CN104919057B - 基于rca的局部扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于进行包括至少两轮RCA的局部RCA反应的方法，其中将第二RCA反应的产物附着并从而局限于第一RCA反应的产物，所述方法包括：(a)提供第一RCA产物；(b)将包含或提供用于第二RCA反应的引物的探针与所述第一RCA产物直接或间接杂交；和(c)使用(b)的所述RCA引物进行第二RCA反应以形成第二RCA产物，其中在所述反应中：(i)所述探针和所述引物不能引发使用所述第一RCA产物作为模板的延伸，或限制任何所述延伸以避免与所述第一RCA产物杂交的任何探针的置换；(ii)维持(b)的所述RCA引物与所述第一RCA产物的直接或间接杂交并且，依靠所述杂交，所述第二RCA产物附着于所述第一RCA产物；(iii)用于所述第二RCA反应的RCA模板包含在所述探针中或由所述探针提供，或被单独提供。所述方法在分析物的检测中是特别有用的，其中所述分析物为核酸或其中核酸用作或产生为所述分析物的标志物。

Description

基于RCA的局部扩增方法
技术领域
本发明总体上属于利用滚环扩增(RCA)的核酸扩增领域，具体属于在至少两轮扩增中产生基于RCA的局部高度线性扩增的构思。第二(或进一轮)RCA反应的产物并非以物理方式源自第一(或更早的)RCA产物，并且第二轮或进一轮的RCA扩增提供了用于放大可从滚环扩增反应获得的信号的方式。本发明的方法包括通过第二单独的RCA模板的RCA产生第二RCA产物。通过确保第二RCA的反应产物物理附着于第一RCA反应的产物，可获得局部扩增反应。本发明提供了此类方法，并且在来自基于检测RCA产物的检测测定的信号的放大中特别有用。
背景技术
滚环复制(RCR)是实质上用于环状DNA分子诸如质粒或病毒的复制的机制。该反应已被采用作为用于扩增环状分子的实验室方法的基础，并且已被证实可用于多种使用或产生环状核酸分子作为报告分子的测定中，其中通过RCA扩增(复制)环状分子，并且检测复制或扩增的环状核酸分子。在其他方法中，可通过RCA来环化并扩增所需分子或靶分子。因此，滚环复制(RCR)现在通常被称为滚环扩增(RCA)，并且这些术语在本文中可互换使用。
RCA涉及使用环状单链核酸分子例如寡核苷酸作为滚环模板，并使用链置换聚合酶延伸与所述环状模板杂交的引物(所述链置换活性置换引物并有效地使环“滚动”)进行的核酸分子的合成。引物在某些典型测定中可由靶核酸(RNA或DNA)分子提供。聚合酶和核苷酸的添加启动合成反应，即聚合。由于滚环模板是无尽的，因此所得产物是由与滚环模板互补的串联重复组成的长单链核酸分子(即多联体)。
实际上，RCA反应通常利用线性核酸分子，例如寡核苷酸诸如在下文中更详细描述的锁式探针，通常通过例如使用连接酶将所述核酸分子的末端连接在一起来操纵所述核酸分子以产生环状核酸模板分子。例如，可通过与用作连接模板的靶核酸分子上的相邻序列杂交来将核酸分子的末端彼此接近。环状核酸分子的形成使得其在RCA反应中能够被拷贝。该反应可通过向封闭环添加引物来引发，或可从靶核酸分子即连接模板产生引物。初始引物从而形成RCA产物的部分。这可以是特别有利的，因为其可允许对靶核酸进行局部检测，即在其中固定用于引发RCA的核酸分子的实施方案中，所述RCA产物也将被固定。
因此，RCA产物可保留作为核酸环的一串串联重复互补拷贝(多联体)，其对于原位检测是特别有用的，但也可在均相(“溶液中”)测定中被检测到。例如，RCA反应可在仅1小时内导致环的1000倍扩增(基于由约100个核苷酸组成的环)。因此，环状寡核苷酸的RCA可产生形成直径可为约1μm的DNA束或“串滴(blob)”的RCA产物。所述产物可通过缀合于荧光标记的核酸探针的杂交来检测，即串滴DNA，所述杂交允许通过荧光显微镜术或流式细胞术使串滴可视化。在其它实施方案中，可通过用限制性内切酶或核酶进行消化来将RCA产物还原成单体，随后检测所述单体。
由于RCA反应产生可容易检测的信号的能力，因此其用作用于检测样品中的任何核酸分子的报告系统，所述核酸分子可以是靶核酸分子(即靶待检测的核酸分子，或其中所述核酸分子是测定的"分析物")，或其可以是待检测作为靶分析物存在的标志物(或替代物)的核酸分子。因此，RCA反应已被用于直接检测细胞和组织样品中的靶核酸，例如核酸分子的原位(即局部)检测，这对于研究和诊断目的具有重大意义。然而，RCA测定不限于用于非均相形式，而且还可用于均相测定(参见例如WO 2009/037659)。
RCA也已被用于用于检测其它分析物，即除核酸分子外的分析物诸如蛋白质、肽等的方法。在这方面，已开发了多种测定法，其中核酸分子可用于直接或间接标识或标记样品中的靶分析物，并且所述核酸分子的检测用于指示分析物在样品中的存在。在一些方法中，当一种或多种分子与靶分析物相互作用(例如，结合)时，可在样品中产生新的核酸分子(即不存在于原始样品中并且不是添加至样品的组分之一的核酸分子)。所产生的核酸分子的检测指示样品中的所述分析物。
基于使用RCA反应作为检测策略的部分来检测此类替代物或标志核酸分子的各种方法在本领域中进行了详尽描述，包括例如免疫-RCA、使用锁式探针的测定和产生环状核酸分子的接近式探针的测定。在所有这些情况下，所述方法依赖于提供或产生随后可用作RCA反应的底物(模板)的环状核酸分子，并且RCA产物随后可被检测作为用于直接检测靶分析物的替代物。
免疫-RCA包括利用核酸分子标记特定靶分析物的抗体。通常，靶分析物例如被第一抗体被捕获在底物上，并与抗体:核酸复合物接触。将环状(或可环化的)寡核苷酸与缀合于所述抗体的核酸杂交(可预先杂交所述寡核苷酸，或在已使抗体与靶分析物相互作用后添加所述寡核苷酸)。可在将样品经历RCA以扩增环状/环化的寡核苷酸之前洗掉过量的抗体。缀合于抗体的核酸分子用作进行RCA的引物。因此，RCA产物被系连于与靶分析物相互作用的抗体，从而允许局部检测样品中，例如细胞或组织样品中的分析物。
接近式测定依赖于"接近探测"的原理，其中通过多个(即2个或更多个，通常2个或3个)探针的结合来检测分析物，所述探针，当通过结合于分析物而被拉近(从而称为“接近式探针”)时，允许信号产生。通常，接近式探针的至少一个包含连接于探针的分析物结合域的核酸域，并且信号的产生牵涉核酸部分和/或由其它探针携带的其它功能性部分之间的相互作用。因此信号的产生取决于探针之间的相互作用(更具体地讲是通过核酸或由它们携带的其它功能性部分/域进行)，并因而仅当探针已结合于分析物时才发生，从而赋予检测系统提高的特异性。近年来接近探测的构思已得到发展，许多基于该原理的测定现在本领域中是公知的。例如，接近式连接测定(PLA)依赖于接近式探针与分析物的靠近结合，以从牵涉接近式探针的核酸域的或由所述核酸域(例如在其之间和/或以其为模板)介导的连接反应产生信号。
接近式探针的核酸域在接近时，基于所谓的锁式探针原理(如例如由Landegren等人在WO 99/49079中描述的)，可作为一个或多个添加的寡核苷酸的彼此连接(包括分子内连接)的模板来环化一个或多个添加的线性寡核苷酸，从而形成核酸环。在此类方法中，通过与由一个或多个接近式探针的核酸域提供的一个或多个环化模板杂交使添加的线性寡核苷酸的末端并置以便连接。各种此类测定式描述于WO 01/61037中。
因此明显的是，RCA可在样品中任何核酸分子的特异性检测中具有效用，无论其为样品中的“原始”靶分析物，还是其为通过特定检测分子例如接近式探针与靶分析物例如蛋白质的相互作用产生的“替代”靶分析物。RCA还可用于检测扩增的核酸分子。例如，在其中靶核酸分子以低量存在的样品(例如稀有转录物)中，RCA可用于通过增加可用于被检测的核酸的量来“增强”检测。
基本RCA反应的各种改进已被提出，包括提供高度线性扩增，例如以提高基于检测RCA产物的测定的灵敏度。
这些方法中的许多方法还包括扩增在第一RCA反应中产生的信号，即基于第一RCA产物的扩增。一般地这些方法集中在使用第一RCA反应的产物作为引物延伸的模板的技术上。例如，在超分支RCA反应(HBRCA)中，引物与通过第一RCA反应产生的多联体RCA产物中的每一个串联重复杂交。随后使用第一RCA产物作为模板延伸引物。随着每一个引物被延长，其遇到下游引物的产物并置换其以产生原始第一RCA反应产物的序列的单链串联重复。此外，第一RCA反应的引物可随后与产生的(被置换的)单链中的串联重复杂交，并延伸以形成另外的置换链，依此类推。因此，交替的链拷贝和链置换过程产生DNA分支的连续扩展模式，并且依靠链置换，还产生一组离散的包含具有环的单位长度及其多倍长度的双链小片段的游离DNA片段。这由Lizardi在Nature Genetics 1998,19,225-2323和WO 97/19193中进行了描述。
类似方法是DNA级联反应，如由Koch在WO 97/20948中描述的，但在该情况下引物延伸时间受到控制，以使链的拷贝不进行至末端，并且被置换的链仍然附着于模板(RCA产物)。
在WO 03/012199中，描述了基于重复RCA反应的称为环-对-环(circle-to-circle)(C2C)法的方法，该方法还可用于扩增从第一RCA反应产生的信号。同样，第一代RCA产物用作用于延伸与所述产物杂交的引物的模板。然而，在该方法中，第一代RCA产物被切割成单体(每一个单体对应于多联体产物中的一个串联重复)，所述单体被环化，随后在进一轮RCA中用作RCA模板。由于在该方法中第一RCA产物被切割，因此第二RCA产物不可能局限至第一产物。
在US 5,854,033中，Lizardi描述了称为巢式连接介导的RCA(嵌套LM-RCA)的另外方法。LM-RCA包括基于与锁式探测类似的原理产生RCA产物，其中可环化的寡核苷酸("开族环探针")与靶核酸序列(如果存在的话)杂交，随后被连接以形成环。连接后，引物与所述环杂交，随后进行RCA反应以产生包含环的串联重复的互补拷贝的线性RCA产物(称为"串联序列DNA；TS-DNA)。在巢式LM-RCA反应中，为了放大信号，将另外的可环化的寡核苷酸与TS-DNA杂交，连接，随后经历第二轮RCA。应理解，在这些方法中，在RCA反应过程中，环化的寡核苷酸可被置换，从而与其靶(与所述环化寡核苷酸杂交的)分离。对于其中期望局限化信号的原位方法，提出了其中连接第一可环化寡核苷酸(OCP)但不进行扩增，并且将第二可环化寡核苷酸与所述第一环化的寡核苷酸(OCP)杂交的替代方法。
Ward在美国专利No.6,686,157中描述了作为用于通过RCA使信号能够放大的工具的称为棒棒糖探针的新型探针。所述棒棒糖探针(lollipop probe)是具有两个靶向结合臂和为添加的环状DNA分子的RCA提供结合位点和引物的第三臂的分支三尾结构。靶结合臂被设计来结合靶核酸分子上的相邻序列，以便在与靶杂交后它们可被连接在一起，拓扑地将探针连接于其靶序列。Ward的核酸靶是期望被检测到的分析物核酸分子，并且无迹象表明所述靶本身可以是RCA产物。
虽然已描述了基于进行初始RCA产物的第二扩增的用于信号放大的方法，但存在对开发具有增强的灵敏度和/或性能，例如具有更强的信号、更快的信号产生和/或提高的信噪比的测定的持续需要。特别地，存在对开发其中第二信号可被局限于第一信号的测定(例如(但不仅仅)在原位检测方法的情况下)的需要。在某些情况下将基于初始检测产物的信号检测偶联和共局限于基于第二检测产物的信号检测可以是有用的或需要的。
发明内容
本发明涉及解决此需求，并且基于进行第二RCA反应的构思，所述第二RCA反应取决于第一RCA反应，但不扩增第一RCA产物，以放大可通过第一RCA反应产生的信号(换句话说，以通过第二RCA产生更多的可被检测到以产生信号的"信号产物")。本发明的重要特征是第二RCA产物物理附着于第一RCA产物并且保持所述附着，以使来自第二RCA产物的信号被局限于第一RCA产物。
通过使用与第一RCA产物杂交(直接或间接)以扩增第二RCA模板环的RCA引物，可通过RCA引物的延伸产生第二RCA产物，所述第二RCA产物，依靠引物的杂交，从而与第一RCA产物杂交，并从而附着于其。由于第一RCA产物是包含第一RCA反应的模板环("第一RCA环")的串联重复互补拷贝的多联体，因此用于第二RCA的RCA引物将结合在整个第一RCA产物中重复的其同源引物-结合序列的重复拷贝。换句话说，第一RCA产物将包含用于第二RCA的RCA引物的重复结合位点(每一个串联重复(多联体的“单体”)中一个)。每一个此类引物可引发第二RCA反应，从而导致增加的(高度线性)扩增。
为了保持RCA引物与第一RCA产物的杂交(并从而保持第二RCA产物的局限化)，必须确保使用第一RCA产物作为模板的延伸不发生，或限制确实发生的任何延伸，使得不存在任何下游杂交的引物的置换。因此，本发明的另一特征是第二RCA引物不能使用第一RCA产物作为模板来引发延伸，或限制任何所述延伸以避免下游杂交的引物的置换。当简单的RCA引物将在其5'末端退火至第一RCA产物并且将具有可用于结合第二RCA模板环的游离的非杂交的3'末端，并从而不应具有可用于在第一RCA产物上引发延伸的杂交的3'末端时，可能可以例如通过聚合酶的外切核酸酶作用降解引物的单链3'末端来产生能够在第一RCA产物上引发引物延伸的构建体。因此重要的是以此类方式进行所述方法，以使RCA引物不能在第一RCA产物上引发至任何显著的程度。如将在下文中更详细描述的，所述延伸可通过设计或修饰RCA引物以便其不能在第一RCA产物上用作引物来阻止或限制，例如，通过将“外切核酸酶阻断区”整合进引物，以阻止外切核酸酶消化产生能够在第一RCA模板上引发的引物，和/或通过确保反应混合物中不存在外切核酸酶活性，例如通过使用不具有外切核酸酶活性的聚合酶。此外，还如下文中更详细地描述的，设想可以以各种形式提供探针，所述探针与第一RCA产物杂交并且可包含或提供用于第二RCA的引物，包括例如通过探针的解折叠(即探针的双链部份的释放或打开，以暴露单链区)或切割。此类探针还可包含或提供第二RCA反应的其它组分(例如第二RCA模板)。此类探针可包含与靶杂交的3'末端。在此类实施方案中，重要地的是确保防止或阻断此类杂交的3'探针末端(其不用作第二RCA引物)在第一RCA产物(作为模板)上延伸。这可通过将保护基团掺入杂交的3'末端和/或通过使用阻断性寡核苷酸来实现，所述阻断性寡核苷酸本身被阻止延伸和置换，在引物提供探针之间杂交。因此，可限制确实发生的以任何第一RCA产物为模板的延伸延伸进任何下游杂交的探针并置换所述探针。这在下文中将进一步描述。
因而，有利地，本发明的方法允许第二RCA被局限于第一RCA。如将在下文中进一步解释的，这在靶分析物的局部(空间)检测中(例如，在原位检测方法中)可具有益处。由于用于第二RCA的模板分子不直接结合于第一RCA产物，因此因环的杂交和成链而引起的拓扑约束的任何可能问题(所述问题在本领域中被认为抑制RCA反应)得以避免。
由第二RCA反应提供的强信号放大可增强方法的灵敏度并且提供容易地检测RCA产物或使其可视化(例如在低显微镜放大倍数下，或利用数字成像扫描法，或可能甚至无需借助显微镜)的能力。来自增加的量的第二RCA产物的强信号还可打开在RCA基检测测定中使用其它检测方式，例如流式细胞术的可能性，从而增加可能用于所述测定的仪器基础。可以甚至通过可能的第三代或进一代RCA(其全都依靠用于每一代RCA的引物来联系，所述引物使先前的RCA产物与下一代RCA产物发生联系)来进一步增强信号放大。
此外，由于可在第一RCA反应过程中(即当第一RCA产物形成时，或当第一RCA反应正在进行时)启动第二RCA反应，因此可实现更快的信号产生，从而导致更快速的测定。
鉴于该两代以上RCA的偶联产生增强的和更快的信号放大，我们已将该新方法称为超级RCA(sRCA)。
在其最宽泛的第一方面，本发明提供了用于进行包括至少两轮RCA的局部RCA反应的方法，其中第二RCA反应的产物附着并从而局限于第一RCA反应的产物，所述方法包括：
(a)提供第一RCA产物；
(b)将包含或提供用于第二RCA反应的引物的探针与所述第一RCA产物直接或间接杂交；和
(c)使用(b)的所述RCA引物进行第二RCA反应以形成第二RCA产物，其中在所述反应中：
(i)所述探针和所述引物不能引发使用所述第一RCA产物作为模板的延伸，或限制任何所述延伸以避免与所述第一RCA产物杂交的任何探针的置换；
(ii)维持(b)的RCA引物与第一RCA产物的直接或间接杂交，并且，依靠所述杂交，第二RCA产物附着于第一RCA产物；
(iii)用于所述第二RCA反应的RCA模板包含在探针中或由探针提供，或被单独提供。
(a)、(b)和(c)可同时或相继地进行。
用于第二RCA反应的RCA模板("第二RCA模板")可以以环或可环化的形式存在。"可环化的"意指RCA模板以具有可连接的末端的线性分子形式存在，所述线性分子可通过将末端直接或间接地连接在一起(即彼此连接，或连接于间插("间隙")寡核苷酸的各自末端或可环化的RCA模板的延伸的3'末端)来环化。还可在可被连接在一起形成环的两个或更多个部分即两个或更多个分子(即寡核苷酸)中提供可环化模板。当所述RCA模板是可环化时，在RCA之前通过连接将其环化。连接可使用连接模板作为模板来进行。因此，当RCA模板是可环化时，连接模板可包含在所述探针中或由所述探针提供，或其可被单独地提供。可环化的RCA模板(或模板部分或部份)将在其各自的3'和5'末端区包含连接模板的对应同源互补区(或结合位点)的互补序列，所述互补序列可以是相邻，其中末端彼此直接连接，或非相邻的，中间存在间插“间隙”序列，其中将发生间接连接。在其中单独地提供用于环化可环化RCA模板的连接模板的实施方案中，其可例如由也与第一RCA产物直接或间接杂交的不同的第二探针提供。此类第二探针可视为"连接模板探针"或"环化探针"，或为"第二探针"(在该情况下，上述方法中提及的引物提供第一探针可被视为"初始探针")。
第一RCA产物可以是初始(即最初的)RCA反应的产物，或其可以是进一轮或随后的RCA反应的产物。第二RCA反应可以是第二轮或进一轮或随后的RCA反应。因此应理解，本发明的方法可包括多个连续轮的RCA，例如2、3、4或更多轮，其中在每一轮中，使用与先前轮的RCA的反应产物直接或间接杂交的探针。换句话说，本发明的方法可包括重复步骤(a)、(b)和(c)一次或多次。
本发明的特征是第一RCA产物在方法中保持完整，即其不被切割(例如其不被切割成单体)。
由于RCA产物含有多个重复(或串联)拷贝(或单位)的序列(即其为单体的多联体)，因而可结合多个探针。因此，本发明的方法更具体地包括将多个探针与第一RCA反应产物杂交(直接或间接)。如本文中所用，术语"多个"或"大量"意指两个或更多个，例如至少2个、3个、4个、5个、6个、10个、20个、30个、50个、70个或100个或更多个。将探针与存在于第一RCA产物的每一个重复单位或单体(每一个重复单位或单体是用于产生第一RCA产物的环状RCA模板("第一RCA模板")的互补拷贝)中的结合位点直接或间接杂交。应理解，虽然第一RCA反应的产物的每一个重复单位或单体包含探针的结合位点，但实际上，并非所有这些结合位点可(或将)在探针杂交后被探针占据。许多或多个此类结合位点被探针结合就可满足。因此，在本发明的方法中，探针可与存在于第一RCA产物的单体中的探针结合位点杂交，或与与存在于第一RCA产物的单体中的互补序列杂交的中间核酸分子杂交。更具体地，探针与RCA产物的至少一个单体中的探针结合位点杂交，或与中间核酸分子杂交，所述中间核酸分子与存在于第一RCA产物的至少一个单体中的互补序列杂交。
探针可与第一RCA产物直接杂交，即其直接结合于存在于第一RCA产物中的与所述探针中的结合位点互补或“同源”的探针结合位点。或者，探针可以例如通过结合于中间核酸分子来间接杂交，所述中间核酸分子本身与第一RCA产物杂交(直接或间接)。在此类实施方案中，探针结合于存在于中间核酸分子中的互补(或同源)结合位点。所述中间核酸分子可通过与存在于第一RCA产物的每一个重复单位(或单体)中的互补(或同源)结合位点杂交而结合于第一RCA产物。然而，如上文所示，情况也许是并非每一个中间分子或并非中间分子中的每一个探针结合位点将被探针占据。如果第二探针，如上文中所述，用于提供用于环化的连接模板，则类似的考虑适用。
在本发明的方法中，探针包含或提供用于第二RCA反应的引物。在某些实施方案中，其还可包含或提供用于第二RCA反应的环状或可环化的RCA模板，并且如果需要的话，环化可环化的所述第二RCA模板的连接模板。如将在下文中更详细地描述的，探针可包含或含有能够直接用作引物或用作RCA模板等的部份或域。因此，简单来说，以及如下文中进一步描述的，探针可仅包含一段能够与RCA模板杂交并引发其复制的核苷酸。同样地在其它实施方案中，可将能够用作RCA模板的预先形成的环状核酸分子提供为探针的部分(例如所述探针可包含此类与另一个寡核苷酸杂交的环-进一步参见下文)。然而，在其它实施方案中，探针被设计来释放，或产生，或生成RCA反应所需的引物、RCA模板和任选地连接(环化)模板组分(换句话说RCA反应的核酸组分)或使得所述组分能够生成。这可以例如通过解折叠和/或切割探针以释放或暴露部份或域来实现，所述部分或域随后能够用作RCA组分，例如用作RCA引物和/或用于RCA模板的产生的连接(环化)模板(其可从释放的探针域或从添加的组分例如添加的寡核苷酸产生)。因此，此类通过探针的解折叠或切割释放的组分可能能够直接用作RCA组分，例如引物，或释放的核酸组分或域可彼此相互作用，或与其它添加的组分(例如其它探针(例如如上文中所述的第二探针)或添加的寡核苷酸)相互作用以形成用于RCA的环状模板以及最终地RCA引物/模板复合物，以使得第二RCA能够进行。如果组分从探针的部分或域释放或从所述部分或域产生(而非通过所述部分或域产生)，则组分由探针"提供"。然而，探针组分(例如环化/连接模板)可用于从添加的材料例如添加的寡核苷酸或添加的可环化的RCA模板产生其它RCA组分。
因此可看出，探针可间接含有，或产生RCA引物，并且如果需要的话，还可含有或产生环状或可环化的RCA模板，以及任选地用于环化可环化的RCA模板以形成环状RCA模板的连接(环化)模板。术语"提供"相应地出于这一考虑来进行解释。因此，在本文中所用，术语"提供"意指探针"含有"或能够产生所述组分(或RCA成分)。以RCA引物为例，"探针提供引物"意指引物成分、引物的核苷酸的序列(寡核苷酸序列)包含在探针内，以及可以例如通过探针的切割和/或解折叠从探针产生或释放。引物从而从探针衍生。
本发明的探针从而可采取各种形式，并且可包含一条或多条链或组分寡核苷酸或由其组成。一条此类链或组分寡核苷酸可以是预先形成的环(其可以是第二RCA反应的模板)。因此在某些实施方案中，探针可包含与一条或多条其它链或寡核苷酸杂交的预先形成的环。探针从而可被视为核酸构建体，其可包含一条或多条(例如两条或更多条或三条或更多条)杂交在一起的组成链(或寡核苷酸)。探针可含有一个或多个双链区，所述双链区可通过分子内杂交例如一个或多个发夹结构或茎环结构形成，或通过单独的寡核苷酸组分(链)的分子间杂交形成。
所述探针包含：
(i)包含与靶核酸分子互补(从而能够与其杂交)的区的域("结合域"，或更具体地"靶结合域")，其可以是第一RCA产物或与第一RCA产物杂交(直接或间接)的中间分子。互补的区从而构成靶分子(其本身含有同源或互补结合位点(或互补的区))的结合位点。
(ii)包含或能够提供用于第二RCA反应的引物的域("引物域")；
(iii)包含与用于所述第二RCA反应的环状或可环化模板("第二RCA模板")互补(从而能够与其杂交)的区的域("RCA-模板互补域")。互补的区从而构成模板(其本身包含同源或互补结合位点(互补的区))的结合位点。所述域可以是分开的或重叠的。例如，域(ii)与(iii)可重叠。
在其中域(iii)与可环化模板互补的实施方案中，所述域还可用作用于可环化模板的环化的连接模板。因此，探针还可包含：
(iv)包含或能够提供用于环化用于第二RCA的可环化模板的连接模板(或环化模板)的域("连接-模板域")。域(iv)可与域(iii)重叠。
在某些实施方案中，探针还可包含：
(v)包含或能够提供用于第二RCA反应的环状或可环化模板("第二RCA模板")的域("RCA模板域")。
域(ii)至(v)，尤其是域(ii)、(iv)和(v)可被视为包含或提供RCA反应的核酸组分。因此，在某些实施方案中，探针可包含或提供RCA反应所需的所有核酸组分，即RCA引物和RCA模板，其可以以环状或可环化的形式存在，并且如果所述RCA模板是可环化的，则还可包含或提供用于环化可环化的RCA模板的连接模板。此类探针在本文中被称为"RCA报告分子"，并且在下文中(和在与其同日提交的我们的共同未决的标题为"Product and Usethereof"的英国申请(其公开内容通过引用并入本文)中)进行进一步描述。
然而，探针不必提供用于第二RCA反应的所有核酸组分，并且可单独提供第二RCA模板。例如，可单独地提供用于第二RCA的环状模板。在其它实施方案中，单独地提供可环化的RCA模板。这可以是具有可用于连接在一起(直接或间接)的游离3'和5'末端的线性寡核苷酸。可环化的RCA模板可以与连接模板杂交，使得各自的5'和3'末端并置以便直接地连接在一起，或间接连接于间插"间隙"寡核苷酸的各自末端，或者在连接之前，可环化的分子的杂交的3'末端可通过"间隙填充"聚合酶延伸反应延伸以到达5'末端，在所述末端之前，通过连接进行联接以环化所述分子。有利地，根据本发明，用于环化的连接模板包含在探针中或由探针提供。
