CN109750088B - 基于TdT-RCA的传感器及其在DNA甲基转移酶检测中的应用 - Google Patents

基于TdT-RCA的传感器及其在DNA甲基转移酶检测中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109750088B
CN109750088B CN201910222553.4A CN201910222553A CN109750088B CN 109750088 B CN109750088 B CN 109750088B CN 201910222553 A CN201910222553 A CN 201910222553A CN 109750088 B CN109750088 B CN 109750088B
Authority
CN
China
Prior art keywords
reaction
methyltransferase
solution
dam
dam methyltransferase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201910222553.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109750088A (zh
Inventor
颜玉蓉
丁世家
程伟
晏小玉
马洪敏
阙海英
王通
刘萍
甘秀锋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Medical University
Original Assignee
Chongqing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Medical University filed Critical Chongqing Medical University
Priority to CN201910222553.4A priority Critical patent/CN109750088B/zh
Publication of CN109750088A publication Critical patent/CN109750088A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109750088B publication Critical patent/CN109750088B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明提供一种基于TdT‑RCA的传感器及其在DNA甲基转移酶检测中的应用，该传感器包括：Dam甲基转移酶检测探针、哑铃状滚环模板。本发明通过对甲基转移酶作用的底物发夹探针3’末端进行氨基化修饰有效地防止末端转移酶(TdT)激活的非特异性扩增，降低了背景信号，从而极大提高本发明检测方法的特异性；将TdT催化的引物延伸和哑铃状模板介导的滚环扩增(RCA)反应结合，以硫黄素T(ThT)为荧光染料(与反应产物G三链特异结合作为信号输出)无需荧光标记，操作简单，降低了实验成本；能较好区分Dam甲基转移酶和其他甲基转移酶，具有较好的选择性。

Description

基于TdT-RCA的传感器及其在DNA甲基转移酶检测中的应用
技术领域
本发明涉及生物分析技术领域，特别是涉及一种基于TdT-RCA的传感器及其在DNA甲基转移酶检测中的应用。
背景技术
DNA甲基化是一种众所周知的表观遗传事件，在调控基因表达、细胞分化和基因组稳定性方面起着至关重要的作用。通常，DNA甲基化过程通过DNA甲基转移酶进行，其催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)中的甲基基团共价添加到识别序列中的靶腺嘌呤或胞嘧啶残基。异常的DNA甲基转移酶活性可能导致异常的DNA甲基化模式，这与各种遗传疾病和人类恶性肿瘤密切相关。DNA甲基转移酶已成为各种癌症诊断和治疗的潜在生物标志物和治疗靶点。因此，对DNA甲基转移酶活性的敏感和准确评估以及其抑制剂的筛选在临床诊断和治疗中具有重要意义。目前，高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、凝胶电泳和放射性标记测定法等传统方法已被应用于甲基转移酶的检测。然而，这些方法需要放射性试剂，复杂的样品制备和昂贵的仪器，增加了实验成本的同时也增加了实验的复杂程度，且灵敏度低，这些缺点限制了它们在实践中的广泛使用。
