DE69636080T2

DE69636080T2 - Eine in Kaskaden verlaufende Vervielfältigungsreaktion von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69636080T2
Application number: DE69636080T
Authority: DE
Inventors: Erland Jorn Koch
Original assignee: Individual
Current assignee: Olink AB
Priority date: 1995-12-05
Filing date: 1996-12-05
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2016-12-06
Also published as: DE69636080D1; ATE324464T1; EP1300466B1; WO1997020948A1; EP1300466A3; EP0868530A1; ATE238434T1; AU7691796A; DE69627698T2; CA2239287A1; ES2262902T3; DK0868530T3; CA2239287C; US20020031764A1; AU704750B2; DE69627698D1; DK1300466T3; EP0868530B1; US6610481B2; EP1300466A2

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von DNA, welche aus mehreren Tandemwiederholungen einer Oligonukleotideinheit zusammengesetzt ist, wobei in einer Reaktionskaskade einer Nukleinsäure-Amplifikation/-Vermehrung eine große Anzahl teilweiser und vollständiger DNA- oder RNA-Kopien davon erzeugt werden. Die Erfindung betrifft weiter den Einsatz dieser Reaktionen in einem Nachweisverfahren eines Zielmoleküls oder einer Gruppe an einer spezifischen Stelle und einem Verfahren zur Vermehrung einer bestimmten DNA-Sequenz.
Die wohlbekannte Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) stellt ein Verfahren zur Vermehrung einer beliebigen spezifischen Nukleinsäuresequenz dar, die in einer Nukleinsäure oder einem Nukleinsäurengemisch beinhaltet ist. Im Allgemeinen umfasst der Vorgang eine Kettenreaktion, um irgendeine spezifische Nukleinsäuresequenz in exponentiellen Mengen relativ zu der Anzahl der umfassten Reaktionsschritte herzustellen, vorausgesetzt, dass (a) die Sequenzenden in ausreichender Genauigkeit bekannt sind, so dass zwei Oligonukleotidprimer synthetisiert werden können, die an sie hybridisieren werden, und, dass (b) eine kleine Menge der Sequenz verfügbar ist, um die Kettenreaktion in Gang zu bringen. Das Verfahren umfasst Umsetzen getrennter komplementärer Stränge der Nukleinsäure mit einem molaren Überschuss zweier Oligonukleotidprimer, und Erweitern bzw. Verlängern der Primer in der Anwesenheit einer Nukleinsäurepolymerase und der vier erforderlichen Nukleosidtriphosphate, um komplementäre Primererweiterungs- bzw. Primerverlängerungsprodukte zu bilden, die als Matrizen zum Synthetisieren der spezifischen Nukleinsäuresequenz wirken. Werden die komplementären Stränge der Nukleinsäure, beispielsweise durch Erhitzen, getrennt, dann sind die Stränge für die Synthese komplementärer Stränge durch Primererweiterung verwendungsbereit, wodurch die Kopienanzahl der spezifischen Nukleinsäuresequenz verdoppelt wird. Die Schritte einer Strangtrennung und Erweiterungsproduktsynthese können so häufig wie erforderlich wiederholt werden, um die gewünschte Menge der spezifischen Nukleinsäuresequenz zu erzeugen. Dieses grundlegende Verfahren wird in der US-P-4,683,202 beschrieben und beansprucht, wobei Varianten davon in den zugehörigen US-P-4,683,195 und 4,800,159 beschrieben und beansprucht werden.
Eine Variante der PCR-Technik wurde durch Becton Dickinson beschrieben, in der das Thermozyklisieren durch eine enzymatische Zerstörung der Primer ersetzt wurde, wobei die ursprünglich die Primer bindende Zielsequenz befreit wird, so dass ein neuer Primer gebunden werden kann (EP 0 497 272 A1, EP 0 500 224 A2, EP 0 543 612 A2). Nach Binden des zweiten Primers an die Zielsequenz wird, da der zweite Primer verlängert ist, das durch Kettenverlängerung von dem ersten Primer erzeugte Produkt durch Strangverdrändung entfernt. Ähnlich der PCR wird bei dieser Reaktion Primer-Annealing an beide Enden eines biologischen DNA-Moleküls mit dem Zweck verwendet, dass die dazwischen liegende biologische Sequenz vermehrt wird. Dies ist unterschiedlich zu der vorliegenden DNA-Kaskade, die auf Primern beruht, die sich entlang der Länge einer tandemartig wiederholt zusammengesetzten Sequenz (bezeichnet als "Polymer") reassoziiert.
Eine Strangverdrängung ist ebenfalls in anderen DNA-Techniken enthalten, wie die gewöhnlich verwendete Oligolabelling-Technik bzw. Feinberg-Vogelstein Technik von Hybridisierungssonden. Bei diesem Ansatz jedoch kann die gesamte vorhandene DNA als Matrize für die Reaktion dienen. Die ist unterschiedlich zu der vorliegenden DNA-Kaskade, die auf eine spezifische vorgewählte Matrize beschränkt ist.
PRINS-Reaktionen können, wie durch diesen Erfinder beschrieben und durch Boehringer Mannheim patentiert, ebenfalls durch eine Strangverdrängungs-DNA-Synthese verstärkt werden, nachdem bereits verlängerte Primer zerstört sind. Ähnlich wie die Becton Dickinson-Reaktion, erzeugt diese mehrere Kopien einer biologischen Zielsequenz, wobei sie jedoch nicht die Eigenschaften der vorliegenden DNA Reaktionskaskade aufweist.
J. W. IJdo et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19 (17) (1991), 4780, berichten die schnelle Erzeugung einer menschlichen Telomerwiederholungssequenz (TTAGGG)_n mit Fragmentgrößen bis zu 25 kb unter Verwendung einer der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) verwandten Technik. Die Reaktion wird in der Abwesenheit einer Matrize unter Verwendung von Primern (TTAGGG)₅ und (CCCTAA)₅ ausgeführt. Ein versetztes Annealen der Primer stellt eine einzelsträngige Matrize für die Erweiterung durch die Taq-Polymerase bereit. Die Primer dienen in den frühen Zyklen sowohl als Primer als auch als Matrize, wohingegen die neu gebildeten Sequenzen in den nachfolgenden Stufen der Reaktion als Primer und Matrize dienen, was zu einer heterogenen Population von Molekülen führt, die aus Wiederholungsarrays verschiedener Längen bestehen.
Die synthetisierte DNA wird lediglich als eine Sonde zur Hybridisierung verwendet, wobei der Ansatz somit als eine Alternative für andere Verfahren zum Markieren von Hybridisierungssonden (ähnlich einer End-Markierung und einem Ansynthetisieren bzw. Anhängen) dient. Unterschiedlich zu dem hier beschriebenen Ansatz wird kein überschüssiger kurzer Primer zu den erhaltenen Polymeren gegeben, um eine Reaktionskaskade freizusetzen bzw. einzuleiten.
Ein allgemein verwendetes Verfahren zur Zufallsvermehrung menschlicher DNA, wird Alu-PCR genannt. Dieser Ansatz nutzt die Tatsache, dass das menschliche Genom bestimmte eingestreute bzw. dazwischen liegende Wiederholungselemente, Alu-Wiederholungen genannt, beinhaltet. Diese sich sehr ähnlichen Elemente werden durchschnittlich einmal jede ca. 10 Kb der menschlichen genomischen DNA aufgefunden. Obwohl der tatsächliche Abstand zwischen zwei benachbarten Alu-Elementen entlang des Genoms signifikant unterschiedlich ist, sind die meisten dieser Elemente ausreichend nahe zu ihren Nachbarn angeordnet, um eine Vermehrung der dazwischen liegenden nicht-Alu Sequenz nach Hybridisierung von Primern an die Alu-Sequenz durch PCR zu ermöglichen.
Ein ähnlicher Ansatz für den Nachweis von Rinder-Encephalitis-Viren durch PCR (WO 93/04198 A1) wurde durch die Britisch Technology Gruppe Ltd beschrieben. In diesem Fall umfasst die dazwischen liegende Wiederholung eine sechs Basenmomomere beinhaltende tandemartig wiederholte Sequenz, wobei jede eine Sequenz einer Dyadensymmetrie aufweist. Folglich besteht die Möglichkeit die dazwischen liegenden Sequenzen vielmehr unter Verwendung von lediglich einem Primer (der an beide Stränge bindet) zu vermehren als der in anderen PCR-Typen, wie der Alu-PCR, verwendeten zwei Primer. Die Tatsache, dass die durch diese Technik ermittelte natürlich vorkommende Wiederholung eine Dyadensymmetrieeinheit aufweist, führt dazu, dass sie eine mögliche Ähnlichkeitswahrscheinlichkeit mit einer Variante des durch die hier beschriebenen Reaktionen synthetisierten Polymers aufweist. In derartigen Fällen, in denen die dazwischen liegenden Sequenzen ausreichend kurz sind, sollte die Rindervirus-DNA somit als die Matrize für eine DNA-Kaskade dienen können. Eine derartige Möglichkeit wird jedoch in dem Patent der British Technology Gruppe nicht erkannt, das sich lediglich auf PCR als die sich ergebende Vermehrungsreaktion bezieht. Die Ähnlichkeitswahrscheinlichkeiten setzen ebenfalls voraus, dass sowohl bei dem Rindervirustest als auch einigen Varianten der DNA-Kaskade von Primern mit einer Dyadensymmetrie Gebrauch gemacht wird. Wohingegen diese Primer bei der DNA-Kaskade dazu verwendet werden, um ein Moleküle zusammenzusetzen und auf dem zusammengesetzten Molekül zu wirken, sind jedoch die Primer bei dem Rinder-Encephalitis-Test lediglich als Sonden für den diagnostischen Nachweis bestimmter natürlich vorkommender DNA-Moleküle vorgesehen.
