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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Systeme zum Nachweis von
Nukleinsäuren.
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Polynukleotidsonden,
die Bindungsspezifität
für rRNA
oder rDNA der Untergruppe Gram-positiver Bakterien, die als "Actinomyceten" bekannt sind, besitzen.
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Hintergrund der Erfindung
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Actinomyceten
oder die „Hoch
(G + C)" Untergruppe
Gram-positiver (Gram(+)) Bakterien sind eine bestimmte evolutionäre Abstammungslinie
innerhalb der Eubakterien. Die Actinomyceten zeigen als Ergebnis
einer charakteristisch hohen Mutationsrate sehr ungewöhnliche
phänotypische
Eigenschaften. Viele Mitglieder dieser Gruppe von Bakterien produzieren
Antibiotika und werden gewöhnlich
im Erdboden gefunden. Actinomyceten sind für eine Reihe von bedeutenden
Tierkrankheiten, einschließlich
Tuberkulose, Lepra, Diphterie und Erkrankungen des Zahnfleisches
verantwortlich. Bemerkenswerterweise sind immungeschwächte Individuen
insbesondere gegenüber
Infektionen durch Mycobacteria avium, Mycobacteria intracellulare
und Mycobacteria scrofulaceum, die alle einzelne Arten der Actinomyceten
sind, empfänglich.
Zusätzlich
sind die Actinomyceten für
eine Reihe von wirtschaftlich bedeutenden Pflanzenkrankheiten verantwortlich.
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Es
ist gut bekannt, dass zwei Einzelstränge Desoxyribonukleinsäure („DNA") oder Ribonukleinsäure („RNA") miteinander assoziieren
oder „hybridisieren" können, um
eine Doppelstrangstruktur zu bilden, die zwei Stränge besitzt,
die durch Wasserstoffbrückenbindungen
zwischen komplementären
Basenpaaren zusammengehalten werden. Die Nukleinsäureeinzelstränge werden
aus Nukleotiden gebildet, die die Basen Adenin (A), Cytosin (C),
Thymin (T), Guanin (G), Uracil (U) und Inosin (I) umfassen. In der
Doppelhelixstruktur der Nukleinsäuren
bildet die Base Adenin Wasserstoffbrücken mit der Base Thymin oder
Uracil, die Base Guanin bildet Wasserstoffbrücken mit der Base Cytosin und
die Base Inosin bildet Wasserstoffbrücken mit Adenin, Cytosin oder
Uracil. Daher kann man an jedem Punkt entlang der Kette die klassischen „Watson-Crick" Basenpaare A:T oder
A:U, T:A oder U:A und G:C oder C:G finden. Zusätzlich zu den üblichen
(kanonischen) Basenpaaren kann man aber ebenfalls A:G, G:U und andere „wobble" oder fehlgepaarte
Basenpaare finden.
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Ein
doppelsträngiges
Nukleinsäurehybrid
ergibt sich, wenn ein erstes einzelsträngiges Polynukleotid unter
Bedingungen, die die Hybridisierung begünstigen, mit einem zweiten
einzelsträngigen
Polynukleotid, das eine ausreichende Anzahl zusammenhängender
Basen, die zu der Sequenz des ersten Polynukleotids komplementär sind,
besitzt, in Kontakt gebracht wird. Unter entsprechenden Bedingungen
können
DNA/DNA, RNA/DNA oder RNA/RNA Hybride gebildet werden.
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Im
allgemeinen ist eine Sonde ein einzelsträngiges Polynukleotid, das zu
der Nukleinsäuresequenz, die
nachgewiesen werden soll („Zielsequenz"), ein gewisses Maß an Komplementarität besitzt.
Sonden werden gewöhnlich
mit einem nachweisbaren Rest, wie zum Beispiel einem Radioisotop,
einem Antigen oder einem chemolumineszenten Rest markiert.
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Nukleinsäurehybridisierung
als Verfahren zum Nachweis bestimmter Nukleinsäuresequenzen wird von Kohne
in US-Patent Nr. 4,851,330, von Hogan et al. in US-Patenten Nr.
5,541,308 und 5,681,698 und in EPA 080907 beschrieben. Diese Referenzen
beschreiben ebenfalls Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von
RNA-enthaltenden Organismen in einer Probe, die solche Organismen
enthalten kann. Diese Verfahren erfordern Sonden, die zu der ribosomalen
RNA (rRNA) eines oder mehrerer nicht-viraler Organismen oder Gruppen nicht-viraler
Organismen ausreichend komplementär sind. Gemäß diesem Verfahren werden die
Nukleinsäuren
aus einer zu testenden Probe und eine entsprechende Sonde zuerst
gemischt und dann unter spezifischen Hybridisierungsbedingungen
inkubiert. Üblicherweise,
aber nicht notwendigerweise, ist die Sonde mit einem nachweisbaren
Marker markiert. Die resultierende Hybridisierungsreaktion wird
dann untersucht, um die Menge an markierter Probe, die Duplex-Strukturen
gebildet hat, nachzuweisen und zu quantifizieren, um das Vorliegen
von rRNA, die in der Testprobe enthalten ist, nachzuweisen.
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Mit
der Ausnahme von Viren enthalten alle prokaryotischen Organismen
rRNA Gene, die Homologe der prokaryotischen 5S, 16S und 23S rRNA
Moleküle
kodieren. In Eukaryoten sind diese rRNA Moleküle die 5S rRNA, 5,85 rRNA,
18S rRNA und 28S rRNA, die im wesentlichen den prokaryotischen Molekülen ähneln. Sonden
zum Nachweis von spezifisch angesteuerten rRNA Untersequenzen in
bestimmten Organismen oder Gruppen von Organismen in einer Probe
sind zuvor beschrieben worden. Diese hochspezifischen Sondensequenzen
reagieren zweckmäßigerweise
unter entsprechenden Stringenzbedingungen nicht mit Nukleinsäuren irgendeiner
anderen Bakterienart oder infektiösen Mitteln.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Polynukleotidsonden bereit, die verwendet
werden können,
um Actinomyceten auf hochspezifische Art und Weise nachzuweisen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Oligonukleotidsonde,
die unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen spezifisch
an eine Nukleinsäure-Zielregion, die für Actinomycetenbakterien
charakteristisch ist, hybridisiert, um eine nachweisbare Sonden:Ziel-Duplex
zu bilden. Diese Zielregion entspricht den Nukleotidpositionen 1986-2064
der E. coli rRNA. Die erfindungsgemäße Oligonukleotidsonde hat
eine Länge
von bis zu 100 Nukleotiden und schließt mindestens 17 zusammenhängende Nukleotide,
die in der Sequenz mit SEQ ID Nr. 10 oder dem Komplementär davon
enthalten sind, ein. In bestimmten Ausführungsformen schließt die Oligonukleotidsonde
mindestens 25 zusammenhängende
Nukleotide ein, und kann mindestens 29 zusammenhängende Nukleotide, die in der
Sequenz von SEQ ID Nr. 10 enthalten sind, einschließen. Die
hochstringenten Hybridisierungsbedingungen können entweder durch 0,48 M
Natriumphosphatpuffer, 0,1% Natriumdodecylsulfat und jeweils 1 mM
EDTA und EGTA oder durch 0,6 M LiCl, 1% Lithiumlaurylsulfat, 60
mM Lithiumsuccinat und jeweils 10 mM EDTA und EGTA bereitgestellt
werden. Die Oligonukleotidsonde kann aus DNA bestehen, aber kann
auch mindestens ein Nukleotidanalog einschließen. Zum Beispiel kann die
Sonde mindestens ein Nukleotidanalog einschließen, das eine Methoxygruppe
an der 2' Position eines
Riboserestes besitzt. In einer Ausführungsform hat die erfindungsgemäße Oligonukleotidsonde
eine Sequenz, die SEQ ID Nr. 1 oder das Komplementär davon,
SEQ ID Nr. 2 oder das Komplementär
davon, oder SEQ ID Nr. 3 oder das Komplementär davon ist. In einer bevorzugten
Ausführungsform
ist die Sequenz des Oligonukleotids durch SEQ ID Nr. 2 oder SEQ
ID Nr. 3 gegeben und das Oligonukleotid ist ein Helfer-Oligonukleotid.
Jedes der offenbarten Oligonukleotide kann einen nachweisbaren Marker
einschließen.
Besondere Beispiele von nachweisbaren Markern schließen Chemolumineszenzmarker
und Radiomarker ein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform
besitzt das Nukleotid eine Sequenz, die durch SEQ ID Nr. 1 gegeben
ist. Dieses Oligonukleotid ist insbesondere als eine Hybridisierungssonde
nützlich
und kann einen nachweisbaren Marker einschließen. Ein besonders bevorzugter
nachweisbarer Marker für
die Hybridisierungssonde ist ein Acridiniumester.
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine
Sondenzusammensetzung zum Nachweis der Nukleinsäuren von Actinomycetenbakterien.
Diese Zusammensetzung schließt
eine Oligonukleotidsonde, die unter einer hochstringenten Bedingung
an eine Actinomyceten Nukleinsäure
Zielregion, die Nukleotidpositionen 1986-2064 der E. coli 23S rRNA
entspricht, hybridisiert, um eine nachweisbare Ziel-Sonden-Duplex zu bilden.
