DE69735046T2

DE69735046T2 - Zusammensetzungen und Verfahren für den Nachweis von Mycobacterium kansasii

Info

Publication number: DE69735046T2
Application number: DE69735046T
Authority: DE
Inventors: Steven T. Santee Brentano; Irene San Diego Andruszkiewicz; Caroline F. Oceanside Knott
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1996-05-22
Filing date: 1997-05-22
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2017-05-23
Also published as: CA2255624C; WO1997044488A2; AU710996B2; WO1997044488A3; AU3132997A; JP2000511058A; ES2256871T3; ATE315102T1; EP0808907A3; EP0808907A2; EP0808907B1; US6218107B1; DK0808907T3; CA2255624A1; DE69735046D1; JP4241929B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die hierin beschriebene und beanspruchte Erfindung betrifft das Design und die Verwendung von Nukleinsäuresonden und Helfer-Oligonukleotiden zum Nachweisen von Nukleinsäuren von der Bakterienspezies Mycobacterium kansasii in Testproben, z. B. aus Rachenabstrichen, Gewebeproben, Körperflüssigkeiten und aus Kulturen.
Allgemeiner Stand der Technik
Mycobacterium kansasii ist ein langsam wachsendes photochromogenes Bakterium, das chronische Lungenerkrankung verursacht, die Tuberkulose ähnelt (L.G. Wayne und G.P. Kubica, 1986, „The Mycobacteria", S. 1435–1457, in Sneath et al., Hrsg., BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMIC BACTERIOLOGY, Bd. 2, Williams und Wilkins, Baltimore, USA). Unter den Mykobakterien ist M. kansasii, abgesehen von den komplexen Stämmen M. tuberculosis. und M. avium, eine der am häufigsten isolierten Spezies.
Von Nicht-Tuberkulose-Mykobakterien, wie M. kansasii, verursachte disseminierte Infektionen sind bei wachsender Zahl von mit AIDS infizierten Personen immer mehr zu einem Besorgnis erregenden Problem in der öffentlichen Gesundheitspflege geworden. M. kansasii ist derzeit das zweithäufigste Nicht-Tuberkulose-Mykobakterium, das bei mit HIV infizierten Patienten eine disseminierte Erkrankung verursacht (nach dem M. avium-Komplex).
Klassische Verfahren zur Identifizierung von Mykobakterien umfassen verschiedene biochemische Techniken, säurefeste Färbung, Zellmorphologie und HPLC-Analyse. M. kansasii-Zellen sind mittellange bis lange Stäbchen. Kolonien reichen von flachen bis erhabenen und glatten bis rauen Kolonietypen. M. kansasii-Kolonien sind in der Regel unpigmentiert, wenn sie im Dunkeln gezüchtet wurden, und werden nach Lichteinwirkung gelb (photochromogen). Biochemische Tests umfassen positive Nitratreduktion, Tween- und Harnstoffhydrolyse, Katalaseaktivität und Niacinproduktion. Es kann mehrere Monate dauern, mit diesen Identifikationsverfahren die Speziation eines Mykobakterien-Isolats durchzuführen.
Bestimmte Subspezies von M. kansasii sind atypisch. Siehe beispielsweise Ross et al., J. Clin., Microbiol. 30:2930–2933 (1992). Diese atypischen Subspezies weisen Variationen in ihrer 23S-rRNA-Sequenz auf und sind daher nicht unbedingt mit Sonden nachweisbar, die gegen 23S-rRNA gerichtet sind, die aus den typischen Stämmen von M. kansasii abgeleitet wurde. Diese atypischen Stämme sind jedoch als Erregeragenzien bei Infektionen in Zusammenhang gebracht worden und es ist daher wichtig, die atypischen Stämme als M. kansasii zu identifizieren. Folglich bezieht sich der Ausdruck M. kansasii, wie er hierin verwendet wird, auf sowohl typische als auch atypische Stämme des Organismus.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Nukleinsäurehybridisierungssonden für den schnellen und spezifischen Nachweis von M. kansasii in Testproben und insbesondere in menschlichen klinischen Spezimen bereitzustellen. Des Weiteren ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sonden bereitzustellen, die früher nicht nachweisbare Subspezies von M. kansasii nachweisen können.
Wie hierin verwendet, soll der Ausdruck „Testprobe" eine beliebige Probe bedeuten, von der vermutet wird, dass sie die beabsichtigte Target-Nukleinsäure enthält, und der Ausdruck umfasst, ist aber nicht darauf beschränkt: biologische Proben, Körperflüssigkeiten oder -ausscheidungen, wie Urin, Blut, Milch, Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit, Sputum, Speichel, Fäkalien, Lungenaspirate, Rachen- oder Genitalabstriche, klinische Spezimen, die eine oder mehrere der vorhergehenden enthalten, Umweltproben, Lebensmittelproben und Laborproben.
Bei Nukleinsäurehybridisierung handelt es sich um den Vorgang, durch den zwei Nukleinsäurestränge, die vollständig oder teilweise komplementäre Nukleotidsequenzen aufweisen, unter vorbestimmten Reaktionsbedingungen zusammengelangen, um ein stabiles, doppelsträngiges Hybrid mit spezifischen Wasserstoffbindungen zu bilden. Einer der Nukleinsäurestränge kann eine Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder eine Ribonukleinsäure (RNA) sein; folglich kann die Hybridisierung RNA:RNA-Hybride, DNA:DNA-Hybride oder RNA:DNA-Hybride umfassen.
Folglich bezieht sich der Ausdruck „Hybridisierung", wie in dieser Anmeldung verwendet, auf die Fähigkeit von zwei vollständig oder teilweise komplementären Nukleinsäure-Einzelsträngen, in einer antiparallelen Ausrichtung zusammenzugelangen, um eine stabile Struktur mit einer doppelsträngigen Region zu bilden. Die zwei konstituierenden Stränge dieser doppelsträngigen Struktur, manchmal ein Hybrid genannt, werden mit Wasserstoffbrückenbindungen zusammengehalten. Obwohl diese Wasserstoffbrückenbindungen sich am häufigsten zwischen Nukleotiden bilden, die die Basen Adenin und Thymin oder Uracil (A und T oder U) oder Cytosin und Guanin (C und G) enthalten, kann sich Basenpaarung zwischen Basen bilden, die nicht Mitglieder dieser „kanonischen" Paare sind. Nicht-kanonische Basenpaarung ist in der Technik wohl bekannt. Siehe z. B. The Biochemistry of the Nucleic Acids (Adams et al., Hrsg., 1992).
Bei Nukleinsäurehybridisierung handelt es sich um ein gebräuchliches Verfahren zum Nachweisen und Quantifizieren von Target-Nukleinsäuren mit spezifischen Nukleotidsequenzen. Derartige Verfahren sind zum Identifizieren und Klassifizieren von Organismen, Diagnostizieren infektiöser Erkrankungen und genetischen Anomalitäten, Prüfen von Lebensmitteln und Arzneimitteln und Identifizieren von Verbrechen verdächtiger Personen, neben zahlreichen anderen Zielen, von Nutzen. In der Regel verwenden Nukleinsäurehybridisierungsassays eine markierte Oligonukleotidhybridisierungsassay-Sonde mit einer Nukleinsäuresequenz, die zu der Targetsequenz komplementär ist. Solche Marker sind in der Technik wohl bekannt und können radioaktive Isotope, Enzyme oder fluoreszente, lumineszente oder chemilumineszente Gruppen umfassen; die Anmelder bevorzugen die Verwendung von chemilumineszenten Acridiniumestern als Markern. Siehe Arnold et al., US-Patentschrift Nr. 5,185,439, die Miteigentum an der vorliegenden Anmeldung genießt. Die Sonde wird mit einer Probe gemischt, von der vermutet wird, dass sie eine Nukleinsäure mit der Targetsequenz enthält, unter Hybridisierungsbedingungen, die dazu geeignet sind, das Fusionieren der zwei Stränge durch Wasserstoffbrückenbindung in der Komplementaritätsregion zu ermöglichen. Die Sonde hybridisiert dann an die in der Probe vorliegende Target-Nukleinsäure. Der resultierende Hybrid-Doppelstrang kann mittels verschiedener in der Technik wohl bekannter Verfahren nachgewiesen werden, wie Hydroxyapatit-Adsorption. Ebenfalls umfasst von diesen Techniken sind diejenigen, die das selektive Abbauen des auf der unhybridisierten Sonde vorliegenden Markers und dann das Messen der Markermenge, die mit der verbleibenden hybridisierten Sonde in Zusammenhang steht, umfasst, wie in Arnold et al., US-Patentschrift Nr. 5,283,174, offenbart, die Miteigentum an der vorliegenden Anmeldung genießt. Diese letztere Technik, „Hybridization Protection Assay" (HPA) genannt, wird derzeit von den Anmeldern bevorzugt.
Oftmals wird eine Testprobe aufgrund der Sensibilitätseinschränkungen des bestimmten verwendeten Markers nicht eine ausreichend große Anzahl von Nukleinsäuremolekülen enthalten, um einen direkten Nachweis oder eine direkte Quantifizierung mittels Nukleinsäurehybridisierung zu gestatten. In einem solchen Fall wird die Menge nachweisbarer Target-Nukleotidsequenz erhöht, bevor Nukleinsäurehybridisierung zum Identifizieren von deren Vorliegen oder Menge in der Testprobe verwendet wird. Diese Vorgehensweise wird Nukleinsäureamplifikation genannt und das Verfahren des Erhöhens der Menge der Target-Nukleinsäure wird als Amplifizieren der Target-Nukleinsäure oder Target-Nukleotidsequenz bezeichnet.
Amplifikationsverfahren umfassen die Verwendung von mindestens einem Nukleinsäurestrang, der eine Target-Nukleotidsequenz enthält, als einer Matrize in einer Nukleinsäure polymerisierenden Reaktion, um einen komplementären sekundären Strang zu produzieren, der die Target-Nukleotidsequenz enthält. Amplifikation kann an sowohl dem Sense- als auch dem Antisense-Strang eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls durchgeführt werden, das die Target-Nukleotidsequenz enthält. Durch Wiederholen dieses Vorgangs, unter Verwendung der Produkt-Nukleinsäuren als Matrizen in anschließenden Zyklen, nimmt die Anzahl von Nukleinsäuremolekülen mit der Target-Nukleotidsequenz schnell zu.
