DE69333008T2

DE69333008T2 - Sonde zur diagnose einer ansteckenden krankheit

Info

Publication number: DE69333008T2
Application number: DE69333008T
Authority: DE
Inventors: Tsuneya Ohno; Akio Nara-shi MATSUHISA; Hirotsugu Kobe-shi UEHARA; Soji Osaka-shi EDA
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Current assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date: 1992-07-07
Filing date: 1993-07-07
Publication date: 2004-02-05
Anticipated expiration: 2013-07-08
Also published as: KR950702640A; ATE328118T1; ATE344333T1; EP0652291A4; EP1498495A2; DE69333872D1; EP1329518A3; CA2139847A1; DE69333958T2; JP2965543B2; EP1329519A3; EP1498496A3; EP1160334A3; ATE241702T1; DE69333958D1; DE69334060D1; DE69333872T2; EP1167543A2; DE69334018D1; DE69334018T2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrtfft Sonden, die hergestellt werden, indem von verursachenden Bakterien von ansteckenden Krankheiten Gebrauch gemacht wird, welche zum Nachweisen und Identifizieren der verursachenden Bakterien nützlich sind.
Stand der Technik
In der Pathologie wird Infektion als Invasion und Festsetzung von Raum für das Wachstum in einem Organismus durch einen pathogenen Organismus (nachstehend bezeichnet als "Bakterten") definiert, dann hängt der Ausbruch der Krankheit von der Wechselbeziehung zwischen der Resistenz des Wirtes und der Virulenz der Bakterien ab.
Bei den ansteckenden Krankheiten ist Verbesserung bei den Behandlungverfahren von Bakteriämie als wichtiges Problem angeschnitten worden. Das heißt, Bakteriämie ist keine Krankheit, die durch ein bestimmtes Bakterium verursacht wird, sondern durch Auftreten und Innewohnen der verschiedenen Bakterien im Blut verursacht wird, dann wird der Beginn davon klinisch vermutet, wenn Fieber von etwa 40°C zwei oder mehr Tage lang anhält. Wenn ein Patient ein Baby ist oder an Krebs im Endstadium mit geschwächter Resistenz leidet, kann der Patient innerhalb von ein oder zwei Tagen sterben, weshalb die Bakteriämie eine schwerwiegende und hartnäckige Krankheit ist, und die Verbesserung bei den Behandlungverfahren davon erwartet worden ist.
Bei der ansteckenden Krankheit arbeiten Phagozyten, einschließlich Neutrophile, Monozyten und Makrophagen in erster Linie zum Schutz des Körpers. Das Auftreten von Bakterien im Blut wird als Invasion von überwiegenden Bakterien, welche aus dem Gewebe des Phagozyten hervorgegangen sind, angesehen.
Bakteriämie ist ein Zustand, in welchem die Bakterien im Blut aufgetreten sind, und eine große Menge an Antibiotikum verabreicht wird, um sie zu behandeln, wobei die verursachenden Bakterien gegen das Antibiotikum empfindlich sind. Weil Antibiotika allgemein die Funktionen der inneren Organe, wie die Leber, senken, ist es erforderlich, der Verrtngerung einer Verabreichung eines unwirksamen Antibiotikums an den Patienten in einem schwerwiegenden Zustand Beachtung zu schenken.
Wenn die Bakteriämie als ein Fall definiert wird, in welchem die Phagozytose von Zellen die Virulenz von Bakterien nicht überwinden kann, dann breiten sich die Bakterien durch das Blut im Körper aus, Bakteriämie mit schwerwiegenden Symptomen, die Toxinen zuzuschreiben sind, die durch die Bakterien produziert werden, wird als Sepsis bezeichnet. Der Nachweis von Sepsis, mit anderen Worten die Festsetzung der Diagnose erfordert ein überprüfen der Punkte 1) klinische Symptome, 2) Züchten von Proben, 3) Gram-Färbung der Bakterien, die in der Probe enthalten sind, und 4) Schockzustand, dann wird bei Vervollständigen der Überprüfung dieser Punkte das Behandlungsverfahren bestimmt. Demgemäß ist auf dem Fachgebiet erwartet worden, die Bakterien schnell und zuverlässig zu identifizieren.
