ES2965354T3 - Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana - Google Patents

Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana Download PDF

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Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos para el análisis espacial utilizando el agotamiento de ARN dirigido. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana
Lista de secuencias
La actual solicitud contiene una Lista de Secuencias que se ha presentado en un disco compacto. Dicha Lista de Secuencias se denomina 47706-0200WOI.txt, tiene un tamaño de 2.776.333 bites y fue creada el 24 de marzo de 2021.
Antecedentes
Las células dentro de un tejido de un sujeto tienen diferencias en la morfología y/o la función celular debido a niveles variados de analito (p, e.,) expresión de genes y/o proteínas) dentro de las diferentes células. La localización especifica de una célula dentro de un tejido (p. ej., la localización de la célula con relación a células vecinas o la localización de la célula con relación al microambiente tisular) puede afectar, p. ej., a la morfología, la diferenciación, el destino, la viabilidad, la proliferación, el comportamiento y la señalización de la célula y la diafonía con otras células del tejido.
La heterogeneidad espacial se ha estudiado previamente usando técnicas que solo proporcionan datos para un pequeño grupo de analitos en el contexto de un tejido intacto o una porción de un tejido, o proporcionan una gran cantidad de datos de analitos para células individuales, pero no proporcionan información acerca de la localización de la célula individual en una muestra biológica original (p. ej. muestra tisular).
EI ARN no deseable (p. ej., ARN ribosómico) constituye una proporción considerable de la reserva total de ácidos nucleicos procedente de la muestra biológica, que puede competir con la hibridación de analitos diana de interés. En ciertos contextos, el ARN no deseable puede hibridarse a randómeros, secuencias poliadeniladas e incluso secuencias de captura específicas de genes, creando así una señal de fondo incrementada que interfiere con la unión al analito diana.
Una opción para disminuir la señal de fondo de moléculas de ARN no deseable es añadir sondas de eliminación durante la etapa de transcripción inversa del protocolo de expresión de genes en micromatrices espaciales. Se pueden diseñar sondas de eliminación para cubrir diversos tipos de moléculas de ARN no deseable (p. ej., moléculas de ARN tanto nuclear como mitocondrial). En este contexto, al cubrir moléculas de ARNr, se inhibe en gran parte la interacción de las moléculas con la micromatriz espacial de captura. Sin embargo, una desventaja sería que es posible que una fracción considerable de ARNr ya esté interactuando con la micromatriz cuando se añaden las sondas de eliminación, y de ese modo se limita su utilidad. Así, existe una necesidad de retirar este ARN no deseable.
La ligación con plantilla de ARN (RTL) es el procedimiento por el que múltiples oligonucleótidos se hibridan a un analito en secuencias próximas o adyacentes seguido de la ligación de los oligonucleótidos para crear un producto de ligación. Después de la hibridación y la ligación, se crea un complejo de hibrido de ADN-ARN que incluye el analito de interés (p. ej. ARN) y la sonda ligada (formada por ADN o la combinación ADN/ARN). La RTL utiliza una ribonucleasa (p. ej., ARNasa H) para digerir el complejo de hibrido de ADN-ARN, liberando la sonda ligada para aplicaciones ulteriores tales como hibridación a sondas en micromatrices espaciales y secuenciación. En este documento, los Solicitantes han identificado que sondas de ARN no deseable también se pueden añadir e hibridar a ARN no deseables. Además, debido a que el complejo de sondas de ARN no deseable/ARN no deseable crea un complejo de hibrido de ADN-ARN, la misma etapa de endonucleasa que puede digerir el analito también digiere el ARN no deseable. Debido a que sigue existiendo una necesidad de retirar este ARN no deseable, este enfoque simplifica la necesidad de múltiples etapas enzimáticas que podrían afectar a la integridad y la función del ácido nucleico.
Sumario
La presente invención se refiere a un método para identificar una localización de un analito en una muestra biológica, comprendiendo el método:
(a) poner en contacto la muestra biológica con una primera sonda, una segunda sonda una pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable, donde la primera sonda y la segunda sonda son sustancialmente complementarias a secuencias adyacentes del analito, donde la segunda sonda comprende un dominio de unión a sondas de captura que puede unirse a un dominio de captura de una sonda de captura, y donde una sonda de eliminación de ARN no deseable de la pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable es sustancialmente complementaria a una secuencia de una molécula de ARN no deseable en la muestra biológica;
(b) hibridar la primera sonda y la segunda sonda al analito:
(c) hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable a la molécula de ARN no deseable, formando de ese modo complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable:
(d) ligar la primera sonda y la segunda sonda, creando de ese modo una sonda ligada que es sustancialmente complementaria al analito;
(e) retirar los complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable y liberar la sonda ligada del analito;
(f) hibridar el dominio de unión a sondas de captura de la sonda ligada al dominio de captura de la sonda de captura que está fijada al sustrato, donde la sonda de captura comprende además un código de barras espacial; y
(g) determinar (i) toda o una parte de la secuencia de la sonda ligada unida específicamente al dominio de captura, o uno de sus complementos, y (ii) el código de barras espacial on uno de sus complementos, y usar la secuencia determinada de (i) y (ii) para identificar la localización del analito en la muestra biológica.
La presente descripción se refiere a métodos para eliminar ARN no deseable de muestras de ácido nucleico. La descripción es útil para preparar ADNc a partir de las muestras de ácido nucleico con ARN eliminado, por ejemplo, de muestras tisulares embebidas en parafina fijadas (FFPE).
En un aspecto, se proporciona en este documento un método para identificar una localización de un analito en una muestra biológica, comprendiendo el método (a) poner en contacto una muestra biológica con un primer oligonucleótido de sondeo, un segundo oligonucleótido de sondeo y una pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable, donde el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo son sustancialmente complementarios a secuencias adyacentes del analito, donde el segundo oligonucleótido de sondeo comprende un dominio de unión a sondas de captura que es capaz de unirse a un dominio de captura de una sonda de captura, y hibridar el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo a un analito; (c) hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable a la molécula de ARN no deseable; (d) ligar el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo, creando de ese modo una sonda ligada que es sustancialmente complementaria al analito; (e) retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable y liberar la sonda ligada del analito; (f) hibridar el dominio de unión a sondas de captura de la sonda ligada a un dominio de captura de una sonda de captura que está fijada al sustrato: y (g) determinar (i) toda o una parte de la secuencia de la sonda ligada unida específicamente al dominio de captura, o uno de sus complementos, y (ii) toda o una parte de la secuencia del código de barras espacial, o uno de sus complementos, y usar la secuencia determinada de (i) y (ii) para identificar la localización del analito en la muestra biológica.
En algunas realizaciones, el primer oligonucleótido de sondeo comprende al menos dos bases de ácido ribonucleico en el extremo 3'.
En algunas realizaciones, el primer oligonucleótido de sondeo comprende además una secuencia funcional. En algunas realizaciones, la secuencia funcional es una secuencia cebadora.
En algunas realizaciones, el segundo oligonucleótido de sondeo comprende un nucleótido fosforilado en el extremo 5'.
En algunas realizaciones, el método comprende además proporcionar un dominio de unión a sondas de captura que bloquea el resto que interactúa con el dominio de unión a sondas de captura.
En algunas realizaciones, el método comprende además liberar el dominio de unión a sondas de captura que bloquea el resto procedente del dominio de unión a sondas de captura antes de la etapa (f).
En algunas realizaciones, el dominio de unión a sondas de captura comprende una secuencia poliadenilada (poli(A)) o uno de sus complementos.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a sondas de captura que bloquea el resto comprende una secuencia de poliuridina, una secuencia de politimidina, o ambas.
En algunas realizaciones, la liberación de la secuencia de poliuridina procedente de la secuencia de poli(A) comprende desnaturalizar la sonda ligada o poner en contacto la sonda ligada con una endonucleasa o exonucleasa.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a sondas de captura comprende una secuencia que es complementaria a todo o una porción del dominio de captura de la sonda de captura. En algunas realizaciones, el dominio de unión a sondas de captura comprende una secuencia degenerada.
En algunas realizaciones, la etapa de ligación comprende ligar el primer y el segundo oligonucleótidos de sondeo usando ligación enzimática o ligación química. En algunas realizaciones, la ligación enzimática utiliza una ligasa.
En algunas realizaciones, la ligasa es una o más de una ARN ligasa T4 (RnI2), una ligasa SpIintR, una ADN monocatenario ligasa o una ADN ligasa T4. En algunas realizaciones, la ligasa es una ligasa ARN ligasa T42 (Rnl2).
En algunas realizaciones, el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo son sondas de ADN. En algunas realizaciones, la sonda de eliminación de ARN no deseable es una sonda de ADN.
En algunas realizaciones, cada una de las etapas (b) y (c) crea un híbrido de AR; ADN.
En algunas realizaciones, la etapa (e) comprende poner en contacto la sonda de eliminación de ARN no deseable con una ribonucleasa.
En algunas realizaciones, la ribonucleasa es ARNasa H. En algunas realizaciones, la ARNasa H es ARNasa H1. En algunas realizaciones, la ARNasa H es ARNasa H2. En algunas realizaciones, la ARNasa H es una ARNasa termoestable.
En algunas realizaciones, el método comprende además amplificar la sonda ligada antes de la etapa (f). En algunas realizaciones, las etapas (b) y (c) se realizan sustancialmente al mismo tiempo.
En un aspecto, se proporciona en este documento un método para identificar una localización de un analito en una muestra biológica, comprendiendo el método: (a) poner en contacto la muestra biológica con un sustrato que comprende una pluralidad de sondas se captura enlazadas, donde una sonda de captura de la pluralidad comprende (i) el código de barras espacial y (ii) un dominio de captura que se une específicamente a una secuencia presente en el analito, y una pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable, donde una sonda de eliminación de ARN no deseable en la pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable es sustancialmente complementaria a una secuencia de una molécula de ARN no deseable en la muestra biológica; (b) hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable al ARN no deseable, (c) retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable; (d) hibridar el analito a un dominio de captura de una sonda de captura que está fijada al sustrato; (e) extender un extremo 3' de la sonda de captura usando en analito que está unido específicamente al dominio de captura como una plantilla para generar una sonda de captura extendida, y (f) amplificar la sonda de captura extendida para producir un ácido nucleico
En algunas realizaciones, se proporciona en este documento el método para identificar una localización de un analito en una muestra biológica, que comprende además determinar (i) toda o una parte de la secuencia del código de barras espacial o su complemento, y (ii) toda o una porción de la secuencia del analito procedente de la muestra biológica, y usar las secuencias determinadas de (i) y (ii) para identificar la localización del analito en la muestra biológica.
En un aspecto, se proporciona en este documento un método para identificar una localización de un analito en una muestra biológica, comprendiendo el método: (a) poner en contacto la muestra biológica con una pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable, donde una sonda de eliminación de ARN no deseable en la pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable es sustancialmente complementaria a una secuencia de una molécula de ARN no deseable en la muestra biológica, (b) hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable al ARN no deseable; (c) retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable; (d) poner en contacto una pluralidad de ácidos nucleicos con una pluralidad de sondas oligonucleotídicas diana, donde un ácido nucleico de la pluralidad de ácidos nucleicos comprende (i) un código de barras espacial o uno de sus complementos, y (ii) una porción de una secuencia de un analito procedente de una muestra biológica, o uno de sus complementos; y una sonda oligonucleotídicas diana de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas diana comprende: un dominio que se une específicamente a (i) todo o una porción del código de barras espacial o uno de sus complementos, y/o (ii) toda o una porción de la secuencia del analito procedente de la muestra biológica, o uno de sus complementos, y una etiqueta molecular; (e) enriquecer un complejo de la sonda oligonucleotídica diana unida específicamente al ácido nucleico usando un sustrato que comprende un agente que se une específicamente a la etiqueta molecular; y (f) determinar (i) toda o una porción de la secuencia del código de barras espacial o su complemento, y (ii) toda o una porción de la secuencia del analito procedente de la muestra biológica, y usar las secuencias determinadas de (i) y (ii) para identificar la localización del analito en la muestra biológica.
En algunas realizaciones, el método comprende además generar la pluralidad de ácidos nucleicos comprende: (a) poner en contacto la muestra biológica con un sustrato que comprende una pluralidad de sondas de captura enlazadas, donde una sonda de captura de la pluralidad comprende (i) el código de barras espacial y (ii) un dominio de captura que se une específicamente a una secuencia presente en el analito; (b) extender un extremo 3' de la sonda de captura usando el analito que está unido específicamente al dominio de captura como una plantilla para generar una sonda de captura extendida; y (c) amplificar la sonda de captura extendida para producir el ácido nucleico.
En algunas realizaciones, el dominio de la sonda oligonucleotídica diana comprende un total de aproximadamente 40 nucleótidos a aproximadamente 160 nucleótidos
En algunas realizaciones, la etiqueta molecular comprende un resto. En algunas realizaciones, el resto es estreptavidina, avidina, biotina o un fluoróforo.
En algunas realizaciones, la etiqueta molecular comprende una micromolécula, un ácido nucleico o un carbohidrato.
En algunas realizaciones, la etiqueta molecular está situada 5'o 3' al dominio en la sonda oligonucleótida diana.
En algunas realizaciones, el agente que se une específicamente a la etiqueta molecular comprende una proteína. En algunas realizaciones, la proteína es un anticuerpo.
En algunas realizaciones, el agente que se une específicamente a la etiqueta molecular comprende un ácido nucleico.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ADN.
En algunas realizaciones, el agente que se une específicamente a la etiqueta molecular comprende una micromolécula.
En algunas realizaciones, el analito procedente de la muestra biológica está asociado con una enfermedad o afección. En algunas realizaciones, el analito procedente de la muestra biológica comprende una mutación. En algunas realizaciones, el analito procedente de la muestra biológica comprende un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). En algunas realizaciones, el analito procedente de la muestra biológica comprende una repetición trinucleotídica.
En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra tisular.
En algunas realizaciones, la muestra tisular es una muestra tisular embebida en parafina, fijada con formalina (FFPE) una muestra tisular reciente o congelada. En algunas realizaciones, la muestra tisular es la muestra tisular FFPE, y la muestra tisular está desreticulada.
En algunas realizaciones, la muestra biológica se teñía previamente. En algunas realizaciones, la muestra biológica se teñía previamente usando hematoxilina y eosina (H y E) En algunas realizaciones, la muestra biológica se teñía previamente usando inmunofluorescencia o inmunohistoquímica.
En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto la muestra biológica con un agente de permeabilización.
En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra biológica permeabilizada que se ha permeabilizado con un agente de permeabilización.
En algunas realizaciones, el agente de permeabilización se selecciona de un disolvente orgánico, un detergente y una enzima, o una de sus combinaciones. En algunas realizaciones, el agente de permeabilización es una endopeptidasa o proteasa. En algunas realizaciones, la endopeptidasa es pepsina o proteinasa K.
En algunas realizaciones, la etapa de determinación comprende amplificar toda o parte de la sonda ligada unida específicamente al dominio de captura.
En algunas realizaciones, la amplificación es isotérmica. En algunas realizaciones, la amplificación no es isotérmica.
En algunas realizaciones, un producto de amplificación comprende (i) toda o parte de la secuencia de la sonda ligada unida específicamente al dominio de captura, o uno de sus complementos, y (ii) toda o una parte de la secuencia del código de barras espacial, o uno de sus complementos.
En algunas realizaciones, la etapa de determinación comprende secuenciación.
En algunas realizaciones, el analito es ARN. En algunas realizaciones, el ARN es un ARNm.
En un aspecto, se proporciona en este documento un método para enriquecer un ácido nucleico diana en una micromatriz espacial que comprende (a) añadir una pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable a la micromatriz espacial, donde una sonda de eliminación de ARN no deseable de la pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable es sustancialmente complementaria a una secuencia de una molécula de ARN no deseable en la micromatriz espacial; (b) hibridar una sonda de eliminación de ARN no deseable al ARN no deseable; (c) retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable; y (d) amplificar los ácidos nucleicos restantes para enriquecer el ácido nucleico diana.
En un aspecto, se proporciona en este documento un método para eliminar moléculas de ARN no deseable en una micromatriz espacial, que comprende (a) añadir una pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable a la micromatriz espacial, donde una sonda de eliminación de ARN no deseable de la pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable es sustancialmente complementaria a una secuencia de una molécula de ARN no deseable en la micromatriz espacial; (b) hibridar una sonda de eliminación de ARN no deseable al ARN no deseable, y(c) retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable para eliminar las moléculas de ARN no deseable.
En algunas realizaciones, la sonda de eliminación de ARN no deseable es una sonda de ADN.
En algunas realizaciones, la etapa de hibridación comprende hibridar la sonda de ADN con la molécula de ARN no deseable, lo que crea un hibrido de ARN: ADN.
En algunas realizaciones, la etapa de retirada comprende poner en contacto la sonda de eliminación de ARN no deseable con una ribonucleasa.
En algunas realizaciones, la ribonucleasa es ARNasa H. En algunas realizaciones, la ARNasa H es ARNasa H1. En algunas realizaciones, la ARNasa H es ARNasa H2. En algunas realizaciones, la ARNasa H es una ARNasa termoestable.
En algunas realizaciones, la sonda de eliminación de ARN no deseable es sustancialmente complementaria a toda o una porción de la secuencia de la molécula de ARN no deseable en la muestra biológica.
En algunas realizaciones, al menos una sonda de eliminación de ARN no deseable se hibrida específicamente sustancialmente a una o más porciones de la secuencia de la molécula de ARN no deseable.
En algunas realizaciones, al menos una sonda de eliminación de ARN no deseable se hibrida específicamente sustancialmente a la secuencia de longitud completa de la molécula de ARN no deseable.
En algunas realizaciones, la molécula de ARN no deseable es un ARN de transferencia (ARNt), un ARN ribosómico (ARNr), un ARN mensajero (ARNm), o cualquiera de sus combinaciones.
En algunas realizaciones, la molécula de ARN no deseable es un ARN mitocondrial, ARN nuclear o ARN citoplásmico.
En algunas realizaciones, la sonda de eliminación de ARN no deseable comprende además un resto de captura. En algunas realizaciones, la etapa de retirada comprende usar un agente de unión a restos de captura que se une específicamente al resto de captura.
En algunas realizaciones, el resto de captura es estreptavidina, avidina, biotina o un fluoróforo. En algunas realizaciones, el resto de captura es una biotina.
En algunas realizaciones, el resto de captura comprende una micromolécula, un ácido nucleico o un carbohidrato.
En algunas realizaciones, el resto de captura está situado 5' o 3' con respecto al dominio en la sonda de eliminación de ARN no deseable.
En algunas realizaciones, un agente de unión a restos de captura que se une específicamente al resto de captura comprende una proteína.
En algunas realizaciones, la proteína es un anticuerpo. En algunas realizaciones, la proteína es estreptavidina.
En algunas realizaciones, el agente de unión a restos de captura que se une específicamente al resto de captura comprende un ácido nucleico. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ADN.
En algunas realizaciones, el agente de unión a restos de captura que se une específicamente al resto de captura comprende una micromolécula.
En algunas realizaciones, el agente de unión a restos de captura que se une específicamente al resto de captura está enlazado a un sustrato.
En algunas realizaciones, el sustrato es una cuenta. En algunas realizaciones, la cuenta es una cuenta magnética. En algunas realizaciones, el resto de captura es una biotina y el agente de unión a restos de captura es estreptavidina. En algunas realizaciones, la estreptavidina está enlazada a una cuenta magnética que permite que los complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable se retiren magnéticamente de la muestra biológica.
En algunas realizaciones, las sondas de captura pueden hibridarse a la sonda ligada según se describe en este documento.
En algunas realizaciones, las sondas de captura comprende además una secuencia funcional. En algunas realizaciones, la secuencia funcional es una secuencia cebadora o uno de sus complementos. En algunas realizaciones, la sonda de captura comprende además una secuencia molecular única o uno de sus complementos. En algunas realizaciones, la sonda de captura comprende además una secuencia adicional de unión al cebador o uno de sus complementos.
En un aspecto, se proporciona en este documento un estuche que comprende (a) una micromatriz que comprende una pluralidad de sondas de captura; (b) una pluralidad de oligonucleótidos de sondeo que comprende un primer oligonucleótido de sondeo y un segundo oligonucleótido, donde el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo son sustancialmente complementarios a secuencias adyacentes de un analito, donde el segundo oligonucleótido de sondeo comprende un dominio de unión a sondas de captura que se puede unir a un dominio de captura de la sonda de captura, (c) una pluralidad de enzimas que comprenden una ribonucleasa y una ligasa; y (d) instrucciones para usar el estuche.
En algunas realizaciones, la ribonucleasa es ARNasa H.
En algunas realizaciones, la ligasa es una o más de una ARN ligasa T4 (Rnl2), una ligasa SplintR, una ADN monocatenario ligasa o una ADN ligasa T4. En algunas realizaciones, la ligasa es una ligasa ARN ligasa T42 (Rnl2).
Cuando los valores se describen en forma de intervalos, se debe entender que la descripción incluye la divulgación de todos los posibles subintervalos dentro de estos intervalos, asi como valores numéricos específicos que se encuentran dentro de estos intervalos independientemente de que se indique expresamente un valor numérico específico o un subintervalo específico.
El término "cada", cuando se usa en referencia a un conjunto de elementos, está destinado a identificar un elemento individual en el conjunto pero no se refiere necesariamente a todos los elementos del conjunto, a menos que se establezca expresamente lo contrario, o a menos que el contexto de la utilización indique claramente lo contrario.
Descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos ilustran ciertas realizaciones de las características y ventajas de esta divulgación. Estas realizaciones no están destinadas a limitar de ningún modo el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Símbolos de referencia similares en los dibujos indican elementos similares.
La FIG. 1 es un diagrama esquemático que muestra un ejemplo de una sonda de captura con código de barras, según se describe en este documento.
La FIG. 2 es un esquema que ilustra una sonda de captura escindible, donde la sonda de captura escindida puede entrar en una célula no permeabilizada y unirse a analitos diana dentro de la muestra.
La FIG. 3 es un diagrama esquemático de un punto ("feature") con código de barras espacial multiplexado ejemplar.
La FIG. 4 es un diagrama esquemático de un agente de captura de analito ejemplar.
La FIG. 5 es un diagrama esquemático que representa una interacción ejemplar entre una sonda 524 de captura inmovilizada en un punto y un agente 526 de captura de analito.
Las FIGs. 6A, 6B y 6C son esquemas que ilustran cómo se pueden utilizar etiquetas celulares de estreptavidina en un sistema basado en micromatrices para producir células o contenidos celulares con código de barras espacial.
Las FIGs. 7 muestra un flujo de trabajo esquemático que ilustra etapas ejemplares, no limitativas, no exhaustivas, para la eliminación de ARN ribosómico in situ.
La FIG. 8A muestra un esquema que ilustra un flujo de trabajo ejemplar para la eliminación ribosómica (RD).
La FIG. 8B muestra una imagen de tinción con H y E y una imagen de tinción de ARNr 18S. No se realizó eliminación ribosómica.
La FIG. 8C muestra una imagen de tinción con H y E y una imagen de tinción de ARNr 18S. La eliminación ribosómica se realizó usando sondas de RD diseñadas para bloquear tanto el ARN citoplásmico (18S, 28S y 5.8S) como el ARN mitocondrial (16S y 125).
La FIG. 8D muestra una imagen de tinción con H y E y una imagen de tinción de ARNm usando sondas de poliA. No se realizó eliminación ribosómica.
La FIG. 8E muestra una imagen de tinción con H y E y una imagen de tinción de ARNm usando sondas de poliA. La eliminación ribosómica se realizó usando de RD diseñadas para bloquear tanto el ARN citoplásmico (18S, 28S, 5S y 5,8S) como el ARN mitocondrial (165S y 12S)
La FIG. 9A muestra la gráfica de dispersión gen-gen entre tejidos del bulbo olfativo de ratón (MOB) normal y con eliminación ribosómica. La eliminación ribosómica se realizó usando sondas de RD diseñadas para bloquear tanto el ARN citoplásmico (18S, 28S, 5S y 5, 8S) como el ARN mitocondrial (16S y 12S)
La FIG. 9B muestra la gráfica de dispersión gen-gen entre tejidos cancerosos de cerebro infantil (PNET) normal y con eliminación ribosómica. La eliminación ribosómica se realizó usando sondas de RD diseñadas para bloquear tanto el ARN citoplásmico (18S, 28S, 5S y 5, 8S) como el ARN mitocondrial (16S y 12S).
La FIG. 9C muestra la gráfica de dispersión gen-gen entre tejidos adiposos (grasa) normal y con eliminación ribosómica. La eliminación ribosómica se realizó usando sondas de RD diseñadas para bloquear tanto el ARN citoplásmico (18S. 28S, 5S y 5,8S) como el ARN mitocondrial (16S y 12S).
La FIG. 10 muestra gráficas de tejidos que ilustran el nivel de expresión génica de MT-RNR1 o MT-RNR2 de tejidos normal o con eliminación ribosómica. La eliminación ribosómica se realizó usando sondas de RD diseñadas para bloquear tanto el ARN citoplásmico (18S, 28S, 5S y 5.8S) como el ARN mitocondrial (16S y 12S).
La FIG. 11 muestra los UMI por gen en tejidos normales o con eliminación ribosómica. Los tejidos incluyen tejidos adiposo (grasa), de bulbo olfativo de ratón (MOB), MOB-181218 y de cáncer cerebral infantil (PNET).
La FIG. 12 muestra la comparación de las tasas de detección entre tejidos normal y con eliminación ribosómica. Los tejidos incluyen tejidos adiposo (grasa), de bulbo olfativo de ratón (MOB), MOB-181218 y de cáncer cerebral infantil (PNET).
La FIG. 13A muestra gráficas de tejidos por clusterización de Seurat para 7 clústeres procedentes de un tejido normal.
La FIG. 13B muestra gráficas de tejidos por clusterización de Seurat para 7 clústeres procedentes de tejido con eliminación ribosómica.
La FIG. 14A muestra una gráfica de tSNE de clusterización de Seurat correspondiente a las gráficas de tejidos de la FIG. 13A.
La FIG. 14B muestra una gráfica de tSNE de clusterización de Seurat correspondiente a las gráficas de tejidos de la FIG. 138.
La FIG. 15 muestra gráficas de tejidos de 7 clústeres procedentes de un tejido normal (los mismos clústeres de la FIG. 14A).
La FIG. 16 muestra gráficas de tejidos de 7 clústeres procedentes de un tejido con eliminación ribosómica (los mismos clústeres de la FIG. 14B).
La FIG. 17A muestra gráficas de tejidos de 8 clústeres procedentes de un tejido normal correspondientes a los clústeres de Seurat de la gráfica de tSNE de la FIG. 178. Las dos flechas indican los clústeres 1 y 5 (también indicados por números).
La FIG. 17B muestra una gráfica de tSNE de clusterización de Seurat correspondiente a las gráficas de tejidos indicadas de la FIG. 17A Las dos flechas indican los clústeres 1 y 5 (también indicados por números).
La FIG. 18A muestra gráficas de tejidos de 8 clústeres procedentes de un tejido con eliminación ribosómica correspondientes a los clústeres de Seurat de la gráfica de tSNE de la FIG. 18B. Las dos flechas indican los clústeres 3 y 4 (también indicados por números).
La FIG. 18B muestra una gráfica de tSNE de clusterización de Seurat correspondiente a las gráficas de tejidos de la FIG. 18A Las dos flechas indican los clústeres 3 y 4 (también indicados por números)
Las FIGS. 19A-19D muestran imágenes de tinción con H y E y mapas térmicos de expresión génica para muestras de control (muestras 1 y 2) y muestras de eliminación ribosómica (muestras 3 y 4). Las FIGS. 198-19D muestran mapas térmicos de expresión génica para las muestras 1-4 paraPenk, Doc2g y Kctd12,respectivamente.
Las FIGS. 20A-20D muestran mapas térmicos de expresión génica para muestras de control (muestra 1 y 2) y muestras de eliminación ribosómica (muestras 3 y 4). Las FIGS. 20A y 20B muestran mapas térmicos de expresión génica para genes constitutivos:ActbyGapdh,respectivamente. Las FIGS. 20C y 20D muestran mapas térmicos de expresión génica para dos dianas de las sondas de eliminación ribosómica:mt-Rnr1ymt-Rnr2,respectivamente
Descripción detallada
I. Introducción
Se divulgan en este documento métodos y composiciones basados en el uso de la eliminación de ARN elegido como diana para retirar una o más especies de moléculas de ARN no deseable (p.ej., ARN ribosómico y/o ARN mitocondrial) para reducir la reserva y la concentración de moléculas de ARN no deseable en una muestra que podrían interferir con la detección de dianas deseadas (p. ej., detección de ARNm). Para conseguir la eliminación, se diseñan una o más sondas que se hibridan a una o más moléculas de ARN no deseable. Por ejemplo, en una realización, las sondas se pueden administrar a una muestra biológica que se hibridan selectivamente a ARN ribosómico (ARNr), reduciendo se ese modo la reserva y la concentración de ARNr en la muestra. En este documento, este tipo de eliminación de ARN se combina con técnicas de análisis espacial a fin de determinar la abundancia y/o la localización de uno o más analitos en una muestra biológica. La capacidad para reducir la interferencia con detección de dianas deseadas al eliminar moléculas de ARN no deseable incrementa la eficacia y la sensibilidad de las técnicas de análisis espacial. Por ejemplo, la aplicación posterior o simultánea de sondas de captura a la muestra puede dar como resultado una captura mejorada de otros tipos de ARN (p.ej., ARNm o productos de ligación con plantilla de ARN) debido a una reducción en el ARN no deseable (p.ej., ARN seleccionado a la baja) presente en la muestra.
Las metodologías y las composiciones de análisis espacial descritas en este documento pueden proporcionar una gran cantidad de datos de analitos v / o expresión para una variedad de analitos dentro de una muestra biológica a una alta resolución espacial, mientras que se retiene el contexto espacial natural. Los métodos y las composiciones de análisis espacial pueden incluir, p. ej., el uso de una sonda de captura que incluye un código de barras espacial (p. ej., una secuencia de ácido nucleico que proporciona información acerca de la localización o posición de un analito dentro de una célula o una muestra tisular (p. ej., una célula de mamífero o una muestra tisular de mamífero) y un dominio de captura que puede unirse a un analito (p. ej., una proteína y/o un ácido nucleico) producido por y/o presente en una célula. Los métodos y las composiciones de análisis espacial también pueden incluir el uso de una sonda de captura que tiene un dominio de captura que captura un agente intermedio para la detección indirecta de un analito. Por ejemplo, el agente intermedio puede incluir una secuencia de ácido nucleico (p. ej., un código de barras) asociada con el agente intermedio. Por lo tanto, la detección del agente intermedio es indicativa del analito en la célula o la muestra tisular.
