CN114381498A - 一种基于协同原位组装G-四链体DNAzyme纳米线的化学发光传感器及其应用 - Google Patents
一种基于协同原位组装G-四链体DNAzyme纳米线的化学发光传感器及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114381498A CN114381498A CN202111470190.XA CN202111470190A CN114381498A CN 114381498 A CN114381498 A CN 114381498A CN 202111470190 A CN202111470190 A CN 202111470190A CN 114381498 A CN114381498 A CN 114381498A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- cells
- cpg methylation
- methylation
- functional
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091027757 Deoxyribozyme Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 108091081406 G-quadruplex Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 239000002070 nanowire Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 101
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 101
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 47
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 105
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 66
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 19
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 claims description 18
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 12
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 claims description 10
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 9
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 4
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 17
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 26
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 22
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 21
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 108050002584 Septin 9 Proteins 0.000 description 14
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 9
- 102000012060 Septin 9 Human genes 0.000 description 9
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 6
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 6
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 5
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 5
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 3
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- RLLPVAHGXHCWKJ-IEBWSBKVSA-N (3-phenoxyphenyl)methyl (1s,3s)-3-(2,2-dichloroethenyl)-2,2-dimethylcyclopropane-1-carboxylate Chemical compound CC1(C)[C@H](C=C(Cl)Cl)[C@@H]1C(=O)OCC1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 RLLPVAHGXHCWKJ-IEBWSBKVSA-N 0.000 description 2
- HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 1-methylcytosine Chemical compound CN1C=CC(N)=NC1=O HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 2
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 2
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 2
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- -1 dTTPs Proteins 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 150000002736 metal compounds Chemical class 0.000 description 2
- 102000031635 methyl-CpG binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091009877 methyl-CpG binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150106774 9 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000008304 DNA mechanism Effects 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000000089 atomic force micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000104 diagnostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000009162 epigenetic therapy Methods 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- QYFRTHZXAGSYGT-UHFFFAOYSA-L hexaaluminum dipotassium dioxosilane oxygen(2-) difluoride hydrate Chemical compound O.[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[F-].[F-].[Al+3].[Al+3].[Al+3].[Al+3].[Al+3].[Al+3].[K+].[K+].O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O QYFRTHZXAGSYGT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000001426 native polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000005820 transferase reaction Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种基于协同原位组装G‑四链体DNAzyme纳米线的化学发光传感器及其应用,属于生物分析及化学发光检测技术领域。所述化学发光传感器至少包括三个功能性发夹探针,甲基定向内切酶GlaI和末端脱氧核苷酸转移酶TdT。本发明设计的G‑四链体DNAzyme纳米线的协同原位组装,用于人类基因组中CpG甲基化的一步检测。具有操作简单、成本低、灵敏度高、特异性好、可靠性高、通用性广等显著特点,为生物医学研究、分子诊断和表观遗传学治疗提供了一种新的检测CpG甲基化的方法,因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于生物分析及化学发光检测技术领域,具体涉及一种基于协同原位组装G-四链体DNAzyme纳米线的化学发光传感器及其应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
DNA甲基化主要发生在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)区域中胞嘧啶的5位,并且它在每个分支的各种生物过程中都发挥着调节作用。异常的CpG甲基化模式可能诱发多种细胞功能的反常,导致许多人类肿瘤的发生和发展。肿瘤抑制基因中的CpG高甲基化与肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、头颈癌相关,并与其他肿瘤的潜在转移相关,而癌基因中的CpG低甲基化与胰腺癌、宫颈癌、子宫癌、肾癌、胃癌、结肠癌、肝癌和肺癌相关。因此,作为一种新的诊断生物标记物和一种新的药理学靶点,准确、灵敏地检测人类基因组中特定位点的CpG甲基化对于生物医学研究、分子诊断和表观遗传学治疗至关重要。
CpG甲基化分析的传统技术根据不同的甲基化鉴别机制进行分类,包括亚硫酸氢盐转化法,甲基化DNA免疫沉淀法和和甲基化敏感限制性内切酶(MSRE)分析法。基于亚硫酸氢盐转化的方法被视为经典的“黄金标准”,它可以将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶,但保持甲基化胞嘧啶不变。基于这种识别机制,已经开发了许多检测DNA甲基化的技术,包括聚合酶链反应(PCR)、高通量DNA测序、限制性标记基因组扫描和微阵列。尽管这些方法应用十分广泛,但其样品制备步骤繁多,分析时间长,成本高,操作程序复杂。此外,亚硫酸氢盐处理可能会导致DNA损伤、DNA丢失和不完全转化,从而导致批次间的不一致。基于免疫的方法需要依赖于用抗体、甲基-CpG结合蛋白以及金属化合物来标记甲基胞嘧啶。尽管这些方法适用于批量分析,但是它们需要大量的样品、费力的抗体制备和昂贵的标记。此外,令人不满意的灵敏度使得无法确定基因组DNA中的甲基化位点。基于MSRE的方法依赖于非甲基化胞嘧啶位点的特异性切割和之后的未切割甲基化DNA的检测,它们可以在温和条件下进行,并且操作简单快速。然而,所有的MSRE方法都是非甲基化依赖性的,即使是微不足道的未甲基化DNA没有切割也可能会导致显著的假阳性,因此该方法不适合用来定量检测低丰度甲基化。因此,一种简单、快速、可靠的CpG甲基化的特异性位点检测方法应该消除亚硫酸氢盐处理、成本标记和背景高的缺点。
发明内容
针对现有技术中的不足,本发明提供一种基于协同原位组装G-四链体DNAzyme纳米线的化学发光传感器及其在CpG甲基化检测中的应用。本发明设计的G-四链体DNAzyme纳米线的协同原位组装,用于人类基因组中CpG甲基化的一步检测。在基因组CpG甲基化存在的情况下,CpG位点的5-mCs被一种新的甲基定向内切酶GlaI特异性切割,该酶通过TMSD级联反应来启动功能性发夹的无酶协同原位自主交叉开放,以产生聚合物DNA纳米线来产生放大的化学发光信号。该纳米装置显示出良好的特异性和高灵敏度。此外,该纳米装置可以在过量的未甲基化DNA中区分出0.001%的CpG甲基化水平,量化人类癌细胞不同目标基因组区域的CpG甲基化水平,甚至可以区分肺肿瘤和正常肺的组织中CpG甲基化的表达。同时,本发明设计的纳米器件可以在2小时内以无标记的方式一步等温完成,而无需传统甲基化分析中的任何亚硫酸氢盐转换、荧光标记和PCR扩增过程。该纳米器件具有操作简单、成本低、灵敏度高、特异性好、可靠性高、通用性广等显著特点,为生物医学研究、分子诊断和表观遗传学治疗提供了一种新的检测CpG甲基化的方法,因此具有良好的实际应用价值。
为实现上述技术目的,本发明的技术方案如下:
本发明的第一个方面,提供一种基于协同原位组装G-四链体DNAzyme纳米线的化学发光传感器,所述化学发光传感器至少包括三个功能性发夹探针,甲基定向内切酶GlaI和末端脱氧核苷酸转移酶TdT;
其中,第一功能性发夹探针由聚腺嘌呤(A)环和具有突出3′-NH2末端的茎组成;
所述第二功能性发夹探针和第三功能性发夹探针均由四个结构域组成;
加入poly-T序列后,第一功能性发夹探针被展开,通过趾端介导的链置换(TMSD)级联反应来启动第二功能性发夹探针和第三功能性发夹探针的自主交叉开放,产生G-四链体DNAzyme纳米线,从而实现了CpG甲基化的无酶原位放大传感;
进一步的,所述第二功能性发夹探针和第三功能性发夹探针3′-末端修饰有胺(NH2)基团;
具体的,
所述第一功能性发夹探针具有SEQ ID NO.1所示的序列;
所述第二功能性发夹探针具有SEQ ID NO.2所示的序列;
所述第三功能性发夹探针具有SEQ ID NO.3所示的序列;
所述甲基定向内切酶GlaI用于特异性地识别和切割序列5'-GmCGmC-3'/3'-mCGmCG-5'中的甲基化胞嘧啶(即5-mC);
所述末端脱氧核苷酸转移酶TdT用于修复5-mCs切割产生的切口,以产生单链DNA链,该链将作为无酶DNAzyme扩增的启动子。
所述化学发光传感器还包括血红素、鲁米诺和双氧水。辅因子血红素与G-四链体DNAzyme纳米线相结合获得血红素/G-四链体DNAzyme纳米线,催化双氧水介导鲁米诺氧化产生增强的化学发光信号。
