DE10215238C1 - Nachweis von Mykobakterien in klinischem Material - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein molekular-biologisches Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mykobakterien und zur Differenzierung des Mycobakterium tuberculosis-Komplex und Mycobakterium avium von anderen Mykobakterien in klinischem Material mittels Amplifikations-Primer und Oligonucleotid-Sonden, die spezifisch für die Gattungs- und Art-spezifischen Regionen des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien sind.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mykobakterien und zur Differenzierung des Mycobacterium tuberculosis- Komplex und Mycobacterium avium von anderen Myko­ bakterien in klinischem Material.

Die Tuberkulose ist eine weltweit verbreitete In­ fektionskrankheit, die chronisch verläuft und jähr­ lich mehr Menschen das Leben kostet als irgendeine andere bakterielle Infektion.

Die Tuberkulose ist insbesondere in der Lunge loka­ lisiert, seltener in Halslymphknoten, Darm oder Haut. Die sehr unterschiedlichen klinischen Verläu­ fe der Tuberkulose machen daher eine exakte Beschreibung des Krankheitszustands und eine schnelle Diagnose insbesondere zu frühen Er­ krankungsstadien notwendig.

Erreger der Tuberkulose sind die Arten: Mycobacte­ rium tuberculosis und sehr selten Mycobacterium bo­ vis. Diese tuberkulösen Erreger werden allgemein unter dem Begriff "Mycobacterium tuberculosis- Komplex" zusammengefasst.

Eine Folgeerscheinung der chronischen Tuberkulose, die insbesondere durch Streuung der tuberkulösen Erreger im gesamten Organismus ausgelöst wird, ist beispielsweise die Meningitis tuberculosa, die durch Lumbalpunktion diagnostiziert werden kann, wobei allein die eindeutige und frühzeitige Diagno­ se und die anschließende gezielte intensive Thera­ pie lebensrettend sind. Weitere Folgeerscheinungen lassen sich ebenfalls nur durch eine eindeutige und frühzeitige Diagnose erkennen oder bereits verhin­ dern: Pleuritis tuberculosa, Peritonitis tuberculo­ sa, Hauttuberkulose, Knochentuberkulose, Gelenktu­ berkulose und Urogenitaltuberkulose. Insbesondere die Urogenitaltuberkulose zeichnet sich durch einen schleichenden, symptomarmen Verlauf aus und lässt sich daher oft nicht sofort als solche erkennen, weshalb eine eindeutige und frühzeitige Diagnose bei Patienten notwendig ist.

In den meisten Industrienationen besteht sofortige Meldepflicht bei einer Erkrankung, nicht zuletzt um so schnell wie möglich eine Ausbreitung in der Be­ völkerung zu verhindern. In einigen Entwicklungs­ ländern wie Afrika, Asien oder Ozeanien liegt die durchschnittliche Inzidenz bei 200 jährlichen Neu­ erkrankungen auf 100 000 Einwohner. In Westeuropa liegt die durchschnittliche Inzidenz immerhin bei 30 jährlichen Neuerkrankungen pro 100 000 Einwohner, in der Bundesrepublik Deutschland bei ca. 20.

In den letzten Jahren kann ein vermehrtes Auftreten von Tuberkulose sowohl in den Entwicklungsländern als auch in den Industrienationen beobachtet wer­ den, wobei vor allem bei immunsupprimierten HIV- Patienten dadurch regelmäßig Todesfälle verzeichnet werden (8).

Es wird angenommen, dass zur Zeit ein Drittel der Weltbevölkerung mit dem Mycobacterium tuberculosis- Komplex infiziert ist. Jedoch nicht nur wegen der allgemeinen Gefahr für große Teile der Weltbevölke­ rung, sondern auch wegen des inzwischen epidemiear­ tigen Auftretens von mehrfach-resistenten Bakteri­ enstämmen (MDRTB) innerhalb oder außerhalb von Krankenhäusern wird die schnelle und eindeutige Di­ agnose zum Nachweis dieser Bakterienstämme gefor­ dert (9, 14).

Durch die HIV-Epidemie der letzten Jahrzehnte als "Nährboden" zur Verbreitung von Infektionskrankhei­ ten vermehrte sich außerdem auch das epidemiologi­ sche Auftreten von nicht-tuberkulösen Mykobakterien (4). Bei durch nicht-tuberkulöse Mykobakterien ver­ ursachten Infektionen sind ähnlich einer "echten" Tuberkulose Organe wie Lunge, Lymphknoten im Hals­ bereich oder die Haut betroffen. Selten kommt es zu einer Streuung der nicht-tuberkulösen Erreger in den gesamten Organismus, wobei Folgeerscheinungen ähnlich wie bei einer "echten" Tuberkulose beobach­ tet werden können. Nicht-tuberkulöse Mykobakterien führen bei Patienten, die beispielsweise an zysti­ scher Fibrose erkrankt sind, zu einer zusätzlichen Verschlechterung des Krankheitsbildes im Bereich der Lunge (1, 2, 16).

Zu den nicht-tuberkulösen Mykobakterien, die in der klinischen Praxis beobachtet werden, zählen: Myco­ bacterium avium, Mycobacterium intracellulare, My­ cobacterium kansasii, Mycobacterium marinum, Myco­ bacterium fortuitum, Mycobacterium chelonae und My­ cobacterium abscessus (4).

Die Diagnostik von Mykobakterien in klinischem Ma­ terial sollte idealer Weise einen spezifischen Nachweis von tuberkulösen und von nicht- tuberkulösen Mykobakterien erlauben.

In den letzten Jahren wurden zur klinischen Diagno­ se von Mykobakterien im Labor verstärkt molekular­ biologische Techniken basierend auf einer Nuclein­ säure-Vervielfachung, insbesondere Amplifikation, wie der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt. PCR-Verfahren zur Amplifikation einer Vielzahl ver­ schiedener chromosomaler DNA-Fragmente wurden zur Detektion von sowohl Gattungs-spezifischen als auch von M. tuberculosis-spezifischen DNA-Regionen ein­ gesetzt (15).

Gattungs-spezifische Verfahren werden eingesetzt, um eine Mykobakterien-Infektion gegenüber anderen Infektionen abzugrenzen. Bekannte Gattungs- spezifische Verfahren zielen dabei auf das 16S- rRNA-Gen oder das Gen des 65 kDa-"heat shock"- Proteins. Eine anschließende spezifische Identifi­ kation einiger Mykobakterienarten wird mit konser­ vierten Hybridisierungssonden durchgeführt (5, 12) Alternativ werden die amplifizierten Gene sequen­ ziert (6) oder es wird eine Analyse mittels Re­ striktionsenzymen durchgeführt (15).

Zu den spezifischen DNA-Regionen, die zum Art- spezifischen Nachweis des M. tuberculosis-Komplex mittels PCR eingesetzt werden, zählen beispielswei­ se IS 6110, die Gene des 38 kDa-Proteins, die Gene des MBP 64-Proteins sowie die Regionen mtp40 oder pMTb4.

Abgesehen von diesen individuellen Laborverfahren existieren kommerziell erhältliche Diagnose-Kits, die meist ausschließlich zur Diagnose des M. tuber­ culosis-Komplex geeignet sind. Bekannte Kits werden beispielsweise von Roche-Amplicor™, Geneprobe™ oder Abbot™ angeboten.

Die molekularbiologischen Verfahren, die zu diesem Zweck durchgeführt werden, beinhalten einerseits die Vervielfältigung der nachzuweisenden Nuclein­ säure (Targetamplifikation), beispielsweise durch die PCR, durch die Transkriptions-basierte isother­ me DNA-Synthese (TMA), durch die Ligase- Kettenreaktion (LCR) oder durch die isotherme Strangverdrängungs-Amplifikation (SDA), anderer­ seits die Vervielfältigung der signalgebenden Kom­ ponente (Signalamplifikation), wie durch die iso­ therme Qβ-Replikation.

Bezeichnend für die heutige Situation ist die Tat­ sache, dass es bis jetzt noch keine Methode gibt, die als allgemein anerkannter Diagnose-Standard ak­ zeptiert ist. Der Nachweis von Mykobakterien mit Hilfe von molekularen Methoden wird in Deutschland inzwischen zweimal pro Jahr durch eine nationale Qualitätskontrolle überprüft. In diesen Ringversu­ chen zeigten sich Schwächen bei den kommerziell er­ hältlichen Diagnose-Kits und bei verschiedenen Ei­ genentwicklungen, vor allen bei der Anwendung mit stark verdünnten Proben. Es wird davon ausgegangen, dass es sich hierbei um systematische Schwächen der jeweils zugrunde liegenden Nachweisreaktionen han­ delt. Daher werden alle bisher bestehenden Methoden als unbefriedigend und deshalb verbesserungswürdig angesehen.

Weitere wesentliche Nachteile der kommerziell er­ hältlichen Verfahren sind insbesondere (a) eine fehlende Möglichkeit der Unterscheidung zwischen dem Mycobacterium tuberculosis-Komplex und nicht- tuberkulösen Mykobakterien, (b) eine mögliche un­ spezifische Inhibition der Amplifikationsreaktion im Nachweisverfahren bei klinischen Proben, (c) ei­ ne lange Untersuchungsdauer (über mehrere Stunden) und (d) eine Beschränkung des einsetzbaren klini­ schen Materials insbesondere auf Proben aus dem Re­ spirationstrakt.

Das 16S-rRNA-Gen wird bereits zum Nachweis und zur Identifizierung verschiedener humanpathogener Myko­ bakterien mittels PCR eingesetzt. Zur Identifizie­ rung von Mykobakterien aufgrund ihrer unterschied­ lichen 16S-rRNA-Gene werden Datenbanken wie RIDOM und Micro Seq eingesetzt. Die Datenbank RIDOM ba­ siert auf 16S-rRNA-Gen 5'-Teilsequenzen bis zur Po­ sition 510 (17), das Micro Seq 500 16S-rRNA- Sequenzierkit der Firma Applied Biosystems® beruht auf der Vervielfachung (PCR) und Sequenzierung der ersten 500 Basenpaare des bakteriellen rRNA-Gens. Um das Micro Seq 500-System einzusetzen, ist auch die RIDOM-Datenbank zur Differenzierung ribosomalen RNA erforderlich (18). Aus (19) ist bekannt, zur Identifizierung von Mykobakterien die Untersuchung Gattungs-spezifischer Bereiche auf dem 16S-rRNA-Gen mit der Untersuchung des Art-spezifischen Inserti­ onselements IS6110 zu verknüpfen. Die EP 0 528 306 A2 beschreibt Amplifikationsprimer für die 16S- rRNA-Gen-Region und Gattungs-spezifische Hybridi­ sierungssonden. Dabei werden auch Sonden mit Kon­ sensus-Sequenzen eingesetzt. Aus der WO 02/22872 A1 wird ein Multiplex-PCR-Verfahren beschrieben. Dabei wird der interne transkribierte Art-spezifische "spacer" zwischen 16S-RNA-Gen und 23S-RNA-Gen un­ tersucht. Aus der US 6,136,529 A ist ein Hybridi­ sierungssonden-Assay bekannt, worin Einzel-Oligo- Nucleotidsonden zur Identifizierung von M. avium eingesetzt werden. Diese Sonden werden aus der Se­ quenzinformation des gesamten 16S-rRNA-Gens abge­ leitet. Basierend auf einem 16S-rRNA-Nachweissystem wird in (7) ein Algorithmus zur spezifischen Ver­ vielfältigung eines 1000 bp Fragments der mykobak­ teriellen 16S-rRNA mittels eines unspezifischen Primers und eines Gattungs-spezifischen Primers für Mykobakterien vorgeschlagen. Zur Bestätigung, ob das richtige Fragment vervielfältigt wird, werden dabei Gattungs-spezifische Oligonucleotid-Sonden eingesetzt, die mit dem amplifizierten Fragment hybridisieren. Im weiteren Verlauf werden Art- spezifische Hybridisierungssonden eingesetzt, wobei anhand desselben amplifizierten Fragments die Myko­ bakterienarten M. tuberculosis-Komplex und M. avium gegenüber anderen Bakterienarten unterschieden wer­ den können (5). Wesentliche Nachteile dieser meist mehrstufigen Verfahren bestehen darin, dass diese Nachweisverfahren auf zum Teil aufwendigen Hybridisierungsverfahren basieren und den Einsatz hochqualifizierter Personen erfor­ dert. Darüber hinaus müssen diese Nachweisverfahren mindestens über Nacht angesetzt werden; ein Ergeb­ nis steht also frühestens am nächsten Tag nach Pro­ benbereitstellung zur Verfügung (5, 6). Patienten müssen bis zum Vorliegen der Untersuchungsergebnis­ se meist stationär aufgenommen werden. Für die kli­ nische Routinediagnose sind diese Verfahren daher nur sehr bedingt einsetzbar.