In der japanischen nicht geprüften Patentanmeldung, Veröffentlichungsnr. 04-262799, die Toyobo Co. LtD. gehört, beschrieben Toshiya & Yutaka die Bildung eines Polymers von einem ringförmigen DNA-Molekül, das dem ähnlich ist welches als Ausgangsmaterial für die vorliegende DNA-Kaskade verwendet wurde. Der DNA-Ring wird erhalten, in dem ein gestaltetes lineares DNA-Molekül an ein biologisches DNA-Molekül, unter Verwendung der Zirkularisierung als ein Test für die Anwesenheit des relevanten biologischen Moleküls, zirkularisiert wird. Nach Zirkularisierung des Testmoleküls wird ein drittes DNA-Molekül zugegeben, das an den Teil des Testmoleküls binden kann, der nicht mit dem biologischen Molekül hybridisiert. Dieses dritte Molekül dient anschließend als ein Primer für eine rollende-Kreis-Replikation des zirkularisierten Testmoleküls, wobei somit ein von diesem abgeleitetes Tandemwiederholungspolymer gebildet wird. Bei diesem Ansatz ist nicht vorgesehen, dass das so erzeugte Polymer als das Ausgangsmaterial für eine DNA-Kaskade verwendet werden könnte. Weder wird vorgeschlagen, dass das Zirkularisierungsverfahren an dem 3'-Ende des biologischen Moleküls positioniert werden könnte, so dass dieses Ende als ein Primer für die rollende-Kreis-Replikation verwendet werden könnte, wobei die Notwendigkeit für die Zugabe eines dritten DNA-Moleküls diese zu starten bzw. zu initiieren, beseitigt wird, noch dass die Reaktion umgekehrt werden könnte, so dass es das biologische Molekül ist, welches zirkularisiert wird.
Bis jetzt wurden sehr erfolgreiche Techniken zur enzymatischen Vermehrung von DNA entwickelt, um Nukleinsäuresequenzen biologischen Ursprungs zu vermehren, so dass Untersuchungen von oder mit diesen Sequenzen ermöglicht werden. Die vorliegende Erfindung stellt einen Test auf die Anwesenheit eines biologischen Moleküls bereit, der den Nachweis des biologischen Moleküls durch dessen Fähigkeit umfasst, als eine Matrize für eine Zirkularisierung und Ligation eines linearen Oligonukleotids, das zu ihm zugegebenen wurde, zu dienen, wobei das entstandene ringförmige Oligonukleotid als eine Matrize für ein endlos-kopierendes Verfahren in Anwesenheit der notwendigen Nukleosidtriphosphate mit Hilfe einer Nukleinsäurepolymerase, die zur Strangverdrängung fähig ist und im Wesentlichen keine 5'-3'-Exonukleaseaktivität aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrize für die Bildung des ringförmigen Oligonukleotids auch das 3'-Ende bereitstellt, das zur Polymerbildung durch rollende-Kreis-Replikation des zirkularisierten Oligonukleotids benötigt wird.
Der Test gemäß der beanspruchten Erfindung kann weiterhin eine DNA-Kaskadenreaktion als einen zusätzlichen Nachweisschritt umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Strategie bereit, die als eine "DNA-Kaskade" bezeichnet wird, die darin besteht, synthetische DNA zu vermehren. Das Vermehrungsverfahren kann anschließend zusätzlich als ein Marker bei biologischen Analysen verwendet werden, und um Nukleinsäuresequenzen biologischen Ursprungs mitzuvermehren.
Die DNA-Kaskade ist eine Technik zur Herstellung mehrerer teilweiser oder vollständiger Kopien einer vorgeformten Matrize. Dies wird nach dem anfänglichen Zusammenbau ("lineare Multiplikationsreaktion", Phase 1) einer geeigneten Matrize erreicht, die mehrere Tandemwiederholungen einer Oligonukleotideinheit umfasst, wobei jede von denen per se als ein spezifischer Startpunkt für den Kopiervorgang (die "Kaskadenvermehrungsreaktion", Phase 2) dienen kann.
Die Matrize für die Kaskadenreaktion kann aus zwei komplementären Oligonukleotiden mit einer internen Wiederholungseinheit in einer ähnlichen Weise zu der durch J. W. IJdo et al., loc. cit. beschrieben, aufgebaut werden.
Die Matrize wird jedoch am einfachsten durch einen neues erfindungsgemäßes Verfahren von einem Oligonukleotid erzeugt, das mindestens eineinhalb und vorzugsweise zwei Einheiten einer Nukleotidsequenz umfasst, die Dyadensymmetrie zeigt.
Dieses Verfahren umfasst wiederholte Denaturierung und Annealingereignisse, so dass das Oligonukleotid durch eine primerunterstützte Synthese, die durch eine DNA-Polymerase in der Anwesenheit der notwendigen Nukleosidtriphosphate katalysiert wird, schrittweise wachsen kann.
Diese wiederholte Denaturierung und dieses Annealing kann, wie in Beispiel 1 erläutert, durch Thermozyklisieren erreicht werden, könnte jedoch ebenfalls durch andere Mittel erreicht werden. Eine Möglichkeit bestünde darin, das(die) Oligonukleotid(e) an dem Schmelzpunkt deren Duplexform (oder leicht oberhalb dieser Temperatur) zu inkubieren. Dies würde zu einem statistischen Gleichgewicht führen, bei dem eine Fraktion der Moleküle zu einer beliebigen Zeit eine Kettenverlängerung, und somit Polymerwachstum unterstützen könnten. Bei einem derartigen Aufbau würde der periodische Temperaturdurchlauf (temperatur cycling) durch einen Temperaturgradienten ersetzt, der die Moleküle drängt länger und länger zu werden, um sich an die zunehmende Inkubationstemperatur anzupassen. Der Vorteil des Gradientenansatzes besteht darin, dass er keine Inkubationen bei hohen Temperaturen erfordert, insbesondere nicht, wenn die gewählten DNA-Sequenzen reich an Adenin und Thymin sind. Die Vermeidung hoher Inkubationstemperaturen kann von Vorteil sein, wenn während die Oligonukleotide an spezifischen Nachweisreagenzien, wie Avidin oder Antikörpern, angefügt sind, die Polymerbildung durchgeführt wird, da derartige Moleküle hohe Temperaturen wenig tolerieren.
Eine erste Ausführungsform stellt somit ein Verfahren zur Herstellung von DNA bereit, die mehrere Tandemwiderholungen einer Oligonukleotideinheit beinhaltet, wobei ein Oligonukleotid, das mindestens eineinhalb Einheiten einer Dyadensymmetrie zeigenden Nukleotidsequenz umfasst, in der Gegenwart der notwendigen Nukleosidtriphosphate während wiederholter Zyklen von Denaturierung und Annealing mit Hilfe einer Matrizen und Primer abhängigen DNA-Polymerase schrittweise kopiert wird, wobei die Kettenverlängerung zu jedem Zeitpunkt stattfindet, an dem das Annealing zu einer rasterverschobenen Hybridisierung führt, was zu Duplexen mit begrabenen 3'-Enden führt.
Die Basensequenz in dem Oligonukleotid könnte entsprechend der individuellen Notwendigkeiten frei gewählt werden, um jedoch an dem Polymerisationsverfahren teilnehmen zu können, muss das Oligonukleotid aus mindestens eineinhalb Kopien der Sequenz bestehen, die als die Wiederholungseinheit des Polymers vorgesehen ist. Weiterhin kann es wünschenswert sein das Oligonukleotid derart zu gestalten, dass es Wiederholungen einer Sequenz beinhaltet, die Dyadensymmetrie zeigt, da dies die Sequenz zu sich selbst komplementär macht und die Notwendigkeit des Einschlusses eines zweiten (komplementären) Oligonukleotids in das Polymerisationsverfahren beseitigt. Somit würde die kürzeste sich wiederholende Einheit, die eine Dyadensymmetrie zeigt, zwei komplementäre Basen, beispielsweise die Sequenz "AT" aufweisen. Eineinhalb Einheiten dieser Sequenz wäre "ATA", wobei das kürzeste Oligonukleotid, das für sich allein als ein Substrat für die Polymerisation dienen kann, somit ein drei Basen umfassendes Oligonukleotid wie "ATA" darstellen würde. Es kann jede sich wiederholende Dyadensymmetrieeinheit, die mehr als zwei Basen umfasst und jede Anzahl von Dyadensymmetrieeinheiten, die größer als eineinhalb sind, ebenfalls gewählt werden, wobei die einzige Beschränkung in den technischen Beschränkungen bezüglich der Größe des Oligonukleotids besteht, die durch das verwendete Verfahren auferlegt werden, um die Oligonukleotide herzustellen. Vorzugsweise umfasst das Ausgangsoligonukleotid mindestens zwei Einheiten der Nukleotidsequenz, die Dyadensymmetrie zeigt.
In einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung der Matrize, umfasst die Dyadensymmetrie zeigende Nukleotidsequenz, die Promotorregion für ein Enzym, das ohne die Notwendigkeit für einen Primer und die komplementäre Wiederholung der Region eine Matrizen abhängige DNA oder RNA-Synthese ausführen kann. Die Anwesenheit einer derartigen Promotorregion in jeder Oligonukleotideinheit der Matrize kann, wie nachfolgend erklärt wird, bei der Ausführung der anschließenden Kaskadenphase vorteilhaft sein.
In einer anderen besonderen Ausführungsform des vorstehend erwähnten Verfahrens wird jede zu vermehrende Nukleotidsequenz in dem Ausgangsnukleotid zwischen die Kopien der Dyadensymmetrie zeigende Nukleotidsequenz eingefügt. Falls eine derartige eingefügte Nukleotidsequenz die Promotorregion für ein Enzym umfasst, dass eine Matrizen abhängige DNA oder RNA Synthese ohne die Notwendigkeit für einen Primer ausführen kann, dann wird das gleiche Ergebnis, wie in der vorstehenden ersten besonderen Ausführungsform, erhalten.
Eine Nukleinsäurematrize, die aus mehreren Tandemwiederholungen einer Oligonukleotideinheit zusammengesetzt ist, kann ebenfalls durch ein anderes erfindungsgemäßes neues Verfahren hergestellt werden, das eine Zirkularisierung eines Oligonukleotids umfasst, so dass es kein Ende aufweist und somit als eine Matrize für ein endlos-kopierendes Verfahren wirken kann, das durch ein Enzym katalysiert wird, das vielmehr DNA oder RNA verdrängt als verdaut, die den Teil des ringförmigen Oligonukleotids besetzen, den es im Begriff ist zu kopieren, wodurch ein großes Molekül hergestellt wird, dass ein Multimer des Oligonukleotids ist.