Im vorliegenden Verfahren zum Nachweisen und Identifizieren der Bakterien in einer Bakteriämieprobe ist es ein gewöhnliches Verfahren, eine Probe in Selektivmedium zu identifizieren, welches ein positives Signal in einem routinemäßigen Verfahren in einer Kulturflasche hat. Jedoch ist es ziemlich schwiertg, Bakterien aus dieser Blutprobe erfolgreich zu züchten, dann werden, wenn eine hohe Dosis von Antibiotika verabreicht wird, wenn Bakteriämie vermutet wurde, die Bakterien in vielen Fällen im Blut nicht gezüchtet und wachsen nicht, weshalb die Rate positiver Fälle in der Kulturflasche extrem niedrig wird.
Obwohl verfügbare Subroutineverfahren instrumentelle Analyse von Bestandteilen und metabolischen Produkten von Bakterien (Yoshimi Benno, „Quick identification of bacteria with gas chromatography", Rinsho Kensa, Bd. 29, Nr. 12, November 1985, Igaku Shoin Hrsg.) einschließen, sind ein Verfahren, das spezifische Antikörper verwendet (vorläufige Japanische Patentschrift Nr. 60–224068), und ein Hybridisierungsverfahren, das die Spezifität von DNA verwendet (vorläufige Japanische Patentschrift Nr. 61–502376), von denen jedes erfordert, die Bakterien zu trennen und sie zu züchten, entwickelt worden. Andererseits gibt es, weil ein Verfahren eingeführt wurde, das auf der Funktion der Phagozyten bei ansteckenden Krankheiten beruht, ein Verfahren zum Überprüfen eines gefärbten Abstrichs von Buffy coat unter einem optischen Mikroskop, worin Leukozyten der Blutprobe konzentriert sind. Allgemein gesagt, wurde, obwohl die Rate des Nachweises von Bakterien in Buffy coat-Proben von erwachsenen Bakteriämiepatienten höchstens 30% beträgt, welches dem in Ohrläppchenproben ähnlich ist, berichtet, dass Bakterien in sieben Fällen von zehn Fällen (70%) bei neugeborenen Patienten nachgewiesen wurden, weshalb eine Information hinsichtlich des Vorhandenseins von Bakterien im peripheren Blut, die durch Mikroskopuntersuchung eines Abstrichs zu erhalten ist, wichtig für die Behandlung ist.
Weil die herkömmliche Verfahren Vorbehandlung erfordern, welche insgesamt mindestens drei bis vier Tage erfordert, enthaltend ein bis zwei Tage zur selektiven Isolierung von Bakterien aus einer Probe, einen Tag zum Züchten und einen oder mehrere Tage zum Fixieren, und das Züchten davon bei der Ausübung fortgesetzt wird, bis die Bakterien wachsen, erfordert die Kultur eine Woche oder mehr sogar für C.B.-positive Fälle, weshalb dieses ein Faktor bei der hohen Sterblichkeit von C.B.-positiven Patienten war, die mit den herkömmlichen Verfahren behandelt wurden. Zum Beispiel betrug gemäß eines Berichts, der in „The Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases", Bd. 58, Nr. 2, S. 122, 1984, veröffentlicht wurde, obwohl die Rate positiver Blutkulturen 28,6% (163 Fälle/569 Fällen) betrug, die Sterblichkeit mindestens 84,6% (138 Fälle/163 Fällen).
Ferner kann es unmöglich sein, Kontamination bei der Züchtung durch einheimische Bakterien zu unterscheiden. Zum Beispiel hält sich Staphylococcus epidermidis, welches eines der Staphylokokken ist und das verursachende Bakierium von Bakteriämie ist, auf der Haut normaler Personen auf, dann gibt es ein Kontaminationsrisiko einer Probe mit diesem Bakterium, wenn eine Nadel in die Haut eingeführt wird.
Als wichtige Angelegenheit unter den derartigen vorstehenden Umständen ist, weil viele Bakterien in einer zu züchtenden Probe in die Phagozyten eingebracht worden sind und tot oder lokal immobilisiert sind, die Zahl an wachsbaren Bakterien sogar unter geeigneten Züchtungsbedingungen klein, wodurch die tatsächliche Nachweisrate von Bakterien durch Züchten einer Probe höchstens etwa 10% beträgt. Mit anderen Worten, zu diesem Zeitpunkt können 90% des überprüften Bluts des Patienten, welches wertere ein oder mehrere Tage gezüchtet worden ist, von dem klinisch vermutet wird, dass er an einer Bakteriämie leidet, das Vorhandensein von Bakterien nicht erklären.
Im Licht der vorstehenden Situation hängt die vorliegende Ausübung von einer zu beginnenden Behandlung ab, wenn eine Bakteriämie klinisch vermutet wird, ohne die Nachweisergebnisse abzuwarten, das heißt, ein empirischer Versuch (Trial and Error-Verfahren), bei welchem zuerst ein Breitband-Antibiotikum verabreicht wird, und, wenn das Antibiotikum nach ein oder zwei Tagen nicht wirksam ist, ein anderes Antibiotikum versucht wird.