Aus dem Stand der Technik ist daher bisher kein für den klinischen Routineeinsatz geeignetes Verfahren bekannt, das sich insbesondere durch einfache An­ wendung auszeichnet und womit es gelingt, M. tuber­ culosis und M. avium schneller und spezifisch in klinischem Material wie Sputum, Bronchial-Lavage, Magensaft, Urin, Stuhl, Knochenmark, Blut oder Bi­ opsien, insbesondere Punktatbiopsien, nachzuweisen und im gleichen Verfahren eine Mykobakterien- Infektion eindeutig von anderen mikrobiellen Infek­ tionen abzugrenzen.

DNA extrahiert aus klinischen Proben enthält Verun­ reinigungen, die oft dazu führen, dass die Enzym- basierte Amplifikation, insbesondere die PCR, ge­ hemmt wird. So besteht bei den bisher bekannten Nachweisverfahren die große Gefahr, dass ein nega­ tives Ergebnis erhalten wird, obwohl tatsächlich eine Mykobakterieninfektion beim Patienten vor­ liegt. Im schlimmsten Fall wird dadurch eine beste­ hende Tuberkulose übersehen. Es besteht daher seit langem auch das Bedürfnis, ein Kontrollsystem zu entwickeln, das sogenannte "falsch-negative" Befun­ de im Nachweisverfahren ausschließt (Inhibiti­ onskontrolle).

Es ist bekannt, dass der Einsatz der Echtzeit-PCR (Rapid-Cycle-PCR), die beispielsweise mit einem Luft-temperierten System ausgestattet ist und somit wesentlich geringere Transitionszeiten gegenüber einer herkömmlichen PCR aufweist, zu einer deutlich verminderten Zeit bis zum Nachweis von beispiels­ weise M. tuberculosis führt (2).

Darüber hinaus stellen fluorimetrische Messungen, insbesondere, wenn sie Rahmen des Echtzeit-PCR- Verfahren eingesetzt werden, eine schnelle und emp­ findliche Methode zum Nachweis von amplifizierten Genfragmenten dar. In (3) wurde eine Echtzeit- Fluorimetrie zum Nachweis von M. tuberculosis in Expectoraten unter Verwendung des TaqMan™-Systems eingesetzt.

Das LightCycler™-System der Firma Roche Molecular Biochemicals, das eine Ausgestaltung der Echtzeit- PCR ist, wurde inzwischen ebenfalls zum Nachweis von M. bovis in Rinderstuhl sowie zum Nachweis von Rifampin- oder Isoniazid-Resistenz-bedingten Muta­ tionen in M. tuberculosis eingesetzt (11, 13). In diesen beiden Studien waren die vervielfachten Fragmente typischerweise 200 Basenpaare lang. Auf­ grund des hohen Durchsatzes eines LightCycler™- Systems wird nämlich bisher davon ausgegangen, dass eine Vervielfachung von größeren DNA-Fragmenten von Mykobakterien aufgrund des in Mykobakterien vorkom­ menden hohen CG-Nukleotidgehaltes von ca. 65% bis zu 75% schwierig bis unmöglich ist.

Ausgehend vom Stand der Technik besteht ein wesent­ licher Nachteil der bisher bekannten Nachweisreak­ tionen darin, dass Mykobakterien-Infektionen in klinischem Material bisher noch nicht eindeutig ge­ genüber nicht-mykobakteriellen Infektionen abge­ grenzt werden können: Aus den Stand der Technik ist die Gattungs-spezifische Region II, "genus II", auf dem 16S-rRNA-Gen von Mykobakterien bekannt, wobei mittels eines spezifischen Hybridisierungssonden- Paars und einer Schmelzkurvenanalyse eine Vielzahl von Mykobakterienarten aufgrund eines höheren Schmelzpunktes des Sonden-Paars von anderen Bakte­ rien-Arten und anderen Mikroorganismen unterschie­ den werden können (6). Jedoch weisen auch bestimmte Mykobakterienarten wie M. triviale, M. agri, M. Xe­ nopi oder M. chitae einen niedrigen Schmelzpunkt auf, so dass nach dem Stand der Technik eine ein­ deutige Abgrenzung der Mykobakterien von Nicht- Mykobakterien, insbesondere in einem einzigen Ver­ fahrensschritt, gar nicht möglich ist.

Vor diesem Hintergrund liegt das technische Problem der vorliegenden Erfindung darin, ein verbessertes Verfahren bereitzustellen, das insbesondere einen besonders schnellen und gleichzeitig spezifischeren Nachweis von Mykobakterien-Infektionen in klini­ schem Material verschiedenen Ursprungs und die Identifizierung der Arten fit tuberculosis-Komplex und/oder M. avium in einem gemeinsamen Nachweisver­ fahren ermöglicht.

Die vorliegende Erfindung löst das technische Prob­ lem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zum gemeinsamen, spezifischen Nachweis einer Mykobakte­ rien-Infektion und des Mycobacterium tuberculosis- Komplex und/oder von Mycobacterium avium gegenüber anderen Mykobakterienarten in klinischem Material, wobei

• a) mikrobielle DNA aus dem klinischen Material extrahiert wird und anschließend
• b) mindestens ein Fragment des 16S-rRNA-Gens aus der mikrobiellen DNA mit einem Primerpaar umfassend die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 amplifiziert wird
  oder
  mit zwei Primerpaaren, wobei das eine Primerpaar die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 umfasst und das andere Primerpaar unmittelbar davor oder danach oder gleichzeitig eingesetzt wird und die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5 umfasst, amplifiziert wird und anschließend
• c) das mindestens eine amplifizierte 16S-rRNA- Genfragment mittels mindestens eines Paares mar­ kierter Hybridisierungssonden, die mit hypervariab­ len Art-spezifischen Regionen des 16S-rRNA- Fragments von Mykobakterien hybridisieren, detek­ tiert wird, wobei das Paar markierter Hybridisie­ rungssonden zum Nachweis des M. tuberculosis- Komplex die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 oder das Paar der komplementären Sequenzen davon beinhaltet und wobei das Paar der markierten Hybridisierungssonden zum Nachweis von M. avium die Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 oder das Paar der komplementären Sequenzen davon beinhaltet, und anschließend, gleichzeitig oder zeitlich unmittelbar davor
• d) das mindestens eine amplifizierte 16S-rRNA- Genfragment mittels eines Paars markierter Hybridi­ sierungssonden, das mit der Gattungs-spezifischen Region III des 16S-rRNA-Fragments hybridisiert, de­ tektiert wird, wobei das Paar die Nucleotidsequen­ zen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 oder das Paar der komplementären Sequenzen davon beinhaltet, und wo­ bei
• e) der spezifische Nachweis der Mykobakterien- Gattung und der Nachweis des M. tuberculosis- Komplex und/oder von M. avium in den Schritten (c) und (d) mittels Schmelzkurvenanalyse erfolgt.

Die Erfindung sieht vorteilhafterweise also vor, dass in einem einheitlichen gemeinsamen Verfahrens­ gang der Nachweis von Mykobakterien als Gattung zu­ sammen mit dem Art-spezifischen Nachweis von M. tu­ berculosis-Komplex ermöglicht wird. Die Erfindung ermöglicht auch einen gemeinsamen einheitlichen spezifischen Nachweis der Gattung Mycobacterium zu­ sammen mit dem Art-spezifischen Nachweis von M. a­ vium. Schließlich ermöglicht die Erfindung auch den gemeinsamen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Mycobacterium zusammen mit dem Art- spezifischen Nachweis von M. tuberculosis-Komplex und von M. avium.

Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens ist, dass in dem eingesetzten kombinierten Nachweisverfahren zur Diagnose von Mykobakterien- Infektionen sowohl eine bestehende Mykobakterien- Infektion gegenüber anderen mikrobiellen Infektion als auch eine bestehende Tuberkulose gegenüber nicht-tuberkulösen Infektionen eindeutig und sicher erkannt werden kann. Dieser Nachweis war in so vor­ teilhafter Weise nach dem Stand der Technik nicht möglich.

Der eindeutige Nachweis einer Mykobakterien- Infektion gegenüber anderen mikrobiellen Infektio­ nen findet erfindungsgemäß durch Analyse der Schmelztemperaturen der Hybridisierung des Gat­ tungs-spezifischen Hybridisierungssonden-Paars, das die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 oder das Paar der komplementären Sequenzen davon beinhaltet, mit der Gattungs-spezifischen Region III des 16S-rRNA-Gens statt. In den erfindungsgemä­ ßen Nachweisverfahren zeichnen sich Mykobakterien- Stämme durch Schmelztemperaturen von mindestens 55°C, insbesondere von 55°C und 61,5°C aus. In ei­ ner weiteren Variante dieses Nachweisverfahrens kann bei Auftreten der Schmelztemperatur von 55°C der Mykobakterien-Stamm M. chelonae eindeutig ge­ genüber allen anderen Mykobakterien-Stämmen, die insbesondere eine Schmelztemperatur von 61,5°C auf­ weisen, identifiziert und eine Mykobakterien- Infektion durch M. chelonae nachgewiesen werden.

Als weiterer Vorteil erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren neben dem eindeutigen und sicheren Nach­ weis einer tuberkulösen Infektion den eindeutigen und sicheren Nachweis einer nicht-tuberkulösen In­ fektion ausgelöst durch M. avium.

Der eindeutige Nachweis einer tuberkulösen Infekti­ on durch Stämme des M. tuberculosis-Komplex findet erfindungsgemäß durch Analyse der Schmelztemperatu­ ren der Hybridisierung des Art-spezifischen Hybri­ disierungssonden-Paars für den M. tuberculosis- Komplex, das die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 oder das Paar der komplementären Sequenzen davon beinhaltet, mit der Art- spezifischen Region des 16S-rRNA-Gens statt. In den erfindungsgemäßen Nachweisverfahren zeichnen sich Stämme des M. tuberculosis-Komplex durch Schmelz­ temperaturen von mindestens 55°C, insbesondere von 64°C aus.

Der eindeutige Nachweis einer tuberkulösen Infekti­ on durch M. avium findet erfindungsgemäß durch Ana­ lyse der Schmelztemperaturen der Hybridisierung des Art-spezifischen Hybridisierungssonden-Paars für M. avium, das die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 oder das Paar der komplementären Sequenzen davon beinhaltet, mit der Art- spezifischen Region des 16S-rRNA-Gens statt. In den erfindungsgemäßen Nachweisverfahren zeichnet sich M. avium durch Schmelztemperaturen von mindestens 55°C, insbesondere von 61°C aus.