Es ist eine Reihe von Amplifikationsverfahren beschrieben worden; dazu zählen verschiedene Ausführungsformen der Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) (siehe z. B. Mullis et al., US-Patentschrift Nr. 4,683,195) und Verfahren, die In-vitro-Transkription (RNA-Synthese) in einem oder mehreren Schritten des Vorgangs einsetzen (siehe z. B. Murakawa et al., DNA 7:287–295, Burg et al., PCT-Anmeldung Nr. WO89/1050, Gingeras et al., PCT-Anmeldung Nr. WO88/10315, Kacian & Fultz, europäische Anmeldung Nr. 89313154, McDonough et al., PCT-Anmeldung Nr. WO94/03472, Kacian et al., PCT-Anmeldung Nr. WO93/22461, und Dattagupta et al. (in den Vereinigten Staaten von Amerika am 16. März 1994 eingereicht, US-Anmeldung mit dem Aktenzeichen 08/215,081)). Die letzten zwei dieser Referenzen genießen Miteigentum an der vorliegenden Anmeldung.
Eine Hybridisierungsassay-Sonde wird zum Nachweisen, Indizieren und/oder Quantifizieren des Vorliegens der beabsichtigten Target-Nukleinsäure verwendet; eine solche Sonde wird für gewöhnlich mit einem radioaktiven oder lumineszenten Atom oder einer nachweisbaren chemischen Gruppe, wie einem chemilumineszenten Rest, markiert. Die Anmelder bevorzugen die Verwendung von Acridiniumester-Derivaten als einem Markierungsreagens. Das Vorliegen der beabsichtigten Target-Nukleinsäure kann jedoch auch ohne die Verwendung einer markierten Sonde nachgewiesen werden.
Es können beispielsweise Hybride, die zwischen der Sonde und der Target-Nukleinsäure gebildet wurden, unter Verwendung. von Hydroxyapatit- oder Gelfiltration isoliert oder durch Verwendung von Elektrophorese mit nicht-denaturierendem Gel sichtbar gemacht werden. Manchmal wird die beabsichtigte Target-Nukleinsäure ein beliebiges einer Population von unterschiedlichen Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequenzen, die für gewöhnlich von einer biologischen Quelle stammen, enthalten. Lediglich beispielhaft und nicht einschränkend kann die Target-Nukleotidsequenz von den Nukleinsäuren einer Gattung von Organismen (aber nicht von Organismen außerhalb der Gattung) geteilt werden, bei denen der Nachweis eines beliebigen dieser erwünscht ist. Alternativ dazu kann die Target-Nukleotidsequenz auf eine Organismusspezies oder einen Stamm jener Spezies beschränkt sein.
Nicht alle Sonden sollen notwendigerweise nachweisbar sein. Manche Hybridisierungssonden, „Helfer-Oligonukleotide" oder „Helfersonden" genannt, sind dazu entworfen, die Fähigkeit einer separaten Assay-Sonde, sich an ihre Target-Nukleotidsequenz zu binden, zu fördern. Ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, glauben die Anmelder, dass Helfersonden das Binden der Assay-Sonde durch lokales Verringern des Umfangs intramolekularer Wasserstoffbrückenbindung in der Target-Nukleinsäure fördern, wodurch die Target-Nukleotidsequenz vermehrt für spezifische Hybridisierung mit der markierten Sonde zur Verfügung gestellt wird. Je nach dem Lage der Bindungsstelle der markierten Sonde und der sekundären Struktur der Target-Nukleinsäure können Helfersonden zu Nukleotidsequenzregionen gesteuert werden, die zur Bindungsstelle der markierten Sonde proximal sind, oder zu Regionen gesteuert werden, die zur Bindungsstelle distal sind, aber dennoch die Sondenbindung beeinflussen. Helfersonden werden in Hogan et al., US-Patentschrift Nr. 5,030,557, beschrieben, die Miteigentum an der aktuellen Anmeldung genießt.
Beschreibungen der Verwendung von Nukleinsäurehybridisierung zum Nachweisen des Vorliegens bestimmter Nukleinsäuresequenzen sind in Kohne, US-Patentschrift Nr. 4,851,330, und in Hogan et al., internationale Patentanmeldung Nr. WO8803957, gegeben, wobei beide dieser Referenzen Miteigentum an der vorliegenden Anmeldung genießen. Hogan beschreibt Verfahren zum Bestimmen des Vorliegens eines nicht-viralen Organismus oder einer Gruppe von nicht-viralen Organismen in einer Probe (z. B. Sputum, Urin, Blut und Gewebeschnitte, Lebensmittel, Erdboden und Wasser) unter Verwendung von Nukleinsäurehybridisierungstechniken.
Hogan, oben, beschreibt außerdem eine Reihe von Hybridisierungssonden, die spezifisch nur Target-Nukleotidsequenzen von ribosomaler RNA (rRNA) nachweisen, die zu einem spezifischen Organismus oder einer spezifischen Gruppe von Organismen gehören.
Yang et al., J. Clin. Microbiol. 31:2769–2772 (1993), offenbart die Isolierung einer Sequenz aus einem klinischen Isolat, die, wenn sie als eine Hybridisierungssonde verwendet wird, Spezifität für die M. kansasii-Spezies aufzeigt. Der darin offenbarte, von M. kansasii abgeleitete p6123-Klon enthält keine Region, die zu der Sequenz einer in der vorliegenden Erfindung offenbarten Sonde vollkommen homolog ist.
Die europäische Patentschrift Nr. 0669402 offenbart Nukleinsäuresequenzen, die als Amplifikationsprimer zum speziesspezifischen Nachweis und zur Identifikation von M. kansasii von Nutzen ist. Die Amplifikationsprimer sind von dem p6123-Klon abgeleitet, der vorher in Yang et al., oben, offenbart wurde, und zeigen als solche keine vollständige Sequenzhomologie zu einer beliebigen der in der vorliegenden Erfindung offenbarten Sonden.
Die US-Patentschrift Nr. 5,500,341 offenbart Oligonukleotidsonden und -primer, die Spezifität für M. kansasii in Nukleinsäurehybridisierungsassays und in Nukleinsäureamplifikationsreaktionen aufzeigen. Der von M. kansasii abgeleitete genomische Klon MK7 enthält keine Region, die zu der Sequenz einer in der vorliegenden Erfindung offenbarten Sonde vollkommen homolog ist.
Endozo et al., Abstracts of the General Meeting of the American Society for Microbiology, Bd. 95, Seite 133, offenbart die Identifizierung einer Subgruppe von M. kansasii mittels rRNA-Sequenzanalyse. Es wurde eine Gruppe von 11 Isolaten identifiziert, die für M. kansasii typische Charakteristika aufzeigten, jedoch Unterschiede in den variablen Regionen der 23S-rDNA-Gene aufwiesen.
Eine vollständige ribosomale 23S-DNA-Sequenz von M. kansasii ist in der GENBANK-DATENBANK als Zugangsnummer Z17212 erhältlich.
Zusammenfassung der Erfindung
Die dargebotene Erfindung offenbart und beansprucht Oligonukleotidhybridisierungsassay-Sonden und Helfer-Oligonukleotide, die dazu entworfen sind, zu spezifischen Regionen von M. kansasii-rRNA oder der diese kodierenden DNA oder zu einem Oligonukleotid oder einer Nukleinsäure, das bzw. die eine M. kansasii-rRNA- oder -rDNA-Nukleotidsequenz umfasst, im Wesentlichen daraus besteht oder daraus besteht, komplementär zu sein.
Die Hybridisierungssonden der vorliegenden Erfindung sind dazu entworfen, eine Target-Nukleinsäure in einer Region eines Moleküls mit einer spezifischen Target-Nukleotidsequenz unter Bedingungen, die den selektiven Nachweis der Target-Nukleinsäure ermöglichen, zu hybridisieren.
Folglich ist ein grundlegendes und neuartiges Charakteristikum der Hybridisierungssonden und Helfer-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung ihre Fähigkeit, unter geeigneten, definierten Hybridisierungsreaktionsbedingungen bevorzugt an eine vorbestimmte Region einer Target-Nukleinsäure von M. kansasii gegenüber Nukleinsäuren oder Nukleinsäureregionen, auf die nicht abgezielt wird, zu hybridisieren. Diese Spezifität hängt vom Komplementaritätsgrad zwischen den Nukleotidsequenzen der Regionen der Target-Nukleinsäure und der Hybridisierungssonde, die in den mittels Wasserstoffbrücken verbundenen Hybridisierungskomplex eingebunden ist, sowie den Hybridisierungsreaktionsbedingungen ab.
Die vorliegende Erfindung offenbart und beansprucht außerdem doppelsträngige Nukleinsäurehybridmoleküle, die zwischen den Hybridisierungssonden und ihren spezifischen Target-Nukleinsäuren gebildet werden. Zwischen Assay-Sonden und Target-Nukleinsäuremolekülen gebildete Hybride sind zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung von M. kansasii von Nutzen, da diese Strukturen sich nach der Hybridisierungsreaktion von der unhybridisierten Assay-Sonde physikalisch oder chemisch unterscheiden können. Hybride, die zwischen den Assay-Sonden und den Target-Nukleinsäuremolekülen gebildet wurden, beispielsweise können durch Verwendung von Hydroxyapatit, Gelfiltration, Gelelektrophorese und anderen verwandten Methoden von unhybridisierten Assay-Sonden segregiert werden. Wenn markierte Assay-Sonden verwendet werden, kann auf den Assay-Sonden vorliegender Marker als Teil der Hybride nachgewiesen werden, so dass der Marker auf den Hybriden das Vorliegen der Target-Nukleinsäure in der Originalprobe anzeigt. Wenn nicht markierte Assay-Sonden verwendet werden, kann das Vorliegen der Hybride mittels Spektrophotometrie, Farbstoffbindung und anderen wohl bekannten Verfahren nachgewiesen werden.
Alternativ dazu kann das Vorliegen von Hybriden nachgewiesen werden, wenn markierte Assay-Sonden verwendet werden, ohne das Erfordernis, die Hybride physikalisch von der unhybridisierten markierten Sonde zu segregieren. In Arnold et al., US-Patentschrift Nr. 5,283,174, ist der selektive Abbau des auf unhybridisierter Sonde vorliegenden Markers offenbart. Diese letztere Technik, „Hybridization Protection Assay" (HPA) genannt, wird derzeit von den Anmeldern bevorzugt.
Folglich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Oligonukleotidhybridisierungsassay-Sonden bereitzustellen, die M. kansasii von anderen Mikroorganismen in einer Testprobe unterscheiden können. Diese Sonden weisen einen hohen Grad an Spezifität für M. kansasii-Nukleinsäuren auf und werden an diese unter Hybridisierungsbedingungen hybridisieren, die die Hybridisierung derselben Sonde an Nukleinsäuren von eng damit verwandten Organismen, wie M. gastri, M. avium und M. intracellulare, nicht begünstigen.