Gemäß dem Verfahren zum Färben von Bakterien in der Probe, werden auch die Bestandteile des lebenden Körpers zusammen mit den Bakterien gefärbt, weshalb Erfahrung erforderlich ist, um die Bakterien gemäß ihres Bildes durch das Mikroskop schnell zu identifizieren, dann kann es Fälle geben, die als Bakteriämie kaum diagnostiziert werden können.
Obwohl die Bakteriämie eine Krankheit ist, bei welcher eine schnelle und genaue Diagnose erforderlich ist, kann das herkömmliche Diagnoseverfahren nicht auf derartige Erfordernisse reagieren.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wurde hinsichtlich der Probleme auf dem Fachgebiet eingeführt und betrifft eine Sonde, wie in den Patentansprüchen definiert.
Durch die erfindungsgemäße Sonde werden zum Beispiel verursachende Bakterien von ansteckenden Krankheiten ohne Züchtung/Vermehrung der Bakterien schnell und genau durch Nachweis von DNA, die in den verursachenden Bakterien enthalten ist, die mit dem Phagozyten stufenweise gespalten und eingebracht wird, nachgewiesen. Dann können, wenn Primer durch Sichbeziehen auf Informationen über die Rasensequenz dieser Sonden entworfen werden, die verursachenden Bakterien ohne Hybridisierung durch Amplifikation der DNA mit PCR-Technik identifiziert werden.
Wenn eine nicht-radioaktive Sonde, zum Beispiel eine biotinylierte Sonde, zur Hybridisierung verwendet wird, weil eine derartige Sonde mit einem optischen Mikroskop in einem herkömmlichen Labor ohne Einrichtungen zum Umgang mit Radioisotopen nachgewiesen werden kann, wäre das Nachweisverfahren schnell und einfach.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Restrtktionsenzymkarte eines HindIII-Fragments an einer Sonde zum Nachweisen von Staphylococcus aureus.
2 ist eine Restrtktionsenzymkarte eines HindIII-Fragments an einer Sonde zum Nachweisen von Staphylococcus epidermidis.
3 ist eine Restrtktionsenzymkarte eines HindIII-Fragments an einer Sonde zum Nachweisen von Enterococcus faecalis.
4 ist eine Restrtktionsenzymkarte eines HindIII-Fragments an einer Sonde zum Nachweisen Pseudomonas aeruginosa.
5 ist eine Restrtktionsenzymkarte eines HindIII-Fragments an einer Sonde zum Nachweisen Escherichia coli.
6 ist eine Restrtktionsenzymkarte eines HindIII-Fragments an einer Sonde zum Nachweisen von Enterobacter cloacae und Klebsiella pneumoniae.
Beste Art und Weise zum Durchführen der Erfindung
Beispiele von Sonden, die aus Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae und Enterobacter cloacae (J. Infection, Bd. 26, S. 159–170 (1993), J. Clin. Microbiol., Bd. 31., S. 552–557 (1993)) hergestellt werden, beziehungsweise als verhältnismäßig weitverbreitete verursachende Bakterien der ansteckenden Krankheiten, insbesondere die Bakteriämie, aufgeführt werden, wurden wie folgt beschrieben.
Beispiel 1: Herstellung einer DNA-Sonde aus verursachenden Bakterien von ansteckenden Krankheiten
1) Isolierung von verursachenden Bakterien von ansteckenden Krankheiten
Das Blut, das vom Patienten gesammelt wurde, der an zielgerichteten Krankheiten leidet, wurde für das Blutkulturverfahren (BBC-System: Blutkuttursystem; Roche) und für einen herkömmlichen Identifizierungskit (Api 20, Apistaf, Apistiep 20: Bio-Meryu) verwendet, und das jeweilige verursachende Bakterium wurde gemäß dem Handbuch des Kits isoliert und identifiziert.
2) Extraktion und Reinigung von genomischer DNA aus einem isolierten Stamm
Stämme, die im vorstehenden (1) isoliert wurden, wurden über Nacht in BHI- (Brain Heart Infusion-) Medium gezüchtet, die gezüchteten Bakterien gesammelt, dazu wurde Achromopeptidase anstelle von Lysozym zugegeben, dann wurde genomische DNA gemäß dem Saito-Miura-Verfahren („Preparation of Transforming Deoxyribonucleic Acid by Phenol Treatment", Biochem. Biophys. Arta. Bd. 72, S. 619–629) extrahiert, und die extrahierte DNA wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII gespaltet, und wurde zufällig in den Vektor pBR322 kloniert.