本发明的第二个方面,提供上述化学发光传感器在检测DNA甲基化中的应用。
具体的,所述DNA甲基化为CpG甲基化。
本发明的第三个方面,提供一种检测DNA甲基化的方法,所述方法包括采用上述化学发光传感器进行检测。
本发明的第四个方面,提供上述生物传感器和/或检测方法在CpG甲基化相关药物筛选和/或生物样品CpG甲基化分析中的应用。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果:
(1)巧妙地设计探针
在所提出的用于原位CpG甲基化分析的自组装纳米器件中,巧妙地设计了三个功能性发夹(即发夹1、2和3)。在加入poly-T序列后,发夹1将被展开,通过趾端介导的链置换(TMSD)级联反应来启动功能发夹2和3的自主交叉开放,产生由血红素/G-四链体DNAzyme结构组成的聚合物DNA纳米线。功能性发夹的自主交叉开放产生的G-四链体DNAzyme纳米线,实现了CpG甲基化的无酶原位放大传感。
(2)良好的特异性和高灵敏度
该纳米器件具有良好的特异性和高灵敏度,体外检测限(LOD)为0.565aM,体内检测限为1个细胞。它可以从过量的未甲基化DNA中区分0.001%的CpG甲基化水平,量化人类癌细胞不同靶基因区域的CpG甲基化靶点,甚至可以区分肺癌和癌前组织中CpG甲基化的表达。
(3)等温条件下一步快速实现
上述技术方案可以在2小时内以无标记的方式一步等温完成,无需任何亚硫酸氢盐转换、荧光标记和PCR扩增过程,为基因组甲基化相关的临床诊断和生物医学研究提供了一个新的平台。
(4)现有技术的潜在可集成性
上述技术方案证明了G-四链体DNAzyme纳米线的协同原位组装,用于人类基因组中CpG甲基化的一步检测。在基因组CpG甲基化存在的情况下,CpG位点的5-mCs被一种新的甲基定向内切酶GlaI特异性切割,随后通过TMSD级联反应来启动功能性发夹的无酶协同原位自主交叉开放,以产生聚合物DNA纳米线来产生放大的化学发光信号。该纳米器件具有操作简单、成本低、灵敏度高、特异性好、可靠性高、通用性广等显著特点,为生物医学研究、分子诊断和表观遗传学治疗提供了一种新的检测CpG甲基化的方法,因此具有良好的实际应用价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明用于一步检测人类基因组中CpG甲基化的G-四链体DNAzyme纳米线协同原位组装示意图。该策略包括两个步骤:(1)GlaI酶催化5-mCs在CpG位点的特异性切割,(2)切口修复介导的原位组装G-四链体DNAzyme纳米线产生放大的化学发光信号。
图2为本发明实施例中验证原位CpG甲基化试验相关图;其中,A为GlaI酶催化裂解反应产物的PAGE分析。泳道M,DNA标记;泳道1,甲基化DNA;泳道2,未甲基化DNA;泳道3,合成的单位点切割产物;泳道4,合成的双位点切割产物;泳道5,甲基化DNA+GlaI酶;泳道6,未甲基化DNA+GlaI酶。B为TdT介导的切口修复产物的琼脂糖凝胶电泳分析。泳道1,甲基化DNA+GlaI酶;泳道2,甲基化DNA+GlaI酶+TdT酶;泳道3,未甲基化DNA+GlaI酶;泳道4,未甲基化DNA+GlaI酶+TdT酶。C为存在未甲基化DNA(a)和甲基化DNA(b)时的AFM图像。比例尺为100纳米。D为在不存在甲基化DNA、GlaI酶、dTTPs、TdT酶和发夹1、2和3中任何一种以及存在所有上述试剂的情况下,对反应体系进行化学发光测量。在A、B和C中使用200nM非甲基化DNA和200nM甲基化DNA;D为采用200pm甲基化DNA;A、B、C和D中均使用2U GlaI酶和0.5U TdT酶。
图3为本发明实施例中原位CpG甲基化检测灵敏度相关图;其中,A为化学发光强度对甲基化DNA浓度的相关性。插图显示化学发光强度在1×10-18-1×10-10M范围内与甲基化DNA浓度的对数呈线性关系;B为测量得到的CpG甲基化水平与输入的CpG甲基化水平在0.001%-100%范围内呈现线性相关性。
图4为本发明实施例中真实基因组DNA中CpG甲基化的分析相关图,其中,A为化学发光强度分别对基因组DNA、基因组DNA加上100fM非甲基化Septin 9、基因组DNA加上100fM甲基化Septin 9和对照的响应。B为化学发光强度与HCT-116细胞数对数的线性关系,线性范围为1-10000个细胞。C为Septin 9基因中靶标DNA区域的测序结果。检测到的CpG甲基化位点序列用矩形标识。
图5为本发明实施例中原位自组装纳米器件的可靠性和通用性相关图;其中,A为分别从HCT-116细胞、HepG-2细胞、H-157细胞、H-209细胞、MCF-7细胞和裂解缓冲液(对照)中测定100ng基因组DNA中的CpG甲基化水平;B为分别测量7个肺肿瘤组织和5个正常肺组织的100ng基因组DNA中CpG甲基化的表达。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明,以下实例仅是为了解释本发明,并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件,通常按照常规条件,或按照试剂公司所推荐的条件;下述实施例中所用的试剂、耗材等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
如前所述,CpG甲基化分析的传统技术根据不同的甲基化鉴别机制进行分类,包括亚硫酸氢盐转化法,甲基化DNA免疫沉淀法和和甲基化敏感限制性内切酶(MSRE)分析法。基于亚硫酸氢盐转化的方法被视为经典的“黄金标准”,它可以将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶,但保持甲基化胞嘧啶不变。基于这种识别机制,已经开发了许多检测DNA甲基化的技术,包括聚合酶链反应(PCR)、高通量DNA测序、限制性标记基因组扫描和微阵列。尽管这些方法应用十分广泛,但其样品制备步骤繁多,分析时间长,成本高,操作程序复杂。此外,亚硫酸氢盐处理可能会导致DNA损伤、DNA丢失和不完全转化,从而导致批次间的不一致。基于免疫的方法需要依赖于用抗体、甲基-CpG结合蛋白以及金属化合物来标记甲基胞嘧啶。尽管这些方法适用于批量分析,但是它们需要大量的样品、费力的抗体制备和昂贵的标记。此外,令人不满意的灵敏度使得无法确定基因组DNA中的甲基化位点。基于MSRE的方法依赖于非甲基化胞嘧啶位点的特异性切割和之后的未切割甲基化DNA的检测,它们可以在温和条件下进行,并且操作简单快速。然而,所有的MSRE方法都是非甲基化依赖性的,即使是微不足道的未甲基化DNA没有切割也可能会导致显著的假阳性,因此该方法不适合用来定量检测低丰度甲基化。因此,一种简单、快速、可靠的CpG甲基化的特异性位点检测方法应该消除亚硫酸氢盐处理、成本标记和背景高的缺点。
与MSREs方法不同,GlaI作为一种甲基化依赖性限制性核酸内切酶可以特异性地识别和切割序列5'-GmCGmC-3'/3'-mCGmCG-5'中的甲基化胞嘧啶(即5-mC),但是保留未甲基化的胞嘧啶完好无损。受这一发现的启发,GlaI的引入可以确保低丰度DNA甲基化的准确定量。如何在有限的基因组样本中敏感地检测特异性位点的CpG甲基化是另一个关键问题。由于Watson-Crick碱基配对的独特特性(如可编程的序列、可预测的结构和精确的分子长度),催化核酸作为放大标签吸引了越来越多的关注。高编辑灵活性、低非特异性吸收和固有的良好生物相容性,使得催化核酸在构建高效传感平台方面得到广泛的应用价值。其中,血红素/G-四链体辣根过氧化物酶(HRP)模拟的DNAzyme可以作为一个生物催化标签,它具有协议简单、灵敏度高、热稳定性好、可逆性好等特点。例如,构建具有HRP模拟DNAzyme的DNA机制为PCR提供了一种替代方法。然而,蛋白酶刺激的HRP模拟DNAzyme的合成通常需要繁琐的实验步骤、严格的反应条件、昂贵的试剂以及非特异性的信号放大。
在本发明中,已经证明了G-四链体DNAzyme纳米线的协同原位组装,用于人类基因组中CpG甲基化的一步检测。在基因组CpG甲基化存在的情况下,CpG位点的5-mCs被一种新的甲基定向内切酶GlaI特异性切割,该酶通过TMSD级联反应来启动功能性发夹的无酶协同原位自主交叉开放,以产生聚合物DNA纳米线来产生放大的化学发光信号。该纳米装置显示出良好的特异性和高灵敏度,体内检测限为1个细胞,体外检测限为0.565aM,优于之前所报告的方法。此外,该纳米装置可以在过量的未甲基化DNA中区分出0.001%的CpG甲基化水平,量化人类癌细胞不同目标基因组区域的CpG甲基化水平,甚至可以区分肺肿瘤和正常肺的组织中CpG甲基化的表达,该方法优于已报道的甲基化方法(0.01%~1%)。重要的是,这种纳米器件可以在2小时内以无标记的方式一步等温完成,而无需传统甲基化分析中的任何亚硫酸氢盐转换、荧光标记和PCR扩增过程。同时,本申请证明了该纳米器件的可靠性和通用性,用于检测人类癌症细胞系不同靶标基因组区域的CpG甲基化水平,包括HepG-2细胞、H-157细胞、MCF-7细胞、HCT-116细胞和H-209细胞。这些结果表明,这种纳米器件可以提供一个可靠和通用的平台,用于量化各种复杂生物样本(如癌细胞和肿瘤组织)中不同的CpG甲基化靶标。该纳米器件具有操作简单、成本低、灵敏度高、特异性好、可靠性高、通用性广等显著特点,为生物医学研究、分子诊断和表观遗传学治疗提供了一种新的检测CpG甲基化的方法。
原位CpG甲基化检测原理:作为概念证明,在Sepin 9基因中使用了一个特定的DNA序列,该序列包含一个5'-GmCGmC-3'/3'-mCGmCG-5'位点(77373474位点),其中有四个5-mCs作为模型靶点。如图1所示,在这个纳米器件中,三个功能性发夹(即发夹1、发夹2和发夹3)被巧妙设计。发夹1由聚腺嘌呤(A)环和具有突出3′-NH2末端的茎组成。带有3′-NH2末端的发夹2和3分别由四个结构域(I′、II、III、IV)和(I、II′、III、IV)组成。值得注意的是,结构域III参与发夹2和发夹3茎的双链结构以阻止活性G-四链体DNAzyme结构的自组装,并且3′-末端被胺(NH2)基团修饰以防止非特异性扩增。为了便于引入信号扩增放大检测技术,末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)用于修复5-mCs切割产生的切口,以产生单链DNA链,该链将作为无酶DNAzyme扩增的启动子。在存在甲基化DNA(即甲基化Sepin 9)的情况下,内切酶GlaI在CpG位点特异性切割5-mCs,产生两个具有3′-OH末端的切口。切割切口将作为引物,启动TdT催化的无模板单碱基延伸,其将dTTPs聚合在3′-OH末端以产生聚胸苷(T)长链。合成的poly-T产物与发夹1的poly-A环(方案1,灰白色)杂交打开发夹结构,暴露结构域I(方案1,深灰色)(步骤1)。暴露的结构域I可以通过TMSD与发夹2中的结构域I′(方案1,深灰色)杂交,完全暴露结构域II(方案1,灰白色)和III(方案1,亮白色)(步骤2)。类似地,发夹2中暴露的结构域II随后通过发夹3中结构域I的链置换与结构域II′(方案1,灰白色)杂交,完全暴露结构域I和III(方案1,亮白色)(步骤3)。发夹3中暴露的结构域I(方案1,深灰色)可依次与发夹2中的结构域I′(方案1,深灰色)杂交,通过趾端介导的链置换(TMSD)级联反应激活发夹2和3的自主交叉开放(步骤2和3),最终导致G-四链体DNAzyme结构的长链自组装。DNAzyme产物随后与辅因子血红素相结合,获得血红素/G-四链体HRP模拟的纳米结构,该纳米结构将催化H2O2介导的鲁米诺氧化,最终产生放大的化学发光信号。
该策略有五个显著的特点:(1)新的甲基化依赖性限制性内切酶GlaI被用来特异性切割CpG位点的5-mCs,确保了低丰度CpG甲基化的可靠定量;(2)应用无模板修复酶TdT以产生随机遗传信息,确保了发夹探针的高度设计自由度;(3)催化发夹自主交叉开放以产生G-四链体DNAzyme纳米线,实现了CpG甲基化的无酶原位放大传感;(4)化学发光测量系统能够精确测量小信号,有助于快速灵敏地检测CpG甲基化;(5)该分析可以在2小时内以一步等温并且无标记的方式进行,从而简化操作步骤并降低成本(基于亚硫酸氢盐转化的“金标准”甲基化方法通常需要16~40小时)。
因此,本发明的一个典型具体实施方式中,提供一种基于协同原位组装G-四链体DNAzyme纳米线的化学发光传感器,所述化学发光传感器至少包括三个功能性发夹探针,甲基定向内切酶GlaI和末端脱氧核苷酸转移酶TdT;
其中,第一功能性发夹探针由聚腺嘌呤(A)环和具有突出3′-NH2末端的茎组成;
所述第二功能性发夹探针和第三功能性发夹探针均由四个结构域组成;
加入poly-T序列后,第一功能性发夹探针被展开,通过趾端介导的链置换(TMSD)级联反应来启动第二功能性发夹探针和第三功能性发夹探针的自主交叉开放,产生G-四链体DNAzyme纳米线,从而实现了CpG甲基化的无酶原位放大传感;
进一步的,所述第二功能性发夹探针和第三功能性发夹探针3′-末端修饰有胺(NH2)基团;
具体的,
所述第一功能性发夹探针具有SEQ ID NO.1所示的序列;
所述第二功能性发夹探针具有SEQ ID NO.2所示的序列;
所述第三功能性发夹探针具有SEQ ID NO.3所示的序列;
所述甲基定向内切酶GlaI用于特异性地识别和切割序列5'-GmCGmC-3'/3'-mCGmCG-5'中的甲基化胞嘧啶(即5-mC);
所述末端脱氧核苷酸转移酶TdT用于修复5-mCs切割产生的切口,以产生单链DNA链,该链将作为无酶DNAzyme扩增的启动子。
所述化学发光传感器还包括血红素、鲁米诺和双氧水。辅因子血红素与G-四链体DNAzyme纳米线相结合获得血红素/G-四链体DNAzyme纳米线,催化双氧水介导鲁米诺氧化产生增强的化学发光信号。
本发明的又一具体实施方式中,提供上述化学发光传感器在检测DNA甲基化中的应用。
具体的,所述DNA甲基化为CpG甲基化。
本发明的又一具体实施方式中,提供一种检测DNA甲基化的方法,所述方法包括采用上述化学发光传感器进行检测。
具体的,所述方法包括:
将待测样品与甲基定向内切酶GlaI、末端脱氧核苷酸转移酶TdT和三个功能性发夹探针在缓冲液中进行孵育;
所述缓冲液中还包含dTTPs和CoCl2。
所述孵育具体条件为:在25-35℃孵育1-3小时,优选为在30℃孵育2小时。
所述检测方法还包括对孵育产物进行凝胶电泳分析和/或化学发光检测分析;
具体的,所述化学发光检测分析具体包括:向孵育产物中加入血红素、鲁米诺孵育后,再向其中加入双氧水产生化学发光信号,采用光度计进行化学发光检测分析。
其中,所述待测样品可以是生物样品,包括离体的血液、体液、组织(如肿瘤组织)和细胞(如肿瘤细胞),经试验证明,本发明化学发光传感器能够在单细胞水平灵敏检测量化不同靶基因区域的CpG甲基化靶点。甚至可以区分肺癌和癌前组织中CpG甲基化的表达。
本发明又一具体实施方式中,提供上述生物传感器和/或检测方法在CpG甲基化相关药物筛选和/或生物样品CpG甲基化分析中的应用。
所述生物样品包括离体的血液、体液、组织和细胞,所述细胞可以为正常细胞或癌细胞。经试验证明,本发明的化学发光传感器能够在过量的未甲基化DNA中区分出0.001%的CpG甲基化水平,量化人类癌细胞不同目标基因组区域的CpG甲基化水平,甚至可以区分肺肿瘤和正常肺的组织中CpG甲基化的表达,在生物医学研究、分子诊断和表观遗传学治疗等领域具有广泛的应用价值。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。下述实施例中,使用相关探针等核苷酸序列如下表1所示:
表1
其中,C代表甲基化胞嘧啶5-mC;S代表正义链;A代表反义链。
实施例
实验方法
G-四链体DNAzyme纳米线的协同原位组装用于CpG甲基化的一步传感。首先,制备了甲基化DNA靶标(甲基化Sepin 9基因)、非甲基化DNA靶标(非甲基化Sepin 9基因)和功能性发夹。所有寡核苷酸用1×Tris-EDTA缓冲液(10mM Tris,1mM EDTA,pH 7.4)溶解以制备储备溶液。为了获得双链DNA(dsDNA)靶标(即甲基化和非甲基化Sepin 9)和切割产物,S-甲基化Sepin 9和A-甲基化Sepin 9、S-非甲基化Sepin 9和A-非甲基化Sepin 9、S-单位点切割和A-单位点切割、S-双位点切割和A-双位点切割以1:1的比例混合,分别在1×杂交缓冲液(10mM Tris-HCl,50mM NaCl,pH 8.0)中稀释至10μM,然后缓慢冷却至室温以形成双链结构。将功能性发夹(即发夹1、2和3)在1×杂交缓冲液(10mM Tris-HCl,1.5mM MgCl2,pH8.0)中稀释至10μM,并在95℃下加热5min,随后缓慢地冷却至室温25℃,以形成完美的发夹结构。其次,将不同浓度的甲基化和非甲基化Sepin 9基因添加到30μL的反应溶液中,该反应溶液含有2U GlaI酶、3μL 10×SEBuffer Y、0.2U TdT酶、100μM dTTPs、0.25mM CoCl2、3μL 10×末端转移酶反应缓冲液和功能性发夹(1μM发夹1、1μM发夹2和1μM发夹3),并在30℃下孵育2小时,以进行功能性发夹的协同原位自主交叉开放,最终生成血红素/G-四链体DNAzyme纳米线。
凝胶电泳分析。为了分析GlaI酶催化的切割产物,在1×TBE缓冲液(9mM Tris-HCl,9mM硼酸,0.2mM EDTA,pH 7.9)中,在110V恒定电压下,在室温下进行12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)50min。为了分析TdT酶催化的无模板延伸产物,在1×TAE缓冲液(40mM Tris-acetic acid,2mM EDTA,pH 8.0)中,在110V恒定电压下,在室温下进行2%琼脂糖凝胶电泳40min。电泳结束后,凝胶用SYBR Gold染色,并通过ChemiDoc MP成像系统(Hercules,California,USA)显示成像。
化学发光信号测量。将新制备的0.2μL血红素溶液(7.5μM)和1.8μL鲁米诺溶液(5mM)添加到反应溶液中,该反应溶液中含有10μL反应产物和5μL孵育缓冲液(40mM HEPES,300mM NaCl,20mM KCl,pH 8.0),在室温下孵育30分钟,使核苷酸折叠成DNAzyme的活性G-四链体结构。在反应产物中加入30μL H2O2(50mM),此时会产生化学发光信号,使用GloMax96微孔板光度计(Promega,Madison,WI,USA)以6.8s的时间间隔同时检测产生的化学发光信号。
DNA纳米结构的原子力显微镜表征。为了表征纳米结构,采用原子力显微镜(AFM)分析了G-四链体DNAzyme纳米线。在AFM成像之前,反应产物通过QIAquick核苷酸去除试剂盒(28304)(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)纯化。云母片(muscovite mica,grade V-1)(SPI Supplies,West Chester,USA)由单层的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)功能化,首先在云母表面加入30μL 1%APTES 15min,然后用超纯水冲洗5min,氮气流干燥,随后在120℃烘箱中加热30min,最终冷却至室温。然后将10μL纯化的反应产物(1ng/μL)固定在APTES云母表面5分钟,然后用20μL超纯水冲洗并用氮气流轻轻干燥。使用Veeco DI Nanoscope多模V系统(Plainview,NY,USA)以2.44Hz的扫描频率在轻敲模式下对样品进行成像表征。
细胞培养和基因组DNA制备。HCT-116细胞在McCoy’s 5A培养基(Gibco,USA)中培养,该培养基添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素、3mM/L-谷氨酰胺和1%NaHCO3。HepG-2细胞和MCF-7细胞在添加10%FBS和1%青霉素链霉素的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM)中培养。H-157细胞和H-209细胞分别在添加10%和20%FBS的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基中培养。所有癌细胞系均在37℃、含5%CO2的加湿培养箱内培养。在生长的指数期,通过胰蛋白酶消化(0.25%胰蛋白酶,1mMEDTA,Invitrogen)收集癌细胞,用冰冷PBS缓冲液(155mM NaCl,1.1mM KH2PO4,3.0mMNa2HPO4·H2O,pH 7.4)洗涤,然后在4℃下以1000rpm离心5分钟。为了确定准确的细胞数,将20μL的细胞转移到细胞计数板中,并通过Countstar自动细胞计数器(IC 1000,Inno-Alliance Biotech,Wilmington,DE,USA)进行计数。在室温下以11000rpm离心1×106个癌细胞1分钟,收集细胞沉淀物以提取基因组DNA。最后,使用TIANamp基因组DNA试剂盒(DP304-03,Tiangen Biotech,Beijing,China)获得基因组DNA提取物。对于临床应用,根据制造商的说明,使用基因组DNA分离试剂盒从7个肺肿瘤组织和5个相应的癌前组织中提取基因组DNA。使用NanoDrop 2000c分光光度计(Thermo Scientific,Wilmington,DE,USA)直接定量提取的基因组DNA浓度,随后将100ng基因组DNA提取物与反应溶液混合,以测量CpG甲基化表达水平。值得注意的是,为了确保所有游离的3′-OH仅由切割的损伤位点产生,所有获得的具有游离3′-OH末端的基因组DNA片段在TdT聚合酶的协助下通过结合双脱氧核苷酸磷酸盐(ddATP)被阻断。
Septin 9基因中目标DNA序列的亚硫酸氢盐测序。使用上述TIANamp基因组DNA试剂盒从HCT-116细胞中提取基因组DNA,然后送到Sangon Biotechnology Co.Ltd.(青岛,中国)进行亚硫酸氢盐测序。首先用亚硫酸氢钠处理基因组DNA样品,然后使用引物F(5′-AAATCC GAC ATA ATA ACT AAT AAA CAA C-3′)和B(5′-GCG GTT AGT TTT GTA TTG TAG GAG-3′)进行PCR扩增。在50μL反应溶液(每个引物0.4μM,4U Pfu DNA聚合酶,0.2mM dNTPs和缓冲液(10mM Tris-HCl,50mM KCl,1.5mM MgCl2,pH 8.8)中,按照以下程序进行PCR扩增:95℃下反应5min,然后依次按照下述进行反应35个循环,95℃反应30秒,58℃反应30秒,72℃反应90秒,最后在72℃下反应10分钟。PCR产物最终用ABI 3730XL DNA分析仪(AppliedBiosystems,Foster City,CA,USA)进行测序。
实验结果
(1)验证原位CpG甲基化试验
进行凝胶电泳、原子力显微镜(AFM)表征和化学发光测量以验证该分析。首先,使用12%的PAGE分析GlaI酶催化的切割产物(图2A)。在甲基化DNA+GlaI反应中检测到两条不同的61bp和53bp的条带(图2A,泳道5),表明CpG位点的5-mCs可被GlaI酶切割以产生更长的切割片段(53bp)。61bp的条带来自于过量的甲基化Sepin 9靶标物,这与合成的甲基化DNA(61bp)的条带相同(图2A,泳道1)。53bp条带是合成的单位点切割产物(53bp)的特征条带(图2A,泳道3)。而对于非甲基化DNA+GlaI(图2A,泳道6),仅检测到一条61bp的条带,其对应于合成的非甲基化Sepin 9靶标物(61bp,图2A,泳道2)的大小相一致。这些结果表明,GlaI可以特异性地区分甲基化DNA和非甲基化DNA。为了进一步验证TdT催化的体外切口修复,采用2%琼脂糖凝胶电泳来表征无模板延伸产物。对应于甲基化DNA+GlaI+TdT反应,检测到多条阶梯状条带(>53bp)(图2B,泳道2),表明启动了无模板单碱基延伸以产生poly-T序列的长链(>53bp)。相反,仅检测到甲基化Sepin 9(61bp)(图2B,泳道1)、单位点切割产物(53bp)(图2B,泳道1)和非甲基化Sepin 9(图2B,泳道3和4)的原始条带分别响应于甲基化DNA+GlaI、非甲基化DNA+GlaI或非甲基化DNA+GlaI+TdT,表明没有发生无模板延伸反应。此外,使用原子力显微镜(AFM)对获得的DNAzyme链进行表征(图2C)。当存在未甲基化DNA时,功能性发夹均匀分散且尺寸分布窄(图2Ca),而当存在甲基化DNA时,功能性发夹自动组装形成微米长的DNAzyme链(图2Cb)。链的高度在0.8到1.5nm之间,远高于单链DNA(0.6nm),表明功能性发夹(即发夹1、2和3)原位组装形成了双面G-四链体DNAzyme链。此外,在辅助因子血红素、过氧化氢和鲁米诺的协助下进行了化学发光信号值的测量。在没有甲基化DNA、GlaI酶、dTTPs、TdT酶和发夹1、2和3中任何一种的情况下,均未检测到明显的化学发光信号(图2D)。然而,在甲基化DNA+GlaI酶+TdT酶+dTTPs+发夹1、2和3(图2D)反应中检测到显著的化学发光信号,表明只有甲基化Sepin 9可以被GlaI特异性切割,以启动切口修复介导的G-四链体DNAzyme纳米线的原位自组装,从而产生一个放大的化学发光信号。
(2)原位CpG甲基化检测的灵敏度
在最佳条件下,研究所提出的纳米器件的检测灵敏度。如图3A所示,当甲基化DNA(即甲基化Sepin 9)的浓度从1×10-18增加到1×10-10M时,化学发光信号逐渐增强,当甲基化DNA的浓度超过100pm时,其化学发光信号趋于稳定。值得注意的是,1aM甲基化DNA产生的化学发光信号可以很好地与未甲基化DNA(即未甲基化Sepin 9)对照所产生的化学发光信号区分开来。此外,化学发光强度(I)与甲基化DNA浓度(C)的对数在从1×10-18M到1×10-10M的8个数量级的大动态范围内呈现线性相关性(图3A插图),相关方程为I=6.95E9+3.44E8log10C(R2=0.9994)。测得的检测限为0.565aM。与基于亚硫酸氢盐转换的双环信号放大法(0.78pm)相比,灵敏度提高了6个数量级,与基于MSRE的EXPAR方法(200am)相比,灵敏度提高了2个数量级,与基于亚硫酸氢盐转换的PCR方法(20am)相比,灵敏度提高了35.4倍。
进一步研究了该方法的特异性(图3B)。将甲基化Sepin 9与非甲基化Sepin 9以不同比例混合。甲基化水平根据方程式1确定。
Methylation level(%)=M/(M+U)×100% (1)
式中,M为用所提出的纳米器件测得的甲基化DNA的量,U为未甲基化DNA的量。如图3B所示,所测得的甲基化DNA水平(Y)与输入的甲基化DNA水平(X)呈线性相关性,其相关方程为Y=1.47X-1.07(R2=0.9998)。值得注意的是,即使低至0.001%的甲基化Sepin 9(相当于1fM)也可以很好地与过量的非甲基化Sepin 9区分开来),该方法优于已报道的甲基化方法(0.01%~1%),包括基于亚硫酸氢盐转化的切酶辅助信号放大试验(0.1%),基于单量子点的纳米传感器(0.01%),基于MSRE的辅助依赖链式反应分析(0.1%),和聚合酶/内切酶介导的EXPAR分析(0.01%)。
(3)真实基因组DNA中CpG甲基化的分析
检测了该纳米器件在人类结肠癌细胞系(HCT-116细胞)中检测CpG甲基化的能力。CpG甲基化靶标物(即甲基化Septin 9)的水平可以根据图3A的插图进行定量,并测量得到基因组DNA样本中甲基化Septin 9的浓度为3.26fM。与仅由基因组DNA产生的化学发光信号相比,将100fM标准非甲基化Septin 9加入基因组DNA不会引起化学发光信号的显著变化。相比之下,将100fM标准的甲基化Septin 9加入相等的基因组DNA中可诱导显著增强的化学发光信号,甲基化Septin 9的浓度确定为101.3fM,回收率为98.1%。此外,还检测了不同数量的HCT-116细胞中甲基化Septin 9的水平。如图4B所示,化学发光信号强度(I)与HCT-116细胞数(N)的对数呈现线性相关性,线性范围为1-10000个细胞(图4B),其相关方程为I=1.86E9+2.34E8 log10N(R2=0.9992)。检测限可以直接测量到1个细胞。为了证实结果的准确性,对提取的基因组DNA中靶Septin 9基因的5'-GCGC-3'/3'-CGCG-5'位点(77373474位点)进行了测序(图4C)。亚硫酸氢盐测序结果表明,77373474位点的所有胞嘧啶均甲基化,这与的结果相一致(图4A和B),表明该纳米装置能够准确、灵敏地检测真实基因组DNA中的位点特异性CpG甲基化。
(4)原位自组装纳米器件的可靠性和通用性
证明了该纳米装置的可靠性和通用性,用于检测人类癌症细胞系不同目标基因组区域的CpG甲基化水平,包括HepG-2细胞、H-157细胞、MCF-7细胞、HCT-116细胞和H-209细胞。根据图3A的插图来确定不同CpG甲基化靶标的表达水平。如图5A所示,分别在HCT-116细胞、HepG-2细胞和H-157细胞中检测到CpG甲基化的显著表达。这些结果可以很好地解释为HCT-116细胞Septin 9启动子区的CpG位点、HepG-2细胞的E-cadherin抑癌基因和H-157细胞的pl6抑癌基因的高度甲基化。相反,在H-209细胞和MCF-7细胞中检测到CpG甲基化的低表达,这与H-209细胞的pl6抑癌基因和MCF-7细胞的E-cadherin抑癌基因中未甲基化的CpG位点相一致。此外,利用这种纳米装置来测量肺肿瘤组织中CpG甲基化的表达。如图5B所示,肺肿瘤组织中CpG甲基化的表达水平远远高于正常肺组织(t检验,P<0.001),肺肿瘤组织中CpG甲基化的中位浓度为38.62fM,正常肺组织中CpG甲基化的中位浓度为4.48fM,表明该纳米器件可以区分肺癌组织和正常肺组织中CpG甲基化的表达。这些结果表明,这种纳米器件可以提供一个可靠和通用的平台,用于量化各种复杂生物样本(如癌细胞和肿瘤组织)中不同的CpG甲基化靶标。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 一种基于协同原位组装G-四链体DNAzyme纳米线的化学发光传感器及其应用
<130>
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttaaacacct tcttcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagaaga aggtgtttaa gta 53
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgggtcaatt ctccaactta aacctactta aacacctgtt taagttgggt agggcggg 58
<210> 3
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agggcgggtg ggtgtttaag ttggagaatt gttaaacagg tgtttaagta gtgggt 56
<210> 4
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agctgcgcgt tgaccgcggg gtccgacatg atggctggtg ggcagcgggt cgcgcggagg 60
g 61
<210> 5
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccctccgcgc gacccgctgc ccaccagcca tcatgtcgga ccccgcggtc aacgcgcagc 60
t 61
<210> 6
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agctgcgcgt tgaccgcggg gtccgacatg atggctggtg ggcagcgggt cgcgcggagg 60
g 61
<210> 7
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccctccgcgc gacccgctgc ccaccagcca tcatgtcgga ccccgcggtc aacgcgcagc 60
t 61
<210> 8
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agctgcgcgt tgaccgcggg gtccgacatg atggctggtg ggcagcgggt cgc 53
<210> 9
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcgacccgct gcccaccagc catcatgtcg gaccccgcgg tcaacgcgca gct 53
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gttgaccgcg gggtccgaca tgatggctgg tgggcagcgg gtcgc 45
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gcgacccgct gcccaccagc catcatgtcg gaccccgcgg tcaac 45
Claims (10)
1.一种基于协同原位组装G-四链体DNAzyme纳米线的化学发光传感器,其特征在于,所述化学发光传感器至少包括三个功能性发夹探针,甲基定向内切酶GlaI和末端脱氧核苷酸转移酶TdT;
其中,第一功能性发夹探针由聚腺嘌呤环和具有突出3′-NH2末端的茎组成;
所述第二功能性发夹探针和第三功能性发夹探针均由四个结构域组成;
加入poly-T序列后,第一功能性发夹探针被展开,通过趾端介导的链置换级联反应启动第二功能性发夹探针和第三功能性发夹探针的自主交叉开放,产生G-四链体DNAzyme纳米线。
2.如权利要求1所述的化学发光传感器,其特征在于,所述第二功能性发夹探针和第三功能性发夹探针3′-末端修饰有NH2。
3.如权利要求1所述的化学发光传感器,其特征在于,
所述第一功能性发夹探针具有SEQ ID NO.1所示的序列;
所述第二功能性发夹探针具有SEQ ID NO.2所示的序列;
所述第三功能性发夹探针具有SEQ ID NO.3所示的序列。
4.如权利要求1所述的化学发光传感器,其特征在于,所述化学发光传感器还包括血红素、鲁米诺和双氧水。
5.权利要求1-4任一项所述化学发光传感器在检测DNA甲基化中的应用;
优选的,所述DNA甲基化为CpG甲基化。
6.一种检测DNA甲基化的方法,其特征在于,所述方法包括采用权利要求1-4任一项所述化学发光传感器进行检测。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述方法包括:
将待测样品与甲基定向内切酶GlaI、末端脱氧核苷酸转移酶TdT和三个功能性发夹探针在缓冲液中进行孵育;
优选的,所述缓冲液中还包含dTTPs和CoCl2;
优选的,所述孵育具体条件为:在25-35℃孵育1-3小时,优选为在30℃孵育2小时。
8.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述方法还包括对孵育产物进行凝胶电泳分析和/或化学发光检测分析;
优选的,所述化学发光检测分析具体方法包括:向孵育产物中加入血红素、鲁米诺孵育后,再向其中加入双氧水产生化学发光信号,采用光度计进行化学发光检测分析;
优选的,所述待测样品是生物样品,包括离体的血液、体液、组织和细胞;进一步优选的,所述组织包括肿瘤组织,所述细胞包括肿瘤细胞。
9.权利要求1-4任一项所述生物传感器和/或权利要求6-8任一项所述检测方法在CpG甲基化相关药物筛选和/或生物样品CpG甲基化分析中的应用。
10.如权利要求9所述应用,其特征在于,所述待测样品是生物样品,包括离体的血液、体液、组织和细胞;优选的,所述组织包括肿瘤组织,所述细胞包括肿瘤细胞。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111470190.XA CN114381498A (zh) | 2021-12-03 | 2021-12-03 | 一种基于协同原位组装G-四链体DNAzyme纳米线的化学发光传感器及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111470190.XA CN114381498A (zh) | 2021-12-03 | 2021-12-03 | 一种基于协同原位组装G-四链体DNAzyme纳米线的化学发光传感器及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114381498A true CN114381498A (zh) | 2022-04-22 |
Family
ID=81195823
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111470190.XA Pending CN114381498A (zh) | 2021-12-03 | 2021-12-03 | 一种基于协同原位组装G-四链体DNAzyme纳米线的化学发光传感器及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114381498A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116144770A (zh) * | 2022-10-18 | 2023-05-23 | 湖南工程学院 | 基于DNA walker及支链杂交链式反应检测乳腺癌循环肿瘤核酸的探针组及方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111088324A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-05-01 | 山东师范大学 | 一种检测甲基转移酶的单个量子点纳米传感器及其检测方法和应用 |
CN112094889A (zh) * | 2020-08-31 | 2020-12-18 | 山东师范大学 | 化学发光传感器及检测细菌或人类甲基转移酶中的应用 |
CN112326637A (zh) * | 2020-10-30 | 2021-02-05 | 山东师范大学 | 一种检测5-羟甲基胞嘧啶的化学发光生物传感器及其检测方法和应用 |
-
2021
- 2021-12-03 CN CN202111470190.XA patent/CN114381498A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111088324A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-05-01 | 山东师范大学 | 一种检测甲基转移酶的单个量子点纳米传感器及其检测方法和应用 |
CN112094889A (zh) * | 2020-08-31 | 2020-12-18 | 山东师范大学 | 化学发光传感器及检测细菌或人类甲基转移酶中的应用 |
CN112326637A (zh) * | 2020-10-30 | 2021-02-05 | 山东师范大学 | 一种检测5-羟甲基胞嘧啶的化学发光生物传感器及其检测方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
郭亚辉 等: "G 四链体在生物传感器中的应用", 武汉大学学报(理学版), vol. 63, no. 1, 28 February 2017 (2017-02-28), pages 9 - 21 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116144770A (zh) * | 2022-10-18 | 2023-05-23 | 湖南工程学院 | 基于DNA walker及支链杂交链式反应检测乳腺癌循环肿瘤核酸的探针组及方法 |
CN116144770B (zh) * | 2022-10-18 | 2023-12-15 | 湖南工程学院 | 基于DNA walker及支链杂交链式反应检测乳腺癌循环肿瘤核酸的探针组及方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6571895B1 (ja) | 核酸プローブ及びゲノム断片検出方法 | |
RU2733887C2 (ru) | Мультиплексное детектирование нуклеиновых кислот | |
Yao et al. | Specific and simultaneous detection of micro RNA 21 and let-7a by rolling circle amplification combined with lateral flow strip | |
AU2014209942B2 (en) | Process for detection of DNA modifications and protein binding by single molecule manipulation | |
KR102592367B1 (ko) | 게놈 및 치료학적 적용을 위한 핵산 분자의 클론 복제 및 증폭을 위한 시스템 및 방법 | |
JP4933458B2 (ja) | シグナル増幅による核酸の検出および分析のための方法および組成物 | |
CN110144384B (zh) | 一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用 | |
CA2800637C (en) | Method of dna sequencing by polymerisation | |
JP6169603B2 (ja) | 単一分子のハイブリダイゼーションおよび操作によるdnaの検出および定量法 | |
US9845495B2 (en) | Method and kit for detecting target nucleic acid | |
JP2004527241A (ja) | シトシンメチル化型の高感度での実証方法 | |
EP4365305A2 (en) | Method of detecting an analyte | |
Xu et al. | Exponential rolling circle amplification and its sensing application for highly sensitive DNA detection of tumor suppressor gene | |
CN114381498A (zh) | 一种基于协同原位组装G-四链体DNAzyme纳米线的化学发光传感器及其应用 | |
JP5206059B2 (ja) | メチル化されたdnaの含量を測定する方法 | |
JP5258760B2 (ja) | メチル化核酸又は非メチル化核酸を増幅する方法 | |
JP4924014B2 (ja) | Dnaメチル化測定方法 | |
CN114507706B (zh) | 基于酶dna修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用 | |
CN110951831A (zh) | 一种基于核酸识别诱导的荧光生物传感器及应用 | |
JP5151167B2 (ja) | Dnaメチル化測定方法 | |
JP2022534440A (ja) | 生体分子のデジタルマルチプレックス検出および/または定量化の方法ならびにその使用 | |
JP2023523477A (ja) | 単一標的遺伝子の遺伝的変異のリアルタイム検出用の一本鎖核酸及びこれを用いた検出方法 | |
US20200216881A1 (en) | Compositions and methods for detection of genomic variations | |
JP4940940B2 (ja) | Dnaメチル化測定方法 | |
JP4940939B2 (ja) | Dnaメチル化測定方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |