DE69722028T2 - Genetische marker und verfahren zur erkennung von listeria monocytogenes und listeriaspezien - Google Patents

Genetische marker und verfahren zur erkennung von listeria monocytogenes und listeriaspezien Download PDF

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie und die Verwendung von zufällig amplifizierten Nukleinsäurefragmenten (RAPD) zur Selektion genetischer Marker, welche bei der Identifizierung von Bakterien verwendbar sind. Noch spezifischer ausgedrückt betrifft die Erfindung spezifische DNS-Marker-Sequenzen, welche verwendbar zur Detektion von Listeria monocytogenes und Listeria spp. sind, und Verwendung dieser diagnostischen Marker zur Bestimmung, ob ein unbekanntes Bakterium ein Mitglied entweder von Listeria monocytogenes oder Listeria spp. ist.
  • HINTERGRUND
  • Von zentraler Bedeutung auf dem Gebiet der Mikrobiologie ist die Fähigkeit, Mikroorganismen auf dem Niveau von Gattung, Spezies oder Serotyp positiv zu identifizieren. Korrekte Identifizierung ist nicht nur ein wesentliches Werkzeug im Labor, sondern spielt eine signifikante Rolle bei der Kontrolle mikrobieller Kontamination bei der Verarbeitung von Nahrungsmitteln, der Herstellung landwirtschaftlicher Produkte und der Überwachung von Umweltmedien wie Grundwasser. Zunehmende Strenge bei Vorschriften, die für mikrobielle Kontamination gelten, resultierte in einem entsprechenden Anstieg solcher industrieller Ausgangsstoffe, welche der Überwachung von Kontamination unterliegen müssen.
  • Von größtem Interesse ist die Detektion und Kontrolle pathogener Mikroorganismen. Obwohl ein breites Spektrum an Mikroorganismen als pathogen klassifiziert worden ist, hat sich die Aufmerksamkeit in erster Linie konzentriert auf einige wenige Bakterien-Gruppierungen, so wie Escherichia, Salmonella, Listeria und Clostridia. Typischerweise hat sich die Pathogen-Identifizierung gestützt auf Methoden zur Unterscheidung von phänotypischen Aspekten, so wie Wachstums- oder Beweglichkeitscharakteristika, und immunologischen und serologischen Charakteristika. Selektive Anzuchtverfahren und immunologische Methoden sind die traditionellen Methoden der Wahl zur Bakterienidentifizierung und diese können wirkungsvoll sein zur mutmaßlichen Detektion einer großen Anzahl von Spezies innerhalb einer bestimmten Gattung. Diese Methoden sind jedoch zeitaufwändig und unterliegen Irrtümern. Methoden selektiven Wachstums erfordern Kultivieren und Subkultivieren in selektiven Medien, gefolgt von einer subjektiven Analyse durch einen erfahrenen Untersucher. Immunologische Detektion (z. B. ELISA) ist schneller und spezifischer, jedoch erfordert sie immer noch Wachstum einer signifikanten Population von Organismen und Isolierung der relevanten Antigene. Aus diesen Gründen hat sich das Interesse einer Detektion von bakteriellen Pathogenen auf der Basis der Nukleinsäuresequenz zugewendet.
  • Es ist beispielsweise gut bekannt, dass Nukleinsäuresequenzen, die mit den Ribosomen von Bakterien verbunden sind, oft hochkonserviert sind durch Gattungen hindurch und deshalb verwendbar zur Identifizierung sind (Webster, U.S. Pat. Nr. 4.717.653 und U.S. Pat. Nr. 5.087.558; Enns, Lab. Med., 19, 295 (1988); Mordarski, Soc. Appl. Bacteriol. Tech. Ser., 20 (Chem. Methods Bact. Syst.), 41 (1985)). Weisburg et al. ( EP 51736 ) legen eine Methode offen zur Detektion und Identifizierung pathogener Mikroorganismen unter Mitwirkung der PCR-Amplifikation und Markierung eines Zielnukleotids zur Hybridisierung mit 16S rDNS von E. coli. Lane et al. (WO 9015157) unterrichten uns über universelle Nukleinsäuresonden, welche mit konservierten Regionen der 23S- oder 16S-rRNS von Eubakterien hybridisieren.
  • Obwohl bakterielle ribosomale Nukleinsäuren hochkonservierte Sequenzen enthalten, sind sie nicht die einzige Quellen der Basensequenz-Konservierung, welche zur Identifizierung von Mikroorganismen verwendbar ist. Wheatcroft et al. (CA 2055302) beschreiben die Auswahl transponierbarer Elemente, flankiert von einzigartigen DNS-Sequenzen, zur Detektion verschiedener Rhizobium-Stämme. In ähnlicher Weise legen Tommassen et al. (WO 9011370) Polynukleotid-Sonden und Methoden zur Identifizierung und Detektion gram-positiver Bakterien offen. Die Methode von Tommassen et al. stützt sich auf Sonden, welche relativ kurzen Fragmenten des Proteins der äußeren Membran, Omp A, das als hochkonserviert durch die gesamten grampositiven Gattungen hindurch bekannt ist, entsprechen. Atlas et al. ( EP 517154 ) unterrichten uns über eine Nukleinsäure-Hybridisierungsmethode zur Detektion von Giardia sp., basierend auf einem Entwurf von Sonden mit Sequenzen komplementär zu Regionen des Gens, welches für das Giardin-Protein codiert. Webster et al. (U.S. Pat. Nr. 4.717.653) haben auf die Verwendung von rRNS ausgeweitet durch Offenlegung einer Methode zur Charakterisierung von Bakterien, basierend auf dem Vergleich des chromatographischen Musters der Restriktionsendonukleaseverdauten DNS vom unbekannten Organismus mit äquivalenten chromatographischen Mustern von mindestens zwei verschiedenen bekannten Spezies von Organismen. Die verdaute DNS ist hybridisiert oder reassoziiert worden mit Nukleinsäure, die Information ribosomaler RNS enthält, von (oder abgeleitet von) einem bekannten Sonden-Organismus. Die Methode von Webster et al. setzt effektiv einen einzigartigen bakteriellen Nukleinsäure-„Fingerabdruck" ein, welcher einer besonderen Bakteriengattung entspricht, und mit dem unbekannte „Fingerabdrücke" verglichen werden.
  • Methoden zur Identifizierung von Listeria monocytogenes durch Verwendung spezifischer Hybridisierungs-Sonden oder Primer sind bekannt. Beispielsweise unterrichten uns U.S. Pat. Nr. 5.523.205 und JP 05219997 über DNS-Sonden mit der Fähigkeit, mit einem Teil des Genomes von pathogenem Listeria monocytogenes zu hybridisieren, die aber nicht mit den Genomen anderer Listeria-Spezies hybridisieren. DE 4238699 und EP 576842 unterrichten uns über Methoden zur Detektion von Listeria monocytogenes unter Verwendung von Primern, die entworfen wurden, um Amplifikationsprodukte zu ergeben, welche spezifisch für das monocytogenes-Genom sind. EP 576842 diskutiert eine Methode zur Detektion von L. monocytogenes unter Verwendung von Amplifikations-Primern, basierend auf Genen, welche für das hochkonservierte IAP („invasion-associated protein"= Invasions-assoziiertes Protein) von Listeria codiert und WO 9008841 belehrt uns über Nukleinsäure-Sonden, welche fähig sind, mit ribosomaler RNS (rRNS) oder rDNS von Listeria zu hybridisieren, und nicht mit rRNS oder DNS von nicht-Listeria.
  • Die oben beschriebenen Methoden sind verwendbar zur Detektion von Bakterien, aber jede stützt sich auf die Kenntnis eines Genes, Proteins oder einer anderen spezifischen Sequenz, die a priori als hochkonserviert durch eine spezifische Bakteriengruppe hindurch bekannt ist. Eine alternative Methode würde eine ungezielte Analyse von bakterieller genomischer DNS für spezifische nicht-phänotypische genetische Marker, welche allen Spezies dieser Bakterien gemeinsam sind, einbeziehen. Beispielsweise können genetische Marker, die auf einzelnen Punktmutationen beruhen, detektiert werden durch differenzierende DNS-Bandenmuster bei Restriktionsenzym-Analyse. Da Restriktionsenzyme DNS an spezifischen Sequenzen schneiden, resultiert eine Punktmutation innerhalb dieser Stelle im Verlust oder Gewinn einer Erkennungsstelle, wodurch in dieser Region Anlass für Restriktionsfragmente von unterschiedlicher Länge gegeben wird. Mutationen, die durch Insertion, Deletion oder Inversion von DNS-Bereichen verursacht werden, führen auch zu einer Variation der Länge von DNS-Restriktionsfragmenten. Genomische Restriktionsfragmente von unterschiedlicher Länge zwischen Genotypen können bei Southern-Blots (Southern, J. Mol. Biol. 98, 503 (1975)) detektiert werden. Die genomische DNS wird typischerweise verdaut mit einem Restriktionsenzym der Wahl, die Fragmente werden elektrophoretisch getrennt und dann mit einer geeignet markierten Sonde zur Detektion hybridisiert. Die durch diese Methode detektierte Sequenzvariation ist bekannt als Restriktions-Längen-Polymorphismus oder RFLP (Botstein et al., Am. J. Hum. Genet. 342, 314 (1980)). Genetische RFLP-Marker sind insbesondere nützlich zur Detektion genetischer Variation bei phänotypisch stummen Mutationen und dienen als höchst genaue diagnostische Werkzeuge.
  • Eine andere Methode zur Identifizierung polymorpher genetischer Marker wendet DNS-Amplifizierung an unter Verwendung kurzer Primer von willkürlicher Sequenz. Diese Primer sind bezeichnet worden als „zufällig amplifizierte polymorphe DNS" oder „RAPD"-Primer ( siehe Williams et al., Nucl. Acids. Res., 18, 6531 (1990) und U.S. Pat. Nr. 5.126.239; ebenso EP 0543484 A2 , WO 92/07095, WO 92/07948, WO 92/14844 und WO 92/03567). Die RAPD-Methode amplifiziert entweder doppel- oder einzelsträngige, ungezielte, willkürliche DNS-Sequenzen unter Verwendung von Standard-Amplifizierungs-Puffern, dATP, dCTP, dGTP und dTTP, und einer thermostabilen DNS-Polymerase wie Taq. Die Nukleotidsequenz der Primer ist typischerweise etwa 9 bis 13 Basen lang, zwischen 50 und 80% G+C in der Zusammensetzung und enthält keine palindromischen Sequenzen. RAPD-Detektion von genetischen Polymorphismen stellt einen Fortschritt dar gegenüber RFLP, indem sie weniger zeitaufwändig, informativer und leicht zugänglich für Automatisierung ist. Aufgrund ihrer Empfindlichkeit zur Detektion von Polymorphismen sind RAPD-Analyse und Variationen, welche auf RAPD/PCR-Methoden basieren, die Methoden der Wahl geworden zum Analysieren genetischer Variation innerhalb von Spezies oder nahe verwandten Gattungen, sowohl im Tier- wie auch im Pflanzenreich. Beispielsweise diskutieren Landry et al. (Genome, 36, 580 (1993)) die Verwendung von RAPD-Analyse zur Unterscheidung verschiedener Spezies von winzigen parasitären Wespen, die morphologisch nicht voneinander unterscheidbar sind. Van Belkurn et al. (Mol. Biochem Parasitol., 61, 69 (1993)) unterrichtet uns über die Verwendung von PCR-RAPD zur Unterscheidung verschiedener Spezies von Giardia.
  • In der gemeinschaftlich zuerkannten U.S. Pat. Nr. 5.340.728 legen die Patentanmelder eine Methode offen von „double-nested" PCR, welche verwendet wird, um die Anwesenheit von einem spezifischen Mikroorganismus zu detektieren. Diese Offenlegung beschreibt erstmalig die Identifizierung eines zufälligen einzigartigen DNS-Segments für jeden individuellen Mikroorganismus, welches für diesen Mikroorganismus diagnostisch sein wird. Um dieses diagnostische Nukleinsäuresegment zu identifizieren und zu erhalten, wird eine Serie von polymorphen Markern von jedem interessierenden Organismus erzeugt unter Verwendung von Einzel-Primer-RAPD-Analyse. Die RAPD-Serie von jedem Organismus wird verglichen mit ähnlich erzeugten RAPD-Serien für andere Organismen, und ein RAPD-Marker, einzigartig für alle Mitglieder der Gruppe wird dann ausgewählt. Der einzigartige Marker wird dann isoliert, amplifiziert und sequenziert. Äußere Primer und innere Primer geeignet für „double-nested"-PCR von jedem Marker können dann entwickelt werden. Diese Primer umfassen Sequenzsegmente innerhalb der RAPD-Marker, wobei der innere Primersatz komplementär zu den 3'-Enden des Zielstückes der Nukleinsäure sein wird. Diese „nested"-Primer können dann verwendet werden für „nested"-PCR-Amplifikation, um definitiv die Anwesenheit von einem spezifischen Mikroorganismus zu detektieren.