在其它实施方案中，探针可与其它添加的反应物例如添加的寡核苷酸相互作用，以产生用于第二RCA反应的环状模板。因此探针可提供与另一个单独地提供的连接模板协同作用以允许两个或更多个添加的寡核苷酸环化的连接模板。例如，探针可包含连接模板域，所述连接模板域可与其它单独的连接模板域(例如由第二不同探针提供的)一起作用，以作为模板将两个或更多个添加的寡核苷酸连接成环，从而产生用于第二RCA的环状模板。或者，探针可包含与可环化的第二RCA模板的区互补的域(该域与所述模板的可连接末端是分开的(例如在可环化的分子的中间部分中))并且所述可环化的分子的末端可与例如由第二探针单独地提供的单独的连接模板域杂交。
应理解，域(ii)(引物域)将包含与RCA模板互补的区，以使引物可与RCA模板杂交以及引发RCA模板的RCA。然而，探针还可含有其它单独的包含与第二RCA模板互补的区的域。例如，连接模板域(iv)还可含有与第二RCA模板互补的区。因此，本发明的探针可包含不止一个上文所示的某些域，尤其是域(i)和(iii)。如根据下文中的更详细描述将很显然的是，探针还可含有不止一个的域(iv)和(v)。
具体地，探针可含有不止一个例如2个或更多个，或3个或更多个含有与其靶序列互补的区的域(i)。具体地，探针可含有两个域(i)。在其它实施方案中，其可包含3个域(i)。所述域可存在于探针的相同或不同的链或组分寡核苷酸上。例如，当探针为线性寡核苷酸或包含线性寡核苷酸时，2个域(i)可被提供在寡核苷酸的3'和5'末端的每一个上。在某些此类实施方案中，探针可以以使得末端并置以便于连接的方式与其靶分子直接或间接杂交，如上文中针对可环化的RCA模板的连接所指示的。
如上文中指示的以及如将在下文中更详细描述的，在某些实施方案中，可切割和/或解折叠探针以释放上文所示的一个或多个域。例如，可切割和/或解折叠探针以释放用于第二RCA反应的引物。
因此，在一个具体实施方案中，本发明提供了用于进行包括至少两轮RCA的局部RCA反应的方法，其中第二RCA反应的产物附着并从而局限于第一RCA反应的产物，所述方法包括：
(a)提供第一RCA产物；
(b)将包含或提供用于与第二RCA反应的引物的探针与所述第一RCA产物直接或间接杂交，其中所述探针被切割和/或解折叠以释放所述RCA引物；和
(c)使用(b)的所述RCA引物进行第二RCA反应以形成第二RCA产物，其中在所述反应中：
(i)所述探针和所述引物不能引发使用所述第一RCA产物作为模板的延伸，或限制任何所述延伸以避免与第一RCA产物杂交的任何下游探针的置换；
(ii)维持(b)的RCA引物与第一RCA产物的直接或间接杂交并且，依靠所述杂交，第二RCA产物附着于第一RCA产物；
(iii)用于所述第二RCA反应的RCA模板包含在探针中或由探针提供，或被单独提供。
术语"释放"在本文中被广泛地用于表示使得域(或探针组分)可用于发挥作用，例如探针内的发夹结构的解折叠可释放随后可用于用作引物的探针的3'末端，或可暴露互补的区。通过置换杂交的链或寡核苷酸的解折叠也可释放域(或组分)。因此可以说，术语"解折叠"在本文中被广泛地用于包括打开或分开双链结构(双链体)的任何方式。因此，其不仅包括发夹的打开，而且还包括双链置换，例如杂交的寡核苷酸或链的全部或部分的置换。在其它实施方案中，引物可通过切割(其可以是外切核酸切割或内切核酸切割)而被释放。例如，可利用外切核酸酶(其可由单独的酶提供或由用于RCA的聚合酶提供)消化探针(或组分探针寡核苷酸)的延伸的游离3'末端以回切至与环状RCA模板杂交，并从而能够引发模板的RCA的3'末端。或者，可通过切割探针中的切割位点(例如限制性内切酶，或更具体地切口酶(以便仅一条链被切割)的)来释放引物。各种此类实施方案在下文中进行了描述。在其它实施方案中，可将两种解折叠(例如探针的杂交寡核苷酸组分的置换或发夹的打开)与切割(例如核酸外切切割)结合用于释放引物。在其它实施方案中，可组合不同的切割机制(例如与释放的3'末端的外切核酸酶降解组合的切口酶切割)。
其它探针域或组分例如连接模板和/或环状或可环化的RCA模板的释放可任选地类似地发生。例如，除了引物以外，探针的切割还可释放可环化的RCA模板，其可使用引物作为连接模板，或利用单独的连接模板来环化，在某些实施方案中，所述单独的连接模板还可通过探针的切割来释放。
在本发明的方法中，不期望的是用于第二RCA反应的模板应与第一RCA产物杂交。因此，第二RCA模板不能与第一RCA产物杂交，或所述方法的条件是诸如抑制任何此类杂交或使所述杂交减少至最少。具体地，其不应能够在与用于第二RCA反应的引物结合的同时与第一RCA产物杂交。因此，并且特别地当第二RCA模板被作为预先形成的环提供时，特别是当被作为预先形成的环单独地提供时，优选的特征是第二RCA模板不能同时结合第一RCA产物和用于第RCA的探针或引物。具体地，在此实施方案中，第二RCA模板不含第一RCA产物和探针的，或第一RCA产物和用于第二RCA反应的引物的单独的结合位点。
或者，设置探针/引物和第二RCA模板使得三向连接(3-way junction)(3WJ)RCA反应是不可能的。3WJ-RCA需要用于RCA的引物结合靶序列和RCA模板，以使RCA反应发生，并且同时地RCA模板直接结合于靶序列。换句话说，在此类反应中，设计RCA引物，以使得除非靶分子存在，否则其不能结合于RCA模板，并且RCA模板同时结合于靶分子。本发明不包括3WJ-RCA。
在本发明的方法的其它实施方案中，当将第二RCA模板作为预先形成的环单独地提供时，则(i)引物通过探针的切割和/或解折叠提供；和/或(ii)方法的步骤(c)(i)中的第一RCA产物上的延伸的引发被延伸和/或降解和/或置换阻断区阻止或受其限制(进一步参见下文)。
本发明的方法可以是均相或非均相的。即，其可在溶液中进行而无需固相或载体(即无需任何反应组分的固定)或其可以以固定的形式或基于固相的形式进行，特别地其中固定第一RCA产物。第一RCA产物的固定可以以各种方式来实现。例如在原位测定中，可在使用靶(分析物)核酸作为第一RCA引物引发的第一RCA反应中形成第一RCA产物。此处，将第一RCA产物附着于本身被固定于固体载体的靶组织样品。这可以例如在使用锁式探针检测靶核酸时进行。或者，第一RCA可通过被结合于固定的(或固定的)分析物靶的免疫RCA或接近式探针的核酸域来引发。在其它实施方案中，用于第一RCA反应的引物可被简单地固定于固体载体。非均相固定的形式的使用使得可容易地进行洗涤，从而例如允许容易地除去未结合的探针，和/或未以物理方式附着于表面的其它未反应的添加的反应组分，或假的不期望的反应。因此可容易地连续进行非均相或基于固相的方法。
在本发明的一个优选实施方案中，除非所述探针已与第一RCA产物杂交(直接或间接)，否则RCA引物和/或环状RCA模板不能形成(例如被释放)或产生引物/RCA模板复合物。换句话说，除非探针已与第一RCA产物杂交，否则引物和/或环状RCA模板不能，或不可用于参与第二RCA反应。因此，第二RCA反应取决于第一RCA产物的存在。因此，方法的特异度可得以提高。第二RCA反应从而可被视为靶依赖性RCA反应，其中第二RCA反应的靶是第一RCA反应产物。
这可通过如下方式来实现：控制如何进行所述方法，和/或设计探针以便引物和任选地其它探针组分/域的释放直至或除非探针已结合于第一RCA产物(或中间分子)才发生。换句话说，在某些实施方案中，只有当探针与第一RCA产物杂交(直接或间接)时，探针才可被切割和/或解折叠以释放引物(和任选地其它探针域/组分，例如用于环化添加的可环化的RCA模板或也通过探针的切割和/或解折叠释放的可环化的RCA模板的连接模板)。
最简单地，可通过除去任何未杂交的探针使得引物(和任选地环状或可环化的RCA模板和/或其它探针域/组分)不能参与第二RCA反应。这可容易地在固相或固定的形式中通过洗掉任何未结合的反应剂来实现。因此，在第一RCA产物不存在的情况下，探针不具有"结合靶"(即无第一RCA产物或中间核酸分子)，从而不因结合于其靶而被固定，并且可被洗掉。因此，如果第一RCA产物不存在，则探针不可用于第二RCA。
因此，在本发明的方法的优选实施方案中，除非探针已与第一RCA产物杂交，否则引物不能引发所述第二RCA反应。此类在第一RCA产物不存在的情况下的第二RCA反应的引发的阻止或减少可通过进行此类方法来实现，所述方法使得未结合的探针(即未与第一RCA产物杂交的探针)在进行步骤(c)的RCA反应之前被除去。这可以例如通过以固相形式进行所述方法以及在探针添加和杂交的步骤后进行洗涤来容易地实现。可选择地或此外，如上文中所提及的和在下文中进一步论述的，探针可被设计来通过切割和/或解折叠释放RCA反应的一种或多种核酸组分(引物、RCA模板，任选地用于环化以形成环状RCA模板的连接模板)，并且该释放取决于(例如需要)探针与第一RCA产物的杂交，和/或只有当探针已与第一RCA产物杂交，释放的组分才可反应以形成用于RCA的引物/模板复合物。
因此，以此类方式设计或进行所述方法，以使得在第一RCA产物不存在的情况下第二RCA产物的产生被阻止以降至最低程度。更具体地，在本发明的方法中，在第一RCA产物不存在的情况下，第二RCA产物的产生被阻止或降至随机水平。
应理解，当在此类实施方案中时，设计或进行所述方法，以使得除非第一RCA产物存在，否则第二RCA反应不应发生，此类方法的本质是非特异性反应可发生，并且不能保证绝对阻止。因此，某些不期望的非特异性或随机反应或相互作用可在样品或反应混合物中发生，并且这些反应或相互作用可导致例如由除探针/引物外的组分或核酸分子引发的第二RCA产物的产生。这就是随机水平上的第二RCA产物的产生的意思。
如上文中所指出的，本发明的方法的显著特征是探针、特别地包含在探针中的或由探针提供的引物不能引发使用第一RCA产物作为模板的延伸，或限制确实发生的任何所述延伸以避免与第一RCA产物杂交的任何下游探针(或引物)的置换。当然应理解，该需要应用于与第一RCA产物杂交的任何方法组分或反应物。这可包括被使用的任何中间寡核苷酸分子，或与第一RCA产物杂交的任何第二或不同的探针。
为了获得该特征(步骤(c)(i)的特征)，取决于所使用的方法步骤和探针设计的精确性质，可单独地或组合地使用各种手段和方法。例如，可将修饰(例如阻断基团或经修饰的残基)掺入探针(和使用的任何第二探针)，所述修饰抑制聚合酶和/或外切核酸酶作用(即其抑制延伸和/或降解)，或所述修饰抑制链置换。阻断性寡核苷酸(例如具有上述修饰)可用于防止与第一RCA模板(或中间分子)杂交的3'末端延伸。例如，此类阻断性寡核苷酸可与第一RCA模板在本发明的探针之间(例如与不期望连接的3'末端毗邻)杂交。为了阻止任何杂交的探针或探针组分的不期望的外切核酸酶消化产生能够在第一RCA产物上引发的引物/模板构建体，可避免任何具有核酸外切活性的试剂的存在，例如可使用外切核酸酶缺陷性聚合酶。在某些实施方案中，可使用洗涤步骤。例如，在经设计具有一个或多个可连接的末端(所述末端与第一RCA产物杂交而并置以便于连接)的探针的情况下，已杂交但未连接的任何探针可通过严格洗涤除去(按照本领域中公知的原理)。这特别适用于基于非均相或固相的方法的情况。可使用此类方法的任何组合。
就阻止或抑制在第一RCA产物(作为模板)上的引发而言，存在许多待考虑的情景。首先在包含或释放不与第一RCA产物杂交的游离3'末端(例如意欲用作RCA引物的游离3'末端)的探针的情况下，重要的是抑制返回至已杂交的区的3'末端的切割(所述切割可导致与第一RCA模板杂交的引物产生)。这可通过使用外切核酸酶缺陷性和/或不含外切核酸酶的试剂(例如在3'外切核酸酶活性上有缺陷的或不存在3'外切核酸酶活性的聚合酶)来实现。可选择地或此外，可使用如上文所示的所谓的外切核酸酶阻断区(即用于阻断或抑制外切核酸酶活性，特别地3'核酸外切活性的修饰)。例如，探针或探针组分可在探针或引物的3'末端与杂交的区之间的区中包含此类阻断区，例如一段抗核酸酶核苷酸。
在与第一RCA产物杂交的具有3'末端(其中该3'末端不是连接所需的)的探针或探针组分的情况下，可在3'末端上或其附近包含用于抑制延伸的修饰或阻断区(例如"聚合酶-阻断区"或"延伸阻断区")。可选择地或此外，可使用阻断性核苷酸来阻止可从3'末端发生的任何延伸延伸进入任何下游探针并置换所述探针。如上文中所指出的，此类阻断性寡核苷酸本身被修饰来掺入延伸和/或降解阻断区(例如在3'末端)和置换阻断区(例如在5'末端)。
在某些实施方案中，探针可包含与第一RCA产物杂交并且是连接(例如至探针的5'末端，或至另一个探针)所需的3'末端。在此类情况下，为了确保3'末端可用于连接，在杂交的3'末端包含延伸和/或降解阻断区可能是不适当的。在该情况下，可通过严格洗涤以除去任何未连接的探针来抑制任何未连接的3'末端的不期望的3'延伸。可选择地或此外，在此类情况下，可在杂交的可连接的5'末端上或其附近修饰探针以包含置换阻断区。在此类情况下，确实从3'末端发生的任何延伸将不置换杂交的5'末端(探针本身的或下游杂交的探针的)。
用于抑制或阻断外切核酸酶和/或聚合酶作用(即用于抑制或阻断降解和/或延伸)以及抑制或阻断置换的修饰或阻断基团在本领域中是公知的并且在文献中进行了描述，可使用这些修饰或阻断基团中的任何修饰或阻断基团。因此，核苷酸可被修饰来包含或掺入可抑制酶(例如聚合酶)发挥功能(例如结合)的阻断基团。例如，外切核酸酶阻断区可包含抗核酸酶核苷酸残基的区。这些外切核酸酶阻断区可以例如是2'O-Me-RNA残基、锁核酸(LNA)残基、肽核酸(PNA)残基、硫代磷酸(phosphothiate)修饰的核酸或掺入在核苷酸残基之间的聚乙烯-接头骨架部分。还可包含无碱基(无嘌呤或无嘧啶，或AP)位点作为外切核酸酶阻断区。此外，探针或探针组分可包含发夹结构作为外切核酸酶阻断区。存在几种修饰核酸以便它们是抗外切核酸酶的和/或不用作引物的方法，并且本发明的方法无意限制于上文所列的实例。
类似地，延伸或聚合酶阻断区可包括在上文被指示为外切核酸酶阻断区的任何经修饰的残基或阻断区。可将抑制聚合酶的结合的任何基团或修饰掺入探针的相关区。例如，可使用任何具有嵌入功能的基团，例如吖啶基团。
阻断性寡核苷酸可包含或掺入上文中提及的任何外切核酸酶或延伸/聚合酶阻断区。可抑制不需要的延伸反应的阻断性寡核苷酸在文献中，例如在Olasagasti等人，2010,Nature Nanotechnology,5,798-806和Senior Thesis of Rashid,at the University ofCalifornia,Santa Cruz(标题为Blocking Oligomer Design(3/10-3/11))中进行了描述。。
置换阻断区在本领域中也是已知的并且可使用任何报导过的或已知的置换阻断区。置换阻断区可包含经修饰的核苷酸残基的任何区段或区，相较于未经修饰的DNA和/或RNA，所述区段或区与DNA和/或RNA形成更稳定的杂交体。此类修饰包括LNA、PNA和2'-O-MeRNA残基。因此，可使用具有足够的长度或强度以避免置换的此类残基的区段或区。还可使用无碱基(AP)位点。还可使用如在文献中报导的DNA夹。
因此，在一个优选实施方案中，本发明的方法包括探针的使用，所述探针掺入了(或包含)一个或多个用于抑制降解、延伸和/或链置换的经修饰的区，和/或可使用阻断性寡核苷酸(其本身可掺入了此类经修饰的区)。
在此类优选实施方案中，可看到本发明提供用于进行包括至少两轮RCA的局部RCA反应的方法，其中第二RCA反应的产物附着并从而局限于于第一RCA反应的产物，所述方法包括：
(a)提供第一RCA产物；
(b)将包含或提供用于第二RCA反应的引物的探针与所述第一RCA产物直接或间接杂交；和
(c)使用(b)的所述RCA引物进行第二RCA反应以形成第二RCA产物，其中在所述反应中：
(i)所述探针包含一个或多个经修饰的区和/或使用阻断性寡核苷酸，以便所述探针和所述引物不能引发使用所述第一RCA产物作为模板的延伸，或限制任何所述延伸以避免与第一RCA产物杂交的任何探针的置换；
(ii)维持(b)的RCA引物与第一RCA产物的直接或间接杂交并且，依靠所述杂交，第二RCA产物附着于第一RCA产物；
(iii)用于所述第二RCA反应的RCA模板包含在探针中或由探针提供，或被单独提供。
更具体地，在该实施方案中，如上文中所示的经修饰的区用于抑制降解、延伸和/或链置换。因此，经修饰的区可包含或构成外切核酸酸酶阻断区、延伸阻断区和/或置换阻断区。经修饰的区可包含经修饰的核苷酸和/或阻断基团和/或发夹结构。经修饰的核苷酸包括无碱基核苷酸。可以以此类方式添加包含一个或多个此类经修饰的区的阻断性寡核苷酸以与第一RCA产物杂交，以使得探针或引物不能以第一RCA产物作为模板来进行延伸，或限制任何所述延伸以避免与第一RCA产物杂交的任何下游探针的置换。例如，阻断性寡核苷酸可邻近探针的杂交的3'末端杂交，或阻断性寡核苷酸可在多个探针之间与第一RCA产物杂交，例如以便任意两个探针之间存在至少一个阻断性寡核苷酸。
如上文中所指出的，本发明的一个有利方面是可启动第二RCA，同时第一RCA正在进行，或换句话说，一旦第一RCA产物已开始形成就可启动第二RCA。这导致更快的信号产生的有利方面。因此信号放大可能最佳地可能以v2/2进行，相较于其中v为聚合酶的核苷酸掺入速率，相较于单个RCA的v，从而以多个新的RCA产物产生的速率进行。这可加速任何RCA依赖性方案，并且可具有用于快速检测测定的特定值。通过进一轮的RCA启动关闭，信号强度或速度或两者的进一步增加是可能，并且该增加与第二RCA反应产物相关联，依此类推(例如第3代、第4代、第5代……代的RCA)。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法可包括产生第一RCA产物的步骤作为步骤(a)(或进行第一RCA反应以产生第一RCA产物)。第一RCA产物一开始形成就可进行步骤(b)和(c)。因此，步骤(a)和/或(b)和/或(c)可同时或基本上同时进行。具体地，步骤(b)可与步骤(a)同时进行。因此，在某些实施方案中，用于第二RCA反应的试剂，例如可将所需的探针和任何另外的反应物(例如环状或可环化的第二RCA模板和/任何第二探针)直接添加至用于第一RCA反应的试剂。
本发明的方法依赖于多个能够与第一RCA产物杂交的探针。因此，应理解，第一RCA产物必须可用于探针杂交。该要求是所有RCA基检测法的特征，其中RCA产物通过将探针例如检测探针与产物杂交来检测，并且在本领域中是公知的。因此，对于第一RCA产物可以有利的是具有低含量的二级结构。然而，该特征可通过在有利于杂交条件下，按照本领域中公知的原理进行所述方法来补偿。因此，例如，可在甲酰胺存在的情况下，例如在含有甲酰胺的缓冲液中进行所述方法。
第一RCA产物可从从任何核酸(例如DNA或RNA)环的RCA产生，或实际上所述环可具有任何经修饰的核酸，只要其能够用作RCA反应的模板。所述环(第一RCA模板)可以例如为报告DNA环，即来自任何RCA基检测测定，所述测定使用或产生核酸环(环状核酸分子)作为所述测定的报告分子。因此，第一RCA产物可以是免疫RCA或其中产生环状核酸分子的接近式探针测的产物，例如如上文中所论述的，或其可通过环化的锁式探针的RCA获得。或者，用于产生第一RCA产物的第一RCA模板可以是环化的靶(分析物)核酸分子。使用环化衔接子(所谓的"选择子")进行的靶核酸分子的环化由我们在WO 99/049079、WO 2003/012119和WO2005/070630中进行了描述。
本发明的简单的代表性实施方案描绘于图1中。在该基于固相的方法中，将第一RCA反应的产物直接或间接固定在固体载体上。如所显示的，固定用于第一RCA反应的引物。将包含用于第二RCA反应的引物，或更具体地引物域(ii)和结合域(i)的探针与第一RCA的产物反应接触，并且使其与所述产物直接或间接杂交(显示了直接杂交)。一个探针可结合多联体第一RCA产物中的每一个重复序列(单体)。引入用于第二RCA反应的环状或可环化模板，使其与探针杂交。如果模板是可环化的，则探针用作用于环化RCA模板的连接模板(即也包含连接域(iv))。未杂交的或未结合的探针例如可通过进行洗涤步骤来除去。这可在接触和杂交探针的步骤之后但在RCA模板的引入之前进行。或者未结合的探针可在已引入探针和RCA模板之后，但在启动第二RCA之前，例如在已引入进行RCA和/或连接所必需的试剂(例如聚合酶和/或连接酶)之前除去。此外可选择地，可将RCA模板与探针预杂交，随后可将探针/RCA模板复合物一起添加至第一RCA产物(即添加至样品或反应混合物)并使其与第一RCA产物杂交。随后可进行洗涤以除去未结合的探针。因此，除非探针(引物)已结合于第一RCA产物，否则其不能引发第二RCA反应。在洗涤步骤和/或环化可环化的RCA模板的任何必需连接步骤后，可启动第二RCA反应。所述模板可以以此类方式与探针杂交，以使得探针提供杂交的3'末端来引发RCA，或者如果以此类方式杂交所述模板，以使得探针具有游离3'末端，则可通过3'核酸外切切割以切回游离3'末端来产生(“释放”)引物。这可由具有3'外切核酸酶活性的聚合酶或通过单独的外切核酸酶来提供。为了确保探针不能够在第一RCA产物上引发延伸，可使用外切核酸酶缺陷型聚合酶(在该情况下外切核酸酶消化不是产生引物所需要的)或将外切核酸酶阻断区例如在引物的3'末端与与第一RCA产物杂交的区之间引入探针。或者，可将阻断性寡核苷酸在杂交的探针之间与第一RCA反应的产物杂交。
因此，在一个或多个具体方面，本发明提供了用于进行包括至少两轮RCA的局部RCA反应的方法，其中第二RCA反应的产物附着并从而局限于于第一RCA反应的产物，所述方法包括：
(a)提供被固定在固体载体上的第一RCA产物；
(b)将包含或提供用于第二RCA反应的引物的探针与所述第一RCA产物直接或间接杂交；
(c)进行洗涤以除去任何未结合的探针(尚未杂交的探针)；和
(d)使用(b)的所述RCA引物进行第二RCA反应以形成第二RCA产物，其中在所述反应中：
(i)所述探针和所述引物不能引发使用所述第一RCA产物作为模板的延伸，或限制任何所述延伸以避免与第一RCA产物杂交的任何探针的置换；优选地其中所述探针包含一个或多个经修饰的区和/或使用阻断性寡核苷酸；
(ii)维持(b)的RCA引物与第一RCA产物的直接或间接杂交并且，依靠所述杂交，第二RCA产物附着于第一RCA产物；
(iii)用于所述第二RCA反应的RCA模板包含在探针中或由探针提供，或被单独提供。
本发明的方法的另一个代表性实施方案描绘于图2中。该实施方案代表可在均相中，在无固相的溶液相中进行的方法。其可相继地或同时进行。探针包含位于探针的各自5'和3'末端上的结合域(i)和引物域(ii)。所述域彼此互补(之间具有非互补序列)并且杂交在一起以形成发夹结构。结合域与存在于第一RCA产物的每一个单体中(或中间分子中)的对应的结合位点互补，并且当与第一RCA产物(或中间核酸)接触时，与其结合位点杂交，从而引起发夹打开。在这一点上应理解，可设计探针，使得对靶分子上的结合位点的竞争性杂交比对对引物域的强，以便在靶分子(第一RCA产物或中间分子)存在的情况下打开发夹。可选择地，或此外，可设计探针，以使得结合域(i)包含在环区并且探针与其靶结合位点的杂交引起发夹打开。发夹结构的打开释放可用于用作引物的探针的3'末端(引物域)。因此，使得用于第二RCA反应的引物仅在探针与第一RCA产物杂交时才可用或释放。因此，探针被设计来防止引物在探针与第一RCA产物杂交之前结合于第二RCA模板。
释放的引物域与用于第二RCA反应的环状模板杂交并且引发第二RCA反应。可看到可改进该实施方案以使用可环化的第二RCA模板，在该情况下，探针还包含连接模板域(iv)。引物域(i)从而还可用作连接模板域。
在图2中显示的方法的其它改进中，第二RCA模板可以以此类方式与探针杂交，以使得留下游离3'末端，所述游离3'末端可以例如通过外切核酸酶活性被回切以产生引物。在此类实施方案中，引物域不存在于探针的3'末端，但可以例如位于环区中。
为了防止使用第一RCA产物作为模板的不需要的延伸，上述策略是可用的。因此，可使用外切核酸酶缺陷型聚合酶，或探针可在例如引物域的3'末端与杂交区(结合域)之间含有外切核酸酶阻断区。或者可使用阻断性寡核苷酸。
根据图2的上述描述应理解，第二RCA模板可含有也与第一RCA产物互补的互补(针对引物域)的区。可通过试剂和/或反应条件的适当设计(例如通过利用分子内对分子间杂交的不同稳定性、杂交长度的差异和使不需要的杂交去稳定的错配的可能引入)使RCA模板与第一RCA产物的任何不需要的杂交减少至最少。
因此，在其它更具体的方面，本发明提供了用于进行包括至少两轮RCA的局癌RCA反应的方法，其中第二RCA反应的产物附着并从而局限于于第一RCA反应的产物，所述方法包括：
(a)提供第一RCA产物；
(b)将包含发夹结构的探针与所述第一RCA产物直接或间接杂交，所述发夹结构在所述杂交后被解折叠，从而释放能够用作用于第二RCA反应的引物的引物域；
(c)使用(b)的所述RCA引物进行第二RCA反应以形成第二RCA产物，其中在所述反应中：
(i)所述探针和所述引物不能引发使用所述第一RCA产物作为模板的延伸，或限制任何所述延伸以避免与第一RCA产物杂交的任何探针的置换；优选地其中所述探针包含一个或多个经修饰的区和/或使用阻断性寡核苷酸；
(ii)维持(b)的RCA引物与第一RCA产物的直接或间接杂交并且，依靠所述杂交，第二RCA产物附着于第一RCA产物；
(iii)用于所述第二RCA反应的RCA模板包含在探针中或由探针提供，或被单独提供。
