. Obwohl das genannte PCR-System vor mehr als 10 Jahren publiziert
wurde, konnte sich noch keine vergleichbare Methode in der Praxis
durchsetzen.
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US2004/0248148 A1 offenbart
ein PCR-Verfahren in Echtzeit zur Identifizierung von Coliformen,
wobei LacZ-Gene nachgewiesen werden.
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US 5,298,392 A offenbart
Verfahren und Mittel zum Nachweis von LacZ in Coliformen.
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Ootsubo,
M, J. Appl. Microbiol. (2002) 93 (1) 60–68, offenbaren Oligonukleotid-Sonden
zum Nachweis von Coliformen bzw. Enterobacteriaceae, die aus dem
16 rDNA-Bereich von Enterobacteriaceae stammen. Die Identifikation
der Sonde D in diesem Dokument entspricht einem empirischen Test
und die Sonde stellt eine Einzelsonde dar. Der coliforme Nachweis
mit der ebenfalls versuchten Sonde B scheitert, da diese nicht die nötige Spezifität zeigt.
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Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfinder haben überraschenderweise
gefunden, dass es über
die Verwendung von Primern und/oder Sonden, bevorzugt einer bestimmten
Kombination von degenerierten Vorwärts- und Rückwärtsprimern möglich ist,
zwischen coliformen und nicht-coliformen LacZ-tragenden Bakterien
zu unterscheiden und somit coliforme Bakterien nachzuweisen. Insbesondere
ist es möglich
LacZ-tragende coliforme Bakterien von LacZ-tragenden Aeromonas-Arten
zu differenzieren. Mit herkömmlichen
mikrobiellen Coliformen-Nachweismethoden ist eine sensitive Detektion
unter Ausschluss von Aeromonas nicht möglich. Es erscheint uns wichtig,
dass in der industriellen Anwendung die Detektion von falsch-positiven
Aeromonas-Arten von großer
Bedeutung ist, während
andere bakterielle Spezies, wie z. B. in Salzwasser wachsende Keime,
in diesem Zusammenhang eher von akademischem Interesse sind. Dieser
Tatsache trägt
die vorliegende Erfindung Rechnung.
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Die
erfindungsgemäßen Primer
und Sonden hybridisieren spezifisch mit LacZ-Gen spezifischen Bereichen,
die in Coliformen, bevorzugt aber nicht Aeromonas, konserviert sind.
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Das
erfindungsgemäße PCR-Nachweissystem
weist eine hohe Übereinstimmung
mit den auf Wachstum basierenden Coliformen-Nachweisen auf.
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Die
Spezifität
des Nachweissystems bzw. des Verfahrens der vorliegenden Erfindung
auf Coliforme kann, wie in den Beispielen gezeigt, getestet werden.
Im nicht differenzierenden, spezifischen Nachweis von Coliformen
wird hier auf die coliformen und nicht-coliformen Spezies wie in
Tabelle 3A gezeigt getestet.
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Ein
spezifisches Nachweissystem ist dann spezifisch für Coliforme,
wenn die aufgelisteten coliformen Spezies, wie Budvicia, Citrobacter,
alle LacZ-tragenden Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Pantoea,
Serratia positiv und die aufgelisteten nicht-coliformen Stämme, wie
Edwardsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Vibrio sp. BCD 5889,
Milchsäurebakterien
und übrige
Spezies, d. h. andere Spezies, die nicht Enterobacteriaceae sind,
negativ getestet werden.
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Ein
spezifisches Nachweissystem ist bevorzugt dann spezifisch für Coliforme,
wenn die aufgelisteten coliformen Spezies, wie Budvicia, Buttiauxella,
Cedecea, Citrobacter, alle LacZ-tragenden Enterobacter, Erwinia,
Escherichia, Ewingella,, Hafnia, Klebsiella, Leclercia, Pantoea,
Rahnella, Raoultella, ausgewählte
atypische LacZ-tragende Salmonella, Serratia, Yersinia, Yokenella
positiv und die aufgelisteten nicht-coliformen Stämme, wie
Edwardsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Vibrio sp. BCD 5889,
Milchsäurebakterien
und übrige
Spezies, d. h. andere Spezies, die nicht Enterobacteriaceae sind,
negativ getestet werden.
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Bevorzugt
sind zusätzlich
auch Aeromonas negativ. In diesem Fall ist der Nachweis Coliformen-spezifisch
unter Ausgrenzung von Aeromonas.
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Bereits
ein für
Coliformen spezifischer Primer bzw. eine für Coliformen spezifische Sonde,
ausgewählt aus
dem LacZ-Gen von Coliformen, kann ausreichen, die Spezifität des erfindungsgemäßen Nachweissystems
zu gewährleisten.
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Als
Hybridisierung wird die Doppelstrangbildung zweier identischer oder ähnlicher
Nukleotidfragmente (DNA, RNA, PNA) bezeichnet. Von spezifischer
Hybridisierung spricht man, wenn eine stabile Hybridnukleinsäure zwischen
dem Oligonukleotid und der entsprechenden Ziel-DNA des Oligonukleotides
besteht, nicht jedoch zu anderer DNA als der Ziel-DNA. Im Sinne
dieser Erfindung weist das Merkmal ”Sequenz, die mit einer Sequenz
nach (i) spezifisch hybridisiert” auf eine Sequenz hin, die
unter stringenten Bedingungen mit der Sequenz nach (i) hybridisiert.
Beispielsweise können
die stringenten Hybridisierungsbedingungen wie in Beispiel 1 (Primer,
siehe Tabellen 1 und 2) bzw. Beispiel 2 (Sonden) gewählt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst ein PCR-Nachweissystem bzw. das erfindungsgemäße Verfahren
für den
Gesamtnachweis von coliformen Bakterien die beiden Vorwärtsprimer
der SEQ ID Nos: 1 und 2 und den Rückwärtsprimer der SEQ ID No: 3.
Alle drei Primer werden entweder in Zweierkombinationen (1/3) oder
(2/3) oder bevorzugt zusammen (1/2 und 3) in einer PCR-Reaktion
eingesetzt. Die Nummern „1”, „2”, „3”, etc.
schließen
die jeweiligen „SEQ
ID No: 1”; „SEQ ID
No: 2”; „SEQ ID
No: 3”;
etc. und die in dieser Anmeldung definierten Derivate ein.