  • Bei der gemeinschaftlich eigenen (W0 95/33854) haben die Patentanmelder diese RAPD-Methodologie zur Identifizierung einer Sequenz oder eines Markers eingehender angepasst und beschrieben. Die Gegenwart des Markers ist diagnostisch für alle Individuen der Gattung Salmonella. WO 95/33854 lehrt eine Methode, die eine RAPD-Amplifizierung von genomischer DNS einer repräsentativen Anzahl von Salmonella-Individuen einbezieht, zur Produktion eines RAPD-Amplifizierungsproduktes, bezeichnet als das diagnostische Fragment. Dieses diagnostische Fragment muss in den RAPD-Profilen anwesend sein bei über 90% der untersuchten Individuen. Sequenzinformation vom diagnostischen Fragment ermöglicht die Identifizierung der am besten geeigneten Bindestellen für PCR-Primer innerhalb des diagnostischen Fragmentes, um einen einzigartigen diagnostischen Marker zu definieren. Primer, die diesen Marker flankieren, sind verwendbar zur Erzeugung von Amplifikationsprodukten genomischer DNS von Salmonella, aber werden keine Amplifikationsprodukte produzieren in Nicht-Salmonella-Gattungen.
  • Bei der gemeinschaftlich eigenen U.S. Patent Nr. 5.747.257 legen die Patentanmelder eine Methode, diagnostische Sequenzen und Primer offen, die bei der Identifizierung von Escherichia coli Serotyp 0157:H7 verwendbar sind. Die Methode bezieht die Identifizierung eines RAPD-amplifizierten DNS-Fragmentes ein, das 0157:H7 Escherichia coli gemeinsam ist, die Identifizierung der am stärksten konservierten Regionen dieses Fragmentes und die Präparation spezifischer Primer, verwendbar zur Detektion der Gegenwart eines Markers innerhalb des Fragmentes, wodurch der Primersatz dann verwendbar ist bei der Identifizierung von allen 0157:H7 Escherichia coli. Diese Methode unterrichtet uns nicht über Marker, die verwendbar sind zur spezifischen Identifizierung von Listeria monocytogenes und Listeria spp..
  • Eine Detektionsmethodologie unter Verwendung von PCR/RAPD spezifisch für Listeria monocytogenes und Listeria spp. würde von hohem Nutzen in der Nahrungsmittelindustrie sein. Detektionsverfahren, die nicht abhängig sind von Sequenzen, die von einem bekannten Gen stammen oder mit einem bekannten phänotypischen Charakteristikum von Listeria monocytogenes und Listeria spp. verbunden sind, sind zuvor noch nicht offengelegt worden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Methode bereit zur spezifischen Identifizierung von Listeria monocytogenes und Listeria spp. unter Verwendung diagnostischer genetischer Marker.
  • Ein Verfahren wird bereitgestellt zur Bestimmung, ob ein unbekanntes Bakterium Listeria monocytogenes ist, welches einbezieht:
    • (A) Amplifizieren genomischer DNS von (i) einer Positiv-Testgruppe von Listeria monocytogenes-Stämmen und (ü) einer Negativ-Testgruppe von nicht-monocytogenes Listeria-Stämmen mit einem Primer, der sich von einem diagnostischen Prä-Marker-Fragment für Listeria monocytogenes ableitet, ausgewählt aus der Gruppe von Nukleinsäuren, welche SEQ ID NOS: 17, 18 und 19 entsprechen, um ein diagnostisches Fragment von 1300 bp (Basenpaaren) jeweils für die Positiv- und die Negativ-Testgruppen zu erzielen;
    • (B) Auswahl mindestens eines diagnostischen Marken von Listeria monocytogenes, welcher innerhalb des diagnostischen Fragments enthalten ist, durch Vergleich des diagnostischen Fragments, erhalten bei Amplifikation von der Positiv-Testgruppe, mit dem diagnostischen Fragment, erhalten bei Amplifikation von der Negativ-Testgruppe, wobei mindestens ein hochkonservierter Bereich im diagnostischen Fragment der Positiv-Testgruppe identifiziert wird, welcher zu weniger als 90% homolog ist zu jedem Mitglied der Negativ-Testgruppe;
    • (C) Entwurf mindestens eines Amplifikationsprimers, der dem einen diagnostischen Marker, der in Schritt (B) mindestens identifiziert wurde, entspricht; und
    • (D) Amplifizieren genomischer DNS des unbekannten Bakteriums bei geeigneten Annealing-Temperaturen mit dem zumindest einen Amplifikationsprimer von Schritt (C), wobei der Erhalt von mindestens einem Amplifikationsprodukt anzeigt, dass das unbekannte Bakterium Listeria monocytogenes ist.
  • Das Verfahren verwendet vorzugsweise diagnostische Prä-Markerfragmente von Listeria monocyrogenes, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Nukleinsäuren besteht, die SEQ ID NOS: 20-23 entsprechen. Das Verfahren verwendet vorzugsweise diagnostische Fragmente von Listeria monocytogenes, die mindestens zu 83% homolog sind zu SEQ ID NOS: 24-31 und 33-40. Das Verfahren verwendet vorzugsweise diagnostische Fragmente, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Nukleinsäuren besteht, die SEQ ID NOS: 24-31 und 33-40 entsprechen. Das Verfahren verwendet vorzugsweise mindestens einen diagnostischen Marker, welcher in Schritt (B) ausgewählt wurde, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Nukleinsäuren besteht, die SEQ ID NOS: 46-83 entsprechen.
  • Vorzugsweise haben die verwendeten Amplifikationsprimer eine Länge von etwa 15 bis 30 bp und die geeigneten Annealing-Temperaturen liegen im Bereich von etwa 60°C–70°C.
  • Es wird ebenfalls ein Verfahren bereitgestellt zur Bestimmung, ob ein unbekanntes Bakterium ein Mitglied der Gattung Listeria ist, umfassend
    • (A) Amplifizieren genomischer DNS von (i) einer Positiv-Testgruppe von Listeria monocytogenes-Stämmen und (ii) einer Negativ-Testgruppe von nicht-monocytogenes Listeria-Stämmen mit einem Primer, welcher sich von einem diagnostischen Prä-Marker-Fragment für Listeria monocytogenes-Stämme ableitet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, welche SEQ ID NOS: 17, 18 und 19 entsprechen, um ein diagnostisches 1300 bp-großes Fragment jeweils für die Positiv- und die Negativ-Testgruppen zu erzielen;
    • (B) Auswahl mindestens eines Listeria-gattungsspezifischen diagnostischen Markers, welcher enthalten ist innerhalb des diagnostischen Fragmentes, durch Vergleich des diagnostischen Fragmentes, welches bei Amplifikation von der Positiv-Testgruppe erhalten wird, mit dem diagnostischen Fragment, welches bei Amplifikation von der Negativ-Testgruppe erhalten wird, wobei mindestens ein hochkonservierter Bereich im diagnostischen Fragment der Positiv-Testgruppe identifiziert wird, welcher mindestens zu 90% homolog ist zur entsprechenden Positiv-Testgruppe des diagnostischen Fragmentes;
    • (C) Entwurf von Amplifikationsprimern, die dem einen diagnostischen Listeriagattungsspezifischen Marker, welcher in Schritt (B) mindestens ausgewählt wird, entsprechen; und
    • (D) Amplifikation genomischer DNS des unbekannten Bakteriums bei geeigneten Annealing-Temperaturen mit den Amplifikationsprimern von Schritt (C), wobei der Erhalt von Amplifikationsprodukten anzeigt, dass das unbekannte Bakterium ein Mitglied der Gattung Listeria ist.
  • Das gattungsspezifische Verfahren verwendet bei Schritt (A) vorzugsweise ein diagnostisches Fragment, welches zu 83% homolog ist zu einem von SEQ ID NOS: 24-31 und 33-40. Das Verfahren verwendet bei Schritt (A) vorzugsweise ein diagnostisches Fragment ausgewählt aus der Gruppe, die aus Nukleinsäuren besteht, die SEQ ID NOS: 24-31 und 33-40 entsprechen. Das Verfahren verwendet vorzugsweise diagnostische Prä-Marker-Fragmente von Listeria monocytogenes ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Nukleinsäuren besteht, die SEQ ID NOS: 20-23 entsprechen. Das Verfahren verwendet vorzugsweise diagnostische Marker ausgewählt bei Schritt (B) aus der Gruppe, welche aus Nukleinsäuren besteht, die SEQ ID NOS: 84-110 entsprechen. Vorzugsweise verwendet dieses Verfahren Amplifikationsprimer mit einer Länge von 15 bis 30 bp und verwendet eine geeignete Annealingtemperatur im Bereich von etwa 60°C bis 70°C.
  • Ein Hybridisierungsverfahren zur Bestimmung, ob ein unbekanntes Bakterium Listeria monocytogenes ist, wird bereitgestellt, umfassend das in Kontakt bringen der genomischen DNS des unbekannten Bakteriums mit einer Nukleinsäure-Sonde, welche ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuresequenzen, die SEQ ID NOS: 46-83 entsprechen, und anschließend Detektion der Hybridisierung von der Nukleinsäuresonde mit der genomischen DNS. Ein gattungsspezifisches Hybridisierungsverfahren zur Bestimmung, ob ein unbekanntes Bakterium Listeria monocytogenes ist, wird bereitgestellt, umfassend das in Kontakt bringen der genomischen DNS des unbekannten Bakteriums mit einer Nukleinsäuresonde, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuresequenzen, die SEQ ID NOS: 84-110 entsprechen, und anschließend Detektion der Hybridisierung von der Nukleinsäuresonde mit der genomischen DNS.
  • Isolierte Nukleinsäurefragmente werden bereitgestellt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Nukleinsäurefragmenten, die SEQ ID NOS: 17 durchgehend bis 110 entsprechen. Isolierte Nukleinsäurefragmente werden bereitgestellt, welche für die Aminosäuresequenz codieren, wie sie in einer von SEQ ID NOS: 32 und 41-45 angegeben ist. Diese Erfindung stellt weiterhin isolierte Nukleinsäurefragmente mit SEQ ID NOS: 17-110 bereit.
  • Detaillierter beziehen die Verfahren die folgenden Schritte ein:
    • (i) RAPD-Analyse: Die genomische DNS von Positiv- und Negativ-Testgruppen einer repräsentativen Anzahl von Individuen von Listeria monocytogenes wurde amplifiziert unter Verwendung von RAPD-Primern. Bei der Positiv-Testgruppe, die aus 20 Stämmen von Listeria monocytogenes bestand, und der Negativ-Testgruppe, die aus 25 Stämmen von nicht-monocytogenes Listeria spp. bestand, ergab RAPD-Amplifikation einige Amplifikationsprodukte spezifisch für die Positiv-Testgruppe, die nicht bei der Negativ-Testgruppe gesehen wurden. Die RAPD-Marker-Profile für Individuen der Positiv-Testgruppe wurden verglichen mit den RAPD-Marker-Profilen für Individuen der Negativ-Testgruppe, und ein Nukleinsäurefragment wurde ausgewählt, wobei das Fragment in allen RAPD-Marker-Profilen der Positiv-Testgruppe vorhanden war und in den RAPD-Marker-Profilen der Negativ-Testgruppe fehlte. Dieses Fragment wurde als eine „Prä-Marker-Sequenz" bezeichnet.
    • (ii) Sequenzieren: Die Nukleotide der Prä-Marker-Sequenz von Schritt (i) wurden sequenziert, um verfügbare Primer-Bindestellen zu identifizieren.
    • (iii) Bewertung der Prä-Marker-Sequenz auf Listeria-monocytogenes-Spezifität: Einzelne Primer, abgeleitet von der Prä-Marker-Sequenz, wurden ausgewählt. Diese Primer produzierten Einzel-Amplifikationsprodukte bei Verwendung zur Amplifikation genomischer DNS von Listeria monocytogenes.
    • (iv) Bestimmung und Isolierung des diagnostischen Fragmentes: Sequenzen der flankierenden Regionen der Prä-Marker-Sequenz wurden bestimmt und offenbarten ein diagnostisches Fragment von 1300 bp. Sequenzierung des diagnostischen Fragmentes bei Listeria monocytogenes und nichtmonocytogenes Listeria offenbarte konservierte Regionen, spezifisch sowohl für Listeria spp. im Allgemeinen als auch Listeria monocytogenes im Besonderen. Amplifikationsprimer wurden entworfen basierend auf diesen konservierten Regionen.
    • (v) Vorläufige Auswahl diagnostischer Primer von Listeria monocytogenes auf der Basis der Sensitivität gegenüber der Annealing-Temperatur: Primer, die einzigartig für Listeria monocytogenes sind, wurden identifiziert basierend auf dem diagnostischen Fragment. Primerpaare wurden ausgewählt auf Basis ihrer Fähigkeit, der Bildung nichtspezifischer Amplifikationsprodukte zu widerstehen, wenn die Annealing-Temperaturen herabgesetzt wurden.
    • (vi) Endgültige Auswahl diagnostischer Primer von Listeria monocytogenes: Die Primer von Schritt (v) wurden verwendet bei der Amplifikation genomischer DNS einer großen Gruppe von Listeria monocytogenes (Positiv-Testgruppe) und nicht-monocytogenes Spezies (Negativ-Testgruppe) unter spezifischen Annealing-Bedingungen, zur Bestätigung der Spezifität dieser Primer für die Detektion von Listeria monocytogenes.
