CN113156122B - 一种检测外泌体pd-l1的荧光传感器及其制备与应用 - Google Patents

一种检测外泌体pd-l1的荧光传感器及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测外泌体PD‑L1的荧光传感器及其制备与应用，所述传感器包括外泌体PD‑L1、信号识别部分和信号转换部分，信号识别部分包括适体，适体上含有一段被封闭的引物序列，外泌体PD‑L1与适体结合使引物暴露；信号转换部分为：引物与发夹A结合触发级联引物交换反应(PER)，生成产物，产物与硫黄素ThT结合产生荧光，实现外泌体PD‑L1的检测。本发明首次将级联PER反应用于检测外泌体PD‑L1，通过PER的信号放大作用结合，使荧光信号进一步放大，提高灵敏度和特异性；无需洗涤，能一步法实现检测，操作简便；利用适体识别外泌体，适体可通过程序设计，无需复杂的DNA抗体偶联，且适体空间位阻较小可有效识别外泌体。

Description

一种检测外泌体PD-L1的荧光传感器及其制备与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测外泌体PD-L1的荧光传感器及其制备与应用。
背景技术
肝细胞癌(HCC，也称为原发性肝癌)是世界上最常见的癌症之一。每年大约有84万新发的HCC病例，并且至少有78万人死于HCC。肝癌的主要治疗方案是手术切除、肝移植、放疗或化学药物局部给药以及联合治疗。然而，由于HCC起病的隐匿性和缺乏特定的早期标志物，大多数患者通常被诊断时已经是晚期，不再适合手术治疗，生存时间通常只有6个月。射频消融(RFA)目前是较小的HCC的一线治疗，具有与外科手术切除相似的功效，并且损伤小、恢复快。然而，由于消融能量在肿瘤中的分布不均，杀死远端或末梢癌细胞的效率不高，可能导致残留肿瘤的存在。经导管动脉化疗栓塞(TACE)是晚期肝癌的另一种一线治疗方法。然而，由于缺氧后肿瘤中的代偿性血管增生，治疗效果也不能令人满意。索拉非尼是晚期肝癌的主流靶向治疗药物，可以显着延长患者的中位生存期，但在治疗后期逐渐会出现耐药性。因此，鉴定HCC的早期特异性诊断标志物并解决耐药性和疾病复发的问题是临床实践中的紧迫问题。
肝癌的发生和发展是一个极其复杂的病理过程，其潜在的分子机制仍不清楚。大量的基础和临床研究表明，病毒感染、酒精和非酒精性肝毒性是HCC的主要原因，而其发病机理尚不清楚。近年来，体内和体外实验都证明外泌体可能在肝癌的发生、发展、诊断和治疗中起关键作用。在肝脏中产生外泌体的细胞类型主要是肝实质细胞(例如肝细胞)、非实质肝内免疫细胞(例如巨噬细胞、树突状细胞、T/B细胞和自然杀伤细胞)、以及各种非实质性肝基质细胞(如星状细胞)。外泌体被包括乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)在内的各种病毒所利用，将病毒RNA复合物传递至相邻的正常肝细胞，并通过浆细胞样树突状细胞(PDC)诱导非特异性免疫反应，以及引起T细胞抑制的特异性免疫反应。HCC细胞还可以通过产生抑制免疫应答的外泌体来逃避肿瘤的免疫监视。例如，侵袭性很强的肝癌细胞能够表达PD-L1(细胞程序性死亡-配体1)免疫检查点蛋白，它与免疫细胞上的PD-1受体相结合，能够抑制免疫反应。因此，外泌体PD-L1在肝癌的发展、诊断和治疗中起着关键作用，并具有广泛的临床应用。
滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法，以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物(与部分环状模板互补)，在酶催化下将dNTPs转变成单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复的模板互补片段。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力，目前也有。但RCA需要合成DNA环型模板和连接链，过程比较复杂。因此，有必要构建一种更加简便、且灵敏度和特异性好的外泌体PD-L1检测策略具有重要的临床意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测外泌体PD-L1的荧光传感器及其制备与应用，本发明创新地提出了一种单步无标记的外泌体PD-L1荧光成像的生物传感策略，通过适体激活引物交换反应，结合荧光分子后产生放大且可靠的荧光，从而实现肝癌细胞来源的外泌体PD-L1的原位检测。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种检测外泌体PD-L1的荧光传感器，包括外泌体PD-L1、信号识别部分和信号转换部分，所述信号识别部分包括能与外泌体PD-L1结合的适体，所述适体上含有一段被封闭的引物序列，外泌体PD-L1与适体结合，使引物暴露；所述信号转换部分为：所述引物与发夹结合触发级联引物交换反应(Primer Exchange Reaction，PER)，生成产物，所述产物与硫黄素ThT结合产生荧光，实现外泌体PD-L1的检测。