Diese Oligonukleotidsonde hat eine Länge von bis zu 100 Nukleotidbasen
und schließt mindestens
17 zusammenhängende
Nukleotide, die in der Sequenz von SEQ ID Nr. 10 oder dem Komplementär davon
enthalten sind, ein. Unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen
hybridisiert die Oligonukleotidsonde spezifisch an Nukleinsäuren, die
in Corynebacterium aquaticum, Corynebacterium jeikieum, Corynebacterium
xerosis, Micrococcus luteus, Propionibacterium acnes, Mycobacterium
chelonae, Mycobacterium terrae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium
simiae, Mycobacterium avium, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium
gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium smegatis, Mycobacterium fortuitum,
Mycobacterium gastri, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum
und Mycobacterium phlei vorhanden sind. Vorzugsweise besitzt die
Oligonukleotidsonde eine Länge
von bis zu 100 Nukleotidbasen und schließt mindestens 25 zusammenhängende Nukleotide,
die in der Sequenz von SEQ ID Nr. 10 oder dem Komplementär davon
enthalten ist, ein. In bestimmten Ausführungsformen besteht die erfindungsgemäße Oligonukleotidsonde
aus DNA. Beispiele nützlicher
hochstringenter Hybridisierungsbedingungen werden alternativ durch
0,48 M Natriumphosphatpuffer, 0,1% Natriumdodecylsulfat und jeweils
1 mM EDTA und EGTA oder durch 0,6 M LiCl, 1% Lithiumlaurylsulfat,
60 mM Lithiumsuccinat und jeweils 10 mM EDTA und EGTA bereitgestellt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besitzt die Oligonukleotidsonde
die Sequenz von SEQ ID Nr. 1 oder des Komplementärs davon. In einer bevorzugten
Ausführungsform
kann die Länge
der Oligonukleotidsonde bis zu 60 Basen betragen. Eine besonders
bevorzugte Oligonukleotidsonde hat die Länge und Sequenz von SEQ ID
Nr. 1. Bestimmte Ausführungsformen
der erfindungsgemäßen Sondenzusammensetzung
schließen
einen nachweisbaren Marker an der Oligonukleotidsonde ein. Zum Beispiel
kann, wenn die Oligonukleotidsonde eine Länge von bis zu 60 Nukleotiden
besitzt, die Oligonukleotidsonde einen nachweisbaren Marker einschließen. Alternativ
kann, wenn die Oligonukleotidsonde die Sequenz von SEQ ID Nr. 1
besitzt, ein nachweisbarer Marker eingeschlossen sein. Unabhängig davon,
ob die Sondenzusammensetzung eine markierte Oligonukleotidsonde
von 17–100
Nukleotiden Länge
oder von 17–60
Nukleotiden Länge
einschließt
oder die Sequenz von SEQ ID Nr. 1 besitzt, kann der nachweisbarer
Marker entweder ein Chemolumineszenzmarker (wie zum Beispiel ein
Acridiniumester) oder ein Radiomarker sein. Es wird bevorzugt, dass diese
markierten Oligonukleotidsonden in Verbindung mit mindestens einem
Helfer-Oligonukleotid, das die Bildung der nachweisbaren Sonden:Ziel-Duplex
unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen erleichtert, verwendet
werden. Mindestens eins der Helferoligonukleotide kann mindestens
ein Nukleotidanalog einschließen.
Ein Beispiel eines besonders bevorzugten Nukleotidanalog wäre eins,
in dem der Riboserest an der 2' Position
eine Methoxygruppe trägt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird
die markierte Oligonukleotidsonde, unabhängig von ihrer Länge, in
Verbindung mit mindestens einem Helferoligonukleotid, das die Sequenz
von SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 besitzt, eingesetzt.
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Noch
ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren
zum Nachweis der Anwesenheit von Actinomycetenbakterien in einer
Testprobe. Dieses Verfahren schließt Schritte ein, um zu besagter
Testprobe eine Sondenzusammensetzung zuzugeben, die eine Oligonukleotidsonde
umfasst, die unter einer hochstringenten Bedingung an eine Actinomyceten
Nukleinsäure
Zielregion, die Nukleotidpositionen 1986-2064 von E. coli 23S rRNA
entspricht, hybridisiert, um eine nachweisbare Ziel:Sonden-Duplex zu bilden,
wobei besagte Oligonukleotidsonde eine Länge von bis 100 Nukleotidbasen
besitzt und mindestens 25 zusammenhängende Nukleotide, die in der
Sequenz von SEQ ID Nr. 10 oder dem Komplementär davon enthalten sind, umfasst,
und wobei unter besagten Hybridisierungsbedingungen besagte Oligonukleotidsonde
spezifisch Nukleinsäuren
hybridisiert, die in Corynebacterium aquaticum, Corynebacterium
jeikieum, Corynebacterium xerosis, Micrococcus luteus, Propionibacterium
acnes, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium terrae, Mycobacterium
intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium avium, Mycobacterium
scrofulaceum, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium
smegatis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium gastri, Mycobacterium
xenopi, Mycobacterium marinum und Mycobacterium phlei enthalten
sind. Danach wird die resultierende Mischung unter hochstringenten
Bedingungen hybridisiert, so dass sich jede Actinomyceten Nukleinsäure, die
in der Testprobe enthalten sein kann, mit der Sondenzusammensetzung
verbindet, um eine Sonden:Ziel-Duplex zu bilden. Schließlich schließt das Verfahren
den Nachweis der Sonden:Ziel-Duplex als Indikator für die Anwesenheit
von Actinomycetenbakterien in einer Testprobe ein. In einer Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens
schließt
die Testprobe Bakterien ein und es wird ein vorbereitender Schritt durchgeführt, um
die Nukleinsäure
von jedem Bakterium, das in der Testprobe vorhanden sein kann, freizusetzen.
In einer anderen Ausführungsform
der Erfindung ist die Testprobe ein Lysat. Im allgemeinen können die hochstringenten
Hybridisierungsbedingungen entweder durch (a) 0,48 M Natriumphosphatpuffer,
0,1% Natriumdodecylsulfat und jeweils 1 mM EDTA und EGTA oder (b)
0,6 M LiCl, 1% Lithiumlaurylsulfat, 60 mM Lithiumsuccinat und jeweils
10 mM EDTA und EGTA bereitgestellt werden. Es ist jedoch selbstverständlich,
dass andere hochstringente Hybridisierungsbedingungen gute Ergebnisse
ergeben können.
In einer bevorzugten Ausführungsform
hat die Oligonukleotidsonde, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet wird, die Länge
und Sequenz von SEQ ID Nr. 1. Wenn dies der Fall ist, kann die Oligonukleotidsonde
einen nachweisbaren Marker einschließen. In einer besonders bevorzugten
Ausführungsform
hat die markierte Oligonukleotidsonde die Sequenz von SEQ ID Nr.
1, der Marker an der Sonde ist ein Acridiniumester, und der Nachweisschritt
in dem erfindungsgemäßen Verfahren
schließt
das Durchführen
von Luminometrie, um Sonden:Ziel-Duplexes nachzuweisen, ein. In
Fällen,
wo die markierte Oligonukleotidsonde die Sequenz von SEQ ID Nr.
1 besitzt, kann die Sondenzusammensetzung ferner mindestens ein
Helfer-Oligonukleotid einschließen,
das die Bildung der Sonden:Ziel-Duplex erleichtert. Beispielhafte
Helfer-Oligonukleotide haben die Sequenzen von SEQ ID Nr. 2 und
SEQ ID Nr. 3.
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Noch
ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf einen Kit, der
verwendet werden kann, um die Gegenwart von Actinomyceten Nukleinsäuren in
einer Testprobe nachzuweisen. Der Kit enthält eine Sondenzusammensetzung,
die eine Oligonukleotidsonde einschließt, die unter einer hochstringenten
Bedingung an eine Actinomyceten Nukleinsäure Zielregion, die Nukleotidpositionen
1986-2064 von E. coli 23S rRNA entspricht, hybridisiert, um eine
nachweisbare Ziel:Sonden-Duplex zu bilden. Die Oligonukleotidsonde
hat eine Länge
von bis zu 100 Nukleotidbasen und schließt mindestens 25 zusammenhängende Nukleotide,
die in der Sequenz von SEQ ID Nr. 10 oder dem Komplementär davon
enthalten sind, ein. Unter den hochstringenten Hybridisierungsbedingungen
hybridisiert die Oligonukleotidsonde spezifisch Nukleinsäuren, die
in Corynebacterium aquaticum, Corynebacterium jeikieum, Corynebacterium
xerosis, Micrococcus luteus, Propionibacterium acnes, Mycobacterium
chelonae, Mycobacterium terrae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium
simiae, Mycobacterium avium, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium
gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium smegatis, Mycobacterium
fortuitum, Mycobacterium gastri, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium
marinum und Mycobacterium phlei vorhanden sind. Zusätzlich schließt der erfindungemäße Kit gedruckte
Anleitungen ein, die die zum Nachweis der Actionomyceten Nukleinsäure durch
den Nachweis eines Komplexes zwischen der Oligonukleotidsonde und
einem Actinomyceten Nukleinsäureziel
zu befolgenden Schritte, in der Reihenfolge ihrer Durchführung, beschreiben.
Sowohl die Sondenzusammensetzung als auch die gedruckten Anweisungen
sind zusammen verpackt.
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Definitionen
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Wie
hierin verwendet, haben die folgenden Ausdrücke die angegebenen Bedeutungen,
sofern nicht ausdrücklich
das Gegenteil angegeben wird.
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Ein „Nukleotid" ist eine Untereinheit
einer Nukleinsäure,
die aus einer Phosphatgruppe, einem 5-Kohlenstoffatome enthaltenden
Zucker und einer stickstoffhaltigen Base besteht. Der 5-Kohlenstoffatome
enthaltende Zucker, der in RNA gefunden wird, ist Ribose. In DNA
ist der 5- Kohlenstoffatome
enthaltende Zucker 2'-Deoxyribose.
Der Zucker eines 5'-Nukleotids
enthält
eine Hydroxylgruppe (-OH) an der 5'-Kohlenstoff-5 Position. Der Ausdruck
schließt
ebenfalls Analoge von natürlich
auftretenden Nukleotiden und insbesondere Analoge ein, die Methoxygruppen
an der 2'-Position der Ribose
besitzen (OMe). Wie hierin verwendet, haben Methoxy-Oligonukleotide
enthaltende „T" Reste eine Methoxygruppe
an der 2' Position
des Riboserestes und ein Uracil an der Basenposition des Nukleotids.
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Eine „Nicht-Nukleotideinheit" ist eine Einheit,
die nicht wesentlich an der Hybridisierung eines Polymers teilnimmt.
Solche Einheiten müssen
zum Beispiel nicht an irgendeiner bedeutenden Wasserstoffbrückenbindung
mit einem Nukleotid beteiligt sein und schließen Einheiten, die als Bestandteil
eine der fünf
Nukleotidbasen oder Analoge davon besitzen, aus.
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Ein „Oligonukleotid" ist ein Nukleotidpolymer,
das zwei oder mehr Nukleotideinheiten, die kovalent miteinander
verbunden sind, besitzt. Oligonukleotide sind im allgemeinen ungefähr 10 bis
ungefähr
100 Nukleotide lang. Die Zuckergruppen der Nukleotiduntereinheiten
können
Ribose, Desoxyribose oder modifizierte Derivate davon, wie zum Beispiel
OMe sein. Die Nukleotiduntereinheiten können durch Bindungen, wie zum
Beispiel Phosphodiesterbindungen, modifizierte Bindungen oder durch
Nicht-Nukleotidreste, die die Hybridisierung des Oligonukleotids
an seine komplementäre
Zielnukleotidsequenz nicht verhindern, sein. Modifizierte Bindungen
schließen
solche ein, in denen die Standard Phosphodiesterbindung durch eine
andere Bindung, wie zum Beispiel eine Phosphorthioatbindung, eine
Methylphosphonatbindung oder eine neutrale Peptidbindung, ersetzt
ist. Stickstoffhaltige Basenanaloga können ebenfalls Bestandteile
von Oligonukleotiden gemäß der Erfindung
sein.
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Eine „Zielnukleinsäure" ist eine Nukleinsäure, die
eine Zielnukleinsäuresequenz
umfasst.
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Eine „Zielnukleinsäuresequenz", „Zielnukleotidsequenz" oder „Zielsequenz" ist eine spezifische
Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidsequenz, die durch ein Oligonukleotid
hybridisiert werden kann.
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Eine „Oligonukleotidsonde" ist ein Oligonukleotid,
das eine Nukleotidsequenz besitzt, die ausreichend komplementär zu ihrer
Zielnukleinsäuresequenz
ist, um unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen eine nachweisbare
Sonden:Ziel-Hybridduplex
zu bilden. Eine Oligonukleotidsonde ist eine isolierte chemische Spezies
und kann zusätzliche
Nukleotide außerhalb
der auf das Ziel gerichteten Region einschließen, solange solche Nukleotide
die Hybridisierung unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen
nicht verhindern. Nicht-komplementäre Sequenzen, wie zum Beispiel
Promotersequenzen, Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen
oder Sequenzen, die eine gewünschte
Sekundär-
oder Tertiärstruktur
verleihen, wie zum Beispiel eine katalytische aktive Stelle, können verwendet
werden, um bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Sonden den Nachweis zu
ermöglichen.
Eine Oligonukleotidsonde kann gegebenenfalls mit einem nachweisbaren
Rest, wie zum Beispiel einem Radioisotop, einem fluoreszierenden
Rest, einem chemolumineszenten Rest, einem Enzym oder einem Liganden
markiert sein, der verwendet werden kann, um die Hybridisierung der
Sonde an ihre Zielsequenz nachzuweisen oder zu bestätigen. Oligonukleotidsonden
im Größenbereich von
10 bis 100 Nukleotidenlänge
werden bevorzugt.
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Ein „nachweisbarer
Rest" ist ein Molekül, das an
eine Nukleinsäuresonde
angeheftet ist oder als Teil davon synthetisiert wird. Dieses Molekül sollte
eindeutig nachweisbar sein und erlaubt daher die Sonde nachzuweisen.
Diese nachweisbaren Reste sind oftmals Radioisotope, Chemolumineszenzmoleküle, Enzyme, Haptene
oder sogar einzigartige Oligonukleotidsequenzen.
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Ein „Hybrid" oder eine „Duplex" ist ein Komplex,
der über
Watson-Crick Basenpaarungen oder nicht-kanonische Basenpaarungen
zwischen den komplementären
Basen zwischen zwei einzelsträngigen
Nukleinsäuresequenzen
gebildet wird.
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„Hybridisierung" ist der Prozess,
durch den sich zwei komplementäre
Nukleinsäurestränge verbinden, um
eine Doppelstrangstruktur zu bilden („Hybrid" oder „Duplex").
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„Komplementarität" ist eine Eigenschaft,
die durch die Basensequenz eines Einzelstrangs DNA oder RNA verliehen
wird, die durch Wasserstoffbrückenbindungen
zwischen Watson-Crick Basenpaaren auf den entsprechenden Strängen ein
Hybrid oder Doppelstrang DNA:DNA, RNA:RNA oder DNA:RNA bilden kann. Adenin
(A) ergänzt
gewöhnlich
Thymin (T) oder Uracil (U), während
Guanin (G) gewöhnlich
Cytosin (C) ergänzt.
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„Fehlpaarung" bezieht sich in
einem Hybrid auf jede Paarung von zwei Nukleotiden, die nicht-kanonische
Watson-Crick Wasserstoffbrückenbindungen
bilden. Zusätzlich
kann, für
die Zwecke der folgenden Diskussionen, ein Mismatch eine Insertion
oder Deletion in einem Strang des Hybrids einschließen, was
zu einem ungepaarten Nukleotid(en) führt.
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Der
Ausdruck „Stringenz" wird verwendet,
um die Temperatur und Lösungsmittelzusammensetzung
zu beschreiben, die während
der Hybridisierung und den folgenden Prozessierungsschritten bestehen.
Unter hochstringenten Bedingungen bilden sich nur hoch komplementäre Nukleinsäurehybride;
Hybride ohne einen ausreichenden Grad an Komplementarität bilden
sich nicht. Dementsprechend bestimmt die Stringenz der Assaybedingungen
die Menge der Komplementarität,
die zwischen zwei Nukleinsäuresträngen, die
ein Hybrid bilden, benötigt
wird. Die Stringenzbedingungen werden so gewählt, dass der Stabilitätsunterschied
zwischen dem Hybrid, das mit der Ziel- und mit der Nicht-Zielnukleinsäure gebildet
wird, maximiert wird. Beispielhafte hochstringente Bedingungen werden
in den Arbeitsbeispielen bereitgestellt.
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Der
Ausdruck „Sondenspezifität" bezieht sich auf
eine Eigenschaft einer Sonde, die ihre Eigenschaft, zwischen Ziel- und Nicht-Ziel Sequenzen
zu unterscheiden, beschreibt.
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Der
Ausdruck „variable
Region" bezieht
sich auf ein Nukleotidpolymer, das sich zwischen dem Zielorganismus
und Nicht-Zielorganismen, die in einer Probe enthalten sind, in
mindestens einer Base unterscheidet.
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Eine „konservierte
Region" ist eine
Nukleinsäuresubsequenz,
die zwischen mindestens zwei verschiedenen Polynukleotiden nicht
variabel ist.
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„Bakterien" sind Mitglieder
der phylogenetischen Gruppe der Eubakterien, die als eine der drei
grundlegenden Reiche von Lebewesen betrachtet wird.
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Der
Ausdruck „Sequenzdivergenz" bezieht sich auf
einen Prozess, durch den sich Nukleotidpolymere während der
Evolution weniger ähnlich
werden.
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Der
Ausdruck „Sequenzkonvergenz" bezieht sich auf
einen Prozess, durch welchen sich Nukleotidpolymere während der
Evolution ähnlicher
werden.
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„Tm" bezieht sich auf
die Temperatur, bei der 50% der Sonde von der hybridisierten in
die nicht hybridisierte Form umgewandelt sind.
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Ein „Helfer-Oligonukleotid" ist ein Oligonukleotid,
das eine Region der Zielnukleinsäure
bindet, die eine andere Region ist, als die, die von einer Oligonukleotidsonde
gebunden wird. Helfer-Oligonukleotide führen neue Sekundär und Tertiär-Strukturen
in die Zielregion der einzelsträngigen
Nukleinsäure
ein, so dass die Rate der Bindung der Oligonukleotidsonde beschleunigt
wird. Obwohl Helferoligonukleotide nicht mit einem nachweisbaren
Marker markiert sind, wenn sie in Verbindung mit markierten Oligonukleotidsonden
verwendet werden, ermöglichen
sie die Bindung von markierten Sonden und verstärken so indirekt die Hybridisierungssignale.
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Die
Ausdrücke „besteht
im wesentlichen aus" oder „bestehend
im wesentlichen aus" bedeuten,
dass das Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz besitzt, die im wesentlichen
der einer spezifizierten Nukleotidsequenz gleicht. Alle Additionen
oder Deletionen sind nicht-materielle Variationen der spezifizierten
Nukleotidsequenz, die das Oligonukleotid nicht daran hindern, die
beanspruchte Eigenschaft zu besitzen, wie zum Beispiel in der Lage
zu sein unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen verglichen
mit Nicht-Zielnukleinsäuren vorzugsweise
an seine Zielnukleinsäure
zu hybridisieren.
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Der
Durchschnittsfachmann wird verstehen, dass im wesentlichen den Sonden
dieser Erfindung entsprechende Sonden von der genannten Sequenz
abweichen und trotzdem an dieselbe Zielnukleinsäuresequenz hybridisieren können. Diese
Abweichung von der Nukleinsäure
kann in Form eines Prozentsatzes an identischen Basen innerhalb
der Sequenz oder als Prozentsatz das perfekt komplementären Basen
zwischen der Sonde und ihrer Zielsequenz ausgedrückt werden. Sonden gemäß der vorliegenden
Erfindung entsprechen im wesentlichen einer Nukleinsäuresequenz,
wenn diese Prozentsätze
von 100 bis 80% betragen oder wenn von 0 Basenfehlpaarungen in einer
10 Nukleotiden langen Zielsequenz bis zu 2 Basenfehlpaarungen in einer
10 Nukleotiden langen Zielsequenz vorkommen. In bevorzugten Ausführungsformen
beträgt
der Prozentsatz 100 bis 85%. In bevorzugteren Ausführungsformen
beträgt
dieser Prozentsatz 90% bis 100%; in anderen bevorzugten Ausführungsformen
beträgt
dieser Prozentsatz 95% bis 100.
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Mit „ausreichend
komplementär" oder „im wesentlichen
komplementär" sind Nukleinsäuren gemeint, die
eine ausreichende Menge von zusammenhängenden komplementären Nukleotiden
besitzen, um unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen ein
Hybrid zu bilden, das für
den Nachweis stabil ist.
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Mit „Nukleinsäurehybrid" oder „Sonden:Ziel-Duplex" ist eine Struktur
gemeint, die eine doppelsträngige,
wasserstoffbrückengebundene,
vorzugsweise 10 bis 100 Nukleotide lange, bevorzugter 14 bis 50
Nukleotide lange Struktur ist. Die Struktur ist ausreichend stabil,
um mit Mitteln, wie zum Beispiel Chemolumineszenz oder Fluorenzlichtnachweis,
Autoradiographie, elektrochemischer Analyse oder Gelelektrophorese
nachgewiesen zu werden. Solch Hybride schließen RNA:RNA, RNA:DNA oder DNA:DNA
Duplex-Moleküle ein.
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Mit „negativem
Sense" ist ein Nukleinsäuremolekül gemeint,
das zu einem Referenz (Sense) Nukleinsäuremolekül perfekt komplementär ist.
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„RNA und
DNA Äquivalente" bezieht sich auf
RNA- und DNA-Moleküle, die
dieselben komplementären Basenpaar-Hybridisierungseigenschaften
besitzen. RNA und DNA Äquivalente
haben unterschiedliche Zuckergruppen (d.h. Ribose anstelle von Desoxyribose)
und können
sich durch die Gegenwart von Uracil in RNA und Thymin in DNA unterscheiden.
Der Unterschied zwischen RNA und DNA Äquivalenten trägt nicht
zu den Unterschieden zwischen sich im wesentlichen entsprechenden
Nukleinsäuresequenzen
bei, da die Äquivalente
denselben Grad an Komplementarität
zu einer bestimmten Sequenz besitzen.
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Mit „vorzugsweise
hybridisieren" ist
gemeint, dass unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen Oligonukleotidsonden
ihre Zielnukleinsäuren
hybridisieren können,
um stabile Sonden:Ziel-Hybride zu bilden (wodurch sie die Anwesenheit
von Zielnukleinsäuren
anzeigen) ohne stabile Sonden:Nicht-Ziel Hybride zu bilden (das
würde die
Anwesenheit von Nicht-Ziel Nukleinsäuren anderer Organismen anzeigen).