    • (vii) Voruntersuchung der Selektivität für diagnostische Primer von Listeria spp.: Primer, die einzigartig für Listeria spp. sind, wurden identifiziert basierend auf dem diagnostischen Fragment. Primerpaare wurden ausgewählt aufgrund ihrer Fähigkeit, L. spp. spezifisch zu detektieren.
    • (viii) Auswahl diagnostischer Primer von Listeria spp. aufgrund der Sensitivität gegenüber der Annealing-Temperatur: Die Primerpaare von Schritt (vii) wurden gescreent aufgrund ihrer Fähigkeit, der Bildung nichtspezifischer Amplifikationsprodukten zu widerstehen, wenn die Annealing-Temperaturen vermindert werden.
    • (ix) Endgültige Auswahl diagnostischer Primer von Listeria spp.: Die Primer von Schritt (viii) wurden verwendet bei der Amplifikation genomischer DNS einer großen Gruppe von Listeria spp. (Positiv-Testgruppe) und Nicht-Listeria spp. (Negativ-Testgruppe) unter spezifischen Annealing-Bedingungen, zur Bestätigung der Spezifität dieser Primer für die Detektion von Listeria spp..
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • 1 ist ein Gel, dass RAPD-Bandenmuster für Listeria monocytogenes-Stämme zeigt, die Negativ- und Positiv-Testgruppen umfassend, amplifiziert mit dem 12-meren Primer 12CN015. Die spezifischen Bahnen werden in Tabelle 3 identifiziert..
  • 2 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von L. monocytogenes #647, L. innocua DP #4450, L. seeligeri DP #3327, L. welshimeri DP #3359 und L. ivanovii DP #3340.
  • 3 zeigt die für Listeria monocytogenes einzigartigen spezifischen diagnostischen Primersequenzen, lokalisiert bei 1515(rc341.zweimalig)-26-363, 1515(rc341.zweimalig)-27-281, 1515-26-36, 1515-27-357, 1515-26-rc233, 1515(8585)-27-rc737 und 1515(8585)-28-rc793 und einen Vergleich von Sequenzen der Priming-Stelle für Stämme, welche die folgenden Spezies repräsentieren: L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri und L. ivanovii.
  • 4A- 4C sind Gele, die das Auftreten von anomalen und falsch positiven Amplifikationsprodukten veranschaulichen bei Verminderung der Annealing-Temperatur für das 1515-26-36/1515-26-rc233-Primer-Paar. Die spezifischen Bahnen werden in Tabelle 7 identifiziert.
  • 5A zeigt die Bandenmuster der PCR-Produkte von Listeria monocytogenes-Stämmen für die Positiv-Testgruppe, amplifiziert mit dem Primer-Paar 1515-27-357/1515(8585)-27-rc737. Die spezifischen Bahnen werden identifiziert in Tabelle 8, Spalte A.
  • 5B zeigt die Muster der PCR-Produkte von Listeria monocytogenes-Stämmen für die Negativ-Testgruppe, amplifiziert mit dem Primer-Paar 1515-27-357/1515(8585)-27-rc737. Die spezifischen Bahnen werden identifiziert in Tabelle 8, Spalte B.
  • 6 ist ein Gel, das die sieben Listeria spp.-spezifischen Primer-Sequenzen zeigt, lokalisiert bei 1515-30-76, 1515-30-88,1515(8585)-30-624,1515(8585)-30-rc483,1515(8585)-30-rc555,1515(8585)-30-rc573 und 1515(8585)-30-rc824 und einen Vergleich von Sequenzen der Priming-Stellen für Stämme, welche die folgenden Spezies repräsentieren: L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri und L. ivanovii.
  • 7 ist ein Gel, dass die Antwort der Listeria spp.-Positiv-Testgruppe zeigt für PCR-Produkte, erzeugt vom Primer-Satz 1515-30-76/1515(8585)-30-rc555. Die spezifischen Bahnen werden identifiziert in Tabelle 11.
  • 8A- 8B ist ein Gel, das die Antwort der Listeria spp.-Negativ-Testgruppe zeigt für PCR-Produkte, erzeugt vom Primer-Satz 1515-30-76/1515(8585)-30-rc555. Die spezifischen Bahnen werden identifiziert in Tabelle 12.
  • Die Patentanmelder haben 110 Sequenzprotokolle bereitgestellt in Konformität mit 37 C. F. R. 1.821-1.825 und Anhängen A and B ("Requirements for Application Disclosure Containing Nucleotides and/or Amino Acid Sequences") und in Konformität mit "Rules for the Standard Representation of Nucleotide and Amino Acid Sequences in Patent Applications" und Anlagen I und II zum Beschluss des Präsidenten des EPA, veröffentlicht in Beilage Nr.2 zum ABl. EPA, 12/1992.
  • Die Sequenzen von SEQ ID NOS: 1-16 sind willkürliche Primer von 12 Basen, die bei der Erzeugung von RAPD-Mustern verwendet werden. Diese werden ebenfalls in Tabelle 1 gezeigt. Die Sequenzen von SEQ ID NOS: 17-19 sind Einzel-Primer, abgeleitet von den Prä-Marker-Sequenzen. Diese werden ebenfalls in Tabelle 2 gezeigt. SEQ ID NOS: 20 und 21 stellen die Prä-Marker-Sequenz für Stamm #647 dar und SEQ ID NOS:22 und 23 stellen die Prä-Marker-Sequenz dar für Stamm #1324. Die Aminosäurezusammensetzung für alle L. monocytogenes-Stämme wird dargestellt in SEQ ID NO: 32. Sequenzen, die SEQ ID NOS: 24-31 und 33-40 entsprechen sind diagnostische Fragmente; Sequenzen, die SEQ ID NOS: 32 und 41-45 entsprechen, sind offene Leserahmen, die für Aminosäuresequenzen codieren.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Bei dem vorliegenden Verfahren haben die Patentanmelder RAPD-Amplifikation genomischer DNS von Listeria monocytogenes und Listeria spp. verwendet, um diagnostische Fragmente und Primer zu entdecken, die verwendbar für die spezifische Detektion von Listeria monocytogenes und Listeria spp. sind.
  • Die Fragmente werden verwendet, um spezifische Primer von den am meisten konservierten Regionen zu erzeugen, zur Verwendung in einer PCR-Untersuchung, die Amplifikationsprodukte, spezifisch entweder für Listeria monocytogenes oder für Listeria spp., produzieren wird.
  • Das Verfahren des Patentanmelders ist in folgender Hinsicht unterscheidend. Um Listeria monocytogenes unter allen anderen Listeria oder Listeria spp. unter allen anderen Bakterien zu detektieren, muss das Verfahren erfolgreich sein bei der Bestimmung der am meisten konservierten Bereiche des diagnostischen Fragmentes von einem phänotypisch uncharakterisierten DNS-Segment, das allen Listeria monocytogenes oder allen Listeria spp. gemeinsam ist. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird erkennen, dass Sequenzkonservierung sowohl Helfer als auch Gegner sein kann bei der Identifizierung von Mitgliedern einer bestimmten Gattung. Beispielsweise sind viele Bakterien-Sequenzen über Gattungen hinweg konserviert, und diese würden bei der Bestimmung von Spezies innerhalb einer bestimmten Gattung nicht nützlich sein. Aus genau diesem Grund stützen sich die bereits auf diesem Fachgebiet bekannten Verfahren in erster Linie auf die Analyse von Sequenzen, die sich von Proteinen oder Genen ableiten, die als spezifisch für eine bestimmte Gattung bekannt sind, z. B. ribosomale RNS oder für Toxin-codierende Gene. Das Verfahren des Patentanmelders weicht von dieser Technik ab insofern, dass die konservierten Sequenzen der Erfindung sich weder von einem bekannten Gen ableiten, noch die Sequenz mit einem bekannten phänotypischen Charakteristikum verbunden ist.
  • Die folgenden Bezeichnungen können wie hierin verwendet zur Interpretation der Ansprüche und der Spezifizierung verwendet werden.
  • „Nukleinsäure" bezieht sich auf ein Molekül, welches einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann, umfassend Monomere (Nukleotide), die einen Zucker, Phosphat und entweder ein Purin oder ein Pyrimidin enthalten. Bei Bakterien, niedrigeren Eukaryonten und bei höheren Tieren und Pflanzen bezieht sich „Desoxyribonukleinsäure"(DNS) auf das genetische Material, während „Ribonukleinsäure"(RNS) bei der Translation der Information von DNS zu Proteinen beteiligt ist.
  • Der Ausdruck „Primer-gerichtete Amplifikation" bezieht sich auf jedes einer Anzahl von bei diesem Fachgebiet bekannten Verfahren, welches eine logarithmische Amplifizierung von Nukleinsäure-Molekülen ergibt durch Verwendung der Erkennung einer spezifischen Nukleinsäure-Sequenz oder – Sequenzen, um einen Amplifizierungsprozess zu initiieren. Die Patentanmelder ziehen in Betracht, dass Amplifizierung nach einem von verschiedenen Arbeitsplänen, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, ausgeführt werden könnte, einschließlich -aber nicht darauf beschränkt- der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder der Ligase-Kettenreaktion (LCR). Wenn die PCR-Methodologie ausgewählt wird, schließt das Amplifizierungsverfahren eine Zusammensetzung der Replikation ein, bestehend aus, beispielsweise, Nukleotid-Triphosphaten, zwei Primern mit geeigneten Sequenzen, DNS- oder RNS-Polymerase und Proteinen. Diese Reagenzien und Details, welche die Verfahren für ihre Verwendung bei der Amplifizierung von Nukleinsäuren beschreiben, werden bereitgestellt in U.S. Pat. Nr. 4.683.202 (1987, Mullis et al.) und U.S. Pat. Nr. 4.683.195 (1986, Mullis et al.).
  • Der Ausdruck „Prä-Marker-Sequenz" bezieht sich auf ein DNS-Fragment von 414 bp, welches einen internen Bereich des diagnostischen Fragmentes darstellt.
  • Dar Ausdruck „abgeleitet von" mit Bezug auf einen Amplifikations-Primer, bezieht sich auf die Tatsache, dass die Sequenz des Primers ein Fragment der Sequenz ist, von der er „abgeleitet" worden ist.
  • Das Fragment wird immer in einer Orientierung 5' zu 3' aufgezeichnet. Der verwendbare Größenbereich der Primer-Sequenz für PCR-Amplifikation ist etwa 15 Basenpaare bis etwa 30 Basenpaare lang.
  • Ein „diagnostisches Fragment" bezieht sich auf eine besondere DNS-Sequenz, die hoch konserviert ist zwischen den Individuen einer besonderen genetisch verwandten Population, zum Beispiel, einer Gattung, Spezies oder eines Serotyps von Bakterien. Bei der augenblicklichen Erfindung wird der Ausdruck „diagnostisches Fragment" verwendet in Bezug auf die Zusammensetzung von jenem DNS-Fragment, das während der RAPD-Amplifikation erzeugt wird, und solcher Fragmente, die erzeugt werden bei Amplifikation mit Einzel-Primern, welche von der Prä-Marker-Sequenz stammen, wobei diese Fragmente vorhanden sind bei den RAPD- und den Einzel-Primer-Amplifikationsprofilen entweder von 1) allen Listeria monocytogenes und abwesend bei denen von anderen Listeria spp. oder 2) vorhanden bei allen Listeria spp., aber abwesend bei Profilen von Nicht-Listeria-Spezies. Der Ausdruck „diagnostischer Marker" wird hierin verwendet in Bezug auf den Teil des diagnostischen Fragmentes, welcher angezielt werden kann, um ein Amplifikationsprodukt entweder nur bei Listeria monocytogenes oder nur bei Listeria spp. zu produzieren. Der diagnostische Marker ist nur in dem Organismus vorhanden, welcher auf der erwünschten Klassifizierungsstufe (d. h. Spezies oder Gattung) identifiziert werden soll, und Versuche, die diagnostischen Marker in Individuen ohne dieses Ziel zu amplifizieren, werden kein Amplifikationsprodukt ergeben. Innerhalb des Kontextes der vorliegenden Erfindung schließen diagnostische Fragmente, welche diagnostische Marker für Listeria monocytogenes und Listeria spp. sind und verwendbar bei der Erfindung des Anmelders, die Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NOS: 24-31 und 33-40 ein von etwa 1300 bp, welche einen offenen Leserahmen von 855 bp einschließen, der für ein Peptid codiert wie bei SEQ ID NOS: 32 angegeben.
  • Die Ausdrücke „konserviert" oder „hochkonserviert" beziehen sich auf einen Grad an Ähnlichkeit, welcher zwischen 2 oder mehr Nukleinsäure-Fragmenten besteht, wobei eine Basenähnlichkeit zwischen den Fragmenten von mindestens 90% besteht. Der Ausdruck „Basenähnlichkeit" bezieht sich auf die Verwandtschaft zwischen der Nukleotidsequenz von zwei Nukleinsäuremolekülen. Bewertungen solcher Ähnlichkeit werden entweder durch DNS-DNS- oder DNS-RNS-Hybridisierung bereitgestellt unter Stringenzbestimmungen, wie es für Fachleute auf diesem Gebiet gut verständlich ist (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Band 1, 2, 3 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)).
  • Der Ausdruck „Primer" bezieht sich auf ein Nukleinsäure-Fragment oder eine -Sequenz, die komplementär mindestens zu einem Abschnitt entlang eines Stranges der Nukleinsäureprobe sind, wobei der Zweck des Primen ist, die Nukleinsäure-Replikation eines Teils der Nukleinsäureprobe entlang dieses Stranges zu fördern und zu lenken. Primer können entworfen werden, um komplementär zu spezifischen Segmenten einer Zielsequenz zu sein. Bei PCR wird beispielsweise jeder Primer verwendet in Kombination mit einem anderen Primer, die einen „Primer-Satz" oder ein „Primer-Paar" bilden; dieses Paar flankiert die Zielsequenz, die amplifiziert werden soll. Bei RAPD-Amplifikation werden willkürliche Einzel-Primer verwendet, um ungezielte Segmente von Nukleinsäure zu amplifizieren, die zwischen den Stellen der Primer-Sequenz auf gegenüberliegenden DNS-Strängen lokalisiert sind. Der Ausdruck „Primer" als solcher wird allgemein vom Anmelder verwendet, um jedes sequenzbindende Oligonukleotid zu umfassen, welches die Initiierung des Nukleinsäure-Replikationsprozesses bewirkt. „Diagnostische Primer" wird sich auf Primer beziehen, die entworfen werden mit Sequenzen, welche komplementär sind zu Primer-Bindestellen auf dem diagnostischen Marker. Diagnostische Primer sind nützlich zur bequemen Detektion und Identifikation diagnostischer Marker, die spezifisch für Listeria monocytogenes und Listeria spp. sind.
  • Eine „genetisch verwandte Population" bezieht sich auf jede Gruppierung von Mikroorganismen, die vielfache oder einzelne genotypische oder phänotypische Charakteristika besitzen von ausreichender Ähnlichkeit, um den Organismen zu erlauben, klassifiziert zu werden als eine einzelne Gattung, Spezies oder Subspezies von Bakterien. Zum Zweck der vorliegenden Offenbarung schließen Beispiele genetisch verwandter Populationen beispielsweise Listeria monocytogenes und Listeria spp. ein.
  • Eine „Testgruppe" bezieht sich auf eine bestimmte Gruppe von Organismen oder Individuen, ausgewählt aufgrund ihrer genetischen Ähnlichkeit zueinander oder aufgrund ihrer genetischen Unähnlichkeit gegenüber einer anderen Gruppe (d. h. einer anderen Gattung, Spezies, Subspezies oder eines anderen Serotyps). Eine „Positiv-Testgruppe" wird sich auf eine Anzahl von Individuen beziehen, ausgewählt aufgrund der gewünschten genetischen Ähnlichkeit zwischen diesen Individuen, und wird im augenblicklichen Fall aus Individuen entweder von Listeria monocytogenes oder von Listeria spp. zusammengesetzt sein.
  • In ähnlicher Weise wird sich eine „Negativ-Testgruppe" beziehen auf eine Testgruppe, ausgewählt aufgrund der genetischen Diversität zwischen ihren Mitgliedern und den Mitgliedern der Positiv-Testgruppe. Eine geeignete Negativ-Testgruppe bei der vorliegenden Erfindung würde zusammengesetzt sein aus Nicht-Listeria monocytogenes, wenn L. monocytogenes der Zielorganismus ist, oder Nicht-Listeria spp., wenn Listeria spp. der Zielorganismus ist.
  • Der Ausdruck „unbekannter Mikroorganismus" oder „unbekanntes Bakterium" ist ein Mikroorganismus oder Bakterium, dessen Identität nicht bestimmt ist.
  • Der Ausdruck „Amplifikationsprodukt" bezieht sich auf spezifische DNS-Fragmente, erzeugt von einer beliebigen Primer-gerichteten Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion. Die diagnostischen Marker der vorliegenden Erfindung sind Amplifikationsprodukte, erzeugt bei einer PCR-Reaktion unter Verwendung diagnostischer Primer, und sind nützlich zur Detektion von Listeria monocytogenes und Listeria spp..
  • Der Ausdruck „RAPD" bezieht sich auf „zufällig amplifizierte polymorphe DNS (= random amplified polymorphic DNA)". „RAPD-Amplifizierung" bezieht sich auf ein Verfahren von Einzel-Primergerichteter Amplifikation von Nukleinsäuren unter Verwendung von kurzen Primern willkürlicher Sequenz, um ungezielte, zufällige Nukleinsäuresegmente zu amplifizieren. Dieses Verfahren wird offengelegt und beansprucht in U.S. Pat. Nr. 5.126.239. „RAPD-Verfahren" oder „RAPD-Analyse" bezieht sich auf ein Verfahren zur Detektion von genetischen Polymorphismen unter Mitwirkung der ungezielten Amplifikation von Nukleinsäuren unter Verwendung kurzer Primer von willkürlicher Sequenz, wobei das Profil oder Muster der „RAPD"-Amplifikationsprodukte von den Proben untereinander verglichen wird, um Polymorphismen zu detektieren. „RAPD-Primer" bezieht sich auf Primer von etwa 8 bis 13 bp, von willkürlicher Sequenz, verwendbar bei der RAPD-Amplifikation oder RAPD-Analyse gemäß dem angeführten Verfahren. Das „RAPD-Marker-Profil" bezieht sich auf das Muster oder den „Fingerabdruck" von amplifizierten DNS-Fragmenten, welche während des RAPD-Verfahrens amplifiziert werden und aufgetrennt und sichtbar gemacht werden durch Gelelektrophorese.
  • Der Ausdruck „Ribotyp" bezieht sich auf eine spezifische Klassifizierung von Bakterien oder anderen Mikroorganismen aufgrund des Verdaus von Genom-DNS mit einer Restriktionsendonuklease, elektrophoretische Auflösung der restringierten DNS und Sichtbarmachung solcher Fragmente, die rDNS-Sequenzen enthalten, mithilfe von Hybridisierung mit einer Sonde, abgeleitet vom rDNS-Operon.
  • Der diagnostische Marker der Erfindung kann verwendet werden, zur Identifizierung eines beliebigen Mitglieds entweder von Listeria monocytogenes unter Ausschluss anderer Listeria spp., oder von Listeria spp. unter Ausschluss von allen anderen Bakterien. Bei der vorliegenden Erfindung sind diagnostische Primer, die den Marker flankieren, nützlich zur Amplifizierung des Markers unter Verwendung von PCR Alternativ könnten Nukleinsäuresonden entwickelt werden aufgrund einiger oder aller Sequenzen von diagnostischen Markern und somit verwendet werden zur Detektion der Anwesenheit der Markersequenz unter Verwendung von Standard-Nukleinsäurehybridisierung an Festphase oder in Lösung und Protokollierungsverfahren. Es wurde in Betracht gezogen, dass Regionen von etwa 30 Basenpaaren oder mehr des diagnostischen Markers, insbesondere die Primer-Regionen umfassend, als Hybridisierungsstellen von diagnostischen Sonden verwendet werden könnten. Diese Verfahren könnten spezifisch verwendet werden für die Detektion von Listeria monocytogenes oder Listeria spp. in Nahrung, in menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten oder -geweben, Umweltmedien oder medizinischen Produkten und Apparaten.
  • Das angeführte Verfahren wird unten eingehender beschrieben mit Bezug auf die spezifischen Verfahrensschritte wie in der Zusammenfassung der Erfindung bereitgestellt.
  • AUSWAHL VON RAPD-PRIMERN UND DETEKTION DES DIAGNOSTISCHEN FRAGMENTES BEI MITGLIEDERN DER POSITIV- UND NEGATIV-TESTGRUPPEN, SCHRITT (I)
  • Genom-DNS, isoliert von Positiv- und Negativ-Testgruppen der Mikroorganismen, wurden RAPD-Amplifikation unterworfen unter Verwendung von sechzehn 12 Basen-großen Primern willkürlicher Sequenz. Die Positiv-Testgruppe bestand aus 20 Stämmen Listeria monocytogenes und wird im Detail weiter unten beschrieben in dem Teil ALLGEMEINE METHODEN. Die Negativ-Testgruppe bestand aus einer Auswahl von 25 Listeria spp. und wird ebenfalls im Teil ALLGEMEINE METHODEN weiter unten beschrieben. Techniken zur Isolierung genomischer DNS sind allgemein und gut bekannt auf diesem Fachgebiet und Beispiele können gefunden werden bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual- Band 1, 2, 3 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)).
  • RAPD-Primer von 12 Basen Länge wurden verwendet, weil bei dieser Primerlänge die RAPD-Muster allgemein ein bis fünf amplifizierte DNS-Fragmente enthielten. Verwendung kürzerer Primer resultierte oft in einer großen Anzahl von Amplifikationsprodukten, was die Extraktion eines einzelnen homogenen Fragmentes zur Sequenzierung viel schwieriger machte. Wenn Primer aus mehr als 12 Basen verwendet wurden, produzierte ein signifikanter Anteil der Bakterienstämme keine RAPD-Produkte, was das Screening einer viel größeren Anzahl willkürlicher Primer notwendig gemacht hätte. Es wurde ermittelt, dass einer der Primer, bezeichnet als 12CN015 (Tabelle 1, ALLGEMEINE METHODEN), ein Amplifikationsprodukt von 414 bp (bezeichnet als eine Prä-Marker-Sequenz) bei allen aus der Positiv-Testgruppe produziert. 12CN015 hatte die Sequenz GGA CAG AGC ATA (SEQ ID NO:15). Es wurde ermittelt, dass der Primer 12CN15 ein 414 bp-großes Amplifikationsprodukt bei allen L. monocytogenes-Stämmen produziert. Diese 414 bp-große Prä-Marker-Sequenz wurde nicht bei den Amplifikationsprodukten der Negativ-Testgruppe beobachtet bei Verwendung des gleichen Primers. Beispiele der RAPD-Musters von 12CN 15 für Stämme von beiden Testgruppen werden gezeigt in Abbildung 1.
  • SEQUENZIERUNG DER PRÄ-MARKER-SEQUENZ, SCHRITT (II)
  • Weil das 414 bp-große Produkt einzigartig für L. monocytogenes war, wurden Proben dieses Produktes für zwei verschiedene Stämme von L. monocytogenes, DP #647 und DP #1324, isoliert und die jeweiligen Produkte sequenziert. Die beiden Stämme repräsentierten einen Ribotyp, der hochpolymorph (#1324) war aufgrund des RAPD-Musters, und einen Ribotyp, der pathogen ist (#647). Der Grund, einen gewöhnlichen pathogenen Stamm und einen polymorphen Stamm von L. monocytogenes auszuwählen, war, die genetische Diversität, die wahrscheinlich innerhalb des 12CN15-Markenfragmentes festzustellen ist, zu charakterisieren.
  • Die vollständigen Sequenzen der 414 bp-großen Produkte für DP #647 und #1324 einschließlich der flankierenden Sequenzen von 12CN15, werden bei SEQ ID NOS: 20 und 21 für DP #647 und SEQ ID NO: 21 und 23 für DP #1324 gezeigt. Vergleich der Sequenzen von DP #647 und #1324 zeigt eine Homologie von 98%. Beide Sequenzen scheinen ein interner Abschnitt eines offenen Leserahmens (ORF) mit der gleichen Aminosäurezusammensetzung zu sein.
  • AUSWERTUNG DER PRÄ-MARKER-SEQUENZ AUF SPEZIFITÄT FÜR LISTERIA MONOCYTOGENES, SCHRITT (III)
  • Der Zweck des anfänglichen PCR-Screenings war, Sequenzbereiche zu identifizieren, die Spezies-Selektivität zeigten. Primen, die auf den 414 bp-großen Prä-Marken-Sequenzen basierten, wurden zuerst ausgewertet auf ihre Fähigkeit, spezifisch von genomischer DNS von L. monocytogenes zu amplifizieren. Anfängliche Primen-Sequenzen hatten eine Länge von 26 Basen mit einer GC-Gehalt von 50% +/– 5%, um eine Annealing-Temperatur im Bereich von 70°C zu ermöglichen. Priming-Stellen wurde ausgewählt innerhalb eines Abstandes von 200 Basen von jeder 12CN15-Priming-Stelle. Diese Sequenzen wurden überprüft, um sicherzustellen, dass Inter-Primer- und Intra-Primer-Interaktionen verringert wurden, um die Produktion nichtspezifischer PCR-Artefakte zu vermeiden.
  • Viele der anfänglichen Primen-Paare, die getestet wurden, erzeugten multiple Amplifikations-Produkte von genomischen DNS von L. monocytogenes. Multiple PCR-Produkte können auftreten, wenn mindestens 8 Basen einer 3'-Primersequenz als ein inverser Repeat erscheinen in der Region, die an die ursprünglichen Ziel-Priming-Stellen angrenzt. Um zu bestimmen, welche Produkte das Ergebnis von inversen Repeats einer Einzel-Primen-Sequenz sind und welche Primen für diese Produkte verantwortlich waren, wurden die Amplifikationsreaktionen durchgeführt unter Verwendung von Einzel-Primern. Eine signifikante Anzahl von Einzel-Primern, so wie 1515-26-85 (SEQ ID NO:17), 1515-26-rc292 (SEQ ID NO:18) und 1515-26-rc341 (SEQ ID NO:19) (Tabelle 2) waren in der Lage, PCR-Produkte bei Einzel-Primer-Amplifikationen zu erzeugen.
  • BESTIMMUNG UND ISOLIERUNG DES DIAGNOSTISCHEN FRAGMENTES, SCHRITT (IV) BESTIMMUNG VON AN DEN RAPD-MARKER ANGRENZENDEN SEQUENZEN
  • Jeder der einzelnen Primen, 1515- 26-85 (SEQ ID NO:17), 1515-26-rc292 (SEQ ID NO: 18) und 1515-26-rc341 (SEQ ID NO: 19), erzeugte ein PCR-Produkt, das einen Teil des ursprünglichen 414 bp großen Fragmentes enthielt plus eine zusätzliche Sequenz. Sequenzbestimmung dieser vergrößerten CN15-Fragmente wurde ausgeführt mit Mitteln, die gut bekannt sind bei diesem Fachgebiet.
  • Sequenzierung offenbarte annähernd 900 Basen zusätzlicher Sequenz. Die neue Sequenz bestand aus 400 Basen in der Region, die der ursprünglichen 12CN15-Stelle vorangeht, und 500 Basen in der Region, die der zweiten 12CN15-Stelle folgt, und offenbarte einen vollständigen offenen Leserahmen (0RF).
  • Der Konservierungsgrad innerhalb dieses genetischen Locus wurde weiterhin untersucht durch Amplifikation zusätzlicher Listeria-monocytogenes-Stämme und Vergleich dieser Amplifikationsprodukte mit den bereits sequenzierten Stämmen.
  • Der Vergleich offenbarte, dass alle Stämme ein diagnostisches Fragment von 1300 bp enthalten, welches einen vollständigen offenen Leserahmen von 855 Basen enthält. Diese Sequenz wurde verwendet als das diagnostische Fragment und wird identifiziert durch SEQ ID NOS: 24-31. Um zu bestimmen, ob dieses Fragment selektive Priming-Sellen für Listeria monocytogenes-spezifische Primer enthielt, wurde eine weitere Analyse der Sequenz-Zusammensetzung gemacht zur Bestimmung, ob sie verschieden von anderen Listeria spp.war.
  • VERGLEICH DER BASENÄHNLICHKEIT ZWISCHEN DIAGNOSTISCHEN FRAGMENTEN VON 1300 BP
  • Ein Vergleich der Basenähnlichkeit zwischen allen isolierten 1300 bp-großen diagnostischen Fragmenten wird unten angegeben.
  • Figure 00140001
  • SEQUENZIERUNG DES MARKER-FRAGMENTES FÜR ANDERE LISTERIA-SPEZIES – BESTIMMUNG DER SEQUENZZUSAMMENSETZUNG DES DIAGNOSTISCHEN FRAGMENTES
  • Auswertung der Primer-Stellen im 1300 bp-großen diagnostischen Fragment zeigte, dass nicht alle Primer-Stellen spezifisch waren für Listeria monocytogenes, was eine Konservierung der Sequenzzusammensetzung auf Gattungsniveau nahe legt.
  • Die genetische Zusammensetzung wurde untersucht durch Isolierung und Sequenzierung des 855 bp-großen Fragmentes und den flankierenden Regionen für eine Testgruppe von nicht-monocytogenes Stämmen. Es wurde für alle Stämme ermittelt, dass sie den offenen Leserahmen von 855 Basen enthalten. Ein Vergleich der Sequenzen jedoch zeigte, dass es Spezies-abhängige Unterschiede gab bei der Nukleinsäurezusammensetzung innerhalb des 0RF (SEQ ID NOS: 33-40 und Tabelle 3, Beispiel 3). Die spezifischen Lagen dieser Unterschiede lassen auf Priming-Stellen schließen, wobei die Diversität der Nukleotidsequenz ausreichend sein könnte, um selektives Priming von Listeria monocytogenes-Stämmen zu ermöglichen.
  • VORLÄUFIGE AUSWAHL DIAGNOSTISCHER PRIMER VON LISTERIA MONOCYTOGENES AUFGRUND DER SENSITIVITÄT GEGENÜBER DER ANNEALING-TEMPERATUR, SCHRITT (V)
  • Ein Vergleich der Sequenzdaten für die fünf L. spp. ermöglichte es, sieben Priming-Stellen zu identifizieren, die einzigartig für L. monocytogenes waren. Diese Priming-Stellen waren die folgenden: 1515(rc341.zweimalig)-26-363, 1515(rc341.zweimalig)-27-281, 1515-26-1515-27-357, 1515-26-rc233, 1515(8585)-27-rc737 und 1515(8585)-28-rc793 (3) mit einer Länge von 26 bis 30 Basen in Abhängigkeit vom GC-Gehalt. Längere Primer wurden verwendet für Stellen mit einem GC-Gehalt von < 50%, um sicherzustellen, dass eine Annealing-Temperatur von 70°C eingehalten werden konnte. 7 zeigt die Primersequenzen und einen Vergleich von Sequenzen der Priming-Stellen für Stämme, welche die folgenden Spezies repräsentieren: L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri und L. ivanovii.
  • Um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass für L. monocytogenes selektive Primer PCR-Produkte erzeugen würden in nicht-monocytogenes Stämmen durch fehlgepaartes Priming, wurde die Beziehung zwischen Annealing-Temperatur und Selektivität ausgewertet. Eine Testgruppe bestehend sowohl aus Listeria monocytogenes als auch aus nicht-monocytogenes Stämmen, wurde vorbereitet, und Amplifikationen wurden ausgeführt über einen Temperaturbereich und analysiert auf das Auftreten von Amplifikationsprodukten von Listeria spp., die nicht-monocytogenes waren. Primerpaare, die ein Einsetzen nichtspezifischer Amplifikation bei oder über 65°C zeigten, wurden als ungeeignet angesehen zur Verwendung als diagnostische Primer für Listeria monocytogenes.
  • ENDGÜLTIGE AUSWAHL DIAGNOSTISCHER PRIMER VON LISTERIA MONOCYTOGENES, SCHRITT (VI)
  • Bevor die endgültige Auswahl des Primers getroffen wurde, wurde die Genauigkeit der zur Wahl stehenden Primersätze ausgewertet für eine größere Gruppe von L. monocytogenes-Stämmen. Ein Satz von 323 Stämmen von L. monocytogenes wurde verwendet, um die Inklusivität der folgenden Primersätze auszuwerten: 1) 1515-27-357/1515(8585)-27-rc737; 2) 1515-27-357/1515(8585)-28-rc793; und 3) 1515(rc341.zweimalig)-26-(-363) /1515-26-rc233 (3). Die Genauigkeit bei der Detektion von Listeria monocytogenes reichte von 99,5% bis 100%, abhängig von den verwendeten Primern und Amplifikationsbedingungen. Keiner der drei Primersätze erzeugte Amplifikationsprodukte für die 30 nichtmonocytogenes-Stämme bei der Annealing-Stringenz-Testgruppe.
  • VORLÄUFIGE SELEKTIVITÄTSUNTERSUCHUNG DIAGNOSTISCHER PRIMER VON LISTERIA SPP., SCHRITT (VII)
  • Ein Vergleich der Sequenzdaten für die fünf oben erwähnten Listeria-Spezies ermöglichte es, sieben Priming-Stellen zu identifizieren, die vorhanden sind in Stämmen, welche diese Spezies repräsentieren, die mindestens zu 90% homolog zu L. monocytogenes waren. Diese Priming-Stellen waren die folgenden: 1515-30-76, 1515-30-88, 1515(8585)-30-624, 1515(8585)-30-rc483, 1515(8585)-30-rc555, 1515(8585)-30-rc573 und 1515(8585)-30-rc824 (6). Primer für diese Stellen wurden mit einer Länge von 30 Basen gemacht, um Fehlpaarungen bei der Sequenz zu kompensieren und um sicherzustellen, dass eine Annealing-Temperatur von 70°C eingehalten werden konnte.
  • Vor Auswertung der Stringenz-Bedingungen wurde die Genauigkeit von allen zur Wahl stehenden Primer-Sätzen ausgewertet für eine Gruppe von 33 Lspp.-Stämmen. Diese Stämme wurden verwendet, um die Inklusivität der folgenden Primer-Sätze auszuwerten:
    1)1515-30-76/1515(8585)-30-rc483; 2)1515-30-76/1515(8585)-30-rc30-rc555;
    3) 1515-30-76/1515(8585)-30-rc573; 4) 1515-30-76/1515(8585)-30-rc824;
    5)1515-30-88/1515(8585)-30-rc483; 6)1515-30-88/1515(8585)-30-rc555;
    7) 1515-30-88/1515(8585)-30-rc573; 8) 1515(8585)-30-624/1515(8585)-30-rc824.
  • Die Genauigkeit bei der Detektion von L. spp. betrug 100% für die folgenden Primer-Sätze: 1515-30-76/1515(8585)-30-rc555; 1515-30-76/1515(8585)-30-rc573; 1515-30-88/1515(8585)-30-rc555; und 1515-30-88/1515(8585)-30-rc573.
  • AUSWAHL DIAGNOSTISCHER PRIMER VON LISTERIA SPP. AUFGRUND DER SENSITIVITÄT GEGENÜBER DER ANNEALING-TEMPERATUR, SCHRITT (VIII)
  • Wie bei Listeria monocytogenes wurde die Beziehung zwischen Annealing-Temperatur und Selektivität ermittelt, um die Erzeugung nicht-spezifischer Amplifikationsprodukte zu verringern. Dieser Test wurde für alle Primerpaare durchgeführt, die bei der vorläufigen Inklusivitätsauswertung 100% erzielten. Amplifikationen wurden ausgeführt bei einer Testgruppe von 7 Stämmen von Listeria spp. und Nicht-L. spp. bei einer Annealing-Temperatur von 70°C. Die Annealing-Temperatur wurde dann in 5°C-Schritten erniedrigt bis zum Auftreten von nicht-spezifischen Amplifikationsprodukten. Es wurde ermittelt, dass es für den Primer-Satz 1515-30-76/1515(8585)-30-rc555 am wenigsten wahrscheinlich war, nichtspezifische Amplifikationsprodukte zu erzeugen.
  • ENDGÜLTIGE AUSWAHL DIAGNOSTISCHER PRIMER VON LISTERIA SPP., SCHRITT (IX)
  • Vor Bestätigung der Auswahl des Primer-Satzes 1515-30-76/1515(8585)-30-rc555 wurde die Genauigkeit dieses Primersatzes ausgewertet für eine Gruppe von 73 L. spp.-Stämmen. Die Genauigkeit bei der Detektion von L. monocytogenes, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri und L. ivanovii betrug 100%.
  • Dieser Primer-Satz erzeugte keine Amplifikationsprodukte für die 65 Nicht-Listeria spp.-Stämme in der Nicht-Listeria-Testgruppe.
  • Zur Bestimmung, ob der ausgewählte Primer-Satz PCR-Produkte durch fehlgepaartes Priming in nicht-monocytogenes Stämmen erzeugen würde, wurde die Beziehung zwischen Annealing-Temperatur und Selektivität ermittelt. Eine Testgruppe, die sowohl aus Listeria spp. als auch aus Nicht-L. spp.-Stämmen bestand, wurde vorbereitet, und Amplifikationen wurden ausgeführt über einen Temperaturbereich und analysiert auf das Auftreten von Amplifikationsprodukten von Nicht-L. spp. hin. Auf diese Weise wurde bestimmt, dass 60°C die niedrigste Annealing-Temperatur ist, die eine Spezifität für L. spp. ergibt, und 70°C die bevorzugte Temperatur ist, die verwendet werden sollte bei Verwendung dieses Satzes Listeria spp.-spezifischer Primer.
  • BEISPIELE
  • ALLGEMEINE METHODEN
  • Verfahren für DNS-Amplifikationen und andere Protokolle, die in molekularbiologischer Technik üblich sind und in den folgenden Beispielen verwendet werden, können gefunden werden in Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
  • Material und Methoden, geeignet zur Erhaltung und Anzucht von Bakterienkulturen sind gut bekannt auf dem Fachgebiet. Techniken, die geeignet sind zur Verwendung bei den folgenden Beispielen, können gefunden werden im „Manual of Methods for General Bacteriology" (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg und G. Briggs Phillips, eds), American Society for Microbiology, Washington, D. C. (1994) oder in der Arbeit von Thomas D. Brock (in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Zweite Auflage (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass.). Alle Reagenzien und Materialien, die zur Anzucht und Haltung bakterieller Zellen verwendet wurden, wurden bezogen bei Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wis.), DIFCO Laboratories (Detroit, Mich.), GIBCO/BRL (Gaithersburg, Md.), oder Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.), wenn nicht anders angegeben.