Erfindungsgemäß bevorzugt wird das vorgenannte Ver­ fahren mit einem erfindungsgemäßen internen Stan­ dard in Form von künstlichen Plasmiden, Kon­ trollplasmiden, zur Identifizierung sogenannter "falsch-negativer" Befunde durchgeführt. In einer Variante ist dazu vorgesehen, dass ein erster Teil der extrahierten mikrobiellen DNA dem vorgenannten Verfahren mit den Schritten (a) bis (e) unterzogen wird und ein zweiter Teil der extrahierten mikro­ biellen DNA in einem zum vorgenannten Verfahren pa­ rallelen Ansatz

• 1. (a') mit mindestens einem künstlichen Plasmid vor­ zugsweise subcloniert in pGEM-T, das als interner Standard dient, vermischt wird, wobei das künstli­ che Plasmid eine Gattungs-spezifische Region III der 16S-rRNA mit einer modifizierten Nucleotidse­ quenz umfasst, und anschließend
• 2. (b') Fragmente der modifizierten 16S-rRNA-Gene mit­ tels mindestens eines Primerpaares ausgewählt aus der Gruppe der Primerpaare bestehend aus den Nucle­ otidsequenz-Paaren SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5 vervielfacht werden und anschließend
• 3. (c') die vervielfachten 16S-rRNA-Fragmente mittels eines Paars markierter Hybridisierungssonden detek­ tiert werden, die mit der modifizierten Gattungs- spezifischen Region III hybridisieren, wobei das Paar der markierten Hybridisierungssonden die Nuc­ leotidsequenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 umfasst und wobei
• 4. (d') während der Detektion der spezifische Nachweis der 16S-rRNA-Fragmente von Mykobakterien und der modifizierten 16S-rRNA-Fragmente des internen Stan­ dards mittels Schmelzkurvenanalyse erfolgt.

In einer weiteren bevorzugten Variante des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens werden die Schritte (a), (b), (c), (d) und (e) des vorgenannten Verfahrens durchgeführt, wobei das mindestens eine künstliche Plasmid in Schritt (a) mit der gesamten extrahier­ ten mikrobiellen DNA vermischt wird und nach Ampli­ fikation gemäß Schritt (b) die Detektion und Schmelzkurvenanalyse zum Nachweis der vervielfach­ ten 16S-rRNA-Fragmente von Mykobakterien und der modifizierten 16S-rRNA-Fragmente des internen Stan­ dards, insbesondere gleichzeitig, gemäß der Schrit­ te (c') und (d') durchgeführt wird.

Durch den Einsatz eines Kontrollplasmids im erfin­ dungsgemäßen Nachweisverfahren gelingt es vorteil­ haft, den Erfolg der Amplifikationsreaktion bereits während der Nachweisreaktion von Mykobakterien zu kontrollieren, um damit besonders schnell ein si­ cheres und eindeutiges Ergebnis zu erhalten. Insbe­ sondere sogenannte "falsch-negative" Befunde bei Hemmung der Amplifikation sind durch Verwendung des erfindungsgemäßen Plasmids als interner Standard praktisch ausgeschlossen. Damit sind Spezifität und Selektivität des erfindungsgemäßen Verfahrens ge­ genüber dem Stand der Technik deutlich erhöht.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter den Formulierungen "Primerpaar beinhaltend oder umfassend die Nucleotidsequenzen", "ein Paar Hybridisierungssonden beinhaltend oder umfassend die Nucleotidsequenzen" oder ähnlichen verstanden, dass die jeweiligen Nucleotidsequenzen oder das Paar von Nucleotidsequenzen jeweils die in Bezug genommenen Nucleotidsequenzen aufweisen/aufweist, das heißt, dass diese Nucleotidsequenzen oder das Paar davon aus den konkret genannten Nucleotidse­ quenz allein bestehen/besteht oder gegebenenfalls weitere Sequenzen umfassen/umfasst.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer­ den unter dem Begriff "Mycobacterium tuberculosis- Komplex" die tuberkulösen Mykobakterienarten Mycobacterium tuberculosis, insbesondere der Stamm H37Rv, und Mycobacterium bovis, insbesondere der Stamm R99, wobei diese Stämme Erreger der Krankheit Tuberkulose sind, sowie der Stamm BCG Pasteur des Mycobacterium bovis verstanden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff "tuberkulös" eine Eigenschaft be­ schrieben, die sich auf Mycobacterium tuberculosis, insbesondere den Stamm H37Rv, und Mycobacterium bo­ vis, insbesondere den Stamm R99, im engeren Sinne sowie auf den Stamm BCG Pasteur des Mycobacterium bovis im weiteren Sinne bezieht und das Krankheits­ bild der Tuberkulose bewirkt.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer­ den unter der Bezeichnung "Mycobacterium avium" die nicht-tuberkulösen Mykobakterienarten Mycobacterium avium, insbesondere der Stamm ATCC35712, und deren Unterart Mycobacterium paratuberculosis, insbeson­ dere der Stamm Pat. 6783, verstanden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff "nicht-tuberkulös" eine Eigen­ schaft verstanden, die im Zusammenhang mit einer anderen Erkrankung als der Tuberkulose steht und insbesondere eine Mykobakteriose ist.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer­ den unter klinischem Material klinische Proben wie Sputum, Bronchiallavage, Magensaft, Urin, Stuhl, Liquor, Knochenmark, Blut oder Biopsien, insbeson­ dere Punktat-Biopsien, beispielsweise aus Hals­ lymphknoten, verstanden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff "modifizierte Nucleotidsequenz" eine Nucleinsäuresequenz verstanden, die sich durch Austausch, Inversion, Deletion oder Addition von mindestens einem Nucleotid, auch einem ungewöhnli­ chen oder synthetischen Nucleotid, von ihrer ur­ sprünglichen Sequenz, d. h. der Wildtyp-Sequenz, in mindestens einem Nucleotid, bevorzugt in zwei Nuc­ leotiden, unterscheidet. In diesem Zusammenhang wird unter dem Begriff "modifiziert" eine Eigen­ schaft verstanden, die sich auf eine "modifizierte Nucleotidsequenz" bezieht.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorgenann­ ten Verfahren wird die Amplifikation der Genfrag­ mente des 16S-rRNA-Gens mittels Polymerase- Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Bevorzugt wird die Amplifikation mittels Echtzeit-PCR (Rapid- Cycle-PCR) durchgeführt. Im Echtzeit-PCR Verfahren ist es möglich, die Vervielfachung der PCR-Produkte in Echtzeit Amplifikations-Zyklus für Amplifikati­ ons-Zyklus zu beobachten. Besonders bevorzugt wird die Amplifikation in einem LightCycler™-System der Firma Roche Molecular Biochemicals durchgeführt, das eine Ausgestaltung der Echtzeit-PCR ist.

Zu diesem Zweck werden insbesondere der PCR- Ausgangsmischung neben der Polymerase, den Nucleo­ tiden, den Pufferlösungen und den Primern auch Hybridisierungssonden zugegeben, die spezifisch an die gewünschten PCR-Amplifikationsprodukte binden. Dabei werden insbesondere zwei Sequenz-spezifische Oligonucleotid-Sonden verwendet, die mit verschie­ denen Farbstoffen markiert sind. Die Sequenzen der erfindungsgemäßen markierten Hybridisierungssonden- Paare sind so ausgewählt, dass sie auf eine Weise an die Zielsequenzen des amplifizierten DNA- Fragments hybridisieren, dass insbesondere das 3'- Ende der einen Sonde dicht bei dem 5'-Ende der an­ deren Sonde liegt, wodurch die beiden Farbstoffe in unmittelbare Nachbarschaft zueinander gebracht wer­ den, insbesondere beträgt der Abstand zwischen den beiden Sonden zwischen 1 und 5 Nucleotide. Insbe­ sondere kommt es zu einem Fluoreszenz-Resonanz- Energietransfer (FRET) zwischen den beiden Farb­ stoffen der Hybridisierungssonden und damit zu ei­ ner Verschiebung des Fluoreszenzspektrums, wobei das Maß an Fluoreszenz in diesem Wellenlängenbe­ reich eine Funktion der Menge an detektierter DNA ist.

Durch das FRET-System sind erfindungsgemäß quanti­ tative Messungen der Menge amplifizierter DNA- Fragmente vorgesehen. Die erfindungsgemäßen ausge­ wählten Hybridisierungssonden können quantitativ, also stöchiometrisch, an die amplifizierten Frag­ mente binden. Dabei ist die quantitative Hybridi­ sierung insbesondere abhängig von der Temperatur und dem Homologiegrad der verwendeten Oligo­ nucleotid-Sonden mit der detektierten Sequenz auf dem amplifizierten Fragment.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die vor­ genannte fluorimetrische Detektion spezifischer DNA-Sequenzen in den amplifizierten Fragmenten nach einer Amplifikation der Fragmente mittels herkömm­ licher PCR durchgeführt. In einer besonders bevor­ zugten Ausführungsform wird die fluorimetrische De­ tektion in einer Echtzeit-PCR während der Amplifi­ kationsreaktionen durchgeführt, wobei beispielswei­ se die Zunahme an produzierter DNA als Zunahme im Fluoreszenzsignal verfolgt werden kann.

In einer bevorzugten Ausführungsform des vorgenann­ ten erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die spezi­ fische Detektion Art-spezifischer und/oder Gat­ tungs-spezifischer Regionen im amplifizierten DNA- Fragment nach Beendigung der Amplifikationsreakti­ on, wobei nach Hybridisierung des Hybridisierungs­ sonden-Paars, bevorzugt eines FRET-Paars an die zu detektierenden Regionen die Temperatur im Rahmen einer Schmelzkurvenanalyse verändert wird, bevor­ zugt kontinuierlich erhöht wird, und gleichzeitig die in Abhängigkeit von der Temperatur emittierte Fluoreszenz gemessen wird. Auf diese Weise wird ei­ ne Schmelztemperatur bestimmt, bei der die Hybridi­ sierungssonden, insbesondere das eingesetzte FRET- Paar, gerade nicht mehr an die zu detektierende Re­ gion des amplifizierten DNA-Fragments hybridisie­ ren. Der wesentliche Aspekt einer Schmelzkurvenana­ lyse besteht darin, dass es bei Auftreten von Fehl­ paarungen zwischen dem eingesetzten Hybridisie­ rungssonden-Paar und der Zielregion auf dem ampli­ fizierten DNA-Fragment zu einer Reduktion des ge­ messenen Schmelzpunktes kommt. Auf diese Weise wer­ den erfindungsgemäß mit Hybridisierungssonden, ins­ besondere mit einem FRET-Paar, die Regionen von DNA-Fragmenten identifiziert, deren Sequenzen sich voneinander nur geringfügig, insbesondere durch ei­ ne oder wenige Punktmutationen, in der Nucleotidse­ quenz unterscheiden.

In vorteilhafter Weise besitzt das 16S-rRNA-Gen von Mykobakterien sowohl konservierte als auch hochva­ riable Regionen, die beispielsweise eine Gattungs- spezifische Amplifikation von DNA-Fragmenten mit­ tels Gattungs-spezifischer Primer erlaubt. Erfin­ dungsgemäß werden daher die vorgenannten Verfahren der Fluoreszenzdetektion in Verbindung mit der Schmelzkurvenanalyse zum spezifischen Nachweis der Gattungs-spezifischen Region III und der hypervari­ ablen Art-spezifischen Regionen des M. tuberculo­ sis-Komplex und M. avium auf dem 16S-rRNA-Gen ein­ gesetzt.

Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass myko­ bakterielle 16S-rRNA-Gene jeweils zwei Art- spezifische und zwei Gattungs-spezifische Regionen enthalten, siehe Fig. 1: "species (A)" und "spe­ cies (B)" beziehungsweise "genus II" und "genus I". Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine dritte Gattungs-spezifische Region auf dem 16S- rRNA-Gen beschrieben, siehe Fig. 1: "genus III" (erfindungsgemäß).

In Fig. 1 sind zusätzlich schematisch die Primer­ paare dargestellt, die zur Amplifikation der ausge­ wählten Art-spezifischen beziehungsweise Gattungs- spezifischen Regionen verwendet werden.