3) Auswahl der Sonde mit Spezifität zu Arten von urspürnglichen Bakterien
Escherichia coli, das jeden Klon enthielt, der gemäß dem Handbuch von Maniatis (T. Maniatis, et al., „Molecular Cloning (A Laboratory Manual)", Cold Spring Harbour Laboratory (1982)) hergestellt wurde, wurde mit Kulturen im kleinen Maßstab gezüchtet, und es wurden Plasmide erhalt, die jeden Klon enthielten.
Diese Plasmide wurden mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten, wodurch Insertionen mit 1% Agarose-Gel-Elektrophorese (Myupid: Cosmo-Bio) vollständig von den Plasmiden getrennt wurden, dann mit Southern-Transferverfahren (Paul Biodine A: Paul) auf Nylonmembran übertragen wurden und mit einer Sonde kreuzhybridisiert wurden, die durch (Amersham) durch Nick-Translation von Chromosomen-DNA von jedem der vorstehend aufgeführten Bakterienarten hergestellt wurde.
Bei dieser Hybridisierung wurde eine Sonde, weiche mit keiner Insertion kreuzreagierte, außer mit einer Sonde, die aus der ursprünglichen Art davon hergestellt wurde, als Sonde ausgewählt, die ein DNA-Fragment enthielt, welches zu verursachenden Bakterien der ansteckenden Krankheiten spezifisch ist.
Hinsichtlich der Sonden, die aus Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae hergestellt wurden, weil diese Bakterien zur selben Gruppe gehören (Darmbakterien; Gram-negativer aerober Bacillus) wie verursachende Bakterien der Bakteriämie (siehe, J. Infection, Bd. 26, S. 159–170 (1993), J. Clin. Microbiol., Bd. 31., S. 552–557 (1993), vorstehend) und die Kreuzreaktion unter den drei Bakterien in den vorhergehenden Reihenexperimenten auf Spezifität bestätigt worden war, wurde jede Sonde, die aus einer der drei Bakterien hergestellt wurde, als Sonde zum Nachweisen aller dieser Bakterien als relevante Bakterien bezeichnet.

Die Sonden (Bezeichnung), die durch die vorhergehenden Verfahren aus jeder Art ausgewählt wurden, sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1

Art	Bezeichnung
Staphylococcus aureus	SA-7, SA-24, SA-36, SA-77
Staphylococcus epidermidis	SE-3, SE-22, SE-32, SE-37
Enterococcus faecalis	S2-1, S2-3, S2-7, S2-27
Pseudomonas aeruginosa	P2-2, P2-7, P2-17, P4-5
Escherichia coli	EC-24, EC-34, EC-39, EC-625
Klebsiella pneumoniae	KI-50
Enterobacter cloacae	ET-12, ET-49

Restriktionsenzymkarten jeder Sonde wurden jeweils in den 1-6 auch veranschaulicht.
Beispiel 2: Bewertung auf Artsgezifrtät jeder DNA-Sonde
Die Reaktivität zwischen jeder Sonde und DNA von verursachenden Bakterien von ansteckenden Krankheiten wurde gemäß dem folgenden Verfahren untersucht. Zuallererst wurden als Stämme des Gegenstands der Untersuchung klinische Isolate von Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, und Enterobacter cloacae gemäß dem Verfahren von vorstehendem Beispiel 1 (1) isoliert.
Dann wurde DNA von jedem klinischen Isolat gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 (2) extrahiert, und Proben für Dot-Blot-Hybridisierung wurden erhalten, indem eine bestimmte Menge (z.B. 5 μl) DNA auf Nylonfilter getüpfelt wurde und die im Alkalischen denaturierten Isolate ausgewählt wurden. Die Hybridisierung an DNA-Sonden, die aus jedem unterzogenen Bakterium hergestellt und mit Biotin (Bio-dUTP; BRL) markiert wurden, wurde über Nacht gemäß dem Handbuch von Maniatis, vorstehend, unter der Bedingung von 45% Formamid, 5 × SSC, 42°C durchgeführt.
Die Proben, die durch Hybridisierung über Nacht erhalten wurden, wurden 20 Minuten lang bei 55°C zweimal mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS gewaschen, dann wurde die Farbreaktion mit Streptavidin-ALP-Konjugaten (BRL) nachgewiesen und die Hybridisierung bewertet.