Aspectos no limitativos de las metodologías y las composiciones de análisis espacial se describen en las Patentes de EE. UU. N°10.774.374, 10.724.078, 10.480.022, 10.059.990, 10.041.949, 10.002.316, 9.879.313, 9.783.841, 9.727.810, 9.593.365, 8.951.726, 8.604.182, 7.709.198, las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE. UU. N°2020/239946, 25 2020/080136, 2020/0277663, 2020/024641, 2019/330617, 2019/264268, 2020/256867, 2020/224244, 2019/194709, 2019/161796, 2019/085383, 2019/055594, 2018/216161, 2018/051322, 2018/0245142, 2017/241911, 2017/089811, 2017/067096, 2017/029875, 2017/0016053, 2016/108458, 2015/000854, 2013/171621, WO 2018/091676, WO 2020/176788, Rodriques y cols., Science 363(6434): 1463-1467, 2019; Lee y cols., Nat. Protoc. 10(3):442-458 2015; Trejo y cols., PLoS ONE 14(2): e0212031, 2019; Chen y cols., Science 384(6233):aaa6090, 2015; Gao y cols., BMC 30 Biol. 15:50, 2017; y Gupta y cols., Nature Biotechnol. 36: 1197-1202, 2018; the Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits User Guide (p. ej. Rev C, con fecha de junio de 2020), y/o the Visium Spatial Tissue Optimization Reagent Kits User Guide (p. ej. Rev C, con fecha de julio de 2020), ambas de las cuales están disponibles en la ciberpágina de 10x Genomics Support Documentation, y se pueden usar en este documento en cualquier combinación. Aspectos no limitativos adicionales de metodologías y composiciones de análisis espacial se describen en este documento.
Alguna terminología general que se puede usar en esta divulgación se puede encontrar en la Sección (I)(b) del documento WO 2020/176788 y/o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N°2020/0277663. Típicamente, un "código de barras" es una etiqueta, o identificador, que transmite o puede transmitir información (p. ej., información acerca de un analito en una muestra, una cuenta y/o una sonda de captura). Un código de barras puede ser parte de un 40 analito, o independiente de un analito. Un código de barras puede estar enlazado a un analito. Un código de barras particular puede ser único con relación a otros códigos de barras. Para el fin de esta divulgación, un "analito" puede incluir cualquier sustancia biológica, estructura, resto o componente que se vaya a analizar. El término "diana" se puede referir de forma similar a un analito de interés.
Los analitos se pueden clasificar ampliamente en uno de dos grupos: analitos de ácido nucleico y analitos distintos de ácido nucleico. Ejemplos de analitos distintos de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, lípidos, carbohidratos, péptidos, proteínas, glicoproteínas (ligadas por N o ligadas por O), lipoproteínas, fosfoproteínas, variantes fosforiladas o acetiladas específicas de proteínas, variantes de amidación de proteínas, variantes de hidroxilación de proteínas, variantes de metilación de proteínas, variantes de ubiquitinación de proteínas, variantes de sulfatación de proteínas, proteínas virales (p. ej., cápside viral, envuelta viral, revestimiento viral, accesorio viral, glicoproteínas virales, espícula viral, etc.), proteínas extracelulares e intracelulares, anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos. En algunas realizaciones, el analito o los analitos pueden estar localizados en una localización o localizaciones subcelulares, incluyendo, por ejemplo, orgánulos, p. ej., mitocondria, aparato de Golgi, retículo endoplásmico, cloroplastos, vesículas endocíticas, vesículas exocíticas, vacuolas, lisosomas, etc. En algunas realizaciones, el analito o los analitos pueden ser péptidos o proteínas, incluyendo sin limitación anticuerpos y enzimas. Ejemplos adicionales de analitos se pueden encontrar en la Sección (1)(c) del documento WO 2020/176788 y/o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N°2020/0277663. En algunas realizaciones, un analito se puede detectar indirectamente, tal como a través de la detección de un agente intermedio, por ejemplo, una sonda conectada (p, e) un producto de ligación) o un agente de captura de analito (p, ej., un anticuerpo conjugado a oligonucleótido), tales como los descritos en este documento.
Una "muestra biológica" se obtiene típicamente a partir del sujeto para el análisis usando cualquiera de una variedad de técnicas incluyendo, pero no limitadas a, biopsia, cirugía y microscopia de captura láser (LCM), e incluye generalmente células ylu otro material biológico procedente del sujeto. En algunas realizaciones, una muestra biológica puede ser una sección tisular. En algunas realizaciones, una muestra biológica puede ser una muestra biológica fijada y/o teñida (p. ej. una sección tisular fijada y/o teñida). Ejemplos no limitativos de colorantes incluyen colorantes histológicos (p.ej... hematoxilina y/o eosina) y colorantes inmunológicos (p, e) colorantes fluorescentes). En algunas realizaciones, pueden obtenerse imágenes de una muestra biológica (p, e) una muestra biológica fiada y/o teñida). También se describen muestras biológicas en la Sección (1)(d) del documento WO 2020/176788 y/o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N°2020/0277663
En algunas realizaciones, una muestra biológica se permeabiliza con uno o más reactivos de permeabilización. Por ejemplo, la permeabilización de una muestra biológica puede facilitar la captura del analito. Agentes y condiciones de permeabilización ejemplares se describen en la Sección (1)(d)(ii)(13) o la sección de Realizaciones Ejemplares del documento WO 2020/176788 y/o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N°2020/0277663.
Los métodos de análisis espacial basados en micromatrices implicar la transferencia de uno o más analitos desde una muestra biológica a una micromatriz de puntos sobre un sustrato, donde cada punto está asociado con una localización espacial única en la micromatriz. El análisis posterior de los analitos transferidos incluye determinar la identidad de los analitos y la localización espacial de los analitos dentro de la muestra biológica. La localización espacial de un analito dentro de la muestra biológica se determina basándose en el punto al que está unido el analito (p, e., directamente o indirectamente) en la micromatriz, y la localización espacial relativa del punto dentro de la micromatriz.
Una "sonda de captura" se refiere a cualquier molécula capaz de capturar (directamente o indirectamente) y/o etiquetar un analito (p, ej., un analito de interés) en una muestra biológica. En algunas realizaciones, la sonda de captura es un ácido nucleico o un polipéptido. En algunas realizaciones, la sonda de captura incluye un código de barras (p. ej., un código de barras espacial y/o un identificador molecular único (UMI)) y un dominio de captura). En algunas realizaciones, una sonda de captura puede incluir un dominio de escisión y/o un dominio funcional (p. ej., un sitio de unión a cebadores, tal como para secuenciación de próxima generación (NGS)).
La FIG. 1 es un diagrama esquemático que muestra una sonda de captura ejemplar, según se describe en este documento. Según se muestra, la sonda 102 de captura está opcionalmente acoplada a un punto 101 mediante un dominio 103 de escisión, tal como un empalme de disulfuro. La sonda de captura puede incluir una secuencia 104 funcional que es útil para el procesamiento posterior. La secuencia 104 funcional puede incluir toda o una parte de la secuencia de enlace a la celdilla de flujo específica del secuenciador (p. ej., una secuencia P5 o P7) toda o parte de captura puede tener una secuencia complementaria a una secuencia de un analito de ácido nucleico. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a una sonda conectada descrita en este documento. El dominio de entablillado. Este oligonucleótido de entablillado, además de tener una secuencia complementaria a un dominio de captura de una sonda de captura, puede tener una secuencia de un analito de ácido nucleico, una secuencia una secuencia cebadora de secuenciación (p.ej., un sitio de unión al cebador R1, una secuencia de unión al cebador R2), o una de sus combinaciones. La sonda de captura también puede incluir un código 105 de barras espacial. La sonda de captura también puede incluir un secuencia 106 del identificador molecular único (UMI). Aunque laFIG. 1 muestra que el código 105 de barras espacial está localizado aguas arriba (5') de la secuencia 106 del UMI, se debe entender que sondas de captura en las que la secuencia 106 del UMI esté localizada aguas arriba (5') del código 105 de barras espacial también es adecuada para el uso en cualquiera de los métodos descritos en este documento. La sonda de captura también puede incluir un dominio 107 de captura para facilitar la captura de un analito diana. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a una secuencia de manejo de captura presente en un agente de captura de analito. El dominio de captura puede tener una secuencia complementaria a un oligonucleótido de complementaria a una porción de una sonda conectada descrita en este documento y/o una secuencia de manejo de captura descrita en este documento.
Las secuencias funcionales se pueden seleccionar generalmente por la compatibilidad con cualquiera de una variedad de diferentes sistemas de secuenciación, p. ej., los instrumentos de secuenciación lon Torrent Proton o PGM, Illumina, PacBio, Oxford Nanopore, etc., y sus requisitos. En algunas realizaciones, las secuencias funcionales se pueden seleccionar por la compatibilidad con sistemas de secuenciación no comercializados. Ejemplos de estos sistemas y técnicas de secuenciación, para los que se pueden usar secuencias funcionales adecuadas, incluyen (pero no se limitan a) la secuenciación de lon Torrent Proton o PGM, la secuenciación de Illumina, la secuenciación de PacBio SMRT y la secuenciación de Oxford Nanopore. Además, en algunas realizaciones, las secuencias funcionales se pueden seleccionar por la compatibilidad con otros sistemas de secuenciación, incluyendo sistemas de secuenciación no comercializados.
En algunas realizaciones, el código 105 de barras espacial y las secuencias 104 funcionales son comunes a todas las sondas enlazadas a un punto dado. En algunas realizaciones, la secuencia 106 del UMI de una sonda de captura enlazada a un punto dado es diferente de la secuencia del UMI de una sonda de captura diferente enlazada al punto dado.
La FIG. 2 es un esquema que ilustra una sonda de captura escindible, donde la sonda de captura escindida puede entrar en una célula no permeabilizada y unirse a analitos dentro de la muestra. La sonda 201 de captura contiene un dominio 202 de escisión, un péptido 203 de penetración en la célula, una molécula 204 indicadora y un enlace disulfuro (-S-S-). 205 representa todas las otras partes de una sonda de captura, por ejemplo un código de barras espacial y un dominio de captura.
La FIG. 3 es un diagrama esquemático de un punto con código de barras espacial multiplexado ejemplar. En la FIG. 3, el punto 301 puede estar acoplado a sondas de captura con código de barras espacial, donde las sondas con código de barras espacial de un punto particular pueden poseer el mismo código de barras espacial, pero tienen diferentes dominios de captura diseñados para asociar el código de barras espacial del punto con más de un analito diana. Por ejemplo, un punto puede estar acoplado a cuatro tipos diferentes de sondas de captura con código de barras espacial, poseyendo cada sonda de captura con código de barras espacial el código 302 de barras espacial. Un tipo de sonda de captura asociada con el punto incluye el código 302 de barras espacial en combinación con un dominio 303 de captura de poli(T), diseñado para capturar analitos diana de ARNm. Un segundo tipo de sonda de captura asociada con el punto Incluye el código 302 de barras espacial en combinación con un dominio 304 de captura N-mero aleatorio para en análisis de ADNg. Un tercer tipo de sonda de captura asociada con el punto incluye el código 302 de barras espacial en combinación con un dominio de captura complementario a una secuencia de manejo de captura de un agente de captura de analito de interés 305. Un cuarto tipo de sonda de captura asociada con el punto incluye el código 302 de barras espacial en combinación con un dominio de captura que se puede unir específicamente a una molécula 306 de ácido nucleico que puede funcionar en un ensayo de CRISPR (p. ej. CRISPR/Cas9). Aunque solo se muestran cuatro construcciones de sonda de captura-código de barras en la FIG. 3, las construcciones de sonda de captura-código de barras se pueden adaptar para el análisis de cualquier analito dado asociado con un ácido nucleico y capaz de unirse
con esta construcción. Por ejemplo, los esquemas mostrados en la FIG. 3 también se pueden usar para el análisis coincidente de otros analitos divulgados en este documento, incluyendo, pero no limitados a: (a) ARNm, una construcción de seguimiento del linaje, proteínas y metabolitos de la superficie celular o intracelulares, y ADNg: (b) ARNm, proteínas y metabolitos de la superficie celular o intracelulares de cromatina (p. ej., ATAC-seq, DNase-seq, y/o MNaseseq) accesibles, y un agente de perturbación ( p .e., un ARNcr/ARNsg CRISPR, TALEN, nucleasa del dedo de cinc y/o un oligonucleótido antisentido según se describe en este documento); (c) ARNm, proteínas y/o metabolitos de la superficie celular o intracelulares, un agente de etiquetado con código de barras (p. ej., los multímeros de MHC descritos en este documento), y una secuencia V(D)J de un receptor de células inmunitarias (p. ej., receptor de células T). En algunas realizaciones, un agente de perturbación puede ser una micromolécula, un anticuerpo, un fármaco, un aptámero, un miARN, un ambiente físico (p. ej., cambio de temperatura) o cualesquiera otros agentes de perturbación conocidos. Véase, p. ej., la Sección (II)(b) (p. ej, las subsecciones (i)-(vi)) del documento WO 2020/176788 y/o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N°2020/0277663. La generación de sondas de captura se puede conseguir mediante cualquier método apropiado, incluyendo los descritos en la Sección (II)(d)(ii) del documento WO 2020/176788 y/o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N°2020/0277663.
En algunas realizaciones, se puede detectar (p. ej., simultáneamente o secuencialmente) más de un tipo de analito (p. ej., ácidos nucleicos y proteínas) a partir de una muestra biológica usando cualquier técnica apropiada, tales como las descritas en la Sección (IV) del documento WO 2020/176788 y/o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N°2020/0277663.
En algunas realizaciones, la detección de uno o más analitos (p, ej,. analitos proteínicos) se puede realizar usando una o más agentes de captura de analitos. Según se usa en este documento, un "agente de captura de analito" se refiere a un agente que interactúa con un analito (p. ej., un analito en una muestra biológica) y con una sonda de captura (p, e) una sonda de captura enlazada a un sustrato o un punto) para identificar el analito. En algunas realizaciones, el agente de captura de analito incluye: (i) un resto de unión al analito (p. ej., que se une a un analito), por ejemplo, un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno; (ii) un código de barras del resto de unión a analito; y (iii) una secuencia de manejo de captura. Según se usa en este documento, el término "código de barras del resto de unión a analito" se refiere a un código de barras que está asociado con o identifica de otro modo el resto de unión a analito. Según se usa en este documento, el término "secuencia de captura de analito" o "secuencia de manejo de captura" se refiere a una región o resto configurado para hibridarse a, unirse a, acoplarse a o interactuar de otro modo con un dominio de captura de una sonda de captura. En algunas realizaciones, una secuencia de manejo de captura es complementaria a un dominio de captura de una sonda de captura. En algunos casos, un código de barras del resto de unión a analito (o una de sus porciones) se puede retirar (p. ej, escindir) del agente de captura de analito.
La FIG. 4 es un diagrama esquemático de un agente 402 de captura de analito ejemplar comprendido por un resto 404 de unión a analito y un dominio 408 de código de barras del resto de unión a analito. El resto 404 de unión a analito ejemplar es una molécula capaz de unirse a un analito 406 y el agente de captura de analito es capaz de interactuar con una sonda de captura con código de barras espacial. El resto de unión a analito se puede unir al analito 406 con alta afinidad y/o con alta especificidad. El agente de captura de analito puede incluir un dominio 408 de código de barras del resto de unión a analito, una secuencia nucleotídica (p. ej., un oligonucleótido), que se puede hibridar a al menos una porción o la totalidad de un dominio de captura de una sonda de captura. El dominio 408 de código de barras del resto de unión a analito puede comprender un código de barras del resto de unión a analito y una secuencia de manejo de captura descritos en este documento. El resto 404 de unión a analito puede incluir un polipéptido y/o un aptámero. El resto 404 de unión a analito puede incluir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo (p, ej,. un fragmento de unión a antígeno).
La FIG. 5 es un diagrama esquemático que representa una interacción ejemplar entre una sonda 524 de captura inmovilizada en un punto y un agente 526 de captura de analito. La sonda 524 de captura inmovilizada en un punto puede incluir un código 508 de barras espacial así como secuencias 506 funcionales y UMI 510, según se describe en otras partes en este documento.
La sonda de captura también puede incluir un dominio 512 de captura que es capaz de unirse a un agente 526 de captura de analito. El agente 526 de captura de analito puede incluir una secuencia 518 funcional, un código 516 de barras del resto de unión a analito y una secuencia 514 de manejo de captura que es capaz de unirse al dominio 512 de captura de la sonda 524 de captura. El agente de captura de analito también puede incluir un empalme 520 que permite que el dominio 516 de código de barras del agente de captura se acople al resto 522 de unión a analito.
Las FIGs. 6A, 6B y 6C son esquemas que ilustran cómo se pueden utilizar etiquetas celulares de estreptavidina en un sistema basado en micromatriz para producir una célula o contenido celular con código de barras espacial. Por ejemplo, según se muestra en la FIG. 6A, el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) unido a péptido se puede asociar individualmente con biotina (B2m) y unirse a un resto de estreptavidina de modo que el resto de estreptavidina 10 comprenda múltiples restos de pMHC. Cada uno de estos restos se puede unir a un TCR de modo que la estreptavidina se una a una célula T diana a través de múltiples interacciones de unión MHC/TCR. Las múltiples interacciones tienen sinergia y pueden mejorar sustancialmente la afinidad de unión. Esta afinidad puede mejorar el etiquetado de células T y también reducir la probabilidad de que las etiquetas se disocien de las superficies de las células T. Según se muestra en la FlG. 6B, un dominio 601 de código de barras del agente de captura se puede modificar con estreptavidina 602 y ponerse en contacto con múltiples moléculas de MHC 603 biotiniladas de modo que las moléculas de MHC 603 biotiniladas se acoplen con el dominio 601 de código de barras del agente de captura conjugado a estreptavidina. El resultado es un complejo 605 multímero de MHC con código de barras. Según se muestra en la FIG. 6B, la secuencia 601 del dominio de código de barras del agente de captura puede identificar el MHC como su etiqueta asociada y también incluye secuencias funcionales opcionales tales como secuencias para la hibridación con otros oligonucleótidos. Según se muestra en la FIG. 6C, un oligonucleótido ejemplar es la sonda 606 de captura que comprende una secuencia complementaria (p. ej., rGrGrG correspondiente a C C C), una secuencia de código de barras y otras secuencias funcionales, tales como, por ejemplo, un UMI, una secuencia adaptadora (p. ej., que comprende una secuencia cebadora de secuenciación (p. ej., R1 o una R1 parcial ("pR1”), R2), una secuencia de enlace a la celdilla de flujo (p. ej., P5 o P7 o sus secuencias parciales)), etc. En algunos casos, la sonda 606 de captura puede asociarse en primer lugar 25 con un punto (p. ej., una cuenta de gel) y liberarse del punto. En otras realizaciones, la sonda 606 de captura se puede hibridar a un dominio 601 de código de barras del agente de captura del complejo 605 MHC-oligonucleótido. Los oligonucleótidos hibridados (espaciador C C C y espaciador rGrGrG) se pueden extender a continuación en reacciones de extensión con cebador de modo que se generen construcciones que comprenden secuencias que corresponden a cada una de las dos secuencias de código de barras espacial (el código de barras espacial asociado con la sonda de captura y el código de barras asociado con el complejo MHC-oligonucleótido). En algunos casos, una o ambas de las secuencias correspondientes pueden ser un complemento de la secuencia original en la sonda 606 de captura o el dominio 601 del código de barras del agente de captura. En otras realizaciones, la sonda de captura y el dominio de código de barras del agente de captura se ligan entre sí. Opcionalmente, las construcciones resultantes se pueden procesar adicionalmente (p. ej., para añadir secuencias adicionales y/o para limpieza) y someterse a secuenciación. Según se describe en otras partes en este documento, una secuencia derivada de la secuencia de código de barras espacial de la sonda 606 de captura se puede usar para identificar un punto y la secuencia derivada de la secuencia del código de barras espacial en el dominio 601 del código de barras del agente de captura se puede usar para identificar el complejo 604 particular de MHC-péptido unido a la superficie de la célula (p. ej., cuando se usan bibliotecas de MHC-péptido para cribar células inmunitarias o poblaciones de células inmunitarias).
Una descripción adicional de agentes de captura de analitos se puede encontrar en la Sección (II)(b)(ix) del documento WO 2020/176788 y/o la Sección (II)(b)(viii) la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N°2020/0277663.
Existen al menos dos métodos para asociar un código de barras espacial con una o más células vecinas, de modo que el código de barras espacial identifique la una o más células y/o el contenido de la una o más células, según estén asociados con una localización espacial particular. Un método es promover analitos o apoderados de analitos (p.ej., agentes intermedios) fuera de una célula y hacia una micromatriz con código de barras espacial (p, ej., incluyendo sondas de captura con código de barras espacial). Otro método es escindir sondas de captura con código de barras espacial de una micromatriz y promover las sondas de captura con código de barras espacial hacia y/o al interior o sobre la muestra biológica
En algunos casos, las sondas de captura se pueden configurar para cebar, replicar y por consiguiente dar productos de extensión opcionalmente con código de barras a partir de una plantilla (p. ej., una plantilla de ADN o ARN, tal como un analito o un agente intermedio (p. ej., una sonda conectada (p. ej., un producto de ligación) o un agente de captura de analito), o una de sus porciones), o sus derivados (véase, p. ej., la Sección (II)(b)(vii) del documento WO 2020/176788 y/o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N°2020/0277663 referente a sondas de captura extendidas). En algunos casos, las sondas de captura se pueden configurar para formar una sonda conectada (p. ej., un producto de ligación) con una plantilla (p.ej., una plantilla de ADN o ARN, tal como un analito o un producto intermedio, o una de sus porciones), creando de ese modo productos de ligación que sirven como apoderados para una plantilla
Según se usa en este documento, una "sonda de captura extendida" se refiere a una sonda de captura que tiene nucleótidos adicionales añadidos a la terminación (p. ej., extremo 3' o 5') de la sonda de captura extendiendo de ese modo la longitud total de la sonda de captura. Por ejemplo, un "extremo 3' extendido" indica que se añadían nucleótidos adicionales al nucleótido más 3' de la sonda de captura para extender la longitud de la sonda de captura, por ejemplo, mediante reacciones de polimerización usadas para extender moléculas de ácido nucleico incluyendo polimerización con plantilla catalizada por una polimerasa (p. ej., una ADN polimerasa o una transcriptasa inversa) En algunas realizaciones, la extensión de la sonda de captura incluye añadir al extremo 3' de una sonda de captura una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico de un analito o un agente intermedio unido específicamente al dominio de captura de la sonda de captura. En algunas realizaciones, la sonda de captura se extiende usando transcripción inversa. En algunas realizaciones, la sonda de captura se extiende usando una o más ADN polimerasas. Las sondas de captura extendidas incluyen la secuencia de la sonda de captura y la secuencia del código de barras espacial de la sonda de captura.
En algunas realizaciones, las sondas de captura extendidas se amplifican (p, theta) en solución en masa o sobre la micromatriz) para dar cantidades que sean suficientes para el análisis posterior, p. ej., a través de secuenciación de ADN. En algunas realizaciones, las sondas de captura (p, e) moléculas de ADN) extendidas actúan como plantillas para una reacción de amplificación (p. ej., una reacción en cadena de la polimerasa).
Variantes adicionales de métodos de análisis espacial, incluyendo en algunas realizaciones una etapa de obtención de imágenes, se describen en la Sección (II)(a) del documento WO 2020/176788 y/o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N°2020/0277663. El análisis de analitos (y/o agentes intermedios o sus porciones) capturados, por ejemplo, incluyendo retirada de la muestra, extensión de sondas de captura, secuenciación (p. ej., de una sonda de captura extendida escindida y/o una molécula de ADNc complementaria a una sonda de captura extendida), secuenciación sobre la micromatriz (p. ej., usando, por ejemplo, enfoques de hibridación in situ o ligación in situ), análisis temporal y/o captura por proximidad, se describe en la Sección (11)(g) del documento WO 2020/176788 y/o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N°2020/277 . Algunas medidas de control de calidad se describen en la Sección (II) (g( del documento WO 2020/176788 y/o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2020/0277663.
La información espacial puede proporcionar información de importancia biológica y/o médica. Por ejemplo, los métodos y las composiciones descritos en este documento pueden permitir: la identificación de uno o más biomarcadores (p. ej., diagnóstico, pronóstico y/o para la determinación de la eficacia de un tratamiento) de una enfermedad o trastorno; la identificación de una posible diana farmacológica para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno: la identificación (p. ej., diagnóstico) de que un sujeto tenga una enfermedad o un trastorno; la identificación del estadio y/o el pronóstico de una enfermedad o un trastorno en un sujeto; la identificación de que un sujeto tenga una probabilidad incrementada de desarrollar una enfermedad o un trastorno; la comprobación de la progresión de una enfermedad o un trastorno en un sujeto; la determinación de la eficacia de un tratamiento de una enfermedad o un trastorno en un sujeto, la identificación de una subpoblación de pacientes para la que un tratamiento es eficaz para una enfermedad o un trastorno; la modificación de un tratamiento de un sujeto con una enfermedad o un trastorno; la selección de un sujeto para la participación en un estudio clínico; y/o la selección de un tratamiento para un sujeto con una enfermedad o un trastomo
La información espacial puede proporcionar información de importancia biológica. Por ejemplo, los métodos y las composiciones descritos en este documento pueden permitir: la identificación de perfiles de expresión del transcriptoma y/o proteoma (p. ej., en tejido sano y/o enfermo); la identificación de múltiples tipos de analito en estrecha proximidad (p. ej., análisis del vecino más cercano); la determinación de genes y/o proteínas regulados al alza y/o la baja en tejido enfermo, la caracterización de microambientes tumorales; la caracterización de respuestas inmunitarias tumorales; la caracterización de tipos de células y su colocalización en tejido; y la identificación de variantes genéticas dentro de tejidos (p. ej., basándose en perfiles de expresión de genes y/o proteínas asociados con biomarcadores de una enfermedad o un trastorno específicos).
Típicamente, para los métodos basados en micromatrices espaciales, un sustrato funciona como soporte para el enlace directo o indirecto de sondas de captura a puntos de la micromatriz. Un "punto" es una entidad que actúa como soporte o repositorio para diversas entidades moleculares en el análisis espacial. En algunas realizaciones, alguno o todos los puntos de la micromatriz están funcionalizados para la captura de analito. Sustratos ejemplares se describen en la Sección (II)(c) del documento WO 2020/176788 y/o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2020/0277663. Puntos y atributos geométricos ejemplares de una micromatriz se pueden encontrar en las Secciones (II)(d)(i), (N)(d)(iii) y (II)(d)(iv) del documento WO 2020/176788 y/o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. uU. N°2020/0277663.
Generalmente, los analitos y/o los agentes intermedios (o sus porciones) se pueden capturar cuando se pone en contacto una muestra biológica con un sustrato que incluye sondas de captura (p, e) un sustrato con sondas de captura embebidas, punteadas, impresas, fabricadas sobre el sustrato, o un sustrato con puntos (p, ej., cuentas, pocillos) que comprenden sondas de captura). Según se usa en este documento, "contacto", "puesta en contacto" y/o "poner en contacto" una muestra biológica con un sustrato se refiere a cualquier contacto (p,ej., directo o indirecto) de modo que las sondas de captura puedan interactuar (p. ej., unirse covalentemente o no covalentemente (p. ej., hibridarse)) con analitos procedentes de la muestra biológica. La captura se puede conseguir activamente (p. ej., usando electroforesis) o pasivamente (p. ej. usando difusión). La captura de analitos se describe adicionalmente en la Sección (11)(e) del documento WO 2020/176788 /o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. Uu. N° 2020/0277663.
En algunos casos, el análisis espacial se puede realizar al empalmar y/o introducir una molécula (p, ej., un péptido, un lípido o una molécula de ácido nucleico) que tiene un código de barras (p. ej., un código de barras espacial) en una muestra biológica (p, ej., en una célula en una muestra biológica). En algunas realizaciones, una pluralidad de moléculas (p. ej., una pluralidad de moléculas de ácido nucleico) que tiene una pluralidad de códigos de barras (p,ej , una pluralidad de códigos de barras espaciales) se introduce en una muestra biológica (p. ej., en una pluralidad de células en una muestra biológica) para el uso en análisis espacial. En algunas realizaciones, después de enlazar y/o introducir una molécula que tiene un código de barras en una muestra biológica, la muestra biológica se puede separar físicamente (p.ej., disociar) en células individuales o grupos de células para el análisis. Algunos de estos métodos de análisis espacial se describen en la Sección (III) del documento WO 2020/176788 y/o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N°2020/0277663.
En algunos casos, el análisis espacial se puede realizar al detectar múltiples oligonucleótidos que se hibridan a un analito. En algunos casos, por ejemplo, el análisis espacial se puede realizar usando ligación con plantilla de ARN 10 (RTL). Se han descrito previamente métodos de RTL. Véanse, p. ej.,Credley cols.,Nucleic AcidsRes. 21 de agosto de 2017;45(14):e128. Típicamente, la RTL incluye la hibridación de dos oligonucleótidos a secuencias adyacentes en un analito (p. ej., una molécula de ARN, tal como una molécula de ARNm). En algunos casos, los oligonucleótidos son moléculas de ADN. En algunos casos, uno de los oligonucleótidos incluye al menos dos bases de ácido ribonucleico en el extremo 3' y/o el otro oligonucleótido incluye un nucleótido fosforilado en el extremo 5'. En algunos casos, uno de los 15 dos oligonucleótidos incluye un dominio de captura (p. ej., una secuencia de poli(A), una secuencia no homopolimérica). Después de la hibridación al analito, una ligasa (p. ej., ligasa SplintR) liga entre sí los dos oligonucleótidos, creando una sonda conectada (p. ej., un producto de ligación). En algunos casos, los dos oligonucleótidos se hibridan a secuencias que no son adyacentes entre sí. Por ejemplo, la hibridación de los dos oligonucleótidos crea un hueco entre los oligonucleótidos hibridados. En algunos casos, una polimerasa (p. ej., una ADN polimerasa) puede extender uno de los 20 oligonucleótidos antes de la ligación. Después de la ligación, la sonda conectada (p. ej., un producto de ligación) se libera del analito. En algunos casos, la sonda conectada (p. ej., un producto de ligación) se libera usando una endonucleasa (p. ej., ARNasa H). La sonda conectada (p. ej., un producto de ligación) liberada puede ser capturada a continuación por sondas de captura (p. ej., en lugar de la captura directa de un analito) sobre una micromatriz, opcionalmente amplificarse, y secuenciarse, determinando así la localización y opcionalmente la abundancia del analito 25 en la muestra biológica.
Durante el análisis de la información espacial, se obtiene información de la secuencia para un código de barras espacial asociado con un analito, y la información de la secuencia se puede usar para proporcionar información acerca de la distribución espacial del analito en la muestra biológica. Se pueden usar diversos métodos para obtener la información espacial. En algunas realizaciones, sondas de captura específicas y los analitos que capturan se asocian con localizaciones específicas en una micromatriz de puntos sobre un sustrato. Por ejemplo, códigos de barras espaciales específicos se pueden asociar con localizaciones específicas de la micromatriz antes de la fabricación de la micromatriz, y las secuencias de los códigos de barras espaciales se pueden almacenar (p.ej., en una base de datos) junto con información de localizaciones específicas de la micromatriz, de modo que cada código de barras espacial se cartografíe únicamente a una localización particular de la micromatriz.
Alternativamente, códigos de barras espaciales específicos se pueden depositar en localizaciones predeterminadas en una micromatriz de puntos durante la fabricación, de modo que en cada localización, solo esté presente un tipo de código de barras espacial de modo que los códigos de barras espaciales se asocien únicamente con un solo punto de la micromatriz.