Erfindungsgemäß wird zur Amplifikation der Gat­ tungs-spezifischen Region III 16S-rRNA-Gens von My­ kobakterien das Primerpaar umfassend die Nucleotid­ sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 5 eingesetzt. In einer bevorzugten Variante besteht das Primer­ paar aus degenerierten oder mutierten Sequenzen oder Fragmenten davon, die jeweils mit den Nucleo­ tidsequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 5 hybridi­ sieren, wovon sie abgeleitet sind, wobei jeweils ein Homologiegrad von mindestens 90%, bevorzugt von mindestens 95%, besonders bevorzugt von min­ destens 98% besteht.

Das mit den vorgenannten Primerpaar amplifizierte 1000 bp lange Fragment enthält sowohl die konser­ vierte Gattungs-spezifische Region III als auch die hochvariablen Art-spezifischen Regionen des M. tu­ berculosis-Komplex und M. avium.

Als besonders überraschend wurde mit dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren gefunden, dass insbesondere mit dem LightCycler™-System - im Gegensatz zur gän­ gigen Lehrmeinung - eine effektive Amplifikation dieses 1000 bp Fragments und der erfindungsgemäße Nachweis der Gattungs- und Art-spezifischen Regio­ nen auf diesem Fragment erzielt werden konnte, ob­ wohl dieses Fragment aus Mykobakterien einen hohen GC-Gehalt besitzt. Erfindungsgemäß bevorzugt kann daher mittels eines einzigen amplifizierten Frag­ ments des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien ein Gat­ tungs-spezifischer Nachweis einer Mykobakterien- Infektion gegenüber anderen mikrobiellen Infektio­ nen und der Art-spezifische Nachweis des M. tuber­ culosis-Komplex und M. avium durchgeführt werden.

Erfindungsgemäß ist außerdem die zusätzliche oder alternative Verwendung von zwei weiteren Primerpaa­ ren vorgesehen, wobei ein Primerpaar ein insbeson­ dere 300 bp langes Fragment des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien amplifiziert, das die Art- spezifischen Regionen des M. tuberculosis-Komplex und M. avium enthält, wobei dieses Primerpaar aus den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 besteht, und das zweite Primerpaar ein 100 bp lan­ ges Fragment desselben Gens amplifiziert, das die Gattungs-spezifische Region III enthält, wobei die­ ses Primerpaar die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5 umfasst. In einer bevorzugten Variante bestehen die zwei Primerpaare aus den Paa­ ren degenerierter oder mutierter Sequenzen oder Fragmenten davon, die jeweils mit den Nucleotidse­ quenz-Paaren SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5 hybridisieren, wovon sie abge­ leitet sind, wobei jeweils ein Homologiegrad von mindestens 90%, bevorzugt von mindestens 95%, be­ sonders bevorzugt von mindestens 98% besteht.

Erfindungsgemäß wird zur Detektion der vorgenannten amplifizierten 16S-rRNA-Fragmente von Mykobakte­ rien, die die Gattungs-spezfische Region III und/oder die Art-spezifischen Regionen des M. tu­ berculosis-Komplex und M. avium enthalten, ein Paar markierter Hybridisierungssonden eingesetzt, das mit der konservierten Gattungs-spezifischen Region III hybridisiert, wobei dieses Paar die Nucleotid­ sequenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 oder die kom­ plementären Sequenzen davon beinhaltet. Bevorzugt wird dabei das Hybridisierungssonden-Paar als FRET- Paar ausgeführt, wobei die Hybridisierungssonde mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 10 oder der komple­ mentären Sequenz davon als Donor-Komponente (= An­ ker-Sonde) ausgeführt ist, die vorzugsweise am 3'- terminalen Nucleotid mit einem Farbstoff, vorzugs­ weise mit einem Fluoreszenz-Farbstoff, besonders bevorzugt mit Fluorescein assoziiert ist, und die zweite Hybridisierungssonde bestehend aus der Nuc­ leotidsequenz SEQ ID NO: 11 oder der komplementären Sequenz davon als Akzeptor-Komponente (= Sensor- Sonde) ausgeführt ist, die vorzugsweise am 5'- terminalen Nucleotid mit einem weiteren Farbstoff, vorzugsweise mit einem Rhodamin-Derivat assoziiert ist.

Erfindungsgemäß wird die Detektion der vorgenannten die Art-spezifischen Regionen enthaltenden 16S- rRNA-Fragmente mit mindestens einem Paar markierter Hybridisierungssonden durchgeführt, wobei bevorzugt die markierten Hybridisierungssonden-Paare als FRET-Paare ausgeführt sind. Dabei werden analog zum Vorgenannten zur spezifischen Detektion der Myko­ bakterienarten M. tuberculosis-Komplex und M. avium die erfindungsgemäßen Art-spezifischen Hybridisie­ rungssonden-Paare eingesetzt, wobei jeweils ein Hybridisierungssonden-Partner (SEQ ID NO: 6 oder das Komplement beziehungsweise SEQ ID NO: 8 oder das Komplement) als Donor-Komponente (= Anker- Sonde) ausgeführt ist, die vorzugsweise am 3'- terminalen Nucleotid mit einem Farbstoff, vorzugs­ weise mit einem Fluoreszenz-Farbstoff, besonders bevorzugt mit Fluorescein assoziiert ist und der jeweils andere Hybridisierungssonden-Partner (SEQ ID NO: 7 oder Komplement beziehungsweise SEQ ID NO: 9 oder Komplement) als Akzeptor-Komponente (= Sensor-Sonde) ausgeführt ist, die vorzugsweise am 5'-terminalen Nucleotid mit einem weiteren Farb­ stoff, vorzugsweise mit einem Rhodamin-Derivat as­ soziiert ist.

In bevorzugten Varianten der vorgenannten Ausfüh­ rungsformen ist das Rhodamin-Derivat LightCycler- Red 640; in weiteren bevorzugten Varianten der vor­ genannten Ausführungsform ist das Rhodamin-Derivat LightCycler-Red 705; in weiteren bevorzugten Vari­ anten der vorgenannten Ausführungsform ist das Rho­ damin-Derivat Cy5.

In einer Variante des erfindungsgemäßen Nachweis­ verfahrens werden zur Markierung der Hybridisie­ rungssonden-Paare jeweils dieselben Donor- Akzeptor-Farbstoffe verwendet, bevorzugt Fluores­ cein/LightCycler-Red 640, wobei die Schmelzkurven­ analyse mit dem Gattungs-spezifischen Sonden-Paar zum Nachweis von Mykobakterien zeitlich oder räum­ lich getrennt von der Schmelzkurvenanalyse mit ei­ nem der Art-spezifischen Hybridisierungssonden- Paare zum Nachweis des M. tuberculosis-Komplex oder von M. avium insbesondere in jeweils parallelen An­ sätzen erfolgt.

In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens werden zur Markierung der Hybri­ disierungssonden-Paare jeweils verschiedene Donor- Akzeptor-Farbstoffe verwendet, wobei die Schmelz­ kurvenanalyse mit dem Gattungs-spezifischen Sonden- Paar zum Nachweis von Mykobakterien, das bevorzugt mit Fluorescein/LightCycler-Red 640 markiert ist, zeitlich und räumlich zusammen in einem Ansatz mit der Schmelzkurvenanalyse mit einem der Art- spezifischen Hybridisierungssonden-Paare, das be­ vorzugt mit Fluorescein/LightCycler-Red 705 mar­ kiert ist, zum Nachweis des M. tuberculosis-Komplex oder von M. avium erfolgt, wobei bevorzugt im LightCycler™-System die Fluoreszenz des Gattungs- spezifischen Sonden-Paars mit einem Photodetektor- Kanal und die Fluoreszenz eines Art-spezifischen Sonden-Paars mit dem zweiten Photodektor-Kanal re­ gistriert wird.

In diesem Zusammenhang sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung Oligonucleotid-Primer- Paare zur Vervielfältigung von 16S-rRNA-Fragmenten aus extrahierter bakterieller DNA zum spezifischen Nachweis von Mykobakterien und zur Unterscheidung des Mycobacterium tuberculosis-Komplex und Mycobac­ terium avium von anderen Mykobakterienarten in kli­ nischem Material, wobei ein Primerpaar die Nucleo­ tidsequenzen SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 oder ein Paar degenerierter oder mutierter Nucleotidsequen­ zen oder Fragmente davon umfasst. Die degenerierten oder mutierten Nucleotidsequenzen haben die Eigen­ schaft, jeweils mit den Sequenzen SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 zu hybridisieren, wobei jeweils ein Homo­ logiegrad von mindestens 90%, bevorzugt von min­ destens 95%, besonders bevorzugt von mindestens 98%, bevorzugt ist.

Die Erfindung betrifft auch ein zweites Primerpaar mit einem Primer mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 4 oder einer degenerierten oder mutierten Nuc­ leotidsequenz oder ein Fragment davon, das mit der Sequenz SEQ ID NO: 4 hybridisiert, wobei ein Homo­ logiegrad von mindestens 90%, bevorzugt von min­ destens 95%, besonders bevorzugt von mindestens 98% bevorzugt ist.

In diesem Zusammenhang sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung Oligonucleotid- Hybridisierungssonden-Paare zum spezifischen Nach­ weis von Mykobakterien und zur Unterscheidung des Mycobacterium tuberculosis-Komplex und Mycobacteri­ um avium von anderen Mykobakterienarten in klini­ schem Material, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 oder dem Paar der komplementären Sequenzen davon, den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 oder dem Paar der komplementären Sequenzen davon und den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 oder dem Paar der komplementären Sequenzen davon.

In diesem Zusammenhang ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein künstliches Plasmid, Kontrollplasmid, vorzugsweise erhalten durch Subc­ lonierung des 16S-rRNA-Gens in pGEM-T, das als in­ terne Kontrolle der Amplifikation (Inhibiti­ onskontrolle) und des spezifischen Nachweises von 16S-rRNA-Fragmenten von Mykobakterien dient und ei­ ne Nucleinsäuresequenz der modifizierten Gattungs- spezifischen Region III des 16S-rRNA-Gens enthält. Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Kontroll­ plasmid durch Nucleotid-Austausch, Nucleotid- Addition, Nucleotid-Deletion und/oder Nucleotid- Inversion mindestens eines Nucleotids, bevorzugt zweier Nucleotide von der Wildtyp-Nuclein­ säuresequenz der Gattungs-spezifischen Region III des 16S-rRNA-Gens abgeleitet. In einer weiteren Va­ riante umfasst das künstliche Plasmid die Nucleo­ tidsequenz SEQ ID NO: 14 oder SEQ ID NO: 15, worin jeweils ein Nucleotid gegenüber der Wildtyp-Sequenz ausgetauscht ist. Besonders überraschend wurde da­ bei gefunden, dass durch den Ersatz des einen Nucleotids eine Reduktion der Schmelztemperatur der Gattungs-spezifischen Hybridisierungssonden von ungefähr 1°C eintritt.

In einer weiteren besonders bevorzugten Variante umfasst das künstliche Plasmid die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 17, worin jeweils zwei Nucleotide gegenüber der Wildtyp-Sequenz aus­ getauscht sind. Besonders überraschend wurde dabei gefunden, dass durch den Ersatz der zwei Nucleotide eine Reduktion der Schmelztemperatur der Gattungs- spezifischen Hybridisierungssonden von ungefähr 14,5°C eintritt. Dies erlaubt vorteilhafter Weise den gleichzeitigen Einsatz der modifizierten 16S- rRNA zusammen mit der nachzuweisenden Wildtyp-16S- rRNA in einem Ansatz zur Schmelzkurvenanalyse, ins­ besondere mittels des erfindungsgemäßen Gattungs- spezifischen Hybridisierungssonden-Paars, da ihre Schmelztemperaturen unterscheidbar weit auseinan­ derliegen und somit das nachzuweisende Wildtyp-16S- rRNA-Fragment unbeeinflusst vom internen Standard detektiert und erkannt werden kann.

