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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik. Genauer
betrifft die vorliegende Erfindung die Molekulardiagnostik der Whipple-Krankheit
durch Techniken zur Detektion und/oder Amplifizierung und Sequenzierung
mit Hilfe von Sonden oder Oligonukleotidprimern und deren Verwendung
zur Suche nach der Gegenwart oder zur Identifizierung der Bakterien
der Spezies Tropheryma whippelli.
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Die
Whipple-Krankheit ist eine Krankheit, die sich in verschiedenen
Formen zeigt. Die klassischste Form ist jene eines Fiebers mit einem
chronischen Durchfall, was ein Abmagern mit sich zieht, aber es
ist auch eine Krankheit, die geeignet ist, chronische Gelenkerkrankungen,
Gehirnerkrankungen mit Demenz, ophtalmologische Erkrankungen mit
Uveitis und auch eine Herzerkrankung insbesondere Endokarditis mit
negativer Blutkultur zu ergeben. Seit ihrer Beschreibung 1907 erinnert
Whipple an die Existenz eines Bakteriums, das verbunden ist mit "Darmlipodystrophie", angesichts der
Beobachtung zahlreicher Mikroorganismen nach Silberanfärbung eines
mesenterischen Ganglions [Whipple GH (1907) Bull. John Hopkins Hosp.
18:328]. Der Nachweis des positiven, nicht spezifischen PAS-Charakters
(aus dem Englischen "periodic
acid Schiff") von diesem
Bakterium und dazu Elektronenmikroskopiebeobachtungen bestätigen die
Gegenwart einer intrazellulären
Bakterienspezies mit Gram-positiver Struktur [Chears et al. (1961)
Gastroenterology 41:1296]. Das universelle Molekularwerkzeug 16S
rRNA hat es erlaubt, diese Annahme zu bestätigen unter Präzisierung
der phylogenetischen Taxonomie dieser neuen Bakterienspezies und
indem ihr der provisorische Name Tropheryma whippelii zugeschrieben
wird, um die Vorstellung schlechter Darmabsorption zu unterstreichen
und den Entdecker der Krankheit zu ehren [Relman D. et al. (1992)
N. Engl. J. Med. 327:293]. Das direkte Sequenzieren von 721 Basen
eines Fragmentes, amplifiziert aus einer Dünndarmbiopsie eines Patienten
[Wilson KH et al. (1991) Lancet 338:474] und dann aus einem Ganglion
eines anderen Patienten [Wilson KH et al. (1992) ASM Neves 58:318]
bestätigt
die Originalität
der Bakterienspezies, die der Whipple-Krankheit zugeordnet ist. Die Sequenzierung
durch Relman et al. (oben zitiert) von 1321 Basen, die 90% des 16S-rRNA-Gens
darstellen, auf einer Probe und eines Fragmentes von 284 Basen bei
vier anderen Patienten hat es erlaubt, zu bestätigen, daß die Bakterienspezies, die
der Whipple-Krankheit zugeordnet ist, eine neue Spezies darstellte,
und ihre taxonomische Position im Stamm der Actinomyceten zu präzisieren,
das heißt
der Bakterien mit Gram-positiver Struktur mit hohem Gehalt an Guanosin
plus Cytosin, die einen neuen Zweig darstellen, der relativ nahe an
zwei bei humaner Pathologie bekannten Spezies ist, Actinomyces pyogenes
und Rothis dentocariosa.
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Das
Gen rpoB codiert eine der Untereinheiten der bakteriellen RNA-Polymerase
und bildet einen genetischen Marker, der die spezifische Detektion
der Bakterienspezies Tropheryma whippelii erlaubt.
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Gemäß Lazcano
et al. [J. Mol. Evol. (1988) 27:365-376] sind die RNA-Polymerasen
in zwei Gruppen gemäß deren
Ursprung unterteilt, die eine gebildet durch die viralen RNA-Polymerasen,
die RNA- oder DNA-abhängig
sind, und die andere, bestehend aus den DNA-abhängigen RNA-Polymerasen von
eucaryotischem oder procaryotischem Ursprung (Archaebakterien und
Eubakterien). Die DNA-abhängigen
eubakteriellen RNA-Polymerasen sind gekennzeichnet durch eine einfache
und konservierte Multimerkonstitution, genannt "core enzyme", dargestellt durch aββ', oder "holoenzyme", dargestellt durch
aββ'σ [Yura and Ishiama, Ann. Rev.
Genet. (1979) 13:59-97]. Zahlreiche Arbeiten haben die funktionelle
Rolle in dem Multimerenzymkomplex von der Untereinheit β von eubakterieller
RNA-Polymerase gezeigt. Diese archaebakteriellen und eucaryotischen
RNA-Polymerasen zeigen andererseits eine komplexere Struktur, welche
etwa 10, sogar etwa 30 Untereinheiten erreichen kann [Pühlet et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:4569-4573].
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Die
Gene, die verschiedene Untereinheiten aββ'σ von
DNA-abhängiger
RNA-Polymerase bei
den Eubakterien kodieren, bzw. die Gene rpoA, rpoB, rpoC und rpoD
sind in verschiedene Gruppen klassifiziert, die Gene umfassen, welche
für konstitutive
Proteine der Ribosomuntereinheiten kodieren oder für Enzyme,
die bei der Replikation und Reparatur des Genoms involviert sind
[Yura and Yshihma, Ann. Rev. Genet. (1979) 13:59-97]. Bestimmte
Autoren haben gezeigt, daß die
Sequenzen der Gene rpoB und rpoC verwendet werden konnten, um phylogenetische
Stammbäume
zu konstruieren [Rowland et al. Biochem. Soc. Trans. (1992) 21:40S],
welche es erlauben, die verschiedenen Verzweigungen und Unterverzweigungen
in den Reichen der Lebewesen zu trennen.
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Die
Diagnostik der Krankheit wird derzeit durch Beobachtung nach Anfärbung von
mikroskopischen Abstrichen gemacht, erhalten durch Biopsie oder
durch Amplifikation und Sequenzieren des universellen Genwerkzeugs
16S rRNA (Relman et al., oben zitiert).
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Dennoch
ist das 16S-Gen ein Gen, das mittelmäßig zur Identifizierung von
Bakterien diskriminiert. Außerdem
ist es notwendig, über
mehrere molekulare Zielscheiben zur Identifizierung der Bakterien
zu verfügen, insbesondere
um molekulare Kontaminationsprobleme zu überwinden.