进一步，所述适体为适体AP，其核苷酸序列为：
5′-ACAGGTTCTGGGGGGTGGGTGGGGAACCTGTTAACAGGTTCCCC-3′(SEQ ID NO.1)。
进一步，所述适体包含的引物选自引物1或引物2中的至少一种，所述引物1的核苷酸序列为：5′-GGTTCCCC-3′(SEQ ID NO.2)，所述引物2的核苷酸序列为：5′-TCATCTTCTTCATTGAAGATGAC-3′(SEQ ID NO.3)。
进一步，所述发夹选自发夹A与发夹B、发夹C与发夹D中的至少一种组合；所述发夹A的核苷酸序列为：
5′-TTAGGGCCCGGTTTTCCGGGCCCTAACGGGGAACGInvdT-3′(SEQ ID NO.4)；
所述发夹B的核苷酸序列为：
5′-TTAGGGCCCGGTTTTCCGGGCCCTAACCCTAACCInvdT-3′(SEQ ID NO.5)；
所述发夹C的核苷酸序列为：
5′-TTAGGGCCCGGTTTTCCGGGCCCTAACGTCATCTTCInvdT-3′(SEQ ID NO.6)；
所述发夹D的核苷酸序列为：
5′-TTAGGGCCCGGTTTTCCGGGCCCTAACGGGGAACGInvdT-3′(SEQ ID NO.7)。
可选地，所述荧光传感器为单支级联引物交换反应(PER)体系，包括外泌体PD-L1、适体、发夹A、发夹B。
可选地，所述荧光传感器为分支级联引物交换反应(PER)体系，包括外泌体PD-L1、适体、引物2、发夹A、发夹B、发夹C、发夹D。
进一步，所述产物为具有TTTAGGG重复序列域的长分支链，即(TTTAGGG)n。本发明的产物特异性地与ThT分子结合，从而产生荧光。
本发明第二方面提供一种如第一方面所述的检测外泌体PD-L1的荧光传感器的制备方法，包括如下步骤：
(a)适体结合外泌体PD-L1：将适体AP与外泌体PD-L1共同孵育，得A-PDL1复合物；
(b)取步骤(a)所得产物A-PDL1复合物，与发夹混合，孵育，构建级联引物交换反应(PER)；
(c)将硫磺素ThT溶液加入步骤(b)所得的反应液中，混合、孵育，得荧光检测体系。
进一步，通过超速离心法从血清样本中提取外泌体PD-L1。
进一步，所述超速离心法为：在血清样本加入PBS缓冲液，先低速离心，吸取上清液，进行第一次高速离心，过滤去除血清中的细胞和凋亡碎片；进行第二次高速离心，去除蛋白质和较大的细胞外囊泡，取沉积物，用PBS洗涤；最后进行第三次高速离心，获取外泌体沉积物。
可选地，所述超速离心法中，低速离心条件为2000-3000g、20-40min，优选为2000g、30min；第一次高速离心条件为10000-12000g、40-60min，优选为10000g、40min；第二次高速离心条件为10000-12000g、20-40min，优选为10000g、30min；第三次高速离心条件为10000-12000g、60-80min，优选为10000g、70min。
可选地，所述超速离心法中，离心均在4℃条件下进行。
可选地，所述超速离心法中，过滤时使用0.2-0.3μm的过滤器，优选为0.22μm。
进一步，所述步骤(a)、(b)中，适体AP和发夹的摩尔比为1∶1。
进一步，所述步骤(a)中，适体AP要先进行变性退火，然后再与外泌体共同孵育，适体AP的变性温度为90-100℃，优选为95℃，变性时间为5-10min，优选为5min。
进一步，所述步骤(a)中，适体AP和外泌体的孵育温度为37℃，时间为1-2h，优选为1h。
进一步，所述步骤(b)所需的反应溶液还包括：10×NEBuffer3.0缓冲液、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP，Klenow Fragment DNA聚合酶。
可选地，所述步骤(a)的反应溶液包括：2μL5μM适体AP。
可选地，所述步骤(b)的反应溶液包括：2μL 10×NEBuffer3.0缓冲液、15μL A-PDL1复合物、2μL 5μM发夹A、2μL 5μM发夹B、2μL 20mM三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP、2μL20mM三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、2μL 20mM三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP、2μLKlenow Fragment DNA聚合酶。
可选地，所述步骤(b)的反应溶液包括：2μL 10×NEBuffer3.0缓冲液、15μL A-PDLl复合物、2μL 5μM发夹A、2μL 5μM发夹B、2μL 5μM发夹C、2μL 5μM发夹D、2μL 20mM三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP、2μL 20mM三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、2μL 20mM三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP、2μL Klenow Fragment DNA聚合酶。
进一步，所述步骤(b)中，孵育温度为37℃，孵育时间为2-3h，优选为2h。
进一步，所述步骤(c)中，还需要加入PBS缓冲液。
进一步，所述步骤(c)中，硫磺素ThT溶液由硫磺素ThT加水入配制而成，浓度为80-120mM，优选为100mM。优选地，所述水选用去离子水。
可选地，所述步骤(c)的反应溶液包括：2μL 100mM硫磺素ThT、100μL PBS。
进一步，所述步骤(b)中，孵育温度为37℃，孵育时间为30-60min，优选为40min。
进一步，所述步骤(a)、(b)、(c)中，孵育均在避光条件下进行。
本发明第三方面提供一种检测外泌体PD-L1的方法，采用第一方面所述的荧光传感器和/或根据第二方面所述方法制备得到的荧光传感器。
进一步，采用激光共聚焦成像仪或荧光分光光度计检测荧光信号。
进一步，采用激光共聚焦成像仪检测荧光信号的方法包括以下步骤：取反应液滴加到玻片上，盖上盖玻片，进行共聚焦成像，检测条件为：激发波长为488nm，发射波长范围488-800nm，获得荧光信号。
进一步，采用荧光分光光度计检测荧光信号的方法包括以下步骤：
(1)荧光比色皿清洗：将荧光比色皿用酒精浸泡，并用ddH2O清洗；
(2)设置参数：设置激发波长为445nm，发射波长范围为450-550nm，电压为700V；
(3)调零：向荧光比色皿中加入ddH2O，进行调零；
(4)进行检测：将反应液加入荧光比色皿中，点击检测，即可获得荧光信号。
可选地，所述荧光比色皿为石英比色皿。
如上所述，本发明的检测外泌体PD-L1的荧光传感器及其制备与应用，具有以下有益效果：
(1)本发明首次将级联PER反应用于外泌体PD-L1的检测。
(2)本发明的产物能特异性地与硫磺素(ThT)分子结合，从而产生荧光，并通过PER的信号放大作用，使荧光信号进一步放大，提高了对靶物质(外泌体PD-L1)检测的灵敏度和特异性。
(3)现有技术中，很多外泌体成像需要与磁珠结合，从而需要洗涤以去除未和磁珠结合的外泌体，但本发明的方法不需要与磁珠结合，也就无需洗涤。本发明省去了洗涤操作，因此可以通过一步法实现外泌体PD-L1的检测，大大简化了操作步骤。
(4)本发明利用适体识别外泌体PD-L1，与抗体相比，适体可通过程序设计，而无需复杂的DNA抗体偶联，且适体的较小空间位阻可有效识别外泌体。
附图说明
图1显示为本发明所述方法的检测原理图。
图2显示为本发明实施例2中验证适体结合可行性的荧光信号对比图。
图3显示为本发明实施例3中验证PER体系可行性的电泳图。
图4显示为本发明实施例4中的荧光信号分析结果图。
图5显示为本发明实施例5中的共聚焦成像结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
引物交换反应PER是一种可靠的信号放大策略，已在生物传感，生物成像和药物传递等领域受到研究人员的关注。在DNA聚合酶的帮助下，PER可以等温，可编程的形式原位自主合成具有重复序列的长单链DNA。与RCA需要复杂地合成DNA环型模板和连接链不同，PER策略仅需要发夹和引物即可执行特异性且快速的信号扩增。因此，本发明基于PER优越的特性，构建了一种检测样品中外泌体PD-L1的PER策略。本方案提出的是一种单步无标记的外泌体PD-L1荧光成像的生物传感策略，通过适体激活引物交换反应，结合荧光分子后产生放大且可靠的荧光，从而实现肝癌细胞来源的外泌体PD-L1的原位检测。本发明方案主要有以下几点优势：(1)通过避免洗涤一步法检测简化了操作；(2)与抗体相比，适体可通过程序设计，而无需复杂的DNA抗体偶联，适体的较小空间位阻可有效识别外泌体；(3)PER的结合使信号进一步放大，增强该策略的灵敏度和特异性。
本发明的具体实施过程如下：
实施例1
制备荧光传感器并检测外泌体PD-L1
1.材料与方法
1.1材料
HPLC纯化的寡核酸链，三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP均购自Sangon Biotechnology Co.，Ltd(中国上海)。Klenow Fragment DNA聚合酶购自New England Biolabs Inc.(中国北京)。
1.2检测仪器
通过使用Cary Eclipse荧光分光光度计(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)检测荧光光谱。用Fc-500流式细胞仪(Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，CA)记录细胞的流式细胞术测量。在共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss，Germany)上进行了共聚焦显微镜成像和分层化分析。
1.3检测原理
如图1所示，在均相体系中，外泌体PD-L1与适体结合，导致适体的构象发生变化，暴露出引物序列。引物与发夹结合触发原位级联引物交换反应，生成产物，该产物具有TTTAGGG重复序列域的长分支链，加入硫黄素ThT后即可产生荧光信号。通过对荧光信号的检测即可获知外泌体PD-L1的含量。其中荧光强度通过图像J 7.0量化。
1.4制备与检测
(1)提取外泌体：
利用超速离心法提取血清样本中的外泌体。每个血清样本取1.5mL，加入1.5mLPBS混匀后，低速离心(2000g，30min，4℃)后吸上清；然后再离心10000g，50min，用0.22μm的过滤器滤去上清液，以去除血清中的细胞和凋亡碎片。为了去除蛋白质和较大的细胞外囊泡，再进行高速离心(10,000g，30min，4℃)，用大量PBS洗涤存在离心管底部的外泌体，最后进行高速离心(10,000g，70min，4℃)以获取外泌体沉积物。最后，将沉淀的外泌体重悬在100μLPBS中，并储存在-80℃直至使用。
(2)构建级联PER体系：
根据以下步骤，按照表2、表3、表4分别构建级联PER体系，并将反应体系于37℃反应2h。
(a)适体结合外泌体PD-L1：先将适体AP用TE buffer缓冲液溶解，终浓度为5μM，然后于95℃变性5min，然后置于冰水浴中缓慢退火，然后再加入外泌体PD-L1，共同孵育，温度为37℃，时间为1h，得A-PDL1复合物。
(b)取步骤(a)所得产物A-PDLl复合物，加入发夹，并加入10×NEBuffer3.0缓冲液，以及2μL 20mM三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP，2μL Klenow Fragment DNA聚合酶，孵育，温度为37℃，时间为2h，构建级联引物交换反应(PER)。
(c)将硫磺素ThT溶液加入步骤(b)所得的反应液中，并加入100μL PBS，混合，37℃，避光孵育40min，得荧光检测体系。
本发明中所涉及的核苷酸序列表如表1所示。
表1核苷酸序列表
Figure BDA0003046937920000071
表2 PER体系组成
Figure BDA0003046937920000072
Figure BDA0003046937920000081
表3单支PER体系组成
单支PER体系 40μL
外泌体PD-L1 5μL
适体AP 2μL 5μM
Hairpin A 2μL 5μM
Hairpin B 2μL 5μM
KF DNA聚合酶 2μL 100U
Mg2+溶液 2μL 100mM
10×buffer 2μL
ThT 2μL 100μM
ddH2O 21μL
表4分支PER体系组成
分支PER体系 40μL
外泌体PD-L1 5μL
适体AP 2μL 5μM
Primer2 2μL 5μM
Hairpin A 2μL 5μM
Hairpin B 2μL 5μM
Hairpin C 2μL 5μM
Hairpin D 2μL 5μM
KFDNA聚合酶 2μL 100U
Mg2+溶液 2μL 100mM
10×buffer 2μL
ThT 2μL 100μM
ddH2O 15μL
(3)检测荧光信号：
将上述反应物滴加到玻片上，盖上盖玻片后进行激光共聚焦检测，条件为：激发波长为488nm，发射波长范围为488-800nm。
或者，将上述反应物加至100ul并加入石英比色皿中，利用荧光分光光度计进行测量，具体包括以下步骤：
(1)荧光比色皿清洗：将荧光比色皿用酒精浸泡，并用ddH2O清洗；
(2)设置参数：设置激发波长为445nm，发射波长范围为450-550nm，电压为700V；
(3)调零：向荧光比色皿中加入ddH2O，进行调零；
(4)进行检测：将反应液加入荧光比色皿中，点击检测，即可获得荧光信号。
实施例2
验证检测适体结合的可行性
在适体的引物端修饰FAM基团，发夹A的3’端修饰猝灭BHQ1基团。如图2所示，当存在外泌体和适体时，产生明显的荧光信号(红色曲线)；当存在适体和发夹A时，由于引物端被封闭，适体和发夹A未结合，因此仍旧产生较强的荧光信号(绿色曲线)；当外泌体，适体和发夹A同时存在时，适体与外泌体PD-L1结合后暴露出引物端，从而与发夹A结合，导致荧光信号猝灭(蓝色曲线)。该结果证实了适体与外泌体PD-L1结合且构象发生改变的可行性。
实施例3
验证检测PER体系的可行性
对实施例1中整体检测过程用PAGE电泳进行验证，结果如图3所示，其中
泳道M为20bp DNA Marker；
泳道1为primer 1；
泳道2为primer 2；
泳道3为hairpin A；
泳道4为primer 1和hairpin A；
泳道5为primer 2和hairpin B；
泳道6为单支PER所得的反应产物；
泳道7为分支PER所得的反应产物；
泳道8为分支PER不含primer 1所得的反应产物；
泳道9为分支PER不含primer 2所得的反应产物。
如图3所示，泳道1、2、3、4和5分别对应于primer 1、primer 2和hairpinA，因为primer 1只有9bp，故在泳道中无法显示。通道4表明primer 1+hairpin A复合物的成功构建。泳道5显示primer 2和hairpin C两条条带，说明二者在primer 1不存在的时候无法结合，即只有primer 1存在才能触发PER反应。泳道6显示单支PER。泳道7是分支PER。泳道8、9是分支PER不含primer 1以及分支PER不含primer 2，对比显示只有在primer 1存在的条件下，PER反应才会发生，且分支PER比单支PER产生更大的信号放大。
实施例4
流式验证适体与PD-L1的结合
采用流式细胞术分析适体AP与PD-L1的结合，实验方法为：20μL外泌体与4μL乳胶醛微球在室温下反应15min，加入1mL PBS，在37℃下孵育2h，添加100μL封闭液并孵育30min，6000rpm离心3min，并用PBS洗涤两次，重悬于40μL PBS中；取10μL上述所得溶液，加入20μL 1μM DNA探针，溶于100μL结合缓冲液中，在37℃下孵育1h，而后洗涤两次重悬于100μL结合缓冲液中，进行流式检测。其中，封闭缓冲液为含1M甘氨酸和20％BSA的PBS缓冲液，结合缓冲液为含0.5％BSA的PBS缓冲液。
本实施例设置了四组实验，分别为：
1、空白对照组：不加入任何DNA探针。
2、对照组1：加入的DNA探针为随机序列探针(Random Sequence)，其序列为：
5-ATTACCTCTAAATCACTGCTCTGTAACATGGTCGCGCTAGG-3FAM(SEQ ID NO.8)。
3、对照组2：加入的DNA探针为MJ5C适体，其序列为：
5-TACAGGTTCTGGGGGGTGGGTGGGGAACCTGTT-3FAM(SEQ ID NO.9)。
SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9序列来源于文献：[1]Homogeneous，Low-volume，Efficient and Sensitive Quantitation of Circulating Exosomal PD-L1for CancerDiagnosis and Immunotherapy Response Prediction，Mengjiao Huang，Juanjuan Yang，Angewandte Chemie Intemationa1 Edition，201916039.[2]Homogeneous，Low-volume，Efficient，and Sensitive Quantitation of Circulating Exosomal PD-L1 for CancerDiagnosis and Immunotherapy Response Prediction，Mengjiao Huang，JuanjuanYang.SEQ ID NO.9己报道的外泌体PD-L1的适体序列。
4、实验组：加入的DNA探针为MJ5CP(MJ5C-Primer)适体，即本发明技术方案中用到的适体AP，本文的适体只是比文献中报道的PD-L1适体MJ5C(SEQ ID NO.9)多加了一部分引物序列(SEQ ID NO.10：AACAGGTTCCCC)。
如图4所示，MJ5C适体和加了一段引物序列的MJ5CP适体显示比对照序列具有更高的荧光强度。说明在适体末端加上一段封闭的引物序列不会影响适体MJ5CP适体和PD-L1结合的亲和性。
实施例5
荧光传感器的激光共聚焦检测
按照表5、表3、表4，分别构建Control体系、单支PER体系、分支PER体系，将上述体系分别在37℃温育2h后，取10μL滴加到玻片上并盖上盖玻片，进行共聚焦成像，结果如图5所示。
表2 Control体系组成
Control 40μL
适体AP 2μL 5μM
Primer 2 2μL 5μM
Hairpin A 2μL 5μM
Hairpin B 2μL 5μM
Hairpin C 2μL 5μM
Hairpin D 2μL 5μM
KF DNA聚合酶 2μL 100U
Mg2+ 2μL 100mM
10×buffer 2μL
ThT 2μL 5μM
ddH2O 2μL 5μM
如图5所示，与control体系和单支PER体系相比，分支PER体系的荧光信号更好。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Figure BDA0003046937920000121
Figure BDA0003046937920000131
Figure BDA0003046937920000141
Figure BDA0003046937920000151
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆医科大学
<120> 一种检测外泌体PD-L1的荧光传感器及其制备与应用
<130> PCQYK2110475-HZ
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 适体AP
<400> 1
acaggttctg gggggtgggt ggggaacctg ttaacaggtt cccc 44
<210> 2
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物1
<400> 2
ggttcccc 8
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物2
<400> 3
tcatcttctt cattgaagat gac 23
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 发夹A
<400> 4
ttagggcccg gttttccggg ccctaacggg gaacg 35
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 发夹B
<400> 5
ttagggcccg gttttccggg ccctaaccct aacc 34
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 发夹C
<400> 6
ttagggcccg gttttccggg ccctaacgtc atcttc 36
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 发夹D
<400> 7
ttagggcccg gttttccggg ccctaacggg gaacg 35
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Random Sequence
<400> 8
attacctcta aatcactgct ctgtaacatg gtcgcgctag g 41
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> MJ5C适体
<400> 9
tacaggttct ggggggtggg tggggaacct gtt 33
<210> 10
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 10
<400> 10
aacaggttcc cc 12

Claims (15)

1.一种检测外泌体PD-L1的荧光传感器，其特征在于，所述荧光传感器为单支级联引物交换反应PER体系，包括外泌体PD-L1、信号识别部分和信号转换部分，所述信号识别部分包括能与外泌体PD-L1结合的适体，所述适体上含有一段被封闭的引物序列，外泌体PD-L1与适体结合，使引物暴露；所述信号转换部分为：所述引物与发夹结合触发级联引物交换反应，生成产物，所述产物与硫磺素ThT 结合产生荧光，实现外泌体PD-L1的检测；