In diesem Zusammenhang ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Diagnose-Kit zum spezifischen Nachweis einer Mycobakterien-Infektion und von M. tuberculosis und M. avium in klinischem Material gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren, das mindestens eine Polymerase, mindestens eines, vor­ zugsweise alle der vorgenannten Primerpaare und mindestens eines, vorzugsweise alle der vorgenann­ ten Hybridisierungssonden-Paare umfasst. Erfin­ dungsgemäß bevorzugt umfasst das Diagnosekit zu­ sätzlich mindestens ein erfindungsgemäßes künstli­ ches Kontrollplasmid als internen Standard.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Referenzliste

1. Bange, F. C., B. A. Brown, C. Smaczny, R. J. Wallace Jr, and E. C. Bottger. 2001. Lack of Transmission of Mycobacterium abscessus among Pa­ tients with Cystic Fibrosis Attending a Single Clinic. Clin. Infect. Dis. 32: 1648-1650.
2. Chapin, K. and T. L. Lauderdale. 1997. Evaluation of a rapid air thermal cycler for de­ tection of Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 35: 2157-2159.
3. Desjardin, L. E., Y. Chen, M. D. Perkins, L. Teixeira, M. D. Cave, and K. D. Eisenach. 1998. Comparison of the ABI 7700 system (TaqMan) and competitive PCR for quantification of IS6110 DNA in sputum during treatment of tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 36: 1964-1968.
4. Holland, S. M. 2001. Nontuberculous myco­ bacteria. Am. J. Med. Sci. 321: 49-55.
5. Kirschner, P., J. Rosenau, B. Springer, K. Teschner, K. Feldmann, and E. C. Bottger. 1996. Diagnosis of mycobacterial infections by nucleic acid amplification: 18-month prospective study. J. Clin. Microbiol. 34: 304-312.
6. Kirschner, P., B. Springer, U. Vogel, A. Meier, A. Wrede, M. Kiekenbeck, F. C. Bange, and E. C. Bottger. 1993. Genotypic identification of mycobacteria by nucleic acid sequence determina­ tion: report of a 2-year experience in a clinical laboratory. J. Clin. Microbiol. 31: 2882-2889.
7. Lindbrathen, A., P. Gaustad, B. Hovig, and T. Tonjum. 1997. Direct detection of Mycobac­ terium tuberculosis complex in clinical samples from patients in Norway by ligase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 35: 3248-3253.
8. McKinney, J. D., W. R. Jacobs, and B. R. Bloom. 1998. Persisting problems in tuberculosis, p. 51-139. In R. M. Krause (ed.), Emerging Infec­ tions. Academic Press, London.
9. Nivin, B., P. Nicholas, M. Gayer, T. R. Frieden, and P. I. Fujiwara. 1998. A continuing outbreak of multidrug-resistant tuberculosis, with transmission in a hospital nursery. Clin. Infect. Dis. 26: 303-307.
10. Pfyffer, G. E. 1999. Nucleic acid amplification for mycobacterial diagnosis. J. Infect. 39: 21-26.
11. Taylor, M. J., M. S. Hughes, R. A. Skuce, and S. D. Neill. 2001. Detection of Mycobacterium bovis in Bovine Clinical Specimens Using Real- Time Fluorescence and Fluorescence Resonance En­ ergy Transfer Probe Rapid-Cycle PCR. J. Clin. Microbiol. 39: 1272-1278.
12. Tevere, V. J., P. L. Hewitt, A. Dare, P. Hocknell, A. Keen, J. P. Spadoro, and K. K. Young. 1996. Detection of Mycobacterium tubercu­ losis by PCR amplification with pan-Mycobacte­ rium primers and hybridization to an M. tubercu­ losis-specific probe. J. Clin. Microbiol. 34: 918-­ 923.
13. Torres, M. J., A. Criado, J. C. Palo­ mares, and J. Aznar. 2000. Use of real-time PCR and fluorimetry for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance-associated mutations in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 38: 3194-3199.
14. World Health Organization. 2000. Drug­ resistant strains of TB increasing worldwide (PR WHO/19; http:/ / www.who.int).
15. Telenti, A., F. Marchesi, M. Balz, F. Bally, E. C. Böttger, and T. Bodmer. 1993. Rapid identification of mycobacteria to the species level by polymerase chain reaction and restric­ tion enzyme analysis. J. Clin. Microbiol. 31: 175-­ 178.
16. Torrens, J. K., P. Dawkins, S. P. Conway, and E. Moya. 1998. Nontuberculous mycobacteria in cystic fibrosis. Thorax 53: 182-185.
17. Turenne C. Y. et al. 2001. Necessity of qual­ ity-controlled 16S rRNA gene sequence databases: identifying nontubercolous Mycobacterium species. J. Clin. Microbiol. 39 (10): 3637-3648.
18. Cloud J. L. et al. 2002. Identification of My­ cobacterium spp. by using a commercial 16S ribo­ somal DNA sequencing kit and additional sequenc­ ing libraries. J. Clin. Microbiol. 40 (2): 400-406.
19. Moussa, O. M. et al. 2002. Rapid diagnosis of genitourinary tuberculosis by polymerase chain reaction and non-radioactive DNA hybridization. J. Urol. 164 (2): 584-588.

Die Erfindung wird anhand des Sequenzprotokolls, das die Sequenzen Nr. 1 bis 17 enthält, anhand der Fig. 1 bis 4 sowie anhand der Beispiele 1 bis 8 näher erläutert.
SEQ ID NO: 1 - "sense"-Primer ("forward"-Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation eines 1000 bp- Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Mykobakterien, ent­ haltend die Art-spezifische Regionen des M. tuber­ culosis-Komplex und von M. avium und die Gattungs- spezifische Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 2 - "sense"-Primer ("forward"-Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation eines 300 bp- Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Mykobakterien, ent­ haltend die Art-spezifische Regionen des M. tuber­ culosis-Komplex und von M. avium,
SEQ ID NO: 3 - "antisense"-Primer ("reverse"- Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation eines 300 bp-Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Mykobakte­ rien, enthaltend die Art-spezifische Regionen des M. tuberculosis-Komplex und von M. avium,
SEQ ID NO: 4 - "sense"-Primer ("forward"-Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation eines 100 bp- Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Mykobakterien, ent­ haltend die Gattungs-spezifische Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 5 - "antisense"-Primer ("reverse"- Primer) a) des Primer-Paares zur Amplifikation ei­ nes 1000 bp-Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Myko­ bakterien, enthaltend die Art-spezifische Regionen des M. tuberculosis-Komplex und von M. avium und die Gattungs-spezifische Region III der Gattung My­ cobacterium, und b) des Primer-Paares zur Amplifi­ kation eines 100 bp-Fragments des 16S-rRNA-Gens vom Mykobakterien, enthaltend die Gattungs-spezifische Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 6 - "antisense"-Hybridisierungssonde, insbesondere Donor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Art-spezifischen Region des M. tuber­ culosis-Komplex,
SEQ ID NO: 7 - "sense"-Hybridisierungssonde, insbe­ sondere Akzeptor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Art-spezifischen Region des M. tuber­ culosis-Komplex,
SEQ ID NO: 8 - "antisense"-Hybridisierungssonde, insbesondere Donor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Art-spezifischen Region von M. avium,
SEQ ID NO: 9 - "sense"-Hybridisierungssonde, insbe­ sondere Akzeptor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Art-spezifischen Region von M. avium,
SEQ ID NO: 10 - "antisense"-Hybridisierungssonde, insbesondere Donor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Gattungs-spezifischen Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 11 - "sense"-Hybridisierungssonde, ins­ besondere Akzeptor-Komponente, des Sondenpaars zur Detektion der Gattungs-spezifischen Region III der Gattung Mycobacterium,
SEQ ID NO: 12 - "sense"-Primer ("forward"-Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation des kompletten 16S-rRNA-Gens (1523 bp) von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 13 - "antisense"-Primer ("reverse"- Primer) des Primer-Paares zur Amplifikation zur Amplifikation des kompletten 16S-rRNA-Gens (1523 bp) von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 14 - modifizierter "sense"-Primer ("for­ ward"-Primer) zur Amplifikation eines kompletten Kontrollplasmids, enthaltend eine modifizierte Gat­ tungs-spezifische Region III des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 15 - modifizierter "antisense"-Primer ("reverse"-Primer) zur Amplifikation eines komplet­ ten Kontrollplasmids, enthaltend eine modifizierte Gattungs-spezifische Region III des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 16 - modifizierter "sense"-Primer ("for­ ward"-Primer) zur Amplifikation eines weiteren kom­ pletten Kontrollplasmids, enthaltend eine weitere modifizierte Gattungs-spezifische Region III des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien,
SEQ ID NO: 17 - modifizierter "antisense"-Primer ("reverse"-Primer) zur Amplifikation eines weiteren kompletten Kontrollplasmids, enthaltend eine weite­ re modifizierte Gattungs-spezifische Region III des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Ausfüh­ rungsbeispiele und den dazugehörigen Figuren näher erläutert:

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 Schematische Darstellung des 16S-rRNA- Gens von Mykobakterien (Länge: 1523 bp), der Position der Art-spezifischen Regio­ nen, "species(A)" und "species(B)", so­ wie der Gattungs-spezifischen Regionen "genus I", "genus II" und "genus III", sowie der Lage und Größe der mittels der Primer-Paare (1) und (5), (2) und (3) sowie (4) und (5) amplifizierten Frag­ mente.

Fig. 2 Sensitivität des Art-spezifischen Nach­ weises des PL tuberculosis-Komplexes: Schmelzkurven der Hybridisierung der er­ findungsgemäßen Art-spezifischen Hybri­ disierungssonden mit der Artspezi­ fischen Region des M. tuberculosis- Komplexes im amplifizierten 1000 bp- Fragment der 16S-rRNA von Mykobakterien.

Fig. 3 Modifiziertes 16S-rRNA-Fragment als in­ terner Standard (pJL6): Schmelzkurven der Hybridisierung der Gattungs- spezifischen Hybrid Schmelzkurven der Hybridisierung isierungssonden mit der Gattungs-spezifischen Region III und der modifizierten Gattungs-spezifischen Re­ gion III des internen Standards (pJL6) bei unterschiedlicher Anzahl an Genomko­ pien der nachzuweisenden Gattungs- spezifischen Region III.

Fig. 4 Modifiziertes 16S-rRNA-Fragment als in­ terner Standard (pJL6): Schmelzkurven der Hybridisierung der Gattungs- spezifischen Hybridisierungssonden mit der Gattungs-spezifischen Region III und der modifizierten Gattungs-spezifischen Region III des internen Standards (pJL6) in Gegenwart unterschiedlicher Menge an "Hintergrund"-DNA aus E. coli.

Beispiel 1 a) DNA-Isolierung aus klinischem Material

Mikrobielle DNA wird aus klinischen Proben beste­ hend aus Sputum, Bronchiallavage, Magensaft, Urin, Stuhl, Liquor, Knochenmark, Blut oder Punktat- Biopsien in an sich bekannter Weise zum Beispiel mittels eines QiampMiniKit (Firma Qiagen, Katalog- Nr. 51 306) aufgereinigt, das heißt extrahiert. Chromosomale DNA wird dabei mittels PicoGreen- System (Firma Molecular Probes) quantifiziert.

Verschiedene Anzahlen genomischer Kopien pro Nach­ weis-Ansatz (siehe unten) werden durch Molekularge­ wichtsberechnungen und die Durchführung von Verdün­ nungsreihen erhalten.

a') DNA-Isolierung aus Kulturisolaten

Insbesondere zur Evaluation der erfindungsgemäßen Nachweisverfahren wird mikrobielle DNA verschiede­ ner Kulturen von Mikroorganismen, zum Beispiel der in Tabelle 1 aufgeführten Organismen, isoliert.

Insbesondere zur Anwendung der erfindungsgemäßen Nachweisverfahren auf aus Patienten-Proben gewonne­ nen (Bouillon-)Kulturen von zu diagnostizierenden Mikroorgansmen wird mikrobielle DNA aus diesen Kul­ turen isoliert.