为了解决这些问题，近年来，许多研究致力于构建更安全、简便的方法用于DNA甲基转移酶的检测。电化学方法、比色法、荧光测定法具有直观、简便、安全的优点，然而这些方法一般需要繁琐的纳米材料制备，复杂的序列设计，依赖荧光基团和猝灭基团对探针进行标记，分析检测时间长，涉及复杂的序列设计且费用高昂。电化学方法响应速度快，设计成本低，但复杂的电极表面修饰处理限制了它的应用。核酸扩增方法的引入可以极大提高检测灵敏度，然而现有的核酸扩增通常需要核酸内切酶的特异识别序列以及荧光标记的核酸底物，加大了方案设计的难度和实验复杂性。因此，迫切需要开发一种操作简单、无需荧光标记的用于高灵敏检测DNA甲基转移酶的方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测DNA腺嘌呤甲基转移酶的荧光传感器及制备与应用，用于解决现有技术中DNA甲基转移酶的检测所需序列复杂、成本高昂、操作过程繁琐、方案设计的难度大等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种检测Dam甲基转移酶的荧光传感器，包括：Dam甲基转移酶检测探针、哑铃状滚环模板。
可选地，所述Dam甲基转移酶检测探针为具茎环结构的DNA发夹探针，所述DNA发夹探针含5’-G-A-T-C-3’的回文序列，供Dam甲基转移酶特异性识别；所述检测探针3’末端使用氨基修饰。
可选地，所述哑铃状滚环模板由环部包含富T序列及富C序列的DNA发卡探针合成；所述DNA发卡探针5’端进行磷酸化修饰。
可选地，所述Dam甲基转移酶检测探针长度为38nt。
可选地，所述Dam甲基转移酶检测探针含有如SEQ ID NO.1所示序列：
5’-AGAAGGATCTTATCGACTTGCTTAAGATCCTTCTTAAT-NH2-3’(SEQ ID NO.1)，所述检测探针的3’端进行氨基修饰。
可选地，所述用于合成哑铃状滚环模板的DNA发卡探针长度为62nt。
可选地，所述用于合成哑铃状滚环模板的DNA发卡探针含有如SEQ ID NO.2所示序列：
5’-P-ATTCGTAGACCCGCCCTACCCATCAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATACGCT ACGAAT-3’(SEQ ID NO.2)，序列中下划线部分的碱基是指形成发夹后的双链互相杂交的部分。
可选地，所述荧光传感器还包括S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，通常，购买Dam甲基转移酶及其缓冲液时，供应商会随酶提供SAM，SAM的英文名：S-Adenosyl-L-methionine，化学式：C15H23N6O5S，分子量399.44，CAS登录号：29908-03-0。
可选地，所述荧光传感器还包括荧光染料，该荧光染料即为指示剂。
可选地，所述荧光染料选自硫黄素T(ThT)，该染料可与反应后的产物特异结合，硫黄素T CAS号:2390-54-7，分子式:C17H19ClN2S，分子量:318.8642，该染料可以从市场上购买得到。
可选地，所述荧光染料浓度为5μM。
可选地，所述荧光传感器还包括Dam甲基转移酶及其反应缓冲液、依赖甲基化的限制性内切酶DpnI及其反应缓冲液、末端转移酶(TdT)及其反应缓冲液、Phi29DNA聚合酶及其反应缓冲液、脱氧三磷酸腺苷(dATPs)、扩增原料dNTPs，上述各试剂均可从市场上购买得到。
本发明还提供利用上述荧光传感器检测Dam甲基转移酶的方法，包括如下步骤：
(a)将待测样品加入反应溶液I中进行孵育反应，然后进行高温灭活处理；
(b)向步骤(a)高温灭活处理后的溶液中加入反应溶液II，进行末端转移酶催化的聚合反应；
(c)取步骤(b)所得聚合产物，加入反应溶液Ⅲ进行滚环扩增反应；
(d)对步骤(c)反应后的溶液进行荧光检测，实现对待测样品中Dam甲基转移酶的定量分析。
可选地，所述步骤(a)的所述反应溶液I中包括：Dam甲基转移酶反应缓冲液、DpnI反应缓冲液、Dam甲基转移酶检测探针、SAM、DpnI、Dam甲基转移酶。
可选地，所述步骤(a)中，所述待测样品与所述反应溶液I混合后，所得的混合液中包括：1×Dam甲基转移酶反应缓冲液、1×DpnI反应缓冲液、1μM Dam甲基转移酶检测探针、96～192μM SAM、1～6U DpnI、0.1～40U/mLDam甲基转移酶。
可选地，所述步骤(a)中，所述待测样品与所述反应溶液I混合后，所得的混合液中包括：1×Dam甲基转移酶反应缓冲液、1×DpnI反应缓冲液、1μM Dam甲基转移酶检测探针、160～192μM SAM、4～6U DpnI和0.1～40U/mL的Dam甲基转移酶。
可选地，所述步骤(a)中，孵育反应条件为：37℃，孵育时间为1h。
可选地，所述步骤(a)中，高温灭活处理温度为80℃，灭活时间为20min。
可选地，所述步骤(b)中，所述反应溶液II包括：末端转移酶及其反应缓冲液、dATPs。
可选地，所述步骤(b)中，加入所述反应溶液II后，所得的混合液中包括：4～14U末端转移酶、0.5mM dATP、1x末端转移酶反应缓冲液。
可选地，所述步骤(b)中，加入所述反应溶液II后，所得的混合液中包括：10～14U末端转移酶、0.5mM dATP、1x末端转移酶反应缓冲液。
可选地，所述步骤(b)中，孵育反应条件为：37℃，孵育时间为40min。
可选地，所述步骤(b)中，高温灭活处理温度为75℃，灭活时间为10min。
可选地，所述步骤(c)中，所述反应溶液Ⅲ包括dNTPs、Phi29DNA聚合酶及其反应缓冲液、滚环模板、硫黄素T
