JP7116062B2 - 多重化シグナル増幅 - Google Patents
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Description
関連出願
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２０１７年１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４４４，７３４号、２０１７年８月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／５４６，４１８号、及び２０１７年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／５４６，８３６号の利益を主張するものであり、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に援用される。
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２０１７年１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４４４，７３４号、２０１７年８月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／５４６，４１８号、及び２０１７年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／５４６，８３６号の利益を主張するものであり、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に援用される。
連邦政府による資金提供を受けた研究
本発明は、米国国防省海軍研究局（U.S. Department of Defense Office of Naval Research）により授与されたＮ０００１４－１３－１－０５９３、Ｎ０００１４－１６－１－２１８２、及びＮ０００１４－１６－１－２４１０の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に対する一定の権利を有する。
本発明は、米国国防省海軍研究局（U.S. Department of Defense Office of Naval Research）により授与されたＮ０００１４－１３－１－０５９３、Ｎ０００１４－１６－１－２１８２、及びＮ０００１４－１６－１－２４１０の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に対する一定の権利を有する。
背景
生体分子の細胞内局在化パターンの知識は、これらの分子がどのように機能するかについての重要な洞察を提供することができる。従って、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）及び免疫蛍光法（ＩＦ）など、生体分子の局在化をインサイチュで調べる技術は、基礎研究から臨床診断法までの広範囲の分野で重要な役割を果たす。これらの方法は、その広範な使用にもかかわらず、フルオロフォアのスペクトルのオーバーラップのために多重化能力が限られている。さらに、標的の存在量が少ない場合又は密集した組織環境との関連で検査される場合、これらの技術を用いて、明確で解釈可能なシグナルを生じるために許容できる信号対雑音比をインサイチュで達成することは、多くの場合に困難である。
生体分子の細胞内局在化パターンの知識は、これらの分子がどのように機能するかについての重要な洞察を提供することができる。従って、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）及び免疫蛍光法（ＩＦ）など、生体分子の局在化をインサイチュで調べる技術は、基礎研究から臨床診断法までの広範囲の分野で重要な役割を果たす。これらの方法は、その広範な使用にもかかわらず、フルオロフォアのスペクトルのオーバーラップのために多重化能力が限られている。さらに、標的の存在量が少ない場合又は密集した組織環境との関連で検査される場合、これらの技術を用いて、明確で解釈可能なシグナルを生じるために許容できる信号対雑音比をインサイチュで達成することは、多くの場合に困難である。
概要
本明細書では、例えば、組織サンプル及び体液サンプルにおけるインサイチュ分子（例えば、核酸及び／又はタンパク質）検出のための高レベルの多重化に適合するロバストな高効率画像化方法がいくつかの実施形態で提供される。インサイチュ検出のための重要な基準は、可変的な発現レベルの標的に対して達成可能なシグナルのレベルである。特に、厚い組織サンプルの場合、珍しい標的の検出は、高い自己蛍光バックグラウンド及びシグナル散乱の増大のために厄介であり続けている。二次抗体の放棄が必要とされ、従って多価結合によって二次抗体が提供する増幅が制限される、いくつかの標的の多重化免疫蛍光検出では、この問題が悪化する。これにより、特に低存在量の標的を画像化するために、シグナル増幅に対する明確な必要性が生じる。
本明細書では、例えば、組織サンプル及び体液サンプルにおけるインサイチュ分子（例えば、核酸及び／又はタンパク質）検出のための高レベルの多重化に適合するロバストな高効率画像化方法がいくつかの実施形態で提供される。インサイチュ検出のための重要な基準は、可変的な発現レベルの標的に対して達成可能なシグナルのレベルである。特に、厚い組織サンプルの場合、珍しい標的の検出は、高い自己蛍光バックグラウンド及びシグナル散乱の増大のために厄介であり続けている。二次抗体の放棄が必要とされ、従って多価結合によって二次抗体が提供する増幅が制限される、いくつかの標的の多重化免疫蛍光検出では、この問題が悪化する。これにより、特に低存在量の標的を画像化するために、シグナル増幅に対する明確な必要性が生じる。
本開示の多重化プラットフォームは、高い自己蛍光バックグラウンド及びシグナル散乱の増大などの障害を回避しながら、厚い組織サンプル内の分子の画像化を伴う、複数の低存在量の標的のインサイチュシグナル増幅のための手段を提供する。本開示の方法及び組成物は、例えば、健康な人及びアルツハイマー病の人の脳切片におけるニューロン免疫因子（例えば、サイトカイン）及びそのニューロン細胞との相互作用を含むが、これらに限定されない、様々な異なる状況における多重化分析を可能にする。インサイチュで直接且つタンパク質レベルで実施されるこのような分析は、例えば、異なるニューロン細胞型に対するミクログリアの神経毒効果及び神経保護効果、並びに身体レベルでのその神経変性疾患との関連性を理解するうえで貴重である。多数の重篤な疾患は、同時に研究すべき複数の因子を含むため、異なる組織型における他の多重化分析も様々な他の病状を理解するうえでもかなりの利益を提供する。
本明細書に提供される多重化シグナル増幅方法は、短いｓｓＤＮＡプライマー配列から長いｓｓＤＮＡコンカテマーを生じる。これらのコンカテマーは、次に、局在化され増幅された検出可能なシグナルを生じるために蛍光鎖が適用されたスカフォールド鎖として使用される。
これらの方法は、例えば、インサイチュ標識化のための特有の利点を提供する：これらは、通常、単純で安価な試薬を使用し、細胞及び組織におけるインサイチュ増幅に適合して、高い信号対雑音比（ＳＮＲ）を提供し；最終産物は、空間的にコンパクトであり、これにより、より良好な画質及び解像度と共に複数の標的のより良好な空間的隔離が可能になり（現存の方法と比べて）；及びこれらの方法は、配列設計に対して高い柔軟性を規定し、同時多重化の設計及び実行を実現可能にする。
従って、本開示のいくつかの態様は、（ａ）複数の分子（例えば、核酸標的）を含有するサンプルと、複数のプローブ鎖（例えば、１ｎＭ～１μＭの濃度）であって、各プローブ鎖は、（ｉ）分子標的の領域に対して相補的な（例えば、核酸標的の１つに対して相補的な）不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含む、複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合された分子標的を含む第１の反応混合物を生成すること、（ｂ）ステップ（ａ）で生成された第１の反応混合物と、ｄＮＴＰ（例えば、１～５００μＭの濃度）、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子（例えば、１ｎＭ～１μＭの濃度）であって、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、プローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分子標的に結合された核酸コンカテマーを含む第２の反応混合物を生成すること、（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された第２の反応混合物と、複数のシグナル鎖（例えば、１ｎＭ～１μＭの濃度）であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成することを含み、及び（ｄ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法を提供する。
本開示の他の態様は、（ａ）複数のプローブ鎖と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子とであって、各プローブ鎖は、（ｉ）分子（例えば、核酸）標的に対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含み、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、プローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数のプローブ鎖と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合された核酸コンカテマーを含む第１の反応混合物を生成すること、（ｂ）ステップ（ａ）で生成された第１の反応混合物と、複数の分子標的（例えば、核酸標的）を含有するサンプルとを組み合わせ、且つ分子標的に結合された核酸コンカテマーを含む第２の反応混合物を生成すること、（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された第２の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成することを含み、及び（ｄ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法を提供する。
いくつかの実施形態では、触媒分子は、ＤＮＡから構成される。いくつかの実施形態では、触媒分子は、ＲＮＡから構成される。
いくつかの実施形態では、各触媒分子の第１のドメインは、同じ触媒分子の第２のドメインに結合される。いくつかの実施形態では、各触媒分子の第１のドメインは、同じ触媒分子の第２のドメインに対して完全に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、各触媒分子の第２のドメインは、同じ触媒分子の第３のドメインと同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、各触媒分子は、同じ触媒分子の第１のドメインと第２のドメインとの間に位置する、重合を終結させるストッパー分子又は修飾をさらに含む。例えば、重合を終結させる分子又は修飾は、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、１８原子ヘキサエチレングリコール、アデニル化、アジド、ジゴキシゲニン、コレステリル－ＴＥＧ、３－シアノビニルカルバゾール（ＣＮＶＫ）、ｉｓｏ－ｄＧ、及びｉｓｏ－ｄＣから選択され得る。いくつかの実施形態では、ストッパー分子は、グアニンであり、且つ触媒分子は、アデニン、チミン、及びシトシンから構成され、又は他の実施形態では、ストッパー分子は、シトシンであり、且つ触媒分子は、アデニン、チミン、及びグアニンから構成される。
いくつかの実施形態では、各触媒分子は、第１のドメインと第２のドメインとの間に位置するループドメインをさらに含む触媒ヘアピン分子である。いくつかの実施形態では、各触媒ヘアピン分子は、２５～３００ヌクレオチド長を有するＤＮＡの一本鎖から構成される。いくつかの実施形態では、触媒分子は、互いに結合されたＤＮＡの二本鎖を含み、第１の鎖は、第１のドメインを含有し、且つ第２の鎖は、第２及び第３のドメインを含む。
いくつかの実施形態では、プローブ鎖は、ＤＮＡから構成される。いくつかの実施形態では、プローブ鎖は、ＲＮＡから構成される。いくつかの実施形態では、各プローブ鎖は、１０～５０ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、各プローブ鎖の標的ドメインは、５～２５ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、各プローブ鎖のプライマードメインは、５～２５ヌクレオチド長を有する。
いくつかの実施形態では、核酸標的は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。例えば、核酸標的は、染色体ＤＮＡであり得、又は核酸標的は、ｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであり得る。
いくつかの実施形態では、シグナル鎖の検出可能な分子は、フルオロフォアである。いくつかの実施形態では、シグナル鎖のそれぞれは、１０～３０ヌクレオチド長を有する。
いくつかの実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＢｓｕ ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントから選択される。
いくつかの実施形態では、反応混合物は、水性バッファー、任意選択的にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、任意選択的に５～５０ｍＭの濃度のＭｇＳＯ４を含む。
いくつかの実施形態では、複数のステップ（ａ）は、２～１００のプローブ鎖を含み、複数のステップ（ｂ）は、２～１００の触媒分子を含み、及び／又は複数のステップ（ｃ）は、２～１００のシグナル鎖を含む。いくつかの実施形態では、複数のステップ（ａ）は、２～１０００のプローブ鎖を含み、複数のステップ（ｂ）は、２～１０００の触媒分子を含み、及び／又は複数のステップ（ｃ）は、２～１０００のシグナル鎖を含む。いくつかの実施形態では、複数のステップ（ａ）は、２～１０，０００のプローブ鎖を含み、複数のステップ（ｂ）は、２～１０，０００の触媒分子を含み、及び／又は複数のステップ（ｃ）は、２～１０，０００のシグナル鎖を含む。いくつかの実施形態では、複数のステップ（ａ）は、２～１００，０００のプローブ鎖を含み、複数のステップ（ｂ）は、２～１００，０００の触媒分子を含み、及び／又は複数のステップ（ｃ）は、２～１００，０００のシグナル鎖を含む。
いくつかの実施形態では、サンプルは、細胞サンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルは、組織培養細胞である。いくつかの実施形態では、サンプルは、組織サンプルである。組織サンプルは、例えば、脳組織サンプルであり得る。いくつかの実施形態では、組織サンプルは、腫瘍サンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルは、体液サンプルである。いくつかの実施形態では、体液サンプルは、血清サンプル、血液サンプル、又は唾液サンプルである。他の体液サンプルも使用され得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、糞便サンプルである。
本開示のいくつかの態様は、（ａ）複数のタンパク質又はペプチド標的を含有するサンプルと、複数の一次結合パートナー（例えば、抗体）であって、複数の一次結合パートナーのそれぞれは、タンパク質又はペプチド標的に特異的に結合し、且つプローブ鎖に連結される、複数の一次結合パートナーとを組み合わせ、且つ一次結合パートナー（例えば、抗体）に結合されたタンパク質又はペプチドを含む反応混合物を生成すること、（ｂ）ステップ（ａ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、抗体の１つのプローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ抗体に結合された核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成すること、（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ抗体の１つのプローブ鎖に対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成することを含み、及び（ｄ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法を提供する。いくつかの実施形態では、一次結合パートナーは、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、抗原結合抗体断片である。
本開示の他の態様は、（ａ）複数のタンパク質又はペプチド標的を含有するサンプルと、複数の一次結合パートナー（例えば、抗体）であって、複数の一次結合パートナーのそれぞれは、タンパク質又はペプチド標的に特異的に結合し、且つ架橋鎖に連結される、複数の一次結合パートナーとを組み合わせ、且つ一次結合パートナー（例えば、抗体）に結合されたタンパク質又はペプチドを含む反応混合物を生成すること、（ｂ）ステップ（ａ）で生成された反応混合物と、複数のプローブ鎖であって、各プローブ鎖は、（ｉ）一次結合パートナー（例えば、抗体）の１つの架橋鎖に対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含む、複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つ一次結合パートナー（例えば、抗体）に結合されたプローブ鎖を含む反応混合物を生成すること、（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、プローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ一次結合パートナー（例えば、抗体）に結合された核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成すること、（ｄ）ステップ（ｃ）で生成された反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成することを含み、及び（ｅ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法を提供する。
本開示のさらに他の態様は、（ａ）複数のタンパク質又はペプチド標的を含有するサンプルと、複数の一次抗体（又は複数の他の結合パートナー）であって、複数の一次抗体のそれぞれは、タンパク質又はペプチド標的に特異的に結合する、複数の一次抗体とを組み合わせ、且つ一次抗体に結合されたタンパク質又はペプチドを含む反応混合物を生成すること、（ｂ）ステップ（ａ）で生成された反応混合物と、複数の二次抗体（又はタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ若しくは抗体特異的ナノボディなどの結合パートナーに結合する複数の他の二次プローブ）であって、複数の二次抗体のそれぞれは、一次抗体に特異的に結合し、且つプローブ鎖に連結される、複数の二次抗体とを組み合わせ、且つ二次抗体に結合された一次抗体を含む反応混合物を生成すること、（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、二次抗体の１つのプローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ二次抗体に結合された核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成すること、（ｃ）ステップ（ｃ）で生成された反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ二次抗体の１つのプローブ鎖に対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成することを含み、及び（ｄ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法を提供する。
本開示のさらに他の態様は、（ａ）複数のタンパク質又はペプチド標的を含有するサンプルと、複数の一次結合パートナー（例えば、抗体）であって、複数の一次結合パートナーのそれぞれは、タンパク質又はペプチド標的に特異的に結合する、複数の一次結合パートナーとを組み合わせ、且つ一次結合パートナー（例えば、一次抗体）に結合されたタンパク質又はペプチドを含む反応混合物を生成すること、（ｂ）ステップ（ａ）で生成された反応混合物と、複数の二次結合パートナー（例えば、二次抗体）であって、複数の二次結合パートナーのそれぞれは、一次結合パートナーに特異的に結合し、且つ架橋鎖に連結される、複数の二次結合パートナーとを組み合わせ、且つ二次結合パートナー（二次抗体、又は例えばタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ若しくは抗体特異的ナノボディなどの結合パートナーに結合する他の二次プローブ）に結合された一次結合パートナーを含む反応混合物を生成すること、（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された反応混合物と、複数のプローブ鎖であって、各プローブ鎖は、（ｉ）二次結合パートナーの１つの架橋鎖に対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含む、複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つ二次抗体に結合されたプローブ鎖を含む反応混合物を生成すること、（ｄ）ステップ（ｃ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、プローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ二次結合パートナーに結合された核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成すること、（ｅ）ステップ（ｄ）で生成された反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成することを含み、及び（ｆ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法を提供する。
本明細書では、いくつかの態様において、（ａ）５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合し、及び第３のドメインは、不対３’トーホールドドメインである、触媒分子と、（ｂ）（ｉ）分子標的に特異的に結合する不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）触媒分子の不対３’トーホールドドメインに結合する不対３’プライマードメインを含むプローブ鎖と、（ｃ）検出可能な分子に連結され、且つプローブ鎖の不対３’プライマードメインに結合するドメインを含むシグナル鎖とを含む組成物も提供される。
いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）複数の触媒分子であって、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合し、及び第３のドメインは、不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子と、（ｂ）複数のプローブ鎖であって、各プローブ鎖は、（ｉ）分子標的に特異的に結合する不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）触媒分子の１つの不対３’トーホールドドメインに結合する不対３’プライマードメインを含む、複数のプローブ鎖と、（ｃ）複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに結合するドメインを含む、複数のシグナル鎖とを含む。
さらに、本明細書では、いくつかの実施形態において、タンデム反復配列のコンカテマーが結合される核酸標的を含むサンプルであって、検出可能な標識に連結されたシグナル鎖は、コンカテマーの各配列に結合される、サンプルが提供される。
いくつかの実施形態では、サンプルは、抗体（又は結合パートナー）が結合されるタンパク質標的含み、抗体は、タンデム反復配列のコンカテマーに連結され、及び検出可能な標識に連結されたシグナル鎖は、コンカテマーの各配列に結合される。
いくつかの実施形態では、サンプルは、一次結合パートナー（例えば、一次抗体）が結合されるタンパク質標的を含み、二次結合パートナー（例えば、二次抗体）は、一次結合パートナーに結合され、二次結合パートナーは、タンデム反復配列のコンカテマーに連結され、及び検出可能な標識に連結されたシグナル鎖は、コンカテマーの各配列に結合される。
図面の簡単な説明
基本のプライマー交換反応（ＰＥＲ）サイクルである。ドメイン１を有するプライマーは、まず触媒ヘアピン種に結合する。次に、鎖置換ポリメラーゼがドメイン２を合成し、それを元のプライマーに付加して転写物１＋２を作る。ヘアピンからのプライマーの自然解離は、新しい転写物を溶液中に放出し、ヘアピンは、リサイクルされ、別の反応における使用に利用可能である。
ＰＥＲカスケードによる段階的合成である。５つのヘアピンは、ドメイン１を有するCy5標識プライマーの段階的伸長を媒介する。
ＰＥＲカスケードによる段階的合成である。３７℃で４時間のインキュベーション中に含まれるヘアピンの種々のサブセット。プライマー配列：／５Ｃｙ５／ＴＴＣＴＣＴＴＡＴＴ（配列番号１）；ヘアピン配列：ＡＣＴＡＡＡＴＴＣＡＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＣＴＧＡＡＴＴＴＡＧＴＡＡＴＡＡＧＡＧＡ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号２）；ＡＴＡＴＣＣＣＡＴＡＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＣＴＡＴＧＧＧＡＴＡＴＴＧＡＡＴＴＴＡＧ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号３）；ＡＴＴＡＣＡＣＴＡＣＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＣＧＴＡＧＴＧＴＡＡＴＴＡＴＧＧＧＡＴＡ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号４）；ＡＴＡＴＴＡＡＡＣＣＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＣＧＧＴＴＴＡＡＴＡＴＧＴＡＧＴＧＴＡＡ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号５）；ＡＴＣＡＴＴＴＴＴＣＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＣＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＧＧＴＴＴＡＡＴＡ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号６）。
合成「テロメラーゼ」反応である。単一のヘアピン（ＡＴＣＴＣＴＴＡＴＴＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＣＡＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡＡＴＡＡＧＡＧＡ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号７）は、ドメイン１を有するプライマー（配列番号１）の反復伸長を媒介することができる。
合成「テロメラーゼ」反応である。プライマーは、長い反復配列に伸長される。
合成「テロメラーゼ」反応である。３７℃で４時間のインキュベーション中に触媒ヘアピンの濃度を上昇させると、テロメル化の割合が増大する。
インサイチュ増幅のための基本戦略である。プローブをインサイチュでハイブリダイズした後、ＰＥＲヘアピンを使用して、長い反復コンカテマースカフォールド配列を作製する。次に、蛍光鎖をこのスカフォールドとハイブリダイズさせ、局在化された増幅シグナルを作る。
固定細胞における局在化シグナル増幅の概略図である。ｍＲＮＡ又は染色体の領域などの標的Ｘが同定される。
固定細胞における局在化シグナル増幅の概略図である。システムは、３つの構成要素、対象の標的に結合するように設計されたプローブ（Ｘ’１）、ＰＥＲヘアピン、及び蛍光補体（１’）を含有する。
固定細胞における局在化シグナル増幅の概略図である。まず、プローブをインサイチュでその標的にハイブリダイズさせ、その後、標準ＤＮＡ又はＲＮＡ ＦＩＳＨプロトコルを行う。
固定細胞における局在化シグナル増幅の概略図である。ハイブリダイゼーション後、ハンドルは、ＰＥＲヘアピンにより長いテロメア（鎖）に伸長される。
固定細胞における局在化シグナル増幅の概略図である。最後に、蛍光補体鎖を長い合成鎖にハイブリダイズさせ、蛍光シグナル増幅を局在させる。
固定細胞におけるシグナル増幅のための予備実験である。プローブ（１）（／５ＡＴＴＯ４８８Ｎ／ＴＴＧＣＧＡＧＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＧＧＴＴＴＣＴＣＴＴＡＴＴ；配列番号４１）を染色体のメジャーサテライト部分に結合するように設計し、その５’末端においてATTO 488フルオロフォアにより標識化した。ＰＥＲヘアピン（２）（配列番号４１）、及びATTO 565色素により標識化された、伸長テロメア配列に対して相補的な蛍光プローブ（３）（／５ＡＴＴＯ５６５Ｎ／ＴＴＡＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡＡＴＡＡＧＡＧＡＴ／３ＩｎｖｄＴ／；配列番号８）をシグナル増幅及び検出のために使用した。
固定細胞におけるシグナル増幅のための予備実験である。プローブ（１）のハイブリダイゼーション後、これらをＰＥＲヘアピン（２）により伸長させた。テロメル化後、蛍光プローブ（３）をハイブリダイズさせ、画像化した。
固定細胞におけるシグナル増幅のための予備実験である。全ＰＥＲシステムの存在下において、両方のATTO染料からのシグナルは、核内に共存する。ヘアピン（２）がなければ、蛍光プローブ（３）からのシグナルは、予想通り検出されない。スケールバーは、１０μｍである。
シグナル破壊による多重化の戦略である。標的シグナルは、強力なレーザーでサンプルを標的にすることによりブリーチングされ得る。
シグナル破壊による多重化の戦略である。シグナルは、蛍光鎖のみがＲＮＡ骨格を含有する場合、例えば、ＲＮａｓｅ酵素などのヌクレアーゼで蛍光オリゴ（核酸鎖）を消化することによって除去され得る。酵素の例としては、USER（登録商標）酵素（ウラシル特異的切断試薬；ＮＥＢ）、ＤＮａｓｅＩ及びＥｘｏＩが挙げられる。
シグナル破壊による多重化の戦略である。蛍光鎖は、低塩条件下で標的から洗浄され得る。
シグナル破壊による多重化の戦略である。洗浄ステップ前に一時的にのみ結合する短い蛍光鎖を使用して、蛍光シグナルを局在化させることができる。
交換イメージングのワークフローである。単一レーザーによる複数の標的の画像化は、洗浄（バッファー交換）ステップ及び蛍光ハイブリダイゼーションステップを交互に行うことによって達成することができる。
プライマー交換反応である。同じ短配列「ａ」を繰り返しコピーするＰＥＲ反応の概略図であり、ｓｓＤＮＡの長いコンカテマーが生成される。
プライマー交換反応である。異なるヘアピン濃度における伸長を示すＰＡＧＥ変性ゲル。Ｂｓｔポリメラーゼ及び所与のヘアピン濃度を用いて、１００ｎＭのプライマーを３７℃で４時間、１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰと共にインキュベートした。
ＩＦシグナルのＰＥＲベースの増幅である。コンカテマーのインビトロ伸長：予備伸長コンカテマーをＡｂ上の架橋配列にハイブリダイズさせることができる。
ＩＦシグナルのＰＥＲベースの増幅である。インサイチュ伸長：ＰＥＲプライマーは、Ａｂ上に直接提示され、ＰＥＲによってインサイチュで伸長される。
予備伸長鎖を用いるＰＥＲベースのシグナル増幅を伴うＦＩＳＨである。胚性線維芽細胞中のマウスメジャーサテライト（ＭＳ）を標的とするＦＩＳＨ実験において、予備伸長ＰＥＲ配列を有するオリゴプローブを使用した。
予備伸長鎖を用いるＰＥＲベースのシグナル増幅を伴うＦＩＳＨである。Ｘ染色体上の非反復単一コピーＸ不活性化中心（Ｘｉｓｔ）領域を標的とするＦＩＳＨ実験において、予備伸長ＰＥＲ配列を有する４８のオリゴプローブのセットを使用した。落射蛍光顕微鏡で撮影されたｚ－スタックの最大投影が示される。
予備伸長鎖を用いるＰＥＲベースのシグナル増幅を伴うＦＩＳＨである。ＦＩＳＨ実験前の１５％ＰＡＧＥ変性ゲル上の予備伸長鎖の可視化。濃いバンドは、約２ｋｂに相当する。上部パネルのプローブ（メジャーサテライト）：ＣＣＡＣＴＧＴＡＧＧＡＣＧＴＧＧＡＡＴＡＴＧＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＴＧＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ（配列番号９）；上部及び下部パネルのヘアピン：ＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号１０）。
ＰＥＲを用いたＩＦにおけるシグナル増幅である。マウス胚性線維芽細胞を抗βチューブリン一次抗体で染色した。二次抗体染色は、Alexa 647コンジュゲート二次抗体（中央）を用いるか、又はAlexa 647コンジュゲート相補的シグナル鎖が結合することができる、予備伸長ＰＥＲ鎖の結合のためのドッキング部位を提示するＤＮＡコンジュゲート二次抗体（右側）を用いて実施した。ネガティブコントロール（左側）は、一次抗体を省くが、その他にはＰＥＲ条件と同様にサンプルを処理することにより調製した。有意な非特異的バックグラウンドは、検出されなかった。ヘアピン：ＡＣＣＡＡＴＡＡＴＡＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＣＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号１１）；プライマー（架橋補体／Ｂ３８＊＋プライミングのためのｐ２５）：ＣＴＡＧＡＴＣＧＡＡＣＴＡＴＴＣＧＡＡＣＡＣＴＡＡＡＴＡＴＴＣＣＡＡＴＡＡＴＡ（配列番号１２）；二次抗体にコンジュゲートされたＢ３８架橋配列：／５ＴｈｉｏＭＣ６－Ｄ／ＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＡＧＴＴＣＧＡＴＣＴＡＧ（配列番号１３）；蛍光（２５＊）：／５Ａｌｅｘ６４７Ｎ／ＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号１４）。
コンジュゲート二次抗体を用いるＩＦ戦略である。主要な増幅実験のために、一次抗体は、まず、その標的に結合され、次にＤＮＡコンジュゲート二次抗体が一次抗体に結合される。次に、コンジュゲートＰ３８領域に対して相補的な鎖を突出したｐ２７ハンドルと結合させた。ＰＥＲ増幅は、ｐ２７ハンドルにおいて実施し、相補的蛍光６４７鎖を用いて可視化した。蛍光コントロールは、コンジュゲートしたものではなく蛍光二次抗体を使用する。
インサイチュ対インビトロアプローチである。最初のアプローチは、インサイチュで伸長される鎖を使用する。すなわち、プローブ鎖は、まず固定サンプル内のその標的（ＤＮＡ／ＲＮＡ／タンパク質）に結合され、次にその場所で伸長される。
インサイチュ対インビトロアプローチである。インビトロアプローチは、代わりに、コンカテマーをインビトロで予め伸長させ、次にこれらを標的にハイブリダイズさせる。
２色増幅である。マイナーサテライト領域及びメジャーサテライト領域をそれぞれ標的とするプローブに取り付けられたプライマー１９及び２２を使用した２色実験の概略図。メジャーサテライトを標的とするｐ２２’ｐ２２’ｐ２２’鎖は、ATTO 565色素を含有し、ｐ１９’ｐ１９’ｐ１９’鎖は、Alexa 647色素を含有した。
２色増幅である。個々のチャネルについての画像化の結果であり、適切な蛍光チャネルにおける２つの標的の予想される形態を示す。コントロールとして、細胞にＤＡＰＩ染色も行った。プライマー１９プローブを有するマイナーサテライト：ＡＧＡＴＧＡＧＴＧＡＧＴＴＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＡＣＡＣＡＴＴＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＴＴＴＣＴＣＴＴＡＴＴ（配列番号１５）；プライマー２２プローブを有するメジャーサテライト：ＣＣＡＣＴＧＴＡＧＧＡＣＧＴＧＧＡＡＴＡＴＧＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＴＧＧＴＴＴＴＡＣＡＣＴＡＣ（配列番号１６）；ヘアピン１９：ＡＴＣＴＣＴＴＡＴＴＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＣＡＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡＡＴＡＡＧＡＧＡ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号１７）；ヘアピン２２：ＡＴＴＡＣＡＣＴＡＣＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＣＧＴＡＧＴＧＴＡＡＴＧＴＡＧＴＧＴＡＡ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号１８）；蛍光ｐ１９’：／５Ａｌｅｘ６４７Ｎ／ＴＴＡＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡＡＴＡＡＧＡＧＡＴ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号１９）；蛍光ｐ２２’：／５ＡＴＴＯ５６５Ｎ／ＴＴＧＴＡＧＴＧＴＡＡＴＧＴＡＧＴＧＴＡＡＴＧＴＡＧＴＧＴＡＡＴ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号２０）。
大まかな増幅可視化のための増幅戦略である。メジャーサテライトプローブは、Alexa 647標識化ｐ１９’ｐ１９’ｐ１９’鎖のための結合領域を含有し、従って非増幅プローブを有するサンプル（ＰＥＲインキュベーション中にヘアピンを用いない）からの蛍光を、増幅プローブを有するサンプル（ＰＥＲインキュベーション中にヘアピンを用いる）と比較することができる。
ＰＥＲ分岐変異体である。ＰＥＲ生成コンカテマーは、分岐構造を形成するためのプローブ結合部位として使用され得る。
スペクトル多重化の例である。オリゴにコンジュゲートした二次抗体を用いる２色免疫染色（左側は細胞、右側は網膜組織）であり、二次抗体は、次にインビトロ伸長ＰＥＲ鎖にハイブリダイズされる。
ＰＥＲによる同時インサイチュ多重化シグナル増幅及びＤＥＩによる連続的な多重化検出である。
８つの直交性鎖を用いるインビトロＰＥＲである。３７℃で２時間のインキュベーション後、反応産物を１５％変性ゲルにおいて可視化した。上部の濃いバンドは、SYBRＴＭGold染色により可視化された、１．５ｋｂに相当する伸長産物を示す。より薄いバンドは、過剰なヘアピンを示す。
シグナル増幅のワークフローの概略図である。シグナルレベルの変化を定量化するために蛍光ハイブリダイゼーション２’の前後に画像を獲得した。
ＰＡＧＥゲルは、異なるヘアピン濃度（０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ）で伸長されたコンカテマー（最大１０００ｎｔまで）を示す。
イメージャ結合のための約７０の結合部位を有する約１．５ｋｂの試験コンカテマーである。
Alexa 647を有するイメージャ鎖を用いて、増幅しない場合（蛍光ハイブリダイゼーション１）と比べて約３７倍高いシグナル（蛍光ハイブリダイゼーション２）を得た。Ａｂなしのバックグラウンドは、１°Ａｂが省かれたネガティブコントロールを示す。エラーバーは、平均の標準誤差である（ｎ＝１５０～１８０細胞）。
増幅の前後の代表的な画像である。プライマー（Ｂ３８架橋補体＋増幅前のシグナルの定量化のための２Ｘｐ２７部位＋プライミングのためのｐ２８部位）：ＣＴＡＧＡＴＣＧＡＡＣＴＡＴＴＣＧＡＡＣＡＣＴＡＡＡＴＡＴＴＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＣＡＡＣＴＴＡＡＣ（配列番号２１）；ヘアピン：ＡＣＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＧＴＴＧ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号２２）；二次抗体にコンジュゲートされた架橋配列（Ｂ３８）：／５ＴｈｉｏＭＣ６－Ｄ／ＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＡＧＴＴＣＧＡＴＣＴＡＧ（配列番号２３）。
分岐のための予備伸長ワークフローである。コンカテマーの２つのセットを溶液中で予め合成し、サンプル上に順次適用した。第２のコンカテマーのプライマーは、第１のコンカテマーに相補的な配列に付加した。
予備伸長コンカテマーをラミンＢに対して免疫標識されたHeLa細胞上に順次適用し、分岐構造をインサイチュで構築した。
第１のコンカテマーのみの場合（Ｃ１）に対する、第２のコンカテマー（Ｃ２）を用いた分岐によるシグナルの改善の定量化である。
インサイチュ樹状成長のメカニズムである：指数関数的な成長動態で誘発されるデンドリマーの合成は、ヘアピンに加えて、分岐を媒介する一本鎖ヘルパー鎖を使用する。
樹状構造の自律的なインサイチュ合成の一例である。二次抗体にコンジュゲートされた架橋配列（Ｂ３８）：／５ＴｈｉｏＭＣ６－Ｄ／ＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＡＧＴＴＣＧＡＴＣＴＡＧ（配列番号２４）；コンカテマー１について：プライマー（Ｂ３８架橋補体＋基礎シグナルの定量化のための２Ｘｐ２７部位＋プライミングのためのｐ２８部位）：ＣＴＡＧＡＴＣＧＡＡＣＴＡＴＴＣＧＡＡＣＡＣＴＡＡＡＴＡＴＴＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＣＡＡＣＴＴＡＡＣ（配列番号２５）；ヘアピン：ＡＣＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＧＴＴＧ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号２６）；コンカテマー２について：プライマー（コンカテマー１へのハイブリダイゼーションのための３Ｘｐ２８部位＋増幅の第２ラウンド前のシグナルの定量化のための２Ｘｐ３０部位＋プライミングのためのｐ２５部位）：ＧＴＴＡＡＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＧＴＴＧＴＡＡＡＴＡＣＴＣＴＣＡＡＡＴＡＣＴＣＴＣＴＴＣＣＡＡＴＡＡＴＡ（配列番号２７）；ヘアピン：ＡＣＣＡＡＴＡＡＴＡＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＣＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号２８）；蛍光鎖１（ｐ３０＊）：／５Ａｌｅｘ６４７Ｎ／ＴＴＧＡＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＧＡＧＴＡＴＴＴ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号２９）；蛍光鎖２（ｐ２５＊）：／５Ａｌｅｘ６４７Ｎ／ＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号３０）。
分岐増幅の一例を実証する、αチューブリンに対して染色されたHeLa細胞である（ＤＮＡコンジュゲート一次抗体を用いる）。一次抗体にコンジュゲートされた架橋配列：／５ＴｈｉｏＭＣ６－ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＣＧＣＣＣＴＡＴＡＴＣＣＴＣＧＣＡＡＴＡＡＣＣＣ（配列番号３１）；コンカテマー１：蛍光プライマー（フルオロフォア＋架橋補体＋ｐ３０プライミング部位）：／５ＡＴＴＯ５６５Ｎ／ＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＴＧＣＧＡＧＧＡＴＡＴＡＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＧＴＧＴＣＡＴＡＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＣＴＣＴＣ（配列番号３２）；ヘアピン：ＡＡＡＴＡＣＴＣＴＣＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＣＧＡＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＧＡＧＴＡＴＴ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号３３）；蛍光鎖（ｐ３０＊）：／５ＡＴＴＯ５６５Ｎ／ＴＴＧＡＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＧＡＧＴＡＴＴＴ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号４２）；コンカテマー２：プライマー（コンカテマー１へのハイブリダイゼーションのための３Ｘｐ３０部位＋プライミングのためのｐ３３部位）：ＧＡＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＧＡＧＴＡＴＴＴＴＴＣＣＴＴＣＴＡＴＴ（配列番号３４）；ヘアピン：ＡＣＣＴＴＣＴＡＴＴＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＣＡＡＴＡＧＡＡＧＧＴＡＡＴＡＧＡＡＧＧ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号３５）；蛍光（ｐ３３＊）：／５ＡＴＴＯ５６５Ｎ／ＴＴＡＡＴＡＧＡＡＧＧＴＡＡＴＡＧＡＡＧＧＴ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号３６）。
ＦＦＰＥサンプルの免疫染色である。胚中心の周囲の濾胞間（interfollicular）Ｔ細胞ゾーンを標識化する、Ｔ細胞マーカーＣＤ３で染色された４μｍ厚の扁桃腺サンプル（ＤＮＡコンジュゲート二次抗体を用いる）。スケールバー２００μｍ。プライマー（架橋補体／Ｂ３８＊＋プライミングのためのｐ２７）：ＣＴＡＧＡＴＣＧＡＡＣＴＡＴＴＣＧＡＡＣＡＣＴＡＡＡＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ（配列番号３７）；ヘアピン（２７）：ＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号３８）；二次抗体にコンジュゲートされた架橋配列（Ｂ３８）：／５ＴｈｉｏＭＣ６－Ｄ／ＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＡＧＴＴＣＧＡＴＣＴＡＧ（配列番号３９）；蛍光（ｐ２７＊）：／５Ａｌｅｘ６４７Ｎ／ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴ／３ＩｎｖｄＴ／（配列番号４０）。
詳細な説明
生体分子の細胞内局在化パターンの知識は、これらの分子がどのように機能するかについての重要な洞察を提供することができる。従って、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）及び免疫蛍光法（ＩＦ）など、生体分子の局在化をインサイチュで調べる技術は、基礎研究から臨床診断法までの広範囲の分野で重要な役割を果たす。しかしながら、これらの方法の広範な使用にもかかわらず、技術的な限界は、依然としてこれらの有用性を制限し得る。具体的に、これらの技術は、特に標的の存在量が少ない場合又は密集した組織環境との関連で検査される場合、明確で解釈可能なシグナルを生じるために苦心していることが多い。本明細書では、特に、この限界に対処するために画像化シグナルをインサイチュで増幅するための方法が提供される。
生体分子の細胞内局在化パターンの知識は、これらの分子がどのように機能するかについての重要な洞察を提供することができる。従って、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）及び免疫蛍光法（ＩＦ）など、生体分子の局在化をインサイチュで調べる技術は、基礎研究から臨床診断法までの広範囲の分野で重要な役割を果たす。しかしながら、これらの方法の広範な使用にもかかわらず、技術的な限界は、依然としてこれらの有用性を制限し得る。具体的に、これらの技術は、特に標的の存在量が少ない場合又は密集した組織環境との関連で検査される場合、明確で解釈可能なシグナルを生じるために苦心していることが多い。本明細書では、特に、この限界に対処するために画像化シグナルをインサイチュで増幅するための方法が提供される。
本開示の根底にある増幅プロセスは、プライマー交換反応（ＰＥＲ）と呼ばれる。ＰＥＲは、インサイチュ標識化のためのいくつかの利点を有し、例えば高い信号対雑音比（ＳＮＲ）を提供する、細胞及び組織におけるインサイチュ増幅に適合した単純で安価な試薬の使用；より高い画質及び解像度と共に複数の標的のより高い空間分解能を可能にする、空間的にコンパクトな産物の生成；及び同時多重化の設計及び実行を容易にする配列設計の柔軟性が含まれる。
ＰＥＲ経路は、等温及び自律的な方法で鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いた、成長プライマー鎖上へ任意の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）配列の動的合成を含む。鎖置換ポリメラーゼ及び触媒的に作用するヘアピン種を用いて、プライマー交換反応は、溶液中でヘアピンによりパターン化された順序でプライマー配列を伸長させる（図３Ａ～３Ｃ）。各ＰＥＲヘアピンは、重合を停止させるために停止配列を使用する（２９～３１）。例えば、配列「ａ」がＡ、Ｔ、及びＣの３文字コードを含み、且つｄＮＴＰの混合物からｄＧＴＰが排除される場合、停止配列は、Ｇ－Ｃ対である。他の停止配列には、４文字全てが合成されることを可能にする化学修飾及び合成塩基対が含まれる。例えば、重合を終結させる合成非ＤＮＡリンカー又はｉｓｏ－ｄ若しくはｉｓｏ－ｄＣが使用され得る。プライマーは、ゲル電気泳動実験での容易な追跡のために、その５’末端において色素で標識化することができる。ヘアピンは、プライマーを不可逆的に結合させ得るプライマー鎖上の伸長を防止するためにその３’末端に逆位ｄＴ又は他の修飾も含み得る。ＰＥＲにより生成される線状ｓｓＤＮＡ構造は、繰り返しコピーされる配列に対して相補的な短い蛍光オリゴヌクレオチドの結合のための優れたドッキングプラットフォームを提示し、従ってＤＮＡベースの検出における効率的なシグナル増幅のためのロバストな方法を提供する。ＰＥＲシグナル増幅は、効果的な多重化のために時間効率が良く、且つ標的特異的である。
本開示のプライマー交換反応は、３つの一般的なステップを含む（例えば、図１及び図３Ａ～３Ｂを参照されたい）。最初に、溶液中のプライマードメインを含有するプローブ鎖（その３’末端に配列「１」を保有する）は、触媒分子（例えば、触媒ヘアピン分子）上の露出された相補的不対（一本鎖）トーホールド結合領域（「１’」）に結合する。鎖置換ポリメラーゼは、続いて、停止配列（３本の黒色ライン）に到達するまでプライマー配列（「１」）をコピーする。最後のステップでは、分岐点移動プロセスは、伸長されたプライマー配列を触媒分子から移動させることができ、残りの結合領域は、自然に解離し得る。次に、触媒分子は、別のプライマー交換サイクルにおいて別のプライマードメインと自由に相互作用する（リサイクルされる）。このコピー及び放出手順におけるプライマー結合及び解離ステップは、いずれも可逆的であるが、ｄＮＴＰを燃料とする重合ステップは、効果的に不可逆的である。これは、全体的に駆動される反応プロセスをもたらし、ｄＮＴＰは消費されるが、ヘアピンは消費されない。いくつかの反応サイクルにより、この伸長プロセスの繰り返しは、配列「１」の長い線状一本鎖コンカテマーを生成する（図３Ａ及び３Ｂ）。単一の触媒ヘアピン分子を使用して、成長プライマー鎖上に同じドメインを連続して連結させることにより、任意の長さの鎖を生成することができる。この合成「テロメラーゼ」ＰＥＲシステムにおいて、溶液中の触媒ヘアピン分子の濃度を上昇させると、テロメル化の割合が増大される（図３Ｃ）。誤ったヘアピン上で結合及び伸長しないように十分に直交性であるプライマーを用いて、いくつかのテロメル化反応を並行して実施することができる。
図２Ａ及び２Ｂに描かれる５段階ＰＥＲカスケードシステムは、５つの触媒ヘアピン分子の異なるサブセットがどのように異なる数の伸長ステップを媒介するかを示す。
典型的な多段階多重化ＰＥＲ反応は、直交性のプローブ鎖（それぞれ異なる標的ドメイン及び異なるプライマードメインを含有する）、触媒ヘアピン（それぞれプローブ鎖の１つのプライマードメインに結合し得る異なるトーホールドドメインを含有する）、鎖置換ポリメラーゼ、バッファー、ｄＮＴＰ、及び直交性のシグナル鎖（それぞれプローブ鎖のプライマードメインに対して相補的なドメインを含有し、それぞれスペクトル的に別個のフルオロフォアで標識される）を含む。
非限定的な例として、５～５０のヌクレオチド（例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５若しくは５０のヌクレオチド、又は５～３０、５～４０、５～６０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１５～３０、１５～４０、１５～５０、２０～３０、２０～４０、２０～５０、２５～３０、２５～４０若しくは２５～５０のヌクレオチド）の長さを有するプローブ鎖は、１ｎＭ～１μＭの濃度で反応中に存在し得（プライマーは、非同族ヘアピン上で伸長しないはずである）、触媒ヘアピンも１ｎＭ～１μＭの濃度で反応中に存在し得、５～３０のヌクレオチド（例えば、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８若しくは３０のヌクレオチド、又は５～１０、５～１５、５～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０若しくは２０～３０のヌクレオチド）の長さを有し、フルオロフォア（例えば、Cy5）によりその５’末端で標識されたシグナル鎖は、１ｎＭ～１μＭの濃度で反応中に存在し得、鎖置換ポリメラーゼは、非エキソヌクレアーゼポリメラーゼＢｓｔ、Ｂｓｍ、クレノウ（その他が使用され得る）の１つ又は複数であり得、ｄＮＴＰ濃度は、１μＭ～５００μＭの濃度で反応中に存在し得、及びバッファーは、５ｍＭ～５０ｍＭのＭｇＳＯ４濃度（特異性を保持しながら、反応の速度を調整するため）と、いくつかの反応ではデキストラン硫酸及び／又はポリアクリル酸（ＳＮＲを最大にするため）とを含むリン酸緩衝食塩水であり得る。プライマー交換反応の作用実施例は、以下の実施例２に記載される。
例えば、多重化ＰＥＲ反応のためにシグナルをインサイチュで増幅するための一般的な戦略は、図４に描かれるように、長い蛍光テロメアスキャフォールド（成長ＤＮＡ鎖）を成長させることである。触媒分子（例えば、触媒ヘアピン分子）とのインキュベーションにより長い鎖を成長させた後、相補的シグナル鎖（例えば、フルオロフォアに連結された核酸鎖）の結合が可能になる。いくつかのフルオロフォアが単一のテロメアスキャフォールドに沿って集まることができるため、これにより、増幅された局在化蛍光シグナルが作られる。画像化ワークフローのより詳細な概略図は、図５に示される。第１に、標的が選択される（図５Ａ）。この標的が染色体ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡなどの核酸であれば、インサイチュハイブリダイゼーション手順により固定細胞内の標的の場所に局在化するように、標的（ドメインＸ）に対して相補的なプローブ（ドメインＸ’を有する）が設計される。このプローブは、その３’末端（ドメイン１）にプライマーが取り付けられ、これは、触媒分子（例えば、触媒ヘアピン分子）を用いて伸長させることができる。標的がタンパク質であれば、Ｘドメインの代わりに、プライマーは、標的タンパク質に結合する抗体（又は他の結合パートナー）にコンジュゲートされ得る。
本明細書で提供される多重化増幅システムは、触媒分子（例えば、触媒ヘアピン分子）と、反復伸長ドメイン１に対して相補的な蛍光プローブとを使用する（図５Ｂ）。画像化は、まずプローブをその標的に局在化させ（図５Ｃ）、次にＰＥＲ構成要素を導入して、テロメアスキャフォールドをインサイチュで成長させ（図５Ｄ）、且つ最後に、いくつかのフルオロフォアを単一の局在化点に集めるために、蛍光シグナル鎖（例えば、相補的オリゴヌクレオチド）をこれらの反復転写物（タンデム反復配列）に結合させる（図５Ｅ）ことによって段階的な方法で行われる。
システムの初期試験は、固定不死化マウス胚性線維芽細胞においてＤＮＡ ＦＩＳＨを用いて実施した（図６）。染色体のメジャーサテライト反復領域を標的とし、コントロール実験は、ＰＥＲヘアピンが反応溶液中に含まれる場合、テロメア誘起蛍光のみが存在することを示した。
本明細書に記載される分子構成要素は、１つ又は複数のドメインを含む。分子のドメインは、単にその分子の個別のセグメントである。核酸分子（ヌクレオチドを含むか又はヌクレオチドからなる）のドメインは、ドメインが不対（一本鎖ヌクレオチド）であるか又は対（二本鎖ヌクレオチド塩基対）であるかに応じて、それぞれヌクレオチド又はヌクレオチド塩基対の個別の連続した配列である。いくつかの実施形態では、ドメインは、分子内（同じ分子種内）及び分子間（２つの別々の分子種間）の相補性を定義する目的で複数のサブドメインを有すると記載されている。２つのドメインが対（二本鎖）又は部分的に対の分子種／構造を形成するように１つのドメインが他のドメインのヌクレオチドと塩基対合する（Watson-Crick型ヌクレオチド塩基対合によってハイブリダイズ／結合する）ヌクレオチドを含有すれば、１つのドメイン（又は１つのサブドメイン）は、別のドメインに対して相補的である。相補的ドメインは、対構造を形成するために完全に／全体的に（１００％）相補的である必要はないが、いくつかの実施形態では完全な相補性が提供される。従って、触媒分子の３’トーホールドドメインなどの特定のドメインに対して相補的なプライマードメインは、例えば、ポリメラーゼの存在下において、重合を開始させるのに十分な時間にわたってそのドメインに結合する。例えば、図１は、触媒ヘアピン分子のトーホールドドメイン「１’」に結合するプライマードメイン「１」を示す。
核酸から構成される触媒分子の対ドメイン（ヘアピンに関しては「ステムドメイン」と考えられる）は、触媒分子の不対トーホールドドメインから５’側に（いくつかの実施形態では直接隣接して）位置するヌクレオチドの対配列（例えば、Watson-Crick型核酸塩基対合）を指す。触媒分子の対ドメインは、「置換鎖」と、トーホールドドメインを含有する「テンプレート鎖」との間のヌクレオチド塩基対合によって形成される。触媒ヘアピン分子の対ドメイン（ステムドメイン）は、触媒ヘアピン分子の２つのサブドメインの分子内塩基対合（同じ分子内のヌクレオチド間の塩基対合）によって形成さ、例えば触媒ヘアピンの５’末端に位置するサブドメインに結合（ハイブリダイズ）されたトーホールドドメインから５’側に位置する内部／中央サブドメインである。核酸から構成される触媒分子の対ドメインの長さは、変動し得る。いくつかの実施形態では、対ドメインは、５～４０ヌクレオチド長を有する。例えば、対ドメインは、５～３５、５～３０、５～２５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～４０、１０～３５、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、１５～４０、１５～３５、１５～３０、１５～２５、１５～２０、２０～４０、２０～３５、２０～３０、２０～２５、２５～４０、２５～３５、２５～３０、３０～４０、３０～３５、又は３５～４０ヌクレオチド長を有し得る。いくつかの実施形態では、対ドメインは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、対ドメインは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチド長を有する。対ドメインは、いくつかの実施形態では、４０ヌクレオチドよりも長いか、又は５ヌクレオチドよりも短い。
対ドメインは、一般に、触媒分子の２つのサブドメインの分子内塩基対合によって形成されるが、この対ドメインが少なくとも１つのミスマッチ対（例えば、ＡとＣ若しくはＧとの対合、又はＴとＣ若しくはＧとの対合）を含有し得ることが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、対ドメインは、１～５つのミスマッチヌクレオチド塩基対を有する。例えば、対ドメインは、１、２、３、４、又は５つのミスマッチヌクレオチド塩基対を有し得る。
触媒分子は、一般に、不対（一本鎖）３’トーホールドドメインと、３’トーホールドドメインから５’側の（いくつかの実施形態では直接隣接する）対（二本鎖）ドメインとを含む。触媒分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ及びＲＮＡの組合せから構成され得る。触媒ヘアピン分子は、３’トーホールドドメインの反対側の分子の末端にループドメインをさらに含む。多重化プライマー交換反応の動態は、例えば、触媒分子（例えば、触媒分子の１つ又は複数のドメイン）の長さ、組成及び濃度を変更することによって制御することができる。
触媒ヘアピン分子（説明的な例として、図１Ａを参照されたい）は、ヘアピンループドメイン（ループ様構造）に連結された対ステムドメイン（例えば、サブドメイン「２」のサブドメイン「２’」への分子内結合により形成される）に連結された３’トーホールドドメイン（「１’」）を含む。従って、いくつかの実施形態では、触媒ヘアピン分子は、分子内塩基対合によりヘアピン構造に形成された単一の核酸鎖を含む。ループドメイン（「二本鎖」）のない触媒分子も本明細書において提供される。触媒分子（例えば、触媒ヘアピン分子）の長さは、変動し得る。いくつかの実施形態では、核酸から構成される触媒分子は、２５～３００ヌクレオチド長（５’－３’方向）を有する。例えば、核酸から構成される触媒分子は、２５～２５０、２５～２００、２５～１５０、２５～１００、２５～５０、５０～３００、５０～２５０、５０～２００、５０～１５０、又は５０～１００ヌクレオチド長を有し得る。いくつかの実施形態では、核酸から構成される触媒分子は、３０～５０、４０～６０、５０～７０、６０～８０、７０～９０、８０～１００、１００～１２５、１００～１５０、又は１００～２００ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、核酸から構成される触媒分子は、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００ヌクレオチド長を有する。核酸から構成される触媒分子は、いくつかの実施形態では３００ヌクレオチドよりも長いか、又は２５ヌクレオチドよりも短い。
トーホールドドメインは、触媒分子の３’末端に位置する不対ドメイン（不対３’ドメイン）であり、プローブ鎖のプライマードメインに結合する。いくつかの実施形態では、トーホールドドメイン（従って触媒分子）は、プローブ鎖のプライマードメインに対して相補的な（例えば、長さ及び／又はヌクレオチド組成において完全又は部分的に）ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、トーホールドドメインヌクレオチド配列は、プローブ鎖のプライマードメインよりも長いか又は短い。他の実施形態では、トーホールドドメインヌクレオチド配列は、プローブ鎖のプライマードメインと同じ長さである。トーホールドドメインの長さは、変動し得る。いくつかの実施形態では、トーホールドドメインは、５～４０ヌクレオチド長を有する。例えば、トーホールドドメインは、２～３５、２～３０、２～２５、２～２０、２～１５、２～１０、５～３５、５～３０、５～２５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～４０、１０～３５、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、１５～４０、１５～３５、１５～３０、１５～２５、１５～２０、２０～４０、２０～３５、２０～３０、２０～２５、２５～４０、２５～３５、２５～３０、３０～４０、３０～３５、又は３５～４０ヌクレオチド長を有し得る。いくつかの実施形態では、トーホールドドメインは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、トーホールドドメインは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチド長を有する。トーホールドドメインは、いくつかの実施形態では、４０ヌクレオチドよりも長いか、又は５ヌクレオチドよりも短い。
触媒ヘアピン分子のループドメインは、ステムドメインの（３’トーホールドドメインの反対側の）末端（隣接する）にループ様構造を形成するヌクレオチドの主に不対の配列を指す。ループドメインの長さは、変動し得る。いくつかの実施形態では、核酸から構成される触媒ヘアピン分子のループドメインは、３～２００ヌクレオチド長を有する。例えば、ループドメインは、３～１７５、３～１５０、３～１２５、３～１００、３～７５、３～５０、３～２５、４～１７５、４～１５０、４～１２５、４～１００、４～７５、４～５０、４～２５、５～１７５、５～１５０、５～１２５、５～１００、５～７５、５～５０、又は５～２５ヌクレオチド長を有し得る。いくつかの実施形態では、ループドメインは、３～１０、３～１５、３２～１０、３～２５、３～３０、３～３５、３～４０、３～３５、３～４０、３～４５、３～５０、４～１０、４～１５、４～１０、４～２５、４～３０、４～３５、４～４０、４～３５、４～４０、４～４５、又は４～５０ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、ループドメインは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０ヌクレオチド長を有する。ループドメインは、いくつかの実施形態では、３００ヌクレオチドよりも長い。
いくつかの実施形態では、触媒分子は、ヘアピンループドメインを含有しない。例えば、触媒分子は、単に、ステムドメインに類似している対ドメインに隣接する３’不対トーホールドドメインを含む二本鎖であり得る（隣接するループドメインを含まない）。ループドメインを含まない触媒分子は、１区間（例えば、１０以上）のヌクレオチド塩基対間の架橋又はヌクレオチド塩基相補性により、３’トーホールドドメインと反対側の末端において安定化され得る。
プローブ鎖は、いくつかの実施形態では、分子標的に結合する不対５’標的ドメインと、多重化プライマー交換反応を開始するために触媒分子の不対３’トーホールドドメインに結合する不対３’プライマードメインとを含む。プローブ鎖は、いくつかの実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ及びＲＮＡの組合せから構成される。多重化ＰＥＲ反応（説明的な例として、図５Ｂのプローブ鎖、及び図１の標的ドメインを含まない簡略版を参照されたい）において、プローブ鎖のプライマードメイン（「１」）は、触媒分子のトーホールドドメイン（「１’」）に結合し、反応溶液中に存在する鎖置換ポリメラーゼによるプライマーの伸長は、分岐点移動プロセスにより触媒分子のステムドメインのサブドメイン（「２」）の１つを置換する。全体的な効果は、ヘアピンステムドメインのサブドメイン（「２」）の１つが、伸長された（新しく合成された）プライマードメインで置き換えられることである。
いくつかの実施形態では、プローブ鎖（標的ドメイン及びプライマードメインを含む）は、１０～５０ヌクレオチド長を有する。例えば、プローブ鎖は、１０～４５、１０～４０、１０～３５、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、１５～５０、１５～４５、１５～４０、１５～３５、１５～３０、１５～２５、１５～２０、２０～５０、２０～４５、２０～４０、２０～３５、２０～３０、２０～２５、２５～５０、２５～４５、２５～４０、２５～３５、２５～３０、３０～５０、３０～４５、３０～４０、３０～３５、３５～５０、３５～４５、３５～４０、４０～５０、４０～４５、又は４５～５０ヌクレオチド長を有し得る。いくつかの実施形態では、プローブ鎖は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、プローブ鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチド長を有する。プローブ鎖は、いくつかの実施形態では、５０ヌクレオチドよりも長いか、又は１０ヌクレオチドよりも短い。
いくつかの実施形態では、プライマードメイン（触媒分子のトーホールドドメインに結合するヌクレオチド配列）は、１０～３０ヌクレオチド長を有する。例えば、プライマードメインは、１０～２５、１０～２０、１０～１５、１５～３０、１５～２５、１５～２０、２０～３０、２０～２５、又は２５～３０ヌクレオチド長を有し得る。いくつかの実施形態では、プライマードメインは、１０、１５、２０、２５、又は３０ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、プライマードメインは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチド長を有する。
いくつかの実施形態では、置換ポリメラーゼによるプライマードメイン（プライマー結合部位に結合）の伸長は、重合を終結させる触媒分子中の分子又は修飾の存在によって終結される。従って、いくつかの実施形態では、本開示の触媒分子は、重合を終結させる分子又は修飾を含む。重合を終結させる分子又は修飾（「ストッパー」）は、通常、対ドメインにより重合がプライマーの伸長を終結させるように、触媒分子の対ドメイン（例えば、ステムドメイン）内に位置する。ヘアピンの形態に配置される触媒分子の場合、重合を終結させる分子又は修飾は、対ステムドメインとループドメインとの間に位置し得る（例えば、図１の触媒ヘアピン分子内の３本の黒色直線を参照されたい）。いくつかの実施形態では、重合を終結させる分子は、合成非ＤＮＡリンカー、例えばInt Spacer 9（iSp9）又はSpacer 18（Integrated DNA Technologies（ＩＤＴ））などのトリエチレングリコールスペーサーである。ポリメラーゼによる重合を終結させる任意の非ネイティブリンカーが、本明細書に提供されるように使用され得ることが理解されるべきである。このような分子及び修飾の他の非限定的な例としては、３炭素連結（Int C3 Spacer、iSpC3）（ＩＤＴ）、ACRYDITEＴＭ（ＩＤＴ）、アデニル化、アジド、ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）、コレステリル－ＴＥＧ（ＩＤＴ）、I-LINKERＴＭ（ＩＤＴ）、及び３－シアノビニルカルバゾール（ＣＮＶＫ）並びにこれらの変異体が挙げられる。常にではないが通常、短いリンカー（例えば、iSp9）は、より速い反応時間をもたらす。
いくつかの実施形態では、重合を終結させる分子は、それぞれシトシン及びグアニンの化学変異体であるｉｓｏ－ｄＧ及びｉｓｏ－ｄＣ（ＩＤＴ）などの単一又は対の非天然ヌクレオチド配列である。Ｉｓｏ－ｄＣは、Ｉｓｏ－ｄＧと塩基対合（水素結合）し得るが、ｄＧと塩基対合しない。同様に、Ｉｓｏ－ｄＧは、Ｉｓｏ－ｄＣと塩基対合し得るが、ｄＣと塩基対合しない。ストッパー位置において、これらのヌクレオチドをヘアピンの反対側の対に組み込むことにより、ポリメラーゼは、その位置に付加するための相補的ヌクレオチドを溶液中に有さないために停止され得る。
いくつかの実施形態では、「ストッパー」修飾の性能の効率は、反応中のｄＮＴＰ濃度を（例えば、２００μＭから）１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、又はそれを下回って低下させることによって改善される。
重合を終結させる分子又は修飾を包含させると、その分子又は修飾が対合されないため、多くの場合、触媒分子の対ドメイン（例えば、ヘアピン構造のステムドメイン）内にバルジが形成される。従って、いくつかの実施形態では、触媒分子は、その分子又は修飾の反対側に単一のヌクレオチド（例えば、チミン）、少なくとも２つの同じヌクレオチド（例えば、チミン二量体（ＴＴ）又は三量体（ＴＴＴ））、又は非天然修飾を含むように設計される。
プローブ鎖の標的ドメインは、直接又は間接的に分子標的に結合する。例えば、分子標的が核酸標的（例えば、染色体ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）である場合、標的ドメイン（従ってプローブ鎖）が核酸標的に直接結合するように、標的ドメインは、核酸標的のドメインに対して相補的なヌクレオチド配列を含むように設計され得る（例えば、図５Ａ～５Ｅを参照されたい）。しかしながら、分子標的がタンパク質又はペプチドである場合、タンパク質又はペプチド標的へのプローブ鎖の結合は、間接的であり得る。このような実施形態では、一次及び／又は二次抗体（又は他の結合パートナー）を使用して、まずタンパク質又はペプチド標的を局在化させることができ、次に（１）「予め作製された」コンカテマーが抗体に付加される（例えば、図１０Ａを参照されたい）か、又は（２）抗体に付加した中間架橋鎖を介してプローブ鎖が一次又は二次抗体（又は他の結合パートナー）に結合する。例えば、プローブ鎖が一次抗体の架橋鎖に結合して、触媒分子及びポリメラーゼの存在下で多重化プライマー交換反応を開始させることができるように、一次抗体は、プローブ鎖の５’標的ドメインに対して相補的なドメインを含む「架橋鎖」（不対核酸鎖）により修飾され得る。或いは、（非修飾）一次抗体（分子標的に対して特異的）を使用してタンパク質又はペプチド標的を局在化させ得、次に架橋鎖で修飾された二次抗体（一次抗体に対して特異的）を使用して一次抗体を局在化させる。プローブ鎖は、次に二次抗体の架橋鎖に結合して、触媒分子及びポリメラーゼの存在下で多重化プライマー交換反応を開始させる。さらに他の実施形態では、抗体に付加されたプローブ鎖は、それ自体がプライマー（プライマードメイン）の役割を果たし、触媒分子のトーホールドドメインに直接結合することによってプライマー交換反応を開始させることができる（例えば、図１０Ｂを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本方法は、複数のタンパク質又はペプチド標的を含有するサンプルと、複数の結合パートナーとを組み合わせて、第１の反応混合物を形成した後、第１の反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、複数の触媒分子、及び複数のプローブ鎖とを組み合わせる（種々の要素（ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、触媒分子、及びプローブ鎖）の段階的及び同時的な付加を包含する）ことを含む。例えば、場合により、ユーザーは、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、及び触媒分子を添加する前にプローブを反応混合物に付加してプローブをプレハイブリダイズすることを好み得る。
本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、分子標的（すなわちタンパク質又はペプチド標的）に結合する一次結合パートナーを用いる。一次結合パートナーは、抗体、又は分子標的に特異的に結合することができる任意の他の結合パートナーであり得る。他に言及されない限り、抗体という用語が全長抗体及び抗原結合抗体断片を包含することが理解されるべきである。従って、いくつかの実施形態では、一次結合パートナーは、全長抗体であり得、他の実施形態では、一次結合パートナーは、抗原結合抗体断片であり得る。さらに、いくつかの実施形態は、一次結合パートナーに結合する二次結合パートナーを用いる。二次結合パートナーは、いくつかの実施形態では、全長抗体又は抗原結合抗体断片などの抗体である。他の結合パートナーが二次結合パートナーとして使用され得る。
分子標的がタンパク質又はペプチドである場合、分子標的に結合する分子は、抗体でなくてもよい。分子標的に特異的に結合することができる任意の分子（任意の「結合パートナー」）が使用され得る。従って、結合パートナーは、標的結合抗体又は任意のタイプのその抗原結合断片を含む。さらに、例えば、分子標的がタンパク質リガンドであれば、架橋鎖で修飾される分子は、そのリガンドの受容体であり得る。いくつかの実施形態では、分子標的を局在化させる（それに結合する）ために、融合タンパク質、ペプチド、タンパク質断片、毒素、脂質、又は親和性プローブ（ナノボディ、アフィボディ、単鎖可変断片及びアプタマーを含むが、これらに限定されない）が使用され得る。他の結合パートナー（例えば、タンパク質結合パートナー）の相互作用は、本明細書に包含される。同様に、いくつかの実施形態では、結合パートナーを局在化させる（それに結合する）ために、結合パートナーに結合する他の二次プローブ（タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ又は抗体特異的ナノボディを含むが、これらに限定されない）が使用され得る。
図５Ａ～５Ｅに示されるような多重化プライマー交換反応は、長い核酸コンカテマーの生成をもたらす（例えば、図５Ｄを参照されたい）。分子標的（ポリメラーゼの存在下）に結合されたプローブ鎖は、触媒分子と相互作用して、いくつかの実施形態ではタンデム反復配列である成長鎖を生成する。このタンデム反復配列のコンカテマーは、増幅シグナルの基礎としての役割を果たす。コンカテマーが生成されると、シグナル鎖は、コンカテマーに結合して、増幅シグナルを生じることができる（図５Ｅ）。
シグナル鎖は、このようにしてコンカテマーに結合する。シグナル鎖は、いくつかの実施形態では、プローブ鎖のプライマードメインに対して相補的な配列を含み、従って、シグナル鎖は、成長プローブ鎖から生成されるコンカテマーに結合することができる。シグナル鎖は、検出可能な分子（例えば、蛍光又は化学発光シグナルなどの検出可能なシグナルを発する分子）に連結（それで標識）される。いくつかの実施形態では、標識は、フルオロフォアである。フルオロフォア又は他の蛍光／化学発光分子に連結したプライマーは、単に「蛍光プライマー」と呼ばれる。本明細書で使用され得るフルオロフォアの例としては、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、Alexa fluor、アミノクマリン、Cy2、ＦＡＭ、Alexa fluor 405、Alexa fluor 488、フルオレセインＦＩＴＣ、Alexa fluor 430、Alexa fluor 532、HEX、Cy3、ＴＲＩＴＣ、Alexa fluor 546、Alexa fluor 555、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）、Rhodamine Red-X、Tamara、Cy3.5 581、Rox、Alexa fluor 568、Red 613、Texas Red、Alexa fluor 594、Alexa fluor 633、アロフィコシアニン、Alexa fluor 647、Cy5、Alexa fluor 660、Cy5.5、TruRed、Alexa fluor 680、Cy7及びCy7.5が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能なシグナルを発する他のフルオロフォア及び分子は、本開示によって包含される。
多重化プライマー交換反応は、ポリメラーゼの使用を必要とする。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡ鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（鎖置換ポリメラーゼ）などのＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）である。「鎖置換」は、合成中に遭遇される下流側のＤＮＡを置換する能力を説明する。本明細書で提供されるように使用され得る、ＤＮＡ鎖置換活性を有するポリメラーゼ（鎖置換ポリメラーゼ）の例としては、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＮＥＢ＃Ｍ０２６９）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（例えば、ＮＥＢ＃Ｍ０２７５）、又はＢｓｕ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（例えば、ＮＥＢ＃Ｍ０３３０）が挙げられるが、これらに限定されない。鎖置換活性を有する他のポリメラーゼも使用され得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼである。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである。このような実施形態では、反応条件は、次の通りであり得る：精製ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が補充された１Ｘ反応バッファー（例えば、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭのＤＴＴ）、ｐＨ７．５、３０℃でインキュベート。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントである。このような実施形態では、反応条件は、次の通りであり得る：１Ｘ反応バッファー（例えば、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のTRITON（登録商標）X-100）、ｐＨ８．８、６５℃でインキュベート。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼである。このような実施形態では、反応条件は、次の通りであり得る：１Ｘ反応バッファー（例えば、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ）、ｐＨ７．９、３７℃インキュベート。
多重化プライマー交換反応システム中のプライマー、触媒分子及びｄＮＴＰの濃度は、例えば、特定の用途及びその特定の用途に必要とされる動態に応じて変動し得る。
多重化プライマー交換反応におけるプライマーの濃度は、例えば、１０ｎＭ～１０００ｎＭであり得る。いくつかの実施形態では、多重化プライマー交換反応におけるプライマー濃度は、１０～２０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～７０、１０～８０、１０～９０、１０～１００、１０～１２５、１０～１５０、１０～２００、２５～５０、２５～７５、２５～１００、２５～１５０、２５～２００、５０～７５、５０～１００、５０～１５０、又は５０～２００ｎＭである。いくつかの実施形態では、多重化プライマー交換反応におけるプライマー濃度は、１００～２００、１００～３００、１００～４００、１００～５００、１００～６００、１００～７０、１００～８００、１００～９００、又は１００～１０００ｎＭである。いくつかの実施形態では、多重化プライマー交換反応におけるプライマー濃度は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、又は２００ｎＭである。いくつかの実施形態では、多重化プライマー交換反応におけるプライマー濃度は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００ｎＭである。多重化プライマー交換反応におけるプライマーの濃度は、１０ｎＭ未満であり得、又は１０００ｎＭを超え得る。
多重化プライマー交換反応における触媒分子（例えば、触媒ヘアピン）の濃度は、例えば、５ｎＭ～１０００ｎＭであり得る。いくつかの実施形態では、多重化プライマー交換反応における触媒分子濃度は、５～１０、５～２０、５～３０、５～４０、５～５０、５～６０、５～７０、５～８０、５～９０、５～１００、５～１２５、５～１５０、５～２００、１０～５０、１０～７５、１０～１００、１０～１５０、１０～２００、２５～７５、２５～１００、２５～１２５、又は２５～２００ｎＭである。いくつかの実施形態では、多重化プライマー交換反応における触媒分子濃度は、１０～２００、１０～３００、１０～４００、１０～５００、１０～６００、１０～７０、１０～８００、１０～９００、又は１０～１００ｎＭである。いくつかの実施形態では、多重化プライマー交換反応における触媒分子濃度は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、又は２００ｎＭである。いくつかの実施形態では、多重化プライマー交換反応における触媒分子濃度は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｎＭである。多重化プライマー交換反応における触媒分子の濃度は、５ｎＭ未満であり得、又は１０００ｎＭを超え得る。
多重化プライマー交換反応におけるプライマー対触媒分子の比率は、２：１～１００：１であり得る。いくつかの実施形態では、プライマー対触媒分子の比率は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、又は２０：１である。いくつかの実施形態では、プライマー対触媒分子の比率は、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、又は９０：１である。
多重化プライマー交換反応における異なる触媒分子の数は、非限定的である。多重化プライマー交換反応は、１～１０１０の異なる触媒分子（それぞれ例えば特異的なトーホールドドメイン配列を有する）を含み得る。いくつかの実施形態では、多重化プライマー交換反応は、１～１０、１～１０２、１～１０３、１～１０４、１～１０５、１～１０６、１～１０７、１～１０８、１～１０９、１～１０１０、又はそれを超える異なる触媒分子を含む。いくつかの実施形態では、多重化プライマー交換反応は、１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５、１～５０、１～５５、１～６０、１～６５、１～７０、１～７５、１～８０、１～８５、１～９０、１～９５、１～１００、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、５～３５、５～４０、５～４５、５～５０、５～５５、５～６０、５～６５、５～７０、５～７５、５～８０、５～８５、５～９０、５～９５、５～１００、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１０～３５、１０～４０、１０～４５、１０～５０、１０～５５、１０～６０、１０～６５、１０～７０、１０～７５、１０～８０、１０～８５、１０～９０、１０～９５、又は１０～１００の異なる触媒分子を含む。いくつかの実施形態では、多重化プライマー交換反応は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５の異なる触媒分子を含む。触媒分子は、例えば、そのトーホールドドメインが互いに異なれば、互いに異なる。
多重化プライマー交換反応の動態は、例えば、温度、時間、バッファー／塩条件、及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）濃度を変化させることによって制御され得る。ポリメラーゼは、ほとんどの酵素と同様に、イオン強度、ｐＨ、及び存在する金属イオンの種類（例えば、ナトリウムイオン対マグネシウムイオン）を含む多数のバッファー条件に敏感である。従って、多重化プライマー交換反応が実施される温度は、例えば、４℃～６５℃（例えば、４℃、２５℃、３７℃、４２℃、又は６５℃）で変動し得る。いくつかの実施形態では、多重化プライマー交換反応が実施される温度は、４～２５℃、４～３０℃、４～３５℃、４～４０℃、４～４５℃、４～５０℃、４～５５℃、４～６０℃、１０～２５℃、１０～３０℃、１０～３５℃、１０～４０℃、１０～４５℃、１０～５０℃、１０～５５℃、１０～６０℃、２５～３０℃、２５～３５℃、２５～４０℃、２５～４５℃、２５～５０℃、２５～５５℃、２５～６０℃、２５～６５℃、３５～４０℃、３５～４５℃、３５～５０℃、３５～５５℃、３５～６０℃、又は３５～６５℃である。いくつかの実施形態では、多重化プライマー交換反応は、室温で実施されるが、他の実施形態では、多重化プライマー交換反応は、３７℃で実施される。
多重化プライマー交換反応は、３０分間（ｍｉｎ）～２４時間（ｈｒ）にわたって実施（インキュベート）され得る。いくつかの実施形態では、多重化プライマー交換反応は、１０分間、３５分間、４０分間、４５分間、５０分間、５５分間、６０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、又は２４時間にわたって実行される。
デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）は、多重化プライマー交換反応を駆動する「燃料」である。従って、多重化プライマー交換反応の動態は、いくつかの実施形態では、反応におけるｄＮＴＰの濃度に大きくに依存する。多重化プライマー交換反応におけるｄＮＴＰの濃度は、例えば、２～１０００μＭであり得る。いくつかの実施形態では、多重化プライマー交換反応におけるｄＮＴＰ濃度は、２～１０μＭ、２～１５μＭ、２～２０μＭ、２～２５μＭ、２～３０μＭ、２～３５μＭ、２～４０μＭ、２～４５μＭ、２～５０μＭ、２～５５μＭ、２～６０μＭμＭ、２～６５μＭ、２～７０μＭ、２～７５μＭ、２～８０μＭ、２～８５μＭ、２～９０μＭ、２～９５μＭ、２～１００μＭ、２～１１０μＭ、２～１２０μＭ、２～１３０μＭ、２～１４０μＭ、２～１５０μＭ、２～１６０μＭ、２～１７０μＭ、２～１８０μＭ、２～１９０μＭ、２～２００μＭ、２～２５０μＭ、２～３００μＭ、２～３５０μＭ、２～４００μＭ、２～４５０μＭ、２～５００μＭ、２～６００μＭ、２～７００μＭ、２～８００μＭ、２～９００μＭ、又は２～１０００μＭである。例えば、多重化プライマー交換反応におけるｄＮＴＰ濃度は、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、９５μＭ、１００μＭ、１０５μＭ、１１０μＭ、１１５μＭ、１２０μＭ、１２５μＭ、１３０μＭ、１３５μＭ、１４０μＭ、１４５μＭ、１５０μＭ、１５５μＭ、１６０μＭ、１６５μＭ、１７０μＭ、１７５μＭ、１８０μＭ、１８５μＭ、１９０μＭ、１９５μＭ、又は２００μＭであり得る。いくつかの実施形態では、多重化プライマー交換反応におけるｄＮＴＰ濃度は、１０～２０μＭ、１０～３０μＭ、１０～４０μＭ、１０～５０μＭ、１０～６０μＭ、１０～７０μＭ、１０～８０μＭ、１０～９０μＭ、又は１０～１００μＭである。
いくつかの実施形態では、ｄＮＴＰ変異体が使用される。例えば、ＰＥＲシステムは、ホットスタート／クリーンアンプ（hot start/clean amp）ｄＮＴＰ、ホスホロチオエートｄＮＴＰ、又は蛍光ｄＮＴＰを使用し得る。他のｄＮＴＰ変異体も使用され得る。いくつかの修飾ｄＮＴＰは、正常な（非修飾）ＤＮＡ－ＤＮＡ結合よりも好ましくないため、その使用により、ヘアピン戻し置換プロセスが増大され得る。同様に、異なるタイプの核酸（例えば、ＬＮＡ、ＲＮＡ、又はメチルｄＣ若しくはスーパーＴ ＩＤＴ修飾などの散在修飾塩基）から構成されるヘアピンは、いくつかの実施形態では、触媒分子に関して合成プライマーよりも強い結合を形成することによりＰＥＲの速度を増大させるために使用され得る。
いくつかの実施形態では、触媒分子は、フルオロフォア又はタンパク質などの生体分子に共有結合で連結される。いくつかの実施形態では、触媒分子は、ビオチン修飾を含有し、従ってビオチン－ストレプトアビジン結合により表面に係留され得る。いくつかの実施形態では、触媒分子は、サブドメインの１つにアジド修飾などの修飾を含有し、これによりクリックケミストリーを介してアルキンなどの他の分子に共有結合で連結することができる。他の化学的及び生物学的連結は、本開示により包含される。
本開示の核酸が天然に存在しないことが理解されるべきである。従って、核酸は、「改変核酸」と呼ぶことができる。改変核酸は、天然に存在しない核酸（例えば、互いに共有結合で連結され、且つ場合により、ホスホジエステル骨格と呼ばれるホスホジエステル結合を含有する少なくとも２つのヌクレオチド）である。改変核酸は、組換え核酸及び合成核酸を含む。組換え核酸は、核酸（例えば、単離核酸、合成核酸又はこれらの組合せ）を連結することによって構築され、且つ場合により、生細胞において複製することができる分子である。合成核酸は、増幅されるか、又は化学的に若しくは他の手段により合成された分子である。合成核酸は、化学的に修飾されるか又は他の方法で修飾されるが、天然に存在する核酸分子と塩基対合する（例えば、一時的に又は安定して「結合する」とも称される）ことができるものを含む。組換え及び合成核酸は、上記のもののいずれかの複製から得られる分子も含む。
改変核酸は、全体として、天然に存在しないが、野生型ヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、改変核酸は、異なる生物から得られる（例えば、異なる種から得られる）ヌクレオチド配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、改変核酸は、マウスヌクレオチド配列、細菌ヌクレオチド配列、ヒトヌクレオチド配列、ウイルスヌクレオチド配列、又は上記の配列のいずれか２つ以上の組合せを含む。いくつかの実施形態では、改変核酸は、１つ又は複数のランダム塩基を含有する。
いくつかの実施形態では、本開示の改変核酸は、ホスホジエステル骨格以外の骨格を含み得る。例えば、改変核酸は、いくつかの実施形態では、ホスホルアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ－メチルホスホロアミダイト結合、ペプチド核酸又は上記の結合の任意の２つ以上の組合せを含み得る。改変核酸は、規定されるように、一本鎖（ｓｓ）又は二本鎖（ｄｓ）であり得、又は改変核酸は、一本鎖及び二本鎖配列の両方の部分を含有し得る。いくつかの実施形態では、改変核酸は、三本鎖配列、又はＧ－カルテット、Ｇ－四本鎖、及びｉ－モチーフなどの他の非Watson-Crick型塩基対合の部分を含有する。改変核酸は、例えば、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの組合せ）、ＲＮＡ又はハイブリッド分子を含むことができ、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド（例えば、人口又は天然）の任意の組合せ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン及びイソグアニンを含む２つ以上の塩基の任意の組合せを含有する。改変核酸は、官能基（例えば、架橋化学、例えばアジド官能基、アルキン官能基、ビオチン官能基、６－ＦＡＭ官能基、５－ＴＡＭＲＡ官能基及び／又は５－ブロモｄＵ）によって修飾され得ることも理解されるべきである。
本開示の改変核酸は、標準分子生物学法を用いて生成され得る（例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2012, Cold Spring Harbor Pressを参照されたい）。いくつかの実施形態では、核酸は、GIBSON ASSEMBLY（登録商標）クローニングを用いて生成される（例えば、Gibson, D.G. et al. Nature Methods, 343-345, 2009；及びGibson, D.G. et al. Nature Methods, 901-903, 2010を参照されたく、これらのそれぞれは、参照により本明細書に援用される）。GIBSON ASSEMBLY（登録商標）は、通常、シングルチューブ反応において３つの酵素活性：５’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼの３’伸長活性、及びＤＮＡリガーゼ活性を使用する。５’エキソヌクレアーゼ活性は、５’末端配列をチューバック（chew back）し、アニーリングのために相補的配列を露出させる。次に、ポリメラーゼ活性は、アニーリングされたドメイン上のギャップを充填する。次に、ＤＮＡリガーゼは、ニックを密封し、ＤＮＡ断片を互いに共有結合で連結させる。隣接する断片のオーバーラップ配列は、Golden Gate Assemblyで使用されるものよりもはるかに長く、従ってより高い割合の正しい集合体をもたらす。改変核酸を生成する他の方法は、当該技術分野で知られており、本開示に従って使用され得る。例えば、鎖のサブセットは、多数（例えば、数百又は数千）の特有の鎖を含有するマイクロアレイライブラリから増幅され得る。
分岐変異体
本明細書では、分岐コンカテマーの生成をもたらす方法も提供され、これは、プローブの検出をさらに増幅する。これらの方法を用いて生成される組成物も提供される。さらに、本明細書では、これらの方法を実施するためのキットが提供される。分岐変異体の例は、図１７、図２２Ａ、及び図２２Ｅにおいて提供される。分岐構造は、例えば、図１７及び図２２Ａにおいて分岐状のパターンで描かれるように、第１のコンカテマー種の複数のコピー（全て同じ配列を有する）を第２のコンカテマー種（第１の種とは異なる配列を有する）に連結させることによって生成され得る。分岐構造は、例えば、複数の異なるコンカテマー種を分岐状のパターンで互いに連結させることによっても生成され得る。
本明細書では、分岐コンカテマーの生成をもたらす方法も提供され、これは、プローブの検出をさらに増幅する。これらの方法を用いて生成される組成物も提供される。さらに、本明細書では、これらの方法を実施するためのキットが提供される。分岐変異体の例は、図１７、図２２Ａ、及び図２２Ｅにおいて提供される。分岐構造は、例えば、図１７及び図２２Ａにおいて分岐状のパターンで描かれるように、第１のコンカテマー種の複数のコピー（全て同じ配列を有する）を第２のコンカテマー種（第１の種とは異なる配列を有する）に連結させることによって生成され得る。分岐構造は、例えば、複数の異なるコンカテマー種を分岐状のパターンで互いに連結させることによっても生成され得る。
従って、いくつかの実施形態では、多重化標的検出方法は、（ａ）複数の核酸標的を含有するサンプルと、第１の複数のプローブ鎖であって、第１の複数のものの各プローブ鎖は、（ｉ）核酸標的の１つに対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含む、第１の複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合された分子標的を含む反応混合物を生成すること、（ｂ）ステップ（ａ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第１の複数の触媒分子であって、第１の複数のものの各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、プローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、第１の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分子標的に結合された第１の複数の核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成すること、（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された反応混合物と、第２の複数のプローブ鎖であって、第２の複数のものの各プローブ鎖は、（ｉ）コンカテマーの配列に対して相補的な不対５’ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含む、第２の複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合されたコンカテマーを含む反応混合物を生成すること、（ｄ）ステップ（ｃ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第２の複数の触媒分子であって、第２の複数のものの各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、第２の複数のプローブ鎖のプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、第２の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ第２の複数の核酸コンカテマーに結合された第１の複数の核酸コンカテマーの核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成すること、（ｅ）ステップ（ｄ）で生成された反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ第２の複数のプローブ鎖のプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成することを含み、及び（ｆ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む。例えば、図１７を参照されたい。
いくつかの実施形態では、多重化標的検出方法は、（ａ）複数の核酸標的を含有するサンプルと、第１の複数のプローブ鎖であって、第１の複数のものの各プローブ鎖は、（ｉ）核酸標的の１つに対して相補的な不対５’標的ドメインａ、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインｂを含む、第１の複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合された分子標的を含む反応混合物を生成することと、（ｂ）ステップ（ａ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第１の複数の触媒分子であって、第１の複数のものの各触媒分子は、５’－３’方向にドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、ドメインｂ１、ドメインｂ１
＊、ドメインａ２
＊、ドメインｘ＊、ドメインａ１
＊、ドメインｂ２
＊、及びドメインａ３
＊を含み、ドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、及びドメインｂ１は、それぞれドメインｂ１
＊、ドメインａ２
＊、ドメインｘ＊、及びドメインａ１
＊に結合し（これらに対して相補的である）、且つドメインｂ２
＊及びドメインａ３
＊は、第１の複数のもののプローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインを形成する、第１の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分子標的に結合された第１の複数の核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成することと、（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された反応混合物と、第２の複数のプローブ鎖であって、第２の複数のものの各プローブ鎖は、（ｉ）触媒分子のドメインｘに対して相補的な不対５’ドメインｘ＊、及び（ｉｉ）触媒分子のドメインｂ１及びｂ２
＊に対して相補的な不対３’プライマードメインｂを含む、第２の複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合されたコンカテマーを含む反応混合物を生成することと、（ｄ）ステップ（ｃ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第２の複数の触媒分子であって、第２の複数のものの各触媒分子は、５’－３’方向にドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、ドメインｂ１、ドメインｂ１
＊、ドメインａ２
＊、ドメインｘ＊、ドメインａ１
＊、ドメインｂ２
＊、及びドメインａ３
＊を含み、ドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、及びドメインｂ１は、それぞれドメインｂ１
＊、ドメインａ２
＊、ドメインｘ＊、及びドメインａ１
＊に結合し（これらに対して相補的である）、且つドメインｂ２
＊及びドメインａ３
＊は、第１の複数のもののプローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインを形成する、第２の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分岐コンカテマーを生成することとを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｅ）ステップ（ｄ）で生成された反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ第１及び／又は第２の複数のプローブ鎖のプローブ鎖の不対３’プライマードメインｂに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む。例えば、図２２Ｄ及び２２Ｅを参照されたい。
いくつかの実施形態では、触媒分子は、ＤＮＡから構成される。いくつかの実施形態では、触媒分子は、ＲＮＡから構成される。
いくつかの実施形態では、各触媒分子の第１のドメインは、同じ触媒分子の第２のドメインに結合される。いくつかの実施形態では、各触媒分子の第１のドメインは、同じ触媒分子の第２のドメインに対して完全に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、各触媒分子の第２のドメインは、同じ触媒分子の第３のドメインと同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、各触媒分子は、同じ触媒分子の第１のドメインと第２のドメインとの間に位置する、重合を終結させるストッパー分子又は修飾をさらに含む。例えば、重合を終結させる分子又は修飾は、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、１８原子ヘキサエチレングリコール、アデニル化、アジド、ジゴキシゲニン、コレステリル－ＴＥＧ、３－シアノビニルカルバゾール（ＣＮＶＫ）、ｉｓｏ－ｄＧ、及びｉｓｏ－ｄＣから選択され得る。いくつかの実施形態では、ストッパー分子は、グアニンであり、且つ触媒分子は、アデニン、チミン、及びシトシンから構成されるか、又はストッパー分子は、シトシンであり、且つ触媒分子は、アデニン、チミン、及びグアニンから構成される。
いくつかの実施形態では、各触媒分子は、第１のドメインと第２のドメインとの間に位置するループドメインをさらに含む触媒ヘアピン分子である。いくつかの実施形態では、各触媒ヘアピン分子は、２５～３００ヌクレオチド長を有するＤＮＡの一本鎖から構成される。
いくつかの実施形態では、触媒分子は、１ｎＭ～１μＭの濃度で反応混合物中に存在する。他の濃度は、本明細書中の他の箇所で提供される。
いくつかの実施形態では、プローブ鎖は、ＤＮＡから構成される。いくつかの実施形態では、プローブ鎖は、ＲＮＡから構成される。
いくつかの実施形態では、各プローブ鎖は、１０～５０ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、各プローブ鎖の標的ドメインは、５～２５ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、各プローブ鎖のプライマードメインは、５～２５ヌクレオチド長を有する。他のプローブ鎖の長さ及びドメインの長さは、本明細書中の他の箇所で提供される。
いくつかの実施形態では、本組成物は、１ｎＭ～１μＭの濃度のプローブ鎖を含む。他の濃度は、本明細書中の他の箇所で提供される。
いくつかの実施形態では、核酸標的は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。例えば、核酸標的は、染色体ＤＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、核酸標的は、ｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、シグナル鎖の検出可能な分子は、フルオロフォアである。いくつかの実施形態では、シグナル鎖のそれぞれは、１０～３０ヌクレオチド長を有する。他のシグナル鎖の長さは、本明細書中の他の箇所で提供される。
いくつかの実施形態では、反応混合物は、１ｎＭ～１μＭの濃度のシグナル鎖を含む。他の濃度は、本明細書中の他の箇所で提供される。
いくつかの実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＢｓｕ ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントから選択される。
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の反応混合物は、水性バッファー、任意選択的にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。
いくつかの実施形態では、反応混合物は、１～５００μＭの濃度のｄＮＴＰを含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、５～５０ｍＭの濃度のＭｇＳＯ４を含む。
変異体の画像化
多重化は、いくつかの直交性のＰＥＲ伸長反応を設計することにより達成される。これらの鎖に相補的なオリゴヌクレオチドにおいて異なるフルオロフォアを使用することにより、３～４つまでの標的を画像化することができる。別の可能性は、連続して成長されるプローブ鎖のそれぞれに対して異なるフルオロフォアを用いるか、又は異なる配列から生じる差次的な蛍光色に依存して、各蛍光点の色を特異的な標的にマッピングすることのいずれかにより、ＰＥＲ伸長中にフルオロフォア標識化ｄＮＴＰを使用して各伸長反応をバーコード化することである。
多重化は、いくつかの直交性のＰＥＲ伸長反応を設計することにより達成される。これらの鎖に相補的なオリゴヌクレオチドにおいて異なるフルオロフォアを使用することにより、３～４つまでの標的を画像化することができる。別の可能性は、連続して成長されるプローブ鎖のそれぞれに対して異なるフルオロフォアを用いるか、又は異なる配列から生じる差次的な蛍光色に依存して、各蛍光点の色を特異的な標的にマッピングすることのいずれかにより、ＰＥＲ伸長中にフルオロフォア標識化ｄＮＴＰを使用して各伸長反応をバーコード化することである。
上記のアプローチを用いると、蛍光スペクトルのスペクトルオーバーラップにより標的検出を多重化する能力が制限されるが、これを克服するために使用することができる戦略もいくつかある。一般に、これらの戦略は、それぞれ一度に単一の標的の蛍光を活性化する手段を必要とし、この手段は、以前に画像化された標的を無効化又は破壊する能力も必要とする。これを達成するためのいくつかの手段は、図７に描かれる。１つの選択肢は、サンプルに向けられた強いレーザーを用いて、画像化された時点で各標的の蛍光シグナルをブリーチングすることである（図７Ａ）。蛍光オリゴヌクレオチドがＲＮＡであれば、これらは、ＲＮａｓｅにより消化され得る（図７Ｂ）。高塩条件下で安定して結合されるが、低塩条件下で不安定であるように蛍光オリゴヌクレオチドを設計することにより、個々の蛍光シグナルを簡単なバッファー交換により標的鎖から洗浄することができる（図７Ｃ）。最後に、蛍光オリゴヌクレオチドは、ＰＥＲ合成スキャフォールドに一時的に結合するように設計され得る。この戦略を使用して、回折限界又は超解像度の画像化のいずれかのために蛍光シグナルを局在化させることができる。
従って、いくつかの実施形態では、本方法は、連続的な画像化を含み、フルオロフォア標識化シグナル鎖の第１のセットが１つ又は複数の標的に適用され、画像化され、次に除去（例えば、ブリーチング、消化、洗浄、又は解離）され、且つフルオロフォア標識化シグナル鎖の第２のセットが異なる１つ又は複数の標的に適用され、画像化され、次に除去され、及び異なる標的に特異的なフルオロフォア標識化シグナル鎖の異なるセットを用いて同様に行われる。
これらの戦略の全てにより、個々の標的は、一度に一つずつ画像化され、次に非活性化されることが可能になるため、これらは、全て高度に多重化された画像化に適合する。理論的には、全ての蛍光が同じチャネル内にあれば、１つのみのレーザーを用いて任意の数の標的が画像化され得る。これは、異なるフルオロフォアのスペクトルオーバーラップの課題を克服するだけでなく、１つのレーザーのみを必要とするため、より安価な画像化セットアップも意味し得る。
そのネイティブな構造におけるＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質の画像化は、生命の基礎を成すこれらの生体分子の構造及び機能の解明を促進することができる。上記では、本発明者らは、インサイチュ増幅画像化のために長いポリマーを合成するための新しい方法を紹介し、単一のサンプル中の多数の標的を画像化するためにそれを使用可能な手段のいくつかを明らかにした。
本開示は、以下の番号付けされた段落をさらに包含する。
１．（ａ）複数の核酸標的を含有するサンプルと、複数のプローブ鎖であって、各プローブ鎖は、（ｉ）核酸標的の１つに対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含む、複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合された分子標的を含む第１の反応混合物を生成すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された第１の反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、プローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分子標的に結合された核酸コンカテマーを含む第２の反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された第２の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｄ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された第１の反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、プローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分子標的に結合された核酸コンカテマーを含む第２の反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された第２の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｄ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
１Ａ．（ａ）複数のプローブ鎖と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子とであって、各プローブ鎖は、（ｉ）複数の核酸標的の核酸標的に対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含み、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、プローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数のプローブ鎖と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合された核酸コンカテマーを含む第１の反応混合物を生成すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された第１の反応混合物と、複数の核酸標的を含有するサンプルとを組み合わせ、且つ分子標的に結合された核酸コンカテマーを含む第２の反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された第２の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｄ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された第１の反応混合物と、複数の核酸標的を含有するサンプルとを組み合わせ、且つ分子標的に結合された核酸コンカテマーを含む第２の反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された第２の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｄ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
２．段落１又は１Ａの方法であって、触媒分子は、ＤＮＡから構成される、方法。
３．段落１、１Ａ、又は２のいずれか１つの方法であって、触媒分子は、ＲＮＡから構成される、方法。
４．段落１～３のいずれか１つの方法であって、各触媒分子の第１のドメインは、同じ触媒分子の第２のドメインに結合される、方法。
５．段落１～４のいずれか１つの方法であって、各触媒分子の第１のドメインは、同じ触媒分子の第２のドメインに対して完全に相補的な配列を含む、方法。
６．段落１～５のいずれか１つの方法であって、各触媒分子の第２のドメインは、同じ触媒分子の第３のドメインと同一の配列を含む、方法。
７．段落１～６のいずれか１つの方法であって、各触媒分子は、同じ触媒分子の第１のドメインと第２のドメインとの間に位置する、重合を終結させるストッパー分子又は修飾をさらに含む、方法。
８．段落７の方法であって、重合を終結させる分子又は修飾は、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、１８原子ヘキサエチレングリコール、アデニル化、アジド、ジゴキシゲニン、コレステリル－ＴＥＧ、３－シアノビニルカルバゾール（ＣＮＶＫ）、ｉｓｏ－ｄＧ、及びｉｓｏ－ｄＣから選択される、方法。
９．段落７の方法であって、ストッパー分子は、グアニンであり、且つ触媒分子は、アデニン、チミン、及びシトシンから構成されるか、又はストッパー分子は、シトシンであり、且つ触媒分子は、アデニン、チミン、及びグアニンから構成される、方法。
１０．段落１～９のいずれか１つの方法であって、各触媒分子は、第１のドメインと第２のドメインとの間に位置するループドメインをさらに含む触媒ヘアピン分子である、方法。
１１．段落１０の方法であって、各触媒ヘアピン分子は、２５～３００ヌクレオチド長を有するＤＮＡの一本鎖から構成される、方法。
１２．段落１～１１のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｂ）の反応混合物は、１ｎＭ～１μＭの濃度の触媒分子を含む、方法。
１３．段落１～１２のいずれか１つの方法であって、プローブ鎖は、ＤＮＡから構成される、方法。
１４．段落１～１３のいずれか１つの方法であって、プローブ鎖は、ＲＮＡから構成される、方法。
１５．段落１～１４のいずれか１つの方法であって、各プローブ鎖は、１０～５０ヌクレオチド長を有する、方法。
１６．段落１～１５のいずれか１つの方法であって、各プローブ鎖の標的ドメインは、５～２５ヌクレオチド長を有する、方法。
１７．段落１～１６のいずれか１つの方法であって、各プローブ鎖のプライマードメインは、５～２５ヌクレオチド長を有する、方法。
１８．段落１～１７のいずれか１つの方法であって、組成物は、１ｎＭ～１μＭの濃度のプローブ鎖を含む、方法。
１９．段落１～１８のいずれか１つの方法であって、核酸標的は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む、方法。
２０．段落１９の方法であって、核酸標的は、染色体ＤＮＡである、方法。
２１．段落１９の方法であって、核酸標的は、ｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、方法。
２２．段落１～２２のいずれか１つの方法であって、シグナル鎖の検出可能な分子は、フルオロフォアである、方法。
２３．段落１～２３のいずれか１つの方法であって、シグナル鎖のそれぞれは、１０～３０ヌクレオチド長を有する、方法。
２４．段落１～２２のいずれか１つの方法であって、（ｃ）の反応混合物は、１ｎＭ～１μＭの濃度のシグナル鎖を含む、方法。
２５．段落１～２４のいずれか１つの方法であって、鎖置換ポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＢｓｕ ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントから選択される、方法。
２６．段落１～２５のいずれか１つの方法であって、ステップ（ａ）の反応混合物は、水性バッファー、任意選択的にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む、方法。
２７．段落１～２６のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｂ）及び／又はステップ（ａ）の反応混合物は、１～５００μＭの濃度のｄＮＴＰを含む、方法。
２８．段落１～２２のいずれか１つの方法であって、ステップ（ｂ）及び／又はステップ（ｃ）の反応混合物は、５～５０ｍＭの濃度のＭｇＳＯ４を含む、方法。
２９．段落１～２８のいずれか１つの方法であって、
ステップ（ａ）の複数のプローブ鎖は、２～１０，０００のプローブ鎖を含み、
ステップ（ｂ）の複数の触媒分子は、２～１０，０００の触媒分子を含み、及び
ステップ（ｃ）の複数のシグナル鎖は、２～１０，０００のシグナル鎖を含む、方法。
ステップ（ａ）の複数のプローブ鎖は、２～１０，０００のプローブ鎖を含み、
ステップ（ｂ）の複数の触媒分子は、２～１０，０００の触媒分子を含み、及び
ステップ（ｃ）の複数のシグナル鎖は、２～１０，０００のシグナル鎖を含む、方法。
３０．段落１～２９のいずれか１つの方法であって、サンプルは、細胞サンプルである、方法。
３１．段落１～２９のいずれか１つの方法であって、サンプルは、組織サンプルである、方法。
３２．段落３１の方法であって、組織サンプルは、脳組織サンプルである、方法。
３３．段落３１のサンプルであって、組織サンプルは、腫瘍組織サンプルである、サンプル。
３４．（ａ）複数のタンパク質又はペプチド標的を含有するサンプルと、複数の一次結合パートナーであって、複数の一次結合パートナーのそれぞれは、タンパク質又はペプチド標的に特異的に結合し、且つプローブ鎖に連結される、複数の一次結合パートナーとを組み合わせ、且つ一次結合パートナーに結合されたタンパク質又はペプチドを含む第１の反応混合物を生成すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された第１の反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、一次結合パートナーの１つのプローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ一次結合パートナーに結合された核酸コンカテマーを含む第２の反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された第２の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ一次結合パートナーの１つの架橋鎖に対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｄ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された第１の反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、一次結合パートナーの１つのプローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ一次結合パートナーに結合された核酸コンカテマーを含む第２の反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された第２の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ一次結合パートナーの１つの架橋鎖に対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｄ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
３５．（ａ）複数のタンパク質又はペプチド標的を含有するサンプルと、複数の一次結合パートナーであって、複数の一次結合パートナーのそれぞれは、タンパク質又はペプチド標的に特異的に結合し、且つ架橋鎖に連結される、複数の一次結合パートナーとを組み合わせ、且つ一次結合パートナーに結合されたタンパク質又はペプチドを含む第１の反応混合物を生成すること、
（ｂ）第１の反応混合物と、複数のプローブ鎖であって、各プローブ鎖は、（ｉ）一次結合パートナーの１つの架橋鎖に対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含む、複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合された一次結合パートナーを含む第２の反応混合物を生成すること、
（ｃ）第２の反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、プローブ鎖の１つに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ一次結合パートナーに結合された核酸コンカテマーを含む第３の反応混合物を生成すること、
（ｄ）ステップ（ｂ）で生成された第３の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ一次結合パートナーの１つの架橋鎖に対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｅ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
（ｂ）第１の反応混合物と、複数のプローブ鎖であって、各プローブ鎖は、（ｉ）一次結合パートナーの１つの架橋鎖に対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含む、複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合された一次結合パートナーを含む第２の反応混合物を生成すること、
（ｃ）第２の反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、プローブ鎖の１つに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ一次結合パートナーに結合された核酸コンカテマーを含む第３の反応混合物を生成すること、
（ｄ）ステップ（ｂ）で生成された第３の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ一次結合パートナーの１つの架橋鎖に対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｅ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
３５Ａ．（ａ）複数のタンパク質又はペプチド標的を含有するサンプルと、複数の一次結合パートナーであって、複数の一次結合パートナーのそれぞれは、タンパク質又はペプチド標的に特異的に結合し、且つ架橋鎖に連結される、複数の一次結合パートナーとを組み合わせ、且つ一次結合パートナーに結合されたタンパク質又はペプチドを含む第１の反応混合物を生成すること、
（ｂ）第１の反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、複数のプローブ鎖、及び複数の触媒分子であって、各プローブ鎖は、（ｉ）一次結合パートナーの１つの架橋鎖に対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含み、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、プローブ鎖の１つに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、複数のプローブ鎖、及び複数の触媒分子を第２の反応混合物中で組み合わせることによって生成されたプローブ鎖に結合されたコンカテマーとを組み合わせ、且つ一次結合パートナーに結合された核酸コンカテマーを含む第３の反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された第３の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ一次結合パートナーの１つの架橋鎖に対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｄ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
（ｂ）第１の反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、複数のプローブ鎖、及び複数の触媒分子であって、各プローブ鎖は、（ｉ）一次結合パートナーの１つの架橋鎖に対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含み、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、プローブ鎖の１つに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、複数のプローブ鎖、及び複数の触媒分子を第２の反応混合物中で組み合わせることによって生成されたプローブ鎖に結合されたコンカテマーとを組み合わせ、且つ一次結合パートナーに結合された核酸コンカテマーを含む第３の反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された第３の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ一次結合パートナーの１つの架橋鎖に対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｄ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
３５Ｂ．（ａ）複数の一次結合パートナーと、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子とであって、各結合パートナーは、タンパク質又はペプチド標的に特異的に結合し、且つプローブ鎖に連結され、各プローブ鎖は、（ｉ）一次結合パートナーの１つの架橋鎖に対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含み、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、プローブ鎖の１つに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の一次結合パートナーと、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ核酸コンカテマーに結合された一次結合パートナー（ＢＰ－コンカテマー複合体）を含む第１の反応混合物を生成すること、
（ｂ）第１の反応混合物のＢＰ－コンカテマー複合体と、複数のタンパク質又はペプチド標的を含有するサンプルとを組み合わせ、且つＢＰ－コンカテマー複合体に結合されたタンパク質又はペプチドを含む第２の反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された第２の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ一次結合パートナーの１つのプローブ鎖に対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｄ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
（ｂ）第１の反応混合物のＢＰ－コンカテマー複合体と、複数のタンパク質又はペプチド標的を含有するサンプルとを組み合わせ、且つＢＰ－コンカテマー複合体に結合されたタンパク質又はペプチドを含む第２の反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された第２の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ一次結合パートナーの１つのプローブ鎖に対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｄ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
３６．（ａ）複数のタンパク質又はペプチド標的を含有するサンプルと、複数の一次結合パートナー（例えば、一次抗体）であって、複数の一次結合パートナーのそれぞれは、タンパク質又はペプチド標的に特異的に結合する、複数の一次結合パートナーとを組み合わせ、且つ一次結合パートナー（例えば、一次抗体）に結合されたタンパク質又はペプチドを含む反応混合物を生成すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された反応混合物と、複数の二次結合パートナー（例えば、二次抗体）であって、複数の二次結合パートナーのそれぞれは、一次結合パートナー（例えば、一次抗体）に特異的に結合し、且つ架橋鎖に連結される、複数の二次結合パートナーとを組み合わせ、且つ二次結合パートナー（例えば、二次抗体）に結合された一次抗体を含む反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、二次結合パートナー（例えば、二次抗体）の１つの架橋鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ二次結合パートナー（例えば、二次抗体）に結合された核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成すること、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生成された反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ二次結合パートナー（例えば、二次抗体）の１つの架橋鎖に対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｅ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された反応混合物と、複数の二次結合パートナー（例えば、二次抗体）であって、複数の二次結合パートナーのそれぞれは、一次結合パートナー（例えば、一次抗体）に特異的に結合し、且つ架橋鎖に連結される、複数の二次結合パートナーとを組み合わせ、且つ二次結合パートナー（例えば、二次抗体）に結合された一次抗体を含む反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、二次結合パートナー（例えば、二次抗体）の１つの架橋鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ二次結合パートナー（例えば、二次抗体）に結合された核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成すること、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生成された反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ二次結合パートナー（例えば、二次抗体）の１つの架橋鎖に対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｅ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
３７．（ａ）複数のタンパク質又はペプチド標的を含有するサンプルと、複数の一次結合パートナー（例えば、一次抗体）であって、複数の一次結合パートナーのそれぞれは、タンパク質又はペプチド標的に特異的に結合する、複数の一次結合パートナーとを組み合わせ、且つ一次結合パートナー（例えば、一次抗体）に結合されたタンパク質又はペプチドを含む反応混合物を生成すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された反応混合物と、複数の二次抗体であって、複数の二次抗体のそれぞれは、次結合パートナー（例えば、一次抗体）に特異的に結合し、且つ架橋鎖に連結される、複数の二次抗体とを組み合わせ、且つ二次結合パートナー（例えば、二次抗体）に結合された一次抗体を含む反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された反応混合物と、複数のプローブ鎖であって、各プローブ鎖は、（ｉ）二次結合パートナー（例えば、二次抗体）の１つの架橋鎖に対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含む、複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つ二次結合パートナー（例えば、二次抗体）に結合されたプローブ鎖を含む反応混合物を生成すること、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、プローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ二次結合パートナー（例えば、二次抗体）に結合された核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成すること、
（ｅ）ステップ（ｄ）で生成された反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｆ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された反応混合物と、複数の二次抗体であって、複数の二次抗体のそれぞれは、次結合パートナー（例えば、一次抗体）に特異的に結合し、且つ架橋鎖に連結される、複数の二次抗体とを組み合わせ、且つ二次結合パートナー（例えば、二次抗体）に結合された一次抗体を含む反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された反応混合物と、複数のプローブ鎖であって、各プローブ鎖は、（ｉ）二次結合パートナー（例えば、二次抗体）の１つの架橋鎖に対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含む、複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つ二次結合パートナー（例えば、二次抗体）に結合されたプローブ鎖を含む反応混合物を生成すること、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、プローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ二次結合パートナー（例えば、二次抗体）に結合された核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成すること、
（ｅ）ステップ（ｄ）で生成された反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｆ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
３７Ａ．（ａ）複数の核酸標的を含有するサンプルと、第１の複数のプローブ鎖であって、第１の複数のものの各プローブ鎖は、（ｉ）核酸標的の１つに対して相補的な不対５’標的ドメインａ、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインｂを含む、第１の複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合された分子標的を含む反応混合物を生成することと、
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第１の複数の触媒分子であって、第１の複数のものの各触媒分子は、５’－３’方向にドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、ドメインｂ１、ドメインｂ１ ＊、ドメインａ２ ＊、ドメインｘ＊、ドメインａ１ ＊、ドメインｂ２ ＊、及びドメインａ３ ＊を含み、ドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、及びドメインｂ１は、それぞれドメインｂ１ ＊、ドメインａ２ ＊、ドメインｘ＊、及びドメインａ１ ＊に結合し、且つドメインｂ２ ＊及びドメインａ３ ＊は、第１の複数のもののプローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインを形成する、第１の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分子標的に結合された第１の複数の核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された反応混合物と、第２の複数のプローブ鎖であって、第２の複数のものの各プローブ鎖は、（ｉ）触媒分子のドメインｘに対して相補的な不対５’ドメインｘ＊、及び（ｉｉ）触媒分子のドメインｂ１及びｂ２ ＊に対して相補的な不対３’プライマードメインｂを含む、第２の複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合されたコンカテマーを含む反応混合物を生成することと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第２の複数の触媒分子であって、第２の複数のものの各触媒分子は、５’－３’方向にドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、ドメインｂ１、ドメインｂ１ ＊、ドメインａ２ ＊、ドメインｘ＊、ドメインａ１ ＊、ドメインｂ２ ＊、及びドメインａ３ ＊を含み、ドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、及びドメインｂ１は、それぞれドメインｂ１ ＊、ドメインａ２ ＊、ドメインｘ＊、及びドメインａ１ ＊に結合し、且つドメインｂ２ ＊及びドメインａ３ ＊は、第１の複数のもののプローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインを形成する、第２の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分岐コンカテマーを生成することと
を含む、多重化標的検出方法。
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第１の複数の触媒分子であって、第１の複数のものの各触媒分子は、５’－３’方向にドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、ドメインｂ１、ドメインｂ１ ＊、ドメインａ２ ＊、ドメインｘ＊、ドメインａ１ ＊、ドメインｂ２ ＊、及びドメインａ３ ＊を含み、ドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、及びドメインｂ１は、それぞれドメインｂ１ ＊、ドメインａ２ ＊、ドメインｘ＊、及びドメインａ１ ＊に結合し、且つドメインｂ２ ＊及びドメインａ３ ＊は、第１の複数のもののプローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインを形成する、第１の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分子標的に結合された第１の複数の核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された反応混合物と、第２の複数のプローブ鎖であって、第２の複数のものの各プローブ鎖は、（ｉ）触媒分子のドメインｘに対して相補的な不対５’ドメインｘ＊、及び（ｉｉ）触媒分子のドメインｂ１及びｂ２ ＊に対して相補的な不対３’プライマードメインｂを含む、第２の複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合されたコンカテマーを含む反応混合物を生成することと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第２の複数の触媒分子であって、第２の複数のものの各触媒分子は、５’－３’方向にドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、ドメインｂ１、ドメインｂ１ ＊、ドメインａ２ ＊、ドメインｘ＊、ドメインａ１ ＊、ドメインｂ２ ＊、及びドメインａ３ ＊を含み、ドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、及びドメインｂ１は、それぞれドメインｂ１ ＊、ドメインａ２ ＊、ドメインｘ＊、及びドメインａ１ ＊に結合し、且つドメインｂ２ ＊及びドメインａ３ ＊は、第１の複数のもののプローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインを形成する、第２の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分岐コンカテマーを生成することと
を含む、多重化標的検出方法。
３７Ｂ．請求項３２に記載の方法であって、（ｅ）ステップ（ｄ）で生成された反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ第１及び／又は第２の複数のプローブ鎖のプローブ鎖の不対３’プライマードメインｂに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成することをさらに含み、及び任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、方法。
３８．段落３４～３７Ｂのいずれか１つの方法であって、触媒分子は、ＤＮＡから構成される、方法。
３９．段落３４～３７Ｂのいずれか１つの方法であって、触媒分子は、ＲＮＡから構成される、方法。
４０．段落３４～３９のいずれか１つの方法であって、各触媒分子の第１のドメインは、同じ触媒分子の第２のドメインに結合される、方法。
４１．段落３４～４０のいずれか１つの方法であって、各触媒分子の第１のドメインは、同じ触媒分子の第２のドメインに対して完全に相補的な配列を含む、方法。
４２．段落３４～４１のいずれか１つの方法であって、各触媒分子の第２のドメインは、同じ触媒分子の第３のドメインと同一の配列を含む、方法。
４３．段落３４～４２のいずれか１つの方法であって、各触媒分子は、同じ触媒分子の第１のドメインと第２のドメインとの間に位置する、重合を終結させるストッパー分子又は修飾をさらに含む、方法。
４４．段落４３の方法であって、重合を終結させる分子又は修飾は、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、１８原子ヘキサエチレングリコール、アデニル化、アジド、ジゴキシゲニン、コレステリル－ＴＥＧ、３－シアノビニルカルバゾール（ＣＮＶＫ）、ｉｓｏ－ｄＧ、及びｉｓｏ－ｄＣから選択される、方法。
４５．段落４３の方法であって、ストッパー分子は、グアニンであり、且つ触媒分子は、アデニン、チミン、及びシトシンから構成されるか、又はストッパー分子は、シトシンであり、且つ触媒分子は、アデニン、チミン、及びグアニンから構成される、方法。
４６．段落３４～４５のいずれか１つの方法であって、各触媒分子は、第１のドメインと第２のドメインとの間に位置するループドメインをさらに含む触媒ヘアピン分子である、方法。
４７．段落４６の方法であって、各触媒ヘアピン分子は、２５～３００ヌクレオチド長を有するＤＮＡの一本鎖から構成される、方法。
４８．段落３４～４７のいずれか１つの方法であって、触媒分子を含む反応混合物は、１ｎＭ～１μＭの濃度の触媒分子を含む、方法。
４９．段落３４～４８のいずれか１つの方法であって、プローブ鎖は、ＤＮＡから構成される、方法。
５０．段落３４～４９のいずれか１つの方法であって、プローブ鎖は、ＲＮＡから構成される、方法。
５１．段落３４～５０のいずれか１つの方法であって、各プローブ鎖は、１０～５０ヌクレオチド長を有する、方法。
５２．段落３４～５１のいずれか１つの方法であって、各プローブ鎖の標的ドメインは、５～２５ヌクレオチド長を有する、方法。
５３．段落３４～５２のいずれか１つの方法であって、各プローブ鎖のプライマードメインは、５～２５ヌクレオチド長を有する、方法。
５４．段落３４～５３のいずれか１つの方法であって、組成物は、１ｎＭ～１μＭの濃度のプローブ鎖を含む、方法。
５５．段落３４～５４のいずれか１つの方法であって、タンパク質又はペプチド標的は、抗体、サイトカイン、及び成長因子から選択される、方法。
５６．段落３４～５５のいずれか１つの方法であって、シグナル鎖の検出可能な分子は、フルオロフォアである、方法。
５７．段落３４～５６のいずれか１つの方法であって、シグナル鎖のそれぞれは、１０～３０ヌクレオチド長を有する、方法。
５８．段落３４～５７のいずれか１つの方法であって、シグナル鎖を含む反応混合物は、１ｎＭ～１μＭの濃度のシグナル鎖を含む、方法。
５９．段落３４～５８のいずれか１つの方法であって、鎖置換ポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＢｓｕ ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントから選択される、方法。
６０．段落３４～５９のいずれか１つの方法であって、反応混合物は、水性バッファー、任意選択的にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む、方法。
６１．段落３４～６０のいずれか１つの方法であって、ｄＮＴＰを含む反応混合物は、１～５００μＭの濃度のｄＮＴＰを含む、方法。
６２．段落３４～６１のいずれか１つの方法であって、反応混合物は、５～５０ｍＭの濃度のＭｇＳＯ４を含む、方法。
６３．段落３４～６２のいずれか１つの方法であって、
複数の一次及び／又は二次結合パートナーは、２～１０，０００の一次及び／又は二次結合パートナーを含み、
複数のプローブ鎖は、２～１０，０００のプローブ鎖を含み、
複数の触媒分子は、２～１０，０００の触媒分子を含み、及び／又は
複数のシグナル鎖は、２～１０，０００のシグナル鎖を含む、方法。
複数の一次及び／又は二次結合パートナーは、２～１０，０００の一次及び／又は二次結合パートナーを含み、
複数のプローブ鎖は、２～１０，０００のプローブ鎖を含み、
複数の触媒分子は、２～１０，０００の触媒分子を含み、及び／又は
複数のシグナル鎖は、２～１０，０００のシグナル鎖を含む、方法。
６４．段落３４～６３のいずれか１つの方法であって、サンプルは、細胞サンプル、体液サンプル、又は糞便サンプルである、方法。
６５．段落３４～６４のいずれか１つの方法であって、サンプルは、組織サンプルである、方法。
６６．段落６４の方法であって、組織サンプルは、脳組織サンプルである、方法。
６７．段落６４のサンプルであって、組織サンプルは、腫瘍サンプルである、サンプル。
６８．段落６４のサンプルであって、体液サンプルは、血清、血液、又は唾液サンプルである、サンプル。
６８．（ａ）複数の核酸標的を含有するサンプルと、第１の複数のプローブ鎖であって、第１の複数のものの各プローブ鎖は、（ｉ）核酸標的の１つに対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含む、第１の複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合された分子標的を含む反応混合物を生成すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第１の複数の触媒分子であって、第１の複数のものの各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、プローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、第１の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分子標的に結合された第１の複数の核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された反応混合物と、第２の複数のプローブ鎖であって、第２の複数のものの各プローブ鎖は、（ｉ）コンカテマーの配列に対して相補的な不対５’ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含む、第２の複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合されたコンカテマーを含む反応混合物を生成すること、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第２の複数の触媒分子であって、第２の複数のものの各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、第２の複数のプローブ鎖のプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、第２の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ第２の複数の核酸コンカテマーに結合された第１の複数の核酸コンカテマーの核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成すること、
（ｅ）ステップ（ｄ）で生成された反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ第２の複数のプローブ鎖のプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｆ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第１の複数の触媒分子であって、第１の複数のものの各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、プローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、第１の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分子標的に結合された第１の複数の核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された反応混合物と、第２の複数のプローブ鎖であって、第２の複数のものの各プローブ鎖は、（ｉ）コンカテマーの配列に対して相補的な不対５’ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含む、第２の複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合されたコンカテマーを含む反応混合物を生成すること、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第２の複数の触媒分子であって、第２の複数のものの各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合され、及び第３のドメインは、第２の複数のプローブ鎖のプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、第２の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ第２の複数の核酸コンカテマーに結合された第１の複数の核酸コンカテマーの核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成すること、
（ｅ）ステップ（ｄ）で生成された反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ第２の複数のプローブ鎖のプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｆ）任意選択的に、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
６９．（ａ）５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合し、及び第３のドメインは、不対３’トーホールドドメインである、触媒分子と、
（ｂ）（ｉ）分子標的に特異的に結合する不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）触媒分子の不対３’トーホールドドメインに結合する不対３’プライマードメインを含むプローブ鎖と、
（ｃ）検出可能な分子に連結され、且つプローブ鎖の不対３’プライマードメインに結合するドメインを含む、任意選択的なシグナル鎖と
を含む組成物。
（ｂ）（ｉ）分子標的に特異的に結合する不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）触媒分子の不対３’トーホールドドメインに結合する不対３’プライマードメインを含むプローブ鎖と、
（ｃ）検出可能な分子に連結され、且つプローブ鎖の不対３’プライマードメインに結合するドメインを含む、任意選択的なシグナル鎖と
を含む組成物。
７０．段落６９の組成物であって、触媒分子は、ＤＮＡから構成される、組成物。
７１．段落６９又は７０の組成物であって、触媒分子は、ＲＮＡから構成される、組成物。
７２．段落６９の組成物であって、触媒分子の第１のドメインは、触媒分子の第２のドメインに結合される、組成物。
７３．段落６９～７２のいずれか１つの組成物であって、触媒分子の第１のドメインは、触媒分子の第２のドメインに対して完全に相補的な配列を含む、組成物。
７４．段落６９～７３のいずれか１つの組成物であって、触媒分子の第２のドメインは、触媒分子の第３のドメインと同一の配列を含む、組成物。
７５．段落６９～７４のいずれか１つの組成物であって、触媒分子は、第１のドメインと第２のドメインとの間に位置する、重合を終結させるストッパー分子又は修飾をさらに含む、組成物。
７６．段落７５の組成物であって、重合を終結させる分子又は修飾は、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、１８原子ヘキサエチレングリコール、アデニル化、アジド、ジゴキシゲニン、コレステリル－ＴＥＧ、３－シアノビニルカルバゾール（ＣＮＶＫ）、ｉｓｏ－ｄＧ、及びｉｓｏ－ｄＣから選択される、組成物。
７７．段落７５の組成物であって、ストッパー分子は、グアニンであり、且つ触媒分子は、アデニン、チミン、及びシトシンから構成されるか、又はストッパー分子は、シトシンであり、且つ触媒分子は、アデニン、チミン、及びグアニンから構成される、組成物。
７８．段落６９～７７のいずれか１つの組成物であって、触媒分子は、第１のドメインと第２のドメインとの間に位置するループドメインをさらに含む触媒ヘアピン分子である、組成物。
７９．段落７８の組成物であって、触媒ヘアピン分子は、２５～３００ヌクレオチド長を有するＤＮＡの一本鎖から構成される、組成物。
８０．段落６９～７９のいずれか１つの組成物であって、１ｎＭ～１μＭの濃度の触媒分子を含む、組成物。
８１．段落６９～８０のいずれか１つの組成物であって、プローブ鎖は、ＤＮＡから構成される、組成物。
８２．段落６９～８１のいずれか１つの組成物であって、プローブ鎖は、ＲＮＡから構成される、組成物。
８３．段落６９～８２のいずれか１つの組成物であって、プローブ鎖は、１０～５０ヌクレオチド長を有する、組成物。
８４．段落６９～８３のいずれか１つの組成物であって、プローブ鎖の標的ドメインは、５～２５ヌクレオチド長を有する、組成物。
８５．段落６９～８４のいずれか１つの組成物であって、プローブ鎖のプライマードメインは、５～２５ヌクレオチド長を有する、組成物。
８６．段落６９～８５のいずれか１つの組成物であって、１ｎＭ～１μＭの濃度のプローブ鎖を含む、組成物。
８７．段落６９～８６のいずれか１つの組成物であって、分子標的は、核酸標的である、組成物。
８８．段落８７の組成物であって、プローブ鎖の標的ドメインは、核酸標的に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、組成物。
８９．段落８７又は８８の組成物であって、核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む、組成物。
９０．段落８９の組成物であって、核酸は、染色体ＤＮＡである、組成物。
９１．段落８９の組成物であって、核酸は、ｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、組成物。
９２．段落６９～８６のいずれか１つの組成物であって、分子標的は、架橋鎖にコンジュゲートされた一次結合パートナー（例えば、抗体）によって結合されるタンパク質又はペプチドである、組成物。
９３．段落６７の組成物であって、プローブ鎖の標的ドメインは、架橋鎖に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、組成物。
９４．段落９２又は９３の組成物であって、タンパク質は、抗体、サイトカイン、及び成長因子から選択される、組成物。
９５．段落６９～９４のいずれか１つの組成物であって、シグナル鎖の検出可能な分子は、フルオロフォアである、組成物。
９６．段落６９～９５のいずれか１つの組成物であって、シグナル鎖は、１０～３０ヌクレオチド長を有する、組成物。
９７．段落６９～９６のいずれか１つの組成物であって、１ｎＭ～１μＭの濃度のシグナル鎖を含む、組成物。
９８．段落６９～９７のいずれか１つの組成物であって、鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、組成物。
９９．段落９８の組成物であって、鎖置換ポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＢｓｕ ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントから選択される、組成物。
１００．段落６９～９９のいずれか１つの組成物であって、バッファー、ｄＮＴＰ、及び／又はＭｇＳＯ４をさらに含む、組成物。
１０１．段落１００の組成物であって、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む、組成物。
１０２．段落１００又は１０１の組成物であって、１～５００μＭの濃度のｄＮＴＰを含む、組成物。
１０３．段落１００～１０２のいずれか１つの組成物であって、５～５０ｍＭの濃度のＭｇＳＯ４を含む、組成物。
１０４．（ａ）複数の触媒分子であって、各触媒分子は、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに結合し、及び第３のドメインは、不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子と、
（ｂ）複数のプローブ鎖であって、各プローブ鎖は、（ｉ）分子標的に特異的に結合する不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）触媒分子の１つの不対３’トーホールドドメインに結合する不対３’プライマードメインを含む、複数のプローブ鎖と、
（ｃ）任意選択的な複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに結合するドメインを含む、任意選択的な複数のシグナル鎖と
を含む組成物。
（ｂ）複数のプローブ鎖であって、各プローブ鎖は、（ｉ）分子標的に特異的に結合する不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）触媒分子の１つの不対３’トーホールドドメインに結合する不対３’プライマードメインを含む、複数のプローブ鎖と、
（ｃ）任意選択的な複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つプローブ鎖の１つの不対３’プライマードメインに結合するドメインを含む、任意選択的な複数のシグナル鎖と
を含む組成物。
１０５．段落１０４の組成物であって、
複数の（ａ）は、２～１０，０００の触媒分子を含み、
複数の（ｂ）は、２～１０，０００のプローブ鎖を含み、及び
複数の（ｃ）は、２～１０，０００のシグナル鎖を含む、組成物。
複数の（ａ）は、２～１０，０００の触媒分子を含み、
複数の（ｂ）は、２～１０，０００のプローブ鎖を含み、及び
複数の（ｃ）は、２～１０，０００のシグナル鎖を含む、組成物。
１０６．タンデム反復配列のコンカテマーが結合される核酸標的を含むサンプルであって、検出可能な標識に連結されたシグナル鎖は、コンカテマーの各配列に結合される、サンプル。
１０７．一次結合パートナー（例えば、抗体）が結合されるタンパク質標的を含むサンプルであって、一次結合パートナー（例えば、抗体）は、タンデム反復配列のコンカテマーに連結され、及び検出可能な標識に連結されたシグナル鎖は、コンカテマーの各配列に結合される、サンプル。
１０８．一次結合パートナー（例えば、一次抗体）が結合されるタンパク質標的を含むサンプルであって、二次結合パートナー（例えば、二次抗体）は、一次結合パートナー（例えば、一次抗体）に結合され、二次結合パートナー（例えば、二次抗体）は、タンデム反復配列のコンカテマーに連結され、及び検出可能な標識に連結されたシグナル鎖は、コンカテマーの各配列に結合される、サンプル。
１０９．段落１０６～１０８のいずれか１つのサンプルであって、細胞サンプルである、サンプル。
１１０．段落１０６～１０８のいずれか１つのサンプルであって、組織サンプルである、サンプル。
１１１．段落１１０のサンプルであって、組織サンプルは、脳組織サンプルである、サンプル。
１１２．段落１１１のサンプルであって、組織サンプルは、腫瘍組織サンプルである、サンプル。
１１３．（ａ）複数の核酸標的を含有するサンプルと、第１の複数のプローブ鎖であって、第１の複数のものの各プローブ鎖は、（ｉ）核酸標的の１つに対して相補的な不対５’標的ドメインａ、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインｂを含む、第１の複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合された分子標的を含む反応混合物を生成することと、
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第１の複数の触媒分子であって、第１の複数のものの各触媒分子は、５’－３’方向にドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、ドメインｂ１、ドメインｂ１＊、ドメインａ２＊、ドメインｘ＊、ドメインａ１＊、ドメインｂ２＊、及びドメインａ３＊を含み、ドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、及びドメインｂ１は、それぞれドメインｂ１＊、ドメインａ２＊、ドメインｘ＊、及びドメインａ１＊に結合し、且つドメインｂ２＊及びドメインａ３＊は、第１の複数のもののプローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインを形成する、第１の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分子標的に結合された第１の複数の核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された反応混合物と、第２の複数のプローブ鎖であって、第２の複数のものの各プローブ鎖は、（ｉ）触媒分子のドメインｘに対して相補的な不対５’ドメインｘ＊、及び（ｉｉ）触媒分子のドメインｂ１及びｂ２＊に対して相補的な不対３’プライマードメインｂを含む、第２の複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合されたコンカテマーを含む反応混合物を生成することと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第２の複数の触媒分子であって、第２の複数のものの各触媒分子は、５’－３’方向にドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、ドメインｂ１、ドメインｂ１＊、ドメインａ２＊、ドメインｘ＊、ドメインａ１＊、ドメインｂ２＊、及びドメインａ３＊を含み、ドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、及びドメインｂ１は、それぞれドメインｂ１＊、ドメインａ２＊、ドメインｘ＊、及びドメインａ１＊に結合し、且つドメインｂ２＊及びドメインａ３＊は、第１の複数のもののプローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインを形成する、第２の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分岐コンカテマーを生成することと
を含む、多重化標的検出方法。
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第１の複数の触媒分子であって、第１の複数のものの各触媒分子は、５’－３’方向にドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、ドメインｂ１、ドメインｂ１＊、ドメインａ２＊、ドメインｘ＊、ドメインａ１＊、ドメインｂ２＊、及びドメインａ３＊を含み、ドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、及びドメインｂ１は、それぞれドメインｂ１＊、ドメインａ２＊、ドメインｘ＊、及びドメインａ１＊に結合し、且つドメインｂ２＊及びドメインａ３＊は、第１の複数のもののプローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインを形成する、第１の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分子標的に結合された第１の複数の核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された反応混合物と、第２の複数のプローブ鎖であって、第２の複数のものの各プローブ鎖は、（ｉ）触媒分子のドメインｘに対して相補的な不対５’ドメインｘ＊、及び（ｉｉ）触媒分子のドメインｂ１及びｂ２＊に対して相補的な不対３’プライマードメインｂを含む、第２の複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合されたコンカテマーを含む反応混合物を生成することと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生成された反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第２の複数の触媒分子であって、第２の複数のものの各触媒分子は、５’－３’方向にドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、ドメインｂ１、ドメインｂ１＊、ドメインａ２＊、ドメインｘ＊、ドメインａ１＊、ドメインｂ２＊、及びドメインａ３＊を含み、ドメインａ１、ドメインｘ、ドメインａ２、及びドメインｂ１は、それぞれドメインｂ１＊、ドメインａ２＊、ドメインｘ＊、及びドメインａ１＊に結合し、且つドメインｂ２＊及びドメインａ３＊は、第１の複数のもののプローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインを形成する、第２の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分岐コンカテマーを生成することと
を含む、多重化標的検出方法。
１１３．段落１１２の方法であって、（ｅ）ステップ（ｄ）で生成された反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖は、異なる検出可能な分子に連結され、且つ第１及び／又は第２の複数のプローブ鎖のプローブ鎖の不対３’プライマードメインｂに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成することをさらに含む、方法。
１１４．段落１１３の方法であって、標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、方法。
実施例
実施例１．交換イメージング反応のワークフロー例
図７Ｃに記載される交換イメージング戦略のワークフロー例は、図８に示される。４つの標的は、異なるプライマー伸長オーバーハング（ドメイン１～４）を有する４つのプローブに結合される。１つの標的に対して相補的な蛍光鎖をハイブリダイズさせ、同時に画像化した後、低塩条件によるバッファー交換を使用して、蛍光鎖をその標的から移動させる。
実施例１．交換イメージング反応のワークフロー例
図７Ｃに記載される交換イメージング戦略のワークフロー例は、図８に示される。４つの標的は、異なるプライマー伸長オーバーハング（ドメイン１～４）を有する４つのプローブに結合される。１つの標的に対して相補的な蛍光鎖をハイブリダイズさせ、同時に画像化した後、低塩条件によるバッファー交換を使用して、蛍光鎖をその標的から移動させる。
場合により、反復バーコード配列を成長させるため、又は複数のヘアピン合成ステップにわたって分割される反復ドメインを成長させるために、１つの標的につき複数のＰＥＲヘアピンが使用される。いくつかの実施形態では、蛍光オリゴヌクレオチドは、ＰＥＲ合成スキャフォールド上の反復ドメインよりも長さが短いことができる。いくつかの実施形態では、これらの蛍光オリゴヌクレオチドは、反復ドメイン配列の１つ又は複数に対して相補的であり得る。
実施例２．単一プライマー交換反応
このプライマー交換反応では、伸長のための効果的なプライミング、及び３７℃の最後のステップでの効率的な自然解離を可能にするために、８～９ヌクレオチド長を有するプライマー結合ドメインを使用した。可変濃度のヘアピン（１ｎＭ～１μＭ）を１００ｎＭのフルオロフォア標識プライマーと一緒に、Bst Large Fragmentポリメラーゼ、並びにヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰの混合物と共にインキュベートすることにより、基本の単一プライマー交換反応を検証し、特徴付けした。伸長したプライマー（コンカテマー）は、ゲル電気泳動により可視化した（図９Ｂ）。アウトプットの長さは、シグナル増幅レベルの評価のための直接的な尺度となる。
このプライマー交換反応では、伸長のための効果的なプライミング、及び３７℃の最後のステップでの効率的な自然解離を可能にするために、８～９ヌクレオチド長を有するプライマー結合ドメインを使用した。可変濃度のヘアピン（１ｎＭ～１μＭ）を１００ｎＭのフルオロフォア標識プライマーと一緒に、Bst Large Fragmentポリメラーゼ、並びにヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰの混合物と共にインキュベートすることにより、基本の単一プライマー交換反応を検証し、特徴付けした。伸長したプライマー（コンカテマー）は、ゲル電気泳動により可視化した（図９Ｂ）。アウトプットの長さは、シグナル増幅レベルの評価のための直接的な尺度となる。
実施例３．多重化プライマー交換反応
複数の標的における同時シグナル増幅に対するプライマー交換反応の適合性を確立するために、スペクトルの多重化を使用する。スペクトル的に別個のフルオロフォアでそれぞれ標識された４つの直交性のプライマーを使用し、全ての伸長を並行して実行する。プライマーは、３７℃の動作温度において、それら自体又は非同族ヘアピン上のプライマー結合部位に結合する確率が低いように設計される。全てのプライマーは、同族ヘアピン結合に対して同じ配列長さ（例えば、９－ｎｔ）を特徴とし、同様の結合エネルギーを有する。全てのプライマーは、３文字Ａ、Ｔ、及びＣから構成される配列を含む。これらの反応パラメータは、１００倍を超える増幅及び４ｘのスペクトル増幅を可能にする。
複数の標的における同時シグナル増幅に対するプライマー交換反応の適合性を確立するために、スペクトルの多重化を使用する。スペクトル的に別個のフルオロフォアでそれぞれ標識された４つの直交性のプライマーを使用し、全ての伸長を並行して実行する。プライマーは、３７℃の動作温度において、それら自体又は非同族ヘアピン上のプライマー結合部位に結合する確率が低いように設計される。全てのプライマーは、同族ヘアピン結合に対して同じ配列長さ（例えば、９－ｎｔ）を特徴とし、同様の結合エネルギーを有する。全てのプライマーは、３文字Ａ、Ｔ、及びＣから構成される配列を含む。これらの反応パラメータは、１００倍を超える増幅及び４ｘのスペクトル増幅を可能にする。
実施例４．インビトロＰＥＲベースのシグナル増幅
インビトロ伸長オリゴヌクレオチドを用いて増幅を調べるために実験を行った。上記のように、オリゴヌクレオチドをインサイチュで伸長させる代わりに、オリゴヌクレオチドを予めインビトロで伸長させた。全体的なスキームは、図１４Ａ～１４Ｂに示される。
インビトロ伸長オリゴヌクレオチドを用いて増幅を調べるために実験を行った。上記のように、オリゴヌクレオチドをインサイチュで伸長させる代わりに、オリゴヌクレオチドを予めインビトロで伸長させた。全体的なスキームは、図１４Ａ～１４Ｂに示される。
ＰＥＲは、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブに付加されたプライマーを用いてインビトロで実施した。次に、ＤＮＡ－ＦＩＳＨによりゲノム標的部位を標識するために、ＰＥＲコンカテマーを使用した。可視化は、蛍光シグナル鎖のコンカテマーへのハイブリダイゼーションにより実施した。これらの実験において、ゲノム反復領域（マウス細胞のメジャー及びマイナーサテライト反復配列又はヒト細胞のテロメアなど）は、ロバストな試験標的として良好に可視化された（図１１Ａ）。シグナル増幅の非存在下で検出することが難しい非反復領域も標的とした。ＦＩＳＨプローブ上に付加されたプライマー（標的ゲノム領域を網羅する４８のオリゴの混合物）をインビトロＰＥＲで伸長させ、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）のＸ染色体上のわずか２．７ｋｂ長の単一コピー領域であるゲノム配列ＸＩＳＴ ＤＮＡのインサイチュ標識化のために使用した（図１１Ｂ）。安定的に結合する長さ２０－ｎｔのイメージャ（フルオロフォアに連結された一本鎖核酸）を用いて、両方のアッセイについてゲルに従って７５倍の予想シグナル増幅が得られる（図１１Ｃ）。これらの予備実験で得られた高ＳＮＲを動機として、このアプローチの適合性をＩＦでも検証した。このために、プライマーに２８－ｎｔ架橋配列を付加し、ＰＥＲをインビトロで実施した。次に、架橋に対して相補的な配列にコンジュゲートされた標識二次ＡｂであるＩＦサンプルと共に反応混合物をインキュベートした（図１２Ａ）。哺乳類細胞内の微小管を標的とするデータは、同じフルオロフォアのみによる二次抗体染色と比べてＰＥＲがより高いシグナルを提供することを実証する（図１２Ｂ）。
実施例５．インサイチュＰＥＲベースのシグナル増幅
インビトロ伸長鎖を用いる実験は、細胞サンプルのＰＥＲによるシグナル増幅を実証する。ここで、ＰＥＲシグナル増幅は、インサイチュでのＩＦの感受性を高めるために使用される。ＰＥＲプライマーは、ＤＮＡ－抗体コンジュゲーションを介して抗体（Ａｂ）に提示される。プローブによる標識化後、サンプルを３７℃でＰＥＲ構成要素と共にインキュベートし、相補的蛍光シグナル鎖のハイブリダイゼーションにより伸長コンカテマーを可視化する（図１０Ｂ）。標的タンパク質は、核小体、ミトコンドリア又はゴルジ体などの明白な境界で細胞小器官をマークするものを含む。いくつかの実験では、ＳＮＲ及び増幅倍率の正確な定量化のために、伸長の前後に同じ標的を同じシグナル鎖で画像化するために抗体上に付加的な配列ドメインが含まれる。
インビトロ伸長鎖を用いる実験は、細胞サンプルのＰＥＲによるシグナル増幅を実証する。ここで、ＰＥＲシグナル増幅は、インサイチュでのＩＦの感受性を高めるために使用される。ＰＥＲプライマーは、ＤＮＡ－抗体コンジュゲーションを介して抗体（Ａｂ）に提示される。プローブによる標識化後、サンプルを３７℃でＰＥＲ構成要素と共にインキュベートし、相補的蛍光シグナル鎖のハイブリダイゼーションにより伸長コンカテマーを可視化する（図１０Ｂ）。標的タンパク質は、核小体、ミトコンドリア又はゴルジ体などの明白な境界で細胞小器官をマークするものを含む。いくつかの実験では、ＳＮＲ及び増幅倍率の正確な定量化のために、伸長の前後に同じ標的を同じシグナル鎖で画像化するために抗体上に付加的な配列ドメインが含まれる。
インサイチュＰＥＲを実証するために、プライマー配列を保有するＦＩＳＨプローブ又は二次Ａｂをそれぞれ使用することにより、ＦＩＳＨ及びＩＦサンプルにおける実験を実施した。これらの実験では、増幅レベル及びＳＮＲのヘアピン濃度への依存、並びに非特異的なバックグラウンドがないことを検証した。
５’末端のフルオロフォア及び３’末端のＰＥＲプライマー配列を保有するＦＩＳＨプローブを用いて、ＭＥＦ細胞内のメジャーサテライト反復領域を標的とした（図１６）。ヘアピン濃度を上昇させることにより、蛍光レベルの増大を達成した。ヘアピンを含まないコントロール条件では、ＰＥＲが起こらず、プローブ自体からの蛍光のみが検出された。蛍光レベルの増大は、ヘアピン濃度を５００ｎＭから１μＭまで上昇させることにより達成した（データは示されない）。
βチューブリンを標的とする一次抗体でＭＥＦ細胞を標識化した後、Alexa 488フルオロフォア、又はＰＥＲプライマーのいずれかにコンジュゲートされた二次抗体と共にインキュベーションを行った。Alexa 647コンジュゲートシグナル鎖のハイブリダイゼーションによりＰＥＲ条件を可視化した（データは示されない）。
実施例６．インサイチュＰＥＲベースのシグナル増幅
ＤＮＡコンカテマーの拡散及び到達性における潜在的な問題を伴わずにより厚い組織切片を画像化可能にするために、組織サンプルへのインサイチュＰＥＲアプローチが確立される。組織における主要な課題は、組織環境でのＰＥＲの効率、ＰＥＲ構成要素の組織への拡散、並びにＰＥＲ及びハイブリダイゼーションに関連する自己蛍光及び非特異的バックグラウンドの増大である。染色体２を標的とするプライマー付加ＦＩＳＨプローブでＣ．エレガンス（C. elegans）の全載標本を標識化し、ＰＥＲによるインサイチュ伸長を適用した。プライマー部位を保有するプローブを用いて染色体２に対してＦＩＳＨを実施した。インサイチュＰＥＲ後、洗浄、イメージャのハイブリダイゼーション及び共焦点画像化を行った（データは示されない）。
ＤＮＡコンカテマーの拡散及び到達性における潜在的な問題を伴わずにより厚い組織切片を画像化可能にするために、組織サンプルへのインサイチュＰＥＲアプローチが確立される。組織における主要な課題は、組織環境でのＰＥＲの効率、ＰＥＲ構成要素の組織への拡散、並びにＰＥＲ及びハイブリダイゼーションに関連する自己蛍光及び非特異的バックグラウンドの増大である。染色体２を標的とするプライマー付加ＦＩＳＨプローブでＣ．エレガンス（C. elegans）の全載標本を標識化し、ＰＥＲによるインサイチュ伸長を適用した。プライマー部位を保有するプローブを用いて染色体２に対してＦＩＳＨを実施した。インサイチュＰＥＲ後、洗浄、イメージャのハイブリダイゼーション及び共焦点画像化を行った（データは示されない）。
これらの条件下において、多量の虫全体にわたって明るい蛍光シグナルが観察された（データは示されない）。これらの実験のために、プローブ上の架橋配列は、付加的な区間の非伸長プライマー配列を含有する。同じシグナル鎖を用いて、増幅のないシグナルをまず画像化して基礎レベルを確立する。次に、既知の長さの伸長ＰＥＲ鎖をハイブリダイズさせ、同じ部位を同じシグナル鎖で画像化して、増幅後のシグナルを定量する。この戦略は、組織サンプル中のシグナル鎖のハイブリダイゼーション効率（シグナル鎖長さを変更することによる）、拡散性（ハイブリダイゼーション期間を変更することによる）、結合安定性（洗浄条件を変更することによる）及び非特異性（ブロッカー及びハイブリダイゼーション温度を変更することによる）を調整するために使用される。標的は、１５μｍ未満のヒト脳切片上で標識される。
さらに、ＲＮＡ ＦＩＳＨを用いてマウス網膜組織を調べるために、インビトロ方法を使用した。組織サンプルにおいてシグナルを検出した（データは示されない）。
実施例７．インビトロでのスペクトル多重化
プレートアッセイを用いて同時多重化を得るために、ＩＦと組み合わせて４つの直交性の配列を使用する。インビトロ伸長及びインサイチュ検出戦略を使用して、インサイチュでの検出の直交性を検証する。４つの直交性のプライマー配列を用いて同時インサイチュ伸長を実施し、インサイチュ反応の直交性を検証する。直交標識化Ａｂを用いるＩＦにより形態的に別個の細胞コンパートメント及び構造（例えば、核小体、ミトコンドリア、ゴルジ体、微小管など）を標的とし、各一次Ａｂが省かれたネガティブコントロールを使用する。
プレートアッセイを用いて同時多重化を得るために、ＩＦと組み合わせて４つの直交性の配列を使用する。インビトロ伸長及びインサイチュ検出戦略を使用して、インサイチュでの検出の直交性を検証する。４つの直交性のプライマー配列を用いて同時インサイチュ伸長を実施し、インサイチュ反応の直交性を検証する。直交標識化Ａｂを用いるＩＦにより形態的に別個の細胞コンパートメント及び構造（例えば、核小体、ミトコンドリア、ゴルジ体、微小管など）を標的とし、各一次Ａｂが省かれたネガティブコントロールを使用する。
インサイチュ直交性の実験により、インサイチュで伸長させた直交性プライマーが付加されたメジャー及びマイナーサテライト反復配列を標的とする２色ＦＩＳＨ標識化が良好に実証された。ＭＥＦ内のメジャー及びマイナーサテライト反復配列に対してＦＩＳＨを実施した。
ＦＩＳＨプローブをインサイチュで同時に伸長させ、Alexa 647（マイナー）又はAlexa 565（メジャー）を保有する直交性イメージャとハイブリダイズさせた（データは示されない）。
実施例８．免疫染色実験
ＤＮＡ鎖がコンジュゲートされた二次抗体を使用して、ＰＥＲ増幅を用いる初期免疫染色実験を実施した（図１３）。この「架橋」配列、この場合にはＰ３８をハンドルとして使用して、ｐ２７プライマーハンドルが突出した鎖に結合した。次に、このハンドルをｐ２７の反復配列により伸長させ、そこに蛍光６４７鎖を結合させて、シグナルを可視化した。蛍光コントロール実験では、ＤＮＡコンジュゲート二次抗体ではなく、蛍光４８８二次抗体を一次抗体に結合させた
ＤＮＡ鎖がコンジュゲートされた二次抗体を使用して、ＰＥＲ増幅を用いる初期免疫染色実験を実施した（図１３）。この「架橋」配列、この場合にはＰ３８をハンドルとして使用して、ｐ２７プライマーハンドルが突出した鎖に結合した。次に、このハンドルをｐ２７の反復配列により伸長させ、そこに蛍光６４７鎖を結合させて、シグナルを可視化した。蛍光コントロール実験では、ＤＮＡコンジュゲート二次抗体ではなく、蛍光４８８二次抗体を一次抗体に結合させた
βチューブリンを標的とする一次抗体を用いる例からの結果は、図１０において見ることができる。上側の行は、４８８チャネルにおける蛍光二次抗体（Alexa 488標識）シグナルを示し、下側の行は、ＰＥＲシグナルを示し、これは、予想通り６４７チャネルにおけるシグナルのみを示す。
実施例９．シグナル増幅レベルの定量化
実際のインサイチュシグナル増幅レベルの定量化は、同じサンプルにおいて増幅の前後にシグナルレベルを比較することにより実証した。これは、ハンドル内の架橋補体配列（Ｂ３８＊）と、Ｐ２７プライマー配列との間に直交性の蛍光オリゴヌクレオチドのための余分な結合部位（Ｐ２８）を含むことによって達成された（図２１Ａ）。
実際のインサイチュシグナル増幅レベルの定量化は、同じサンプルにおいて増幅の前後にシグナルレベルを比較することにより実証した。これは、ハンドル内の架橋補体配列（Ｂ３８＊）と、Ｐ２７プライマー配列との間に直交性の蛍光オリゴヌクレオチドのための余分な結合部位（Ｐ２８）を含むことによって達成された（図２１Ａ）。
ヘアピンを１００ｎＭのプライマー、Bst Large Fragmentポリメラーゼ及びヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰ）の混合物と一緒にインキュベートすることにより、基本の単一プライマー交換反応を調製した。伸長されたプライマー（コンカテマー）をゲル電気泳動により可視化した（図２１Ｃ）。ゲル上に可視化されたアウトプットの長さは、シグナル増幅レベルの直接的な尺度となる。この例では、１．５ｋｂの長さのコンカテマーは、最大７０倍のシグナル増大をもたらすことが予想された。これは、蛍光鎖ハイブリダイゼーションの長さが２０ｎｔであり、全てのコンカテマーがこの最大長さに到達し、全ての部位がフルオロフォアにより占められたと仮定して計算した。
HeLa細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、１００ｍＭのＮＨ４Ｃｌでクエンチし、０．１％のTriton-X100で透過処理し、ＰＢＳ中２％のＢＳＡでブロックした。ヤギ抗ラミンＢ抗体を用い、その後、架橋配列（Ｂ３８）にコンジュゲートされた抗ヤギ二次抗体を用いて、免疫染色を実施した。過剰の抗体の洗浄及び後固定後、Ｂ３８＊配列を介して予備伸長コンカテマーを架橋にハイブリダイズさせた。過剰の鎖を洗浄し、次にＰ２８部位に結合するAlexa 647コンジュゲート蛍光鎖と共にサンプルをインキュベートして、増幅がない場合のベースラインシグナルレベルを測定した。第１ラウンドの画像化後、Ｐ２７反復配列に結合するAlexa 647コンジュゲート蛍光鎖と共にサンプルをインキュベートして、増幅シグナルレベルを測定した。過剰の蛍光オリゴヌクレオチドをＰＢＳで洗浄した後、落射蛍光顕微鏡を用いてサンプルを画像化した。画像スタックの最大投影は、図２１Ｅに示される。蛍光シグナルの定量化は、インサイチュイメージング条件下で約３７倍高いシグナルを実証し、これは、シグナルレベルの大幅な改善である。
実施例１０．シグナル破壊による多重化イメージング
２つの戦略で画像化を検証した：ホルムアミド誘発性のシグナル解離及びUSER（登録商標）切断誘発性のシグナル解離。
２つの戦略で画像化を検証した：ホルムアミド誘発性のシグナル解離及びUSER（登録商標）切断誘発性のシグナル解離。
ホルムアミドの場合、ＡＴリッチな２０ｍｅｒ蛍光オリゴヌクレオチドを合成した。蛍光オリゴヌクレオチドは、１ｘＰＢＳ溶液中５０％ホルムアミドにより、室温よりも十分に低い融解温度を有した。ホルムアミド系では、これらの弱い結合オリゴヌクレオチドを洗浄し、永久的に結合したＦＩＳＨプローブが残される。蛍光オリゴヌクレオチドは、ホルムアミドにより良好に洗浄され、次に１ｘＰＢＳ溶液中の標的に再ハイブリダイズされる（データは示されない）。
USER（登録商標）酵素も使用して、シグナル解離を誘発した。ウラシル塩基を切断するUSER（登録商標）酵素（neb.com/products/m5505-user-enzyme）をＤＮＡ配列に組み込んだ。酵素を使用して、蛍光シグナル鎖を、コンカテマーから自然に解離する複数の短い断片に切断し、蛍光シグナルを効果的に洗浄する。プロセスを細胞内で検証した。１ｘＰＢＳ中に１：２０でストックから希釈されたUSER（登録商標）による処理前及び２０分後に、４８８標識プローブ及びウラシル含有６４７蛍光鎖を有する細胞の画像を撮った（データは示されない）。
実施例１１．２色増幅
ＤＮＡ ＦＩＳＨを用いて、固定不死化マウス胚性線維芽細胞において２色実験も実施した（図１５Ａ）。上記の初期実験で標的としたメジャーサテライト反復領域に加えて、異なる色を用いて染色体のマイナーサテライト反復領域も標的とした。これは、２つの異なる標的に対して異なるプライマーをプローブに取り付け、インサイチュ合成したテロメア鎖の相補鎖において異なるフルオロフォアを用いることにより行った。この例では、マイナーサテライト領域及びメジャーサテライト領域を標的とするプローブにそれぞれプライマー１９及び２２を取り付けた。メジャーサテライト領域を標的とするｐ２２’ｐ２２’ｐ２２’鎖は、ATTO 565色素を含有し、マイナーサテライト領域を標的とするｐ１９’ｐ１９’ｐ１９’鎖は、Alexa 647色素を含有した。両方の標的のプライマーを３７℃で３時間のインキュベーション中にＰＥＲヘアピンと一緒に伸長させた。図１５Ｂは、そのそれぞれの適切な蛍光チャネルにおいて２つの標的の予想される形態を有する結果を示す。細胞をコントロールとしてＤＡＰＩ染色も行った。
ＤＮＡ ＦＩＳＨを用いて、固定不死化マウス胚性線維芽細胞において２色実験も実施した（図１５Ａ）。上記の初期実験で標的としたメジャーサテライト反復領域に加えて、異なる色を用いて染色体のマイナーサテライト反復領域も標的とした。これは、２つの異なる標的に対して異なるプライマーをプローブに取り付け、インサイチュ合成したテロメア鎖の相補鎖において異なるフルオロフォアを用いることにより行った。この例では、マイナーサテライト領域及びメジャーサテライト領域を標的とするプローブにそれぞれプライマー１９及び２２を取り付けた。メジャーサテライト領域を標的とするｐ２２’ｐ２２’ｐ２２’鎖は、ATTO 565色素を含有し、マイナーサテライト領域を標的とするｐ１９’ｐ１９’ｐ１９’鎖は、Alexa 647色素を含有した。両方の標的のプライマーを３７℃で３時間のインキュベーション中にＰＥＲヘアピンと一緒に伸長させた。図１５Ｂは、そのそれぞれの適切な蛍光チャネルにおいて２つの標的の予想される形態を有する結果を示す。細胞をコントロールとしてＤＡＰＩ染色も行った。
実施例１２．増幅の可視化
メジャーサテライトＰＥＲ増幅でどの程度の増幅が達成されるかという感覚を得るための実験を設計した（図１６）。１つのAlexa 647標識補体を結合するためにメジャーサテライトプローブに５’ハンドルを付加し（図１６において、これは、Alexa 647標識ｐ１９’ｐ１９’ｐ１９’鎖の結合領域である）、３つの異なるウェルにおいてＰＥＲヘアピン濃度を変更して、３つの異なるＰＥＲ条件下で局在化Alexa 647シグナルの増大を可視化した。結合領域は、非増幅プローブを有するサンプル（すなわちＰＥＲインキュベーション中にヘアピンなし）からの蛍光の、増幅プローブを有するサンプル（すなわちＰＥＲインキュベーション中にヘアピンあり）との比較を可能にする。ウェル１は、３時間のＰＥＲインキュベーション中にヘアピンを含有せず、従ってプローブの３’末端にテロメル化を有さないことが予想された（データは示されない）。ウェル２は、５００ｎＭのヘアピンをインキュベートし、ウェル３は、１μＭのヘアピンをインキュベートした（データは示されない）。ヘアピン濃度を増大させると、同じ顕微鏡条件下で画像化された細胞の蛍光値の増大が見られた。これは、ＰＥＲ合成に対応して増幅があることと一致し、結果を２つの異なるピクセルコントラストレベル下で可視化した。
メジャーサテライトＰＥＲ増幅でどの程度の増幅が達成されるかという感覚を得るための実験を設計した（図１６）。１つのAlexa 647標識補体を結合するためにメジャーサテライトプローブに５’ハンドルを付加し（図１６において、これは、Alexa 647標識ｐ１９’ｐ１９’ｐ１９’鎖の結合領域である）、３つの異なるウェルにおいてＰＥＲヘアピン濃度を変更して、３つの異なるＰＥＲ条件下で局在化Alexa 647シグナルの増大を可視化した。結合領域は、非増幅プローブを有するサンプル（すなわちＰＥＲインキュベーション中にヘアピンなし）からの蛍光の、増幅プローブを有するサンプル（すなわちＰＥＲインキュベーション中にヘアピンあり）との比較を可能にする。ウェル１は、３時間のＰＥＲインキュベーション中にヘアピンを含有せず、従ってプローブの３’末端にテロメル化を有さないことが予想された（データは示されない）。ウェル２は、５００ｎＭのヘアピンをインキュベートし、ウェル３は、１μＭのヘアピンをインキュベートした（データは示されない）。ヘアピン濃度を増大させると、同じ顕微鏡条件下で画像化された細胞の蛍光値の増大が見られた。これは、ＰＥＲ合成に対応して増幅があることと一致し、結果を２つの異なるピクセルコントラストレベル下で可視化した。
実施例１３．ＰＥＲ及びＤＥＩの組合せ
今日まで、例えば、高価な計測手段を用いずに、厚い組織サンプルにおける迅速な（数時間で達成可能）多重化（１０色を超える）タンパク質検出（特に低存在量レベルにおける）を実証する公表されたデータは存在していない。プライマー交換反応（ＰＥＲ）と、ＤＮＡ交換イメージング（ＤＥＩ）方法（例えば、参照により本明細書に援用される、２０１５年９月１７日に公開された国際公開第２０１５／１３８６５３号を参照されたい）とを組み合わせることにより、本開示は、例えば、ニューロン組織の正確な組成マッピングのための手段を提供する。この例では、高感度及び多重化インサイチュ免疫蛍光法を達成するために、免疫蛍光法は、直交性ＰＥＲプライマー配列にコンジュゲートされた数十の一次抗体を用いて実施され、直交性ＰＥＲプライマー配列は、インサイチュＰＥＲにより同時に伸長され、ＤＮＡ交換イメージングは、全ての標的の連続的な検出のために実施される（図１９）。従って、この例では、直交性配列設計を用いることにより、ＤＥＩベースの多重化戦略をＰＥＲ増幅と組み合わせて、深い組織サンプル中の珍しい標的の迅速な多重化検出を可能にする。
今日まで、例えば、高価な計測手段を用いずに、厚い組織サンプルにおける迅速な（数時間で達成可能）多重化（１０色を超える）タンパク質検出（特に低存在量レベルにおける）を実証する公表されたデータは存在していない。プライマー交換反応（ＰＥＲ）と、ＤＮＡ交換イメージング（ＤＥＩ）方法（例えば、参照により本明細書に援用される、２０１５年９月１７日に公開された国際公開第２０１５／１３８６５３号を参照されたい）とを組み合わせることにより、本開示は、例えば、ニューロン組織の正確な組成マッピングのための手段を提供する。この例では、高感度及び多重化インサイチュ免疫蛍光法を達成するために、免疫蛍光法は、直交性ＰＥＲプライマー配列にコンジュゲートされた数十の一次抗体を用いて実施され、直交性ＰＥＲプライマー配列は、インサイチュＰＥＲにより同時に伸長され、ＤＮＡ交換イメージングは、全ての標的の連続的な検出のために実施される（図１９）。従って、この例では、直交性配列設計を用いることにより、ＤＥＩベースの多重化戦略をＰＥＲ増幅と組み合わせて、深い組織サンプル中の珍しい標的の迅速な多重化検出を可能にする。
ＤＥＩ及びＰＥＲを用いる多重化免疫蛍光法の実施を可能にするために、ＤＮＡと直接コンジュゲートされた一次抗体を用いて染色が実施される。二次抗体により提供されるシグナル増幅及び標識化密度増強がなくてもＰＥＲが予想通りに機能し得ることを示すために、ＤＮＡオリゴ（２８－ｎｔ長）に直接コンジュゲートされた抗αチューブリン一次抗体を用いる実験を実施し、微小管の広範な標識化が得られた（データは示されない）。異なる発現レベルの抗体標的化タンパク質の多様なセットを用いて、付加的な実験が実施される。
画像化の各ラウンド後、安定的に結合したイメージャ鎖が除去される。
異なるスペクトルチャネルを用いて、４Ｘ多重化を達成することができる（上記を参照されたい）。より高レベルの多重化を実証するために、インシリコからインビトロへ且つインサイチュへと至る３段階システムが確立される。直交性配列のインシリコ設計のために、８つの異なるプライマーを設計するための実験的なパイプラインが作られる。最初に、９８．２％～９９．２％の確率でその完全補体に結合する、全て９－ｎｔの長さのプライマー配列のライブラリが構築される。結合確率は、NUPACKツール（２４、２５）をコマンドラインから実行して、０℃において１００ｎＭの鎖が１００ｎＭの相補鎖に結合する確率として計算される。このライブラリから、ＣＣＣＣの区間を含有する配列が選別除去される。なぜなら、これらの配列の補体は、四本鎖ＤＮＡ構造を形成する望ましくない可能性を有するヘアピン内のＧＧＧＧを保有することを必要とし得るからである。次に、最適化アルゴリズムを使用して、ライブラリからランダムにｎ個の配列のセットを作成し、直交性の制約を満たすセットが得られるまでこれらを置き換える。適格とするために、セット内の全てのプライマーが以下の試験に合格しなければならない。（ｉ）ホモ二量体化チェック：自己結合確率が２０％未満である。（ｉｉ）ヘテロ二量体化チェック：全てのプライマーに結合する確率が２０％未満である。（ｉｉｉ）クロストークチェック：セット内のプライマーに対する全ての他の相補的配列への結合が０．０８％未満である。（ｉｖ）逆クロストークチェック：セット内の全てのプライマーに対する全ての補体の結合が０．０８％未満である。これにより、この直交性の制約の有効な重み付けの倍増、及び鎖のいずれの方向性が選択されるかに応じて生じ得る小さい熱力学的差異の平均化が保証される。（ｖ）普遍的な配列結合：選択されたヘアピンループ配列（この例では「ＧＣＣＴＴＴＴＧ」）に対する全てのプライマーの結合確率が２０％未満である。次に、選択されたランダムプライマーセットに、本発明者らが経験的に確立した一本鎖の制約を受けさせた。これによると、プライマー配列（Ａ塩基が次に続く）を５回連結する５０－ｎｔの配列が構築される。これらの５０ｍｅｒは、０℃において少なくとも０．０６％の確率で完全に一本鎖（完全に不対）である。このパイプラインを用いて、２時間未満の計算時間で８つの直交性のプライマー配列を設計した。設計基準のさらなる分析を用いて、高レベルのＰＥＲ増強多重化インサイチュイメージングを可能にするために数十の直交性配列を設計することができる。約５０の直交性鎖のセットを作成するために、Simulated Annealing及びGenetic Algorithmsなどの他の方法が使用され得る。
インシリコ設計に続いて、選択された配列はインビトロで評価される。ゲルアッセイを使用して、ＰＥＲが全てのプライマーに対して同時に実施される場合、反応間のクロストークチェックを実施する。最初に、各プライマー配列と、その相補的なヘアピン（ポシティブコントロール）、８つ全てのプライマーに同族のヘアピン、又は特定のプライマーの相補的ヘアピンを除く全てのプライマー（ネガティブコントロール）とを混合することにより、ＰＥＲをインビトロで実施した。各反応からの産物をゲル電気泳動により分析した（図２０）。この実験スキームは、５０のインシリコ設計された鎖の直交性の高スループット検証のために使用される。
イメージャのレベルのクロストークを高スループットで定量的にチェックするために、スペクトル的にバーコード化されたナノロッド折り紙プラットフォーム（spectrally barcoded nanorod origami platform）が使用される（例えば、２０１５年９月１７日に公開された国際公開第２０１５／１３８６５３号を参照されたい）。３つの蛍光のスポットに加えて、第４のスペクトルチャネル（深紅色）及び付加的なスポット位置がプライマー配列を提示するために使用される。各プライマー配列（約５０種）に対してバーコード化された折り紙構造は混ぜ合わせられ、マイカ表面に固定化される（これは、固定化された折り紙骨格を鎖置換ポリメラーゼの作用から保護する）。これらは、全てのヘアピンを提供するＰＥＲにより全て同時に伸長される。次に、連続して、各相補的イメージャが付加され、ＴＩＲＦイメージングが実施され、イメージャが移動され（USER酵素により）、且つ洗浄され、全てのプライマー－イメージャ配列対が画像化されるまで新しいイメージャが付加される。５０配列のプールから始めて、上位の３０がインサイチュ検証のために選択される。
インビトロで確認された直交性配列は、細胞を含むマルチウェルプレートにおいて高速蛍光アッセイを用いてインサイチュで検証される。プライマー結合のための架橋オリゴを提示する抗体を用いて、別個の細胞構造（例えば、ミトコンドリア又は微小管など）が免疫蛍光法により標的とされる。同じ架橋結合配列を保有する直交性プライマー配列を各ウェルにハイブリダイズさせる。ゲルアッセイと同様のスキームに従い、各プライマー配列に対して３つのウェルがある：ポジティブコントロール（正確に相補的なヘアピンのみが付加される）、ネガティブコントロール（相補的なものを除く全てのヘアピン）及び実験条件（全てのヘアピンが付加される）。各ウェルに対して同時にＰＥＲが実施された後、全てのイメージャと共にインキュベーションが行われる。非結合イメージャが洗浄され、任意の望ましくない結合を検出するために蛍光シグナルのレベルが評価される。これらの方法で検証した配列は、ニューロン及びサイトカイン標的をマークする一次抗体にコンジュゲートされる。
実施例１４．コンカテマー長の伸長の制御
コンカテマー長のシグナル増幅に対する効果を調査するために実験を実施した。可変濃度のヘアピン（０．１～０．４ ０．４μＭ）を１００ｎＭのプライマー、Bst Large Fragmentポリメラーゼ及びヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰ）の混合物と一緒にインキュベートすることにより、基本のシグナルプライマー交換反応を調製した。次に、伸長したプライマー（コンカテマー）をゲル電気泳動により可視化した（図２１Ｂ）。ゲル上に可視化されたアウトプットの長さは、予想されるシグナル増幅レベルの直接的な尺度を表した。伸長レベルの厳格な制御及びプログラム可能性が示される。コンカテマー長は、インキュベーション時間又はｄＮＴＰ濃度などの他のパラメータによって制御することもできる。
コンカテマー長のシグナル増幅に対する効果を調査するために実験を実施した。可変濃度のヘアピン（０．１～０．４ ０．４μＭ）を１００ｎＭのプライマー、Bst Large Fragmentポリメラーゼ及びヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰ）の混合物と一緒にインキュベートすることにより、基本のシグナルプライマー交換反応を調製した。次に、伸長したプライマー（コンカテマー）をゲル電気泳動により可視化した（図２１Ｂ）。ゲル上に可視化されたアウトプットの長さは、予想されるシグナル増幅レベルの直接的な尺度を表した。伸長レベルの厳格な制御及びプログラム可能性が示される。コンカテマー長は、インキュベーション時間又はｄＮＴＰ濃度などの他のパラメータによって制御することもできる。
実施例１５．分岐ＰＥＲシグナル増幅
この実施例は、異なる分岐構造と、結果として生じるシグナル増幅とを実証する。ＰＥＲ鎖をカスケード式に適用させて、付加的なコンカテマーの主要なコンカテマーへのハイブリダイゼーションを介して分岐構造を形成することができる。分岐の形成は、プレコンカテマーの標的への同時又は連続的な適用によって実施することができる。分岐コンカテマーは、直接的なインサイチュＰＥＲによって形成することもできる。分岐の形成は、蛍光オリゴヌクレオチドのための結合部位の数を増大させ、さらなるシグナル増幅が可能になる。
この実施例は、異なる分岐構造と、結果として生じるシグナル増幅とを実証する。ＰＥＲ鎖をカスケード式に適用させて、付加的なコンカテマーの主要なコンカテマーへのハイブリダイゼーションを介して分岐構造を形成することができる。分岐の形成は、プレコンカテマーの標的への同時又は連続的な適用によって実施することができる。分岐コンカテマーは、直接的なインサイチュＰＥＲによって形成することもできる。分岐の形成は、蛍光オリゴヌクレオチドのための結合部位の数を増大させ、さらなるシグナル増幅が可能になる。
分岐構造は、以下のように連続して構築した。HeLa細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、１００ｍＭのＮＨ４Ｃｌでクエンチし、０．１％のTriton-X100で透過処理し、ＰＢＳ中２％のＢＳＡでブロックした。ヤギ抗ラミンＢ抗体を用い、その後、架橋配列（Ｂ３８）にコンジュゲートされた抗ヤギ二次抗体を用いて、免疫染色を実施した。過剰の抗体の洗浄及び後固定後、Ｂ３８＊配列を介して予備伸長コンカテマー１（Ｐ３０）を架橋にハイブリダイズさせた。過剰の鎖を洗浄し、コンカテマー２を用いて第２のハイブリダイゼーションを実施した。コンカテマー２は、３反復配列のＰ３０結合部位とそれに続くＰ２５プライミング部位とを有するプライマー鎖を用いて予備伸長させた。予備伸長は、ヘアピン、Bst Large Fragmentポリメラーゼ及びヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰ）の混合物と共にインキュベートされた１００ｎＭのプライマーヘアピンを用いてインビトロで実施した。過剰の鎖を３７℃で洗浄した。次に、Ｐ３０反復配列（コンカテマー１を検出するため、分岐なし）又はＰ２５反復配列（コンカテマー２を検出するため、分岐後）に結合するAlexa 647コンジュゲート蛍光鎖と共にサンプルをインキュベートした。過剰の蛍光オリゴヌクレオチドをＰＢＳで洗浄した後、落射蛍光顕微鏡を用いてサンプルを画像化した。画像スタックの最大投影は、図２２Ａ～２２Ｂに示される。蛍光シグナルの定量化は、分岐のない場合に比べて分岐のある場合、約５倍高い増幅をもたらす。
分岐は、図２２Ｄ～２２Ｅに概略的に示される樹状成長などの他の構築形態によって構築することもできる。
分岐ＰＥＲシグナル増幅を、一次抗体で直接染色した細胞も用いて調査した。上記のように、HeLa細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、１００ｍＭのＮＨ４Ｃｌでクエンチし、０．１％のTriton-X100で透過処理し、ＰＢＳ中２％のＢＳＡでブロックした。４２－ｎｔ架橋配列（Ｂ０）にコンジュゲートされたラット抗αチューブリン抗体を用いて免疫染色を実施した。過剰の抗体の洗浄及び後固定後、Ｂ３８＊配列を介して予備伸長コンカテマー１（Ｐ３０）を架橋に３７℃で４時間ハイブリダイズさせた。過剰の鎖を洗浄し、コンカテマー２を用いて第２のハイブリダイゼーションを３７℃で一晩実施した。コンカテマー２は、３反復配列のＰ３０結合部位とそれに続くＰ３３プライミング部位とを有するプライマー鎖を用いて予備伸長させた。予備伸長は、ヘアピン、Bst Large Fragmentポリメラーゼ及びヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰ）の混合物と共にインキュベートされた１００ｎＭのプライマーヘアピンを用いてインビトロで実施した。過剰の鎖を３７℃で洗浄した。次に、Ｐ３３反復配列に結合する２μＭのAlexa 565コンジュゲート蛍光鎖と共にサンプルを３７℃で１００分間インキュベートした。過剰の蛍光オリゴをＰＢＳで洗浄した後、落射蛍光顕微鏡を用いてサンプルを画像化した。画像スタックの最大投影は、図２３に示される。抗体なしのコントロールは、一次抗体が省かれるが、全ての他のステップが適用されたサンプルにおけるバックグラウンド染色がないことを実証する。伸長なしのコントロールは、コンカテマーの代わりに非伸長プライマーとハイブリダイズされたサンプルを示す。単一ラウンド伸長サンプルのみをコンカテマー１とハイブリダイズさせ、Ｐ３０反復配列に結合する２μＭのAlexa 565コンジュゲート蛍光鎖により可視化した。
実施例１６．ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルにおけるシグナル増幅
この実施例は、過剰の分子がＦＦＰＥ調製手順を困難にし得る、医学的な組織分析及び保管（archival）において一般に使用されるＦＦＰＥサンプルに対するシグナル増幅方法の適用性を実証する。より速い診断的適用のために、抗体及びＤＮＡ鎖のインキュベーション時間を実質的に短くすることができる。
この実施例は、過剰の分子がＦＦＰＥ調製手順を困難にし得る、医学的な組織分析及び保管（archival）において一般に使用されるＦＦＰＥサンプルに対するシグナル増幅方法の適用性を実証する。より速い診断的適用のために、抗体及びＤＮＡ鎖のインキュベーション時間を実質的に短くすることができる。
実験では、標準プロトコルを用いて、４μｍ厚のヒト扁桃腺サンプルをホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。抗原回復後、２％のウシ血清アルブミン及び０．３％のTriton-X100を含有するＰＢＳでサンプルをブロック及び透過処理した。ウサギ抗ヒトＣＤ３抗体を用いて一次抗体染色を４℃で実施した。過剰の抗体を洗浄した後、Ｂ３８架橋配列にコンジュゲートされた抗ウサギ二次抗体と共にサンプルをインキュベートした。過剰の抗体を洗浄した後、サンプルをＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒドで１０分間後固定し、ＰＢＳ中１００ｍＭの塩化アンモニウムで５分間クエンチし、０．３％のTritonを含有するＰＢＳで洗浄した。増幅に使用したＰＥＲコンカテマーは、５’末端上の相補的架橋結合ハンドルを含有する１００ｎＭのＰ２７プライマーを用いて予備伸長させた。０．５μＭのヘアピン、Bst Large Fragmentポリメラーゼ、及びヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰ）の混合物と共に反応を１時間実施した。次に、ポリメラーゼを熱不活性化し、ＦＦＰＥサンプルへの３７℃で一晩のハイブリダイゼーションのために１：１０希釈の反応混合物を使用した。３７℃の０．３％のTritonを含有するＰＢＳで過剰の鎖を洗浄した。次に、サンプルを１μＭの蛍光鎖と共に２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、共焦点顕微鏡を用いてサンプルを画像化した。図２４に示されるように、扁桃腺サンプルについて予想されるように胚中心の周囲の濾胞間Ｔ細胞ゾーン内のＣＤ３ポジティブＴ細胞を可視化した。
参照文献
［１］Choi, Harry MT, et al,“Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression.”Nature biotechnology 28. 11 (2010): 1208-1212.
［２］Lizardi, Paul M., et al.“Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification.”Nature genetics 19.3 (1998): 225-232.
［３］Schoenhuber, W., et al.“Improved sensitivity of whole-cell hybridization by the combination of horseradish peroxidase-labeled oligonucleotides and tyramide signal amplification.”Applied and Environmental Microbiology 63.8 (1997): 3268-3273.
［４］Blackburn, Elizabeth H., and Kathleen Collins.“Telomerase:an RNP enzyme synthesizes DNA.”Cold Spring Harbor perspectives in biology 3.5 (2011): a003558.
［５］DeLong, Edward F., Gene S. Wickham, and Norman R. Pace.“Phylogenetic stains:Ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells.”Science 243.4896 (1989): 1360.
［６］Amann, Rudolf I., Lee Krumholz, and David A. Stahl.“Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic, and environmental studies in microbiology.”Journal of bacteriology 172.2 (1990): 762-770.
［７］Kazane, Stephanie A., et al.“Site-specific DNA-antibody conjugates for specific and sensitive immuno-PCR.”Proceedings of the National Academy of Sciences 109. 10 (2012): 3731-3736.
［８］Yildirim, Eda, et al.“X-chromosome hyperactivation in mammals via nonlinear relationships between chromatin states and transcription.”Nature structural & molecular biology 19.1 (2012): 56-61.
［９］Beliveau, Brian J., et al.“Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.”Proceedings of the National Academy of Sciences 109.52 (2012): 21301-21306.
［１０］Beliveau, Brian J., et al.“Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes.”Nature communications 6 (2015).
［１１］Casanova, Miguel, et al.“Heterochromatin reorganization during early mouse development requires a single-stranded noncoding transcript.”Cell reports 4.6 (2013): 1156-1167.
［１２］Jungmann, Ralf, et al.“Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.”Nature methods 11. 3 (2014): 313.
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［１２］Jungmann, Ralf, et al.“Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.”Nature methods 11. 3 (2014): 313.
本明細書で開示される参照文献、特許及び特許出願の全ては、それぞれが引用される主題（場合により文献の全体を包含し得る）に関して参照により援用される。
不定冠詞「１つの（a）」及び「１つの（an）」は、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、明らかに反対のことが指示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
明らかに反対のことが指示されない限り、２つ以上のステップ又は行為を含む本明細書で特許請求されるあらゆる方法において、方法のステップ又は行為の順序は、必ずしも方法のステップ又は行為が記載された順序に限定されるわけではないことも理解されるべきである。
特許請求の範囲において、及び上記の本明細書において、「含む」、「包含する」、「保有する」、「有する」、「含有する」、「伴う」、「保持する」、「から構成される」などの全ての移行句は、全て非限定的である、すなわち包含するが、限定されないことを意味すると理解されるべきである。「からなる」及び「から本質的になる」という移行句のみは、米国特許庁特許審査便覧（United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures）セクション２１１１．０３に記載されるように、それぞれ限定的又は半限定的な移行句であるものとする。
Claims (13)
- 多重化標的検出方法であって、
（ａ）複数のタンパク質又はペプチド標的を含有するサンプルと、複数の一次結合パートナーであって、前記複数の一次結合パートナーのそれぞれが、タンパク質又はペプチド標的に特異的に結合し、且つプローブ鎖に連結される、複数の一次結合パートナーとを組み合わせ、且つ一次結合パートナーに結合されたタンパク質又はペプチドを含む第１の反応混合物を生成すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された前記第１の反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子が、５’－３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、前記第１のドメインが、前記第２のドメインに結合され、及び前記第３のドメインが、前記一次結合パートナーの１つの前記プローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ一次結合パートナーに連結された前記プローブ鎖と結合された核酸コンカテマーを含む第２の反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された前記第２の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖が、異なる検出可能な分子に連結され、且つ前記一次結合パートナーの１つの前記プローブ鎖に対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、前記プローブ鎖のそれぞれ及び前記触媒分子のそれぞれが、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡから構成される、多重化標的検出方法。 - （ｄ）複数のシグナル鎖によって標識された前記コンカテマーを画像化すること、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記一次結合パートナーが、抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
- 各触媒分子の前記第１のドメインが、同じ触媒分子の前記第２のドメインに結合され、各触媒分子の前記第２のドメインが、同じ触媒分子の前記第３のドメインと同一の配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 各触媒分子の前記第１のドメインが、同じ触媒分子の前記第２のドメインに対して完全に相補的な配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 各触媒分子が、同じ触媒分子の前記第１のドメインと前記第２のドメインとの間に位置する、重合を終結させるストッパー分子又は修飾をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 重合を終結させる前記ストッパー分子又は修飾が、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、１８原子ヘキサエチレングリコール、アデニル化、アジド、ジゴキシゲニン、コレステリル－ＴＥＧ、３－シアノビニルカルバゾール（ＣＮＶＫ）、ｉｓｏ－ｄＧ、及びｉｓｏ－ｄＣから選択される、請求項６に記載の方法。
- 前記ストッパー分子が、グアニンであり、且つ前記触媒分子が、アデニン、チミン、及びシトシンから構成されるか、あるいは前記ストッパー分子が、シトシンであり、且つ前記触媒分子が、アデニン、チミン、及びグアニンから構成される、請求項６に記載の方法。
- 各触媒分子が、前記第１のドメインと前記第２のドメインとの間に位置するループドメインをさらに含む触媒ヘアピン分子である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シグナル鎖の前記検出可能な分子が、フルオロフォアである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記鎖置換ポリメラーゼが、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＢｓｕ ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントから選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の触媒分子が、２～１０，０００の前記触媒分子を含み、及び
前記複数のシグナル鎖が、２～１０，０００の前記シグナル鎖を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。 - 前記サンプルが、細胞サンプル又は組織サンプルである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
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