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Zur
einfachen und beschleunigten Detektion der Amplifikate erfolgt diese
idealerweise in Form eines PCR-ELISA. In diesem Fall wird der Primer
der SEQ ID NO: 3 durch den Primer der SEQ ID NO: 4 ersetzt. Dieser
besitzt ein gekoppeltes Digoxigenin-Molekül, an welches Peroxidase-gekoppelte
Antikörper
binden:
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Zur
Bindung der Amplifikate werden die Fangsonden der SEQ ID NOs: 5
oder 6 verwendet. Diese sind mit Biotin gekoppelt und binden an
die Oberfläche
von mit Avidin beschichteten Mikrotiterplatten:
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Die
Fangsonde der SEQ ID NO: 6 ist gegenüber der SEQ ID NO: 5 um 5 beliebige
Nukleotide verlängert.
Wir haben gefunden (s. Beispiel 2), dass dieser Spacer die Nachweiseffizienz
erhöht.
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Definitionen
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Die
Mehrdeutigkeits-Codes bei der SEQ ID NOs: 1–6 haben folgende Bedeutung:
M
ist A oder C,
Y ist C oder T,
R ist A oder G,
N ist
A, G, C oder T.
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Bei
der Verwendung von Mehrdeutigkeits-Codes wird jeweils ein Gemisch
der jeweiligen kombinatorisch möglichen
Oligonukleotide verwendet. Wenn z. B. ein Oligonukleotid nur den
Mehrdeutigkeits-Code M aufweist, dann liegt ein Gemisch von zwei
verschiedenen Oligonukleotiden vor, bei denen jeweils A oder C an der
Position von M liegt; wenn ein Oligonukleotid die Mehrdeutigkeits-Codes
M und Y aufweist, dann liegt ein Gemisch von vier verschiedenen
Oligonukleotiden vor, bei denen jeweils A oder C an der Position
von M liegt und C oder T an der Stelle von Y; I oder V bezeichnen
Inosin.
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Neben
dem ELISA sind natürlich
auch andere Nachweismethoden dem Fachmann geläufig. So ist es auch möglich die
PCR-Produkte einfach durch Elektrophorese in einem Agarosegel aufzutrennen
und mit Hilfe eines Farbstoffes wie Ethidiumbromid nachzuweisen.
Das Vorliegen der richtigen Fragmente kann durch den Vergleich mit einem
DNA-Größenstandard überprüft werden
(s. Beispiel 1). Außerdem
kann die Identität
der Banden über
einen Southern-Blot kontrolliert werden.
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Besonders
elegant ist außerdem
der Nachweis der Amplikons mit Hilfe der Echtzeit-PCR-Verfahren. Hier
können
z. B. der Lightcycler® und/oder FRET-Sonden
oder TaqMan®-Sonden
zum Einsatz kommen.
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Als
weitere Ausführungsform
ist es denkbar, einzelne Oligonukleotide der SEQ ID NOs: 1–6 zum Nachweis
von Untergruppen der Coliformen zu verwenden. Dem Fachmann ist unmittelbar
geläufig
wie er zu diesem Zwecke Einzelne der Primer oder Sonden mit neuen,
jedoch spezifischen, Primern oder Sonden kombinieren muss.
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Beim
Nachweis von Coliformen aus flüssigen
Lebensmitteln, kann es vorteilhaft sein, die Bakterien zunächst anzureichern.
Dies kann z. B. durch Filtration oder Zentrifugation geschehen.
Bei festen Lebensmitteln ist es häufig notwendig die bakterielle
DNA, z. B. durch auf Silica-Material basierenden Methoden, zumindest teilweise
aufzureinigen. Außerdem
kann in Betracht gezogen werden, die Coliformen in einer Vorwachstumsphase
zunächst
anzureichern. All diese Methoden sind dem Fachmann geläufig und
ohne Vorbehalt mit unserer Erfindung kombinierbar.
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Mit
dem obigen PCR-System konnten 500 Genomäquivalenten (GÄ) (s. 3)
coliformer Bakterien problemlos nachgewiesen werden. Auch erwies
sich der Nachweis als spezifisch im Vergleich mit einem Wachstumsnachweis
auf Chromokult® Coliformen
Agar.
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Im
Vergleich zum Stand der Technik weist der erfindungsgemäße PCR-Nachweis
bedeutende Vorteile auf. So ist er innerhalb 3–4 Stunden bereits beendet
und damit vielmals schneller als sämtliche Wachstums-Nachweismethoden.
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Durch
die Amplifikation nur eines Zielgenfragmentes ist der Test bereits
in der Konzeption robust. Dies ist wichtig, da insbesondere in festen
Lebensmitteln viele inhibitorische Substanzen vorkommen, die zu falsch-negativen
Ergebnissen führen
können.
Der Test ist insbesondere für
den Nachweis von Coliformen in Wasser und festen Lebensmitteln ausgelegt.
In diesen Proben können
auch viele tote oder nicht mehr wachstumsfähige Coliforme enthalten sein.
Solche Keime sind nur mit einer auf PCR basierenden Nachweismethode sensitiv
nachzuweisen.
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Beschreibung der Abbildungen
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1:
Amplifikation von 500 GÄ des
LacZ-Fragments verschiedener coliformer Keime
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Spur
1: Molekulargewichtsmarker VI, Spur 2: Escherichia coli DSM 30083,
Spur 3: Escherichia hermannii DSM 4560, Spur 4: Citrobacter koseri
DSM 4595, Spur 5: Citrobacter sp. DSM 30040, Spur 6: Enterobacter
cloacae BCD 2467, Spur 7: Enterobacter aerogenes DSM 30053, Spur
8: Klebsiella pneumoniae DSM 2026, Spur 9: Raoultella terrigena
DSM 2687, Spur 10: Pantoea agglomerans DSM 3493, Spur 11: Coliformes Isolat
Nr. 82, Spur 12: Negativkontrolle
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2:
Einfluss des Sonden-„Spacer” auf die
ELISA-Ergebnisse beim Nachweis coliformer Bakterien
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Die
kolorimetrische Detektion von jeweils 15 ng Amplifikat nach dem
ELISA-Prinzip erfolgte mit je 5 pmol pro Kavität der Sonden SEQ ID NO: 5 (ohne
5'-dTMP-„Spacer”) oder
SEQ ID NO: 6 (mit 5'-dTMP-„Spacer”).