Die experimentellen Ergebnisse an Reaktivität zwischen jeder Sonde und DNA von jedem klinischen Isolat werden in der folgenden Tabelle 2 (i)–(vi) veranschaulicht. Hinsichtlich einer Bezeichnung in den Tabellen, bezieht sich die Bezeichnung von „+" auf das Vorhandensein eines Signals an Hybridisierung, während sich das von "–" auf das Fehlen eines Signals an Hybridisierung bezieht.
Tabelle 2 (i)
Tabelle 2 (ii)
Tabelle 2 (iii)
Tabelle 2 (iv)
Tabelle 2 (v)
Tabelle 2 (vi)
Wie aus der vorstehenden Tabelle 2 offensichtlich wird, hat jede Sonde nur mit der DNA reagiert, die aus dem Herkunftsstamm (oder verwandten Stamm davon) erhalten wurde, und mit keiner DNA reagiert (hybridisiert), die aus anderen Stämmen als den Stämmen aus dem Herkunftsstamm erhalten wurde, deshalb ist ihre Spezifität bestätigt worden.
Beispiel 3: Analyse der Basensequenz
Die Basensequenz der erfindungsgemäßen DNA-Sonden (insgesamt 23 Sonden), deren Spezifität zur Herkunftsart in den Beispielen 1 und 2 bestätigt worden ist, wurden gemäß dem folgenden Verfahren sequenziert.
(1) Präparation von Plasmid-DNA
Escherichia coli K-12, JM109 Transformanten, wobei die subklonierten Insertionsfragmente (die sequenziert werden sollen) in pGem-3Z (Promega) enthalten sind, wurden in 5 ml Luria-Bastani-Medium (Bactotrypton, 10 g/l; Bactohefeextrakt, 5 g/l; NaCl, 10 g/l; pH-Wert mit 5 N NaOH eingestellt auf 7,0) geimpft und über Nacht gezüchtet.
Die Kulturflüssigkeit wurde zentrifugiert (5.000 U/min, 5 min) und die Bakterien gesammelt. 100 μl Lösung aus 50 mM Glukose/ 50 mM Tris-HCl (pH 8,0)/10 mM EDTA, das 2,5 mg/ml Lysozym (Sigma) enthielt, wurde zum Ausfällen zugegeben, und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen. 0,2 M NaON-Lösung, die 1% Natriumdodecylsulfat (Sigma) enthielt, wurde zu der so erhaltenen Suspension zugegeben und damit gemischt. 150 μl 5 M Kaliumacetatlösung (pH 4,8) wurde ferner zugegeben und damit gemischt, dann 15 Minuten lang auf Eis gestellt.
Der durch Zentrifugation (15.000 U/min, 15 min) erhaltene Überstand wurde mit Phenol/CHCl₃ behandelt, und dazu wurde das zweifache Volumen Ethanol gegeben, dann wurde ein Präzipitat durch Zentrifugation (12.000 U/min, 5 min) erhalten. Dieses Präzipitat wurde in 100 μl Lösung aus 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/0,1 mM EDTA gelöst, und i 0 mg/ml RNase A-Lösung (Sigma) wurde dazu gegeben, dann wurde es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen.
300 μl 0,1 M Natriumacetatlösung (pH-Wert 4,8) wurde zu dieser Präparation zugegeben und mit Phenol/CHCl₃ behandelt, dann wurde ein Niederschlag durch Zugeben von Ethanol zum Überstand erhalten. Die DNA-Proben wurden erzeugt, indem dieser Niederschlag getrocknet und in 10 μl destilliertem Wasser gelöst wurde.
2) Vorbehandlung zum Sequenzieren
Die Vorbehandlung zum Sequenzieren wurde mit AutoRead^TM Sequencing Kit (Pharmacia) durchgeführt.
Die Konzentration der DNA, um eine Matrize zu werden, wurde auf 5–10 μg in 32 μl eingestellt 32 μl Matrizen-DNA wurde in ein 1,5-ml-Miniröhrchen (Eppendorf) überführt und dazu 8 μl 2 M NaOH-Lösung gegeben, dann leicht damit gemischt. Nach sofortiger Zentrifugation wurde es für 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen.
7 μl 3M Natriumacetat (pH 4,8) und 4 μl destilliertes Wasser, dann 120 μl Ethanol wurden dazu gegeben, dann damit gemischt, und 15 Minuten lang auf Trockeneis stehen gelassen. DNA, welche durch 15 Minuten lange Zentrifugation gefällt worden ist, wurde gesammelt, und der Überstand wurde vorsichtig entfernt. Der so erhaltene Niederschlag wurde mit 70% Ethanol gewaschen und 10 Minuten lang zentrifugiert. Dann wurde der Überstand wieder vorsichtig entfernt und der Niederschlag unter vermindertem Druck getrocknet.
Der Niederschlag wurde in 10 μl destilliertem Wasser gelöst, dann wurden 2 μl Fluoreszenzprimer (0,42 A₂₆₀ Unit/10 ml, 4–6 pmol) {M13 Universalprimer; 5'-Fluoresceind[CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT]-3' (1,6 pmol/μl; 0,42 A₂₆₀ Unit/ml; M13-Gegenstrangprimer, 5'-Fluorescein-d[CAGGAAACAG CTATGAC]-3' (2,1 pmol/μl; 0,42 A₂₆₀ Unit/ml)) und 2 μl Kochsalzlösung zum Anlagern dazu gegeben und leicht gemischt.
Nach sofortiger Zentrifugation wurden sie bei 65°C 5 Minuten lang wärmebehandelt und schnell in eine 37°C warme Umgebung überführt und die Temperatur 10 Minuten lang gehalten. Nach dem Halten der Temperatur wurde sie 10 Minuten lang oder länger bei Raumtemperatur stehen gelassen und sofort zentrifugiert. Dann wurden Proben hergestellt, indem dazu 1 μl einer Verlängerungskochsalzlösung und 3 μl Dimethylsulfoxid gegeben wurden.
Vier Miniröhrchen sind mit einer der Markierungen „A", „C", „G" und „T" identifiziert worden, und gemäß der Markierung wurden 2,5 μl A-Mischung (gelöstes ddATP mit dATP, dCTP, c⁷dGTP und dTTP), C-Mischung (gelöstes ddCTP mit dATP, dCTP, c⁷dGTP und dTTP), G-Mischung (gelöstes ddGTP mit dATP, dCTP, c⁷dGTP und dTTP) oder T-Mischung (gelöstes ddTTP mit dATP, dCTP, C⁷dGTP und dTTP) wurden in jeweils ein identifiziertes Röhrchen gegossen. Jede Lösung wurde in gefrorenem Zustand aufbewahrt, und die Lösung wurde bei Verwendung eine Minute lang oder länger auf 37°C erwärmt.
2 μl verdünnte T7DNA-Polymerase (Pharmacia; 6–8 Units/2 μl) wurde zur DNA-Probe zugegeben und durch leichtes Pipettieren oder Mischen voliständig gemischt. Sofort nach dem Beenden des Mischens wurde diese gemischte Lösung in jeweils 4,5 μl Vierarten-Lösung gegossen, welche bei der bestimmten Temperatur gehalten wurde. Frische Spitzen wurden zum Zeitpunkt des Gießens verwendet.
Die Lösung ist fünf Minuten lang bei 37°C gehalten worden, dann wurden 5 μl Stoplösung in jede Reaktionslösung gegossen. Frische Spitzen wurden zum Gießen verwendet. Sofort nach 2–3 Minuten langem Halten der Lösung bei 90°C, wurde sie auf Eis gekühlt. 4–6 μl/Spur der Lösung wurden auf die Elektrophorese aufgetragen.
(3) Sequenzierung der Rasensequenz
Sequenzieren jeder Basensequenz der Sonden, die in den Beispielen 1 und 2 offenbart sind, mit der Spezifität gegen Staphylococcus aureus oder Staphylococcus epidermidis wurden mit dem A.L.F.-DNA-Sequenziersystem (Pharmacia) unter einer Elektrophoresebedingung von 45°C 6 Stunden lang durchgeführt.
Dann wurden die Basensequenzen der Sonden (SEQ ID NR.), die aus jedem verursachenden Bakterium von ansteckenden Krankheiten hergestellt wurden und in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgeführt sind, in der hier angefügten Sequenzliste offenbart.
Tabelle 3
Dadurch ist genetische Information hinsichtlich der spezifischen Stelle von jedem verursachenden Bakterium von ansteckenden Krankheiten (oder verwandten Bakterien davon) geklärt worden.