  • Die Bedeutung der Abkürzungen ist folgendermaßen: „h" bedeutet Stunde(n), „min" bedeutet Minute(n), „sec" bedeutet Sekunde(n), „d" bedeutet Tag(e), „ml" bedeutet Milliliter, „1" bedeutet Liter. DNS-Sequenzierung wurde durchgeführt von Lark Sequencing Technologies Inc., (Houston, Tex.) oder gemäß der Methode von Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74, 5463, (1977)) unter Verwendung von Fluoreszenz-markierten Didesoxynukleotiden und dem Genesis 2000TM DNS-Analyse-System (E. I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, Del.).
  • AUFBAU VON POSITIV- UND NEGATIV-TESTGRUPPEN VON LISTERIA MONOCYTOGENES
  • Eine Positiv-Testgruppe, bestehend aus 20 genotypisch verschiedenen Listeria monocytogenes-Stämmen, wurde aufgebaut zur Identifizierung eines RAPD-Markers von Listeria monocytogenes und Listeria spp.. Die Listeria monocytogenes-Stämme der Positiv-Testgruppe umfassten alle gewöhnlich anzutreffenden Serotypen und schlossen L. monocytogenes, DP #647, #899, #1324 und #3386, ein.
  • Die Negativ-Testgruppe bestand aus 25 verschiedenen Listeria nicht-monocytogenes-Stämmen, umfassend die Spezies L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayi, L. murrayi und L. ivanovii. RAPD-PRIMER
  • RAPD-Primer, die zum Amplifizieren genomischer DNS von den Positiv- und Negativ-Testgruppen verwendet werden, sind unten in Tabelle 1 angegeben. TABELLE 1 Willkürliche Zwölf-Basen-Primer, verwendet bei der Erzeugung von RAPD-Mustern
    Figure 00170001
  • PRIMER-NOMENKLATUR
  • Die Primer-Namen, die in den folgenden Beispielen zugewiesen werden, werden auf die folgende Weise abgeleitet: Die erste Zahl, 1515, zeigt an, dass die Primer-Sequenz von dem RAPD-Fragment kommt, welches an beiden Enden durch 12CN15 gebunden wurde. Die zweite Zahl zeigt die Primerlänge an. Die dritte Zahl identifiziert die 3'-Basen-Position des Primers, wobei Position 1 am 5'-Ende der ursprünglichen putativen 12CN15-Priming-Stelle ist. Die Bezeichnung „rc" bedeutet, dass die Priming-Stelle auf dem Komplementärstrang lokalisiert ist.
  • Auf die Lagen des Primen kann auch verwiesen werden durch die letzte Zahl der Identifizierungszahl. So kann „1515-26-85" auch als „85" erwähnt werden.
  • RAPD-Primer können auch ohne die Bezeichnung „12" erwähnt werden. So kann „12CN15" auch als „CN 15" erwähnt werden.
  • Die unten in Tabelle 2 beschriebenen Primer werden abgeleitet von der Prä-Marker-Sequenz. Als Einzel-Primer passen sie zur Prä-Marker-Sequenz und sie passen auch mindestens zu den letzten 9 Basen von der 3'-Sequenz bei einer anderen Lage außerhalb der Prä-Marker-Sequenz. Das Nettoergebnis ist, dass diese Primer Amplifikationsprodukte bei Einzel-Primer-Reaktionen von genomischer DNS erzeugen werden. Diese Produkte enthalten einen Teil des ursprünglichen 414 bp-großen Fragmentes plus zusätzliche Sequenz. TABELLE 2
    Figure 00180001
  • BEISPIEL 1
  • ISOLIERUNG DER PRÄ-MARKER-SEQUENZ VON LISTERIA MONOCYTOGENES DURCH RAPD-ANALYSE
  • Beispiel 1 beschreibt detailliert die Isolierung der 414 bp-großen Prä-Marker-Sequenz aus genomischer DNS von Listeria monocytogenes unter Verwendung von RAPD(„Raudom Amplified Polymorphic DNA"= zufällig amplifizierte polymorphe DNS)-Primer-Analyse.
  • Ein Satz von acht 12 Basen-großen Primern (Tabelle 1) wurde verwendet bei einer RAPD-Analyse von 20 Listeria monocytogenes-Stämmen. Die Ergebnisse dieser Amplifikationen wurden untersucht auf ein für Listeria monocytogenes spezifisches Amplifikationsprodukt hin, das leicht von anderen RAPD-Produkten abgetrennt werden könnte.
  • Das Amplifikations- und Datenerfassungsprotokoll für die RAPD-Reaktion mit jedem der 12-Basen-Primer war folgendermaßen:
  • Amplifizierungsprotokoll: Für jedes 50 μl-Reaktionsgemisch wurden 1,5 μl dNTP-Gemisch (jeweils 5 mM dNTP), 36,3 μl deionisiertes Wasser, 5 μl 10fach-konzentrierter Reaktionspuffer (500 mM KCl, 100 mM Tris @ pH 8,3 , 15 mM MgCl2, 0,003% Gelatine), 5 μl Primer (10 mM), 0,4 μl Taq-Polymerase (5U/μl) und 1,2 μl Taq-Verdünnungspuffer (10 mM Tris @ pH 8,0 und 1,0% Tween 20) vereinigt. 1,0 μl Aliquot einer genomischen Bakterien-DNS @ 50 ng/μl wurde jeder Mischung zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 94°C für 2 min erhitzt. Achtundzwanzig Zyklen des folgenden Temperaturprofils wurden durchgeführt: 15 sec @ 94°C, 5 min @ 46°C, 2 minütiger Anstieg auf 72°C und 1 min @ 72°C. Am Ende des letzten Zyklus wurde das Reaktionsgemisch bei 72°C für 7 min inkubiert.
  • Nach Amplifizierung wurde ein Reaktions-Aliquot von 5 μl mit 2 μl Ficol-Ladepuffer vereinigt und auf einem 4 % Acrylamidgel (29 : 1)/1-fach TBE laufen gelassen. Im Anschluss an die Elektrophorese wurden die Gele mit Ethidiumbromid gefärbt. Die gefärbten Gele wurden auf eine Durchlichtapparatur gelegt und elektronisch abgebildet mit einer hochempfindlichen CCD-Kamera. Die Bilder wurden gespeichert im Computerspeicher zur nachfolgenden Analyse.
  • Analyse: Es wurde ermittelt, dass der Primer 12CN 15 (SEQ ID NO: 15) ein 414 bp-großes Amplifikationsprodukt bei allen L. monocytogenes -Stämmen produzierte (SEQ ID NO: 32). Dieses 414 bp-große Fragment wurde nicht beobachtet bei den Amplifikationsprodukten der Negativ-Testgruppe unter Verwendung des gleichen Primers. Beispiele der RAPD-Muster mit 12CN15 für Stämme von beiden Testgruppen werden in 1 gezeigt. Die Bahnen korrelieren mit 1, wie in Tabelle 3 folgt: TABELLE 3
    Figure 00190001
    *Pfeile bezeichnen das 414 bp-große Produkt in L. monocytogenes-Stämmen. (Siehe Bahnen 2, 5, 8, 10, 14, 15, 18, 19, 21 und 24 von 1)
  • Wie es durch 1 offensichtlich wird, produzierte die Positiv-Testgruppe ein charakteristisches Amplifikationsprodukt von 414 bp, welches bei allen 20 untersuchten Listeria monocytogenes-Stämmen auftrat. Zusätzlich wird gesehen, dass keiner aus der Negativ-Testgruppe das 414 bp-große Amplifikationsprodukt zeigte, das in der Positiv-Testgruppe gesehen wird.
  • BEISPIEL 2
  • ERZEUGUNG DES DIAGNOSTISCHEN FRAGMENTES VON DER FLANKIERENDEN SEQUENZ DER PRÄ-MARKER-SEQUENZ
  • Beispiel 2 illustriert die Sequenzierung der flankierenden Regionen der 414 bp-großen Prä-Marker-Sequenz unter Verwendung von Einzel-Primern und die Erzeugung des diagnostischen Fragmentes. Die 414 bp-große Prä-Marker-Sequenz von Beispiel 1 wurde kommerziell sequenziert von zwei oben beschriebenen Listeria monocytogenes-Stämmen (#647 und #1324). Die Prä-Marker-Sequenz für jeden Stamm ist angegeben in SEQ ID NOS: 20 und 21 für #647 und SEQ ID NOS: 22 und 23 für #1324.
  • Primer wurden entworfen aufgrund der Prä-Marker-Sequenz und ausgewertet auf ihre Fähigkeit hin, spezifisch von genomischer Listeria monocytogenes-DNS zu amplifizieren. Anfängliche Primer-Sequenzen waren 26 Basen lang mit einem GC-Gehalt von 50 + – 5%, um eine Annealing-Temperatur im Bereich von 70°C zu ermöglichen. Priming-Stellen wurden ausgewählt innerhalb eines Abstandes von 200 Basen von jeder 12CN15-Priming-Stelle. Nach dieser Methode wurden drei Einzel-Primer identifiziert als 1515-26-85 (SEQ ID NO: 17), 1515-26-rc292 85 (SEQ ID NO: 18) und 1515-26-rc341 85 (SEQ ID NO: 19), (Tabelle 2), welche ein PCR-Produkt in Abwesenheit eines zweiten Primers erzeugten.
  • Jeder dieser Einzel-Primer erzeugte ein PCR-Produkt, welches Teile der ursprünglichen Prä-Marker-Sequenz plus zusätzlicher Sequenz enthielt. Die Sequenz dieser vergrößerten 12CN15-Fragmente wurde vervollständigt unter Verwendung der Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74, 5463 (1977)) unter Verwendung Fluoreszenz-markierter Didesoxynukleotide und dem Genesis 2000 DNS-Analysesystem (E. I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, Del.).
  • Die neue Sequenz bestand aus 400 Basen im Bereich , welcher der ursprünglichen 12CN15-Stelle vorangeht, und 500 Basen im Bereich, welcher der zweiten 12CN 15-Stelle nachfolgt. Diese Sequenzdaten machten es möglich, einen vollständigen 0RF plus einige hundert Basen stromaufwärts und stromabwärts vom Leserahmen zu identifizieren.
  • Um den Grad der Konservierung innerhalb dieses genetischen Locus weiter zu charakterisieren, wurden Nukleinsäuresequenzen für zwei zusätzliche L. monocytogenes-Stämme, DP #899 und DP #3386, bestimmt. DP #899 ist ein zusätzlicher Repräsentant einer bekanntermaßen pathogenen Ribotyp-Gruppe von L. monocytogenes. DP #3386 ist ein Stamm einer weniger pathogenen Ribotyp-Gruppe von L. monocytogenes. Die Sequenzierung dieser Stämme wurde ausgeführt unter Verwendung der Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (s. oben) und dem Genesis 2000 DNS-Analyse-System. Die vollständigen Sequenzen für die L. monocytogenes-Stämme DP #647, #899, #1324 und #3386 werden gezeigt in SEQ ID NOS: 24-31. (Das 5'-Ende der ursprünglichen CN15-Priming-Stelle wurde als Basen-Nummer 1 bezeichnet, um einen gemeinsamen Bezugspunkt für alle Sequenzdaten bereitzustellen.)
  • Die Analyse der Nukleinsäuresequenz zeigte, dass alle vier Stämme einen vollständigen offenen Leserahmen von 855 Basen enthielten. Innerhalb dieses 0RF zeigten #647, #899 und #3386 alle identische Nukleinsäuresequenzen. DP #1324 ist zu 97% homolog zu den anderen drei Listeria monocytogenes-Stämmen. Als die Nukleinsäuresequenzen in die entsprechende Aminosäuresequenz translatiert wurden, wurde gefunden, dass DP #1324 identisch mit den anderen drei Stämmen war. Die Aminosäurezusammensetzung für alle L. monocytogenes-Stämme wird gezeigt in SEQ ID NO: 32.
  • Die Promotor- und terminale Spacer-Sequenzen für DP #647, #899 und #3386 waren ebenfalls identisch. DP #1324 zeigt eine Homologie von 98% und 96% jeweils mit dem Promotor bzw. dem terminalen Spacer. Dieser genetische Locus und die umgebende Region zeigten ein hohes Konservierungsniveau der Stämme von L. monocytogenes untereinander.
  • Weitere Analyse der Sequenzzusammensetzung des 1300 bp-großen diagnostischen Fragmentes, das den 855 bp-großen 0RF enthielt, war nötig, um zu bestimmen, ob es ausreichend verschieden von anderen L. spp war, um so selektive Priming-Stellen für eine PCR-gestützte Untersuchung auf L. monocytogenes bereitzustellen.
  • BEISPIEL 3
  • BESTIMMUNG DER SEQUENZZUSAMMENSETZUNG DES DIAGNOSTISCHEN FRAGMENTES DURCH VERGLEICH DER MARKER-FRAGMENT-SEQUENZ MIT ANDEREN LISTERIA-SPEZIES
  • Eine vorläufige Auswertung der Primer-Stellen im vergrößerten CN 15-Marker zeigte, dass viele Lagen nicht zwischen L. monocytogenes und anderen L.spp. unterschieden. Diese Beobachtung ließ darauf schließen, dass viel von der Sequenzzusammensetzung dieses genetischen Locus auf Gattungsniveau konserviert war. Um zu bestimmen, ob dieser genetische Locus Sequenzen enthielt, die einzigartig für L. monocytogenes sind, wurden auch Stämme, die L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri und L. ivanovii repräsentierten, zur Sequenzierung ausgewählt. (Markersequenzen wurden nicht bestimmt für L. grayi und L. murrayi , da diese Spezies bedeutend stärker polymorph waren als andere L. spp..) Zuvor bestimmte nicht-selektive Priming-Stellen wurden verwendet, um geeignete DNS-Mengen zur Sequenzierung zu erzeugen. Wie bei L. monocytogenes erzeugten die Primer 1515-26-85 (SEQ ID NO: 17), 1515-26-rc292 (SEQ ID NO: 18) und 1515-26-rc341 (SEQ ID NO: 19) bei Verwendung für Einzel-Primer-Amplifikationen ebenfalls PCR-Produkte, geeignet zur Sequenzierung. Die Sequenzierung wurde ausgeführt unter Verwendung der Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. und dem Genesis 2000 DNS-Analyse-System.
  • Ein Vergleich der Nukleotidsequenzen zeigte, dass jede der obengenannten Spezies einen 855 Basen-großen offenen Leserahmen enthielt. Jedoch gab es einige Spezies-abhängige Unterschiede bei der Nukleinsäure-Zusammensetzung innerhalb des ORF. Die Sequenzen SEQ ID NOS: 33-40 zeigen die Nukleinsäure-Zusammensetzung für jeweils die folgenden Stämme: L. innocua DP #4450, L. seeligeri DP #3327, L. welshimeri DP #3359 und L. ivanovii DP #3340. Diese Unterschiede in der Nukleotidsequenz sind verantwortlich für entsprechende Speziesvariationen in der Aminosäuresequenz. Die Nukleotid- und Aminosäure-Sequenz-Homologie wird zusammengefasst in Tabelle 4. 2 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen für jede L. spp., einschließlich L. monocytogenes. TABELLE 4 Vergleich von Nukleotid- und Aminosäure-Sequenz des Offenen Leserahmens zwischen Listeria-Spezies
    Figure 00210001
  • Von den untersuchten L. spp. zeigte L. innocua deutlich die größte Ähnlichkeit zu L. monocytogenes. Die verbleibenden drei Spezies zeigten alle ungefähr vergleichbare Dievergenzniveaus bei Nukleotid- und Aminosäurezusammensetzung.
  • Die Nukleinsäuresequenzen von Promotor und terminalem Spacer wiesen ebenfalls signifikante Unterschiede zwischen den Spezies auf. Die Homologien von Promotor- und Spacer-Sequenzen, im Vergleich zu L. monocytogenes, werden in Tabelle 5 zusammengefasst. TABELLE 5 Vergleich der Sequenz von Promotor und terminalem Spacer zwischen L. Spp..
    Figure 00220001
  • Die Homologie zu L. monocytogenes, welche gefunden wurde bei Sequenzen von Promotor und terminalem Spacer, ist signifikant verschieden von der für die Sequenzen des offenen Leserahmens. L. innocua and L. welshimeri zeigen beide Homologien zu L. monocytogenes in der Promotor-Region, die signifikant größer sind als die entsprechende ORF-Homologie. Für L. seeligeri und L. ivanovii zeigen die Promotor-Regionen und ORF-Regionen beide vergleichbare Homologieniveaus zu L. monocytogenes. Bei drei Spezies zeigen die Sequenzen vom terminalen Spacer eine bedeutende Verminderung der Homologie im Vergleich zu den Promotor-Regionen und offenen Leserahmen, während bei L. ivanovii ähnliche Homologieniveaus zu L. monocytogenes bei allen drei Regionen gefunden werden.
  • BEISPIEL 4
  • AUSWAHL DIAGNOSTISCHER PRIMER VON LISTERIA MONOCYTOGENES AUFGRUND DER SENSITIVITÄT GEGENÜBER DER ANNEALING-TEMPERATUR IDENTIFIZIERUNG VON PRIMING-STELLEN UND PRIMER-SYNTHESE
  • Ein Vergleich der Sequenzdaten für die fünf L. spp. (Beispiel 3) machte es möglich, sieben Priming-Stellen zu identifizieren, die einzigartig für L. monocytogenes waren. Diese Priming-Stellen waren folgende: 1515(rc341.zweimalig)-26-363, 1515(rc341.zweimalig)-27-281, 1515-26-36, 1515-27-357, 1515-26-rc233, 1515(8585)-27-rc737 und 1515(8585)-28-rc793 (3). „Einzigartigkeit" ist definiert als jeder Sequenzbereich von 26-30 Basen, bei dem die Homologie zwischen L. monocytogenes und jeder anderen Listeria spp. weniger als 90% beträgt.
  • Primer wurden synthetisiert, um diesen Stellen zu entsprechen, und reichten in der Länge von 26 bis 30 Basen, abhängig vom GC-Gehalt. Längere Primer wurden verwendet für Stellen mit einem GC-Gehalt von < 50%, um sicherzustellen, dass eine Annealingtemperatur von 70°C eingehalten werden konnte.
  • 3 zeigt die Primersequenzen und einen Sequenzvergleich der Priming-Stellen von Stämmen, welche die folgenden Spezies repräsentieren: L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri und L. ivanovii.
  • BESTIMMUNG DER ANNEALINGTEMPERATUR
  • Um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass L. monocytogenes-selektive Primer durch fehlgepaartes Priming in nicht-monocytogenes Stämmen PCR-Produkte erzeugen, wurde die Beziehung zwischen Annealingtemperatur und Selektivität ausgewertet. Eine Testgruppe von 33 Stämmen, bestehend aus 15 L. innocua, 5 L. welshimeri, 6 L. seeligeri, 3 L. ivanovii, 1 L. grayi und 3 L. monocytogenes, wurde vorbereitet. Amplifizierungen wurden zuerst ausgeführt bei einer Annealingtemperatur von 70°C. Die Annealingtemperatur wurde dann in 5°C-Schritten erniedrigt bis für die nicht-monocytogenes-Stämme Amplifizierungsprodukte begannen aufzutreten. Das Amplifizierungs- und Detektionsprotokoll wird unten zusammengefasst.
  • Vereinige 1,5 μl dNTP-Gemisch (jedes dNTP 5 mM), 40 μl deionisiertes Wasser, 5 μl 10-fach konzentrierten Reaktionspuffer (500 mM KCl, 100 mM Tris @ pH 8,3 , 15 mM MgCl2, 0,003% Gelatine), 0,4 μl Taq-Polymerase (5U/μl), 1,2 μl Taq-Verdünnungspuffer (10 mM Tris @ pH 8,0 und 1,0% Tween 20), 0,66 μl von jedem Primer (10 μM) und 1,0 μl genomischer DNS @ 50 ng/μl. Erhitze auf 94°C für 2 min.. Es wurden fünfunddreißig Zyklen des folgenden Temperaturprofils durchgeführt: 15 sec @ 94°C, 2 min bei der spezifizierten Annealingtemperatur und 1 min @ 72°C. Nach Abschluss des letzten Zyklus wurde das Reaktionsgemisch bei 72°C für 7 min. inkubiert.
  • Das Sichtbarmachung der Amplifizierungsprodukte ist die gleiche wie oben beschrieben.
  • Tabelle 6 zeigt einen Vergleich des Einsetzens falsch positiver Antwortreaktionen, wenn die Annealingtemperatur herabgesetzt wird. TABELLE 6 Prozent falsch positiver L. monocytogenes-Antworten als Funktion der Annealing-Temperatur
    Figure 00230001
    *Primer-Markierungszahlen, die in Klammern enthalten sind, d. h. (85,85) und (rc341, rc341), zeigen an, dass diese Primer abgeleitet wurden von Fragmenten, die durch die Einzel-Primer, 151526-85 und 151526-rc341, erzeugt wurden.
  • Primerpaare, die keine falsch-positiven Antworten produzierten bei 5°C unter der Standard-Annealingtemperatur von 70°C, wurden als Kandidaten für ein PCR-gestütztes Untersuchungsverfahren auf L. monocytogenes angesehen. Von allen untersuchten Primer-Sätzen zeigte nur 1515-26-36/1515-26-rc233 ein inakzeptables Einsetzen falsch-positiver Antworten bei 65°C.
  • 4A-4C zeigen Gele, die das Auftreten anomaler Amplifizierungsprodukte illustrieren bei Reduktion der Annealingtemperatur für das Primerpaar 1515-26-36/1515-26-rc233. Die Gelbahnen werden -wie in Tabelle 7 folgt- ausgewiesen: TABELLE 7
    Figure 00230002
    Figure 00240001
  • BEISPIEL 5
  • ENDAUSWERTUNG DER DIAGNOSTISCHEN PRIMER VON LISTERIA MONOCYTOGENES
  • Beispiel 5 erläutert die Inklusivität der identifizierten diagnostischen Primer von Listeria monocytogenes für alle Stämme von Listeria monocytogenes.
  • Die Genauigkeit aller zur Wahl stehenden Primer-Sätze wurde ausgewertet für eine größere Gruppe L. monocytogenes-Stämme. Ein Satz von 323 L. monocytogenes-Stämmen wurde verwendet, um die Inklusivität eines Satzes von drei Primersätzen zu bewerten. Die Bedingungen der PCR-Untersuchung waren die gleichen wie die oben spezifizierten, außer dass nur eine Annealingtemperatur von 70°C verwendet wurde. In PCR-gestützten Untersuchungen unter Verwendung dieser drei Primersätze, war die Genauigkeit folgendermaßen:
    • 1) 1515-27-357/1515(8585)-27-rc737, 100%;
    • 2) 1515-27-357/1515(8585)-28-rc793, 99.2%; und
    • 3) 1515(rc341x2)-26-363/1515-26-rc233, 99.5%.
  • Obgleich Primer -281/rc233 nicht untersucht wurde, wurde erwartet, dass seine Inklusivitätsantwort vergleichbar mit 1515(rc341.zweimalig)-26-363/1515-26-rc233 sei. Keiner der drei Primersätze erzeugte Amplifizierungsprodukte für die 30 nicht-monocytogenes Stämme in der Annealing-Stringenz-Testgruppe. Beispiele der Ergebnisse von Positiv- und Negativ-Testgruppe für das Primerpaar 1515-27-357/1515(8585)-27-rc737 werden gezeigt jeweils in 5A und 5B. 5A und 5B zeigen beide eine Gelanalyse, die den in Tabelle 8 aufgelisteten Stämmen entspricht. TABELLE 8
    Figure 00240002
    Figure 00250001
  • BEISPIEL 6
  • SELEKTIVITÄTSUNTERSUCHUNG FÜR DIE DIAGNOSTISCHEN PRIMER VON LISTERIA SPP. AUSWAHL DER DIAGNOSTISCHEN PRIMER VON LISTERIA SPP.
  • Ein Vergleich der Sequenzdaten für die fünf Listeria-Spezies machte es möglich, Priming-Stellen zu identifizieren, die zu mindestens 90% homolog zu L. monocytogenes waren. Die folgenden Priming-Stellen wurden als mögliche Kandidaten ausgewählt: 76, 88, 624, rc483, rc555, rc573 und rc324. Primer für diese Stellen wurde 30 Basen lang gemacht, um Fehlpaarungen bei der Sequenz zu kompensieren und sicherzustellen, dass eine Annealingtemperatur von 70°C beibehalten werden kann. 6 zeigt die Primersequenzen und einen Vergleich der Sequenzen von Priming-Stellen für Stämme, welche die folgenden Spezies repräsentieren: L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri und L. ivanovii. Primerpaare von dieser Gruppe wurden zuerst bewertet mittels einer Testgruppe von 33 Stämmen, bestehend aus 15 L. innocua, 5 L. welshimeri, 6 L. seeligeri, 3 L. ivanovii, 1 L. grayi und 3 L. monocytogenes. Amplifikationen wurden zuerst ausgeführt bei einer Annealingtemperatur von 70°C. Die Ergebnisse dieser Auswertung werden in Tabelle 9 zusammengefasst. TABELLE 9 % Positive Antwort für PCR-gestützte Untersuchung von L. spp.: Effekt der Lage der Priming-Stelle
    Figure 00260001
  • Die Priming-Stellen 76, 88, rc555 und rc573 scheinen alle brauchbar zu sein bei einer Annealingtemperatur von 70°C aufgrund der positiven Antwort von 100%, die mit jeder Kombination dieser Primer erzielt wurde. Wenn rc483 in Verbindung mit 76 oder 88 verwendet wird, geht die positive Antwort zurück auf einen Antwortbereich von 80-85%. Verminderung der Annealingtemperatur auf 65°C erhöht die Antwort auf 97%. Obschon sowohl 76/rc824 als auch 624/rc824 kein PCR-Produkt bei einer Arinealingtemperatur von 70°C erzeugten, stieg bei Erniedrigung der Temperatur auf 65°C die positive Antwort an auf 97%. Unter allen Untersuchungen bei 65°C war ein einzelner L. grayi-Stamm der einzige falsch-negative. Es scheint, dass die Schmelztemperaturen von den Primern rc824 und rc483 zu niedrig sind, um ihre effektive Verwendung bei 70°C zu ermöglichen. Es wurden keine weiteren Untersuchungen mit diesen Primem gemacht. Die Priming-Stellen 76, 88, rc555 und rc573 scheinen alle bei einer Annealingtemperatur von 70°C praktikabel zu sein.
  • L. grayi und L. murrayi werden nicht so häufig angetroffen wie andere L. spp.. Jedoch wurden, da keine Sequenzdaten für diese Spezies bestimmt waren, zusätzliche Stämme getestet mit den Primersätzen, die 100% erzielten. Die Testgruppe bestand aus 7 Stämmen von L. grayi und 4 Stämmen von L. murrayi. Die positive Antwort der verschiedenen Primersätze war folgendermaßen:
    76/rc55550%;
    76/rc57318%;
    88/rc55527%; und
    88/rc5739%.
  • Die schwache und variable Antwort von L. grayi und L. murrayi auf Priming-Stellen des Gattungsniveaus ist nicht überraschend. DNS-DNS-Hybrtdisierungsstudien haben gezeigt, dass L. grayi und L. murrayi nur mäßig verwandt sind mit den Referenzstämmen von L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri und L. ivanovii, d. h., jeweils zu 3-29% bzw. 1-9%. (Rocourt et al., Curr. Microbiol. 7: 383-388 (1982).) Aufgrund dieser und anderer DNS-DNS-Hybridisierungsstudien ist vorgeschlagen worden, dass L. grayi und L. murrayi ausreichend verschieden von L. monocytogenes sind, um ihre Abtrennung in eine neue Gattung, Murraya grayi, zu verdienen. Die Frage, wie diese Spezies klassifiziert werden sollten, ist zur Zeit nicht entschieden. Ungeachtet wie die Stämme von diesen beiden Spezies schlussendlich klassifizier werden, zeigen die Primer vom Gattungsniveau allgemein eine schwache positive Antwort auf Stämme von dieser Gruppe. Es wird erwartet, das die Stärke der positiven Antwort extrem abhängig ist vom Niveau der in der Untersuchung verwendeten DNS, wobei erwartet wird, dass die Sensitivität gegenüber L. grayi- und L. murrayi-Stämmen um 3 Größenordnungen schwächer ist als gegenüber anderen Listeria-Spezies.
  • BEISPIEL 7
  • AUSWAHL DER DIAGNOSTISCHEN PRIMER VON LISTERIA SPP. AUFGRUND DER SENSITIVITÄT GEGENÜBER DER ANNEALING-TEMPERATUR
  • Um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass L. spp.-Primer durch fehlgepaartes Priming in Nicht-Listeria-Stämmen PCR-Produkte erzeugen, wurde die Beziehung zwischen Annealingtemperatur und Amplifizierungsspezifität ausgewertet. Amplifizierungen wurden ausgeführt an einer Testgruppe von 7 Stämmen bei einer Annealingtemperatur von 70°C. Die Annealingtemperatur wurde dann in 5°C-Schritten erniedrigt bis zum Auftreten nichtspezifischer Amplifizierungsprodukte. Die Primerkombinationen 76/rc573 und 88/rc573 zeigten beide nicht-spezifische Produkte bei 65°C. Bei 60°C begann 88/rc555, unspezifische Produkte zu zeigen. Solche Produkte wurden nicht beobachtet für den Primer-Satz 76/rc555, bis die Annealingtemperatur auf 55°C vermindert wurde. Da es für den Primersatz 76/rc555 am wenigsten wahrscheinlich war, nicht-spezifische Amplifizierungsprodukte zu erzeugen, war dieser Primersatz der Hauptkandidat für die Listeria spp.-Detektionsuntersuchung.
  • BEISPIEL 8
  • ENDAUSWERTUNG DER DIAGNOSTISCHEN PRIMER VON LISTERIA SPP. ENDAUSWERTUNG DES KANDIDATEN FÜR DEN PRIMER-SATZ VON LISTERIA SPP.
  • Bevor die Auswahl des Primers 76/rc555 bestätigt wurde, wurde die Genauigkeit dieses Satzes für zusätzliche L. spp.-Stämme ausgewertet. Diese gesamte Testgruppe bestand aus 73 Stämmen, die folgendermaßen in Spezies aufgegliedert wurden: 9 L. monocytogenes, 34 L. innocua, 5 L. welshimeri, 11 L. seeligeri, 3 L. ivanovii, 7 L. grayi und 4 L. murrayi. Die PCR-Bedingungen waren die gleichen wie oben spezifiziert, außer dass nur eine Annealingtemperatur von 70°C verwendet wurde. Alle Stämme, die zu den Spezies L. monocytogenes, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri und L. ivanovii gehörten, wurden zu 100% positiv getestet für den Primersatz 76/rc555. Wie oben berichtet, erzielte die Testgruppe von 7 L. grayi- und 4 L. murrayi-Stämmen 50%.
  • Die Genauigkeit des Primersatzes 76/rc555 wurde ebenfalls ausgewertet bei einer Nicht-Listeria spp.-Testgruppe bestehend aus 65 Stämmen, die eine Vielfalt verwandter grampositiver Stämme und enterischer gramnegativer Stämme repräsentieren. Die untersuchten Spezies werden in Tabelle 10 zusammengefasst. TABELLE 10 Negativ-Testgruppe zum Screening des Primersatzes von Listeria spp. 1515-30-76/1515(8585)-30-rc555,
    Figure 00280001
  • Keiner der Stämme von Tabelle 10 produzierte eine positive PCR-Antwort für Annealingtemperaturen im Bereich von 60-70°C. Beispiele der Ergebnisse von den Listeria spp.- und Nicht-Listeria spp.-Testgruppen für das Primerpaar 76/rc555 werden gezeigt durch Gelanalyse jeweils in 7A bzw. 7B. Die Bahnen werden zugewiesen wie in Tabelle 11 folgt: Tabelle 11 Antwort der Listeria spp.-Positiv-Testgruppe für PCR-Produkte erzeugt vom Primersatz 1515-30-761515(8585)-30-rc555 entsprechend FIG. 4
    Figure 00280002
    Figure 00290001
    TABELLE 12 Antwort der Listeria spp.-Negativ-Testgruppe für PCR-Produkte erzeugt vom Primersatz 1515-30-76/1515(85851-30-rc555
    Figure 00290002
    Figure 00290003
    Figure 00300001
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    Figure 00750001

Claims (18)

  1. Ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein unbekanntes Bakterium Listeria monocytogenes ist, umfassend (A) Amplifizieren genomischer DNS von (i) einer Positiv-Testgruppe von Listeria monocytogenes-Stämmen und (ü) einer Negativ-Testgruppe von nicht-monocytogenes Listeria-Stämmen mit einem Primer, der sich von einem diagnostischen Prä-Marker-Fragment für Listeria monocytogenes ableitet, wobei der Primer ausgewählt ist aus der Gruppe von Nukleinsäuren, welche SEQ ID NOS: 17, 18 und 19 entsprechen, um ein diagnostisches Fragment von 1300 bp (Basenpaaren) jeweils für die Positivund die Negativ-Testgruppen zu erzielen; (B) Auswahl mindestens eines diagnostischen Markers von Listeria monocytogenes, welcher innerhalb des diagnostischen Fragments enthalten ist, durch Vergleich des diagnostischen Fragments, erhalten bei Amplifikation von der Positiv-Testgruppe, mit dem diagnostischen Fragment, erhalten bei Amplifikation von der Negativ-Testgruppe, wobei mindestens ein hochkonservierter Bereich im diagnostischen Fragment der Positiv-Testgruppe identifiziert wird, welcher zu weniger als 90% homolog ist zu jedem Mitglied der Negativ-Testgruppe; (C) Entwurf mindestens eines Amplifikationsmarker, der dem einen diagnostischen Marker, der in Schritt (B) mindestens identifiziert wurde, entspricht; und (D) Amplifizieren genomischer DNS des unbekannten Bakteriums bei geeigneten Annealing-Temperaturen mit dem zumindest einen Amplifikationsprimer von Schritt (C), wobei der Erhalt von mindestens einem Amplifikationsprodukt anzeigt, dass das unbekannte Bakterium Listeria monocytogenes ist.
  2. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das diagnostische Prä-Marker-Fragment von Listeria monocytogenes ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, die SEQ ID NOS: 20-23 entsprechen.
  3. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das diagnostische Fragment mindestens zu 83% homolog ist zu SEQ ID NOS: 24-31 und 33-40.
  4. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das diagnostische Fragment ausgewählt ist aus der Gruppe, welche aus Nukleinsäuren besteht, die SEQ ID NOS: 24-31 und 33-40 entsprechen.
  5. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin mindestens ein diagnostischer Macker, welcher in Schritt (B) ausgewählt wurde, aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Nukleinsäuren besteht, die SEQ ID NOS: 46-83 entsprechen.
  6. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin mindestens ein Amplifikationsprimer eine Länge von etwa 15 bis 30 bp hat.
  7. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die geeignete Annealing-Temperatur in einem Bereich von etwa 60°C bis 70°C liegt.
  8. Ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein unbekanntes Bakterium ein Mitglied der Gattung Listeria ist, umfassend (A) Amplifizieren genomischer DNS von (i) einer Positiv-Testgruppe von Listeria monocytogenes-Stämmen und (ii) einer Negativ-Testgruppe von nicht-monocytogenes Listeria-Stämmen mit einem Primer, welcher sich von einem diagnostischen Prä-Marker-Fragment für Listeria monocytogenes-Stämme ableitet, wobei der Primer ausgewählt wurde aus einer Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, welche SEQ ID NOS: 17, 18 und 19 entsprechen, um ein diagnostisches 1300-bp-Fragment jeweils für die Positiv- und die Negativ-Testgruppen zu erzielen; (B) Auswahl mindestens eines Listeria-gattungsspezifischen diagnostischen Markers, welcher enthalten ist innerhalb des diagnostischen Fragmentes, durch Vergleich des diagnostischen Fragmentes, welches bei Amplifikation von der Positiv-Testgruppe erhalten wird, mit dem diagnostischen Fragment, welches bei Amplifikation von der Negativ-Testgruppe erhalten wird, wodurch mindestens ein hochkonservierter Bereich im diagnostischen Fragment der Positiv-Testgruppe identifiziert wird, welches mindestens zu 90% homolog ist zur entsprechenden Positiv-Testgruppe des diagnostischen Fragmentes; (C) Entwurf von Amplifikationsprimern, die dem einen diagnostischen Listertagattungsspezifischen Marker, welcher in Schritt (B) mindestens ausgewählt wird, entsprechen; und (D) Amplifikation genomischer DNS des unbekannten Bakteriums bei geeigneten Annealing-Temperaturen mit den Amplifikationsprimern von Schritt (C), wobei der Erhalt von Amplifikationsprodukten anzeigt, dass das unbekannte Bakterium ein Mitglied der Gattung Listeria ist.
  9. Das Verfahren nach Anspruch 8, worin bei Schritt (A) das diagnostische Fragment mindestens zu 83% homolog ist zu einer von SEQ ID NOS: 24-31 und 33-40.
  10. Das Verfahren nach Anspruch 8, worin bei Schritt (A) das diagnostische Fragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, die SEQ ID NOS: 24-31 und 33-40 entsprechen.
  11. Das Verfahren nach Anspruch 8, worin das diagnostische Prä-Marker-Fragment von Listeria monocytogenes ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, die SEQ ID NOS: 20-23 entsprechen.
  12. Das Verfahren nach Anspruch 8, worin der diagnostische Marker, welcher in Schritt (B) mindestens ausgewählt wurde, aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Nukleinsäuren besteht, die SEQ ID NOS: 84-110 entsprechen.
  13. Das Verfahren nach Anspruch 8, worin der mindestens einen Amplifikationsprimer eine Länge von etwa 15 bis 30 bp hat.
  14. Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei die geeignete Annealing-Temperatur im Bereich von etwa 60°C bis 70°C liegt.
  15. Ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein unbekanntes Bakterium Listeria monocytogenes ist, umfassend das in Kontakt bringen der genomischen DNS des unbekannten Bakteriums mit einer Nukleinsäure-Sonde, welche ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, die SEQ ID NOS: 46-83 entsprechen, und anschließend Detektion der Hybridisierung von der Nukleinsäuresonde mit der genomischen DNS.
  16. Ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein unbekanntes Bakterium Listeria monocytogenes ist, umfassend das in Kontakt bringen der genomischen DNS des unbekannten Bakteriums mit einer Nukleinsäure-Sonde, welche ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, die SEQ ID NOS: 84-110 entsprechen, und anschließend Detektion der Hybridisierung von der Nukleinsäuresonde mit der genomischen DNS.
  17. Isolierte Nukleinsäurefragmente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäurefragmenten, die SEQ ID NOS: 17 bis 31, 33 bis 40, und 46 bis 110 entsprechen.
  18. Ein isoliertes Nukleinsäurefragment, welches für die Aminosäuresequenz, wie in einer von SEQ ID NOS: 32 und 41-45 angegeben, codiert.
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