可选地，所述步骤(c)中，加入所述反应溶液Ⅲ后，所得的混合液中包括：1.7mMdNTPs、4～14UPhi29DNA聚合酶、0.5μM滚环模板、5μM硫黄素T、1x Phi29DNA聚合酶缓冲液。
可选地，所述步骤(c)中，加入所述反应溶液Ⅲ后，所得的混合液中包括：1.7mMdNTPs、10～14UPhi29DNA聚合酶、0.5μM滚环模板、5μM硫黄素T、1x Phi29DNA聚合酶缓冲液。
可选地，所述步骤(c)中，孵育反应条件为：30℃，避光孵育时间为1h。
上述的缓冲液，所有原始浓度的缓冲液均为10x缓冲液，加到反应体系时需要将其变成1x缓冲液，例如，反应溶液I总体积是20微升，那我们就需要加入2微升的10x的Dam甲基转移酶缓冲液(加入后终浓度变成1x)，所有试剂加完后，用双蒸馏水补足至20微升。其他反应缓冲液的稀释方法与此类似。
上述各反应溶液中各试剂的浓度均为终浓度。
本发明还提供上述荧光传感器在Dam甲基转移酶检测中的应用。
如上所述，本发明的一种检测DNA腺嘌呤甲基转移酶的荧光传感器及制备与应用，至少具有以下有益效果：
(1)本发明将末端转移酶(TDT)催化的引物延伸和哑铃状模板介导的滚环反应结合，可极大提高反应的灵敏度；
(2)本发明以硫黄素T(ThT)为荧光染料，与反应产物G三链的特异结合可极大提高荧光信号，操作简单，降低了实验成本；
(3)本发明能较好区分Dam甲基转移酶和其他甲基转移酶，具有较好的选择性。
附图说明
图1为本发明的原理图。
图2为本发明实施例中加Dam甲基转移酶、不加DpnI、不加SAM、空白的荧光信号对比图。
图3为本发明实施例的体系中不同反应混合液及哑铃状滚环模板制备的电泳验证图。
图4为本发明实施例的反应体系中加入不同浓度DpnI的荧光传感器响应信号结果图。
图5为本发明实施例的反应体系中加入不同浓度SAM的荧光传感器响应信号结果图。
图6为本发明实施例的反应体系中加入不同浓度TdT的荧光传感器响应信号结果图。
图7为本发明实施例的反应体系中加入不同浓度phi29DNA聚合酶的荧光传感器响应信号结果图。
图8-a为本发明实施例中检测6个不同浓度(40U/mL,20U/mL,10U/mL,5U/mL,1U/mL,0.5U/mL,0.1U/mL,0U/mL)Dam甲基转移酶溶液所得荧光传感器响应信号图。
图8-b为本发明实施例中Dam甲基转移酶浓度在0.1～40U/mL范围内的荧光强度与其浓度的对数之间的线性相关性。
图9为本发明制备的荧光传感器的特异性分析实验结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明是基于末端转移酶(TdT)介导的滚环扩增(RCA)用于无标记检测DNA甲基转移酶的荧光方法。
本发明设计了一种含有5’-G-A-T-C-3’回文序列的DNA发夹探针作为Dam甲基转移酶的检测探针。为了防止TdT激活的非特异性扩增，对DNA发夹探针的3’末端进行氨基修饰。当体系中存在Dam甲基转移酶时，DNA发夹探针茎部的5’-G-A-T-C-3’序列被甲基化，得到5’-G-mA-T-C-3’。甲基化的DNA发夹探针随后被甲基化依赖性的限制性核酸内切酶DpnI剪切，释放三个DNA单链片段，其中两条DNA链含有游离的3’-OH末端。
末端转移酶(TdT)催化三磷酸脱氧腺苷(dATPs)加入到单链DNA的游离3’-OH末端以得到富A序列。含有富A序列的DNA片段与所述滚环模板环部上的富T序列杂交结合，作为引物触发滚环扩增反应，合成大量富含G序列的片段与染料ThT结合产生荧光信号，不同数量的富G序列与ThT结合，产生不同的荧光值。而在没有Dam甲基转移酶的情况下，末端转移酶(TdT)介导的延伸和后续的滚环扩增反应均不能启动，无明显的荧光信号产生。
本发明荧光传感器的制备包括Dam甲基转移酶检测探针的制备和滚环模板的合成，结合末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化反应和滚环扩增实现信号放大的方法，合成大量富含G序列的结构，与染料特异性结合产生荧光信号，根据荧光信号与待测物浓度之间的线性关系，无需荧光标记即可实现对Dam甲基转移酶的高灵敏检测。本发明构建的荧光传感器制备及检测方法简便、无需荧光标记，有效防止非特异性反应的发生，稳定性和重现性良好，有望在Dam甲基转移酶的检测分析及应用研究方面推广使用。
实施例1制备用于检测Dam甲基转移酶的荧光传感器
1.材料与方法
1.1材料
HPLC纯化的DNA探针序列由上海生工生物工程有限公司合成。Dam甲基转移酶及其反应缓冲液(货号：#M0222S，购买的试剂中，随酶提供SAM)、限制性核酸内切酶DpnI及其反应缓冲液(货号：#R0176S)、AluI甲基转移酶(货号：#M0220S)及其反应缓冲液、Hhal甲基转移酶及其反应缓冲液(货号：#M0217S)、末端转移酶(TdT)及其反应缓冲液(货号：M0315S)均购自New England Biolabs公司。Phi29DNA聚合酶及其反应缓冲液(货号：B600060)、T4DNA连接酶及其反应缓冲液(货号：B600511)、脱氧三磷酸腺苷dATPs(货号：A620046)、dNTPs(货号：A610056)、硫黄素T(ThT)(货号：A606360)均购自上海生工生物工程有限公司。DNAmarker(货号：#3420A)购自大连Takara公司。
本实施例中的室温均指23±2℃。
1.2检测仪器
Cary Eclipse荧光分光光度计为安捷伦公司产品。
1.3检测原理
本实施例所提出的Dam甲基转移酶检测原理如图1所示。体系中有两种DNA探针(茎中含有5’-GATC-3’回文序列的Dam甲基转移酶检测探针和含有富T及富C序列的哑铃状滚环模板)。此外，用NH2修饰检测探针的3’末端以防止末端转移酶(TdT)激活的非特异性扩增。当体系中存在Dam甲基转移酶时，检测探针茎部的5’-G-A-T-C-3’序列被甲基化，得到5’-G-mA-T-C-3’。甲基化的DNA检测探针随后被甲基化依赖性的限制性核酸内切酶DpnI剪切，释放三个DNA单链片段，其中两条DNA链含有游离的3’-OH末端。末端转移酶(TdT)催化三磷酸脱氧腺苷(dATPs)加入到单链DNA的游离3’-OH末端以得到富A序列。含有富A序列的DNA片段与所述滚环模板环部上的富T序列杂交结合，作为引物触发滚环扩增反应，合成大量富含G序列的片段与染料结合产生荧光信号，不同数量的富G序列与荧光染料硫黄素(ThT)结合，产生不同的荧光值。而在没有Dam甲基转移酶的情况下，末端转移酶(TdT)介导的延伸和后续的滚环扩增反应均不能启动，无明显的荧光信号产生。
1.4 Dam甲基转移酶检测探针和哑铃状滚环模板的制备
将Dam甲基转移酶检测探针(10μM)在95℃变性5分钟，然后缓慢冷却至室温，以确保发夹结构的形成，-20℃冻存备用。所述Dam甲基转移酶检测探针的碱基序列为：5’-AGAAGGATCTTATCGACTTGCTTAAGATCCTTCTTAAT-NH2-3’。
将5’磷酸化的用于合成哑铃状滚环模板的DNA探针(序列为5’-P-ATTCGTAGACCCGCCCTACCCATCAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATACGCTACGAAT-3’)5μL(100μM)，10μL 10×T4DNA连接酶反应缓冲液和85μL H2O混合后，在95℃变性5分钟，然后缓慢冷却至室温以确保探针折叠成发夹结构。随后，将6μL T4DNA连接酶(5U/μL)加入上述反应混合物中，16℃孵育7小时，65℃灭活10分钟，得到5μM哑铃状滚环模板，-20℃冻存备用。
1.5 Dam甲基转移酶的检测
配制体积为20μL的甲基化反应溶液，其中含有1×Dam甲基转移酶反应缓冲液、1×DpnI反应缓冲液、1μM Dam甲基转移酶检测探针、160μM SAM、4U DpnI和0.1～40U/mL的Dam甲基转移酶，37℃孵育1h后，在80℃下加热20分钟终止反应。然后，将上述溶液加入TdT延伸反应体系中，得到的反应混合液中包含1×TdT缓冲液、0.5mM dATP和10U TdT，反应混合液体积为40μL，在37℃下孵育40分钟，75℃灭活10分钟。在上述溶液中加入滚环扩增反应体系，得到100μL反应混合液，该反应混合液中包含0.5μM哑铃状滚环模板、1.7mM dNTP、5μMThT、10U phi29DNA聚合酶以及1×phi29DNA聚合酶反应缓冲液，混合液体积为100μL，于30℃反应60分钟后进行荧光检测。激发波长为435nm，激发和发射的狭缝宽度为5nm，荧光发射光谱范围在450-600nm。采用490nm处测量的荧光强度用于评估该传感器的性能。
1.6凝胶电泳分析
室温下，在1×TBE缓冲液(89mM硼酸,89mM Tris,2mM EDTA,pH 8.3)中，以110V恒定电压进行12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)40分钟，然后用GV染料进行凝胶染色30分钟，最后进行成像分析。
1.7 Dam甲基转移酶检测特异性分析
选择40U/mL Hhal甲基转移酶和AluI甲基转移酶作为潜在的干扰酶，用上述相同方法进行特异性分析实验。
实施例2验证检测Dam甲基转移酶的荧光传感器的可行性
1.本实施例检测Dam甲基转移酶的传感器的可行性，首先设置对照试验通过荧光测量得以验证。
如图2所示，曲线a-d是指在含1μM甲基转移酶检测探针的1×Dam甲基转移酶反应缓冲液中分别加入：(a)40U/mLDam甲基转移酶,160μMSAM,4UDpnI；(b)40U/mLDam甲基转移酶,160μMSAM；(c)40U/mLDam甲基转移酶,4UDpnI；(d)160μM SAM,4UDpnI。没有限制性内切酶DpnI或Dam甲基转移酶的对照组(曲线b和d)荧光信号非常弱，低背景信号的实现是由于用NH2对Dam甲基转移酶检测探针的3’末端进行了修饰，有效地防止了末端转移酶(TdT)引起的非特异性延伸。并且，缺少了SAM的反应液荧光强度也较弱(曲线c)。相反，在将Dam甲基转移酶和SAM一起加入溶液后，DpnI的存在引起增强的荧光信号(曲线a)，表明甲基化和切割反应的发生，且释放出的单链DNA引发了后续末端转移酶(TdT)催化的延伸，进而触发了滚环扩增反应。
2.用聚丙烯酰胺凝胶电泳验证Dam甲基转移酶的甲基化和DpnI的剪切过程。
如图3所示，在没有Dam甲基转移酶或DpnI的情况下，仅观察到与泳道2处于相同位置的条带(泳道3和4)，表明检测探针未被剪切。然而，在Dam甲基转移酶和DpnI同时存在时，由于发生了甲基化和剪切反应，泳道5可观察到新的条带产生。甲基化反应后，TdT可催化裂解的DNA片段的聚合，得到迁移率较低的含富A的DNA序列(泳道6)。与泳道7中的只含未连接的DNA发卡探针的条带相比，在泳道8中观察到新的具有较低迁移率的条带，其表明哑铃状滚环模板的成功连接。另外，泳道10为加入了Dam甲基转移酶作为阳性对照的实验组，可明显看到孔中保留了高密度条带，证明了具有大分子量的滚环扩增产物的产生，而未加Dam甲基转移酶的阴性对照组(泳道9)则只观察到相应位置的Dam甲基转移酶检测探针以及哑铃状滚环模板的条带，没有滚环产物的产生。
实施例3制备的检测Dam甲基转移酶的荧光传感器及其实验条件研究
为了获得所构建荧光传感器的最佳分析性能，探索了相应的实验条件，例如限制性内切酶DpnI、末端转移酶(TdT)、phi29DNA聚合酶的量以及SAM浓度。F-F0值(F为Dam甲基转移酶存在时的荧光信号，而F0是Dam甲基转移酶不存在时的荧光信号)用于评估该荧光传感器的性能。
1.为考察DpnI浓度对制备的检测Dam甲基转移酶的荧光传感器的影响，本实验采用了含不同DpnI浓度(体系中加入DpnI的总量分别为1U,2U,3U,4U,5U,6U)的反应体系，然后进行荧光强度检测，结果见图4。随着DpnI浓度的增加，荧光强度逐渐增加，并且在4U时趋于稳定。因此，选择4U的DpnI用于后面的实验。
2.为考察SAM浓度对制备的检测Dam甲基转移酶的荧光传感器的影响，本实验采用了含不同SAM浓度(96,112,128,144,160,176,192μM)的反应体系，然后进行荧光强度检测，结果见图5。通过比较不同浓度的SAM获得的荧光强度，SAM的浓度优选为160μM。
3.为考察TdT浓度对制备的检测Dam甲基转移酶的荧光传感器的影响，本实验采用了含不同TdT浓度(4,6,8,10,12,14U)的反应体系，然后进行荧光强度检测，结果见图6。结果表明，10U的TdT可以达到最佳荧光信号。
4.为考察phi29DNA聚合酶浓度对制备的检测Dam甲基转移酶的荧光传感器的影响，本实验采用了含不同phi29DNA聚合酶浓度(4,6,8,10,12,14U)的反应体系，然后进行荧光强度检测，结果见图7。荧光信号在10U时趋于稳定，因此选择10U作为最佳的phi29DNA聚合酶含量。
实施例4制备的检测Dam甲基转移酶的荧光传感器的性能分析
在最佳实验条件下，探索了所提出的荧光传感器检测的动态范围和灵敏度。
随着Dam甲基转移酶浓度从0U/mL增加到40U/mL(曲线a–h分别对应40,20,10,5,1,0.5,0.1,0U/mL)，生物传感系统的荧光强度也逐渐增加(图8-a)，因为有更多的检测探针被甲基转移酶甲基化，然后DpnI剪切甲基化的检测探针从而产生更多的末端含有3’-OH的DNA裂解片段，继而TdT可以催化裂解的DNA片段进行聚合反应以获得富A序列来触发滚环扩增反应，滚环产物的增加导致传感系统的荧光信号明显增加。在Dam甲基转移酶浓度范围为0.1U/mL至40U/mL时，荧光强度F(490nm处)与Dam甲基转移酶浓度的对数值(lg C)有良好的线性相关关系(图8-b)。相应的线性方程为F＝282.35+221.37lg C，相关系数为0.9915。根据空白信号加上三倍标准偏差所对应的信号值估计检测限，计算出的检测限为0.058U/mL。灵敏度的提高可归因于以下三个因素：(1)对Dam甲基转移酶检测探针的3’末端进行的NH2修饰有效防止了TdT激活的非特异性扩增；(2)末端转移酶(TdT)的特性是仅在DNA含有游离的3’-OH末端的情况下才催化聚合反应的发生，极大降低了背景信号；(3)TdT聚合产物作为滚环扩增的引物触发滚环扩增反应，双重扩增反应极大增强了荧光强度。
实施例5制备的检测Dam甲基转移酶的荧光传感器的特异性分析
为了研究所构建荧光传感器的选择性，将AluI甲基转移酶和Hha甲基转移酶作为潜在干扰进行了特异性实验，分别采用如实施例1的方法进行。
结果如图9所示，加入了Dam甲基转移酶的实验组观察到显著的增强的荧光信号，而加入AluI甲基转移酶或Hhal甲基转移酶的对照组荧光信号接近于空白对照组，这些结果说明制备的荧光传感器可以有效地将Dam甲基转移酶其他种类的甲基转移酶区分开来。良好的特异性可能源于Dam甲基转移酶和DpnI与其作用底物是序列特异性的。
实施例6制备的检测Dam甲基转移酶的荧光传感器的重现性分析
在最优实验条件下，用构建的荧光传感器对10U和40U两个浓度的Dam甲基转移酶进行检测，重复进行三次平行实验，变异系数分别为5.4％和7.4％，表明本发明所构建的荧光传感器具有令人满意的重现性。
相对于现有技术，本发明至少具有如下有益效果：
1.实验成本更低：现有技术中使用的其中一条探针需要同时修饰“无碱基”位点和氨基，探针修饰费用高；本发明采用的硫黄素比SYBR gold等其他荧光染料更加便宜；
2.本发明的反应时间只需3h10min，而现有技术所需时间长达4h以上；
3.现有技术中，SYBR gold可以和双链结合，其反应体系中，初始存在发夹探针，带有部分双链结构，进而会存在背景信号。
综上所述，本发明通过对甲基转移酶作用的底物发夹探针3’末端进行氨基化修饰有效地防止末端转移酶(TdT)激活的非特异性扩增，降低了背景信号，从而极大提高本发明检测方法的特异性；将TdT催化的引物延伸和哑铃状模板介导的滚环扩增(RCA)反应结合，以硫黄素T(ThT)为荧光染料(与反应产物G三链特异结合作为信号输出)无需荧光标记，操作简单，降低了实验成本；能较好区分Dam甲基转移酶和其他甲基转移酶，具有较好的选择性。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆医科大学
<120> 基于TdT-RCA的传感器及其在DNA甲基转移酶检测中的应用
<130> PCQYK193253
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Dam甲基转移酶检测探针
<400> 1
agaaggatct tatcgacttg cttaagatcc ttcttaat 38
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 用于合成哑铃状滚环模板的DNA发卡探针
<400> 2
attcgtagac ccgccctacc catcagcttt tttttttttt ttttttttca tacgctacga 60
at 62

Claims (12)

1.一种检测Dam甲基转移酶的荧光传感器，其特征在于，包括：反应溶液I、反应溶液II和反应溶液III；
所述反应溶液I包括：Dam甲基转移酶反应缓冲液、DpnI反应缓冲液、Dam甲基转移酶检测探针、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、DpnI、Dam甲基转移酶；
所述反应溶液II包括：末端转移酶及其反应缓冲液、dATP；
所述反应溶液III包括：dNTPs、Phi29DNA聚合酶及其反应缓冲液、哑铃状滚环模板、硫黄素T；
所述Dam甲基转移酶检测探针为具茎环结构的长度为38nt的第一DNA发夹探针，所述第一DNA发夹探针的茎部含5’-G-A-T-C-3’的回文序列，供Dam甲基转移酶特异性识别；所述检测探针3’末端使用氨基修饰；所述Dam甲基转移酶检测探针的序列如SEQ ID NO.1所示：
5’-AGAAGGATCTTATCGACTTGCTTAAGATCCTTCTTAAT-NH2-3’(SEQ ID NO.1)；
所述哑铃状滚环模板由环部包含富T序列及富C序列的第二DNA发卡探针折叠成发夹结构，随后采用T4 DNA连接酶连接而成；所述第二DNA发卡探针5’端进行磷酸化修饰；所述第二DNA发卡探针长度为62nt，所述第二DNA发卡探针的序列如SEQ ID NO.2所示：
5’-P-ATTCGTAGACCCGCCCTACCCATCAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATACGCTACGAAT -3’(SEQ ID NO.2)。
2.利用权利要求1所述荧光传感器检测Dam甲基转移酶的方法，其特征在于：
包括如下步骤：
(a)将待测样品加入反应溶液I中进行孵育反应，然后进行高温灭活处理；
(b)向步骤(a)高温灭活处理后的溶液中加入反应溶液II，进行末端转移酶催化的聚合反应；
(c)取步骤(b)所得聚合产物，加入反应溶液Ⅲ进行滚环扩增反应；
(d)对步骤(c)反应后的溶液进行荧光检测，实现对待测样品中Dam甲基转移酶的定量分析；
所述方法为非疾病诊断与治疗方法。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述待测样品与所述反应溶液I混合后，所得的混合液中包括：1×Dam甲基转移酶反应缓冲液、1×DpnI反应缓冲液、1μM Dam甲基转移酶检测探针、96～192μM SAM、1～6U DpnI、0.1～40U/mL Dam甲基转移酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述待测样品与所述反应溶液I混合后，所得的混合液中包括：1×Dam 甲基转移酶反应缓冲液、1×DpnI 反应缓冲液、1μM Dam 甲基转移酶检测探针、160～192μM SAM、4～6U DpnI和0.1～40U/mL的Dam甲基转移酶。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，孵育反应条件为：37℃，孵育时间为1h。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，高温灭活处理温度为80℃，灭活时间为20min。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，加入所述反应溶液II后，所得的混合液中包括：4～14U末端转移酶、0.5mM dATP、1x末端转移酶反应缓冲液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，加入所述反应溶液II后，所得的混合液中包括：10～14U末端转移酶、0.5mM dATP、1x末端转移酶反应缓冲液。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，聚合反应条件为：37℃，40min。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，聚合反应后还包括高温灭活步骤，条件为75℃，10min。
11.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，加入所述反应溶液Ⅲ后，所得的混合液中包括：1.7mM dNTPs、4～14U Phi29 DNA聚合酶、0.5μM哑铃状滚环模板、5μM硫黄素T、1xPhi29 DNA聚合酶缓冲液。
12.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，反应条件为：30℃，避光，1h。
CN201910222553.4A 2019-03-22 2019-03-22 基于TdT-RCA的传感器及其在DNA甲基转移酶检测中的应用 Expired - Fee Related CN109750088B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910222553.4A CN109750088B (zh) 2019-03-22 2019-03-22 基于TdT-RCA的传感器及其在DNA甲基转移酶检测中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910222553.4A CN109750088B (zh) 2019-03-22 2019-03-22 基于TdT-RCA的传感器及其在DNA甲基转移酶检测中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109750088A CN109750088A (zh) 2019-05-14
CN109750088B true CN109750088B (zh) 2022-06-21

Family

ID=66409181

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910222553.4A Expired - Fee Related CN109750088B (zh) 2019-03-22 2019-03-22 基于TdT-RCA的传感器及其在DNA甲基转移酶检测中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109750088B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110609020B (zh) * 2019-08-15 2021-10-01 济南大学 基于回文分子信标检测atp的生物传感器及其制备方法和应用
CN111893214B (zh) * 2020-07-08 2023-03-28 重庆医科大学 双模板多循环g-三联体机器及其在hiv检测中的应用
CN112094889A (zh) * 2020-08-31 2020-12-18 山东师范大学 化学发光传感器及检测细菌或人类甲基转移酶中的应用
CN113088558B (zh) * 2021-04-15 2023-10-13 重庆医科大学 一种检测dna甲基化转移酶的荧光生物传感器及其制备与应用
CN113156122B (zh) * 2021-04-29 2023-07-04 重庆医科大学 一种检测外泌体pd-l1的荧光传感器及其制备与应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103710453A (zh) * 2013-12-30 2014-04-09 深圳先进技术研究院 一种基于化学发光反应的甲基化酶检测探针、检测试剂盒及检测方法
CN107151694B (zh) * 2016-09-30 2020-05-12 山东大学 环介导的级联放大策略用于高灵敏检测dna甲基转移酶活性
EP3574109B1 (en) * 2017-01-24 2023-07-26 Vastogen, Inc. Methods for constructing copies of nucleic acid molecules
CN107760762B (zh) * 2017-09-30 2020-05-08 山东师范大学 一种检测dna腺嘌呤甲基转移酶的荧光化学传感器及其检测方法