Gewerbliche Anwendungsmöglichkeit
Gemäß der Sonden der vorliegenden Erfindung, welche in den angehängten Patentansprüchen definiert sind, können zum Beispiel verursachende Bakterien von ansteckenden Krankheiten, welche in den Phagozyten eingebracht worden sind, ohne Vermehrung der Bakterien direkt nachgewiesen werden und schnell und genau identifiziert werden. Das heißt, entsprechend der Diagnose kann die Identifizierung der Bakterien unter Verwendung der erfindungsgemäßen Sonde mit einer einzelnen Probe verwirklicht werden dann kann die für die Diagnose erforderliche Zeit auf etwa ein bis zwei Tage verrtngert werden, während das herkömmliche Verfahren (mit niedriger Nachweisrate) 3–4 Tage erforderte, und die Nachweisrate bemerkenswert verbessern. Deshalb kann diese Erfindung objektive Faktoren zur Behandlung der Bakteriämie bereitstellen, dann die wirksame Behandlung im frühen Stadium der ansteckenden Krankheiten verwirklichen und es wird erwartet, dass sie die Sterblichkeit verringern kann.
Dann können diese Sonden künstlich hergestellt werden, indem die Rasensequenzen der Sonden geklärt werden, welche spezifisch mit primären Bakterien von ansteckenden Krankheiten reagieren. Ferner kann ein Teil der Information über die analysierten Basensequenzen zum schnellen Diagnostizieren der verursachenden Bakterien verwendet werden, indem DNA von verursachenden Bakterien von ansteckenden Krankheiten in der klinischen Probe mit PCR-Verfahren und Primern, die durch Gebrauchmachen der Information hergestellt werden, amplifiziert wird.
Ferner kann durch Vergleichen der Basensequenzen der genomischen DNA in der klinischen Probe mit der der vorliegenden Erfindung schnelle Identifizierung der Art der verursachenden Bakterien der ansteckenden Krankheiten verwirklicht werden.
Wie oben angegeben, stellt die vorliegende Erfindung wünschenswerte Sonden zur Diagnose ansteckender Krankheiten bereit, erwartet dann Nützlichkeiten als Faktor, um Prtmer für die PCR und eine Standardsequenz für einen Vergleich mit genomischer DNA in der klinischen Probe herzustellen, und erwartet ferner eine Wirkung, um wertvolle Hinweise zum Herstellen und Entwickeln der anderen Sonden bereitzustellen, welche spezifisch mit verursachenden Bakterien von ansteckenden Krankheiten reagieren.
Dann sollten, weil die Basensequenzen, die in der vorliegenden Anmeldung offenbart wurden, durch zufälliges Klonieren der genomischen DNA von klinischen Isolaten erhalten wurden, Nützlichkeiten der Basensequenzen der vorliegenden Erfindung auf die Komplementärstränge davon erweitert werden.
Ferner würde, obwohl angenommen wird, dass die DNA, die aus Widtypstämmen erhalten wird, den mutierten Teil enthält, ersichtlich aus der vorstehenden Offenbarung der Beispiele, der mutierte DNA-Teil die Nützlichkeiten, die aus der vorliegenden Erfindung abzuleiten sind, die die Spezifität der erfindungsgemäßen Sonden bei der Hybridisierung zur Diagnose von ansteckenden Krankheiten umfassen, und einen Gebrauch der Information über die Basensequenzen, die in der vorliegenden Anmeldung offenbart wurden, um die Prtmer für das PCR-Verfahren zu entwerten, um eine schnelle Diagnose der ansteckenden Krankheiten zu verwirklichen, nicht beeinflussen.