在一个实施方案中，单独地提供环状或可环化的第二RCA模板，并且当所述RCA模板是可环化时，更优选地通过使用包含在所述探针中或由所述探针提供的连接模板连接来进行环化。
其它代表性实施方案描绘于图3中。这是另外的固相实施方案，其中第一RCA产物被固定在固体载体上。该实施方案需要两个探针与第一RCA产物直接或间接杂交(显示了直接杂交)，并且连接在一起以形成用于环化添加的一个或多个添加的寡核苷酸(以形成用于第二RCA的环状模板)的连接模板。探针之一是根据本发明的探针，并且另一个探针是第二探针，其含有与第一RCA产物上的不同结合位点杂交的第二结合域以及连接模板域或包含与可环化的RCA模板互补的区的域。因此本发明的(第一)探针包含结合域(在其5'末端)和引物域(在其3'末端)，以及包含与一起构成可环化的RCA模板的一个或多个寡核苷酸(两个添加的寡核苷酸示于图3中)互补的区的域。这些互补的区可构成连接模板域(如所显示的)。第二探针包含结合域(在其3'末端)，以及连接模板域或与一个或多个添加的寡核苷酸互补的区。所述添加的寡核苷酸能够与探针杂交，它们的末端并置以便于连接。因此，如图3中显示的，第二探针包含用于添加的寡核苷酸的连接-模板域。进行连接步骤，所述步骤将两个探针连接在一起，从而稳定它们与第一RCA产物的杂交。连接还用于将添加的寡核苷酸联接在一起并且环化其以形成或产生用于第二RCA的环状RCA模板。进行洗涤步骤以除去未结合的(未杂交的)探针。因此在第一RCA产物不存在的情况下，洗掉探针，并且探针不可用于引发第二RCA反应(事实上探针也不可用于产生RCA模板)。此类洗涤步骤可在添加用于环化的寡核苷酸之前或之后，但在连接和/或RCA的启动之前进行。
为了阻止第一RCA产物(作为模板)上的不需要的延伸，探针(具体地第一引物提供探针)可包含外切核酸酶阻断区，如早前所描述的，或可使用外切核酸酶缺陷型聚合酶。为了阻止第二探针的任何未杂交的或未连接的3'末端的延伸，可在连接步骤之后包括严格洗涤步骤来除去任何未连接的探针。可选择地或此外，(第一)探针的杂交的5'末端可包含置换阻断区(即置换阻断区可包含在本发明的探针的结合域中)。可选择地或此外，可使用阻断性寡核苷酸。
可对图3中描绘的方法进行改进。例如，可利用单个可环化的RCA模板替代2个寡核苷酸，以及环化模板的连接可通过探针的一个或另一个来连接，例如第二探针可包含用于环化的连接模板域。或者，可用3个或更多个寡核苷酸(所述寡核苷酸与两个探针杂交并且并置以便于在两个探针上连接)替代2个寡核苷酸。在其它改进中，不必将探针连接在一起。在此类实施方案中，第二探针的杂交的末端将被阻断而不能延伸和/或置换，第一探针的杂交的5'末端可包括置换阻断区，和/或可使用在两个探针之间杂交的阻断性寡核苷酸。在其它改进中，引物域不必位于探针的最3'末端，并且可将外切核酸酶消化用于回切以释放引物。
因此，在另外的更加具体的方面，本发明提供了用于进行包括至少两轮RCA的局部RCA反应的方法，其中第二RCA反应的产物附着并从而局限于于第一RCA反应的产物，所述方法包括：
(a)提供被固定在固体载体上的第一RCA产物；
(b)将包含或提供用于第二RCA反应的引物的(第一)探针和第二探针与所述第一RCA产物直接或间接杂交，所述第二探针任选地经并置杂交以便直接或间接连接于第一探针，其中所述探针各自包含与一个或多个RCA模板寡核苷酸中的同源结合位点互补的至少一个结合位点，所述寡核苷酸可连接在一起以形成用于第二RCA反应的环状RCA模板；
(c)将所述探针与所述一个或多个RCA模板寡核苷酸杂交，其中所述寡核苷酸经并置杂交以便于连接来环化寡核苷酸；
(d)进行连接步骤以将所述RCA模板寡核苷酸连接在一起并且进行环化，从而产生用于第二RCA反应的环状RCA模板，和任选地将所述探针连接在一起；
(e)洗涤一次或多次以除去任何未结合的探针(尚未杂交的探针)和/或未连接的探针，其中为了除去未结合的探针，可在步骤(c)之前或之后进行所述洗涤步骤，以及为了除去任何未结合和未连接的或任何未连接的探针，可在步骤(d)后进行洗涤；
(f)使用(b)的所述环状RCA模板和所述RCA引物进行第二RCA反应以形成第二RCA产物，其中在所述反应中：
(i)所述探针和所述引物不能引发使用所述第一RCA产物作为模板的延伸，或限制任何所述延伸以避免与第一RCA产物杂交的任何探针的置换；优选地其中所述探针包含一个或多个经修饰的区和/或使用阻断性寡核苷酸；
(ii)维持(b)的RCA引物与第一RCA产物的直接或间接杂交并且，依靠所述杂交，第二RCA产物附着于第一RCA产物。
如上文中所指出的，在一个有利方面，本发明的探针是所谓的RCA报告探针，其包含或提供进行RCA反应所需的所有核酸组分(或底物)，尤其是引物和RCA模板。RCA模板可以以环状或可环化的形式存在，并且如果是可环化的，必须在RCA之前将其环化。在此类实施方案中，需要一个或多个连接模板来进行环化，并且所述连接模板也包含在探针中或由探针提供。
因此在一个优选方面，本发明提供了用于进行包括至少两轮RCA的局部RCA反应的方法，其中第二RCA反应的产物附着并从而局限于于第一RCA反应的产物，所述方法包括：
(a)提供第一RCA产物；
(b)将包含或提供下列用于RCA反应的核酸组分的探针(更具体地RCA报告探针)与所述第一RCA产物杂交：
(i)用于第二RCA反应的引物；
(ii)用于第二RCA反应的环状或可环化的RCA模板；
和；当所述RCA模板是可环化时
(iiii)用于所述RCA模板的环化的连接模板；
其中所述探针是可切割和/或可解折叠的，以释放至少使RCA反应能够进行的引物；
(c)切割和/或解折叠探针以释放引物，和任选地RCA模板和连接模板(如果存在的话)；
(d)当所述RCA模板是可环化时，进行连接步骤以环化RCA模板；
(e)使用(b)的所述RCA引物和RCA模板进行第二RCA反应以形成第二RCA产物，其中在所述反应中：
(i)所述探针和其任何解折叠的或切割的部分(例如包含在探针中或从探针释放的任何核酸组分)不能引发使用所述第一RCA产物作为模板的延伸，或限制任何所述延伸以避免与第一RCA产物杂交的任何探针的置换；
(ii)维持(b)的RCA引物与第一RCA产物的直接或间接杂交并且，依靠所述杂交，第二RCA产物附着于第一RCA产物。
有利地，在探针已被切割和/或解折叠之前，由探针提供的RCA组分不可用于RCA反应，即必须在RCA反应可发生之前，通过解折叠探针和/或切割探针来释放RCA反应的组分的至少一种。因此，此类"单个"或”自包含的”探针具有减少添加至反应以实现RCA的不同初始核酸组分的数目，即减小存在于所述方法中的初始组分的复杂度同时保持与RCA测定相关的有利方面的作用。此类单个探针的使用还可帮助简化测定以减小因大量步骤而引起的误差和无效，例如操作误差工，以及降低成本和减少反应时间。此外，通过减少测定中组分的数目，可使样品中的组分之间的潜在相互作用的数目减少至最少，同时维持促成测定的特异性和选择性的多特异性相互作用，即此类探针的使用可允许保持产生特异性但不必向测定添加更多组分或步骤的多重处理步骤。
更具体地，由探针提供的(即作为其部分包含的，或从其产生的)RCA核酸组分能够在与第一RCA产物杂交并且切割和/或解折叠探针后启动RCA反应。因此，探针通过许多精确的相互作用实现特异性而无需增加待添加至反应的组分的数目。
在其最广泛的意义上，用于本发明的方法的RCA报告探针可被定义为提供或能够提供用于RCA反应的核酸组分(更具体地足以启动RCA反应的核酸组分)的探针，所述探针是包含如下部分的核酸构建体：
(i)能够结合(例如杂交)于第一RCA产物或中间分子的一个或多个结合域(或更具体地一个或多个包含与所述第一RCA产物或中间分子互补的区的域)，所述中间分子直接或间接结合(例如杂交)于所述第一RCA产物；
(ii)一起包含或能够提供环状或可环化的RCA模板的一个或多个域；
(iii)包含或能够提供用于所述RCA模板的RCA的引物的域，其中所述域与所述环状或可环化的RCA模板的区杂交；并且，当所述RCA模板是可环化时，
(iv)一个或多个包含或能够提供连接模板的域，所述连接模板可作为模板来连接(或环化)可环化的RCA模板；
其中探针的至少部分必须被切割和/或解折叠以释放所述引物，以使所述RCA能够进行。
应理解，每一个探针产生单个环状RCA模板(用于第二RCA反应)。因此，应理解，在部分(ii)中，当不止一个域提供环状或可环化的RCA模板时，每一个此类域可贡献最终的RCA模板的部分或部份，所述部分或部份被连接在一起以形成环。因此，部分(ii)可另选地表达为：
(ii)包含或提供环状或可环化的RCA模板的域，或一起能够提供可环化的RCA模板的2个或更多个域。
有利地，在优选实施方案中，除非探针结合于所述第一RCA产物或中间分子，否则探针不能产生RCA产物，即探针可被视为靶依赖性RCA探针，即RCA产物仅在靶分子存在的情况下产生，这最终是第一RCA产物，尽管在探针的结合靶的情况下，这可以是第一RCA产物或中间核酸分子。例如，在RCA报告探针的情况下，引物和/或环状或可环化的RCA模板可能不能参与或启动RCA反应，因为在第一RCA产物(或中间核酸分子)不存在的情况下，从探针释放的RCA核酸组分接近不充分，以致不能使RCA反应继续进行，例如探针可取决于靶依赖性连接反应来产生RCA产物。在一些实施方案中，当探针未结合于所述第一RCA产物或中间分子时，引物和/或环状或可环化的RCA模板可能难以接近(例如不可利用)来进行滚环扩增反应，例如探针可取决于靶依赖性切割和/或解折叠来释放一个或多个RCA核酸组分。
靶依赖性探针，即需要与靶(第一RCA产物或中间分子)相互作用来产生RCA产物的探针，在(但不限于)均相反应中是特别有用的。不依赖于与靶核酸分子的相互作用来产生RCA产物的探针在非均相测定中是特别有用的，在所述测定中，可在检测RCA产物之前，例如通过洗涤从样品除去未结合于靶核酸分子的探针和/或RCA产物(例如过量的探针或未结合的产物)。
在一些实施方案中，可由探针的相同部分提供引物和连接模板，即相同域/序列可用作引物和连接模板。将明显的是，在利用可环化的RCA模板的实施方案中，必须连接RCA模板来形成环状核酸分子，以便其可用作RCA的模板(即在探针依赖性连接中)。
根据下文中的描述将明显的是，存在大量RCA报告探针排列，并且提供每一个实施方案的详细描述是不可行的。然而，一些示例性实施方案在下文中进行了描述，很清楚地，落在所述发明的范围内的其它探针可通过组合这些示例性实施方案的特征来产生，这可由本领域普通技术人员基于本文中的发明描述来容易地实现。
本发明的探针由一个或多个核酸分子或寡核苷酸，即一条或多条核酸链，例如1条、2条、3条或更多条核酸链或寡核苷酸形成。因此，虽然本发明的探针可被视为单个核酸分子，但更适当地其可被认为是核酸构建体，其中当探针包含不止一条核酸链(或寡核苷酸)时，每一条链(或寡核苷酸)包含与构建体中的至少一条其它链(或寡核苷酸)互补的区，以便所述链(寡核苷酸)被预杂交(在探针与样品接触之前被杂交，即探针的每一条核酸链(寡核苷酸)未被单独地添加至样品)，以便可将探针作为单个核酸构建体提供。因此，本发明的探针可以是包含至少2个发夹结构的单链核酸分子(即连续核酸链)，其在下文中被更详细地定义。虽然发夹结构在探针中形成为双链的区，但探针可被当作单链，因为其由单个连续核酸分子形成，即分子中的所有核苷酸通过共价键即磷酸二酯键联接。
在其它实施方案中，探针可以是部分双链核酸分子，即包含至少2条通过一个或多个互补(通过氢键，即标准碱基配对，如下文中描述的)的区联接的核酸链，其中核酸链的至少一条的至少部分是单链的。在一些实施方案中，部分双链构建体的至少一条链是环状的或准环状的(即可环化的)寡核苷酸(RCA模板)。在一些实施方案中，部分双链分子的一条链包含至少一个发夹结构并且第二链以与不形成发夹结构的第一链的部分杂交的寡核苷酸形式提供。超过2条核酸链，例如3条、4条、5条或更条核酸链可杂交在一起以形成本发明的探针。
下文中给出的RCA报告探针以及它们如何产生RCA产物的代表性描述举例说明了所述探针所需的特征和可与所述特征一起并入探针设计的变异。
RCA报告探针的最简单形式之一描述于图4中。探针以包含2条核酸链的核酸构建体的形式存在，并且在本文中被称为一种类型的如下所定义的"环状RCA探针"。
第一核酸链包含各自具有靶核酸分子，即第一RCA产物或中间分子的结合位点，具体地与所述靶核酸分子互补的区(所谓的靶互补域、结合域或靶识别域)的两个域。第一核酸链的5'末端上的靶互补域("结合域")用于将RCA产物固定(即附着)于靶核酸分子(第一RCA产物或中间分子)。第一核酸链的3'末端上的结合域包含当结合于靶核酸分子时被切割酶识别的序列，即所述域包含切割识别位点，即可被切割或导致探针中的相邻位点或域的切割的位点或域。结合域通过包含与RCA模板(在此实施方案中环状核酸分子)互补的区的域来连接。因此，连接(靶互补)结合域的序列(或区)可被视为包含RCA模板互补域或RCA模板结合域。该域将形成用于RCA的引物的至少一部分，从而可被视为引物域(即RCA引物域)。因此，探针的第一核酸链可被称为"引物链"，即RCA引物由第一链提供或从第一链产生。
第二核酸链以与引物域的至少部分杂交(即与引物域的RCA模板互补域部分杂交)的环状核酸分子(RCA模板)形式存在。因此，第二核酸链可被称为"RCA模板链"、"模板链"或"环状链"。如下文中更详细论述的，将明显的是，在一些实施方案中，RCA模板可以是可环化的核酸分子(或可环化的寡核苷酸)，例如有效地锁式探针(针对引物链)。因此，引物域(例如引物域的RCA模板互补域部分)可作为模板来连接可环化的RCA模板。因此，引物域和/或RCA模板结合域还可被视为连接模板域。
在第一RCA产物(或中间核酸分子)(即靶分子)存在的情况下，探针的结合域与它们在核酸分子中的同源(靶)结合位点(探针结合位点)杂交。探针与靶的杂交形成"功能性"切割识别位点(图4A)。在识别切割识别位点的酶，具体地仅切割一条链的内切核酸酶诸如切口酶存在的情况下，探针的第一链被切割，这导致不与靶核酸分子杂交的可延伸的3'末端(即单链域)释放(图4B)。该3'可延伸末端可与RCA模板互补。或者，可以例如通过外切核酸酶消化来降解探针的第一链的单链部分。在任一情况下，引物链的切割(其可包括不止一个切割事件)导致引物域即RCA引物的释放。使用RCA模板作为用于聚合的模板来延伸引物域，以产生通过探针的5'靶互补结合域被固定或附着于靶核酸(第一RCA产物或中间分子)的第二RCA产物(图4C)。
为了抑制或阻止使用第一RCA产物作为模板的不需要的延伸，3'末端结合域(其与第一RCA产物杂交)可包含延伸阻断区。引物域可包含外切核酸酶阻断区(例如在引物的3'末端与5'结合结构域之间)。5'结合域可包括置换和/或延伸阻断区等。可选择地或此外，可使用阻断性寡核苷酸。
本发明的RCA报告探针的另一个示例性实施方案描绘于图5中，其描绘了一种类型的如下文中所定义的"发夹RCA探针"。探针以具有发夹结构的第一核酸链的形式存在，其包含切割识别位点(如所显示的，在环区)。所述第一核酸链能够提供足以启动RCA反应的核酸组分，即可从第一核酸链产生引物、RCA模板和连接模板。在一些变型实施方案中，可将连接模板作为第二核酸链的部分提供。因此，发夹RCA探针的第一核酸链可被视为引物链或RCA模板链，即发夹RCA探针的第一核酸链总是提供引物和RCA模板。第一链包含2个靶互补域(结合域)，每一个末端上一个，其与靶核酸分子(第一RCA产物或中间分子)杂交。第二核酸链与第一核酸链杂交，并且探针的双链部分用作切割识别位点，例如被切割酶识别的位点或域。因此，第二核酸链可被视为切割链。
在图5中，探针的每一个末端上的靶互补结合域与第一RCA产物或中间分子(其可直接或间接包含相邻的探针结合位点，参见例如图15A)杂交。此外，在一些实施方案中，探针的结合域可与靶核酸分子杂交，以便探针的5'和3'末端是可直接或间接连接的，以便可使用靶核酸分子作为连接模板来连接探针以形成环状核酸分子(参见图6)。
在于允许探针与其靶核酸分了杂交的条件下与样品(即反应混合物)接触后，将一个或多个识别切割识别位点的切割试剂添加至样品中，这导致探针的至少两个位点(即发夹结构的环和探针的双链部分或与其相邻的区)的切割。在切割探针后，发夹结构能够解折叠以提供通过与包含靶互补结合域的探针的部分杂交而附着于靶核酸分子的RCA模板(可环化的核酸分子)。在一些实施方案中，与RCA模板杂交的(即附着的)探针的部分可用作用于RCA反应的引物(例如图6)。在其它实施方案中，引物由通过其它靶互补结合域附着于靶核酸分子的探针的部分提供。在这些实施方案中，探针的相同部分可提供引物和连接模板。然而，根据下文中的描述，很明显，可将引物和连接模板作为探针的单独域提供，例如，可由探针的第二核酸链提供连接模板。
在靶核酸分子存在的情况下，可将RCA核酸组分与靶核酸分子(经由结合域)直接或间接杂交，从而使RCA核酸组分保持紧密靠近。RCA模板(可环化的核酸分子)与引物和连接模板杂交，所述引物和连接模板可以是探针核酸构建体的相同部分。探针的连接模板作为模板在连接酶存在的情况下环化RCA模板。可使用环化的RCA模板作为聚合模板延伸探针的引物部分来产生第二RCA产物。将明显的是，在靶核酸分子不存在的情况下，形成RCA核酸组分的探针的切割部分未保持靠近，从而在靶核酸(第一RCA产物或中间分子)不存在的情况下阻止第二RCA产物的产生。
为了阻止或抑制以第一RCA产物为模板的不需要的延伸，可包含一个或多个和/或延伸和/或置换阻断区，和/或基于上述原理使用阻断性寡核苷酸。因此例如，可在3'结合域中包含延伸阻断区。可在5'结合域中包含置换阻断区和/或延伸阻断区。可在引物域(3'引物末端的上游或下游，取决于探针的哪个部分提供引物)中包含外切核酸酶阻断区。
上述示例性实施方案表明本发明的RCA报告探针可能需要两个类型的连接事件来使RCA反应能够进行。在其它实施方案中，不需要连接事件。第一连接事件可被定义为"靶依赖性连接"，其中探针的结合域可与其靶核酸分子杂交，以便可使用靶核酸作为连接(环化)模板来直接或间接连接探针的5'和3'末端(参见图6)。
这可以是特别有利的，因为其可允许第二RCA产物的产生是靶依赖性的，即第二RCA产物只可在第一RCA产物存在的情况下才产生。例如，可设计探针的结合域以使得仅当探针的末端已通过以靶为模板的连接被直接或间接连接时，通过探针的切割产生的RCA组分才会保持结合于(即附着于或杂交于)靶核酸分子。这可例如通过设计探针以确保靶互补结合域的至少一个仅在其它靶互补结合域存在的情况下才可稳定地杂交来实现，例如探针的靶互补结合域的至少一个可以是短序列。在切割探针之前，靶互补结合域(其通过核酸分子的内部部分来联接)与靶核酸分子的相互作用的组合足以将探针附着于靶核酸分子。然而，如果靶互补结合域在探针中的可切割位点被切割后未被连接(直接或间接)，则使RCA能够进行所需的探针的至少一种核酸组分将与靶核酸解离。因此，除非以靶为模板的连接已发生来将所有RCA核酸组分紧密地固定(即附着)于靶核酸(即以稳定探针的靶互补结合域与靶核酸分子的相互作用)，否则RCA反应将不能进行。
第二连接事件可被定义为"探针依赖性连接"，其中将RCA模板提供作为可环化的核酸分子的形式(或作为可连接在一起以形成环的两个或更多个“部分”或单独的分子)来提供，并且其分子内(或如果牵涉不止1个分子的话，分子间)连接以探针的一个或多个域即探针的连接模板域为模板来连接。探针依赖性连接在其中由探针通过发夹结构例如茎环结构(即发夹RCA探针)的切割提供RCA模板的实施方案中是必需的。然而，探针依赖性连接事件也可以是环状RCA探针所需要的，如果RCA模板链是可环化的核酸分子的话。
在一些实施方案中，探针需要靶依赖性连接和探针依赖性连接，优选地其中除非已存在靶依赖性连接，否则探针依赖性连接不能发生，例如当在探针切割后如果靶依赖性连接还未发生，探针依赖性连接所需的探针的部分将与靶核酸分子分离。
因此，可看到，本发明的RCA报告探针可使得所述方法能够在受控的不同(不连续的或可分开的)阶段进行。实际上，优选地可同时组合所有或大部分反应物，以使反应能够进行而无需干预。然而，本发明的RCA报告探针需要一系列事件发生，以产生第二RCA产物(所述第二RCA产物在某些检测测定的实施方案中可指示靶核酸分子，从而靶分析物在样品中的存在)并且，在上述实施方案中，事件的顺序(即反应的阶段)可被认为是：
(i)探针与靶(第一RCA产物或中间物)核酸分子的结合(这可包括解折叠探针，如下文中所描述的)和任选地连接靶互补结合域(即靶依赖性连接)；
(ii)切割探针中的可切割位点(即释放RCA反应的组分的至少一种)；
(iii)任选地连接RCA模板以环化其(连接可环化的核酸分子或两个或更多个RCA模板分子，即探针依赖性连接)；
(iv)延伸所述RCA引物以形成第二RCA产物；和
(v)任选地检测第二RCA产物(检测延伸的引物，其为探针的部分)。
因此，可将所述方法(或测定)的试剂与含靶核酸的样品(即含有第一RCA产物和任选地中间分子的样品或反应混合物)同时接触，而不在切割和/或解折叠探针以释放为使第二RCA能够进行所需的核酸组分之前产生第二RCA产物。以单个探针的形式提供使RCA能够进行的核酸组分是有利的，并且特别有益的是所述单个探针还允许所述方法能够在各个阶段中进行，同时使得能够同时添加方法试剂。
如下文中更详细描述的，本发明提供了许多RCA报告探针变体。然而，在其最简单的形式中，可看到本发明的RCA报告分子的方面提供单个探针(核酸构建体)，所述探针与第一RCA产物直接或间接相互作用并提供核酸组分(即所述RCA核酸组分形成核酸构建体的部分和/或从其产生)，所述核酸组分是使得能够在切割和/或解折叠探针后进行第二RCA反应所必需的并且足以进行所述反应。因此，如上文中指出的，本发明可被看作提供单个RCA探针或自包含RCA探针。在具体实施方案中，本发明可被看作提供必须与靶核酸相互作用并且被切割和/或解折叠以释放使RCA反应能够进行的组分的RCA报告探针，例如靶核酸分子依赖性RCA探针。所述探针还可被视为用于第二RCA产物的靶依赖性产生的探针，其中第二RCA产物的序列与第一RCA产物的序列无关(即第二RCA产物不包含与第一RCA产物具有显著序列同一性的序列)。
本发明的RCA报告探针可落入两个分类中的一个分类，这取决于探针以何种形式提供RCA模板。
在第一种类中，探针包含RCA模板，即将RCA模板作为核酸构建体的核酸链之一来提供，即以预先形成的环状寡核苷酸或准环状(即可环化的)寡核苷酸的形式提供RCA模板。因此，这些探针通常可被称为环状或准环状RCA探针或RCA模板探针，其中术语"环状RCA探针"可用于指包含环状和可环化的RCA模板的探针。
在第二种类中，探针提供RCA模板，即RCA模板，或其两个或更多个部分(所述通过将探针切割成通过探针的每一个部分的结合域保持靠近的多个部分来产生)。因此，这些探针可被视为"多部分探针"，例如两部分、三部分探针等。在一些实施方案中，RCA模板通过发夹结构例如茎环域的切割来产生。因此，这些探针通常可被称为发夹或茎环RCA探针。在其它实施方案中，通过切割线性域即无分子内互补性的域来产生RCA模板。因此，这些探针通常可被称为线性RCA探针。发夹RCA探针和线性RCA探针可被称为准RCA模板探针或可释放的RCA模板探针。
虽然环状RCA探针、线性RCA探针和发夹RCA探针可能需要探针依赖性连接事件来产生RCA模板，但优选地环状RCA探针的RCA模板以预先形成的环状寡核苷酸的形式存在。因此，环状RCA探针也可被视为以探针为模板的连接依赖性RCA探针(虽然这些探针可以仍然是以靶为模板的连接依赖性探针)。相反地，发夹RCA探针和线性RCA探针需要探针依赖性连接事件来形成RCA模板，从而也可被视为以探针为模板的连接依赖性RCA探针。
如下文中所论述的，在一些实施方案中，环状RCA探针可包含发夹或茎环结构。然而，环状RCA探针中的发夹或茎环结构不是产生RCA模板所需的。相反地，发夹RCA探针中的发夹结构之一将释放RCA模板(即RCA模板从发夹RCA探针中的发夹结构产生)。
上述"环状RCA探针"的变体示于图19中，其中当靶互补结合域结合于靶核酸分子时探针形成发夹结构，例如在靶互补域之间形成茎环结构。茎环结构形成切割域，其中探针的切割释放RCA引物。因此，所述探针需要靶依赖性切割来释放RCA组分，虽然切割识别位点不必直接包含靶核酸分子。
"环状RCA探针"的2个另外的示例性实施方案示于图7和8中，所述实施方案是上文中描述的和图4中显示的实施方案的变型。任选地，在这些实施方案中，第一核酸链(引物链)的靶互补结合域与靶核酸分子(第一RCA产物或中间分子)杂交，以使探针的5'和3'末端是可直接或间接连接的，以便可使用靶核酸作为连接模板来连接探针以形成环状核酸分子。
第一核酸链的3'末端上的结合域包含当结合于靶核酸分子时被切割酶识别的序列，即所述域包含切割识别位点。优选地，切割识别位点是功能性的，即当所述域是双链时被切割酶识别并切割。许多酶切割识别位点包含对称的即回文序列，当多个包含相同切割位点的单链分子存在于样品中时，这可能是有问题的，即包含回文切割识别序列的探针可能形成作为切割酶的底物的双链体。因此，如果切割识别位点包含对称的(即回文)序列，则可以有利地阻断切割识别位点以避免探针的靶独立性切割，这可导致在样品中不存在靶核酸(第一RCA产物)的情况下产生RCA产物。