Cuando sea necesario, las micromatrices se pueden descodificar usando cualquiera de los métodos descritos en este documento de modo que los códigos de barras espaciales se asocien únicamente con localizaciones de puntos de la micromatriz, y esta cartografía se puede almacenar según se describe anteriormente.
Cuando se obtiene información de la secuencia para sondas de captura y/o analitos durante el análisis de la información espacial, las localizaciones de las sondas de captura y/o los analitos se pueden determinar haciendo referencia a la información almacenada que asocia únicamente cada código de barras espacial con una localización de un punto de la micromatriz. De esta manera, sondas de captura específicas y analitos capturados se asocian con localizaciones especificas en la micromatriz de puntos. Cada localización de un punto de la micromatriz representa una posición con relación a un punto de referencia de coordenadas (p. ej., una localización de la micromatriz, un marcador fiduciario) para la micromatriz. Según esto, cada localización de un punto tiene una "dirección o localización en el espacio de coordenadas de la micromatriz.
Algunos flujos de trabajo de análisis espacial ejemplares se describen en la sección de Realizaciones Ejemplares del 5 documento WO 2020/176788 y/o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2020/0277663. Véase, por 5 ejemplo, la Realización ejemplar que empieza con "En algunos ejemplos no limitativos de los flujos de trabajo descritos en este documento, la muestras se puede sumergir...” del documento WO 2020/176788 y/o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2020/0277663. Véanse además, p. ej.. the Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits User Guide (p. ej. Rev C, fechada en junio de 2020).
En algunas realizaciones, el análisis espacial se puede realizar usandohardwarey/osoftwareespecializado, tal como cualquiera de los sistemas descritos en las Secciones (I I)(e)(i) y/o (V) del documento WO 2020/176788 y/o la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N A 0 2020/0277663, o cualquiera de uno o más de los dispositivos o métodos descritos en las SeccionesControl Slide for Imaging. Methods of Using Control Slides and Substrates for Systems of Using Control Slides and Substrates for Imaging yio Sample and Array Alignment Devices and Methods, Informational labelsdel documento WO 2020/123320.
Sistemas adecuados para realizar un análisis espacial pueden incluir componentes tales como una cámara (p, s) una celdilla de flujo o una cámara hermética a los fluidos sellable) para contener una muestra biológica. La muestra biológica se puede montar, por ejemplo, en un soporte para muestras biológicas. Una o más cámaras para fluido pueden estar conectadas a la cámara y/o al soporte para muestras a través de conductos para fluidos, y se pueden aportar fluidos a la cámara y/o el soporte para muestras a través de bombas fluídicas, fuentes de vacío u otros dispositivos acoplados a los conductos para fluidos que crean un gradiente de presión para activar un flujo de fluido. Una o más válvulas también pueden estar conectadas a los conductos para fluidos para regular el flujo de reactivos desde depósitos hasta la cámara y/o el soporte para muestras.
Los sistemas pueden incluir opcionalmente una unidad de control que incluye uno o más procesadores electrónicos, una interfaz de entrada, una interfaz de salida (tal como una pantalla) y una unidad de almacenamiento (p, phi) un medio de almacenamiento en estado sólido tal como, pero no limitado a, un medio de almacenamiento escribible y/o reescribible persistente, magnético, óptico o en otro estado sólido). La unidad de control puede estar conectada opcionalmente a uno o más dispositivos remotos a través de una red. La unidad de control (y sus componente) puede realizar generalmente cualquiera de las etapas y funciones descritas en este documento. Cuando el sistema está conectado a un dispositivo remoto, el dispositivo (o los dispositivos) remoto puede realizar cualquiera de las etapas y funciones descritas en este documento. Los sistemas pueden incluir opcionalmente uno o más detectores (p. ej., CCD, CMOS) usados para capturar imágenes. Los sistemas también pueden incluir opcionalmente una o más fuentes de luz (p. ej. basadas en LED, basadas en diodos, láseres) para iluminar una muestra, un sustrato con puntos, analitos procedentes de una muestra biológica capturados sobre un sustrato, y diversos medios de control y calibración.
Los sistemas pueden incluir opcionalmente instrucciones desoftwarecodificadas y/o desarrolladas en uno o más medios de almacenamiento tangibles y componentes dehardwaretales como circuitos integrados específicos de la aplicación. Las instrucciones desoftware,cuando son ejecutadas por una unidad de control (y en particular, un procesador electrónico) o un circuito integrado, pueden hacer que la unidad de control, el circuito integrado u otro componente ejecute las instrucciones desoftwarepara realizar cualquiera de las etapas o funciones del método descritas en este documento.
En algunos casos, los sistemas descritos en este documento pueden detectar (p, e) registrar una imagen) la muestra biológica sobre la micromatriz. Métodos ejemplares para detectar la muestra biológica sobre una micromatriz se describen en la Solicitud PCT N°2020/061064 y/o la Solicitud de Patente de EE. UU. N° de Serie 16/951.854.
Antes de transferir analitos desde la muestra biológica a la micromatriz de puntos sobre el sustrato, la muestra biológica se puede alinear con la micromatriz. El alineamiento de una muestra biológica y una micromatriz de puntos que incluye sondas de captura puede facilitar el análisis espacial, lo que se puede usar para detectar diferencias en la presencia y/o el nivel de analito dentro de diferentes posiciones en la muestra biológica, por ejemplo, para generar un mapa tridimensional de la presencia y/o el nivel de analito. Métodos ejemplares para generar un mapa bi- y/o tridimensional de la presencia y/o el nivel de analito se describen en la Solicitud PCT N° 2020/053655 y métodos de análisis espacial se describen generalmente en el documento WO 2020/061108 y/o la Solicitud de Patente de EE. UU. N° de Serie 16/951.864.
En algunos casos, un mapa de la presencia y/o el nivel de analito se puede alinear con una imagen de una muestra biológica usando uno o más marcadores fiduciarios, p. ej., objetos colocados en el campo de visión de un sistema de obtención de imágenes que aparecen en la imagen producida, según se describe en la sección Substrate Attributes, la sección Control Slide for Imaging Section del documento WO 2020/123320, la Solicitud T * N deg 2020/061066 y/o la Solicitud de Patente de EE. UU. N° de Serie 16/951.843. Los marcadores fiduciarios se pueden usar como un punto de referencia o una escala de medida para el alineamiento (p. ej., para alinear una muestra y una micromatriz, para alinear dos sustratos, para determinar una localización de una muestra o micromatriz sobre un sustrato con relación a un marcador fiduciario) y/o para mediciones cuantitativas de tamaños y/o distancias.
II. Eliminación de ARN elegido como diana
La eliminación de ARN elegido como diana permite la eliminación o retirada de una o más especies de moléculas de ARN no deseable (p. ej., ARN ribosómico y/o ARN mitocondrial), reduciendo de ese modo la reserva y la concentración de moléculas de ARN no deseable en la muestra que podrían interferir con la detección de dianas deseadas (p. ej.. detección de ARNm). Para conseguir la eliminación, se diseñan una o más sondas que se hibridan a una o más moléculas de ARN no deseable. Por ejemplo, en una realización, se pueden administrar sondas a una muestra biológica que se hibridan selectivamente a ARN ribosómico (ARNr), reduciendo de ese modo la reserva y la concentración de ARNr en la muestra. En una realización, se pueden administrar sondas a una muestra biológica que se hibridan selectivamente a ARN mitocondrial (ARNmt), reduciendo de ese modo la reserva y la concentración de ARNmt en la muestra. La aplicación posterior o coincidente de sondas de captura a la muestra puede dar como resultado una captura mejorada de otros tipos de ARN debido a una reducción en el ARN no deseable (p. ej., ARN seleccionado a la baja) presente en la muestra.
Un ejemplo no limitativo de un método para identificar una localización de un analito (p. ej., cualquiera de los analitos descritos en este documento) en una muestra biológica usando eliminación de ARN elegido como diana incluye: (a) poner en contacto la muestra biológica con una pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable (p. ej. cualquiera de las sondas de eliminación de ARN no deseable descritas en este documento), donde una sonda de eliminación de ARN no deseable en la pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable es sustancialmente complementaria a toda o una porción de la secuencia de una molécula de ARN no deseable ( p.ej., cualquiera de las moléculas de ARN no deseable descritas en este documento) en la muestra biológica: (b) hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable al ARN no deseable ( p .e). usando cualquiera de los métodos para hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable al ARN no deseable descritos en este documento); (c) retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable - ARN no deseable (p, ej., usando cualquiera de los métodos para retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable descritos en este documento): (d) poner en contacto la muestra biológica con un sustrato (p.ej., cualquiera de los sustratos descritos en este documento) que comprende una pluralidad de sondas de captura (p. ej., cualquiera de las sondas de captura descritas en este documento) enlazadas, donde una sonda de captura de la pluralidad incluye (i) el código de barras espacial (p. ej., cualquier código de barras espacial descrito en este documento) y (ii) un dominio de captura (p, p) , cualquiera de los dominios de captura descritos en este documento) que se une específicamente a una secuencia presente en el analito, (e) extender un extremo 3' de la sonda de captura usando el analito que está unido específicamente al dominio de captura como una plantilla para generar una sonda de captura extendida; y(t) amplificar (p.ej., usando cualquiera de los métodos para amplificación descritos en este documento) la sonda de captura extendida para producir un ácido nucleico.
Un ejemplo no limitativo de un método para identificar una localización de un analito en una muestra biológica usando ligación con plantilla de ARN y eliminación de ARN elegido como diana incluye: (a) poner en contacto una muestra biológica con un primer oligonucleótido de sondeo, un segundo oligonucleótido de sondeo y una pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable, donde el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo son sustancialmente complementarios a secuencias adyacentes del analito, donde el segundo oligonucleótido de sondeo incluye un dominio de unión a sondas de captura que puede unirse a un dominio de captura de una sonda de captura, y donde una sonda de eliminación de ARN no deseable de la pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable es sustancialmente complementaria a una secuencia de una molécula de ARN no deseable en la muestra biológica (b) hibridar el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo al analito; (c) hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable a la molécula de ARN no deseable; (d) ligar el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo, creando de ese modo una sonda ligada que es sustancialmente complementaria al analito; (e) retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable y liberar la sonda ligada del analito; (f) hibridar el dominio de unión a sondas de captura de la sonda ligada a un dominio de captura de una sonda de captura que está fijada al sustrato; y (g) determinar (i) toda o una parte de la secuencia de la sonda ligada unida específicamente al dominio de captura, o uno de sus complementos, y (ii) toda o una parte de la secuencia del código de barras espacial, o uno de sus complementos, y usar la secuencia determinada de (i) y (ii) para identificar la localización del analito en la muestra biológica.
Un ejemplo no limitativo de los métodos descritos en este documento que usa sondas de eliminación de ARN no deseable se muestra en la FIG. 7. Una muestra biológica se pone en contacto con sondas 701 de eliminación de ARN 40 no deseable (p. ej., sondas de eliminación ribosómica) donde las sondas de eliminación de ARN no deseable se hibridan 703 a una molécula 702 de ARN no deseable (p. ej., ARNr). Las sondas de eliminación de ARN se pueden ligar entre sí, o no ligarse entre sí. El ARN no deseable que está unido a la sonda de eliminación de ARN no deseable se digieren enzimáticamente 704 usando ARNasa H 705. El tratamiento con ARNasa H da como resultado ARN no deseable digerido 706. En algunas realizaciones, cuando las sondas de eliminación de ARN se combinan con ligación con plantilla 45 de ARN, el método descrito en la FIG. 7 se puede producir antes de o coincidentemente con la hibridación con sondas de RTL (p. ej., sondas de RHS y LHS) y la reacción de ligación con el ARNm diana. La digestión con ARNasa H del ARN de los híbridos de ARN: ADN del método de eliminación de ARN se puede producir coincidentemente con la del ARNm de los híbridos de ARNm diana: sonda de ADN diana creados para la reacción de ligación con plantilla de ARN. En algunas realizaciones, los métodos descritos en la FIG. 7 también pueden realizarse en cualquier metodología de 50 análisis espacial que se beneficie de la retirada de especies de ARN no deseable. Por ejemplo, la eliminación de ARN que se describe en este documento también se podría usar junto con la captura directa de ARNm por la sonda de captura.
Tras la eliminación del ARN no deseable, la muestra contendrá una población enriquecida de la diana de ARN de interés 55 (p. ej., una diana de ARNm). En algunas realizaciones, el ARN no deseable comprende menos de 20%, 19%, 18%, 17%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11% 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1%, o cualquiera de sus intervalos, del ARN total en la muestra después de la eliminación del ARN no deseable (es decir, menos de 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1%, o cualquiera de sus intervalos, en comparación con una muestra que no sufre la etapa de eliminación). Por consiguiente, la población enriquecida de la 60 diana de ARN de interés puede comprender al menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% u 80%, o cualquiera de sus intervalos, del ARN total en la muestra.
(a) Molécula o moléculas de ARN no deseable
Según se usa en este documento, el término "molécula de ARN no deseable" o "ARN no deseable" se refiere a un ARN no deseado que es la diana para la eliminación desde la muestra biológica. En algunas realizaciones, ejemplos del ARN no deseable incluyen, pero no se limitan a, ARN mensajero (ARNm), ARN ribosómico (ARNr), ARN mitocondrial (ARNmt), ARN de transferencia (ARNt), microARN (miARN) y ARN viral. En algunas realizaciones, el ARN no deseable puede ser un transcrito (p. ej., presente en una sección tisular).
En algunas realizaciones, la molécula de ARN no deseable incluye ARN ribosómico (ARNr) 5,8S, ARNr 5S, ARN de transferencia (ARNt), microARN (miARN), un ARN nucleolar pequeño (ARNsno), ARN de interacción con Piwi (ARNpi), ARN pequeño derivado de ARNt (ARNts) y ARN derivado de ARNr pequeño (ARNsr), o ARN mitocondrial (ARNmt). En algunas realizaciones, la molécula de ARN no deseable incluye una molécula de ARN que se añade (p. ej., se transfecta) a una muestra (p. ej., un ARN interferente pequeño (ARNsi)). El ARN no deseable puede ser ARN bicatenario o ARN monocatenario. En realizaciones en las que el ARN no deseable es bicatenario, se procesa como un ARN monocatenario antes de la eliminación. En algunas realizaciones, el ARN no deseable puede ser ARN circular. En 15 algunas realizaciones, el ARN no deseable puede ser un ARNr bacteriano (p. ej., ARNr 16s o ARNr 23s). En algunas realizaciones, el ARN no deseable es de E. coli.
En algunas realizaciones, la molécula de ARN no deseable es ARNr. En algunas realizaciones, el ARNr es ARNr eucariótico. En algunas realizaciones, el ARNr es ARNr citoplásmico. En algunas realizaciones, el ARNr es ARNr mitocondrial. ARNr citoplásmicos incluyen, por ejemplo, ARNr 28S, 5,8S, 5S y 18S. ARNr mitocondriales incluyen, por ejemplo, ARNr 12S y 16S. El ARNr también puede ser ARNr procariótico, que incluye, por ejemplo, ARNr 5S, 16S y 23S. Las secuencias para los ARNr son muy conocidas por los expertos en la técnica y se pueden encontrar fácilmente en bases de datos de secuencias tales como GenBank o se pueden encontrar en la bibliografía. Por ejemplo, la 5 secuencia del ARNr 18S humano se puede encontrar en GenBank como el N° de Registro M10098 y el ARNr 28S 2 humano como el N° de Registro M11167.
En algunas realizaciones, la molécula de ARN no deseable es ARN mitocondrial. ARN mitocondriales incluyen, por ejemplo, ARNr 12S (codificado por MT-RNR1) y ARNr 16S (codificado por MT-RNR2), ARN que codifican proteínas de la cadena de transporte de electrones (p. ej., NADH deshidrogenasa, coenzima Q-citocromo c reductasa / citocromo b citocromo c oxidasa, ATP sintasa o humanina), y ARNt (codificados por MT-TA, MT-TR, MT-TN, MT-TD, MT-TC, MT-TE, MT-TQ, MT-TG, MT-TH, MT-TI, MT-TL1, MT-TL2, MT-TK, MT-TM, MT-TF, MT-TP, MT- TS1, MT-TS2, MT-TT, MT-TW, MT-TY o MT-TV).
En algunas realizaciones, la molécula de ARN no deseable es ARN de transferencia (ARNt). En algunas realizaciones, el ARN no deseable puede ser un ARNm particular. Por ejemplo, puede ser deseable retirar transcritos celulares que habitualmente están presentes en abundancia. Así, el ARNm no deseable puede incluir, pero no se limita a, ACTB, GAPDH y TUBB. Otras secuencias para ARNt y ARNm específico son bien conocidas por los expertos en la técnica y se pueden encontrar fácilmente en bases de datos de secuencias tales como GenBank o se pueden encontrar en la bibliografía.
En algunas realizaciones, el ARNm no es la diana para la eliminación por sondas de ARN no deseable. En algunas realizaciones, una o más sondas de eliminación de ARN no deseable no tienen una poli-dT que se hibride a la cola de poli-A de ARNm eucariótico. En otra realización particular más, la sonda de eliminación de ARN no deseable elige como diana y se hibrida específicamente a ARNr 18S humano o 28S humano. Ejemplos de la secuencia de sondas de 45 eliminación de ARN no deseable que eligen como diana la secuencia de longitud completa de ARNr 18S humano y 28S humano se ilustran, p. ej., en la Publ. Sol. EE. UU. N°2011/0111409 Al.
En algunas realizaciones, la una o más moléculas de ARN no deseable son una sola especie de ARN. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la una o más moléculas de ARN no deseable se hibridan solo a moléculas de ARN ribosómico. En algunas realizaciones, la una o más moléculas de ARN no deseable se hibridan solo a moléculas de ARN mitocondrial. En algunas realizaciones, la molécula de ARN no deseable puede ser una combinación de dos o más especies de ARN. En algunas realizaciones, la molécula de ARN no deseable es un fragmento de ARN de una de las moléculas de ARN no deseable descritas en este documento. En algunas realizaciones, la molécula de ARN no deseable es una molécula de ARN de longitud completa de una de las moléculas de ARN no deseable descritas en este documento.
(b) Diseño de sondas de eliminación de ARN no deseable
En algunas realizaciones, la una o más sondas de eliminación de ARN no deseable son una sonda de ADN. En algunas realizaciones, la sonda de ADN incluye un oligonucleótido de ADN monocatenario que tiene una secuencia parcial o completamente complementaria a un ARN no deseable y se hibrida específicamente al ARN no deseable.
En algunas realizaciones, la una o más sondas de eliminación de ARN no deseable son al menos 70%, al menos 75%, al menos 80% al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al 5 menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% complementarias a una o más moléculas de ARN no 6 deseable. En algunas realizaciones, la una o más sondas de eliminación de ARN no deseable son 100% (es decir, E2172415816-11-202318 completamente) complementarias a una o más moléculas de ARN no deseable. En algunas realizaciones, las sondas usadas en este documento se han descrito en Morían y cois., PLoS One. 2012;7(8): e42882. En algunas realizaciones, las sondas usadas en este documento se han descrito en la Publ. Sol. EE. UU. N° 2011/0111409. En algunas realizaciones, las sondas usadas en este documento se han descrito en Adiconis y 5 cols., Nat Methods. julio de 2013; 10(7):623-9.
La sonda de ADN se puede producir mediante técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una sonda de ADN se produce mediante síntesis química, mediante expresión in vitro a partir de moléculas de ácido nucleico recombinantes o mediante expresión in vivo a partir de moléculas de ácido nucleico recombinantes. La sonda 10 de eliminación de ARN no deseable también se puede producir mediante la amplificación del ARN no deseable, p. ej., RT-PCR, PCR asimétrica o amplificación en círculo rodante.
En algunas realizaciones, los métodos de eliminación de ARN elegido como diana que se divulgan en este documento incluyen múltiples sondas de eliminación de ARN no deseable. En algunas realizaciones, las sondas de eliminación de 15 ARN no deseable incluyen secuencias que son complementarias o sustancialmente complementarias a una o más moléculas de ARN no deseable. Los métodos proporcionados en este documento se pueden aplicar a una sola molécula de ARN no deseable o a una pluralidad de moléculas de ARN no deseable.
En algunas realizaciones, la sonda de eliminación de ARN no deseable tiene una longitud de aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, aproximadamente 40, aproximadamente 40, aproximadamente 41, aproximadamente 42, aproximadamente 43, aproximadamente 44, aproximadamente 45, aproximadamente 46, aproximadamente 47, aproximadamente 48, aproximadamente 49, aproximadamente 50, aproximadamente 51, aproximadamente 52 aproximadamente 53, aproximadamente 54, aproximadamente 55, aproximadamente 56, aproximadamente 57, aproximadamente 58, aproximadamente 59, aproximadamente 60, aproximadamente 61, aproximadamente 62, aproximadamente 63, aproximadamente 64, aproximadamente 65, aproximadamente 66, aproximadamente 67, aproximadamente 68, aproximadamente 69, aproximadamente 70, aproximadamente 71, aproximadamente 72, aproximadamente 73, aproximadamente 74, aproximadamente 75, aproximadamente 76, aproximadamente 77, aproximadamente 78, aproximadamente 79, aproximadamente 80, aproximadamente 81, aproximadamente 82, aproximadamente 83, aproximadamente 84, aproximadamente 85, aproximadamente 86, aproximadamente 87, aproximadamente 88, aproximadamente 89, aproximadamente 90, aproximadamente 91, aproximadamente 92, aproximadamente 93, aproximadamente 94, aproximadamente 95, aproximadamente 96, aproximadamente 97, aproximadamente 98, aproximadamente 99, aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 800, aproximadamente 900, aproximadamente 1000, aproximadamente 1500, aproximadamente 2000, aproximadamente 3000, aproximadamente 4000 o aproximadamente 5000 nucleótidos.
En algunas realizaciones, una sola sonda de eliminación de ARN no deseable abarca toda la longitud del ARN no deseable. En algunas realizaciones, la sonda de eliminación de ARN no deseable tiene regiones que no son complementarias a un ARN no deseable, siempre que estas secuencias no afecten sustancialmente a la hibridación específica de la sonda de eliminación de ARN no deseable al ARN no deseable.
En algunas realizaciones, las sondas 45 de eliminación no son contiguas, de modo que aunque se puedan hibridar colectivamente a través de una longitud del ARN no deseable, pueden existir huecos entre las sondas de eliminación individuales. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las sondas de eliminación de ARN que eligen como diana un ARN no deseable están espaciadas al menos uno, al menos dos, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 50, al menos 60 nucleótidos a lo largo de la longitud del ARN no deseable. Como tales, puede haber una pluralidad de sondas de eliminación de ARN que se hibriden adyacentes a, o no contiguas, entre sí a lo largo de la longitud, o parcialmente a lo largo de la longitud, de la molécula de ARN no deseable.
En algunas realizaciones, la sonda de eliminación de ARN no deseable se asocia con (p. ej., se conjuga a) una etiqueta detectable, una etiqueta óptica y/o una etiqueta como la descrita en este documento. En algunos casos, la etiqueta 55 detectable es un radioisótopo, un resto fluorescente o quimioluminiscente, con una enzima o un ligando, que se puede usar para la detección o confirmación de que la sonda se ha hibridado a la secuencia diana. La etiqueta detectable puede ser directamente detectable por sí misma (p. ej., etiquetas radioisotópicas o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede ser indirectamente detectable, p. ej., al catalizar alteraciones químicas de un compuesto o una composición de sustrato químico, compuesto o composición de sustrato químico que es directamente 60 detectable. La etiqueta detectable se puede detectar cualitativamente (p. ej., ópticamente o espectralmente), o se puede cuantificar usando métodos conocidos en la técnica y/o divulgados en este documento.
En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en este documento incluyen una reserva de dos o más sondas de eliminación de ARN no deseable. En algunas realizaciones, la reserva de sondas de eliminación de ARN no deseable 65 incluye aproximadamente 100 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 300 nM, aproximadamente 400 nM, aproximadamente 500 nM, aproximadamente 600 nM, aproximadamente 700 nM, aproximadamente 800 nM, aproximadamente 900 nM o aproximadamente 1000 nM de cada sonda de eliminación de ARN. En algunas realizaciones, la reserva de sondas de eliminación de ARN no deseable incluye aproximadamente 1 qM, aproximadamente 2 qM, aproximadamente 3 qM, aproximadamente 4 qM, aproximadamente 5 qM, aproximadamente 6 qM, aproximadamente 7 qM, aproximadamente 8 qM, aproximadamente 9 qM o aproximadamente 10 qM, o más, de 5 cada sonda de eliminación de ARN. En algunas realizaciones, la concentración de una sonda de eliminación de ARN en una reserva de sondas de eliminación de ARN depende de la abundancia relativa del ARN no deseable elegido como diana por la sonda de eliminación de ARN específica. Por ejemplo, los transcritos ribosómicos 18S y 28S pueden ser muy abundantes en una muestra tisular. En este caso, las sondas de eliminación de ARN que eligen como diana 18S y/o 28S pueden estar presentes en la reserva de sondas de eliminación de ARN no deseable a una concentración 10 superior que otras sondas de eliminación de ARN presentes en la reserva.
En algunas realizaciones, una sonda de eliminación de ARN incluye una secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NOs: 1-195. En algunas realizaciones, una reserva de sondas de eliminación de ARN incluye dos o más sondas cada una de las cuales tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NOs: 151-195.
(c) Hibridación de una sonda de eliminación de ARN no deseable a la molécula de ARN no deseable. En algunas realizaciones, una o más sondas de eliminación de ARN no deseable se hibridan a un ARN no deseable. En algunas realizaciones, una o más sondas de eliminación de ARN no deseable se hibridan a una o más porciones de la secuencia de la molécula de ARN no deseable. En algunas realizaciones, una o más sondas de eliminación de ARN no 20 deseable se hibridan a la secuencia completa de la molécula de ARN no deseable. La hibridación se puede producir en un ARN no deseable que tiene una secuencia que es 100% complementaria al oligonucleótido o los oligonucleótidos de sondeo. En algunas realizaciones, la hibridación se puede producir en una diana que tiene una secuencia que es al menos (p. ej., al menos aproximadamente) 80%, al menos (p. ej., al menos aproximadamente) 85%, al menos (p. ej., al menos aproximadamente) 90%, al menos (p. ej., al menos aproximadamente) 95%, al menos (p. ej., al menos 25 aproximadamente) 96%, al menos (p. ej., al menos aproximadamente) 97%, al menos (p. ej., al menos aproximadamente) 98% o al menos (p. ej., al menos aproximadamente) 99% complementaria al oligonucleótido o los oligonucleótidos de sondeo.
En algunas realizaciones, la sonda de eliminación de ARN no deseable puede ser complementaria a toda o parte de una secuencia de ARN no deseable y, por lo tanto, puede haber más de una sonda de ARN no deseable que se hibride específicamente al ARN no deseable. Por ejemplo, puede haber al menos l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sondas de eliminación de ARN no deseable que se hibriden específicamente a un ARN no deseable. En algunas realizaciones, el ARN no deseable tiene una estructura terciaria y la sonda de eliminación de ARN no deseable puede ser complementaria a una porción expuesta de la secuencia de ARN no deseable.
En algunas realizaciones, una o más sondas de eliminación de ARN no deseable se pueden hibridar al ARN no deseable de modo que al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% de la secuencia completa del ARN no deseable sea hibridado por las sondas de eliminación de ARN no deseable.
En algunas realizaciones, al menos una sonda de eliminación de ARN no deseable se hibrida específicamente sustancialmente a toda la secuencia de longitud completa del ARN no deseable. Según se usa en este documento, "sustancialmente toda la secuencia de longitud completa" se refiere a menos de 100% pero al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, o cualquiera de sus intervalos, de la secuencia de longitud completa. En algunas realizaciones, una multiplicidad de sondas de eliminación de ARN no deseable se une específicamente sustancialmente a toda la secuencia de longitud completa del ARN diana. En otra realización, una multiplicidad de sondas de ADN se une específicamente a toda la secuencia de longitud completa, o sus porciones, del ARN diana, bien adyacentes o bien de manera no contigua.
En algunas realizaciones, la sonda de eliminación de ARN no deseable se hibrida específicamente a la molécula de ARN no deseable y crea un híbrido de ARN: ADN. Según se usa en este documento, "se hibrida específicamente" se 55 refiere a un estado en el que una sonda de ADN específica se puede hibridar con un ARN diana, por ejemplo, ARNr, a lo largo de otros ácidos nucleicos presentes en una muestra de ácido nucleico. En algunos casos, la sonda de ADN se desnaturaliza en primer lugar en ADN monocatenario mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, al calentar o bajo condiciones alcalinas, y a continuación se hibrida al ARN diana mediante métodos también conocidos en la técnica, por ejemplo, al enfriar el ADN calentado en presencia del ARN diana. En algunos casos, la sonda de ADN bicatenario se calienta para conseguir la desnaturalización hasta una sola cadena antes de ser añadido a la muestra biológica. En algunos casos, la sonda de ADN se produce como una molécula de ADN monocatenario, en la que no se requeriría desnaturalización. La condición bajo la que una sonda de ADN se hibrida específicamente con un ARN son muy conocidas por los expertos normales en la técnica y se apreciará que estas condiciones pueden variar dependiendo de factores que incluyen el contenido de GC y la longitud de la sonda, la temperatura de hibridación, la composición del 65 reactivo o la solución de hibridación y el grado de especificidad de hibridación buscado.
En algunas realizaciones, el híbrido de ARN: ADN se elimina a continuación de la muestra de ácido nucleico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se usa una ribonucleasa (ARNasa) que elige como diana específicamente híbridos de ARN: ADN para eliminar el híbrido de ARN: ADN. En algunas realizaciones, se usa ARNasa H para hidrolizar específicamente el ARN en el híbrido de ARN: ADN de modo que el ARN se degrade. El ADN restante está entonces disponible para hibridarse con otra secuencia de ARN no deseable.
En algunos casos, después de que se cree el híbrido de ARN: ADN, no se adoptan etapas adicionales para retirar el híbrido (p. ej., no se produce digestión con ribonucleasa según se describe posteriormente). Así, en algunos casos, la hibridación sirve para "bloquear" la asociación de (p. ej., inhibir la unión de) moléculas de ARN no deseable (p. ej., ARNr) monocatenario con secuencias de sondeo que eligen como diana, p. ej., colas de poli(A) u otras dianas de interés. Según esto, en algunos aspectos, los métodos de detección espacial divulgados en este documento se producen en presencia del híbrido de ARN: ADN. En casos en los que el híbrido de ARN: ADN se crea pero no se retira, la detección de moléculas de ARN de interés se incrementa con relación a un contexto en el que no se cree híbrido. En algunos casos, la detección de moléculas de ARN diana de interés se incrementa en aproximadamente 5%, en 15 aproximadamente 10%, en aproximadamente 15%, en aproximadamente 20%, en aproximadamente 25%, en aproximadamente 30%, en aproximadamente 35%, en aproximadamente 40%, en aproximadamente 45%, en aproximadamente 50%, en aproximadamente 55%, en aproximadamente 60%, en aproximadamente 65%, en aproximadamente 70%, en aproximadamente 75 %, en aproximadamente 80%, en aproximadamente 85%, en aproximadamente 90%, en aproximadamente 95%, en aproximadamente 1,5 veces, en aproximadamente 2,0 veces, en 20 aproximadamente 2,5 veces, en aproximadamente 3,0 veces, en aproximadamente 3,5 veces, en aproximadamente 4,0 veces, en aproximadamente 4,5 veces, en aproximadamente 5,0 veces, en aproximadamente 6 veces, en aproximadamente 7 veces, en aproximadamente 8 veces, en aproximadamente 9 veces, en aproximadamente 10 veces, o más en comparación con un contexto en el que no se cree híbrido.
(d) Retirada de la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable.
(i) Digestión con ribonucleasa
En algunas realizaciones, el complejo de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable se retira. En algunas realizaciones, la etapa de retirada incluye la adición de ARNasa H. En algunas realizaciones, la etapa de retirada incluye poner en contacto la sonda de eliminación de ARN no deseable con una ribonucleasa (p. ej. ARNasa H). En algunas realizaciones, la ribonucleasa es una endorribonucleasa. En algunas realizaciones (p. ej., en el contexto de ligación con plantilla de ARN), también se usa una endorribonucleasa para liberar la sonda del analito. En algunas realizaciones, la endorribonucleasa es una o más de ARNasa H, ARNasa A, ARNasa C o ARNasa I, o cualesquiera de sus combinaciones. En algunas realizaciones, la endorribonucleasa es ARNasa H. En algunas realizaciones, la ARNasa H es ARNasa H1, ARNasa H2, o cualesquiera de sus combinaciones. En algunas realizaciones, la ARNasa H es una ARNasa H termoestable. La ARNasa H termoestable se puede obtener comercialmente, incluyendo, por ejemplo, HybridaseTM (Lucigen, Middleton, WI).
En algunas realizaciones, la ARNasa H degrada el ARN de un híbrido de ARN: ADN a un intervalo de temperatura de entre 32°C y 95°C (p. ej., usando una ARNasa H termoestable). En algunas realizaciones, la ARNasa H degrada el ARN de un híbrido de ARN: ADN a un intervalo de temperatura de entre 32°C y 60°C. En algunas realizaciones, la ARNasa H degrada el ARN de un híbrido de ARN: ADN a un intervalo de temperatura de entre 37°C y 60°C. En otra realización más, la ARNasa H degrada el ARN de un híbrido de ARN:ADN a una temperatura de aproximadamente 32°C, aproximadamente 33°C, aproximadamente 34°C, aproximadamente 35°C, aproximadamente 36°C, aproximadamente 37°C, aproximadamente 38°C, aproximadamente 39°C, aproximadamente 40°C, aproximadamente 41°C, aproximadamente 42°C, aproximadamente 43°C, aproximadamente 44°C, aproximadamente 45°C, aproximadamente 46°C, aproximadamente 47°C, aproximadamente 48°C, aproximadamente 49°C, aproximadamente 50°C, aproximadamente 51°C, aproximadamente 52°C, aproximadamente 53°C, aproximadamente 54°C, aproximadamente 5055°C, aproximadamente 56°C, aproximadamente 57°C, aproximadamente 58°C, aproximadamente 59°C, aproximadamente 60°C, aproximadamente 61°C, aproximadamente 62°C, aproximadamente 63°C o aproximadamente 64°C.
En algunas realizaciones, la etapa de hibridación y la degradación de ARN con ARNasa H se repite más de una vez. En algunos casos, la etapa de hibridación y la etapa de degradación de ARN se repite al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, o más. En algunos casos, se realiza una etapa de lavado entre cada etapa usando métodos y soluciones (p. ej., PBS, PBST) divulgados en este documento y conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, la ribonucleasa se puede inactivar mediante un agente de permeabilización, por ejemplo inactivación y permeabilización simultáneas de una muestra biológica. En algunos casos, el agente de permeabilización es uno o más de un disolvente orgánico, un agente de reticulación, un detergente y una enzima conocidos en la técnica. En algunos casos, el agente de permeabilización es una endopeptidasa o proteasa. En algunos casos, la endopeptidasa es pepsina. En algunos casos, la endopeptidasa es proteinasa K. En algunos casos, la ribonucleasa se termoinactiva. Por ejemplo, en algunos casos, la ribonucleasa (p. ej., distinta de la ARNasa H termoestable) se termoinactiva a 65°C.
En algunas realizaciones, sondas de ADN que no se han hibridado con ARN no deseable diana, o sondas que se han liberado después de la degradación con ARNasa H del ARN procedente del híbrido de ARN: ADN, se pueden retirar en diversos estadios del aislamiento de ARN mediante enzimas degradadoras de ADN u otras técnicas bien conocidas en la técnica. En algunas realizaciones, la enzima degradadora de ADN es una exonucleasa que digiere ADN en una dirección 5' a 3'. En algunas realizaciones, la enzima degradadora de ADN no digiere las sondas de captura enlazadas sobre el sustrato. En algunas realizaciones, la enzima degradadora de ADN es una exonucleasa RecJ. Una exonucleasa RecJ degrada ADN monocatenario (ADNss) en la dirección 5'-3' y puede participar en la recombinación homóloga y la reparación de divergencias. En algunos casos, la exonucleasa RecJ se aísla de Escherichia coli. En algunas realizaciones, la enzima degradadora de ADN se puede inactivar mediante un agente de permeabilización divulgado en este documento.
(ii) Retirada de complejo de ARN no deseable-sonda de eliminación
En algunas realizaciones, el complejo de ADN: ARN que incluye una sonda de eliminación de ARN no deseable y un ARN no deseable se retira usando métodos diferentes a la adición de ARNasa H. En algunos casos, la sonda de eliminación de ARN no deseable incluye un resto de captura. Según se divulga en este documento, un resto de captura de la sonda de eliminación de ARN no deseable se fija a (p. ej., se conjuga a) la secuencia de ácido nucleico de la sonda de eliminación de ARN no deseable. En algunas realizaciones, la sonda de eliminación de ARN no deseable incluye uno o más restos de captura. En algunas realizaciones, el resto de captura incluye una etiqueta según se describe en este documento. En algunas realizaciones, la etiqueta se usa para identificar y retirar una sonda de eliminación de ARN no deseable, se hibriden o no a moléculas de ARN no deseable. En algunos casos, usando la etiqueta, la sonda de eliminación de ARN (incluyendo sondas de eliminación de ARN no deseable complejadas con ARN no deseable) se puede aislar y retirar de la muestra biológica. En algunas realizaciones, la etiqueta se asocia directamente con (es decir, se conjuga a) la sonda de eliminación de ARN no deseable. La etiqueta detectable puede ser directamente detectable por sí misma (p. ej., etiquetas radioisotópicas o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede ser indirectamente detectable, p. ej., al catalizar alteraciones químicas de un compuesto o una composición de sustrato químico, compuesto o composición de sustrato químico que es directamente detectable. Las etiquetas detectables pueden ser adecuadas para la detección a pequeña escala y/o adecuadas para el cribado de alto rendimiento. Como tales, las etiquetas detectables incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos, fluoróforos, compuestos quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes y colorantes.
En algunas realizaciones, el resto de captura incluye una micromolécula. En algunas realizaciones, el resto de captura incluye un ácido nucleico. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es monocatenario. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es bicatenario. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ARN. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ADN. En algunas realizaciones, el resto de captura incluye un carbohidrato. En algunas realizaciones, el resto de captura está posicionado 5' con respecto al dominio en la sonda de eliminación de ARN no deseable.
En algunas realizaciones, el resto de captura está en la posición 3' con respecto al dominio en la sonda de eliminación de ARN no deseable. En algunas realizaciones, el agente de unión a restos de captura que se une específicamente al resto de captura incluye 40 una proteína. En algunas realizaciones, la proteína es un anticuerpo. En algunas realizaciones, el agente de unión a restos de captura que se une específicamente al resto de captura comprende un ácido nucleico. En algunas realizaciones, el agente de unión a restos de captura que se une específicamente al resto de captura comprende una micromolécula. En algunas realizaciones, el agente de unión a restos de captura que se une específicamente al resto de captura está enlazado a un sustrato. En algunas realizaciones, el sustrato es una cuenta. En algunas realizaciones, el 45 sustrato es un pocillo. En algunas realizaciones, el sustrato es un portaobjetos. En algunas realizaciones, el sustrato es una cuenta magnética, por ejemplo una partícula paramagnética, de modo que los complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable, o la sonda de eliminación de ARN no deseable sola, se puedan retirar magnéticamente de la muestra biológica, por ejemplo mediante un imán de las tierras raras u otros dispositivos magnéticos.
En algunas realizaciones, el resto de captura es biotina. En algunas realizaciones, una molécula de biotina directamente se asocia con (es decir, se conjuga a) la sonda de eliminación de ARN no deseable en el extremo 3'. En algunas realizaciones, una molécula de biotina directamente se asocia con (es decir, se conjuga a) la sonda de eliminación de ARN no deseable en el extremo 5'. En algunas realizaciones, la molécula de biotina se puede asociar con (p. ej., conjugarse a) una molécula de avidina, permitiendo la inmunoprecipitación (“pulldown”) de los complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable, o la sonda de eliminación de ARN no deseable. En algunas realizaciones, y según se divulga posteriormente, la molécula de biotina se puede asociar con (p. ej., conjugarse a) una molécula de estreptavidina, de modo que los complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable, o la sonda de eliminación de ARN no deseable, conjugados a una molécula de biotina puedan ser capturados 60 por estreptavidina o avidina y eliminados de la muestra biológica.
(e) Ligación con plantilla de ARN (RTL) espacial in situ usando eliminación de ARN elegido como diana
En algunos casos, la sonda de eliminación de ARN no deseable se usa en el contexto de (p. ej., simultáneamente con) 65 la ligación con plantilla de ARN (RTL) espacial in situ. En el contexto de la RTL, la retirada de ARN no deseable se E21724158 16-11-2023 22 puede conseguir coincidentemente. En algunos casos, tanto los oligonucleótidos de sondeo de RTL como las sondas de eliminación de ARN no deseable se pueden añadir al mismo tiempo. Después de la ligación de las sondas de RTL, se añade a la muestra una endonucleasa tal como ARNasa H. La ARNasa H digiere tanto el analito de ARN como el ARN no deseable. En algunos casos, al menos una de las sondas de RTL incluye una secuencia de captura de sondeo tal como una secuencia de poli-A, una secuencia de oligo-d(T) o una sonda de captura particular (en el ámbito del análisis 5 de ARN elegido como diana). Como resultado de este procedimiento, las moléculas de ARN no deseable (p. ej., ARNr; ARNmt) se digieren y así no están disponibles para la interferencia con aplicaciones ulteriores tales como la captura de la sonda de la secuencia de poli-A o uno de sus complementos que se produce durante los métodos basados en micromatrices espaciales divulgados en este documento.
En una característica de la divulgación, se proporcionan métodos para identificar una localización de un analito en una muestra biológica, comprendiendo el método (a) poner en contacto una muestra biológica con un primer oligonucleótido de sondeo, un segundo oligonucleótido de sondeo y una pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable; (b) hibridar el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo al analito; (c) hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable a la molécula de ARN no deseable; (d) ligar el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo, creando de ese modo una sonda ligada que es sustancialmente complementaria al analito; (e) retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable y liberar la sonda ligada del analito; (f) poner en contacto la muestra biológica con un sustrato, donde la sonda de captura está fijada al sustrato, donde la sonda de captura comprende un código de barras espacial y el dominio de captura; (g) permitir que el dominio de unión a sondas de captura de la sonda ligada se una específicamente al dominio de captura; y (h) determinar (i) toda o una parte de la secuencia de la sonda ligada unida específicamente al dominio de captura, o uno de sus complementos, y (ii) toda o una parte de la secuencia del código de barras espacial, o uno de sus complementos, y usar la secuencia determinada de (i) y (ii) para identificar la localización del analito en la muestra biológica.
En algunas realizaciones, los métodos que se divulgan en este documento incluyen la hibridación de uno o más oligonucleótidos de sondeo (p. ej., sondas de RTL) a un analito diana (p. ej., ARN; p. ej., ARNm) de interés. En algunas realizaciones, los métodos incluyen la hibridación de 2, 3, 4 o más oligonucleótidos de sondeo. En algunas realizaciones, los métodos incluyen la hibridación de dos oligonucleótidos de sondeo. En algunas realizaciones, el oligonucleótido de sondeo incluye secuencias que son complementarias o sustancialmente complementarias al analito. Por ejemplo, en algunas realizaciones, cada oligonucleótido de sondeo incluye una secuencia que es complementaria o sustancialmente complementaria a un ARNm de interés (p. ej., a una porción de la secuencia de un ARNm de interés). Los métodos proporcionados en este documento se pueden aplicar a la hibridación de dos o más oligonucleótidos de sondeo a una sola molécula de ácido nucleico.
En algunos casos, una primera secuencia de oligonucleótido de sondeo de un primer oligonucleótido de sondeo de la pluralidad de primeros oligonucleótidos de sondeo puede comprender un primer resto reactivo. Uno o más primeros oligonucleótidos de sondeo de la pluralidad de primeros oligonucleótidos de sondeo puede comprender la misma primera secuencia de oligonucleótido de sondeo y/o la misma segunda secuencia de oligonucleótido de sondeo. Cada uno de la pluralidad de segundos oligonucleótidos de sondeo puede comprender una tercera secuencia de oligonucleótido de sondeo complementaria a la secuencia de una segunda región diana de una molécula de ácido nucleico de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico. La pluralidad de segundos oligonucleótidos de sondeo puede comprender además una cuarta secuencia de oligonucleótido de sondeo. Una tercera secuencia de oligonucleótido de sondeo de un segundo oligonucleótido de sondeo de la pluralidad de segundos oligonucleótidos de sondeo puede comprender un segundo resto reactivo. Uno o más oligonucleótidos de sondeo de los segundos oligonucleótidos de sondeo de la pluralidad de segundos oligonucleótidos de sondeo puede comprender la misma tercera secuencia de oligonucleótido de sondeo y/o, si está presente, la misma cuarta secuencia de oligonucleótido de sondeo. Una primera secuencia de oligonucleótido de sondeo de un primer oligonucleótido de sondeo de la pluralidad de primeros oligonucleótidos de sondeo se puede hibridar a una primera región diana de una molécula de ácido nucleico de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico. Una tercera secuencia de oligonucleótido de sondeo de un segundo oligonucleótido de sondeo de la pluralidad de segundos oligonucleótidos de sondeo se puede hibridar a la segunda región diana de una molécula de ácido nucleico de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico. La primera y la tercera secuencias de oligonucleótido de sondeo hibridadas a la primera y la segunda regiones diana, respectivamente, de una molécula de ácido nucleico de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico pueden ser adyacentes entre sí de modo que un primer resto reactivo de la primera secuencia de oligonucleótido de sondeo sea adyacente a un segundo resto reactivo de la tercera secuencia de oligonucleótido de sondeo. El primer y el segundo restos reactivos del primer y el segundo oligonucleótidos de sondeo hibridados a moléculas de ácido nucleico de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico pueden reaccionar para proporcionar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico empalmadas a oligonucleótidos de sondeo.
En algunas realizaciones, uno de los oligonucleótidos de sondeo incluye una secuencia de poli(A) o uno de sus complementos. En algunos casos, la secuencia de poli(A) o uno de sus complementos está en el extremo 5' de uno de los oligonucleótidos de sondeo. En algunos casos, la secuencia de poli(A) o uno de sus complementos está en el extremo 3' de uno de los oligonucleótidos de sondeo. En algunas realizaciones, un oligonucleótidos de sondeo incluye una secuencia degenerada o UMI. En algunas realizaciones, la secuencia UMI es específica para una diana o grupo de dianas particular. En algunos casos, la secuencia UMI o uno de sus complementos está en el extremo 5' de uno de los oligonucleótidos de sondeo. En algunos casos, la secuencia UMI o uno de sus complementos está en el extremo 3' de 5 uno de los oligonucleótidos de sondeo.
En algunos casos, la primera y la segunda regiones diana de una molécula de ácido nucleico de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico son adyacentes entre sí. En algunas realizaciones, el primero y el segundo oligonucleótidos de sondeo se unen a secuencias complementarias en el mismo transcrito. En algunas realizaciones, las secuencias complementarias a las que se unen el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo están alejadas entre sí l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, 5 aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, 1 aproximadamente 125 o aproximadamente 150 nucleótidos. Los huecos entre los oligonucleótidos de sondeo pueden rellenarse en primer lugar antes de la ligación, usando, por ejemplo, dNTPs en combinación con una polimerasa tal como polimerasa Mu, ADN polimerasa, ARN polimerasa, transcriptasa inversa, polimerasa VENT, polimerasa Taq, y/o cualesquiera de sus combinaciones, derivados y variantes (p. ej., mutantes manipulados). En algunas realizaciones, cuando el primer y el segundo oligonucleótidos de sondeo están separados entre sí por uno o más nucleótidos, se usan desoxirribonucleótidos para extender y ligar el primer y el segundo oligonucleótidos de sondeo.
En algunos casos, el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo se hibridan a un analito en el mismo transcrito. En algunos casos, el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo se hibridan a un analito en el mismo exón. En algunos casos, el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo se hibridan a un analito en diferentes exones. En algunos casos, el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo se hibridan a un analito que es el resultado de un episodio de translocación (p. ej., en el contexto del cáncer). Los métodos proporcionados en este documento hacen posible identificar episodios de empalme, episodios de translocación y mutaciones alternativos que cambian el grado de hibridación de uno o ambos oligonucleótidos de sondeo (p. ej., polimorfismos de un solo nucleótido, inserciones, 30 eliminaciones, mutaciones puntuales).
En algunas realizaciones, la primera y/o la segunda sonda que se divulgan en este documento incluyen al menos dos bases de ácido ribonucleico en el extremo 3'; una secuencia funcional; un nucleótido fosforilado en el extremo 5'; y/o un dominio de unión a sondas de captura. En algunas realizaciones, la secuencia funcional es una secuencia cebadora. El dominio de unión a sondas de captura es una secuencia que es complementaria a un dominio de captura particular presente en una sonda de captura. En algunas realizaciones, el dominio de unión a sondas de captura incluye una secuencia de poli(A). En algunas realizaciones, el dominio de unión a sondas de captura incluye una secuencia de poliuridina, una secuencia de politimidina, o una de sus combinaciones. En algunas realizaciones, el dominio de unión a sondas de captura incluye una secuencia aleatoria (p. ej., un hexámero u octámero aleatorio). En algunas realizaciones, el dominio de unión a sondas de captura es complementario a un dominio de captura en una sonda de captura que detecta una diana o dianas particulares de interés. En algunas realizaciones, se proporciona un resto de bloqueo del dominio de unión a sondas de captura que interactúa con el dominio de unión a sondas de captura. En algunas realizaciones, un resto de bloqueo del dominio de unión a sondas de captura incluye una secuencia que es complementaria o sustancialmente complementaria a un dominio de unión a sondas de captura. En algunas realizaciones, un resto de bloqueo del dominio de unión a sondas de captura evita que el dominio de unión a sondas de captura se una a la sonda de captura cuando esté presente. En algunas realizaciones, un resto de bloqueo del dominio de unión a sondas de captura se retira antes de unir el dominio de unión a sondas de captura (p. ej., presente en una sonda ligada) a una sonda de captura. En algunas realizaciones, un resto de bloqueo del dominio de unión a sondas de captura comprende una secuencia de poliuridina, una secuencia de politimidina, o una de sus combinaciones.
En algunas realizaciones, el primer oligonucleótido de sondeo se hibrida a un analito y un segundo oligonucleótido de sondeo se hibrida a un analito próximo al primer oligonucleótido de sondeo. La hibridación se puede producir en una diana que tiene una secuencia que es 100% complementaria al oligonucleótido o los oligonucleótidos de sondeo. En algunas realizaciones, la hibridación se puede producir en una diana que tiene una secuencia que es al menos (p. ej., al menos aproximadamente) 80%, al menos (p. ej., al menos aproximadamente) 85%, al menos (p. ej., al menos aproximadamente) 90%, al menos (p. ej., al menos aproximadamente) 95%, al menos (p. ej., al menos aproximadamente) 96%, al menos (p. ej., al menos aproximadamente) 97%, al menos (p. ej., al menos aproximadamente) 98% o al menos (p. ej., al menos aproximadamente) 99% complementaria al oligonucleótido o los oligonucleótidos de sondeo. Después de la hibridación, en algunas realizaciones, el primer oligonucleótido de sondeo se extiende. Después de la hibridación, en algunas realizaciones, el segundo oligonucleótido de sondeo se extiende. Por ejemplo, en algunos casos, un primer oligonucleótido de sondeo se hibrida a una secuencia diana aguas arriba para una segunda sonda oligonucleotídica, mientras que en otros casos un primer oligonucleótido de sondeo se hibrida a una secuencia diana aguas abajo de un segundo oligonucleótido de sondeo.
El método divulgado en este documento incluye la adición de sondas de ARN no deseable descritas en este documento. En algunos casos, las sondas de ARN no deseable se añaden al mismo tiempo que el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo.
En algunos casos, las sondas de ARN no deseable se añaden antes que el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo. En algunos casos, las sondas de ARN no deseable se añaden después del primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo.
En algunas realizaciones, los métodos divulgados en este documento incluyen una etapa de lavado después de la hibridación del primer y el segundo oligonucleótidos de sondeo y/o las sondas de ARN no deseable. La etapa de lavado retira cualesquiera oligonucleótidos no unidos y se puede realizar usando cualquier técnica conocida en la técnica. En algunas realizaciones, se usa un tampón de prehibridación para lavar la muestra. En algunas realizaciones, se usa un 10 tampón de fosfato. En algunas realizaciones, se realizan múltiples etapas de lavado para retirar oligonucleótidos no unidos. Por ejemplo, es ventajoso disminuir la cantidad de sondas no hibridadas presentes es una muestra biológica ya que pueden interferir con aplicaciones y métodos ulteriores.
En algunas realizaciones, después de la hibridación de oligonucleótidos de sondeo (p. ej., primer y segundo 15 oligonucleótidos de sondeo) al analito diana, los oligonucleótidos de sondeo (p. ej., el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo) se ligan entre sí, creando una sola sonda ligada que es complementaria al analito diana. La ligación se puede realizar enzimática o químicamente, según se describe en este documento. Por ejemplo, el primer y el segundo oligonucleótidos de sondeo se hibridan a la primera y la segunda regiones diana del analito, y los oligonucleótidos de sondeo se someten a una reacción con ácidos nucleicos para ligarlos entre sí. Por ejemplo, las sondas se pueden someter a una reacción de ligación enzimática usando una ligasa (p. ej., ARN ligasa T4 (Rnl2), una ligasa SplintR o una ADN ligasa T4). Véase, p. ej., Zhang L., y cols.; Archaeal RNA ligase from thermoccocus kodakarensis for template dependent ligation RNA Biol. 2017; 14(1): 36-44 para una descripción de ligasa de KOD.
En algunas realizaciones, se añade trifosfato de adenosina (ATP) durante la reacción de ligación. La selladura catalizada por ADN ligasa de sustratos de ADN mellado se activa en primer lugar a través de hidrólisis de ATP, dando como resultado la adición covalente de un grupo AMP a la enzima. Después de la unión a un sitio mellado en un dúplex de ADN, la ligasa transfiere este AMP al extremo 5 ' fosforilado en la mella, formando un enlace pirofosfato 5’-5’. Finalmente, la ligasa cataliza un ataque sobre este enlace pirofosfato por el grupo OH en el extremo 3' de la mella, sellándola de ese modo, después de lo cual se liberan ligasa y AMP. Si la ligasa se separa del sustrato antes del ataque en 3', p. ej., debido a la recarga prematura con AMP de la enzima, entonces el AMP 5' se deja en el extremo 5', bloqueando intentos de ligación adicionales. En algunos casos, el ATP se añade en una concentración de aproximadamente 1 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 1000 pM o aproximadamente 10000 pM durante de la reacción de ligación.
En algunos casos, cofactores que ayudan en la ligadura de los oligonucleótidos de sondeo se añaden durante el procedimiento de ligación. En algunos casos, los cofactores incluyen iones magnesio (Mg2+). En algunos casos, los cofactores incluyen iones manganeso (Mn2+). En algunos casos, el Mg2 se añade en forma de MgCE En algunos casos, el Mn2+ se añade en forma de MnCl2. En algunos casos, la concentración de MgCh está en aproximadamente 1 mM, en aproximadamente 10 mM, en 1aproximadamente 100 mM o en aproximadamente 1000 mM. En algunos casos, la concentración de MnCl2está en aproximadamente 1 mM, en aproximadamente 10 mM, en aproximadamente 100 mM o en aproximadamente 1000 mM.
En algunas realizaciones, cada uno de los oligonucleótidos de sondeo (p. ej., el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo) puede comprender un resto reactivo de modo que, tras la hibridación a la diana y la exposición a condiciones de ligación apropiadas, los oligonucleótidos de sondeo se puedan ligar entre sí. En algunas realizaciones, oligonucleótidos de sondeo que incluyen un resto reactivo se ligan químicamente. Por ejemplo, un oligonucleótido de sondeo capaz de hibridarse a una primera región diana de una molécula de ácido nucleico puede comprender un primer resto reactivo, y un oligonucleótido de sondeo capaz de hibridarse a una segunda región diana de la molécula de ácido nucleico puede comprender un segundo resto reactivo. Cuando el primer y el segundo oligonucleótidos de sondeo se hibridan a la primera y la segunda regiones diana de la molécula de ácido nucleico, el primer y el segundo restos reactivos pueden ser adyacentes entre sí. Un resto reactivo de una sonda se puede seleccionar del grupo no limitativo que consiste en azidas, alquinos, nitronas (p. ej., 1,3-nitronas), alquenos tensionados (p. ej., trans-cicloalquenos tales como ciclooctenos u oxanorbornadieno), tetrazinas, tetrazoles, yoduros, tioatos (p. ej., fosforotioato), ácidos, aminas y fosfatos. Por ejemplo, el primer resto reactivo de un primer oligonucleótido de sondeo puede comprender un resto azida y un segundo resto reactivo de un segundo oligonucleótido de sondeo puede comprender un resto alquino. El primer y el segundo restos reactivos pueden reaccionar para formar un resto de empalme. Una reacción entre el primer y el segundo restos reactivos puede ser, por ejemplo, una reacción de cicloadición tal como una cicloadición azida-alquino promovida por tensión, una cicloadición azida-alquino catalizada por 60 cobre, una cicloadición alquino-nitrona promovida por tensión, una reacción de Diels-Alder, una cicloadición [3+2], una cicloadición [4+2] o una cicloadición [4+1]; una reacción tiol-eno; una reacción de subestación nucleófila; u otra reacción. En algunos casos, los extremos de las sondas se ligan entre sí usando química clic bioortogonal, que traba eficazmente las sondas alrededor de la diana. Véase Rouhanifard y cols., Nat Biotechnol. 12 de nov. de 2018; 10.1038/nbt.4286. En algunos casos, la reacción entre el primer y segundo restos reactivos puede dar un resto triazol o un resto isoxazolina. Una reacción entre el primer y el segundo restos reactivos puede implicar someter los restos reactivos a condiciones adecuadas tales como una temperatura, un pH o una presión adecuados y proporcionar uno o más reactivos o catalizadores para la reacción. Por ejemplo, una reacción entre el primer y el segundo restos reactivos puede ser catalizada por un catalizador de cobre, un catalizador de rutenio o una especie tensionada tal como un difluorooctino, un dibencilciclooctino o una biarilazaciclooctinona. La reacción entre un primer resto reactivo de un primer oligonucleótido de sondeo hibridado a una primera región diana de la molécula de ácido nucleico y un segundo resto reactivo de un tercer oligonucleótido de sondeo hibridado a una segunda región diana de la molécula de ácido nucleico puede empalmar el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo para proporcionar una sonda ligada. Según esto, la reacción del primer y el segundo restos reactivos puede comprender una reacción de ligación química tal como una reacción química "clic” de azida 5' a alquino 3' catalizada por cobre para formar un empalme de triazol entre dos oligonucleótidos de sondeo. En otros ejemplos no limitativos, un resto yoduro se puede ligar químicamente a un resto fosforotioato para formar un enlace fosforotioato, un ácido se puede ligar a una amina para formar un enlace amida y/o un fosfato y una amina se pueden ligar para formar un enlace fosforamidato.
En algunas realizaciones, después de la ligación del primer y el segundo oligonucleótidos de sondeo para crear una sonda ligada, la sonda ligada se libera del analito. En esta fase del método, (1) la sonda ligada se crea y se hibrida al analito, y (2) la sonda de ARN no deseable se hibrida al ARN no deseable. Para liberar la sonda ligada se libera del analito, se usa una endorribonucleasa. Una endorribonucleasa tal como ARNasa H escinde específicamente ARN en híbridos de ARN: ADN. Así, no solo la ARNasa H escinde la hibridación de la sonda ligada al analito (liberando la sonda ligada), la ARNasa H también escinde el ARN no deseable. En algunas realizaciones, la sonda ligada se libera enzimáticamente. En algunas realizaciones, se usa una endorribonucleasa para liberar la sonda del analito. En algunas realizaciones, la endorribonucleasa es una o más de ARNasa H. En algunas realizaciones, la ARNasa H es ARNasa H1 o ARNasa H2.
En algunas realizaciones, después de crear una sonda ligada a partir de los oligonucleótidos de sondeo (p. ej., un primer oligonucleótido de sondeo y un segundo oligonucleótido de sondeo), la muestra biológica se permeabiliza. En algunas realizaciones, la permeabilización se produce usando una proteasa. En algunas realizaciones, la proteasa es una endopeptidasa. Endopeptidasas que se pueden usar incluyen pero no se limitan a tripsina, quimotripsina, elastasa, termolisina, pepsina, clostripano, glutamil endopeptidasa (GluC), ArgC, peptidil-asp endopeptidasa (ApsN), endopeptidasa LysC y endopeptidasa LysN. En algunas realizaciones, la endopeptidasa es pepsina.
En algunas realizaciones, la sonda ligada incluye un dominio de unión a sondas de captura, que se puede hibridar a una sonda de captura (p. ej., una sonda de captura inmovilizada, directamente o indirectamente, sobre un sustrato). En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en este documento incluyen poner en contacto una muestra biológica con un sustrato, donde la sonda de captura se fija al sustrato (p. ej., se inmoviliza al sustrato, directamente o indirectamente). En algunas realizaciones, la sonda de captura incluye un código de barras espacial y el dominio de captura. En algunas realizaciones, el dominio de unión a sondas de captura de la sonda ligada se une específicamente al dominio de captura. Después de la hibridación de la sonda ligada a la sonda de captura, la sonda ligada se extiende en el extremo 3' para formar una copia de los componentes adicionales (p. ej., el código de barras espacial) de la sonda de captura. En algunas realizaciones, los métodos de captura de sondas ligadas que se proporcionan en este documento incluyen la permeabilización de la muestra biológica de modo que la sonda de captura se pueda hibridar más fácilmente a la sonda ligada capturada (es decir, en comparación con ausencia de permeabilización). En algunas realizaciones, se pueden añadir reactivos de transcripción inversa (RT) a muestras biológicas permeabilizadas. La incubación con reactivos de RT puede producir ADNc de longitud completa con código de barras espacial a partir de los analitos capturados (p. ej., ARNm poliadenilado). Se pueden añadir reactivos de formación de la segunda cadena (p. ej. cebadores de la segunda cadena, enzimas) a la muestra biológica sobre el portaobjetos para iniciar la síntesis de la 45 segunda cadena.
El ADNc resultante se puede desnaturalizar desde la plantilla de la sonda de captura y transferirse (p. ej., a un tubo limpio) para la amplificación, y/o la construcción de una biblioteca según se describe en este documento. El ADNc de longitud completa con código de barras espacial se puede amplificar a través de PCR antes de la construcción de la biblioteca. A continuación, el ADNc se puede fragmentar enzimáticamente y seleccionarse por tamaño a fin de optimizar el tamaño del amplicón de ADNc. Pueden usarse P5, P7, i7 e i5 como índices de muestra, y se puede añadir TruSeq Read 2 a través de reparación de extremos, formación de cola de A, ligación de adaptadores y PCR. A continuación, los fragmentos de ADNc se pueden secuenciar usando secuenciación de extremos apareados usando TruSeq Read 1 y TruSeq Read 2 como sitios cebadores de secuenciación.
En algunas realizaciones, la muestra biológica se pone en contacto con las sondas de eliminación de ARN no deseable y las sondas de RTL (p. ej., el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo) sustancialmente al mismo tiempo. En algunas realizaciones, la muestra biológica se pone en contacto con las sondas de RTL (p. ej., el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo) después de las sondas de eliminación de ARN no deseable.
En algunas realizaciones, la hibridación entre las sondas de RTL (p. ej., el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo) y el analito y la hibridación entre las sondas de eliminación de ARN no deseable al ARN no deseable se produce sustancialmente al mismo tiempo. En algunas realizaciones, la hibridación entre las sondas de RTL (p. ej., el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo) y el analito se produce después de la hibridación entre las sondas de eliminación de ARN no deseable y el ARN no deseable se produce sustancialmente al mismo tiempo.
En algunas realizaciones, la etapa de retirada de la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable y la liberación de la sonda ligada del analito se produce sustancialmente al mismo tiempo.
En algunas realizaciones, la etapa de retirada de la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable se produce antes de la liberación de la sonda ligada del analito.
En algunas realizaciones, las sondas de RTL (p. ej., el primero y el segundo oligonucleótidos de sondeo) y el analito (p. ej., el ARNm diana) se hibridan para formar un híbrido de ARN: ADN sustancialmente al mismo tiempo cuando las sondas de eliminación de ARN no deseable y el ARN no deseable se hibridan para formar un híbrido de ARN: ADN. En algunas realizaciones, una ribonucleasa (p. ej., ARNasa H) digiere las cadenas de ARN de los híbridos de ARN: ADN, donde las cadenas de ARN incluyen el analito y la molécula de ARN no deseable.
Descripciones detalladas de la captura de ARN elegido como diana usando ligación con plantilla de ARN (RTL) se ha divulgado en la Solicitud de EE. UU. N° 62/952.736.
(f) Captura dirigida a la diana de analitos usando hibridación de sondas oligonucleotídicas diana
En algunas realizaciones, se diseñan una o más sondas oligonucleotídicas diana para elegir como diana e hibridarse a una pluralidad de ácidos nucleicos (p. ej., a bibliotecas espaciales preparadas; p. ej., a bibliotecas de ADNc preparadas). En este caso, antes de elegir como diana uno o más ácidos nucleicos diana de interés, en algunas realizaciones, la muestra biológica se pone en contacto en primer lugar con las sondas de eliminación de ARN no deseable que se describen en este documento. En algunas realizaciones, se forma un complejo de sondas de eliminación de ARN no deseable hibridadas a una molécula de ARN no deseable. En algunas realizaciones, una ribonucleasa (p. ej., ARNasa 25 H) digiere las cadenas de ARN de los híbridos de ARN: ADN, donde el ARN se encadena a moléculas de ARN no deseable (p. ej. ARNr).
En algunas realizaciones, se divulgan en este documento métodos para eliminar un ARN no deseado en una muestra biológica e incluyen poner en contacto en primer lugar la muestra biológica con una pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable, donde una sonda de eliminación de ARN no deseable en la pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable es sustancialmente complementaria a una secuencia de una molécula de ARN no deseable en la muestra biológica; hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable al ARN no deseable; y retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable. Después de la retirada de los complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable, se puede buscar la identificación de un analito.
En algunos casos, para crear una biblioteca inespecífica de analitos a partir de una muestra cuyas moléculas de ARN no deseado se eliminaba, los métodos (después de la eliminación de ARN no deseado) incluyen hibridar los analitos a una pluralidad a sondas de captura, cada una de las cuales incluye un código de barras espacial y un dominio de captura que se une específicamente a una secuencia presente en el analito. En algunas realizaciones, la sonda de captura se extiende usando el analito que se une específicamente al dominio de captura como una plantilla para generar una sonda de captura extendida. Después de la producción de la plantilla, el complejo de sonda de captura/analito se puede amplificar para producir una biblioteca de ADNc usando métodos divulgados en este documento.
Después de la eliminación de ARN, se pueden analizar analitos diana particulares. Por ejemplo, en un caso divulgado en este documento, las sondas oligonucleotídicas diana son parte de un "conjunto" que incluye cientos o miles de sondas oligonucleotídicas para ciertos entornos. Por ejemplo, un conjunto de oligonucleótidos puede detectar analitos desregulados durante el cáncer, durante una desregulación inmunitaria, durante el desarrollo neurológico y la progresión de la enfermedad, o actuar en la misma ruta. Conjuntos y oligonucleótidos particulares se divulgan en las Sol. EE. UU. N° 62/970.066, 62/929.686, 62/980.124 y 62/980.116.
En algunos casos, las sondas oligonucleotídicas diana se hibridan a un analito diana, y a continuación se enriquecen selectivamente, p. ej., mediante métodos de amplificación y/o inmunoprecipitación divulgados en este documento. En algunas realizaciones, la sonda oligonucleotídica diana no incluye un resto fijado a la secuencia (es decir, la sonda oligonucleotídica diana es una sonda oligonucleotídica diana desnuda). En algunos casos, las sondas oligonucleotídicas 55 están asociadas con uno o más restos. En algunas realizaciones, el resto es biotina. En algunas realizaciones, una molécula de biotina directamente se asocia con (es decir, se conjuga a) la sonda oligonucleotídica diana en el extremo 3'. En algunas realizaciones, una molécula de biotina directamente se asocia con (es decir, se conjuga a) la sonda oligonucleotídica diana en el extremo 5'. En algunas realizaciones, y según se divulga posteriormente, la molécula de biotina se puede asociar a (p. ej., conjugar a) una molécula de avidina, permitiendo la inmunoprecipitación de un analito. En algunas realizaciones, y según se divulga posteriormente, la molécula de biotina se puede asociar a (p. ej., conjugar a) una molécula de estreptavidina, permitiendo la inmunoprecipitación de un analito. Después de la inmunoprecipitación de los analitos de interés, el analito resultante se puede amplificar, creando una biblioteca de analitos enriquecida. Por "enriquecida", se entiende que existen concentraciones incrementadas de un analito de interés en comparación con una muestra de la misma biblioteca de analitos que no haya sufrido la etapa de inmunoprecipitación.
(g) Métodos de eliminación de ARN elegido como diana
Se proporcionan en este documento métodos para identificar una localización de un analito (p. ej., cualquier analito descrito en este documento) en una muestra biológica que incluyen (a) poner en contacto la muestra biológica con un sustrato que comprende una pluralidad de sondas de captura enlazadas, donde una sonda de captura de la pluralidad comprende (i) el código de barras espacial y (ii) un dominio de captura que se une específicamente a un dominio de captura de la sonda de captura; (b) poner en contacto una muestra biológica con un primer oligonucleótido de sondeo, un segundo oligonucleótido de sondeo y una pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable (p. ej., cualquiera de las sondas de eliminación de ARN no deseable descritas en este documento), donde el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo son sustancialmente complementarios a secuencias adyacentes del analito, donde el segundo oligonucleótido de sondeo comprende un dominio de unión a sondas de captura (p. ej., cualquiera de los dominios de unión a sondas de captura descritos en este documento) que es capaz de unirse a un dominio de captura (p. ej., cualquiera de los dominios de captura descritos en este documento) de una sonda de captura (p. ej., cualquiera de las sondas de captura descritas en este documento), y donde una sonda de eliminación de ARN no deseable de la pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable es sustancialmente complementaria a toda o una porción de la secuencia de una molécula de ARN no deseable (p. ej., cualquiera de las moléculas de ARN no deseable descritas en este documento) en la muestra biológica; (c) hibridar el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo al analito; (d) hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable a la molécula de ARN no deseable (p. ej. usando cualquiera de los métodos para hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable al ARN no deseable descritos en este documento); (e) ligar el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo, creando de ese modo una sonda ligada (p. ej., usando cualquiera de los métodos para ligación descritos en este documento) que es sustancialmente complementaria al analito; (f) retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable (p. ej., usando cualquiera de los métodos para retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable descritos en este documento) y liberar la sonda ligada del analito (p. ej., usando cualquiera de los métodos para liberar la sonda ligada del analito descritos en este documento); (g) dejar que el dominio de unión a sondas de captura de la sonda ligada se una específicamente al dominio de captura; y (h) determinar (i) toda o una parte de la secuencia de la sonda ligada unida específicamente al dominio de captura, o uno de sus complementos, y (ii) toda o una parte de la secuencia del código de barras espacial, o uno de sus complementos, y usar la secuencia determinada de (i) y (ii) para identificar la 0 localización del analito en la muestra biológica.
Se proporcionan en este documento métodos para identificar una localización de un analito (p. ej., cualquier analito descrito en este documento) en una muestra biológica que incluyen (a) poner en contacto la muestra biológica con un sustrato (p. ej., cualquiera de los sustratos descritos en este documento) que comprende una pluralidad de sondas de captura (p. ej., cualquiera de las sondas de captura descritas en este documento) enlazadas, donde una sonda de captura de la pluralidad comprende (i) el código de barras espacial (p. ej., cualquier código de barras espacial descrito en este documento) y (ii) un dominio de captura (p. ej., cualquier dominio de captura descrito en este documento) que se une específicamente a una secuencia presente en el analito; (b) poner en contacto la muestra biológica con una pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable (p. ej., cualquiera de las sondas de eliminación de ARN no deseable descritas en este documento), donde una sonda de eliminación de ARN no deseable en la pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable es sustancialmente complementaria a toda o una porción de la secuencia de una molécula de ARN no deseable (p. ej., cualquiera de las moléculas de ARN no deseable descritas en este documento) en la muestra biológica; (c) hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable al ARN no deseable (p. ej., usando cualquiera de los métodos para hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable al ARN no deseable descritos en este documento); (d) retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable (p. ej., usando cualquiera de los métodos para retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable descritos en este documento); (e) extender un extremo 3' de la sonda de captura usando el analito que se une específicamente al dominio de captura como una plantilla para generar una sonda de captura extendida; y (f) amplificar (p. ej., usando cualquiera de los métodos para amplificación descritos en este documento) la sonda de captura extendida para producir un ácido nucleico.
Se proporcionan en este documento métodos para identificar una localización de un analito (p. ej., cualquier analito descrito en este documento) en una muestra biológica que incluyen (a) poner en contacto la muestra biológica con una pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable (p. ej., cualquiera de las sondas de eliminación de ARN no deseable descritas en este documento), donde una sonda de eliminación de ARN no deseable en la pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable es sustancialmente complementaria a toda o una porción de la secuencia de una molécula de ARN no deseable (p. ej., cualquier molécula de ARN no deseable descrita en este documento) en la muestra biológica; (b) hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable al ARN no deseable (p. ej., usando cualquiera de los métodos para hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable al ARN no deseable descritos en este documento); (c) retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable (p. ej., usando cualquiera de los métodos para retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable descritos en este documento); (d) poner en contacto una pluralidad de ácidos nucleicos con una pluralidad de sondas oligonucleotídicas diana (p. ej., cualquiera de las sondas oligonucleotídicas diana descritas en este documento), donde: un ácido nucleico de la pluralidad de ácidos nucleicos comprende (i) un código de barras espacial (p. ej., cualquier código de barras espacial descrito en este documento) o uno de sus complementos, y (ii) una porción de una secuencia de un analito procedente de una muestra biológica, o uno de sus complementos; y una sonda oligonucleotídica diana de la pluralidad de sondas oligonucleotídicas diana comprende: un dominio que se une específicamente a (i) todo o una porción del código de barras espacial o uno de sus complementos, y/o (ii) toda o una porción de la secuencia del analito procedente de la muestra biológica, o uno de sus complementos, y una etiqueta molecular; (e) enriquecer un complejo de la sonda oligonucleotídica diana unida específicamente al ácido nucleico usando un sustrato que comprende un agente (p. ej., cualquier agente descrito en este documento) que se une específicamente a la etiqueta molecular; y (f) determinar (i) toda o una porción de la secuencia del código de barras espacial o su complemento, y (ii) toda o una porción de la secuencia del analito procedente de la muestra biológica, y usar las secuencias determinadas de (i) y (ii) para identificar la localización del analito en la muestra biológica.
En algunos casos, las sondas de eliminación de ARN no deseable se usan en un entorno en el que se usa una molécula de ADN proteínico como sonda diana. En algunos casos, las sondas de eliminación de ARN no deseable se pueden usar en cualquiera de los métodos de análisis espacial descritos en este documento. Por ejemplo, las sondas de eliminación de ARN no deseable se pueden hibridar a una molécula de ARN no deseable en presencia de un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno que esté asociado con una molécula de ácido nucleico, según se divulga en este documento. En algunos casos, la molécula (p. ej., una molécula de ácido nucleico) que tiene un código de barras (p. ej., un código de barras espacial) puede estar acoplada (p. ej., asociada con; conjugada a) un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno de tal manera que facilite el enlace de la molécula (p. ej., una molécula de ácido nucleico) que tiene un código de barras (p. ej., un código de barras espacial) a una muestra biológica (p. ej., una célula; p. ej., una superficie de una célula) usando el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno. En algunos casos, las sondas de eliminación de ARN no deseable se hibridan a moléculas de ARN no deseable, impidiendo que las moléculas de ARN no deseable se hibriden a la molécula de ácido nucleico del anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno. En ;algunos casos, la detección de analitos de interés se incrementa en aproximadamente 5%, en aproximadamente 10%, en aproximadamente 15%, en aproximadamente 20%, en aproximadamente 25%, en aproximadamente 30%, en aproximadamente 35%, en aproximadamente 40%, en aproximadamente 45%, en aproximadamente 50%, en aproximadamente 55%, en aproximadamente 60%, en aproximadamente 65%, en aproximadamente 70%, en aproximadamente 75%, en aproximadamente 80%, en aproximadamente 85%, en aproximadamente 90%, en aproximadamente 95%, en aproximadamente 1,5 veces, en aproximadamente 2,0 veces, en aproximadamente 2,5 veces, en aproximadamente 3,0 veces, en aproximadamente 3,5 veces, en aproximadamente 4,0 veces, en aproximadamente 4,5 veces, en aproximadamente 5,0 veces, en aproximadamente 6 veces, en aproximadamente 7 veces, en aproximadamente 8 veces, en aproximadamente 9 veces, en aproximadamente 10 veces, o más, en comparación con un entorno en el que no se cree híbrido de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable.
En algunos casos, la sonda de eliminación de ARN no deseable es una molécula de ARN. En algunos casos, la molécula de ARN se hibrida a una molécula de ADN que está conjugada a proteína (p. ej., un anticuerpo), donde el anticuerpo se une a una proteína de interés. La molécula de ARN es complementaria a la molécula de ADN que está conjugada a la proteína (p. ej., el anticuerpo). En algunos casos, se realizan las siguientes etapas: el anticuerpo-la molécula de ADN se une a una proteína de interés; las moléculas de ARN (es decir, las sondas de eliminación de ARN) se hibridan a la molécula de ADN, bloqueando de ese modo la hibridación de otros ácidos nucleicos a la molécula de ADN.
En algunos casos, el anticuerpo se une a la proteína de interés después de hibridar la molécula de ARN a la molécula de ADN. En el último entorno, en una realización, la molécula de ARN se compleja con el anticuerpo-la molécula de ADN antes de que el anticuerpo-la molécula de ADN se una a la proteína de interés. Después de que el anticuerpo se hibride a la proteína, se puede añadir ARNasa H para escindir la molécula de ARN de la molécula de ADN de modo que la molécula de ADN esté libre para hibridarse a cualquier micromatriz de captura espacial según se describe en este documento.
(h) Métodos de prehibridación
(i) Obtención de imágenes y tinción
Antes de la adición a las sondas (p. ej., sondas de eliminación de ARN no deseable y/o sondas de RTL), en algunos casos, las muestras biológicas se pueden teñir usando una amplia variedad de tintes y técnicas de tinción. En algunos casos, la muestra biológica es una sección sobre un portaobjetos (p. ej., una sección de 5 pm, una sección de 7 pm, una sección de 10 pm, etc.). En algunos casos, la muestra biológica se seca después de la colocación sobre un portaobjetos de vidrio. En algunos casos, la muestra biológica se seca a 42°C. En algunos casos, el secado se produce durante aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2, horas, aproximadamente 3 horas, o hasta que las secciones se vuelvan transparentes. En algunos casos, la muestra biológica se puede secar durante la noche (p. ej., en un desecador a temperatura ambiente).
En algunas realizaciones, una muestra se puede teñir usando cualquier número de tintes biológicos, incluyendo pero no limitados a, naranja de acridina, pardo de Bismarck, carmín, azul de Coomassie, violeta de cresilo, DAPI, eosina, bromuro de etidio, fucsina ácida, hematoxilina, tintes de Hoechst, yodo, verde de metilo, azul de metileno, rojo neutro, azul del Nilo, rojo del Nilo, tetróxido de osmio, yoduro de propidio, rodamina o safranina. En algunos casos, los métodos divulgados en este documento incluyen la obtención de imágenes de la muestra biológica. En algunos casos, la obtención de imágenes de la muestra se produce antes de la desaminación de la muestra biológica. En algunos casos, la muestra se puede teñir usando técnicas de tinción conocidas, incluyendo técnicas de tinción de Can-Grunwald, Giemsa, hematoxilina y eosina (H y E), de Jenner, Leishman, tricromo de Masson, Papanicolaou, Romanowsky, plata, Sudán, de Wright y/o ácido peryódico de Schiff (PAS). La tinción de PAS se realiza típicamente después de fijación con formalina o acetona. En algunos casos, el tinte es un tinte de H y E.
En algunas realizaciones, la muestra biológica se puede teñir usando una etiqueta detectable (p. ej., radioisótopos, fluoróforos, compuestos quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes y colorantes) según se describe en otras partes en este documento. En algunas realizaciones, una muestra biológica se tiñe usando solo un tipo de tinte o una técnica. En algunas realizaciones, la tinción incluye técnicas de tinción biológica tales como tinción con H y E. En algunas realizaciones, la tinción incluye identificar analitos usando anticuerpos conjugados fluorescentemente. En algunas realizaciones, una muestra biológica se tiñe usando dos o más tipos diferentes de tintes, o dos o más técnicas de tinción diferentes. Por ejemplo, una muestra biológica se puede preparar al teñir y obtener imágenes usando una técnica (p. ej., tinción con H y E y obtención de imágenes de campo claro), seguido por tinción y obtención de imágenes usando otra técnica (p. ej., tinción con IHC/IF y microscopía de fluorescencia) para la misma muestra biológica.
En algunas realizaciones, las muestras biológicas se pueden desteñir. Métodos de destinción o decoloración de una muestra biológica son conocidos en la técnica y dependen generalmente de la naturaleza del tinte o los tintes aplicados a la muestra. Por ejemplo, una tinción con H y E se puede desteñir lavando la muestra en HCl, u otro ácido (p. ej., ácido selénico, ácido sulfúrico, ácido yodhídrico, ácido benzoico, ácido carbónico, ácido málico, ácido fosfórico, ácido oxálico, 20 ácido succínico, ácido salicílico, ácido tartárico, ácido sulfuroso, ácido tricloroacético, ácido bromhídrico, ácido clorhídrico, ácido nítrico, ácido ortofosfórico, ácido arsénico, ácido selenioso, ácido crómico, ácido cítrico, ácido fluorhídrico, ácido nitroso, ácido isociánico, ácido fórmico, seleniuro de hidrógeno, ácido molíbdico, ácido láctico, ácido acético, ácido carbónico, sulfuro de hidrógeno, o sus combinaciones). En algunas realizaciones, la destinción puede incluir 1, 2, 3, 4, 5 o más lavados en un ácido (p. ej. HCl). En algunas realizaciones, la destinción puede incluir añadir HCl a una solución ulterior (p. ej., solución de permeabilización). En algunas realizaciones, la destinción puede incluir disolver una enzima usada en los métodos divulgados (p. ej., pepsina) en una solución de ácido (p. ej., HCl). En algunas realizaciones, después de desteñir la hematoxilina con un ácido, se pueden añadir otros reactivos a la solución de destinción para elevar el pH para el uso en otras aplicaciones. Por ejemplo, se puede añadir SDS a una solución de destinción ácida a fin de elevar el pH en comparación con la solución de destinción ácida sola. Como otro ejemplo, en algunas realizaciones, se aplican uno o más tintes de inmunofluorescencia a la muestra a través de acoplamiento a un anticuerpo. Estos tintes se pueden retirar usando técnicas tales como escisión de las empalmes disulfuro a través de tratamiento con un agente reductor y lavado con detergente, tratamientos con sales caotrópicas, tratamiento con solución de recuperación de antígeno y tratamiento con un tampón ácido de glicina. Métodos para tinción y destinción múltiples se describen, por ejemplo, en Bolognesi y cols., J. Histochem. Cytochem. 2017; 65(8): 431-444, Lin y cols., Nat 35 Commun. 2015; 6:8390, Pirici y cols., J. Histochem. Cytochem. 2009; 57:567-75, y Glass y cols., J. Histochem. Cytochem.
2009; 57:899-905.
En algunas realizaciones, se pueden realizar protocolos de inmunofluorescencia o inmunohistoquímica (técnicas de tinción directas e indirectas) como parte de, o además de, flujos de trabajo espaciales ejemplares presentados en este 40 documento. Por ejemplo, las secciones tisulares se pueden fijar según métodos descritos en este documento. La muestra biológica se puede transferir a una micromatriz (p. ej., micromatriz de sondas de captura), donde analitos (p. ej., proteínas) se sondan usando protocolos de inmunofluorescencia. Por ejemplo, la muestra se puede rehidratar, bloquear y permeabilizar (3X SSC, BSA al 2%, Triton X al 0,1%, 1 U/^l de inhibidor de ARNasa durante 10 minutos a 4°C) antes de teñirse con anticuerpos primarios fluorescentes (l: 100 en 3XSSC, BSA al 2%, Triton X al 0,1%, 1 U/^l de inhibidor de 45 ARNasa durante 30 minutos a 4°C). La muestra biológica se puede lavar, cubrir con un cubreobjetos (en glicerol 1 U/^l de inhibidor de ARNasa), someter a obtención de imágenes (p. ej., usando un microscopio confocal u otro aparato capaz de detección fluorescente), lavar y procesar según la captura de analito o los flujos de trabajo espaciales descritos en este documento.
En algunos casos, se pueden añadir a la muestra una solución de glicerol y un cubreobjetos. En algunos casos, la solución de glicerol puede incluir un tinte de contraste (p. ej., DAPI).
Según se usa en este documento, un tampón de recuperación de antígeno puede mejorar la captura de anticuerpo en protocolos de IF/IHC. Un protocolo ejemplar para la recuperación de antígeno puede ser precalentar el tampón de recuperación de antígeno (p. ej., hasta 95°C), sumergir la muestra biológica en el tampón de recuperación de antígeno calentado durante un tiempo predeterminado, y a continuación retirar la muestra biológica del tampón de recuperación de antígeno y lavar la muestra biológica.
En algunas realizaciones, optimizar la permeabilización puede ser útil para identificar analitos intracelulares. La optimización de la permeabilización puede incluir la selección de agentes de permeabilización, la concentración de agentes de permeabilización y la duración de la permeabilización. La permeabilización tisular se analiza en otras partes en este documento.
En algunas realizaciones, el bloqueo de una micromatriz y/o una muestra biológica en la preparación del etiquetado de la muestra biológica disminuye la unión inespecífica de los anticuerpos a la micromatriz y/o la muestra biológica (disminuye el fondo). Algunas realizaciones proporcionan tampones de bloqueo/soluciones de bloqueo que se pueden aplicar antes y/o durante la aplicación de la etiqueta, donde el tampón de bloqueo puede incluir un agente de bloqueo, y opcionalmente un tensioactivo y/o una solución salina. En algunas realizaciones, un agente de bloqueo puede ser albúmina sérica bovina (BSA), suero, gelatina (p. ej., gelatina de pescado), leche (p. ej., leche desnatada en polvo), caseína, polietilenglicol (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA) o polivinilpirrolidona (PVP), un reactivo de bloqueo de biotina, un reactivo de bloqueo de peroxidasa, levamisol, solución de Carnoy, glicina, lisina, borohidruro sódico, azul cielo de pontamina, negro de Sudán, azul de tripano, agente de bloqueo de FITC, y/o ácido acético. El tampón de bloqueo/la solución de bloqueo se puede aplicar a la micromatriz y/o la muestra biológica antes de y/o durante el etiquetado (p. ej., la aplicación de anticuerpos conjugados a fluoróforos) de la muestra biológica.
(ii) Preparación de una muestra para la aplicación de sondas
En algunos casos, la muestra biológica se desparafina. La desparafinación se puede conseguir usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, en algunos casos, las muestras biológicas se tratan con una serie de lavados que incluyen xileno y diversas concentraciones de etanol. En algunos casos, los métodos de desparafinación 15 incluyen el tratamiento de xileno (p. ej., tres lavados en 5 minutos cada uno). En algunos casos, los métodos incluyen además el tratamiento con etanol (p. ej., etanol al 100%, dos lavados de 10 minutos cada uno; etanol al 95%, dos lavados de 10 minutos cada uno; etanol al 70%, dos lavados de 10 minutos cada uno; etanol al 50%, dos lavados de 10 minutos cada uno). En algunos casos, después de los lavados con etanol, la muestra biológica se puede lavar con agua desionizada (p. ej., dos lavados durante 5 minutos cada uno). Se aprecia que un experto en la técnica puede ajustar 20 estos métodos para optimizar la desparafinación.
En algunos casos, la muestra biológica se desreticula. En algunos casos, la muestra biológica se desreticula en una solución que contiene tampón de TE (que comprende Tris y EDTA). En algunos casos, el tampón de TE es básico (p. ej., a un pH de aproximadamente 9). En algunos casos, la desreticulación se produce a de aproximadamente 50°C a aproximadamente 80°C. En algunos casos, la desreticulación se produce a aproximadamente 70°C. En algunos casos, la desreticulación se produce durante aproximadamente 1 hora a 70°C. Justo antes de la desreticulación, la muestra biológica se puede tratar con un ácido (p. ej., HCl 0,1 M durante aproximadamente 1 minuto). Después de la etapa de desreticulación, la muestra biológica se puede lavar (p. ej., con 1x PBST).
En algunos casos, los métodos de preparación de una muestra biológica para la aplicación de sondas incluyen permeabilizar la muestra. En algunos casos, la muestra biológica se permeabiliza usando un tampón de fosfato. En algunos casos, el tampón de fosfato es PBS (p. ej., 1x PBS). En algunos casos, el tampón de fosfato es PBST (p. ej., 1x PBST). En algunos casos, la etapa de permeabilización se realiza múltiples veces (p. ej., 3 veces en 5 minutos cada una).
En algunos casos, los métodos de preparación de una muestra biológica para la aplicación de sondas incluyen etapas de equilibrado y bloqueo de la muestra biológica. En algunos casos, el equilibrado se realiza usando un tampón de prehibridación (tampón prehib.). En algunos casos, el tampón prehib. está libre de ARNasa. En algunos casos, el tampón prehib. no contiene albúmina sérica bovina (BSA), soluciones como de Denhardt, u otros materiales biológicos potencialmente contaminados con nucleasas.
En algunos casos, la etapa de equilibrado se realiza múltiples veces (p. ej., 2 veces 5 minutos cada una; 3 veces 5 minutos cada una). En algunos casos, la muestra biológica se bloquea con un tampón de bloqueo. En algunos casos, el tampón de bloqueo incluye un portador tal como ARNt, por ejemplo ARNt de levadura tal como de levadura de cerveza (p. ej., en una concentración final de 10-20 pg/ml). En algunos casos, el bloqueo se puede realizar durante 5, 10, 15, 20, 25 o 30 minutos.
Cualquiera de las e etapas precedentes se puede optimizar para el rendimiento. Por ejemplo, se puede variar la temperatura. En algunos casos, los métodos de prehibridación se realizan a temperatura ambiente. En algunos casos, los métodos de prehibridación se realizan a 4°C (en algunos casos, variando los espacios de tiempo proporcionados en este documento).
(i) Hibridación de las sondas
En algunas realizaciones, los métodos descritos en este documento incluyen hibridar sondas de eliminación de ARN no deseable antes de o contemporáneamente con la captura de ARN elegido como diana que incluye hibridar un primer oligonucleótido de sondeo y un segundo oligonucleótido de sondeo (p. ej., un par de sondas). En algunos casos, el primer y el segundo oligonucleótidos de sondeo para la captura de ARN elegido como diana incluyen cada uno secuencias que son sustancialmente complementarias a una o más secuencias (p. ej., una o más secuencias diana) de un analito de interés. En algunas realizaciones, la primera sonda y la segunda sonda se unen a secuencias complementarias que son completamente adyacentes (es decir, no hay hueco de nucleótidos) entre sí o están en el mismo transcrito.
En algunos casos, los métodos incluyen la hibridación de grupos de sondas, donde los pares de sondas están en un medio a una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nM. En algunos casos, la concentración de los pares de sondas es aproximadamente l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 o 500 nM. En algunos casos, la concentración de los pares de sondas es 5 nM. En algunos casos, los grupos de sondas se diluyen en un tampón de hibridación (hib.). En algunos casos, los grupos de sondas están a una concentración de 5 nM en tampón hib.
En algunos casos, la hibridación de las sondas (p. ej., hibridación de las sondas de eliminación de ARN no deseable y/o el primer y el segundo oligonucleótidos de sondeo) se produce a aproximadamente 50°C. En algunos casos, la temperatura de hibridación de sondas varía de aproximadamente 30°C a aproximadamente 75°C, de aproximadamente 35°C a aproximadamente 70°C o de aproximadamente 40°C a aproximadamente 65°C. En algunas realizaciones, la temperatura es aproximadamente 30°C, aproximadamente 31°C, aproximadamente 32°C, aproximadamente 33°C, aproximadamente 34°C, aproximadamente 35°C, aproximadamente 36°C, aproximadamente 37°C, aproximadamente 38°C, aproximadamente 39°C, aproximadamente 40°C, aproximadamente 41°C, aproximadamente 42°C, aproximadamente 43°C, aproximadamente 44°C, aproximadamente 45°C, aproximadamente 46°C, aproximadamente 47°C, aproximadamente 48°C, aproximadamente 49°C, aproximadamente 50°C, aproximadamente 51°C, aproximadamente 52°C, aproximadamente 53°C, aproximadamente 54°C, aproximadamente 55°C, aproximadamente 56°C, aproximadamente 57°C, aproximadamente 58°C, aproximadamente 59°C, aproximadamente 60°C, aproximadamente 61°C, aproximadamente 62°C, aproximadamente 63°C, aproximadamente 64°C, aproximadamente 65°C, aproximadamente 66°C, aproximadamente 67°C, aproximadamente 68°C, aproximadamente 69°C o aproximadamente 70°C. En algunos casos, la hibridación de las sondas se produce durante aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 2,5 horas, aproximadamente 3 horas, o más. En algunos casos, la hibridación de las sondas se produce durante aproximadamente 2,5 horas a 50°C.
En algunos casos, el tampón de hibridación incluye SSC (p. ej., 1x SSC) o SSPE. En algunos casos, el tampón de hibridación incluye formamida o carbonato de etileno. En algunos casos, el tampón de hibridación incluye una o más sales, como sal de Mg, por ejemplo MgCl2, sal de Na, por ejemplo NaCI, sal de Mn, por ejemplo MnCl2. En algunos casos, el tampón de hibridación incluye solución de Denhardt, sulfato de dextrano, Ficoll, PEG u otros aceleradores de la velocidad de hibridación. En algunos casos, el tampón de hibridación incluye un portador tal como ARNt de levadura, ADN de esperma de salmón y/o ADN de fago lambda. En algunos casos, el tampón de hibridación incluye uno o más bloqueadores. En algunos casos, el tampón de hibridación incluye un inhibidor o inhibidores de ARNasa. En algunos casos, el tampón de hibridación puede incluir BSA, bloqueadores específicos de secuencias, bloqueadores inespecíficos, EDTA, un inhibidor o inhibidores de ARNasa, betaína, TMAC o DMSO. En algunos casos, un tampón de hibridación puede incluir además detergentes tales como Tween, Triton-X 100, Sarkosyl y SDS. En algunos casos, el tampón de hibridación incluye agua libre de nucleasa, agua DEPC.
En algunas realizaciones, las secuencias complementarias a las que se unen el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo están separadas entre sí 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente 125, aproximadamente 150, aproximadamente 175, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 450, aproximadamente 500, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 800, aproximadamente 900 o aproximadamente 1000 nucleótidos. Los huecos entre los oligonucleótidos de sondeo se pueden rellenar en primer lugar antes de la ligación, usando, por ejemplo, polimerasa Mu, ADN polimerasa, ARN polimerasa, transcriptasa inversa, polimerasa VENT, polimerasa Taq y/o cualesquiera de sus combinaciones, derivados y variantes (p. ej., mutantes manipulados). En algunas realizaciones, cuando el primer y el segundo oligonucleótidos de sondeo están separados entre sí por uno o más nucleótidos, los nucleótidos se ligan entre el primer y el segundo oligonucleótidos de sondeo. En algunas realizaciones, cuando el primer y el segundo oligonucleótidos de sondeo están separados entre sí por uno o más nucleótidos, los desoxirribonucleótidos se ligan entre el primer y el segundo oligonucleótidos de sondeo.
En algunos casos, después de la hibridación, la muestra biológica se lava con un tampón de lavado de poshibridación. En algunos casos, el tampón de lavado de poshibridación incluye uno o más de SSC, ARNt de levadora, formamida, carbonato de etileno y agua libre de nucleasas. Se proporcionan además realizaciones adicionales relativas a la hibridación de sondas.
(i) Temperaturas de hibridación
En algunas realizaciones, el método descrito utiliza oligonucleótidos que incluyen ácidos desoxirribonucleicos (en lugar de utilizar estrictamente ribonucleótidos) en el sitio de ligación. La utilización de ácidos desoxirribonucleicos en los métodos descritos en este documento crea una eficacia más uniforme que se puede controlar fácilmente y es flexible para diversas aplicaciones. En algunas realizaciones, una sonda de eliminación de ARN no deseable incluye ácidos desoxirribonucleicos (en lugar de utilizar estrictamente ribonucleótidos) en el sitio de ligación. En algunas realizaciones, un primer oligonucleótido de sondeo y/o un segundo oligonucleótido de sondeo incluyen ácidos desoxirribonucleicos (en lugar de utilizar estrictamente ribonucleótidos) en el sitio de ligación.
En un ejemplo no limitativo, los métodos divulgados en este documento incluyen poner en contacto una muestra biológica con una pluralidad de oligonucleótidos (p. ej., sondas de eliminación de ARN no deseable y/o sondas de RTL) que incluyen una sonda de eliminación de ARN no deseable, un primer oligonucleótido (p. ej., una primera sonda) y un segundo oligonucleótido (p. ej., una segunda sonda), donde la sonda de eliminación de ARN no deseable incluye una secuencia que es sustancialmente complementaria a al menos una porción de un ARN no deseable, donde el primer oligonucleótido (p. ej., la primera sonda) y el segundo oligonucleótido (p. ej., la segunda sonda) son complementarios a una primera secuencia presente en un analito y una segunda secuencia presente en el analito, respectivamente; hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable, el primer oligonucleótido (p. ej., la primera sonda) y el segundo oligonucleótido (p. ej., la segunda sonda) al analito a una primera temperatura; hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable y el primer oligonucleótido (p. ej., la primera sonda) y el segundo oligonucleótido (p. ej., la segunda sonda) a un tercer oligonucleótido (p. ej., un oligonucleótido de entablillado) a una segunda temperatura de modo que el primer oligonucleótido (p. ej., la primera sonda) y el segundo oligonucleótido (p. ej., la segunda sonda) se apoyen entre sí; ligar el primer oligonucleótido (p. ej., la primera sonda) al segundo oligonucleótido (p. ej., la segunda sonda) para crear un producto de ligación; poner en contacto la muestra biológica con un sustrato, donde una sonda de captura está inmovilizada sobre el sustrato, donde la sonda de captura incluye un código de barras espacial y un dominio de captura; permitir que el producto de ligación se una específicamente al dominio de captura; y determinar (i) toda o parte de la secuencia del producto de ligación unido específicamente al dominio de captura, o uno de sus complementos, y (ii) toda o una parte de la secuencia del código de barras espacial, o uno de sus complementos, y usar la secuencia determinada de (i) y (ii) para identificar la localización del analito en la muestra biológica; donde el primer oligonucleótido (p. ej., la primera sonda), el segundo oligonucleótido (p. ej., la segunda sonda) y el tercer oligonucleótido son oligonucleótidos de ADN, y donde la primera temperatura es una temperatura superior que la segunda temperatura.
En algunas realizaciones, la sonda de eliminación de ARN no deseable, el primer oligonucleótido (p. ej., la primera sonda) y/o el segundo oligonucleótido (p. ej., la segunda sonda) se hibridan a un analito a una primera temperatura. En algunas realizaciones, la primera temperatura varía de aproximadamente 50°C a aproximadamente 75°C, de aproximadamente 55°C a aproximadamente 70°C o de aproximadamente 60°C a aproximadamente 65°C. En algunas realizaciones, la primera temperatura es aproximadamente 55°C, aproximadamente 56°C, aproximadamente 57°C, aproximadamente 58°C, aproximadamente 59°C, aproximadamente 60°C, aproximadamente 61°C, aproximadamente 62°C, aproximadamente 63°C, aproximadamente 64°C, aproximadamente 65°C, aproximadamente 66°C, aproximadamente 67°C, aproximadamente 68°C, aproximadamente 69°C o aproximadamente 70°C.
En algunas realizaciones, después de la etapa de hibridación de la sonda de eliminación de ARN no deseable, el primer oligonucleótido (p. ej., la primera sonda), y/o el segundo oligonucleótido (p. ej., la segunda sonda) al analito, se realiza una etapa de lavado para eliminar oligonucleótidos (p. ej., sondas) no unidos. La etapa de lavado se puede realizar usando cualquiera de los métodos y las soluciones de lavado descritos en este documento.
En algunas realizaciones, después de la etapa de hibridación del primer oligonucleótido (p. ej., la primera sonda) y el segundo oligonucleótido (p. ej., la segunda sonda) al analito, se añade al analito un tercer oligonucleótido (p. ej., un oligonucleótido de entablillado). En algunas realizaciones, el tercer oligonucleótido es un oligonucleótido. En algunas realizaciones, el tercer oligonucleótido es un oligonucleótido de ADN.
En algunas realizaciones, el tercer oligonucleótido incluye una secuencia que es al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% complementaria a una porción del primer oligonucleótido de sondeo (p. ej., una porción de la primera sonda que no está hibridada al analito (p. ej., una secuencia auxiliar)).
En algunas realizaciones, el tercer oligonucleótido incluye una secuencia que es 100% complementaria a una porción del primer oligonucleótido (p. ej., la primera sonda). En algunas realizaciones, el tercer oligonucleótido incluye una secuencia que es al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% complementaria a una porción del segundo oligonucleótido de sondeo (p. ej., una porción de la segunda sonda que no está hibridada al analito (p. ej., una secuencia auxiliar)). En algunas realizaciones, el tercer oligonucleótido incluye una secuencia que es 100% complementaria a una porción del segundo oligonucleótido (p. ej., la segunda sonda). En algunas realizaciones, el tercer oligonucleótido se hibrida al primer oligonucleótido (p. ej., la primera sonda) en la porción complementaria. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se hibrida al segundo oligonucleótido (p. ej., la segunda sonda) en la porción complementaria.
En algunas realizaciones, el tercer oligonucleótido se hibrida al primer oligonucleótido (p. ej., la primera sonda) y al segundo oligonucleótido (p. ej., la segunda sonda) a una segunda temperatura. En algunas realizaciones, la segunda temperatura es inferior que la primera temperatura a la que el primer y el segundo oligonucleótidos (p. ej., la primera y segunda sondas) se unen al analito. En algunas realizaciones, la segunda temperatura varía de aproximadamente 15°C a aproximadamente 35°C, de aproximadamente 20°C a aproximadamente 30°C o de aproximadamente 25°C a aproximadamente 30°C. En algunas realizaciones, la primera temperatura es aproximadamente 15°C, aproximadamente 16°C, aproximadamente 17°C, aproximadamente 18°C, aproximadamente 19°C, aproximadamente 20°C, aproximadamente 21°C, aproximadamente 22°C, aproximadamente 23°C, aproximadamente 24°C, aproximadamente 25°C, aproximadamente 26°C, aproximadamente 27°C, aproximadamente 28°C, aproximadamente 29°C, aproximadamente 30°C, aproximadamente 31°C, aproximadamente 32°C, aproximadamente 33°C, aproximadamente 34°C o aproximadamente 35°C. Métodos que incluyen un tercer oligonucleótido, o de entablillado, se han descrito en la Pub. Patente EE. UU. N° 2019/0055594A1.
En algunas realizaciones, después de la etapa de hibridación del tercer oligonucleótido al analito, se realiza una etapa de lavado para retirar tercer oligonucleótidos no unidos. La etapa de lavado se puede realizar usando cualquiera de los métodos y soluciones de lavado descritos en este documento. En algunas realizaciones, después de la etapa de lavado, el primer y segundo oligonucleótidos (p. ej., la primera y la segunda sondas) se unen al (p. ej., se hibridan al) analito, y el tercer oligonucleótido se une a (p. ej., se hibrida a) el primer y el segundo oligonucleótidos (p. ej., en porciones de la primera y la segunda sondas que no están unidas al analito).
En algunas realizaciones, el oligonucleótido (p. ej. la primera sonda), el segundo oligonucleótido (p. ej., la segunda sonda) y el tercer oligonucleótido se añaden a la muestra biológica al mismo tiempo. A continuación, en algunas realizaciones, la temperatura se ajusta hasta la primera temperatura para permitir que el primer oligonucleótido (p. ej. la primera sonda) y el segundo oligonucleótido (p. ej., la segunda sonda) se hibriden al analito en la muestra biológica. Posteriormente, la temperatura se ajusta hasta la segunda temperatura para permitir que el tercer oligonucleótido se hibride al primer oligonucleótido y al segundo oligonucleótido.
En algunas realizaciones en las que un tercer oligonucleótido se hibrida a una primera sonda y una segunda sonda que se hibridan a secuencias diana que no son directamente adyacentes en el analito, el tercer oligonucleótido se extiende para rellenar el hueco entre la primera sonda y la segunda sonda. En algunos casos, una polimerasa (p. ej., una ADN polimerasa) puede extender una de las sondas (p. ej., la primera sonda) antes de la ligación.
En algunas realizaciones, se realiza una etapa de ligación. La ligación se puede realizar usando cualquiera de los métodos descritos en este documento. En algunas realizaciones, la etapa incluye la ligación del primer oligonucleótido (p. ej., la primera sonda) y el segundo oligonucleótido (p. ej., la segunda sonda), formando un producto de ligación. En algunas realizaciones, el tercer oligonucleótido sirve como un entablillado oligonucleotídico para facilitar la ligación del primer oligonucleótido (p. ej., la primera sonda) y el segundo oligonucleótido (p. ej., la segunda sonda). En algunas realizaciones, la ligación es ligación química. En algunas realizaciones, la ligación es ligación enzimática. En algunas realizaciones, la ligasa es una ARN ligasa T4 (Rnl2), una ligasa SplintR, una ADN monocatenario ligasa o una ADN ligasa T4.
(ii) Tampón de hibridación
En algunas realizaciones, una sonda de eliminación de ARN no deseable, una primera sonda y/o una segunda sonda de eliminación de ARN no deseable, una primera sonda y/o una segunda sonda se hibridan al analito en un tampón de hibridación. En algunos casos, el tampón de hibridación contiene formamida. En otros casos, el tampón de hibridación está libre de formamida. La formamida no es beneficiosa para el ser humano y es un peligro conocido para la salud.
Químicamente, se puede oxidar a lo largo del tiempo, afectando de ese modo a la vida útil del reactivo y, lo más importante, la eficacia del reactivo. Como tales, los métodos descritos en este documento pueden incluir tampones libres de formamida, incluyendo tampón de hibridación libre de formamida.
En algunas realizaciones, el tampón de hibridación libre de formamida es un tampón de hibridación de citrato sódico en solución salina (SSC). En alguna realización, el SSC está presente en el tampón de hibridación de SSC de aproximadamente 1x SSC a aproximadamente 6x SSC (p. ej., de aproximadamente 1x SSC a aproximadamente 5x SSC, de aproximadamente 1x SSC a aproximadamente 4x SSC, de aproximadamente 1x SSC a aproximadamente 3x SSC, de aproximadamente 1x SSC a aproximadamente 2x SSC, de aproximadamente 2x SSC a aproximadamente 6x SSC, de aproximadamente 2x SSC a aproximadamente 5x SSC, de aproximadamente 2x SSC a aproximadamente 4x SSC, de aproximadamente 2x SSC a aproximadamente 3x SSC, de aproximadamente 3x SSC a aproximadamente 5x SSC, de aproximadamente 3x SSC a aproximadamente 4x SSC, de aproximadamente 4x SSC a aproximadamente 6x SSC, de aproximadamente 4x SSC a aproximadamente 6x SSC, de aproximadamente 4x SSC a aproximadamente 5x SSC o de aproximadamente 5x SSC a aproximadamente 6x SSC). En algunas realizaciones, el SSC está presente en el tampón de hibridación de SSC de aproximadamente 2x SSC a aproximadamente 4x SSC.
En algunas realizaciones, se puede usar tampón de hibridación de SSPE. En algunas realizaciones, el tampón de hibridación de<s>S<c>comprende un disolvente. En algunas realizaciones, el disolvente comprende carbonato de etileno en lugar de formamida (2020, Kalinka y cols.,Scientia Agrícola78(4): e20190315). En algunas realizaciones, el carbonato de etileno está presente en el tampón de hibridación de SSC de aproximadamente 10% (p/v) a aproximadamente 25% (p/v) (p. ej., de aproximadamente 10% (p/v) a aproximadamente 20% (p/v), de aproximadamente 10% (p/v) a aproximadamente 15% (p/v), de aproximadamente 15% (p/v) a aproximadamente 25% (p/v), de aproximadamente 15% (p/v) a aproximadamente 20% (p/v) o de aproximadamente 20% (p/v) a aproximadamente 25% (p/v)). En algunas realizaciones, el carbonato de etileno está presente en el tampón de hibridación de SSC de aproximadamente 15% (p/v) a aproximadamente 20% (p/v). En algunas realizaciones, el carbonato de etileno está presente en el tampón de hibridación de SSC en aproximadamente 10% (p/v), aproximadamente 11% (p/v), aproximadamente 12% (p/v), aproximadamente 13% (p/v), aproximadamente 14% (p/v), aproximadamente 15% (p/v), aproximadamente 16% (p/v), aproximadamente 17% (p/v), aproximadamente 18% (p/v), aproximadamente 19% (p/v), aproximadamente 20% (p/v), aproximadamente 21% (p/v), aproximadamente 22% (p/v), aproximadamente 23% (p/v), aproximadamente 24% (p/v) o aproximadamente 25% (p/v). En algunas realizaciones, el carbonato de etileno está presente en el tampón de hibridación de SSC en aproximadamente 13% (p/v).
En algunas realizaciones, el tampón de hibridación de SSC está a una temperatura de aproximadamente 40°C a aproximadamente 60°C (p. ej., de aproximadamente 40°C a aproximadamente 55°C, de aproximadamente 40°C a aproximadamente 50°C, de aproximadamente 40°C a aproximadamente 45°C, de aproximadamente 45°C a aproximadamente 60°C, de aproximadamente 45°C a aproximadamente 55°C, de aproximadamente 45°C a aproximadamente 50°C, de aproximadamente 50°C a aproximadamente 60°C, de aproximadamente 50°C a aproximadamente 55°C o de aproximadamente 55°C a aproximadamente 60°C). En algunas realizaciones, el tampón de hibridación de SSC está a una temperatura de aproximadamente 45°C a aproximadamente 55°C, o cualquiera de los subintervalos descritos en este documento. En algunas realizaciones, el tampón de hibridación de SSC está a una temperatura de aproximadamente 40°C, aproximadamente 41°C, aproximadamente 42°C, aproximadamente 43°C, aproximadamente 44°C, aproximadamente 45°C, aproximadamente 46°C, aproximadamente 47°C, aproximadamente 48°C, aproximadamente 49°C, aproximadamente 50°C, aproximadamente 51°C, aproximadamente 52°C, aproximadamente 53°C, aproximadamente 54°C, aproximadamente 55°C, aproximadamente 56°C, aproximadamente 57°C, aproximadamente 58°C, aproximadamente 59°C o aproximadamente 60°C. En algunas realizaciones, el tampón de hibridación de SSC está a una temperatura de aproximadamente 50°C.
En algunas realizaciones, el tampón de hibridación de SSC comprende además uno o más de un portador, un aglutinador o un aditivo. Ejemplos no limitativos de un portador que se pueden incluir en el tampón de hibridación incluyen: ARNt de levadura, ADN de esperma de salmón, ADN de fago lambda, glucógeno y colesterol. Ejemplos no limitativos de un aglutinador molecular que se puede incluir en el tampón de hibridación incluyen: Ficoll, dextrano, solución de Denhardt y PEG. Ejemplos no limitativos de aditivos que se pueden incluir en el tampón de hibridación incluyen: bloqueadores de la unión, inhibidores de ARNasa, ajustadores de Tm y adyuvantes para relajar las estructuras secundarias de ácidos nucleicos (p. ej., betaína, TMAC y DMSO). Además, un tampón de hibridación puede incluir detergentes tales como SDS, Tween, Triton-X 100 y Sarkosyl (p. ej., sal sódica de N-lauroilsarcosina). Un experto podría entender que un tampón para la hibridación de ácidos nucleicos podría incluir muchos compuestos diferentes que podrían potenciar la reacción de hibridación.
(j) Lavado
En algunas realizaciones, los métodos divulgados en este documento también incluyen una etapa de lavado. La etapa de lavado retira cualquier sonda no unida. Las etapas de lavado podrían realizarse entre cualquiera de las etapas en los métodos divulgados en este documento. Por ejemplo, se puede realizar una etapa de lavado después de añadir sondas (p. ej., cualquiera de las sondas de ARN no deseable y/o pares de sondas de RTL descritos en este documento) a la 35 muestra biológica. Como tales, las sondas libres/no unidas se retiran por lavado, dejando solo sondas que se han hibridado a un analito y/o ARN no deseable (p. ej., ARNr). En algunos casos, se producen múltiples (es decir, al menos 2, 3, 4, 5 o más) etapas de lavado entre los métodos divulgados en este documento. Las etapas de lavado se pueden realizar en momentos (p. ej., l, 2, 3, 4 o 5 minutos) y a temperaturas (p. ej., temperatura ambiente; 4°C conocidos en la técnica y determinados por un experto en la técnica.
En algunos casos, las etapas de lavado se realizan usando un tampón de lavado. En algunos casos, el tampón de lavado incluye SSC (p. ej., 1x SSC). En algunos casos, el tampón de lavado incluye PBS (p. ej., 1x PBS). En algunos casos, el tampón de lavado incluye PBST (p. ej., 1x PBST). En algunos casos, el tampón de lavado también puede incluir formamida o estar libre de formamida.
Se proporcionan en este documento realizaciones adicionales relativas a las etapas de lavado. (i) Tampón de lavado libre de formamida
En algunas realizaciones, después de la hibridación y/o la ligación de la sonda de eliminación de ARN no deseable, una 50 o más sondas de eliminación de ARN no deseable no hibridadas se retiran de la micromatriz. En algunas realizaciones, después de ligar una primera sonda y una segunda sonda, la una o más primeras sondas no hibridadas, una o más segundas sondas no hibridadas, o ambas, se retiran de la micromatriz. En algunas realizaciones, después de ligar una primera sonda, una segunda sonda y un tercer oligonucleótido, la una o más primeras sondas no hibridadas, una o más segundas sondas no hibridadas o uno o más terceros oligonucleótidos, o todos los anteriores, se retiran de la micromatriz. En algunas realizaciones, se usa un tampón de prehibridación para lavar la muestra. En algunas realizaciones, se usa un tampón de fosfato. En algunas realizaciones, se realizan múltiples etapas de lavado para retirar oligonucleótidos no unidos.
En algunas realizaciones, la retirada incluye lavar la una o más sondas no hibridadas (p. ej., una sonda de eliminación de ARN no deseable, una primera sonda, una segunda sonda y un tercer oligonucleótido) de la micromatriz en un tampón de lavado libre de formamida.
En algunas realizaciones, el tampón de lavado libre de formamida es una tampón de lavado de SSC. En algunas realizaciones, el SSC está presente en el tampón de lavado de SSC de aproximadamente 0,01x SSC a aproximadamente 1x SSC (p. ej., de aproximadamente 0,01x SSC a aproximadamente 0,5x SSC, de 0,01x SSC a aproximadamente 0,1x SSC, de aproximadamente 0,01x SSC a aproximadamente 0,05x SSC, de aproximadamente 0,05x SSC a aproximadamente 1x SSC, de aproximadamente 0,05x SSC a aproximadamente 0,5x SSC, de aproximadamente 0,05x SSC a aproximadamente 0,1x SSC, de aproximadamente 0,1x SSC a aproximadamente 1x 5 SSC, de aproximadamente 0,1x SSC a aproximadamente 0,5x SSC o de aproximadamente 0,5x SSC a aproximadamente 1x SSC). En algunas realizaciones, el SSC está presente en el tampón de lavado de SSC en aproximadamente 0,01x SSC, aproximadamente 0,02x SSC, aproximadamente 0,03x SSC, aproximadamente 0,04x SSC, aproximadamente 0,05x SSC, aproximadamente 0,06x SSC, aproximadamente 0,07x SSC, aproximadamente 0,08x SSC, aproximadamente 0,09x SSC, aproximadamente 0,1x SSC, aproximadamente 0,2x SSC, aproximadamente 0,3x SSC, aproximadamente 0,4x SSC, aproximadamente 0,5x SSC, aproximadamente 0,6x SSC, aproximadamente 0,7x SSC, aproximadamente 0,8x SSC, aproximadamente 0,9x SSC o aproximadamente 0,1x SSC. En algunas realizaciones, el SSC está presente en el tampón de lavado de SSC en aproximadamente 0,1x SSC.
En algunas realizaciones, el tampón de lavado de SSC comprende un detergente. En algunas realizaciones, el detergente comprende dodecilsulfato sódico (SDS). En algunas realizaciones, el SDS está presente en el tampón de lavado de SSC de aproximadamente 0,01% (v/v) a aproximadamente 0,5% (v/v) (p. ej., de aproximadamente 0,01% (v/v) a aproximadamente 0,4% (v/v), de aproximadamente 0,01% (v/v) a aproximadamente 0,3% (v/v), de aproximadamente 0,01% (v/v) a aproximadamente 0,2% (v/v), de aproximadamente 0,01% (v/v) a aproximadamente 0,1% (v/v), de aproximadamente 0,05% (v/v) a aproximadamente 0,5% (v/v), de aproximadamente 0,05% (v/v) a aproximadamente 0,4% (v/v), de aproximadamente 0,05% (v/v) a aproximadamente 0,3% (v/v), de aproximadamente 0,05% (v/v) a aproximadamente 0,2% (v/v), de aproximadamente 0,05% (v/v) a aproximadamente 0,1% (v/v), de aproximadamente 0,1% (v/v) a aproximadamente 0,5% (v/v), de aproximadamente 0,1% (v/v) a aproximadamente 0,4% (v/v), de aproximadamente 0,1% (v/v) a aproximadamente 0,3% (v/v), de aproximadamente 0,1% (v/v) a aproximadamente 0,2% (v/v), de aproximadamente 0,2% (v/v) a aproximadamente 0,5% (v/v), de aproximadamente 0,2% (v/v) a aproximadamente 0,4% (v/v), de aproximadamente 0,2% (v/v) a aproximadamente 0,3% (v/v), de aproximadamente 0,3% (v/v) a aproximadamente 0,5% (v/v), de aproximadamente 0,3% (v/v) a aproximadamente 0,4% (v/v) o de aproximadamente 0,4% (v/v) a aproximadamente 0,5% (v/v)). En algunas realizaciones, el SDS está presente en el tampón de lavado de SSC en aproximadamente 0,01% (v/v), aproximadamente 0,02% (v/v), aproximadamente 0,03% (v/v), aproximadamente 0,04% (v/v), aproximadamente 0,05% (v/v), aproximadamente 0,06% (v/v), 30 aproximadamente 0,07% (v/v), aproximadamente 0,08% (v/v), aproximadamente 0,09% (v/v), aproximadamente 0,10% (v/v), aproximadamente 0,2% (v/v), aproximadamente 0,3% (v/v), aproximadamente 0,4% (v/v) o aproximadamente 0,5% (v/v), En algunas realizaciones, el SDS está presente en el tampón de lavado de SSC en aproximadamente 0,1% (v/v). En algunas realizaciones, puede estar presente Sarkosyl en el tampón de lavado de SSC.
En algunas realizaciones, el tampón de lavado de SSC comprende un disolvente. En algunas realizaciones, el disolvente comprende formamida o carbonato de etileno. En algunas realizaciones, el carbonato de etileno está presente en el tampón de lavado de SSC de aproximadamente 10% (p/v) a aproximadamente 25% (p/v), o cualquiera de los subintervalos descritos en este documento. En algunas realizaciones, el carbonato de etileno está presente en el tampón de lavado de SSC de aproximadamente 15% (p/v) a aproximadamente 20% (p/v). En algunas realizaciones, el carbonato de etileno está presente en el tampón de lavado de SSC en aproximadamente 16% (p/v).
En algunas realizaciones, el tampón de lavado de SSC está a una temperatura de aproximadamente 50°C a aproximadamente 70°C (p. ej., de aproximadamente 50°C a aproximadamente 65°C, de aproximadamente 50°C a aproximadamente 60°C, de aproximadamente 50°C a aproximadamente 55°C, de aproximadamente 55°C a aproximadamente 70°C, de aproximadamente 55°C a aproximadamente 65°C, de aproximadamente 55°C a aproximadamente 60°C, de aproximadamente 60°C a aproximadamente 70°C, de aproximadamente 60°C a aproximadamente 65°C o de aproximadamente 65°C a aproximadamente 70°C). En algunas realizaciones, el tampón de lavado de SSC está a una temperatura de aproximadamente 55°C a aproximadamente 65°C. En algunas realizaciones, el tampón de lavado de SSC está a una temperatura de aproximadamente 50°C, aproximadamente 51°C, 50 aproximadamente 52°C, aproximadamente 53°C, aproximadamente 54°C, aproximadamente 55°C, aproximadamente 56°C, aproximadamente 57°C, aproximadamente 58°C, aproximadamente 59°C, aproximadamente 60°C, aproximadamente 61°C, aproximadamente 62°C, aproximadamente 63°C, aproximadamente 64°C, aproximadamente 65°C, aproximadamente 66°C, aproximadamente 67°C, aproximadamente 68°C, aproximadamente 69°C o aproximadamente 70°C. En algunas realizaciones, el tampón de lavado de SSC está a una temperatura de aproximadamente 60°C.
En algunas realizaciones, el método incluye liberar el producto de ligación, donde la liberación se realiza después de que la matriz se lave para retirar la una o más primera y segunda sondas no hibridadas. (k) Ligación
En algunas realizaciones, después de la hibridación de los oligonucleótidos de sondeo (p. ej., una primera sonda, una segunda sonda y/o un tercer oligonucleótido) al analito, las sondas (p. ej., una primera sonda, una segunda sonda y/o un tercer oligonucleótido) pueden ligarse entre sí, creando un solo producto de ligación que incluye una o más secuencias que son complementarias al analito. En algunas realizaciones, después de la hibridación de las sondas de eliminación de ARN no deseable, las sondas de eliminación de ARN no deseable se pueden ligar entre sí. La ligación se puede realizar enzimáticamente o químicamente, según se describe en este documento.
En algunos casos, la ligación es una reacción de ligación enzimática, que usa una ligasa (p. ej., ARN ligasa T4 (Rnl2), una ligasa SplintR, una ADN monocatenario ligasa o una ADN ligasa T4). Véase, p. ej., Zhang y cols.; RNA Biol. 2017; 14(1): 36-44, para una descripción de ligasa de KOD. Después de la reacción de ligación enzimática, las sondas (p. ej., una primera sonda, una segunda sonda y/o un tercer oligonucleótido) se pueden considerar ligadas.
En algunas realizaciones, una polimerasa cataliza la síntesis de una cadena complementaria del producto de ligación, creando un producto de ligación bicatenario. En algunos casos, la polimerasa es ADN polimerasa. En algunas realizaciones, la polimerasa tiene una actividad de polimerasa 5' a 3'. En algunas realizaciones, la polimerasa tiene una actividad de exonucleasa 3' a 5' para la corrección de errores. En algunas realizaciones, la polimerasa tiene una actividad de polimerasa 5' a 3' y una actividad de exonucleasa 3' a 5' para la corrección de errores.