Somit hybridisiert die Sonde die Zielnukleinsäure zu einem ausreichenden
größeren Ausmaß als Nicht-Zielnukleinsäure, um dem
Durchschnittsfachmann zu ermöglichen,
die Gegenwart von Actinomyceten Bakterien genau nachzuweisen und
ihre Anwesenheit von der anderer Organismen zu unterscheiden. Bevorzugte
Hybridisierung kann unter Verwendung von Techniken, die im Stand
der Technik bekannt sind und hierin beschrieben werden, gemessen
werden. Zum Beispiel hybridisieren Oligonukleotidsonden gemäß der Erfindung
verglichen mit der Hybridisierung an C. albicans Nukleinsäuren vorzugsweise
ungefähr
100–2000-fach
besser an Actinomyceten Nukleinsäuren.
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Eine
Actinomyceten „Nukleinsäuresequenz
Zielregion" bezieht
sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die
in der Nukleinsäure
von Actinomycetenbakterien vorhanden ist oder einer Sequenz, die
dazu komplementär
ist, und die nicht in der Nukleinsäure anderer Arten vorhanden
ist. Nukleinsäuren,
die Nukleotidsequenzen besitzen, die zu einer Zielsequenz komplementär sind,
können
durch Ziel-Amplifizierungstechniken,
wie zum Beispiel die Polymerase Kettenreaktion (PCR) oder die Transkriptionsvermittelte
Amplifikation (z.B. Kacian und Fultz, Nucleic Acid Sequence Amplification
Methods, U.S. Patent Nr. 5,824,518) erzeugt werden.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 zeigt
ein Alignment einer Oligonukleotidsonde und zweier Helfer-Oligonukleotide
mit einer Auswahl positiv reaktiver und nicht-reaktiver Zielsequenzen.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Hierin
offenbaren wir bevorzugte Zielnukleotidsequenzen für Oligonukleotidsonden
und Helfer-Oligonukleotide, die verwendet werden können, um
rRNA oder rDNA von Actinomycetenbakterien nachzuweisen und zu identifizieren.
Insbesondere werden besonders bevorzugte Polynukleotidsonden und
akzessorische Helfer-Oligonukleotide, die für den spezifischen Nachweis
von Actinomyceten nützlich
sind, offenbart. Die Sonden, die zu bestimmten rRNA Sequenzen der
23S rRNA komplementär
sind, sind vorteilhaft in der Lage, Actinomyceten von den bekannten
phylogenetisch nächsten
Nachbarn zu unterscheiden.
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Zusätzlich dazu über Nukleinsäuresequenzen,
die die Hybridisierung an die ribosomale RNA (rRNA) oder DNA (rDNA)
Sequenzen von Actinomycetenbakterien erlauben, zu verfügen, sind
die Oligonukleotidsonden gemäß der Erfindung
mindestens 90%, vorzugsweise perfekt zu mindestens einem Teil der
beschriebenen Zielsequenzregion, die durch SEQ ID Nr. 11 identifiziert
wird, komplementär.
Der Teil ist vorzugsweise mindestens 17 Nukleotide, bevorzugter
mindestens 25 Nukleotide und noch bevorzugter mindestens 29 Nukleotide lang.
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Wie
oben angedeutet, richten sich die erfindungsgemäßen Oligonukleotide auf Nukleinsäuresequenzen
von Actinomycetenbakterien. Diese Oligonukleotide können als
Sonden verwendet werden, die vorzugsweise an eine Actinomyceten
Nukleinsäure
Zielregion hybridisieren, um eine nachweisbare Duplex zu bilden, die
die Anwesenheit von Actinomycetenbakterien anzeigt. Alternativ können die
erfindungsgemäßen Oligonukleotide
als Helfer-Oligonukleotide verwendet werden, die unter hochstringenten
Hybridisierungsbedingungen an eine Actinomyceten Nukleinsäure Zielregion
hybridisieren und die Bildung einer Duplex zwischen einer markierten
Oligonukleotidsonde und ihrer komplementären Zielnukleinsäure verstärken.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
hybridisieren die hierin beschriebenen Oligonukleotidsonden unter
hochstringenten Hybridisierungsbedingungen selektiv Nukleinsäuren von
Actinomycetenbakterien gegenüber
solchen anderer Organismen. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung umfasst die Oligonukleotidsonde einen nachweisbaren Rest,
wie zum Beispiel ein Acridiniumester oder ein Radioisotop.
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Bevorzugte
Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von Actinomycetenbakterien
schließen
den Schritt des Inkontaktbringens einer Testprobe mit einer Oligonukleotidsonde,
die verglichen mit einer Nukleinsäuresequenz eines anderen Organismus
vorzugsweise an eine Actinomyceten Nukleinsäure Zielsequenz hybridisiert,
unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen ein. Vorzugsweise
ist Zielnukleinsäuresequenz zu
einer Sequenz von mindestens 17 zusammenhängenden Nukleotiden, vorzugsweise mindestens
25 zusammenhängenden
Nukleotiden, noch bevorzugter mindestens 29 zusammenhängenden
Nukleotiden, die in der Sequenz, die durch SEQ ID Nr. 11 angegeben
wird, enthalten sind, voll komplementär. Somit haben Oligonukleotide,
die im Zusammenhang mit dieser Erfindung nützlich sind, vorzugsweise eine
Länge von
bis zu 100 Nukleotiden und besitzen mindestens 17 zusammenhängende Nukleotide,
bevorzugter mindestens 25 zusammenhängende Nukleotide, noch bevorzugter
mindestens 29 zusammenhängende
Nukleotide, die in der Sequenz, die durch GGTCTTTCCGTCCTGCCGCGCGTAACGAGCATCTTTACTCGTAGTGCAATTT
CGCCGAGTCTGTGGTTGAGACAGTGGG (SEQ ID Nr. 10) oder das Komplementär davon
gegeben ist, enthalten sind. Die Oligonukleotide können RNA
und DNA Äquivalente
sein und können
Nukleotidanaloge enthalten.
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Einleitung und Hintergrund
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Bei
Entwicklung der Erfindung wurden rRNA Sequenzen einer Auswahl an
verwandten und nicht verwandten Organismen abgeglichen, um konservierte
Kandidaten-Sequenzen, die in der 23S rRNA vorhanden sind, und die
verwendet werden können,
um Actinomyceten Organismen von anderen Bakterien sowie eukaryotischen
Organismen zu unterscheiden, zu identifizieren. Die rRNA oder rDNA
Sequenzen von Actinomyceten und entfernten phylogenetischen Nachbarn
wurden abgeglichen, um Gebiete maximaler Homologie aufzudecken.
Homologe Regionen wurden auf Sequenzvariationen untersucht, um rRNA
Sequenzen, die unter den Actinomyceten konserviert wurden und Fehlpaarungen
mit anderen nah und entfernt verwandten Gattungen zeigten, zu identifizieren.
Die Sequenzen, die gemäß den unten
beschriebenen Verfahren als Kandidatensonden abgeleitet wurden,
wurden schließlich
gegen eine Reihe von rRNA Standards und bakteriellen Lysaten getestet,
um ihre Nützlichkeit
als Sonden unter Laborbedingungen zu verifizieren.
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Die
Polynukleotidsequenzen von rRNAs werden am geeignetesten unter Verwendung
eines Didesoxynukleotid-Sequenzierungsverfahrens
bestimmt. In diesem Verfahren können
Oligonukleotidprimer von ungefähr
10–100
Basen Länge,
die zu konservierten Regionen der rRNA von irgendeiner der 5S, 16S
oder 23S Ribosom-Untereinheiten komplementär sind, mit reverser Transkriptase
verlängert
werden. Die resultierenden DNA Verlängerungsprodukte können dann
entweder durch chemischen Abbau oder durch Didesoxynukleotid-Sequenzierung
sequenziert werden (Lane et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:
6955 (1985)). Gemäß einem
anderen bevorzugten Verfahren können
die genomischen Sequenzen, die die rRNA kodieren, ebenfalls bestimmt
werden.
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Der
starke Zusammenhang von Sekundärstruktur
und Funktion der rRNA Moleküle
ist gut bekannt. Tatsächlich
sind evolutionäre
Veränderungen
in der Primärsequenz
der rRNA wirksam eingeschränkt,
so dass die Sekundärstruktur
des Moleküls
beibehalten wird. Zum Beispiel wird, wenn eine Base auf einer Seite
einer Helix eines rRNA Moleküls
verändert
wird, eine ausgleichende Veränderung
auf der anderen Seite der Helix gemacht, um die Komplementarität zu bewahren
(darauf wird als Kovarianz Bezug genommen). Diese Beziehung erlaubt
zwei sehr verschiedenen rRNA Sequenzen, basierend auf der konservierten
Primärsequenz
und konservierten Elementen der Sekundärstruktur, „abgeglichen" zu werden. Wenn
die Sequenzen einmal abgeglichen worden sind, wird es möglich, konservierte
und variable Regionen der rRNA Sequenz zu identifizieren.
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Variable
Regionen der rRNAs wurden durch vergleichende Analyse unter Verwendung
von publizierten rRNA Sequenzen und Sequenzen, die während der
Entwicklung der vorliegenden Erfindung bestimmt wurden, identifiziert.
Es kann dafür
kommerziell erhältliche
Software verwendet oder für
die hierin offenbarten Zwecke angepasst werden. Da die Sequenzevolution
in jeder der variablen Regionen (zum Beispiel umfassend ein Minimum
von 10 Nukleotiden) von rRNA zum größten Teil divergent und nicht
konvergent ist, können
wir mit Zuversicht Sonden, die auf einigen rRNA Sequenzen, die sich
zwischen dem Zielorganismus und seinen phylogenetisch nächsten Verwandten
unterscheiden, basieren, entwerfen. Tatsächlich haben wir in einer einzelnen
Probe eine ausreichende Variation zwischen den rRNA Sequenzen vieler
Zielorganismen und ihren nächsten
phylogenetischen Verwandten entdeckt, um den Entwurf einer Sonde
zu erlauben, die gemäß den unten beschriebenen
Verfahren verwendet werden kann.
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Richtlinien für die Auswahl
von Sonden
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Die
folgenden allgemeinen Richtlinien können verwendet werden, um Sonden
zu entwerfen, die die gewünschten
Eigenschaften gemäß der vorliegenden
Erfindung besitzen. Die Manipulation von einem oder mehreren der
vielen Faktoren, die das Ausmaß und
die Spezifität
einer Hybridisierungsreaktion beeinflussen, kann die Sensitivität und Spezifität einer
bestimmten Sonde festlegen. Das ist unabhängig davon, ob die Probe über die
gesamte Länge
zu ihrer Polynukleotid Zielsequenz perfekt komplementär ist oder
nicht. Richtlinien zur Herstellung von Sonden, die im Zusammenhang
mit der Erfindung nützlich
sind, folgen nun.