Anschließend wird die mikrobielle DNA in an sich bekannter Weise zum Beispiel mittels eines QiampMi­ niKit™ (Firma Qiagen, Katalog-Nr. 51 306) aufgerei­ nigt, das heißt extrahiert. Chromosomale DNA wird dabei in an sich bekannter Weise zum Beispiel mit­ tels PicoGreen™-System (Firma Molecular Probes) quantifiziert.

b) PCR-Amplifikation

Zur Amplifikation in einer optimierten LightCyc­ ler™-PCR (siehe Beispiel 3) wird ein Ansatz bein­ haltend die fertig erhältliche Mischung "LightCyc­ ler FastStart DNA Master Hybridisation Probes" (Ka­ talog-Nr. 239 272, Firma Roche Molecular Biochemi­ cals) gewählt.

Es wird folgende Reaktionsmischung für die Light- Cycler-Reaktion hergestellt:

• - Taq Polymerase
• - Reaktionspuffer
• - Desoxi-Nucleosid-Triphosphat-Mischung (dNTP)
• - 3 mmol/l MgCl₂ Primer-Paar a) oder b)
  je Primer: 18 µmol, entsprechend 1,1 µmol/l Endkonzentration:
  • a) Primer-Paar SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5
    oder
  • b) Primer-Paar SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 und Primer-Paar SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5

Erfindungsgemäß wird zur Amplifikation das Primer-Paar a) SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 ein­ gesetzt, das ein 1000 bp langes Fragment der 16S-rRNA, enthaltend die Gattungs-spezifische Region III und die Art-spezifischen Regionen, amplifiziert.

Alternativ werden erfindungsgemäß die beiden Primer-Paare b) gleichzeitig in einem Mu­ litplex-PCR-Ansatz, in parallelen Ansätzen oder zeitlich getrennt eingesetzt, wobei das Primer-Paar enthaltend SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 ein 300 bp langes Fragment der 16S-rRNA, enthaltend die Art-spezifischen Regionen, amplifiziert und zum anschließenden Nachweis des M. tuberculosis-Komplex und/oder von M. avium dient, und wobei das Primer-Paar enthal­ tend SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5 ein 100 bp lan­ ges Fragment der 16S-rRNA, enthaltend die Gat­ tung sspezifische Region III, amplifiziert und zum anschließenden Nachweis einer Mykobakte­ rien-Infektion dient.

• - Oligonucleotid-FRET-Sonden-Paare c) bis e) je Sonde: 2 µmol, entsprechend 120 nmol/l End­ konzentration:
  • a) SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 zur Detektion der Gattungs-spezifischen Region III,
  • b) SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 zur Detektion der Art-spezifischen Region des M. tubercu­ losis-Komplex,
  • c) SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 zur Detektion der Art-spezifischen Region von M. avium

Erfindungsgemäß wird das Sondenpaar c) SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 oder ein komplementäres oder mutiertes oder degeneriertes Paar davon zur Detektion der Gattungs-spezifischen Region III eingesetzt. Soll im erfindungsgemäßen Ver­ fahren lediglich zusätzlich zu der Gattungs- spezifischen Detektion der M. tuberculosis- Komplex detektiert werden, wird das Sondenpaar d) SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 beziehungsweise deren Äquivalente, das heißt mutierte oder komplementäre Paare davon, eingesetzt. Sollen dagegen zusätzlich zur Gattungs-spezifischen Detektion lediglich Mykobaktieren der Art M. avium nachgewiesen werden, wird das Sondenpaar e) SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 beziehungsweise deren Äquivalente, das heißt mutierte oder komplementäre Paare davon, eingesetzt. Sollen gemeinsam mit der Gattungs-spezifischen Region III sowohl der M. tuberculosis-Komplex also auch M. avium nachgewiesen werden, werden ne­ ben dem Sondenpaar c) entsprechend beide Son­ denpaare d) und e) eingesetzt.

Diese Reaktionsmischung wird durch Puls- Zentrifugation in die Glaskapillaren des LightCyc­ ler-Systems verbracht und die Amplifikation nach dem "Hot Start"-Prinzip nach einer anfänglichen De­ naturierung bei 95°C für 10 Minuten mit den folgen­ den Schritten durchgeführt:

• 1. Denaturierung bei 95°C für 3 Sekunden
• 2. Primer-Hybridisierung bei Temperaturen von 68°C bis 62°C für 2 Sekunden ("touch-down- annealing")
• 3. Polymerisation bei 72°C für 40 Sekunden.

Die Schritte 1 bis 3 werden insgesamt 50 mal zyk­ lisch abgearbeitet, wobei für die ersten 5 Zyklen die Hybridisierung in Schritt 2 bei 68°C erfolgt und bei den nachfolgenden 6 Zyklen die Temperatur auf 62°C in Schritten von 1°C pro Zyklus reduziert wird und für die restlichen Zyklen bei 62°C durch­ geführt wird. Die Rate der Temperaturänderung liegt bei allen Schritten bei 20°C pro Sekunde.

c) Detektion und Schmelzkurvenanalyse

Zur Detektion der amplifizierten Fragmente werden die in der Reaktionsmischung eingesetzten FRET- markierten Hybridisierungssonden-Paare verwendet, wobei jeweils ein Hybridisierungssonden-Partner (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6 beziehungsweise SEQ ID NO: 8) als Donor-Komponente am 3'-terminalen Nucle­ otid mit Fluorescein assoziiert ist, und der je­ weils andere Hybridisationssonden-Partner (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 7 beziehungsweise SEQ ID NO: 9) als Akzeptor-Komponente am 5'-terminalen Nucleotid mit LightCycler-Green 640 assoziiert ist.

Die im Verlauf der Detektion erfolgende Schmelzkur­ venanalyse beginnt mit der Denaturierung der ampli­ fizierten Fragmente bei 95°C für 30 Sekunden, wor­ auf eine Hybridisierung mit den vorgenannten FRET- Paaren bei 38°C für 30 Sekunden folgt. Zur Bestim­ mung der Schmelzkurve der Hybridisierung wird die Temperatur anschließend kontinuierlich von 38°C auf 80°C mit einer Rate von 0,2°C/sec erhöht, wobei die von den FRET-Paaren emittierte Fluoreszenz kontinu­ ierlich aufgezeichnet wird. Zur Auswertung des Flu­ oreszenzsignals wird das LightCycler-"Run Profile"- Programm in der Version 3.5.3 eingesetzt, wobei die Verstärkung des F2-Kanals des photometrischen De­ tektors des LightCycler-Systems automatisch einge­ stellt wird.

Beispiel 2 Künstliches Plasmid als interner Stan­ dard a) Bereitstellung eines Kontrollplasmids (erfin­ dungsgemäß)

Um einen internen Standard zur Kontrolle der er­ folgreichen selektiven Amplifikation der gewünsch­ ten Fragmente des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien gemäß Beispiel 1 zur Verfügung zu haben (Inhibiti­ onskontrolle), wird zunächst das gesamte 16S-rRNA- Gen von Mykobakterien (1523 bp) mit einem PCR- Primerpaar amplifiziert, wobei der "sense"-Primer aus der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 12 und der "an­ tisense"-Primer aus der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 13 besteht. Zur Amplifikation werden 40 Zyklen der folgenden Schritte durchgeführt:

• 1. Denaturierung bei 95°C
• 2. Primer-Hybridisierung bei 56,5°C
• 3. Polymerisation bei 72°C.

Anschließend werden die amplifizierten Fragmente in an sich bekannter Weise zum Beispiel in pGEM-T (Firma Promega) subcloniert.

Um das künstliche Plasmid als internen Standard einsetzen zu können, soll sich die im künstlichen Plasmid (= pIJ6) enthaltene Gattungs-spezifische Re­ gion III der 16S-rRNA durch mindestens eine Punkt­ mutation von der Wildtyp-Nucleotidsequenz der Gat­ tungs-spezifischen Region III unterschieden. Um mindestens eine gezielte Punktmutation in die Gat­ tung sspezifische Region III des 16S-rRNA-Fragments einzuführen, werden zur Vervielfältigung der die subclonierten Fragmente enthaltenden Plasmide modi­ fizierte Primerpaare eingesetzt, bei denen jeweils ein oder zwei Nucleotide in den Nucleotidsequenzen gegenüber den Wildtyp-Nucleotidsequenzen ausge­ tauscht wurden.

Dazu werden folgende Primerpaare, abgeleitet von der Wildtyp-Sequenz der Gattungs-spezifischen Regi­ on III, insbesondere von der die Akzeptor- Komponente des erfindungsgemäßen FRET-Paars, SEQ ID NO: 11, bindenden Region verwendet:

• a) Austausch eines Nucleotids:
  "forward"-Primer: (SEQ ID NO: 14)
  "forward"-Primer: (SEQ ID NO: 15)
• b) Austausch von zwei Nucleotiden:
  "forward"-Primer: (SEQ ID NO: 16) "reverse"-Primer: (SEQ ID NO: 17)

In den erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen der vorgenannten modifizierten Primerpaare wurde je­ weils das unterstrichene Nucleotid gegenüber der Wildtyp-Sequenz der Gattungs-spezifischen Region III ersetzt.

Die Vervielfachung der Kontrollplasmide mit den mo­ difizierten Primerpaaren wird jeweils in einer "long range"-PCR mit einer Pfu-Polymerase, Typ: "Pfu Turbo Hot Start DNA" (Firma Stratagene) in an sich bekannter Weise in einem "Hot Start" PCR- Verfahren durchgeführt mit jeweils 18 Zyklen der folgenden Schritte:

• 1. Denaturierung bei 95°C
• 2. Primer-Hybridisierung bei 50°C
• 3. Polymerisation bei 68°C.

Ergebnisse

• a) Die erhaltenen Amplicons werden zusätzlich über ein Gel aufgereinigt und die Punktmutationen können anschließend werden mittels Sequenzierung bestätigt werden.
• b) Der Ersatz des Nucleotids "T" mit dem Nucleotid "C" am 3'-Ende der die Akzeptor-Komponente des FRET-Paars bindenden Region der Gattungs- spezifischen Region III führt zu einer Reduktion der Schmelztemperatur von ungefähr 1°C.
• c) Wird am 5'-Ende das Nucleotid "G" mit dem Nucle­ otid "A" und vier Nucleotide entfernt davon das Nucleotid "A" mit dem Nucleotid "T" ersetzt, kommt es zu einer signifikanten Reduktion der Schmelztem­ peratur um cirka 14,5°C.

Als besonders überraschend wird gefunden, dass eine zwei Nucleotide umfassende Modifikation der die Ak­ zeptor-Komponente des FRET-Paars bindenden Region der Gattungs-spezifischen Region III ausreicht, um eine Differenzierung der so modifizierten 16S-rRNA, enthalten in einem künstlichen Plasmid, von der Wildtyp-16S-rRNA zu unterscheiden. Die Verwendung des erfindungsgemäßen modifizierten 16S-rRNA- Fragments als interner Standard, enthalten in einem künstlichen Plasmid, im erfindungsgemäßen Verfahren gemäß Beispiel 1 ist somit besonders vorteilhaft zur Kontrolle der Amplifikation und zur Verifikati­ on des Nachweises einer Mykobakterien-Infektion.

b) Zweckmäßigkeit des Kontrollplasmids bei geringer Menge von Proben-Genom

In einem weiteren Experiment wird zunächst, wie un­ ter a) beschrieben, durch Einsatz der erfindungsge­ mäßen Primer SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 ein Kontrollplasmid erhalten, das ein durch Austausch zweier Nukleotide modifiziertes 16S-rRNA-Fragment enthält. Jeweils 50 Kopien des Kontrollplasmids werden als interner Standard mit verschiedenen An­ zahlen von Genkopien des 16S-rRNA-Gens von M. tu­ berculosis gemischt und dem Nachweisverfahren gemäß Beispiel 1 unterzogen.

Ergebnis

In Gegenwart von 50 Kopien des internen Standards konnten bereits 10 Genkopien des 16S-rRNA-Fragments von M. tuberculosis eindeutig mittels Schmelzkur­ venanalyse nachgewiesen werden. Bei einer Anzahl von 5 Genkopien ist das dabei erhaltene Fluores­ zenzsignal zwar nicht mit einfachen statistischen Mitteln auswertbar, jedoch lässt sich in der Schmelzkurvenschar in Fig. 3 eine deutliche Spitze bei der entsprechenden Schmelztemperatur nachwei­ sen.

Die Verwendung dieses internen Standards ist somit auch dann möglich, wenn zu erwarten ist, dass die Anzahl an nachzuweisenden Genkopien im klinischen Material um eine Größenordnung geringer ist als die Zahl der als interner Standard eingesetzten Plas­ midkopien.

c) Zweckmäßigkeit des Kontrollplasmids in Gegenwart von "Hintergrund"-DNA

In einem weiteren Experiment wird zunächst, wie un­ ter a) beschrieben, durch Einsatz der erfindungsge­ mäßen Primer SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 ein Kontrollplasmid (erhalten, das ein durch Austausch zweier Nukleotide modifiziertes 16S-rRNA-Fragment enthält. Jeweils 50 Kopien des Kontrollplasmids und 10 Genkopien des 16S-rRNA-Gens von M. tuberculosis werden mit unterschiedlichen Mengen an "Hinter­ grund"-DNA von E. coli im Bereich von 1 pg bis 200 ng versetzt und anschließend dem Nachweisver­ fahren gemäß Beispiel 1 unterzogen.

Ergebnis

In Gegenwart von bis zu 200 ng fremder DNA, soge­ nannter "Hintergrund"-DNA, pro Ansatz konnten 10 Genkopien des 16S-rRNA-Fragments von M. tuberculo­ sis noch eindeutig mittels Schmelzkurvenanalyse nachgewiesen werden (Fig. 4).

Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren, insbesonde­ re unter Verwendung dieses internen Standards, ist somit auch dann möglich, wenn zu erwarten ist, dass im isolierten klinischen Material eine große Menge an fremder DNA, Hintergrund-DNA, vorhanden ist.

Beispiel 3 Beurteilung der Leistungsfähigkeit des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens auf dem Light- Cycler™-System

Zur Untersuchung der auf dem LightCycler™-System basierten Amplifikation und Hybridisierung (siehe Beispiel 1) wird als "Template" genomische DNA des Bakterienstammes Mycobacterium bovis BCG des M. tu­ berculosis-Komplex verwendet.

Verschiedene Anzahlen genomischer Kopien pro PCR- Reaktion werden durch Molekulargewichtsberechnungen und die Durchführung von Verdünnungsreihen erhal­ ten.

Folgende Parameter wurden für die kombinierte Amplifikations- und Hybridisierungsreaktion einge­ setzt:

• - MgCl₂-Konzentration 3 mmol/l
• - Primer-Konzentration: 18 pmol pro Reaktion, entspricht einer Endkonzentration von 1,1 µmol/l
• - "Hot Start"-Taq Polymerase des Typs "LightCyc­ ler™ FastStart DNA Master SYBR Green I" (Kata­ log-Nr. 3003230)
• - Polymerisationszeit: 40 Sekunden
• - Hybridisierungs-Zeit: 3 Sekunden
• - Hybridisierungs-Temperatur: 62°C, bei schritt­ weiser Reduzierung ausgehend von 68°C nach 5 Zyklen mit 1°C pro Zyklus.

Ergebnisse

Eine Zahl von 5 Genomkopien kann reproduzierbar in Verdünnungsreihen nachgewiesen werden.

Sowohl der Einsatz einer "Hot Start"-Polymerase als auch die zyklusweise Reduktion der Hybridisierungs- Temperatur verhindert die Bildung von Primer- Dimeren und die erhöht die Sensitivität der Ampli­ fikation.

Beispiel 4 Spezifische Amplifikation von 16S-rRNA- Fragmenten von Mykobakterien (erfindungsgemäß)

In einem ersten Ansatz gemäß Beispiel 1 wird mit den entsprechenden erfindungsgemäßen Primerpaaren ein jeweils 100 bp langes Fragment der Gattungs- spezifischen Region III (SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5) und ein 300 bp langes Fragment der Art-spezifischen Regionen (SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3) amplifiziert.

In einem zweiten Ansatz gemäß Beispiel 1 wird ein 1000 bp langes Fragment, das sowohl die Gattungs- spezifische Region III als auch die beiden Art- spezifischen Regionen enthält, mit dem entsprechen­ den Primerpaar (SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5) amplifi­ ziert.

Anschließend wird die Sensitivität des erfindungs­ gemäßen Nachweisverfahrens gemäß Beispiel 1 getes­ tet.

Ergebnis

Überraschenderweise ergibt sich, dass das 1000 bp lange Fragment gegenüber den beiden 100 bp und 300 bp langen Fragmenten dieselbe Sensitivität des Nachweises besitzt. Dieses Ergebnis steht im Gegen­ satz zu dem Vorurteil aus dem Stand der Technik, wonach es aufgrund des hohen CG-Nucleotidgehalts im 16S-rRNA-Gen von Mykobakterien zu unspezifischen Störungen bei dem Nachweisverfahren gemäß Beispiel 1 in einem LightCycler™-System kommt.

Beispiel 5 Sensitivität des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens

Zur Überprüfung der Sensitivität wird im erfin­ dungsgemäßen Nachweisverfahren (Beispiel 1) das mit dem Primer-Paar SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 amplifi­ zierte 1000 bp-Fragment eingesetzt.

a) Sensitivität des Nachweises der Gattungs- spezifischen Region III

Zunächst wird eine Verdünnungsreihe des Genoms von M. bovis BCG aus dem M. tuberculosis-Komplex wird erstellt, die jeweils 5, 50, 500 beziehungsweise 5000 Genomkopien enthält.

In weiteren Ansätzen werden Verdünnungsreihen wei­ terer tuberkulöser und nicht-tuberkulöser Mykobak­ terienarten untersucht.

Ergebnisse

• a) Bereits bei 5 Genomkopien lässt sich eindeutig eine Schmelzkurve bestimmen, wobei der Schmelzpunkt der Gattungs-spezifischen Region III für alle Myko­ bakterienarten bei mindestens 55°C liegt. Bei M. chelonae liegt der Schmelzpunkt bei 55°C, bei allen anderen Mykobakterienarten bei 61,5°C.
• b) Darüber hinaus zeigt sich, dass bei einer Viel­ zahl anderer Mykobakterienarten, beispielsweise von M. tuberculosis, M. bovis, M. avium, M. intracellu­ lare, M. paratuberculosis, M. kansasii, M. marinum, M. abcessus, M. fortuitum, ein eindeutiger Nachweis der Gattungs-spezifischen Region III bei einer Zahl von 5 Genomkopien erfolgen kann.

b) Sensitivität des Nachweises von M. tuberculosis

Gemäß a) wird eine Verdünnungsreihe des M. tubercu­ losis-Genoms erstellt, die jeweils 5, 50, 500 be­ ziehungsweise 5000 Kopien enthält.

Ergebnis

Bereits bei 5 Genomkopien kann die Schmelzkurve der Art-spezifischen Region von M. tuberculosis eindeu­ tig bestimmt werden (Fig. 2). Dabei liegt der er­ mittelte Schmelzpunkt bei 64°C (Tabelle 1).

c) Sensitivität des Nachweises von M. avium

Entsprechend a) und b) wird eine Verdünnungsreihe des Genoms von M. avium angefertigt und mit den entsprechenden Hybridisierungssonden-Paaren eine Schmelzkurvenanalyse der amplifizierten Fragmente durchgeführt.

Ergebnis

Bereits ausgehend von 5 Genomkopien ist eine Schmelzkurvenanalyse des Amplicons möglich, wobei ein Schmelzpunkt von 61,0°C festgestellt wird (Ta­ belle 1).

Beispiel 6 Spezifität des erfindungsgemäßen Nach­ weisverfahrens a) Spezifität der Amplifikations-Primer

Aus den Mikroorganismen aus Tabelle 1 wird pro An­ satz jeweils 2,5 ng genomische DNA, entsprechend 500 000 Genomkopien, extrahiert und in das erfin­ dungsgemäße Nachweisverfahren eingesetzt.

Wie in Beispiel 5 wird dabei mit dem Gattungs- spezifischen Primerpaar SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 ein 1000 bp langes Fragment des 16S-rRNA-Gens amplifiziert.

Ergebnisse

• a) Bei sämtlichen untersuchten Mykobakterienarten findet Amplifikation statt.
• b) Das eingesetzte Primer-Paar zeigt eine fast vollständige Gattungs-Spezifität für Mykobakterien: Ausgewählt aus der Vielzahl verschiedener bakteri­ eller und pilzlicher Mikroorganismen findet ledig­ lich bei der Gattung Corynebakterium eine Amplifi­ kation des 16S-rRNA-Gens statt.

b) Spezifität des Gattungs-spezifischen Nachweises

Eine Schmelzkurvenanalyse der in amplifizierten Fragmente mittels des erfindungsgemäßen Hybridisie­ rungssonden-Paars SEQ ID NO: 10 /SEQ ID NO: 11, spezifisch für die Gattungs-spezifische Region III, wird durchgeführt.

Ergebnisse Tabelle 1

• a) Sämtliche Mykobakterienarten weisen einen Schmelzpunkt von mindestens 55°C auf.
• b) Bei M. chelonae liegt der Schmelzpunkt bei 55°C, bei allen anderen Mykobakterienarten bei 61,5°C.
• c) Der Schmelzpunkt bei amplifizierten 16S-rRNA- Fragmenten der Gattung Corynebakterium liegt bei 43°C, beziehungsweise es kann überhaupt kein Hybri­ disierungssignal detektiert werden.
• d) Mittels des erfindungsgemäßen Gattungs- spezifischen Nachweisverfahrens lassen sich sämtli­ che Mykobakterienarten eindeutig gegenüber anderen Mikroorganismen identifizieren.

c) Spezifität des Nachweises des M. tuberculosis- Komplex

Entsprechend a) werden zunächst jeweils 2,5 ng ge­ nomischer DNA der in Tabelle 1 aufgelisteten Mikro­ organismen eingesetzt und jeweils ein 1000 bp lan­ ges Fragment amplifiziert.

Anschließend wird mit dem Art-spezifischen Hybridi­ sierungssonden-Paar SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 eine Schmelzkurvenanalyse der Amplicons durchgeführt.

Ergebnis

Während die Schmelztemperatur bei den Arten des M. tuberculosis-Komplex bei einheitlich 64°C liegt, beträgt die Schmelztemperatur für alle nicht- tuberkulösen Erreger zwischen 43,5°C und 54°C, falls überhaupt ein Hybridisierungssignal detek­ tiert werden kann (Tabelle 1).

Mittels des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens lassen sich tuberkulöse Erreger gegenüber allen an­ deren nicht-tuberkulösen Erregern selektiv nachwei­ sen.

d) Spezifität des Nachweises des M. avium

Entsprechend a) werden zunächst jeweils 2,5 ng ge­ nomischer DNA der in Tabelle 1 aufgelisteten Mikro­ organismen eingesetzt und jeweils ein 1000 bp lan­ ges Fragment amplifiziert.

Anschließend wird mit dem Art-spezifischen Hybridi­ sierungssonden-Paar SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 eine Schmelzkurvenanalyse der Amplicons durchgeführt.

Ergebnis

Während die Schmelztemperatur bei M. avium bei ein­ heitlich 61°C liegt, beträgt die Schmelztemperatur für alle anderen Erreger zwischen 43°C und 54°C, falls überhaupt ein Hybridisierungssignal detek­ tiert werden kann (Tabelle 1).