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Die
PCR wurde mit den Primern SEQ ID NOs: 1 + 2/SEQ ID NO: 4 und genomischer
DNA der folgenden Stämme
durchgeführt:
Escherichia coli DSM 30083, Escherichia hermannii DSM 4560, Escherichia
vulneris DSM 4564, Citrobacter koseri DSM 4595, Citrobacter sp.
DSM 30040, Enterobacter aerogenes DSM 30053, Enterobacter amnigenus
DSM 4486, Enterobacter cloacae BCD 2467, Klebsiella pneumoniae subsp.
pneumoniae DSM 2026, Raoultella terrigena DSM 2687, Pantoea agglomerans
DSM 3493, Rahnella aquatilis DSM 4594, Serratia fonticola DSM 4576,
Yokenella regensburgei DSM 5079 und den coliformen Lebensmittelisolaten
82 und 118-1.
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3:
Ermittlung der Sensitivität
des kompetitiven PCR-ELISA zum Nachweis coliformer Bakterien
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Die
PCR wurde in Gegenwart von 60 Kopien der internen Amplifikationskontroll-DNA
(IAK-coliform) mit den Primern SEQ ID NOs: 1 + 2/SEQ ID NO: 4 und
0,5 bis 500 GÄ der
folgenden Stämme
durchgeführt: Escherichia
coli DSM 30083, Citrobacter sp. DSM 30040, Citrobacter koseri DSM
4595, Enterobacter cloacae BCD 2467, Enterobacter aerogenes DSM
30053, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae ATCC 13883, Klebsiella
pneumoniae subsp. pneumoniae DSM 2026, Roultella terrigena DSM 2687,
Pantoea agglomerans DSM 3493, Escherichia hermannii DSM 4560 sowie
den coliformen Lebensmittelisolaten Nr. 82 und 118-1.
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Die
Detektion der Amplifikate erfolgte mit den Sonden SEQ ID NO: 6 (5
pmol, für
Wildtyp) und der Kontroll-DNA-Sonde (1,5 pmol, für IAK-coliform). Für die Detektion
mit der Kontroll-DNA-Sonde sind die jeweiligen Mittelwerte aller
Teststämme
dargestellt.
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Beispiel 1
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Die
entwickelten PCR-Primer wurden mit isolierter DNA ausgewählter coliformer
Stämme
getestet. Dabei wurden jeweils 500 GÄ der folgenden bakteriellen
Spezies verwendet: Escherichia coli DSM 30083, Escherichia hermannii
DSM 4560, Citrobacter koseri DSM 4595, Citrobacter sp. DSM 30040,
Enterobacter cloacae BCD 2467, Enterobacter aerogenes DSM 30053,
Klebsiella pneumoniae DSM 2026, Raoultella terrigena DSM 2687, Pantoea
agglomerans DSM 3493 und Coliformes Isolat Nr. 82.
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Die
PCR-Reaktion wurde, wie in den folgenden Tabellen 1 und 2 zusammengefasst,
angesetzt und durchgeführt: Tabelle 1: Zusammensetzung des PCR-Nachweistests
für ausgewählte coliforme
Bakterien
| Reagenz | Volumen | Endkonz. |
| 10 PCR-Puffer | 2,0 μl | 1 × |
| Mg Cl2 (50 mM) | 1,0 μl | 2,5
mM |
| dNTP-Mix
(je 10 mM) | 0,4 μl | je
200 μM |
| | SEQ
ID NO: 2 (10 μM) | 1,0 μl | 0,5 μM |
| SEQ
ID NO: 3 (ELISA: SEQ ID NO: 4) (10 μM) | 0,25 μl | 0,125 μM |
| SEQ
ID NO: 1 (10 μM) | 1,25 μl | 0,625 μM |
| Taq DNA-Polymerase | 0,12 μl | 0,03
U/μl |
| DNA-Extrakt | 1 μl | |
| Aqua dest. | ad
20 μl | |
Tabelle 2: Temperaturzyklen der PCR-Reaktion
| | Temperatur
(°C) | Zeit |
| 35 Zyklen | 95 | 20
sek |
| 611 | 40
sek |
| 72 | 15
sek |
| Terminale
Elongation | 72 | 5
min |
- 1Im Sinne der Definition,
der ”stringenten
Hybridisierungsbedingungen” dieser
Anmeldung liegt die Temperatur bei zwischen 55 und 61°C.
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Die
amplifizierten DNA-Fragmente wurden schließlich in einem Agarosegel elektrophoretisch
getrennt und mit Ethidiumbromid visualisiert.
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In 1 ist
deutlich zu erkennen, dass von jedem coliformen Stamm ein charakteristisches
Fragment des LacZ-Gens amplifiziert wurde.
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Beispiel 2
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Unsere
Primer und Sonden wurden in einer Amplifikat-Detektion mittels ELISA
getestet. Dabei wurde insbesondere die Länge der Sonde der SEQ ID NO:
5 optimiert.
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Da
die sterischen Gegebenheiten einen Einfluss auf die Hybridisierung
mit an Festphasen immobilisierten Oligonukleotiden haben, wurde
untersucht, ob die Verlängerung
der Sonde der SEQ ID NO: 5 am 5'-Ende
um fünf
dTMP-Nukleotide, die nicht mit der Ziel-DNA hybridisieren, einen
Einfluss auf die Detektion der Amplifikate hat. Durch diesen sogenannten „Spacer” vergrößert sich
der Abstand der „Fang”-Sonde
von der Wandung der Mikrotiterplatte, und somit der Raum, an dem
Hybridisierung und Detektion der Amplifikate erfolgen.
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Für den Sondenvergleich
wurden amplifizierte LacZ-Fragmente von 16 verschiedenen coliformen
Bakterien eingesetzt. Die Amplifikate wurden mit dem Primerpaar
SEQ ID NOs: 1 + 2/SEQ ID NO: 4 generiert, densitometrisch quantifiziert
und zu jeweils 15 ng für
die ELISA-Detektion eingesetzt. Die ELISA-Detektion erfolgte wie
nachfolgend beschrieben parallel mit jeweils 5 pmol der Sonden SEQ
ID NO: 5 (ohne 5'-„Spacer”) und SEQ ID
NO: 6 (mit 5'-„Spacer”) pro Reaktion.