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Zuerst
sollte die Stabilität
des Sonden:Zielnukleinsäure-Hybrids so ausgewählt werden,
das sie mit den Assaybedingungen kompatibel ist. Das kann durch
das Vermeiden langer A und T reicher Sequenzen und das Beenden der
Hybride mit G:C Basenpaaren und durch das Entwerden der Sonde in
einer solchen Art und Weise, dass die Tm für Standardbedingungen, die
in dem Assay verwendet werden, angemessen ist. Die Nukleotidsequenz
der Sonde sollte so ausgewählt
werden, dass die Länge
und %G und %C zu einer Sonde führen,
die eine Tm besitzt, die ungefähr
2–10°C höher ist,
als die bei der der endgültige
Assay durchgeführt
wird. Die Basenzusammensetzung der Sonde ist signifikant, da G:C
Basenpaare verglichen mit A:T oder A:U Basenpaaren größere thermale
Stabilität
zeigen. Somit werden Hybride, die komplementäre Nukleinsäuren, die einen hohen G:C Gehalt
besitzen, einschließen,
verglichen mit Hybriden, die einen niedrigeren G:C Gehalt besitzen,
bei höheren
Temperaturen stabil sein.
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Die
Ionenstärke
und Temperaturbedingungen, bei denen die Hybridisierungsreaktion
durchführt
wird, sollten ebenfalls in Erwägung
gezogen werden, wenn eine Sonde entworfen wird, die ein negativ
geladenes Rückgrat,
wie es zum Beispiel durch Phosphodiesterbindungen zwischen den Nukleotiden
bereitgestellt wird, besitzt. Es ist allgemein bekannt, dass die
Hybridisierungsrate mit der Ionenstärke der Reaktionsmischung ansteigt.
Ebenso steigt die thermale Stabilität der Hybride mit steigender
Ionenstärke.
Umgekehrt erhöhen
Wasserstoffbrückenbindungen
unterbrechende Reagenzien, wie zum Beispiel Formamid, Harnstoff,
DMSO und Alkohole die Stringenz der Hybridisierung. Die Destabilisierung
von Wasserstoffbrückenbindungen
durch Reagenzien dieser Klasse kann die Tm stark verringern. Im
allgemeinen tritt für
synthetische Oligonukleotidsonden von ungefähr 10–50 Basen Länge die optimale Hybridisierung
ungefähr
5°C unter
der Schmelztemperatur einer gegebenen Duplex auf. Hybridisierungsbedingungen,
die unter dem Temperaturoptimum durchgeführt werden, können zulassen,
dass fehlgepaarte Basensequenzen hybridisieren und können zu
verringerter Sondenspezifität
führen.
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Zweitens
sollte die Position, an der die Sonde ihr Zielpolynukleotid bindet
so ausgewählt
werden, dass die Stabilität
von Hybriden, die zwischen Sonde:Nicht-Ziel Polynukleotiden gebildet
werden, minimiert wird. Das kann dadurch erreicht werden, dass die
Länge der
perfekten Komplementarität
mit Polynukleotiden von Nicht-Ziel Organismen minimiert wird, G:C
reiche homologe Regionen mit Nicht-Ziel Regionen vermieden werden
und die Sonde so Positioniert wird, dass sie sich über so viele
destabilisierende Fehlpaarungen wie möglich erstreckt. Ob eine Sondensequenz
für den
Nachweis nur einer spezifischen Organismenart nützlich ist, hängt stark
von den thermalen Stabilitätsunterschieden
zwischen Sonde:Ziel-Hybriden und Sonde:Nicht-Ziel-Hybriden ab. Die
Unterschiede in der Tm sollten so groß wie möglich sein, um hoch spezifische Sonden
zu erzeugen.
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Die
Länge der
Zielnukleinsäuresequenz
und die entsprechende Länge
der Sondensequenz sind ebenfalls wichtige Faktoren, die in Erwägung gezogen
werden sollten, wenn eine Probe entwickelt wird, die nützlich ist,
um spezifisch Actinomyceten nachzuweisen. Obwohl es möglich ist,
dass Polynukleotide, die nicht perfekt komplementär sind,
aneinander hybridisieren, wird die längste Abfolge einer perfekt
homologen Basensequenz normalerweise der wichtigste bestimmende
Faktor der Hybridstabilität
sein.
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Drittens
sind Regionen der rRNA, von denen bekannt ist, dass sie starke interne
Strukturen bilden, die die Hybridisierung einer Sonde hemmen, als
Ziele weniger bevorzugt. Sonden, die ausgedehnte Selbst-Komplementarität besitzen,
sollten ebenfalls vermieden werden. Wie oben angedeutet, ist die
Hybridisierung die Assoziierung von zwei Einzelsträngen komplementärer Nukleinsäure, um
eine über
Wasserstoffbrücken
verbundene Doppelstrangstruktur zu bilden. Wenn einer der beiden
Stränge
komplett oder teilweise doppelsträngig ist, wird er weniger in
der Lage sein, an der Bildung eines neuen Hybrids teilzunehmen.
Bedeutsamerweise bilden alle rRNA Moleküle sehr stabile intramolekulare
Hybride.
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Die
Rate und das Ausmaß der
Hybridisierung zwischen einer Sonde und ihrem Ziel kann wesentlich erhöht werden,
indem die Sonde so entworfen wird, dass ein wesentlicher Teil der
Sequenz von Interesse einzelsträngig
ist. Wenn die nachzuweisende Zielnukleinsäure eine genomische Sequenz
ist, die eine rRNA kodiert, wird das Ziel natürlicherweise in einer Doppelstrangform
auftreten. Dies ist ebenfalls der Fall bei Produkten der Polymerase
Kettenreaktion (PCR). Diese doppelsträngigen Ziele sind natürlicherweise
für die
Hybridisierung mit einer Sonde hemmend. Schließlich können sich ungewünschte intramolekulare
und intermolekulare Hybride innerhalb eines einzelnen Sondenmoleküls oder
zwischen verschiedenen Sondenmolekülen bilden, wenn es ausreichende
Selbst-Komplementarität
gibt. Daher sollte ausgedehnte Selbst-Komplementarität in einer
Sondensequenz vermieden werden.
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Vorzugsweise
werden Sonden, die für
das Durchführen
der unten beschriebenen Verfahren nützlich sind, nur unter hochstringenten
Bedingungen hybridisieren. Unter diesen Bedingungen bilden sich
nur hoch komplementäre
Nukleinsäurehybride
(d.h. solche, die mindestens 14 von 17 komplementäre Basen
in einer zusammenhängenden
Reihe von Basen besitzen). In Abwesenheit eines ausreichenden Grads
an Komplementarität
bilden sich keine Hybride. Dementsprechend bestimmt die Stringenz
der Assaybedingungen die Menge an Komplementarität, die zwischen zwei Nukleinsäuresträngen, die
ein Hybrid bilden, benötigt
wird. Die Stringenz wird ausgewählt,
um die Stabilitätsunterschiede
zwischen dem Hybrid, das mit dem Ziel gebildet wird, und dem das
mit Nicht-Zielnukleinsäuren
gebildet wird zu maximieren.
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Beispielhafte
hochstringente Bedingungen werden in den unten präsentierten
Beispielen verwendet.
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Während Oligonukleotidsonden
verschiedener Längen
und Basenzusammensetzungen zum Nachweis von Actinomyceten verwendet
werden können,
haben in dieser Erfindung bevorzugte Sonden Längen von bis zu 100 Nukleotiden
und bevorzugter 60 Nukleotiden. Bevorzugte Längenbereiche für die erfindungsgemäßen Oligonukleotide
sind 10 bis 100 Basen Länge
oder bevorzugter zwischen 15 und 50 Basen Länge, wobei diese zu der Zielnukleinsäure ausreichend
homolog sind, um unter hochstringenten Bedingungen, wie zum Beispiel
solchen, die in den unten beschriebenen Beispielen verwendet werden,
die Hybridisierung zu erlauben. Die spezifischen Sondensequenzen,
die unten beschrieben werden, können
jedoch ebenfalls in einem Nukleinsäureklonierungsvektor oder Transkript
oder einer anderen längeren
Nukleinsäure
bereitgestellt und trotzdem zum Nachweis von Mitgliedern der Actinomyceten
verwendet werden.
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Chemische Struktur von
Oligonukleotiden
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Alle
Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung können mit chemischen Gruppen
modifiziert werden, um ihre Leistung zu verbessern. Es ist somit
selbstverständlich,
dass die Bezugnahme auf „Oligonukleotidsonden" oder „Helfer-Oligonukleotide" oder einfach „Oligonukleotide", Polymere von nativen
Nukleotiden sowie Polymere, die mindestens ein Nukleotidanalog einschließen, umfasst.
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Oligonukleotide
mit modifiziertem Rückgrat,
wie zum Beispiel solche, die Phosphorthioat- oder Methylphosphonatgruppen
besitzen, sind Beispiele von Analoga, die in Verbindung mit Oligonukleotiden
der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Diese Modifikationen
machen die Oligonukleotide gegenüber der
nukleolytischen Aktivität
von bestimmten Polymerasen oder gegenüber Nuklease-Enzymen resistent.
Andere Analoga, die in die Strukturen der hierin offenbarten Oligonukleotide
eingebaut werden können,
schließen Peptidnukleinsäuren oder „PNAs" ein. Die PNAs sind
Verabindungen, die Liganden, die an ein Peptid Rückgrat anstelle eines Phosphodiester
Rückgrats
gebunden sind, umfassen. Charakteristische Liganden schließen entweder
die vier natürlich
auftretenden Haupt DNA Basen (d.h. Thymin, Cytosin, Adenin oder
Guanin) oder andere natürlich
auftretende Nukleobasen (zum Beispiel Inosin, Uracil, 5-Methylcytosin oder
Thiouracil) oder artifizielle Basen (zum Beispiel Bromthymin, Azadenine
oder Azaguanine, etc.) ein, die über
einen geeigneten Linker an das Peptid Rückgrat angeheftet sind. Die
PNAs sind in der Lage, komplementäre ssDNA und RNA Stränge zu binden.
Verfahren zur Herstellung und Verwendung von PNAs werden in U.S.
Patent Nr. 5,539,082 offenbart. Eine andere Art von Modifikation,
die verwendet werden kann, um die Oligonukleotide, die die hierin beschriebenen
Sequenzen besitzen, herzustellen, schließt die Verwendung von Nicht-Nukleotidlinkern
(z.B. Arnold et al., „Non-Nucleotide
Linking Reagents for Nucleotide Probes", U.S. Patent Nr. 6,031,091) ein, die
zwischen den Nukleotiden in der Nukleinsäurekette eingebaut sind, und
die nicht mit der Hybridisierung oder der Verlängerung eines Primers interferieren.