Folglich ermöglicht die Verwendung von Hybridisierungsassay-Sonden den spezifischen Nachweis oder die spezifische Quantifizierung von M. kansasii in einer Testprobe, die diese Organismen enthält. Diese Sonden können für sich in einem Hybridisierungsassay verwendet werden oder können in Verbindung mit anderen Assay-Sonden und/oder Helfer-Oligonukleotiden verwendet werden. Die Hybridisierungsassay-Sonden können direkt zum Nachweisen nicht amplifizierter Target-Nukleinsäuren verwendet werden oder können zum Nachweisen von Nukleinsäuren mit M. kansasii-Nukleotidsequenzen, die mittels Nukleinsäureamplifikation erhalten wurden, verwendet werden.
Die Sonden der Erfindung können entweder spezifisch oder nicht-spezifisch für Stämme von M. kansasii sein. Wie oben erwähnt, existieren atypische Varianten von M. kansasii, die unterschiedliche Nukleinsäuresequenzen in ihrer 235-rRNA aufweisen. Zwei solche atypischen Subspezies, hierin als die „BOV"- und die „COU"-Subspezies gekennzeichnet, werden unten identifiziert. Sonden können so entworfen werden, dass sie sowohl typische als auch atypische Subspezies von M. kansasii einschließen oder eine Subspezies ausschließen. Folglich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Oligonukleotidhybridisierungsassay-Sonden und/oder -Sondenmischungen bereitzustellen, die alle M. kansasii-Organismen (typische und atypische) von Nicht-M. kansasiii-Organismen unterscheiden können. Weiterhin ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Oligonukleotidhybridisierungsassay-Sonden bereitzustellen, die eine Subspezies von M. kansasii-Organismen nachweisen und identifizieren können. Umfasst von diesen Sonden sind Sonden, die für die typischen M. kansasii-Organismen, M. kansasii-BOV-Subspezies und M. kansasii-COU-Subspezies spezifisch sind.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Nachweis von allen M. kansasii-Organismen und zum Unterscheiden von M. kansasii von Nicht-M. kansasii-Organismen bereitzustellen. Weiterhin ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Unterscheiden von Subspezies von M. kansasii, wie typischen, BOV und COU, voneinander bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die schnelle, spezifische und reproduzierbare Identifizierung von M. kansasii in einer Testprobe, die von einem Rachenabstrich oder einer anderen Probe stammt, durch Verwendung von Hybridisierungsassay-Sonden und Helfer-Oligonukleotiden, die gegen M. kansasii-Nukleinsäuren gerichtet sind, zu ermöglichen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung zum Steigern der Hybridisierungsrate einer M. kansasii-spezifischen Hybridisierungsassay-Sonde an ihre Target-Nukleinsäure sowie zum Steigern der Stabilität des dadurch gebildeten Hybrids durch Verwendung von Helfer-Oligonukleotiden, die an M. kansasii-Nukleinsäuren hybridisieren können, bereitzustellen, wodurch die Bindung der markierten Sonde an ihr Target unterstützt wird.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine Hybridisierungsassay-Sonde zum Nachweisen des Vorliegens von Mycobacterium kansasii in einer Probe bereit, wobei die Sonde von 10 bis 100 Basen lang ist und eine zusammenhängende Region mit mindestens 10 Basen aufweist, die zu einer zusammenhängenden Region mit mindestens 10 Basen perfekt komplementär ist, die in einer Targetsequenz vorliegt, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, dem Komplement von SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, dem Komplement von SEQ ID NO: 21 und SEQ ID NO: 22 ausgewählt ist. Die Sonde bildet unter stringenten Hybridisierungsbedingungen einen nachweisbaren Doppelstrang mit Nukleinsäure von Mycobacterium kansasii und bildet unter den stringenten Hybridisierungsbedingungen keinen nachweisbaren Doppelstrang mit Nukleinsäure von Mycobacterium avium, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium gastri, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium scrofulacelum, Mycobacterium simiae oder Mycobacterium tuberculosis.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Targetsequenz aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 20 ausgewählt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Targetsequenz aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, dem Komplement von SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 und dem Komplement von SEQ ID NO: 21 und SEQ ID NO: 22 ausgewählt.
Vorzugsweise ist die Basensequenz der Sonde, jedoch nicht die zusammenhängende Region mit 10 Basen umfassend, die zu einer zusammenhängenden Region mit mindestens 10 Basen perfekt komplementär ist, die in einer Targetsequenz vorliegt, zu mindestens 80 % zu der in der Targetsequenz vorliegenden Basensequenz komplementär. Mehr bevorzugt ist die Basensequenz der Sonde, jedoch nicht die zusammenhängende Region mit 10 Basen umfassend, die zu einer zusammen hängenden Region mit mindestens 10 Basen perfekt komplementär ist, die in einer Targetsequenz vorliegt, zu mindestens 90 % zu der in der Targetsequenz vorliegenden Basensequenz komplementär.
Vorzugsweise ist die Basensequenz der Sonde zu der in der Targetsequenz vorliegenden Basensequenz perfekt komplementär. Vorzugsweise ist die Basensequenz der Sonde von 10 bis 50 Basen lang.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Mycobacterium kansasii um die Mycobacterium kansasii-BOV-Subspezies. Alternativ dazu handelt es sich bei dem Mycobacterium kansasii um die Mycobacterium kansasii-COU-Subspezies. Vorzugsweise enthält die Sonde einen Marker.
Die Erfindung stellt einen nachweisbaren Doppelstrang bereit, der zwischen einer Sonde der Erfindung und Nukleinsäure von Mycobacterium kansasii gebildet wird. Die Erfindung stellt außerdem eine Sondenmischung zum Nachweisen des Vorliegens von Mycobacterium kansasii in einer Probe bereit. Die Sondenmischung umfasst eine Sonde der Erfindung und ein oder mehrere Helfer-Oligonukleotide. Vorzugsweise ist jedes des einen oder der mehreren Helfer-Oligonukleotide von 10 bis 100 Basen lang und weist eine zusammenhängende Region mit mindestens 10 Basen auf, die zu einer zusammenhängenden Region mit mindestens 10 Basen perfekt komplementär ist, die in einer Referenzsequenz vorliegt, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 und Komplementen davon ausgewählt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Referenzsequenz der Sondenmischung aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 27 und Komplementen davon ausgewählt.
Die Erfindung stellt eine Sondenmischung zum Nachweisen des Vorliegens von Mycobacterium kansasii in einer Probe bereit. Die Sondenmischung umfasst eine erste Hybridisierungsassay-Sonde der Erfindung, wobei die Targetsequenz aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 20 ausgewählt ist; und eine zweite Hybridisierungsassay-Sonde der Erfindung, wobei die Targetsequenz aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, dem Komplement von SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, dem Komplement von SEQ ID NO: 21 und SEQ ID NO: 22 ausgewählt ist.
Vorzugsweise umfasst die Sondenmischung weiterhin ein oder mehrere Helfer-Oligonukleotide. Vorzugsweise ist jedes Helfer-Oligonukleotid von 10 bis 100 Basen lang und weist eine zusammenhängende Region mit mindestens 10 Basen auf, die zu einer zusammenhängenden Region mit mindestens 10 Basen perfekt komplementär ist, die in einer Referenzsequenz vorliegt, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 und Komplementen davon ausgewählt ist.
Vorzugsweise umfasst die Sondenmischung weiterhin eine dritte Hybridisierungsassay-Sonde zum Nachweisen des Vorliegens von Mycobacterium kansasii in einer Probe. Die Sonde ist von 10 bis 100 Basen lang und weist eine zusammenhängende Region mit mindestens 10 Basen auf, die zu einer zusammenhängenden Region mit mindestens 10 Basen perfekt komplementär ist, die in einer dritten Targetsequenz vorliegt, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 19 ausgewählt ist. Die dritte Sonde bildet unter stringenten Hybridisierungsbedingungen einen nachweisbaren Doppelstrang mit Nukleinsäure von Mycobacterium kansasii und die dritte Sonde bildet unter den stringenten Hybridisierungsbedingungen keinen nachweisbaren Doppelstrang mit Nukleinsäure von Mycobacterium avium, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium gastri, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium scrofulacelum, Mycobacterium simiae oder Mycobacterium tuberculosis.
Vorzugsweise ist die Basensequenz der dritten Sonde von 10 bis 50 Basen lang. Vorzugsweise ist die Basensequenz der dritten Sonde, jedoch nicht die zusammenhängende Region mit 10 Basen umfassend, die zu einer zusammenhängenden Region mit mindestens 10 Basen perfekt komplementär ist, die in einer Targetsequenz vorliegt, zu mindestens 80 % zu der in der dritten Targetsequenz vorliegenden Basensequenz komplementär. Mehr bevorzugt ist die Basensequenz der dritten Sonde, jedoch nicht die zusammenhängende Region mit 10 Basen umfassend, die zu einer zusammenhängenden Region mit mindestens 10 Basen perfekt komplementär ist, die in einer Targetsequenz vorliegt, zu mindestens 90 % zu der in der dritten Targetsequenz vorliegenden Basensequenz komplementär. Am meisten bevorzugt ist die Basensequenz der dritten Sonde zu der in der dritten Targetsequenz vorliegenden Basensequenz perfekt komplementär. Vorzugsweise enthält die dritte Sonde einen Marker.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens von Mycobacterium kansasii in einer Probe bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte des Versehens der Probe mit mindestens einer Sonde oder einer Sondenmischung der Erfindung und des Inkubierens der Probe unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, so dass die Sonde bzw. die Sonden an Mycobacterium kansasii-Nukleinsäure hybridisieren, wodurch ein nachweisbarer Doppelstrang gebildet wird. Die Sonde bildet unter stringenten Hybridisierungsbedingungen keinen nachweisbaren Doppelstrang mit Nukleinsäure von Mycobacterium avium, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium gastri, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium scrofulacelum, Mycobacterium simiae oder Mycobacterium tuberculosis. Das Verfahren umfasst außerdem das Nachweisen des Doppelstrangs, falls dieser gebildet wurde, als einem Anzeichen für das Vorliegen von Mycobacterium kansasii in der Probe.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Kit zum Nachweisen des Vorliegens von Mycobacterium kansasii bereit. Das Kit umfasst eine Hybridisierungsassay-Sonde der Erfindung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf Hybridisierungsassay-Sonden und Helfer-Oligonukleotide gerichtet, die für den spezifischen Nachweis von M. kansasii-Nukleinsäuren, einschließlich jener von atypischen Stämmen von M. kansasii-Nukleinsäuren, verwendet werden sollen. Alle der hierin offenbarten und beanspruchten Oligonukleotide haben die Tatsache gemein, dass sie mindestens eine Nukleotidsequenzregion enthalten, die zu der einer M. kansasii-Nukleinsäure komplementär ist.
Definitionen
Die folgenden Ausdrücke haben die in der Patentschrift angegebenen Bedeutungen, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben.
Mit „Target-Nukleinsäure" ist eine einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäure mit einer Target-Nukleotidsequenz gemeint.
Mit „Oligonukleotid" ist ein einzelsträngiges Nukleotid-Polymer, das mehr als 2 Nukleotide lang ist, vorzugsweise zwischen 10 und 100 Nukleotiden, am meisten bevorzugt zwischen 12 und 50 Nukleotiden lang. Solche Oligonukleotide können durch Phosphodiesterverbindungen, durch Phosphorthioatverbindungen oder durch andere seltene oder nicht natürlich vorkommende Verbindungen verknüpft sein. Ein Oligonukleotid kann beispielsweise Peptidnukleinsäuren (PNAs) enthalten. Des Weiteren kann ein Oligonukleotid ungewöhnliche Nukleotide oder Nicht-Nukleotid-Teile, wie 2'-Methoxy- oder 2'-Halogenidribopyranosyl-Teile, aufweisen. Ein wie hierin definiertes Oligonukleotid ist eine Nukleinsäure, vorzugsweise DNA, kann aber auch RNA sein oder weist eine Kombination von kovalent verknüpften Ribo- und Desoxyribonukleotiden auf. Substitutionen von seltenen oder nicht natürlich vorkommenden Verbindungen und/oder ungewöhnlichen Nukleotiden oder Nicht-Nukleotid-Teilen dürfen nicht die Fähigkeit des Oligonukleotids beeinträchtigen, mit Targetsequenzen zu hybridisieren. Oligonukleo tidsonden mit einer definierten Sequenz können mittels Durchschnittsfachmännern bekannten Techniken, wie chemischer oder biochemischer Synthese, und mittels In-vitro- oder In-vivo-Expression aus rekombinanten Nukleinsäuremolekülen, z. B. bakteriellen oder retroviralen Vektoren, hergestellt werden. Wie von dieser Offenbarung vorgesehen, besteht ein Oligonukleotid nicht aus chromosomaler DNA oder den In-vivo-Transkriptionsprodukten davon.
Mit „Target-Nukleinsäuresequenz", „Target-Nukleotidsequenz" oder „Targetsequenz" ist eine spezifische erwünschte Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidsequenz gemeint, die die gesamte oder einen Teil der Nukleotidsequenz eines einzelsträngigen Target-Nukleinsäuremoleküls umfasst, und die dazu perfekt komplementäre Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidsequenz gemeint.
Bei einer „im Wesentlichen ähnlichen" Nukleotidsequenz handelt es sich um eine Nukleotidsequenz, die mit einer bestimmten identifizierten Nukleinsäuresequenz identisch ist oder im Vergleich zu dieser nicht mehr als 20 Fehlpaarungen oder interne Deletionen und/oder Additionen (mit Ausnahme von RNA- oder DNA-äquivalenten Nukleotide) aufweist. Ein Oligonukleotid mit einer zu einer identifizierten Sequenz in einer Referenznukleinsäure im Wesentlichen ähnlichen Nukleotidsequenz hat mit jener Referenznukleinsäure die selektive Hybridisierungsfähigkeit gemein. Darüber hinaus kann ein Oligonukleotid mit einer im Wesentlichen ähnlichen Nukleotidsequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäure mit einer zu der identifizierten Sequenz perfekt komplementären Nukleotidsequenz ein stabiles nachweisbares Hybrid bilden, wird jedoch mit einer Nicht-Target-Nukleinsäuresequenz kein stabiles nachweisbares Hybrid bilden. Diese im Wesentlichen ähnlichen Sequenzen können zusätzliche Nukleotide am 3'- und/oder 5'-Ende der identifizierten Sequenz aufweisen.
„Stringente" Hybridisierungsassaybedingungen beziehen sich auf Bedingungen, in denen eine spezifische Hybridisierungsassay-Sonde in der Lage ist, mit Target-Nukleinsäuren (vorzugsweise rRNA oder rDNA von M. kansasii) und nicht wesentlich mit anderen in der Testprobe vorliegenden Nukleinsäuren, die entweder von anderen Mikroorganismen (z. B. M. gastri, M. avium und M. intracellulare) oder von Menschen stammen, zu hybridisieren. Man wird zu schätzen wissen, dass diese Bedingungen in Abhängigkeit von Faktoren variieren können, darunter der GC-Gehalt und die Länge der Sonde, die Hybridisierungstemperatur, die Zusammensetzung des Hybridisierungsreagens bzw. der Hybridisierungslösung und das Ausmaß erstrebter Hybridisierungsspezifität. Beispiele spezifischer stringenter Hybridisierungsbedingungen sind in der Offenbarung unten bereitgestellt.
Mit „Sonde" ist ein einzelsträngiges Oligonukleotid gemeint, das eine Sequenz aufweist, die teilweise oder vollständig zu einer Nukleinsäuresequenz komplementär ist, deren Nachweis erstrebt wird, um unter stringenten Hybridisierungsbedingungen stabil daran zu hybridisieren. Im Fall einer gruppen- oder speziesspezifischen Sonde weist die Sonde die Fähigkeit auf, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen stabil an eine Target-Nukleinsäure und nicht an Nicht-Target-Nukleinsäuren zu hybridisieren, wie jene von Organismen außerhalb der phylogenetischen Gruppe oder Spezies. Sonden können, müssen jedoch nicht, Regionen aufweisen, die nicht zu einer Targetsequenz komplementär sind, solange solche Sequenzen die erwünschte Spezifität der Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen nicht wesentlich verändern. Wenn solche nicht komplementären Regionen vorliegen, können sie eine 5'-Promotorsequenz und/oder eine Bindungsstelle für RNA-Transkription, eine Restriktionsendonukleaseerkennungsstelle, eine nichtselektive Sequenz, die eine Immobilisierung der Sonde oder Hybridisierung mit einer spezifischen Target-Nukleinsäure ermöglicht, enthalten oder sie können Sequenzen enthalten, die eine erwünschte sekundäre oder tertiäre Struktur verleihen werden, wie eine katalytisch aktive Stelle oder eine Haarnadelstruktur an der Sonde, an der Target-Nukleinsäure- oder beiden. Eine Sonde kann mit einem Reportergruppenteil, wie einem Radioisotop, einem fluoreszenten oder chemilumineszenten Teil, mit einem Enzym oder anderen Liganden markiert werden, der bzw. das zum Nachweis oder zur Bestätigung dafür, dass die Sonde an die Targetsequenz hybridisiert ist, verwendet werden kann. Ein Verwendungszweck einer Sonde ist als eine Hybridisierungsassay-Sonde; Sonden können auch als therapeutische Oligonukleotide in vivo oder in vitro oder Antisense-Agenzien zum Blockieren oder Inhibieren der Gentranskription, des mRNA-Spleißens oder der Translation in kranke, infizierte oder pathogene Zellen verwendet werden.
Wie in dieser Offenbarung verwendet, bedeutet die Phrase „eine Sonde (oder ein Oligonukleotid) mit einer Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen aus einer Sequenz besteht, ausgewählt aus", dass die Sonde als ein grundlegendes und neuartiges Charakteristikum unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäure in einer Nukleotidsequenzregion mit einer Nukleotidsequenz, die zu einer der aufgeführten Nukleinsäuresequenzen der Gruppe genau komplementär ist, ein stabiles nachweisbares Hybrid bildet. Ein genaues Komplement umfasst unter dieser Definition die entsprechende DNA- oder RNA-Sequenz.
Mit „Nukleinsäurehybrid" oder „Hybrid" ist eine Nukleinsäurestruktur gemeint, die eine doppelsträngige, mittels Wasserstoffbrücken verbundenen Region enthält, vorzugsweise zwischen 10 und 100 Nukleotide lang, am meisten bevorzugt zwischen etwa 12 und 50 Nukleotide lang, wobei jeder Strang zu dem anderen komplementär ist und wobei die Region unter stringenten Hybridisierungsbedingungen ausreichend stabil ist, um durch Mittel, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Nachweis mit Chemilumineszenz- oder Fluoreszenzlicht, Autoradiographie oder Gelelektrophorese, nachgewiesen zu werden. Solche Hybride können RNA:RNA-, RNA:DNA- oder DNA:DNA-Doppelstrangmoleküle umfassen.
Mit „komplementär" ist gemeint, dass die Nukleotidsequenzen von ähnlichen Regionen von zwei einzelsträngigen Nukleinsäuren oder zwei verschiedenen Regionen derselben einzelsträngigen Nukleinsäure eine Nukleotidbasenzusammensetzung aufweisen, die ermöglicht, dass die Einzelstränge unter stringenten Hybridisierungsbedingungen zusammen in einer stabilen doppelsträngigen, mittels Wasserstoffbrücken verbundenen Region hybridisieren. Wenn eine zusammenhängende Sequenz von Nukleotiden einer einzelsträngigen Region mit einer analogen Sequenz von Nukleotiden der anderen einzelsträngigen Region eine Reihe von „kanonischen", mittels Wasserstoffbrückenbindungen verbundenen Basenpaaren bilden kann, so dass A mit U oder T gepaart ist und C mit G gepaart ist, sind die Nukleotidsequenzen „perfekt" komplementär.
Mit „konservativ modifizierte Varianten" sind Nukleinsäuren oder Oligonukleotide mit einer Nukleotidsequenz gemeint, die zu einer ersten Nukleotidsequenzregion einer ersten Nukleinsäure komplementär ist, wobei die erste Nukleotidsequenzregion zu einer zweiten Nukleotidsequenzregion, die in einer zweiten „Referenz"-Nukleinsäure enthalten ist, perfekt komplementär ist. Konservativ modifizierte Varianten weisen nicht mehr als 8 zusätzliche Nukleotide und nicht mehr als 8 Nukleotide weniger als die Referenznukleinsäure auf. Es versteht sich, dass solche konservativ modifizierten Varianten nicht-komplementäre Nukleotide am 5'- und 3'-Ende aufweisen können, die die Sonde länger als die Referenznukleotidsequenz machen. Konservativ modifizierte Varianten werden unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Target-Nukleinsäureregion mit einer M. kansasii-Nukleotidsequenz ein stabiles nachweisbares Hybrid bilden, werden aber mit Nicht-Target-Nukleinsäure kein stabiles nachweisbares Hybrid bilden.
Mit „Nukleinsäureamplifikation" oder „Target-Amplifikation" ist das Erhöhen der Anzahl von Nukleinsäuremolekülen mit mindestens einer Target-Nukleinsäuresequenz gemeint.
Mit „Helfer-Oligonukleotid" ist eine normalerweise nicht markierte Nukleinsäuresonde gemeint, die dazu entworfen ist, mit der Target-Nukleinsäure an einem anderen Ort als dem einer markierten Hybridisierungsassay-Sonde zu hybridisieren, wodurch entweder die Hybridisierungsrate der markierten Sonde gesteigert wird, die Schmelztemperatur (T_m) des Hybrids aus Target und markierter Probe erhöht wird oder beides.
Hybridisierungsbedingungen und Sonden-/Primerdesign
Die Hybridisierungsreaktionsbedingungen, von größter Bedeutung die Hybridisierungstemperatur und die Salzkonzentration in der Hybridisierungslösung, können so gewählt werden, dass die Hybridisierungssonden der vorliegenden Erfindung bevorzugt an Nukleinsäuren mit einer Target-Nukleotidsequenz von M. kansasii gegenüber anderen Nukleinsäuren, auf die nicht abgezielt wird und von denen vermutet wird, dass sie in der Testprobe vorliegen, zu hybridisieren. Bei verminderten Salzkonzentrationen und/oder erhöhten Temperaturen (erhöhte Stringenz genannt) verringert sich das Ausmaß an Nukleinsäurehybridisierung, da die Wasserstoffbrückenbindung zwischen gepaarten Nukleotidbasen in dem doppelsträngigen Hybridmolekül getrennt wird; dieser Vorgang wird „Schmelzen" genannt.
Allgemein ausgedrückt sind die stabilsten Hybride jene, die die größte Anzahl von zusammenhängenden, perfekt angepassten (d. h. mittels Wasserstoffbrücken verbundenen) Nukleotidbasenpaaren aufweist. Folglich würde von solchen Hybride für gewöhnlich erwartet, dass sie diejenigen sind, die zuletzt schmelzen, da die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen zunimmt. Eine doppelsträngige Nukleinsäureregion, die ein oder mehrere fehlgepaarte, „nicht-kanonische" oder unvollkommene Basenpaare enthält (was in einer schwächeren oder nicht existierenden Basenpaarung an jener Position in der Nukleotidsequenz einer Nukleinsäure resultiert), kann jedoch unter Bedingungen relativer hoher Stringenz trotzdem noch ausreichend stabil sein, um zu ermöglichen, dass das Nukleinsäurehybrid in einem Hybridisierungsassay ohne Kreuzreagieren mit anderen Nukleinsäuren, auf die nicht abgezielt wird und die in der Testprobe vorliegen, nachgewiesen wird.
Daher werden, je nach sowohl dem Ausmaß an Sequenzvariation zwischen Nukleinsäuren des Target-Organismus und jener von Nicht-Target-, aber eng damit verwandten Organismen einerseits als auch dem Ausmaß an Komplementarität zwischen der Nukleotidsequenz einer bestimmten Hybridisierungssonde und jener der Target-Nukleinsäure andererseits, eine oder mehrere Fehlpaarungen zwischen der Sonde und dem Target nicht notwendigerweise die Fähigkeit des Oligonukleotids, an Target- anstelle von Nicht-Target-Nukleinsäuren zu hybridisieren, aufheben.
Die Hybridisierungsassay-Sonden der vorliegenden Erfindung wurden ausgewählt, selektiert und/oder entworfen, um den Unterschied zwischen den Schmelztemperaturen des Hybrids aus Sonde und Target (T_m, als die Temperatur definiert, bei der sich die Hälfte der potentiellen doppelsträngigen Moleküle in einer gegebenen Reaktionsmischung in einem einzelsträngigen, denaturierten Zustand befindet) und der T_m eines fehlgepaarten Hybrids, der zwischen der Sonde und der rRNA oder rDNA der phylogenetisch am engsten damit verwandten Organismen, die in der Testprobe vorliegen, aber deren Nachweis nicht angestrebt wird, gebildet wurde, zu maximieren. Während die nicht markierten Amplifikationsoligonukleotide und Helfer-Oligonukleotide nicht einen solchen äußerst hohen Spezifitätsgrad wie die markierte Hybridisierungsassay-Sonde aufweisen müssen, um in der vorliegenden Erfindung von Nutzen zu sein, werden sie im Allgemeinen auf eine ähnliche Art und Weise entworfen, um bevorzugst an Target-Nukleinsäuren eines oder mehrerer Organismen gegenüber anderen Nukleinsäuren zu hybridisieren.
Nukleinsäuresequenzen
Nukleotidsequenzen der rRNA von M. kansasii und eng damit verwandten Organismen, wie M. gastri, M. avium und M. intracellulare, wurden von veröffentlichten Quellen erhalten oder wurden unabhängig davon von den Anmeldern unter Verwendung von in der Technik wohl bekannten Nukleinsäuresequenzierungstechniken bestimmt. Siehe z. B. Lane et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:6955 (1985).
Durch Koordinieren der rRNA-Sequenzen dieser verschiedenen Organismen haben die Anmelder spezifische diskrete Regionen mit relativer Interspeziesvariabilität entdeckt. Jene Regionen, die den größten Umfang an Nukleotidsequenzvariabilität zwischen dem Target-Organismus, M. kansasii, und den Organismen, auf die „nicht abgezielt" wird, z. B. M. gastri, M. avium und M. intracellulare, aufzeigten, wurden für das Design von speziesspezifischen Hybridisierungsassay-Sonden als potentielle Targetregionen gewählt.
1 zeigt die Konsensussequenzen zwischen den Nukleotiden 622 und 680 (wie es für die 23S-rRNA von E. coli nummeriert ist; die „650-Region") von 23S-rRNA für typische M. kansasii- als auch für zwei atypische Variantenstämme, die hierin als „COU" und „BOV" bezeichnet sind. SEQ ID NO: 1 ist vom typischen Stamm, wohingegen SEQ ID NO: 2 vom Stamm BOV ist und SEQ ID NO: 3 vom Stamm COU ist.
Lediglich Identifizieren von mutmaßlich eindeutigen, potentiellen Target-Nukleotidsequenzen garantiert nicht, dass eine funktionsgemäß speziesspezifische Hybridisierungsassay-Sonde dazu gebracht werden kann, an M. kansasii-rRNA oder -rDNR zu hybridisieren, die jene Sequenz umfasst. Verschiedene andere Faktoren werden die Eignung eines Nukleinsäureorts als einer Targetstelle für speziesspezi fische Sonden bestimmen. Beispiel: Das Erhöhen des GC-Gehalts der potentiellen Target-Nukleotidsequenz (und folglich des doppelsträngigen Hybrids aus Sonde und Target) erhöht im Allgemeinen. die Stabilität und folglich die T_m des Hybrids. Die Anzahl von zusammenhängenden Nukleotiden in jener Sequenzregion, die mit einem oder mehreren der Organismen, auf die „nicht abgezielt" wird, identisch sind, wirkt sich ebenfalls auf die Stabilität und folglich die T_m eines teilweise fehlgepaarten Hybrids zwischen einer Sonde, die zu M. kansasii-rRNA perfekt komplementär ist, und einer Nukleinsäure mit rRNA-Nukleotidsequenzen des Organismus oder der Organismen, auf den bzw. die nicht abgezielt wird, aus. Folglich kann, wenn der Unterschied zwischen den Schmelztemperaturen der zwei Hybride nicht ausreichend groß ist, normalerweise mindestens 2–5 °C, eine Sonde möglicherweise nicht speziesspezifisch sein, auch wenn sie auf eine eindeutige Region gerichtet ist.
Die gewünschte Hybridisierungstemperatur und die Zusammensetzung der Hybridisierungslösung (wie die Salzkonzentration) sind zwei Bedingungen, die eine große Auswirkung auf die Stabilität von doppelsträngigen Hybriden haben; diese Bedingungen müssen beim Konstruieren einer gruppen- oder speziesspezifischen Sonde berücksichtigt werden. Die thermische Stabilität von Hybrid-Nukleinsäuren nimmt mit der Ionenstärke der Reaktionsmischung zu. Andererseits können chemische Reagenzien, die Wasserstoffbrückenbindungen trennen, wie Formamid, Harnstoff, Dimethylsulfoxid und Alkohole, die thermische Stabilität der Hybride erheblich reduzieren.
Um die Spezifität einer Sonde für deren Target zu maximieren, wurden die beanspruchten Sonden der vorliegenden Erfindung dazu entworfen, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit ihren Targets zu hybridisieren. Unter derartigen Bedingungen werden nur Nukleinsäure-Einzelstränge mit einem hohen Komplementaritätsgrad aneinander hybridisieren; Nukleinsäure-Einzelstränge ohne einen solchen hohen Komplementaritätsgrad werden nicht dazu neigen, Hybride zu bilden. Dementsprechend kann die Stringenz der Assaybedingungen (d. h. die Temperatur und die Ionenstärke) den Umfang an Komplementarität bestimmen, der zwischen zwei Nukleinsäuresträngen bestehen sollte, um ein Hybrid zu bilden. In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung wird die Stringenz so gewählt, dass der Unterschied bei der Stabilität zwischen dem Hybrid, das zwischen der Sonde und der Target-Nukleinsäure gebildet wird, und potentiellen Hybriden, die zwischen der Sonde und etwaigen vorliegenden einzelsträngigen Nicht-Target-Nukleinsäuren gebildet werden, maximiert wird.
Die korrekte Sondenspezifität kann durch Minimieren der Länge der Sonde mit einer Nukleotidsequenz, die zu Sequenzen von Nicht-Target-Organismen perfekt komplementär ist, durch Vermeiden von an G und C reichen Regionen mit Homologie zu Nicht-Target-Sequenzen und durch Konstruieren der Sonde derart, dass sie so viele destabilisierende Fehlpaarungen zu Nicht-Target-Sequenzen wie möglich enthält, entwickelt werden.
Die Länge der Target-Nukleinsäuresequenz und folglich die Gesamtlänge der Sondensequenz kann für die Spezifität ebenfalls wichtig sein. In einigen Fällen können mehrere Nukleotidsequenzen in einer bestimmten „variablen" Region, die in Bezug auf den Ort und die Länge unterschiedlich sein kann, vorliegen, die als speziesspezifische Sondentargets verwendet werden könnten. In einigen Fällen kann einespeziesspezifische Sonde nicht auf eine bestimmte variable rRNA-Region ausgelegt werden, entweder weil die Sequenzregion für die Sonde nicht zugänglich ist oder aus anderen Gründen. Obwohl das Hybridisieren von Nukleinsäuren, die nicht perfekt komplementär sind, möglich ist, wird der längste Abschnitt einer perfekt homologen Basensequenz im Allgemeinen die Hybridstabilität bestimmen. Es können Oligonukleotidsonden mit unterschiedlichen Längen und unterschiedlicher Basenzusammensetzung verwendet werden.
Targetregionen, die starke intramolekulare Strukturen bilden, die auf die Hybridisierung inhibierend wirken, sind weniger bevorzugte Targetregionen. Desgleichen sollten Sondendesigns, die in umfassender Selbstkomplementarität resultieren, vermieden werden. Wie oben erläutert, ist Hybridisierung die Assoziation von zwei Einzelsträngen von komplementären Nukleinsäuren, um ein mittels Wasserstoffbrücken verbundenes, doppelsträngiges Hybrid zu bilden. Wenn einer oder beide der zwei Stränge ganz oder teilweise an intramolekularer oder intermolekularer Bindung beteiligt sind, werden dieser bzw. diese weniger dazu in der Lage sein, an der Bildung eines neuen intermolekularen Hybrids aus. Sonde und Target mitzuwirken. Von ribosomalen RNA-Molekülen beispielsweise ist bekannt, dass sie mittels Wasserstoffbrückenbindung sehr stabile intramolekulare Helices und sekundäre Strukturen bilden. Durch Entwerfen eines Hybridisierungsassays derart, dass ein wesentlicher Anteil der Targetsequenz bis zur Hybridisierung mit der Sonde in einem einzelsträngigen Zustand verbleibt, können die Rate und das Ausmaß der Hybridisierung zwischen Sonde und Target erheblich erhöht werden. Eine Methode, dies durchzuführen, besteht darin, als eine Target-Nukleotid sequenz eine Sequenz zu wählen, die an intramolekularer Wasserstoffbrückenbindung relativ unbeteiligt ist. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Hybridisierungsassay-Sonde in einer Sondenmischung mit Helfer-Oligonukleotiden verwendet werden, was die Targetstelle für die Hybridisierung mit der Hybridisierungsassay-Sonde zugänglicher machen kann. Solche Helfersonden sind allgemein beschrieben.
Eine Reihe von Formeln steht zur Verfügung, die einen Schätzwert der Schmelztemperatur für perfekt auf ihre Target-Nukleinsäuren angepasste Oligonukleotide bereitstellen. Eine solche Formel, T_m = 81,5 + 16,6 (log₁₀[Na⁺]) + 0,41 (Anteil G + C) – (600/N) (wobei N = die Länge des Oligonukleotids in Anzahl der Nukleotide), liefert einen. guten Schätzwert der T_m für Oligonukleotide, die zwischen etwa 14 und 70 Nukleotiden lang sind. Aus solchen Berechnungen kann eine anschließende empirische Verifizierung oder „Feinabstimmung" der T_m unter Verwendung von Screeningtechniken vorgenommen werden. (Zwecks weiterer Informationen zu Hybridisierung und Oligonukleotidsonden siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) (in Kapitel 11). Diese Referenz liefert auch Schätzwerte der Auswirkung von Fehlpaarungen auf die T_m eines Hybrids.
Herstellung von Oligonukleotiden
Ein Oligonukleotid besteht aus kovalent miteinander verknüpften Nukleotid-Untereinheiten. Die Zuckergruppen der Nukleotid-Untereinheiten können Ribose, Desoxyribose oder modifizierte Derivate davon, wie O-Methylribose oder 2'- Halogenidribose, sein. Die Nukleotid-Untereinheiten können durch Verbindungen wie Phosphodiesterverbindungen, modifizierte Verbindungen oder durch Nicht-Nukleotid-Teile verknüpft sein, die die Hybridisierung des Oligonukleotids nicht verhindern. Modifizierte Verbindungen umfassen jene Verbindungen, in denen eine Standard-Phosphodiesterverbindung durch eine andere Verbindung ersetzt wird, wie eine Phosphorthioatverbindung oder Methylphosphonatverbindung. Wie oben erwähnt, enthält das Oligonukleotid, wenn es als eine Hybridisierungsassay-Sonde verwendet wird, vorzugsweise eine Reportergruppe, wie Acridiniumester oder ein Radioisotop, um das Ermitteln der Hybridisierung der Sonde an deren Targetsequenz zu unterstützen.
Alle Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung, ob Hybridisierungsassay-Sonden oder Helfer-Oligonukleotide, können mit chemischen Gruppen modifiziert werden, um ihre Leistung zu steigern oder die Charakterisierung von Amplifikationsprodukten zu unterstützen. Hauptkettenmodifizierte Oligonukleotide, wie jene, die Phosphorthioat- oder Methylphosphonatgruppen aufweisen, die die Oligonukleotide gegenüber der nukleolytischen Aktivität bestimmter Polymerasen resistent machen, beispielsweise ermöglichen die Verwendung solcher Enzyme in einer Amplifikations- oder anderen Reaktion. Ein weiteres Modifikationsbeispiel umfasst das Verwenden von Nicht-Nukleotid-Linkern (z. B. Arnold et al., europäische Patentanmeldung 88308766-0), die zwischen Nukleotiden oder an einem Ende der Oligonukleotidkette eingebunden sind und die Hybridisierung oder die Elongation der Primer nicht verhindern.
Wie oben offenbart, kann das 5'-Ende der Oligonukleotide so modifiziert werden, dass es gegenüber der in manchen Nukleinsäurepolymerasen vorliegenden 5'-Exonukleaseaktivität resistent ist. Solche Modifikationen können mittels Hinzufügen einer Nicht-Nukleotid-Gruppe zu dem 5'-terminalen Nukleotid des Primers unter Verwendung von Techniken, wie jenen, die von Arnold et al., oben, mit dem Titel „Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes", beschrieben werden, durchgeführt werden.
Oligonukleotidhybridisierungsassay-Sonden an M. kansasii-rRNA und -rDNA
Die hierin offenbarten und beanspruchten Oligonukleotidhybridisierungsassay-Sonden sind dazu in der Lage, bevorzugt an Target-Nukleinsäuren, die Nukleotidsequenzen von M. kansasii-rRNA oder -rDNA enthalten, gegenüber der Nukleinsäuren von phylogenetisch eng damit verwandten Bakterienspezies, vorzugsweise M. gastri, M. avium und M. intracellulare, zu hybridisieren. Diese Hybridisierungsassay-Sonden wurden auf Grundlage eines Vergleichs der Nukleotidsequenzen von entsprechenden Regionen der ribosomalen RNA von M. kansasii, einschließlich der rRNA von M. kansasii-Varianten, und der phylogenetisch eng damit verwandten Spezies entworfen, selektiert und/oder ausgewählt.
Die Hybridisierungsassay-Sonden der vorliegenden Erfindung sind zu den folgenden Target-rRNA-Nukleotidsequenzen komplementär:
und DNA-Versionen davon, in denen Uracil durch Thymin ersetzt ist:
oder die zu diesen Sequenzen perfekt komplementären Nukleotidsequenzen.
Die Hybridisierungssonden können von der Länge her von 10, 11, 12, 13, 14 oder 15 bis 100 Nukleotide variieren und sind vorzugsweise zwischen 10 und 50 Nukleotide lang. Die Sonden müssen dazu in der Lage sein, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die identifizierten Targetregionen zu hybridisieren, wie oben definiert. Als solche müssen sie eine zusammenhängende Region mit mindestens 10 Basen aufweisen, die zu einer zusammenhängenden Region mit mindestens 10 Basen perfekt komplementär ist, die in einer. Targetsequenz vorliegt. Des Weiteren muss die Hybridisierung an die zusammenhängende Region ein nachweisbares Hybrid mit M. kansasii-Nukleinsäure erzeugen und darf nicht dazu in der Lage sein, mit Nicht-Target-Nukleinsäure, wie der von M. avium, M. gastri oder M. intracellulare, ein nachweisbares Hybrid zu bilden.
Bevorzugte Ausführungsformen dieser Oligonukleotidhybridisierungsassay-Sonden haben die Nukleotidsequenz:
und RNA-Versionen davon, in denen Thymin durch Uracil ersetzt ist:

oder die dazu perfekt komplementären Nukleotidsequenzen.
Kernsequenzen dieser bevorzugten Oligonukleotidhybridisierungsassay-Sonden haben die Nukleotidsequenz:
Die Oligonukleotidhybridisierungsassay-Sonden können entweder einzeln oder in Kombination verwendet werden. Sonden, die SEQ ID NO: 7 CGCTCGCGCGCGATACGC entsprechen, und ihre verwandten Sonden können zum Nachweis von typischem M. kansasii verwendet werden; Sonden, die SEQ ID NO: 8 entsprechen, und ihre verwandten Sonden können zum Nachweis von atypischen M. kansasii-BOV-Stämmen verwendet werden; Sonden, die SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 entsprechen, und ihre verwandten Sonden können zum Nachweis von atypischen M. kansasii-CQU-Stämmen verwendet werden. Kombinationen dieser Sonden können zum Nachweis der entsprechenden Kombinationen von M. kansasii-Stämmen verwendet werden.
Die Oligonukleotidhybridisierungsassay-Sonden der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise mit einem nachweisbaren. Marker, wie einem Radioisotop, einem fluoreszenten oder chemilumineszenten Teil, mit einem Enzym oder einem anderen Liganden markiert, das bzw, der zum Nachweis oder zur Bestätigung, dass die Sonde an die Targetsequenz hybridisiert ist, verwendet werden kann. Die Anmelder bevorzugen die Verwendung von chemilumineszenten Acridiniumestern als Markern. Siehe Arnold et al., US-Patentschrift Nr. 5,185,439, die Miteigentum an der vorliegenden Anmeldung genießt. Die Assay-Sonde wird mit einer Probe gemischt, von der vermutet wird, dass sie eine Nukleinsäure mit der Targetsequenz enthält, unter Hybridisierungsbedingungen, die dazu geeignet sind, das Fusionieren der zwei Stränge durch Wasserstoffbrückenbindung in der Komplementaritätsregion zu ermöglichen.
Die Sonde bzw. die Sonden können auch mit einem oder mehreren nicht markierten Helfer-Oligonukleotide kombiniert werden, um die Bindung an die Nukleinsäure mit der Target-Nukleotidsequenz von M. kansasii zu unterstützen. Die Sonden hybridisieren dann an die in der Probe vorliegende Target-Nukleinsäure; die resultierenden Hybrid-Doppelstränge können getrennt und mittels verschiedener in der Technik wohl bekannter Techniken nachgewiesen werden, wie Hydroxyapatit-Adsorption und Radioaktivitätsüberwachung. Ebenfalls umfasst von diesen Techniken sind diejenigen, die das selektive Abbauen des auf der unhybridisierten Sonde vorliegenden Markers und dann das Messen der Markermenge, die mit der verbleibenden hybridisierten Sonde in Zusammen hang steht, umfasst, wie in Arnold et al., US-Patentschrift Nr. 5,283,174, offenbart, die Miteigentum an der vorliegenden Anmeldung genießt. Diese letztere Technik wird derzeit von den Anmeldern bevorzugt.