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Der
Nachweis von Amplifikaten nach dem ELISA-Prinzip erfolgte mittels
einer Antigen/Antikörper
gekoppelten, enzymatischen Farbreaktion in Mikrotiterplatten nach
vorhergegangener Hybridisierung mit Oligonukleotid-Sonden. Die Sonden
waren dabei über
ein biotinyliertes 5'-Ende
an die Streptavidin-Beschichtung der Mikrotiterplatten gebunden.
Die Antigen/Antikörper-Reaktion
mit einem Peroxidase-gekoppelten Antikörper ermöglichte die 5'-Digoxigenin-Markierung
eines Primers.
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Zur
Vorbereitung wurde jeder PCR-Ansatz mit 1 Volumen Denaturierungslösung 2 versetzt
und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, sowie die berechneten Mengen
Sonde und Hybridisierungspuffer miteinander vermischt. Pro Kavität der Mikrotiterplatte
(Biotin-Bindekapazität
7 ng/well) wurden 100 μl
vorgewärmter
Hybridisierungspuffer und 1 bis 5 pmol Sonde verwendet. Nach Ablauf
der Denaturierungszeit wurden jeweils 10 μl Amplifikatlösung in
die Kavitäten
pipettiert und 100 μl
des Hybridisierungspuffer/Sonden-Gemisches
zugefügt.
Die Platten wurden mit Folie abgedeckt und zur Hybridisierung 30
min bei 52°C inkubiert.
Nicht gebundenes Amplifikat wurde durch 4 × 2 min Waschen bei 52°C mit 200 μl vorgewärmten Waschpuffer
I entfernt. Anschließend
erfolgte die Antigen/Antikörper-Reaktion
durch Zugabe von 100 μl/Kavität des 1:3.000
in Waschpuffer 11 verdünnten
Anti-Digoxigenin-POD-Fab-Fragmentes und Inkubation für 30 min
bei 37°C.
Nach 4 × 1
min Waschen mit 200 μl
Waschpuffer II wurden 100 μl
des Reagenz BM-Blue zugegeben. Die Farbreaktion erfolgte für 15 min
bei Raumtemperatur. Nach Zugabe von 100 μl Stopp-Reagenz wurde die Extinktion
im ELISA-Reader bei 450 nm gegen eine Referenzwellenlänge von
650 nm gemessen. Denaturierungslösung
Hybridisierungspuffer
| 2,5 | × | SSC |
| 2 | × | Denhardt's Lösung |
| 10 | mM | Tris-HCl |
| 1 | mM | EDTA |
| | | pH
7,5 |
Waschpuffer
I
| 1 | × | SSC |
| 2 | × | Denhardt's Lösung |
| 10 | mM | Tris-HCl |
| 1 | mM | EDTA |
| | | pH
7,5 |
Waschpuffer
II
| 100 | mM | Tris-HCl |
| 150 | MM | NaCl |
| 0,05 | %
(v/v) | Tween® 20 |
| 0,5 | %
(w/v) | Blocking
Reagenz |
| 100 | μg/ml | Heringsperma-DNA |
| | | pH
7,5 |
Stopp-Reagenz
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Einen
Vergleich der ermittelten Extinktionswerte zeigt 2.
Bei allen 16 LacZ-Amplifikaten
werden mit der um fünf
Nukleotide verlängerten
Sonde der SEQ ID NO: 6 höhere
Extinktionswerte bei der Detektion nach dem ELISA-Prinzip erzielt.
Durchschnittlich waren die Extinktionswerte mit dieser Sonde in
etwa um den Faktor 2,5 höher.
In Abhängigkeit
von der Sequenz des Amplifikats wurden sowohl mit der Sonde der
SEQ ID NO: 5 als auch mit der Sonde der SEQ ID NO: 6 sehr unterschiedliche
Werte ermittelt. Mit der Sonde der SEQ ID NO: 5 schwankten die Extinktionswerte
zwischen 0,2 (Yokenella regensburgei) und 2,7 (E. coli DSM 30083), mit
der Sonde der SEQ ID NO: 6 zwischen 0,4 (Citrobacter sp. DSM 30040)
und dem maximal erreichbarem Wert 4,0 (E. coli DSM 30083).
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Beispiel 3
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Die
Spezifität
des PCR-ELISA-Systems wurde zum einen mit der DNA von definierten
Isolaten und zum anderen mit DNA-Extrakten, die aus kulturellen
Anreicherungen von verschiedenen festen Lebensmitteln sowie Mineral-
und Oberflächenwasserproben
gewonnen wurden, getestet. Die Durchführungsbedingungen der PCR und
des ELISA entsprechen jeweils den Angaben in Beispiel 1 bzw. 2.
Die Fähigkeit
der Isolat-DNA-Extrakte
zu amplifizieren, wurde mit einem Primerpaar, welches universell
bakterielle DNA amplifiziert, überprüft.
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Für den Vergleich
mit einem etablierten, phänotypischen
Nachweisverfahren wurden die Isolate bzw. Anreicherungen auf dem
Chromocult® Coliformen
Agar (CC-Agar) ausplattiert. β-Galaktosidase
positive Enterobacteriaceae bilden auf diesem Agar (bei gleichzeitiger
Expression der β-Glucuronidase)
rote oder violette Kolonien. Die Lebensmittel- und Wasserproben
wurden zudem auf eine etwaige Gasbildung in dem jeweiligen selektiven
Anreicherungsmedium untersucht.
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Tabelle 3: Spezifität des PCR-ELISA für Coliforme
im Vergleich zum mikrobiologischen Nachweis
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A. Testung der DNA von charakterisierten
Isolaten
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B. Testung von Lebensmittel- und Wasserproben
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A.
| | Anteil positiver
Proben | Isolate | Anteil positiver
Proben |
| Isolate | PCR-ELISA | CC-Agar | PCR-ELISA | CC-Agar |
| Budvicia | 1/1 | 1/1 | Proteus | 0/2 | 0/2 |
| Buttiauxella | 1/1 | 1/1 | Providencia | 0/1 | 0/1 |
| Cedecea | 1/1 | 1/1 | Rahnella | 1/1 | 1/1 |
| Citrobacter | 8/8 | 8/8 | Raoultella | 4/4 | 4/4 |
| Edwardsiella | 0/1 | 0/1 | Salmonella | 23/25 | 23/25 |
| Enterobacter | 15/16 | 15/16 | Serratia | 8/8 | 8/8 |
| Erwinia | 1/1 | 1/1 | Yersinia | 2/2 | 2/2 |
| Escherichia | 5/5 | 5/5 | Yokenella | 1/1 | 0/1 |
| Ewingella | 1/1 | 1/1 | coliforme
Isolate | 38/38 | 38/38 |
| Hafnia | 1/2 | 1/2 | Aeromonas | 0/6 | 5/6 |
| Klebsiella | 3/3 | 3/3 | | | |
| Leclercia | 1/1 | 1/1 | Vibrio
sp. BCD 5889 | 0/1 | 1/1 |
| Morganella | 0/1 | 0/1 | Milchsäurebakterien | 0/4 | nicht
bestimmt |
| Pantoea | 5/5 | 5/5 | übrige Spezies | 0/9 | nicht
bestimmt |
B.
| | Anteil positiver
Proben |
| Extrakte | PCR-ELISA | CC-Agar | Gasbildung |
| (feste)
Lebensmittel | 11/40 | 10/40 | 9/40 |
| Mineralwasser | 0/15 | 0/15 | 0/15 |
| Oberflächenwasser | 2/2 | 2/2 | 2/2 |
-
Die
PCR-ELISA-Tests wurde mit dem Primerpaar SEQ ID NOs: 1 + 2/SEQ ID
NO: 4 und der Sonde SEQ ID NO: 6 durchgeführt. Die mikrobiologische Analyse
der Isolate erfolgte durch Einzelkolonieausstrich auf Chromocult® Coliformen
Agar (CC-Agar). Als positiv gelten rote oder violette Kolonien.
-
Die
Tabellen 3A und 3B zeigen eine weitgehende Übereinstimmung zwischen dem
phäno-
und dem genotypischen Nachweis von Coliformen. Innerhalb der Familie
Enterobacteriaceae unterschieden sich die Ergebnisse nur bei den
Typstämmen
der Spezies Moellerella wisconsensis und Yokenella regensburgei.
Yokenella regensburgei DSM 5079 bildete trotz vorhandenem LacZ-Gen
keine roten Kolonien auf CC-Agar.
-
Stark
unterschiedlich fiel der Spezifitätstest bei der Gattung Aeromonas
aus. Im Gegensatz zur Kultivierung auf CC-Agar erfolgte kein falsch-positiver
Nachweis von Aeromonas-Arten mit dem erfindungsgemäßen genotypischen
Detektionssystem. In Sequenz-Alignments konnten die Erfinder erkennen,
dass nicht nur die Kombination der Primer SEQ ID NOs: 1 + 2/SEQ
ID NO: 3 oder SEQ ID NOs: 1 + 2/SEQ ID NO: 4, sondern auch bereits
die einzelnen Primer die Differenzierung zwischen LacZ-tragenden
Coliformen und Aeromonas-Arten leisten.
-
Bei
der Testung der insgesamt 57 Lebensmittel- und Wasserproben differierten
PCR-ELISA und CC-Agar
nur in einer Probe (Nr. 23, Petersilie). Keine Gasbildung wurde
bei den mittels PCR-ELISA positiv getesteten Lebensmittelproben
neben der Petersilie bei den Proben Nr. 18 (Mandeln) und Nr. 40
(Weißwurst) beobachtet.
Die Anreicherung des Haselnusskäse
(Nr. 11) wies bei negativem PCR-ELISA- und CC-Agar-Ergebnis eine
geringe Gasbildung auf.
-
Beispiel 4
-
Zur Überprüfung der
Funktionsfähigkeit
kann eine interne Amplifikationskontrolle verwendet werden. Zur
Herstellung dieser Kontrolle wurde ein LacZ-Fragment aus E. coli
DSM 30083 amplifiziert und in dem pGEM®-T
Vektor kloniert, in E. coli XL1-blue transformiert und amplifiziert.
Das Fragment lässt
sich durch die Primer SEQ ID NOs: 1 + 2/SEQ ID NO: 4 amplifizieren.
Es wird jedoch nicht mit den Sonden der SEQ ID NO: 5 oder 6 „gefangen”, sondern
mit Hilfe einer Sonde, die eine willkürliche im LacZ-Gen nicht vorkommende
Sequenz aufweist. In dem kompletten Testsystem wird die Konzentration
der Kontroll-DNA so eingestellt, dass sie mit der eventuell vorhandenen
Coliformen-DNA um Amplifikation konkurriert. Ist keine Coliformen-DNA
in dem Test, dann wird sie amplifiziert und im ELISA nachgewiesen
und zeigt somit, dass keine inhibitorischen Substanzen die Polymerase-Kettenreaktion
verhindert haben. Anderseits wird die Kontroll-DNA nicht amplifiziert,
wenn signifikante Mengen an Coliformen-DNA in der Probe sind.
-
Optional
kann einer ausgereiften Testversion das Enzym UNG (Uracil-DNA Glycosylase)
und ein modifizierter dNTP-Mix mit dUTP statt dTTP beigefügt werden.
-
Diese
Komposition verhindert die laborinterne Kreuzkontamination mit PCR-Amplifikaten.
-
Beispiel 5
-
Die Überprüfung der
Sensitivität
des kompetitiven coliformen LacZ-PCR-ELISA-Systems wurde im Prinzip
unter den zuvor beschriebenen PCR-Bedingungen durchgeführt. Zusätzlich zu
den Substanzen der Tabelle 1 wurde die Kontroll-DNA (0,2 fg, ca.
60 Kopien) hinzugefügt.
Für den
optimalen Ablauf der PCR wurde eine „Hot-Start”-Taq Polymerase verwendet.
Bei diesem Enzym wird die bei niedrigen Temperaturen durch einen
Antikörper
blockierte DNA-Polymerase erst durch die DNA-Denaturierungstemperatur aktiviert,
wodurch die Wahrscheinlichkeit der Primer-Dimer-Bildung sehr stark minimiert ist.
-
Die
Sensitivitätstestungen
erfolgten mit dekadischen Verdünnungsreihen
der gereinigten DNA von 12 verschieden coliformen Bakterienstämmen. Die
Detektion der Amplifikate erfolgte kolorimetrisch nach dem ELISA-Prinzip
unter Standardbedingungen wie zuvor beschrieben mit der Sonde der
SEQ ID NO: 6.