因此，在一些实施方案中，探针可包含第三核酸链(一种保护链或阻断链)(图7)，其能够与切割识别位点杂交，以使其不形成被切割酶识别或切割的位点，即所述保护链(寡核苷酸)与包含切割识别位点的结合域的区互补但不形成功能性切割域或可切割位点。因此，保护或阻断链与切割识别位点部分互补。相较于两个探针的回文序列之间的相互作用，保护链必须与切割识别位点更强地相互作用(杂交)，例如保护链可包含与探针互补的长于切割识别位点的区。
在靶核酸分子(第一RCA产物或中间分子)存在的情况下，探针的靶互补结合域与它们的同源或靶位点杂交。包含切割识别位点的结合域与靶核酸分子形成比其与被置换(即探针被“解折叠”)的保护链形成的相互作用更稳定的相互作用。结合域与靶核酸分子之间的双链体形成可被切割酶例如内切核酸酶诸如切口酶切割的功能性切割识别位点，或导致与探针中的切割识别位点相邻的序列的切割。在识别切割识别位点的酶存在的情况下，探针的第一链被切割，这导致不与靶核酸分子杂交的可延伸的3'末端(即单链域)。探针的第一链的单链部分可以例如通过外切核酸酶消化来降解，从而导致引物域的释放。使用环状核酸分子(RCA模板)作为用于聚合的模板来延伸引物域以产生第二RCA产物，所述第二RCA产物通过杂交附着于第一RCA产物(更具体地通过探针的5'靶互补结合域附着于第一RCA产物或中间核酸分子)。
在一些实施方案中，RCA模板(即环状链)可用作保护链或阻断链(图8)。当探针与靶核酸分子相互作用以形成功能性切割位点时，RCA模板被置换至第一核酸链(引物链)的另一个区，所述区也与RCA模板互补(所谓的置换区或置换域)。该置换可被视为解折叠步骤。RCA模板与包含切割识别位点的探针的靶互补结合域相互作用，该相互作用强于与探针的置换区的相互作用，以使得仅当探针与靶核酸序列相互作用时，RCA模板才被置换(探针才被解折叠)。
在一些实施方案中，所述切割识别位点不是对称序列。因此，可以不需要阻断链或保护链。
以第一RCA产物为模板的不需要的延伸可基于如上文中所述的原理和与如上文中所述类似地，使用阻断区和/或阻断性寡核苷酸来抑制或阻止。例如，3'结合域可包含延伸阻断区。5'结合域可含有置换阻断区和/或延伸阻断区。探针可在3'引物末端与结合域(5'结合域)等之间含有外切核酸酶阻断区。
环状RCA探针的其它实施方案示于图9和10中。在这些示例性实施方案中，引物链和环状链是环状寡核苷酸。引物链包含靶互补结合域，当其与靶核酸分子杂交时形成功能性切割识别位点。在一些实施方案中，识别切割识别位点的切割酶能够在与切割识别位点相邻的位点切割(例如使用IIS型限制性内切核酸酶)引物链。这对于避免靶核酸分子(第一RCA产物或中间分子)的切割是特别有用的。引物链的切割所发生的位点(可切割域)可由限制性寡核苷酸(下文中所定义的)形成，所述限制性寡核苷酸形成核酸构建体的第三链，即限制性链或切割链(图9)。或者，引物链可包含形成可切割域的发夹结构(图10)。如上文中所描述的，RCA探针的引物链的切割和随后外切核酸酶降解释放可通过RCA模板依赖性聚合延伸来形成第二RCA产物的引物。在一些实施方案中，不需要外切核酸酶降解，并且引物链的切割可直接释放可用作用于第二RCA反应的引物的引物链的部份。
同样，阻断区和/或阻断性寡核苷酸可用于阻止或抑制使用第一RCA产物作为模板的不需要的延伸。例如，可在引物链的区中于引物的3'末端与结合域之间包含外切核酸酶阻断区。结合域可包含置换阻断区和/或延伸阻断区等。
其它示例性实施方案示于图11中。探针提供第一核酸链，引物链，其在一些实施方案中可以以发夹结构的形式存在。在其它实施方案中，引物链可以以环状寡核苷酸的形式存在(图12)。探针还提供第二核酸链，环状链，其以与第一核酸链的区例如发夹结构的单链环杂交的环状核酸分子的形式存在(图11)。
在探针与靶核酸分子(第一RCA产物或中间分子)相互作用，例如与其杂交之前，第一核酸分子/链的3'末端(或朝向3'末端的核酸分子的部分)可与第一核酸链的5'末端的至少部分(即与结合域的至少部分)杂交，以形成发夹结构例如茎环。这可用于保护引物链的一个或两个末端免受降解，例如由样品中的具有外切核酸酶活性的组分进行的消化。然而，探针的第一核酸链形成发夹结构不是必需的，即在一些实施方案中，引物链可以不具有分子内互补性。
在第一RCA产物或中间分子(即靶核酸分子)存在的情况下，引物链的靶互补结合域与其同源或靶位点杂交。当以发夹结构的形式提供探针的引物链时，探针与靶核酸之间的相互作用足以使发夹结构去稳定，即引物链的靶互补结合域与靶核酸之间的双链体比引物链的5'与3'末端之间的双链体更稳定。例如，引物链的结合域与靶核酸之间的双链体可比引物链的5'与3'末端之间的双链体更长。
引物链包含切割位点，所述切割位点形成RCA模板在其上被杂交的位点的部分或与所述位点相邻(即在RCA模板在其上被杂交的位点的3')。切割位点的切割(例如通过引物链的3'的外切核酸酶降解进行的)导致RCA引物的释放，所述引物可使用RCA模板链作为聚合模板来延伸，以产生第二RCA产物。
同样，使用第一RCA产物作为模板的不需要的延伸可通过使用如上论述的阻断区和/或阻断性寡核苷酸来避免。因此，结合域可含有延伸和/或置换阻断区。引物链可在引物的3'末端与结合域等之间含有外切核酸酶阻断区。
其它环状RCA探针示例性实施方案示于图13中，其中所述探针包含3个核酸链：引物链、环状链和侵入链(其也可被视为阻断链)。
在优选实施方案中，引物链在5'末端包含靶互补结合域以及在3'末端包含含有切割识别位点的域(切割域)，所述域通过也可被视为引物域或其部分的与RCA模板互补的内部区(RCA模板互补域)联接。切割域包含与靶序列的区(与引物链的靶互补区(结合域)能够与其杂交的的区直接或间接相邻的靶序列的区)相似或相同的序列的区。
在其5'末端，侵入链包含与切割域互补的区，并且在其3'末端包含靶互补结合域，其中与切割域互补的区也与靶序列的区(与引物链的靶互补结合域能够与其杂交的区直接或间接相邻的靶序列的区)互补。侵入链阻止，即阻断切割域被切割酶例如外切核酸酶切割。
在靶核酸分子(第一RCA产物或中间分子)存在的情况下，探针的靶互补区(结合域)结合于靶分子(靶分子的探针结合域)。这从切割域置换侵入链，即探针解折叠并且侵入链侵入靶核酸，这将切割域暴露于切割酶，其中所述域的切割(例如探针的单链3'末端直至与RCA模板杂交的引物域的降解)释放用于以RCA为模板的延伸的引物，以形成第二RCA产物。
在一些实施方案中，引物链不包含切割域。相反地，引物链在5'末端包含靶互补区(结合域)(与RCA模板互补的第一区(RCA模板互补域)和与RCA模板互补的第二区；所述第二域用作用于RCA反应的引物(引物域)。引物域包含与靶序列的区(与引物链的靶互补结合域能够与其杂交的区直接或间接相邻的靶序列的区)相似或相同的序列的区。引物域与侵入链的杂交比其与RCA模板的杂交更强。
在靶核酸分子存在的情况下，探针的靶互补区(结合域)结合于靶分子。这从引物域置换侵入链，即探针解折叠并且侵入链侵入靶核酸，这释放引物域来结合用于以RCA为模板的延伸的RCA模板。因此，引物可通过探针的靶依赖性解折叠来释放。
以第一RCA产物为模板的不需要的延伸可通过如上论述的阻断区和/或阻断性寡核苷酸的适当使用来避免。例如，所述域可包含置换和/或延伸阻断区，可在3'引物末端与结合域之间包含外切核酸酶阻断区，和/或可使用阻断性寡核苷酸等。
因此，在本发明的更具体方面，本发明的RCA报告探针可被定义为提供或能够提供足以启动滚环扩增(RCA)反应的核酸组分的探针，所述探针是核酸构建体，其包含：
(a)第一链(即引物链)，其包含：
(i)第一结合域，其包含能够结合于第一RCA产物或中间分子的结合域(更具体地包含与所述产物或中间分子互补的区)(即靶互补域或靶结合域，或更简单地结合域)，所述中间分子直接或间接结合(例如杂交)于第一RCA产物；
(ii)第二域，其包含与环状或可环化的RCA模板互补的区，所述域可提供用于所述RCA模板的RCA的引物的全部或部分(即RCA模板互补域和/或引物域)；和
(iii)第三域，其包含切割识别位点(即切割域)或包含与环状或可环化的RCA模板互补的可提供用于所述RCA模板的RCA的引物的区(即引物域)，
和
(b)第二链(即环状链)，其能够与第一链的第二域杂交，所述第二链包含：
(i)环状RCA模板，其包含至少一个与第一链(即第一链的至少第二域)互补的区；或
(ii)可环化的RCA模板，其包含2个与第一链的第二域互补的区，其中第一互补区在可环化的RCA模板的5'末端，并且第二互补区在可环化的RCA模板的3'末端，并且其中所述互补区能够与第一链的第二域杂交，以使所述5'和3'末端可直接或间接连接，
其中探针的至少部分的切割和/或解折叠释放用作用于RCA模板的RCA的引物的域。
在本发明的该方面的一些实施方案中，引物链的第三域包含与第一域互补的区，以便当第一域不与第一RCA产物或中间分子杂交时，第三域与第一域杂交以形成核酸双链体。因此，将探针与靶核酸分子接触可被视为解折叠探针。该实施方案对于当探针未结合于靶核酸分子时阻止其的切割(例如其中切割剂为外切核酸酶，特别地3'外切核酸酶)是特别有利的。
在一些实施方案中，核酸构建体包含保护链或保护寡核苷酸。所述保护链或保护寡核苷酸可阻止或防止寡核苷酸的切割识别位点或域被切割酶识别。在一些实施方案中，保护链或寡核苷酸可阻止引物链与样品中的另一核酸分子例如与另一探针形成功能性切割识别位点。在其它实施方案中，保护链或寡核苷酸可阻止引物链引发以RCA为模板的延伸。在一些实施方案中，RCA模板用作保护链或寡核苷酸。在一些实施方案中，可直接或间接连接引物链的末端。
在一些实施方案中，引物链为环状核酸分子。在其它实施方案中，环状引物链包含发夹结构。在一些实施方案中，核酸构建体包含限制性寡核苷酸(即限制性链或切割链)。
"发夹RCA探针"的其它示例性实施方案示于图14中，其为上述和图5中显示的实施方案的变型。
探针以第一核酸链的形式存在，其包含发夹结构和在发夹结构的任一侧上与第一核酸链杂交的两个其它核酸链(第二和第三链，即寡核苷酸)。通过第二和第三链产生的探针的双链部分用作切割识别位点，例如被一种或多种切割酶识别的位点或域。因此，第二和第三链可被称为切割链或切割寡核苷酸。在一些实施方案中，这些链可被称为如下所定义的限制性寡核苷酸或限制性链。
第一链包含3个与其靶互补的区(即3个结合域)，其中每一个靶互补结合域与切割识别位点直接相邻，即与形成发夹结构的探针的区或切割链所杂交的区直接相邻。每一个结合域用于将RCA核酸组分的一种直接或间接附着于第一RCA产物。
在于允许探针与其靶核酸分子(即第一RCA产物或中间分子)杂交的条件下与样品接触后，可将一种或多种识别切割识别位点的切割剂添加至样品，这导致探针中的3个位点即发夹结构的环和探针的每一个双链部份或与其相邻的区的切割。在切割探针后，发夹结构能够解折叠(通过发夹结构的部分的切割)以提供附着于(经由与包含靶互补结合域的探针的部分的杂交)靶核酸分子的RCA模板。引物和连接模板各自由附着于(经由其它靶互补结合域)靶核酸分子的探针的部份提供。
在靶核酸分子存在的情况下，将RCA核酸组分与第一RCA产物(经由靶互补结合域)直接或间接杂交，从而使RCA核酸组分保持紧密靠近。RCA模板与引物和连接模板杂交。探针的连接模板部分在连接酶存在的情况下作为模板环化RCA模板。探针的引物部分可使用环化RCA模板作为聚合模板来延伸，以产生第二RCA产物。将明显的是，在靶核酸分子不存在的情况下，形成RCA核酸组分的探针的被切割的部分未保持靠近，从而阻止第二RCA产物在靶核酸不存在的情况下产生。
可与如上文中所述类似地使用延伸阻断区、外切核酸酶阻断区和/或置换阻断区和/或阻断性寡核苷酸来避免以第一RCA产物为模板的不需要的延伸。因此，例如，结合域可包含置换阻断区和/或延伸阻断区。第一链的其它区可包含外切核酸酶阻断区等。
在其它实施方案中，可将引物域和连接模板域的一个或两个作为发夹结构来提供，参见例如图15和16。将明显的是，引物域和连接域可通过发夹结构与切割寡核苷酸的组合来提供。然而，以发夹结构的形式来提供所有RCA核酸组分是特别有利的，因为这允许以单链核酸分子(即包含分子内互补的区的单个连续核酸链)的形式提供本发明的探针核酸构建体。
因此，在本发明的一个实施方案中，可以以"两部分"发夹RCA探针的形式提供RCA报告探针(图15)。探针以包含2个发夹结构(每一个发夹结构包含可切割的位点并且连接于靶互补结合域)的单个核酸链的形式存在。图15中，探针在每一个末端上包含靶互补结合域。将明显的是，探针的末端可与其靶核酸分子(第一RCA产物或中间分子)杂交，以使探针的5'和3'末端可直接或间接连接，以便可使用靶核酸作为连接模板来连接探针，从而形成环状核酸分子。
在于允许探针与其靶核酸分子杂交的条件下与样品接触后，可添加切割剂以切割发夹结构中的切割位点。发夹结构解折叠以产生进行第二RCA反应所需的核酸组分。在一个实施方案中，引物和连接模板由第一发夹结构提供(即引物也用作连接模板或反之亦然)并且RCA模板由第二发夹结构提供。在另一个实施方案中，连接模板由第一发夹结构提供，并且引物和RCA模板由第二发夹结构提供。
在靶核酸分子存在的情况下并在切割探针后，引物和连接模板域形成包含靶互补结合域的探针的部分。因此，将引物与连接模板域与靶核酸分子杂交，从而使RCA核酸组分保持紧密靠近。RCA模板与引物和连接模板杂交。在其中引物域也用作连接模板的实施方案中，将RCA模板与包含靶互补域的探针的部份杂交。如上文中所描述的，探针的连接模板部分在连接酶存在的情况下用作模板来环化RCA模板。探针的引物部分可使用环化的RCA模板作为聚合模板来延伸，以产生第二RCA产物。将明显的是，在靶核酸分子不存在的情况下，形成RCA核酸组分的探针的被切割的部分未保持靠近，从而在靶核酸(第一RCA产物或中间分子)不存在的情况下阻止第二RCA产物的产生。
"三部分"探针示于图16中，其以包含3个发夹结构(每一个发夹结构包含可切割的位点并且连接于靶互补结合域)的单个核酸链的形式存在。将明显的是，该探针与图14中显示的和上述的实施方案类似地起作用。差异在于用发夹结构替代切割寡核苷酸。
两部分"线性RCA探针"的示例性实施方案描绘于图17E中，其为上述和图5中显示的实施方案的变型。
探针以2条核酸链的形式存在并且包含单个切割域。第一链提供RCA模板并且第二链可被视为切割链。在图17E中，探针在5'末端包含第一靶互补结合域和在3'末端附近包含第二靶互补结合域。在于允许探针与靶核酸分子(第一RCA产物或中间分子)杂交的条件下与样品接触后，可添加切割剂以切割结合域之间的切割位点。不与靶核酸分子互补的探针的部分形成进行第二RCA反应所需的核酸组分。例如，附着于第一结合域的探针的部分形成连接模板和RCA引物。第二结合域形成RCA模板，即第二结合域的任一侧上的域的末端可结合连接模板，以便它们可直接或间接连接。
在靶核酸分子存在的情况下，并且在切割探针后，连接模板/RCA引物和RCA模板域形成包含靶互补结合域的探针的部分。因此，连接模板/RCA引物域和RCA模板域与靶核酸分子杂交，从而使RCA核酸组分保持紧密靠近。如上文中所描述的，探针的连接模板/RCA引物部分在连接酶存在的情况下用作模板来环化RCA模板。探针的连接模板/RCA引物部分可使用环化的RCA模板作为聚合模板来进行延伸，以产生第二RCA产物。将明显的是，在靶核酸分子不存在的情况下，形成RCA核酸组分的探针的被切割的部分未保持靠近，从而在靶核酸不存在的情况下阻止第二RCA产物产生。
上述发夹RCA探针和线性RCA探针的"两部分"和"三部分"方面是指靶互补结合域的数目，其中探针的切割用于使直接或间接附着于每一个靶互补结合域的RCA核酸组分分离。因此，将明显的是，"三部分"探针不能参与以靶为模板的连接，然而这是"两部分"探针的优选方面。
"两部分"探针设计的其它实例示于图17中。如上文中所描述的，每一个发夹RCA探针提供足以启动RCA反应的核酸组分，即引物、连接模板和RCA模板，并且根据图中举例说明的实施方案，可确定提供RCA模板的域与提供连接模板的域相邻。然而，提供引物的域可与提供RCA模板的域或提供连接模板的域相邻。
很显然，上述"两部分"和"三部分"探针是示例性的，并且可能在更多部分例如4、5个部分等中提供RCA组分。因此，线性和发夹RCA探针可以是多部分探针，其中每一个RCA组分在探针切割后附着于单独的靶互补结合域。在这方面，可在不止一个部分例如2或3个部分等中提供RCA模板，所述模板可被连接来形成环状寡核苷酸。在这方面，其中提供RCA模板的部分的数目将决定由探针提供的连接模板的数目，即如果在2个部分例如2个半环中提供RCA模板，则探针将提供2个连接模板，其中连接模板之一还可用作RCA引物(例如四部分探针)或可单独地提供RCA引物(例如五部分探针)。四部分和五部分探针示于图18中。
因此，在本发明的另一个更具体的方面，RCA报告探针可被定义为提供或能够提供足以启动滚环扩增(RCA)反应的核酸组分的探针，所述探针为核酸构建体，其包含：
(i)至少两个域，其各自包含能够结合于第一RCA产物或或中间分子的结合域(更具体地包含与所述产物或中间分子互补的区)，所述中间分子直接或间接结合(例如杂交)于第一RCA产物；
(ii)一起能够提供RCA模板的一个或多个域；和
(iii)至少一个能够提供连接模板和/或引物的域，所述域包含：
(a)与探针内序列互补，以便其形成包含切割识别位点的发夹结构的部分的区；或
(b)包含切割识别位点的双链核酸的区，
其中
(1)每一个能够提供RCA核酸组分的域可经由结合域直接或间接附着于第一RCA产物；
(2)能够提供RCA模板的域与能够提供连接模板的域相邻；和
(3)探针的切割释放(或足以释放)(即探针可被切割以释放)所述RCA核酸组分，以使得当结合域与第一RCA产物直接或间接杂交(即与第一RCA产物或中间核酸分子杂交)时能够进行RCA反应。
在发夹RCA探针实施方案中，探针包含一起能够提供RCA模板的一个或多个域，其中一个或多个所述域包含与探针内的序列互补的区，以便其形成包含切割识别位点的发夹结构的部分。
在一些实施方案中，靶互补结合域与靶或中间核酸分子杂交，以使探针的5'和3'末端可直接或间接连接。
在一些实施方案中，能够提供RCA模板的域还提供用于进行RCA反应的引物，在该情况下能够提供连接模板和/或引物的域只提供连接模板。因此，在一些实施方案中，将连接模板和引物域作为单独的域来提供。
在示例性实施方案中，每一种RCA核酸组分由单独的域提供，其中探针包含能够提供连接模板或引物的其它域，所述域包含；
(a)与探针内序列互补，以使其形成包含切割识别位点的发夹结构的部分的区；或
(b)包含切割识别位点的双链核酸的区。
包含切割识别位点的双链核酸的区由与探针的第一链的区杂交的核酸链提供，其中第一链可被视为包含能够提供RCA模板的域的链。因此，如上文中所论述的，探针可包含一个或多个切割寡核苷酸或限制性寡核苷酸。
如上文中所论述的，本发明的特征是阻止探针使用第一RCA产物或中间分子作为延伸模板，或限制延伸。如果探针包含可参与以靶为模板的延伸反应的可延伸的3'末端，则延伸产物可随着其延伸而置换结合于靶核酸分子的探针。如果该情况发生，则第二RCA产物被局限于第一RCA产物的特征将丧失。
可从图和上述示例性实施方案看到，本发明的探针可包含与其靶核酸分子(第一RCA产物或中间分子)杂交的3'末端，例如其中探针在其3'末端包含靶互补结合域。类似地，探针的切割可导致包含与靶核酸分子杂交的可延伸的3'末端的一个或多个探针的部分。在环状RCA探针实施方案中，很显然，如果RCA模板链与引物链解离，则引物链可启动以靶为模板的延伸反应，例如可降解探针直至探针的5'末端上的靶互补结合域，以使所述域包含可使用靶作为延伸模板，利用聚合酶延伸的可延伸的3'末端。因此，可在探针中包含一个或多个阻断基团来阻止不需要的以靶为模板的延伸。此外或可选择地，可以有用地，在本发明的方法中利用不可置换的阻断性寡核苷酸(抗置换寡核苷酸)。不可置换的寡核苷酸("阻断性寡核苷酸")可结合靶中的探针结合域之间的靶核酸分子的区。因此，任何以靶为模板的延伸产物/反应可在延伸产物置换本发明的探针之前被不可置换的阻断性寡核苷酸阻断。
本发明的探针可在一个或多个位置包含阻断基团或"阻断区"，这可取决于探针的设计。例如探针的5'末端和/或3'末端上的靶互补结合域的部分可被修饰来包含置换阻断区，以使其不能被链置换聚合酶，或被延伸链置换。因此，探针的结合域的一个或多个可包含外切核酸酶阻断区和/或延伸阻断区和/或置换阻断区。
可修饰探针的3'末端以使其不能用作引物。例如，可修饰探针，以使3'末端不与靶核酸分子互补，从而不能参与以靶为模板的延伸反应。此类非互补末端可包含外切核酸酶阻断区。
在一些实施方案中，特别地对于本发明的环状RCA探针，可在引引物链的部份中于5'靶互补结合域与RCA模板互补域/引物域之间包含外切核酸酶阻断区。
因此，取决于所使用的方法步骤和探针设计的精确性质，可单独地或组合地使用各种方式和方法。例如，可将修饰(例如阻断基团或经修饰的残基)掺入探针，所述修饰抑制聚合酶和/或外切核酸酶作用(即其抑制延伸和/或降解)，或其抑制链置换。为了防止任何杂交的探针或探针组分(即在切割探针后)产生能够在靶核酸分子上进行引发的引物的不需要的外切核酸酶消化，可避免任何具有核酸外切活性的试剂存在，例如可使用外切核酸酶缺陷型聚合酶。在本发明的方法的某些实施方案中，可使用洗涤步骤。例如，在经设计具有一个或多个与靶核酸分子杂交而并置以便于连接的可连接的末端的探针的情况下，已杂交但未连接的任何探针可通过严格洗涤(按照本领域公知的原理)去除。这在非均相或基于固相的方法的情况下是特别适用的。可使用此类方法的任意组合。
在具有与靶核酸分子杂交的3'末端(其中该3'末端并非进行连接所需要的)的探针或探针组分(即在切割探针后)的情况下，可在3'末端或其附近包含用于抑制延伸的修饰或阻断区(例如"聚合酶阻断区"或"延伸阻断区")。可选择地或此外，可使用阻断性寡核苷酸来阻止可从3'末端延伸进入任何下游探针并置换所述探针的任何延伸。如上文中所指出的，此类阻断性寡核苷酸本身被修饰来掺入延伸和/或降解阻断区(例如在3'末端)和置换阻断区(例如在5'末端)。
在某些实施方案中，探针可包含与靶核酸分子杂交的并且是进行连接(例如连接于探针的5'末端)所需的3'末端。在此类情况下，为了确保3'末端可用于连接，在杂交的3'末端上包含延伸和/或降解阻断区是不适当的。在该情况下，可通过严格洗涤以除去任何未连接的探针来抑制任何未连接的3'末端的不需要的3'延伸。可选择地或此外，在此类情况下，可在杂交的可连接的5'末端或其附近修饰探针以包含置换阻断区。在此类情况下，确实从3'末端发生的任何延伸将不会置换杂交的5'末端。
使用靶核酸分子作为连接模板连接的本发明的RCA报告探针(即以靶为模板的连接依赖性探针)相对于现有技术水平的RCA探针，例如直接在它们的靶核酸上环化的常规锁式探针是特别有利的。在这方面，以靶为模板的锁式探针的连接用于将环化的核酸分子锁于连接模板(即靶核酸分子)，这可抑制(因拓扑学抑制而导致的)以环化的分子为模板的RCA。可以有必要解除或释放拓扑学抑制，例如通过消化靶核酸分子，以使RCA反应能够进行。然而，由于本发明的探针提供使RCA能够进行的核酸组分并且所述探针本身被延伸以产生RCA产物，因此无需从靶核酸分子解除或解锁探针来产生RCA产物。事实上，以靶核酸分子为模板的探针的连接可帮助促进第二RCA产物的定位，即确保RCA产物连接于第一RCA产物。
因此本发明的RCA报告探针特别有利地用于用来通过sRCA检测靶分析物分子的方法。在这方面，尽管多个常规锁式探针可结合包含多个结合位点的靶核酸分子，但靶分子必须被切割以使得针对每一个探针的RCA反应能够进行。因此，RCA产物未彼此连接，即每一个RCA产物是靶核酸分子的单独部分的延伸。或者，如果靶核酸分子未被切割，则仅单个锁式探针可产生RCA产物(即靶核酸分子的3'末端的单个延伸)。相反地，本发明的RCA报告探针不需要靶核酸分子(第一RCA产物或中间分子)被切割来产生第二RCA产物。因此，所产生的所有第二RCA产物可附着于第一RCA产物。这使得所有RCA产物能够被局限于第一RCA产物的位置中，这可导致更强的信号和/或允许可检测的信号更快地产生。
在一些实施方案中，可有用地这样RCA报告探针，以使得当探针的末端已通过以靶为模板的连接直接或间接连接时，通过切割探针产生的RCA组分才会保持结合于(即附着于或杂交至)靶核酸分子。这可以例如通过设计探针以确保靶互补域(即结合域)的至少一个只有在另一个靶互补域存在的情况下才可稳定杂交来实现，例如靶互补结合域中的一个可包含与其靶分子互补的短区。在切割探针之前，靶互补域(其通过间插序列联接)与靶核酸分子的相互作用的组合足以将探针附着于其靶核酸。然而，如果靶互补域未被连接(直接或间接)，则在切割探针中的可切割位点后，使RCA能够进行所需的探针的核酸组分的至少一种将与靶核酸解离。因此，除非以靶为模板的连接已发生，否则RCA反应将不能进行。
很显然，以靶为模板的连接可以是分子内的或分子间的。分子内连接在上文中进行了描述，其中探针的5'和3'末端与其靶核酸分子杂交，以使所述末端可被直接连接(间接连接牵涉空隙寡核苷酸，如下文中所描述的)。分子间连接需要另外的核酸分子，例如稳定寡核苷酸或连接寡核苷酸或"空隙"寡核苷酸，所述寡核苷酸与靶核酸分子的与探针的5'或3'末端相邻的区杂交。可使用连接酶将探针的靶互补区连接于空隙寡核苷酸，这可阻止由探针提供的RCA核酸组分在所述探针被切割后与靶核酸分子解离。
如上文中所描述的，在一些实施方案中，探针包含多个发夹结构并且使用本发明的探针的方法可有利地包括如下步骤：解折叠探针的域以释放对于使RCA能够进行是必需的并且足以使所述RCA能够进行的核酸组分。这可以例如通过改变样品的条件以促进解折叠，例如改变样品的温度或盐浓度来实现。解折叠可包括置换核酸构建体的一条或多条链，所述置换可以是分子内或分子间置换。
如上文中总体论述，本发明的方法允许第一RCA的进一轮局部RCA扩增，其中第二轮或进一轮RCA扩增产物被局限于第一RCA扩增产物。这可具有许多应用，最为明显地用于信号放大，并因此用于许多基于检测RCA产物的检测方法或测定。因此，在此类实施方案中，如上所定义的本发明的方法可包括检测所述附着的第二RCA产物，从而检测所述第一RCA产物的额外或附加步骤，其中检测被局限于第一RCA产物。
或者认为，可看到此类实施方案提供本发明的其它方面，所述方面可被定义为用于检测RCA反应的第一产物的方法，所述方法包括进行如本文中所定义的局部RCA反应和检测如上所定义的所述第二RCA产物。在某些实施方案中，可允许进行局部检测(例如空间检测)，例如当第一RCA产物被原位固定或固置时。
如上文中所指出的，此类方法的优点包括更强和/或更快的信号放大。所述方法从而在检测任何需要测定靶或分析物中具有特别的效用，所述靶或分析物可以是本身可通过RCA扩增以形成第一RCA产物的靶/分析物核酸分子，或可通过使用或产生环状核酸分子作为测定靶/分析物的测定报告分子或标志物的测定检测的靶/分析物核酸分子或任何其它分子(参见上文)。此类环可以是用于产生第一RCA产物的第一RCA模板。
因此本发明的方法和探针可用于检测样品中的核酸分子。所述核酸分子可以是待检测的靶分析物或可指示靶分析物在样品中的存在。例如，所述核酸分子可附着于靶，例如直接或间接结合于靶例如蛋白质分子的抗体:核酸缀合物的核酸域。类似地，待检测的核酸分子可以是从接近式探针之间的相互作用产生的核酸分子，其结合于靶分析物例如蛋白质。
因此，可看到本发明提供用于检测样品中的分析物的方法，其中使用或产生(例如从核酸分析物产生，或用作或产生为所述分析物的标志物)第一环状RCA模板，使用所述第一RCA模板进行第一RCA反应以产生第一RCA产物，如本文中所述进行局部第二RCA反应以产生被局限于所述第一RCA产物的第二RCA产物，并检测所述第二RCA产物。
因此，可使用如本文中所定义或描述的探针，尤其是RCA报告探针，其中所述探针与第一RCA产物直接或间接杂交。第一RCA产物可使用第一RCA模板通过第一RCA反应来产生，所述第一RCA模板本身可以是如下物质或来源于所述物质或从所述物质产生：
(i)分析物；
(ii)直接或间接附着于分析物的核酸分子(例如探针)；或
(iii)指示样品中的分析物，或样品中所述分析物的替代物(即其的标志物)。
如上文中所描述的，通过在局部第二RCA中使用RCA报告探针，可通过此类要求(即RCA组分的至少一种组分通过切割反应和/或通过在将探针与第一RCA产物/中间分子接触后使探针解折叠来释放)来控制第二RCA反应。
RCA模板，即环状或可环化的核酸分子(例如寡核苷酸)，在本领域是公知的。RCA模板通常可包含约20个-1000个核苷酸，例如26个-1000个、30个-1000个、30个-900个、60个-900个、40个-800个、50个-700个、60个-600个、70个-500个、80个-400个、90个-300个或100个-200个核苷酸，诸如至少20个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、120个、150个、200个或250个核苷酸。
可环化的核酸分子(通常称为锁式探针和其变体)通常为线性核酸分子，其包含可与一个或多个核酸域(共同模板)杂交的游离末端，所述核酸域用作模板来将游离末端彼此连接以产生环状寡核苷酸。此类连接可以是直接的，即其中游离末端彼此紧密相邻地与连接模板杂交。或者，连接可以是间接的，即其中游离末端与连接模板杂交，游离末端之间的间隔通过“间隙”寡核苷酸来填充，以使每一个游离末端被连接于所述间隙寡核苷酸的一个末端。在一些实施方案中，游离末端之间的间隔可通过例如在聚合酶反应中，使用连接模板作为延伸模板延伸游离3'末端来“充满”。一旦游离3'末端已延伸至与游离5'末端相邻，就可通过连接反应连接两个末端。
在其中以探针(其中探针为环状RCA探针)的预先形成的环状链或可环化的链的形式提供第二RCA模板或单独地提供(不作为探针的部分)第二RCA模板，并且探针的切割和/或解折叠不是产生RCA模板所需的实施方案中，第二RCA模板优选地以预先形成的环(环状寡核苷酸)的形式提供。然而，这不是本方法或探针的基本特征，并且第二RCA模板可以以可环化的寡核苷酸的形式提供，其中与第二RCA模板杂交的探针的域可用作连接模板和/或延伸模板(基于上述间隙填充实施方案)。
在其中第二RCA模板通过探针(例如其中探针为发夹或线性RCA报告探针)的域的切割和任选地解折叠来释放的实施方案中，第二RCA模板将以可环化的核酸分子的形式存在，即被切割的探针的核酸域的一个或多个可释放5'和/或3'末端，从而允许连接末端以形成环状分子(第二RCA模板)。两个或更多个第二RCA模板部分可被连接在一起来形成第二环状RCA模板。所述域的可连接的5'和3'末端的释放从而可被视为用于通过连接进行的环化的第二RCA模板的产生。在本发明的一个优实施方案中，单个RCA模板域的可连接的5'和3'末端彼此直接相邻地与连接模板杂交以避免对提供单独的"间隙"寡核苷酸(间隙寡核苷酸不能由本发明的发夹RCA探针提供)的需要。在其它实施方案中，域的可连接的5'和3'末端可与连接模板杂交，在所述末端之间留下间隔，其中所述间隔通过使用连接模板作为延伸模板延伸3'末端来“充满”，随后连接域以形成RCA模板。
第一和/或第二RCA模板可包含报告域，其为可用于检测和/或鉴定RCA产物(即以RCA模板为模板的引物延伸产物)的序列。这在本发明的多重实施方案(其中将不止一种不同的第一RCA产物经历例如其中在单个测定中检测不止一种分析物例如核酸分析物的方法)中是特别有利的。第二RCA模板(例如由每一种RCA报告探针(例如对于从靶分析物衍生的或指示靶分析物的第一RCA产物是特异性的每一种探针)提供的RCA模板)，可包含独特的"标志物"或标识序列(例如条码序列，诸如包含特定检测探针的序列的位点，即RCA产物与RCA模板互补，并且因此与RCA产物杂交的检测探针将包含与RCA模板的部分相同的序列)以允许单独检测和/或定量样品中的每一种分析。因此，在多重测定中，每一种探针(或第二RCA模板)可包含不同的报告域，并且可以例如使用可与报告域的互补序列杂交的标记有不同荧光基团的寡核苷酸来平行(即同时)检测探针与靶分析物之间的相互作用的检测，即每一种分析物的检测。或者，每一种标志物(和从而每一种分析物)可使用连续可视化反应来检测，其中每一个反应以例如剥离或漂白步骤相间隔。适合于使用本发明的方法的连续可视化反应的方法在本领域中是已知的，例如等人，2009(A single moleculearray for digital targeted molecular analyses.Nucleic Acids Res.2009年1月；37(1):e7),等人，2002(Sequential immunofluorescence staining and imageanalysis for detection of large numbers of antigens in individual cellnuclei.Cytometry,47(1):32-41,2002)，所述文献在此通过引用并入。在本发明的一些代表性实施方案中，可平行检测多种分析物。在本发明的其它代表性实施方案中，可相继地检测多种分析物。
使用不同标记物的不同组合和/或比例的标记的组合方法，例如比例标记，在本领域中是已知的，并且可用于增加可一次检测的或在相同反应中检测的不同分子并从而不同分析物的数目。例如，可使用利用不同彩色标记物和/或荧光标记物和/或不同比例的不同彩色标记物和/或荧光标记物的组合。例如，此类具有彩色标记物和/或荧光标记物的不同组合的“颜色”-编码可用于基于利用流式细胞术或显微镜进行的检测的多重测定。或者，通过使用镧系元素同位素标记物，可使用cyToF检测。例如，可将7个不同的荧光基团分成4个不同的类型。如果仅用一种颜色标记，则存在7个不同组合，如果用2种颜色标记，则存在21个不同组合，如果用3和4种标记，则存在35个不同组合，依此类推。
引物或引物域(RCA引物)是包含可以例如在聚合反应中使用第二RCA模板作为延伸模板来进行延伸的3'末端的探针的部分或区。因此，引物或引物域包含与第二RCA模板的部分互补的区(在下文中进一步定义的)，所述区在有利于引物的RCA模板依赖性延伸的测定的条件下形成充分稳定的双链体。引物域还可用作如本文中所描述和下文中所定义的连接模板。探针的引物域的长度通常为至少5bp，通常为至少6bp、8bp或10bp，通常为至少15bp，更常见地为至少16bp，以及在长度上可长至30bp或更长，其中引物的长度范围通常为5bp至50bp，例如6bp、8bp或10bp至50bp，通常为约10bp至35bp。在一些实施方案中，引物或引物域可包含切割识别位点(其可只是易被外切核酸酶消化的游离3'末端)。
连接模板或连接模板域可存在于探针中，但并非在所有实施方案中是必不可少的，例如在以预先形成的环状寡核苷酸提供RCA模板的情况下。当存在时，所述域为探针的部分或区，可环化的RCA模板的5'和3'末端结合于所述部分或区，以其为模板来直接或间接连接RCA模板以形成环状寡核苷酸。如上文中所提及的，在一些实施方案中，连接模板还可用作延伸模板(用于"间隙填充"延伸反应)。因此，连接模板或连接模板域包含与RCA模板(或其部分)的部分(5'和3'末端)互补的区(在下文中进一步定义的)，所述区在有利于可环化的RCA模板的连接模板依赖性连接的测定的条件下形成充分稳定的双链体。探针的连接模板域的长度通常为至少2bp，常见地至少5bp，通常至少10bp，诸如至少15bp、16bp、17bp、18bp、19bp或20bp，并且在长度上可长至30bp或更长，其中连接模板的长度通常在2bp至50bp的范围内，通常约15bp至35bp或约10bp-20bp。
因此，在本发明的一些实施方案中，本发明的探针可被视为包含各种域，其各自用于与其靶核酸分子(第一RCA产物或中间分子)相互作用或通过在切割位点的切割和/或探针的解折叠后释放域来提供用于RCA的核酸组分的至少一种。
因此，探针包含至少一个包含与其靶核酸分子即第一RCA产物或中间分子互补的区的域；靶互补域或结合域。根据本文中的论述应理解，此类中间分子将包含与第一RCA产物互补的区和第二区，所述第二区不与第一RCA产物互补并且包含与探针互补的区或探针的结合位点。可使用一种或多种中间分子，例如中间分子可包含多个探针的结合位点，或中间分子可包含一个探针的结合位点，并且对于每一种探针可使用一种中间分子(例如当中间分子结合于存在于每一个单体中的位点时)。为简便起见，本发明主要是针对探针与第一RCA产物之间的直接相互作用来定义的，但当在探针结合的上下文中或针对使用第一RCA产物作为模板的不需要的延伸参考该定义时，应理解这将类似地应用于对中间分子的结合或在其上的延伸。此外，在检测测定法的上下文中，探针与其相互作用的第一RCA产物或中间分子可被视为针对探针的靶核酸分子，即使本方法的目的可以是探针不与其直接相互作用的核酸分子或其它分析物的检测。
与其靶核酸分子互补的区是指能够与靶核酸分子的至少一个区形成中间分子双链体的探针的部份。在一些实施方案中，与靶核酸分子互补的区将足以在其中探针发挥效用的测定条件下形成稳定双链体，以使探针(或其结构域)与靶核酸分子甚至在切割和/或解折叠探针后不解离。在其它实施方案中，可设计与靶核酸分子互补的区，以便只有当探针的至少一个其它靶互补域与靶核酸分子形成双链体(在其中探针发挥效用的测定条件下)时其才能够与靶核酸分子形成稳定双链体。因此，可能必需稳定探针与靶核酸分子之间形成的双链体(例如通过与靶核酸分子上的探针结合位点/域相互作用的探针的域的分子内连接)，以在切割和/或解折叠探针后防止探针(或其域)与靶核酸分子解离。
在其中探针包含必须被解折叠和/或切割以释放RCA核酸组分(例如发夹RCA探针)的发夹结构的实施方案中，所述发夹结构可包含任何合适数目的核苷酸残基，以便可解折叠发夹。在某些实施方案(特别地与RCA报告探针实施方案相关的)中，发夹结构只有在合适的条件下，例如在添加切割剂后才解折叠。很显然，发夹的结构将取决于用于促进其解折叠的方法。在代表性实例中，形成发夹结构的核酸域的部份(即提供发夹结构的双链体和环的部份)长度为约14个至约1000个核苷酸，其中在某些实施方案中，它们的长度范围可为约14至约500个核苷酸，包括约14个至约250个核苷酸，例如约14个至约160个核苷酸，诸如约14个至约150个核苷酸、约14个至约130个核苷酸、约14个至约110个核苷酸、约14个至约90个核苷酸、约14个至约80个核苷酸、约14个至约75个核苷酸、约14个至约70个核苷酸、约14个至约60个核苷酸以及所述范围之间的任何长度。因此，至少一个发夹结构的双链体部分(即茎环结构的茎)的长度可为至少3个碱基对，优选至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、40个或50个碱基对。在其它实施方案中，探针的至少一个发夹结构的双链体部分的长度可为至少100个、200个、300个或400个碱基对。
至少一个发夹结构的单链环优选地包含至少8个核苷酸，优选地至少9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、40个或50个核苷酸。在其它实施方案中，至少一个发夹结构的单链环的长度可为至少100个、200个、300个或400个核苷酸。
在本发明的某些优选实施方案中，探针的发夹结构包含至少一个尿嘧啶残基，优选至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个尿嘧啶残基(其可提供切割位点)
"互补"核苷酸序列将在适当的杂交条件下特异性组合以形成稳定的双链体。例如，当第一序列的一部分可在反向平行的意义(其中每一个序列的3'末端结合于另一个序列的5'末端并且一个序列的每一个A、T(U)、G和C从而分别与另一个序列的T(U)、A、C和G对齐)结合于第二序列的一部分时，则两个序列是互补。RNA序列还可包括互补G＝U或U＝G碱基对。因此，两个序列在本发明下不必具有完全的同源性来"互补"。通常地当至少约85％(优选地至少约90％，最优选至少约95％)的核苷酸在确定长度的分子上共享碱基对组织时，两个序列充分互补。
在上述实施方案的一些实施方案中，可以有用地，探针的一个域与不止一个其它核酸分子共享互补性。可能特别有利地，所述域对于与其相互作用的每一种核酸分子具有不同的互补性，即允许一个相互作用优先于不同的相互作用发生。例如，在一些实施方案中，靶互补结合域可与靶核酸分子互补和与探针的第二链或其它链例如保护链(在本说明书中保护链可被看作"阻断"链)互补，其中探针与靶核酸分子之间的相互作用足以置换"阻断"(保护)链(即解折叠探针)。在另一个示例性实施方案中，引物域可与"阻断"链(此处为侵入链)和RCA模板互补，并且侵入链可与靶核酸分子互补。探针与靶核酸分子之间的相互作用足以将侵入链从其与引物域的相互作用置换出来，其中侵入链结合于靶核酸分子并且引物链结合于RCA模板，即探针被解折叠以释放用于RCA的引物。因此，探针的互补域的序列可与一种或多种核酸分子，例如探针或靶核酸分子的域共有至少约85％，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
探针的任何域和/或靶核酸分子之间的互补性区(即杂交区)可具有在4bp-100bp的范围内的长度。在一些实施方案中，可以有用地使用相对短的互补性区例如6bp-20bp、6bp-18bp、7bp-15bp或8bp-12bp。然而，可使用其它更长的互补性区，特别是对于探针与靶核酸分子之间的相互作用，例如至少20bp、25bp、35bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp或100bp诸如10bp-100bp、20bp-90bp、30bp-70bp或40bp-60bp。
在本发明的许多实施方案中，探针包含至少一个包含切割识别位点的域，例如切割域或可切割域。切割识别位点为被切割酶识别的序列，即切割酶能够与切割识别位点特异性相互作用，其中所述相互作用导致核酸分子的切割。在一些实施方案中，切割酶可在切割识别位点上切割核酸分子，即切割识别位点可以是切割域或可切割域。在其它实施方案中，切割酶可在与切割识别位点直接或间接相邻的位置上切割，即切割域或可切割域可形成与切割识别位点不同的域。因此，本发明的探针可包含切割识别位点和可切割域作为单独的特征。在其它实施方案中，所有切割识别位点可以是可切割位点/域。
在一些实施方案中，探针包含不止一个可切割域，其中可切割域的切割释放引物域、RCA模板和连接模板域。在一些实施方案中，切割导致探针内的发夹结构解折叠，这释放RCA核酸组分。因此，可切割域的切割可导致探针的域分离成不同的核酸分子(例如发夹RCA探针)，其中所述域通过它们与靶核酸分子的相互作用彼此保持靠近。如果探针被切割成未附着于靶核酸分子的单独的核酸域，则域之间的相互作用(域之间的互补性区)不足以使域保持靠近来使得RCA反应(即第二RCA反应)能够进行。
"切割"在本文中被广义地定义为包括打断核苷酸链(即核苷酸序列)的任何方法。切割从而可包括打断共价键。这可包括核苷酸链的切割(即链切割或链切断)，例如通过磷酸二酯键的断裂。
在一些实施方案中，探针的切割位点的切割涉及打断至少一个连接探针核酸分子的相邻核苷酸残基的共价键，例如磷酸二酯键的水解。切割优选地包括一个或多个磷酸二酯键的水解，特别地其中切割位点形成发夹结构的部分。因此，在一些实施方案中，切割识别位点(或可切割域)存在于发夹结构中。
在其最简单的形式中，切割识别位点可以是可用于切割(和/或易被切割)的探针的部分，优选地当探针结合于其靶核酸分子时。例如，切割识别位点可以是探针末端上为单链的区，例如单链3'末端。换句话说，在一些实施方案中，探针的单链3'末端可被视为切割域。只能够降解单链核酸的外切核酸酶可用于降解探针的单链末端，其中降解会在为双链和/或包含阻断域例如外切核酸酶阻断区的探针的区上停止。例如，图1描绘了其中探针的3'末端的降解释放用于RCA模板指导的延伸的引物域。在优选实施方案中，环状RCA探针的解折叠和/或切割释放可被外切核酸酶降解的单链3'末端。
在具体实施方案中，探针包含具有双链核酸的区，其可以以发夹结构的形式存在，可包含内切核酸酶识别序列，即切割识别位点可以是内切核酸酶识别位点。在示例性实施方案中，例如当探针包含内切核酸酶识别位点时，内切核酸酶将只切割探针的双链体部份的单条链，例如发夹结构的一条链，从而释放RCA核酸组分或可提供RCA核酸组分的域。
探针可包含内切核酸酶识别序列。例如，探针的核酸链可以是"切割寡核苷酸"或"限制性寡核苷酸"，其与探针的另一条核酸链杂交以提供内切核酸酶识别位点。在一些实施方案中，切割或限制性寡核苷酸可与探针的单链部分或区，例如发夹结构的单链环杂交，以在探针内包含双链体。然而，在其中单独地提供切割寡核苷酸的实施方案中，其不提供RCA核酸组分例如连接模板。
在本发明的方法的具体实施方案中，例如通过使用包含至少一个切割链的发夹和/或线性RCA探针，可有利地在反应混合物中包含，即添加过量的切割链。这可帮助确保所有结合于靶核酸分子的探针可释放足以启动第二RCA反应的核酸组分。例如，在一些反应条件中，一定比例的切割链可与探针离解。因此，通过在反应混合物中提供过量的切割链，即切割寡核苷酸，可足以替代已从探针移位的任何切割链，即原位重新装配探针。
在一些实施方案中，内切核酸酶可以是限制性内切核酸酶(限制性内切酶)，即切割识别位点可以是限制性内切核酸酶识别位点。应理解，这可用于其中切割位点不通过靶结合产生即不包含靶核酸分子的实施方案。可使用任何合适的限制性内切核酸酶来切割探针，即探针可包含合适的限制性内切核酸酶识别位点。如上文中所描述的，在具体的实施方案中，可以有用地，使用II型限制性内切核酸酶识别序列，和任选地切割域。一些II型限制性内切核酸酶例如IIS型酶在本发明的方法中具有特别的效用。II型限制性内切核酸酶在特定的切割识别位点内或在相邻位点(切割域)上切割，其中所述相邻位点可与切割识别位点(例如IIS型酶)相距特定的距离和/或可包含另外的切割识别位点(例如IIE型酶)。
在一些实施方案中，通过提供探针例如探针中的发夹结构来获得切割识别位点，所述识别位点包含一个或多个尿嘧啶残基。包含尿嘧啶残基的域，例如发夹结构，可通过利用与能够识别dsDNA的无嘌呤/无嘧啶(AP)位点的内切核酸酶例如内切核酸酶IV组合的尿嘧啶-DNA糖苷酶(UNG)的处理来切割，其中切割释放一种或多种RCA核酸组分。因此，切割识别位点例如可切割域，可包含一个或多个尿嘧啶残基，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个尿嘧啶残基。
在一些实施方案中，可使用仅切割可切割域例如发夹结构的双链体中的一条链的切口酶对可切割域例如发夹结构进行切割，从而释放一种或多种RCA核酸组分。因此，切割识别位点可以是切口酶的位点。切口酶是仅切割DNA双链体的单条链的内切核酸酶。如上文中所描述的，可在探针的单链区例如发夹结构的环中，例如通过使寡核苷酸与所述单链区例如环退火(杂交)，或当包含切割识别位点的靶互补域结合于靶核酸分子时，提供切割识别位点。或者认为，当切割寡核苷酸或靶核酸分子与切割识别位点相互作用时，切割识别位点可变得有功能，即可以以被内切核酸酶识别并切割(或使得内切核酸酶能够在与切割识别位点相邻的位置上，即在可切割域中切割探针)的形式存在。在其它实施方案中，阻断性寡核苷酸可结合于切割识别位点以阻止切割发生。
一些切口酶通过结合并识别特定核苷酸识别序列即切割识别序列，在DNA分子上的特定位点引入单链切口。一些切口酶在双链体中的错配位置上引入单链切口。因此，在一些实施方案中，当靶互补域结合于具有错配的靶核酸分子(即靶互补域可以不与靶核酸分子中的靶结合域100％互补，如上文中所定义的)时，可形成切割识别位点。已发现许多天然存在的切口酶，目前已确定了其中至少4种的序列识别性质。在美国专利No.6,867,028(其通过引用以其整体并入本文)中描述了切口酶，并且任何合适的切口酶识别位点可用于本发明的探针和方法。
在利用切口酶的本发明的方法的一些优选实施方案中，在切割，和任选地解折叠探针后从测定除去切口酶或使切口酶灭活，以防止不需要的连接产物的切割。
在本发明的其它实施方案中，外切核酸酶可用于降解探针的一条链的部份，例如探针或发夹结构的3'末端上的单链域，从而释放由探针提供的RCA核酸组分。因此，切割识别位点或更具体地切割域可以是易被外切核酸酶切割(即解锁)的探针或发夹结构的单链部分。取决于发夹结构的取向或探针的设计，外切核酸酶可具有5'或3'外切核酸酶活性。在一些实施方案中，外切核酸酶活性可由聚合酶提供。
在一些实施方案中，可通过解折叠探针来释放RCA核酸组分的一种或多种，这可以以许多方式来实现。在具体实施方案中，可通过切割来解折叠一种RCA核酸组分，即可通过探针的切割和解折叠来释放一种或多种RCA核酸组分。在一些实施方案中，只有探针的切割是释放一种或多种RCA核酸组分所需要的，其中所述切割可包括切割一个或多个切割域，例如2个、3个、4个、5个或更多个切割域。在一些实施方案中，例如，发夹RCA探针，切割在核酸域的发夹结构中发生(即切割域位于发夹结构中或形成发夹结构的部分)。如上文中所论述的，切割优选为酶促切割。
如上文中所描述的，本发明的一些探针包含至少一个发夹结构。发夹结构还可称为发夹-环或茎-环，这些术语在本文中可互换使用。发夹是可存在于单链DNA或RNA分子中的分子内基碱配对模式。当相同链的两个区(当以相反方向阅读时通常在核苷酸序列上互补)碱基配对形成终止于未配对(即单链)的环中的双螺旋(双链体)时，发夹形成。
在本发明的一些方面，发夹结构不形成探针的末端，即至少一个发夹的双链体在双链体的5'和/或3'末端上侧翼连接有单链区。因此，在一些实施方案中，发夹可在探针的至少一个末端，即双链体的一个末端(3'或5'末端)形成探针的末端。
探针的解折叠还可通过破坏探针的双链组件(部份或域)诸如发夹结构，例如环状RCA探针中的发夹结构的至少部来实现。这可通过改变样品的条件以使发夹结构不再是热动力学上有利的结构(例如通过改变溶液的温度或盐浓度)来实现。在一些实施方案中，通过将探针与靶核酸分子接触来实现解折叠，即靶依赖性解折叠，其中探针与靶之间的相互作用(形成的双链体)比由探针的域形成的分子内双链体稳定，即解折叠可包括置换核酸链。类似地，可通过修饰双链体中的一个或多个核苷酸碱基以破坏使两条链退火的氢键(所谓的沃尔森-克里克碱基配对)来破坏发夹结构。例如，从核苷酸切割碱基可充分破坏双链体，足以"解折叠"发夹。
因此切割和/或解折叠探针导致用于RCA反应的核酸组分的至少一种，特别地至少引物的释放。如上文中所描述的，在切割和/或解折叠探针之前，RCA核酸组分的至少一种，即引物和/或环状或可环化的RCA模板，不能参与或启动第二RCA反应。例如，在解折叠和/或切割之前，RCA核酸组分的至少一种对于滚环扩增反应是不可接近的(例如不可利用的或被阻断的)，即不以可允许RCA进行的形式存在。例如，引物域可以不具有游离3'可延伸末端，例如探针可在引物域的3'末端的3'下游包含与RCA模板不具有互补性的另外的核苷酸。或者引物域可在发夹的茎结构中杂交。此外或可选择地，可不环化RCA模板。因此，一个或多个RCA核酸组分的释放意指探针被解折叠和/或切割以产生所述一种或多种可用于(即可及的)RCA反应的组分。换句话说，探针产生、生成或允许生成一种或多种RCA核酸组分。因此，释放可包括解锁所述一种或多种组分，以便它们可用于启动或参与RCA反应。释放可以是转化或修饰所述探针以生成或产生一种或多种可使RCA反应能够开始(即在合适的聚合酶存在的情况下)的组分。
探针的域可由核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸以及能够参与沃尔森-克里克类型或类似类型的碱基相互作用的合成核苷酸残基。因此，核酸域可以是DNA和/或RNA或其任何修饰，例如PNA或含有非核苷酸骨架的其它衍生物。在一些实施方案中，探针域可包含外切核酸酶阻断区，以便其在以靶为模板的核酸延伸反应中不能用作引物，即不能被聚合酶识别为引物和/或不能被降解以产生能够引发靶核酸分子的延伸的核酸分子。
探针的域的可能长度已在上文中进行了定义，很显然，当探针包含多条核酸链时，每一条链可具有不同的长度，所述长度可在很宽的范围内变化。例如，保护链和/或切割链通常可包含4个-100个核苷酸，例如5个-90个、6个-80个、7个-70个、8个-60个、9个-50个、10个-40个核苷酸，诸如至少12个、15个、18个、20个、25个、30或35个核苷酸，然而RCA模板通常可包含20个-1000个核苷酸，例如26个-1000个、30个-900个、40个-800个、50个-700个、60个-600个、70个-500个、80个-400个、90个-300个、100个-200个核苷酸，诸如至少20个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、120个、150个、200个或250个核苷酸。通常，环状RCA探针的引物链的长度与RCA模板的典型长度范围相似。发夹RCA探针(即提供RCA模板的链)的长度通常包含40个-1500个核苷酸，例如50个-1400个、60个-1300个、70个-1200个、80个-1100个、90个-1000个核苷酸，诸如至少40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、200个、250个或300个核苷酸。当RCA探针包含不止一条核酸链时，探针的长度可根据最长的链例如引物链、环状链、RCA模板链来确定。
如上文中所提及的，为了使探针能够结合靶核酸分子，所述靶分子至少部分是单链的，并且通常是完全单链的。为了允许探针或中间分子的结合，如上文中所提及的，第一RCA产物将通常具有很少的二级结构，并且可使用有利于杂交的条件。在其中探针包含不止一种靶互补域的实施方案中，靶核酸分子可被视为包含每一个互补结合域的探针结合位点。或者，每一个靶互补结合域可被视为与探针结合域的不同部份(区或部分)的结合。在优选实施方案中，探针的靶互补结合域和其靶的探针结合位点共享至少85％的序列同一性，优选90％，例如95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，可有用地在双链体中具有至少一个错配以产生功能性切割识别位点(可切割域)，例如其可被切口酶切割。探针结合位点的长度可与探针的靶互补结合域的长度相同，如上文中所定义的，或可以更长，例如如果多个靶互补结合域结合于探针结合位点的话。
如上文中所描述的，本发明的方法和探针可用于检测任何靶分析物，其中如果靶分析物不是核酸分子，则第一RCA模板(或实际上第一RCA产物)可被视为分析物的标志物。
"分析物"或最终的检测测定靶或目标，可以是期望检测出的任何物质(例如分子)或实体。分析物从而是本发明的检测方法或用途的"靶"。分析物可相应地是可能期望检测出的任何生物分子或化合物，例如肽或蛋白质，或核酸分子或小分子，包括有机和无机分子。分析物可以是细胞或微生物，包括病毒或其片段或其产物。分析物可以是可针对其开发特异性结合伴侣(例如亲和结合伴侣)的任何物质或实体。此类特异性结合伴侣可以是核酸探针(对于核酸分析物而言)，并且可直接导致第一RCA模板(例如锁式探针)的产生。或者，如上文中所论述的，可将特异性结合伴侣偶联于核酸，其可以例如在使用或生成可以是第一RCA模板的环状核酸分子的测定中使用RCA策略来检测。特定目标分析物从而可包括核酸分子诸如DNA(例如基因组DNA、线粒体DNA、质体DNA、病毒DNA等)和RNA(例如mRNA、微小RNA、rRNA、snRNA、病毒RNA等)以及合成和/或经修饰的核酸分子(例如包括包含合成或经修饰核苷酸或由其组成的核酸域，诸如LNA、PNA、吗啉代等)、蛋白质性质分子诸如肽、多肽、蛋白质或朊病毒或包含蛋白质或多肽组分等或其片段的任何分子。分析物可以是单个分子或含有两个或更多个分子亚单位的复合物，例如包括但不限于蛋白质-DNA复合物，其可以或不可以彼此共价结合，并且可以相同或不同。因此除了细胞或微生物以外，此类复合物也可以是蛋白质复合物或蛋白质相互作用。此类复合物或相互作用从而可以是同多聚体或异多聚体。分子例如蛋白质的聚集体也可以是靶分析物，例如相同蛋白质或不同蛋白质的聚集体。分析物还可以是蛋白质或肽与核酸分子诸如DNA或RNA之间的复合物，例如蛋白质与核酸之间，例如调控因子，诸如转录因子与DNA或RNA的相互作用。有利地，当分析物为核酸分子时，可原位检测核酸，即无需从细胞取出或提取核酸。然而，分离和扩增的核酸分子也代表适当的靶分析物。
包括所有生物和临床样品，例如生物体的任何细胞或组织样品，或来源于其的任何体液或制剂，以及样品诸如细胞培养物、细胞制剂、细胞裂解物等。还包括环境样品例如土壤和水样品或食物样品。样品可以是新鲜制备的或它们可以以任何便利的方式进行预处理例如以便贮存。
代表性样品从而包括可含有生物分子或任何其它需要的分析物或靶分析物的任何材料，包括例如食物和关联产品、临床和环境样品。所述样品可以是生物样品，其可含有任何病毒或细胞材料，包括所有原核或真核细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。此类生物材料从而可包含所有类型的哺乳动物和非哺乳动物的细胞、植物细胞、藻类包括蓝绿藻、真菌、细菌、原生动物等。代表性样品从而包括全血和血衍生产品诸如血浆、血清和血沉棕黄层、血细胞、尿、粪便、脑脊液或任何其它体液(例如呼吸道分泌物、唾液、奶等)、组织、活检组织、细胞培养物、细胞悬液、条件培养基或具有细胞培养成分的其它样品等。可以以任何便利的或需要的方式(例如通过细胞裂解或分析物的纯化、分离等)预处理样品，以准备用于本发明的方法和用途。
靶分析物的检测取决于分析物在样品中的存在，所述分析物导致第一RCA产物的产生。随后按照本发明产生第二RCA产物，可检测所述第二RCA产物以检测分析物。如上文中所论述的，第二RCA产物可导致强得多的和/或更快的信号。在一些实施方案中，第一和第二RCA产物可有利地例如使用针对每一种所述产物的单独的经标记的检测探针来检测。从而检测具有更强的信号的第二产物可使得能够例如在低放大倍数下进行检测。在更高的放大倍数下的更精确定位可进一步通过检测第一产物来获得。
因此，在添加适当的聚合酶(和必要时其它酶，例如切割酶和/或连接酶)后，分析物在样品中的存在可通过第二RCA模板的滚环扩增(RCA)，即通过检测第二RCA产物和任选地第一RCA产物来检测。多联体RCA产物提供用于检测分析物的“信号”。所述信号可通过本领域已知的(关于其它实例参见下文)和如US 7,320,860中教导的任何适当方法，例如通过将经标记的探针与报告域序列杂交来检测，所述报告域序列在整个多联体RCA产物中重复。
如上文中所提及的，在某些实施方案中，必须通过切割和/或解折叠来释放探针的RCA核酸组分的至少一种，以使得RCA产物能被产生。因此，在代表性实施方案中，可将检测RCA产物例如扩增RCA产物所需的试剂与探针同时添加至反应中，从而避免对在单独的步骤中添加特定检测试剂的需要。使测定的步骤数目减少至最少可有助于减少进行测定所需的总体时间，即增加测定的效率，并且促成增强的信噪比，即帮助减小非特异性本底。
在一些实施方案中，第二RCA模板(和事实上第一RCA模板)可通过连接反应来环化，即在添加适当的连接酶后。在某些RCA报告探针实施方案中，用于RCA的所有核酸组分由RCA报告探针提供。然而，RCA模板的连接可包括间隙寡核苷酸的使用。因此，在利用环状RCA探针的实施方案中，探针可包含间隙寡核苷酸或间隙链。间隙链可被定义为在可环化的RCA模板的5'与3'末端之间与RCA探针的引物链杂交的寡核苷酸。将RCA模板的每一个末端连接于间隙寡核苷酸的末端以产生环化的RCA模板。将明显的是，可单独地向本发明的探针提供间隙寡核苷酸，即在一些实施方案中，间隙寡核苷酸不是探针的部分。因此，在本发明的方法中，可将间隙寡核苷酸在探针之前、之后或与之同时添加至样品。在一些实施方案中，可添加几种不同的间隙寡核苷酸，其中以不同的浓度添加每一种类型的间隙寡核苷酸。每一种类型的间隙寡核苷酸可在5'和3'末端包含与连接模板域(在可环化的RCA模板的末端之间)互补的共同序列和不同的间插序列，其可用作如上定义的报告分子。所得的RCA产物可包含不同的报告域序列，这取决于哪个间隙寡核苷酸被连接至RCA模板中并且可被单独地检测到。这可用于扩大本文中描述的测定方法的动态范围，如WO2012/049316中描述的。
术语"检测"在本文中被广泛地用于包括确定分析物或分析物的任何测量形式的存在(即其存在还是不存在)的任何方法。因此"检测"可包括以任何方式确定、测量、评估或测定分析物的存在或不存在或量或定位。包括定量和定性测定、测量或评估，包括半定量。此类测定、测量或评估可以是相对的，例如当将检测样品中的两种或更多种不同分析物时，或可以是绝对的。因此，术语"定量"，当在定量样品中的靶分析物的上下文中使用时，可指绝对或相对定量。绝对定量可通过包括已知浓度的一种或多种对照分析物和/或将靶分析物的检测水平与已知对照分析物相对照(例如通过标准曲线的产生)来实现。或者，相对定量可通过比较两种或更多种不同靶分析物之间的检测水平或量(以提供所述两种或更多种不同分析物的每一种的相对量，即彼此相对地)来实现。
可针对探针和其靶核酸分子中的每一个域的序列来选择或挑选探针的各种域(即引物域、连接模板域、RCA模板、结合域等和间插(即连接)序列)的序列。因此，各种域的序列不是至关重要的，只要相互作用以使第二RCA产物能够产生所需的域可在适当的条件下，例如在靶核酸分子(第一RCA产物或中间分子)存在的情况下彼此杂交即可。然而，除探针的发夹结构所需的序列外，应选择域的序列以避免分子内杂交(即相同链的域之间的杂交事件)的发生。例如，引物域不应能够与连接模板域杂交。一旦域的序列被选择或鉴定，就可使用任何便利的方法来合成探针。
如本文中所用，术语"杂交"或"使杂交"是指充分互补以通过沃尔森-克里克碱基配对形成双链体的核苷酸序列之间的双链体的形成。当两个核苷酸序列共享碱基对组织同源性时，这些分了是彼此"互补的"。因此，探针的域中的互补性区是指该域的能够形成分子内或分子间双链体(即相同分子内的双链体(发夹结构)或与探针构建体的不同分子或不同链的双链体)的部分。这些术语还用于指与沃尔森-克里克碱基配对类似的碱基对相互作用，包括Hoogsteen碱基配对(其为还允许第三链缠绕以沃尔森-克里克模式装配的双螺旋以形成三链体的碱基配对的罕见变型)。
可选择被添加至样品的探针的量以在反应混合物中提供充分低的浓度的探针，以使非靶特异性相互作用减小至最小，即以确保探针不随机结合于样品中的非靶分子达到任何大的或显著的程度。例如，在某些实施方案中，期望只有当探针结合其靶核酸分子(即仅在第一RCA产物存在的情况下)时，RCA引物和任选地其它RCA核酸组分才被释放，从而允许产生第二RCA产物。在代表性实施方案中，在与含有第一RCA产物的样品组合后，反应混合物中的每一种探针的浓度范围为约1fM至1μM，诸如约1pM至约1nM，包括约1pM至约100nM，例如1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM。
可将许多不同的探针添加至样品以进行多重测定(例如其中已产生或添加多种不同的第一RCA产物或第一RCA模板的情况下)，以平行检测多种分析物。多重测定可包括检测样品中的数十、数百、数千或甚至数万种分析物。因此，多重测定可包含至少2种不同的探针，即能够与不同的第一RCA产物杂交(直接或间接)，从而例如检测不同分析物的探针。例如，多重测定可利用至少3种、4种、5种、10种、20种、30种、40种或50种探针，诸如100种、200种、500种、1000种、10000种或更多种探针。
在含有第一RCA产物的样品(或反应混合物)和探针组合后，可将反应混合物孵育足以使探针结合于样品中的其靶(第一RCA产物或中间分子)(如果存在的话)的一段时间。如上文中所描述的，在某些实施方案中，一旦探针已结合(直接或间接)于第一RCA产物，探针就可被解折叠和/或切割以释放至少RCA引物和任选地其它RCA核酸组分，并且必要时，可使探针的域能够相互作用，即对于引物而言，与第二RCA模板相互作用以形成用于第二RCA的引物/RCA模板复合物。在其它实施方案中，可只添加引物和第二RCA模板。一旦引物/RCA模板复合物已形成，就使用第二RCA模板作为用于聚合的模板来延伸引物。当在测定中使用超过一个类型的探针时，可单独地切割和/或解折叠每一种不同类型的RCA探针，例如可通过切割解折叠第一探针，并且可通过靶结合来解折叠第二探针。在一些代表性实施方案，例如原位测定或其中将第一RCA产物固定的其它测定中，可在探针的添加与RCA产物的检测之间包括洗涤步骤，例如可将第一RCA产物捕获或固定在固体载体或底物上，可洗涤所述产物以除去未附着于第一RCA产物的未结合的或非特异性结合的探针或RCA产物。在一些实施方案中，可在探针的切割与第二RCA产物的检测之间包括洗涤步骤，例如以除去非直接或间接针对第一RCA产物的探针的切割的域。可选择地或此外，可在已将探针添加至样品并使其结合后，但在解折叠和/或切割步骤之前，包括洗涤步骤。
在代表性实施方案中，可在添加另外的探针之前，预孵育探针和样品，持续范围在5分钟至约24小时内的一段时间。优选地，所述预孵育为在范围为4℃至约50℃例如10℃-40℃或20℃-37℃的温度下进行约20分钟至12小时。应最优化在其下维持反应混合物的条件以促进探针对其靶核酸分子的特异性结合，同时抑制非特异性相互作用。
在预孵育后，如果包括此类步骤的话，则可切割和/或解折叠探针，并且可将所得的混合物在范围为约4℃至约105℃包括约4℃至约80℃，诸如约10℃至约70℃、约15℃至约60℃，通常地约20℃至约37℃的温度下孵育范围为约5分钟至约48小时，包括约30分钟至约12小时的一段时间。在高温度(例如高于约40℃-50℃)下孵育可使用嗜热酶或极端嗜热酶例如连接酶和/或聚合酶。条件应充许RCA核酸组分之间的高效和特异性杂交，如上文中所描述的。
在样品与探针组合后，可添加间隙寡核苷酸(如果使用的话)，随后使其杂交。可选择地或此外，可将一种或多种间隙寡核苷酸与探针一起添加。在一些实施方案中，可将间隙寡核苷酸与探针预杂交。
一般地，能够检测RCA产物的存在的任何便利方案可用于检测第二RCA产物和任选守第一RCA产物。检测方案可以需要或可以不需要分离步骤。
在一些实施方案中，连接模板域稳定可环化的第二RCA模板的末端，通过将反应混合物与例如由合适的核酸连接酶提供的核酸连接活性接触，并在足以使核酸域的连接发生的条件下维持所述混合物来连接所述末端。在其它实施方案中，可在与第一RCA产物杂交后将探针的3'和5'末端连接在一起。在其它实施方案中，当两个探针与第一RCA产物杂交时，可将探针连接于第二探针。
如本领域中已知的，在模板指导的连接中，当两个紧密相邻的核酸与与它们互补的第三核酸序列(即连接模板)退火或杂交时，连接酶催化它们的并置的3'-羟基与5'-磷酸末端之间的磷酸二酯键的形成。可使用任何合适的连接酶，其中代表性目标连接酶包括，但不限于：温度敏感连接酶和耐热连接酶。温度敏感连接酶包括，但不限于，噬菌体T4DNA连接酶、噬菌体T7连接酶和大肠杆菌(E.coli)连接酶。热稳定连接酶包括，但不限于，Taq连接酶、Tth连接酶、和Pfu连接酶。热稳定连接酶可获自嗜热或极端嗜热生物，包括但不限于，原核生物体、真核生物体或古细菌(archael)生物体。某些RNA连接酶也可用于本发明的方法。
可将合适的连接酶和必需的和/或需要的任何试剂与反应混合物组合，并将其在足以使杂交的寡核苷酸的连接(例如经由探针连接模板的第二RCA模板的连接，以靶核酸分子(第一RCA产物或中间分子)为模板的靶互补结合域的一个或多个的连接)发生的条件下维持。连接反应条件对于本领域普通技术人员来说是公知的。在连接过程中，在某些实施方案中，可将反应混合物在范围为约4℃至约105℃、约4℃至约80℃诸如约10℃至约70℃、约15℃至约60℃，通常地诸如约20℃至约37℃的温度下维持范围为约5秒至约16小时，诸如约1分钟至约1小时的时期。在其它实施方案中，将反应混合物在范围为约35℃至约45℃诸如约37℃至约42℃的温度下，例如在或约38℃、39℃、40℃或41℃的温度下维持范围为约5秒至约16小时，诸如约1分钟至约1小时，包括约2分钟至约8小时的时期。在代表性实施方案中，连接反应混合物包含50mM Tris pH7.5、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP、25mg/ml BSA、0.25个单位/ml RNA酶抑制剂和0.125个单位/ml的T4DNA连接酶。在另一个代表性实施方案中，使用2.125mM镁离子、0.2个单位/ml RNA酶抑制剂和0.125个单位/ml DNA连接酶。
将明显的是，连接条件可取决于用于本发明的方法的连接酶。因此，上述连接条件仅仅是代表性实例并且参数可按照公知的方案来改变。例如，可在高于50℃的温度下使用可用于本发明的方法的连接酶即然而，还应理解，一个参数例如温度的改变可能需要其它条件的改变来确保测定的其它步骤(例如探针与靶核酸分子的结合)不被抑制或破坏。RCA测定法的这样操作在本领域中是常规的。
连接(如果需要连接，例如如果探针包含或提供可环化的第二RCA模板或必须连接探针以稳定其与其靶核酸分子的相互作用)后，第二RCA模板(其可以是连接产物)可被检测例如为分析物在样中的存在的指示，或为样品中的分析物的量的测量和任选地定位。
连接步骤后的方法的下一个步骤(如果需要的话)是产生第二RCA产物，即在聚合反应中使用第二RCA模板延伸RCA引物。滚环扩增(RCA)在本领域中是公知的，在Dean等人，2001(Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymeraseand Multiply-Primed Rolling Circle Amplification,Genome Research,11，第1095-1099页)(其公开内容通过引用并入本文)中进行了描述。在代表性第二RCA反应中，环状或环化的第二RCA模板能够与由探针提供的RCA引物相互作用。将RCA引物用于引物延伸反应中，例如在第二RCA模板上延伸RCA引物以产生第二RCA产物，其为单多联体产物。RCA引物将具有充分的长度(如上文中所描述的)，以提供在退火条件(在下文中更详细描述的)下与RCA模板的杂交。
除了上述核酸组分以外，主题方法中产生的反应混合物通常包含聚合酶，例如phi29DNA聚合酶和如下文中所述的进行DNA聚合酶反应所需的其它组分。所需聚合酶活性通常可由一种或多种不同的聚合酶提供。在一些实施方案中，所述聚合酶具有外切核酸酶活性，例如5'和/或3'外切核酸酶活性。
在制备主题方法的该步骤的反应混合物中，可以以任何便利的顺序组合各种组成成分。例如，可同时组合所有各种组成成分以产生反应混合物。
可使用任何便利的方案检测RCA反应(即第二RCA反应，还有任选地第一RCA产物)的扩增产物，其中所使用的特定方案可非特异性或特异性地检测RCA产物，如在下文中更详细地描述的。例如，可直接检测RCA产物，例如可将多联体切割以产生单体，所述单体可使用凝胶电泳，或更优选地通过与经标记的检测寡核苷酸(其与RCA产物中的报告域杂交)杂交来检测。或者，可间接检测RCA产物，例如可通过PCR扩增所述产物，随后可检测所述扩增产物。
代表性目标非特异性检测方案包括使用信号产生系统的方案，所述信号产生系统例如经由嵌入来选择性检测单链DNA产物或双链DNA产物。用于此类实施方案的代表性可检测分子包括荧光核酸染色，诸如菲啶鎓染料，包括其单体或同二聚体或异二聚体，当与核酸复合时其产生增强的荧光。菲啶鎓染料的实例包括乙锭同二聚体，溴化乙锭，碘化丙啶和其他烷基取代的菲啶鎓染料。在本发明的另一个实施方案中，核酸染色是吖啶类染料，或其同二聚体或异二聚体，诸如吖啶橙、吖啶同二聚体、乙锭-吖啶异源二聚体或9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶或掺入所述染料。在本发明的另一个实施方案中，核酸染色是吲哚或咪唑染料，诸如Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580(BIOPROBES 34,Molecular Probes,Inc.Eugene,Oreg.,(2000年5月))、DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)或DIPI(4',6-(二咪唑啉-2-基)-2-苯基吲哚)。其它允许的核酸染色包括，但不限于，7-咪唑啉D、羟芪巴脒、LDS751、选定的补骨脂素(呋喃香豆素)、苯乙烯基染料、金属复合物诸如钌复合物和过渡金属复合物(例如，掺入Tb3+和Eu3+)。在本发明的某些实施方案中，所述核酸染色是当与核酸结合时产生增强的荧光的花青染料或花青染料的同二聚体或异二聚体。可使用在属于Lee(1989)的美国No.4,883,867、属于Yue等人(1996)的美国专利No.5,582,977、属于Yue等人(1994)的美国专利No.5,321,130以及属于Yue等人(1995)的美国专利No.5,410,030(所有4个专利通过引用并入)中描述的任何染料，包括可在商标TOTO、BOBO、POPO、YOYO、TO-PRO、BO-PRO、PO-PRO和YO-PRO下从Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg商购获得的核酸染料。可使用在属于Haugland等人(1995)的美国专利No.5,436,134、属于Yue等人(1997)的美国专利No.5,658,751和属于Haugland等人(1999)的美国专利No.5,863,753(所有3个专利通过引用并入)中描述的任何染料，包括可在商标SYBR Green、EvaGreen、SYTO、SYTOX、PICOGREEN、OLIGREEN和RIBOGREEN下从Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg商购获得的核酸染料。在本发明的其它实施方案中，所述核酸染料是掺入氮杂-或polyazabenzazolium杂环诸如氮杂苯并噁唑、氮杂苯并咪唑或氮杂苯并噻唑的单体、同二聚体或异二聚体花青染料，当与核酸结合时其产生增强的荧光，包括可在商标SYTO、SYTOX、JOJO、JO-PRO、LOLO、LO-PRO下从Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg商购获得的核酸染料。
在其它实施方案中，与对于一般的核酸分子相反，对于RCA产物是特异性的信号产生系统可被用于检测扩增。在这些实施方案中，信号产生系统可包括特异性结合于在RCA产物中发现的序列(即报告域序列)的探针核酸或寡核苷酸，其中可用可直接或间接检测的标记物来标记探针核酸/寡核苷酸。可直接检测的标记物是可直接检测而无需使用额外试剂的标记物，而可间接检测的标记物是可通过使用一种或多种额外的试剂来检测的标记物，例如当标记物是由两种或更多种组分组成的信号产生系统的成员时。在许多实施方案中，所述标记物是可直接检测的标记物，其中可直接检测的目标标记物包括，但不限于：荧光标记物、放射性同位素标记物、化学发光标记物等。在许多实施方案中，所述标记物是荧光标记物，其中在此类实施方案中使用的标记试剂为荧光标记的核苷酸，例如荧光标记的CTP(诸如Cy3-CTP、Cy5-CTP)等。可用于标记核苷酸以产生经标记的探针核酸(即检测探针)的荧光部分包括，但不限于：荧光素、花青染料诸如Cy3、Cy5、Alexa 555、Bodipy 630/650等。还可使用其它标记物，诸如上述那些标记物，这在本领域中是已知的。
在某些实施方案中，用“能量转移”标记物标记特殊标记的探针核酸(检测探针)。如本文中所用，"能量转移"是指籍以利用荧光修饰基团改变荧光基团的荧光发射的方法。能量转移标记在本领域中是公知的，此类经标记的寡核苷酸探针包括型探针，如美国专利No.6,248,526(其公开内容通过引用并入本文)(以及Held等人，Genome Res.(1996)6:986-994；Holland等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA(1991)88:7276-7280；和Lee等人，Nuc.Acids Res.(1993)21:3761-3766)中描述的。检测探针的其它实例包括：蝎型探针(如在Whitcombe等人，Nature Biotechnology(1999)17:804-807；美国专利No.6,326,145(其公开内容通过引用并入本文)中描述的)、日出探针(如Nazarenko等人，Nuc.Acids Res.(1997)25:2516-2521；美国专利No.6,117,635，其公开内容通过引用并入本文中描述的)、分子信标(Tyagi等人，Nature Biotechnology(1996)14:303-308；美国专利No.5,989,823，其公开内容通过引用并入本文)和构象辅助探针(如在临时申请系列no.60/138,376(其公开内容通过引用并入本文)中描述的)。
因此，确定第二和任选的第一RCA产物的存在可使用任何方便的方案来实现。可筛选(即，测定、评估、评价、测试等)反应混合物的任何所得的第二和任选地第一RCA产物的存在，以检测靶分析物在待测定的样品中的存在。取决于所需灵敏度和其中正在实践所述方法的应用，具体检测方案可变化。
可以以许多不同的方式检测RCA产物。例如，掺入RCA产物的核苷酸可被直接标记，例如被荧光标记地或另外地被可通过分光光度计检测的方式标记或被放射性同位素标记，或用任何发信号的标记物标记，以便RCA产物被直接标记。在一些实施方案中，如上文中论述的检测探针，例如荧光标记的探针、分子信标(如上文中所述的)等可被用于检测RCA产物的存在，其中这些探针针对在RCA多联体中重复，从而只以其整体存在于RCA产物中的序列(报告域序列，即与RCA模板中的报告域序列相同的序列)。
在主题方法的该检测步骤中制备的反应混合物还可包含含水缓冲介质，所述缓冲介质包含单价离子源、二价阳离子源和缓冲剂。可使用任何便利的单价离子源，诸如KCl、醋酸钾、醋酸铵、谷氨酸钾、NH4Cl、硫酸铵等。二价阳离子可以是镁、锰、锌等，其中所述阳离子通常为镁。可使用任何便利的镁阳离子源，包括MgCl2、醋酸镁等。存在于缓冲液中的Mg2+的量可在0.5至10mM的范围内，尽管可使用更高或更低的量，所述量可取决于反应的类型。例如，对于PCR，存在于缓冲液中的Mg2+的量可为约1.5mM，然而对于RCA，存在于缓冲液中的Mg2 +的量可以为10mM。可存在于缓冲液中的代表性缓冲剂或盐包括Tris、Tricine、HEPES、MOPS等，其中缓冲剂的量通常在约5至150mM，通常约10至100mM，和更常见地约20至50mM的范围内，其中在某些优选实施方案中，缓冲剂以足以提供范围为约6.0至9.5的pH(其中最优选为72℃，pH 7.3)的量存在。可存在于缓冲介质中的其它试剂包括螯合剂诸如EDTA、EGTA等。
主题方法中的下一步骤是从经标记的目标RCA产物检测信号，其中信号检测可取决于所使用的具体信号产生系统而变化。在某些实施方案中，在主题测定中仅测定和使用可检测信号例如荧光的存在或不存在，例如以测定或鉴定第二(和任选地第一)RCA产物(并从而靶分析物)的存在或不存在。取决于所使用的具体标记物，信号的检测可指示第二(或第一)RCA产物的存在或不存在。
在其中信号产生系统是荧光信号产生系统的实施方案中，信号检测通常包括检测来自反应混合物的荧光信号的变化以获得测定结果。换句话说，评估由反应混合物产生的荧光信号的任何调节。所述变化可以是荧光的增强或减弱(这取决于所使用的标记物的性质)，但在某些实施方案中，为荧光的增强。可使用任何便利的装置例如合适的荧光计诸如热稳定性比色杯或板读数荧光计来筛选样品的荧光的增强，或例如当样品为在显微镜载玻片上的组织样品时，可使用荧光显微镜来检测荧光。使用已知的荧光计适当地监控荧光。将来自这些设备的信号(例如以光电倍增电压的形式存在的)传送至数据处理器板并被转化成与每一个样品管相关的光谱。可同时评估多个管例如96管。因此，在一些实施方案中，可平行检测多种分析物，然而在其它实施方案中，可相继地(例如一次一种分析物或一次一组分析物)检测多种分析物。
当检测方案是实时方案(例如，如在实时PCR反应方案中使用的)时，可以以此方式：在整个反应过程中以频繁的时间间隔，例如每3分钟一次收集数据。通过监控每一个循环过程中来自样品的反应性分子的荧光，可以以各种方式监控扩增反应的进展。例如，可以例如通过计算熔融峰下面积来分析由熔融峰提供的数据，并将这些数据针对循环数作图。
可以例如使用预先选择的荧光部分诸如染料的“拟合”来解析以该方式产生的光谱，以形成代表每一种发信号部分(即荧光基团)的峰。可测定代表每一个信号的强度值的峰下面积，并且如果需要的话，表达为彼此的商。信号强度和/或比率的差异将允许在整个反应过程中或在不同的反应条件(诸如温度)下记录经经标记的探针的变化。所述变化与寡核苷酸探针与靶序列之间的结合现象或结合于靶序列的寡核苷酸探针的降解相关。差异峰下面积的积分将使标记作用的强度值能够被计算。
取决于样品是在引物延伸反应结束时被筛选一次还是例如在每一轮扩增反应后被筛选多次(例如如在实时PCR监控中所进行的一样)，筛选混合物的荧光的变化提供了一个或多个测定结果。
可以以各种方式解释如上文中所述产生的数据。在其最简单形式中，在扩增反应的过程中或结束时来自样品的荧光的增强或减弱表示存在于样品中的靶分析物的量的增加，例如由于与在反应混合物中检测到的RCA产物的量相关，从而表明此类事实，即扩增反应已进行，并从而靶分析物实际上存在于初始样品中。定量也可能是通过在整个扩增过程中监控扩增反应。定量还可包括测定反应混合物中的一种或多种核酸对照，如上文中所述的。
这样，可容易地筛选(或评估或测定等)反应混合物的RCA产物，并从而靶分析物例如核酸分析物的存在。所述方法适合用于检测单种靶分析物以及多重分析(其中测定样品中的两种或更多种不同的靶分析物)。在后面的这些多重情况下，可使用的探针的不同组的数目通常在约2至约20或更高，例如最多至100或更高，1000或更高等的范围内，其中可平行或相继地检测样品中的多种分析物。
使用几种不同探针(多路技术(multiplexing))在单个反应中同时进行的许多分析物的分析可因提高的灵敏度而得以增强，并且在某些实施方案中，也因提高的特异度而增强，这可使用本发明的方法和探针来获得。每一个探针组可被设计来产生可用于确定最终被探针询查的分析物的存在或不存在、量和/或定位的RCA产物。可使用已知来自文献的用于分析核酸分子的任何已良好建立的方法(包括液相色谱、电泳、质谱、显微镜检查、实时PCR、荧光探针、微阵列、比色分析诸如ELISA、流式细胞术、质谱(CyTOF)等)来检测RCA产物。
本发明的探针和方法可如上文中所述于均相中(即溶液中)使用，或可选择地通过使用固相来在非均相中使用，例如其中第一RCA产物被固定在固相上，从而允许使用洗涤步骤。这可由靶分析物的固定导致，例如在原位检测法中。固相测定的使用提供了有利方面，特别地对于困难样品的检测：洗涤步骤可帮助除去未结合的和/或未连接的探针等抑制组分，以及可从不期望地大的样品体积富集分析物。可使用更高的浓度和更大量的探针，因为未结合的分析物、探针和RCA产物可通过洗涤除去。
可以以各种方式实现第一RCA产物和/或分析物在固相上的固定。因此，设想了几个固相测定的实施方案。在一个此类实施方案中，分析物首先可被固定的(或可固定的)捕捉探针捕获，可产生第一RCA产物以使其附着于所述分析物，例如依靠用于第一RCA产物的引物附着于分析物(例如通过偶联于分析物的结合伴侣)，随后第一RCA产物可被随后添加的包含或提供用于第二RCA的引物的探针结合。或者，可简单地将第一RCA产物固定于固体载体。例如，可为第一RCA产物的引物提供可固定基团或部分或装置以便固定，或可在第一RCA之前固定所述引物。
可以以许多便利的方式将固定的捕捉探针或第一RCA引物或第一RCA产物固定，即结合于载体。因此可根据选择从许多固定装置和固体载体(如在本领域中众所周知的和文献中描述的)挑选固定的方式或装置以及固体载体。因此，捕捉探针或第一RCA引物或第一RCA产物可被直接结合于载体(例如通过化学交联)，其可通过交联基团，或通过中间结合基团(例如通过生物素-链霉抗生物素相互作用)间接结合。因此，可为捕捉探针或第一RCA引物或第一RCA产物提供在载体上提供的用于固定的装置(例如亲和结合伴侣，例如生物素或半抗原或核酸分子，其能够结合于其伴侣，即同源结合伴侣，例如链霉抗生物素蛋白或抗体或核酸分子)。可在结合于分析物之前或之后固定捕捉探针。此外，可将此类"可固定的"捕捉探针与同载体一起的样品接触。类似地，可在第一RCA等之前或之后固定第一RCA引物。
捕捉探针可以例如是能够特异性结合于靶分析物的抗体或核酸分子。换句话说，捕捉探针可以是固定的(或可固定的)包含分析物结合域的分析物特异性探针(即分析物捕捉探针)。因此在此类实施方案中，首先利用固定的或可固定的捕捉探针捕获分析物，所述探针仅用于将分析物固定在固相上，随后将固定的分析物经历使用第一RCA模板或导致第一RCA模板产生的检测方案，其中用于第一RCA的引物附着于分析物。在此类实施方案中，所述捕捉探针可以是能够直接或间接结合分析物的任何结合伴侣。更具体地，此类捕捉探针特异性结合分析物。
固体载体可以是目前被广泛使用的或被提出用于固定、分离等的任何公知的载体或基质。这些载体可采用颗粒(例如可以是磁性或非磁性的珠粒)、薄片、凝胶、滤纸、膜、纤维、毛细管或微量滴定条、管、平板或孔等的形式。
所述载体可以由玻璃、硅石、胶乳或聚合物材料制成。呈现高的表面积的用于结合分析物的材料是合适的。此类载体可具有不规则表面，并且可以是例如多孔的或颗粒性的，例如颗粒、纤维、网、烧结体或筛子。颗粒材料例如珠粒因它们的更大的结合能力而为有用的，特别是聚合物珠粒。
便利地，根据本发明使用的颗粒固体载体将包括球形珠粒。珠粒的尺寸不是至关重要，但是它们可以例如具有至少1μm，优选至少2μm的直径的量级，并且具有优选不超过10μm，例如不超过6μm的最大直径。
单分散颗粒，即在尺寸上基本上均一(具有小于5％的直径标准差的尺寸)的那些单分散颗粒，具有它们提供非常均一的反应再现性的有利方面。代表单分散聚合物颗粒可通过在US-A-4336173中描述的技术来产生。
然而，为了帮助操作和分离，磁性珠粒是有利的。如本文中所用，术语“有磁性的”是指当被置于磁场中时所述载体能够赋予其磁矩，即顺磁的，并因此在该场的作用下是可移动的。换句话说，包含磁性颗粒的载体可通过磁性聚集而被容易地移取，这提供了快速、简单和高效的在分析物结合步骤后分离颗粒的方式。
在其它实施方案中，分析物本身可以例如通过非特异性吸附而被固定(或可固定的)在固相上。在一个具体的此类实施方案中，分析物可存在于附着(能够附着)于固体载体的细胞(任选地被固定和/或透化)内，例如可将包含分析物的组织样品固定在显微镜载玻片上。
上述方法通常导致存在于反应混合物中的靶依赖性第一RCA产物(即只在靶分析物的存在的情况下才产生的第一RCA产物)的检测。这导致第二RCA产物的产生，这反过来提供了存在于待测定的样品中的靶分析物的量的测量。该测量可以是定性的或定量的。
因此，用于检测一种或多种靶分析物在复杂样品中的存在的上述探针和方法用于多种不同的应用。
主题探针和方法可用于筛选样品的一种或多种靶分析物在样品中的存在或不存在。如上文中所指示的，本发明提供了用于检测一种或多种靶分析物在样品中的存在或定量所述靶分析物的量的探针和方法。
主题探针和方法可用于检测一种或多种靶分析物在多种不同类型的样品(包括具有大量非靶实体的复杂样品)中的存在。所述主题方法对于检测样品或复杂样品中的一种或多种靶分析物是高度灵敏的。
根据上文中的描述和下文中描述的代表性实例，很明显，本发明的方法和探针具有优于现有方法的有利方面。值得注意的是，所述方法允许来自第一RCA产物的信号的信号放大(从而提高方法的灵敏度)以及也如上文中所指出的，更快的信号产生。提高的灵敏度可允许仅以低的量存在的分析物被检测到。基本上，所述方法允许从RCA反应产生增强的信号。更大更显著的反应产物被形成，其可被更迅速和更容易地检测到。来自第二RCA产物的放大的信号被局限于第一RCA产物。这可允许分析物的高度灵敏的局部检测，例如原位检测。
因此在根据本发明的方法中，可以以高度特异性的方式产生第一RCA产物，即第一RCA产物，或事实上第一RCA模板的产生可严格取决于分析物的存在(例如在锁式探针或使用接近式探针的测定的情况下，所述探针必须结合并相互作用以产生环状RCA模板)。第二RCA取决于第一RCA产物(如在上文中论述的)的存在是有利的，但对该第二RCA步骤的特异性的要求不太严格(事件上其可以是远不严格)并且第二RCA产物的一定程度的本底产生可被耐受，因为在第一RCA产物不存的情况下，这将远低于其存在的情况(根据信号强度和尺寸)。在第一RCA产物存在的情况下，即当sRCA反应发生时，产生非常强的信号放大。这在下列实施例中获得了证明。
然而不希望受理论束缚，据信两代或更多代RCA产物，当附着在一起并且被标记(例如利用例如针对第二RCA产物的检测探针)时，将作为单个颗粒一起在液体中游动。这可打开使用其它检测方式例如流式细胞术或CyTOF来检测第二RCA产物(或所述方法的sRCA产物)的可能性，从而拓宽了可用于RCA基测定中的检测的仪器基础。
由第二RCA反应提供的强信号放大可使信号能够被迅速和容易地可视化(例如通过在低放大倍数下的显微镜观察或在数字扫描图像上)，并从而可允许在临床情形中对测定结果进行快速容易地目测观察，例如用于常规用途的病理结果的观察。因此本发明的方法特别适合于临床分析方法。
如上文中所指出的，可检测第一和第二RCA产物，从而使得第二产物能够在例如低放大倍数下被容易地检测到，同时通过使用对于第一RCA产物是特异性的检测探针，保存第一RCA产物的更精确定位。
这可以例如有助于鉴定人组织中的稀有的完整病毒基因组拷贝或另外地检测稀有的RCA产物，诸如在组织的无效突变检测时。当稀有事件的容易鉴定可以有帮助时的另一个实例是当在绝大多数非CTC细胞当中筛选循环肿瘤细胞(CTC)的存在时。sRCA反应的强信号使得能在低放大倍数下快速且容易地鉴定事件(CTC的检测)，并且在更高放大倍数下可视化的第一RCA产物的更精确定位允许确认信号源于CTC而不是源于相邻的非CTC细胞。
可通过在第一RCA继续进行的同时启动第二RCA来实现的更快的信号放大也在上文中进行了论述。因此，所述方法使得RCA依赖性检测测定能够被加速，这在医疗点场所诸如医生的办公室等中可具有价值。通过在sRCA法中进行进一轮或进一代RCA，速度和/或信号强度的进一步增加是可能的。
信号强度/速度的增加可使得其它检测方法能够超过常规基于荧光的方法，例如使用浊度计计数、磁性计数、颗粒计数、电传感、表面传感以及基于重量的检测技术。例如在1小时的扩增后来自第二代RCA的一种单独的sRCA产物具有数飞克的潜在重量。此类重量增加可通过本领域中已知的方法和装置诸如悬臂、表面等离子体方法和微量天平例如石英晶体微量天平等来检测。
由于本发明的方法产生增强的被局限于第一RCA的产物的信号，因此其还赋予使用标准流式细胞术或被分配在平面等上以进行高精度数字检测来计数由个别核酸环(第一RCA模板)触发的个别反应产物(第二RCA产物)的能力。因此，所述方法可允许与数字PCR等同的反应，但无需乳剂或微加工结构，或找到其中每区室存在正好1个模板的条件。
从本发明的方法衍生的大量扩增产物将进一步允许个别DNA环的克隆，因为获自个别环(例如第一RCA模板)的产物可以被可视化。个别sRCA产物从而可被鉴定和分离。例如，借助于本发明的扩增方法，可在用于分离的低熔点琼脂糖中实现可视化而无需放大，随后可分离产物，例如用牙签挑出，类似细菌菌落的分离。
本发明的sRCA法提供鉴定和计数甚至非常稀有的突变的潜能，包括当使用相对易错突变检测方法时。因此，第一RCA产物可使用含有突变的分析物靶核酸环作为第一RCA模板来产生，并且突变序列在第一RCA产物中的反复出现可通过使用用于第二RCA的等位基因特异性(例如突变特异性)探针(即识别存在于第一RCA产物的单体重复中的突变序列的探针)来检测。
稀有突变的检测对于临床诊断是非常重要的。例如，某些基因的突变(例如KRAS突变)在诊断上可以是非常重要的，并且可用于鉴定对特定疗法(例如抗-EGFR疗法)的获得性抗性的出现。近年来许多努力已集中在开发用于检测这类突变的方法上。本发明的方法可为这类方法提供有用的添加。
使用本发明的sRCA反应检测稀有突变的方法的实例可包括从靶细胞分离DNA，片段化DNA，使用被设计来具有两个靶特异性末端(所述末端特异性结合目标靶区并且使得靶片段能被环化)的"选择者"探针分离可含有目标靶序列(例如突变)的片段，和使用环化的靶片段作为第一RCA模板进行第一RCA反应。可将所产生的第一RCA产物经历本发明的sRCA法。有利地，可将RCA报告探针(特别地以靶为模板的连接依赖性RCA报告探针，其连接以第一RCA产物为模板来进行)用于产生第二RCA产物。用于第二RCA的探针可被设计来识别(例如结合，和/或被连接)期望被检测到的突变序列。因此，通过分离靶序列来产生第一RCA模板，提供了产生包含多个(互补)拷贝的靶序列的第一RCA产物的机会。因此，可在多联体第一RCA产物中产生增加的数目的“靶”。这些靶中的每一个靶可被探针(所述探针可被设计来对于期望被检测出的突变是特异性的)结合，以启动第二RCA反应，随后可检测第二RCA产物以检测所述突变。
附图说明
本发明将参考下列非限定性实施例和参考下列附图来进一步描述，其中：
图1描绘如实施例1中例举的根据本发明的固相sRCA反应。如下连续产生第二代RCA产物：使用固定的引物从第一RCA模板循环产生第一RCA产物。使包含用于第二RCA的引物的探针和第二环状RCA模板一起与第一RCA产物杂交，可将所述第二环状RCA模板与所述探针预杂交。随后通过杂交的引物引发，启动第二RCA反应以产生与第一RCA产物杂交的第二RCA产物。
图2描绘了根据本发明的均相sRCA反应，其中如下同时产生第二RCA产物：将包含用于第二RCA反应的引物的探针和第二RCA环状模板与从第一RCA模板产生的第一RCA产物接触。所述探针以发夹(所述发夹的双链体包含用于第一RCA产物的结合域和包含与第二RCA模板互补的域的引物域)形式存在。在探针与第一RCA产物结合后，发夹被打开，并且RCA模板结合于引物域，从而使得第二RCA反应能被引发。
图3描绘固相sRCA反应，其中使用两种单独地提供的探针连续产生第二RCA产物，所述探针与第一RCA产物杂交并且以第一RCA产物作为模板来连接两个添加的寡核苷酸以形成环状第二RCA模板。探针之一包含能够在已通过连接形成第二RCA模板后引发第二RCA反应的引物域。两个探针的连接稳定它们与第一RCA产物的杂交，从而稳定对第一RCA产物的附着。
图4显示环状RCA探针，其中探针对靶核酸分子的结合形成切割识别位点(A)，其被切割(B)以释放用于延伸(C)的引物。
图5显示结合于核酸分子(例如第一RCA产物)的两部分发夹RCA探针。A和A'以及B和B'代表互补序列，其中包含A和B的域用作连接模板，以通过在探针被切割后与A'和B'杂交来用于环化RCA模板。C代表切割域。
图6显示两部分发夹RCA探针的3个变体。探针1和2需要以靶为模板的连接来使RCA组分能够在它们通过切而割释放后保持接近。探针3可参与以靶为模板的连接，但这不是必需的。A和A'以及B和B'代表互补序列，其中包含A和B的域用作连接模板，以通过在探针被切割后与A'和B'杂交来用于环化RCA模板。C代表切割域。
图7显示包含保护链的环状RCA探针。当探针结合于其靶核酸分子时，所述保护链被置换。
图8显示环状RCA探针，其中RCA模板用作保护链。当探针结合于其靶核酸分子时，RCA模板保护链被置换至第二RCA模板互补域。
图9显示包含切割链的环状RCA探针。当探针结合于其靶核酸分子时，切割识别位点形成，所述切割识别位点允许由切割链形成的切割域被切割。切割释放RCA引物。
图10显示如图9中描述的环状RCA探针，其中所述切割域由发夹结构形成。
图11显示环状RCA探针的2个变体。左边的探针通过结合于靶核酸分子被解折叠，随后被切割。右边的探针不需要靶相互作用来使切割发生。探针被描绘为与第一RCA产物杂交。
图12显示环状RCA探针，其中所述引物链也是环状寡核苷酸。
图13显示包含侵入链的环状RCA探针。当探针结合于其靶核酸分子时，侵入链被从探针置换出来以释放RCA引物。
图14显示包含两条切割链的三部分RCA发夹探针，其中ab为引物域，发夹中标记有A的域与双链体中标记有A的域互补，与茎环结构直接相邻的标记有B的域与双链体中标记有B的域互补。ab与B之间以及在AB双链体右边的域是切割域。
图15显示结合于核酸分子(第一RCA产物)的两部分发夹RCA探针，其中标记有A和B的域互补并且C代表切割域。
图16显示结合于核酸分子(第一RCA产物)的三部分发夹RCA探针，其中标记有A、B和ab的域互补并且C代表切割域。
图17显示(A)-(E)中的多种两部分探针，其中下列域是互补的：P1和P1'；P2和P2'；N1和N1'；以及C和C'。R1和R2用于标记靶结合域。C代表切割域。
图18显示结合于核酸分子的四部分(A)和五部分(B)发夹RCA探针，其中标记有A1、A2、B1、B2和ab的域是互补的。(C)显示由固定的靶核酸分子的检测产生的双重标记的串滴。
图19显示其中当探针结合于靶核酸分子以形成茎环结构时形成切割域的环状RCA探针。标记有P2的域代表互补序列。
图20显示使用图1中显示的sRCA反应方案进行的实施例1中描述的实验的结果。当第二RCA启动探针结合于第一RCA产物时，通过启动第二RCA产生超级RCA产物。(A)仅第一轮RCA在固体载体上产生。(B)基于第一轮RCA产生，在第二RCA启动探针与第一RCA产物杂交后产生第二轮RCA。(C)在第一RCA产物不存在的情况下，可看到少量第二RCA产物，这表明用于第二RCA的启动探针可自身产生少量第二RCA产物。用相同荧光基团标记图(A)、(B)和(C)中的RCA产物，利用相同的曝光时间(150ms)拍摄照片。(D)只显示从第一轮RCA产生的信号。(曝光时间：1000ms)。(E)只显示从第二轮RCA产生的信号。(曝光时间：33ms)。(F)代表(D)和(E)的合并后图像。图(F)显示第一RCA产物与第二RCA产物之间的共局限。
图21显示使用环状RCA探针检测初始RCA产物，其中(A)显示在初始RCA产物不存在的情况下无第二RCA产物产生，以及(B)显示初始和第二RCA产物共局限。
图22显示在具有链置换活性的聚合酶存在或不存在的情况下从检测寡核苷酸与RCA产物的杂交产生的信号。描绘了与RCA产物杂交的检测寡核苷酸，其中所述标记以星号标示，具有游离3'末端的寡核苷酸以箭头标示，利用3个2'-O-甲基化的RNA碱基阻断的寡核苷酸以点标示。
图23显示使用锁式探针(A)或两部分发夹RCA探针(B)的第二RCA反应。
图24显示使用连续三部分探针或包含切割链的三部分探针的核酸检测测定的比较结果的直方图。
图25显示(A)两部分发夹切割链探针在通过生物素/链霉抗生物素相互作用固定于底物的核酸分子的检测中的信噪比的图，和(B)使用连续两部分探针或包含切割链的两部分探针的核酸检测测定的比较结果的直方图。
具体实施方式
实施例
实施例1–固相sRCA反应
使用图1中描绘的探针例证sRCA原理。
探针的产生
在溶液中单独地预先连接第一和第二RCA模板以形成RCA"探针"(引物/模板复合物)。将300nM RCA模板、100nM RCA引物与连接缓冲液(1X T4连接酶缓冲液，1mM ATP和0.05U/μL T4连接酶)混合，在37℃进行30分钟。
第一RCA探针的固定
在1XPBS中制备第一RCA探针的100fM稀释物。将50μL的100fM稀释物施用于链霉抗生物素蛋白涂覆的载玻片(Codelink)，在室温进行30分钟。在孵育后，用洗涤缓冲液(1XPBS,0.05％Tween 20)洗涤载玻片2次。
第一RCA产物的产生
在除去洗涤缓冲液后，将RCA混合物(1X phi29缓冲液(Fermentas),250μM dNTP,0.02U/μL phi29聚合酶(Fermentas))添加至载玻片上，并在37℃孵育30分钟。孵育后，用洗涤缓冲液(1XPBS,0.05％Tween 20)洗涤载玻片。
第二RCA探针杂交
将第二RCA探针在1X杂交缓冲液(Olink)中稀释至1nM。将50μL的1nM第二RCA探针施用于载玻片，于37℃进行30分钟。孵育后，用洗涤缓冲液(1XPBS,0.05％Tween 20)洗涤载玻片2次。
第二RCA产物的产生
在除去洗涤缓冲液后，将RCA混合物(1X phi29缓冲液(Fermentas),250μM dNTP,0.02U/μL phi29聚合酶(Fermentas))添加至载玻片，在37℃孵育30分钟。在孵育后，用洗涤缓冲液(1XPBS,0.05％Tween 20)洗涤载玻片2次。
检测寡核苷酸的杂交
分别用FITC和Cy3标记具有与第一RCA产物和第二RCA产物互补的特定序列的寡核苷酸。将两种检测寡核苷酸在杂交缓冲液(2X SSC,20％Formamide)中稀释至100nM。将稀释的寡核苷酸施用于载玻片，在37℃孵育30分钟。孵育后，用洗涤缓冲液(1XPBS,0.05％Tween20)洗涤载玻片2次。RCA探针的图像示于图20中。
实施例2-用于检测RCA产物的环状RCA探针
本实施例证明环状RCA探针在超级RCA(sRCA)反应中的效用，如图11的解折叠RCA报告探针实施方案中所描绘的。
使用phi29聚合酶在37℃通过RCA扩增预先连接的锁，进行1小时。随后掺入环状RCA探针，并且使反应在37℃继续进行1小时，随后在65℃进行10分钟以灭活phi29聚合酶。随后将分别靶向初始和第二RCA产物的Cy-3或FITC-标记的寡核苷酸添加至sRCA反应，使其在55℃杂交20分钟。使sRCA产物粘附于多聚-L赖氨酸涂覆的载玻片，随后利用20X物镜通过表面荧光显微镜检查使其可视化，曝光时间为1500ms。
图21A显示在初始RCA产物不存在的情况下不产生第二RCA产物。图21B显示初始与第二RCA产物共定位。
实施例3–封闭探针的3'末端以避免以靶为模板的延伸和随后探针从第一(初始) RCA产物的置换的重要性
在实验之前，用secure-Seal 8(Grace Bio-labs)将链霉抗生物素涂覆的载玻片(SurModics)区室化。在每一个反应小室中，将50μl的1pM合成生物素化DNA模板在1x PBS中于37℃孵育60分钟。孵育后，用封闭缓冲液(0.1％BSA(Sigma),100nM山羊IgG(Sigma),1mM生物素(Sigma),10ng/μl鲑精DNA(Sigma),5mM EDTA,1x PBS和0.05％Tween 20)在37℃封闭载玻片，进行60分钟。在新的混合物的每一次添加之前进行洗涤步骤(利用2个重复的50μl 1×PBS 0.05％Tween20)以除去先前的孵育试剂。
将50μl连接混合物(1x NEB4缓冲液(NEB),0.5μg/μl BSA(NEB),15个单位的T4DNA连接酶(Fermentas)和0.5mM ATP(Fermentas))和100nM的锁式探针添加至反应小室。在37℃孵育连接反应30分钟，随后洗涤，添加50μl滚环扩增(RCA)混合物(1x phi29缓冲液(Fermentas),0.2μg/μl纯化的BSA(NEB),0.25mM dNTP(Fermentas),25个单位的phi29(Fermentas))。在37℃进行RCA反应，持续60分钟。
将50μl含有100nM的20％甲酰胺(Sigma)和2x SSC(300mM NaCl,30mM柠檬酸钠)中的检测寡核苷酸的检测混合物添加在每一个小室中。在37℃孵育30分钟。本实验中使用的标记有Alex555(在图22中以星号标示的)的检测寡核苷酸在它们的结合序列中与RCA产物相同，但在它们的3’末端不同，它们的末端是游离的(图22中以箭头标示的)或用3个2'-O-甲基化RNA碱基封闭的(图22中以点标示的)。用两种检测寡核苷酸之一(图22A和C)或两种检测寡核苷酸(以1:1的比率)(图22B)标记RCA产物。以一式两份进行标记反应。
在检测寡核苷酸杂交后，洗涤小室。在重复小室(图24标记有-phi的列)的一个小室中添加50μl的1XPBS,0.05％Tween20，然而在其它重复小室(图22标记有phi+的列)中添加50μl的phi29混合物(1x phi29缓冲液(Fermentas),0.2μg/μl纯化的BSA(NEB),0.25mMdNTP(Fermentas),25个单位的phi29(Fermentas))。在37℃孵育60分钟。随后，洗涤、干燥载玻片，用VectaShield(Immunkemi)和盖玻片封装载玻片，随后对其进行成像。
图22显示当使以靶为模板的延伸发生时，与RCA产物杂交的核酸分子被置换。在本实施例中，检测寡核苷酸被置换，但原理可适用于检测探针，例如保持对靶核酸分子的附着所需的RCA报告分子。
实施例4–使用锁式探针与使用RCA报告分子(sRCA)的第二RCA的比较
通过实施例3中描述的方案在载玻片上产生初始RCA产物。将50μl的连接混合物(1x NEB4缓冲液(NEB),0.5μg/μl BSA(NEB),15个单位的T4DNA连接酶(Fermentas)和0.5mMATP(Fermentas))和100nM的锁式探针或20nM的靶连接依赖性两部分发夹探针(包含切割链，例如如图6中显示的)添加至反应小室。在37℃孵育连接反应，进行60分钟。洗涤后，添加50μl的3’末端终止混合物(1X末端转移酶缓冲液(NEB),0.25mM CoCl2 100nM dUTP,10个单位的末端转移酶)，在每一个反应小室中于37℃孵育30分钟。洗涤后，将50μl UNG混合物(1xNEB4缓冲液,0.5μg/μl BSA,5个单位的UNG)添加至小室，将其在37℃孵育30分钟。随后将50μl 1XPBS,0.05％Tween20添加至施加有锁式探针的小室(图23A)，然而在施加有两部分探针的小室中进行解折叠和切割反应(图23B)：首先，向每一个孔中添加50μl的解折叠和切割混合物(1x NEB4缓冲液(New England Biolabs(NEB),0.5μg/μl BSA(NEB),50个单位的NbBtsI(NEB),50个单位的MlyI(NEB))和500pmol的另外的切割链。在于37℃孵育60分钟，随后洗涤后，添加50μl的另外的切割混合物(1x NEB4缓冲液(NEB),0.5μg/μl BSA(NEB)和5个单位的UNG(Fermentas)以除去切割链。将反应在37℃孵育30分钟。洗涤后，向反应小室中添加50μl的连接混合物(1x NEB4缓冲液(NEB),0.5μg/μl BSA(NEB),15个单位的T4 DNA连接酶(Fermentas)和0.5mM ATP(Fermentas))。将连接反应在37℃孵育30分钟。最后，通过添加50μl的滚环扩增(RCA)混合物(1x phi29缓冲液(Fermentas),0.2μg/μl纯化的BSA(NEB),0.25mM dNTP(Fermentas),25个单位的phi29(Fermentas))启动两种小室中的第二RCA反应。在37℃进行RCA反应60分钟。通过10nM的标记有不同荧光基团的检测寡核苷酸的杂交(通过在37℃孵育30分钟)使初始和第二RCA产物可视化。随后洗涤、干燥载玻片，用VectaShield(Immunkemi)和盖玻片封装载玻片，随后对其进行成像。
图23显示使用两部分RCA报告探针产生的信号相较于使用锁式探针进行的第二RCA得以显著增强。
以下实施例5至7使用合成DNA靶作为初始RCA产物的替代物来例证各种RCA报告分子的功能性。
实施例5–三部分发夹RCA探针
"三部分"RCA探针的效用使用核酸分子来显示。测试"三部分"探针的两个变体，即包含3个发夹结构的单链探针以及包含发夹结构和2个切割链的部分双链探针。
将50μl的10pM合成生物素化DNA模板在链霉抗生物素蛋白涂覆的载玻片(SurModics)上于1x PBS中在37℃孵育60分钟，以在未掺入DNA的1xPBS作为阴性对照。孵育后，用封闭缓冲液(0.1％BSA(Sigma),100nM山羊IgG(Sigma),1mM生物素(Sigma),10ng/μl鲑精DNA(Sigma),5mM EDTA,1x PBS和0.05％Tween 20)于37℃封闭载玻片，进行60分钟。
在实验之前，用secure-Seal 8(Grace Bio-labs)将链霉抗生物素涂覆的载玻片区室化。在新的混合物的每一次添加之前进行洗涤步骤(利用2个重复的50μl 1×PBS,0.05％Tween20)以除去先前的孵育试剂。
通过在37℃于Mg杂交缓冲液(50mM KAc,20mM TrisAc,10mM MgAc和1mM DTT)中以100:1的摩尔比孵育切割链和RCA模板链60分钟来制备包含切割链的三部分探针。将单链(连续)探针在95℃于1M NaCl中孵育5分钟，随后以1℃/秒的温度下降速率冷却至20℃，以使发夹结构能够形成。随后将探针在封闭缓冲液中稀释至20nM，将50μl的每一种探针施用于包含固定的靶核酸分子的反应小室。在于37℃孵育60分钟后，通过洗涤除去未结合的探针。进行一系列反应以释放/产生RCA核酸组分和扩增RCA模板。
首先将50μl解折叠和切割混合物(即引物和RCA模板释放混合物)(1x NEB4缓冲液(New England Biolabs(NEB),0.5μg/μl BSA(NEB),50个单位的Nb BtsI(NEB),50个单位的MlyI(NEB))和500pmol切割链添加至每一个孔。所述解折叠混合物在包含连续(单链)三部分RCA报告分子的反应中不含切割链。
在于37℃孵育60分钟，随后洗涤后，添加50μl的另外的切割混合物(例如以除去切割链或释放RCA组分)。用于包含切割链的三部分探针的切割混合物含有：1x NEB4缓冲液(NEB),0.5μg/μl BSA(NEB)和5个单位的UNG(Fermentas),1μg/μl BSA(NEB),5个单位的UNG(Fermentas)和5个单位的EndoIV(Fermentas)。用于连续三部分探针的另外的切割混合物含有：1x解折叠缓冲液(20mM Tris–HCl,30mM NaCl,1mM EDTA,100mM KCl和1mM DTT),1μg/μl BSA(NEB),5个单位的UNG(Fermentas)和5个单位的EndoIV(Fermentas)。将反应在37℃孵育30分钟以释放RCA核酸组分。洗涤后，向反应小室中添加50μl的连接混合物(1x NEB4缓冲液(NEB),0.5μg/μl BSA(NEB),15个单位的T4DNA连接酶(Fermentas)和0.5mM ATP(Fermentas))。在37℃孵育连接反应，进行30分钟，随后洗涤，添加50μl的滚环扩增(RCA)混合物(1x phi29缓冲液(Fermentas),0.2μg/μl纯化的BSA(NEB),0.25mM dNTP(Fermentas),25个单位的phi29(Fermentas))。在37℃进行RCA反应，进行60分钟。通过10nM荧光标记的探针(检测探针)的杂交(通过在37℃孵育30分钟)，随后进行洗涤和酒精系列来使RCA产物可视化。随后用VectaShield(Immunkemi)和盖玻片封装载玻片，然后对其成像。用ImageJ分析显微照片，随后计数串滴。
图24显示在靶分析物存在的情况下连续三部分探针产生与包含切割链的三部分探针相似的信号。在靶分析物不存在的情况下，两种探针都显示非常低的信号。连续三部分探针显示比切割链三部分探针更好的信噪比。
实施例6–核酸分子的检测中的连续两部分探针和切割链两部分探针
"两部分"RCA探针的效用使用核酸分子来显示。使用两种不同的技术将靶核酸固定在载玻片上。测试"两部分"探针的两个变体，即包含2个发夹结构的连续探针和包含发夹结构和切割链的部分双链探针。
合成DNA模板的固定
在55℃将10μl的1x PBS中的合成生物素化DNA模板与链霉抗生物素蛋白涂覆的载玻片(SurModics)接触10分钟。或者，在37℃将DNA模板与载玻片在50μl 1x PBS中杂交60分钟，以1xPBS作为阴性对照。孵育后，在37℃用封闭缓冲液(0.1％BSA(Sigma)，100nM山羊IgG(Sigma)，1mM生物素(Sigma)，10ng/μl鲑精DNA(Sigma)，5mM EDTA，1x PBS和0.05％Tween20)封闭载玻片，进行60分钟。在实验之前，用secure-Seal 8(Grace Bio-labs)将链霉抗生物素涂覆的载玻片区室化。在新的试剂混合物的每一次添加之前进行洗涤步骤(利用2个重复的50μl 1×PBS,0.05％Tween20)以除去先前的孵育试剂。
连续探针的装配
由于受到可用的DNA合成服务限制(单链DNA交付高达200bp)，因此按它们的组成部分订购两部分(和三部分)连续探针。通过在37℃于连接缓冲液(1X NEB4缓冲液(NEB),0.5mM ATP(Fermantas),0.6个单位/μl T4DNA连接酶)中以等摩尔比率孵育所有部分30分钟来装配探针。按照制造商的手册，将反应混合物施用在6％TBE-尿素凝胶(LifeTechnologies)中。随后通过正确的大小上从凝胶纯化DNA片段来回收探针。
两部分探针的制备和杂交
通过在Mg杂交缓冲液(50mM KAc,20mM TrisAc,10mM MgAc和1mM DTT)中于37℃以100:1的摩尔比孵育切割链和RCA模板链60分钟来制备具有杂交的切割链的两部分探针。通过在95℃于1M NaCl中孵育探针5分钟，随后以1℃/秒的温度下降速率冷却至20℃来制备两部分连续探针。随后将探针在封闭缓冲液中稀释至20nM，将50μl的所述探针稀释物施用于反应小室，用合成模板固定所述探针。
解折叠和切割反应
在于37℃孵育60分钟后，通过洗涤除去未结合的探针。如实施例5中所述进行切割和解折叠反应，其中在使用连续两部分探针的测定中不包含另外的切割链。
图25A显示使用通过生物素/链霉抗生物素蛋白相互作用固定的靶DNA从两部分切割链探针获得的信号。图25B显示从与载玻片杂交的靶DNA获得的信号并且证明连续两部分探针在靶分析物存在的情况下产生与包含切割链的两部分探针相似的信号。两种探针在靶DNA不存在的情况下都显示低的信号。连续两部分探针显示比切割链两部分探针更好的信噪比。
实施例7–五部分发夹探针
将五部分发夹探针(如图18B中显示的)用于检测被固定于载玻片上的DNA。
按照实施例5和6中描述的方案进行用于合成DNA靶的固定、探针的制备和杂交的步骤以及切割和检测步骤。
与实施例6类似，按如下部分订购探针：RCA引物域、RCA模板的第一部分(锁1)、RCA模板的第二部分(锁2)和2个连接模板域(连接1和2)以及它们的连接模板。将RCA引物部分在其5’末端生物素化。通过首先将RCA引物部分寡核苷酸固定在链霉抗生物素蛋白涂覆的珠粒(MyOne T1珠粒，Invitrogen)上来装配五部分探针。每珠粒约1/8的涂覆位置被RCA引物部分寡核苷酸占据。通过重复如下方案相继地将其它4个部分(锁1、锁2、连接1和连接2)添加至RCA引物部分寡核苷酸：在1x连接缓冲液(400mM Tris-HCl,100mM MgCl2),0.1u/μlT4DNA连接酶(Fermantas)和0.5mM ATP中添加含有2倍摩尔过量的探针部分和20倍摩尔过量的连接模板的连接混合物，在37℃孵育30分钟。在新的混合物的每一次添加之前，对珠粒施以洗涤步骤，包括在室温于1x PBS 0.05％Tween-20中和在46℃于0.1x SSC中孵育30分钟。在最后的连接反应后，通过用95％甲酰胺在90℃孵育珠粒5分钟来从珠粒释放DNA连接产物。按照制造商的手册将上清液施加至6％TBE-尿素凝胶(Life Technologies)。随后通过在约500bp的大小处从凝胶纯化DNA片段来除去五部分探针。
图18C显示可使用五部分探针检测RCA产物。对于每一个RCA产物看到2个"串滴"，因为每一个连接域用作报告域，这意味着RCA产物被双重标记。

Claims (35)

1.一种用于进行包括至少两轮RCA的局部RCA反应的方法，其中第二RCA反应的产物附着并从而局限于第一RCA反应的产物，所述方法包括：
(a)提供第一RCA产物；
(b)将探针与所述第一RCA产物直接或间接杂交，其中所述探针包含或提供用于第二RCA反应的引物，和
(c)使用(b)的所述RCA引物进行第二RCA反应以形成第二RCA产物，其中在所述反应中：
(i)所述探针和所述引物不能引发使用所述第一RCA产物作为模板的延伸，或限制任何所述延伸以避免与所述第一RCA产物杂交的任何探针的置换，其中：
(A)如果所述探针包含或释放不与所述第一RCA产物杂交的游离3’末端，所述探针在所述探针或引物的3’末端和所述杂交的区之间包含一个或多个经修饰的区，所述经修饰的区用于抑制3'核酸外切酶降解返回至与所述第一RCA产物杂交的所述探针的区，
(B)如果所述探针包含与所述第一RCA产物杂交的3’末端并且所述3’末端不是连接所需的，所述探针在所述3’末端上或其附近包含修饰，所述修饰用于抑制从探针3'末端的延伸，或
(C)如果所述探针包含与所述第一RCA产物杂交并且是连接所需的3’末端，所述探针在杂交的可连接的5’末端上或其附近被修饰，以包含置换阻断区，以抑制所述探针与所述第一RCA产物的链置换，
和/或使用与所述第一RCA产物杂交的阻断性寡核苷酸，以防止可能从探针的3'末端发生的任何延伸延伸进入和置换任何下游探针，以避免与所述第一RCA产物杂交的任何探针的置换；
(ii)维持(b)的所述RCA引物与所述第一RCA产物的直接或间接杂交并且，依靠所述杂交，所述第二RCA产物附着于所述第一RCA产物；
(iii)用于所述第二RCA反应的RCA模板包含在所述探针中或由所述探针提供，或被单独提供。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针与存在于所述第一RCA产物的单体中的探针结合位点杂交或与中间核酸分子杂交，所述中间核酸分子与存在于所述第一RCA产物的单体中的互补序列杂交。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤(a)包括产生第一RCA产物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)、(b)和(c)同时进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)、(b)和(c)相继地进行。
6.根据权利要求1所述的方法，其中重复步骤(a)、(b)和(c)一次或多次。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针包含：
(i)至少一个结合域，其包含与靶核酸分子互补的区，所述靶核酸分子为第一RCA产物；
(ii)引物域，其包含或能够提供用于所述第二RCA反应的引物；和
(iii)至少一个RCA-模板互补域，其包含与用于所述第二RCA反应的环状或可环化模板互补的区；和任选的
(iv)至少一个连接-模板域，其包含或能够提供用于环化用于所述第二RCA的可环化模板的连接模板；和/或
(v)至少一个RCA模板域，其包含或能够提供用于所述第二RCA反应的环状或可环化模板；
其中所述域是分开的或重叠的。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针包含一条或多条组成型核酸链，和任选地一个或多个双链区，其可通过分子内杂交或通过单独核酸链的分子间杂交形成。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述探针为线性寡核苷酸或包含所述线性寡核苷酸，并且其中2个结合域被提供在所述寡核苷酸的3'和5'末端的每一个上，并且所述探针经杂交以使所述末端并置以便彼此直接或间接地连接，所述方法还包括将所述探针末端彼此直接或间接地连接。
10.根据权利要求1所述的方法，其中除非所述探针已与所述第一RCA产物直接或间接杂交，否则所述引物不能引发所述第二RCA反应。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一RCA产物被固定在固体载体上；并且所述方法包括在进行步骤(c)的所述第二RCA反应之前洗除任何未结合的探针的附加步骤。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针被切割和/或解折叠以释放所述RCA引物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述切割和/或解折叠取决于所述探针与所述第一RCA产物的直接或间接杂交，或其中用于所述第二RCA反应的引物/RCA模板复合物只有在所述探针已与所述第一RCA产物直接或间接杂交时才能形成。
14.根据权利要求12所述的方法，其中
(i)所述探针包含在所述杂交时被解折叠以释放能够用作用于第二RCA反应的引物的引物域的发夹结构；或
(ii)在所述探针与所述第一RCA产物杂交时，产生切割识别位点，并且所述探针被切割以释放能够用作用于第二RCA反应的引物的引物；或
(iii)所述探针包含切割识别位点，并且所述探针被切割以释放能够用作用于第二RCA反应的引物的引物。
15.根据权利要求1所述的方法，其中单独地提供环状或可环化的第二RCA模板，并且其中如果所述RCA模板是可环化的，则其优选地通过使用包含在所述探针中的或由所述探针提供的连接模板直接或间接地连接其末端来环化。
16.根据权利要求15所述的方法，其中单独地提供环状第二RCA模板。
17.根据权利要求1所述的方法，其包括：
(a)提供被固定在固体载体上的第一RCA产物；
(b)将探针与所述第一RCA产物直接或间接杂交，所述探针在下文中为第一探针，其包含或提供用于第二RCA反应的引物，和第二探针，所述第二探针任选地经并置杂交以便直接或间接地连接于所述第一探针，其中所述探针各自包含与一个或多个RCA模板寡核苷酸中的同源结合位点互补的至少一个结合位点，所述寡核苷酸可连接在一起以形成用于第二RCA反应的环状RCA模板；
(c)将所述一个或多个RCA模板寡核苷酸与所述探针杂交，其中所述寡核苷酸经并置杂交以便连接来环化所述寡核苷酸；
(d)进行连接步骤以将所述RCA模板寡核苷酸连接在一起并环化，从而产生用于第二RCA反应的环状RCA模板，和任选地将所述探针连接在一起；
(e)洗涤一次或多次以除去任何未结合的探针和/或未连接的探针，其中为了除去未结合的探针，可在步骤(c)之前或之后进行所述洗涤步骤，以及为了除去任何未结合且未连接的探针或任何未连接的探针，可在步骤(d)之后进行洗涤；
(f)使用所述环状RCA模板进行所述第二RCA反应。
18.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中直接或间接地与所述第一RCA产物杂交的探针是在下文中称为RCA报告探针的探针，其包含或提供如下的用于RCA反应的所有核酸组分：
(i)用于第二RCA反应的引物；
(ii)用于第二RCA反应的环状或可环化的RCA模板；
并且，其中所述RCA模板是可环化的；
(iii)用于所述RCA模板的环化的连接模板；
其中所述探针是可切割的和/或可解折叠的以释放至少使RCA反应能够进行的引物；并且所述方法还包括：
切割和/或解折叠所述探针以释放所述引物，和任选的所述RCA模板，以及连接模板，如果存在的话；并且
其中所述RCA模板是可环化的，从而进行连接步骤以环化所述RCA模板；
然后使用所述RCA引物和所述RCA模板进行所述第二RCA反应。
19.根据权利要求9所述的方法，其中已与所述第一RCA产物杂交但尚未连接的探针通过严格洗涤除去。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述引物和连接模板由所述探针的相同部分提供。
21.根据权利要求1所述的方法，其中将能够用作用于所述第二RCA反应的RCA模板的预先形成的环状核酸分子作为所述探针的部分提供。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针包含一个或多个包含切割识别位点的发夹和/或线性双链结构，所述切割识别位点可被切割以释放所述引物、可环化的第二RCA模板和连接模板。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述阻断性寡核苷酸在所述探针之间与所述第一RCA模板杂交。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的区包含抗核酸酶核苷酸残基、2'O-Me-RNA残基、硫代磷酸修饰的核酸、在核苷酸残基之间掺入的聚乙烯-接头骨架部分、相较于未修饰的残基与DNA和/或RNA形成更稳定的杂交体的经修饰的核苷酸残基、无碱基位点、插入基团和/或发夹结构。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述插入基团为吖啶基团。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的区包含锁核酸(LNA)残基或肽核酸(PNA)残基。
27.根据权利要求1所述的方法，其中使用外切核酸酶-缺陷型试剂和/或不含外切核酸酶的试剂。
28.根据权利要求1所述的方法，其还包括检测所述附着的第二RCA产物。
29.一种用于检测样品中的分析物的方法，其中第一环状RCA模板从核酸分子分析物产生，或用作或产生为所述分析物的标志物，所述方法包括使用所述第一RCA模板进行第一RCA反应来产生第一RCA产物，进行如根据权利要求1至27中任一项中所定义的局部第二RCA反应，以及检测所述第二RCA产物，和任选的所述第一RCA产物，从而检测所述分析物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述第一RCA产物通过免疫RCA或接近式探针测定产生。
31.根据权利要求29所述的用于检测样品中的不止一种分析物的方法，其中用于每一种分析物的所述第二RCA模板包含不同的报告域以检测所述第二RCA产物，或相继地检测所述分析物。
32.根据权利要求29所述的方法，其中通过使用核酸染色或通过使用经标记的核苷酸以掺入所述RCA产物，来使用与所述RCA产物特异性杂交的经标记的检测寡核苷酸检测所述RCA产物。
33.根据权利要求29所述的方法，其中使用液相色谱、电泳、质谱、显微镜检查、实时PCR、荧光探针、微阵列、比色分析、流式细胞术、利用浊度计计数、磁性计数、颗粒计数、电传感、表面传感或基于重量的检测技术来检测所述RCA产物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述比色分析是ELISA。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述质谱是CyTOF。
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