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Nukleinsäure-basierte
Verfahren zum Nachweis von rRNA oder rDNA
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Eine
Zusammensetzung, die eine Oligonukleotisonde entweder alleine oder
in Kombination mit einem oder mehreren Helfer-Oligonukleotiden einschließt, kann
verwendet werden, um rRNA oder rDNA von Actinomycetenbakterien in
einem Hybridisierungsassay nachzuweisen. Definierte Oligonukleotide,
die verwendet werden können,
um die Erfindung durchzuführen,
können
mit jedem von mehreren gut bekannten Verfahren, einschließlich automatisierter
chemischer Festphasensynthese unter Verwendung von Cyanoethylphosphoramidit
Vorläufern
(Barone et al., Nucl Acids Res 12: 4051 (1984)) hergestellt werden.
Andere gut bekannte Verfahren zur Herstellung von synthetischen
Oligonukleotiden können
ebenfalls verwendet werden.
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Im
wesentlichen kann jedes Markierungs- und Nachweissystem, das zum
Kontrollieren der spezifischen Nukleinsäurehybridisierung verwendet
werden kann, in Verbindung mit den hierin offenbarten Sonden verwendet
werden, wenn eine markierte Sonde gewünscht ist. Eingeschlossen in
der Auswahl nützlicher
Marker sind: Isotopenmarker, Enzyme, Haptene, verbundene Oligonukleotide,
Chemolumineszenzmoleküle
und Redox-aktive Reste, die gegenüber elektrochemischen Nachweisverfahren
empfänglich
sind. Standardisotopenmarker, die verwendet werden können, um
markierte Oligonukleotide herzustellen, schließen ein 3H, 35S, 32P, 125I, 57Co und 14C. Wenn radiomarkierte Sonden verwendet
werden, können
die Hybride durch Autoradiographie, Szintillationszählung oder
Gammazählung
nachgewiesen werden.
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Nicht-Isotopenmaterialien
können
ebenfalls verwendet werden, um Oligonukleotidsonden zu markieren.
Diese nicht-Isotopenmarker
können
intern oder an einem Ende der Oligonukleotidsonde positioniert werden.
Modifizierte Nukleotide können
enzymatisch oder chemisch eingebaut werden, wobei die Modifikationen der
Sonde während
oder nach der Sondensynthese zum Beispiel durch die Verwendung von
Nicht-Nukleotid Linkergruppen
durchgeführt
werden. Nicht-Isotopenmarker
schließen
fluoreszierende Moleküle,
Chemolumineszenzmoleküle,
Enzyme, Kofaktoren, Enzymsubstrate, Haptene oder andere Liganden
ein. Acridiniumester sind besonders bevorzugte Nicht-Isotopenmarker
zum Nachweis von Sondenhybriden.
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Tatsächlich kann
jede Anzahl von anderen Nicht-Isotopenmarkern
zur Herstellung von markierten Oligonukleotiden gemäß der Erfindung
verwendet werden. Bevorzugte Chemolumineszenzmoleküle schließen Acridiniumester
des Typs, der durch Arnold et al., in U.S. Patent Nr. 5,283,174
für die
Verwendung im Zusammenhang mit homogenen Schutzassays offenbart
wurde, und des Typs, der durch Woodhead et al. in U.S. Patent Nr.
5,656,207 für
die Verwendung im Zusammenhang mit Assays, die viele Ziele in einer
einzelnen Reaktion quantifizieren, ein. U.S. Patent 5,998,135 offenbart
noch ein anderes Verfahren, das, unter Verwendung von Fluorimetrie
um die Fluoreszenzemission von Lanthanidmetallmarkern, die an die
Proben angeheftet sind, nachzuweisen, wobei die Emission von diesen
Markern verstärkt
wird, wenn sie sich in großer
Nähe zu
einem Energietransferpartner befinden, für die Markierung und den Nachweis
der Sonden der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Bevorzugte
elektrochemische Marker und Nachweisansätze werden in den U.S. Patenten
Nr. 5,591,578 und 5,770,369 und der publizierten internationalen
Patentanmeldung Nr. PCT/US98/12082 offenbart. Redox-aktive Reste,
die als elektrochemische Marker in der vorliegenden Erfindung nützlich sind,
schließen Übergangsmetalle,
wie zum Beispiel Cd, Mg, Cu, Co, Pd, Zn, Fe und Ru, ein.
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Der
Durchschnittsfachmann wird anerkennen, dass alternative Verfahren
zum Nachweis von Nukleinsäuren
von Actinomycetenbakterien unter Verwendung der erfindungsgemäßen Sonden
unter Verwendung von entweder markierten Sonden oder nicht markierten
Sonden durchgeführt
werden können.
Zum Beispiel werden Hybridisierungsassayverfahren, die sich nicht
auf die Verwendung von markierten Sonden verlassen, in US Patent
Nr. 5,945,286 offenbart, das die Immobilisierung von nicht markierten
Sonden, die aus Peptidnukleinsäuren
(PNAs) hergestellt sind, und nachweisbar markierten interkalierenden
Molekülen,
die Doppelstrang PNA Sonde:Zielnukleinsäure-Duplexe binden können, beschreibt. In diesen
Verfahren sowie in bestimmten elektrochemischen Nachweisverfahren,
zum Beispiel denen, die in der veröffentlichten internationalen
Patentanmeldung Nr. PCT/US98/12082 betitelt „Nachweis von Analyten unter
Verwendung von Reorganisierungsenergie", der veröffentlichten internationalen
Patentanmeldung Nr. PCT/US98/12430 betitelt „Elektronische Verfahren für den Nachweis
von Analyten" und
in der veröffentlichten
internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US97/20014 betitelt „Über leitende
Oligomere an Nukleinsäuren
gebundene Elektroden" offenbart werden,
ist es nicht erforderlich, dass die Oligonukleotidsonde einen nachweisbaren
Marker besitzt.
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Die
Annehmbarkeit des Endproduktes nach der Synthese und Reinigung eines
Oligonukleotids kann durch jedes mehrerer Verfahren verifiziert
werden. Zuerst kann eine Polyacrylamid Gelelektrophorese verwendet
werden, um gemäß Standardlaborverfahren
die Größe und Reinheit
des Oligonukleotids zu bestimmen (siehe Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Sambrook et al., eds. Cold Spring Harbor Lab Publ., 11.51, (1989)).
Alternativ können
Hochdruckflüssigchromatographie("HPLC")-Verfahren für denselben
Zweck verwendet werden.
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Die
Hybridisierung zwischen der markierten Oligonukleotidsonde und der
Zielnukleinsäure
in den unten beschriebenen Verfahren kann durch die Verwendung von
nicht-markierten „Helfer-Oligonukleotiden" gemäß dem von
Hogan et al. in US-Patent Nr. 5,030,557 betitelt „Mittel
und Verfahren zum Verstärken
der Nukleinsäurehybridisierung" offenbarten Verfahren
verstärkt
werden. Wie oben angedeutet, binden Helfer-Oligonukleotide eine
Region der Zielnukleinsäure,
die sich von der Region, die durch die Assaysonde gebunden wird, unterscheidet
Diese Bindung verleiht der Zielregion der einzelsträngigen Nukleinsäure neue
Sekundär- und
Tertiärstrukturen
und beschleunigt die Rate der Sondenbindung. Helfer-Oligonukleotide,
die in Verbindung mit markierten Oligonukleotidsonden der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
sind vorzugsweise 17 bis 100 Nukleotide lang und haben eine Sequenz,
die mindestens 17 zusammenhängende
Nukleotide, die in der Sequenz von SEQ ID Nr. 10 enthalten sind,
einschließt.
Andere bevorzugte Helferoligonukleotide haben Längen von bis zu 100 Nukleotiden
und schließen
mindestens 25 zusammenhängende
Nukleotide, die in der Sequenz von SEQ ID Nr. 10 enthalten sind,
ein.
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Der
Durchschnittsfachmann wird anerkennen, dass Faktoren, die die thermale
Stabilität
eines Sonden:Ziel-Hybrids beeinflussen, ebenfalls die Probenspezifität beeinflussen
können.
Dementsprechend sollte das Schmelzprofil, einschließlich der
Schmelztemperatur (Tm) von Sonde:Ziel-Hybriden für jede Sonden:Ziel-Kombination
empirisch bestimmt werden. Ein bevorzugtes Verfahren, um diese Bestimmung
durchzuführen,
wird von Arnold et al. in US Patent Nr. 5,283,174, betitelt „Homogener
Schutzassay", beschrieben.
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Ein
Ansatz zum Messen der Tm eines Sonde:Ziel-Hybrids schließt das Durchführen eines
Hybridisierungsschutzassays ein. Gemäß dem Verfahren dieses Assays
wird ein Sonden:Ziel-Hybrid
unter Zielüberschuss-Bedingungen
in einer Lithiumsuccinat-gepufferten Lösung, die Lithiumlaurylsulfat
enthält,
gebildet. Aliquots der „vorgeformten" Hybride werden in
dem Hybridisierungspuffer verdünnt
und für
fünf Minuten
bei verschiedenen Temperaturen, die unter dem angenommenen Tm (typischerweise
55°C) starten
und in 2–5
Grad Schritten ansteigen, inkubiert. Diese Lösung wird dann mit einem leicht
alkalischen Boratpuffer verdünnt
und bei einer niedrigeren Temperatur (zum Beispiel 50°C) für zehn Minuten
inkubiert.
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Ein
Acridiniumester (AE), der an eine einzelsträngige Sonde gebunden ist, wird
unter diesen Bedingungen hydrolisiert, während ein Acridiniumester,
der eine hybridisierte Sonde gebunden ist, relativ „geschützt" sein wird. Dieses
Verfahren wird als Hybridisierungsschutzassay („HPA") bezeichnet. Die Menge an verbleibender
Chemolumineszenz ist proportional zu der Menge des Hybrids und wird
in einem Luminometer durch die Zugabe von Wasserstoffperoxyd gefolgt
von Lauge gemessen. Die Daten werden als Prozent des Maximumsignals
(gewöhnlich
bei der niedrigsten Temperatur) gegen die Temperatur aufgetragen.
Die Tm wird als der Punkt definiert, bei dem 50% des Maximumsignal übrig bleiben.
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In
einem alternativen Ansatz kann die Tm eines Sonde:Ziel-Hybrids unter Verwendung
einer Isotopen-markierten Sonde bestimmt werden. In allen Fällen wird
die Tm für
ein gegebenes Hybrid abhängig
von der Konzentration an Salzen, Detergenzien und anderen gelösten Stoffen,
die in der Hybridisierungslösung enthalten
sind, variieren. Alle diese Faktoren beeinflussen die relative Hybridstabilität während der
thermalen Denaturierung (Molecular Cloning: A Laboratory Manual
Sambrook et al., eds. Cold Spring Harbor Lab Publ., 9.51 (1989)).