-
Das
auf dem LacZ-Gen basierende PCR-ELISA-System zum Nachweis von coliformen
Bakterien ermöglicht
den Nachweis von 5 bis 50 Genomäquivalenten.
Bei 9 der 12 getesteten Stämme
wurde ein positives Ergebnis bei Einsatz von 5 GÄ in die PCR erzielt, bei den
restlichen Stämmen
waren dazu 50 GÄ notwendig.
-
Die
Extinktionswerte der Proben mit 0,5 GÄ DNA und die der Negativkontrollen
(in 3 nicht dargestellt) waren vergleichbar und lagen
im Mittel bei 0,04.
-
Beispiel 6
-
Basierend
auf unserem PCR-Nachweissystem für
gesamtcoliforme Bakterien lässt
sich ein Kit zusammenstellen, das eine schnelle Analytik und Abgrenzung
von Aeromonas-Spezies
erlaubt.
-
Ein
solches Kit kann enthalten:
10 × PCR-Puffer
MgCl2 (50 mM Stammlösung)
dNTP-Mix (je 10
mM Stammlösungen)
Taq
DNA-Polymerase
Aqua dest.
Primer der SEQ ID NOs: 1 + 2/SEQ
ID NO: 3 oder SEQ ID NOs: 1 + 2/SEQ ID NO: 4
Sonden der SEQ
ID NO: 5 oder 6
Primer und Sonden der internen Positivkontrolle
Kontroll-DNA
-
Idealerweise
sind einzelne Komponenten des Kits bereits im richtigen Verhältnis vorgemischt.
-
Zur
Detektion kann das Kit außerdem
ELISA-Reagenzien enthalten.
-
Zusammenfassung
-
Die
Erfindung umfasst Primer und Sonden zum Nachweis von coliformen
Bakterien.
-
Ausführungsformen
-
- 1. Ein Verfahren zum Nachweis von Enterobakterien,
die ein LacZ-Gen tragen, wie in Anspr. 1 definiert.
- 2. Ein Verfahren nach Ausführungsform
1, gekennzeichnet dadurch, dass das Verfahren nicht auf dem Wachstum
der Mikroorganismen basiert und in weniger als 12, 16 oder 24 Stunden
durchgeführt
werden kann.
- 3. Ein Verfahren nach Ausführungsform
1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, dass LacZ-Gen-tragende Aeromonas-Arten
nicht detektiert werden.
- 4. Ein Verfahren nach Ausführungsform
1, 2 oder 3, gekennzeichnet dadurch, dass alle coliformen Bakterien
spezifisch und nicht differenzierend nachgewiesen werden.
- 5. Ein Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen,
gekennzeichnet dadurch, dass nur ein Gen des Genoms der Bakterien
analysiert wird.
- 6. Ein Verfahren nach Ausführungsform
5, gekennzeichnet dadurch, dass auf das Vorhandensein des LacZ-Gens
oder von RNA-Transkripten des LacZ-Gens getestet wird, mit Hilfe
von mindestens einem für Coliforme
spezifischen Primer und/oder mindestens einer für Coliforme spezifischen Sonde.
- 7. Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen
1 bis 6, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
a) Inkontaktbringen
der Probe mit einer Kombination aus mindestens zwei ersten Nukleinsäuren (Primern), die
mit dem LacZ-Gen hybridisieren, wobei bevorzugt mindestens einer,
mehr bevorzugt beide mit dem LacZ-Gen aus coliformen Bakterien spezifisch
hybridisieren, bevorzugt unter stringenten Bedingungen;
b)
Amplifikation eines Fragmentes des LacZ-Gens;
c) Inkontaktbringen
des/der in Schritt (b) erhaltenen Amplifikationsfragmente(s) mit
mindestens einer zweiten Nukleinsäure (Sonde), die eine für das LacZ-Gen spezifische Teilsequenz,
bevorzugt eine für
coliforme Bakterien spezifische Teilsequenz, umfasst, wobei die
zweite Nukleinsäure
(Sonde) mit mindestens einem Amplifikationsfragment unter Bildung
mindestens einer Hybridnukleinsäure
hybridisiert, und zwar, bevorzugt spezifisch hybridisiert, mehr
bevorzugt unter stringenten Bedingungen;
d) Nachweis der mindestens
einen Hybridnukleinsäure.
- 8. Verfahren nach Ausführungsform
7, dadurch gekennzeichnet, dass als erste Nukleinsäure (Primer)
eine oder mehrere Nukleinsäuren
verwendet werden, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind:
einer
Nukleinsäure,
die eine Nukleinsäuresequenz
nach SEQ ID Nos: 1 bis 4 oder ein jeweiliges Derivat davon umfasst,
wobei die Derivate wie folgt sind:
a) bevorzugt ein 15 bis
23, mehr bevorzugt 15 bis 20, noch mehr bevorzugt 15 bis 18, Nukleotide
langes Fragment, von irgendeiner der SEQ ID Nos: 1–4;
b)
eine Nukleinsäure,
die mit einer Nukleinsäure
nach irgendeiner der SEQ ID Nos: 1–4 unter stringenten Bedingungen
hybridisiert;
c) eine Nukleinsäure, die mindestens 70%, bevorzugt
75%, bevorzugter 80%, mehr bevorzugt 85%, noch mehr bevorzugt 90%,
am meisten bevorzugt 95%, identisch mit einer Nukleinsäure nach
irgendeiner der SEQ ID Nos: 1–4
ist;
d) eine Nukleinsäure,
in der insgesamt maximal 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 Nukleotid(e) in einer
von SEQ ID Nos: 1–4
substituiert, addiert, deletiert oder insertiert wurden, wobei bevorzugt
die ersten beiden Positionen in SEQ ID Nos: 1–4 jeweils unverändert sind;
e)
eine Nukleinsäure,
die komplementär
zu einer Nukleinsäure
nach (a) bis (d) ist.
- 9. Verfahren nach Ausführungsform
7, dadurch gekennzeichnet, dass als zweite Nukleinsäure (Sonde)
eine oder mehrere Nukleinsäuren
verwendet werden, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind:
einer
Nukleinsäure,
die eine Nukleinsäuresequenz
nach SEQ ID Nos: 5 bis 6 umfasst oder ein jeweiliges Derivat davon,
wobei die Derivate wie folgt sind:
a) bevorzugt ein 15 bis
26, mehr bevorzugt 15 bis 23, noch mehr bevorzugt 15 bis 20, am
bevorzugtesten 15 bis 18, Nukleotide langes Fragment, von irgendeiner
der SEQ ID Nos: 5 oder 6;
b) eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure nach
irgendeiner der SEQ ID Nos: 5 oder 6 unter stringenten Bedingungen
hybridisiert;
c) eine Nukleinsäure, die mindestens 80%, bevorzugt
82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% identisch mit einer
Nukleinsäure
nach irgendeiner der SEQ ID Nos: 5 oder 6 ist;
d) eine Nukleinsäure, in
der insgesamt maximal 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 Nukleotid(e) in einer
von SEQ ID Nos: 1–4
substituiert, addiert, deletiert oder insertiert wurden;
e)
eine Nukleinsäure,
die komplementär
zu einer Nukleinsäure
nach (a) bis (d) ist.
- 10. Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen
7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine
DNA, RNA oder PNA ist.
- 11. Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen
7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass bis zu 20% der Nukleotide
von
a) einem der beiden Primer und/oder
b) der mindestens
einen Sonde,
mindestens jedoch 1 Nukleotid, in 10 aufeinanderfolgenden
Nukleotiden durch Nukleotide ersetzt ist/sind, die in Bakterien
nicht natürlich
vorkommen.
- 12. Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen
7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass in die Nukleinsäure (Primer
und/oder Sonde, bevorzugt in mindestens eine Sonde) zur Erzeugung
eines direkt oder indirekt nachweisbaren Signals eine Modifikation
eingeführt
ist, wobei die Modifikation bestehen kann aus:
(i) einer radioaktiven
Markierung;
(ii) farbigen Gruppen;
(iii) fluoreszierenden
Gruppen;
(iv) chemolumineszierenden Gruppen;
(v) Gruppen
zur Immobilisierung an einer festen Phase und/oder
(vi) Gruppen,
die eine indirekte oder direkte Nachweisreaktion, mit Hilfe von
Antikörpern,
Antigenen, Enzymen und/oder Substanzen mit Affinität zu Enzymen
oder Enzymkomplexen erlauben, oder eine Kombination von Modifikationen
gemäß zwei oder
mehr der unter (i) bis (vi) genannten Modifikationen.
- 13. Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen
7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Amplifizieren eine Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) umfasst.
- 14. Verfahren nach Ausführungsform
13, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
mindestens mit einem der Primer der SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2 und
SEQ ID No: 3 oder der SEQ ID No: 4 oder einem jeweiligen Derivat
davon durchgeführt
wird, wobei bevorzugte Kombinationen für die jeweiligen SEQ ID Nos:
1–4 inklusive
der jeweiligen Derivate (hier in Sammelbezeichnung mit einfachen nrn
abgekürzt: „1–4”) sind:
(1/3), (1/4), (2/3), (2/4), (1,2/3), (1,2/4) und (1,2/3,4).
- 15. Verfahren nach Ausführungsform
13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) mindestens mit einer Kombination der Primer der SEQ ID No:
1, SEQ ID No: 2 und SEQ ID No: 3 oder einem jeweiligen Derivat davon
durchgeführt
wird.
- 16. Verfahren nach Ausführungsform
15, gekennzeichnet dadurch, dass der Primer der SEQ ID No: 3 durch den
Primer der SEQ ID No: 4 oder einem jeweiligen Derivat davon ersetzt
wird, wobei bevorzugte Kombinationen für die jeweiligen SEQ ID Nos:
1–4 inklusive
der jeweiligen Derivate („1–4”) sind:
(1/3), (1/4), (2/3), (2/4), (1,2/3), (1,2/4) und (1,2/3,4).
- 17. Verfahren nach Ausführungsform
13, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
mindestens mit einer der Sonden der SEQ ID No: 5 oder SEQ ID No:
6 oder einem jeweiligen Derivat davon durchgeführt wird.
- 18. Verfahren nach den vorhergehenden Ausführungsformen 13, 14 oder 17,
dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
mindestens mit einer Kombination der Oligonukleotide der SEQ ID
No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3 und SEQ ID No: 5 oder einem jeweiligen
Derivat davon durchgeführt wird.
- 19. Verfahren nach den vorhergehenden Ausführungsformen 13, 14 oder 17,
dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
mindestens mit einer Kombination der Oligonukleotide der SEQ ID
No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 und SEQ ID No: 6 oder einem jeweiligen
Derivat davon durchgeführt wird.
- 20. Verfahren nach Ausführungsform
13, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
eine online- oder realtime-PCR umfasst.
- 21. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 7 bis 12, dadurch
gekennzeichnet, dass das Amplifizieren eine Ligase-Kettenreaktion,
eine isotherme Nukleinsäureamplifikation
oder eine Qss-Replikation umfasst.
- 22. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 7 bis 12, dadurch
gekennzeichnet, dass bei der Amplifikation eine Amplifikationskontrolle
durchgeführt
wird.
- 23. Verfahren nach Ausführungsform
22, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikationskontrolle ein Fragment
des LacZ-Gens umfasst.
- 24. Verfahren nach Ausführungsform
22, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikationskontrolle wie folgt
konzipiert ist:
a) sie wird durch mindestens einem der Primer
der SEQ ID Nos: 1, 2, 3 oder 4, bzw. einer Kombination daraus oder
einem jeweiligen Derivat davon amplifiziert;
b) die Amplifikation
erfolgt in Kompetition mit eventuell vorhandener Wildtyp-DNA coliformer Bakterien;
und
c) das Kontrollamplifikat hybridisiert nicht mit Sonden,
die mit dem LacZ-Gen hybridisieren.
- 25. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 7 oder 13, dadurch
gekennzeichnet, dass die Amplifikate in folgenden Schritten detektiert
werden:
a) Koppeln von Sonden, die mit dem LacZ-Gen hybridisieren
an eine feste Oberfläche,
z. B. durch die Bindung zwischen Biotin der Sonden der SEQ ID Nos:
5 oder 6 oder einem jeweiligen Derivat davon und oberflächengekoppeltem
Avidin;
b) Denaturieren der zu detektierenden Amplikons, so
dass sie als Einzelstrang-DNA vorliegen;
c) Hybridisieren der
nach a) oberflächengekoppelten
Sonden mit den Einzelstrang-Amplikons;
d) Inkontaktbringen
der Hybrid-DNA nach c) mit Molekülen,
die an die Einzelstrang-DNA binden, z. B. Antikörper, die mit der SEQ ID No:
4 oder einem jeweiligen Derivat davon kreuzreagieren; und
e)
Detektion einer Farbreaktion, die durch Enzyme hervorgerufen wird,
die an die Antikörper
nach d) gekoppelt sind.
- 26. Verfahren nach Ausführungsform
25, dadurch gekennzeichnet, dass ein „Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay” (ELISA)
zur Detektion der Amplikons durchgeführt wird.
- 27. Nachweisprimer, der spezifisch Mikroorganismen der Enterobakterien,
die ein LacZ-Gen
tragen oder spezifisch Coliforme amplifiziert (Primer), ausgewählt aus
einer Nukleinsäure,
die eine Nukleinsäuresequenz
nach SEQ ID Nos: 1–4
oder ein jeweiliges Derivat davon umfasst, wobei die Derivate wie
folgt sind:
a) ein 15 bis 23, bevorzugt 15 bis 30, mehr bevorzugt
15 bis 23, noch mehr bevorzugt 15 bis 20, Nukleotide langes Fragment,
von irgendeiner der SEQ ID Nos: 1–4;
b) eine Nukleinsäure, die
mit einer Nukleinsäure
nach irgendeiner der SEQ ID Nos: 1–4 unter stringenten Bedingungen
hybridisiert;
c) eine Nukleinsäure, die mindestens 70%, bevorzugt
75%, bevorzugter 80%, mehr bevorzugt 85%, noch mehr bevorzugt 90%,
am meisten bevorzugt 95%, identisch mit einer Nukleinsäure nach
irgendeiner der SEQ ID Nos: 1–4
ist;
d) eine Nukleinsäure,
in der insgesamt maximal 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 Nukleotid(e) in einer
von SEQ ID Nos: 1–4
substituiert, addiert, deletiert oder insertiert wurden, wobei ersten
beiden Positionen in SEQ ID Nos: 1–4 unverändert sind;
e) eine Nukleinsäure, die
komplementär
zu einer Nukleinsäure
nach (a) bis (d) ist.
- 28. Nachweissonde die spezifisch Mikroorganismen der Enterobakterien,
die ein LacZ-Gen
tragen oder spezifisch Coliforme nachweist (Sonde), ausgewählt aus
einer Nukleinsäure,
die eine Nukleinsäuresequenz
nach SEQ ID Nos: 5 und 6 oder ein jeweiliges Derivat davon umfasst,
wobei die Derivate wie folgt sind:
a) bevorzugt ein 15 bis
26, mehr bevorzugt 15 bis 23, noch mehr bevorzugt 15 bis 20, am
bevorzugtesten 15 bis 18, Nukleotide langes Fragment, von irgendeiner
der SEQ ID Nos: 5 oder 6;
b) eine Nukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure nach
irgendeiner der SEQ ID Nos: 5 oder 6 unter stringenten Bedingungen
hybridisiert;
c) eine Nukleinsäure, die mindestens 80%, bevorzugt
82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% identisch mit einer
Nukleinsäure
nach irgendeiner der SEQ ID Nos: 5 oder 6 ist;
d) eine Nukleinsäure, in
der insgesamt maximal 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 Nukleotid(e) in einer
von SEQ ID Nos: 5 oder 6 substituiert, addiert, deletiert oder insertiert
wurden;
e) eine Nukleinsäure,
die komplementär
zu einer Nukleinsäure
nach (a) bis (c) ist.
- 29. Nukleinsäure
nach einer der Ausführungsformen
27 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass es eine DNA, RNA oder PNA
ist.
- 30. Nukleinsäure
nach einer der Ausführungsformen
27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure dadurch
modifiziert ist, dass bis zu 20% der Nukleotide, mindestens jedoch
1 Nukleotid in 10 aufeinander folgenden Nukleotiden durch Nukleotide
ersetzt sind, die in Bakterien nicht natürlich vorkommen.
- 31. Nukleinsäure
nach einer der Ausführungsformen
27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass in die Nukleinsäure zur
Erzeugung eines direkt oder indirekt nachweisbaren Signals eine
Modifikation eingeführt
wird, wobei die Modifikation bestehen kann aus:
(i) einer radioaktiven
Markierung;
(ii) farbigen Gruppen;
(iii) fluoreszierenden
Gruppen;
(iv) chemoluminiszierenden Gruppen;
(v) Gruppen
zur Immobilisierung an einer festen Phase und/oder
(vi) Gruppen,
die eine indirekte oder direkte Nachweisreaktion, mit Hilfe von
Antikörpern,
Antigenen, Enzymen und/oder Substanzen mit Affinität zu Enzymen
oder Enzymkomplexen erlauben, oder eine Kombination von Modifikationen
gemäß zwei oder
mehr der unter (i) bis (vi) genannten Modifikationen.
- 32. Verwendung einer Nukleinsäure nach einer der Ausführungsformen
27 bis 31 zum Nachweis von Enterobakterien, die ein LacZ-Gen tragen
oder zum spezifischen Nachweis von Coliformen, wie in Anspruch 14
definiert.
- 33. Verwendung einer Nukleinsäure nach Ausführungsform
32 zum Nachweis von Gesamtcoliformen und/oder zur Ausgrenzung von
Aeromonas-Arten.
- 34. Verwendung einer Nukleinsäure nach einer der Ausführungsformen
27 bis 31 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis
26.
- 35. Kit für
den Nachweis von Enterobakterien, die ein LacZ-Gen tragen, oder
Coliformen enthaltend mindestens eine Nukleinsäuren nach den Ausführungsformen.
27 bis 31.
- 36. Kit nach Ausführungsform
35 zum Nachweis von Gesamtcoliformen oder aller Enterobakterien
die ein LacZ-Gen tragen und/oder zur Ausgrenzung von Aeromonas-Arten.
- 37. Kit nach Ausführungsform
36 enthaltend die Nukleinsäuren
der SEQ ID No: 1 und/oder SEQ ID No: 2 und/oder SEQ ID Nos: 3 oder
4 und optional die Sonden der SEQ ID Nos: 5 oder 6.
- 38. Kit nach Ausführungsform
37, enthaltend zusätzlich
eine Amplifikationskontrolle für
die Amplifikationsreaktion.
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der
amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.