所述适体为适体AP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
5'-ACAGGTTCTGGGGGGTGGGTGGGGAACCTGTTAACAGGTTCCCC-3'；
所述适体包含的引物选自引物1或引物2中的至少一种，所述引物1的核苷酸序列如SEQID NO.2所示：5'-GGTTCCCC-3'，所述引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5'-TCATCTTCTTCATTGAAGATGAC-3'；
所述发夹选自发夹A与发夹B；
所述发夹A的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：
5'-TTAGGGCCCGGTTTTCCGGGCCCTAACGGGGAACGInvdT-3'；
所述发夹B的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：
5'-TTAGGGCCCGGTTTTCCGGGCCCTAACCCTAACCInvdT-3'；
所述产物为具有TTTAGGG重复序列域的长分支链。
2.根据权利要求1所述的检测外泌体PD-L1的荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（a）适体结合外泌体PD-L1：将适体AP 与外泌体PD-L1共同孵育，得A-PDL1复合物；
（b）取步骤（a）所得产物A-PDL1复合物，与发夹混合，孵育，构建级联引物交换反应；
（c）将硫磺素ThT溶液加入步骤（b）所得的反应液中，混合、孵育，得荧光检测体系。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：通过超速离心法从血清样本中提取外泌体PD-L1。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述超速离心法为：在血清样本加入PBS缓冲液，先低速离心，吸取上清液，进行第一次高速离心，过滤去除血清中的细胞和凋亡碎片；进行第二次高速离心，去除蛋白质和较大的细胞外囊泡，取沉积物，用PBS洗涤；最后进行第三次高速离心，获取外泌体沉积物。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）、（b）中，适体和发夹的摩尔比为1:1。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）中，适体AP要先进行变性退火，然后再与外泌体共同孵育，适体AP的变性温度为90-100℃，变性时间为5-10min。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）中，适体AP和外泌体的孵育温度为37℃，时间为1-2h。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（b）所需的反应溶液还包括：10× NEBuffer3.0缓冲液、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP， Klenow Fragment DNA聚合酶。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（b）中，孵育温度为37℃，孵育时间为2-3h。
10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（c）中，还需要加入PBS缓冲液。
11.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（c）中，硫磺素ThT溶液由硫磺素ThT加水配制而成，浓度为80-120 mM。
12.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（c）中，孵育温度为37℃，孵育时间为40min。
13.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）、（b）、（c）中，孵育均在避光条件下进行。
14.一种检测外泌体PD-L1的方法，采用权利要求1所述的荧光传感器和/或根据权利要求2-13任一项所述的方法制备得到的荧光传感器。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：采用激光共聚焦成像仪或荧光分光光度计检测荧光信号。
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