DE69931928T2

DE69931928T2 - Reversibel inhibierende sonden

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Publication number: DE69931928T2
Application number: DE69931928T
Authority: DE
Inventors: C. Christopher San Diego ADAMS; T. Steven Santee BRENTANO; P. Gary Foster City SCHROTH
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1998-07-31
Filing date: 1999-07-30
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2019-07-31
Also published as: AU5246799A; DE69931928D1; US20020038016A1; CA2336539A1; EP1100972A1; JP2002521070A; US7122316B2; WO2000006779A1; ATE330031T1; US6602668B2; ES2265688T3; AU759915B2; US20030157547A1; US6297365B1; EP1100972B1

Description

GEGENSTAND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, Reagenzien und Verfahren zum Verbessern eines Amplifikationsprotokolls. Bevorzugt werden die Zusammensetzungen, Reagenzien und Verfahren in Verbindung mit einem RNA-Polymerase getriebenem transkriptionsgebundenem Amplifikationsprotokoll verwendet.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es wird bei keiner der hierin beschriebenen Referenzen zugegeben, dass sie als Stand der Technik für die beanspruchte Erfindung gelten.
Die Nukleinsäureamplifikation schließt die enzymatische Synthese von Nukleinsäureamplikons ein, die eine Sequenz enthalten, die komplementär zu einer zu amplifizierenden Nukleinsäuresequenz ist. Die Nukleinsäureamplifikation kann mittels verschiedener Techniken, wie z.B. solchen, die eine transkriptionsgebundene Amplifikation, die Polymerasekettenreaktion (PCR), die Ligase-Kettenreaktion (LCR) und die Strangverdrängungsamplifikation (SDR) einschließen, durchgeführt werden.
Die Verwendung einer Nukleinsäureamplifikation schließt diagnostische und synthetische Anwendungen ein. Diagnostische Anwendungen der Nukleinsäureamplifikation schließen für gewöhnlich ein Screening darüber ein, ob Amplikons erzeugt wurden, die Menge der erzeugten Amplikons und/oder bestimmen, ob die erzeugten Amplikons eine bestimmte Sequenz enthalten.
Die transkriptiongebundene Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz verwendet für gewöhnlich eine RNA- Polymerase, eine DNA-Polymerase, Desoxyribonukleosidtriphosphate, Ribonukleosidtriphosphate und ein zur Promotormatrize komplementäres Oligonukleotid. Das zur Promotermatrize komplementäre Oligonukleotid enthält eine 5' Sequenz, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird, und eine 3' Sequenz, die mit einer Nukleinsäurematrize an einem Ort 3' der Ziel-Sequenz, die man zu amplifizieren wünscht, hybridisiert. Nach der Hybridisierung des zur Promotormatrize komplementären Oligonukleotids mit der Matrize, wird ein doppelsträngiger Promotor stromaufwärts der Ziel-Sequenz gebildet. Die Bildung des doppelsträngigen Promotors schließt im Allgemeinen eine DNA-Polymeraseaktivität ein.
Die RNA-Polymerase gebundene Amplifikation wird durch das Binden einer RNA-Polymerase an einen Promotorbereich, der für gewöhnlich doppelsträngig ist, initiiert. Die RNA-Polymerase schreitet stromabwärts vom Promotorbereich voran und synthetisiert Ribonukleinsäure von der 5' in die 3' Richtung. Mehrere Kopien, im Allgemeinen im Bereich von 100–3000 RNA-Transkripten, können unter Verwendung einer einzelnen Matrize durch eine RNA-Polymerase gebundene Amplifikation erzeugt werden.
Verschiedene Formate können für das Durchführen der transkriptionsgebundenen Amplifikation verwendet werden. Beispiele für verschiedene Formate werden in Veröffentlichungen bereitgestellt, wie z.B. Burg et al., U.S. Patent Nr. 5,437,990; Kacian et al., U.S. Patent Nr. 5,399,491; Kacian et al., U.S. Patent Nr. 5,554,516; Kacian et al., Internationale Veröffentlichungsnr. PCT/US93/04015, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 93/22461; Gingeras et al., Internationale Veröffentlichungsnr. PCT/U587/01966, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 88/01302; Gingeras et al., Internationale Veröffentlichungsnr. PCT/US/88/02108, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 88/10315; Davey und Malek, Europäische Anmeldung Nr. 88113948.9, Europäische Veröffentlichungsnr. 0 329 822 A2; Malek et al., U.S. Patent Nr. 5,130,238; Urdea, Internationale Veröffentlichungsnr. PCT/US91/00213, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 91/10746; McDonough et al., Internationale Veröffentlichungsnr. PCT/US93/07138, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 94/03472 und Ryder et al., Internationale Veröffentlichungsnr. PCT/US94/08307, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 95/03430.
Die PCR Amplifikation wird beschrieben von Mullis et al., U.S. Patent Nr. 4,683,195, 4,683,202, und 4,800,159 und in Methods in Enzymology, 155: 335–350 (1987).
Ein Beispiel für LCR wird in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 320 308 beschrieben. Eine LCR verwendet wenigstens vier separate Oligonukleotide. Zwei der Oligonukleotide hybridisieren an einer Nukleinsäurematrize, so dass das 3' Ende eines Oligonukleotids und das 5' Ende des anderen Oligonukleotids für die Ligation positioniert sind. Die hybridisierten Oligonukleotide werden dann ligiert und bilden ein Volllängenkomplement zur Ziel-Sequenz in der Nukleinsäurematrize. Die doppelsträngige Nukleinsäure wird dann denaturiert und dritte und vierte Oligonukleotide werden mit dem komplementären Strang hybridisiert und miteinander verbunden. Die Amplifikation wird durch weitere Hybridisierungszyklen, Ligation und Denaturierung erreicht, wodurch mehrere Kopien der Ziel-Sequenz und der Sequenz, die zur Ziel-Sequenz komplementär ist, erzeugt werden.
Die SDA ist eine isothermale Amplifikationsreaktion, die auf der Fähigkeit eines Restriktionsenzyms, das den ummodifizierten Strang einer Hemiphosphorthioat-Form seiner Erkennungsstelle zerschneidet und auf der Fähigkeit einer DNA-Polymerase, die die Replikation an der Schnittkante initiiert und einen stromabwärts gelegenen Nicht-Matrizenstrang ersetzt, beruht. (siehe, z.B. Walker, PCR Methods and Applications, 3: 25–30 (1993), Walker et al., Nucleic Acids Res., 20: 1691– 1996 (1992), and Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 392–396 (1991). Die Schritte, die zum Erzeugen der Fragmente für das Durchführen der autokatalytischen SDA-Amplifikation verwendet werden, werden als anpassungsfähig für das Erzeugen von Fragmenten für eine transkriptionsgebundene Amplifikation oder eine Amplifikation, die mittels Q-beta-Technologie durchgeführt wird, angegeben. (Walker et al., Nucleic Acids Res., 20: 1691–1696 (1992)). Savinkova et al. (Mol. Biol. (Moskau) 1988, 22(3), 807–812) beschreibt synthetische Oligonukleotide, die die –10 Bereiche der E. coli Promotoren betreffen. Die Oligonukleotide binden an die nicht transkribierten Stränge des Promotors. Die synthetischen Oligonukleotide, die an die nicht transkribierten DNA-Stränge binden, können die RNA-Synthese inhibieren, die durch die E. coli RNA-Polymerase synthetisiert wurden.
WO 96/41010 betrifft ein Verfahren zum Auswählen von hochaffinen Nukleinsäureliganden für DNA-Polymerasen, besonders hitzestabile Polymerasen, wie die Taq- und Tth-Polymerase. Diese Liganden ermöglichen die Verringerung der Hintergrundamplifikation in Polymerisationsverfahren. Das Capping des 3' Endes der hochaffinen Liganden verhindert die Verlängerung der Liganden. Die Liganden werden durch das Selex-Verfahren ausgewählt und können chemisch am Ribose und/oder Phosphat und/oder Basenrest zum Verbessern ihrer Bindungseigenschaften modifiziert werden. Die Liganden können in einer PCR für das Verbessern einer spezifischen Amplifikation der Ziel-Nukleinsäure verwendet werden. Die Zugabe von Liganden bei Umgebungstemperatur verhindert die ungewollte Amplifikation nicht-verwandter DNA-Sequenzen, die natürlicherweise in einer biologischen Probe vorkommen. Die Verwendung von hochaffinen Liganden ermöglichte die empfindliche Detektion von Ziel-DNA-Molekülen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Inhibitoren einer Ziel-unabhängigen Amplifikation und die Verwendung solcher Inhibitoren zum Verbessern eines Amplifikationsprotokolls. Man glaubt, dass die Inhibitoren ein Amplifikationsprotokoll durch das Inhibieren der Fähigkeit einer oder mehrerer Nukleinsäurepolymerasen eine Nukleinsäure in einer Polymerasereaktion in Abwesenheit der Ziel-Nukleinsäure zu verwenden, verbessert wird.
Die "Ziel-unabhängige Amplifikation" betrifft die Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz, die keine Ziel-Nukleinsäuresequenz ist. Die Ziel-Nukleinsäuresequenz ist auf einer Ziel-Nukleinsäure vorhanden und ist eine zu amplifizierende Nukleotidbasensequenz oder -Bereich.
Man glaubt, dass die vorliegende Erfindung die Nukleinsäureamplifikation durch die Verwendung von Kompetitoren für Amplifikationsoligonukleotide begünstigt, um Amplifikationsenzyme in einer Lösung einer Nicht-Zielnukleinsäure, wie z.B. Amplifikationsoligonukleotiden, zu sequestrieren. Die Kompetitoren konkurrieren offensichtlich mit Amplifikationsoligonukleotiden um die Bindung an ein oder mehrere Amplifikationsenzyme und können im Überschuss relativ zu den Amplifikationsoligonukleotiden zugegeben werden.
In Abwesenheit einer Ziel-Nukleinsäure werden die betroffenen Amplifikationsenzyme durch Kompetitoren belegt und die Fähigkeit der Enzyme in einer Polymerasereaktion, die eine Nicht-Ziel-Nukleinsäure einschließt, teilzunehmen, wird inhibiert. Amplifikationsoligonukleotide, die mit einer Ziel-Nukleinsäure hybridisiert sind, konkurrieren bevorzugt mit den Kompetitoren um die Amplifikationsenzymbindung. Daher arbeiten die Kompetitoren als reversible Inhibitoren der Amplifikationsenzyme.
Amplifikationsenzyme sind Nukleinsäurepolymerasen, die die Synthese von Polynukleotiden durch Polymerisieren von Nukleosidtriphosphaten katalysieren. Die reversible Inhibition von Amplifikationsenzymen wird durchgeführt, um die Bildung von ungewünschten Nebenprodukten, wie zum Beispiel einem oder mehreren der folgenden, zu verhindern:
(1) einem Primerdimer; (2) einer RNA replizierenden Nukleinsäure; (3) einer einzelsträngigen Primer verlängerten RNA oder DNA; und (4) einer Modifikation eines Primers, die den Primer untauglich macht für eine Teilnahme in der Amplifikation einer Ziel-Nukleinsäuresequenz. Die Arten ungewünschter Nebenprodukten, die gebildet werden können, werden vom bestimmten Amplifikationsprotokoll, das durchgeführt wird, abhängen.
Amplifikationsoligonukleotide hybridisieren mit einer Ziel-Nukleinsäure und nehmen an einer Amplifikationsreaktion teil. Beispiele von Amplifikationsoligonukleotiden schließen zur Matrize komplementäre Sonden, wie zum Beispiel Primer, und zu Promotormatrizen komplementäre Sonden, wie z.B. Promotor-Primer, ein.
Obwohl man erwartet, dass die Inhibitoren einer Ziel-unabhängigen Amplifikation, die durch die vorliegende Erfindung beschrieben werden, durch Konkurrieren mit Amplifikationsoligonukleotiden um die Bindung an ein Amplifikationsenzym arbeiten, sind, soweit es in den Ansprüchen nicht anders spezifiziert wird, die Ansprüche nicht auf einem bestimmten Mechanismus begrenzt. Zum Beispiel werden Sonden mit einem hohen Grad an Sequenzähnlichkeit zu einem RNA-Polymerasepromotor, der ein Amplifikationsprotokoll verbessert, in den weiter unten bereitgestellten Beispielen beschrieben. Solche Beispiele illustrieren die Wirksamkeit solcher Sonden und ermöglichen ein Sondendesign, das auf einer Sequenzähnlichkeit zu einem RNA-Polymerasepromotor basiert, ohne die Enzymbindung zu bestimmen oder die Fähigkeit mit Amplifikationsoligonukleotiden zu konkurrieren.
Demnach beschriebt ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung einer Ködersonde, die einen ersten Nukleotidbasen-Erkennungssequenzbereich bestehend aus Nukleinsäure, wobei der erste Bereich mindestens 35% Sequenzähnlichkeit mit einer RNA-Polymerase-Promotorsequenz aufweist, die aus der Gruppe bestehend aus einer T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz, einer T3-RNA-Polymerase-Promotorsequenz und einer SP6-RNA-Polymersase-Promotorsequenz ausgewählt wird; und einem zweiten Nukleotidbasen-Erkennungssequenzbereich, der direkt mit dem 5' Ende des ersten Bereiches oder dem 3' Ende oder dem 5' Ende des ersten Bereiches über eine oder mehrere chemische Gruppe(n), die keine Nukleotidbasen-Erkennungsgruppe enthält/enthalten, die als eine Matrize in einer Polymerasereaktion dienen kann, verbunden ist, wobei die chemischen Gruppen unter Amplifizierungsbedingungen eine stabile Bindung bilden, vorausgesetzt, dass, wenn der erste Bereich verwendet werden kann, um eine funktionelle Doppelstrang-Promotorsequenz unter Verwendung eines komplementären Oligonukleotids zu erzeugen, die Sonde dann keine Nukleinsäuresequenz größer als 10 Nukleotide direkt an dem 3' Ende des ersten Bereichs aufweist und die Sonde kein 3' Ende besitzt, das an einer Polymerasereaktion teilnehmen kann, umfasst.
Das Vorhandensein eines zweiten Bereiches, der 3' oder 5' zum ersten Bereich positioniert ist, verhindert nicht, dass andere Bereiche vorhanden sind. Zum Beispiel kann die Ködersonde einen zweiten Bereich 3' zum ersten Bereich enthalten und kann auch einen Bereich enthalten, der entweder direkt oder über einen Nicht-Nukleotid-Linker an das 5' Ende des ersten Bereichs gebunden ist.
Bevorzugt ist die Ködersonde eine gereinigte Sonde. Mit "gereinigt" ist gemeint, dass die Ködersonde wenigstens 0,1% der in einer Zubereitung vorhandenen Erkennungsmoleküle ausmacht. In bevorzugten Ausführungsformen macht die Ködersonde wenigstens 1%, wenigstens 5%, wenigstens 25%, wenigstens 50%, wenigstens 75% oder 100% der in der Zubereitung vorhandenen Nukleinsäure aus.
Ein "Nukleotidbasensequenz-Erkennungsmolekül" ist ein Molekül, das Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen enthält, die über ein Rückgrat miteinander verbunden sind. Beispiele für Nukleotidbasensequenz-Erkennungsmoleküle schließen Peptidnukleinsäuren, Oligonukleotide und Derivate davon ein. Eine Nukleotidbasen-Erkennungsgruppe kann eine Wasserstoffbrückenbindung mit Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil ausbilden. Das Rückgrat präsentiert die Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen in einer für eine Wasserstoffbrückenbindung mit einem komplementären Nukleotid geeigneten Konformation, das in einer Nukleinsäuresequenz vorhanden ist.
Eine "funktionelle doppelsträngige Promotorsequenz" ist eine Sequenz, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird und verwendet werden kann, um einfach detektierbare RNA-Transkripte zu erzeugen. Ein funktioneller doppelsträngiger Promotor kann ausgehend von einer einzelsträngigen Promotorsequenz, z.B. durch Hybridisieren eines komplementären Oligonukleotids an die Promotorsequenz, gebildet werden.
Ein "Nicht-Nukleotid-Linker" betrifft einen oder mehrere chemische Reste, die eine stabile Verknüpfung unter Amplifikationsbedingungen bilden, und die keine Nukleotidbasen-Erkennungsgruppe enthalten, die als Matrize in einer Polymerasereaktion dienen kann.
Eine Ködersonde, die an eine RNA-Polymerase bindet, kann mittels Standardtechniken, wie zum Beispiel durch die Verwendung von kompetitiven und nicht-kompetitiven Assays, die ein markiertes Oligonukleotid mit einer RNA-Polymerase-Promotorsequenz verwenden, gemessen werden. Zusätzlich können Oligonukleotide, die an eine RNA-Polymerase binden, ausgewählt werden und in großen Mengen mittels des "Proteinbindungs- Amplifikationsprotokolls", wie weiter unten beschrieben, erzeugt werden.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-Nukleinsäuresequenz unter Bedingungen zur transkriptionsgebundenen Amplifikation, das die Schritte umfasst:

(a) Herstellen einer Mischung umfassend eine RNA-Polymerase und die Ködersonde gemäß einem der Ansprüche 1–18, wobei die Ködersonde unter den Amplifizierungsbedingungen nicht mit einer Ziel-Nukleinsäure, die die Ziel-Nukleinsäuresequenz umfasst, hybridisiert, und wobei die Mischung die Ziel-Nukleinsäure nicht enthält;
(b) Vereinigen der Mischung mit der Ziel-Nukleinsäuresequenz und den Amplifikationsoligonukleotiden, die in der Lage sind, die Ziel-Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren; und
(c) Amplifizieren der Ziel-Nukleinsäuresequenz unter den Amplifizierungsbedingungen, wobei der Amplifizierungsschritt unter Verwendung der Amplifizierungs-Oligonukleotide und der RNA-Polymerase ausgeführt wird;

Erwartete Vorteile der vorliegenden Erfindung schließen einen oder mehrere der folgenden ein: (1) erhöhte Ausbeute von zum Ziel komplementären Amplikons; (2) erhöhte Empfindlichkeit und (3) erhöhte Verfügbarkeit für Polymerasen für die Ziel-Amplifikation. Man erwartet, dass solche Vorteile aus der Verringerung der ungewünschten Nebenprodukte erwachsen.
Ein anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass sie bei einer im Wesentlichen konstanten Temperatur verwendet werden kann. Bei einer im Wesentlichen konstanten Temperatur wird eine Reaktion nicht zwischen einer hohen und einer niedrigen Temperatur wechseln, um eine Nukleinsäure alternativ zu denaturieren und anzubinden, wie das zum Beispiel in einer PCR der Fall ist.
Verschiedene Beispiele werden in der gesamten Anmeldung verwendet. Die Beispiele sind nicht dazu gedacht, die beanspruchte Erfindung in irgendeiner Art und Weise zu begrenzen.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aufgrund der folgenden Figuren, detaillierten Beschreibung der Erfindung, den Beispielen und den Ansprüchen deutlichen werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A und 1B stellen einen möglichen Mechanismus zur Konkurrenz zwischen Ködersonden und ungebundenen Amplifikationsprimern für Amplifikationsenzyme in einer transkriptionsgebundenen Amplifikation dar. 1A stellt ein Amplifikationsschema in Abwesenheit von Ködersonden dar. 1B stellt Ködersonden dar, die die Bildung von Nebenprodukten inhibieren.
2A und 2B stellen zwei Beispiele für Ködersonden dar. Die in 2A gezeigte Ködersonde ist ein einzelsträngiges Oligonukleotid mit einem selbstkomplementären 5' Ende, das eine Haarnadel bildet. Die in 2B gezeigte Ködersonde enthält zwei Oligonukleotidbereiche, die an ihren 5' Enden miteinander verknüpft sind, um eine Ködersonde mit zwei 3' Enden zu bilden. Die drei Kohlenstoffgruppen (-ccc), die in den 2A und 2B dargestellt werden, sind Propyl-Blockiergruppen, die an die 3' Enden gebunden sind.
3 stellt die Ergebnisse eines Experimentes dar, das die Wirkung einer blockierten Ködersonde der SEQ. ID. NO: 10 auf die T7 Hepatitis C Virus (HCV) transkriptionsgebundenen Amplifikationskinetiken untersucht. Die Amplifikationszeit betrifft die Länge der Zeit die der Zugabe der Enzymreagenzien folgt. Die Reaktionen (20 μl Reaktionsvolumen) wurden durch die Zugabe von HPA-Sondenreagenz beendet. Ergebnisse bei denen keine Ködersonden vorhanden sind, werden durch eine "-♦-" gekennzeichnet. Ergebnisse bei denen Ködersonden vorhanden sind, sind durch ein "-
-" gekennzeichnet.
4 stellt die Ergebnisse eines Experimentes dar, das die Wirkung einer blockierten Ködersonde der SEQ ID NO: 10 auf die T7 Human Immunodeficiency Virus (HIV) transkriptionsgebundenen Amplifikationskinetiken untersucht. Die Amplifikationszeit betrifft die Länge der Zeit, die der Zugabe des Enzymreagenzes folgt. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe des HPA-Sondenreagenzes beendet. Ergebnisse bei denen keine Ködersonden vorhanden waren, werden durch "-♦-" gekennzeichnet. Ergebnisse bei denen Ködersonden vorhanden waren, werden durch "-
-" gekennzeichnet.
5 stellt die Ergebnisse eines Experimentes dar, das die Auswirkung einer blockierten Ködersonde der SEQ ID NO: 10 auf die T3 HIV transkriptionsgebundenen Amplifikationskinetiken untersucht. Die Amplifikationszeit betrifft die Länge der Zeit, die der Zugabe des Enzymreagenzes folgt. Die Reaktionen werden durch die Zugabe des HPA-Sondenreagenzes beendet. Die Ergebnisse bei denen keine Ködersonde vorhanden war, werden durch ein "-♦-" gekennzeichnet. Ergebnisse bei denen eine Ködersonde vorhanden war, werden durch ein "-
-" gekennzeichnet.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, Reagenzien und Verfahren zum Verbessern eines Amplifikationsprotokolls. Man glaubt, dass die vorliegende Erfindung die Amplifikation durch Bereitstellen eines Mittels zum Sequestrieren der Amplifikationsenzyme von Amplifikationsoligonukleotiden, die nicht mit einer Ziel-Nukleinsäure hybridisiert sind, verbessert.
Die 1A und 1B stellen einen möglichen Mechanismus dar, durch den die Amplifikation durch die Verwendung von reversiblen Inhibitoren (z.B., Ködern) von Amplifikationsenzymen verbessert wird. Der dargestellte Mechanismus schließt eine transkriptionsgebundene Amplifikation ein und zeigt die Inhibition der Fähigkeit einer reversen Transkriptions- und RNA-Polymerase zur Erzeugung ungewünschter Produkte.
Der obere Teil der 1 stellt eine Amplifikation in Abwesenheit von reversiblen Amplifikationsenzyminhibitoren (z.B., Ködern) dar und der untere Teil der 1 stellt die Amplifikation in Gegenwart der reversiblen Amplifikationsenzyminhibitoren dar (z.B., Ködern). Man glaubt, dass Ködersonden an die Amplifikationsenzyme binden, wodurch die Enzyme besetzt werden und die Fähigkeit der Enzyme verringert wird, ungewünschte Produkte mit Hilfe von Amplifikationsoligonukleotiden zu bilden.
Die vorliegende Erfindung wird bevorzugt verwendet, um die Anzahl der ziel-spezifischen Amplikonprodukte zu erhöhen und die der unerwünschten Produkte, die Reaktanden und Systemresourcen unproduktiv konsumieren, zu minimieren. Durch Maximieren der Menge des zielspezifischen Amplikonproduktes und Verringern der unerwünschten Produkte können ein oder mehrere Merkmale der Amplifikation verbessert werden.
I. DEFINITIONEN
Beschreibungen werden zusammen mit bevorzugten Ausführungsformen einiger der hierin beschriebenen Begriffe in diesem Abschnitt dargestellt. Mit diesem Abschnitt ist nicht beabsichtigt eine Beschreibung aller der hierin verwendeten Begriffe bereitzustellen sondern eher einen Referenzabschnitt für viele der Begriffe bereitzustellen.
"Amplifikationsbedingungen" betreffen Bedingungen, die mit der Nukleinsäurepolymerisation kompatibel sind, um einen komplementären Strang mittels einer Nukleinsäurematrize und einer Nukleinsäurepolymerase zu erzeugen. Solche Bedingungen schließen die Anwesenheit von erforderlichen Amplifikations-Komponenten ein, die Enzyme, Nukleosidtriphosphatsubstrate, Pufferbedingungen und eine geeignete Temperatur ein. Die spezifisch verwendeten Bedingungen hängen vom Typ der durchgeführten Amplifikation ab. Bedingungen zum Durchführen verschiedener Typen von Amplifikation sind im Stand der Technik gut bekannt und werden durch die hierin zitierten Publikationen, wie zum Beispiel diejenigen, die im Abschnitt "HINTERGRUND DER ERFINDUNG", siehe oben, beschrieben werden, exemplarisch dargestellt. Beispiele für verschiedene Amplifikationsverfahren, die im Abschnitt "HINTERGRUND DER ERFINDUNG" beispielhaft dargestellt sind, schließen die transkriptionsgebundene Amplifikation, PCR, LCR und SDA ein.
Die Bedingungen für die transkriptionsgebundene Amplifikation sind solche Bedingungen, die mit der RNA-Polymerase gebundenen Amplifikation, die das Erzeugen von RNA-Transkripten einschließt, kompatibel sind. Solche Bedingungen sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen die geeigneten Pufferbedingungen, Nukleosidtriphosphatsubstrate, Temperatur, die Amplifikationsoligonukleotide, RNA-Polymerase und die Reverse Transkriptase ein.
Bedingungen für SDA sind solche Bedingungen, die mit einer Strangverdrängungsamplifikation kompatibel sind. Solche Bedingungen sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen die geeigneten Pufferbedingungen, Nukleosidtriphosphatsubstrate, die Temperatur, die Amplifikationsoligonukleotide, die Nukleinsäurepolymerase und die Restriktionsenzyme ein.
Bedingungen für die DNA-Polymerase Amplifikation sind Bedingungen, die mit der Aktivität der DNA-Polymerase kompatibel sind. Solche Bedingungen schließen die geeigneten Pufferbedingungen, Nukleosidtriphosphatsubstrate und die Temperatur ein.
Ein "Amplifikationsoligonukleotid" betrifft ein gegebenenfalls modifiziertes Oligonukleotid, das an einer Amplifikationsreaktion teilnehmen kann. Die Zusammensetzung eines Amplifikationsoligonukleotides wird vom verwendeten Amplifikationsschema abhängen. Beispiele für Amplifikationsoligonukleotide schließen Primer und Promotor-Primer ein, die mit einer anfänglichen Matrize oder mit einer komplementären Matrize, die ausgehend von der anfänglichen Matrize erzeugt wurde, komplementär sind.
Ein "analoges Oligonukleotid" betrifft ein gegebenenfalls modifiziertes Oligonukleotid, das im Wesentlichen die gleiche Nukleinsäuresequenz aufweist wie die, die in einer Ziel-Nukleinsäure in einem Bereich 5' der Ziel-Sequenz vorhanden ist. Das analoge Oligonukleotid hat ausreichende Komplementarität, um mit dem Komplement der Ziel-Nukleinsäure unter Amplifikationsbedingungen zu hybridisieren. Das analoge Oligonukleotid kann einen nicht-komplementären Bereich, wie zum Beispiel einen Promotor-Bereich enthalten. Das analoge Oligonukleotid kann eine oder mehrere Modifikationen, wie zum Beispiel eine Modifikation, die die Nukleinsäure-Polymeraseaktivität inhibiert, enthalten. Das analoge Oligonukleotid enthält bevorzugte wenigstens etwa 15 zusammenhängende Basen, die zumindest zu wenigstens 80%, noch bevorzugter zu wenigstens 90% und am meisten bevorzugt zu 100% analog mit einem zusammenhängendem Basenbereich der Ziel-Nukleinsäure sind. Das analoge Oligonukleotid ist bevorzugt 15 bis 60 gegebenenfalls modifizierte Nukleotide lang, und noch bevorzugter sind die gegebenenfalls modifizierten Nukleotide unmodifizierte Nukleotide.
Ein "analoger Primer" betrifft ein analoges Oligonukleotid, das ein 3' Ende enthält, das an einer Nukleinsäure-Polymerasereaktion teilnehmen kann. Der 5' Bereich des analogen Primers kann nicht-komplementär zur Ziel-Nukleinsäure sein und kann zum Beispiel eine Promotorsequenz sein, die einen analogen Promotor-Primer ergeben würde.
Ein "zur Matrize komplementäres Oligonukleotid" betrifft ein gegebenenfalls modifiziertes Oligonukleotid, das ausreichend komplementär ist, um mit einer Ziel-Nukleinsäure in einem Bereich 3' der Ziel-Sequenz zu hybridisieren. Das zur Matrize komplementäre Oligonukleotid kann einen nicht-komplementären Bereich, wie zum Beispiel einen 5' Promotor-Bereich, enthalten. Bevorzugt enthält das zum Ziel komplementäre Oligonukleotid wenigstens etwa 15 zusammenhängende Basen, die wenigstens zu 80%, noch bevorzugter wenigstens 90% und am meisten bevorzugt 100% komplementär zu einem nebeneinander liegendem Basenbereich der Ziel-Nukleinsäure sind. Das zur Matrize komplementäre Oligonukleotid ist bevorzugt 15 bis 60 gegebenenfalls modifizierte Nukleotide lang und noch bevorzugter sind die gegebenenfalls modifizierten Nukleotide unmodifizierte Nukleotide.
Ein "zur Matrize komplementärer Primer" betrifft ein zur Matrize komplementäres Oligonukleotid, das ein 3' Ende enthält, das in einer Polymerasereaktion einfach verwendet werden kann. Der 5' Bereich des Primers kann nicht-komplementär zur Ziel-Nukleinsäure sein und kann zum Beispiel eine Promotorsequenz sein.
Ein "zur Promotor-Matrize komplementäres Oligonukleotid" betrifft eine zur Matrize komplementäres Oligonukleotid mit einer 5' Promotorsequenz. Die Promotorsequenz wird durch eine RNA-Polymerase wieder erkannt.
Ein "Primer" betrifft ein Oligonukleotid, das ein 3' Ende enthält, das in einer Polymerasereaktion einfach verwendet werden kann. Der 5' Bereich des Primers kann nicht- komplementär zur Ziel-Nukleinsäure sein und kann zum Beispiel eine Promotorsequenz sein.
Ein "Promotor-Primer" betrifft ein Oligonukleotid mit einer 5' Promotorsequenz und einer 3' Primersequenz.
II. REVERSIBLE INHIBITION DER AKTIVITÄT DER AMPLIFIKATIONSENZYME
Die reversible Inhibition der Aktivität der Amplifikationsenzyme wird durchgeführt, um die zielunabhängige Amplifikation oder die Aktivität der Nukleinsäurepolymerase zu inhibieren. Bevorzugt wird der Inhibitor, der zum Erzielen der reversiblen Inhibition verwendet wird, entworfen, um die Bindung eines Amplifikationsoligonukleotids durch ein Amplifikationsenzym in Abwesenheit einer Ziel-Nukleinsäure zu inhibieren. In Gegenwart des Ziels bildet das Amplifikationsoligonukleotid einen Komplex mit dem Ziel, das mit dem Inhibitor effektiv um die Enzymbindung konkurriert.
Das Binden eines Inhibitors an ein Amplifikationsenzym kann im Gegensatz zum Binden eines Amplifikationsenzyms an ein Amplifikationsoligonukleotid durch die folgenden beispielhaften Techniken verbessert werden: (1) Erhöhen der Menge des Inhibitors relativ zum Amplifikationsoligonukleotid; und (2) Kombinieren des Amplifikationsenzyms mit dem Inhibitor vor dem Einbringen der Amplifikationsoligonukleotide.
III. KÖDERSONDEN
Die hierin beschriebenen Verfahren werden bevorzugt unter Verwendung einer Ködersonde durchgeführt. Bevorzugte Ködersonden haben kein 3' Ende, das in einer Polymerasereaktion verwendet werden kann. Noch bevorzugter enthält die Ködersonde keine Sequenz, die im Wesentlichen komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäuresequenz ist. Im Wesentlichen komplementäre Sequenzen können miteinander unter Bedingungen, die in einer Amplifikationsreaktion verwendet werden, miteinander hybridisieren. Bevorzugt enthält die Ködersonde nicht mehr als 5 Erkennungsgruppen, die eine Wasserstoffbrückenbindung mit einem Bereich von 10 oder mehreren zusammenhängenden Ziel-Nukleinsäuresequenzbasen ausbilden können.
Noch bevorzugter werden Ködersonden in einer Menge verwendet, die der Menge der Amplifikationsoligonukleotide gleicht oder im Überschuss. Ein bevorzugtes molares Verhältnis der Ködersonde zur Gesamtmenge des Amplifikationsoligonukleotids ist 1:3 zu 100:1, bevorzugt 2:1 zu 5:1. Das molare Verhältnis von Ködersonde zu Amplifikationsenzym ist bevorzugt etwa 1:15 zu 5:1, noch bevorzugter 1:2 zu 2:1 und noch bevorzugter 1:1.
Bevorzugt werden die Ködersonden mit einem Amplifikationsenzym(en) vor dem Einbringen der Amplifikationsoligonukleotide inkubiert. Noch bevorzugter ist/sind das/die Amplifikationsenzym(e) eine RNA-Polymerase und/oder eine Reverse Transkriptase, die vor dem Kontakt mit einem Amplifikationsoligonukleotid mit Ködersonden kombiniert werden, die eine 5' promotorähnliche Sequenz und ein blockiertes 3' Ende aufweisen.
Ködersonden werden bevorzugt so entworfen, dass sie nicht in einer Nukleinsäure-Polymerasereaktion verwendet werden können. Bevorzugte Ködersonden weisen keine Struktur auf, die einen funktionellen Promotor bereitstellt und weisen kein 3' Ende auf, das an einer Polymerasereaktion teilnehmen könnte.
Einzelsträngige und doppelsträngige DNA-Promotorsequenzen, die durch eine RNA-Polymerase wirksam verwendet werden können, werden bevorzugt vermieden. Die Verwendung von Fängersonden mit einer funktionellen doppelsträngigen DNA-Promotorsequenz kann in der Produktion von unerwünschten Ziel-unabhängigen Amplifikationsprodukten münden.
Vergleichbar werden RNAs mit einer Stammschleifen-Sekundärstruktur und DNA mit einer zirkulären Struktur, was zu einer zielunabhängigen Amplifikation führen kann, vermieden. Biebricher und Luse, EMBO J., 13: 3458–3465 (1996) weisen darauf hin, das strukturierte RNA-Moleküle verschiedener Sequenzen an einer durch eine RNA-Polymerase katalysierten Replikation teilnehmen können. Daubendiek et al., J. Am. Chem. Soc., 117: 7818–7819 (1995) weisen darauf hin, dass ein zirkuläres Desoxyoligonukleotid als Matrize für die T7-Polymerase in Abwesenheit von RNA-Primern, in Abwesenheit von RNA-Promotorsequenzen und in Abwesenheit irgendeiner Duplexstruktur dienen kann.
A. Ködersondensteuerung
Bevorzugte Ködersonden, die durch die vorliegende Erfindung beschrieben werden, zielen auf eine Nukleinsäurepolymerase, bevorzugt die RNA Polymerase und/oder Reverse Transkriptase. Solche Sonden können zum Beispiel durch Verwenden eines oder mehrerer der folgenden Verfahren(s) erzeugt werden: (1) Auswählen der Sonden, die an eine RNA-Polymerase und/oder Reverse Transkriptase binden; (2) Entwerfen von Sonden mit einer Promotorsequenz, die mit einer RNA-Polymerase-Promotorsequenz sequenzähnlich oder identisch ist; und (3) Entwerfen von Sonden mit einer zu sich selbst komplementären "Haarnadel"-struktur.
Es sind RNA-Promotorsequenzen aus einer Vielfalt verschiedener Quellen sequenziert worden. (Siehe z.B., Jorgensen et al., J. B. C., 266: 645–655 (1991)). Beispiele für natürlich auftretende RNA-Promotorsequenzen sind die folgenden:
Eine Ködersonde kann eine Sequenz enthalten, die zu jeder Kodierung, d.h. (+) oder (–), eines Promotors ähnlich ist. Der Bezug auf "ähnlich" schließt auch dieselbe Sequenz ein. Bevorzugt weist die Ködersonde, die in einer transkriptionsgebundenen Amplifikation verwendet wird, eine Sequenz auf, die der Promotorsequenz, die in einem Promotor-Primer, der in der transkriptionsgebundenen Amplifikationsreaktion verwendet wird, ähnlich ist.
Bevorzugt weisen Ködersonden einen Bereich mit einer Sequenzähnlichkeit auf, die zu wenigstens 50% ähnlich zur T7 RNA-Polymerase-Promotorsequenz, zur T3 RNA-Polymerase-Promotorsequenz oder SP6 RNA-Polymerase-Promotorsequenz ist. Noch bevorzugter liegt die Sequenzähnlichkeit bei wenigstens 75% zur T7 RNA-Polymerase-Promotorsequenz, zur T3 RNA-Polymerase-Promotorsequenz oder der SP6 RNA-Polymerase-Promotorsequenz. Noch bevorzugter liegt die Sequenzähnlichkeit bei 75% bis zu 95% zur T7, T3, oder SP6 RNA-Polymerase-Promotorsequenz.
Der Prozentsatz der Basenähnlichkeit ist die Gesamtzahl von Basen in einer zusammenhängenden Basensequenz, die die gleichen sind wie die, die in einer Volllängen-RNA-Polymerase-Promotorsequenz vorhanden sind, geteilt durch die Anzahl der Basen in der Volllängen-RNA-Polymerasesequenz. Demnach wird in Bezug auf die T7 Polymerase, die in SEQ. ID. NO: 3 bereitgestellt wird, die Anzahl der Basen, die in den Ködersonden, die die gleichen sind wie die T7 Polymerase-Promotorsequenz, vorhanden sind, durch 23 geteilt. Zum Beispiel weist die SEQ. ID. NO: 7: taatacgact cactataggg eine Sequenzähnlichkeit von etwa 87% zur T7 Polymerase, die in SEQ. ID. NO: 3 bereitgestellt wird, auf. Veränderungen der Basen, die für die SEQ. ID. NO: 7 aufgelistet werden, würden die Sequenzähnlichkeit beeinflussen.
Ein anderer Weg zum Entwerfen von Ködersonden ist die Verwendung einer Sequenz mit einem zu sich selbst komplementären Bereich, der eine Stammschleifenstruktur erzeugen wird. Zusätzlich zum Erkennen von Promotorsequenzen, scheinen die RNA-Polymerasen auch Sekundärstrukturen zu erkennen.
Zusätzlich dazu, dass eine Sequenz auf eine RNA-Polymerase gerichtet ist, können die Ködersonden zusätzliche Sequenzen einschließen. Zusätzliche Sequenzen können zufällig erzeugt werden. Bevorzugt sind die zusätzlichen Sequenzen nicht komplementär zur Ziel-Nukleinsäure oder dem Komplement davon oder zu irgendeiner anderen Sequenz, die in der Amplifikationsreaktion vorhanden ist. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält eine Ködersonde eine zusätzliche Sequenz, um die Ködersonde mit einer Gesamtlänge bereitzustellen, die etwa der Gesamtlänge eines Amplifikationsoligonukleotides, das in einem Amplifikationsprotokoll verwendet wird (z.B., ±fünf Basen) nahe kommt.
B. Das Proteinbindungs-Amplifikationsprotokoll
Das Proteinbindungs-Amplifikationsprotokoll kann verwendet werden, um große Anzahlen eines Oligonukleotids, das ein Protein binden kann, auszuwählen und zu erzeugen. Bevorzugt wird das Protokoll mittels eines Amplifikationsenzyms, wie zum Beispiel einer RNA-Polymerase oder einer Reversen Transkriptase, durchgeführt. Verschiedene Techniken, die für das Durchführen des Proteinbindungs-Amplifikationsprotokolls nützlich sind, werden beschrieben von Gold et al., Anu. Rev. Biochem., 64: 763–797 (1995) und Uphoff et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 6: 281–288 (1996).
Das Proteinbindungs-Amplifikationsprotokoll kann unter Verwendung einer Sammlung von zwei oder mehr Oligonukleotiden, wobei jedes einen bekannten 3' Bereich, einen möglichen Protein-Bindungsbereich und einen bekannten 5' Bereich umfasst, durchgeführt werden. Der mögliche Protein-Bindungsbereich kann ein zufällig generierter Sequenzbereich sein.
Die Sammlung von Oligonukleotiden wird mit dem Protein kombiniert, um eine Proteinbindung zu ermöglichen. Proteinbindende Oligonukleotide werden dann von ungebundenen Oligonukleotiden abgetrennt. Die Abtrennung kann mittels verschiedener Techniken, wie zum Beispiel Immunopräzipitation unter Verwendung eines Antikörpers, der das Protein erkennt, erzielt werden.
Ein anderes Beispiel für eine Abtrennungstechnik verwendet ein Protein, das an eine Affinitätssäule gebunden ist, wobei Oligonukleotide, die nicht an das Protein gebunden sind, durch die Säule durchgewaschen werden, unter Bedingungen bei denen proteingebundene Oligonukleotide zurückgehalten werden. Die gebundenen Oligonukleotide können dann vom Protein abgetrennt werden.
Die Oligonukleotide, die an das Protein binden, werden mit einer zur Promotormatrize komplementären Sonde unter Bedingungen kombiniert, bei der ein doppelsträngiger Promotorbereich erzeugt wird. Die zur Promotormatrize komplementäre Sonde hybridisiert mit einem Abschnitt des bekannten 3' Endes des Oligonukleotids, gefolgt von der Bildung eines doppelsträngigen Promotors.
Ein doppelsträngiger Promotor kann durch verschiedene Techniken, wie zum Beispiel durch Hybridisierung mit einer komplementären Promotorsequenz oder durch Erzeugen einer komplementären Promotorsequenz mittels der Aktivität der DNA-Polymerase gebildet werden. Bevorzugt wird ein doppelsträngiger Promotor unter Verwendung einer DNA-Polymerase durch Verlängern des 3' Endes eines Oligonukleotids mittels der Promotorsequenz der zur Promotormatrize komplementären Sonde als Matrize erzeugt.
Das mit dem doppelsträngigen Promotor verbundene Oligonukleotid wird in einer transkriptionsgebundenen Amplifikationsreaktion verwendet, um mehrere RNA-Transkripte zu erzeugen. Die erzeugten Transkripte sind komplementär mit dem proteinbindenden Oligonukleotid.
Die RNA-Transkripte werden als Matrize zum Erzeugen von mehreren Kopien des proteinbindenden Oligonukleotids in Primer Verlängerungsreaktionen verwendet. Primer Verlängerungsreaktionen werden mittels eines Primers, der analog zum bekannten 5' Ende des Oligonukleotids ist (und daher komplementär zum 3' Ende des RNA-Transkripts) und einer DNA-Polymerase unter DNA-Polymerase Amplifikationsbedingungen durchgeführt. Bevorzugt ist die DNA-Polymerase eine Reverse Transkriptase. RNA, die in einer RNA:DNA Duplex vorhanden ist, kann unter Verwendung der Aktivität der Rnase H entfernt werden. Mehrere Zyklen können durchgeführt werden, um große Zahlen von Oligonukleotiden zu erzeugen, die an das Protein binden, und um hochaffinere Polymerase bindende Sequenzen auszuwählen.
C. Ködersondenkonstruktion
Ködersonden sind Nukleotidbasensequenz-Erkennungsmoleküle, die Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen umfassen, die durch ein Rückgrat miteinander verbunden sind. Die verschiedenen Untereinheiten der Ködersonde sollten es der Ködersonde ermöglichen, kompetitiv und reversibel an ein Amplifikationsenzym zu binden. Komponenten, die vermieden werden sollten, schließen die ein, die das Anbinden an ein Amplifikationsenzym verhindern und die eine irreversible Inhibition der enzymatischen Aktivität ergeben.
Eine gegebene Nukleotidbasen-Erkennungsgruppe, die in einem Nukleotidbasensequenz-Erkennungsmolekül vorhanden ist, kann zu einem bestimmten Nukleotid komplementär sein (z.B. Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin und Uracil) und daher in der Lage sein, eine Wasserstoffbrückenbindung mit dem Nukleotid auszubilden. Eine Nukleotidbasen-Erkennungsgruppe kann auch eine Wasserstoffbrückenbindung mit verschiedenen Nukleotiden ausbilden. Wenn zum Beispiel Inosin eine Nukleotidbasen-Erkennungsgruppe ist, kann es eine Wasserstoffbrückenbindung mit verschiedenen Nukleotidbasen ausbilden.
Bevorzugte Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen sind stickstoffhaltige Purin- oder Pyrimidinbasen oder Derivate davon, die entweder mit Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil eine Wasserstoffbrückenbindung ausbilden können. Beispiele für solche Erkennungsgruppen schließen Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil und Derivate davon ein. Beispiele von Derivaten schließen modifizierte Purin- oder Pyrimidinbasen, wie zum Beispiel N⁴-Methyldesoxyguanosin, Deaza- oder Azapurine und -Pyrimidine, die an Stelle von natürlichen Purin- und Pyrimidinbasen verwendet werden, Pyrimidinbasen mit substituenten Gruppen in der 5 oder 6 Position, und Purinbasen mit einem veränderten oder ersetzten Substituenten in der 2,6 oder 8 Position ein. Siehe, z.B. Cook, Internationale Anmeldungsnr. PCT/US92/11339, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 93/13121. Zusätzliche Beispiele schließen 2-Amino-6-methylaminopurin, O6-Methylguanin, 4-Thiopyrimidine, 4-Aminopyrimidine, 4-Dimethylhydrazinpyrimidine, O4-Alkylpyrimidine (siehe, z.B. The Glen Report, Volume 1(1993)) ein.
Ein Nukleotidbasensequenz-Erkennungsmolekül-Rückgrat kann aus verschiedenen Gruppen hergestellt werden. Beispiele für verschiedene Gruppen schließen zucker-phosphordiesterähnliche Rückgratgruppen und Peptidnukleinsäure-Rückgratgruppen ein.
Struktur I stellt ein zucker-phosphordiesterähnliche Rückgrat dar, in der die Zuckergruppe eine Pentofuranosyl-Gruppe ist. Die Zuckergruppen werden über eine Verknüpfung, wie zum Beispiel eine Phosphordiester-Verknüpfung, oder andere geeignete Verknüpfungen miteinander verbunden.
STRUKTUR I
X repräsentiert die Gruppe, die zwei Zucker miteinander verbindet. Beispiele für X schließen -OP(O)₂O-, -NHP(O)₂O-, -OC(O)₂O-, -OCH₂C(O)₂NH-, -OCH₂C(O)₂O-, -OP(CH₃)(O)O-, -OP(S)(O)O- und -OC(O)₂NH- ein. Wie bei den anderen hierin bereitgestellten Beispielen können andere Äquivalente, die im Stand der Technik gut bekannt sind oder die verfügbar wären, verwendet werden.
Y₁ und Y₂ sind unabhängig voneinander ausgewählte Gruppen. Beispiele für Y₁ und Y₂ schließen H, OH, C₁-C₄-Alkoxy, Halogen und C₁-C₆-Alkyl ein. Bevorzugt sind Y₁ und Y₂ unabhängig voneinander entweder H, OH, F oder OCH₃. C₁-C₆-Alkyl und C₁-C₄-Alkoxy können sein oder können Gruppen einschließen, die geradkettig, verzweigt oder zyklisch sind.
Base₁ und Base₂ werden unabhängig aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus: Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil oder einer Gruppe, die die komplementäre Basenpaarung einer benachbarten Base mit einer komplementären Nukleinsäure nicht inhibiert. Beispiele für Gruppen, die die komplementäre Basenpaarung nicht inhibieren, schließen kleinere Gruppen wie zum Beispiel Wasserstoff, OH, C₁-C₆-Alkyl und C₁-C₄-Alkoxy ein. In verschiedenen Ausführungsformen enthält die Nukleotidbasen-Erkennungssequenz wenigstens etwa 7 oder wenigstens etwa 10 und nicht mehr als etwa 40 oder etwa 30 Basen, die unabhängig ausgewählt werden aus der Gruppe, die besteht aus: Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin und Uracil.
R₁ und R₂ repräsentieren unabhängig voneinander ausgewählte Gruppen. Beispiele für R₁ und R₂ schließen zusätzliche zucker-phosphordiesterähnliche Gruppen, Wasserstoff, Hydroxy, Peptidnukleinsäure, Phosphat, Thiophosphat, C₁-C₆-Alkyl und Moleküle ein, die keine Sequenzinformation bereitstellen, wie zum Beispiel Polysaccharide, Polypeptide, Peptide und andere Nicht-Nukleotidverbindungen.
Derivate der Struktur I, die eine Komponente einer Nukleotidbasen-Erkennungssequenz sein können, sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen zum Beispiel Moleküle mit einem anderen Typ von Zucker ein. Zum Beispiel kann eine Nukleotidbasen-Erkennungssequenz Cyclobutylreste aufweisen, die durch Verknüpfungsreste verbunden sind, wobei die Cyclobutylreste heterozyklische Basen aufweisen, die daran gebunden sind. Siehe, z.B. Cook et al., Internationale Anmeldungsnr. PCT/US93/01579, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 94/19023.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Nukleotidbasen-Erkennungsmolekül ein Polynukleotid oder Derivat davon. Ein "Polynukleotid oder Derivat davon" ist ein Nukleotidbasen-Erkennungsmolekül, das aus Wiederholungseinheiten der Struktur I zusammengesetzt ist, wobei X -OP(O)₂O- ist; Y₁ und Y₂ werden unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, die aus H, OH, OCH₃ und F besteht; Base₁ und Base₂ werden unabhängig aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus: Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin und Uracil. Der terminale Bereich des Moleküls enthält R₁ und R₂, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus OH, C₁-C₆-Alkyl, Phosphat, Thiophosphat besteht.
Ein anderer Typ eines Nukleotidbasensequenz-Erkennungsmolekül-Rückgrates ist das, das in einer Peptidnukleinsäure vorhanden ist. Eine Peptidnukleinsäure in einem DNA-Analogon, wobei das Desoxyribosephosphatrückgrat durch ein Pseudopeptidrückgrat ersetzt ist. Eine Peptidnukleinsäure wird beschrieben von Hyrup und Nielsen, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 4: 5–23 (1996), und Hydig-Hielsen und Godskesen, Internationale Anmeldungsnr. PCT/DK95/00195, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 95/32305.
Bevorzugt wird die Peptidnukleinsäure aus N-(2-Aminoethyl) Glycin-Einheiten, wie in Struktur II dargestellt, zusammengesetzt.
STRUKTUR II
R₁, R₂ und Base₁ sind die, wie sie für Verbindungen der Struktur I beschrieben worden sind.
Nukleotidbasensequenz-Erkennungsmoleküle können unter Verwendung von Standardtechniken erzeugt werden. Veröffentlichungen, die die organische Synthese von Oligonukleotiden und modifizierten Oligonukleotiden beschreiben, schließen Eckstein, F., Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Kapitel 1–5 (1991), der die organische Synthese von Oligonukleotiden diskutiert; Caruthers et al., In Methods In Enzymology 154: 287 (1987), der ein Verfahren zur organischen Synthese von Oligonukleotiden mittels Standardphosphoramiditfestphasenchemie beschreibt; Bhatt, U.S. Patent Nr. 5,252,723, das ein Verfahren zur organischen Synthese von modifizierten Oligonukleotiden, die Phosphorthioat-Verknüpfungen enthalten, beschreibt und Klem et al., Internationale Veröffentlichungsnr. WO 92/07864, das die organische Synthese von modifizierten Oligonukleotiden mit verschiedenen Internukleosid-Verknüpfungen einschließlich Methylphosphonat-Verknüpfungen beschreibt, ein.
Zusätzliche Referenzen, die Techniken beschreiben, die zum Erzeugen verschiedener Typen von Nukleotidbasensequenz-Erkennungsmolekülen verwendet werden können, schließen Cook, Internationale Anmeldungsnr. PCT/US92/11339, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 93/13121; Miller et al., Internationale Anmeldungsnr. PCT/US94/00157, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 94/15619; McGee et al., Internationale Anmeldungsnr. PCT/US93/06807, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 94/02051; Cook et al., Internationale Anmeldungsnr. PCT/US93/01579, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 94/19023; Hyrup und Nielsen, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 4: 5–23 (1996) und Hydig-Hielsen und Godskesen, Internationale Anmeldungsnr. PCT/DK95/00195, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 95/32305 ein.
Ködersonden enthalten bevorzugt zwei Bereiche: (1) Einen ersten Bereich, der bevorzugt ein polymerasebindender Bereich oder ein promotorähnlicher Bereich ist; und (2) einen zweiten Bereich, der im Wesentlichen nicht komplementär zu einer in einem Amplifikationsprotokoll verwendeten Nukleinsäure ist.
In einer Ausführungsform umfasst der erste Bereich (a) ein Rückgrat, das eine oder mehrere Gruppen enthält, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einer oder mehreren Typen von Zucker-Phosphodiester-Gruppen und einer oder mehreren Peptid-Nukleinsäuregruppen besteht, und (b) wenigstens zehn Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen, die mit dem Rückgrat verbunden sind, wobei jede Erkennungsgruppe unabhängig mit wenigstens Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil eine Wasserstoffbrückenbindung ausbilden kann. In zusätzlichen Ausführungsformen sind wenigstens etwa 15, wenigstens etwa 20 oder wenigstens etwa 25 Erkennungsgruppen vorhanden.
In einer anderen Ausführungsform umfasst der zweite Bereich (a) ein Rückgrat, das eine oder mehrere Gruppen enthält, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einer oder mehreren Typen von Zucker-Phosphodiester-Gruppen und einer oder mehreren Peptid-Nukleinsäuregruppen besteht, und (b) wenigstens fünf Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen, die mit dem Rückgrat verbunden sind, wobei jede Erkennungsgruppe unabhängig mit wenigstens einem Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil eine Wasserstoffbrückenbindung ausbilden kann. In zusätzlichen Ausführungsformen sind wenigstens etwa 10, wenigstens etwa 15 oder wenigstens etwa 20 Erkennungsgruppen vorhanden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Ködersonde aus gegebenenfalls modifizierten Oligonukleotiden hergestellt. Gegebenenfalls modifizierte Oligonukleotide können veränderte Zuckergruppen, veränderte Phosphodiester-Verknüpfungen und/oder veränderte Stickstoffbasen enthalten. Bevorzugte Modifikationen schließen verschiedene Purin- oder Pyrimidinstickstoffbasen oder Derivate davon ein, die Wasserstoffbrückenbindungen entweder zu Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin ausbilden können; verschiedene Zuckerreste, wie zum Beispiel 2'Alkoxyribose, 2'Haloribose und Cyclobutyl; und verschiedene Internukleosid-Verknüpfungen, wie zum Beispiel Methylphosphonat und Phosphorthioat. Bevorzugt ist die 2'Alkoxyribose, falls vorhanden, 2'Methoxyribose und die 2'Haloribose ist, falls vorhanden, 2'Fluorribose.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Ködersonde, die einen ersten und einen zweiten Bereich enthält, aus 15 bis 100 gegebenenfalls modifizierten Nukleosiden und einer oder mehreren Blockiergruppen, die am 3'Terminus der Sonde angeordnet sind. Bevorzugt weist jedes der gegebenenfalls modifizierten Nukleoside unabhängig voneinander einen Purin- oder Pyrimidinrest auf, der unabhängig aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Inosin, Uracil, Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin; und einen Zuckerrest, der unabhängig aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Desoxyribose, 2'-Methoxyribose und Ribose besteht, auf; und jedes der gegebenenfalls modifizierten Nukleoside wird über eine Internukleosid-Verknüpfung, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Phosphordiester, Phosphorthioat und Methylphosphonat besteht, miteinander verbunden. Noch bevorzugter ist der erste Bereich an seinem 5' Ende bis zum 3' Ende des zweiten Bereichs durch eine Phosphordiester, Phosphorthioat, Methylphosphonat oder Polysaccharid-Gruppe kovalent verbunden. Noch bevorzugter enthält die Sonde 15 bis 75, am meisten bevorzugt 35–70 gegebenenfalls modifizierte Nukleoside.
In einer bevorzugteren Ausführungsform weisen wenigstens 80% der gegebenenfalls modifizierten Nukleoside einen Purin- oder Pyrimidinrest, der unabhängig aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin besteht, und einen Desoxyribosezuckerrest auf; und wenigstens 80% der Internukleosid-Verknüpfungen, die die gegebenenfalls modifizierten Nukleoside verbinden, sind Phosphordiester. Noch bevorzugter besteht die Sonde aus unabhängig ausgewählten Desoxyribonukleotiden und einer oder mehreren Blockiergruppen.
D. Ködersondenkonfigurationen
Ködersonden können mit einem ersten und einem zweiten Nukleotidbasen-Erkennungssequenzbereich mit verschiedenen Konfigurationen entworfen werden. Beispiele für verschiedene Konfigurationen schließen das 3' oder 5' Ende eines ersten Nukleinsäurebereichs ein, der direkt oder über einen Linker entweder an das 5' oder 3' Ende eines zweiten Nukleinsäurebereichs gebunden ist.
2A und 2B stellen Illustrationen von zwei verschiedenen Ködersondenkonfigurationen bereit. Der erste Nukleotidbasen-Erkennungssequenzbereich ist in den 2A und 2B unterstrichen. 2A stellt eine Ködersonde dar, in der ein 5' Ende des ersten Bereichs direkt mit einem 3' Ende eines zweiten Bereichs verbunden ist. 2B stellt eine Ködersonde dar, in der das 5' Ende des ersten Bereichs mit dem 5' Ende des zweiten Bereichs über einen Nicht-Nukleotid-Linker (dargestellt durch die gebogene Linie) verbunden ist. Die in den 2A und 2B gezeigten terminalen Propyl-Gruppen sind Blockiergruppen.
E. Blockiergruppen
Blockiergruppen sind chemische Reste, die einer Nukleinsäure zugefügt werden können, um die Nukleinsäurepolymerisation, die durch eine Nukleinsäurepolymerase katalysiert wird, zu inhibieren. Die Blockiergruppen sind für gewöhnlich an(m) den terminalen 3' Ende(n) einer Ködersonde, die aus Nukleotiden oder Derivaten davon zusammengesetzt ist, angeordnet. Durch Anbinden einer Blockiergruppe an das terminale 3' OH ist die 3' OH Gruppe nicht länger verfügbar, um ein Nukleosidtriphosphat in einer Polymerisationsreaktion zu akzeptieren.
Zahlreiche verschiedene Gruppen können zugegeben werden, um das 3' Ende einer Sondensequenz zu blockieren. Beispiele für solche Gruppen schließen Alkylgruppen, Nicht-Nukleotid-Linker, Phosphorthioate, Alkan-Diolreste, Peptidnukleinsäuren und Nukleotid-Derivate, denen ein 3' OH fehlt (z.B. Cordycepin) ein.
Eine Alkyl-Blockiergruppe ist ein gesättigter Kohlenwasserstoff mit einer Länge von bis zu 12 Kohlenstoffen, die geradkettig oder verzweigt sein können und/oder eine zyklische Gruppe enthalten können. Noch bevorzugter ist die Alkyl-Blockiergruppe C₂-C₆-Alkyl, die geradkettig oder verzweigt sein kann und/oder eine cyklische Gruppe enthält.
IV. AMPLIFIKATIONSVERFAHREN
Die vorliegende Erfindung kann in Verbindung mit verschiedenen Amplifikationsverfahren verwendet werden. Anwendbare Verfahren sind solche, die die Verwendung einer Nukleinsäurepolymerase einschließen. Durch Kombinieren einer Nukleinsäurepolymerase mit einem reversiblen Inhibitor, wie zum Beispiel einer Ködersonde, kann die Fähigkeit einer Polymerase, unerwünschte Produkte zu bilden, inhibiert werden.
Der Abschnitt "HINTERGRUND DER ERFINDUNG", siehe oben, stellt Beispiele von Amplifikationsverfahren bereit, die die Verwendung von DNA- und/oder RNA-Polymerasen einschließen. Geeignete DNA und/oder RNA-Polymerasen für das Durchführen dieser und anderer Amplifikationsverfahren, die eine Nukleinsäurepolymerisation einschließen, sind bereits verfügbar und schließen zum Beispiel die DNA-abhängigen DNA-Polymerasen, wie zum Beispiel die DNA-Polymerase I, T4 DNA-Polymerase, die Taq-Polymerase und das Exonuclease defiziente Klenow-Fragment; DNA-abhängige RNA-Polymerase, wie zum Beispiel die T7 RNA-Polymerase, T3 RNA-Polymerase und SP6 RNA-Polymerase; und die RNA-abhängigen DNA-Polymerasen, wie zum Beispiel die Avian Myeloblastis Virus (AMV) Reverse Transkriptase, Moloney Murine Leukemiavirus (MMLV) Reverse Transkriptase und HIV Reverse Transkriptase ein.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass sie ein Mittel zum Verringern unerwünschter Nebenprodukte unter isothermen Bedingungen bereitstellt. Dieser Vorteil ist besonders für verschiedene Protokolle, wie z.B. die transkriptionsgebundene Amplifikation und SDA geeignet, die unter Verwendung isothermer Bedingungen durchgeführt werden können. Der Abschnitt "HINTERGRUND DER ERFINDUNG", siehe oben, stellt verschiedene Formate bereit, die für das Durchführen einer transkriptionsgebundenen Amplifikation und SDA angewendet werden können. Beispiele der verschiedenen Formate schließen Burg et al., U.S. Patent Nr. 5,437,990, dass eine Beschreibung eines allgemeinen transkriptionsgebundenen Amplifikationsformates einschließt, und Kacian et al., U.S. Patent Nr. 5,399,491 ein, dass eine Beschreibung eines transkriptionsgebundenen Amplifikationsformates einschließt, dass die Verwendung der Aktivität der RNase H, die in einer Reversen Transkriptase vorhanden ist, um die Strangersetzung zu erzielen, beschreibt.
Zusätzliche Verfahren, die im Abschnitt "BACKGROUND OF THE INVENTION", siehe oben, beschrieben werden, schließen Kacian et al., U.S. Patent 5,554,516; Kacian et al., Internationale Anmeldungsnr. PCT/US93/04015, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 93/22461; Gingeras et al., Internationale Anmeldungsnr. PCT/US87/01966, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 88/01302; Gingeras et al., Internationale Anmeldungsnr. PCT/US88/02108, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 88/10315; Davey und Malek, Europäische Anmeldungsnr. 88113948.9, Europäische Veröffentlichungsnr. 0 329 822 A2; Malek et al., U.S. Patent Nr. 5,130,238; Urdea, Internationale Anmeldungsnr. PCT/US91/00213, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 91/10746; McDonough et al., Internationale Anmeldungsnr. PCT/US93/07138, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 94/03472; Ryder et al., Internationale Anmeldungsnr. PCT/US94/08307, Internationale Veröffentlichungsnr. WO 95/03430; Walker, PCR Methods and Applications, 3: 25–30 (1993); Walker et al., Nucleic Acids Res., 20: 1691–1696 (1992) und Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 392–396 (1991) ein.
Bevorzugt wird die Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz durchgeführt, indem man zuerst ein Amplifikationsenzym mit einem reversiblen Inhibitor des Enzyms in Abwesenheit von Amplifikationsoligonukleotiden, die mit einer Ziel-Nukleinsäure hybridisieren können, miteinander kombiniert. Nach dem Kombinationsschritt, wird das mit dem Inhibitor kombinierte Enzym dann in einer Amplifikationsreaktion verwendet.
Der erste Kombinationsschritt kann als ein Vor-Inkubationsschritt gedacht sein, der es dem reversiblen Inhibitor ermöglicht, an ein Amplifikationsenzym zu binden, oder ansonsten zu sequestrieren. Bevorzugt ist der reversible Inhibitor einer Ködersonde. Noch bevorzugter ist das Amplifikationsverfahren entweder eine transkriptionsgebundene Amplifikation oder SDA.
In einer bevorzugten Ausführungsform, die die transkriptionsgebundene Amplifikation betrifft, ist/sind das/die Amplifikationsenzym(e) eine RNA-Polymerase und/oder Reverse Transkriptase, und die Vorinkubation findet in Abwesenheit von zum Promotor-Ziel komplementären Oligonukleotiden statt. Noch bevorzugter findet die Vor-Inkubation in Abwesenheit sowohl von Primern als auch zum Promotor-Ziel komplementären Oligonukleotiden statt.
In bevorzugten Ausführungsformen, die auf eine SDA gerichtet sind, ist das Amplifikationsenzym eine DNA-Polymerase, der eine 5'-3' Exonucleaseaktivität fehlt, und die Vor-Inkubation findet in Abwesenheit von SDA-Amplifikationsoligonukleotiden statt.
BEISPIELE
Beispiele, die verschiedene Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung illustrieren, werden weiter unten bereitgestellt. Diese Beispiele sind nicht zur Begrenzung der beanspruchten Erfindung gedacht.
1. HIV-AMPLIFIKATIONSBEDINGUNGEN
Mit Ausnahme einer variierenden Ziel(Target)-Konzentration enthielten die Standard T7 HIV-Amplifikationsreaktionen 15 pMol/Reaktion eines T7 Promotor-Primers, 15 pMol/Reaktion eines analogen Primers, 35 mM KCl, 75 mM Tris-Cl pH 7.5, 9 mM HEPES pH 7,5, 20 mM MgCl₂, 1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 1 mM dTTP, 4 mM ATP, 4 mM CTP, 4 mM GTP, 4 mM UTP, 5% w/v PVP, 0,15 mM ZnOAc, 10% v/v Glycerol, 12,5 mM NaCl, 0,75 mM EDTA, 2,5% Triton^® X-102 (Sigma, St. Louis, MO), 0,0025% Phenol rot, 100–200 Epicentre-Einheiten einer Reversen Transkriptase (Epicentre Technologies Inc., Madison, WI) und etwa 500 Epicentre-Einheiten der T7 RNA-Polymerase (Epicentre Technologies Inc.) entweder in 20 μL oder 100 μL Reaktionsvolumen, soweit nicht anderes angegeben.
Standard T3 HIV-Amplifikationsreaktionen enthielten 15 pMol/Reaktion eins T3 Promotor-Primers mit 15 pMol/Reaktion eines analogen Primers, 35 mM KCl, 2,5 mM NaCl, 65 mM Tris-Cl pH 7,5, 20 mM MgCl₂, 1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 1 mM dTTP, 4 mM ATP, 4 mM CTP, 4 mM GTP, 4 mM UTP, 2,5% v/v Glycerol, 10 mM DTT, 0,25 mM EDTA, 0,0025% Triton^® X-100 (Sigma), 100–200 Epicentre-Einheiten der Reversen Transkriptase, Transkriptase (Epicentre Technologies Inc.), und 500 Epicentre-Einheiten der T3 RNA-Polymerase (Epicentre Technologies Inc.) entweder in 20 μL oder 100 μL Reaktionsvolumen, soweit nicht anders angegeben.
Für 100 μL Amplifikationsreaktionen (T7- oder T3-Amplifikationsreaktionen) wurden 25 μL des Amplifikationsreagenzes in individuelle Röhrchen aliquotiert, gefolgt von der Zugabe von 200 μL Mineralöl. Die Ziel-RNA (synthetisiert durch in vitro Transkriptionsreaktionen) wurde auf die entsprechende Kopienanzahl im Wasser verdünnt und in einem 50 μL Volumen zugegeben. Die Reaktionen wurden bei 60°C (in einem Trockenbadinkubator oder Wasserbad) für 10 min inkubiert, gefolgt von einer Inkubation bei 42°C für 5 min.
Fünfundzwanzig Mikroliter des Enzymreagenzes, das die Reverse Transkriptase und die T7 oder T3 RNA-Polymerase mit oder ohne Ködersonden enthält, wurden dann zugegeben und die Reaktionsröhrchen wurden bei 42°C für zusätzliche 60–90 min inkubiert, mit Ausnahme für die Experimente, mit denen die transkriptionsgebundenen Amplifikationskinetiken untersucht wurden, in denen die Reaktionen vorzeitig beendet wurden. Die Reaktionen wurden durch Zugabe des HPA-Sondenreagenzes beendet, was der anfängliche Schritt im Amplifikations-Detektionsverfahren war. Für 20 μL transkriptionsgebundene Amplifikationsreaktionen (T7 oder T3) wurden alle Reagenzien in einem fünftel Volumen, beschrieben, für 100 μL Reaktionen, zugegeben.
II. HPA-DETEKTION
Die Herstellung der Amplikons wurde durch Hybridisieren mit acridiniumestermarkierten Oligonukleotiddetektionssonden detektiert. (Siehe, z.B., Arnold et al., U.S. 5,283,174 , wird hiermit hierin aufgenommen). In einigen Beispielen wurden ein oder mehrere unmarkierte Helferoligonukleotide verwendet, um die Hybridisierung mit der Nukleinsäure, die die Ziel-Sequenz aufweist, zu erleichtern (siehe z.B., Hogan et al., U.S. Patent 5,030,557).
Die Hybridisierung der Detektionssonden wurde im HPA-Sondenreagenz durchgeführt, das aus 0,05 M Lithiumsuccinat, pH 5, 0,6 M Lithiumchlorid, 1% (w/v) Lithiumlaurylsulfat (LLS), 10 mM EDTA, 7,5 mM Aldrithiol und 10 mM EGTA bei 60°C für 10 min zusammengesetzt wurde. Das HPA-Sondenreagenz wurde normalerweise als 2×-Stammlösung, die die Detektionssonde enthielt, hergestellt und ein entsprechendes Volumen wurde zu jeder Amplifikationsreaktion zugegeben. Nach einer 10 min Hybridisierung bei 60°C wurden 300 μL (3×-Reaktionsvolumen) einer Lösung, die 0,15 M Natriumtetraborat, pH 8,5 und 1% Triton^® X-100 enthalten, zu jedem Röhrchen zugegeben und die Reaktionen wurden bei 60°C für zusätzliche 15 min inkubiert.
Die Detektion und Quantifizierung von Hybridmolekülen wurden mittels eines Luminometers durchgeführt (z.B., LEADER^TM 50; Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA). Das Luminometer injiziert automatisch zwei Reagenzien, wobei das erste aus 1 mM Salpetersäure und 1% Wasserstoffperoxid zusammengesetzt ist, und das zweite aus 1 N Natriumhydroxid zusammengesetzt ist. Die Reagenzien verursachen die Bildung von Chemilumineszenz von unveränderten Acridiniumestern, die in acridiniumestermarkierten Oligonukleotiden vorhanden sind. Die Assay-Ergebnisse wurden in relativen Lichteinheiten (RLUs), ein Maß für die Anzahl der Photonen, die durch das Luminometer detektiert wurden, angegeben.
III. NUKLEINSÄURESEQUENZEN
Die folgenden Nukleinsäuresequenzen sind Beispiele für Ködersonden, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Der fett gedruckte Abschnitt der SEQ. ID. NO: 8–13 betrifft promotorähnliche Sequenzbereiche. SEQ. ID. NO: 14 ist eine Zufallssequenz. Ködersonden, die in den unten beschriebenen Beispielen verwendet wurden, wurden am terminalen 3' OH durch eine n-Propyl-Gruppe blockiert.
Beispiel 1: Verwendung von Ködersonden in einer T7 Amplifikation
Ködersonden, die Sequenzen enthalten, die zu einem RNA-Polymerase nativen Promotor ähnlich oder mit diesem identisch sind, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Amplifikation unter Verwendung des T7 RNA-Polymerase transkriptionsgebundenen Amplifikationssystems zu verbessern. Ein Promotor-Primer und ein komplementärer Primer wurden in einer Standard transkriptionsgebundenen Amplifikationsreaktion (20 μL Volumen) verwendet, um 20 Kopien von HIV-Ziel-RNA in Gegenwart oder Abwesenheit von 10–20 pMol 3' blockierter Oligonukleotide der SEQ. ID. NO. 8, 9, 10 oder 14 zu amplifizieren.
Die bei den Reaktionen hergestellten Amplikons wurden durch HPA mit einer Acridiniumester markierten Detektionssonde bei einer Konzentration von 0,1 pMol pro Reaktion quantifiziert. Die Anzahl der Reaktionen, die eine positive Amplifikation ergaben, wurden aufgezeichnet. Eine Amplifikation war positiv, wenn ≥ 30,000 RLU während des HPA-Detektionsschrittes beobachtet wurden. Der RLU-Wert von 30.000 liegt über 30-fach über dem Hintergrundsignal und repräsentiert ein Minimum einer 10⁹-fachen Ziel-Amplifikation. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Tabelle 1. Zusammenfassung der Ergebnisse von Experimenten, die die Wirkung von verschiedenen Ködersonden auf die T7 transkriptionsgebundene Amplifikationsleistung unter Verwendung von 20 Kopien des Ziels (20 μL Reaktionsvolumen) untersuchen. Die Reaktionen wurden als positiv gewertet, wenn die RLUs ≥ 30,000 waren.
Eine höhere positive Rate ist äquivalent zu einer höheren Empfindlichkeit. Die besten Ergebnisse wurden mit der SEQ. ID. No: 10 Ködersonde erhalten, die eine Sequenz enthält, die mit einem T3 und T7 RNA-Polymerasepromotor ähnlich, jedoch nicht identisch ist. Die SEQ. ID. NO: 10 Ködersonde weist 16/23 Übereinstimmungen mit der T3 Konsensussequenz und 19/23 Übereinstimmungen mit der T7 Konsensussequenz auf. Die Positivrate erhöhte sich von 67% ohne Ködersonden auf 90% mit der SEQ. ID. NO: 10 Ködersonde. Reaktionen, die eine Ködersonde enthielten, die eine Konsensus-T7-Promotorsequenz (SEQ. ID. NO: 9) enthielten, erzeugten eine höhere Empfindlichkeit als Reaktionen ohne eine Ködersonde oder Ködersonden ohne eine promotorähnliche Sequenz, jedoch nicht so gute Reaktionen wie die SEQ. ID. NO: 10 Ködersonde.
Beispiel 2: Verwendung von Ködersonden in einer T3 Amplifikation
Ködersonden, die Sequenzen enthalten, die zu einem RNA-Polymerase nativen Promotor ähnlich oder mit diesem identisch sind, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Amplifikation im T3 RNA-Polymerase transkriptionsgebundenen Amplifikationssystem zu verbessern. T3 transkriptionsgebundene Amplifikationsreaktionen waren denen, in Bsp. 1 beschriebenen, ähnlich, mit der primären Ausnahme, dass ein T3 Promotor-Primer und eine T3 RNA-Polymerase verwendet wurden. 20 Kopien der HIV-Ziel-RNA wurden anfänglich vorgelegt (20 μL Reaktionsvolumen). Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Tabelle 2. Zusammenfassung der Ergebnisse von Experimenten, die die Wirkung von Ködersonden auf die T3 transkriptionsgebundene Amplifikationsleistung untersuchen. Die Identität und Quantität jeder Ködersonde, die zum T3 Enzym-Reagenz in 20 μL Reaktionsvolumen zugegeben wurde, wird dargestellt. Die Reaktionen wurden als positiv gewertet, wenn die RLUs bei ≥ 30,000 lagen.
Wie beim Beispiel 1 wurden die besten Ergebnisse mit der SEQ. ID. NO: 10 Ködersonde, die eine Sequenz enthält, die zu einem T3 oder T7 RNA-Polymerasepromotor ähnlich, jedoch mit diesem nicht identisch ist, erhalten. Reaktionen, die eine Ködersonde einschlossen, die eine T3 Promotorsequenz (SEQ. ID. NO: 8) oder die T7-Promotorsequenz (SEQ. ID. NO: 9) enthielten, erzeugten eine höhere Empfindlichkeit als Reaktionen ohne eine Ködersonde oder Ködersonden ohne eine promotorähnliche Sequenz.
Beispiel 3: Ködersondenlänge
Die Ködersondenlänge wurde unter Verwendung der Sonde der SEQ. ID. NO: 13, die eine veränderte Version der Sonde der SEQ. ID. NO: 10 ist, untersucht. Die Fähigkeit der Sonder der SEQ. ID. NO: 13 die Amplifikation zu verbessern, wurde mittels einer T7 Amplifikation und einer wie im Beispiel 1 beschriebenen Detektion gemessen. Tabelle 3 fasst die Ergebnisse zusammen. Ein Vergleich der Ergebnisse in Tabelle 2 und Tabelle 3 deutet daraufhin, dass die kürzere Sonde der SEQ. ID. NO: 13 die transkriptionsgebundene Amplifikationsleistung wesentlich verbessert, jedoch in einem geringerem Umfang als die SEQ. ID. NO: 10 Sonde.
Tabelle 3
Tabelle 3. Zusammenfassung der Ergebnisse von Experimenten, die die Wirkung einer veränderten Ködersonde auf die T7 transkriptionsgebundene Amplifikation untersuchen. 20 Kopien des HIV-RNA-Ziels wurden anfänglich in einem 20 μL Reaktionsvolumen vorgelegt. Die Reaktionen wurden als positiv gewertet, wenn die RLUs ≥ 30.000 waren.
Beispiel 4: Verwendung von Ködersonden und zusätzlichen Zielen
Dieses Beispiel bestätigt, dass die beobachtete Verbesserung der Amplifikation bei Verwendung von Ködersonden nicht auf einen bestimmten Typ von Ziel-Nukleinsäure begrenzt ist. T7 transkriptionsgebundene Amplifikationsreaktionen wurden unter Verwendung von 20 Kopien eines HCV-Ziels bei Bedingungen, die denen in Beispiel 1 für die T7 HIV transkriptionsgebundenen Amplifikationsreaktionen beschriebenen ähneln, durchgeführt. Die primäre Ausnahme zu den Amplifikationsbedingungen im Beispiel 1 war die Verwendung von HCV sequenzspezifischen Amplifikationsoligonukleotiden.
Die Reaktionen enthielten 18 pMol eines T7 Promotor-Primers zusammen mit 10 pMol/Reaktion analoger Primer und 20 Kopien des Ziels. Das in den Reaktionen erzeugte Amplikon wurde durch HPA, wie in Beispiel 1 beschrieben, quantifiziert, mit der Ausnahme, dass Acridiniumester markierte Sonden in einer Konzentration von jeweils 0,05 pMol pro Reaktion mit Helfersonden in einer Konzentration von jeweils 2,5 pMol pro Reaktion verwendet wurden.
Die Zugabe einer Ködersonde der SEQ. ID. NO: 10 zum Enzymreagenz verbesserte die Durchführung dieses Assays wesentlich. Der Prozentsatz an positiven Reaktionen, die 10 Kopien der HCV-RNA enthielten, erhöhte sich in Gegenwart der Ködersonden der SEQ. ID. NO: 10 von 78% (25/32) auf 100% (25/25).
Beispiel 5: Ködersondenkinetiken bei Verwendung von HCV und T7
Die Ködersonden erhöhten die Kinetiken der T7-HCV transkriptionsgebundenen Amplifikationsreaktionen. T7-HCV Reaktionen und die Detektion wurden wie in Beispiel 4 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Menge des erzeugten Amplikons als eine Funktion der Amplifikationszeit quantifiziert wurde. Das in den Reaktionen erzeugte Amplikon wurde durch HPA mit HCV-Sonden, wie im Beispiel 4 beschrieben, quantifiziert und das Ergebnis wurde als positiv gewertet, wenn ein Signal von 30.000 RLU oder mehr erhalten wurde. Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt.
Die Zugabe von 22 pMol/rxn der Ködersonde der SEQ. ID. NO: 10 zu 20 μL HCV transkriptionsgebundenen Amplifikationsreaktionen, die 20 Kopien der Ziel-RNA enthalten, erhöhte die Produktionsrate der Amplifikation. Zehn Minuten nach Zugabe des Enzymreagenzes waren 75% (30/40) der Reaktionen, die die Ködersonden enthielten, positiv (≥ 30.000 RLU), wobei nur 10% (4/40) der Reaktionen, denen die Ködersonden fehlten, positiv waren. Darüber hinaus lag nach einer 10 min Amplifikationszeit die durchschnittliche RLU für die Proben, die die Ködersonden enthielten, um das 4-fache höher (64,951 RLUs) als bei solchen ohne sie (16,317 RLU).
Beispiel 6: Ködersondenkinetiken unter Verwendung von HIV und T7
Dieses Beispiel illustriert die Fähigkeit von Ködersonden, die Kinetiken des T7-HIV transkriptionsgebundenen Amplifikationssystems zu verbessern. T7-HIV transkriptionsgebundene Amplifikationsreaktionen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit der Ködersonde SEQ. ID. NO: 10 durchgeführt. Amplifikation und Amplikon-Detektion wurden wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Die in 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass das durchschnittliche Signal sich in einer schnelleren Rate erhöhte als die durchschnittlichen RLU-Werte für die Probenpopulation.
Beispiel 7. Ködersondenkinetiken unter Verwendung von HIV und T3
Dieses Beispiel illustriert die Fähigkeit von Ködersonden, die Kinetiken des T3-HIV transkriptionsgebundenen Amplifikationssystems zu verbessern. T3-HIV transkriptionsgebundene Amplifikationsreaktionen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit der Ködersonde der SEQ. ID. NO: 10 durchgeführt. Die Amplifikation und Amplikon-Detektion wurden wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.
Die in 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass der Prozentsatz der positiven Reaktionen sich in einer schnelleren Rate erhöhte als die durchschnittlichen RLU-Werte für die Probenpopulation, wenn eine Ködersonde verwendet wurde.
Weitere Ausführungsformen liegen innerhalb der folgenden Ansprüche.
SEQUENZ PROTOKOLL

Claims

Eine gereinigte Ködersonde umfassend: einen ersten Nukleotidbasen-Erkennungssequenzbereich bestehend aus Nukleinsäure, wobei der erste Bereich mindestens 35% Sequenzähnlichkeit zu einer RNA-Polymerase Promotersequenz besitzt, die aus der Gruppe bestehend aus einer T7 RNA-Polymerase-Promotorsequenz, einer T3 RNA-Polymerase-Promotorsequenz und einer SP6 RNA-Polymerase-Promotorsequenz ausgewählt wird; und eine zweiter Nukleotidbasen-Erkennungssequenzbereich, der direkt mit dem 5' Ende des ersten Bereichs oder dem 3' Ende oder dem 5' Ende des ersten Bereichs über eine oder mehrere chemische Gruppe(n), die keine Nukleotidbasen-Erkennungsgruppe enthält/enthalten, die als Matrize in einer Polymerasereaktion dienen kann(können), verbunden ist(sind), wobei die chemische(n) Gruppe(n) unter Amplifizierungsbedingungen eine stabile Bindung bilden, vorausgesetzt, dass, wenn der erste Bereich verwendet werden kann, um eine funktionelle Doppelstrang-Promotersequenz unter Verwendung eines komplementären Oligonukleotids zu erzeugen, die Sonde dann keine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mehr als 10 Nukleotide besitzt, die direkt an das 3' Ende des ersten Bereichs gebunden ist, und die Sonde kein 3' Ende besitzt, das an einer Polymerasereaktion teilnehmen kann.
Die Sonde gemäß Anspruch 1, wobei der zweite Bereich direkt mit dem 5' Ende des ersten Bereichs verbunden ist, und wobei besagte Sonde keine Nukleinsäuresequenz, die länger als 10 Nukleotide ist, besitzt, die direkt mit dem 3' Ende verbunden ist.
Die Sonde gemäß Anspruch 1, wobei der zweite Bereich mit dem 5' Ende des ersten Bereichs über die eine oder mehrere chemische Gruppe(n) verbunden ist, und wobei besagte Sonde keine Nukleinsäuresequenz, die länger als 10 Nukleotide ist, besitzt, die direkt mit dem 3' Ende verbunden ist.
Die Sonde gemäß Anspruch 1, wobei der zweite Bereich mit dem 3' Ende des ersten Bereichs über die eine oder mehrere chemische Gruppe(n) verbunden ist.
Die Sonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der erste Bereich keine Nukleinsäuresequenz, die länger als 5 Nukleotide ist, besitzt, die direkt mit seinem 3' Ende verbunden ist, wenn der erste Bereich verwendet werden kann, um die funktionelle Doppelstrang-Promotersequenz zu erzeugen.
Die Sonde gemäß Anspruch 1, wobei der zweite Bereich aus Nukleinsäure besteht, und wobei das 3' Ende des zweiten Bereichs mit dem 3' Ende des ersten Bereichs über die eine oder mehrere chemische Gruppe(n) verbunden ist.
Die Sonde gemäß Anspruch 1, wobei der erste Bereich nicht verwendet werden kann, um besagte funktionelle Doppelstrang-Promotersequenz zu erzeugen.
Die Sonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der zweite Bereich einen zu sich selbst komplementären Bereich einschließt, die eine Stammschleifen-Struktur erzeugt.
Die Sonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Sonde keine Sequenz enthält, die im Wesentlichen zu einer Ziel-Nukleinsäuresequenz komplementär ist.
Die Sonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, ferner umfassend Blockiergruppen, die an dem/den 3' terminalen Ende(n) der Sonde lokalisiert sind.
Die Sonde gemäß Anspruch 1, wobei die Sonde aus 15 bis 100 unabhängig ausgewählten Desoxyribonukleotiden und einer oder mehreren Blockiergruppe(n), die am 3' Terminus der Sonde lokalisiert ist/sind, besteht.
Die Sonde gemäß Anspruch 10 oder 11, wobei die Blockiergruppen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Phosphorthioat, Alkan-Diol-Resten, Cordycepin und einer Alkyl-Gruppe besteht.
Die Sonde gemäß Anspruch 1, wobei die Sonde aus 35 bis 70 unabhängig ausgewählten Nukleotiden und einer oder mehreren Blockiergruppe(n), die am 3' Terminus der Sonde lokalisiert ist/sind, besteht, wobei die Blockiergruppen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Phosphorthioat, Alkan-Diol-Resten, Cordycepin und einer Alkyl-Gruppe besteht, und wobei der zweite Bereich mindestens 10 Nukleotide umfasst.
Die Sonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die RNA-Polymerase-Promotorsequenz die T7 RNA-Polymerase-Promotorsequenz ist, und wobei der erste Bereich eine Sequenzähnlichkeit von mindestens 50% zu der T7 RNA-Polymerase-Promotorsequenz aufweist.
Die Sonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die RNA-Polymerase-Promotorsequenz die T3 RNA-Polymerase-Promotorsequenz ist, und wobei der erste Bereich eine Sequenzähnlichkeit von mindestens 50% zu besagter T3 RNA-Polymerase-Promotorsequenz aufweist.
Die Sonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die RNA-Polymerase-Promotorsequenz besagte SP6 RNA-Polymerase-Promotorsequenz ist, und wobei der erste Bereich eine Sequenzähnlichkeit von mindestens 50% zu der SP6 RNA-Polymerase-Promotorsequenz aufweist.
Die Sonde gemäß Anspruch 1, wobei der erste Bereich eine Nukleotidbasen-Sequenzähnlichkeit von mindestens 75% zu mindestens einer der SEQ ID No: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 aufweist.
Die Sonde gemäß Anspruch 17, wobei der erste Bereich eine Nukleotidbasen-Sequenzähnlichkeit von 75 bis 95% zu SEQ ID NO: 3 aufweist.
Ein Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-Nukleinsäuresequenz unter Bedingungen für die transkriptionsgebundene Amplifikation umfassend die Schritte: (a) Herstellen einer Mischung umfassend eine RNA-Polymerase und die Ködersonde gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Ködersonde unter den Amplifikationsbedingungen nicht mit einer Ziel-Nukleinsäure, die die Ziel-Nukleinsäuresequenz umfasst, hybridisiert, und wobei die Mischung die Ziel-Nukleinsäure nicht enthält; (b) Kombinieren der Mischung mit der Ziel-Nukleinsäuresequenz und den Amplifikationsoligonukleotiden, die in der Lage sind, besagte Ziel-Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren; und (c) Amplifizieren der Ziel-Nukleinsäuresequenz unter den Amplifizierungsbedingungen, wobei der Amplifizierungsschritt unter Verwendung der Amplifikationsoligonukleotide und der RNA-Polymerase ausgeführt wird; wobei vor Schritt (b) keine Amplifikationsoligonukleotide, die in Schritt (b) mit der Mischung kombiniert werden, in der Mischung vorhanden sind, und wobei die Amplifikationsoligonukleotide und die Ködersonde um die Bindung an der RNA-Polymerase konkurrieren.
Das Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das Verfahren unter isothermen Bedingungen durchgeführt wird.