En algunas realizaciones, cada sonda (p. ej., una primera sonda, una segunda sonda y/o un tercer oligonucleótido) puede comprender un resto reactivo de modo que, tras la hibridación a la diana y la exposición a condiciones de ligación apropiadas, los oligonucleótidos de sondeo se puedan ligar entre sí. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos de sondeo que incluyen un resto reactivo se ligan químicamente. Por ejemplo, una primera sonda capaz de hibridarse a una primera región diana (p. ej., una primera secuencia diana o una primera porción) de una molécula de ácido nucleico puede comprender un primer resto reactivo, y un segundo oligonucleótido de sondeo capaz de hibridarse a una segunda región diana (p. ej., una segunda secuencia diana o una segunda porción) de la molécula de ácido nucleico puede comprender un segundo resto reactivo. Cuando la primera y la segunda sondas se hibridan a la primera y la segunda regiones diana (p. ej., la primera y la segunda secuencias diana) de la molécula de ácido nucleico, el primer y el segundo restos reactivos pueden ser adyacentes entre sí. Un resto reactivo de una sonda se puede seleccionar del grupo no limitativo que consiste en azidas, alquinos, nitronas (p. ej., 1,3-nitronas), alquenos tensionados (p. ej., transcicloalquenos tales como ciclooctenos u oxanorbornadieno), tetrazinas, tetrazoles, yoduros, tioatos (p. ej., fosforotioato), ácidos, aminas y fosfatos. Por ejemplo, el primer resto reactivo de una primera sonda puede comprender un resto azida, y un segundo resto reactivo de una segunda sonda puede comprender un resto alquino. El primer y el segundo restos reactivos pueden reaccionar para formar un resto de empalme. Una reacción entre el primer y el segundo restos reactivos puede ser, por ejemplo, una reacción de cicloadición tal como una cicloadición azida-alquino promovida por tensión, una cicloadición azida-alquino catalizada por cobre, una cicloadición alquino-nitrona promovida por tensión, una reacción de Diels-Alder, una cicloadición [3+2], una cicloadición [4+2] o una cicloadición [4+1]; una reacción tiol-eno; una reacción de subestación nucleófila; u otra reacción. En algunos casos, la reacción entre el primer y segundo restos reactivos puede dar un resto triazol o un resto isoxazolina. Una reacción entre el primer y el segundo restos reactivos puede implicar someter los restos reactivos a condiciones adecuadas tales como una temperatura, un pH o una presión adecuados y proporcionar uno o más reactivos o catalizadores para la reacción. Por ejemplo, una reacción entre el primer y el segundo restos reactivos puede ser catalizada por un catalizador de cobre, un catalizador de rutenio o una especie tensionada tal como un difluorooctino, un dibencilciclooctino o una biarilazaciclooctinona. La reacción entre un primer resto reactivo de una primera sonda hibridada a una primera región diana (p. ej., una primera secuencia diana o primera porción) de la molécula de ácido nucleico y un segundo resto reactivo de un tercer oligonucleótido de sondeo hibridado a una segunda región diana (p. ej., una primera secuencia diana o una primera porción) de la molécula de ácido nucleico se puede empalmar a la primera sonda y la segunda sonda para proporcionar una sonda ligada. Tras el empalme, la primera y segunda sonda se pueden considerar ligadas. Según esto, la reacción del primer y el segundo restos reactivos puede comprender una reacción de ligación química tal como una reacción química "clic” de azida 5' a alquino 3' catalizada por cobre para formar un empalme de triazol entre dos oligonucleótidos de sondeo. En otros ejemplos no limitativos, un resto yoduro se puede ligar químicamente a un resto fosforotioato para formar un enlace fosforotioato, un ácido se puede ligar a una amina para formar un enlace amida y/o un fosfato y una amina se pueden ligar para formar un enlace fosforamidato.
En algunos casos, la ligación se realiza en un n tampón de ligación. En casos en los que la ligación de la sondas se realice sobre sondas que contienen dirribonucleótidos, el tampón de ligación puede incluir tampón de ARN ligasa T42, enzima (p. ej., ligasa RNL2) y agua libre de nucleasas. En casos en los que la ligación de la sondas se realice sobre sondas de ADN, el tampón de ligación puede incluir Tris-HCl pH 7,5, MnCl2, ATP, DTT, líquido sustituto (p. ej., glicerol), enzima (p. ej., ligasa SplintR) y agua libre de nucleasas.
En algunas realizaciones, el tampón de ligación incluye reactivos adicionales. En algunos casos, el tampón de ligación 55 incluye trifosfato de adenosina (ATP) se añade durante la reacción de ligación. La selladura catalizada por ADN ligasa de sustratos de ADN mellados se activa en primer lugar a través de hidrólisis de ATP, dando como resultado la adición covalente de un grupo AMP a la enzima. Después de unirse a un sitio mellado en un dúplex de ADN, la ligasa transfiere el AMP al extremo 5' fosforilado en la mella, formando un enlace pirofosfato 5'-5'. Finalmente, la ligasa cataliza un ataque sobre este enlace pirofosfato por el grupo OH en el extremo 3' de la mella, sellándola de ese modo, después de lo cual la se liberan ligasa y AMP. Si la ligasa se separa del sustrato antes del ataque en 3', p. ej., debido a la recarga prematura de AMP de la enzima, entonces el AMP 5' se deja en el extremo 5', bloqueando intentos de ligación adicionales. En algunos casos, se añade ATP a una concentración de aproximadamente l pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 1000 pM o aproximadamente 10000 pM durante la reacción de ligación.
En algunas realizaciones, se añaden cofactores que ayudan en la ligadura de los oligonucleótidos de sondeo durante el procedimiento de ligación. En algunos casos, los cofactores incluyen iones magnesio (Mg2+). En algunos casos, los cofactores incluyen iones manganeso (Mn2+). En algunos casos, el Mg2+ se añade en forma de MgCl2. En algunos casos, el Mn2+ se añade en forma de MnCl2. En algunos casos, la concentración de MgCl2 está en aproximadamente 1 mM, en aproximadamente 10 mM, en aproximadamente 100 mM o en aproximadamente 1000 mM. En algunos casos, la concentración de MnCl2 está en aproximadamente 1 mM, en aproximadamente 10 mM, en aproximadamente 100 mM o en aproximadamente 1000 mM.
En algunas realizaciones, el producto de ligación incluye un dominio de captura de sondas de captura, que se puede unir a una sonda de captura (p. ej., una sonda de captura inmovilizada, directamente o indirectamente, sobre un sustrato). En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en este documento incluyen poner en contacto una muestra biológica con un sustrato, donde la sonda de captura se fija al sustrato (p. ej., se inmoviliza al sustrato, directamente o indirectamente). En algunas realizaciones, el dominio de captura de la sonda de captura de la sonda ligada específicamente se une al dominio de captura.
Después de la ligación, en algunos casos, la muestra biológica se lava con un tampón de lavado de posligación. En algunos casos, el tampón de lavado de posligación incluye uno o más de SSC (p. ej., 1x SSC), carbonato de etileno o formamida y agua libre de nucleasas. En algunos casos, la muestra biológica se lava en esta fase a de aproximadamente 50°C a aproximadamente 70°C. En algunos casos, la muestra biológica se lava a aproximadamente 60°C.
(i) Ligación que incluye fosfato 5' preadenilado sobre la segunda sonda
Se proporcionan en este documento métodos para determinar una localización de un ácido nucleico diana en una muestra biológica que incluyen: (a) poner en contacto la muestra biológica con un sustrato que comprende una pluralidad de sondas de captura, donde una sonda de captura de la pluralidad de sondas de captura comprende un dominio de captura y un código de barras espacial; (b) hibridar un ácido nucleico diana en la muestra biológica con una primera sonda y una segunda sonda, donde la primera sonda comprende, de 3' a 5', una secuencia sustancialmente complementaria al dominio de captura y una secuencia que es sustancialmente complementaria a una primera secuencia en el ácido nucleico diana y tiene un grupo fosfato preadenilado en el extremo 5'; la segunda sonda comprende una secuencia sustancialmente complementaria a una segunda secuencia en el ácido nucleico diana; (c) 30 generar un producto de ligación al ligar un extremo 3' de la segunda sonda al extremo 5' de la primera sonda usando una ligasa que no requiera trifosfato de adenosina para la actividad de ligasa; (d) liberar el producto de ligación del ácido nucleico diana y unir el dominio de captura del producto de ligación específicamente al dominio de captura de la sonda de captura; y (e) determinar (i) toda o parte de una secuencia correspondiente al producto de ligación, o uno de sus complementos, y (ii) toda o parte de una secuencia correspondiente al código de barras espacial, o uno de sus 35 complementos, y usar las secuencias determinadas de (i) y (ii) para identificar la localización del ácido nucleico diana en la muestra biológica.
En algunos casos, la ligasa que no requiere trifosfato de adenosina para la actividad de ligasa (p. ej., 5' AppADN/ARN ligasa termoestable, ARN ligasa T42 truncada (trRnl2), ARN ligasa T4 2 truncada K227Q, ARN ligasa T42 truncada 40 KQ, ADN ligasa de virus de Chlorella PBCV-1, y sus combinaciones). Véanse, p. ej. Nichols y cols., "RNA Ligases", Curr. Protocol. Molec. Biol.
84(1):3.15.1-.4 (2008); Viollet y cols., "T4 RNA Ligase 2 Truncated Active Site Mutants:
Improved Tools for RNA Analysis," BMC Biotechnol. 11: 72 (2011); y Ho y cols., "Bacteriophage T4 RNA Ligase 2 (gp24.1) Exemplifies a Family of RNA Ligases Found in All Phylogenetic Domains," PNAS 99(20): 12709-14 (2002), para una descripción de ARN ligasas T4 y ARN ligasas T4 truncadas. La 5' AppADN/ARN ligasa es una enzima perteneciente a la familia de las ligasas que cataliza la ligación del extremo 3' de ARNss o ADNss a un ADNss adenilado en 5' o ARNss adenilado en 5'. La ARN ligasa T42 es una enzima perteneciente a la familia de las ligasas que cataliza la ligación de mellas de ARNds y ARNss a ARNss. También puede ligar el extremo 3' de ARN o ADN a un ADNp 5' cuando se reasocie con un complemento de ARN, y el extremo 3' de ARN a un ARNp 5' cuando se reasocie a un complemento de ADN, con eficacia reducida. La ARN ligasa T42 truncada K227Q es una enzima perteneciente a la familia de las 50 ligasas que cataliza la ligación del extremo 3' de ARNss a ADNss adenilado en 5' y ARNss adenilado en 5'. Tiene una reducción de productos secundarios en comparación con ARN ligasa T42 truncada. La ARN ligasa T42 truncada KQ es una enzima perteneciente a la familia de las ligasas que cataliza la ligación del extremo 3' de ARNss a ADNss adenilado en 5' y ARNss adenilado en 5'. Es una elección preferida para la ligación de ARNss a adaptadores preadenilados y tiene una reducción de productos secundarios en comparación con la ARN ligasa T42 truncada.
En algunas realizaciones, la ARN ligasa T4 comprende una mutación K227Q. Véase Viollet y cols., "T4 RNA Ligase 2 Truncated Active Site Mutants: Improved Tools for RNA Analysis,"BMC Biotechnol.11.
En algunos casos, se añaden cofactores que ayudan en la ligación de la primera y la segunda sonda durante la ligación.
En algunos casos, los cofactores incluyen iones magnesio (Mg2+). En algunos casos, los cofactores incluyen iones manganeso (Mn2+). En algunos casos, el Mg2+ se añade en forma de MgCl2. En algunos casos, el Mn2+ se añade en forma de MnCl2. En algunos casos, la concentración de MgCh está en de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM. En algunos casos, la concentración de MnCh está en de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM.
En algunos casos, la ligación se produce a un pH en el intervalo de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9,0, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,0 o de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,0.
En algunas realizaciones, el tampón de ligación incluye un tampón de almacenamiento de enzimas. En algunas realizaciones, el tampón de almacenamiento de enzimas incluye glicerol. En algunas realizaciones, el tampón de ligación está complementado con glicerol. En algunas realizaciones, el glicerol está presente en el tampón de ligación en un volumen total de 15% v/v. (l) Permeabilización y liberación del producto ligado
En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en este documento incluyen una etapa de permeabilización. En algunas realizaciones, la permeabilización se produce usando una proteasa. En algunas realizaciones, la proteasa es una endopeptidasa. Endopeptidasas que se pueden usar incluyen pero no se limitan a tripsina, quimotripsina, elastasa, termolisina, pepsina, clostripano, glutamil endopeptidasa (GluC), ArgC, peptidil-asp endopeptidasa (ApsN), endopeptidasa LysC y endopeptidasa LysN. En algunas realizaciones, la endopeptidasa es pepsina. En algunas realizaciones, la muestra biológica se permeabiliza contemporáneamente con o antes de la puesta en contacto de la muestra biológica con sondas de eliminación de ARN no deseable. En algunas realizaciones, la muestra biológica se permeabiliza después de que la muestra biológica se ponga en contacto con sondas de eliminación de ARN no deseable. En algunas realizaciones, la muestra biológica se permeabiliza después de que la muestra biológica se ponga en contacto con sondas de eliminación de ARN no deseable pero antes de la puesta en contacto con la micromatriz. En algunas realizaciones, la muestra biológica se permeabiliza después de que la muestra biológica se ponga en contacto con sondas de eliminación de ARN no deseable pero antes de la puesta en contacto con un primer oligonucleótido de sondeo y un segundo oligonucleótido de sondeo. En algunas realizaciones, después de crear un producto de ligación (p. ej., al ligar una primera sonda y una segunda sonda que se hibridan a secuencias adyacentes en el analito), la muestra biológica se permeabiliza. En algunas realizaciones, la muestra biológica se permeabiliza contemporáneamente con o antes de la puesta en contacto de la muestra biológica con una primera sonda y una segunda sonda, la hibridación de la primera sonda y la segunda sonda al analito, la generación de un producto de ligación al ligar la primera sonda y la segunda sonda y la liberación del producto ligado desde el analito.
En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en este documento incluyen la permeabilización de la muestra biológica de modo que la sonda de captura pueda unirse más fácilmente a la sonda ligada capturada (es decir, en comparación con ausencia de permeabilización). En algunas realizaciones, se pueden añadir reactivos de transcripción inversa (RT) a muestras biológicas permeabilizadas. La incubación con los reactivos de RT puede producir ADNc de longitud completa con código de barras espacial a partir de los analitos capturados (p. ej., ARNm poliadenilado). Se pueden añadir reactivos para la segunda cadena (p. ej., cebadores de la segunda cadena, enzimas) a la muestra biológica sobre el portaobjetos para iniciar la síntesis de la segunda cadena.
En algunos casos, la etapa de permeabilización incluye la aplicación de un tampón de permeabilización a la muestra biológica. En algunos casos, el tampón de permeabilización incluye un tampón (p. ej., Tris pH 7,5), MgCl2, detergente Sarkosyl (p. ej., lauroilsarcosinato sódico), enzima (p. ej., proteinasa K) y agua libre de nucleasas. En algunos casos, la etapa de permeabilización se realiza a 37°C. En algunos casos, la etapa de permeabilización se realiza durante de aproximadamente 20 minutos a 2 horas (p. ej., aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 1,5 horas o aproximadamente 2 horas). En algunos casos, la etapa de liberación se realiza durante aproximadamente 40 minutos.
En algunas realizaciones, después de generar un producto de ligación, el producto de ligación se libera del analito. En algunas realizaciones, un producto de ligación se libera del analito usando una endorribonucleasa. En algunas realizaciones, la endorribonucleasa es ARNasa H, ARNasa A, ARNasa C o ARNasa I. En algunas realizaciones, la endorribonucleasa es ARNasa H. La ARNasa H es una endorribonucleasa que hidroliza específicamente los enlaces fosfodiéster de ARN, cuando se hibrida a ADN. La ARNasa H es parte de una familia conservada de ribonucleasas que están presentes en muchos organismos diferentes. Existen dos clases principales de ARNasa H: ARNasa H1 y ARNasa H2. Las enzimas ARNasa H retrovirales son similares a la ARNasa H1 procariótica. Todas estas enzimas comparten la 50 característica de que son capaces de escindir el componente de ARN de un heterodúplex de ARN:ADN. En algunas realizaciones, la ARNasa H es ARNasa H1, ARNasa H2 o ARNasa H1 o ARNasa H2. En algunas realizaciones, la ARNasa H incluye pero no se limita a ARNasa HII dePyrococcus furiosus,ARNasa HII dePyrococcus horikoshi,ARNasa HI deThermococcus litoralis,ARNasa HI deThermus thermophilus,ARNasa HI de E. coli o ARNasa HII de E. coli.
En algunos casos, la etapa de liberación se realiza usando un tampón de liberación. En algunos casos, el tampón de liberación incluye uno o más de un tampón (p. ej., Tris pH 7,5), una enzima (p. ej., ARNasa H) y agua libre de nucleasas. En algunos casos, la etapa de liberación se realiza a 37°C. En algunos casos, la etapa de liberación se realiza durante aproximadamente de 20 minutos a 2 horas (p. ej. aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 1,5 horas o aproximadamente 2 horas). En algunos casos, la etapa de liberación se realiza durante aproximadamente 30 minutos.
En algunos casos, la etapa de liberación se produce antes de la etapa de permeabilización. En algunos casos, la etapa de liberación se produce después de la etapa de permeabilización. En algunos casos, la etapa de liberación se produce al mismo tiempo que la etapa de permeabilización (p. ej., en el mismo tampón).
(m) Muestras biológicas
Los métodos divulgados en este documento se pueden realizar sobre cualquier tipo de muestra. En algunas realizaciones, la muestra es un tejido reciente. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra congelada. En algunas realizaciones, la muestra se congelaba previamente. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra embebida en parafina, fijada con formalina (FFPE).
Los sujetos de los que se pueden obtener muestras biológicas pueden ser individuos sanos o asintomáticos, individuos que tienen o se sospecha que tienen una enfermedad (p. ej., cáncer) o una predisposición a una enfermedad, y/o individuos que necesitan terapia o se sospecha que necesitan terapia. En algunos casos, la muestra biológica puede incluir una o más células enfermas. Una célula enferma puede tener propiedades metabólicas, expresión génica, expresión proteínica y/o rasgos morfológicos alterados. Ejemplos de enfermedades incluyen trastornos inflamatorios, trastornos metabólicos, trastornos del sistema nervioso y cáncer. En algunos casos, la muestra biológica incluye células cancerosas o tumorales. Las células cancerosas se pueden derivar de tumores sólidos, neoplasias hematológicas, líneas celulares o se pueden obtener como células tumorales circulatorias. En algunos casos, la muestra biológica es una muestra heterogénea. En algunos casos, la muestra biológica es una muestra heterogénea que incluye células tumorales o cancerosas y/o células estromáticas,
En algunos casos, el cáncer es cáncer de mama. En algunos casos, el cáncer de mama es cáncer de mama triplemente positivo (TPBC). En algunos casos, el cáncer de mama es cáncer de mama triplemente negativo (TNBC).
En algunos casos, el cáncer es cáncer colorrectal. En algunos casos, el cáncer es cáncer ovárico. En ciertas realizaciones, el cáncer es cáncer epidermoide, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer gastrointestinal, linfoma hodgkiniano o no hodgkiniano, cáncer pancreático, glioblastoma, glioma, cáncer de cuello uterino, cáncer ovárico, cáncer hepático, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, mieloma, carcinoma de glándulas salivares, cáncer renal, carcinoma de células basales, melanoma, cáncer prostático, cáncer vulvar, cáncer tiroideo, cáncer testicular, cáncer esofágico o un tipo de cáncer de cabeza o cuello. En ciertas realizaciones, el cáncer tratado es melanoma desmoplástico, cáncer de mama inflamatorio, timoma, cáncer rectal, cáncer anal, o glioma del tronco encefálico tratable quirúrgicamente o no tratable quirúrgicamente. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano.
Las muestras FFPE generalmente están muy reticuladas y fragmentadas, y por lo tanto este tipo de muestra permite una recuperación limitada de ARN usando técnicas de detección convencionales. En ciertas realizaciones, los métodos de captura de ARN elegido como diana proporcionados en este documento están menos afectados por la degradación de ARN asociada con la fijación con FFPE que otros métodos (p. ej., métodos que se benefician de la captura de oligo- dT y la transcripción inversa de ARNm). En ciertas realizaciones, los métodos proporcionados en este documento permiten una medición sensible de genes de interés específicos que de otro modo podrían perderse con un enfoque transcriptómico global.
En algunos casos, las muestras FFPE se tiñen (p. ej. usando H y E). Los métodos divulgados en este documento son compatibles con H y E permitirán la superposición en un contexto morfológico con el análisis transcriptómico. Sin embargo, dependiendo de la necesidad, algunas muestras se pueden teñir solo con un tinte nuclear, tal como la tinción de una muestra solo con hematoxilina y no eosina, cuando se necesite la localización de un núcleo celular.
En algunas realizaciones, una muestra biológica (p. ej., una sección tisular) se puede fijar con metanol, teñir con hematoxilina y eosina y someterse a obtención de imágenes. En algunas realizaciones, la fijación, la tinción y la obtención de imágenes se produce antes de que una o más sondas se hibriden a la muestra. Algunas realizaciones de cualquiera de los flujos de trabajo descritos en este documento pueden incluir además una etapa de destinción (p. ej., una etapa de destinción de hematoxilina y eosina), después de la obtención de imágenes de la muestra y antes de permeabilizar la muestra. Por ejemplo, la destinción se puede realizar al realizar una o más (p. ej., una, dos, tres, cuatro o cinco) etapas de lavado (p. ej., una o más (p. ej., una, dos, tres, cuatro o cinco) etapas de lavado realizadas usando un tampón que incluye HCl). Las imágenes se pueden usar para cartografiar patrones espaciales de expresión génica de nuevo en la muestra biológica. Se puede usar una enzima de permeabilización para permeabilizar la muestra biológica directamente sobre el portaobjetos.
En algunas realizaciones, la muestra FFPE se desparafina, se permeabiliza, se equilibra y se bloquea antes de que se añadan oligonucleótidos diana. En algunas realizaciones, la desparafinación usa xilenos. En algunas realizaciones, la desparafinación incluye múltiples lavados con xilenos. En algunas realizaciones, la desparafinación incluye múltiples lavados con xilenos seguidos por retirada de los xilenos usando múltiples rondas de alcohol graduado seguido por el lavado de la muestra con agua. En algunos aspectos, el agua es agua desionizada. En algunas realizaciones, el equilibrado y el bloqueo incluye incubar la muestra en un tampón prehib. En algunas realizaciones, el tampón prehib. incluye ARNt de levadura. En algunas realizaciones, la permeabilización de una muestra incluye el lavado de la muestra con un tampón de fosfato. En algunas realizaciones, el tampón es PBS. En algunas realizaciones, el tampón es PBST.
(n) Determinación de la secuencia del producto de ligación
Después de que un analito (p. ej., una molécula de ARNm) o un producto de ligación procedente de la muestra se haya hibridado o se haya asociado de otro modo con una sonda de captura según cualquiera de los métodos descritos anteriormente en relación con la metodología analítica espacial basada en células, se analizan las construcciones con código de barras que resultan de la hibridación/asociación.
En algunas realizaciones, después de poner en contacto una muestra biológica con un sustrato que incluye sondas de captura, se puede realizar opcionalmente una etapa de retirada para retirar del sustrato toda o una porción de la muestra biológica. En algunas realizaciones, la etapa de retirada incluye la degradación enzimática y/o química de células de la muestra biológica. Por ejemplo, la etapa de retirada puede incluir tratar la muestra biológica con una enzima (p. ej., una proteinasa, p. ej., proteinasa K) para retirar des sustrato al menos una porción de la muestra biológica. En algunas realizaciones, la etapa de retirada puede incluir la ablación del tejido (p. ej., ablación láser).
En algunas realizaciones, se proporcionan en este documento métodos para detectar espacialmente un analito (p. ej., detectar la localización de un analito, p. ej., un analito biológico) de una muestra biológica (p. ej., presente en una muestra biológica), comprendiendo el método: (a) opcionalmente teñir y/o obtener imágenes de una muestra biológica sobre un sustrato; (b) permeabilizar (p. ej., proporcionar una solución que comprende un agente de permeabilización a) la muestra biológica sobre el sustrato; (c) poner en contacto la muestra biológica con una micromatriz que comprende una pluralidad de sondas de captura, donde una sonda de captura de la pluralidad captura el analito biológico; (d) hibridar una sonda de eliminación de ARN no deseable a un ARN no deseable; (e) retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable; (f) hibridar el analito a un dominio de captura de una sonda de captura que está fijada al sustrato; y (g) analizar el analito biológico capturado, detectando de ese modo espacialmente el analito biológico; donde la muestra biológica se retira totalmente o parcialmente del sustrato.
En algunas realizaciones, una muestra biológica no se retira del sustrato. Por ejemplo, la muestra biológica no se retira del sustrato antes de la liberación de una sonda de captura (p. ej., una sonda de captura unida a un analito) del sustrato. En algunas realizaciones, esta liberación comprende la escisión de la sonda de captura del sustrato (p. ej., a través de un dominio de escisión). En algunas realizaciones, esta liberación no comprende liberar la sonda de captura del sustrato (p. ej., se puede elaborar una copia de la sonda de captura unida a un analito y la copia se puede liberar del sustrato, p. ej., a través de desnaturalización). En algunas realizaciones, la muestra biológica no se retira del sustrato antes del análisis de un analito unido a una sonda de captura después de que se libere del sustrato. En algunas realizaciones, la muestra biológica permanece sobre el sustrato durante la retirada de una sonda de captura del sustrato y/o el análisis de un analito unido a la sonda de captura después de que se libere del sustrato. En algunas realizaciones, la muestra biológica permanece sobre el sustrato durante la retirada (p. ej., a través de desnaturalización) de una copia de la sonda de captura (p. ej., complemento). En algunas realizaciones, el análisis de un analito unido a una sonda de captura desde el sustrato se puede realizar sin someter la muestra biológica a degradación enzimática y/o química de las células (p. 35 ej., células permeabilizadas) o ablación del tejido (p. ej., ablación láser).
En algunas realizaciones, al menos una porción de la muestra biológica no se retira del sustrato. Por ejemplo, una porción de la muestra biológica puede permanecer sobre el sustrato antes de liberar una sonda de captura (p. ej., una prueba de captura unida a un analito) del sustrato y/o analizar un analito unido a una sonda de captura liberada del sustrato. En algunas realizaciones, al menos una porción de la muestra biológica no se somete a degradación enzimática y/o química de las células (p. ej., células permeabilizadas) o ablación del tejido (p. ej., ablación láser) antes del análisis de un analito unido a una sonda de captura a partir del sustrato.
En algunas realizaciones, se proporcionan en este documento métodos para detectar espacialmente un analito (p. ej., detectar la localización de un analito, p. ej., un analito biológico) a partir de una muestra biológica (p. ej., presente en una muestra biológica) que incluyen: (a) opcionalmente teñir y/o someter a obtención de imágenes una muestra biológica sobre un sustrato; (b) permeabilizar (p. ej., proporcionar una solución que comprende un reactivo de permeabilización a) la muestra biológica sobre el sustrato; (c) poner en contacto la muestra biológica con una micromatriz que comprende una pluralidad de sondas de captura, donde una sonda de captura de la pluralidad captura el analito biológico; (d) hibridar una sonda de eliminación de ARN no deseable a un ARN no deseable; (e) retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable; (f) hibridar el analito a un dominio de captura de una sonda de captura que está fijada al sustrato; y (g) analizar el analito biológico capturado, detectando de ese modo espacialmente el analito biológico; donde la muestra biológica no se retira del sustrato.
En algunas realizaciones, se proporcionan en este documento métodos para detectar espacialmente un analito biológico de interés a partir de una muestra biológica que incluyen: (a) teñir y obtener imágenes de una muestra biológica sobre un sustrato; (b) proporcionar una solución que comprende un reactivo de permeabilización a la muestra biológica sobre el sustrato; (c) poner en contacto la muestra biológica con una micromatriz sobre un sustrato, donde la micromatriz comprende una o más pluralidades de sondas de captura, permitiendo de ese modo que la una o más pluralidades de sondas de captura capturen el analito biológico de interés; (d) hibridar una sonda de eliminación de ARN no deseable a un ARN no deseable; (e) retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable; (f) hibridar el analito a un dominio de captura de una sonda de captura que está fijada al sustrato; y (g) analizar el analito biológico capturado, detectando de ese modo espacialmente el analito biológico de interés; donde la muestra biológica no se retira del sustrato.
En algunas realizaciones, el método incluye además someter una región de interés en la muestra biológica a análisis transcriptómico espacial. En algunas realizaciones, una o más de las sondas de captura incluyen un dominio de captura. En algunas realizaciones, una o más de las sondas de captura comprenden un identificador molecular único (UMI). En algunas realizaciones, una o más de las sondas de captura comprenden un dominio de escisión. En algunas realizaciones, el dominio de escisión comprende una secuencia reconocida y escindida por uracil-ADN glicosilasa, endonucleasa apurínica/apirimidínica (AP) (APE1), reactivo de ruptura específico de uracilo (USER) y/o una endonucleasa VIII. En algunas realizaciones, una o más sondas de captura no comprenden un dominio de escisión y no se escinden de la micromatriz.
En algunas realizaciones, una sonda de captura se puede extender (una "sonda de captura extendida", p. ej., según se describe en este documento). Por ejemplo, la extensión de una sonda de captura puede incluir generar ADNc a partir de un ARN capturado (hibridado). Este procedimiento implica la síntesis de una cadena complementaria del ácido nucleico hibridado, p. ej., generar ADNc basándose en plantilla de ARN capturada (el ARN hibridado al dominio de captura de la sonda de captura). Así, en una etapa inicial de extensión de una sonda de captura, p. ej., la generación de ADNc, el ácido nucleico, p. ej. ARN, capturado (hibridado) actúa como una plantilla para la etapa de extensión, p. ej., transcripción inversa. En algunas realizaciones, la sonda de captura se extiende después de hibridar una sonda de eliminación de ARN no deseable a un ARN no deseable y retirar la pluralidad de complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable.
En algunas realizaciones, la sonda de captura se extiende usando transcripción inversa. Por ejemplo, la transcripción inversa incluye sintetizar ADNc (ADN complementario o de copia) a partir de ARN, p. ej., (ARN mensajero), usando una transcriptasa inversa. En algunas realizaciones, la transcripción inversa se realiza mientras el tejido todavía está en su lugar, generando una biblioteca de analitos, donde la biblioteca de analitos incluye los códigos de barras espaciales procedentes de las sondas de captura adyacentes. En algunas realizaciones, la sonda de captura se extiende usando una o más ADN polimerasas.
En algunas realizaciones, un dominio de captura de una sonda de captura incluye un cebador para producir la cadena complementaria de un ácido nucleico hibridado a la sonda de captura, p. ej., un cebador para ADN polimerasa y/o transcripción inversa. Las moléculas de ácido nucleico, p. ej., ADN y/o ADNc, generadas por la reacción de extensión incorporan la secuencia de la sonda de captura. La extensión de la sonda de captura, p. ej., una reacción de ADN polimerasa y/o transcripción inversa, se puede realizar usando una variedad de enzimas y protocolos adecuados.