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Die
Rate, mit welcher eine Sonde an ihr Ziel hybridisiert, ist ein Maß der thermalen
Stabilität
der Zielsekundärstruktur
in der Sondenregion und kann unter Verwendung von C0t½ Messungen
bestimmt werden. Diese kinetischen Messungen der Hybridisierungsrate
haben Einheiten von (Mol Nukleotid pro Liter) × (Sekunden). Einfacher ausgedrückt ist
der C0t½ Wert
die Konzentration von Sonde mal der Halbwertszeit der Hybridisierung
bei dieser Konzentration. Dieser Wert kann durch das Hybridisieren
verschiedener Mengen von Sonde an eine konstante Menge von Zielnukleinsäure für eine festgelegte
Zeit bestimmt werden. Zum Beispiel werden 0,05 pmol Ziel mit 0,012,
0,025, 0,05, 0,1 und 0,2 pmol Sonde für 30 Minuten inkubiert. Der
C0t½ kann ebenfalls durch
das Hybridisieren des Ziels und der Sonde unter Zielüberschuss-Bedingungen und dann
das Messen des Anstiegs der Duplexbildung über die Zeit bestimmt werden.
Die Menge von vorhandenem Hybrid kann unter Verwendung des oben
beschriebenen HPA-Verfahrens oder durch Szintillationszählung gemessen
werden, wenn eine radiomarkierte Sonde in dem Verfahren verwendet
wird. Wenn eine AE markierte Sonde verwendet wird, wird das gemessene
Signal dann als der log der Prozentzahl an maximalen relativen Lichteinheiten („RLU") von der höchsten Sondenkonzentration
gegen die Sondenkonzentration (Mol Nukleotid pro Liter) aufgetragen.
Der C0t½ wird
graphisch aus der Konzentration, die 50% der maximalen Hybridisierung
entspricht, multipliziert mit der Hybridisierungszeit in Sekunden
bestimmt. Diese Werte reichen von 9 × 10–6 bis
9 × 10–5 mit
bevorzugten Werten kleiner als 3,5 × 10–5.
Vergleichbare Werte können
durch das Messen der Radioaktivität und das Auftragen von % Hybridisierung
an einem gegebenen Zeitpunkt gegen den maximalen Ausschlag erhalten
werden.
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In
einem bevorzugten Verfahren des Nachweises, ob eine biologische
Probe rRNA oder rDNA enthält, die
die Anwesenheit von Mitgliedern der Actinomyceten anzeigen würde, können Nukleinsäuren von
bakteriellen Zellen durch Ultraschallaufschluss, zum Beispiel gemäß dem von
Murphy et al. in US Patent Nr. 5,374,522 offenbarten Verfahren,
freigesetzt werden. Andere bekannte Verfahren, um Zellen aufzuschließen schließen die
Verwendung von Enzymen, osmotischem Schock, chemischer Behandlung
und Vortexen mit Glaskügelchen
ein. Andere Verfahren, um die Nukleinsäuren, die den hierin offenbarten
Hybridisierungsmethoden unterzogen werden können, aus Mikroorganismen freizusetzen,
wurden von Clark et al. in US-Patent Nr. 5,837,452 und von Kacian
et al. in US Patent Nr. 5,364,763 beschrieben. Nach oder gleichzeitig
mit der Freisetzung von rRNA kann in Gegenwart von beschleunigenden
Mitteln markierte Sonde zugegeben und bei der optimalen Hybridisierungstemperatur
für einen
Zeitraum inkubiert werden, der notwendig ist, um eine signifikante
Hybridisierungsreaktion zu erreichen.
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Die
folgende Polynukleotidsequenz wurde anhand der Kriterien Länge, Tm
und Nukleotidsequenz charakterisiert und es wurde gefunden, dass
sie für
die rRNA von Actinomyceten spezifisch ist, CGAGCATCTTTACTCGTAGTGCAATTTCG
(SEQ ID Nr. 1). Dieses Polynukleotid, auf das hierin als MtuB2011
Bezug genommen wird, ist zu einem einzigartigen Segment, das in
der 23S rRNA von allen Actinomyceten gefunden wird, komplementär. Eine
repräsentative
Liste von Actinomycetenbakterien kann in Tabelle 2 gefunden werden.
Die Probe ist 29 Basen lang, besitzt einen RXL Linker zwischen 11
und 12 Nukleotiden vom 5' Ende aus,
hat eine Tm von 65,5°C
und hybridisiert die rRNA von Mycobacterium avium in einer Region,
die den Basen 2011–2040
von E. coli 23S rRNA entspricht.
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Diese
Sonde ist ein Beispiel eines Oligonukleotids dass: (1) die Zielnukleinsäure unter
hochstringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, (2) eine
Länge von
bis zu 100 Nukleotidbasen besitzt und (3) mindestens 17 zusammenhängende Nukleotide
einschließt,
die in die 1986-2064 Zielregion, die durch SEQ ID Nr. 10 oder das
Komplementär
davon identifiziert wird, fallen. Andere Oligonukleotide, die diese
Eigenschaften besitzen, werden ebenfalls für die Verwendung als Nachweissonden
im Hybridisierungsassay in Erwägung
gezogen und werden von der Erfindung umfasst.
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Ebenso
werden Oligonukleotide, die die Sequenzen von SEQ ID Nr. 2 und SEQ
ID Nr. 3 besitzen, hierin als Beispiele von nützlichen Helfer-Oligonukleotiden
offenbart. Wie die Helfer- Oligonukleotide,
die hierin in den Arbeitsbeispielen verwendet werden, haben andere
Helfer-Oligonukleotide, die ebenfalls von der Erfindung umfasst
werden, Sequenzen von bis zu 100 Nukleotiden Länge und haben ferner mindestens
17 oder bevorzugter mindestens 25 zusammenhängende Nukleotide, die in der
Zielregion, die durch SEQ ID Nr. 10 oder das Komplementär davon
identifiziert wird, enthalten sind.
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Wie
unten angedeutet, hybridisiert die MtuB2011 Sonde Actinomyceten
rRNA in einer Art und Weise, die durch die Verwendung von Helfer-Oligonukleotiden
unterstützt
wurde. Gemäß dem Verfahren,
das verwendet wurde, um diese Bestimmung durchzuführen, wurde
ein einzelsträngiges
Sondenoligonukleotid, das am 5' Ende
radiomarkiert war, mit rRNA von Mycobacterium avium in An- oder
Abwesenheit von Helfer-Oligonukleotiden in Kontakt gebracht. Sondenmoleküle, die
die rRNA hybridisierten, um Doppelstrang-Hybride zu bilden, wurden
durch Hydroxyapatitbindung von einzelsträngigen Sondenmolekülen getrennt.
Die an das Hydroxyapatit gebundenen Doppelstrang-Hybride wurden
nachgewiesen und mittels Szintillationszählung quantifiziert. Das Ausmaß der Hybridisierung
wurde dann als Prozentsatz berechnet. Wie unten gezeigt, war die
Tm des Sonden:Ziel-Hybrids
in der Gegenwart von einem oder mehreren Helfer-Oligonukleotiden vorteilhafterweise deutlich
erhöht.
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Die
folgenden Beispiele beschreiben die Verfahren, die verwendet wurden,
um zu zeigen, dass die MtuB2011 Sonde rRNA von Mycobacterium avium
hybridisiert und das diese Interaktion durch das Einschließen von Helfer-Oligonukleotiden
in die Hybridisierungsmischung erleichtert wurde.
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Beispiel 1
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Tm Bestimmung für Sonden:Ziel-Hybride
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Tm
Werte für
Sonden:Ziel- und Helfer:Ziel-Hybride wurden unter Verwendung einer
am Ende markierten Sonde, die die Sequenz von MtuB2011 besaß, und am
Ende markierten Helfer-Oligonukleotiden,
ausgewählt
aus der Gruppe: (A) OMeFraB1986 und (B) OMeFraB2040, bestimmt. Die
Sequenz von MtuB2011 ist CGAGCATCTTTACTCGTAGTGCAATTTCG (SEQ ID Nr.
1), die Sequenz von OMeFraB1986 ist CCGAGUCUGUGGUUGAGACAGUGGG (SEQ
ID Nr. 2) und die Sequenz von OMeFraB2040 ist GGUCUUUCCGUCCUGCCGCGCGUAA
(SEQ ID Nr. 3). Die Helfer-Oligonukleotide A und B wurden ausgewählt, um
die rRNA von Actinomyceten in Regionen des Moleküls, die direkt benachbart zu
der Sonde sind, zu binden, wobei Helfer A in ungefähr der 1986-2010
Region der 23S rRNA und Helfer B in der 2040–2064 Region der 23S rRNA bindet. Die
Sonde und Helfer-Oligonukleotide waren unter Verwendung von [γ-32P]ATP als Phosphatdonor und T4 Polynukleotidkinase,
um die Phosphattransferreaktion im wesentlichen wie in Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., eds. Cold Spring
Harbor Lab Publ. 10.59 (1989)) beschrieben zu katalysieren, am 5'-Ende markiert. Die
am Ende markierten Helfer-Oligonukleotide wurden einzeln mit gereinigter
rRNA von Mycobacterium gordonae kombiniert und das Sondenoligonukleotid
wurde mit gereinigter rRNA von Mycobacterium avium kombiniert, um
Zielüberschuss-Bedingungen
zu schaffen. In Versuchen, die sowohl die Sonde als auch die Helfer-Oligonukleotide
einschlossen, war die Sonde am Ende markiert und jedes Helfer-Oligonukleotid
war gegenüber
der Mycobacterium avium rRNA, die als Ziel diente, in mindestens
10-fachen molarem Überschuss
vorhanden. Alle Mischungen wurden in einer Lösung, die 0,48 M Natriumphosphatpuffer,
0,1% Natriumdodecylsulfat, 1 mM EDTA und 1 mM EGTA einschloss, bis
zur Vollständigkeit
hybridisiert. Als negative Kontrollen wurden die Sonde und/oder
Helfer-Oligonukleotide
in der Abwesenheit des Nukleinsäureziels hybridisiert.
Nach Abschluss des Hybridisierungsverfahrens wurden die Mischungen
verdünnt
und über
eine Hydroxyapatitsäule
laufen gelassen, um einzelsträngige
Nukleinsäuren
von Doppelstrang-Hybriden zu trennen. Die Menge an Radioaktivität in dem
Säulendurchfluss
steht für
die einzelsträngige
Sonde und wurde über
Szintillationszählung
gemessen. Die Menge an Radioaktivität, die an das Hydroxyapatit
gebunden ist, wurde separat über
Szintillationszählung
gemessen. Das Ausmaß der
Hybridbildung, ausgedrückt
als Prozentsatz, wurde durch das Dividieren der Menge an Sonde (gemessen
in cpm), die an das Hydroxyapatit gebunden ist, durch die Gesamtmenge
an Sonde (in cpm), die auf die Säule
gegeben wurde, berechnet. Die Ergebnisse dieser Verfahren sind in
Tabelle 1 dargestellt.
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Tabelle
1 Hybridisierung
der MtuB2011 Sonde mit Ziel rRNA
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Die
Ergebnisse dieses Verfahrens bestätigten, dass die an Ende markierte
Sonde rRNA von Mycobacterium avium und/oder Mycobacterium gordonae
hybridisierte und zeigte, dass diese Interaktion vorteilhaft durch
Helfer-Oligonukleotide erleichtert wurde. Wir beobachteten insbesondere,
dass der Tm des Sonde:Ziel-Komplexes von 65,5 auf 69,5°C erhöht werden
konnte, wenn beide Helfer-Oligonukleotide bei der Hybridisierungsreaktion
eingeschlossen waren. Obwohl die Sonde entweder alleine oder in
Kombination mit einem oder mehreren Helfer-Oligonukleotiden verwendet
werden kann, um Actinomyceten rRNA zu hybridisieren, wurden die
unten beschriebenen Experimente, um die Sonde zu charakterisieren,
unter Verwendung der Sonde in Kombination mit Helfer-Oligonukleotiden,
die die Sequenz von OMeFraB1986 und OMeFraB2040 besaßen, durchgeführt. Kombinationen
von Sonde und Helfer-Oligonukleotiden, die in den hierin beschriebenen
Verfahren nützlich
sind, haben unter den oben beschriebenen Bedingungen vorzugsweise
Sonden:Ziel Tm-Werte im Bereich von ungefähr 65–70°C.
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Die
Probenspezifität
wurde durch Demonstration der positiven Hybridisierung an rRNAs
einer Spezifitätsreihe
bestätigt.
Die Auswahl an Organismen, die in diesem Verfahren als Zielnukleinsäure-Quellen
verwendet wurde, stellt einen breiten taxonomischen Querschnitt
von Organismen und nächsten
Nachbargruppen dar. In dem folgenden Verfahren wurden die quantitiven
Ergebnisse unter Verwendung der AE-markierten Hybridisierungssonde
mit der Menge an bakterieller rRNA, die in jeder Probe vorhanden
war, unter Verwendung einer positiven Kontrollsonde verglichen.
Diese positive Kontrollsonde, die rRNA von allen Bakterienspezies
hybridisierte, war insbesondere nützlich, um die Gegenwart von
bakterieller rRNA in den Proben zu bestätigen, die die MtuB2011 Sonde
nicht hybridisierte. In solch einem Fall lieferte die positive Kontrollsonde
die Bestätigung für die Gegenwart
von hybridisierbarer rRNA und validierte so die negativen Ergebnisse.
Im Fall von Pilz Ziel-rRNA diente eine allgemein reaktive Pilz rRNA
Hybridisierungssonde als positive Kontrolle.
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Die
folgenden Beispiele beschreiben die Verfahren, die verwendet wurden,
um zu zeigen, dass die MtuB2011 Sonde rRNAs einer Reihe von Actinomyceten
Organismen hybridisiert.
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Beispiel 2
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Verifizierung der Sondenspezifität
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Bakterielle
Lysate oder gereinigte RNA wurden als Nukleinsäureziele für die Hybridisierung einer
Probe, die die Sequenz CGAGCATCTTTACTCGTAGTGCAATTTCG (MtuB2011)
(SEQ ID Nr. 1) besaß,
zusammen mit Helfer-Oligonukleotiden, die die Sequenzen CCGAGUCUGUGGUUGAGACAGUGGG (OMeFraB1986)
(SEQ ID Nr. 2) und GGUCUUUCCGUCCUGCCGCGCGUAA (OMeFraB2040) (SEQ
ID Nr. 3) besaßen,
verwendet. Organismen, die in diesem Verfahren als rRNA Quellen
eingesetzt wurden, waren entweder typische klinische Isolate oder
wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten.
Alle Proben sind in Tabelle 2 durch Master Log Nummern für Gen-Probe
Incorporated identifiziert. Die meisten Proben wurden von der ATCC
erhalten. Parallele Proben von jeder rRNA wurden mit der markierten
positiven Kontrollsonde mit der Sequenz CGACAAGGAAUUUCGC (OMe Eco
B 1933) (SEQ ID Nr. 4) und unmarkierten Helfer-Oligonukleotiden
mit der Sequenz UACCUUAGGACCGUUAU (OMe Eco B 1916) (SEQ ID Nr. 5)
und CAGGUCGGAACUUACC (OMe Eco B 1949a) (SEQ ID Nr. 6) hybridisiert.
Die Hybridisierungslösung
enthielt 0,6 M LiCl, 1% Lithiumlaurylsulfat, 60 mM Lithiumsuccinat
und jeweils 10 mM EDTA und EGTA, pH 5,5. Sowohl die MtuB2011 Sonde
als auch die positive Kontrollsonde waren mit Acridiniumester im
wesentlichen gemäß dem Verfahren
offenbart in US-Patent Nr. 5,185,439 betitelt „Acridinium Ester Markierung
und Reinigung von Nukleotidsonden" markiert. Bei Abschluss der Hybridisierungsreaktion
wurde der Acridiniumester, der an nicht-hybridisierte Sonde gebunden
war, unter leicht alkalischen Bedingungen nicht-chemolumineszent
gemacht, während
der Acridiniumester, der an hybridisierte Sonden angeheftet war,
gegenüber
der Inaktivierung resistent blieb. Bedingungen für die Hydrolyse und den Nachweis
von hybridisierter Sonde, die mit Acridiniumester markiert war, werden
von Arnold et al., in Clin Chem. 35: 1588 (1989)) beschrieben. Das
Ausmaß der Sondenhybridisierung
in diesen Verfahren wurde durch Luminometrie unter Verwendung von
Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann vertraut sind, quantifiziert.
Der Betrag des Actionomyceten Sondensignals wurde dann durch den
Betrag des positiven bakteriellen Kontrollsignals geteilt, um die
Ergebnisse in der Studie quantitativ zu normieren. Proben, die MtuB2011
Sondensignale besaßen,
die größer als
30% der positiven Kontrolle waren, zeigten spezifische Hybridisierung
der MtuB2011 Sonde mit Helfern an, während niedrigere Werte negative
Ergebnisse für
das Assayformat anzeigen. Die Assayergebnisse sind in Tabelle 2
gezeigt. Tabelle
2 Hybridisierung
der MtuB2011 Sonde und rRNA-enthaltenden Lysaten aus einer Auswahl
von Actinomyceten
- *"GP#" Einträgen zeigen
Master Log Nummern für
Gen Probe Incoroporated an.
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Die
Ergebnisse, die in Tabelle 2 präsentiert
werden, bestätigen,
dass die Sonde, die sich gegen Actinomyceten rRNA richtete, wirksam
rRNA Proben einer Vielzahl von Actinomycetenarten hybridisierte.
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Die
Spezifität
der Actinomyceten-spezifischen Sonde wurde ferner durch das Hybridisieren
der markierten Probe mit einer Auswahl von Arten, die ein breites
Spektrum an phylogenetisch unterschiedlichen Organismen repräsentieren,
untersucht. In diesem Verfahren wurde die AE-markierte Sonde einzeln
mit individuellen rRNA enthaltenden Lysaten von Organismen gemischt,
die nur entfernte phylogenetische Verwandte der Actinomyceten waren.
Positive Hybridisierungsergebnisse, die unter Verwendung der positiven
Kontrollsonde erhalten wurden und negative Ergebnisse, die unter
Verwendung der MtuB2011 Sonde in dem folgenden Verfahren erhalten
wurden, zeigten ferner an, dass die MtuB2011 Sonde vorteilhaft hochspezifisch
für Actinomyceten
Organismen war.
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Die
folgenden Beispiele beschreiben zusätzliche Verfahren, die verwendet
wurden, um die Spezifität der
Sonde zu zeigen. Insbesondere zeigten die folgenden Verfahren, dass
die MtuB2011 Sonde nicht mit Lysaten von nicht-phylogenetisch verwandten
Organismen kreuzhybridisierte.
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Beispiel 3
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Abwesenheit
von Kreuzhybridisierung mit phylogenetisch nicht verwandten Organismen
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Hybridisierungsassays
wurden unter Verwendung der AE-markierten
Sonden und Helfer-Oligonukleotide gemäß den Verfahren, die in den
vorigen Beispielen beschrieben wurden, durchgeführt, außer dass Lysate, die aus vielen
unterschiedlichen Arten isolierte rRNA enthielten, als Zielnukleinsäuren dienten.
Die Ergebnisse dieses Verfahrens sind in Tabelle 3 präsentiert.
Eine Pan-Pilzprobe mit der Sequenz GTCTGGACCTGGTGAGTTTCCC (SEQ ID
Nr. 7) und Methoxy Helfer-Oligonukleotiden mit den Sequenzen CGUGUUGAGUCAAAUUAAGCCGC
(SEQ ID Nr. 8) und GCUCUCAAUCUGUCAAUCCUUAUUGU (SEQ ID Nr. 9) wurden
als positive Kontrollen verwendet, um Pilz rRNAs nachzuweisen. Die
Ergebnisse, die in Hybridisierungsverfahren, die Ziel-rRNA von Pilzorganismen
verwendeten, erhalten wurden, sind in Tabelle 4 präsentiert. Tabelle
3 Hybridisierung
der MtuB2011 Sonde mit rRNA einer Auswahl von phylogenetisch nicht-verwandten
Organismen
- *"GP#" Einträge zeigen
Master Log Nummern für
Gen-Probe Incoroporated an.
Tabelle
4 Hybridisierung der MtuB2011 Sonde mit rRNA einer Auswahl an Pilzorganismen - *"GP#" identifiziert Organismen über Master
Log Nummern für
Gen-Probe Incoroporated.
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Die
Ergebnisse, die in Tabelle 3 und Tabelle 4 präsentiert werden, bestätigten,
dass die MtuB2011 Sonde mit rRNA von vielen nicht-verwandten bakteriellen
und Pilz-Arten nicht kreuzhybridisierte. Zusammengenommen mit den
positiven Hybridisierungsergebnissen, die in Tabelle 2 präsentiert
wurden, war klar, dass die Probe für die rRNA von Actinomyceten
hochspezifisch war.
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Diese
Ergebnisse bestätigten,
dass die hierin offenbarten neuartigen Sonden in der Lage waren,
Actinomyceten nachzuweisen. Außerdem
waren die Sonden in der Lage, Actinomyceten von Organismen, die phylogenetisch
nahe verwandt waren, zu unterscheiden.
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Diese
Erfindung wurde mit Bezugnahme auf eine Reihe von spezifischen Beispielen
und Ausführungsformen
beschrieben. Natürlich
legen sich bei Durchsicht der vorangehenden detaillierten Beschreibung
eine Reihe von verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung dem Durchschnittsfachmann von selbst nahe. Daher sollte
der wahre Umfang der vorliegenden Erfindung mit Bezugnahme auf die
angefügten Patentansprüche bestimmt
werden.
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