DE102010010372B3

DE102010010372B3 - Identifizierung von Erregern des Mycobacterium tuberculosis Komplexes

Info

Publication number: DE102010010372B3
Application number: DE201010010372
Authority: DE
Inventors: Susanne Homolka; PD Dr. Niemann Stefan
Original assignee: Forschungsinstitut Borstel Institut fuer Experimentelle Biologie und Medizin
Current assignee: Forschungszentrum Borstel Leibniz Lungenzentrum FZB
Priority date: 2010-03-05
Filing date: 2010-03-05
Publication date: 2011-11-17
Anticipated expiration: 2030-03-06

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik der Tuberkulose. Es werden Kits und Verfahren zu Identifizierung und/oder Diagnose von Erregern des Mycobacterium tuberculosis Komplexes (M. tuberculosis, M. africanum, M. canettii, M. bovis, M. caprae, M. pinnipedii und M. microti) zur Verfügung gestellt, die im Wesentlichen auf Nachweis von SNPs (Single Nucleotide Polymorphismen) beruhen. Dabei reicht überraschenderweise die Analyse von Polymorphismen in nur 5 Genen aus, um eine Identifizierung der oben genannten Spezies zu, erreichen. Die Polymorphismen in Rv2946c, Rv2628, Rv2629, Rv1811 und Rv0557 erlauben eine eindeutige Differenzierung der Genotypen/phylogenetische Linien.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik der Tuberkulose. Es werden Kits und Verfahren zur Identifizierung und/oder Diagnose von Erregern des Mycobacterium tuberculosis Komplexes (MTBK) zur Verfügung gestellt, die im Wesentlichen auf dem Nachweis von SNPs (Single Nucleotide Polymorphismen) beruhen. Dabei reicht überraschenderweise die Analyse von Polymorphismen in nur 5 Genen aus, um eine Identifizierung der Spezies zu erreichen. Die Polymorphismen in Rv2946c, Rv2628, Rv2629, Rv1811 und Rv0557 erlauben eine Differenzierung der Genotypen/phylogenetischen Linien.
Die Tuberkulose ist mit jährlich 1,8 Mio. Todesfällen auch heute noch die häufigste zum Tode führende, bakterielle Infektionskrankheit. Schätzungsweise ist ein Drittel der Weltbevölkerung mit dem Tuberkuloseerreger infiziert und 10% dieser Menschen werden im Laufe ihres Lebens erkranken.
Die Erreger der Tuberkulose sind der Gattung Mycobacterium zuzuordnen, die rund 147 obligat pathogene, fakultativ pathogene als auch apathogene Arten umfasst (http://www.bacterio.cict.fr/m/mycobacterium.html). Dazu zählen neben M. tuberculosis, M. africanum und M. canettii auch die tierpathogenen Erreger M. bovis, M. caprae, M. pinnipedii und M. microti, die zum MTBK zusammengefasst werden. Global betrachtet gilt M. tuberculosis als Haupterreger tuberkulöser Erkrankungen beim Menschen. Aber auch M. africanum Stämme sind für eine Vielzahl von Tuberkuloseinfektionen besonders in bestimmten Regionen Afrikas verantwortlich (Niemann 2004, Homolka 2008). Im Gegensatz dazu wurden M. canettii Stämme bislang nur vereinzelt von Patienten in Ostafrika isoliert (van Soolingen 1997, Pfyffer 1998).
Tierpathogene Erreger besitzen im Allgemeinen einbreiteres Wirtsspektrum. So können M. bovis Stämme außer bei Rindern, Wildschweinen, Nashörnern oder Dachsen auch Erkrankungen im Menschen verursachen. M. caprae Stämme sind hauptsächlich aus Ziegen und Schafen isoliert worden (Aranaz 1996, Aranaz 1999), aber auch Infektionen von Menschen, Rindern und anderen Tieren sind beschrieben (Cvetnic 2007, Pate 2006, Kubica 2003).
M. microti konnte hauptsächlich aus kleinen Nagern wie der Erdmaus und beim Menschen isoliert werden (Niemann 2000, Smith 2009, Frank 2009). M. pinnipedii Stämme führen zu tuberkulösen Erkrankungen in Seelöwen und Robben (Kiers 2008).
M. tuberculosis Komplex Isolate unterscheiden sich in ihrer Virulenz und in ihren phänotypischen Eigenschaften, was z. B. gerade in Hinblick auf den Erwerb von Resistenzmutationen und damit auf das klinische Erkrankungsbild von erheblicher Bedeutung ist.
Stämme des MTBKs weisen eine hohe Sequenzähnlichkeit (99,9%) auf (Brosch 2002, Gutacker 2002). Daher beruhte die Differenzierung klinischer Isolate viele Jahre lang ausschließlich auf phänotypische und morphologische Eigenschaften. Zum Beispiel können M. bovis und M. caprae Stämme über die PZA-Empfindlichkeitstestung differenziert werden (Niemann 2000).
Morphologische Merkmale wie eugones und dysgones Wachstum auf Löwenstein-Jensen Kulturmedium ermöglichen ebenfalls eine Klassifizierung von MTBK Stämmen. M. tuberculosis Stämme zeigen ein eugones Wachstum mit trockenen, krümeligen Kolonien. M. africanum, M. canettii und M. bovis Isolate hingegen bilden feuchte, farblose, Kolonien und werden als dysgon bezeichnet.
Eine detaillierte Differenzierung von klinischen Isolaten wurde durch die Entwicklung und Einführung molekularer Typisierungsmethoden wie IS6110 RFLP (restriction fragment length polymorphism) Fingerprinting, Spoligotyping (spacer oligonucleotide typing) oder MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repetitive units - variable number of tandem repeats) ermöglicht (van Embden 1993, Kamerbeek 1997, Supply 2006). Dadurch konnten Stämme des MTBKs in sogenannte Genotypen und phylogenetische Linien klassifiziert werden (Brudey 2006, Wirth 2008). Zum Beispiel beinhaltet die SpoDB4 Datenbank zurzeit basierend auf ca. 40.000 klinischen Isolaten aus 122 Ländern 1939 Spoligomuster, die 62 Linien beschreiben (Brudey 2006). Weiterhin definierten Wirth et al. 2008 die phylogenetischen Gruppen 1 und 2 („Clade” 1 und 2). Zur phylogenetischen Gruppe 1 gehören mit Ausnahme von M. tuberculosis EAI (Fast African Indian) Stämmen alle M. tuberculosis Isolate. Die phylogenetische Gruppe 2 wird durch M. africanum, M. canettii und M. tuberculosis EAI sowie allen tierpathogenen Erregern gebildet (Wirth 2008).
Häufig vorkommende M. tuberculosis Genotypen, die oftmals nach dem Isolierungsort benannt wurden, sind Beijing, Cameroon, Haarlem, Dehli/CAS (Central Asian) und Latin-American-Mediterranean (LAM) aber auch Uganda und Ghana (Wirth 2008). Viele dieser Genotypen werden in weitere Subgruppen unterteilt (Brudey 2006). M. africanum Stämme hingegen unterscheidet man in West African 1 und in West African 2 Stämme (Niemann 2004). Ähnlichkeitsstammbäume basierend auf MIRU-VNTR (24 Loci) und Spoligotypisierungsdaten (43 Spacer) können unter http://www.miru-vntrplus.org generiert werden.
Sreevatsan et al. beschrieben 1997 basierend auf der Sequenzanalyse von 26 Strukturgenen in 842 klinischen Isolaten 32 Mutationen, von denen 30 zu keiner Veränderung in der Aminosäuresequenz führten. Aufgrund dieser geringen Sequenzvariabilität wurden Stämme des MTBKs nach Sreevatsan et al. in lediglich 3 großen phylogenetischen Gruppen eingeteilt. Als phylogenetische Marker wurden Mutationen in Codon 463 des katG und in Codon 95 des gyrA Gens beschrieben (Sreevatsan 1997).
Durch die Entschlüsselung des M. tuberculosis H37Rv Genoms (Cole 1998) und vergleichende Analysen der Referenzstämme H37Rv und M. bovis BCG (Bacille Calmette Guerin) Pasteur konnten variablen Regionen (regions of difference, RD) im mykobakteriellen Genom nachgewiesen werden (Gordon 1999). Über den Nachweis von 20 dieser großen Sequenzpolymorphismen (large sequence polymorphism, LSP) in 100 klinischen Isolaten gelang es Brosch et al. 2002, Stämme des MTBKs in verschiedene phylogenetische Gruppen einzuteilen. Zum Beispiel lassen sich M. tuberculosis und M. canettii Isolate von M. africanum und tierpathogenen Erregern über die RD9 Region unterscheiden. Alle M. tuberculosis und M. canettii Isolate weisen diese Region auf, während M. africanum, M. microti und M. bovis eine Deletion zeigen (Brosch 2002). Eine Differenzierung von unterschiedlichen M. tuberculosis Genotypen konnte für die TbD1 Region gezeigt werden (Brosch 2002).
Eine umfangreiche Studie zur genetischen Diversität basierend auf LSP Analysen in 875 klinischen Isolaten veröffentlichten Gagneux et al. 2006. Darin wurde nachgewiesen, dass M. tuberculosis und M. africanum Isolate in 6 Hauptlinien unterschieden werden können, wobei M. africanum Stämme in West African 1 und West African 2 unterteilt werden (Gagneux 2006).
Eine Vielzahl der weltweit vorkommenden Stämme gehören der sogenannten „Euro-American” Linie an (M. tuberculosis 4 nach Gagneux. et al. 2006). Dazu zählen beispielsweise die Genotypen Haarlem, Uganda, Cameroon oder LAM. Diese Stämme weisen die RD9 Region auf (RD9⁺), zeigen aber Deletionen in der TbD1 Region (TbD1^–) und im pks15/1 Gen (pks15/1^–).
Die M. tuberculosis Linie 1, zu denen Isolate des East African Indian (EAI) Genotyps zählen, trägt die RD9 und TbD1 Region. Zusätzlich zeigen Stämme dieser Linie keine Deletionen in pks15/1, sie sind also RD9⁺, TbD1⁺ und pks15/1⁺. Stämme der Linien M. tuberculosis 2 und 3 (Gagneux et al. 2006), zu denen die Genotypen Beijing und Dehli/CAS zuzuordnen sind, werden als RD9⁺, TbD1^– und pks15/1⁺ definiert.
M. africanum Isolate und tierpathogene Stämme sind RD9^– und TbD1⁺. West African 1 und West African 2 Stämme unterscheiden sich im pks15/1 Gen. Stämme des West African 1 Genotyps zeigen im Gegensatz zu West African 2 Stämme keine Deletion.
Gagneux et al., 2006 stellte einen Zusammenhang zwischen dem Vorkommen von Stämmen verschiedener phylogenetischer Linien und bestimmten geographischen Regionen dar. Weiterhin wurde postuliert, dass klinische Isolate des MTBKs spezifisch an bestimmte humane Populationen adaptiert sind und dass daher die genetische Diversität gerade in Hinblick auf die Entwicklung neuer Impfstoffe oder Medikamente nicht vernachlässigt werden darf.
LSPs können als valide Marker für die Klassifizierung von phylogenetischen Gruppen genutzt werden. Jedoch haben sie für phylogenetische Analysen auch eine Reihe von Nachteilen. Zum einen ist die Unterscheidungsfähigkeit stark eingeschränkt. Zum anderen geben LSP Daten im Gegensatz zu Sequenzdaten basierend auf Einzelbasenaustausche keine Auskunft über die genetische Distanz von Stämmen.
Nach der Studie von Sreevatsan et al. führten Baker et al. 2004 eine Multi-Locus Sequenzanalyse von 7 Haushaltsgenen in 225 klinischen Isolaten durch, um informative Sequenzvariationen zu bestimmen. Dabei konnten 37 synonyme SNPs identifiziert werden, die M. tuberculosis in 4 Hauptlinien unterteilte.
Basierend auf der Analyse von 36 SNPs in 5069 Isolaten konnten Gutacker et al. nachfolgend 9 phylogenetische Linien bestimmen und ebenfalls einen Zusammenhang mit ihrer geographischen Verteilung beobachten (Gutacker 2006). Eine ähnliche Studie, in der 159 SNPs in 219 Stämmen untersucht wurden, veröffentlichte Filliol et al. im selben Jahr. Auch hier konnte nachgewiesen werden, dass die genetische Variabilität von Stämmen des MTBKs mit bestimmten geographischen Regionen korrelieren (Filliol et al. 2006).
Eine systematische Analyse der genomischen Variabilität klinischer Isolate basierend auf einer Stammkollektion, welche die gesamte geographische Diversität des MTBKs abdeckt, ist bislang noch nicht durchgeführt worden. Die meisten Studien basieren auf lokalen Kollektionen klinischer Isolate, wobei die eingeschlossenen, phylogenetischen Linien stark von der jeweiligen Studienregion abhängen.
Die erwähnten Studien zeigten, dass die genetische Diversität von Stämmen des MTBKs größer sein könnte als urprünglich angenommen. Darüber hinaus lässt die Korrelation genotypspezifischer Varianten mit bestimmten geographischen Regionen einen ersten Zusammenhang zwischen genetischer Diversität und biologischer Variabilität klinischer Isolate vermuten.
Djelouadji et al. (2008, PloS Negl Trop Dis 2(6): e253) schlägt ein Verfahren zur Identifikation von Arten des M. tuberculosis Komplexes vor, bei dem der „Exact Tandem Repeat D (ETR-D, auch Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit 4 genannt) sequenziert wird. Damit lassen sich mit Hilfe von sechs Polymorphismen, verschiedener Anzahl von Tandem-Repeats und zwei Deletionen/Insertionen die meisten klinischen Isolate und die meisten Arten differenzieren. Eine Differentialdiagnose des oft Antibiotika-resistenten Stammes M. tuberculosis Beijing ist mit dem Verfahren jedoch nicht möglich.
Djelouadji et al. (2009, BMC Research Notes 2009, 2: 239) schlägt Verfahren zur Identifizierung von M. tuberculosis W-Beijing vor, welches auf Nachweis von Polymorphismen in der Rv0927c-pstS3 intergenen Sequenz durch Pyrosequenzierung beruht.
Comas et al (2009) zeigt, dass sich bei der Typisierung des M. tuberculosis Komplexes auf Basis von Typisierung mit Hilfe von sich repetitiven Sequenzen wie „Interspersed Repetitive Units” oft Homoplasien, sich widersprechende phylogenetische Zuordnungen ergeben. Sequenzierung von 89 kodierenden Gene war dem deutlich überlegen. Es sollten daher phylogenetisch robustere Marker zur Identifizierung von Erregern des M. tuberculosis-Komplexes eingesetzt werden.
Es besteht somit ein Bedarf nach neuen Verfahren und Kits zur Identifizierung von Erregern des M. tuberculosis Komplexes, welche eine zuverlässige Identifizierung der wesentlichen Arten oder sogar Genotypen erlaubt und eine Analyse von weniger Polymorphismen als im Stand der Technik benötigt. Dieses Problem wird durch den Gegenstand der Erfindung gelöst.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Kit zur Identifizierung von Erregern des M. tuberculosis Komplexes zur Verfügung, welches Mittel zur Analyse von Sequenzen in den Genen Rv2628, Rv2629, Rv1811, Rv0557 und der Promorotregion von Rv2946c umfasst, wobei die Mittel bei Rv2628, Rv2629, Rv1811 und Rv0557 geeignet zur Detektion des Vorliegens von Polymorphismen gegenüber der Referenzsequenz von M. tuberculosis H37Rv, und bei Rv2946c geeignet zur Detektion des Vorliegens von Polymorphismen gegenüber der Referenzsequenz von M. tuberculosis Beijing sind.
H37Rv weist in dem Polymorphismus Rv2946c pks15/1 im Vergleich zu Beijing eine Deletion von 7 bp auf, wie in der Literatur bereits beschrieben (Reed et al., 2004) wurde. Der Polymorphismus in Rv2946c pks 15/1, ist entsprechend der bekannten Literatur benannt. Es handelt sich um eine Deletion im Promotorbereich von Rv2946c pks 15/1. Diese befinet sich in Leserichtung vor dem Startcodon GTG. Die Deletion von 7 bp umfasst die Basenpaare –34 bis –28. Die Deletion von 6 bp umfasst die Basenpaare –33 bis –28, wobei das dem Startcodon benachbarte Basenpaar mit –1 bezeichnet wird.
Die Sequenz des Referenzstammes M. tuberculosis H37Rv ist z. B. unter http://tuberculist.epfl.ch oder bei Cole et al., 2006 veröffentlicht. Die Sequenz des Referenzstammes M. tuberculosis Beijing ist z. B. bei Reed et al. veröffentlicht. Die Sequenzen der wichtigsten erfindungsgemäßen Sequenzgene sind ferner in 7 angegeben. Wenn nicht anders angegeben, dient H37Rv als Referenz.
Bevorzugt umfasst das Kit Mittel zur Detektion von a) dem Polymorphismus in Rv2946c pks 15/1, welcher eine Deletion von 6 oder 7 bp ist, b) dem Polymorphismus in Rv1811, welcher eine Substitution im Codon 15 (gtc>gtt) ist, c) dem Polymorphismus in Rv1811, welcher eine Substitution A107V (gcc>gtc) ist, d) dem Polymorphismus in Rv2628, welcher eine Substitution L83W (ttg>tgg) ist, e) dem Polymorphismus in Rv0557, welcher eine Substitution im Codon 350 (gtg>gta) ist.
Bevorzugt ist das Kit mindestens zur Differenzierung zwischen a) M. tuberculosis, b) M. canetti, c) M. bovis, d) M. caprae, e) M. pinnipedii und M. microti geeignet, z. B. wenn es die Mittel zur Detektion der oben genannten Polymorphismen umfasst. Weitere Polymorphismen müssen hierzu nicht analysiert werden. Eine Differenzierung zwischen M. pinnipedii und M. microti ist nur selten nötig, so dass dann zu im Stand der Technik bekannten Methoden gegriffen werden kann.
In einer Ausführungsform umfasst das Kit ferner Mittel zur Detektion von dem Polymorphismus in Rv2628, welcher eine Substitution A96T (gcg>acg) ist, wenn auch eine Identifizierung von M. tuberculosis West African 1 gewünscht ist.
Insbesondere umfasst sind die Polymorphismen:

– der Polymorphismus in Rv2946c pks 15/1, der eine Deletion von 6 oder 7 bp ist;
– und/oder der Polymorphismus in Rv2628, der eine Substitution A96T (gcg>acg) ist und/oder eine Substitution L83W (ttg>tgg) ist;
– und/oder der Polymorphismus in Rv2629, der eine Substitution D64A (gat>gct) ist und/oder eine Substitution P322L (ccg>ctg) ist;
– und/oder der Polymorphismus in Rv1811, der eine Substitution A107V (gcc>gtc) ist und/oder eine Substitution im Codon 15 (gtc>gtt) ist und/oder eine Substitution im R182H (cgc>cac) ist und/oder eine Substitution im Codon 80 (atc>att) ist;
– und/oder der Polymorphismus in Rv0557, der eine Substitution R178G (cgg>ggg) ist und/oder eine Substitution im Codon 350 (gtg>gta) ist und/oder eine Substitution im Codon 270 (gcc>gct) ist und/oder eine Substitution L153V (ctg>gtg) ist.

Dabei können einige oder alle der genannten Polymorphismen analysiert werden, d. h., das Kit kann Mittel zum Nachweis aller oder einiger Polymorphismen enthalten. Nur selten wird eine Analyse aller Polymorphismen nötig sein, da im allgemeinen schön die Analyse weniger Polymorphismen zu einem eindeutigen Ergebnis führt. Manchmal können bestimmte, z. B. tierpathogene Arten oder Genotypen von vornherein ausgeschlossen werden. Selbstverständlich ist es auch möglich, ein oder mehrere andere Polymorphismen zu analysieren, z. B. solche, die in der vorliegenden Beschreibung offenbart sind.
Die Mittel zum Nachweis der Polymorphismen können Primer, insbesondere Primer zur Sequenzierung und/oder zur Polymorphismus-spezifischen Amplifizierung, und/oder Sonden umfassen.
Sonden können zur Hybridisierung entweder mit den relevanten Sequenzen des Referenzstammes oder der jeweiligen polymorphen Sequenz ausgebildet sein. Dabei sind verschiedene Nachweisverfahren (z. B. Southern Blot, FRET (Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer), Reverse Hybridisierung, z. B. Reverse Linien-Hybridisierung oder Arrays) bekannt, und die Sonden können – da die zu detektierenden Polymorphismen durch die Erfindung zur Verfügung gestellt werden, vom Fachmann entsprechend gestaltet werden. Die Sonden können detektierbar markiert sein, z. B. mit einem oder mehreren Fluoreszenzfarbstoff(en). Sie können auch, z. B. für Reverse Linien-Hybridisierung, schon auf Streifen zur Detektion aufgebracht oder in einem Array angeordnet sein.
Primer zur Sequenzierung der Gene können auf Basis der bekannten Sequenzen hergestellt werden, Beispiele sind hierin offenbart, z. B. in der Primertabelle unten. Die Primer sind vorteilhafterweise so gewährt, dass alle Regionen mit relevanten Polymorphismen des Gens (Rv) gemeinsam sequenziert werden, so dass für eine erfindungsgemäße Genotypisierung nur die Sequenzierung von Rv2946c, Rv2628, Rv2629, Rv1811 und Rv0557 nötig ist.
Primer können auch zur Polymorphismus-spezifischen Amplifizierung gewählt werden, indem z. B. ein Primer des Paares an seinem 3'-Ende an der polymorphen Base endet, und nur ein Amplifikationsprodukt entsteht, wenn der Primer mit der Sequenz übereinstimmt. Der zweite Primer des Paares kann so gewählt werden, dass ein Amplifikationsprodukt mit einer einzigartigen Länge entsteht, wenn man mehrere oder alle Polymorphismen in einer Reaktion nachweist. Dabei sollten die Primer nach Länge und GC-Gehalt so gewählt werden, dass die Amplifikation bei gleichen Bedingungen stattfinden kann.
Ein Nachweis kann auch per Real-time PCR, z. B. mit Tagman^® oder Lightcycler^® erfolgen.
Wie die Beispiele für die Mittel zur Detektion des Vorliegens von Polymorphismen zeigen, können die Mittel zur Detektion des Vorliegens von mehreren Polymorphismen in einem Gen (z. B. in Rv2628, Rv2629, Rv1811 und/oder Rv0557) ein Mittel oder mehrere Mittel sein. Wird z. B. eine Sequenzierung des ganzen Abschnitts gewählt, ist nur jeweils ein Primerpaar/Gen nötig, d. h., das Kit braucht nur 5 Primerpaare zu umfassen. Die Mittel können z. B. Primerpaare zur Sequenzierung sein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24; ID NO: 57 und SEQ ID NO: 58; ID NO: 59 und SEQ ID NO: 60; und ID NO: 61 und SEQ ID NO: 62.
Selbstverständlich sind auch Kombinationen verschiedener Mittel (z. B. Sonden/Primer) möglich. Ein erfindungsgemäßes Kit kann ferner Reagenzien zur Amplifizierung und/oder Hybridisierung von DNA umfassen. Ein Kit kann ferner eine Gebrauchsanleitung bzw. Interpretationshilfe für die Ergebnisse umfassen, welche z. B. eine Abfolge der Differenzierung von Genotypen ähnlich wie das Diagramm in 4 enthält.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Identifizierung von. Erregern des M. tuberculosis Komplexes, Schritte umfassend, bei denen man in einer Probe Sequenzen in den Genen Rv2628, Rv2629, Rv1811, Rv0557 und der Promotorregion von Rv2946c, analysiert, die erhaltenen Sequenzen von Rv2628, Rv2629, Rv1811 und Rv0557 mit der Referenzsequenz von M. tuberculosis H37Rv und die erhaltene Sequenz von Rv2946c mit der Referenzsequenz von M. tuberculosis Beijing vergleicht, und Polymorphismen nachweist. In einer Ausführungsform werden jeweils die vollständigen Sequenzen der Gene analysiert. Die genannten Gene enthalten, wie beschrieben, Polymorphismen, welche eine Differenzierung zwischen den häufigsten Erregerstämmen erlauben.
In einer Ausführungsform weist man a) den Polymorphismus in Rv2946c pks 15/1, welcher eine Deletion von 6 oder 7 bp ist, b) den Polymorphismus in Rv1811, welcher eine Substitution im Codon 15 (gtc>gtt) ist, c) den Polymorphismus in Rv1811, welcher eine Substitution A107V (gcc>gtc) ist, d) den Polymorphismus in Rv2628, welcher eine Substitution L83W (ttg>tgg) ist, e) den Polymorphismus in Rv0557, welcher eine Substitution im Codon 350 (gtg>gta) ist, und optional den Polymorphismus in Rv2628, welcher eine Substitution A96T (gcg>acg) ist, nach.
Dabei erhält man bevorzugt eine Differenzierung mindestens zwischen a) M. tuberculosis, b) M. canetti, c) M. bovis, d) M. caprae, e) M. pinnipedii und M. microti.
In einem erfindungsgemäßen Verfahren werden insbesondere 5 bis 13 Polymorphismen, z. B. 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder 13 Polymorphismen nachgeweisen, wobei die Polymorphismen ausgewählt sind aus einer Gruppe, wobei

– der Polymorphismus in Rv2946c pks 15/1 eine Deletion von 6 oder 7 bp ist;
– und/oder der Polymorphismus in Rv2628 eine Substitution A96T (gcg>acg) und/oder eine Substitution L83W (ttg>tgg) ist;
– und/oder der Polymorphismus in Rv2629 eine Substitution D64A (gat>gct) und/oder eine Substitution P322L (ccg>ctg) ist;
– und/oder der Polymorphismus in Rv1811 eine Substitution A107V (gcc>gtc) und/oder eine Substitution im Codon 15 (gtc>gtt) und/oder eine Substitution im R182H (cgc>cac) und/oder eine Substitution im Codon 80 (atc>att) ist;
– und/oder der Polymorphismus in Rv0557 eine Substitution R178G (cgg>ggg) und/oder eine Substitution im Codon 350 (gtg>gta) und/oder eine Substitution im Codon 270 (gcc>gct) und/oder eine Substitution L153V (ctg>gtg) ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Sequenz z. B. analysiert, indem man eine Sequenzierung und/oder eine Polymorphismus-spezifischen Amplifizierung, und/oder Hybridisierung einer Sonde vornimmt, woduch ein oder mehrere Polymorphismen nachgewiesen werden.
Bevorzugt wird bei dem erfindungsgeäßen Verfahren ein erfindungsgemäßes Kit eingesetzt. Vor der Analyse kann DNA, insbesondere genomische DNA eines Mykobakteriums aus einer Probe isoliert werden, z. T. kann die Probe jedoch auch direkt in das Analyseverfahren eingebracht werden. Die Probe kann z. B. eine Probe eines Patienten, insbesondere eine Tuberkulose-Patienten, sein, z. B. Sputum, eine Biopsie oder Blut. Die Probe kann jedoch auch eine Mykobakterien-Kultur sein, die aus einer, Patientenprobe gewonnen wurde, oder ein Laborisolat. Der Patient kann ein Mensch oder ein evtl. von Mykobakterien infiziertes Tier sein.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verfügung, bei dem man

a) den Polymorphismus in Rv2946c pks 15/1 nachweist, der eine Deletion von 6 oder 7 bp ist; wobei man, wenn diese Deletion nicht vorliegt,
b) den Polymorphismus in Rv2628 nachweist, der eine Substitution A96T (gcg>acg) ist, wenn dieser nicht vorliegt,
c) den Polymorphismus in Rv1811 nachweist, der eine Substitution im Codon 15 (gtc>gtt) ist, wenn dieser nicht vorliegt,
d) den Polymorphismus in Rv0557 nachweist, der eine Substitution im Codon 270 (gcc>gct) ist, wenn dieser nicht vorliegt,
e) den Polymorphismus in Rv2629 nachweist, der eine Substitution Substitution D64A (gat>gct) ist; wobei man, wenn der Polymorphismus in Rv2946c pks 15/1 eine Deletion von 6 bp ist:
f) den Polymorphismus in Rv1811 nachweist, der eine Substitution A107V (gcc>gtc) ist, wenn dieser nicht vorliegt,
g) den Polymorphismus in Rv2628 nachweist, der eine Substitution L83W (ttg>tgg) ist, wenn dieser nicht vorliegt,
h) den Polymorphismus in Rv0557 nachweist, der eine Substitution im Codon 350 (gtg>gta) ist; wobei man, wenn der Polymorphismus in Rv2946c pks 15/1 eine Deletion von 7 bp ist:
i) den Polymorphismus in nachweist, der eine Substitution R182H (cgc>cac) ist, wenn dieser nicht vorliegt,
j) den Polymorphismus nachweist, der eine Substitution im Codon 80 (atc>att) ist, wenn dieser nicht vorliegt,
k) den Polymorphismus in Rv0557 nachweist, der eine Substitution R178G (cgg>ggg) ist, wenn dieser nicht vorliegt,
l) den Polymorphismus in Rv0557 nachweist, der eine Substitution L153V (ctg>gtg) ist, wenn dieser nicht vorliegt,
m) den Polymorphismus in Rv2629 nachweist, der eine eine Substitution P322L (ccg>ctg) ist.

Die durch dieses Verfahren identifizierten Erreger werden z. B. in dem Flussdiagramm unten beschrieben.
Sofern in der Beschreibung der Erfindung ein/eine verwendet wurde, ist, wenn nicht anders angegeben, immer auch eine Vielzahl mit bezeichnet.
Die Erfindung wird im Folgenden durch Beispiele illustriert, die Möglichkeiten ihrer Ausführung verdeutlichen, die Erfindung aber nicht beschränken sollen. Alle zitierten Publikationen sind hiermit ausdrücklich durch Bezugnahme in die Beschreibung der Erfindung mit aufgenommen.
Legende der Figuren
1. Phylogenetischer Baum basierend auf MIRU-VNTR (24 Loci) und Spoligotypying (43 Spacer) Daten (http://www.miruvntrplus.org). Repräsentative Vertreter von 18 unterschiedlichen Genotypen wurden in die Sequenzanalyse mit eingeschlossen. Die Strukturierung in zwei Hauptgruppen (Gruppe 1 und 2) ist deutlich zu erkennen. (Neighbour-Joining tree).
2 Phylogenetischer Stammbaum basierend auf Multi-Locus-Sequenz-Typisierungsdaten. Die Berechnung des „Maximum Parsimomy Trees” beruhte auf 148 Mutationen, die in 29 Genen nachgewiesen werden konnten. Eine gruppen-, linien- und genotypspezifische Einteilung von MTBK Stämmen konnte bestätigt werden. Beige: M. canettii Stämme; Braun: M. africanum West African 2 Stämme; Gelb: tierpathogene Spezies; Dunkelgrün: M. aficanum West African 1a und 1b Stämme; Hellblau: M. tuberculosis Linie 2; Rot: Stämme der „Euro-American” Linie; Hellgrün: Referenzstamm H37Rv; Dunkelblau: M. tuberculosis Linie 3; Lila: M. tuberculosis Linie 1. (Bootstrap 2000).
3 Phylogenetisch informative Sequenzvariationen. Es konnten 45 genotypspezifische Mutationen und 12 genotypübergreifende Mutationen identifiziert werden (blaue Markierungen). Die höchste Variabilitätzeigten M. canettii Stämme, gefolgt von West African 1 Stämme. Eine detailiierte Liste der Sequenzvariationen (Nr. der Mutation links) befindet sich in einer Tabelle „Übersicht der genotypspezifischen Mutationen” unten. CAS: Central Asian Genotyp; EAI: East African Indian Genotyp; LAM: Latin-American-Mediterranean Genotyp.
4 Verfahren zur Differenzierung von Stämmen des MTBKs basierend auf Sequenzvariationen-Flußdiagramm. Die Klassifizierung erfolgt nach dem Ausschlussprinzip bestimmter Mutationen in den entsprechenden Genen. Cd: Codon; +: Mutation vorhanden; –: Mutation nicht vorhanden. Alle Genotypen, die nicht mit einer anderen Spezies bezeichnet sind, sind M. tuberculosis.
5 Genotypspezifische Mutationen in Rv1811 (mgtC). Dargestellt ist die Position des mgtC Gens im mykobakteriellen Genom (http//tuberculist.epfl.ch). Es konnten 5 phylogenetisch informative SNPs nachgewiesen werden, von denen 3 zu einer veränderten Aminosäuresequenz führten. Die einzelnen Genotypen mit den entprechenden Sequenzveränderungen sind im unteren Teil der Abbildung dargestellt.
6 Refererizsequenzen der Gene Rv0557 (SEQ ID NO: 67, A), Rv2628 (SEQ ID NO: 68, B), Rv2629 (SEQ ID NO: 69, C), Rv1811 (SEQ ID NO: 70, D), jeweils M. Tuberculosis H37Rv, und der Promotorsequenz von Rv2946c, M. Tuberculosis Beijing (SEQ ID NO: 71, E). Die Gensequenzen beginnen mit dem Startcodon +1, die Promotorsequenz endet vor dem Startcodon –1. Unterlegt ist jeweils das Startcodon. Unterstrichen ist der Bereich der 6 bp Deletion, fett gedruckt die 7 bp Deletion.
Beispiele
Abbkürzungsverzeichnis

A: Adenin
C: Cytosin
CAS: Central Asia (Genotyp von M. tuberculosis)
CTAB: Cetyltrimethylammoniumbromid
DMSO: Dimethylsulfoxid
DNA: Desoxyribonukleinsäure
dNTP: Desoxyribonukleotidtriphosphat
EAI: East African Indian (Genotyp von M. tuberculosis)
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
EtOH: Ethanol
G: Guanin (DNA) oder Glycin (Aminosäuren)
LAM: Latin American Mediterranean (Genotyp von M. tuberculosis)
LJ: Löwenstein-Jensen
PBS: Phosphat gepufferte Salzlösung
PCR: Polymerasekettenreaktion
PIM: Phosphatidylinositolmanan
rcf: relative Zentrifugalkraft Streptomycin
SNP: Einzelbasenaustausch
T: Thymin
T_a: Annealing-Temperatur
TAE: Tris-Acetat-EDTA
TB: Tuberkulose
TE: Tris-EDTA
Tris: Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
Wt: Wildtyp

Materialien
Reagenzien für die PCR

Produkt Hersteller Standort

HotStarTaq DNA Polymerase Kit Qiagen Hilden

100 mM dNTP Set Roche Mannheim

Enzyme

Produkt Hersteller Standort

Exonuklease I New England Biolabs Frankfurt

Lysozym Roche Mannheim

Proteinase-K Roche Mannheim

Shrimp Alkaline Phosphatase USB Amersham Otelfingen

Reagenzien und Materialien für die Sequenzierung stammten, bis auf LiChrosolv^® Wasser für die Chromatographie (Merck, Darmstadt, DE), von Applied Biosystems, Darmstadt. Chemikalien wurden, wenn nicht separat aufgeführt, von Merck, Darmstadt, DE, bezogen.

Produkt	Hersteller	Standort
Braunwasser Ecotainer^® Aqua B.	B. Braun Melsungen AG	Melsungen
Cetyltrimathylammoniumbromid	AppliChem	Darmstadt
Ethylendiamintetraacetat-Na₂-Dihydrat	MP Biomedicals	Eschwege
Formamid	MP Biomedicals	Eschwege
illustra^TM Sephadex G50 Fine DNA grade	GE Healthcare	München
Isopropanol	Carl Roth	Karlsruhe
N-Lauroylsarcosin-Natrium Salz	Sigma-Aldrich^®	Steinheim
Roti^®-Stock 100×TE-Puffer	Carl Roth	Karlsruhe
Tris-Base	MP Biomedicals	Eschwege
UltraPure^TM Agarose	Invitrogen	Karlsruhe
100 bp DNA Leiter Extended	Carl Roth	Karlsruhe

Verbrauchsmaterialien

Produkt	Hersteller	Standort
Millipore Multiscreen^®-HV-Platten	Millipore	Schwalbach

Geräte

Produkt	Hersteller	Standort
ABI PRISM^® 3130xl Genetic Analyzer	Applied Biosystems	Darmstadt
Aufbereitungssystem Elga PURELAB ultra	Elga labwater	Celle
Dosierungsplatte MACL09645	Millipore	Schwalbach
Eppendorf Zentrifuge 5430	Eppendorf	Hamburg
Geldokumentationssystem	Bio-Rad Laboratories GmbH	München
Gelkammer mini sub cell^®GT	Bio-Rad Laboratories GmbH	München
Gelkammer sub cell^®GT	Bio-Rad Laboratories GmbH	München
Gelkammer wide mini sub cell^®GT	Bio-Rad Laboratories GmbH	München
Rettich Zentrifuge Universal 32R	über Armin Baack Laborbedarf	Schwerin
Rettich Rotanta 460R	über Armin Baack Laborbedarf	Schwerin
MJ Research PTC-200 Thermocycler	über Biozym	Hess. Oldendorf
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Peqlab	Erlangen
Spannungsgerät PowerPac^TM 300	Bio-Rad Laboratories GmbH	München

Bakterienstämme

Die in dieser Arbeit zur Untersuchung der genetischen und biologischen Diversität verwendete Referenzkollektion klinischer Isolate umfasst 58 Vertreter der weltweit am häufigsten vorkommenden Spezies und Genotypen des Mycobacterium tuberculosis Komplex (MTBK). Alle Mykobakterienstämme sind in Vorarbeiten am Nationalen Referenzzentrum in Borstel phäno- und genotypisch charakterisiert worden und können von dort bezogen werden. Die vorhandenen Referenzstämme H37Rv, CDC1551, Bovis ATCC sowie Africanum ATCC wurden in die Analyse mit einbezogen. Eine Beschreibung der einzelnen Stämme hinsichtlich der Spezies, ihres Genotyps und der Ergebnisse der Empfindlichkeitstestung gegenüber den Erstrangmedikamenten befindet sich in der folgenden Tabelle (S: sensitiv, R: resistent).

Stammnummer	Spezies	Genotyp	SM	INH	RMP	EMB	PZA
9679/00	M. tuberculosis	H37Rv ATCC	S	S	S	S	S
CDC1551	M. tuberculosis	CDC1551	S	S	S	S	S
9564/00	M. bovis	Bovis ATCC	S	S	S	S	R
9550/00	M. africanum	Africanum ATCC	S	S	S	S	S
9532/03	M. tuberculosis	Haarlem	S	S	S	S	S
2336/02	M. tuberculosis	Haarlem	S	S	S	S	S
4130/02	M. tuberculosis	Haarlem	S	S	S	S	S
4850/03	M. tuberculosis	EAI	S	S	S	S	S
1797/03	M. tuberculosis	EAI	S	S	S	S	S
947/01	M. tuberculosis	EAI	S	S	S	S	S
2333/99	M. tuberculosis	Uganda I	S	S	S	S	S
2169/99	M. tuberculosis	Uganda I	S	S	R	S	S
2201/99	M. tuberculosis	Uganda I	R	R	R	S	S
2191/99	M. tuberculosis	Uganda II	S	S	S	S	S
2253/99	M. tuberculosis	Uganda II	S	S	S	S	S
2176/99	M. tuberculosis	Uganda II	S	S	S	S	S
10493/01	M. tuberculosis	Ghana/TB1	R	R	S	S	S
2570/02	M. tuberculosis	Ghana/TB1	S	S	S	S	S
10469/01	M. tuberculosis	Ghana/TB1	R	R	S	R	S
5390/02	M. tuberculosis	Cameroon	S	S	S	S	S
5400/02	M. tuberculosis	Cameroon	S	S	S	S	S
1428/02	M. tuberculosis	Cameroon	S	S	S	S	S
1417/02	M. tuberculosis	Cameroon	S	S	S	S	S
7968/03	M. tuberculosis	LAM	S	S	S	S	S
8885/03	M. tuberculosis	LAM	S	S	S	S	S
946/03	M. tuberculosis	LAM	S	S	S	S	S
2151/03	M. tuberculosis	S-type	S	S	S	S	S
2318/06	M. tuberculosis	S-type	S	S	S	S	S
6411/05	M. tuberculosis	S-type	S	S	S	S	S
4412/0q4	M. tuberculosis	X-type	S	S	S	S	S
9953/04	M. tuberculosis	X-type	S	S	S	S	S
8431/05	M. tuberculosis	X-type	S	S	S	S	S
7936/01	M. tuberculosis	Dehli/CAS	S	S	S	S	S
2637/02	M. tuberculosis	Dehli/CAS	S	S	S	S	S
1934/03	M. tuberculosis	Beijing	S	S	S	S	S
1500/03	M. tuberculosis	Beijing	S	S	S	S	S
12594/02	M. tuberculosis	Beijing	S	S	S	S	S
3256/02	M. tuberculosis	Beijing	R	R	R	R	S
3329/02	M. tuberculosis	Beijing	R	R	R	R	S
4445/02	M. tuberculosis	Beijing	R	R	R	R	S
10517/01	M. africanum	West African 2	S	S	S	S	S
5468/02	M. africanum	West African 2	S	S	S	S	S
10514/01	M. africanum	West African 2	S	R	S	S	S
5434/02	M. africanum	West African 1a	R	S	S	S	S
1449/02	M. africanum	West African 1a	S	S	S	S	S
1473/02	M. africanum	West African 1a	S	S	S	S	S
1443/02	M. africanum	West African 1b	S	S	S	S	S
10473/01	M. africanum	West African 1b	S	S	S	S	S
10494/01	M. africanum	West African 1b	R	S	S	S	S
7011/02	M. pinnipedii	Seal	S	S	S	S	S
7739/01	M. pinnipedii	Seal	S	S	S	S	S
4258/00,	M. bovis	Bovis	S	S	S	S	R
751/01	M. bovis	Bovis	S	S	S	S	R
7540/01	M. bovis	Bovis	S	S	S	S	R
9577/99	M. caprae	Caprae	S	S	S	S	S
1694/00	M. caprae	Caprae	S	S	S	S	S
8986/99	M. caprae	Caprae	S	S	S	S	S
417/01	M. microti	Llama	S	S	S	S	S
1479/00	M. microti	Vole	S	S	S	S	S
3040/99	M. canettii	Canettii	S	S	S	S	S
3041/99	M. canettii	Canettii	S	S	S	S	S
3151/08	M. canettii	Canettii	S	S	S	S	S

Primer
Die in folgenden Tabelle zusammengefassten Primersequenzen sind in der Literatur beschrieben bzw. mit Hilfe der OLIGO Primer Analysis Software v.5.0 (National Bioscience, Plymouth, Minnesota, USA) entworfen worden. Die dargestellten Positionen ergeben sich aus den Nukleotidpositionen des 5'-Endes der jeweiligen Primer, wobei der Genstart mit +1 definiert ist. Alle Primer wurden durch Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Deutschland hergestellt. Tabelle Primersequenzen

¹Hershberg et al. 2008.
²Keating et al. 2005
Nährmedien und Zusätze
Löwenstein-Jensen Medium (1600 ml)
Zunächst wurden 38,5 g Löwenstein-Jensen Basis in 600 ml Aqua dest. gelöst und 12 ml 87 Glyzerin hinzugefügt. Die Lösung wurde autoklaviert. Anschließend wurden 1000 ml Volleier dazu gegeben und die Lösung zu je 5 ml in Glasröhrchen abgefüllt. Die Koagulation erfolgte bei 86°C in Schräglage für 45 min.
Middlebrook 7H9 Medium (1000 ml)
Es wurden 4,7 g Middlebrook 7H9 Medium in 900 ml Aqua dest. gelöst und mit 2 ml Glyzerin sowie 500 μl Tween 80 vermischt. Nach dem Autoklavieren wurde vor Gebrauch OADC (oleic acid, bovine albumin, dextrose, catalase) in einer Endkonzentration von 10% frisch hinzugefügt.
OADC-Lösung

Der essentielle Zusatz für die Kultivierung von Mykobakterien in 7H9 und 7H10 Medium wurde gebrauchsfertig bei der Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland bestellt. Die einzelnen Bestandteile sind in Tabelle 3.2 zusammengefasst. Bestandteile des OADC:

Substanz	Menge in g/l	Funktion
Ölsäure	0,10	Stoffwechselsubstrat
Rinderalbumin	50,00	Bindung freier Fettsäuren, die für Mykobakterien toxisch wirken können
Dextrose	20,00	Energiequelle
Katalase	0,03	Zerstörung von im Medium potentiell vorkommender toxischer Peroxide

Puffer und Lösungen für molekularbiologische Methoden
Puffer und Lösungen für DNA-Arbeiten
CTAB-Lösung für die Isolierung genomischer DNA aus Mykobakterien (100 ml)
4,1 g NaCl wurden in 90 ml Aqua dest. gelöst. Unter Rühren wurden 10 g Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) hinzugefügt. Durch Erwärmung auf 65°C wurde der Lösungsprozess beschleunigt. Die Lösung wurde anschließend auf ein Gesamtvolumen von 100 ml mit Aqua dest. aufgefüllt.
0,5 M EDTA-Lösung (1000 ml)
186,12 g EDTA-Na₂-Dihydrat wurden in Aqua dest. gelöst und auf 1000 ml aufgefüllt. Die Lösung wurde auf einen pH von 8 mit NaOH eingestellt.
Schwerepuffer zum Beschweren der DNA für die Agarose-Gelelektrophorese
Der Schwerepuffer setzte sich aus 50% (v/v) Glyzerin, 0,05% (w/v) Bromophenolblau, 1 mM EDTA-Lösung sowie 50% (v/v) 1×TAE Puffer zusammen.
50×TAE-Puffer (1000 ml)
242 g Tris-Base und 40 ml 0,5 M EDTA-Lösung wurden in 750 ml Aqua dest. gelöst. Der pH von 7,5 wurde mit ca. 57 ml Essigsäure eingestellt. Anschließend wurde die Lösung auf ein Gesamtvolumen von einem Liter mit Aqua dest. aufgefüllt. Für die Agarose-Gelelektrophorese wurde der Puffer mit Aqua dest. 1:50 verdünnt eingesetzt.
Methoden Mikrobiologische Methoden
Kultivierung von M. tuberculosis Komplex Stämmen in Flüssigkultur
Möglichkeit 1:
Zunächst wurden die einzelnen klinischen Isolate auf Löwenstein-Jensen Festkultur beimpft und für ca. 14–21 Tage bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde mit einer 10 μl Einmalimpföse eine homogene Bakteriensuspension in 10 ml 7H9 Medium (10% OADC) hergestellt (Vorkultur), die in Nährmedienflaschen (Nalgene) überführt und bei 37°C stehend inkubiert wurden. Für die Überführung ins Rollflaschensystem wurden Kulturen mit einer optischen Dichte zwischen OD 0,2–0,4 benötigt (600 nm). Die Inkubationszeit variierte je nach klinischem Isolat zwischen 5 und 10 Tagen. Alle Vorkulturen wurden vor Umsetzung ins Rollflaschensystem (Hauptkulturen) Sterilitätskontrollen unterzogen. Dazu wurden je 100 μl Vorkultur in 5 ml LB-Medium sowie in 5 ml BHI(Brain heart infusion)-Medium überführt und bei 37°C für mindestens 3 Tage inkubiert. Außerdem wurden je 200 μl auf Blutagarplatten und auf BHI-Agarplatten beimpft und ebenfalls bei 37°C inkubiert. Eine mikroskopische Kontrolle erfolgte durch die Anfertigung eines Ziehl-Neelsen Präparats. Zusätzlich wurden alle klinischen Isolate erneut genotypisiert. Anschließend wurde die gesamte Vorkultur in 20 ml über Nacht bei 37°C in Rollflaschen vorinkubiertem 7H9/OADC Medium überführt. Bei einer OD von 0,2–0,4 wurde sukzessiv Medium (je 20 ml) bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml aufgefüllt und die Hauptkulturen bei 37°C rollend inkubiert (5 rpm, Rolleinheit Wheaton). Erneut wurden alle oben aufgeführten Sterilitätskontrollen durchgeführt. Bei einer OD von 0,2–0,4 wurden 1 ml Aliquots in Schraubdeckelreaktionsgefäße hergestellt und bei –80°C für weitere Analysen gelagert. Die Gesamtinkubationszeit im Rollflaschensystem mit einem Volumen von 100 ml betrug ungefähr 7–10 Tage. Eine erneute Genotypisierung folgte.
Möglichkeit 2:
Drei klinische Isolate von 5 verschiedenen Genotypen des MTBK sowie der H37Rv Referenzstamm wurden aus Gefrierkulturen kultiviert. Dazu wurden 200 μl der Gefrierkultur in 20 ml 7H9/OADC Medium in TPP-Zellkulturflaschen (25 cm²) überführt und stehend für ca. 10 Tage inkubiert. Die wesentlichen Unterschiede der Anzucht bestanden also darin, dass es sich um Standkulturen mit kontinuierlicher Sauerstoffzufuhr aufgrund gefilterter Zellkulturflaschen handelte.
Bestimmung der optischen Dichte (OD)
Möglichkeit 1:
Für die Bestimmung der OD wurden 100 μl der entsprechenden Kultur in Flachboden-Mikrotiterplatten (96 Vertiefungen, Nunc) gegeben und im ELISA Reader Sunrise bei einer Wellenlänge von 600 nm (Referenzwelllenlänge ist 0) gemessen. Als Leerwert wurde 7H9/OADC Medium eingesetzt. Die Messung erfolgte in Duplikaten.
Möglichkeit 2:
Zur Bestimmung der CD wurden 750 μl der entsprechenden Kultur in verschließbare Einmalküvetten überführt und bei einer Absorption von 600 nm im BIO-RAD SmartSpec^TM 3000 gemessen. Zur Bestimmung des Leerwerts wurde 7H9/OADC Medium eingesetzt.
Ziehl-Neelsen Färbung
Für den Nachweis von Mykobakterien und als Kontaminationskontrolle wurden Ziehl-Neelsen Präparate von allen Vor und Hauptkulturen angefertigt. Dazu wurden 10 μl der Kultur auf einem Objektträger ausgestrichen und ca. 15 min unter der Werkbank getrocknet. Die eingetrocknete Kultur wurde hitzefixiert, indem sie mehrmals durch die Bunsenbrennerflamme gezogen wurde. Die Färbung erfolgte außerhalb des S3-Bereiches. Hierzu wurden die Präparate mit filtrierter Karbolfuchsinlösung bedeckt und erhitzt. Dabei war es wichtig, die Färbelösung nur so zu erwärmen, dass es zu keiner Blasenbildung kommen konnte. Nach jeweils kurzen Abkühlungsphasen wurde die Hitzefixierung insgesamt dreimal wiederholt. Nach einer abschließenden 10-minütige Abkühlungsphase wurde die Färbelösung von den Präparaten entfernt und die Objektträger kurz in Aqua dest. gewaschen. Durch mehrmaliges Eintauchen der Präparate in 0,5% HCl–70% Ethanol-Lösung wurden diese entfärbt. Ein kurzer Waschschritt in Aqua dest. folgte. Die Gegenfärbung wurde mit einer 1:10 verdünnten Methylenblau-Lösung für ca. 1 min durchgeführt. Nach einem erneuten Waschschritt in Aqua dest. wurden die Präparate bei Raumtemperatur getrocknet.
Bestimmung der Lebendkeimzahl von M. tuberculosis Komplex Stämmen
Möglichkeit 1:
Die Bestimmung der Lebendkeimzahl der bei –80°C gelagerten MTBK Aliquots erfolgte ca. eine Woche nach Einlagerung. Dazu wurden von jeweils 2 Aliquots pro Stamm Verdünnungsreihen angelegt und ausplattiert. Zunächst wurden die Bakterienzellen durch mehrmaliges Auf- und Abziehen (ca. 10×) mit einer 1 ml Spritze durch eine 26G-Kanüle vereinzelt. Anschließend wurden 1:10 Verdünnungen (bis einschließlich 10^–7) in mit 0,05% Tween 80 versetztem Braunwasser in einem Gesamtvolumen von 5 ml hergestellt. Sowohl von der unverdünnten als auch von den einzelnen Verdünnungsstufen wurden je 100 μl auf 7H10 Platten mit einem Zusatz von 10% Rinderserum ausgestrichen. Es sei darauf hingewiesen, dass jede 7H10 Platte halbiert und damit je zwei unterschiedliche Verdünnungsstufen pro Platte beimpft wurden. Zum Schutz vor Austrocknung wurden die Platten in Plastikfolie eingepackt. Die Inkubation erfolgte bei 37°C bakterienstamm – abhängig für 3–5 Wochen.
Möglichkeit 2:
Für die Bestimmung der Lebendkeimzahl der in murine Makrophagen wachsenden Keime wurden die Makrophagen lysiert und das Zelllysat durch mehrmaliges Auf- und Abziehen (ca. 10×) mit einer 1 ml Spritze durch eine 26G-Kanüle homogenisiert. Anschließend wurden 1:10 Verdünnungen (bis einschließlich 10^–3) in Flachboden-Mikrotiterplatten (96 Vertiefungen, Nunc) mit einem Gesamtvolumen von 250 μl hergestellt. Die Verdünnungsschritte erfolgten in mit 0,05% Tween 80 versetztem PBS-Puffer. Sowohl von den unverdünnten als auch von den einzelnen Verdünnungsstufen wurden jeweils 50 μl auf 7H10 Platten (10% OADC) ausgestrichen. Die 7H10 Platten waren in 4 Quadranten unterteilt.
Molekularbiologische Arbeiten
DNA-Arbeiten
Isolierung genomischer DNA aus M. tuberculosis Komplex Stämmen
Die Isolierung genomischer DNA erfolgte aus Zellen, die durch Zentrifugieren einer 5 ml Flüssigkultur oder alternativ durch überführen mit einer Impföse von einer LJ-Festkultur gewonnen wurden Zunächst wurden die Zellen in 400 μl TE-Puffer (Carl Roth) resuspendiert und für 20 min bei 80°C hitzeinaktiviert.
Zum Abbau der Zellwand wurde die Zellsuspension anschließend mit 50 μl Lysozym (10 mg/ml) versetzt und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Zum Lysat wurde ein Mix aus 10% SDS und 5 μl Proteinase K-Lösung (19,2 mg/ml) hinzugefügt und nach kurzem Vortexen für 10 min bei 65°C inkubiert. Im Anschluss wurden 100 μl 5 M NaCl und 100 μl CTAB-Lösung (vorgewärmt auf 65°C) zugefügt und für weitere 10 min bei 65°C inkubiert. In diesem Schritt wurden die im Lysat befindlichen Polysaccharide durch das CTAB komplexiert. Durch Zugabe von 750 μl Chloroform-Isoamyalkohol (24:1) und kurzem Vortexen wurde die DNA extrahiert. Die Phasentrennung erfolgte mittels Zentrifugation für 5 min bei 15000 rcf (Eppendorf 5430). In der oberen wässrigen Phase befand sich die DNA, die in ein neues Reaktionsgefäß überführt worden ist. Nach Zugabe von 0,6 Volumen (~450 μl) Isopropanol und vorsichtigem Schwenken wurde die DNA für 30 min bei –20°C gefällt. Ein weiterer Zentrifugationsschritt bei 15000 rcf für 15 min folgte. Der Überstand wurde verworfen und die DNA mit 500 μl 70% Ethanol gewaschen. Anschließend wurde die DNA erneut für 5 min bei 15000 rcf zentrifugiert und der Überstand sehr vorsichtig abgenommen. Das DNA Pellet wurde bei Raumtemperatur getrocknet und in 80 μl TE-Puffer gelöst.
Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR)

Für die Analyse der genomischen Diversität von MTBK Stämmen wurden 29 Gene für die spätere Sequenzanalyse amplifiziert. Der PCR Ansatz erfolgte unter einer DNA-freien Werkbank, die Zugabe der DNA hingegen außerhalb. Die PCR mit einem Gesamtvolumen von 25 μl setzte sich zusammen aus:

10×PCR-Puffer (Qiagen)			2,50 μl
25 mM MgCl₂ (Qiagen)			0,75 μl
20 μM F-Primer			1,25 μl
20 μM P-Primer			1,25 μl
10 mM dNTP-Mix (Roche)			0,50 μl
DMSO			1,25 μl
HotStarTaq^®DNA-Polymerase (Qiagen)			0,13 μl
H₂O (Carl Roth)			15,37 μl
DNA			2,00 μl

Von den eingesetzten DNAs (Referenzkollektion) wurden 1:50 Verdünnungen mit Aqua dest. für die PCR hergestellt. Eine Übersicht zu den analysierten Genen hinsichtlich Funktion, Gengröße, PCR-Fragmentlänge sowie der Annealing-Temperatur (T_a) befinden sich in der Tabelle unten. Die einzelnen Primersequenzen und deren Positionen sind in der obigen Tabelle zusammengefasst. Die PCR Reaktion erfolgte in einem MJ Research PTC-200^TM Thermocycler.

Auf einem intialen Inkubationschritt von 15 min bei 95°C zur Aktivierung der HotStarTaq^® DNA-Polymerase folgten 35 Zyklen nach folgendem Profil, wobei die Annealing-Temperatur und die Elongationszeit je nach Fragmentlänge variierte (siehe Tabelle):

Rv Nummer	Genname	Funktion/Produkt	Gesamtes Gen	Gen (bp)	PCR (bp)	T_a (°C)
Rv0288	esxH	10 kDa Antigen	X	291	788	62
Rv0388c	ppe9	unbekannt	X	543	713	64
Rv407	fgd1	Glucose-6-phosphate-dehydrogenase	X	1011	1606	62
Rv0410c	pknG	Proteinkinase G	X	2253	2620	68
Rv0557	mtfB	Mannosyltransferase	X	1137	1340	68
Rv0667	rpoB	RNA Polymerase (β-Untereinheit)	-	3519	158	62
Rv1009	rpfB	”Resusciation” Faktor B	X	1089	1360	62
Rv1483	fabG1	3-Oxoacyl-Reduktase	-	744	248	64
Rv1617	pykA	Pyruvatkinase	-	1419	315	64
Rv1811	mgtC	Mg²⁺ Transport P-type ATPase	X	705	880	62
Rv1884c	rpfC	”Resusciation” Faktor C	X	531	689	64
Rv1908	katG	Katalase-Peroxidase	-	2223	210	67
Rv1980c	mpt64	Antigen MPT64	X	687	858	60
Rv2032	acg	Nitroreduktase	X	996	1359	64
Rv2389c	rpfD	”Resusciation” Faktor D	X	465	836	62
Rv2428	ahpC	Alkyl-Hydroperoxid-Reduktase	-	588	237	66
Rv2430c	ppe41	Antigen	X	585	796	64
Rv2431c	pe25	Antigen	X	300	649	64
Rv2450c	rpfE	”Resusciation” Faktor D	X	519	938	62
Rv2609c	-	Membranprotein	X	1056	1314	66
Rv2610c	pimA	Mannosyltransferase	X	1137	1302	66
Rv2611c	-	Acyltransferase	X	951	1175	66
Rv2612c	pgsA1	Phosphatidyl-Inositol-Synthase	X	654	815	66
Rv2613c	-	Phosphorylase	X	588	830	66
Rv2628	-	Antigen	X	363	521	62
Rv2629	-	hypothetisches Protein	X	1125	1575	64
Rv2946c	pks1/15	Polyketidsynthase	-	1616	144	64
Rv3547	-	F420-abhängige Nitroreduktase	X	456	846	64
Rv3696c	glpK	Glycerolkinase	-	517	240	64

Agarosegelelektrophorese
Alle PCR Produkte wurden mittels Gelektrophorese überprüft. Für ein 1% Agarosegel wurden 1 g UltraPure^TM Agarose in 100 ml 1×TAE-Puffer durch Aufkochen gelöst. Unter einem Abzug wurden 10 μl einer 1% Ethidiumbromid-Lösung unter Rühren zur gelösten Agarose hinzugefügt und in eine Gelvorrichtung luftblasenfrei gegossen. Nach ca. 20 Minuten Abkühlung wurde das feste Agarosegel in eine Elektrophoresekammer überführt und die mit Schwerepuffer gemischten PCR-Proben aufgetragen.
Dazu wurden jeweils 3 μl Schwerepuffer mit 2 μl PCR-Produkt gemischt. Als Laufpuffer in der Elektrophoresekammer wurde 1×TAE-Puffer verwendet. Ein Größenstandard (100 bp DNA Leiter, Carl Roth) wurde immer mitgeführt. Die Gelelektrophorese wurde bei einer konstanten Spannung von –120 Volt für 30–45 min durchgeführt. Danach konnten die PCR Banden unter UV-Licht sichtbar gemacht werden.
Aufreinigung von PCR-Produkten mittels ExoSAP – Methode für die Sequenzanalyse
Die Aufreinigung der PCR Produkte (Abbau von überschüssigen Desoxynukleotiden und Primern) erfolgte mit Hilfe der Exonuklease I aus E. Coli und der Alkalischen Phosphatase aus Schrimps.
Zunächst wurde von der Exonuklease I (20 U/μl) eine 1:20 Verdünnung hergestellt. Dazu wurden 5 μl Exonuklease I mit 85 μl TE-Puffer (pH 7,5) und 10 μl Glyzerin (87%) vermischt. Der Aufreinigungsansatz setzte sich zusammen aus:

PCR-Produkt 5 μl

Exonuklease I (1 U/μl) 1 μl

Alkalische Phosphatase (1 U/μl) 1 μl
Der Aufreinigungsansatz wurde in einem Thermocycler 30 min bei 37°C inkubiert und anschließend zur Inaktivierung der Enzyme für 15 min auf 80°C erhitzt. Das PCR Produkt konnte nun für die folgende Sequenzreaktion verwendet werden.
Sequenzreaktion
Für die Sequenzreaktion wurde das BigDye^® Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit (ABI) mit dem entsprechenden Sequenzierungspuffer verwendet. Ein 20 μl Standardansatz erhielt folgende Komponenten:

Aqua dest. (Carl Roth) 14,0 μl

Sequenzierungspuffer (ABI) 3,5 μl

Primer (10 μM) 0,5 μl

BigDye^® (ABI) 1,0 μl

Aufgereinigtes PCR Produkt 1,0 μl
Alle in dieser Arbeit analysierten Gene wurden mit den in der Primertabelle aufgelisteten F- und R-Primern sequenziert. Bei großen Genen wurden zusätzliche Sequenzierprimer (S-Primer) benötigt. Die Sequenzreaktion erfolgte in einem MJ Research PTC-200^TM Thermocycler:
Aufreinigung der Sequenzansätze und Sequenzierung
Die Aufreinigung der Sequenzansätze erfolgte mittels MultiScreen^®-HV Filtrationsplatten, die mit Matrizes aus illustra^TM Sephadex G50 beladen wurden. Dazu wurde die benötigte Menge an Sephadex mit einer Dosierungsplatte abgemessen und in die Filtrationsplatte überführt. Anschließend wurden 300 μl Aqua dest (Carl Roth). zu jeder mit Sephadex befüllte Filtrationseinheit hinzugegeben. Zum Aufquellen des Sephadex wurde die Platte für ca. 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die Filtrationsplatte mit Hilfe eines Fixierrahmens auf eine Auffangplatte gelegt und für 5 min bei 920 rcf (Rettich Universal 32R) zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen und die Platte auf eine neue Mikrotiterplatte (96 Vertiefungen) überführt. Anschließend wurden 10 μl des Sequenzansatzes mittig auf die Sephadexmatrix gegeben. Ein erneuter Zentrifugationsschritt für 5 min bei 920 rcf folgte. Für die automatische Kapillargelektrophorese wurden 4 μl des aufgereinigten Sequenzansatz in 15 μl Formamid (ABI) in einer „MicroAmp^® Optical 96well Reaction Plate” überführt. Die Analyse erfolgte entsprechend den Instruktionen des Herstellers am ABI PRISM^® 3130xl Genetic Analyzer.
Sequenzanalyse
Zur Analyse der Sequenzdaten wurde die SegScape Software v.2.6 verwendet (Applied Biosystems, Darmstadt). Die BioNumerics Software v.5.1 (Applied Math, Sint Martens Latem, Belgien) ermöglichte die phylogenetische Auswertung.
Ergebnisse
Genetische Diversität von M. tuberculosis Komplex Stämmen
Zur Analyse der genetischen Diversität von MTBK Stämmen wurde eine umfangreiche Sequenzanalyse von 29 Genen in 58 klinischen Isolaten sowie von den H37Rv, Bovis ATCC und Africanum ATCC Referenzstämmen durchgeführt. Die Auswahl der Stämme basierte auf einer phylogenetischen Klassifizierung, so dass die Referenzkollektion repräsentive Vertreter der weltweit am häufigsten vorkommenden Spezies und Genotypen der Gruppe 1 und 2 bzw. der durch Gagneux et al. definierten 6 Hauptlinien umfasste (1).
Ein Teil der Ergebnisse der Sequenzanalysen sind im Rahmen eines Kooperationsprojekts mit S. Gagneux (MRC London) erarbeitet worden und in einer gemeinsamen Veröffentlichung (Hershberg et al. 2008) beschrieben.
Von fast allen Stämmen (Ausnahme 8885/03 Rv2431c Gen) konnten alle 29 Gene amplifiziert und sequenziert werden. Insgesamt wurden Sequenzdaten mit einer Gesamtgröße von 18598 bp/Stamm generiert, was ca. 0,42% des mykobakteriellen Gesamtgenoms (~4,4 Mbp) entspricht. Alle DNA-Sequenzen wurden, sofern nicht anders angegeben, mit der H37Rv Referenzsequenz verglichen, um Sequenzvariationen (SNPs oder LSPs) zu bestimmen.
Insgesamt ergab die Analyse 148 Sequenzvariationen, wobei resistenz – assoziierte Mutationen nicht gewertet wurden. Daraus resultiert eine Mutationsrate von 7,96 × 10^–3/bp. Von den 148 Mutationen traten 44 bei den hoch diversen M. canettii Isolaten auf, woraus sich für M. canettii Stämme eine deutlich höhere Mutationsrate/bp von 5,6 × 10^–3 ergibt. Die hier analysierten M. canettii Stämme weisen also untereinander im Durchschnitt 15 Sequenzveränderungen auf, während für die restlichen MTBK Stämme eine durchschnittliche Variabilität von 2 Sequenzvariationen gezeigt werden konnte.
Um einen ersten Eindruck über den Nutzen der gefundenen Sequenzvariationen für eine phylogenetische Stammklassifizierung zu bekommen, wurde basierend auf den Sequenzdaten ein phylogenetischer Baum berechnet (2). In dem sequenzbasierten Stammbaum spiegelt sich die gruppen- und linienspezifische Einteilung sowie die klare Abgrenzung einzelner Genotypen entsprechend der auf klassischen Stammtypisierungsdaten basierenden Gruppierung wider (Vergeich 1 und 2). Allerdings deutet sich an, dass EAI Stämme eine eigene Gruppe (Gruppe 3) bilden und sich von der phylogenetischen Gruppe 2 abgrenzen.
Von den 148 nachgewiesenen Mutationen waren 45 genotypspezifisch und 12 genotypübergreifend. Diese Sequenzveränderungen können somit zur Identifizierung größerer phylogenetischer Gruppen verwendet werden (3). 91 der beschriebenden Mutationen traten nur in einem oder zwei der untersuchten Stämmen des jeweiligen Genotyps auf. Interessanterweise konnten für fast alle Genotypen mit Ausnahme von M. pinnipedii und M. microti sowie M. tuberculosis Uganda und X-type Stämmen mindestens eine definierende Sequenzvariation identifiziert werden. M. pinnipedii und M. microti sind üblicherweise tierpathogen und infizieren nur selten Menschen, so dass die praktische Bedeutung gering ist. M. tuberculosis Uganda und X-type Stämme sind genetisch und phänotypisch eng verwandt. Damit können mehr als 99% aller Infektionen mit MTBC-Erregern mit dem erfindungsgemäßen Verfahren diagnostiziert werden. Eine weitere Differenzierung kann, wenn nötig, mit im Stand der Technik bekannten Verfahren stattfinden.
Am häufigsten zeigten M. canettii Stämme genotypspezifische Veränderungen (14/45), gefolgt von M. africanum West African 1 (9/45) und West African 2 (5/45) Isolaten (3). Die Analyse der M. africanum Stämme ergab außerdem viele Mutationen, die ebenfalls in einigen tierpathogenen Spezies identifiziert werden konnten. Unter den tierpathogenen Erregern zeigten M. bovis und M. caprae Isolate insgesamt 3 gemeinsame SNPs. Für M. pinnipedii und M. microti Stämme konnten ebenfalls 3 gemeinsame Mutationen detektiert werden. (3). Insgesamt wurden für M. bovis und M. caprae nur eine bzw. zwei genotypspezifische Veränderungen nachgewiesen, während für M. pinnipedii und M. microti keine genotypspezifischen Mutationen in den hier analysierten Genen gefunden wurden.

Von den insgesamt 57 phylogenetisch informativen Mutationen waren 37 nicht-synonym und haben somit eine potentielle funktionelle Bedeutung. Daraus ergibt sich eine Rate von nicht-synonymen zu synonymen Mutationen von 1,85. Unter Ausschluss von M. canettii Stämmen wurden 40 genotypassozierte Sequenzvariationen, von denen 30 zu einer Veränderung in der Aminosäuresequenz führten, nachgewiesen. Das Verhältnis von nicht-synonymen zu synonymen Mutationen erhöhte sich dadurch auf einen Wert von 3. Tebelle: Übersicht der genotypspezifischen Mutationen

Nr.	Rv-Nummer	Codon	Basenaustausch
1	Rv0288	A71S	Gcg>Tcg
2	Rv0407	K296E	Aag>Gag
3	Rv0407	K270M	aAg>aTg
4	Rv0410c	A665T	Gcc>Acc
5	Rv0410c	T736K	aCg>aAg
6	Rv0410c	Codon 614	tcG>tcA
7	Rv0557	T74M	aCg>aTg
8	Rv0557	G304D	gGc>gAc
9	Rv0557	R178G	Cgg>Ggg
10	Rv0557	2356S	Ccg>Tcg
11	Rv0557	Codon 350	gtG>gtA
12	Rv0557	Codon 270	gcC>gcT
13	Rv0557	R152P	cGc>cCc
14	Rv0557	L153V	Ctg>Gtg
15	Rv1009	A357V	gCA>gTA
16	Rv1009	E275D	gaG>gaC
17	Rv1009	L345Q	cTg>cAg
18	Rv1009	Codon 346	cgT>cgC
19	Rv1483	-	G>A –102
20	Rv1811	A107V	gCc>gTc
21	Rv1811	Codon 15	gtC>gtT
22	Rv1811	R182H	cGc>cAc
23	Rv1811	Codon 80	atC>atT
24	Rv1884c	H2Y	Cat>Tat
25	Rv1980c	I43N	aTt>aAt
26	Rv1980c	M45T	aTg>aCg
27	Rv2032	Codon 62	ggG>ggC
28	Rv2032	A34S	Gcc>Tcc
29	Rv2428	-	G>A –88
30	Rv2450c	Codon 17	Ttg>Ctg
31	Rv2450c	T20R	aCg>aGg
32	Rv2450c	Codon 105	gcG>gcA
33	Rv2450c	Codon 139	ggG>ggA
34	Rv2611c	Codon 262	taT>taC
35	Rv2612c	S2N	aGc>aAc
36	Rv2613c	Codon 6	cgC>cgT
37	Rv2628	A96T	Gcg>Acg
38	Rv2628	Codon 26	atA>atC
39	Rv2628	S49A	Tcc>Gcc
40	Rv2629	D64A	gAt>gCt
41	Rv2629	2322L	cCg>cTg
42	Rv3547	Codon 48	ctG>ctT
43	Rv3547	D113N	Gac>AaC
44	Rv3547	Codon 69	gaC>gaT
45	Rv3547	Codon 148	gtT>gtC
46	Rv0407	Codon 320	ttT>ttC
47	Rv0410c	Codon 69	ccG>ccA
48	Rv0557	Codon 107	ggT>ggC
49	Rv1009	G282E	gGA>gAa
50	Rv1009	Codon 245	ggC>ggT
51	Rv1617	E220D	gaG>gaT
52	Rv2032	P318L	cCA>cTA
53	Rv2946c	-	7 bp Deletion
54	Rv2946c	-	6 bp deletion
55	Rv2628	S59L	tCg>tTg
56	Rv2628	L83W	tTg>tGg
57	Rv3547	L90V	Ctc>Gtc

Betrachtet man alle gefundenen Sequenzveränderungen, konnten insgesamt 87 Mutationen mit funktioneller Bedeutung und 61 synonyme Variationen detektiert werden. Daraus ergibt sich eine Rate von nicht-synonymen zu synonymen Mutationen von 1,43. M. canettii Stämme zeigten 44 Mutationen, während alle restlichen MTBK Isolate 104 Sequenzveränderungen aufwiesen. Von den 104 detektierten Mutationen führten 68 zu einer Veränderung in der Aminosäuresequenz, 36 Mutationen hatten keine funktionelle Bedeutung. Daraus ergab sich ein Verhältnis von nicht synonymen zu synonymen Variationen von 1,89. Im Gegensatz dazu wurden für M. canettii Stämme 19 funktionelle Mutationen und 25 synonyme Veränderungen in den hier untersuchten Genen nachgewiesen. Daraus ergibt sich eine für M. canettii spezifische Rate von nicht-synonymen zu synonymen Mutationen von 0,76.
Basierend auf den durchgeführten Sequenzanalysen konnte ein neues Verfahren zur Differenzierung der wichtigsten phylogenetischen Gruppen des MTBKs durch Analyse von nur 5 Genen (Rv0557, Rv1811, Rv2628, Rv2629, Rv2946c) erarbeitet werden. Durch das Vorhandensein bestimmter Sequenzvariationen können fast alle hier untersuchten Genotypen eindeutig klassifiziert werden. Ein Ablaufschema ist in 4 dargestellt. Es zeigt ein Verfahren zur Differenzierung von Stämmen des MTBKs basierend auf Sequenzvariationen. Die Klassifizierung erfolgt nach dem Ausschlussprinzip bestimmter Mutationen in den entsprechenden Genen.
Im Folgenden werden die Sequenzierergebnisse detailliert beschrieben. Hierbei werden Mutationen als Aminosäureaustausch im Einbuchstabencode mit entsprechenden, mittig zentrierten Codon angegeben. Bei synonymen Mutationen wird nur der Basenaustausch im Triplettcode dargestellt. Alle Analysen wurden, sofern nicht anders angegeben, im Vergleich zur H37Rv Referenzsequenz durchgeführt. Ausnahme ist der Polymorphismus in Rv2946c pk15/1, da hier die Referenzsequenz ohne Deletion M. tuberculosis Beijing ist. Die Genangabe bezieht sich auch hier auf H37Rv, das hier jedoch selbst eine Deletion trägt.
Mutationen in Zellwand-assoziierten Genen
Im Rahmen der Erfindung wurde die Referenzkollektion auf Mutationen in Zellwand assoziierten Genen im Vergleich zu der H37Rv Referenzsequenz analysiert. An der Synthese von Lipoarabinomanan (LAM), einen ubiquitären Bestandteil der mykobakteriellen Zellwand, und dessen Vorläufermolekülen Lipomanan (LM) und Phosphatidylinositolmannosid (PIM) sind u. a. Gene des pimA-Operons (Rv2609c–Rv2613c) beteiligt. Für alle Stämme der Referenzkollektion konnten Sequenzdaten generiert werden, die in Tabelle 1 zusammengefasst sind.
In den fünf untersuchten Genen konnten insgesamt neun Sequenzveränderungen nachgewiesen werden, von denen fünf phylogenetisch informativ waren. Vier weitere Mutationen traten in einem bzw. zwei der analysierten Stämme des jeweiligen Genotyps auf (Tab. 1). Unter den neun beschriebenden Sequenzvariationen führten sechs zu einer veränderten Aminosäuresequenz.
Alle analysierten M. africanum Stämme des West African 2 Genotyps zeigten eine synonyme Veränderung in Codon 262 des Rv2611c Gens (taT>taC). Zusätzlich konnte hier eine H37Rv spezifische Variante nachgewiesen werden. Im Gegensatz zur H37Rv Wildtypsequenz wiesen alle klinischen Isolate und die Bovis ATCC bzw. Africanum ATCC Referenzstämme Mutationen in Codon 102 (I102M, atA>atG) sowie in Codon 197 (S197C, tCt>tGt) auf, welche nicht explizit in der Tabelle 1 erwähnt werden. Ein M. tuberculosis Beijing Stamm zeigte einen tCT>tGC Austausch in Codon 197 (S197C).

In allen M. tuberculosis EAI Stämmen konnte eine funktionelle Mutation im Rv2612c Gen detektiert werden (S2N, aGc>aAc). Ein weiterer synonymer SNP wurde für alle M. tuberculosis Dehli/CAS Stämme im Rv2613c Gen identifiziert (Codon 6, cgC>cgT). Neben den genotypspezifischen Varianten wiesen einige Stämme zusätzlich stammspezifische Mutationen auf, die in Tabelle 1 zusammengefasst sind. Tab. 1 Mutationen im pimA-Operon.

Genotyp	N	Rv2609c (%)	Rv2610c (%)	Rv2611c (%)	Rv2612 c (%)	Rv2613c (%)
H37Rv ATCC	1	-	-	-	-	-
Bovis ATCC	1	-	-	-	-	-
Africanum ATCC	1	-	-	-	-	-
Haarlem	3	-	-	-	-	-
Uganda I	3	-	-	-	-	-
Uganda II	3	-	-	-	-	-
Ghana/TB1	3	-	-	-	-	-
Cameroon	4	-	-	-	-	-
LAM	3	-	-	-	-	-
S-type	3	-	-	-	-
X-type	3	-	-	-	-	-
Dehli/CAS	2	-	-	-	-	Codon 6, cgC>cgT (100%)
EAI	3	M99T (33,3%)	-	Codon 210, cC>gcG (33,3%)	S2N (100%)	-
Beijing	6	-	-	-	-	-
West African 1a	3	-	-	-	-	-
West African 1b	3	-	-	-	-	-
West African 2	3	-	-	Codon 262, taT>taC (100%)	-	-
M. pinnipedii	2	-	-	-	-	-
M. bovis	3	-	-	-	-	-
M. caprae	3	-	-	-	-	F117V (66,6%); M35L (66,6%)
M. microti	2	-	-	-	-	-
M. canettiii	3	-	-	-	-	-

Die H37Rv spezifischen Varianten in Rv2611c sind nicht explizit dargestellt. N: Anzahl der untersuchten Stämme.
Die Sequenzanalyse einer weiteren Mannosyltransferase pimB (Rv0557) ergab insgesamt acht genotypspezifische Mutationen, wovon 6 einen Aminosäureaustausch bedingten (Tab. 2). So zeigten alle M. tuberculosis Haarlem Stämme eine Mutation in Codon 152 (R152P; cGc>cCc), während alle Cameroon Isolate eine Veränderung in Codon 178 trugen (R178G; Cgg>Ggg). M. tuberculosis S-type Stämme wiesen einen Leucin zu Valin Austausch in Codon 153 auf (L153V; Ctg>Gtg). Für alle M. africanum West African 1 Stämme könnten gleich zwei genotypspezifische Mutationen identifziert werden (T74M, aCg>aTg; G304D, gGc>gAc). M. canettii Isolate zeigten eine genotypspezifische Variation in Codon 356 (P356S, Ccg>Tcg).
In M. tuberculosis EAI Stämmen wurde eine nicht-funktionelle Veränderung in Codon 270 (gcC>gcT) nachgewiesen. Eine weitere synonyme, genotypspezifische Variation zeigten alle M. caprae Isolate (Codon 350, gtG>gtA).

Zusätzlich wurde in Rv0557 auch eine genotypübergreifende Mutation nachgewiesen. Die in Codon 107 beschriebene Veränderung (Tab. 2) trat in allen tierpathogenen Stämmen sowie in allen M. africanum und M. canettii Isolaten auf. Weiterhin wiesen diese Mutation auch alle M. tuberculosis Beijing, EAI und Dehli/CAS Stämme auf, so dass über diesen phylogenetischen Marker die „Euro-American” Linie definiert werden kann. Eine Vielzahl von weiteren nur in einzelnen Stämmen gefundenen Mutationen sind ebenfalls in Tabelle 2 zusammengefasst. Tab. 2 Mutationen in pimB (Rv0557)

Genotyp	N	pimB-Rv0557 (%)
H37Rv ATCC	1	-
Bovis ATCC	1	Codon 107, ggT>ggC (100%)
Africanum ATCC	1	Codon 107, ggT>ggC (100%); R148P (100%); H149P (100%)
Haarlem	3	R152P (100%)
Uganda I	3	Codon 315, acC>acT (33,3%)
Uganda II	3	-
Ghana/TB1	3	-
Cameroon	4	R178G (100%)
LAM	3	-
S-type	3	L153V (100%)
X-type	3	-
Dehli/CAS	2	Codon 107, ggT>ggC (100%)
EAI	3	Codon 107, ggT>ggC (100%); Codon 270, gcC>gcT (100%)
Beijing	6	Codon 107, ggT>ggC (100%)
West African 1a	3	T74M (100%); Codon 107, ggT>ggC (100%); G304D (100%)
West African 1b	3	T74M (100%); Codon 107, ggT>ggC (100%); G304D (100%)
West African 2	3	Codon 107, ggT>ggC (100%)
M. pinnipedii	2	Codon 107, ggT>ggC (100%)
M. bovis	3	Codon 107, ggT>ggC (100%)
M. caprae	3	Codon 107, ggT>ggC (100%); Codon 350, gtG > gtA (100%)
M. microti	2	Codon 107, ggT>ggC (100%)
M. canettiii	3	A87T (66,6%); Codon 107, ggT>ggC (100%); P356S (100%), Codon 5, cgC>cgT (33,3%)

N: Anzahl der untersuchten Stämme

Mutationen in Reaktivierungsgenen (resusciation factors)
Ein besonderes Merkmal des Tuberkuloseerregers ist der Übergang in einen metabolisch inaktiven Zustand (Dormancy). An der Reaktivierung sind Reaktivierungsfaktoren beteiligt, die durch fünf sogenannte rpf Gene (rpfA–rpfE, resusciation promoting factor) kodiert werden. Im Rahmen der Erfindung wurden Sequenzdaten für rpfE (Rv1009), rpfC (Rv1884c), rpfD (Rv2389c) sowie rpfE (Rv2450c) erhoben und hinsichtlich genotypspezifischer Variationen analysiert. Alle im Folgenden beschriebenen Sequenzdaten sind in Tabelle 3 zusammenfassend dargestellt.
Insgesamt konnten 24 Mutationen, von denen 11 phylogenetisch informativ waren, identifiziert werden. Dreizehn weitere Mutationen wurden nur in einzelnen Isolaten gefunden. Von den 24 Mutationen führten 17 zu einer veränderten Aminosäuresequenz. Im rpfB Gen (Rv1009) konnten vorrangig Mutationen in den tierpathogenen Isolaten nachgewiesen werden. Alle M. bovis und M. caprae Stämme zeigten einen Glycin zu Glutaminsäure Austausch in Codon 282 (gGa>gAa). Genotypübergreifende Mutationen konnten auch für M. microti und M. pinnipedii detektiert werden (Codon 245, ggC>ggT). Weiterhin zeigten M. bovis Stämme eine genotypspezifische Veränderung in Codon 357 (A357V, gCa>gTa). In M. canettii Isolaten konnten drei Veränderungen in Rv1009 nachgewiesen werden (E275D, gaG>gaC; L345Q; cTg>cAg; Codon 346, cgT > cgC).
Die Analyse des rpfC Gens (Rv1884c) ergab weitaus weniger Variationen. Alle M. canettii Stämme zeigten eine genotyp spezifische, funktionelle Mutation in Codon 2 (H2Y, Cat>Tat).
Weitere nur in einzelnen Stämmen gefundene Mutationen sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Im rpfD Gen (Rv2389c) wurden nur 2 stammspezifische Mutationen detektiert. Ein M. canettii Stamm zeigte eine Deletion von Codon 1–48. Ein weiterer M. tuberculosis Haarlem Stamm wies eine stille Mutation in Codon 114 auf (ggC>ggA).

Die Analyse des rpfE (Rv2450c) Gens ergab für alle klinischen Isolate sowie für alle Referenzstämme eine Mutation in Codon 126 (R126Q, cGg>cAg), was auf eine fehlerhafte Sequenzannotation im H37Rv Genom schlussfolgern lässt und daher nicht explizit in Tabelle 3 erwähnt wird. Zusätzlich konnten genotyp- und stammspezifische Mutationen detektiert werden. So zeigten alle M. africanum West African 1 Stämme einen synonymen SNP in Codon 17 (Ttg>Ctg). Weitere stille Mutationen konnten für alle M. canettii Isolate in Codon 105 (gcG>gcA) und in Codon 139 (ggG>ggA) beschrieben werden. Einen genotypspezifischen, funktionellen SNP (T20R, aCg>aGg) zeigten alle Beijing Isolate. Tab. 3 Mutationen in rpf Genen

Genotyp	N	Rv1009 (%)	Rv1884c (%)	Rv2389c (%)	Rv2450c (%)
H37Rv ATCC	1	-	-	-	-
Bovis ATCC	1	G282E (100%); A357V (100%)	-	-	-
Africanum ATCC	1	-	-		-
Haarlem	3	-	-	Codon 114 ggC>ggA (33,3%)	-
Uganda I	3	-	-	-	L8P (33,3%)
Uganda II	3	-	-	-	-
Ghana/TB1	3	T39A (33,3%)	-	-	-
Cameroon	4	-		-	-
LAM	3	-	H16R (66,6%)	-	A90V (33,3%)
S-type	3	-	I158S (33,3%)	-	-
X-type	3	-	-	-	I115V (66,6%); G169V (33,3%); R170C (33,3%)
Dehli/CAS	2	-	-	-	-
EAI	3	-	-	-	-
Beijing	6	-	-	-	T20R (100%)
West African 1a	3	-	-	-	Codon 17 Ttg>Ctg (100%)
West African 1b	3	-	-	-	Codon 17 Ttg>Ctg (100%)
West African 2	3	-	Codon 30 acT>acG (33,33%)	-	-
M. pinnipedii	2	Codon 245 ggC>ggT (100%)	-	-	-
M. bovis	3	G282E (100%); A357V (100%)	-	-	-
M. caprae	3	I46V (33,3%); G282E (100%); Codon 211 CGTC Insertion (33,3%)	-	-	-
M. microti	2	Codon 245 ggC>ggT (100%)	-	-	-
M. canettii	3	E275D (100%); L345Q (100%); Codon 346 cgT>cgC (100%)	H2Y (100%)	Deletion Codon 1–48 (33,3%)	Codon 105 gcG>gcA (100%); Codon 139 ggG>ggA (100%)

N: Anzahl der untersuchten Stämme

Mutationen in Stoffwechselgenen
Keating et al. zeigten 2005 in einer umfangreichen Studie, dass die genetische Ursache für ein Pyruvat – abhängiges Wachstum bestimmter MTBK Stämme auf Mutationen im glpK (Rv3696c) und im pykA (Rv1617) Gen zurückzuführen sind. Zur Detektion weiterer, genotypspezifischer Variationen innerhalb des MTBKs wurden Sequenzanalysen von den publizierten Regionen in glpK und pykA durchgeführt.
Bei der Analyse des glpK Gens ergab sich, dass der Nachweis der G-Insertion in Codon 191 in klinischen Isolaten nicht M. bovis, M. microti und M. africanum spezifisch ist. Zum Beispiel zeigten nur 2 von 3 klinischen M. bovis Isolaten eine G-Insertion. Ein ähnliches Bild ergab sich für M. pinnipedii und M microti Stämme. Jeweils ein klinisches Isolat zeigte eine G-Insertion in Codon 191, ein anderes entsprach jedoch der H37Rv Wildtypsequenz. G-Insertionen konnten auch für einige M. africanum West African 1 und West African 2 Stämme, für Africanum ATCC sowie für einen M. caprae Stamm detektiert werden. Die Analyse ergab außerdem für zwei Stämme eine G-Deletion in Codon 190 (M. africanum West African 1b und West African 2). Zusätzlich zeigten fast alle M. africanum West African 1 Stämme sowie ein M. caprae Isolat eine synonyme Mutation in Codon 208 (taG>taA). Alle Ergebnisse sind in Tab. 4 zusammengefasst.
Sequenzdaten des 315 bp Bereichs im pykA Gen konnten für alle Stämme der Referenzkollektion erhoben werden. Dabei entsprachen alle M. tuberculosis und M. canettii Stämme der H37Rv Referenzsequenz. M. africanum Isolate und alle tierpathogenen Stämme hingegen zeigten die von Keating et al. beschriebene, funktionelle Mutation in Codon 220 (E220D, gaG>gaT), die demnach für alle Stämme mit einer RD9 Deletion spezifisch ist. Einzige Ausnahme stellte dabei der Bovis ATCC Stamm dar. Codon 220 zeigte hier einen gaG>gaA Austausch und hatte damit keine funktionelle Bedeutung (Tab. 5)
Manjunatha et al. beschrieben 2006 im Zusammenhang mit dem Resistenzerwerb gegenüber dem neuen, zurzeit in klinischen Studien getesteten Antituberkulotikum PA-824 ein weiteres mykobakterielles Enzym (fgd1, Rv0407) von diagnostischer Bedeutung. Rv0407 kodiert für eine Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase, die für den Abbau von Glukose über den Pentosephosphatweg verantwortlich ist. Die Sequenzanalyse (Tab. 5) ergab eine synonyme Veränderung in Codon 320 (ttT>ttC) in allen tierpathogenen, M. africanum und M. canettii Stämmen. Da diese Mutation auch zusätzlich in allen M. tuberculosis Beijing, EAI und Dehli/CAS Stämmen nachgewiesen wurde, definiert dieser phylogenetische Marker die nach Gagneux et al. Beschriebene „Euro-American” Linie. Genotypspezifische Variationen konnten für M. tuberculosis Haarlem und M. africanum West African 2 detektiert werden. Klinische Isolate des Haarlem Genotyps zeigten eine aAg>aTg Mutation in Codon 270, die in einem Aminosäureaustausch resultiert (K270M).

Alle M. africanum West African 2 Stämme trugen einen funktionellen SNP in Codon 296 (K296E, Rag>Gag). Auch in Rv407 konnten weitere in einzelnen Stämmen vorliegende Variationen nachgewiesen werden, die in Tab. 5 zusammengefasst sind. Tab. 4 Mutationen in glpK (Rv3696)

Stammnummer	N	glpK-Rv3696 (%)
H37Rv ATCC	1	-
Bovis ATCC	1	Codon 191 G-Insertion (100%)
Africanum ATCC	1	Codon 191 G-Insertion (100%)
Haarlem	3	Codon 191 G-Insertion (33,3%)
Uganda I	3	-
Uganda II	3	-
Ghana/TB1	3	-
Cameroon	4	-
LAM	3	-
S-type	3	-
X-type	3	-
Dehli/CAS	2	-
EAI	3	-
Beijing	6	-
West African 1a	3	Codon 191 G-Insertion (33,3%); Codon 208 taG>taA (100%)
West African 1b	3	Codon 190 G-Deletion (33,3%); Codon 191 G-Insertion (33,3%); Codon 208 taG>taA (66,6%)
West African 2	3	Codon 190 G-Deletion (33,3%); Codon 191 G-Insertion (33,3%)
M. pinnipedii	2	Codon 191 G-Insertion (50%)
M. bovis	3	Codon 191 G-Insertion (66,6%)
M. caprae	3	Codon 191 G-Insertion (33,3%); Codon 208 taG>taA (33,3%)
M. microti	2	Codon 191 G-Insertion (50%)
M. canettii	3	-

N: Anzahl der untersuchten Stämme Tab. 5 Mutationen in pykA (Rv1617) und in fgd1 (Rv0407)

Genotyp	N	pykA-Rv1617 (%)	fgd1-Rv0407 (%)
H37Rv ATCC	1	-	-
Bovis ATCC	1	Codon 220 gaG>gaT (100%)	Codon 320 ttT>ttC (100%)
Africanum ATCC	1	E220D (100%)	Codon 320 ttT>ttC (100%); K296E (100%)
Haarlem	3	-	K270M (100%)
Uganda I	3	-	-
Uganda II	3	-	-
Ghana/TB1	3	-	-
Cameroon	4	-	-
LAM	3	-	-
S-type	3	-	-
X-type	3	-	-
Dehli/CAS	2	-	Codon 320 ttT>ttC (100%); Codon 234 tcC>tcT (50%)
EAI	3	-	Codon 320 ttT>ttC (100%)
Beijing	6	-	Codon 320 ttT>ttC (100%)
West African 1a	3	E220D (100%)	Codon 320 ttT>ttC (100%); Cdon 271 gcC>gcT (66,6%)
West African 1b	3	E220D (100%)	Codon 320 ttT>ttC (100%)
West African 2	3	E220D (100%)	Codon 320 ttT>ttC (100%); K296E (100%); G145A (33,3%)
M. pinnipedii	2	E220D (100%)	Codon 320 ttT>ttC (100%)
M. bovis	3	E220D (100%)	Codon 320 ttT>ttC (100%)
M. caprae	3	E220D (100%)	Codon 320 ttT>ttC (100%)
M. microti	2	E220D (100%)	Codon 320 ttT>ttC (100%)
M. canettii	3	-	Codon 320 ttT>ttC (100%); M208I (33,3%)

N: Anzahl der untersuchten Stämme

Mutationen in Antigenen
Zur Analyse der genetischen Diversität des MTBKs in Antigenen wurden beispielhaft Sequenzdaten für das 10kDa Antigen esxH (Rv0288) sowie Antigen mpt64 (Rv1980c) erhoben. Beide Gene zeigten wenige Variationen.
Im Rv0288 Gen konnte eine genotypspezifische, funktionelle Mutation in Codon 71 (A71S, Gcg>Tcg) für alle M. africanum West African 2 Stämme sowie im Africanum ATCC Stamm detektiert werden. Ein M. tuberculosis EAI Stamm zeigte einen nicht-synonymen SNP in Codon 9 (P9S, Ccc>Tcc). Alle anderen klinischen Isolate entsprachen der H37Rv Referenzsequenz.
Im Rv1980c Gen konnte eine M. africanum West African 1 genotypspezifische Mutation (I43N, aTt>aAt) nachgewiesen werden.
Weiterhin konnte für alle M. canettii Stämme ein Aminosäureaustausch in Codon 45 detektiert werden (M45T, aTg>aCg). Die Sequenzanalyse aller anderen Stämme ergab die H37Rv Referenzsequenz.
Mutationen in pE und ppE Genen
Abdallah et al. zeigten 2006, dass PPE41/PE25 (Rv2430c-2431c) sekretiert wird und immunmodulatorisch wirkt. Die Sequenzanalyse von Rv2430c (ppe41) und Rv2431c (pe25) ergab keine genotypspezifischen Sequenzvariationen innerhalb des MTBKs. In Rv2430c zeigten 2 der M. tuberculosis EAI Stämme eine synonyme Mutation in Codon 59 (ccA>ccT). Eine 112 bp Deletion (Codon 2–Codon 39) konnte in einem M. tuberculosis LAM Stamm beschrieben werden. Für einen M. microti Stamm wurde eine funktionelle Variante in Codon 48 (T48P, Acg>Ccg) identifiziert.
Die Analyse des Rv2431c Gens ergab eine Mutation in Codon 40 (R40P, cGg>cCg) in einem M. bovis Isolat. Für den M. tuberculosis LAM Stamm mit der 112 bp Deletion in Rv2430c konnten keine Sequenzdaten generiert werden. Alle anderen klinischen Isolate entsprachen der H37Rv Referenzsequenz.
Ein weiteres in die Sequenzanalyse mit einbezogene ppE Gen (Rv0388c, ppe9) wies ebenfalls wenige Variationen auf. M. bovis Stämme sowie 2 der M. caprae Stämme zeigten eine Mutation in Codon 142 (E142A, gAa>gCa). In Codon 146 konnte eine T- Deletion und damit eine Leserasterverschiebung für alle M. microti Stämme und einem M. pinnipedii Isolat nachgewiesen werden. Alle klinischen Isolate sowie alle in dieser Analyse untersuchten Referenzstämme wiesen folgende Mutationen auf, welche auf Fehler in der H37Rv Sequenzannotation schließen lässt: Q122K, Cag>AaG; Codon 127 ggA>ggC; T138A, Acg>Gcg; H139Q caC>caG; H146Q, caT>caG; L149V, Ttg>Gtg; D152E, gaC>gaG; G159A, gGg>gCg; Codon 162, tcC>tcG; Codon 165 C-Insertion, Codon 169 C-Insertion.
Mutationen in Resistenzgenen

Zur Überprüfung der Ergebnisse der Empfindlichkeitstestung gegenüber Erstrangmedikamenten wurden Sequenzanalysen in für Isoniazid (INH) und Rifampicin (RMP) beschriebenen Resistenzgenen (INH: katG, fabG1-inhA, ahpC; RMP: rpoB) durchgeführt. Dabei konnten zwei phylogenetische Marker identifiziert werden. Im fabG1-inhA (Rv1483) Gen zeigten alle M. africanum West African 1 Stämme einen G zu A Austausch an Position –102 vor Startcodon. In ahpC (Rv2428) konnte ein G zu A Austausch an Position –88 vor Startcodon für alle Dehli/CAS Stämmen identifiziert werden. Die Ergebnisse für alle als INH und RMP resistent beschriebenen Stämme sowie alle weiteren Stämme mit Mutationen in den entsprechenden Genen sind in Tab. 6 zusammengefasst. Alle nicht dargestellten Stämme entsprachen der H37Rv Referenzsequenz. Tab. 6 Mutationen in Resistenzgenen

Nr.	Spezie	Genotyp	katG	fabG1-inhA	ahpC	rpoB
2169/99	M. tuberculosis	Uganda I	-	-	-	Codon 432 TTC Insertion
2201/99	M. tuberculosis	Uganda I	-	C>T –15	-	D435Y
10493/01	M. tuberculosis	Ghana/TB1	S325I	-	-	-
10469/01	M. tuberculosis	Ghana/TB1	-	-	-	D435Y
9953/04	M. tuberculosis	X-type	-	-	Codon 6 atT>atC	-
7936/01	M. tuberculosis	Dehli/CAS	-	-	G>A –88	-
2637/01	M. tuberculosis	Dehli/CAS	-	-	G>A –88	-
3256/02	M. tuberculosis	Beijing	S315T	-	-	H445D
3329/02	M. tuberculosis	Beijing	S315T	-	-	S450L
4445/02	M. tuberculosis	Beijing	S315T	-	-	S450L
5434/02	M. africanum	West African 1a	-	G>A –102	-	-
1449/02	M. africanum	West African 1a	-	G>A –102	-	-
1473/02	M. africanum	West African 1a	-	G>A –102	-	-
1443/02	M. africanum	West African 1b	-	G>A –102	-	-
10473/01	M. africanum	West African 1b	-	G>A –102	-	-
10494/01	M. africanum	West African 1b	-	G>A –102	-	-
10514/01	M. africanum	West African 2	-	C>T –15	-	-

Virulenz-assoziierte Gene
In der Literatur wurde eine Vielzahl von Genen beschrieben, die im Zusammenhang mit der Virulenz von MTBK Stämmen stehen. Sequenzvariationen in diesen Genen stellen somit einen Mechanismus für die Modulation der Virulenz oder der Wirt-Pathogen Interaktion dar. Aus diesem Grund wurden sieben Virulenz-assoziierte Gene in die Sequenzanalyse mit eingeschlossen.
Zum Beispiel kodiert Rv0410c für eine Proteinkinase G (pknG), die in die Phagosomen von Makrophagen sekretiert, die Phagosomen-Lysomen-Fusion inhibiert und somit ein intrazelluläres Wachstum des Pathogens ermöglicht. Die Sequenzanalyse (Tab. 7) identifizierte genotypübergreifende und genotypspezifische Mutationen sowie Sequenzvariationen in einzelnen Stämmen des MTBKs.
So zeigten alle M. bovis und M. caprae Stämme eine synonyme Veränderung in Codon 69 (ccG>ccA). M. africanum West African 1 Stämme trugen eine Variation in Codon 665 (A665T, Gcc>Acc), während für alle West African 2 Stämme eine Mutation in Codon 736 (T736K, aCg>aAg) identifiziert werden konnte. Für alle M. tuberculosis EAI Stämme konnte eine Mutation in Codon 614 (tcG>tcA) detektiert werden. Eine Vielzahl von Mutationen präsentierte ein M. canettii Isolat, die in Tab. 7 nicht explizit erwähnt werden: Codon 3 aaA>aaG; Codon 36 ttC>ttG; Codon 269 ctC>ctT; Codon 501 tcA>tcG, Codon 506 ctA>ctG; Codon 510 cgC>cgT; Codon 532 gtT>gtC; K557R, aAA>aGG; Codon 564 gaT>gaC; Codon 575 gcC>gcG; Codon 579 acC>acG; A580V, gCc>gTc; Codon 707 ccG>ccA; Codon 716 ggT>ggC.
MgtC (Rv1811), ein weiteres Beispiel für einen wichtigen Virulenzfaktor, kodiert für eine Magnesium-Transport-P-Typ-ATPase, die bei Magnesiummangel unter ATP Verbrauch Mg²⁺ ins Cytosol befördert. Neben dem von Alix et al. 2006 beschriebenen Haarlem genotypspezifischen Polymorphismus in Codon 182 (R182H, cGc>cAc) ergab die Analyse der Referenzkollektion weitere genotypspezifische Variationen (6). Zum Beispiel zeigten alle M. tuberculosis LAM Stämme eine synonyme Mutation in Codon 80 (atC>atT). M. africanum West African 1b Stämme trugen eine funktionelle Mutation in Codon 95 (T95M, aCg>aTg), während alle West African 1a Stämme der H37Rv Referenzsequenz entsprachen. West African 2 Stämme zeigten eine funktionelle Mutation in Codon 107 (A107V, gCc>gTc). Für M. canettii Stämme konnte eine synonyme Veränderung in Codon 15 (gtC>gtT) identifiziert werden. Weiterhin ergab die Sequenzanalyse eine stammspezifische Mutation in einem M. microti Stamm, der eine A-Insertion in Codon 7 zeigte.
In dieser Arbeit wurden außerdem Sequenzanalysen von einigen der von Hershberg et al. publizierten Genen (Rv2032, Rv2628, Rv3547) mit eingeschlossen. In Rv2032 konnten genotypübergreifende, genotypspezifische sowie Variationen in einzelnen Stämmen detektiert werden. Alle M. bovis und M. caprae Stämme zeigten eine Mutation in Codon 318 (P318L, cCa>cTa). Zusätzlich trugen alle M. caprae Isolate eine Veränderung in Codon 34 (A34S, Gcc>Tcc), wobei einer der Stämme eine weitere Mutation in Codon 108 (E108V, gAg>gTg) aufwies. Für alle M. canettii Stämme konnte eine synonyme Veränderung in Codon 62 (ggG>ggC) detektiert werden. Stammspezifische Mutationen wurden für M. africanum ATCC, M. tuberculosis Ghana/TB1 und einen der M. canettii Stämme nachgewiesen, die in Tab. 7 zusammengefasst sind. Die größte Variabilität zeigte erneut einer der M. canettii Stämme: S13R agC>agG; Codon 59 gcG>gcAt; Codon 62 ggG>ggC; Codon 84 gaA>gaG; R141C, Cgc>Tgc; I151L, Atc>Ctc; Codon 279 caC>caT; Codon 297 gcC>gcG; Codon 305 ccG>ccT; M307V, Atg>Gtg.
Im Rv2628 Gen konnten ebenfalls genotypübergreifende und genotypspezifische Mutation sowie Variationen in einzelnen Isolaten detektiert werden (Tab. 8). Alle M. africanum, M. canettii und tierpathogenen Isolate sowie M. tuberculosis EAI Stämme zeigten einen tCg>tTg Austausch in Codon 59 (S59L). Zusätzlich konnte für alle M. microti und M. pinnipedii Stämme eine Mutation in Codon 83 (L83W, tTg>tGg) nachgewiesen werden. M. africanum West African 1 Stämme zeigten eine funktionelle Mutation in Codon 96 (A96T, Gcg>Acg). Für M. canettii Stämme konnten 2 genotypspezifische SNPs identifiziert werden (Codon 26 atA>atC; S49A, Tcc>Gcc). Einzelne Varianten trugen M. africanum West African 1b, West African 2 sowie M. canettii. Stämme. Ein M. africanum West African 1b Isolat zeigte eine funktionelle Mutation in Codon 6 (P6L, cCg>cTg), der West African 2 Stamm eine Variation in Codon 27 (G27S, Ggc>Agc). Für die M. canettii Stämme ergab sich folgendes Bild: 3040/99: Codon 78 ggT>ggC; T85R, Acc>Gcc; 3041/99: Codon 31 G-Insertion; T85R, Acc>Gcc; Codon 91 gaT>gaC; 3151/08: Codon 31 G-Insertion, Codon 91 gaT>gaC.

Die Analyse des Rv3547 Gens identifizierte vier genotypspezifische SNPs sowie eine genotypübergreifende Variation (Tab. 8). Alle M. africanum West African 1 Stämme zeigten eine Veränderung in Codon 48 (ctG>ctT) sowie in Codon 113 (D113N, Gac>Aac). M. canettii Stämme wiesen Variationen in Codon 69 (gaC>gaT) sowie in Codon 148 (gtT>gtC) auf. Als gemeinsame Mutation zeigten alle M. microti und M. pinnipedii Stämme einen Ctc>Gtc (L90V) Austausch in Codon 90. In Rv3547 konnten auch Variationen in einzelnen Isolaten identifiziert werden, die in Tab. 8 zusammengefasst sind. Tab. 7 Mutationen in Rv0410c, Rv1811 und Rv2032

Genotyp	N	Rv0410c (%)	Rv1811 (%)	Rv2032 (%)
H37Rv ATCC	1	-	-	-
Bovis ATCC	1	Codon 69 ccG>ccA (100%)	-	P318L (100%)
Africanum ATCC	1	-	-	Y179C (100%)
Haarlem	3	-	R182H (100%)	-
Uganda I	3	-	-	-
Uganda II	3	-	-	-
Ghana/TB1	3	-	-	Codon 186 ggG>ggC (33,3%)
Cameroon	4	-	-	-
LAM	3	-	Codon 80 atC>atT (100%)	-
S-type	3	-	-	-
X-type	3	-	-	-
Dehli/CAS	2	-	-	-
EAI	3	Codon 614 tcG>tcA (100%); D145H (66,6%); H159Y (33,3%)	-	-
Beijing	6	-	-	-
West African 1a	3	Codon 132 ggC>gGA (33,3%; A665T (100%)	-	-
West African 1b	3	A665T (100%)	T95M (100%)	-
West African 2	3	T736K (100%)	A107V( 100%)	-
M. pinnipedii	2	-	-	-
M. bovis	3	Codon 69 ccG>ccA (100%)	-	P318L (100%)
M. caprae	3	Codon 69 ccG>ccA (100%); Q58H (33,3%)	-	P318L (100%); A34S (100%); E108V (33,3%)
M. microti	2	E259Q (50%)	Codon 7 A-Insertion (50%)	-
M. canettii	3	Codon 272 Ttg>Ctg (100%); Codon 458 gtC>gtG (66,6%), Codon 730 acT>acC (66,6%); siehe Text (33,3%)	Codon 15 gtC>gtT (100%)	Codon 62 ggG>ggC (100%); Codon 271 acG>acC (66,6%); siehe Text (33,3%)

N: Anzahl der untersuchten Stämme

Reed et al. beschrieben 2004, dass die Hypervirulenz bestimmter Stämme auf eine funktionelle Polyketidsynthase (pks15/1, Rv2946c) zurückzuführen ist, die für die Synthese des phenolischen Glykolipids verantwortlich ist. Stämme wie der H37Rv Referenzstamm haben im Vergleich zu den Beijing Stämmen eine 7 bp Deletion, die zu einer Leserasterverschiebung führt und damit die Synthese einer aktiven Polyketidsynthase ausschliesst. Die Sequenzanalyse der Referenzkollektion (Tab. 8) bestätigte die beschriebene Deletion im Vergleich zur Beijing Referenzsequenz. Alle klinischen M. tuberculosis EAI, Beijing, Dehli/CAS sowie alle M. africanum West African 1 und M. canettii Isolate entsprachen der Beijing Referenzsequenz und besitzen damit eine funktionelle Polyketidsynthase. M. africanum West African 2, M. bovis, M. caprae, M. pinnipedii und M. microti Stämme wiesen eine 6 bp Deletion auf, was zum Verlust zweier Aminosäuren führt, aber nicht zur Inaktivierung der Polyketidsynthase.

Ein weiteres Beispiel für Gene, in denen Sequenzveränderungen in einen veränderten Phänotyp resultieren, bietet die von Wang et al. 2007 veröffentlichte Studie, die eine Mutation in Codon 64 des Rv2629 Gens mit RMP Resistenz assoziert. Der Studienaufbau lies jedoch vermuten, dass der Zusammenhang zwischen Mutation und RMP Resistenz auf dem Genotyp der ausgewählten klinischen Isolate beruhte. Die Sequenzanalyse der Referenzkollektion (Tab. 8) sowie weiterer klinischer Isolate (Homolka et al. 2009) konnte dies bestätigen. Eine Veränderung in Codon 64 (D64A, gAt>gCt) im Rv2629 Gen ist spezifisch für Isolate des Beijing Genotyps. Bei der Analyse konnte außerdem ein weiterer phylogenetischer Marker identifiziert werden. Alle M. tuberculosis Ghana/TB1 Stämme wiesen eine Mutation in Codon 322 (2322L, cCg>cTG) auf. Stammspezifische Variationen sind in Tab. 8 zusammengefasst. Tab. 8 Mutationen in Rv2628, Rv2629, Rv2946c (pks15/1) und Rv3547

Genotyp	N	Rv2628 (%)	Rv2629 (%)	*Rv2946c (%)	Rv3547 (%)
H37Rv ATCC	1			7 bp Del (100%)
Bovis ATCC	1	S59L (100%)		6 bp Del (100%)
Africanum ATCC	1			6 bp Del (100%)
Haarlem	3			7 bp Del (100%)
Uganda I	3			7 bp Del (100%)
Uganda II	3		Codon 126 caC>caT (33,3%)	7 bp Del (100%)
Ghana/TB1	3		P322L (100%)	7 bp Del (100%)
Cameroon	4			7 bp Del (100%)
LAM	3			7 bp Del (100%)	R23W (33,3%)
S-type	3			7 bp Del (100%)
X-type	3			7 bp Del (100%)
Dehli/CAS	2				A111T (50%)
EAI	3	S59L (100%)
Beijing	6		D64A (100%)
West African 1a	3	S59L (100%); A96T (100%)			Codon 48 ctG>ctT (100%); D113N (100%)
West African 1b	3	S59L (100%); A96T (100%); P6L (33,3%)			Codon 48 ctG>ctT (100%); D113N (100%)
West African 2	3	S59L (100%); G27S (33,3%)	T211I (33,3%)	6 bp Del (100%)
M. pinnipedii	2	S59L (100%); L83W (100%)		6 bp Del (100%)	L90V (100%)
M. bovis	3	S59L (100%)		6 bp Del (100%)
M. caprae	3	S59L (100%)		6 bp Del (100%)
M. microti	2	S59L (100%); L83W (100%)		6 bp Del (100%)	L90V (100%)
M. canettii	3	S59L (100%); Codon 26 atA>atC (100%); S49A (100%); siehe Text (33,3%)	G80R (33,3%); Codon 271 gcG>gcA (33,3%) T118S (66,6%); Codon 178 cgC>cgT (66,6%)		Codon 69 gaC>gaT (100%); Codon 148 gtT>gtC (100%); Codon 23 Cgg>Agg (66,6%)

N: Anzahl der untersuchten Stämme; Del: Deletion;
*Sequenzvergleich bezieht sich auf M. tuberculosis Beijing

Diskussion
Jahrzehnte war die Aufklärung der Pathologie der Tuberkulose und damit die Entwicklung neuer antituberkulöser Medikamente und Testsysteme auf eine kleine Anzahl klinischer Laborstämme wie CDC1551 und H37Rv fokussiert. Diese Referenzstämme repräsentieren jedoch nur einen kleinen Teil der genetischen und biologischen Diversität klinischer Isolate (Fux et al. 2005). In den letzten Jahren sind daher Untersuchungen zur natürlichen Variabilität von MTBK Stämmen in den Fokus intensiver Forschung gerückt (Nicol et al 2008). Es wurde im Rahmen der Erfindung die genetische und biologische Diversität klinischer Isolate der weltweit am häufigsten vorkommenden Genotypen des MTBKs analysiert.
Genetische Diversität
DNA Sequenzvariationen und die daraus resultierende genetische Diversität innerhalb eines Genus sind Ergebnisse von Mutations- und Rekombinationsereignissen. Im Gegensatz zu vielen anderen Bakterien weisen Stämme des MTBKs jedoch eine geringere Sequenzvariabilität auf und werden daher als genetisch monomorph bezeichnet (Achtmann 2008). Aufgrund der strikten Klonalität und den vergleichsweise geringen Sequenzunterschieden wurde die genetische Diversität von Stämmen des MTBKs und ihre phänotypischen Konsequenzen viele Jahre als vernachlässigbar betrachtet (Musser 2000, Sreevatsan 1997). Neue Studien zeigen jedoch, dass klinische Isolate eine größere genetische Diversität aufweisen als ursprünglich angenommen (Hershberg 2008, Wirth 2008).
Es wurden vergleichende Sequenzanalysen von 29 Genen in 58 klinischen Isolaten sowie in den H37Rv, Bovis ATCC und Africanum ATCC Referenzstämmen durchgeführt. Die untersuchten Gene repräsentieren dabei eine Auswahl unterschiedlicher Genklassen, die zum Beispiel Gene unterschiedlicher Stoffwechelswege, Gene mit funktioneller Bedeutung bei der Reaktivierung latenter M. tuberculosis Erreger oder Gene der PE und PPE Gruppe einschließen.
Im Rahmen der Erfindung konnten 57 phylogenetisch informative Mutationen nachgewiesen werden, von denen 45 als genotypspezi fische und 12 als genotypübergreifende Sequenzvariationen beschrieben wurden (3). Basierend auf diesen Daten ist es erstmalig gelungen, ein Verfahren zu erarbeiten, das über die Sequenzierung von nur fünf Genen eine eindeutige Differenzierung fast aller hier untersuchten Stämme (mit Ausnahme von M. pinnipedii und M. microti sowie M. tuberculosis Uganda und X-type) ermöglicht (4). Eine hochauflösende Differenzierung von MTBK Stämmen ist nicht nur für epidemiologische Studien zum Nachweis von Übertragungswegen oder Risikofaktoren von großer Bedeutung, sondern ermöglicht auch ein besseres Verständnis von pathobiologischen Merkmalen bestimmter Erreger (Comas 2009). Als sogenannte „Gold Standards” kommen heutzutage vorrangig Spoligotyping und MIRU-VNTR Typisierungmethoden zum Einsatz, da eine sequenzbasierte Genotypisierung klinischer MTBK Stämme durch z. B. Multi-Locus-Sequenzanalysen für die diagnostische Anwendung oftmals ungeeignet ist. Wie jedoch die von Comas et al. kürzlich veröffentlichte Studie zeigte, weisen im Gegensatz zu den klassischen Typisierungsmethoden sequenzbasierte Methoden wie SNP Assays einen geringeren Homoplasieindex auf und eignen sich daher deutlich besser für phylogenetische Untersuchungen (Comas 2009), da sie einen bestimmten Genotyp definieren. Als schnelle und kostengünstige Methode könnte der hier beschriebende sequenzbasierte Assay in zukünftigen, epidemiologischen Studien Anwendung finden.
Ein weiterer interessanter Aspekt ist die Identifizierung bestimmter Mutationen in mehreren Stämmen eines Genotyps, die mögliche Untergruppen von Genotypen definieren könnten. Zum Beispiel zeigten 2 von 3 M. tuberculosis LAM Stämmen eine Mutation im rpfC Gen und 2 von 3 X-type Isolaten eine Veränderung im rpfE Gen. Die SpolDB4 Datenbank umfasst zurzeit 12 Subgruppen des LAM und 6 Untergruppen des X-type Genotyps (Brudey 2006).
Insgesamt konnte die in der Literatur beschriebene Populationsstruktur von MTBK Stämmen, d. h. die Einteilung von klinischen Isolaten in 2 phylogenetischen Gruppen, 6 Hauptlinien und einer Viehzahl von Genotypen, durch die hier durchgeführte Sequenzanalyse bestätigt werden (Gagneux 2006, Wirth 2008, Hershberg 2008). Zum Beispiel traten genotypspezifische und genotypübergreifende Sequenzvariationen vorrangig in M. canettii und in M. africanum Stämme sowie in tierpathogenen Erregern auf (3), die eine klare Differenzierung von MTBK Stämmen in 2 Gruppen zuließen. Diese Ergebnisse korrelieren mit der von Wirth et al. veröffentlichten, auf MIRU-VNTR Analysen basierende Studie von 355 Isolaten. Hier konnten ebenfalls 2 phylogenetische Gruppen identifiziert werden (Clade 1, Clade 2), wobei M. africanum und M. canettii Stämme sowie alle tierpathogenen Erreger der Gruppe 2 zuzuordnen sind (Wirth 2008). Alle M. tuberculosis Isolate mit Ausnahme von M. tuberculosis EAI Stämmen gehören zur phylogenetischen Gruppe 1. Darüber hinaus konnten gemeinsame Mutationen in allen M. africanum, M. canettii und tierpathogenen Errregern sowie in allen M. tuberculosis EAI, Beijing und Dehli/CAS Stämmen nachgewiesen werden, wodurch sich die von Gagneux et al. beschriebene „Euro-American” Linie definieren lässt. Ein weiteres, interessantes Ergebnis ist der Nachweis zahlreicher genotypspezifischer Mutationen in M. africanum West African 1 und West African 2 Isolaten, die M. africanum Stämme in 2 definierten Linien einteilen. Zusammenfassend läßt sich also sagen, dass die auf klassische Typisierungsmethoden basierende Phylogenie von MTBK Stämmen durch die hier beschriebenen Sequenzergebnissen bestätigt wird, und die neue Methode daher gut zur Diagnose der verschiedenen Erreger geeignet ist.
Die im Rahmen der Erfindung identifizierten SNPs sind phylogenetische Marker, die eine einfache Genotypisierung z. B. klinischer Isolate u. a. über Sequenzierung ermöglichen.
Publikationen

Homolka et al., ESM 2007, 28. Jahrestagung der Europäischen Gesellschaft für Mykobakteriologie, Athen.
Homolka et al., Dechema 2008. Gesellschaft für Chemische Technik und Biotechnologie e. V., Frankfurt.
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Claims

Kit zur Identifizierung von Erregern des M. tuberculosis Komplexes, umfassend Mittel zur Analyse von Sequenzen in den Genen Rv0557, Rv2628, Rv2629, Rv1811 und der Promotorsequenz von Rv2946c, wobei die Mittel bei Rv2628, Rv2629, Rv1811 und Rv0557 geeignet zur Detektion von Polymorphismen gegenüber der Referenzsequenz von M. tuberculosis H37Rv, und bei Rv2946c geeignet zur Detektion des Vorliegens von Polymorphismen gegenüber der Referenzsequenz von M. tuberculosis Beijing sind.
Kit nach Anspruch 1, wobei das Kit mindestens zur Differenzierung zwischen a) M. tuberculosis, b) M. canetti, c) M. bovis, d) M. caprae, e) M. pinnipedii und M. microti geeignet ist.
Kit nach einem der vorherigen Ansprüche, umfassend Mittel zur Detektion von a) dem Polymorphismus in Rv2946c pks 15/1, welcher eine Deletion von 6 oder 7 bp ist, b) dem Polymorphismus in Rv1811, welcher eine Substitution im Codon 15 (gtc>gtt) ist, c) dem Polymorphismus in Rv1811, welcher eine Substitution A107V ist, d) dem Polymorphismus in Rv2628, welcher eine Substitution L83W ist, e) dem Polymorphismus in Rv0557, welcher eine Substitution im Codon 350 (gtg>gta) ist.
Kit nach Anspruch 3, umfassend Mittel zur Detektion von dem Polymorphismus in Rv2628, welcher eine Substitution A96T ist.
Kit nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei – der Polymorphismus in Rv2946c pks 15/1 eine Deletion von 6 oder 7 bp ist; – und/oder der Polymorphismus in Rv2628 eine Substitution A96T und/oder eine Substitution L83W ist; – und/oder der Polymorphismus in Rv2629 eine Substitution D64A und/oder eine Substitution P322L ist; – und/oder der Polymorphismus in Rv1811 eine Substitution A107V und/oder eine Substitution im Codon 15 (gtc>gtt) und/oder eine Substitution im R182H und/oder eine Substitution im Codon 80 (atc>att) ist; – und/oder der Polymorphismus in Rv0557 eine Substitution R178G und/oder eine Substitution im Codon 350 (gtg>gta) und/oder eine Substitution im Codon 270 (gcc>gct) und/oder eine Substitution L153V ist.
Kit nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Mittel Primer, insbesondere Primer zur Sequenzierung und/oder zur Polymorphismus-spezifischen Amplifizierung, und/oder Sonden umfassen.
Kit nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Mittel geeignet zur Detektion des Vorliegens von mehreren Polymorphismen in einem Gen, ein Mittel oder mehrere Mittel sein können.
Kit nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Mittel Primerpaare zur Sequenzierung sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24; ID NO: 57 und SEQ ID NO: 58; ID NO: 59 und SEQ ID NO: 60; und ID NO: 61 und SEQ ID NO: 62.
Kit nach einem der der vorherigen Ansprüche, ferner umfassend Reagenzien zur Amplifizierung und/oder Hybridisierung von DNA.
Verfahren zur Identifizierung von Erregern des M. tuberculosis Komplexes, Schritte umfassend, bei denen man in einer Probe Polymorphismen enthaltende Sequenzen in den Genen Rv0557, Rv2628, Rv2629, Rv1811 und der Promotorsequenz von Rv2946c analysiert, die erhaltenen Sequenzen von Rv2628, Rv2629, Rv1811 und Rv0557, mit der Referenzsequenz von M. tuberculosis H37Rv und die erhaltene Sequenz von Rv2946c mit der Referenzsequenz von M. tuberculosis Beijing vergleicht, und Polymorphismen nachweist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei man eine Differenzierung mindestens zwischen a) M. tuberculosis, b) M. canetti, c) M. bovis, d) M. caprae, e) M. pinnipedii und M. microti erhält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, bei dem a) der Polymorphismus in Rv2946c pks 15/1 eine Deletion von 6 oder 7 bp ist, b) der Polymorphismus in Rv1811 eine Substitution im Codon 15 (gtc>gtt) ist, c) der Polymorphismus in Rv1811 eine Substitution A107V ist, d) der Polymorphismus in Rv2628 eine Substitution L83W ist, e) der Polymorphismus in Rv0557 eine Substitution im Codon 350 (gtg>gta) ist, und optional der Polymorphismus in Rv2628 eine Substitution A96T ist, nachweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10–12, wobei – der Polymorphismus in Rv2946c pks 15/1 eine Deletion von 6 oder 7 bp ist; – und/oder der Polymorphismus in Rv2628 eine Substitution A96T und/oder eine Substitution L83W ist; – und/oder der Polymorphismus in Rv2629 eine Substitution D64A und/oder eine Substitution P322L ist; – und/oder der Polymorphismus in Rv1811 eine Substitution A107V und/oder eine Substitution im Codon 15 (gtc>gtt) und/oder eine Substitution im R182H und/oder eine Substitution im Codon 80 (atc>att) ist; – und/oder der Polymorphismus in Rv0557 eine Substitution R178G und/oder eine Substitution im Codon 350 (gtg>gta) und/oder eine Substitution im Codon 270 (gcc>gct) und/oder eine Substitution L153V ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10–13, wobei man eine Sequenz analysiert, indem man eine Sequenzierung und/oder eine Polymorphismus-spezifischen Amplifizierung, und/oder Hybridisierung einer Sonde vornimmt, woduch ein oder mehrere Polymorphismen nachgewiesen werden.
Verfahren nach nach einem der Ansprüche 10–14, wobei man ein Kit nach einem der Ansprüche 1–9 einsetzt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10–15, wobei man vor der Analyse DNA eines Mycobakteriums aus einer Probe isoliert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10–16, wobei man a) der Polymorphismus in Rv2946c pks 15/1 nachweist, der eine Deletion von 6 oder 7 bp ist; wobei man, wenn diese Deletion nicht vorliegt, b) den Polymorphismus in Rv2628 nachweist, der eine Substitution A96T ist, wenn dieser nicht vorliegt, c) den Polymorphismus in Rv1811 nachweist, der eine Substitution im Codon 15 (gtc>gtt) ist, wenn dieser nicht vorliegt, d) den Polymorphismus in Rv0557 nachweist, der eine Substitution im Codon 270 (gcc>gct) ist, wenn dieser nicht vorliegt, e) den Polymorphismus in Rv2629 nachweist, der eine Substitution Substitution D64A ist; wobei man, wenn der Polymorphismus in Rv2946c pks 15/1 eine Deletion von 6 bp ist: f) den Polymorphismus in Rv1811 nachweist, der eine Substitution A107V ist, wenn dieser nicht vorliegt, g) den Polymorphismus in Rv2628 nachweist, der eine Substitution L83W ist, wenn dieser nicht vorliegt, h) den Polymorphismus in Rv0557 nachweist, der eine Substitution im Codon 350 (gtg>gta) ist; wobei man, wenn der Polymorphismus in Rv2946c pks 15/1 eine Deletion von 7 bp ist: i) den Polymorphismus in nachweist, der eine Substitution R182H ist, wenn dieser nicht vorliegt, j) den Polymorphismus nachweist, der eine Substitution im Codon 80 (atc>att) ist, wenn dieser nicht vorliegt, k) den Polymorphismus in Rv0557 nachweist, der eine Substitution R178G ist, wenn dieser nicht vorliegt, l) den Polymorphismus in Rv0557 nachweist, der eine Substitution L153V ist, wenn dieser nicht vorliegt, m) den Polymorphismus in Rv2629 nachweist, der eine eine Substitution P322L ist.