SEQUENZ-LISTE
(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES, LTD 7–10, DOSHO – MACHI 1 CHOME, CHUO-KU, OSAKA-SHI, OSAKA 541 JAPAN
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: SONDE ZUR DIAGNOSE EINER ANSTECKENDEN KRANKHEIT
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 23
(iv) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) TRÄGER – ART: 3.5'' Diskette, 1.44 Mb storage
(B) COMPUTER: IBM Compatible PC
(C) ARBEITSSYSTEM: COMPAQ 386 MS DOS
(D) SOFTWARE: WordPerfect (Version 5.1)
(v) AKTUELLE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDE-NUMMER: 93914968.8 VOLLSTÄNDIGE ANZAHL VON SEQUENZEN, WELCHE AUFGEFÜHRT SIND: 23

INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 1:
LÄNGE: 8959 Basen-Paare
TYP: Nukleinsäure
FASERUNG: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Staphylococcus aureus
STAMM: klinisch isoliertes SA-7
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 1:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 2:
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TYP: Nukleinsäure
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TOPOLOGIE: linear
MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Staphylococcus aureus
STAMM: klinisch isoliertes SA-24
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 2:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 3:
LÄNGE: 2082 Basen-Paare
TYP: Nukleinsäure
FASERUNG: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Staphylococcus aureus
STAMM: klinisch isoliertes SA-36
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 3:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 4
LÄNGE: 2885 Basen-Paare
TYP: Nukleinsäure
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TOPOLOGIE: linear
MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Staphylococcus aureus
STAMM: klinisch isoliertes SA-77
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 4
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 5:
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ORIGINAL-QUELLE:
ART: Staphylococcus epidermidis
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SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 5:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 6:
LÄNGE: 8654 Basen-Paare
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MOLEKULAR-TYP: genomische DNA 1
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Staphylococcus epidermidis
STAMM: klinisch isoliertes SE-22
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 6:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 7:
LÄNGE: 5024 Basen-Paare
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ORIGINAL-QUELLE:
ART: Staphylococcus epidermidis
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SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 7:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 8:
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MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Staphylococcus epidermidis
STAMM: klinisch isoliertes SE-37
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 8:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 9:
LÄNGE: 2291 Basen-Paare
TYP: Nukleinsäure
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MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Staphylococcus faecalis
STAMM: klinisch isoliertes S2-1
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 9:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 10:
LÄNGE: 3719 Basen-Paare
TYP: Nukleinsäure
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MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Enterococcus faecalis
STAMM: klinisch isoliertes S2-3
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 10:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 11:
LÄNGE: 3480 Basen-Paare
TYP: Nukleinsäure
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MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Enterococcus faecalis
STAMM: klinisch isoliertes S2-7
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INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 12:
LÄNGE: 2441 Basen-Paare
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MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Enterococcus faecalis
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SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 12:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 13:
LÄNGE: 9515 Basen-Paare
TYP: Nukleinsäure
FASERUNG: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Pseudomonas aeruginosa
STAMM: klinisch isoliertes P2-2
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 13:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 14:
LÄNGE: 2471 Basen-Paare
TYP: Nukleinsäure
FASERUNG: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Pseudomonas aeruginosa
STAMM: klinisch isoliertes P2-7
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 14:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 15:
LÄNGE: 5247 Basen-Paare
TYP: Nukleinsäure
FASERUNG: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Pseudomonas aeruginos
STAMM: klinisch isoliertes P2-17
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 15:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 16:
LÄNGE: 2812 Basen-Paare
TYP: Nukleinsäure
FASERUNG: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Pseudomonas aeruginos
STAMM: klinisch isoliertes P4-5
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 16:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 17:
LÄNGE: 3615 Basen-Paare
TYP: Nukleinsäure
FASERUNG: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Pseudomonas aeruginos
STAMM: klinisch isoliertes EC-24
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 17:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 18:
LÄNGE: 4954 Basen-Paare
TYP: Nukleinsäure
FASERUNG: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Pseudomonas aeruginos
STAMM: klinisch isoliertes EC-34
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 18:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 19:
LÄNGE: 3796 Basen-Paare
TYP: Nukleinsäure
FASERUNG: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Escherichia coli
STAMM: klinisch isoliertes EC-39
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 19:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 20:
LÄNGE: 5541 Basen-Paare
TYP: Nukleinsäure
FASERUNG: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Escherichia coli
STAMM: klinisch isoliertes EC-625
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 20:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 21:
LÄNGE: 6317 Basen-Paare
TYP: Nukleinsäure
FASERUNG: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Enterobacter cloacae
STAMM: klinisch isoliertes ET-12
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 21:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 22:
LÄNGE: 6914 Basen-Paare
TYP: Nukleinsäure
FASERUNG: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Enterobacter cloacae
STAMM: klinisch isoliertes ET-49
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 22:
INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 23:
LÄNGE: 5975 Basen-Paare
TYP: Nukleinsäure
FASERUNG: doppelt
TOPOLOGIE: linear
MOLEKULAR-TYP: genomische DNA
ORIGINAL-QUELLE:
ART: Klebsiella pneumoniae
STAMM: klinisch isoliertes KI-50
SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 23:

Claims

Sonde zur Diagnose von Infektionskrankheiten, umfassend DNA-Fragmente, die durch Verdau von DNA von Staphyloccocus aureus, der zu verursachenden Bakterien der Infektionskrankheiten gehört, mit dem Restriktionsenzym HindIII hergestellt wurden, wobei gilt: die Sonde besteht aus Basensequenzen, die in SEQ ID NR. 1 dargelegt sind, und reagiert spezifisch mit DNA von Staphyloccocus aureus.
Sonde nach Anspruch 1, wobei die Sonde nichtradioaktiv ist.
Sonde nach Anspruch 2, wobei die Sonde biotinyliert ist.