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Im übrigen ist
dieses Bakterium zum ersten Mal isoliert und kultiviert worden in
Zellsystemen im Labor der Erfinder [Raoult D. et al. (2000) N. Engl.
J. Med. 342:620 und
WO 00/58440 ]
aus der Herzklappe, die bei einem Patienten entnommen ist, der eine
Endokarditis mit negativer Blutkultur zeigte (Twist-Stamm).
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Die
Erfinder haben bereits in
WO-A-00/58440 ein
Fragment von 612 Basen des Gens rpoB des Bakteriums Tropheryma whippelii
beschrieben, das der SEQ ID Nr. 3 entspricht, aus der sie zwei spezifische
Nukleotidsequenzen des Gens rpoB von Tropheryma whippelii als spezifische
Amplifikationsprimer und Sonden zur spezifischen Detektion der Spezies
Tropheryma whippelii bestimmt haben.
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Die
in
WO-A-00/58440 beschriebenen
Techniken erlaubten es dennoch nicht, die vollständige Sequenz des Gens rpoB
von Tropheryma whippelii zu erhalten.
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Ein
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, zusätzliche Fragmente des Gens
rpoB zu liefern, insbesondere die vollständige Sequenz des Gens rpoB
von Tropheryma whippelii, um insbesondere neue spezifische Sequenzen
des Gens rpoB von Tropheryma whippelii zu liefern; insbesondere
weiter Sequenzen, die eine größere Spezifität zur Detektion
als die Sequenzen aufweisen, die aus den SEQ ID Nr. 3 Sequenzen
gezogen sind und die beschrieben sind in
WO-A-00/58440 .
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Mehrere
Versuche, die Sequenz SEQ ID Nr. 3 mit Consensusprimern aus rpoB-Gen
von anderen Bakterien und spezifischen Primern zu verlängern, die
durch die Erfinder entwickelt sind (SEQ ID Nr. 13, 15 und 17) haben
es erlaubt, die Sequenz bis zum Erhalt der Sequenz SEQ ID Nr. 4
von 2750 bp hiernach zu verlängern,
aber haben es anschließend
nicht erlaubt, die vollständige
Sequenz des Gens zu erhalten. Die Erfinder haben eine Reihe von
spezifischen Primern entwickelt, um die so genannte "Genomwanderungs"-Technik auszuführen ("Genome Walker", beschrieben in
Siebert et al Nucleic Acids Research 23:1087-1088, 1995) aus der
Bestimmung einer Reihe von spezifischen Amplifikationsprimern, nämlich Amplifikationsprimer,
die hiernach als SEQ ID Nr. 5 bis 8 identifiziert sind. Diese verschiedenen
Amplifikationsprimer haben es Schritt für Schritt erlaubt, immer längere Fragmente
aus SEQ ID Nr. 4 zu erhalten, bis zum Erhalt der vollständigen Sequenz
SEQ ID Nr. 9.
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Die
vorliegende Erfindung hat daher die vollständige Sequenz des Gens rpoB
des Bakteriums Tropheryma whippelii zum Gegenstand, bestehend aus
der Sequenz SEQ ID Nr. 9. Die vollständige Sequenz des Gens rpoB
ist bestimmt worden durch Kombination zweier Techniken, der enzymatischen
Amplifikation und der automatischen direkten Sequenzierung mit Consensusprimern,
unter einer großen
Anzahl anderer Bakterien einer Gattung und von unterschiedlichen
Spezies einerseits und durch automatisches direktes Sequenzieren aus
Amplifikationsprodukten, die nach Anwendung der Genome Walker-Technik
(Wandern auf dem Genom) mit DNA erhalten sind, die aus dem ersten
Twist-Stamm von Tropheryma whippelii andererseits extrahiert ist. Diese
letztere Technik besteht darin, entlang des Gens von einem ersten
bekannten Fragment aus zu wandern unter Ausführen einer partiellen Chromosomen-DNA-Bank des untersuchten
Bakteriums. Diese Technik, die später beschrieben werden wird,
erfordert daher eine Bakterienchromosomen-DNA-Menge, die nur nach
Extraktion der DNA aus einer reinen Bakterienkultur erhalten wird
und sie nimmt daher die Verfügbarkeit
eines Isolats in Kultur an. Es sind diese Verfügbarkeit dieses Isolats und
die Bestimmung der verschiedenen Amplifikationsprimer SEQ ID Nr.
5 bis 8 aus SEQ ID Nr. 4, die die Amplifikation mit Erfolg von der
Genwanderungstechnik für
die Bestimmung der vollständigen
Sequenz des Gens rpoB bei dem Twist-Stamm des Bakteriums Tropheryma
whippelii erlaubt haben.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft daher auch Nukleinsäuresequenzen
der Spezies Tropheryma whippelii, deren Nukleotidsequenz in der
SEQ ID Nr. 9 des Gens rpoB des oben anvisierten Bakteriums umfaßt ist und
nicht vollständig
in der SEQ ID Nr. 3 umfaßt
ist, oder eine zu dieser Nukleotidsequenz komplementäre Sequenz.
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Aus
der vollständigen
Sequenz SEQ ID Nr. 9 haben die Erfinder daher eine Sequenz SEQ ID
Nr. 10 mit größerer Spezifität gegenüber dem
Gen rpoB von Tropheryma whippelli außerhalb des Bereichs bestimmt, der
der SEQ ID Nr. 3 entspricht, aus welcher man zwei spezielle spezifische
Sequenzen bestimmen konnte, welche ein Fragment von etwa 500 Basenpaaren
einrahmen, nämlich
die Sequenzen SEQ ID Nr. 11 und 12, die eine optimale Zuverlässigkeit
für die
spezifische Detektion des Bakteriums Tropheryma whippelii durch
Amplifikation und Sequenzierung des Amplifikationsprodukts oder
durch Hybridisierung als Detektionssonde verleihen.
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Ein
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein einzelsträngiges Oligonukleotid,
gewählt
unter den Oligonukleotiden mit einer Sequenz von wenigstens 10 aufeinanderfolgenden
Nukleotidmotiven, eingeschlossen in einer Sequenz, die gewählt ist
unter:
- – der
Sequenz SEQ ID Nr. 9 und welche nicht vollständig in der Sequenz SEQ ID
Nr. 3 umfaßt
ist und vorzugsweise in SEQ ID Nr. 3 umfaßt ist, und
- – vorzugsweise
eine der Sequenzen SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12
und
- – komplementären Sequenzen
dieser Oligonukleotide.
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Ein
spezieller bevorzugtes Oligonukleotid hat eine Sequenz, gewählt unter
den vollständigen
Sequenzen SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12 und deren komplementären Sequenzen.
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Die
vorliegende Erfindung hat auch ein Oligonukleotid als Gegenstand,
das eine Sequenz aufweist, gewählt
unter:
- – den
Sequenzen von wenigstens 10 aufeinanderfolgenden Oligonukleotiden
in einer Sequenz, die gewählt ist
durch die Sequenzen SEQ ID Nr. 5 bis 8 und SEQ ID Nr. 17 und deren
komplementären
Sequenzen, und
- – vorzugsweise
den vollständigen
Sequenzen SEQ ID Nr. 5 bis 8 und SEQ ID Nr. 17 und deren komplementären Sequenzen.
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Die
Oligonukleotide gemäß der vorliegenden
Erfindung verfügen
insbesondere über
wenigstens 10 Nukleotidmotive, wie oben beschrieben und höchstens
100, vorzugsweise höchstens
50 Motive. Insbesondere verfügt
ein Oligonukleotid gemäß der vorliegenden
Erfindung vorzugsweise über
12 bis 35 Motive, weiter vorzugsweise 18 bis 22 Motive.
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Die
Nukleotidsequenzen gemäß der Erfindung
können
hergestellt werden durch chemische Synthese unter Verwendung der
Techniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind und zum Beispiel beschrieben
in dem Artikel von Itakura K. et al. [(1984) Annu. Rev. Biochem.
53:323].
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Eine
erste Anwendung eines Oligonukleotides gemäß der Erfindung ist seine Verwendung
als Sonde einer Spezies zur Detektion in einer Probe von Bakterien
der Spezies Tropheryma whippelii. Im folgenden der Beschreibung
wird eine solche Sonde der Erfindung Sonde einer Spezies genannt.
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Vorzugsweise
besteht eine Sonde der Erfindung aus einem Oligonukleotid, gewählt unter:
- – Oligonukleotiden
mit einer Nukleotidsequenz von wenigstens 10 aufeinanderfolgenden
Nukleotiden, eingeschlossen in einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 10,
SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12 und deren komplementären Sequenzen,
und
- – den
Oligonukleotiden mit einer Nukleotidsequenz, gewählt unter den vollständigen Sequenzen
SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12 und deren komplementären Sequenzen.
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Die
Sonden gemäß der Erfindung
können
verwendet werden zu diagnostischen Zwecken bei der Suche nach der
Gegenwart oder Abwesenheit einer Zielnukleinsäure in einer Probe gemäß bekannten
Hybridisierungstechniken und insbesondere den Punktabscheidungstechniken
auf einem Filter, genannt "DOT-BLOT" [Maniatis et al.
(1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor], den Techniken zur Überführung von
DNA, genannt "SOUTHERN
BLOT" [Southern
E.M., J. Mol. Biol. (1975) 98:503], den Techniken zur Überführung von RNA,
genannt "NORTHERN
BLOT" oder "Sandwich" genannte Techniken
mit einer Sonde zum Erfassen und/oder einer Sonde zur Detektion,
wobei die Sonden in der Lage sind, mit zwei unterschiedlichen Regionen einer
Zielnukleinsäure
zu hybridisieren und wenigstens eine dieser Sonden (im allgemeinen
die Detektionssonde) in der Lage ist, mit einem Zielbereich zu hybridisieren,
der spezifisch für
die Spezies ist, wobei die Sonde zum Erfassen und die Sonde zur
Detektion wohlgemerkt Nukleotidsequenzen haben müssen, die wenigstens teilweise
verschieden sind.
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Die
zu detektierende Nukleinsäure
(Zielscheibe) kann nach einer klassischen Amplifikation erhalten werden,
das heißt
welche DNA ergibt, erhalten nach Amplifikation durch PCR oder RNA,
erhalten nach einer transkriptionellen Amplifikation durch TAM,
NASBA, 3SR, usw ... Im Fall der Detektion eines Ziels vom Typ doppelsträngige Nukleinsäure gebührt es,
die Denaturierung dieser letzteren vor Einsatz des Detektionsverfahrens
vorzunehmen. Die Zielnukleinsäure
kann erhalten werden durch Extraktion gemäß bekannten Verfahren der Nukleinsäuren von
einer zu untersuchenden Probe. Die Denaturierung einer doppelsträngigen Nukleinsäure kann
durchgeführt
werden durch Verfahren, die bekannt sind zur chemischen, physischen
oder enzymatischen Denaturierung und insbesondere durch Heizen bei
einer geeigneten Temperatur über
80°C.
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Um
die vorgenannten Hybridisierungstechniken einzusetzen und insbesondere "Sandwich"-Techniken, wird
eine Sonde der Erfindung, genannt Sonde zum Erfassen, immobilisiert
auf einem festen Träger
und eine andere Sonde der Erfindung, genannt Sonde zur Detektion,
wird markiert mit einem Markerreagenz. Die Beispiele eines Trägers und
eines Markerreagenzes sind wie oben definiert.
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Ein
anderer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung
der Gegenwart oder Abwesenheit eines Bakteriums Tropheryma whippelii
in einer Probe, die Nukleinsäuren
wenigstens eines solchen Bakteriums enthält oder geeignet ist zu enthalten,
umfassend Schritte, die darin bestehen, die Probe mit wenigstens
einer Sonde einer Spezies der Erfindung zu kontaktieren und dann
in an sich bekannter Weise die Bildung oder Abwesenheit einer Bildung
eines Hybridisierungskomplexes unter der Sonde und der Nukleinsäure der
Probe zu bestimmen.
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Beispiele
zur Detektion der Bildung oder der Abwesenheit einer Bildung eines
Hybridisierungskomplexes unter einer Sonde und der Nukleinsäure umfassen
die Techniken "DOT-BLOT", "SOUTHERN BLOT" und "Sandwich".
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Gemäß der speziellen
Ausführung
dieses Verfahrens zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit
einer Tropheryma whippelii-Spezies, verwendet man mehrere Speziessonden
der Erfindung, wobei wohl verstanden ist, daß diese Sonden in der Lage
sind, mit nicht überlappenden
Bereichen einer Nukleinsäure
zu hybridisieren, die dem Gen rpoB von Tropheryma whippelii entsprechen.
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Vorteilhafterweise
wird eine Sonde immobilisiert auf einem festen Träger und
eine andere Sonde wird markiert durch ein Markerreagenz, genannt
Detektionssonde, welche nicht notwendigerweise eine Speziessonde
ist.
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Eine
andere Anwendung eines Nukleotids der Erfindung ist seine Verwendung
als Nukleotidprimer, verwendbar bei der Synthese einer Nukleinsäure von
Tropheryma whippelii in Gegenwart einer Polymerase durch ein an
sich bekanntes Verfahren, insbesondere unter den Amplifizierungsmethoden,
die eine solche Synthese verwenden in Gegenwart einer Polymerase
(PCR, RT-PCR, usw ...). Ein Primer der Erfindung kann insbesondere
verwendet werden zur inversen spezifischen Transkription einer Messenger-RNA-Sequenz
von Tropheryma whippelii, um eine entsprechende komplementäre DNA-Sequenz
zu erhalten. Eine solche inverse Transkription kann das erste Stadium
der RT-PCR-Technik bilden, wobei das folgende Stadium die Amplifikation
durch PCR von erhaltener komplementärer DNA ist. Man kann auch
Primer der Erfindung verwenden zur spezifischen Amplifikation durch
Polymerisationskettenreaktion der vollständigen DNA-Sequenz des Gens rpoB
von Tropheryma whippelii.
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Gemäß einem
besonderen Fall umfaßt
der Primer, der ein Oligonukleotid der Erfindung umfaßt, außerdem eine
sense- oder antisense-Sequenz eines Promotors, der durch RNA-Polymerase
erkannt wird (Promotoren T7, T3, SP6 zum Beispiel) [Studier FW,
BA Moffatt (1986) J. Mol. Biol. 189:113]: solche Primer sind verwendbar
in Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäure, welche einen Transkriptionsschritt
eingreifen lassen, zum Beispiel die Techniken NASBA oder 3SR [Van
Gemen B. et al. Abstract MA 1091, 7th International Conference an
AIDS (1991) Florence, Italy].
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Ein
Gegenstand der Erfindung ist spezieller ein Nukleotidprimer, der
verwendbar ist zum vollständigen oder
teilweisen Sequenzieren des Gens rpoB von irgendeinem Stamm von
Tropheryma whippelii, vorzugsweise eine spezifische Sequenz des
Gens rpoB von Tropheryma whippelii. Der Nukleotidprimer ist insbesondere verwendbar
zum Sequenzieren einer amplifizierten Nukleinsäure. Das Sequenzieren ist der
Erhalt der vollständigen
oder teilweisen Sequenz des Gens rpoB durch ein an sich bekanntes
Verfahren, abbrechende Polymerisation unter Verwendung der Didesoxynukleotide
[Sanger F., Coulson AR (1975) J. Mol. Biol. 94:441] oder mehrfache
Hybridisierungen unter Verwendung der DNA-Chips.
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Bei
einer Verwendung als Primer durch Sequenzieren einer spezifischen
Sequenz des Gens rpoB von Tropheryma whippelii verwendet man vorzugsweise
ein Oligonukleotid, das besteht aus:
- – Oligonukleotiden
mit einer Nukleotidsequenz von wenigstens 10 aufeinanderfolgenden
Nukleotiden, eingeschlossen in einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 10,
SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12 und deren komplementären Sequenzen,
und
- – Oligonukleotiden
mit einer Nukleotidsequenz, die gewählt ist unter den vollständigen Sequenzen
SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12 und deren komplementären Sequenzen.
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Die
vorliegende Erfindung liefert daher auch ein Verfahren zur Bestimmung
der Gegenwart oder Abwesenheit eines Bakteriums Tropheryma whippelii
in einer Probe, die Nukleinsäuren
wenigstens eines solchen Bakteriums enthält oder geeignet ist zu enthalten,
dadurch gekennzeichnet, daß man
eine DNA-Amplifikation der Probe mit Hilfe von zwei Primern gemäß der Erfindung
ausführt
und man die erhaltene Sequenz mit der SEQ ID Nr. 9 vergleicht.
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Insbesondere
vergleicht man die Sequenz des erhaltenen Amplifikationsproduktes
unter vorherigem Ausführen
seiner Sequenzierung.
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Vorzugsweise
führt man
eine Amplifikation von DNA der Probe mit Hilfe von zwei Primern,
SEQ ID Nr. 11 und 12 aus und man vergleicht die erhaltene Sequenz
mit der SEQ ID Nr. 10.
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Die
Erfindung wird besser mit Hilfe der nachfolgenden Beschreibung verstanden
werden, aufgeteilt in zwei Beispiele, die Experimente betreffen,
die durchgeführt
sind mit dem Ziel, die Erfindung auszuführen und welche rein zur Veranschaulichung
und Erklärung
angegeben sind.
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Die 1 stellt
eine der Positionen der spezifischen und consensuellen Primer dar,
die zur Bestimmung der aufeinanderfolgenden Fragmente des vollständigen Gens
rpoB der Bakterienspezies Tropheryma whippelii verwendet werden.
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Die 2 stellt
die Visualisierung der Amplifikationsprodukte dar, die erhalten
sind mit Hilfe der Primer SEQ ID Nr. 11 und 12, visualisiert durch
Ethidiumbromidanfärbung
nach Elektrophorese auf einem Agarosegel des Beispiels 2.
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Verschiedene
in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendete Ausdrücke sind
wie folgt definiert:
- – unter "Nukleinsäure extrahiert aus Bakterien" versteht man entweder
die vollständige
Nukleinsäure
oder die genomische DNA oder Messenger-RNA oder auch DNA erhalten
aus der inversen Transkription der Messenger-RNA oder auch die ribosomalen
RNA;
- – ein "Nukleotidfragment" oder ein "Oligonukleotid" sind zwei synonyme
Ausdrücke,
die eine Verkettung von Nukleotidmotiven bezeichnen, gekennzeichnet
durch eine Informationssequenz der natürlichen (oder gegebenenfalls
modifizierten) Nukleinsäuren
und geeignet, zu hybridisieren, wie natürliche Nukleinsäuren, mit einem
komplementären
oder im wesentlichen komplementären
Nukleotidfragment unter vorbestimmten strikten Stringenzbedingungen.
Die Aneinanderkettung kann Nukleotidmotive mit unterschiedlicher
Struktur von jenen der natürlichen
Nukleinsäuren
enthalten. Ein Nukleotidfragment (oder Oligonukleotid) kann zum Beispiel
bis zu 100 Nukleotidmotive enthalten. Es enthält im allgemeinen wenigstens
10 und insbesondere wenigstens 12 Nukleotidmotive und kann erhalten
werden aus einem natürlichen
Nukleinsäuremolekül und/oder
durch genetische Rekombination und/oder durch chemische Synthese;
- – ein
Nukleotidmotiv ist ein Derivat eines Monomers, das ein natürliches
Nukleotid einer Nukleinsäure
sein kann, dessen konstitutive Elemente ein Zucker, eine Phosphatgruppe
und eine stickstoffhaltige Base sind, gewählt unter Adenin, Guanin, Uracil,
Cytosin, Thymin; oder auch das Monomer eines modifizierten Nukleotids,
bei dem wenigstens eines der drei obigen konstitutiven Elemente
modifiziert ist; zum Beispiel kann die Modifikation entweder auf
der Ebene der Basen mit modifizierten Basen wirken, wie Inosin,
5-Methyldesoxycytidin, Desoxyuridin, 5-Dimethylaminodesoxyuridin oder jede
andere modifizierte Base, die zur Hybridisierung in der Lage ist,
oder auf der Ebene des Zuckers, zum Beispiel die Ersetzung von wenigstens einer
Desoxyribose durch ein Polyamid [Nielsen PE et al., Science (1991) 254:1497-1500]
oder auch auf der Ebene der Phosphatgruppe, zum Beispiel durch Ersetzung
der Ester, gewählt
insbesondere unter den Diphosphaten, den Alkylphosphonaten und den
Phosphorthioaten;
- – unter "Hybridisierung" versteht man das
Verfahren, im Laufe von welchem unter geeigneten Bedingungen zwei
Nukleotidfragmente mit ausreichend komplementären Sequenzen in der Lage sind,
sich durch stabile und spezifische Wasserstoffbrückenbindungen zu verbinden,
um einen Doppelstrang zu bilden. Die Hybridisierungsbedingungen
werden bestimmt durch die "Stringenz", das heißt die Strenge
der Arbeitsbedingungen. Die Hybridisierung ist umso spezifischer,
je stärker
die Stringenz durchgeführt
ist. Die Stringenz ist insbesondere abhängig von der Zusammensetzung
an Basen einem Doppel Sonde/Ziel, sowie vom Mispaarungsgrad unter
den beiden Nukleinsäuren.
Die Stringenz kann auch abhängig
sein von den Hybridisierungsreaktionsparametern wie der Konzentration
und der Art von ionischen Spezies, die in der Hybridisierungslösung vorliegen,
der Art und Konzentration von Denaturiermitteln und/oder der Hybridisierungstemperatur.
Die Stringenz der Bedingungen, unter welchen die Hybridisierungsreaktion
durchgeführt
werden muß,
hängt insbesondere
von den verwendeten Sonden ab. Alle diese Angaben sind wohlbekannt
und die geeigneten Bedingungen können
gegebenenfalls in jedem Fall durch Routineexperimente bestimmt werden.
Gemäß der Länge der
verwendeten Sonden liegt die Temperatur für die Hybridisierungsreaktion
im allgemeinen zwischen etwa 20 und 65°C, insbesondere zwischen 35
und 65°C
in einer Salzlösung
bei einer Konzentration von etwa 0,8 bis 1 M,
- – eine "Sonde" ist ein Nukleotidfragment,
das zum Beispiel 10 bis 100 Nukleotidmotive enthält, insbesondere 12 bis 35
Nukleotidmotive, die eine Hybridisierungsspezifität unter
Bedingungen aufweisen, welche bestimmt sind, um einen Hybridisierungskomplex
mit einer Nukleinsäure
auszubilden mit im vorliegenden Fall einer Nukleotidsequenz, die
umfaßt
ist entweder in einer Messenger-RNA oder in einer DNA, erhalten durch
inverse Transkription der Messenger-RNA, Transkriptionsprodukt;
eine Sonde kann verwendet werden zu Diagnosezwecken (insbesondere
Sonden zum Erfassen oder zur Detektion) oder zu Therapiezwecken,
- – eine "Sonde zum Erfassen" wird immobilisiert
oder immobilisierbar auf einem festen Träger durch jedes geeignete Mittel,
zum Beispiel durch Kovalenz, durch Adsorption oder durch direkte
Synthese auf einem Festkörper.
Beispiele von Trägern
umfassen Mikrotiterplatten und DNA-Chips oder spezielle Magnete,
wie beschrieben in WO-A-99/35500 ,
- – eine "Sonde zur Detektion" kann markiert sein
mit einem Markerreagenz, gewählt
zum Beispiel unter den radioaktiven Isotopen, den Enzymen, insbesondere
den Enzymen, die in der Lage sind, auf ein chromogenes, fluorigenes
oder lumineszentes Substrat zu wirken (insbesondere eine Peroxidase
oder eine alkalische Phosphatase), den chemischen Chromophorverbindungen,
den chromogenen, fluorigenen oder lumineszenten Verbindungen, den
Analoga der Nukleotidbasen und den Liganden wie Biotin,
- – eine "Speziessonde" ist eine Sonde,
die die Identifizierung der Spezies eines Bakteriums erlaubt,
- – ein "Primer" ist eine Sequenz,
die zum Beispiel 10 bis 100 Nukleotidmotive aufweist und eine Hybridisierungsspezifität unter
Bedingungen aufweist, die festgelegt sind zum Start einer enzymatischen
Polymerisation, zum Beispiel in einer Amplifizierungstechnik wie
der PCR, in einem Sequenzierverfahren, in einem Transkriptionsverfahren,
usw.
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BEISPIEL 1: Vollständige Sequenz des Gens rpoB
von Tropheryma whippelii
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Die
vollständige
Sequenz des Gens rpoB von Tropheryma whippelii ist bestimmt worden
durch aufeinanderfolgende Kombination von zwei Techniken, der enzymatischen
Amplifikation und automatische direkte Sequenzierung unter Verwendung
von Consensusprimern, zuerst und dann dem Wandern auf dem Gen durch die
Technik des "Genome
Walker", später.
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1 – Enzymatische
Amplifikation, verbunden mit automatischer Sequenzierung
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Die
Consensusprimer, die den Erhalt eines ersten Fragments der Sequenz
Tropheryma whippelii rpoB erlaubt haben, sind bestimmt worden aus
dem Vergleich der Sequenzen rpoB von Bacillus subtilis, Bartonella henselae,
Borrelia burgdorferi, Buchnera aphidicola, Chlamydia pneumoniae,
Chlamydia trachomatis, Coxiella bumetii, Escherichia coli, Haemophilus
influenzae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Mycobacterium
leprae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma
gallisepticum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria
meningitidis, Pseudomonas putida, Rickettsia prowazekii, Rickettsia
typhi, Salmonella enterica Typhimurium, Spiroplasma citri, Staphylococcus
aureus, Synechocystis spp., Thermotoga maritima, Treponema pallidum,
und menschlichem granulocytischem Ehrlichreagenz. Diese Sequenzen
sind ausgewählt
worden durch eine Ausrichtung der DNA-Sequenzen des rpoB-Gens dieser
verschiedenen anderen Bakterien und unter Selektion von jenen, die
die konserviertesten waren mit der Annahme, daß sie auch in dem Gen rpoB
von Tropheryma whippelii vorliegen. Die verwendeten Primer hatten
als Sequenz: SEQ ID Nr. 1 = 5'-TIA
TGG GII CIA AIA TGC A-3' (Position
1967-1985) SEQ ID Nr. 2 = 5'-GCC
CAI CAT TCC ATI TCI CC-3' (Position
3198-3217, rückwärts), in
denen I Inosin darstellt.
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Die
Nummerierung der oben genannten und nachfolgenden Positionen entspricht
den Positionen auf der vollständigen
Sequenz SEQ ID Nr. 9.
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Die
Primer haben die Amplifikation und dann die Sequenzierung eines
Fragments von 1400 Basenpaaren zugelassen, von dem 612 Basenpaare
sequenziert worden sind mit Hilfe der Primer SEQ ID Nr. 1 und SEQ
ID Nr. 2 und welches der Sequenz SEQ ID Nr. 3 (Positionen 2063-2673)
entspricht, deren Sequenz ist:
-
Die
Sequenzierung dieses ersten Fragments F1 hat es erlaubt, spezifische
Amplifikationsprimer zu bestimmen, die, kombiniert in PCR-Amplifizierungsreaktionen
mit degenerierten Consensusprimern, es erlaubt haben, die Sequenz
SEQ ID Nr. 3 über
die 3'- und 5'-Enden zu verlängern und
es erlaubt haben, drei andere überlappende
Fragmente F2, F3 und F4 über
eine Gesamtlänge
von 2750 Basenpaaren zu erhalten, die der SEQ ID Nr. 4 entspricht.
Die Position der Primer und der Fragmente wird angezeigt in der
Figur Nr. 1. Das Fragment F3 (Positionen 1248 bis 2163) ist erhalten
worden durch Anwenden der Primer SEQ ID Nr. 13 (spezifischer Primer;
Positionen 2145 bis 2163): 5'-CGG
AAA CAT CCC CCA CAA T-3' und
SEQ ID Nr. 14 (Consensusprimer; Positionen 1248 bis 1264): 5'-ACC GAC GAT ATC
GAC CA-3'; das Fragment
F2 (Positionen 2592 bis 3229) ist erhalten worden durch Anwenden
der Primer SEQ ID Nr. 15 (spezifischer Primer; Positionen 2592 bis
2610): 5'-TTG GTA
AGG TGA CCC CAA A-3' und
SEQ ID Nr. 16 (Consensusprimer; Positionen 3213 bis 3229): 5'-GGT AAA GCG CAG
TTC GG-3'; das Fragment
F4 (Positionen 484 bis 1331) ist erhalten worden durch Anwenden
der Primer SEQ ID Nr. 17 (spezifischer Primer; Positionen 1315 bis
1331): 5'-CCA GCC
CGG AGC TGG TT-3' und
SEQ ID Nr. 18 (Consensusprimer; Positionen 484 bis 498): 5'-TTT CAT TTG CCA
AGC-3'.
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Die
folgenden Versuche, um diese Sequenz durch die Technik der Consensusprimer
zu verlängern, sind
anschließend
fehlgeschlagen, wobei sie es nicht ermöglichen, die Sequenzierung
des Gens gemäß diesem
Ansatz fortzusetzen. Insbesondere die folgenden Consensusprimer,
gewählt
unter den konserviertesten Sequenzen der Gene rpoB von anderen Bakterien,
die phylogenetisch nahe sind zu Tropheryma whippelii: Mycobacterium
smegmatis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus
licheniformis, Salmonella enterica Typhimurium, sind getestet worden
ohne Erfolg: Balich7f: 5'-GGT
AAA GCG CAG TTC GG-3' (SEQ
ID Nr. 19); Balich 460f: 5'-GTC
ATT CCA AAC CGT GG-3' (SEQ
ID Nr. 20); Balich37f: 5'-CTA
TGC ACG CAT TAG CGA-3' (SEQ
ID Nr. 21); Myco12F: 5'-GAA
CCG CTT GAG GTT C-3' (SEQ
ID Nr. 22); Myco43F 5'-ACC
TTC ATC ATC AAC GG-3' (SEQ
ID Nr. 23); Myco8R: 5'-GAT
TCG TTG CGG GAC A-3' (SEQ
ID Nr. 24).
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2 – Wanderung
auf dem Gen durch die Technik des "Genome Walker"
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Dieses
unerwartet auftretende Scheitern bei dem Stamm von Tropheryma whippelii
in Kultur erklärt, daß es unmöglich gewesen
ist, erst recht die Gesamtheit der Sequenz des Gens rpoB von Tropheryma
whippelii aus klinischen Entnahmen zu erhalten, die das Bakterium
Tropheryma whippelii enthalten. Eine zweite Technik, genannt "Wanderung auf dem
Genom", ist anschließend angewandt
worden, um die Sequenz Tropheryma whippelii rpoB in 3'-Richtung und in
5'-Richtung zu vervollständigen.
Diese Technik ist beschrieben worden [(1995) Siebert et al. Nucl.
Acids Res. 23:1087-1088] und besteht darin, eine Genom-DNA-Bank
des Bakteriums auszuführen
und dann Fragmente dieser Bank mit Hilfe von universellen Primern
zu amplifizieren, die von der gewünschten Sequenz unabhängig sind
und mit spezifischen Primern der gewünschten Sequenz. Nachdem eine
große
DNA-Menge extrahiert worden ist (in der Größenordnung von Mikrogramm),
gereinigt aus dem Bakterienstamm Tropheryma whippelii Twist, beschrieben
in
WO 00/58440 , ist
die Bakterien-DNA fragmentiert worden durch enzymatischen Verdau
mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen und die so erhaltenen Fragmente
sind mit einem ihrer zwei Enden an synthetische Oligonukleotide
gebunden worden, genannt Adaptoren, die geliefert werden in einem
kommerziellen Kit (Genome Walker kit
®, Clontech
Laborstories, Palo Alto, Kalifornien). Komplementäre Oligonukleotide
der Adaptoren, auch geliefert in demselben Laborkit, bilden dann
Amplifikationsprimer für
die enzymatische Kettenamplifikationstechnik ("polymerase chain reaction", PCR). Diese Oligonukleotide
bilden daher universelle Primer, die in dieser Technik unabhängig von
der untersuchten Bakterien-DNA-Sequenz verwendet werden. Um die
PCR-Reaktionen auszuführen,
mull ein zweites Oligonukleotid als Amplifikationsprimer in den
PCR-Reaktionen eingefügt werden.
Dieser Oligonukleotidprimer mull mehreren Kriterien entsprechen
und die Bestimmung seiner Sequenz bildet daher einen Aspekt der
Erfindung: (1) Die Sequenz dieses Oligonukleotids ist komplementär zur SEQ
ID Nr. 4; (2) dieses Oligonukleotid ist angeordnet bei etwa 50 Basen
des Endes von SEQ ID Nr. 4; (3) dieses Oligonukleotid hat eine Länge von
mehr als 20 Basen. Die Verwendung eines Oligonukleotids, das diese
Merkmale aufweist, entsprechend der Sequenz SEQ ID Nr. 5 = 5'-CTT ATC TCG CCC
GTA TCA TG-3' (Position
627-646, invers) hat es so erlaubt, ein Fragment F6 (Positionen
146 bis 646) von 500 Basenpaaren zu erhalten. Auf der so erhaltenen
Sequenz hat die Verwendung eines zweiten spezifischen Oligonukleotids,
entsprechend der SEQ ID Nr. 6: = 5'-CCA GTC AAA ACT ATC GAG CTG CAA A-3' (Position 307 bis
331, invers), die Amplifikation eines Fragments F8 von 1100 Basenpaaren
erlaubt, enthaltend das 3'-Ende
des Gens rpoB (Positionen 1 bis 331) und welches sich stromabwärts dieses
Endes erstreckt. Auf der Basis der Sequenz SEQ ID Nr. 4 hat man
im übrigen
die Sequenz SEQ ID Nr. 4 in der 5'-Richtung durch Verwendung eines Oligonukleotids
SEQ ID Nr. 7 verlängert: 5'-TTC TCT ATG ATG
GCC GCA C-3' (Position
3168 bis 3187) eines Fragments F5 (Positionen 3168 bis 3668) von
500 Basenpaaren. Auf Basis dieses letzten Fragmentes ist schließlich ein
spezifisches Oligonukleotid bestimmt worden mit Sequenz SEQ ID Nr.
8: 5'-GCA GCG CTT
CGG AGA GAT GGA G-3' (Position
3357 bis 3379), welche es erlaubt hat, ein Fragment F7 von 1500
Basenpaaren zu erhalten, das das 5'-Ende des Gens rpoB (Positionen 3357
bis 3657) enthält
und sich über
dieses Ende hinweg erstreckt. Diese Wanderungstechnik auf dem Genom
setzt den Erhalt einer großen
Menge von Chromosomen-DNA von Tropheryma whippelii voraus und ihre
Anwendung ist möglich
gemacht worden durch den Erhalt des Stammes Twist des Bakteriums Tropheryma
whippelii und die Extraktion einer großen Menge von DNA aus diesem
Stamm. Der Erhalt eines Stammes, der isoliert und kultiviert ist
von Tropheryma whippelii war notwendig für die Bestimmung der vollständigen Sequenz
von rpoB bei dem Bakterium Tropheryma whippelii.
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Die
Amplifikation der Genombank mit Hilfe der Oligonukleotide SEQ ID
Nr. 5 bis SEQ ID Nr. 8 hat es erlaubt, in den 3'- und 5'-Richtungen die Sequenz SEQ ID Nr. 4
zu verlängern,
um die vollständige
Sequenz des Gens rpoB von Tropheryma whippelii Twist- Stamm zu erhalten.
Die vollständige
Sequenz des Gens rpoB von Tropheryma whippelii, erhalten durch Anwendung
der Consensusamplifizierungstechniken und Wanderungstechniken auf
dem Genom, hinterlegt in Genbank mit der Zugangsnummer (Accession
number) AF243072, entspricht der SEQ ID Nr. 9. Insgesamt ist diese
Sequenz SEQ ID Nr. 9 erhalten worden gemäß dem Schema der 1,
das die Position der Consensusprimer und der aufeinanderfolgenden
Fragmente präzisiert,
die erhalten werden:
-
In
der Sequenz SEQ ID Nr. 9, die hierunter dargestellt ist, ist die
SEQ ID Nr. 4 unterstrichen und die Sequenzen in fetten Buchstaben
sind der Reihe nach:
- – SEQ ID Nr. 6 (komplementäre Sequenz),
- – SEQ
ID Nr. 5 (komplementäre
Sequenz),
- – SEQ
ID Nr. 11 (identische Sequenz),
- – SEQ
ID Nr. 12 (komplementäre
Sequenz),
- – SEQ
ID Nr. 7 (identische Sequenz),
- – SEQ
ID Nr. 8 (identische Sequenz).
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Diese
Sequenz mißt
3657 Basenpaare und zeigt einen Gehalt an Cytosin plus Guanosin
von 50,4%.
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BEISPIEL 2: Spezifische Detektion des
Gens rpoB von Tropheryma whippelii
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Zwei
spezifische Primer sind bestimmt worden aus der SEQ ID Nr. 9 derart,
daß in
spezifischer Weise ein Fragment von 507 Basenpaaren des Gens rpoB
von Tropheryma whippelii eingerahmt wird mit SEQ ID Nr. 10 = 5'-
-
Die
Bestimmung der beiden Primer SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12 ist
in silico derart durchgeführt worden,
daß die
Zwänge
gewahrt werden, die den Primern zur molekularen Identifikation eigen
sind. Die Aufzählung
dieser Zwänge
ist integraler Bestandteil des erfinderischen Verfahrens dadurch,
daß derzeit
in der wissenschaftlichen Literatur nicht verfügbar ist: (1) Länge von
18-22 Basenpaaren; (2) Sequenzen der beiden Primer, die eine ähnliche
Schmelztemperatur aufweisen; (3) Sequenzen der beiden Primer, die
weder Selbsthybridisierung noch Komplementarität zulassen; (4) Sequenz, eingerahmt
durch die beiden spezifischen Primer des Bakteriums Tropheryma whippelii;
diese Bedingung ist überprüft worden
nach Ausrichtung der SEQ ID Nr. 9 mit der Gesamtheit der Sequenzen
der rpoB-Bakteriengene,
die verfügbar
sind in den Computerdatenbanken; (5) Sequenz, eingerahmt durch diese
beiden Primer, die eine optimale Länge von etwa 500 Basenpaaren aufweist;
diese optimale Länge
entspricht dabei einem Kompromiß zwischen
der Suche längstmöglichsen Identifizierungsregion,
die daher eine größtmögliche Diskriminierung
zwischen irgendeiner Sequenz aus der SEQ ID Nr. 9 und der Gesamtheit
der bekannten homologen rpoB-Bakteriensequenzen erlaubt, und der
Suche eines kürzest
möglichen
Identifizierungsbereichs, um die Empfindlichkeit der molekularen
Detektion weitestmöglich
zu erhöhen.
Es ist daher angenommen worden, daß es eine umgekehrte Beziehung
zwischen der Detektionsempfindlichkeit und Länge der Bakterien-DNA-Sequenz
gibt, die in einer Entnahme zu detektieren ist. Die Größe von 500
Basenpaaren entspricht schließlich
einer mittleren Sequenzlänge,
erhalten nach einem Lauf auf einem aktuell verfügbaren automatischen Sequenzierer.
Diese beiden Primer sind jeweils in Position 713-745 und 1181-1200
der Sequenz SEQ ID Nr. 9 des Gens rpoB des Bakteriums Tropheryma
whippelii. Die Sequenz dieser beiden Primer ist die folgende:
SEQ
ID Nr. 11 = 5'-TTG
AGC GCA CGC CGG AAA AA-3'
SEQ
ID Nr. 12 = 5'-GCA
CCG CAA CCT CGG AGA AA-3' (komplementärer Inversprimer)
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Der
Bereich des Gens rpoB von Tropheryma whippelii, eingerahmt durch
diese beiden Primer, Bereich bezeichnet als SEQ ID Nr. 10 (Position
713-1200), stellt den höchsten
Diskriminierungsgrad dar, nämlich
eine prozentuale Homologie unter 70% im Verhältnis zu den anderen Bereichen
desselben Gens, einschließlich
im Verhältnis
zum Bereich SEQ ID Nr. 3, der einen Homologieprozentanteil von 75
bis 85% aufweist.
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Es
ist wichtig, den höchsten
Diskriminierungsgrad aufrechtzuerhalten, um die Fehlergrenze zu
berücksichtigen,
die eingeführt
wird bei den Handhabungen der Proben in der diagnostischen Laborpraxis
und welche zu Amplifikationsfehlern führen, die durch thermostabile
Polymerasen, insbesondere die Taq-Polymerase, und Sequenzierfehler
gemacht werden. Diese so eingeführten
Fehler sind in der Größenordnung
von 0,5%.
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Das
Gen rpoB ist amplifiziert worden durch die PCR-Technik unter Verwendung
von 35 Amplifikationszyklen, umfassend jeder eine Denaturierungsphase
von 94°C
für 30
Sekunden, eine Hybridisierungsphase der Primer SEQ ID Nr. 11 und
12 bei 58°C
für 30
Sekunden und eine Elongationsphase bei 72°C für 60 Sekunden. Das Amplifikationsprodukt
wird visualisiert nach Anfärbung
durch Ethidiumbromid (2). Die Kontrollbakterien: Mycobacterium
avium, Mycobacterium tuberculosis, Nocardia otitidiscaviarum, Escherichia
coli, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium amycolatum sind
nicht durch die Oligonukleotidprimer SEQ ID Nr. 11 und 12 amplifiziert
worden, was die Spezifität
dieser Primer auf den Bakterienspezies zeigt, die phylogenetisch nahe
zu Tropheryma whippelii sind. Diese Technik ist angewandt worden
zur Detektion der Gegenwart oder der Abwesenheit des Gens rpoB von
Tropheryma whippelii in 10 jejunalen Biopsien, erhalten bei 10 unterschiedlichen
Patienten, von denen drei Biopsien vorher als DNA von Tropheryma
whippelii enthaltend unabhängig
gezeigt worden sind und von denen sieben gezeigt worden sind als
frei von DNA von Tropheryma whippelii. Diese Technik ist blind angewandt
worden mit Kodieren der 10 Entnahmen, wobei die Experimentatoren nicht
den Code kennen und daher nicht die Menge der bearbeiteten Entnahmen
wissen. Diese Technik hat es erlaubt, 100% positive Paare und 100%
negative Paare zu detektieren. Die erhaltenen Amplifikationsprodukte für die drei
positiven Biopsien sind sequenziert worden und die drei erhaltenen
Sequenzen hatten 100% Homologie mit SEQ ID Nr. 10.
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In
2 sind
die PCR-Amplifikationsprodukte dargestellt, die erhalten sind aus
10 jejunalen Biopsien, entnommen bei Patienten, die eine bestätigte Whipple-Krankheit
aufwiesen (Bahnen D, I und K) und keine Whipple-Krankheit aufwiesen
(Bahnen C, E, F, G, H, J und L). Die Bahnen A und N zeigen den Molekulargewichtsmarker
und die Bahnen B und M entsprechen Negativamplifikationskontrollen
(steriles Wasser). Die Amplifkationsprodukte werden erhalten nach
Einverleiben der Primer SEQ ID Nr. 11 und 12 gemäß der Erfindung und visualisiert
durch Anfärben
mit Ethidiumbromid nach Elektrophorese auf einem Agarosegel. Sequenzprotokoll