Mittels des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens lässt sich der nicht-tuberkulöse Erreger M. avium gegenüber allen anderen Erregern selektiv nachwei­ sen.

Beispiel 7 Vergleichsbeispiel zur Spezifität des Gattungs-spezifischen Nachweises mittels der Gat­ tungs-spezifischen Region II ("genus II")

Im Gegensatz zum vorstehenden erfindungsgemäßen Beispiel 6b) werden zur Schmelzkurvenanalyse des gemäß 6a) amplifizierten 1000 bp-Fragments des 16S-rRNA-Gens von Mykobakterien aus Tabelle 1 die aus dem Stand der Technik bekannten Hybridisie­ rungssonden verwendet, die für die Gattungs- spezifische Region II selektiv sind (siehe Fig. 1: "genus II").

In Tabelle 1 sind die Ergebnisse der Schmelzkurven­ analyse dargestellt: Während ein Großteil der un­ tersuchten Mykobakterienarten einen Schmelzpunkt von 60,5°C besitzt, ist bei den Mykobakterienarten M. triviale, M. chitae, M. xenopi und M. agri der Schmelzpunkt gegenüber den anderen Mykobakterienar­ ten erniedrigt (Tabelle 1). Außerdem werden auch bei der Gattung Cornyebakterium Amplifikate detek­ tiert.

Die gefundenen Schmelzpunkte von M. triviale, M. chitae, M. xenopi, M. agri und allen anderen Myko­ bakterienarten lassen sich statistisch nicht von den gefundenen Schmelzpunkten der Cornyebakterium- Arten trennen. Ein eindeutiger Nachweis einer Myko­ bakterien-Infektion gegenüber zum Beispiel einer Infektion mit Cornyebakterien ist mittels der Gat­ tungs-spezifischen Region II nicht möglich.

Beispiel 8 Quantitative Bestimmung des Gehalts an Mykobakterien in klinischen Proben (erfindungsge­ mäß)

In dem erfindungsgemäß eingesetzten FRET-System ist unter bestimmten Bedingungen das Maß an Fluoreszenz in diesem Wellenlängenbereich eine Funktion der Menge an in der Probe vorhandenen und detektierten DNA. Durch das FRET-System sind quantitative Mes­ sungen der Menge amplifizierter DNA-Fragmente mög­ lich, wenn die ausgewählten Hybridisierungssonden quantitativ, also stöchiometrisch, an die amplifi­ zierten Fragmente binden.

Zur Quantifizierung von "Target"-DNA, wird diese mit einer bekannten DNA-Konzentration eines Stan­ dards verglichen. Dazu eignet sich das klonierte 16S rRNA-Gen im pGEM-T oder auch das erfindungsge­ mäß eingesetzbare Kontrollplasmid (pIJ6).

Die Fluoreszenz wird bei dieser Methode nach jedem der insgesamt 50 Amplifikationszyklen gemessen. Bei einer hohen Konzentration des Standards erscheint ein Fluoreszenzsignal beispielsweise bereits nach 20 Zyklen. Eine niedrige Konzentration führt erst nach beispielsweise 35 Zyklen zu einem Signal.

Der Standard wird zum einen getrennt von den zu un­ tersuchenden Proben gemessen, wobei wenigstens fünf verschiedene Konzentrationen verwendet werden, um eine Standardkurve zu erstellen. Wird das Plasmid pIJ6 verwendet, kann jeweils eine Konzentration des Standards in jeder untersuchten Probe verwendet werden. Die Unterscheidung zwischen Standard und "Target-DNA" erfolgt über den unterschiedlichen Schmelzpunkt. Der Standard dient insbesondere gleichzeitig als Kontrolle, dass die Amplifikation nicht durch Störfaktoren inhibiert wurde (Inhibiti­ onskontrolle).

Zur Detektion der amplifizierten Fragmente werden die in der Reaktionsmischung eingesetzten FRET- markierten Hybridisierungssondenpaare verwendet. Die Amplifikationsreaktion läuft wie in Beispiel 1, wobei nach jedem Amplifikationsschritt die Fluores­ zenz gemessen wird. Die optimale "Annealing"- Temperatur liegt bei 62°C. Die Schmelzpunktanalyse wird unbeeinträchtigt nach Abschluss der Amplifika­ tionsreaktion wie in Beispiel 1c) durchgeführt.

Tabelle 1

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (22)

1. Verfahren zum gemeinsamen und jeweils spezifi­ schen Nachweis einer Mykobakterien-Infektion, des Mycobacterium tuberculosis-Komplex und/oder von My­ cobacterium avium in klinischem Material umfassend die Schritte

• a) Extraktion von mikrobieller DNA aus klinischem Material,
• b) Vervielfachung von mindestens einem Fragment des 16S-rRNA-Gens aus der extrahierten DNA mit­ tels eines Primerpaares umfassend die Nucleo­ tidsequenzen SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 oder mittels zweier Primerpaare, wobei das eine Pri­ merpaar die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 2/SEQ ID NO: 3 umfasst und das andere Primer­ paar die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5 umfasst,
• c) Detektion der Gattungs-spezifischen Region des vervielfachten 16S-rRNA-Fragments von Mykobak­ terien mittels eines Paares markierter Hybridi­ sierungssonden, wobei das Paar die Nucleotidse­ quenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 umfasst,
• d) Detektion der Art-spezifischen Region des ver­ vielfachten 16S-rRNA-Fragments von Mykobakte­ rien mittels eines Paares markierter Hybridi­ sierungssonden, wobei zum Nachweis des Mycobac­ terium tuberculosis-Komplex das Paar die Nucle­ otidsequenzen SEQ ID NO: 6/SEQ ID NO: 7 oder die komplementären Sequenzen davon umfasst und wobei zum Nachweis von Mycobacterium avium das Paar die Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 8/SEQ ID NO: 9 oder die komplementären Sequen­ zen davon umfasst, und
• e) wobei der gemeinsame, jeweils spezifische Nach­ weis von Mykobakterien und des Mycobacterium tuberculosis-Komplex und/oder von Mycobacterium avium während der Detektion gemäß der Schritte c) und d) mittels Schmelzkurvenanalyse erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die extrahierte mikrobielle DNA in Verfahrensschritt a) mit mindes­ tens einem künstlichen Plasmid, die als interner Standard dient, vermischt wird, wobei das künstli­ che Plasmid eine Gattungs-spezifische Region III der 16S-rRNA von Mykobakterien oder Teile davon um­ fasst, welche in ihrer Nucleotidsequenz modifiziert wurde, und wobei eine Schmelzkurvenanalyse zum spe­ zifischen Nachweis der vervielfachten 16S-rRNA- Fragmente von Mykobakterien und der modifizierten 16S-rRNA-Fragmente des künstlichen Plasmids durch­ geführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die extrahierte mikrobielle DNA aufgeteilt wird und ein erster Teil davon im Verfahren nach den Schritten a) bis e) von Anspruch 1 weiterbehandelt und ein zweiter Teil ei­ nem parallelen Verfahren unterzogen wird, umfassend die Schritte

• 1. a') Vermischen der extrahierten mikrobiellen DNA mit mindestens einem künstlichen Plasmid als interner Standard, wobei das künstliche Plasmi­ de eine Gattungs-spezifische Region III der 16S-rRNA von Mykobakterien oder Teile davon um­ fasst, welche in ihrer Nucleotidsequenz modifi­ ziert wurde,
• 2. b') Vervielfachung der 16S-rRNA-Fragmente mittels mindestens einem Primerpaar ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Nucleotidsequenzen-Paare SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5,
• 3. c') Detektion der vervielfachten 16S-rRNA-Fragmente mittels eines Paars markierter Hybridisierungs­ sonden, die mit der Gattungs-spezifischen Regi­ on III des 16S-rRNA-Fragments von Mykobakterien hybridisieren, wobei das Paar die Nucleotidse­ quenzen SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 11 oder die komplementären Sequenzen davon umfasst, und
• 4. d') wobei zum spezifischen Nachweis der verviel­ fachten 16S-rRNA-Fragmente von Mykobakterien und der modifizierten 16S-rRNA-Fragmente des mindestens einen künstlichen Plasmids während der Detektion gemäß Schritt c') eine Schmelz­ kurvenanalyse erfolgt.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Vervielfachung der Genfragmente mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Polymerase- Kettenreaktion (PCR) als Echtzeit-PCR, bevorzugt mittels LightCycler™-System, durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Detektion während oder nach der Verviel­ fachung der 16S-rRNA-Fragmente erfolgt.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Detektion mittels Echtzeit-PCR, besonders bevorzugt mittels LightCycler™-System erfolgt.

8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Detektion mittels Fluoreszenznachweis durchgeführt wird und wobei die markierten Hybridi­ sierungssonden-Paare als Fluoreszenz-Resonanz- Energie-Transfer-Paar ausgebildet sind.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Schmelzkurvenanalyse im Anschluss an die Vervielfachung der 16S-rRNA-Fragmente mittels Echt­ zeit-PCR, bevorzugt mittels LightCycler™-System, erfolgt.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die De­ tektion als quantitative Messung durchgeführt wird.

11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprü­ che, wobei das klinische Material ausgewählt ist aus der Gruppe klinischer Proben bestehend aus Spu­ tum, Bronchiallavage, Magensaft, Urin, Stuhl, Li­ quor, Knochenmark, Blut und Biopsien.

12. Oligonucleotid-Primerpaar, welches die Nuclein­ säuren mit den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3 aufweist.

13. Oligonucleotid-Primer, welcher die Nucleinsäu­ ren mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 4 aufweist.

14. Oligonucleotid-Hybridisierungssonden-Paar, wel­ ches die Nucleinsäuren mit den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 oder mit den komple­ mentären Sequenzen davon aufweist.

15. Oligonucleotid-Hybridisierungssonden-Paar, wel­ ches die Nucleinsäuren mit den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 oder mit den komple­ mentären Sequenzen davon aufweist.

16. Oligonucleotid-Hybridisierungssonden-Paar, wel­ ches die Nucleinsäuren mit den Nucleotidsequenzen SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 oder mit den kom­ plementären Sequenzen davon aufweist.

17. Künstliches Plasmid einsetzbar als interne Kon­ trolle der Vervielfachung und des Nachweises von 16S-rRNA-Fragmenten von Mykobakterien, umfassend modifizierte Sequenzen der Gattungs-spezifischen Region III des 16S-rRNA-Gens.

18. Künstliches Plasmid nach Anspruch 17, wobei das künstliche Plasmid mindestens einen/eine Nucleotid- Austausch, -Addition, -Deletion und/oder -Inversion gegenüber der Wildtyp-Sequenz der Gattungs- spezifischen Region III des 16S-rRNA-Gens aufweist.

19. Künstliches Plasmid nach Anspruch 17 oder 18, umfassend die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 14 oder SEQ ID NO: 15.

20. Künstliches Plasmid nach Anspruch 17 oder 18, umfassend die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 17.

21. Diagnose-Kit zum spezifischen Nachweis einer Mykobakterien-Infektion und des Mycobacterium tu­ berculosis-Komplex und von Mycobacterium avium in klinischem Material gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 umfassend:

• a) mindestens eine Polymerase,
• b) mindestens ein Primerpaar gemäß Anspruch 12,
• c) mindestens ein Primerpaar enthaltend einen Primer gemäß Anspruch 13, das die Gattungs- spezifische Region III von Mykobakterien amplifiziert.
• d) ein Hybridisierungssonden-Paar gemäß Anspruch 16 zur Detektion der Gattungs-spezifischen Region III,
• e) mindestens ein Hybridisierungssonden-Paar ge­ mäß den Ansprüchen 14 bis 15 zur Detektion der Art-spezifischen Regionen.

22. Diagnose-Kit nach Anspruch 21, beinhaltend ein künstliches Plasmid gemäß einem der Ansprüche 17 bis 20.