Eine zweite Ausführungsform stellt somit ein Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure bereit, die aus mehreren Tandemwiederholungen einer Oligonukleotideinheit zusammengesetzt ist, wobei ein ringförmiges Oligonukleotid, das mindestens eine Kopie der Einheit umfasst, in Anwesenheit der notwendigen Nukleosidtriphosphate mit Hilfe einer Nukleinsäure-Polymerase, die eine Strangverdrängung ausführen kann und im Wesentlichen keine 5'-3'-Exonukleaseaktivität aufweist, als eine Matrize für ein endlos-kopierendes Verfahren verwendet wird und falls notwendig einen Primer, der an irgendeinen Abschnitt des Oligonukleotids binden kann.
Das Zirkularisierungsverfahren kann zweierlei Art sein, da die Reaktion so gestaltet sein kann, dass jeder von den zwei Strängen an dem anderen zirkularisiert werden kann. Falls eine synthetische Sequenz und ein biologische Sequenz verwendet werden, kann somit gewählt werden die biologische Sequenz an die synthetische Sequenz oder die synthetische Sequenz an die biologische Sequenz zu zirkularisieren, wobei alles von der Gestaltung des Experiments abhängt. In ähnlicher Weise kann der zu zirkularisierende Strang entweder an das 3'-Ende des Matrizenstrangs zirkularisiert werden, so dass dieser ebenfalls als Primer für die Polymerbildung dienen kann, oder es kann die Zirkularisierung von dem 3'-Ende der Matrize weg ausgeführt werden, so dass die Zugabe eines zusätzlichen Primers für die rollende-Kreis-Replikation notwendig würde.
Wird eine Polymerase verwendet, die eine Matrizen und Primer abhängige DNA oder RNA-Synthese ausführen kann, dann wird das Kopieren von einem Primer gestartet, der an irgendeinen Abschnitt des ringförmigen Oligonukleotids bindet.
Mit Blick auf eine anschließende Kaskadenreaktion ist die Polymerase vorzugsweise eine Matrizen und Primer abhängige DNA-Polymerase, wobei es von Vorteil sein kann, dass das ringförmige Oligonukleotid eine Dyadensymmetrie zeigende DNA-Sequenz umfasst, und wobei der Primer die gleiche DNA-Sequenz aufweist.
Wird eine Matrizen-abhängige RNA-Polymerase ohne die Notwendigkeit eines Primers verwendet, dann wird das Kopieren von einer Promotorregion gestartet, die in das ringförmige Oligonukleotid eingefügt ist und durch die Polymerase erkannt wird.
In dem Fall ist es, falls es wünschenswert ist eine anschließende Kaskadenreaktion auszuführen, notwendig mit Hilfe einer reversen Transkriptase und einem DNA-Primer aus dem erhaltenen RNA-Multimer ein DNA-Multimer herzustellen.
Zu Zwecken eines Überwachens der linearen Multiplikationsreaktion und Ermittelns des Multimerprodukts kann es nützlich sein, das die vorhandenen Nukleosidtriphosphate markiert sind. Eine derartige Markierung kann beispielsweise ein Enzym, ein radioaktives Isotop, eine fluoreszierende Verbindung, eine chemilumineszierende Verbindung, eine bioluminineszierende Verbindung, ein Metallchelat oder ein Hapten sein, das durch eine spezifische Sekundärreaktion nachweisbar ist.
Die Kaskadenvermehrungsreaktion umfasst ein Kopieren der Matrize in einem Enzym katalysierten Verfahren, welche von mehreren Wiederholungseinheiten der Matrize herrührt, wodurch ermöglicht wird, dass mehrere Kopien irgendeines Segments der Matrize hergestellt werden können. Um dies zu erreichen ist es notwendig Enzyme zu verwenden, die vielmehr die DNA oder RNA verdrängen, die den Teil der Matrize besetzen, den sie im Begriff sind zu kopieren, als verdauen. Da die Sequenzen der hergestellten Kopien sowohl identisch als auch komplementär sind, können sie aggregieren, um große Komplexe mit einer abnehmenden Beweglichkeit relativ zu den einzelnen Molekülen zu bilden.
In einer zweiten Ausführungsform stellt demgemäß die vorliegende Erfindung eine Kaskadennukleinsäurevermehrungsreaktion bereit, bei der eine große Anzahl von teilweisen und vollständigen DNA oder RNA-Kopien einer DNA-Matrize, die aus mehreren Tandemwiederholungen einer Oligonukleotideinheit zusammengesetzt ist, mit Hilfe einer Nukleinsäurepolymerase hergestellt werden, die eine Strangverdrängung ausführen kann und im Wesentlichen keine 5'-3'-Exonukleaseaktivität aufweist, in dem in der Anwesenheit der notwendigen Nukleosidtriphosphate die Matrize mit der Nukleinsäurepolymerase, und falls notwendig einem Primer, der an die Oligonukleotideinheit binden kann, in Kontakt gebracht wird, wobei die Polymerase auf diese Weise DNA oder RNA synthetisiert, die idealer Weise von jeder sich wiederholenden Oligonukleotideinheit in der Matrize herrührt.
Falls irgendein Teil der sich wiederholenden Oligonukleotideinheit der des Promotor eines Enzyms entspricht, das, ähnlich wie die T3, T7 oder SP6 Polymerase, zu einer Matrizen abhängigen DNA oder RNA Synthese fähig ist, ohne die Notwendigkeit für einen Primer als einen Startpunkt für den Vorgang, dann kann die Kaskadenphase durch die einfache Zugabe dieses Enzyms und der notwendigen Nukleosidtriphosphate zu der einzelsträngigen oder doppelsträngigen Matrize, vorzugsweise der doppelsträngigen Matrize, induziert werden.
Falls dies nicht der Fall ist, dann wird zusammen mit einem geeigneten Enzym, das DNA oder RNA aus den geeigneten Nukleosidtriphosphaten in einer Matrizen und Primer abhängigen Reaktion synthetisieren kann und die vorstehend erwähnte Fähigkeit aufweist eine Strangverdrängung zu induzieren, ein Primer benötigt, der an die sich wiederholende Oligonukleotideinheit binden kann. In diesem Fall müssen die Stränge der Matrize zuerst getrennt werden, so dass der Primer an jeden Strang hybridisieren kann. Geeignete DNA-Polymerasen dieser Art sind bspw. das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, Präparationen der Taq-Polymerase ohne Exonukleaseaktivität oder die T4 DNA-Polymerase.
Falls die DNA-Matrize von einem ringförmigen Oligonukleotid mit Hilfe einer DNA-Polymerase hergestellt wird, die von an irgendeinen Abschnitt des ringförmigen Oligonukleotids bindenden Primers startet, dann kann die Kaskadenreaktion gleichzeitig mit der Matrizenbildung ausgeführt werden, in dem ein Primer zugegeben wird, der an mindestens einen Abschnitt der komplementären Oligonukleotideinheiten bindet, die die Matrize umfasst.
In diesem Fall ist es, wie vorhergehend erwähnt, vorteilhaft sein, dass das beginnende ringförmige Oligonukleotid eine Dyadensymmetrie zeigende DNA-Sequenz umfasst und der Primer die gleiche DNA-Sequenz aufweist, da dann sowohl die Matrizenbildung als auch die Kaskadenreaktion davon unter Verwendung des gleichen Einzelprimers stattfindet.
Ist die Nukleinsäurepolymerase eine DNA-Polymerase, dann sind die von der Matrize verdrängten, synthetisierten Stränge ebenfalls DNA und die Kaskadenreaktion verläuft weiterhin von den wiederholten Oligonukleotideinheiten der neu synthetisierten DNA-Stränge.
In einer besonderen Ausführungsform einer derartigen Kaskadenreaktion wird die Zeitführung der Kaskadenreaktion auf die Anzahl der Wiederholungseinheiten in der Matrize angepasst, und möglicherweise die Konzentration in einer derartigen Weise, dass das Kopieren der Matrize und die neu synthetisierten DNA-Stränge nicht bis zu den Enden davon abläuft, so dass die verdrängten Stränge an der Matrize angefügt bleiben, die ein großes Netz verbundener Stränge bilden.
Ist die Nukleinsäurepolymerase eine RNA-Polymerase, dann sind die von der Matrize verdrängten synthetisierten Stränge RNA, und die Kaskadenreaktion erzeugt eine große Anzahl einzelsträngiger RNA-Moleküle, die aneinander hybridisieren, wobei ein großes immobiles Netzwerk gebildet wird.
Die synthetisierten RNA-Moleküle werden durch die RNA-Polymerase nicht weiter kopiert, wobei jedoch, falls weitere Kopien erwünscht sind, es möglich ist wie folgt vorzu gehen: Das erzeugte Netzwerk hybridisierter RNA-Moleküle wird denaturiert, an komplementäre Oligonukleotide, die als Primer für eine cDNA-Synthese geeignet sind, reassoziiert, und mit Hilfe einer reversen Transkriptase in cDNA-Stränge kopiert, wonach die Kaskadenreaktion von den sich wiederholenden Oligonukleotideinheiten der cDNA-Stränge weiter fortgesetzt wird.
In der Kaskadenreaktion kann es ebenfalls für Zwecke eines Überwachens der Reaktion oder eines Ermittelns des Produkts oder der Produkte vorteilhaft sein, dass die vorhandenen Nukleosidtriphosphate markiert sind. Erneut kann eine derartige Markierung beispielsweise ein Enzym, ein radioaktives Isotop, eine fluoreszierende Verbindung, eine chemilumineszierende Verbindung, eine biolumineszierende Verbindung, ein Metallchelat oder ein Halogen sein, das durch eine spezifische Sekundärreaktion nachweisbar ist.
Eine Anwendungsausführungsform stellt ein Verfahren zum Ermitteln eines Zielmoleküls oder einer Gruppe an einer speziellen Stelle bereit, wobei

a) ein Detektor- bzw. Nachweismolekül, das spezifisch an das Ziel bindet, an ein Oligonukleotid angefügt ist, das in einer Reaktion teilnehmen kann, um eine DNA-Matrize zu bilden, die aus mehreren Tandemwiederholungen des Oligonukleotids besteht,
b) das Oligonukleotid mit angefügtem Detektormolekül mit dem Zielort in Kontakt gebracht wird, wobei Oligonukleotid mit angefügtem Detektormolekül, das nicht an das Ziel gebunden vorliegt, entfernt wird,
c) eine Reaktion ausgeführt wird, um eine DNA-Matrize zu bilden, die aus mehreren Tandemwiederholungen des an das Detektormolekül gebundenen Oligonukleotids besteht, und
d) das Ziel durch Nachweis der gebundenen vermehrten Nukleinsäure ermittelt wird.

In diesem Verfahren wird es häufig zweckdienlich sein, dass weiterhin eine wie vorher beschriebene Kaskadenreaktion vor Nachweis des Ziels ausgeführt wird.
In einer anderen Ausführungsform dieses Verfahrens
wird a) ein Detektormolekül, das spezifisch an das Ziel bindet, an eine DNA-Matrize angefügt, die mehrere Tandemwiederholungen einer Oligonukleotideinheit beinhaltet,
wird b) die Matrize mit dem angefügte Detektormolekül mit dem Zielort in Kontakt gebracht, wobei Matrize mit angefügtem Detektormolekül, das nicht an das Ziel gebunden ist wird entfernt,
wird c) eine wie vorher beschriebene Kaskadenreaktion ausgeführt, und
wird d) das Ziel durch Nachweis der gebundenen vermehrten Nukleinsäure ermittelt.
Umfasst das Verfahren eine Kaskadenreaktion, dann kann die Anwesenheit eines großen Netzes von Nukleinsäuresträngen von selbst sichtbar oder nachweisbar sein, wobei jedoch gewöhnlich die in dem Verfahren verwendeten Nukleosidtriphosphate zur Herstellung der DNA-Matrize, und möglicherweise, in der Kaskadenreaktion markiert vorliegen, wobei das Ziel durch Ermitteln der Markierung nachgewiesen wird.
Die Markierung an den markierten Nukleosidtriphosphaten kann beispielsweise ein Enzym, ein radioaktives Isotop, eine fluoreszierende Verbindung, eine chemilumineszierende Verbindung, eine biolumineszierende Verbindung, ein Metallchelat oder ein Halogen sein, das durch eine spezifische Sekundärreaktion nachweisbar ist.
Falls das Produkt der Nachweisreaktion an einer bestimmten Lokalisation erscheinen wird, dann sollten die nachzuweisenden Zielmoleküle oder Gruppen an einer spezifischen Stelle entweder vor oder nachdem die erfindungsgemäßen Reaktionen stattfinden, gebunden haben. Beispielsweise können sie an einer festen Oberfläche befestigt sein, oder sie können innerhalb eines engen Raums, wie beispielsweise einer organischen Zelle, begrenzt sein.
Eine praktische Verwendung dieser Ausführungsform ist eine, bei der das Ziel ein spezifisches Antigen und das Detektormolekül ein Antikörper gegen das Antigen ist. Eine andere besteht darin, bei der das Ziel ein bestimmtes Kohlenhydramolekül oder Gruppe ist und das Detektormolekül ein daran bindendes Lektin ist. Noch eine andere ist eine, bei der das Ziel eine spezifische Nukleinsäuresequenz ist, und das Detektormolekül eine DNA oder RNA-Sonde ist, die spezifisch an die Zielsequenz hybridisiert.
Eine weitere Anwendungsausführungsform stellt ein Verfahren zur Vermehrung eines bestimmten DNA-Fragments bereit, wobei ein erstes Oligonukleotid an beide Enden von einer Kopie der DNA-Sequenz angefügt wird und ein zweites zu dem ersten komplementäres Oligonukleotid wird an beide Enden einer anderen Kopie der DNA-Sequenz angefügt, wobei in der Anwesenheit der notwendigen Nukleosidtriphosphate während wiederholter Zyklen von Denaturierung und Annealing die erhaltenen DNA-Sequenzen mit Hilfe einer Matrizen und Primer abhängigen Polymerase schrittweise kopiert werden, wobei die Kettenverlängerung zu jedem Zeitpunkt stattfindet, an dem das Annealing zu einer Raster verschobenen Hybridisierung führt, was zu Duplexen mit begrabenen 3'-Enden führt.
In einer anderen Ausführungsform dieses Vermehrungsverfahrens wird ein erstes Oligonukleotid zu dem 5'-Ende gegeben und ein zweites zu dem ersten komplementäres Oligonukleotid zu dem 3'-Ende von einer Kopie der DNA-Sequenz und umgekehrt mit einer anderen Kopie der DNA-Sequenz, wobei in der Anwesenheit der notwendigen Nukleosidtriphosphate während wiederholter Zyklen von Denaturierung und Annealing die erhaltenen DNA-Sequenzen mit Hilfe einer Matrizen und Primer abhängigen Polymerase schrittweise kopiert werden, wobei die Kettenverlängerung zu jedem Zeitpunkt stattfindet, an dem das Annealing zu einer Raster verschobenen Hybridisierung führt, was zu Duplexen mit bedeckten 3'-Enden führt.
In noch einer anderen Ausführungsform dieses Vermehrungsverfahrens wird mindestens eine Einheit eines Oligonukleotids, das Dyadensymmetrie zeigt, zu beiden Enden der DNA-Sequenz zugegeben, wobei in der Anwesenheit der notwendigen Nukleosidtriphosphate während wiederholter Zyklen von Denaturierung und Annealing die erhaltenen DNA-Sequenzen mit Hilfe einer Matrizen und Primer abhängigen Polymerase schrittweise kopiert werden, wobei die Kettenverlängerung zu jedem Zeitpunkt stattfindet, an dem das Annealing zu einer Raster verschobenen Hybridisierung führt, was zu Duplexen mit bedeckten 3'-Enden führt.
In jeder der vorstehend erwähnten drei Ausführungsformen kann es zweckdienlich sein, dass die Oligonukleotideinheiten, die zu den Enden der bestimmten DNA-Sequenz zugegeben werden, so gestaltet werden, dass sie Restriktionsenzymerkennungsstellen beinhalten, die der DNA-Sequenz benachbart liegen.
In immer noch einer anderen Ausführungsform des Vermehrungsverfahrens wird die bestimmte zu vermehrende DNA-Sequenz entweder zirkularisiert oder in ein ringförmiges Oligonukleotid eingefügt, wobei die erhaltene ringförmige DNA in der Anwesenheit der notwendigen Nukleosidtriphosphate und, falls notwendig einem Primer, der an irgendeinen Abschnitt des Oligonukleotids binden kann, mit Hilfe einer Nukleinsäurepolymerase, die zu einer Strangverdrängung fähig ist und im Wesentlichen keine 5'-3'-Exonukleaseaktivität aufweist als eine Matrize für ein endlos-kopierendes Verfahren verwendet wird.
In dieser Ausführungsform kann es zweckdienlich sein, dass die bestimmte DNA-Sequenz in eine Stelle des ringförmigen Oligonukleotids eingefügt wird, um Restriktionsenzymerkennungsstellen zu erzeugen, die der DNA-Sequenz benachbart liegen.
Umfasst das Verfahren weiterhin eine wie vorstehend beschriebene Kaskadenreaktion, dann wird jede der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen des Vermehrungsverfahrens die bei weitem größte Vermehrung erzeugen.
In dieser Vermehrungsausführungsform der Erfindung wird es ebenfalls zu Überwachungs- und Nachweiszwecken nützlich sein, dass die Nukleosidtriphosphate in dem Verfahren markiert vorliegen.
1 erläutert die perfekte Übereinstimmung zweier Kopien von einem Oligonukleotid, das zwei Einheiten einer Dyadensymmetrie umfasst, als auch das rasterverschobene Annealing der Stränge und DNA-Synthese nach der ersten Denaturierung des Doppelstrangs.
2 erläutert in ähnlicher Weise die perfekte Übereinstimmung eines Oligonukleotids mit internen Wiederholungen und dessen komplementären Oligonukleotid, als auch dem rasterverschobenen Annealing der zwei Stränge und DNA-Synthese nach der ersten Denaturierung des Doppelstrangs.
3 erläutert die Ko-Vermehrung einer DNA-Sequenz von zwölf "irrelevanten" Basen zwischen zwei Einheiten einer Dyadensymmetriesequenz.
4 stellt ein Diagramm dar, das ein endlos-kopieren von einem ringförmigen Oligonukleotid erläutert. (1) ist ein lineares Oligonukleotid; (2) ist das zirkularisierte Oligonukleotid; (3) erläutert das Kopieren des ringförmigen Oligonukleotid, beginnend von einem Primer oder einem Promotor an dem 5'-Ende; und (4) erläutert die Strangverdrängung und fortgesetztes Kopieren nach einem Umlauf des Oligonukleotids.
5 erläutert eine Kaskadenvermehrungsreaktion von einer DNA-Matrize, die mehrere Tandemwiederholungen einer Dyadensymmetrie-Oligonukleotideinheit umfasst, wobei die Dyadensymmetrieeinheit als ein Primer verwendet wird. Der Primer wird an zahlreiche komplementäre Sequenzen in dem Matrizestrang hybridisiert, und da die verwendete DNA-Polymerase zu einer Strangverdrängung fähig ist und keine signifikante 5'-3'-Exonukleaseaktivität aufweist, wird eine Strangverdrängung eintreten, wenn die DNA-Synthese eine Stelle erreicht, die durch einen synthetisierten Strang besetzt ist. Die DNA-Synthese wird folglich entlang des Matrizestrangs fortgesetzt, während mehr Primersequenzen an die verdrängten Stränge binden, was zur Synthese neuer Stränge führt, die einander verdrängen.
6 erläutert das Anhängen eines Oligonukleotids, das wiederholte Einheiten einer Dyadensymmetrienukleotidsequenz umfasst, an einen Antikörper, der an ein an einer festen Fläche befestigtes, spezifisches Antigen bindet, mit einem Blick auf eine nachfolgende Multiplikation und wahlweise Kaskadenreaktion, um den Antikörper nachzuweisen.
Die theoretisch produktivste Ausführungsform der Erfindung ist wie folgt:

i) Die Matrize wird durch Polymerisation von einer Dyadensymmetrie einer kurzen sich wiederholenden Oligonukleotideinheit hergestellt, so dass sie so viele Dyadensymmetriesequenzen wie möglich beinhaltet.
ii) Die Kaskadenphase erzeugt mehrere DNA-Kopien der Matrize. Aufgrund der Beschaffenheit der Dyadensymmetrie der Sequenz wird jede der mehreren Kopien eine Sequenzzusammensetzung aufweisen, die zu der der Matrize identisch ist, und wird somit als Matrize für die Synthese mehrerer neuer Kopien dienen können, welche jeweils als eine Matrize für die Synthese mehrerer neuer Kopien (und so weiter) dienen können. (Falls die in dem Verfahren erzeugte Nukleinsäure RNA ist, wäre es mit den heute verfügbaren Enzymen notwendig diese mit einem zweiten Enzym (einer reversen Transkriptase) in DNA umzuwandeln, um sie zu einer geeigneten Matrize für neue Kopierrunden zu machen.)

Diese Ausführungsform wird nachfolgend ausführlicher beschrieben.
Die DNA-Kaskade ist eine Zwei-Phasen-Reaktion zur Herstellung großer Mengen von DNA mit einer spezifischen Basensequenz. In Phase 1 werden Multimere einer gewählten Oligonukleotidsequenz erzeugt. In Phase 2 wird diese Multimerstruktur (die Matrize) bis zu einer Menge vermehrt, die einige Größenordnungen größer ist als die Menge des Ausgangsmaterials. Die Verbindung der zwei Phasen führt zu einer Wirkung, die das bei weitem überschreitet, was mit jeder der zwei Reaktionen einzeln erreicht werden könnte. Die in der Phase 2 synthetisierte DNA könnte als Ausgangsmaterial für eine zweite Phase 1 oder eine zweite Phase 2 dienen. Die unterschiedlichen Schritte können somit wiederholt und gemäß der spezifischen Erfordernisse kombiniert werden. In beiden Phasen können Varianten vorgestellt werden. Im Folgenden wird das Prinzip eines jeden Schritts zusammen mit einer kurzen Erwähnung von Hauptvarianten und einer Darstellung möglicher Anwendungen erklärt werden.
Bildung von Multimeren
Die Multimermatrizenbildung durch aufeinander folgendes Wachstum von einem Oligonukleotids einer Dyadensymmetrie kann dargestellt werden mit dem Oligonukleotid
das eine unmittelbare Wiederholung der Dyadensymmetrie GAAATTTC ist. Zwei Moleküle dieses Oligonukleotids können entweder mit einer perfekten Übereinstimmung hybridisieren oder in einer rasterverschobenen Position, in der lediglich die Hälfte jeden Moleküls basengepaart vorliegt (1). In der letzteren Situation werden die Duplexe entweder begrabene oder freie 3'-Enden aufweisen, die entweder eine Rasterverschiebung nach recht oder nach links darstellen. Falls eine DNA-Polymerase und Nukleosidtriphosphate vorhanden sind, werden begrabene 3'-Enden erweitert werden, was zu dem Wachstum des DNA-Strangs um die Hälfte der Größe des eingesetzten Oligonukleotids führt. Folglich wird bei durchschnittlich 25% der Oligonukleotide deren Länge um 50% zunehmen. Falls aufeinander folgende Runden von Denaturierung und Annealing/Kettenverlängerung ausgeführt werden, werden die Moleküle mit einer ständig zunehmenden Geschwindigkeit weiter in der Größe zunehmen (Es gibt zwei Gründe warum die Wachstumsgeschwindigkeit zunehmen wird. Einer besteht darin, dass eine heterogene Population von Molekülen erzeugt wird, welche die Frequenz eines Rasterverschiebens erhöht. Der andere besteht darin, dass da die Moleküle länger werden, so auch die möglichen Rasterverschiebungen und somit das erhaltene Wachstum.) bis ein Pegel erreicht ist, an dem die Reaktion in der Effizienz aufgrund der Tatsache abnimmt, dass DNA-Polymerasen lediglich einige Kilobasen DNA in vitro synthetisieren können. Bis dahin wuchs unser ursprüngliches 16mer zu einer Größe von einigen Kilobasen.
Eine ähnliche Reaktion konnte mit zwei Oligonukleotiden erhalten werden, die die Sequenz (GAAA)_n und (TTTC)_n (2) aufweisen. Eine derartige Polymerisationsreaktion von zwei Oligonukleotiden wurde vorher durch J. W. IJdo et al., loc. cit., beschrieben und zeigte, dass von kurzen Oligonukleotiden Moleküle von 25 Kilobasen erzeugt werden können.
Das Prinzip als solches sollte durch das Anordnen einer "irrelevanten" Sequenz zwischen die anfänglichen Kopien des wachsenden Oligonukleotids nicht beeinflusst werden. (In diesem Zusammenhang bedeutet "irrelevant", dass die Sequenz von sich aus unfähig wäre in die erfindungsgemäßen Reaktionen einzugreifen.) Folglich sollte das Oligonukleotid
wachsen, um die Sequenz
zu erzeugen (3).
Der Vorteil einer Zugabe der "irrelevanten" Sequenz bestünde darin, dass sie zusammen mit dem vermehrten Oligonukleotid ko-vermehrt vorliegt. Das Oligonukleotid würde somit als ein Träger für die Vermehrung von etwas Anderem dienen. Der Preis besteht selbstverständlich darin, dass sobald die Größe der Vermehrungseinheit ansteigt die Kopienanzahl in jedem Polymer abnimmt, da die Gesamtgröße des Polymers festgelegt ist. Je kleiner die Anzahl der Einheiten pro Polymer ist desto weniger DNA konnte in der nächsten Phase erzeugt werden, in der der maximale Vermehrungsgrad primär durch die Anzahl sich wiederholender Einheiten in jedem Polymer bestimmt wird.
Im Fall, dass eine Multimermatrize von einem ringförmigen Oligonukleotid gebildet wird, kann das Multimer ohne wiederholte Denaturierung und Annealing (4) hergestellt werden. Dies erfordert die Verwendung einer Polymerase, die zu einer Strangverdrängung fähig ist und im Wesentlichen keine 5'-3'-Exonukleaseaktivität aufweist, wie nachfolgend für die Kaskadenphase beschrieben wird und mit Kinetiken, die solchen dort beschrieben identisch sind. Das Ausgangsoligonukleotid sollte ebenfalls größer sein als es für eine Multimermatrizenbildung von einem linearen Molekül einer Dyadensymmetrie benötigt wird. Die genaue Minimalgröße kann jedoch nicht dargelegt werden, da sie von der Sequenz des Oligonukleotids und der Größe des zum Kopieren der ringförmigen DNA verwendeten Enzyms abhängig ist. Die Steifigkeit der DNA ist von der Basensequenz abhängig, und je starrer sie ist umso länger muss das Oligonukleotid sein, um zu einem Ring gebogen werden zu können. Weiterhin muss dieser Ring groß genug sein, so dass die DNA-Polymerase an ihm wirken kann. Falls das ursprüngliche Oligonukleotid nicht groß genug ist, um diese Erfordernisse zu erfüllen, kann es, wie in dem vorherigen Kapitel beschrieben, verlängert werden, bis es eine ausreichende Größe erreicht hat. Neben den Größenerfordernissen erfordert die Zirkularisierungsvariante lediglich, dass das zu zirkularisierende Molekül eine 5'-Phosphatgruppe und ein 3'-Hydroxygruppe, als auch unter geeigneten Reaktionsbedingungen die Zugabe einer DNA- oder RNA-Ligase einschließlich der Anwesenheit eines energiereichen Moleküls wie ATP aufweist, um für die kovalente Bindung der Enden die notwendige Energie aufzubringen. Falls das ringförmige Oligonukleotid an einer bestimmten Stelle angebracht werden muss, dann muss es mit einem Detektormolekül verbunden werden, ein Detektormolekül beinhalten oder einen Rest beinhalten, an den ein Detektormolekül angehängt werden kann.
Die Möglichkeit einer Polymerbildung von einer ringförmigen Matrize kann verwendet werden, um Moleküle zu identifizieren, die Ringe bilden können, wenn sie mit einer geeigneten Matrize ergänzt werden, oder als Matrizen zur Zirkularisierung der ergänzenden DNA dienen können. Das Vorhandensein eines bestimmten biologischen Moleküls kann somit durch dessen Fähigkeit nachgewiesen werden eine Zirkularisierung eines an es zugegebenen bzw. angefügten linearen DNA-Moleküls zu induzieren, wobei die Zirkularisierung durch die Fähigkeit eines dritten DNA-Moleküls, das an den Ring bindet, nachgewiesen wird, das, wie in dem Toyobo-Patent, loc. cit. beschrieben ist, die rollende-Kreis-Replikation in Gang bringt.
Die Zirkularisierung kann jedoch noch einfacher in Richtung des 3'-Endes der Matrize ausgeführt werden, so dass dieses Ende als ein Primer für die rollende-Kreis-Replikation dienen kann. Nicht nur, dass dieser Ansatz die Notwendigkeit der Zugabe eines zusätzlichen Primers beseitigt, so verhindert er ebenfalls, dass die an kreuzreagierenden Stellen fälschlich gebildeten Ringe kopiert werden, solange sie nicht zufällig mit einem 3'-Ende übereinstimmen. Dieser Ansatz weist ebenfalls den weiteren Vorteil auf, dass das Polymer mit dem nachgewiesenen 3'-Ende kovalent verbunden wäre. Falls daher der Ring an einer Stelle in einem Chromosom gebildet wird, wird das Polymer eine Fortsetzung der chromosomalen DNA an dieser Stelle, und falls der Ring an einer in einer Mikrotiterplatte gefangenen DNA gebildet wird, an magnetischen Kügelchen oder anderweitig, darin wird das Polymer eine Fortsetzung der gefangenen DNA sein. Als ein Ergebnis davon wird das Polymer nicht nur an der relevanten Stelle spezifisch synthetisiert, sondern ebenfalls sehr effizient dort zurückgehalten.
Die Bildung des Polymers kann unmittelbar ermittelt werden falls es aus markierten Nukleotiden synthetisiert wird, wobei jedoch eine höhere Spezifität und Sensibilität durch Hinzufügen eines zusätzlichen Nachweisschritts erhalten werden würde, welcher eine DNA-Kaskade an dem Polymer, oder mögliche andere Ansätze wie PRINS oder FISH sein könnte. Eine Vorraussetzung für diesen Reaktionstyp besteht darin, dass die untersuchte DNA ein geeignet lokalisiertes 3'-Ende aufweist. Falls ein derartiges Ende nicht naturgemäß verfügbar ist, kann es bspw. durch Verdau mit einem geeigneten Restriktionsenzym, künstlich erzeugt werden.
Ein weitere Ausführungsform dieses Assays besteht darin, dass sie nicht nur empfindlich auf die Sequenz der DNA-Matrize, sondern ebenfalls auf deren Form (gebrochen (mit einem 3'-Ende) oder fortlaufend (kein 3'-Ende)) ist. Es sollte somit nicht nur zu bestimmen möglich sein ob und wo eine bestimmte Zielsequenz vorhanden ist, sondern ebenfalls ob sie gebrochen ist oder nicht. Derartige Brüche können von verschiedenen enzymatischen Wirkungen (bspw. Topoisomerasen) und pathologischen Vorgängen (bspw. Chromosomenbrüche bei Krebs) herrühren.
Ein Umkehren des Assayaufbaus, so dass es die DNA in der Probe ist, die an der zugegebenen DNA zirkularisiert wird, weist die Folge auf, dass es die DNA in der Probe ist, die bei der rollenden-Kreis-Replikation kopiert wird. Folglich wird die Sequenzzusammensetzung der DNA in dem Polymer die der Probe widerspiegeln und eine nachfolgende Kaskadenreaktion an dem Polymer kann mit den im Segment zur Zirkularisierung verwendeten Primern freigesetzt werden, so dass jeglicher "falsch" gebildete Ring nicht nachweisbar wäre, da er nicht die Kaskadenprimer binden kann. Weiterhin würde die in der Kaskadenreaktion synthetisierte DNA ebenfalls der Probe entsprechen und könnte für sich allein für analytische Zwecke (verwendet als Probe, sequenziert etc.) verwendet werden.
Ein wie vorstehend beschriebenes ringförmiges Oligonukleotid kann ebenfalls unmittelbar als eine Matrize für die nachfolgende Kaskadenphase verwendet werden, falls derartiges erwünscht wird.
Die Kaskadenphase
Falls das ursprüngliche Oligonukleotid zu dem Polymeren zugegeben wird, dann wird es an zahlreiche Positionen entlang der verlängerten DNA binden, da das was vorliegt ein langes Polymers ist, das bis zu einigen Tausend Tandemkopien des ursprünglichen Oligonukleotid beinhaltet. Falls das Annealing in der Anwesenheit von markierten Nukleotiden und einer DNA-Polymerase mit im Wesentlichen keiner 5'-3'-Exonukleaseaktivität stattfindet, dann werden diese Hybridisierungen zu einer ähnlichen Anzahl von Initialreaktionsereignissen bzw. Primingereignissen führen, die jeweils eine teilweise Kopie des Polymers erzeugen. Da die DNA-Polymerase keine signifikante Exonukleaseaktivität aufweist, wird eine Strangverdrängung stattfinden, wenn die DNA-Synthese eine Stelle erreicht die bereits durch ein Oligonukleotid besetzt ist, wodurch ermöglicht wird mehrere Kopien des gleichen Segments des Polymers (5) zu erzeugen.
Wie in 5 gezeigt, weist die einzelsträngige DNA, die durch die Strangverdrängung erzeugt wird, ebenfalls die Möglichkeit auf an neue Oligonukleotide (welche zu neuen Strängen führen, die einander verdrängen) zu binden. Prinzipiell kann dieser Vorgang für immer ablaufen (und mit einer ständig zunehmenden Geschwindigkeit, da die Anzahl neuer erzeugter Einzelstränge die Anzahl von Strängen übersteigt, die zu deren Erzeugung verwendet wurden), der durch n Runden von Strangverdrängung von einem Polymer, das m Kopien des vermehrten Oligonukleotid beinhaltet, maximal mⁿ Moleküle erzeugt. Praktisch ist es wahrscheinlich, dass die Reaktion nach einiger Zeit verlangsamt wird, da die neuen Stränge mit jeder Erzeugung kürzer und kürzer werden. Falls die Reaktion bis zur Abschluss (n erreicht Maximalwert) abgelaufen ist, dann werden jedoch von einen Polymermolekül, das Tausend Kopien des ursprünglichen Oligonukleotids (m = 1000) beinhaltet wahrscheinlich 10¹⁶ neue Moleküle erzeugt.
Falls die Größe des ursprünglichen Oligonukleotids durch Einschluss einer, wie vorstehend erwähnten, "irrelevanten" Sequenz erhöht, dann wird diese selbstverständlich ebenfalls in großen Mengen erzeugt werden, obwohl die Gesamtvermehrung verringert sein wird, wobei mit sehr langen Additionen lediglich einige Hundert Moleküle von jedem Polymer erzeugt werden können.
In diesem Fall können die Reaktionen entweder mit Phase 2 alleine unter Verwendung aller neuen Stränge als Matrizen für eine zweite Kaskadenreaktion oder mit der vollständigen Reaktion wiederholt werden, wobei ein Selbstverlängern der neuen Stränge vor einem neuen Kaskadenschritt ermöglicht wird. Wiederholen der vollständigen Reaktion p-mal würde maximal zu einer (mⁿ)^p fachen Vermehrung führen.
Andere Wege eines Verstärkens der Kaskadenreaktion bestünden in einem für eine Zeit lang Vor-Reagieren lassen des Polymers mit dem (den) Kaskaden freisetzenden Oligonukleotid(en) bevor die DNA-Polymerase zugegeben wird, wodurch sichergestellt wird, dass alle möglichen Bindungsstellen in der ersten Runde einer DNA-Synthese verwendet, und eines abbaubaren Primers, wie in den Becton Dickinson und Boehringer Mannheim Patenten (loc. cit.) beschrieben, verwendet werden, um eine Vielzahl von Initialreaktionsereignissen von jeder Stelle zu erhalten, oder eine Kombination dieser Ansätze.
Alternativ könnte die Erkennungsstelle einer RNA-Polymerase, wie die T7 RNA-Polymerase, in die Vermehrungseinheit aufgenommen und das Enzym am Ende der Reaktion als Kaskadenverstärker zugegeben werden (die T7 RNA-Polymerase erzeugt auf Bindung bis zu 40 RNA-Kopien der zu der Erkennungssequenz benachbarten DNA-Sequenz, so würde falls die ursprüngliche Einheit während der Polymerisationsphase 10-mal vermehrt wird und während der Kaskadenphase weitere 100-mal die gesamte Vermehrung dann 10 × 100 × 40 = 40000-mal betragen).
Promotorsequenzen können polymerisiert werden, wie hier mit dem Promotor für die T7 RNA-Polymerase gezeigt wird.
Die Kaskadenphase kann nicht nur mit einer Primer abhängigen Polymerase freigesetzt werden, sondern ebenfalls mit einer Promotor abhängigen Polymerase; wobei die erzeugte Nukleinsäure vielmehr RNA als DNA sein kann, wie hier für das Promotor abhängige RNA erzeugende Enzym, T7 RNA-Polymerase gezeigt wird. Die Sequenz des T7 Promotors ist CCCTATAGTGAGTCGTATTA. Die kürzeste aus dieser Sequenz zusammengesetzte Dyadensymmetrie ist:
(":" zeigt die Achse der Symmetrie an). Oligonukleotide, die mindestens eineinhalb Einheiten dieser Dyadensymmetrie beinhalten, können in ein doppelsträngiges Polynukleotid polymerisiert werden, wobei jeder Strang die Sequenz
aufweist. Falls beispielsweise "n" 100 ist, bedeutet dies, dass jeder Strang 100 potentielle Bindungsstellen für die T7 RNA-polymerase beinhaltet. Um eine Bindung der Polymerase zu erhalten ist es nicht notwendig die DNA-Stränge durch Hitze oder auf andere Weise zu trennen (denaturieren). Es ist ausreichend die Polymerase und RNA Vorläufer (Nukleosidtriphosphate) zu dem Polymer, gemäß einem der vielen Protokolle zuzugeben, die für eine RNA-Synthese von einen T7 Promotor beschreibenden wurden. Die Polymerase wird dann an mehreren Stellen entlang des DNA-Strangs binden, die eine multifokale RNA-Synthese mit hoher Geschwindigkeit bereitstellt.
Dieser Reaktionstyp könnte insbesondere für Anwendungen geeignet sein, bei denen von besonderer Wichtigkeit ist, dass die in der Reaktion erzeugten Nukleinsäuren an dem Ort einer Synthese sehr genau zurückgehalten bleiben (bspw. Genlokalisation auf Metaphase chromosomen). Der Grund dafür besteht darin, dass die erzeugten einzelsträngigen RNA-Moleküle genau wie die DNA-Stränge von denen sie kopiert wurden, selbstkomplementär sind. Die hohe Konzentration und die geringe Komplexität dieser Moleküle wird zusammen bewirken, dass die Stränge miteinander nahezu sofort hybridisieren, wobei sie ein Netzwerk mit einer Größe und Dichte bilden, das es unwahrscheinlich erscheinen lässt, dass sie von der Synthesestelle weg diffundieren. Theoretisch kann das Netzwerk eine derartige Größe und Dichte erreichen, das es ausfällt, wodurch es vollständig unbeweglich machen würde, solange es nicht irgendeiner mechanischen Kraft ausgesetzt (wie kräftiges Schütteln) wird.
Das gebildete Netzwerk kann von der T7-Polymerase nicht für eine Herstellung weiterer RNA-Stränge gebunden werden, da dieses Enzym lediglich DNA bindet. Falls derartiges erwünscht ist, ist es notwendig die RNA-Moleküle in cDNA-Moleküle zu kopieren. Dies kann durch eine reverse Transkriptase mit Nukleosidtriphosphaten ausgeführt werden und erfordert, dass das Netzwerk denaturiert (durch Hitze oder anderweitig) und mit komplementären Oligonukleotiden reassoziiert wird, die als Startpunkte (Primer) für die DNA-Synthese dienen können.
Mögliche Anwendungen
Vermehrungen ohne zugegebener "irrelevanter" DNA
In dieser Situation wird lediglich das/die Oligonukleotid(e) selbst (sie selbst) vermehrt. Da das was erzeugt wird lediglich große Mengen des gewählten kurzen Oligonukleotids sind und keine "biologischen" Moleküle ist die Reaktion besonders für Nachweiszwecke geeignet.
Eine Vorraussetzung für diesen Verwendungstyp besteht darin, dass die Moleküle dazu gebracht werden können an einer relevanten Stelle zu (ver)bleiben. Anfänglich kann dies durch Fixierung der Polymermatrize für die Kaskadenreaktion an ein Detektormolekül erreicht werden, das spezifisch an die relevante Stelle binden kann. Diese Fixierung kann entweder durch eine chemische Reaktion zwischen reaktiven Gruppen an den zwei Molekülen oder durch eine Affinitätsreaktion erreicht werden, bei der die Matrize einen Rest umfasst, der an das Detektormolekül spezifisch binden wird. Falls das Detektormolekül als Avidin oder Streptavidin vorliegt, kann somit die Matrize, falls sie einen Biotinrest umfasst, spezifisch daran angehängt werden. In ähnlicher Weise kann, falls das Detektormolekül ein Antikörper ist, die Matrize spezifisch daran angehängt werden, falls sie ein durch diesen Antikörper erkanntes Antigen umfasst. Diese Bindung der Matrize kann vor, gleichzeitig mit oder nach der Bindung des Detektormoleküls an das relevante Ziel erfolgen. Falls vorzugsweise ein Oligonukleotid, das an der Bildung der Polymermatrize teilnehmen kann, anstelle der Matrize angehängt werden kann, wobei dann die Matrize an dem Detektormolekül gebildet werden kann.
Falls die Polymerbildung von einem zirkularisierten Oligonukleotid startet, dann kann der Ring dazu verwendet werden, dass die kovalente Bindung des Polymers an dem ermittelten Ziel bewirkt wird, oder als ein Ankerpunkt für das Polymer dient, wobei das Polymer in dem Ring endet und der Ring das Ziel umgibt.
Sobald die Matrize an die relevante Stelle angehängt wurde, kann die Kaskadenreaktion ausgeführt werden. Wie aus 5 abgeleitet werden kann, wird die in dieser Phase auftretende Strangverdrängung einzelsträngige Moleküle erzeugen, die entweder direkt oder indirekt an die Polymermatrize angehängt oder an ähnliche Moleküle in einem großen Netzwerk angehängt sind, das aufgrund dessen Größe unbeweglich ist. Die während der Kaskadenphase synthetisierten Nukleinsäuren werden somit mit dem Polymer verbleiben, das an die relevante Stelle angehängt wurde. Dieses Rückhaltevermögen des Produkts kann abhängig von dem experimentellen Aufbau durch die Eigenschaften der relevanten Stelle erhöht werden. Somit wird beispielsweise, falls die Reaktion in einer Zelle ausgeführt wird, das Zellskelett und die Zellmembran dazu dienen das Rückhaltevermögen des Produkts zu erhöhen.
Falls das Substrat für die Nukleinsäuresynthese markierte Nukleotide sind, dann werden die synthetisierten Nukleinsäuren markiert werden. Somit können die in dem vorstehend erwähnten Beispiel, von einem Vorläufermolekül erzeugten 10¹⁶ Moleküle markiert sein. Diese Anzahl markierter Moleküle liegt bei den meisten Laborreaktionen weit über der Nachweisgrenze. Falls somit die initiierenden Oligonukleotide an einem spezifischen Detektormolekül (wie einem Antikörper an ein Antigen von Interesse) angebracht sind, dann kann die Anwesenheit (Bindung) dieses Detektormoleküls sogar sichtbar sein, wenn lediglich ein Einzelmolekül an dem Ziel gebunden vorliegt (6).
Es liegt somit ein Detektionssystem mit der höchst möglichen Empfindlichkeit vor, da es das Vorhandensein einzelner Entitäten nachweisen kann. Für die meisten Anwendungen wäre dieser Empfindlichkeitsgrad bedeutungslos, da es schwer wäre eine spezifische Bindung einzelner Detektormoleküle von der unvermeidlichen nicht-spezifischen Bindung dieser Moleküle zu unterscheiden. Der hohe Empfindlichkeitsgrad jedoch würde sicherstellen, dass die Empfindlichkeit immer ausreichend wäre.
Es sollte erwähnt werden, dass der Polymerisationsschritt eine nicht spezifische Reaktion in dem Sinn darstellt, dass jedes Oligonukleotid mit der Fähigkeit in einer derartigen Reaktion teilzunehmen unter den angemessenen Bedingungen so reagieren kann. Folglich kann eine Anzahl unterschiedlicher Oligonukleotide in einer einzigen Reaktion polymerisiert werden. Der Kaskadenschritt ist dagegen ein spezifischer Schritt, der von der Zugabe eines spezifischen Oligonukleotids (oder Enzyms) abhängig ist, um die Kaskade freizusetzen. Dies kann für eine differentielle Färbung mehrerer Ziele genutzt werden. Falls eine Anzahl unterschiedlicher Oligonukleotide an eine entsprechende Anzahl von Antikörpern angehängt wurde, wobei diese an deren entsprechenden Antigene banden, konnten alle Oligonukleotide in einer einzigen Reaktion polymerisiert werden. Anschließend kann jedes Polymer als Matrize für eine spezifische Kaskadenreaktion verwendet werden, die durch das relevante Oligonukleotid freigesetzt wird. Folglich würde, falls die erste Kaskade mit einer roten Markierung, die zweite Kaskade mit einer grünen Markierung und die dritte Kaskade mit einer blauen Markierung freigesetzt wurde, das erste Ziel rot, das zweite grün und das dritte blau erscheinen.
Ko-Vermehrung von "irrelevanter" DNA
Wie vorstehend beschrieben, kann irgendeine andere DNA-Sequenz in die Anordnung einer Annealing-DNA angeordnet werden. Diese "irrelevante" DNA kann prinzipiell eines beliebigen Typs sein, solange die Größe nicht unmäßig ist, was die Polymerisation in Phase 1 unmöglichen machen würde. Folglich kann die DNA-Multiplikation und möglicherweise die Kaskade genauso wie die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und Klonierung zur Herstellung großer Mengen irgendeiner interessanten DNA-Sequenz verwendet werden. Die erzeugte DNA kann dann für beliebige Zwecke für die DNA verwendet wird, verwendet werden. Sie kann beispielsweise, während der Synthese markiert und als eine Hybridisierungssonde verwendet, oder kann durch Sequenzierung oder anderweitig charakterisiert werden.
Um die Vermehrung dieser DNA auszuführen ist es selbstverständlich erforderlich die Annealingsequenzen zu den Enden der DNA von Interesse zuzugeben. Dies kann jederzeit auf etliche Arten ausgeführt werden. Die Sequenzen können durch Standard-Ligationsverfahren direkt an die Enden der DNA ligiert werden, oder sie kann in einem Vektor beinhaltet sein, der zum Klonieren der DNA verwendet wird, beispielsweise wie in den meisten modernen Vektoren vorgefunden den Polylinker flankierend. Welches Verfahren auch immer gewählt wird, das Endergebnis wäre eine DNA-Sequenz, die durch eine DNA-Multiplikation und Kaskade zu einer Selbst-Vermehrung fähig ist. Falls es notwendig ist die vermehrte "irrelevante" DNA nach der Vermehrung aus der Vermehrungssequenz freizusetzen, dann kann die Annealing-DNA so gestaltet sein, dass sie Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme umfasst.
Falls eine Multiplikation mit Hilfe von zwei komplementären Oligonukleotidsequenzen verwendet wird, dann kann dies auf zwei unterschiedlichen Arten ausgeführt werden. Entweder kann ein erstes Oligonukleotid, bspw. ATGG, zu beiden Enden eines Batches bzw. einer Charge der zu vermehrenden "irrelevanten" DNA zugegeben werden, und ein zweites zu dem ersten komplementäres Oligonukleotid, in dem Fall CGAT, wird zu beiden Enden einer anderen Charge der "irrelevanten" DNA zugegeben, wobei die erhaltenen DNA-Sequenzen wie folgt hybridisieren und polymerisieren:
Oder das erste Oligonukleotid kann zu dem 5'-Ende und das zweite Oligonukleotid an das 3'-Ende der ersten Charge einer "irrelevanten" DNA zugegeben werden, während das erste Oligonukleotid zu dem 3'-Ende und das zweite Oligonukleotid zu dem 5'-Ende der zweiten Charge einer "irrelevanten" DNA zugegeben wird, wobei die erhaltenen DNA-Sequenzen wie folgt hybridisieren und polymerisieren:
Falls eine Multiplikation mit Hilfe eines Dyadensymmetrie zeigenden Oligonukleotids verwendet wird, dann wird dieses Dyadensymmetrie-Oligonukleotid, bspw. GAAATTTC, zu beiden Enden der "irrelevanten" DNA zugegeben, wobei die erhaltene DNA-Sequenz wie folgt hybridisiert und polymerisiert:
In diesen Ausführungsformen der Multiplikationsreaktion wird der erste Schritt einer Hybridisierung und Polymerisation komplementäre Kopien der "irrelevanten" DNA erzeugen; wobei der zweite Schritt tatsächliche Kopien der "irrelevanten" DNA erzeugen wird und so weiter. Das Ergebnis wird eine Matrize sein, die ein Versetzen tatsächlicher und komplementärer Kopien der erwünschten DNA umfasst. Eine nachfolgende Kaskadenreaktion, die sowohl die erhaltene Matrize als auch die Kopien der Matrize kopiert, wird somit eine Vielzahl von sowohl tatsächlichen und komplementären Kopien der erwünschten DNA erzeugen.
Andererseits wird, falls die Multiplikationsreaktion durch ein endlos-Kopieren einer die "irrelevante" DNA enthaltenden ringförmigen DNA ausgeführt wird, die erhaltene Matrize mehrere komplementäre DNA- oder RNA-Kopien der erwünschten DNA umfassen. Falls die Matrize als DNA vorliegt, wird eine nachfolgende Kaskadenreaktion im ersten Fall tatsächliche Kopien der erwünschten DNA, in dem folgenden Fall komplementäre Kopien davon und so weiter, erzeugen. Falls die Matrize als RNA vorliegt, kann diese durch reverse Transkriptase in cDNA kopiert werden, die tatsächliche Kopien der erwünschten DNA umfasst, wobei eine nachfolgende Kaskadenreaktion in dem ersten Fall komplementäre Kopien der erwünschten DNA, in dem folgenden Fall tatsächliche Kopien davon und so weiter erzeugt werden. Auf jeden Fall besteht das Endergebnis in einer Vielzahl von sowohl tatsächlichen und komplementären Kopien der erwünschten DNA.
Ko-Vermehrungsreaktionen können selbstverständlich ebenfalls, wie vorstehend beschrieben, durch Markierung zu Nachweiszwecken verwendet werden. Die in dem Kaskadenschritt erzeugte DNA-Menge wäre viel geringer, wobei dies jedoch tragbar sein kann. Außerdem könnte die größere Größe der Vermehrungseinheit das Rückhaltevermögen an der Stelle einer Synthese erhöhen, was die geringere Gesamtausbeute kompensiert.
Weiterhin wäre es mit der Ko-Vermehrung irgendeiner anderen DNA möglich die Kaskade mit einem Oligonukleotidprimer freizusetzen, der vielmehr an irgendeine Sequenz in dieser DNA hybridisiert als an die Oligonukleotidsequenz, die für die Polymerisation verwendet wird. Dies würde voraussichtlich die Spezifität der Reaktion weiter erhöhen.
In ähnlicher Weise kann das Detektormolekül als eine "irrelevante" Sequenz vorhanden sein, die das Vermehrungskonstrukt auf eine Stelle ausrichtet, die mit der "irrelevanten" Sequenz hybridisieren kann, wobei dadurch die Kaskadenreaktion an die Stelle gebunden wird.
Beispiele
Beispiel 1.
Bildung eines Polymers aus einer Tandemwiederholung einer Sequenz mit Dyadensymmetrie.
Die Sequenz 5'-ACAAATTTGT-3' weist eine Dyadensymmetrie auf. Das Oligonukleotid 5'-ACAAATTTGTACAAATTTGT-3' beinhaltet zwei Wiederholungen dieser Dyadensymmetrie und kann bis zu einer scheinbaren Größe von ungefähr 20 Kb (wie durch eine neutrale Agarosegel Elektrophorese abgeschätzt) durch die hier beschrieben Reaktion verlängert werden. In diesem Beispiel wird das erhaltene Polymer mit Digoxigenin markiert, da Digoxigenin markiertes dUTP zu der Reaktion gegeben wird. Das Digoxigenin-dUTP kann selbstverständlich weggelassen oder durch dTTP ersetzt werden.
Eine ähnliche Verlängerung wird erreicht, wenn das Oligonukleotid mit einem an das 5'-Ende angehängten Biotin-Molekül synthetisiert wird, das es ermöglicht das Oligonukleotid oder dessen Polymer an Avidin zu anzubringen, wenn derartiges erwünscht wird.
Die alle zehn Zyklen herausgenommenen 10 μl können dazu verwendet werden den Fortgang der Polymerbildung zu überwachen. Es scheint, wie aus den theoretischen Überlegungen vorhergesagt wurde, dass das meiste der Verlängerung in der letzten Inkubation stattfindet. Ebenfalls scheinen die Polymere, wenn sie länger werden, in der Größe stärker zu variieren, was ebenfalls erwartet wurde.
Verfahren:

Mische das Folgende in einem Endvolumen von 20 μl:

1–10 ng	(ungefähr 1 pmol) Oligonukleotid
2 μl	Glycerol
2 μl	10 × Taq-Puffer (geliefert durch den Anbieter der Taq-Polymerase)
2 nmol	jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP
500 pmol	dig-11-dUTP (Boehringer Mannheim)
2 E	Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim)

Wasser auf 20 μl

Inkubiere in einer Thermozykler für 10 Zyklen bei:
30°C für 2 Minuten
50°C für 1 Minute
70°C für 1 Minute.
Überführe dann 10 μl des Gemischs auf eine neue Reaktion und addiere das folgende Gemisch:

1 μl Glycerol

1 μl 10 × Taq-Puffer

2 nmol jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP

500 pmol dig-11-dUTP

2 E Taq-Polymerase

Wasser auf 10 μl.
Inkubiere in einem Thermozykler für 10 Zyklen bei:
40°C für 2 Minuten
65°C für 2 Minuten
90°C für 1 Minute.
Überführe dann 10 μl des Gemisches auf eine neue Reaktion und addiere das folgende Gemisch:

1 μl Glycerol

1 μl 10 × Taq-Puffer

2 nmol jeweils von dCTP, dGTP, dTTP

4 nmol dATP

500 pmol dig-11-dUTP

4 E Taq-Polymerase

Wasser auf 10 μl.
Inkubiere in einem Thermozykler für 10 Zyklen bei:
50°C für 2 Minuten
70°C für 10 Minuten
90°C für 1 Minute.
Danach weist in den hier zitierten Experimenten das Polymer eine Größe von ungefähr 20 Kb auf. Ein zweimaliges Wiederholen der letzten Inkubation führte zu keiner offensichtlichen Erhöhung in der Polymergröße.
Beispiel 2
Das bei Mukoviszidose mutierte Gen kann in Präparationen von Metaphase chromosomen und Interphasekernen gefärbt werden.
In diesem Protokoll wird ein Oligonukleotidsonde zirkularisiert und in einer Präparation fixierter Zellen eines gesunden menschlichen Spenders an die normale Variante des Mukoviszidosegens ligiert. Nach Ligation wird ein zweiter Primer zugegeben. Dieser Primer hybridisiert an den Teil des Rings, der nicht mit der genomischen DNA hybridisiert und initiiert durch rollende-Kreis-Replikation des Rings eine Polymerbildung. Danach wird der gleiche Primer erneut zugegeben, wobei jedoch dieses Mal zusammen mit einem nicht komplementären Primer, der mit dem Polymer hybridisieren kann. Diese beiden Primer zusammen erzeugen dann eine Kaskadenreaktion an dem Polymer. Unter Einschluss von Digoxigenin markiertem dUTP in das Reaktionsgemisch kann diese Kaskadenreaktion anschließend durch Inkubation mit Fluorochrom markiertem Anti-Digoxigenin Antikörper sichtbar gemacht werden.
An Stellen, an denen alle Reaktionen optimal wirken, erscheint die Färbung in Metaphasechromosomen ein wenig verringert, die in der Mitte des langen Arms von Chromosom 7 gelegen ist. Keiner der Schritte wirkt jedoch zu 100% in allen Zellen, so dass das Erscheinungsbild von Zelle zu Zellen variieren wird. Falls das erste Oligonukleotid nicht an die Zielsequenz hybridisiert oder falls es nach Hybridisierung nicht ligiert ist, kann keine Färbung erzeugt werden. Das gleiche trifft zu, falls die Hybridisierung das Polymer erzeugende Oligonukleotid oder die rollende-Kreis-Replikation fehlschlagen. Die Kaskade kann wo alle diese Reaktionen wirkten, freigesetzt werden. Die Menge von in diesen Reaktionen hergestellter (markierter) DNA wird erwartungsgemäß abhängig davon, wie stark die einzelnen Polymere in dem vorhergehenden Schritt (je länger das Polymer desto mehr Kaskadenprodukt) zunahmen und abhängig von räumlichen Bedingungen an der einzelnen Stelle (wie viel DNA aufgenommen werden kann) variieren. Das Erscheinungsbild einzelner Chromosomen 7 variiert damit übereinstimmend nach der Reaktion von keinem Signal zu einem Punkt-ähnlichen Signal zu einem verringert-ähnlichen (down-like) Signal, wobei von den zwei Chromosomen 7 in einer Einzelmetaphase keines, eines oder beide gefärbt werden können.
Die meisten Interphasenkerne beinhalten ebenfalls gefärbte Stellen. Da die Kerne jedoch anders als die Chromosomen keine morphologischen Merkmale zeigen, die eine Bestimmung unterstützen ob die Färbung an der passenden Stelle lokalisiert ist, ist dieses Ergebnis schwerer zu interpretieren.
Verfahren
Stelle eine frische Ausbreitung von in Methanol und Essigsäure (3:1) fixierten Zellen auf einem Objektträger her. Um den Zugang zu den Hybridisierungsstellen zu fördern, ist es wichtig, dass die Chromosomen gut ausgebreitet und nicht im dichten Zytoplasma eingebettet sind.

Bereite das folgende Gemisch für eine Hybridisierung und Ligation der Mukoviszidoseprobe:

2,5 pmol	Sonde (5'-AAGATGATA(T)₄CTTTAATG(T)₁₀ATAATGTTAA GTGACCGGCAGC(A)₄TG(T)₁₆CATCATAGGAAACACCA-3')
5 μl	10 × Tth Ligase-Puffer (1 × Puffer: 20 mM Tris-HCl pH-Wert 9,0, 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA und 0,1% "Triton^® X-100")
10 μl	10 mM NAD
5 μg	Ultraschall behandelte und denaturierte Lachsspermien-DNA
5 μg	BSA
5 μl	Glycerol
12,5 E	Tth DNA-Ligase

Wasser auf 50 μl.

Gebe das Gemisch auf den Objektträger und breite es mit einem Deckglas aus. Inkubiere bei 92,5°C für 2,5 Minuten (um die genomische DNA zu denaturieren) und dann bei 55°C für 30 Minuten (um Sonde zu hybridisieren und zu ligieren).
Wasche anschließend in 30% Formamid, 2 × SSC pH-Wert 7,0 (1 × SSC: 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat) bei 42°C für 10 Minuten und in 2 × SSC bei 55°C für 10 Minuten, um sowohl freie als auch nicht ligierte Sonde zu entfernen.
Dehydriere den Objektträger in einer Ethanolreihe (70–90–99%) und trockne an der Luft.
Der Objektträger ist jetzt für eine Polymerbildung bereit.

Um diese auszuführen, mische das Folgende:

1 pmol	Primer (5'-TGCTGCCGGTCACTTAACAT-3')
5 nmol	jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP
5 μg	BSA
5 μl	10 × Φ-29 Puffer (1 × Φ-29 Puffer: 50 mM Tris-HCl pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl₂, 20 mM (NH₄)₂SO₄, 1 mM DTT)
340 ng	10 × Φ-29 DNA-Polymerase

Wasser auf 50 μl.

Gebe das Gemisch auf den Objektträger, breite mit einem Deckglas aus und inkubiere bei 30°C für 1 Stunde.
Überführe den Objektträger in Waschpuffer (4 × SSC, 0,05% Tween^®-20) und wasche für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
Dehydriere den Objektträger in einer Ethanolreihe (70–90–99%) und trockne an der Luft.
Der Objektträger ist jetzt für die Kaskadenreaktion bereit.

Um die Kaskadenreaktion auszuführen, mische die folgenden Reagenzien:

4 pmol	des Primer, der zur Erzeugung des Polymers verwendet wurde
4 pmol	eines zu dem Polymer komplementären Primers (in diesem Fall: 5'-AAGATGATATTTTCTTTAATG-3')
5 nmol	jeweils von dATP, dCTP und dGTP
4 nmol	dTTP
1 nmol	Digoxigenin dUTP
5 μl	Glycerol
5 μl	10 × Φ-29 Puffer
340 ng	Φ-29 DNA-Polymerase

Wasser auf 50 μl.

Gebe das Gemisch auf den Objektträger, breite mit einem Deckglas aus und inkubiere bei 37°C für 1 Stunde. Überführe den Objektträger in Waschpuffer und äquilibriere in diesem Puffer für 5 Minuten.
Gebe dann 100 μl Fluorescein markierten Anti-Digoxigenin Antikörper hinzu, um die in-situ (mit dem Deckglas ausgebreitet) synthetisierte Digoxigenin markierte DNA sichtbar zu machen. Der Antikörper sollte in mit 5% fettfreier Trockenmilch ergänztem Waschpuffer bereitgestellt werden. Inkubiere für 30 Minuten bei Raumtemperatur bis 37°C und im Dunkeln. Wasche den Objektträger 3 × 5 Minuten in Waschpuffer bei Raumtemperatur.
Der Objektträger kann jetzt analysiert werden.

Claims

Test auf die Anwesenheit eines biologischen Moleküls, umfassend den Nachweis des biologischen Moleküls durch dessen Eigenschaft, als Matrize zur Zirkularisierung und Ligierung eines linearen Oligonucleotids, das zu ihm hinzugefügt wurde, zu dienen, wobei das entstandene ringförmige Oligonucleotid als eine Matrize verwendet wird für ein endlos-kopierendes Verfahren in Anwesenheit der notwendigen Nucleosidtriphosphate mit Hilfe einer Nucleinsäurepolymerase, die zur Strangverdrängung fähig ist und im Wesentlichen keine 5'-3'-Exonucleaseaktivität aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrize für die Bildung des ringförmigen Oligonucleotids auch das 3'-Ende bereitstellt, das zur Polymerbildung durch rollenden-Kreis-Replikation des zirkularisierten Oligonucleotids benötigt wird.
Test gemäß Anspruch 1, wobei das 3'-Ende, das zur Polymerbildung durch rollenden-Kreis-Replikation des zirkularisierten Oligonucleotids benötigt wird, künstlich durch Verdau des biologischen Moleküls mit einem Restriktionsenzym hergestellt wird.
Test gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Matrize für die Ligierung an einer bestimmten Stelle fixiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem chromosomalen Locus, einer Mikrotiter-Vertiefung, einem magnetischen Kügelchen oder einem Sequenzierkamm, so dass auch das Polymer an dieser Stelle fixiert wird.
Test gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Polymerase eine RNA-Polymerase ist und das Verfahren ferner umfasst, dass ein DNA-Multimer aus dem resultierenden RNA-Multimer mit Hilfe einer reversen Transkriptase und eines DNA-Primers erzeugt wird.
Test gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die verwendeten Nucleosidtriphosphate markiert sind.
Test gemäß Anspruch 5, wobei die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Enzym, einem radioaktiven Isotop, einer fluoreszierenden Verbindung, einer chemilumineszierenden Verbindung, einer biolumineszierenden Verbindung, einem Metallchelat und einem Hapten, das durch eine spezifische Sekundärreaktion nachweisbar ist.
Test gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, der ferner eine DNA-Kaskadenreaktion als einen hinzugefügten Nachweisschritt umfasst.
Test gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Matrize unterbrochen ist (mit einem 3'-Ende), was den Nachweis einer Zielsequenz oder von Chromosomen-Brüchen erlaubt.