Beim Nachweis von M. kansasii verwendete Helfer-Oligonukleotide
Zum Unterstützen der Hybridisierung der Hybridisierungsassay-Sonden an die Target-Nukleinsäure wurden spezifische Helfer-Oligonukleotide verwendet. Helfer-Oligonukleotide sind in Hogan und Milliman, US-Patentschrift Nr. 5,030,557, beschrieben, die Miteigentum an der vorliegenden Anmeldung genießt. Spezifische Helfer-Oligonukleotide zum Unterstützen des spezifischen Nachweises von M. kansasii haben Nukleotidsequenzen, die zu einer M. kansasii-RNA-Nukleotidsequenz komplementär sind:
und DNA-Versionen davon, in denen Uracil durch Thymin ersetzt ist:
oder die dazu perfekt komplementären Nukleotidsequenzen.
Bevorzugte Ausführungsformen dieser Helfer-Oligonukleotide sind Oligonukleotide mit der Nukleotidsequenz:
und RNA-Versionen davon, in denen Thymin durch Uracil ersetzt ist:
oder die dazu perfekt komplementären Nukleotidsequenzen.
Helfer-Oligonukleotide können im Allgemeinen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen verwendet werden, sind aber nicht notwendigerweise bei ihrer Selektivität speziesspezifisch, d. h, die Target-Nukleotidsequenzen für die Helfer-Oligonukleotide sind nicht notwendigerweise eindeutig für die Spezies M. kansasii. Vorzugsweise werden Hybridisierungsassay-Sonden in Kombination mit Helfer-Oligonukleotiden zum Nachweis von M. kansasii verwendet.
Die folgenden Beispiele verschiedener Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind lediglich zur Veranschaulichung und sollen nicht den Schutzumfang der Erfindung einschränken.
Beispiel 1
Die DNA-Sequenzen, die für die 23S-rRNA von verschiedenen Stämmen von M. kansasii kodieren, wurden unter Verwendung von PCR-Amplifikation und Zyklussequenzierung erhalten.
Die verschiedenen 23S-rRNA-Sequenzen von M. kansasii wurden mit denen einiger seiner phylogenetisch nächsten Nachbarn verglichen, einschließlich M. gastri, M. avium und M. intracellulare. Von der Region, die einer E. coli-Region in der Nähe des Nukleotids 650 entspricht, wurde festgestellt, dass sie speziesspezifische Variationen aufweist, die für das Sondendesign verwendet werden könnten. Sonde SEQ ID NO: 7, Sonde SEQ ID NO: 8 und Sonde SEQ ID NO: 9 wurden als die beste Unterscheidung zwischen den rRNA-Sequenzen von M. kansasii, einschließlich der atypischen Varianten, und den anderen, eng damit verwandten Organismen bereitstellend ausgewählt.
Beispiel 2
In diesem Versuch wurde die Spezifität der Hybridisierungssonde mit der Nukleotidsequenz nach SEQ ID NO: 8 mittels Hybridisierung an die eng verwandten Organismen M. gastri und M. tuberculosis geprüft. Ein Helfer-Oligonukleotid mit der Sequenz nach SEQ ID NO: 13 wurde verwendet, um die Hybridisierung der Hybridisierungsassay-Sonden an die Target-Nukleinsäure zu unterstützen. Es wurden ATCC-Stämme von M. kansasii, M. gastri und M. tuberculosis verwendet. Die Organismen wurden in geeignete feste Medien inokuliert und zur log-Phase gewachsen. Eine mit Wuchs gefüllte 1-μl-Impföse von jeder Kultur wurde zu einem Bakterienlyseröhrchen gegeben, das Glasperlen und 200 μl Lyselösung enthielt, die aus 5 % Sorbit, 2,85 mM Natriumazid, 3,7 mM Hepes, 0,035 % Triton X-100, 50 mM Succinat, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, 1 % Lithiumlaurylsulfat (LLS) und 600 mM LiCl bestand. Die Röhrchen wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur beschallt, um die Organismen zu lysieren, und dann 10 Minuten lang bei 95 °C ± 5 °C inaktiviert.
Die Sonden wurden mit Acridiniumester markiert. Für jede Sonde wurden ungefähr 2,5 × 10⁶ RLE (relative Lichteinheiten – eine Maßeinheit der Anzahl von Photonen, die von einem Luminometer erkannt werden) verwendet. Die Hybridisierungen wurden 15 Minuten lang bei 60 °C in einer Lösung durchgeführt, die 0,05 M Lithiumsuccinat, pH 5, 0,6 M LiCl, 1 % (w/v) Lithiumlaurylsulfat (LLS), 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 10 mM Ethylenglykolbis(betaaminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA) enthielt. Dreihundert Mikroliter einer Lösung, die 0,15 M Natriumtetraborat, pH 8,5, und 1 % Triton^® X-100 enthielt, wurden in jedes Röhrchen gegeben und jede Reaktionsmischung wurde 8 Minuten lang bei 60 °C inkubiert und auf Raumtemperatur abgekühlt. Der Nachweis der Hybridisierung wurden in einem LEADER^® I-Luminometer von Gen-Probe (Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA, USA) analysiert. Das Luminometer injiziert automatisch zwei Reagenzien, wobei das erste 1 mM Salpetersäure und 0,1 % Wasserstoffperoxid umfasst und das zweite 1 N Natriumhydroxid umfasst. Die Assayergebnisse wurden in RLE angegeben. RLE-Werte, die höher als 30.000 RLE waren, wurden als eine positive Reaktion angesehen. Bei diesen Versuchen wurde jede Reaktion in doppelter Ausfertigung durchgeführt und die Ergebnisse sind unten angezeigt.
Tabelle 1: Nachweis von M. kansasii-Nukleinsäure unter Verwendung einer Hybridisierungsassay-Sonde mit einer Nukleotidsequenz nach SEQ ID NO: 2.
TABELLE 1
Beispiel 3
In diesem Versuch wurde die Spezifität der Hybridisierungssonden mit den Nukleotidsequenzen nach SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 mittels Hybridisierung dieser Sonden an atypische Stämme von M. kansasii geprüft. Die Stämme 1–9 wurden als der BOV-Stamm klassifiziert, während die Stämme 10–11 als der COU-Stamm klassifiziert wurden. Zellwachstum und Lyse, Hybridisierung und Nachweis waren wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Hybridisierung wurde durch die Verwendung von Helfersonden in jeder Hybridisierungsreaktion gefördert. Für Sonden mit den Nukleotidsequenzen nach SEQ ID NO: 8 wurden Helfersonden mit der Nukleotidsequenz nach SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15 verwendet; für Sonden mit den Nukleotidsequenzen nach SEQ ID NO: 9 wurden Helfersonden mit der Nukleotidsequenz nach SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 13 verwendet. Die Ergebnisse demonstrieren die Spezifität der Sonden für die zwei Typen von Variantenstämmen von M. kansasii.
Tabelle 2: Nachweis von atypischer M. kansasii-Nukleinsäure unter Verwendung von Hybridisierungsassay-Sonden mit einer Nukleotidsequenz nach SEQ ID NO: 8 oder SEQ ID NO: 9.
TABELLE 2
Beispiel 4
In diesem Versuch wird die Spezifität der Hybridisierungssonde mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 7 durch Hybridisierung mit einer Reihe von anderen, eng verwandten Organismen demonstriert. Zellwachstum und Lyse waren wie in Beispiel 2 beschrieben, unter Verwendung von RNA, die aus einer Kolonie bzw. > 10⁸ Organismen ausgelöst wurde: Die Hybridisierung war wie in Beispiel 2 beschrieben, unter Verwendung von Helfersonden mit der Nukleotidsequenz nach SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 14. Der Nachweis war wie in Tabelle 2 beschrieben.
Tabelle 3: Nachweis von M. kansasii-Nukleinsäure unter Verwendung der Hybridisierungsassay-Sonde mit der Nukleotidsequenz nach SEQ ID NO: 7 und Helfersonden mit den Nukleotidsequenzen nach SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 14.
TABELLE 3
Beispiel 5
In diesem Versuch wird die Spezifität der Hybridisierungssonde mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 7 für M. kansasii weiter durch Hybridisierung an einen breiten phylogenetischen Querschnitt von Organismen demonstriert. Zellwachstum und Lyse waren wie in Beispiel 4 beschrieben. Hybridisierung und Nachweis waren wie in Beispiel 4 beschrieben, unter Verwendung derselben Helfersonden. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 4 unten dargestellt.
Tabelle 4: Nachweis von M. kansasii-Nukleinsäure unter Verwendung von Hybridisierungsassay-Sonden mit einer Nukleotidsequenz nach SEQ ID NO: 7.
TABELLE 4
Beispiel 6
In diesem Versuch wurde die Spezifität einer Sondenmischung, die alle drei entworfenen Sonden (SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9) und beide Helfersonden (SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 14) enthielt, gegen Standardbakterienstämme geprüft. Insgesamt 55 ATCC-Referenzstämme von Mykobakterien (ATCC = American Type Culture Collection) wurden bewertet. Diese Stämme stellten die mit M. kansasii am engsten verwandten Organismen dar. Die Standardspezifitätsprüfung wurde unter Verwendung von Wuchs durchgeführt, der aus aktiv wachsenden Kulturen der ATCC-Stämme gewonnen wurde, mit Ausnahme von Mycobacterium haemophilum, für den keine Zellen verfügbar waren. Stattdessen wurde rRNA von Mycobacterium haemophilum mit einer Konzentration verwendet, die zu der der wachsenden Zellkulturen äquivalent war. Zellwachstum und Lyse waren wie in Beispiel 2 beschrieben. Hybridisierung und Nachweis waren wie in Beispiel 2 beschrieben. Alle eng verwandten Mykobakterien ergaben negative Ergebnisse von weit unter dem Cut-off-Wert von 30.000 RLE.
Tabelle 5: Spezifität von Sonden mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 für M. kansasii gegenüber anderen Mykobakterien.
TABELLE 5
Beispiel 7
In diesem Versuch wurde die Spezifität der Mischung von Sonden und Helfern, die in Beispiel 6 verwendet wurde, gegen Standardbakterienstämme geprüft. Insgesamt 68 ATCC-Referenzstämme (ATCC = American Type Culture Collection) wurden bewertet. Diese Stämme stellten einen phylogenetischen Querschnitt von Organismen dar. Die Standardspezifitätsprüfung wurde unter Verwendung von Wuchs durchgeführt, der aus aktiv wachsenden Kulturen der ATCC-Stämme gewonnen wurde. Zellwachstum und Lyse waren wie in Beispiel 2 beschrieben. Hybridisierung und Nachweis waren wie in Beispiel 2 beschrieben. Alle Organismen des phylogenetischen Querschnitts ergaben negative Ergebnisse von weit unter dem Cut-off-Wert von 30.000 RLE.
Tabelle 6: Spezifität von Sonden mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 für M. kansasii gegenüber einem phylogenetischen Querschnitt von Organismen.
TABELLE 6
Beispiel 8
Die Mischung von Hybridisierungssonden (in Beispiel 6 gezeigt) wurde auf Spezifität für M. kansasii gegen 58 klinische Isolate, die 7 Spezies von Mykobakterien darstellen, geprüft. Zellkultur und -wachstum und Hybridisierung waren wie in Beispiel 2 beschrieben. Es wurden keine Kreuzreaktionen mit eng verwandten klinischen Isolaten beobachtet.
Tabelle 7: Spezifität der Mischung von Sonden und Helfern für M. kansasii in klinischen Isolaten.
TABELLE 7
Beispiel 9
In diesem Versuch wurde die Sensibilität der Sonden/Helfermischung (in Beispiel 6 gezeigt) mit typischen und atypischen M. kansasii-rRNA geprüft. Die rRNA wurde in Konzentrationen von 0, 0,1, 0,25, 05 und 1 ng/μl verwendet. Die Prüfung wurde für jede Konzentration und jeden RNA-Typ in doppelter Ausfertigung durchgeführt. 100 μl rRNA von entweder dem typischen Stamm von M. kansasii, dem atypischen BOV-Stamm oder dem atypischen COU-Stamm wurden zu Röhrchen gegeben, die lyophilisierte Sonde und Hybridisierungsreagenzien enthielten, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Reaktionsmischungen wurden gevortext und 15 Minuten lang bei 60 °C hybridisiert. Der Nachweis war wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Ergebnisse zeigen, dass die Sonden leicht reagieren und dazu in der Lage sind, geringe Mengen von typischer und atypischer M. kansasii-rRNA nachzuweisen.
Tabelle 8: Sensibilitätsprüfung der Mischung von Sonden und Helfern für typische und atypische rRNAs.
TABELLE 8
Beispiel 10
Dieser Versuch prüfte die Sensibilität der Sonden/Helfermischung von Beispiel 6 zum Nachweisen von M. kansasii-rRNA bei Anwesenheit von Nicht-Targetzellen mit deren rRNA und rDNA. Zellen von M. avium, M. gastri und M. tuberculosis wurden gezüchtet und lysiert, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Proben wurden mit der entsprechenden Mischung aus lysierten Nicht-Targetzellen und M. kansasii-rRNA in einem Bereich von 0 ng bis 100 ng, wie angegeben, hergestellt und Hybridisierung und Nachweis wurden wie in Beispiel 2 beschrieben vorgenommen. Die Ergebnisse zeigen eine gute Signalwiederherstellung bei Anwesenheit einer großen Anzahl (etwa 1,5 × 10⁷) von Nicht-Targetzellen.
Tabelle 9: Sensibilität der Sonden/Helfermischung bei Anwesenheit von Nicht-Targetzellen.
TABELLE 9
Die Ausführungsformen, die in den verschiedenen, oben beschriebenen Beispielen gezeigt sind, bestätigen, dass die hierin beschriebenen Oligonukleotide dazu in der Lage sind, M. kansasii-Nukleinsäuren nachzuweisen, und in einem Assay zum Unterscheiden von M. kansasii von seinen bekannten, nächsten phylogenetischen Nachbarn verwendet werden können. Keines der hierin beschriebenen Beispiele soll die vorliegende Erfindung auf die Ausführungsformen der vorstehenden Offenbarung beschränken; weitere Ausführungsformen liegen innerhalb der folgenden Ansprüche.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Hybridisierungsassay-Sonde zum Nachweisen des Vorliegens von Mycobacterium kansasii in einer Probe, wobei die Sonde von 10 bis 100 Basen lang ist und eine zusammenhängende Region mit mindestens 10 Basen aufweist, die zu einer zusammenhängenden Region mit mindestens 10 Basen perfekt komplementär ist, die in einer Targetsequenz vorliegt, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, dem Komplement von SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, dem Komplement von SEQ ID NO: 21 und SEQ ID NO: 22, wobei die Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen einen nachweisbaren Doppelstrang mit Nukleinsäure von Mycobacterium kansasii bildet und wobei die Probe unter den Bedingungen keinen nachweisbaren Doppelstrang mit Nukleinsäure von Mycobacterium avium, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium gastri, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium scrofulacelum, Mycobacterium simiae oder Mycobacterium tuberculosis bildet.
Sonde nach Anspruch 1, wobei die Targetsequenz aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 20 ausgewählt ist.
Sonde nach Anspruch 1, wobei die Targetsequenz aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, dem Komplement von SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 und dem Komplement von SEQ ID NO: 21 und SEQ ID NO: 22 ausgewählt ist.
Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Basensequenz der Sonde, einschließlich der zusammenhängenden Region mit 10 Basen, die zu einer zusammenhängenden Region mit mindestens 10 Basen perfekt komplementär ist, die in einer Targetsequenz vorliegt, zu mindestens 80 % zu der in der Targetsequenz vorliegenden Basensequenz komplementär ist.
Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Basensequenz der Sonde, einschließlich der zusammenhängenden Region mit 10 Basen, die zu einer zusammenhängenden Region mit mindestens 10 Basen perfekt komplementär ist, die in einer Targetsequenz vorliegt, zu mindestens 90 % zu der in der Targetsequenz vorliegenden Basensequenz komplementär ist.
Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Basensequenz der Sonde zu der in der Targetsequenz vorliegenden Basensequenz perfekt komplementär ist.
Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Basensequenz der Sonde von 10 bis 50 Basen lang ist.
Sonde nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem Mycobacterium kansasii um die Mycobacterium kansasii-BOV-Subspezies handelt.
Sonde nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem Mycobacterium kansasii um die Mycobacterium kansasii-COU-Subspezies handelt.
Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Sonde einen Marker enthält.
Nachweisbarer Doppelstrang, der zwischen der Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und Nukleinsäure von Mycobacterium kansasii gebildet wird.
Sondenmischung zum Nachweisen des Vorliegens von Mycobacterium kansasii in einer Probe, wobei die Sondenmischung Folgendes umfasst: die Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und ein oder mehrere Helfer-Oligonukleotide.
Sondenmischung nach Anspruch 12, wobei jedes des einen oder der mehreren Helfer-Oligonukleotide von 10 bis 100 Basen lang ist und eine zusammenhängende Region mit mindestens 10 Basen aufweist, die zu einer zusammenhängenden Region mit mindestens 10 Basen perfekt komplementär ist, die in einer Referenzsequenz vorliegt, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 und Komplementen davon ausgewählt ist.
Sondenmischung nach Anspruch 13, wobei die Referenzsequenz aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 27 und Komplementen davon ausgewählt ist.
Sondenmischung zum Nachweisen des Vorliegens von Mycobacterium kansasii in einer Probe, wobei die Sondenmischung Folgendes umfasst: eine erste Hybridisierungsassay-Sonde in Übereinstimmung mit der Sonde nach einem der Ansprüche 2 oder 4 bis 10, wobei die Targetsequenz aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 20 ausgewählt ist; und eine zweite Hybridisierungsassay-Sonde in Übereinstimmung mit der Sonde nach einem der Ansprüche 3 bis 10, wobei die Targetsequenz aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, dem Komplement von SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, dem Komplement von SEQ ID NO: 21 und SEQ ID NO: 22 ausgewählt ist.
Sondenmischung nach Anspruch 15, die weiterhin ein oder mehrere Helfer-Oligonukleotide umfasst.
Sondenmischung nach Anspruch 16, wobei jedes Helfer-Oligonukleotid von 10 bis 100 Basen lang ist und eine zusammenhängende Region mit mindestens 10 Basen aufweist, die zu einer zusammenhängenden Region mit mindestens 10 Basen perfekt komplementär ist, die in einer Referenzsequenz vorliegt, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 und Komplementen davon ausgewählt ist.
Sondenmischung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, die weiterhin eine dritte Hybridisierungsassay-Sonde zum Nachweisen des Vorliegens von Mycobacterium kansasii in einer Probe umfasst, wobei die Sonde von 10 bis 100 Basen lang ist und eine zusammenhängende Region mit mindestens 10 Basen aufweist, die zu einer zusammenhängenden Region mit mindestens 10 Basen perfekt komplementär ist, die in einer dritten Targetsequenz vorliegt, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 19 ausgewählt ist, wobei die dritte Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen einen nachweisbaren Doppelstrang mit Nukleinsäure von Mycobacterium kansasii bildet und wobei die dritte Sonde unter den Bedingungen keinen nachweisbaren Doppelstrang mit Nukleinsäure von Mycobacterium avium, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium gastri, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium scrofulacelum, Mycobacterium simiae oder Mycobacterium tuberculosis bildet.
Sondenmischung nach Anspruch 18, wobei die Basensequenz der dritten Sonde von 10 bis 50 Basen lang ist.
Sondenmischung nach Anspruch 18, wobei die Basensequenz der dritten Sonde, einschließlich der zusammenhängenden Region mit 10 Basen, die zu einer zusammenhängenden Region mit mindestens 10 Basen perfekt komplementär ist, die in einer Targetsequenz vorliegt, zu mindestens 80 % zu der in der dritten Targetsequenz vorliegenden Basensequenz komplementär ist.
Sondenmischung nach Anspruch 18, wobei die Basensequenz der dritten Sonde, einschließlich der zusammenhängenden Region mit 10 Basen, die zu einer zusammenhängenden Region mit mindestens 10 Basen perfekt komplementär ist, die in einer Targetsequenz vorliegt, zu mindestens 90 % zu der in der dritten Targetsequenz vorliegenden Basensequenz komplementär ist.
Sondenmischung nach Anspruch 18, wobei die Basensequenz der dritten Sonde zu der in der dritten Targetsequenz vorliegenden Basensequenz perfekt komplementär ist.
Sondenmischung nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei die dritte Sonde einen Marker enthält.
Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens von Mycobacterium kansasii in einer Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Versehen der Probe mit mindestens einer Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder einer Sondenmischung nach einem der Ansprüche 12 bis 23; b) Inkubieren der Probe unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, so dass die Sonde bzw. die Sonden an Mycobacterium kansasii-Nukleinsäure hybridisieren, wodurch ein nachweisbarer Doppelstrang gebildet wird, wobei die Sonde unter den Bedingungen keinen nachweisbaren Doppelstrang mit Nukleinsäure von Mycobacterium avium, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium gastri, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium scrofulacelum, Mycobacterium simiae oder Mycobacterium tuberculosis bildet; und c) Nachweisen des Doppelstrangs von Schritt b), falls dieser gebildet wurde, als einem Anzeichen für das Vorliegen von Mycobacterium kansasii in der Probe.
Kit zum Nachweisen des Vorliegens von Mycobacterium kansasii, wobei das Kit eine Hybridisierungsassay-Sonde in Übereinstimmung mit der Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 10 umfasst.