En algunas realizaciones, se genera una molécula de ADN (p. ej., ADNc) de longitud completa. En algunas realizaciones, una molécula de ADN "de longitud completa" se refiere a la totalidad de la molécula de ácido nucleico capturada. Sin embargo, si un ácido nucleico (p. ej., ARN) se degradaba parcialmente en la muestra tisular, entonces las moléculas de ácido nucleico capturadas no tendrán la misma longitud que el ARN inicial en la muestra tisular. En algunas realizaciones, el extremo 3' de las sondas extendidas, p. ej., moléculas de ADNc de la primera cadena, se modifica. Por ejemplo, un empalme o adaptador se puede ligar al extremo 3' de las sondas extendidas. Esto se puede conseguir usando enzimas de ligación monocatenarias tales como ARN ligasa T4 o CircligaseTM (disponible de Lucigen, Middleton, WI). En algunas realizaciones, se usan oligonucleótidos de cambio de plantilla para extender ADNc a fin de generar un ADNc de longitud completa (o tan cerca de un ADNc de longitud completa como sea posible). En algunas realizaciones, una sonda cooperadora de síntesis de la segunda cadena (una molécula de ADN parcialmente bicatenario capaz de hibridarse al extremo 3' de la sonda de captura extendida) se puede ligar al extremo 3' de la molécula de la sonda extendida, p. ej., ADNc, de la primera cadena usando una enzima de ligación bicatenaria tal como ADN ligasa T4. Otras enzimas apropiadas para la etapa de ligación son conocidas en la técnica e incluyen, p. ej., ADN 45 ligasa Tth, ADN ligasa Taq, ADN ligasa de Thermococcus sp. (cepa 9°N) (9°NTM DNA ligase, New England Biolabs), AmpligaseTM (disponible de Lucigen, Middleton, WI) y SplintR (disponible de New England Biolabs, Ipswich, MA). En algunas realizaciones, se incorpora una cola polinucleotídica, p. ej., una cola de poli(A), en el extremo 3' de las moléculas de sondeo extendidas. En algunas realizaciones, la cola polinucleotídica se incorpora usando una enzima activa como transferasa terminal.
En algunas realizaciones, las sondas de captura extendidas bicatenarias se tratan para retirar cualesquiera sondas de captura no extendidas antes de la amplificación y/o el análisis, p. ej., análisis de secuencias. Esto se puede conseguir mediante una variedad de métodos, p. ej., usando una enzima para degradar las sondas no extendidas, tal como una enzima exonucleasa, o columnas de purificación.
En algunas realizaciones, las sondas de captura extendidas se amplifican para dar cantidades que sean suficientes para el análisis, p. ej., a través de secuenciación de ADN. En algunas realizaciones, la primera cadena de las sondas de captura (p. ej., moléculas de ADN y/o ADNc) extendidas actúa como una plantilla para la reacción de amplificación (p. ej., una reacción en cadena de la polimerasa).
En algunas realizaciones, la reacción de amplificación incorpora un grupo de afinidad sobre la sonda de captura (p. ej. híbrido de ARN-ADNc) extendida usando un cebador que incluye el grupo de afinidad. En algunas realizaciones, el cebador incluye un grupo de afinidad y las sondas de captura extendidas incluye el grupo de afinidad. El grupo de afinidad puede corresponder a cualquiera de los grupos de afinidad descritos previamente.
En algunas realizaciones, las sondas de captura extendidas que incluyen el grupo de afinidad se pueden acoplar a un sustrato específico para el grupo de afinidad. En algunas realizaciones, el sustrato puede incluir un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, el sustrato incluye avidina o estreptavidina y el grupo de afinidad incluye biotina. En algunas realizaciones, el sustrato incluye maltosa y el grupo de afinidad incluye proteína de unión a maltosa. En algunas realizaciones, el sustrato incluye proteína de unión a maltosa y el grupo de afinidad incluye maltosa. En algunas realizaciones, la amplificación de las sondas de captura extendidas puede funcionar para liberar las sondas extendidas de la superficie del sustrato, en la medida que las copias de las sondas extendidas no estén inmovilizadas sobre el sustrato.
En algunas realizaciones, la sonda de captura extendida o su complemento o amplicón se libera. La etapa de liberación de la sonda de captura extendida o su complemento o amplicón desde la superficie del sustrato se puede conseguir de un número de modos. En algunas realizaciones, una sonda de captura extendida o uno de sus complementos se libera de la micromatriz mediante escisión del ácido nucleico y/o mediante desnaturalización (p. ej., al calentar para desnaturalizar una molécula bicatenaria).
En algunas realizaciones, la sonda de captura extendida o su complemento o amplicón se libera de la superficie del sustrato (p. ej., micromatriz) por medios físicos. Por ejemplo, cuando la sonda de captura extendida está indirectamente inmovilizada sobre el sustrato de la micromatriz, p. ej., a través de hibridación a una sonda superficial, puede ser suficiente interrumpir la interacción entre la sonda de captura extendida y la sonda superficial. Métodos para interrumpir la interacción entre moléculas de ácido nucleico incluyen desnaturalizar moléculas de ácido nucleico bicatenarias se conocen en la técnica. Un método sencillo para liberar las moléculas de ADN (es decir, de separación de la micromatriz de las sondas extendidas) es usar una solución que interfiera con los enlaces de hidrógeno de las moléculas bicatenarias. En algunas realizaciones, la sonda de captura extendida se libera mediante una aplicación de solución, tal como agua o tampón, calentada, de al menos 85°C, p. ej., al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99°C. En algunas realizaciones, se añade una solución que incluye sales, tensioactivos, etc. que puede desestabilizar adicionalmente la interacción entre las moléculas de ácido nucleico para liberar la sonda de captura extendida del sustrato.
En algunas realizaciones, cuando la sonda de captura extendida incluye un dominio de escisión, la sonda de captura extendida se libera de la superficie del sustrato mediante escisión. Por ejemplo, el dominio de escisión de la sonda de captura extendida se puede escindir mediante cualquiera de los métodos descritos en este documento. En algunas realizaciones, la sonda de captura extendida se libera de la superficie del sustrato, p. ej., a través de la escisión de un dominio de escisión en la sonda de captura extendida, antes de la etapa de amplificación de la sonda de captura extendida.
En algunas realizaciones, sondas complementarias a la sonda de captura extendida se pueden poner en contacto con el sustrato. En algunas realizaciones, la muestra biológica puede estar en contacto con el sustrato cuando las sondas se ponen en contacto con el sustrato. En algunas realizaciones, la muestra biológica se puede retirar del sustrato antes de poner en contacto el sustrato con sondas. En algunas realizaciones, las sondas se pueden etiquetar con una etiqueta detectable (p. ej., cualquiera de las etiquetas detectables descritas en este documento). En algunas realizaciones, las sondas que no se unen (p. ej., hibridan) especialmente a una sonda de captura extendida se pueden retirar por lavado. En algunas realizaciones, las sondas complementarias a la sonda de captura extendida se pueden detectar sobre el sustrato (p. ej., obtención de imágenes, cualquiera de los métodos de detección descritos en este documento).
En algunas realizaciones, las sondas complementarias a una sonda de captura extendida pueden tener una longitud de aproximadamente 4 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. En algunas realizaciones, las sondas (p. ej., sondas detectables) complementarias a una sonda de captura extendida pueden tener una longitud de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 90 nucleótidos. En algunas realizaciones, las sondas (p. ej., sondas detectables) complementarias a una sonda de captura extendida pueden tener una longitud de aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 80 nucleótidos. En algunas realizaciones, las sondas (p. ej., sondas detectables) complementarias a una sonda de captura extendida pueden tener una longitud de aproximadamente 30 nucleótidos a aproximadamente 60 nucleótidos. En algunas realizaciones, las sondas (p. ej., sondas detectables) complementarias a una sonda de captura extendida pueden tener una longitud de aproximadamente 40 nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos. En algunas realizaciones, las sondas (p. ej., sondas detectables) complementarias a una sonda de captura extendida pueden tener una longitud de aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, aproximadamente 40, aproximadamente 41, aproximadamente 42, aproximadamente 43, aproximadamente 44, aproximadamente 45, aproximadamente 46, aproximadamente 47, aproximadamente 48, aproximadamente 49, aproximadamente 50, aproximadamente 51, aproximadamente 52, aproximadamente 53, aproximadamente 54, aproximadamente 55, aproximadamente 56, aproximadamente 57, aproximadamente 58, aproximadamente 59, aproximadamente 60, aproximadamente 61, aproximadamente 62, aproximadamente 63, aproximadamente 64, aproximadamente 65, aproximadamente 66, aproximadamente 67, aproximadamente 68, aproximadamente 69, aproximadamente 70, aproximadamente 71, aproximadamente 72, aproximadamente 73, aproximadamente 74, aproximadamente 75, aproximadamente 76, aproximadamente 77, aproximadamente 78, aproximadamente 79, aproximadamente 80, aproximadamente 81, aproximadamente 82, aproximadamente 83, aproximadamente 84, aproximadamente 85, aproximadamente 86, aproximadamente 87, aproximadamente 88, aproximadamente 89, aproximadamente 90, aproximadamente 91, aproximadamente 92, aproximadamente 93, aproximadamente 94, aproximadamente 95, aproximadamente 96, aproximadamente 97, aproximadamente 98 y aproximadamente 99 nucleótidos.
En algunas realizaciones, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 sondas se pueden poner en contacto con el sustrato y unirse (p. ej., hibridarse) específicamente a una sonda de captura extendida. En algunas realizaciones, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 sondas se pueden poner en contacto con el sustrato y unirse (p. ej., hibridarse) específicamente a una sonda de captura extendida. En algunas realizaciones, de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 sondas se pueden poner en contacto con el sustrato y unirse (p. ej., hibridarse) específicamente 15 a una sonda de captura extendida. En algunas realizaciones, de aproximadamente 20 a aproximadamente 90 sondas se pueden poner en contacto con el sustrato y unirse (p. ej., hibridarse) específicamente a una sonda de captura extendida. En algunas realizaciones, de aproximadamente 30 a aproximadamente 80 sondas (p. ej., sondas detectables) se pueden poner en contacto con el sustrato y unirse (p. ej., hibridarse) específicamente a una sonda de captura extendida. En algunas realizaciones, de aproximadamente 40 a aproximadamente 70 sondas se pueden poner en contacto con el sustrato y unirse (p. ej., hibridarse) específicamente a una sonda de captura extendida. En algunas realizaciones, de aproximadamente 50 a aproximadamente 60 sondas se pueden poner en contacto con el sustrato y unirse (p. ej., hibridarse) específicamente a una sonda de captura extendida. . En algunas realizaciones, de aproximadamente 50 a aproximadamente 60 sondas se pueden poner en contacto con el sustrato y unirse (p. ej., hibridarse) específicamente a una sonda de captura extendida. En algunas realizaciones, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, aproximadamente 40, aproximadamente 41, aproximadamente 42, aproximadamente 43, aproximadamente 44, aproximadamente 45, aproximadamente 46, aproximadamente 47, aproximadamente 48, aproximadamente 49, aproximadamente 50, aproximadamente 51, aproximadamente 52, aproximadamente 53, aproximadamente 54, aproximadamente 55, aproximadamente 56, aproximadamente 57, aproximadamente 58, aproximadamente 59, aproximadamente 60, aproximadamente 61, aproximadamente 62, aproximadamente 63, aproximadamente 64, aproximadamente 65, aproximadamente 66, aproximadamente 67, aproximadamente 68, aproximadamente 69, aproximadamente 70, aproximadamente 71, aproximadamente 72, aproximadamente 73, aproximadamente 74, aproximadamente 75, aproximadamente 76, aproximadamente 77, aproximadamente 78, aproximadamente 79, aproximadamente 80, aproximadamente 81, aproximadamente 82, aproximadamente 83, aproximadamente 84, aproximadamente 85, aproximadamente 86, aproximadamente 87, aproximadamente 88, aproximadamente 89, aproximadamente 90, aproximadamente 91, aproximadamente 92, aproximadamente 93, aproximadamente 94, aproximadamente 95, aproximadamente 96, aproximadamente 97, aproximadamente 98 y aproximadamente 99 sondas se pueden poner en contacto con el sustrato y unirse (p. ej., hibridarse) específicamente a una sonda de captura extendida.
En algunas realizaciones, las sondas pueden ser complementarias a un solo analito (p. ej., un solo gen). En algunas realizaciones, las sondas pueden ser complementarias a uno o más analitos (p. ej., analitos en una familia de genes). En algunas realizaciones, las sondas (p. ej., sondas detectables) pueden ser para un conjunto de genes asociados con una enfermedad (p. ej., cáncer, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson).
En algunos casos, el analito y la sonda de captura se pueden amplificar o copiar, creando una pluralidad de moléculas de ADNc. En algunos casos, la sonda ligada y la sonda de captura se pueden amplificar o copiar, creando una pluralidad de moléculas de ADNc. En algunas realizaciones, el ADNc se puede desnaturalizar de la plantilla de la sonda de captura y transferir (p. ej., a un tubo limpio) para la amplificación, y/o la construcción de una biblioteca. El ADNc con código de barras espacial se puede amplificar a través de PCR antes de la construcción de la biblioteca. A continuación, el ADNc se puede fragmentar enzimáticamente y seleccionarse por tamaños a fin de optimizar para el tamaño del amplicón de ADNc. Las secuencias P5 y P7 dirigidas a capturar los amplicones sobre una celdilla de flujo de secuenciación (instrumentos de secuenciación de Illumina) se pueden adjuntar a los amplicones, i7 e i5 se pueden usar como índices de muestra, y TruSeq Read 2 se puede añadir a través de reparación de extremos, formación de cola de A, ligación de adaptadores y PCR. Los fragmentos de ADNc se pueden secuenciar a continuación usando 60 secuenciación de extremos apareados usando TruSeq Read 1 y TruSeq Read 2 como sitios cebadores de secuenciación. Las secuencias adicionales se dirigen a instrumentos de secuenciación de Illumina o instrumentos de secuenciación que utilizan esas secuencias; sin embargo, un experto entenderá que secuencias adicionales o alternativas usadas por otros instrumentos o tecnologías de secuenciación también son igualmente aplicables para el uso en los susodichos métodos.
En algunas realizaciones, cuando se añade un código de barras a una muestra a través de hibridación con sondas de captura o agentes de captura de analito hibridados, unidos o bien asociados con la superficie celular o bien introducidos en la célula, según se describe anteriormente, la secuenciación se puede realizar sobre la muestra intacta.
Se puede usar una amplia variedad de diferentes métodos de secuenciación para analizar analitos (p. ej., un analito y/o el producto de ligación) con código de barras. En general, los polinucleótidos secuenciados pueden ser, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), incluyendo sus variantes o derivados (p. ej., ADN monocatenario o híbridos de ADN/ARN, y moléculas de ácido nucleico con un análogo nucleotídico).
La secuenciación de polinucleótidos se puede realizar mediante diversos sistemas. Más generalmente, la secuenciación se puede realizar usando amplificación de ácidos nucleicos, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (p. ej., PCR digital y PCR digital en gotículas (ddPCR), PCR cuantitativa, PCR en tiempo real, PCR múltiple, métodos simples ("single plex”) basados en PCR, PCR en emulsión) y/o amplificación isotérmica. Ejemplos no limitativos de métodos para secuenciar material genético incluyen, pero no se limitan a, métodos de hibridación de ADN (p. ej., transferencia 15 Southern), métodos de digestión con enzimas de restricción, métodos de secuenciación de Sanger, métodos de secuenciación de próxima generación (p. ej., secuenciación monomolecular en tiempo real, secuenciación en nanoporos y secuenciación de Polony), métodos de ligación y métodos de micromatriz.
(o) Estuches
En algunas realizaciones, también se proporcionan en este documento estuches que incluyen uno o más reactivos para detectar uno o más analitos descritos en este documento. En algunos casos, el estuche incluye un sustrato que comprende una pluralidad de sondas de captura que comprenden un código de barras espacial y el dominio de captura. En algunos casos, el estuche incluye una pluralidad de sondas (p. ej., una primera sonda, una segunda sonda, una o más sondas de puenteo y/o un tercer oligonucleótido).
Un ejemplo no limitativo de un estuche usado para realizar cualquiera de los métodos descritos en este documento incluye: (a) un sustrato que comprende una pluralidad de sondas de captura que comprenden un código de barras espacial y un dominio de captura; (b) un sistema que comprende: una pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable, donde una sonda de eliminación de ARN no deseable de la pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable es sustancialmente complementaria a una secuencia de una molécula de ARN no deseable en la muestra biológica; y (c) instrucciones para realizar el método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
Un ejemplo no limitativo de un estuche usado para realizar cualquiera de los métodos descritos en este documento incluye: (a) un sustrato que comprende una pluralidad de sondas de captura que comprenden un código de barras espacial y un dominio de captura; (b) un sistema que comprende: un primer oligonucleótido de sondeo, un segundo oligonucleótido de sondeo y una pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable, donde el primer oligonucleótido de sondeo y el segundo oligonucleótido de sondeo son sustancialmente complementarios a secuencias adyacentes del analito, donde el segundo oligonucleótido de sondeo comprende un dominio de unión a sondas de captura que es capaz de unirse a un dominio de captura de una sonda de captura, y donde una sonda de eliminación de ARN no deseable de la pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable es sustancialmente complementaria a una secuencia de una molécula de ARN no deseable en la muestra biológica; y (c) instrucciones para realizar el método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
En algunas realizaciones de cualquiera de los estuches descritos en este documento, el estuche incluye una segunda sonda que incluye un grupo fosfato preadenilado en su extremo 5' y una primera sonda que comprende al menos dos bases de ácido ribonucleico en el extremo 3'.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Flujo de trabajo de la eliminación ribosómica por RTL (ligación con plantilla de ARN) espacial in s itu
Otros han presentado diseños de sondas ribosómicas y su aplicación a la eliminación ribosómica de ARN total purificado. Véanse Morlan y cols., " Selective depletion of rRNA enables whole transcriptome profiling of archival fixed tissue." Plos one 7.8 (2012); la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N° 20110111409 Al; la solicitud de patente 55 de EE. UU. N° 62/860.993; y Adiconis y cols., "Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or lowinput samples." Nature methods 10.7 (2013): 623. En la presente, el procedimiento de eliminación de ARN se incorpora en el flujo de trabajo de la ligación con plantilla de ARN en una muestra biológica, donde el ARN ribosómico para eliminación no está purificado, sino que está localizado en una muestra, tal como un tejido. Como un ejemplo no limitativo, y según se muestra en la FIG.
7, el procedimiento de eliminación de ARN se puede 60 realizar usando una muestra tisular biológica que comprende ARNm y ARN ribosómico (ARNr), donde el ARNr se va a eliminar de la muestra. Una pluralidad de sondas de eliminación ribosómica se puede añadir simultáneamente para hibridarse específicamente con ARNr, formando estructuras de dúplex de ARN: ADN. Las sondas de eliminación ribosómica pueden estar diseñadas para hibridarse a la secuencia completa o parcial de la molécula de ARNr. Después de la hibridación, se puede añadir ARNasa H para digerir la cadena de ARN del dúplex de ARN: ADN hibridado, de modo que el ARNr se pueda digerir. A continuación, la muestra biológica se puede permeabilizar para liberar las sondas de RTL ligadas. En este ejemplo, la captura de ARNm diana también se puede realizar coincidentemente con el método de eliminación de ARNr. Para realizar la eliminación de ARNr y la captura de ARNm diana coincidentes, dos sondas de RTL (es decir, sondas de LHS y RHS) se pueden aplicar a la misma muestra simultáneamente con las sondas de eliminación de ARNr. Se deja que las sondas se hibriden a sus dianas durante una reacción de hibridación y una etapa de ligación liga entre sí las sondas de RTL, seguido por digestión con ARNasa H del ARN de los híbridos formados de ADN: ARN, digiriendo de ese modo el ARNr y eliminando esas moléculas mientras que se libera al mismo tiempo el producto de ligación de RTL. La muestra se puede permeabilizar, poniendo en contacto de ese modo los productos de ligación de RTL con una pluralidad de sondas de captura enlazadas a un portaobjetos. Las sondas de RTL ligadas se pueden difundir y unir a una sonda de captura fijada a la superficie del portaobjetos, donde la sonda de captura comprende una secuencia complementaria a una secuencia sobre el producto de ligación de RHS. Después de la hibridación, el extremo 3' de la sonda de captura se puede extender usando las sondas de RTL ligadas como plantilla. A continuación, las sondas de RTL extendidas y ligadas se pueden recoger para la preparación ulterior de una biblioteca y el análisis de expresión espacial posterior.
Como otro ejemplo no limitativo, se pueden añadir sondas de eliminación de ARN a una muestra biológica para hibridarse específicamente con moléculas de ARN no deseado. A continuación, se puede añadir ARNasa H para digerir la cadena de ARN del dúplex de ARN: ADN hibridado, de modo que se puedan digerir las moléculas de ARN no deseado. Las sondas de eliminación de ARN también se pueden retirar usando exonucleasa RecJ. A continuación, la muestra biológica se puede someter a un flujo de trabajo de análisis espacial según se describe en este documento.
Ejemplo 2. La eliminación ribosómica in situ incrementa la captura de ARNm con transcriptómica espacial en muestras clínicas
En general, la eliminación ribosómica se puede realizar al añadir sondas específicas de ARNr antes de permeabilizar muestras tisulares. Como se muestra en la FIG. 8A, las sondas de eliminación ribosómica (sondas de RD) se pueden hibridar a e inhibir específicamente la unión inespecífica de moléculas de ARNr a sondas de captura sobre un sustrato, incrementando de ese modo la captura de ARNm con transcriptómica espacial en muestras clínicas. Después de que se retiren las moléculas de ARNr, la muestra tisular se puede permeabilizar mediante métodos de permeabilización como los descritos en este documento. Se diseñaron sondas de eliminación ribosómica para bloquear ARNr 18S, 28S, 5S y 5,8S citoplásmico, así como ARNr 16S y 12S mitocondrial. Para estos grupos de experimentos, las sondas de eliminación ribosómica incluyen las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 1-195. Las sondas de eliminación ribosómica (p. ej., SEQ ID NOs: 1-195) se combinaron en una reserva que incluye una concentración de 2 pM de cada sonda en tampón de IDTE (Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,5-8,0). Para el análisis transcriptómico espacial, en la etapa de transcripción inversa (RT), el H2O (166,3 pl) se reemplazó por un volumen equivalente (166,3 pl) de las sondas de eliminación ribosómica de reserva en tampón de IDTE. La concentración final de cada sonda de eliminación ribosómica en la mezcla de reacción de RT era aproximadamente 1 pM.
Según se muestra en las FIGS. 8B-8C, la eliminación ribosómica usando las sondas descritas en este documento reducía el nivel de ARNr 18S en la muestra tisular. Los resultados de las FIGS. 8D-8E también indicaban que la eliminación ribosómica incrementaba la unión de sondas específicas de poliA a ARNm.
Se evaluaron los efectos de la eliminación ribosómica sobre la expresión génica. Los niveles de expresión génica se compararon entre muestras de tejido normal y tejido con eliminación ribosómica. Se analizaron tejidos de bulbo olfativo de ratón (MOB), tumor cerebral infantil (PNET) y adiposo y los resultados se muestran en las FIGS. 9A-9C, respectivamente. Los resultados muestran que la mayoría de los genes exhibían niveles de expresión similares tras la eliminación ribosómica, según se indica por los valores de R2. MT-RNR1 y MT-RNR2, que codifican ARNr 12S y 16S mitocondrial, respectivamente, exhibían niveles de expresión reducidos en muestras tisulares con eliminación ribosómica.
Gráficas tisulares que indican los niveles de expresión génica de ARNr 12S y 16S mitocondrial se muestran en la FIG. 10. Ambas moléculas de ARNr presentaban un nivel de expresión reducido tras la eliminación ribosómica en un tejido. Según se muestra en las FIGS. 11-12, se observaron más UMI por gen, así como una tasa de detección incrementada con eliminación ribosómica en el tejido en tejidos adiposo (grasa), de bulbo olfativo de ratón (MOB), MOB-181218 y de cáncer cerebral infantil (PNET).
Se compararon patrones de expresión espacial de diferentes clústeres de Seurat entre un tejido normal y un tejido con eliminación ribosómica en la FIG. 13A y la FIG. 13B, respectivamente. Los resultados muestran que las muestras tisulares con eliminación ribosómica exhibían patrones más claros que las muestras tisulares normales (véanse, p. ej., las FIGS. 13A-B). Los análisis de tejido normal y tejido con eliminación ribosómica adicionales en las FIGS. 14A-14B muestran que en una gráfica de tSNE cada clúster de Seurat procedente de tejido con eliminación ribosómica presentaba límites más claros entre clústeres de Seurat en comparación con muestras tisulares normales, indicando una calidad mejorada del grupo de datos. Los patrones de expresión espacial para cada uno de los clústeres de Seurat a partir de la FIG. 14A (tejido normal) y la FIG.
14B (tejido con eliminación ribosómica) se muestran en la FIG. 15 y la FIG. 16, respectivamente. Estos resultados indican que la eliminación ribosómica mejoraba la capacidad analítica y la exactitud globales de los métodos de análisis espacial de la expresión génica que se describen en este documento.
Otro ejemplo se muestra en las FIGS. 17A-17B y las FIGS. 18A-18B, que apoyaban adicionalmente las conclusiones anteriores. En la muestra tisular normal (véanse las F<i>G<s>.17A-17B), los clústeres 1 y 5 (indicados por flechas) tenían altos niveles de expresión sobre regiones sustancialmente separadas de la muestra tisular (FIG. 17A). Sin embargo, estos dos clústeres presentan patrones interpenetrados en la gráfica de tSNE (véase la FIG. 17B, indicado por flechas). En contraste, los clústeres 3 y 4 (indicados por flechas) en la muestra tisular con eliminación ribosómica (véase la FIG. 18A) también tenían patrones de expresión separados, pero presentaban un límite más claro en la gráfica de tSNE (FIG. 5 18B, indicado por flechas). Así, la eliminación ribosómica mejoraba la calidad global del conjunto de datos para reflejar un patrón de expresión génica espacial más preciso.
Un ejemplo adicional del uso de sondas de eliminación ribosómica en un flujo de trabajo transcriptómico espacial se muestra en las FIGS. 19-21, lo que proporciona datos tanto para la expresión génica global como un grupo ejemplar de genes individuales, comparando las muestras de control con muestras con eliminación ribosómica. Según se apunta anteriormente, cada una de las 195 sondas de eliminación ribosómica (p. ej., las sondas de eliminación ribosómica de las SEQ ID NOs: 1-195) se incluían en una concentración final de 1 pM en la mezcla de reacción de RT de transcriptómica espacial. Según se muestra en las FIGS. 19A-19D, la eliminación ribosómica mejoraba la detección de un subgrupo ejemplar de moléculas de ARNm, incluyendo Perk, Doc2g y Kctd12, FIGS. 19B-19D, respectivamente. Como la reserva de sondas de eliminación ribosómica incluía sondas que elegían como diana MT-RNR1 y MT-RNR2, la eliminación de ARN no deseables se confirmaba al comparar la detección de genes constitutivos (p. ej., Actb y Gapdh) con la detección de MT-RNR1 y MT-RNR2. Según se muestra en las FIGS. 20A-20D, no había cambio en la detección de los genes constitutivos sino una reducción en la detección de MT-RNR1 y MT-RNR2 cuando las muestras se exponían a las sondas de eliminación ribosómica. Adicionalmente, la expresión génica no se veía afectada por la inclusión de las sondas de eliminación ribosómica en el flujo de trabajo de transcriptómica espacial. La comparación de la expresión génica global entre muestras de control y muestras con eliminación ribosómica mostraba una correlación significativa para todas las comparaciones (r de Pearson > 0,97; p < 2,2e-16)). Así, según se apunta anteriormente, estos datos muestran que las sondas de eliminación ribosómica incluidas en el flujo de trabajo de transcriptómica espacial incrementaban la resolución de patrones de expresión génica al mejorar la captura de moléculas de ARNm mientras que no se limitaba el análisis de la expresión génica global.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para identificar una localización de un analito en una muestra biológica, comprendiendo el método: (a) poner en contacto la muestra biológica con una primera sonda, una segunda sonda y una pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable, donde la primera sonda y la segunda sonda son sustancialmente complementarias a 5 secuencias adyacentes del analito, donde la segunda sonda comprende un dominio de unión a sondas de captura que es capaz de unirse a un dominio de captura de una sonda de captura, y donde una sonda de eliminación de ARN no deseable de la pluralidad de sondas de eliminación de ARN no deseable es sustancialmente complementaria a una secuencia de una molécula de ARN no deseable en la muestra biológica;
(b) hibridar la primera sonda y la segunda sonda al analito;
(c) hibridar la sonda de eliminación de ARN no deseable a la molécula de ARN no deseable, formando de ese modo complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable;
(d) ligar la primera sonda y la segunda sonda, creando de ese modo una sonda ligada que es sustancialmente complementaria al analito;
(e) retirar los complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-ARN no deseable y liberar la sonda ligada del analito;
(f) hibridar el dominio de unión a sondas de captura de la sonda ligada al dominio de captura de la sonda de captura que está fijada a un sustrato, donde la sonda de captura comprende además un código de barras espacial; y
(g) determinar (i) toda o una parte de la secuencia de la sonda ligada unida específicamente al dominio de captura, o uno de sus complementos, y (ii) el código de barras espacial, o uno de sus complementos, y usar la secuencia determinada de (i) y (ii) para identificar la localización del analito en la muestra biológica.
2. El método según la reivindicación 1, donde la primera sonda comprende además una primera secuencia, y donde el dominio de unión a sondas de captura comprende una secuencia poliadenilada o uno de sus complementos.
3. El método según la reivindicación 1 o 2, donde la ligación de la primera sonda y la segunda sonda comprende el uso de una ligasa seleccionada de ADN ligasa de virus de Chlorella PBCV-1, una ARN ligase T4 (Rnl2), una ligasa SplintR, una ADN ligasa monocatenaria o una ADN ligasa T4.
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la sonda de eliminación de ARN no deseable es una sonda de ADN.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la etapa de retirada comprende poner en contacto los complejos de sonda de eliminación de ARN no deseable-molécula de ARN no deseable con una ribonucleasa.
6. El método según la reivindicación 5, donde la ribonucleasa es una ARNasa H.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la molécula de ARN no deseable es un ARN de transferencia (ARNt), un ARN ribosómico (ARNr), un ARN mensajero (ARNm), un ARN mitocondrial, un ARN nuclear, un ARN citoplásmico, o sus combinaciones.
8. El método según una cualquiera de la reivindicación 1-7, donde la sonda de eliminación de ARN no deseable comprende además un resto de captura, donde la etapa de retirada comprende el uso de un agente de unión a restos de captura que se une específicamente al resto de captura, donde el resto de captura es estreptavidina, avidina, biotina o un fluoróforo.
9. El método según la reivindicación 8, donde el resto de captura está posicionado 5' o 3' con respecto a la secuencia que es sustancialmente complementaria a la secuencia de the molécula de ARN no deseable.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el analito es un ácido ribonucleico (ARN), opcionalmente donde el ARN es ARNm.
11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la muestra biológica es una muestra tisular, opcionalmente donde la muestra tisular es una muestra tisular embebida en parafina, fijada con formalina (FFPE), una muestra tisular reciente o una muestra tisular congelada.
12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la muestra biológica se teñía previamente, opcionalmente donde la muestra biológica se teñía usando hematoxilina y eosina (H y E), inmunofluorescencia o inmunohistoquímica.
13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además poner en contacto la muestra biológica con un agente de permeabilización.
14. El método según la reivindicación 13, donde el agente de permeabilización se selecciona de un disolvente orgánico, un detergente, una enzima, o una de sus combinaciones.
15. El método según la reivindicación 14, donde el agente de permeabilización comprende proteinasa K o pepsina
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