CN112575067B (zh) * 2020-12-15 2023-03-28 南京师范大学 一种dna连接反应与滚环扩增联用的生物传感器检测结构特异性核酸酶fen1的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN109750088A (zh) 2019-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109750088B (zh) 基于TdT-RCA的传感器及其在DNA甲基转移酶检测中的应用
CN107760762B (zh) 一种检测dna腺嘌呤甲基转移酶的荧光化学传感器及其检测方法
CN110878343B (zh) 一种用于遗传性耳聋致病基因SLC26A4突变快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法
JP6126381B2 (ja) 標的核酸の検出方法及びキット
CN107937482A (zh) 一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法
CN105136882A (zh) 基于dna模拟酶诱导苯胺聚合的电化学检测dna甲基转移酶活性的检测方法
Chen et al. Intracellular self-enhanced rolling circle amplification to image specific miRNAs within tumor cells
EP3378948B1 (en) Method for quantifying target nucleic acid and kit therefor
Pu et al. XNA probe and CRISPR/Cas12a-powered flexible fluorescent and electrochemical dual-mode biosensor for sensitive detection of m6A site-specific RNA modification
Joo et al. Highly selective FRET-aided single-molecule counting of microRNAs labeled by splinted ligation
CN113795591A (zh) 表征肿瘤并且识别肿瘤异质性的方法和系统
CN114507706B (zh) 基于酶dna修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用
CN114381498A (zh) 一种基于协同原位组装G-四链体DNAzyme纳米线的化学发光传感器及其应用
CN109415759B (zh) 用于产生dna探针的方法以及使用dna探针分析基因组dna的方法
Liu et al. A sensitive isothermal fluorescence biosensor for microRNA detection coupling primer exchange reaction with catalytic hairpin assembly
CN114480613B (zh) 一种MazF介导的FTO酶的检测方法及抑制剂筛选方法
Alom et al. Unnatural nucleotide-based rkDNA probe combined with graphene oxide for detection of alkaline phosphatase activity
US20110269137A1 (en) Rapid and efficient assay to assess the sequence and size of 3&#39; ends of polynucleotides
WO2023135998A1 (ja) 構造多型変異検出法
CN112608913B (zh) 一种基于C2c2的基因表达调控系统及其应用
KR102197368B1 (ko) Risc를 이용한 폴리뉴클레오타이드의 검출방법
KR100825154B1 (ko) 모세관 전기영동-단일쇄 형태변환 다형성을 이용한 세포내ｍＲＮＡ 정량 방법
Pu et al. Xeno nucleic acid probes mediated methylation-specific PCR for single-base resolution analysis of N 6-methyladenosine in RNAs
Jyothy et al. REAL-TIME PCR OR QUANTITATIVE PCR (QPCR)–A REVOLUTION IN MODERN SCIENCE
JP2023103945A (ja) 構造多型変異検出法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20220621

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee