JP4940940B2 - Ｄｎａメチル化測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法等に関する。
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるＤＮＡのメチル化状態を評価するための方法としては、例えば、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法が存在している（例えば、非特許文献１及び２参照）。
当該測定方法では、まず、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを抽出する必要がある。当該抽出方法としては、例えば、ゲル濾過、シリカ担体、有機溶媒等による抽出方法等が知られているが、いずれの抽出方法も操作が煩雑である。
次いで、抽出されたＤＮＡの目的領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法としては、例えば、（１）亜硫酸塩等を用いて当該ＤＮＡを修飾した後、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の連鎖反応（Polymerase Chain Reaction；以下、ＰＣＲと記すこともある。）に供することにより目的領域を増幅する方法、（２）メチル化感受性制限酵素を用いて当該ＤＮＡを消化した後、ＰＣＲに供することにより、目的領域を増幅する方法等を挙げることができる。
当該測定方法では、まず、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを抽出する必要がある。当該抽出方法としては、例えば、ゲル濾過、シリカ担体、有機溶媒等による抽出方法等が知られているが、いずれの抽出方法も操作が煩雑である。
次いで、抽出されたＤＮＡの目的領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法としては、例えば、（１）亜硫酸塩等を用いて当該ＤＮＡを修飾した後、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の連鎖反応（Polymerase Chain Reaction；以下、ＰＣＲと記すこともある。）に供することにより目的領域を増幅する方法、（２）メチル化感受性制限酵素を用いて当該ＤＮＡを消化した後、ＰＣＲに供することにより、目的領域を増幅する方法等を挙げることができる。
Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M., High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11;22(15):2990-7.
Ushijima T, Morimura K, Hosoya Y, Okonogi H, Tatematsu M, Sugimura T, Nagao M., Establishment of methylation-sensitive- representational difference analysis and isolation of hypo- and hypermethylated genomic fragments in mouse liver tumors.Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Mar 18;94(6):2284-9.
上記のいずれの方法とも、ＰＣＲに供するまでの操作（具体的には例えば、メチル化検出のためのＤＮＡの修飾及びその後の生成物の精製等）に非常に時間と労力とを要し、さらに、ＰＣＲが増幅しようとする目的領域のＤＮＡの塩基配列に対して相補的な１組のオリゴヌクレオチドプライマー（以下、プライマー対と記すこともある。）を用いて液相中にて行われるために、増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、これをＰＣＲのための反応容器へ移し換える操作、また目的領域を増幅させるための前記のプライマー対を含む反応試薬を反応系に添加するための操作等も必要である。更に、増幅しようとする目的領域のＤＮＡの増幅を確認するために、電気泳動等の分析操作に供する必要もあり、しかもその操作は極めて繁雑である。
このように、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定するための一連の操作には、多大な手間が存在していた。
このように、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定するための一連の操作には、多大な手間が存在していた。
本発明者らは、かかる状況下鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法であって、
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の一本鎖ＤＮＡを選択する第一工程、
（２）第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡを少なくとも１種類以上の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）を除去する第二工程、及び、
（３）下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）を前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドから一旦分離する工程（第一前工程）と、
生成した遊離の一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の生成した遊離の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する工程（第二（Ａ）前工程）と、
当該工程（第二（Ａ）前工程）で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする工程（第二（Ｂ）前工程）と
を有する工程（第二前工程）と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖状態であるＤＮＡ（前記の一本鎖状態であるＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧ対を含まない一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖状態であるＤＮＡ）を、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三前工程）とを有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の生成した一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ａ１工程と、第Ａ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の選択された一本鎖状態であるＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ａ２工程とを有する第Ａ工程（本工程）と、
（ｂ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の生成した一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｂ工程（本工程）とを有し、
さらに第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第三工程、
を有することを特徴とする方法（以下、本発明測定方法と記すこともある。）；
２．第一工程において、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させる際に、二価陽イオンを含有する反応系中で結合させることを特徴とする前項１記載の方法。
４．前項１〜３のいずれかの前項記載の第三工程の第一前工程の前操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
前項１記載の第三工程の、前記第二工程と各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
’’を有する第Ｃ工程（本工程）；
５．前項１〜３のいずれかの前項記載の第三工程の第一前工程の後操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、第二工程及び上記の追加前工程を経て得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖ＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖ＤＮＡ）を一本鎖状態に一旦分離する工程（追加再前工程）を有し、且つ、
前項１記載の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法（以下、本発明メチル化割合測定方法と記すこともある。）
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
’’を有する第Ｃ工程（本工程）；
６．前項１〜３のいずれかの前項記載の第三工程の第三前工程の前操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
前項１記載の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
’’を有する第Ｃ工程（本工程）；
７．前項１〜３のいずれかの前項記載の第三工程の第三前工程の後操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、第二工程及び上記の追加前工程を経て得られた未消化物である二本鎖ＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖ＤＮＡ）を一本鎖状態に一旦分離する工程（追加再前工程）を有し、且つ、
前項１記載の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
’’を有する第Ｃ工程（本工程）；
８．前項１〜７のいずれかの前項記載記載の方法の工程として、下記の２つの工程をさらに追加的に有することを特徴とするメチル化割合の測定方法。
（４）前項１〜８のいずれかの前項記載の方法の第一工程を行った後、前項１〜７のいずれかの前項記載の方法の第二工程を行うことなく、前項１〜７のいずれかの前項記載の方法における第三工程を行うことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域のＤＮＡ（メチル化されたＤＮＡ及びメチルされていないＤＮＡの総量）を検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第四工程、及び、
（５）前項１〜７のいずれかの前項記載の第三工程により定量されたＤＮＡの量と、第四工程により定量されたＤＮＡの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの割合を算出する第五工程；
９．生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする前項１〜８のいずれかの前項記載の方法；
１０．生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする前項１〜８のいずれかの前項記載の方法；
１１．生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする前項１〜８のいずれかの前項記載の方法；
１２．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、当該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜１１のいずれかの前項記載の方法；
１３．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、少なくとも１種類以上の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜１２のいずれかの前項記載の方法；
１４．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、予め精製されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜１３のいずれかの前項記載の方法；
１５．少なくとも１種類以上の1本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であることを特徴とする前項１〜１４のいずれかの前項記載の方法；
１６．少なくとも１種類以上の1本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHhaIであることを特徴とする前項１〜１５のいずれかの前項記載の方法；
等を提供するものである。
即ち、本発明は、
１．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法であって、
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の一本鎖ＤＮＡを選択する第一工程、
（２）第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡを少なくとも１種類以上の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）を除去する第二工程、及び、
（３）下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）を前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドから一旦分離する工程（第一前工程）と、
生成した遊離の一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の生成した遊離の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する工程（第二（Ａ）前工程）と、
当該工程（第二（Ａ）前工程）で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする工程（第二（Ｂ）前工程）と
を有する工程（第二前工程）と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖状態であるＤＮＡ（前記の一本鎖状態であるＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧ対を含まない一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖状態であるＤＮＡ）を、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三前工程）とを有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の生成した一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ａ１工程と、第Ａ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の選択された一本鎖状態であるＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ａ２工程とを有する第Ａ工程（本工程）と、
（ｂ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の生成した一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｂ工程（本工程）とを有し、
さらに第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第三工程、
を有することを特徴とする方法（以下、本発明測定方法と記すこともある。）；
２．第一工程において、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させる際に、二価陽イオンを含有する反応系中で結合させることを特徴とする前項１記載の方法。
４．前項１〜３のいずれかの前項記載の第三工程の第一前工程の前操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
前項１記載の第三工程の、前記第二工程と各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
’’を有する第Ｃ工程（本工程）；
５．前項１〜３のいずれかの前項記載の第三工程の第一前工程の後操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、第二工程及び上記の追加前工程を経て得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖ＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖ＤＮＡ）を一本鎖状態に一旦分離する工程（追加再前工程）を有し、且つ、
前項１記載の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法（以下、本発明メチル化割合測定方法と記すこともある。）
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
’’を有する第Ｃ工程（本工程）；
６．前項１〜３のいずれかの前項記載の第三工程の第三前工程の前操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
前項１記載の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
’’を有する第Ｃ工程（本工程）；
７．前項１〜３のいずれかの前項記載の第三工程の第三前工程の後操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、第二工程及び上記の追加前工程を経て得られた未消化物である二本鎖ＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖ＤＮＡ）を一本鎖状態に一旦分離する工程（追加再前工程）を有し、且つ、
前項１記載の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
’’を有する第Ｃ工程（本工程）；
８．前項１〜７のいずれかの前項記載記載の方法の工程として、下記の２つの工程をさらに追加的に有することを特徴とするメチル化割合の測定方法。
（４）前項１〜８のいずれかの前項記載の方法の第一工程を行った後、前項１〜７のいずれかの前項記載の方法の第二工程を行うことなく、前項１〜７のいずれかの前項記載の方法における第三工程を行うことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域のＤＮＡ（メチル化されたＤＮＡ及びメチルされていないＤＮＡの総量）を検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第四工程、及び、
（５）前項１〜７のいずれかの前項記載の第三工程により定量されたＤＮＡの量と、第四工程により定量されたＤＮＡの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの割合を算出する第五工程；
９．生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする前項１〜８のいずれかの前項記載の方法；
１０．生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする前項１〜８のいずれかの前項記載の方法；
１１．生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする前項１〜８のいずれかの前項記載の方法；
１２．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、当該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜１１のいずれかの前項記載の方法；
１３．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、少なくとも１種類以上の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜１２のいずれかの前項記載の方法；
１４．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、予め精製されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜１３のいずれかの前項記載の方法；
１５．少なくとも１種類以上の1本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であることを特徴とする前項１〜１４のいずれかの前項記載の方法；
１６．少なくとも１種類以上の1本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHhaIであることを特徴とする前項１〜１５のいずれかの前項記載の方法；
等を提供するものである。
本発明により、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を簡便に測定する方法等を提供することが可能となる。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明における「生物由来検体」としては、例えば、細胞溶解液、組織溶解液（ここでの組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味である。）若しくは、哺乳動物においては、血漿、血清、リンパ液等の体液、体分泌物（尿や乳汁等）等の生体試料及びこれら生体試料から抽出して得られたゲノムＤＮＡをあげることができる。また当該生物由来検体としては、例えば、微生物、ウイルス等由来の試料もあげられ、この場合には、本発明測定方法における「ゲノムＤＮＡ」とは、微生物、ウイルスのゲノムＤＮＡを意味するものである。
哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発明測定方法の利用が期待できる。
ゲノムＤＮＡを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出すればよい。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体として、その中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
本発明における「生物由来検体」としては、例えば、細胞溶解液、組織溶解液（ここでの組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味である。）若しくは、哺乳動物においては、血漿、血清、リンパ液等の体液、体分泌物（尿や乳汁等）等の生体試料及びこれら生体試料から抽出して得られたゲノムＤＮＡをあげることができる。また当該生物由来検体としては、例えば、微生物、ウイルス等由来の試料もあげられ、この場合には、本発明測定方法における「ゲノムＤＮＡ」とは、微生物、ウイルスのゲノムＤＮＡを意味するものである。
哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発明測定方法の利用が期待できる。
ゲノムＤＮＡを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出すればよい。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体として、その中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
本発明における「メチル化されたＤＮＡ」とは、下記のようなＤＮＡを意味するものである。通常、遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を構成する塩基は４種類である。これらの塩基のうち、シトシンのみがメチル化されるという現象が知られており、このようなＤＮＡのメチル化修飾は、５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列（Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表す。以下、当該塩基配列を「ＣｐＧ」と記すこともある。）中のシトシンに限られている。シトシンにおいてメチル化される部位は、その５位である。細胞分裂に先立つＤＮＡ複製に際して、複製直後は鋳型鎖の「ＣｐＧ」中のシトシンのみがメチル化された状態となるが、メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖の「ＣｐＧ」中のシトシンもメチル化される。従って、ＤＮＡのメチル化の状態は、ＤＮＡ複製後も、新しい２組のＤＮＡにそのまま引き継がれることになる。このようなメチル化修飾により生じたＤＮＡを意味するものである。
本発明における「ＣｐＧ対」とは、ＣｐＧで示される塩基配列と、これに相補するＣｐＧが結合してなる二本鎖オリゴヌクレオチドを意味するものである。
本発明における「ＣｐＧ対」とは、ＣｐＧで示される塩基配列と、これに相補するＣｐＧが結合してなる二本鎖オリゴヌクレオチドを意味するものである。
本発明における「目的とするＤＮＡ領域」（以下、目的領域と記すこともある。）は、当該領域に含まれるシトシンのメチル化有無を調べたいＤＮＡ領域であって、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素の認識部位を有するものであり、例えば、Lysyl oxidase、HRAS-like suppressor、bA305P22.2.1、Gamma filamin、HAND1、Homologue of RIKEN 2210016F16、FLJ32130、PPARG angiopoietin-related protein、Thrombomodulin、p53-responsive gene 2、Fibrillin2、Neurofilament3、disintegrin and metalloproteinase domain 23、G protein-coupled receptor 7、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2等の有用タンパク質遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンを含むＤＮＡの領域等を挙げることができる。
具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がLysyl oxidase遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のLysyl oxidase遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF270645に記載される塩基配列の塩基番号16001〜18661で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のLysyl oxidaseタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2031〜2033に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。配列番号１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号1539、1560、1574、1600、1623、1635、1644、1654、1661、1682、1686、1696、1717、1767、1774、1783、1785、1787、1795等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がHRAS-like suppressor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC068162に記載される塩基配列の塩基番号172001〜173953で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号２で示される塩基配列においては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1743〜1953に示されている。配列番号２で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号２で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号２で示される塩基配列において、塩基番号1316、1341、1357、1359、1362、1374、1390、1399、1405、1409、1414、1416、1422、1428、1434、1449、1451、1454、1463、1469、1477、1479、1483、1488、1492、1494、1496、1498、1504、1510、1513、1518、1520等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、bA305P22.2.1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のbA305P22.2.1遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL121673に記載される塩基配列の塩基番号13001〜13889で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号３で示される塩基配列においては、ヒト由来のbA305P22.2.1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号849〜851に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号663〜889に示されている。配列番号３で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号３で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号３で示される塩基配列において、塩基番号329、335、337、351、363、373、405、424、427、446、465、472、486等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Gamma filamin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のGamma filamin遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC074373に記載される塩基配列の塩基番号63528〜64390で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号４で示される塩基配列においては、ヒト由来のGamma filaminタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号572〜574に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号463〜863に示されている。配列番号４で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号４で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号４で示される塩基配列において、塩基番号329、333、337、350、353、360、363、370、379、382、384、409、414、419、426、432、434、445、449、459、472、474、486、490、503、505等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、HAND1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHAND1遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026688に記載される塩基配列の塩基番号24303〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号５で示される塩基配列においては、ヒト由来のHAND1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号1656〜1658に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1400〜2198に示されている。配列番号５で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号５で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号５で示される塩基配列において、塩基番号1153、1160、1178、1187、1193、1218、1232、1266、1272、1292、1305、1307、1316、1356、1377、1399、1401、1422、1434等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL354733に記載される塩基配列の塩基番号157056〜159000で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号６で示される塩基配列においては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16タンパク質のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1392〜1945に示されている。配列番号６で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号６で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号６で示される塩基配列において、塩基番号1172、1175、1180、1183、1189、1204、1209、1267、1271、1278、1281、1313、1319、1332、1334、1338、1346、1352、1358、1366、1378、1392、1402、1433、1436、1438等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、FLJ32130遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFLJ32130遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号７で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC002310に記載される塩基配列の塩基番号1〜2379で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号７で示される塩基配列においては、ヒト由来のFLJ32130タンパク質のアミノ酸末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2136〜2138に示されており、上記エクソン１と考えられる塩基配列は、塩基番号2136〜2379に示されている。配列番号７で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号７で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号７で示される塩基配列において、塩基番号1714、1716、1749、1753、1762、1795、1814、1894、1911、1915、1925、1940、1955、1968等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、PPARG angiopoietin-related protein遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related protein遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号８で示される塩基配列があげられる。配列番号８で示される塩基配列においては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related proteinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号717〜719に示されており、上記エクソン１の５’側部分の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。配列番号８で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号８で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号８で示される塩基配列において、塩基番号35、43、51、54、75、85、107、127、129、143、184、194、223、227、236、251、258等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Thrombomodulin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のThrombomodulin遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号９で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF495471に記載される塩基配列の塩基番号1〜6096で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号９で示される塩基配列においては、ヒト由来のThrombomodulinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2590〜2592に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号2048〜6096に示されている。配列番号９で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号９で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号９で示される塩基配列において、塩基番号1539、1551、1571、1579、1581、1585、1595、1598、1601、1621、1632、1638、1645、1648、1665、1667、1680、1698、1710、1724、1726、1756等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、p53-responsive gene 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１０で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009471に記載される塩基配列の塩基番号113501〜116000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１０で示される塩基配列においては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1558〜1808に示されている。配列番号１０で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１０で示される塩基配列において、塩基番号1282、1284、1301、1308、1315、1319、1349、1351、1357、1361、1365、1378、1383等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Fibrillin2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC113387に記載される塩基配列の塩基番号118801〜121000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１１で示される塩基配列においては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1091〜1345に示されている。配列番号１１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１１で示される塩基配列において、塩基番号679、687、690、699、746、773、777、783、795、799、812、823、830、834、843等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Neurofilament3遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF106564に記載される塩基配列の塩基番号28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１２で示される塩基配列においては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号614〜1694に示されている。配列番号１２で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１２で示される塩基配列において、塩基番号428、432、443、451、471、475、482、491、499、503、506、514、519、532、541、544、546、563、566、572、580等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、disintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009225に記載される塩基配列の塩基番号21001〜23300で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１３で示される塩基配列においては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1194〜1630に示されている。配列番号１３で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１３で示される塩基配列において、塩基番号998、1003、1007、1011、1016、1018、1020、1026、1028、1031、1035、1041、1043、1045、1051、1053、1056、1060、1066、1068、1070、1073、1093、1096、1106、1112、1120、1124、1126等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G protein-coupled receptor 7遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009800に記載される塩基配列の塩基番号75001〜78000で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１４で示される塩基配列においては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1666〜2652に示されている。配列番号１４で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１４で示される塩基配列において、塩基番号1480、1482、1485、1496、1513、1526、1542、1560、1564、1568、1570、1580、1590、1603、1613、1620等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC008971に記載される塩基配列の塩基番号57001〜60000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１５で示される塩基配列においては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号776〜2632に示されている。配列番号１５で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１５で示される塩基配列において、塩基番号470、472、490、497、504、506、509、514、522、540、543、552、566、582、597、610、612等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026802に記載される塩基配列の塩基番号78801〜81000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１６で示される塩基配列においては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1479〜1804に示されている。配列番号１６で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１６で示される塩基配列において、塩基番号1002、1010、1019、1021、1051、1056、1061、1063、1080、1099、1110、1139、1141、1164、1169、1184等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
本発明における「（目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、）増幅されたＤＮＡの量」とは、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的領域におけるメチル化されたＤＮＡの増幅後の量そのもの、即ち、本発明測定方法の第三工程で求めた量を意味するものである。例えば、生物由来検体が１ｍＬの血清であった場合には、血清１ｍＬ中に含まれる前記のメチル化されたＤＮＡに基づいて増幅されたＤＮＡの量を意味する。
本発明（特に、本発明メチル化割合測定方法）における「メチル化割合」とは、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの増幅後の量とメチル化されていないＤＮＡの増幅後の量との合計量を、メチル化されたＤＮＡの増幅後の量で除した数値を意味するものである。
本発明における「前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ」とは、前記制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧにおけるシトシンがメチル化されていないシトシンである一本鎖ＤＮＡを意味するものである。また「前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡにおける前記制限酵素の認識部位の中に存在している全てのＣｐＧにおけるシトシンがメチル化されている一本鎖ＤＮＡを意味するものである。
本発明測定方法の第一工程において、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の一本鎖ＤＮＡを選択する。
本発明測定方法の第一工程における「一本鎖固定化オリゴヌクレオチド」は、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチド（以下、本固定化オリゴヌクレオチドと記すこともある。）である。
本固定化オリゴヌクレオチドは、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を選択するために用いられる。本固定化オリゴヌクレオチドは、５〜５０塩基長であることが望ましい。
本固定化オリゴヌクレオチドの５’末端側は、担体と固定化され得るものであり、一方その３’末端側は、後述する第二前工程及び第Ａ２工程により５’末端から３’末端に向かって進行する一回伸長反応が可能なようにフリーな状態であればよい。ここで「担体と固定化され得るもの」とは、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を選択する際に本固定化オリゴヌクレオチドが担体に固定化されていればよく、（１）当該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化オリゴヌクレオチドとの結合前の段階で、本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により固定化されるものであってもよく、また（２）当該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化オリゴヌクレオチドとの結合後の段階で、本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により固定化されるものであってもよい。
このような構造を得るには、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、本オリゴヌクレオチドと記すこともある。）の５’末端を通常の遺伝子工学的な操作方法又は市販のキット・装置等に従い、担体に固定すればよい（固相への結合）。具体的には例えば、本オリゴヌクレオチドの５’末端をビオチン化した後、得られたビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体（例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ等）に固定する方法を挙げることができる。
また、本オリゴヌクレオチドの５’末端側に、アミノ基、アルデヒド基、チオール基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、これを表面がシランカップリング剤等で活性化させたガラス、シリカ若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に、例えば、トリグリセリドを５個直列に連結したもの等のスペーサー、クロスリンカー等を介して共有結合させる方法も挙げられる。またさらに、ガラス若しくはシリコン製の支持体の上で直接、本オリゴヌクレオチドの５’末端側から化学合成させる方法も挙げられる。
本発明測定方法の第一工程における「一本鎖固定化オリゴヌクレオチド」は、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチド（以下、本固定化オリゴヌクレオチドと記すこともある。）である。
本固定化オリゴヌクレオチドは、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を選択するために用いられる。本固定化オリゴヌクレオチドは、５〜５０塩基長であることが望ましい。
本固定化オリゴヌクレオチドの５’末端側は、担体と固定化され得るものであり、一方その３’末端側は、後述する第二前工程及び第Ａ２工程により５’末端から３’末端に向かって進行する一回伸長反応が可能なようにフリーな状態であればよい。ここで「担体と固定化され得るもの」とは、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を選択する際に本固定化オリゴヌクレオチドが担体に固定化されていればよく、（１）当該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化オリゴヌクレオチドとの結合前の段階で、本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により固定化されるものであってもよく、また（２）当該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化オリゴヌクレオチドとの結合後の段階で、本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により固定化されるものであってもよい。
このような構造を得るには、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、本オリゴヌクレオチドと記すこともある。）の５’末端を通常の遺伝子工学的な操作方法又は市販のキット・装置等に従い、担体に固定すればよい（固相への結合）。具体的には例えば、本オリゴヌクレオチドの５’末端をビオチン化した後、得られたビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体（例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ等）に固定する方法を挙げることができる。
また、本オリゴヌクレオチドの５’末端側に、アミノ基、アルデヒド基、チオール基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、これを表面がシランカップリング剤等で活性化させたガラス、シリカ若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に、例えば、トリグリセリドを５個直列に連結したもの等のスペーサー、クロスリンカー等を介して共有結合させる方法も挙げられる。またさらに、ガラス若しくはシリコン製の支持体の上で直接、本オリゴヌクレオチドの５’末端側から化学合成させる方法も挙げられる。
本発明測定方法の第一工程は、具体的には例えば、本固定化オリゴヌクレオチドがビオチン化オリゴヌクレオチドの場合には、
（ａ）まず、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に、アニーリングバッファー及びビオチン化オリゴヌクレオチド（当該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化オリゴヌクレオチドとの結合後の段階で、本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により固定化されるものであるために、現段階では遊離状態にあるもの）を添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に存在する目的とするＤＮＡ領域を含む二本鎖ＤＮＡを一本鎖にするために、９５℃で数分間加熱する。その後、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、ビオチン化オリゴヌクレオチドのＴｍ値の約１０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。
（ｂ）その後、室温に戻す。
（ｃ）ストレプトアビジンで被覆した支持体に、上記（ｂ）で得られた混合物を添加し、さらに、これを３７℃で数分間保温することにより、ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定する。
因みに、前述の如く、上記（ａ）〜（ｃ）では、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの結合を、ビオチン化オリゴヌクレオチドとストレプトアビジンで被覆した支持体との固定よりも前段階で実施しているが、この順番は、どちらが先でも構わない。即ち、例えば、ストレプトアビジンで被覆した支持体に固定化されたビオチン化オリゴヌクレオチドに、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料を添加することにより混合物を得て、得られた混合物を生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に存在する目的とするＤＮＡ領域を含む二本鎖ＤＮＡを一本鎖にするために、９５℃で数分間加熱し、その後ビオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、ビオチン化オリゴヌクレオチドのＴｍ値の約１０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温してもよい。
（ｄ）このようにしてビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した後、残溶液の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。
より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加し、その後当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合には、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加し、その後当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
次いで、このような操作を数回実施することにより、残溶液の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。
当該操作は、固定化されていないＤＮＡ、又は、後述の制限酵素で消化された溶液中に浮遊しているＤＮＡ、を反応溶液から取り除くため、重要である。これら操作が不十分であれば、反応溶液中に浮遊しているＤＮＡが鋳型となり、増幅反応で予期せぬ増幅産物が得られることとなる。支持体と生物由来検体中ＤＮＡとの非特異的結合を避けるためには、目的領域とはまったく異なる塩基配列を有するＤＮＡ（例えば、ヒトの生物由来検体の場合は、ラットＤＮＡ等）を大量に生物由来検体に添加し、上記の操作を実施すればよい。
本発明測定方法の第一工程における好ましい態様としては、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させる際に、二価陽イオンを含有する反応系中で結合させることを挙げることができる。より好ましくは、二価陽イオンがマグネシウムイオンであることが挙げられる。ここで「二価陽イオンを含有する反応系」とは、前記一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させるために用いられるアニーリングバッファー中に二価陽イオンを含有するような反応系を意味し、具体的には例えば、マグネシウムイオンを構成要素とする塩（例えば、ＭｇＯＡｃ２、ＭｇＣｌ２等）を１ｍＭ〜６００ｍＭの濃度で含まれることがよい。
（ａ）まず、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に、アニーリングバッファー及びビオチン化オリゴヌクレオチド（当該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化オリゴヌクレオチドとの結合後の段階で、本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により固定化されるものであるために、現段階では遊離状態にあるもの）を添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に存在する目的とするＤＮＡ領域を含む二本鎖ＤＮＡを一本鎖にするために、９５℃で数分間加熱する。その後、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、ビオチン化オリゴヌクレオチドのＴｍ値の約１０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。
（ｂ）その後、室温に戻す。
（ｃ）ストレプトアビジンで被覆した支持体に、上記（ｂ）で得られた混合物を添加し、さらに、これを３７℃で数分間保温することにより、ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定する。
因みに、前述の如く、上記（ａ）〜（ｃ）では、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの結合を、ビオチン化オリゴヌクレオチドとストレプトアビジンで被覆した支持体との固定よりも前段階で実施しているが、この順番は、どちらが先でも構わない。即ち、例えば、ストレプトアビジンで被覆した支持体に固定化されたビオチン化オリゴヌクレオチドに、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料を添加することにより混合物を得て、得られた混合物を生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に存在する目的とするＤＮＡ領域を含む二本鎖ＤＮＡを一本鎖にするために、９５℃で数分間加熱し、その後ビオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、ビオチン化オリゴヌクレオチドのＴｍ値の約１０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温してもよい。
（ｄ）このようにしてビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した後、残溶液の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。
より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加し、その後当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合には、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加し、その後当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
次いで、このような操作を数回実施することにより、残溶液の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。
当該操作は、固定化されていないＤＮＡ、又は、後述の制限酵素で消化された溶液中に浮遊しているＤＮＡ、を反応溶液から取り除くため、重要である。これら操作が不十分であれば、反応溶液中に浮遊しているＤＮＡが鋳型となり、増幅反応で予期せぬ増幅産物が得られることとなる。支持体と生物由来検体中ＤＮＡとの非特異的結合を避けるためには、目的領域とはまったく異なる塩基配列を有するＤＮＡ（例えば、ヒトの生物由来検体の場合は、ラットＤＮＡ等）を大量に生物由来検体に添加し、上記の操作を実施すればよい。
本発明測定方法の第一工程における好ましい態様としては、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させる際に、二価陽イオンを含有する反応系中で結合させることを挙げることができる。より好ましくは、二価陽イオンがマグネシウムイオンであることが挙げられる。ここで「二価陽イオンを含有する反応系」とは、前記一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させるために用いられるアニーリングバッファー中に二価陽イオンを含有するような反応系を意味し、具体的には例えば、マグネシウムイオンを構成要素とする塩（例えば、ＭｇＯＡｃ２、ＭｇＣｌ２等）を１ｍＭ〜６００ｍＭの濃度で含まれることがよい。
本発明測定方法の第二工程において、第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡを少なくとも１種類以上の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）を除去する。
本発明測定方法の第二工程における「メチル化感受性制限酵素」とは、例えば、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているＤＮＡの場合には、当該メチル化感受性制限酵素を当該ＤＮＡに作用させても、当該ＤＮＡは切断されない。これに対して、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないＤＮＡの場合には、当該メチル化感受性制限酵素を当該ＤＮＡに作用させれば、当該ＤＮＡは切断される。このようなメチル化感受性酵素の具体的な例としては、例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等を挙げることができる。尚、前記のメチル化感受性制限酵素は、ヘミメチル状態のＣｐＧ対を含む二本鎖ＤＮＡ（即ち、前記ＣｐＧ対のうち、一方の鎖のシトシンがメチル化されており、他方の鎖のシトシンがメチル化されていないような二本鎖ＤＮＡ）を切断しないものであり、すでにGruenbaumらにより明らかにされている（Nucleic Acid Research, 9、 2509-2515）。また「一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素」とは、一本鎖ＤＮＡ中の、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素の中には一本鎖ＤＮＡを消化するものも存在しており、例えば、HhaI等を挙げることができる。
本発明測定方法の第二工程における「メチル化感受性制限酵素」とは、例えば、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているＤＮＡの場合には、当該メチル化感受性制限酵素を当該ＤＮＡに作用させても、当該ＤＮＡは切断されない。これに対して、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないＤＮＡの場合には、当該メチル化感受性制限酵素を当該ＤＮＡに作用させれば、当該ＤＮＡは切断される。このようなメチル化感受性酵素の具体的な例としては、例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等を挙げることができる。尚、前記のメチル化感受性制限酵素は、ヘミメチル状態のＣｐＧ対を含む二本鎖ＤＮＡ（即ち、前記ＣｐＧ対のうち、一方の鎖のシトシンがメチル化されており、他方の鎖のシトシンがメチル化されていないような二本鎖ＤＮＡ）を切断しないものであり、すでにGruenbaumらにより明らかにされている（Nucleic Acid Research, 9、 2509-2515）。また「一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素」とは、一本鎖ＤＮＡ中の、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素の中には一本鎖ＤＮＡを消化するものも存在しており、例えば、HhaI等を挙げることができる。
当該メチル化感受性制限酵素による消化の有無を調べる方法としては、具体的には例えば、前記ＤＮＡを鋳型とし、解析対象とするシトシンを認識配列に含むＤＮＡを増幅可能なプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡの増幅（増幅産物）の有無を調べる方法をあげることができる。解析対象とするシトシンがメチル化されている場合には、増幅産物が得られる。一方、解析対象とするシトシンがメチル化されていない場合には、増幅産物が得られない。このようにして、増幅されたＤＮＡの量を比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化されている割合を測定することができる。
因みに、第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡにおいて、目的とするＤＮＡ領域は一本鎖状態であり、負鎖としての一本鎖固定化オリゴヌクレオチドは、目的とするＤＮＡ領域とは結合しないため、、当該一本鎖ＤＮＡ鎖は生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来の一本鎖ＤＮＡである。従って、前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素がメチル状態である一本鎖ＤＮＡを切断しないという特性を利用することにより、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧにおけるシトシンがメチル化されていたか否かを区別することができる。即ち、前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理することにより、仮に生物由来検体生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧにおけるシトシンがメチル化されていないのであれば、当該一本鎖ＤＮＡはアンメチル状態であり、前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素により切断される。また仮に生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全てのＣｐＧにおけるシトシンがメチル化されていたのであれば、前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素により切断されない。従って、消化処理を実施した後、後述のように、前記の目的とするＤＮＡ領域を増幅可能な一対のプライマーを用いたＰＣＲを実施すると、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧにおけるシトシンがメチル化されていないのであれば、ＰＣＲによる増幅産物は得られず、一方、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全てのＣｐＧにおけるシトシンがメチル化されていたのであれば、ＰＣＲによる増幅産物が得られることになる。
尚、本発明測定方法の第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡは、一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと結合した部分のみ二本鎖を形成しており、目的領域とするＤＮＡ領域の殆どは一本鎖状態である。殆どのメチル化感受性制限酵素は、アンメチル化状態であっても一本鎖ＤＮＡを消化できないが、前述の通り、一部のメチル化感受性制限酵素はアンメチル化状態の一本鎖ＤＮＡを消化できる。一本鎖ＤＮＡを消化するメチル化感受性制限酵素としては、例えば、HhaIがあり、このような酵素を利用することにより、一本鎖ＤＮＡのメチル化の有無を判別することができる。即ち、上記の操作で得られた一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと結合した検体中のＤＮＡの一本鎖部分の、HhaIの認識部位に含まれるＣｐＧのシトシンがメチル化されていたならば、HhaIは、このＤＮＡを消化することができず、一方メチル化されていなければ、HhaIは、このＤＮＡを消化する。従って、上記反応を実施した後、目的とするＤＮＡ領域を増幅可能な一対のプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施すると、検体中のＤＮＡがアンメチル化状態であれば増幅産物は得られず、検体中のＤＮＡがメチル化状態であれば増幅産物が得られることになる。
因みに、第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡにおいて、目的とするＤＮＡ領域は一本鎖状態であり、負鎖としての一本鎖固定化オリゴヌクレオチドは、目的とするＤＮＡ領域とは結合しないため、、当該一本鎖ＤＮＡ鎖は生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来の一本鎖ＤＮＡである。従って、前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素がメチル状態である一本鎖ＤＮＡを切断しないという特性を利用することにより、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧにおけるシトシンがメチル化されていたか否かを区別することができる。即ち、前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理することにより、仮に生物由来検体生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧにおけるシトシンがメチル化されていないのであれば、当該一本鎖ＤＮＡはアンメチル状態であり、前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素により切断される。また仮に生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全てのＣｐＧにおけるシトシンがメチル化されていたのであれば、前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素により切断されない。従って、消化処理を実施した後、後述のように、前記の目的とするＤＮＡ領域を増幅可能な一対のプライマーを用いたＰＣＲを実施すると、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧにおけるシトシンがメチル化されていないのであれば、ＰＣＲによる増幅産物は得られず、一方、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全てのＣｐＧにおけるシトシンがメチル化されていたのであれば、ＰＣＲによる増幅産物が得られることになる。
尚、本発明測定方法の第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡは、一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと結合した部分のみ二本鎖を形成しており、目的領域とするＤＮＡ領域の殆どは一本鎖状態である。殆どのメチル化感受性制限酵素は、アンメチル化状態であっても一本鎖ＤＮＡを消化できないが、前述の通り、一部のメチル化感受性制限酵素はアンメチル化状態の一本鎖ＤＮＡを消化できる。一本鎖ＤＮＡを消化するメチル化感受性制限酵素としては、例えば、HhaIがあり、このような酵素を利用することにより、一本鎖ＤＮＡのメチル化の有無を判別することができる。即ち、上記の操作で得られた一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと結合した検体中のＤＮＡの一本鎖部分の、HhaIの認識部位に含まれるＣｐＧのシトシンがメチル化されていたならば、HhaIは、このＤＮＡを消化することができず、一方メチル化されていなければ、HhaIは、このＤＮＡを消化する。従って、上記反応を実施した後、目的とするＤＮＡ領域を増幅可能な一対のプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施すると、検体中のＤＮＡがアンメチル化状態であれば増幅産物は得られず、検体中のＤＮＡがメチル化状態であれば増幅産物が得られることになる。
本発明測定方法の第二工程は、具体的には例えば、本固定化オリゴヌクレオチドがビオチン化オリゴヌクレオチドの場合には、以下のように実施すればよい。第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡに、最適な10×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を3μL、1mg/mL BSA水溶液を3μL、メチル化感受性制限酵素HpaII又はHhaI（10U/μL）等を夫々1.5μL加え、次いで当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を30μLとし、37℃で１時間〜３時間インキュベーションすればよい。
このようにして第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡを少なくとも１種類以上の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。
より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加した後、当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合は、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加した後、当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
次いで、このような操作を数回実施することにより、消化物（前記制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）する。
より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加した後、当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合は、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加した後、当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
次いで、このような操作を数回実施することにより、消化物（前記制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）する。
尚、本発明測定方法の第二工程における一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素による消化処理での懸念点として、メチル化されていないシトシンを含む認識配列を完全に消化できない（所謂「ＤＮＡの切れ残し」）虞を挙げることができる。このような虞が問題となる場合には、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位が多く存在すれば、「ＤＮＡの切れ残し」を最小限に抑えることができるので、目的とするＤＮＡ領域としては、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位を少なくとも１つ以上有しており、その認識部位が多ければ多いほどよいと考えられる。
尚、本発明測定方法又は後述のメチル化割合測定方法において、「生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料」が、当該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。ここで、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）を固定化オリゴヌクレオチドで選択する場合には、短い鋳型ＤＮＡの方がより選択され易く、また、ＰＣＲで目的領域を増幅する場合にも、鋳型ＤＮＡが短い方がよいと考えられるので、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素を生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に直接使用し消化処理を実施してもよい。尚、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素により消化処理する方法としては、一般的な制限酵素処理法を用いればよい。
また、「生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料」が、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。
これらの好ましい態様は、生物由来検体そのものを予め上記のような制限酵素で消化処理しておくことにより、メチル化量を精度良く求めることができるためである。当該方法は、上記のような「ＤＮＡの切れ残し」を無くすのに有用である。
生物由来検体に含まれるゲノムＤＮＡ由来の試料をメチル化感受性制限酵素により消化する方法としては、生物由来検体がゲノムＤＮＡ自体の場合には一般的な制限酵素での処理法を用いればよく、生物由来検体が組織溶解液、細胞溶解液等の場合には、大過剰のメチル化感受性制限酵素、例えば、25ngのＤＮＡ量に対して500倍量（10U）又はそれ以上のメチル化感受性制限酵素を用いて消化処理を実施すればよい。因みに、上記の操作においては、ゲノムＤＮＡは二本鎖ＤＮＡとして存在しているので、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素（例えば、HhaI）だけでなく、二本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素（例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等等）を用いることができる。
また、「生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料」が、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。
これらの好ましい態様は、生物由来検体そのものを予め上記のような制限酵素で消化処理しておくことにより、メチル化量を精度良く求めることができるためである。当該方法は、上記のような「ＤＮＡの切れ残し」を無くすのに有用である。
生物由来検体に含まれるゲノムＤＮＡ由来の試料をメチル化感受性制限酵素により消化する方法としては、生物由来検体がゲノムＤＮＡ自体の場合には一般的な制限酵素での処理法を用いればよく、生物由来検体が組織溶解液、細胞溶解液等の場合には、大過剰のメチル化感受性制限酵素、例えば、25ngのＤＮＡ量に対して500倍量（10U）又はそれ以上のメチル化感受性制限酵素を用いて消化処理を実施すればよい。因みに、上記の操作においては、ゲノムＤＮＡは二本鎖ＤＮＡとして存在しているので、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素（例えば、HhaI）だけでなく、二本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素（例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等等）を用いることができる。
本発明測定方法の第三工程において、下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）を前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドから一旦分離する工程（第一前工程）と、
生成した遊離の一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の生成した遊離の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する工程（第二（Ａ）前工程）と、
当該工程（第二（Ａ）前工程）で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする工程（第二（Ｂ）前工程）と
を有する工程（第二前工程）と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖状態であるＤＮＡ（前記の一本鎖状態であるＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖ＤＮＡ）を、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三前工程）とを有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の生成した一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ａ１工程と、第Ａ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の選択された一本鎖状態であるＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ａ２工程とを有する第Ａ工程（本工程）と、
（ｂ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の生成した一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｂ工程（本工程）とを有し、
さらに第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する。
生成した遊離の一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の生成した遊離の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する工程（第二（Ａ）前工程）と、
当該工程（第二（Ａ）前工程）で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする工程（第二（Ｂ）前工程）と
を有する工程（第二前工程）と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖状態であるＤＮＡ（前記の一本鎖状態であるＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖ＤＮＡ）を、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三前工程）とを有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の生成した一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ａ１工程と、第Ａ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の選択された一本鎖状態であるＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ａ２工程とを有する第Ａ工程（本工程）と、
（ｂ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の生成した一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｂ工程（本工程）とを有し、
さらに第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する。
本発明測定方法の第三工程では、まず、下記の各本工程の前工程のうち第一前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）を前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドから一旦分離して一本鎖状態であるＤＮＡにする。具体的には例えば、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）と前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとが結合したＤＮＡサンプルに、アニーリングバッファーを添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を９５℃で数分間加熱する。その後、第二前工程における第二（Ａ）前工程では、具体的に例えば、第一工程に準じて実施すれば良く、生成した遊離の一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとが結合してなる前記の生成した遊離の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する。
Ｐ２工程においては、具体的には例えば、本固定化オリゴヌクレオチドがビオチン化オリゴヌクレオチドの場合には、以下のように実施すればよい。
第一前工程で分離されることにより生成した遊離の一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとに、滅菌超純水を17.85μL、最適な１０×緩衝液（100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2）を3μL、2mM dNTPを3μL、5N ベタインを6μL加え、次いで当該混合物にAmpliTaq（ＤＮＡポリメラーゼの１種：5U/μL）を0.15μL加えて液量を30μLとし、37℃で2時間インキュベーションする。その後、インキュベーションされた溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加し、当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加した後、当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合は、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加した後、当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
次いで、このような操作を数回実施することにより、残溶液の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。
第三前工程においては、第二前工程で伸長形成された二本鎖状態であるＤＮＡ（前記の一本鎖状態であるＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖状態であるＤＮＡ）を一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する。具体的には例えば、第二（ｂ）前工程で得られた二本鎖状態であるＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖状態であるＤＮＡ）に、アニーリングバッファーを添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物をを９５℃で数分間加熱する。
その後、本工程として、
(i)生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）を、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチド（負鎖）にアニーリングさせるために、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチド（負鎖）のＴｍ値の約１０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。
(ii)その後、室温に戻す。（第Ａ工程における第Ａ１工程）
(iii)上記(i)で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる（即ち、第Ａ工程における第Ａ２工程）。具体的には例えば、後述の説明や前述の本発明測定方法の第二（Ｂ）前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(iv)生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成される（即ち、第Ｂ工程）。具体的には例えば、上記(iii)と同様に、後述の説明や前述の本発明測定方法の第二（Ｂ）前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(v)さらに第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すこと（例えば、第Ａ工程及び第Ｂ工程）により、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する。具体的には例えば、上記と同様に、後述の説明や前述の本発明測定方法の第三工程における第二（Ｂ）前工程、第Ａ工程及び第Ｂ工程での操作方法等に準じて実施すればよい。
Ｐ２工程においては、具体的には例えば、本固定化オリゴヌクレオチドがビオチン化オリゴヌクレオチドの場合には、以下のように実施すればよい。
第一前工程で分離されることにより生成した遊離の一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとに、滅菌超純水を17.85μL、最適な１０×緩衝液（100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2）を3μL、2mM dNTPを3μL、5N ベタインを6μL加え、次いで当該混合物にAmpliTaq（ＤＮＡポリメラーゼの１種：5U/μL）を0.15μL加えて液量を30μLとし、37℃で2時間インキュベーションする。その後、インキュベーションされた溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加し、当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加した後、当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合は、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量のＴＥバッファーを添加した後、当該ＴＥバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
次いで、このような操作を数回実施することにより、残溶液の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。
第三前工程においては、第二前工程で伸長形成された二本鎖状態であるＤＮＡ（前記の一本鎖状態であるＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖状態であるＤＮＡ）を一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する。具体的には例えば、第二（ｂ）前工程で得られた二本鎖状態であるＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖状態であるＤＮＡ）に、アニーリングバッファーを添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物をを９５℃で数分間加熱する。
その後、本工程として、
(i)生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）を、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチド（負鎖）にアニーリングさせるために、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチド（負鎖）のＴｍ値の約１０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。
(ii)その後、室温に戻す。（第Ａ工程における第Ａ１工程）
(iii)上記(i)で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる（即ち、第Ａ工程における第Ａ２工程）。具体的には例えば、後述の説明や前述の本発明測定方法の第二（Ｂ）前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(iv)生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成される（即ち、第Ｂ工程）。具体的には例えば、上記(iii)と同様に、後述の説明や前述の本発明測定方法の第二（Ｂ）前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(v)さらに第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すこと（例えば、第Ａ工程及び第Ｂ工程）により、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する。具体的には例えば、上記と同様に、後述の説明や前述の本発明測定方法の第三工程における第二（Ｂ）前工程、第Ａ工程及び第Ｂ工程での操作方法等に準じて実施すればよい。
第三工程は、具体的には、第一前工程から開始して本工程に至るまでの反応を、一つのＰＣＲ反応として実施することもできる。また、第一前工程からと第三前工程まで、各々、独立した反応として実施し、本工程のみをＰＣＲ反応として実施することもできる。
一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素による消化処理の後に目的とするＤＮＡ領域（即ち、目的領域）を増幅する方法としては、例えば、ＰＣＲを用いることができる。目的領域を増幅する際に、片側のプライマーとして固定化オリゴヌクレオチドを用いることができるので、もう一方のプライマーのみ添加してＰＣＲを行うことにより、増幅産物が得られ、その増幅産物も固定化されることとなる。この際、予め蛍光等で標識されたプライマーを使用してその標識を指標とすれば、電気泳動等の煩わしい操作を実施せずに増幅産物の有無を評価できる。ＰＣＲ反応液としては、例えば、本発明測定方法の第二工程で得たＤＮＡに、50μMのプライマーの溶液を0.15μlと、2mM dNTPを2.5μlと、10×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、20mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を2.5μlと、AmpliTaq Gold (耐熱性DNAポリメラーゼの一種： 5U/μl)を0.2μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を25μlとした反応液をあげることができる。
目的とするＤＮＡ領域（即ち、目的領域）は、ＧＣリッチな塩基配列が多いため、時に、ベタイン、ＤＭＳＯ等を適量加えて反応を実施してもよい。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで55〜65℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を１サイクルとする保温を30〜40サイクル行う条件があげられる。かかるＰＣＲを行った後、得られた増幅産物を検出する。例えば、予め標識されたプライマーを使用した場合には、先と同様の洗浄・精製操作を実施後、固定化された蛍光標識体の量を測定することができる。また、標識されていない通常のプライマーを用いたＰＣＲを実施した場合は、金コロイド粒子、蛍光等で標識したプローブ等をアニーリングさせ、目的領域に結合した当該プローブの量を測定することにより検出することができる。また、増幅産物の量をより精度よく求めるには、例えば、リアルタイムＰＣＲ法を用いればよい。リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲをリアルタイムでモニターし、得られたモニター結果をカイネティックス分析する方法であり、例えば、遺伝子量に関して２倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量ＰＣＲ法として知られる方法である。当該リアルタイムＰＣＲ法には、例えば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法、サイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等を挙げることができる。リアルタイムＰＣＲ法のための装置及びキットは市販されるものを利用してもよい。以上の如く、検出については特に限定されることはなく、これまでに周知のあらゆる方法による検出が可能である。これら方法では、反応容器を移し換えることなく検出までの操作が可能となる。
目的とするＤＮＡ領域（即ち、目的領域）は、ＧＣリッチな塩基配列が多いため、時に、ベタイン、ＤＭＳＯ等を適量加えて反応を実施してもよい。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで55〜65℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を１サイクルとする保温を30〜40サイクル行う条件があげられる。かかるＰＣＲを行った後、得られた増幅産物を検出する。例えば、予め標識されたプライマーを使用した場合には、先と同様の洗浄・精製操作を実施後、固定化された蛍光標識体の量を測定することができる。また、標識されていない通常のプライマーを用いたＰＣＲを実施した場合は、金コロイド粒子、蛍光等で標識したプローブ等をアニーリングさせ、目的領域に結合した当該プローブの量を測定することにより検出することができる。また、増幅産物の量をより精度よく求めるには、例えば、リアルタイムＰＣＲ法を用いればよい。リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲをリアルタイムでモニターし、得られたモニター結果をカイネティックス分析する方法であり、例えば、遺伝子量に関して２倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量ＰＣＲ法として知られる方法である。当該リアルタイムＰＣＲ法には、例えば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法、サイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等を挙げることができる。リアルタイムＰＣＲ法のための装置及びキットは市販されるものを利用してもよい。以上の如く、検出については特に限定されることはなく、これまでに周知のあらゆる方法による検出が可能である。これら方法では、反応容器を移し換えることなく検出までの操作が可能となる。
さらに、一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列のビオチン化オリゴヌクレオチドを片側のプライマー、又は、一本鎖固定化オリゴヌクレオチドより、３’端側に新しいビオチン化オリゴヌクレオチドを設計しそれを片側のプライマーとし、その相補側プライマーを用いて、目的領域を増幅することもできる。この場合、得られた増幅産物は、ストレプトアビジンで被覆した支持体があれば固定化されるので、例えば、ストレプトアビジンコートＰＣＲチューブでＰＣＲを実施した場合には、チューブ内に固定されるため、上記の通り、標識されたプライマーを用いれば、増幅産物の検出が容易である。また、先の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドが共有結合等による固定化の場合であれば、ＰＣＲで得られた増幅産物を含む溶液をストレプトアビジン被覆支持体が存在する容器に移し、増幅産物を固定化することが可能である。検出については、上述の通り実施すればよい。目的領域を増幅する相補側のプライマーは、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位を１つ以上有する目的領域を増幅でき、かつ、その認識部位を含まないプライマーでなければいけない。この理由は、以下の通りである。選択及び１回伸長反応で得られた二本鎖ＤＮＡの固定化オリゴヌクレオチド側のＤＮＡ鎖（新生鎖）の一番３’端側の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位のみがメチル化されていない場合には、その部分だけが一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化されることになる。消化後、前述のように洗浄操作を行っても、新生鎖で言う３’端の一部だけを失った二本鎖ＤＮＡが固定化されたままの状態で存在する。相補側のプライマーが、この一番３’端側の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位を含んでいた場合には、当該プライマーの３’端側の数塩基が、新生鎖の３’端の数塩基とアニーリングし、その結果、目的領域がＰＣＲにより増幅する可能性があるからである。
本発明は、本発明測定方法の第三工程の第一前工程の前操作段階又は後操作段階、或いは、第三工程の第三前工程の前操作段階又は後操作段階において、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有するような変法を含む。
即ち、
即ち、
（変法１）
本発明測定方法の第三工程の第一前工程の前操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
本発明測定方法の第三工程の、第二前工程と各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する第Ｃ工程（本工程）
本発明測定方法の第三工程の第一前工程の前操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
本発明測定方法の第三工程の、第二前工程と各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する第Ｃ工程（本工程）
（変法２）
本発明測定方法の第三工程の第一前工程の後操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、第一前工程及び上記の追加前工程を経て得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖ＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖ＤＮＡ）を一本鎖状態に一旦分離する工程（追加再前工程）を有し、且つ、
本発明測定方法の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法（以下、本発明メチル化割合測定方法と記すこともある。）
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する第Ｃ工程（本工程）
本発明測定方法の第三工程の第一前工程の後操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、第一前工程及び上記の追加前工程を経て得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖ＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖ＤＮＡ）を一本鎖状態に一旦分離する工程（追加再前工程）を有し、且つ、
本発明測定方法の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法（以下、本発明メチル化割合測定方法と記すこともある。）
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する第Ｃ工程（本工程）
（変法３）
本発明測定方法の第三工程の第三前工程の前操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
本発明測定方法の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する第Ｃ工程（本工程）
本発明測定方法の第三工程の第三前工程の前操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
本発明測定方法の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する第Ｃ工程（本工程）
（変法４）
本発明測定方法の第三工程の第三前工程の後操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、第一前工程及び上記の追加前工程を経て得られた未消化物である二本鎖ＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖ＤＮＡ）を一本鎖状態に一旦分離する工程（追加再前工程）を有し、且つ、
本発明測定方法の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法（以下、本発明メチル化割合測定方法と記すこともある。）
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する第Ｃ工程（本工程）
本発明測定方法の第三工程の第三前工程の後操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、第一前工程及び上記の追加前工程を経て得られた未消化物である二本鎖ＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖ＤＮＡ）を一本鎖状態に一旦分離する工程（追加再前工程）を有し、且つ、
本発明測定方法の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法（以下、本発明メチル化割合測定方法と記すこともある。）
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する第Ｃ工程（本工程）
当該変法では、外部から「前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）」を反応系内に添加すること等により、第三工程における前述の目的とするＤＮＡ領域の増幅効率を容易に向上させることが可能となる。尚、追加前工程で反応系内に添加される一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）は、一本鎖ＤＮＡの３'末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列であって、５'末端が、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと同じである塩基配列を有する遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチドであれば、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列であっても、又は、短い塩基配列であっても、或いは、長い塩基配列であってもよい。但し、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドよりも長い塩基配列の場合には、前記リバース用プライマー（正鎖）を伸長プライマーとし、当該一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を鋳型として、伸長プライマーを伸長させる反応に利用できない遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチドであることが重要である。
目的領域を増幅する際に、片側のプライマーとして固定化オリゴヌクレオチドを用いて、もう一方のプライマーのみ添加してＰＣＲを行う例を前記したが、目的産物の検出のために他の方法（例えば、ＰＣＲで得られた各々の増幅産物の量を比較することができる分析方法）を実施するのであれば、上記の如く、目的領域を増幅する際に、固定化オリゴヌクレオチドを一方（片側）のプライマーとして使用せず、一対のプライマーを添加してＰＣＲを実施してもよい。かかるＰＣＲを行った後、得られた増幅産物の量を求める。
本発明測定方法の第三工程は繰り返し工程を有するが、例えば、第Ａ１工程における「生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」とは、第１回目の第三工程の操作及び第２回目以降の第三工程の繰り返し操作の両操作において「生成した『遊離の』一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」を意味することになる。
また、第Ｂ工程における「生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）」とは、第１回目の第三工程の操作及び第２回目以降の第三工程の繰り返し操作の両操作において「生成した『固定の』一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」を意味する。但し、第三工程がさらに追加的にＣ工程を有する場合には、第１回目の第三工程の操作において「生成した『固定の』一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」を意味し、一方、第２回目以降の第三工程の繰り返し操作において「生成した『固定の』一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」と「生成した『遊離の』一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」との両者を意味することになる。
また、第Ｂ工程における「生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）」とは、第１回目の第三工程の操作及び第２回目以降の第三工程の繰り返し操作の両操作において「生成した『固定の』一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」を意味する。但し、第三工程がさらに追加的にＣ工程を有する場合には、第１回目の第三工程の操作において「生成した『固定の』一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」を意味し、一方、第２回目以降の第三工程の繰り返し操作において「生成した『固定の』一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」と「生成した『遊離の』一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」との両者を意味することになる。
また、第三工程の各本工程で得られた「伸長形成された二本鎖ＤＮＡ」とは、第Ａ工程の場合には、第１回目の第三工程の操作において「前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位に、アンメチル状態のＣｐＧ対を含まない伸長形成された二本鎖ＤＮＡ」を意味し、一方、第２回目以降の第三工程の繰り返し操作において「前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位に、アンメチル状態のＣｐＧ対を含まない伸長形成された二本鎖ＤＮＡ」と「前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位に、アンメチル状態のＣｐＧ対を含む伸長形成された二本鎖ＤＮＡ」との両者を意味することになる。第Ｂ工程の場合には、第１回目の第三工程の操作及び第２回目以降の第三工程の繰り返し操作の両操作において「前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位では全てがアンメチル状態のＣｐＧ対である伸長形成された二本鎖ＤＮＡ」を意味することになる。
尚、第三工程がさらに追加的にＣ工程を有する場合にも同様である。
尚、第三工程がさらに追加的にＣ工程を有する場合にも同様である。
また、第三工程がさらに追加的にＣ工程を有する場合において、第Ｃ１工程における「生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」とは、第１回目の第三工程の操作及び第２回目以降の第三工程の繰り返し操作の両操作において「生成した『遊離の』一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」を意味することになる。
また本発明は、本発明測定方法の工程として、下記の２つの工程をさらに追加的に有することを特徴とするメチル化割合の測定方法（即ち、本発明メチル化割合測定方法）を含む。
（４）本発明測定方法（前記の変法を含む）の第一工程を行った後、本発明測定方法（前記の変法を含む）の第二工程を行うことなく、本発明測定方法（前記の変法を含む）の第三工程を行うことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域のＤＮＡ（メチル化されたＤＮＡ及びメチルされていないＤＮＡの総量）を検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第四工程、及び、
（５）本発明測定方法（前記の変法を含む）の第三工程により定量されたＤＮＡの量と、第四工程により定量されたＤＮＡの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの割合を算出する第五工程
（４）本発明測定方法（前記の変法を含む）の第一工程を行った後、本発明測定方法（前記の変法を含む）の第二工程を行うことなく、本発明測定方法（前記の変法を含む）の第三工程を行うことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域のＤＮＡ（メチル化されたＤＮＡ及びメチルされていないＤＮＡの総量）を検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第四工程、及び、
（５）本発明測定方法（前記の変法を含む）の第三工程により定量されたＤＮＡの量と、第四工程により定量されたＤＮＡの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの割合を算出する第五工程
当該メチル化割合測定方法は、下記のような場面において利用すればよい。
各種疾患（例えば、癌）においてＤＮＡのメチル化異常が起こることが知られており、このＤＮＡメチル化異常を検出することにより、各種疾患の度合いを測定することが可能と考えられている。
例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100％メチル化されているＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法を実施すれば、メチル化されたＤＮＡの量は多くなり、例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100%メチル化されていないＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法を実施すれば、メチル化されたＤＮＡの量はほぼ０に近い値となるであろう。また、例えば、健常者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいてメチル化割合が低く且つ疾患患者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいてメチル化割合が高いＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法を実施すれば、健常者の場合には、メチル化されたＤＮＡの量は、０に近い値を示し、一方、疾患患者の場合には、健常者の場合における値よりも有意に高い値を示すため、この値の差異に基づき、「疾患の度合い」を判定することができる。ここでの「疾患の度合い」とは、一般に当該分野において使用される意味と同様であって、具体的には、例えば、生物由来検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を意味し、また、例えば、生物由来検体が組織である場合には当該組織における疾患細胞の存在量等を意味している。さらに、生物由来検体が血漿・血清である場合にはその個体が疾患を有する確率を意味している。従って、本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法は、メチル化異常を調べることにより、各種疾患を診断することを可能にする。
各種疾患（例えば、癌）においてＤＮＡのメチル化異常が起こることが知られており、このＤＮＡメチル化異常を検出することにより、各種疾患の度合いを測定することが可能と考えられている。
例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100％メチル化されているＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法を実施すれば、メチル化されたＤＮＡの量は多くなり、例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100%メチル化されていないＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法を実施すれば、メチル化されたＤＮＡの量はほぼ０に近い値となるであろう。また、例えば、健常者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいてメチル化割合が低く且つ疾患患者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいてメチル化割合が高いＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法を実施すれば、健常者の場合には、メチル化されたＤＮＡの量は、０に近い値を示し、一方、疾患患者の場合には、健常者の場合における値よりも有意に高い値を示すため、この値の差異に基づき、「疾患の度合い」を判定することができる。ここでの「疾患の度合い」とは、一般に当該分野において使用される意味と同様であって、具体的には、例えば、生物由来検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を意味し、また、例えば、生物由来検体が組織である場合には当該組織における疾患細胞の存在量等を意味している。さらに、生物由来検体が血漿・血清である場合にはその個体が疾患を有する確率を意味している。従って、本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法は、メチル化異常を調べることにより、各種疾患を診断することを可能にする。
このような本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法における、目的領域のメチル化されたＤＮＡ量の測定、メチル化割合の測定を行うための各種方法で使用し得る制限酵素、プライマー又はプローブは、検出用キットの試薬として有用である。本発明は、これら制限酵素、プライマー又はプローブ等を試薬として含有する検出用キットや、これらプライマー又はプローブ等が担体上に固定化されてなる検出用チップも提供しており、本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法の権利範囲は、当該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットや検出用チップのような形態での使用ももちろん含むものである。
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
ＡＴＣＣより購入された哺乳動物由来の結腸腺癌細胞株Ｃａｃｏ−２(ATCC NO.HTB-37)を、ＡＴＣＣのカタログに記載された細胞株のための専用培地でコンフルエントになるまで培養することにより、各々約１ｘ１０７細胞を得た。得られた細胞に、ＳＥＤＴＡバッファー［10mM Tris-HCl pH 8.0、10mM EDTA pH 8.0、100mM NaCl］を１０倍容量加えた後、これをホモジナイズした。
得られた混合物に、proteinase K（Sigma）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール［1M Tris-HCl、pH 8.0)にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱（ゲノムＤＮＡ）を回収した。回収された沈澱をＴＥバッファー（10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0）に溶解し、これに40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma）を加えて３７℃で１時間インキュベートした。インキュベートされた混合物をフェノール・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱することにより沈澱（ゲノムDNA）を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下のプライマー及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（以下、ＤＮＡフラグメントＸ２と記す。配列番号１８で示される塩基配列を有する。Genbank Accession No.AC009800等に示されるＧＰＲ７配列の塩基番号76477〜77002に相当する領域）を増幅した。
ＡＴＣＣより購入された哺乳動物由来の結腸腺癌細胞株Ｃａｃｏ−２(ATCC NO.HTB-37)を、ＡＴＣＣのカタログに記載された細胞株のための専用培地でコンフルエントになるまで培養することにより、各々約１ｘ１０７細胞を得た。得られた細胞に、ＳＥＤＴＡバッファー［10mM Tris-HCl pH 8.0、10mM EDTA pH 8.0、100mM NaCl］を１０倍容量加えた後、これをホモジナイズした。
得られた混合物に、proteinase K（Sigma）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール［1M Tris-HCl、pH 8.0)にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱（ゲノムＤＮＡ）を回収した。回収された沈澱をＴＥバッファー（10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0）に溶解し、これに40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma）を加えて３７℃で１時間インキュベートした。インキュベートされた混合物をフェノール・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱することにより沈澱（ゲノムDNA）を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下のプライマー及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（以下、ＤＮＡフラグメントＸ２と記す。配列番号１８で示される塩基配列を有する。Genbank Accession No.AC009800等に示されるＧＰＲ７配列の塩基番号76477〜77002に相当する領域）を増幅した。
PF3：5'-GTCCGCGGCGACATTGGG-3' （配列番号１９）
PR3：5'-CGATGAGCTTGCACATGAGCT-3' （配列番号２０）
PR3：5'-CGATGAGCTTGCACATGAGCT-3' （配列番号２０）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを２．５ｎｇと、３μＭに調製された配列番号１９及び配列番号２０で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各２．５μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを２．５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を２．５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、 5U/μl）を０．１２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２５μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで５９℃にて６０秒間さらに７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を５０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、目的のＤＮＡフラグメント（526bp）を切り出し、QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社）により、ＤＮＡフラグメントＸ２を精製した。
得られたＤＮＡフラグメントＸ２の一部をメチル化酵素ＳｓｓＩ（NEB社）により処理し、５’−ＣＧ−３’全てをメチル化したＤＮＡフラグメント（以下、ＤＮＡフラグメントＹ２と記す。）を得た。これについても、先と同様に、１．５％アガロース電気泳動により増幅を確認し、ＤＮＡフラグメント（526bp）を切り出し、QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社）により、ＤＮＡフラグメントＹ２を精製した。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、目的のＤＮＡフラグメント（526bp）を切り出し、QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社）により、ＤＮＡフラグメントＸ２を精製した。
得られたＤＮＡフラグメントＸ２の一部をメチル化酵素ＳｓｓＩ（NEB社）により処理し、５’−ＣＧ−３’全てをメチル化したＤＮＡフラグメント（以下、ＤＮＡフラグメントＹ２と記す。）を得た。これについても、先と同様に、１．５％アガロース電気泳動により増幅を確認し、ＤＮＡフラグメント（526bp）を切り出し、QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社）により、ＤＮＡフラグメントＹ２を精製した。
前記のＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２とアニーリングするオリゴヌクレオチドとして、配列番号２１に示される塩基配列を有する５’末端がビオチン標識されたオリゴヌクレオチドＢ１（19bp）を合成した。
＜ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
B1：5'-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3'（配列番号２１）
B1：5'-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3'（配列番号２１）
ＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２の各々別々（25pg/mL水溶液、10μL）に、５μＭビオチン化オリゴヌクレオチドＢ１を１μＬ、及び、アニーリングバッファー（0.5M チャーチリン酸バッファー、7% SDS、1mM EDTA水溶液）を１０μＬ添加することにより、混合物を得た。
次いで得られた混合物を、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に存在する目的とするＤＮＡ領域を含む二本鎖ＤＮＡを一本鎖にするために、９５℃で５分間加熱した。その後、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、５０℃まで速やかに冷却し、その温度で５分間保温した。次いで、これを３７℃で５分間保温した後、室温に戻し、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡフラグメントＸ２又はＤＮＡフラグメントＹ２）とビオチン化オリゴヌクレオチドとを結合させた（ＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２につき、各々３本作製）。
次に、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブに、上記のようにして、前調製された混合物を添加し、さらに、これを３７℃で５分間保温することにより、ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する。）。
次いで得られた混合物を、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に存在する目的とするＤＮＡ領域を含む二本鎖ＤＮＡを一本鎖にするために、９５℃で５分間加熱した。その後、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、５０℃まで速やかに冷却し、その温度で５分間保温した。次いで、これを３７℃で５分間保温した後、室温に戻し、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡフラグメントＸ２又はＤＮＡフラグメントＹ２）とビオチン化オリゴヌクレオチドとを結合させた（ＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２につき、各々３本作製）。
次に、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブに、上記のようにして、前調製された混合物を添加し、さらに、これを３７℃で５分間保温することにより、ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する。）。
次いで、前記のＰＣＲチューブから溶液を除去した後、１００μＬのＴＥバッファーを添加した後、当該ＴＥバッファーをピペッティングにより取り除いた。当該操作をさらに２回実施した。
このようにして選択され得られた一本鎖ＤＮＡについて、以下の３種の処理を施した。
このようにして選択され得られた一本鎖ＤＮＡについて、以下の３種の処理を施した。
Ａ群（無処理群）：上記で調製された一本鎖ＤＮＡに、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を３μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を３μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を３０μＬとした。
Ｂ群（ＨｐａＩＩによる消化処理群）：上記で調製された一本鎖ＤＮＡに、ＨｐａＩＩを１５Ｕと、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を３μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を３μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を３０μＬとした。
Ｂ群（ＨｈａＩによる消化処理群）：上記で調製された一本鎖ＤＮＡに、ＨｈａＩを夫々１５Ｕと、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を３μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を３μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を３０μＬとした。
各々の反応液を３７℃で１時間インキュベーション（消化処理）した後、上清を取り除き、１００μＬのＴＥバッファーを混合した後、当該ＴＥバッファーをピペッティングにより取り除いた（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
次に、得られた未消化物から、下記のプライマー及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化ＤＮＡ（配列番号２２で示される塩基配列を有する。Genbank Accession No.AC009800等に示されるＧＰＲ７配列の塩基番号76669〜76835に相当する領域）を増幅した。
PF4：5'-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3'（配列番号２３）
PR4：5'-GCGGAGTTGCCCGCCAGA-3'（配列番号２４）
PR4：5'-GCGGAGTTGCCCGCCAGA-3'（配列番号２４）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡに、３μＭに調製された配列番号２３及び配列番号２４で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各２．５μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを２．５μｌと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を２．５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）５Ｕ／μｌを０．１２５μｌと、５Ｎベタイン水溶液を５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２５μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで５９℃にて６０秒間さらに７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を３７サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
ＤＮＡフラグメントＸ２に関して、Ａ群（無処理群）、及びＢ群（HpaII処理群）の場合には、増幅が確認されその増幅産物が得られた。これに対してＣ群（HhaI処理群）の場合には、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。一方、ＤＮＡフラグメントＹ２に関しては、Ａ群（無処理群）、Ｂ群（HpaII処理群）、及びＣ群（HhaI処理群）の全ての場合で、増幅が確認されその増幅産物が得られた。
以上より、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを選択することが可能であること、且つ、一本鎖を消化できるメチル化感受性制限酵素（HhaI）を用いることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されていないＤＮＡを増幅することなく、メチル化されたＤＮＡのみを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量できることが確認された。
実施例２
実施例１で得られたＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２を用いて下記の試験を行った。
ＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２の各々別々を２５ｐｇ／ｍｌの割合になるようにラット血清１ｍＬに添加することにより、血清溶液を得た。当該血清溶液（ＤＮＡフラグメント25pg/mL水溶液、10μL）に、５μＭビオチン化オリゴヌクレオチドＢ１を１μＬ、及び、アニーリングバッファー（0.5M チャーチリン酸バッファー、7% SDS、1mM EDTA水溶液）を１０μＬ添加することにより、混合物を得た。
次いで得られた混合物を、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に存在する目的とするＤＮＡ領域を含む二本鎖ＤＮＡを一本鎖にするために、９５℃で５分間加熱した。その後、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、５０℃まで速やかに冷却し、その温度で５分間保温した。次いで、これを３７℃で５分間保温した後、室温に戻し、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとビオチン化オリゴヌクレオチドとを結合させた（ＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２につき、各々４本作製）。
次に、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブに、上記のようにして、前調製された混合物を添加し、さらに、これを３７℃で５分間保温することにより、ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する）。
実施例１で得られたＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２を用いて下記の試験を行った。
ＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２の各々別々を２５ｐｇ／ｍｌの割合になるようにラット血清１ｍＬに添加することにより、血清溶液を得た。当該血清溶液（ＤＮＡフラグメント25pg/mL水溶液、10μL）に、５μＭビオチン化オリゴヌクレオチドＢ１を１μＬ、及び、アニーリングバッファー（0.5M チャーチリン酸バッファー、7% SDS、1mM EDTA水溶液）を１０μＬ添加することにより、混合物を得た。
次いで得られた混合物を、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に存在する目的とするＤＮＡ領域を含む二本鎖ＤＮＡを一本鎖にするために、９５℃で５分間加熱した。その後、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、５０℃まで速やかに冷却し、その温度で５分間保温した。次いで、これを３７℃で５分間保温した後、室温に戻し、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとビオチン化オリゴヌクレオチドとを結合させた（ＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２につき、各々４本作製）。
次に、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブに、上記のようにして、前調製された混合物を添加し、さらに、これを３７℃で５分間保温することにより、ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する）。
次いで、前記のＰＣＲチューブから溶液を除去した後、１００μＬのＴＥバッファーを添加した後、当該ＴＥバッファーをピペッティングにより取り除いた。当該操作をさらに２回実施した。
このようにして選択され得られた一本鎖ＤＮＡについて、以下の２種の処理を施した。
このようにして選択され得られた一本鎖ＤＮＡについて、以下の２種の処理を施した。
Ａ群（無処理群）：上記で調製された一本鎖ＤＮＡに、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を３μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を３μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を３０μＬとした（各々２本作製）。
Ｂ群（ＨｈａＩによる消化処理群）：上記で調製された一本鎖ＤＮＡに、ＨｈａＩを１５Ｕと、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を３μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を３μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を３０μＬとした（各々２本作製）。
各々の反応液を３７℃で１時間インキュベーション（消化処理）した後、上清を取り除き、１００μＬのＴＥバッファーを混合した後、当該ＴＥバッファーをピペッティングにより取り除いた（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する。）。
次に、得られた未消化物から、下記のプライマー及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化ＤＮＡ（配列番号２２で示される塩基配列を有する。Genbank Accession No.AC009800等に示されるＧＰＲ７配列の塩基番号76669〜76835に相当する領域）を増幅した。
PF4：5'-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3'（配列番号２３）
PR4：5'-GCGGAGTTGCCCGCCAGA-3'（配列番号２４）
PR4：5'-GCGGAGTTGCCCGCCAGA-3'（配列番号２４）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡに、３μＭに調製した配列番号２３及び配列番号２４で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各２．５μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを２．５μｌと、１０×緩衝液（100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin）を２．５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）５Ｕ／μｌを０．１２５μｌと、５Ｎベタイン水溶液を５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２５μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６３℃にて６０秒間さらに７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を３５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
ＤＮＡフラグメントＸ２に関して、Ａ群（無処理群）の場合には、増幅が確認されその増幅産物が得られた。これに対してＢ群（HhaI処理群）の場合には、増幅は確認されずその増幅産物は得られなかった。一方、ＤＮＡフラグメントＹ２に関しては、Ａ群（無処理群）の場合及びＢ群（HhaI処理群）の両場合ともに、増幅が確認されその増幅産物が得られた。
以上より、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料としての血清溶液を用いても、前記の実施例１と同様に、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを選択することが可能であること、且つ、一本鎖を消化できるメチル化感受性制限酵素（HhaI）を用いることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されていないＤＮＡを増幅することなく、メチル化されたＤＮＡのみを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量できることが確認された。
実施例３
実施例１で得られたＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２を用いて下記の試験を行った。
ＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２の０、０．１、１、及び１０ｐｇ/１０μＬのＴＥバッファー（10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0）溶液を調製した。これらＴＥバッファー溶液１０μＬ各々別々に、５μＭビオチン化オリゴヌクレオチドＢ１を１μＬ、１０×アニーリングバッファー（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を２μL、及び、滅菌超純水を７μＬ添加することにより、混合物を得た。
次いで得られた混合物を、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に存在する目的とするＤＮＡ領域を含む二本鎖ＤＮＡを一本鎖にするために、９５℃で５分間加熱した。その後、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、５０℃まで速やかに冷却し、その温度で５分間保温した。次いで、これを３７℃で５分間保温した後、室温に戻し、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡフラグメントＸ２又はＤＮＡフラグメントＹ２）とビオチン化オリゴヌクレオチドとを結合させた（ＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２につき、各々２本作製）。
次に、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブに、上記のようにして、前調製された混合物を添加し、さらに、これを３７℃で５分間保温することにより、ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する。）。
実施例１で得られたＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２を用いて下記の試験を行った。
ＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２の０、０．１、１、及び１０ｐｇ/１０μＬのＴＥバッファー（10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0）溶液を調製した。これらＴＥバッファー溶液１０μＬ各々別々に、５μＭビオチン化オリゴヌクレオチドＢ１を１μＬ、１０×アニーリングバッファー（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を２μL、及び、滅菌超純水を７μＬ添加することにより、混合物を得た。
次いで得られた混合物を、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に存在する目的とするＤＮＡ領域を含む二本鎖ＤＮＡを一本鎖にするために、９５℃で５分間加熱した。その後、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、５０℃まで速やかに冷却し、その温度で５分間保温した。次いで、これを３７℃で５分間保温した後、室温に戻し、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡフラグメントＸ２又はＤＮＡフラグメントＹ２）とビオチン化オリゴヌクレオチドとを結合させた（ＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２につき、各々２本作製）。
次に、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブに、上記のようにして、前調製された混合物を添加し、さらに、これを３７℃で５分間保温することにより、ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する。）。
次いで、前記のＰＣＲチューブから溶液を除去した後、１００μＬの洗浄バッファー（0.05%Tween20含有リン酸バッファー：1ｍM KH2PO4、3ｍM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl、 pH7.4）を添加した後、当該洗浄バッファーをピペッティングにより取り除いた。当該操作をさらに２回実施した。
その後、このようにして得られた一本鎖ＤＮＡについて、以下の２種の処理を施した。
Ａ群（無処理群）：上記で調製された一本鎖ＤＮＡに、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を３μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を３μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を３０μＬとした。
Ｂ群（ＨｈａＩによる消化処理群）：上記で調製された一本鎖ＤＮＡに、ＨｈａＩを１５Ｕと、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を３μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を３μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を３０μＬとした。
各々の反応液を３７℃で５時間インキュベーション（消化処理）した後、上清を取り除き、１００μＬの上記洗浄バッファーを混合した後、当該洗浄バッファーをピペッティングにより取り除いた（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する。）。
各々の反応液を３７℃で５時間インキュベーション（消化処理）した後、上清を取り除き、１００μＬの上記洗浄バッファーを混合した後、当該洗浄バッファーをピペッティングにより取り除いた（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する。）。
次に、得られた未消化物から、下記のプライマー及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化ＤＮＡ（配列番号２２で示される塩基配列を有する。Genbank Accession No.AC009800等に示されるＧＰＲ７配列の塩基番号76669〜76835に相当する領域）を増幅した。
PF4：5'-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3'（配列番号２３）
PR4：5'-GCGGAGTTGCCCGCCAGA-3'（配列番号２４）
PR4：5'-GCGGAGTTGCCCGCCAGA-3'（配列番号２４）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡに、５０μＭに調製した配列番号２３及び配列番号２４で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各０．３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μｌと、１０×緩衝液（100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin）を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）５Ｕ／μｌを０．２５μｌと、５Ｎベタイン水溶液を１０μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで５９℃にて３０秒間さらに７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を３２サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
ＤＮＡフラグメントＸ２に関して、Ａ群（無処理群）の場合には、１ｐｇ／１０μＬのサンプル及び１０ｐｇ／１０μＬのサンプルで増幅が確認されその増幅産物が得られた。これに対してＢ群（HhaI処理群）の場合には、全てのサンプルで、その増幅産物は得られなかった。一方、ＤＮＡフラグメントＹ２に関しては、Ａ群（無処理群）及びＢ群（HhaI処理群）の０．１ｐｇ／１０μＬのサンプル、１ｐｇ／１０μＬのサンプル及び１０ｐｇ／１０μＬのサンプルのサンプルで、増幅が確認されその増幅産物が得られた。
以上より、アニーリングバッファーとして二価陽イオン（マグネシウムイオン）を含有する溶液を用いて、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることで、前記の実施例１及び２と同様に、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを選択することが可能であること、且つ、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素での処理により、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されていないＤＮＡを増幅することなく、メチル化されたＤＮＡのみを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量できることが確認された。
実施例４
実施例１で得られたＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２を用いて下記の試験を行った。
ＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２の０、０．１、１及び１０ｐｇ/１０μＬラット血清溶液を調製した。これら溶液１０μＬ各々別々に、５μＭビオチン化オリゴヌクレオチドＢ１を１μＬ、１０×アニーリングバッファー（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を２μL、及び、滅菌超純水を７μＬ添加することにより、混合物を得た。
次いで得られた混合物を、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に存在する目的とするＤＮＡ領域を含む二本鎖ＤＮＡを一本鎖にするために、９５℃で５分間加熱した。その後、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、５０℃まで速やかに冷却し、その温度で５分間保温した。次いで、これを３７℃で５分間保温した後、室温に戻し、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡフラグメントＸ２又はＤＮＡフラグメントＹ２）とビオチン化オリゴヌクレオチドとを結合させた（ＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２につき、各々２本作製）。
次に、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブに、上記のようにして、前調製された混合物を添加し、さらに、これを３７℃で５分間保温することにより、ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する。）。
実施例１で得られたＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２を用いて下記の試験を行った。
ＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２の０、０．１、１及び１０ｐｇ/１０μＬラット血清溶液を調製した。これら溶液１０μＬ各々別々に、５μＭビオチン化オリゴヌクレオチドＢ１を１μＬ、１０×アニーリングバッファー（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を２μL、及び、滅菌超純水を７μＬ添加することにより、混合物を得た。
次いで得られた混合物を、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に存在する目的とするＤＮＡ領域を含む二本鎖ＤＮＡを一本鎖にするために、９５℃で５分間加熱した。その後、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、５０℃まで速やかに冷却し、その温度で５分間保温した。次いで、これを３７℃で５分間保温した後、室温に戻し、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡフラグメントＸ２又はＤＮＡフラグメントＹ２）とビオチン化オリゴヌクレオチドとを結合させた（ＤＮＡフラグメントＸ２及びＤＮＡフラグメントＹ２につき、各々２本作製）。
次に、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブに、上記のようにして、前調製された混合物を添加し、さらに、これを３７℃で５分間保温することにより、ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する。）。
次いで、前記のＰＣＲチューブから溶液を除去した後、１００μＬの洗浄バッファー（0.05%Tween20含有リン酸バッファー：1ｍM KH2PO4、3ｍM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4）を添加した後、当該洗浄バッファーをピペッティングにより取り除いた。当該操作をさらに２回実施した。
その後、このようにして得られた一本鎖ＤＮＡについて、以下の２種の処理を施した。
Ａ群（無処理群）：上記で調製された一本鎖ＤＮＡに、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を３μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を３μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を３０μＬとした。
Ｂ群（ＨｈａＩによる消化処理群）：上記で調製された一本鎖ＤＮＡに、ＨｈａＩを１５Ｕと、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を３μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を３μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を３０μＬとした。
各々の反応液を３７℃で５時間インキュベーション（消化処理）した後、上清を取り除き、１００μＬの上記洗浄バッファーを混合した後、当該洗浄バッファーをピペッティングにより取り除いた（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する。）。
各々の反応液を３７℃で５時間インキュベーション（消化処理）した後、上清を取り除き、１００μＬの上記洗浄バッファーを混合した後、当該洗浄バッファーをピペッティングにより取り除いた（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する。）。
次に、得られた未消化物から、下記のプライマー及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化ＤＮＡ（配列番号２２で示される塩基配列を有する。Genbank Accession No.AC009800等に示されるＧＰＲ７配列の塩基番号76669〜76835に相当する領域）を増幅した。
PF4：5'-GACAACGCCTCGTTCTCGG-3'（配列番号２３）
PR4：5'-GCGGAGTTGCCCGCCAGA-3'（配列番号２４）
PR4：5'-GCGGAGTTGCCCGCCAGA-3'（配列番号２４）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡに、５０μＭに調製した配列番号２３及び配列番号２４で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各０．３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μｌと、１０×緩衝液（100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin）を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）５Ｕ／μｌを０．２５μｌと、５Ｎベタイン水溶液を１０μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで５９℃にて３０秒間さらに７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を３２サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
ＤＮＡフラグメントＸ２に関して、Ａ群（無処理群）の場合には、１ｐｇ／１０μＬのサンプル及び１０ｐｇ／１０μＬのサンプルで増幅が確認されその増幅産物が得られた。これに対してＢ群（HhaI処理群）の場合には、全てのサンプルで、その増幅産物は得られなかった。一方、ＤＮＡフラグメントＹ２に関しては、Ａ群（無処理群）及びＢ群（HhaI処理群）の１ｐｇ／１０μＬのサンプル及び１０ｐｇ／１０μＬのサンプルで、増幅が確認されその増幅産物が得られた。
以上より、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料としての血清溶液を用いて、且つ、アニーリングバッファーとして二価陽イオン（マグネシウムイオン）を含有する溶液を用いて、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることで、前記の実施例３と同様に、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを選択することが可能であること、且つ、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素での処理により、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されていないＤＮＡを増幅することなく、メチル化されたＤＮＡのみを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量できることが確認された。
実施例３
ＡＴＣＣより購入された哺乳動物由来の乳癌細胞株ＭＣＦ−７(ATCC NO.HTB-22)を、ＡＴＣＣのカタログに記載された当該細胞株のための専用培地でコンフルエントになるまで培養することにより、約１×１０７個の細胞を得た。得られた細胞に、ＳＥＤＴＡバッファー［10mM Tris-HCl pH 8.0、10mM EDTA pH 8.0、100mM NaCl］を１０倍容量加えた後、これをホモジナイズした。得られた混合物に、proteinase K（Sigma）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％(w/v)になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール［1M Tris-HCl、pH 8.0 にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱をＴＥバッファー（10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0）に溶解し、これに４０μｇ／ｍｌになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ）を加えて３７℃で１時間インキュベートした。インキュベートされた混合物をフェノール・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱（ゲノムＤＮＡ）を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下のプライマー及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられる配列番号１７で示される塩基配列（Genbank Accession No.M80343等に示されるLINE1配列の塩基番号257〜352に相当する領域）を含むＤＮＡフラグメント（ＤＮＡフラグメントＸ１、配列番号２５で示される塩基配列を有する。Genbank Accession No.M80343等に示されるＬＩＮＥ１配列の塩基番号8〜480に相当する領域）を増幅した。
ＡＴＣＣより購入された哺乳動物由来の乳癌細胞株ＭＣＦ−７(ATCC NO.HTB-22)を、ＡＴＣＣのカタログに記載された当該細胞株のための専用培地でコンフルエントになるまで培養することにより、約１×１０７個の細胞を得た。得られた細胞に、ＳＥＤＴＡバッファー［10mM Tris-HCl pH 8.0、10mM EDTA pH 8.0、100mM NaCl］を１０倍容量加えた後、これをホモジナイズした。得られた混合物に、proteinase K（Sigma）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％(w/v)になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール［1M Tris-HCl、pH 8.0 にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱をＴＥバッファー（10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0）に溶解し、これに４０μｇ／ｍｌになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ）を加えて３７℃で１時間インキュベートした。インキュベートされた混合物をフェノール・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱（ゲノムＤＮＡ）を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下のプライマー及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられる配列番号１７で示される塩基配列（Genbank Accession No.M80343等に示されるLINE1配列の塩基番号257〜352に相当する領域）を含むＤＮＡフラグメント（ＤＮＡフラグメントＸ１、配列番号２５で示される塩基配列を有する。Genbank Accession No.M80343等に示されるＬＩＮＥ１配列の塩基番号8〜480に相当する領域）を増幅した。
PF1：5'-GAGCCAAGATGGCCGAATAGG-3'（配列番号２６）
PR1：5'-CTGCTTTGTTTACCTAAGCAAGC-3'（配列番号２７）
PR1：5'-CTGCTTTGTTTACCTAAGCAAGC-3'（配列番号２７）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを２ｎｇと、１００ｐｍｏｌ／μｌに調製した配列番号２６及び配列番号２７で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各０．１２５μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを２．５μｌと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を２．５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ ５Ｕ／μｌを０．１２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２５μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６３℃にて６０秒間さらに７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を５０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、目的のＤＮＡフラグメント（473bp）を切り出し、QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社）により、ＤＮＡフラグメントＸ１を精製した。
得られたＤＮＡフラグメントＸ１の一部をメチル化酵素ＳｓｓＩ（NEB社）により処理し、５−ＣＧ−３’全てをメチル化したＤＮＡフラグメント（以下、ＤＮＡフラグメントＹ１と記す）を得た。これについても、先と同様に、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、目的のＤＮＡフラグメント（473bp）を切り出し、QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社）により、ＤＮＡフラグメントＹ１を精製した。
ＤＮＡフラグメントＸ１及びＤＮＡフラグメントＹ１を用いて、以下のメチル化フラグメントと非メチル化フラグメントとの混合物を調製した。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、目的のＤＮＡフラグメント（473bp）を切り出し、QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社）により、ＤＮＡフラグメントＸ１を精製した。
得られたＤＮＡフラグメントＸ１の一部をメチル化酵素ＳｓｓＩ（NEB社）により処理し、５−ＣＧ−３’全てをメチル化したＤＮＡフラグメント（以下、ＤＮＡフラグメントＹ１と記す）を得た。これについても、先と同様に、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、目的のＤＮＡフラグメント（473bp）を切り出し、QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社）により、ＤＮＡフラグメントＹ１を精製した。
ＤＮＡフラグメントＸ１及びＤＮＡフラグメントＹ１を用いて、以下のメチル化フラグメントと非メチル化フラグメントとの混合物を調製した。
Ｉ〜Ｖ各々のＤＮＡフラグメントを用いて、以下の４種の溶液を調製した。
Ａ群（無処理群）：ＤＮＡフラグメント約２５ｎｇに、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を２μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を２μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとした。
Ｂ群（HpaII処理群）:ＤＮＡフラグメント約２５ｎｇに、ＨｐａＩＩを０．５Ｕと、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を２μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を２μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとした。
Ｃ群（HhaI処理群）：ＤＮＡフラグメント約２５ｎｇに、ＨｈａＩを０．５Ｕと、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を２μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を２μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとした。
Ｄ群（HpaII及びHhaI処理群）：ＤＮＡフラグメント約２５ｎｇに、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩを夫々０．５Ｕと、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を２μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を２μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとした。
各々の反応液を３７℃で２時間インキュベーションした後、これに滅菌超純水を加えて１００倍希釈した。
各希釈溶液５μＬ（DNAフラグメント62.5pg相当量）を鋳型とし、配列番号１７で示される塩基配列からなる領域のＤＮＡ量を求めるために、下記のプライマーＰＦ２及びＰＲ２並びに５’末端がレポーター蛍光色素であるＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）及び３’末端がクエンチャー蛍光色素であるＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）で標識されたプローブＴ１を用いたリアルタイムＰＣＲを行った。
各希釈溶液５μＬ（DNAフラグメント62.5pg相当量）を鋳型とし、配列番号１７で示される塩基配列からなる領域のＤＮＡ量を求めるために、下記のプライマーＰＦ２及びＰＲ２並びに５’末端がレポーター蛍光色素であるＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）及び３’末端がクエンチャー蛍光色素であるＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）で標識されたプローブＴ１を用いたリアルタイムＰＣＲを行った。
＜プライマー＞
ＰＦ２(フォワード側)： 5'-CACCTGGAAAATCGGGTCACT-3'（配列番号２８）
ＰＲ２（リバース側）： 5'-CGAGCCAGGTGTGGGATATA-3'（配列番号２９）
ＰＦ２(フォワード側)： 5'-CACCTGGAAAATCGGGTCACT-3'（配列番号２８）
ＰＲ２（リバース側）： 5'-CGAGCCAGGTGTGGGATATA-3'（配列番号２９）
＜プローブ＞
Ｔ１：5'-CGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTT-3'（配列番号３０）
Ｔ１：5'-CGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTT-3'（配列番号３０）
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡフラグメント６２．５ｐｇと、３ｐｍｏｌ／μｌに調製した配列番号２８及び配列番号２９で示される塩基配列からなるプライマーの溶液２種を各２．５μｌと、２．５ｐｍｏｌ／μＬに調製した配列番号３０で示される塩基配列からなるプローブを２．５μＬと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを２．５μｌと、１０×ＰＣＲ緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を２．５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）５Ｕ／μｌを０．１２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２５μｌとしたものを用いた。リアルタイムPCRは、Gene Amp 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems)を用いて実施した。配列番号１７で示される塩基配列のうち塩基番号１〜９４で示される塩基配列からなる領域（ＤＮＡ）を増幅するために、当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて１５秒間、６０℃にて６０秒間を１サイクルとしてリアルタイムＰＣＲを行った。当該リアルタイムＰＣＲの結果により、当該領域のＤＮＡ量を定量した。各生物由来検体について３回試験を実施した。
その結果を図３〜図７に示した。Ａ群での当該領域のＤＮＡ量を１として、他の群での当該領域のＤＮＡ量を示した。図３（「Ｉ」）は、メチル化割合０％のフラグメント混合物であるため、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群での理論値は「０」、図４（「ＩＩ」）は、メチル化割合１０％のフラグメントであるため、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群での理論値は「０．１」、図５（「ＩＩＩ」）は、メチル化割合２５％のフラグメントであるため、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群での理論値は「０．２５」、図６（「ＩＶ」）は、メチル化割合５０％のフラグメントであるため、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群での理論値は「０．５」、図７（「Ｖ」）は、メチル化割合１００％のフラグメントであるため、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群での理論値は「１」を示すことになる。実験の結果、図３〜図７に示す通り、Ｄ群で、この理論値に最も近い値が得られており、２種類以上のメチル化感受性酵素での消化処理が好ましいことが明らかとなった。
その結果を図３〜図７に示した。Ａ群での当該領域のＤＮＡ量を１として、他の群での当該領域のＤＮＡ量を示した。図３（「Ｉ」）は、メチル化割合０％のフラグメント混合物であるため、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群での理論値は「０」、図４（「ＩＩ」）は、メチル化割合１０％のフラグメントであるため、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群での理論値は「０．１」、図５（「ＩＩＩ」）は、メチル化割合２５％のフラグメントであるため、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群での理論値は「０．２５」、図６（「ＩＶ」）は、メチル化割合５０％のフラグメントであるため、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群での理論値は「０．５」、図７（「Ｖ」）は、メチル化割合１００％のフラグメントであるため、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群での理論値は「１」を示すことになる。実験の結果、図３〜図７に示す通り、Ｄ群で、この理論値に最も近い値が得られており、２種類以上のメチル化感受性酵素での消化処理が好ましいことが明らかとなった。
本発明により、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を簡便に測定する方法等を提供することが可能となる。
［配列表フリーテキスト］
配列番号１９
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２４
リアルタイムPCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号２６
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８
支持体への固定化のために設計されたビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号２９
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２４
リアルタイムPCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号２６
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８
支持体への固定化のために設計されたビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号２９
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
Claims (16)
- 生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法であって、
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化感受性制限酵素による消化処理を行う前に、前記ＤＮＡ試料中の二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡへ一旦分離し、前記一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の一本鎖ＤＮＡを選択する第一工程、
（２）第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡを少なくとも１種類以上の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）を除去する第二工程、及び、
（３）下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）を前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドから一旦分離する工程（第一前工程）と、
生成した遊離の一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の生成した遊離の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する工程（第二（Ａ）前工程）と、
当該工程（第二（Ａ）前工程）で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする工程（第二（Ｂ）前工程）と
を有する工程（第二前工程）と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖状態であるＤＮＡ（前記の一本鎖状態であるＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖状態であるＤＮＡ）を、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三前工程）とを有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の生成した一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ａ１工程と、第Ａ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の選択された一本鎖状態であるＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ａ２工程とを有する第Ａ工程（本工程）と、
（ｂ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の生成した一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｂ工程（本工程）とを有し、
さらに第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第三工程、
を有することを特徴とする方法。 - 第一工程が、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、前記生物由来検体中から予め抽出されていないＤＮＡ試料であり、メチル化感受性制限酵素による消化処理を行う前に、前記ＤＮＡ試料中の二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡへ一旦分離し、前記一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の一本鎖ＤＮＡを選択する工程であることを特徴とする請求項１記載の方法。
- 第一工程において、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させる際に、二価陽イオンを含有する反応系中で結合させることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
- 二価陽イオンがマグネシウムイオンであることを特徴とする請求項３記載の方法。
- 請求項１〜４のいずれかの請求項記載の第三工程の第一前工程の前操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
請求項１〜４のいずれかの請求項記載の第三工程の、第二前工程と各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程とを有する第Ｃ工程（本工程） - 請求項１〜４のいずれかの請求項記載の第三工程の第一前工程の後操作段階において、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、第二工程及び上記の追加前工程を経て得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖ＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖ＤＮＡ）を一本鎖状態に一旦分離する工程（追加再前工程）を有し、且つ、
請求項１〜４のいずれかの請求項記載の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内
に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程とを有する第Ｃ工程（本工程） - 請求項１〜４のいずれかの請求項記載の第三工程の第三前工程の前操作段階において、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
請求項１〜４のいずれかの請求項記載の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程とを有する第Ｃ工程（本工程） - 請求項１〜４のいずれかの請求項記載の第三工程の第三前工程の後操作段階において、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、第二工程及び上記の追加前工程を経て得られた未消化物である二本鎖ＤＮＡ（前記の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡを鋳型として伸長形成された二本鎖ＤＮＡ）を一本鎖状態に一旦分離する工程（追加再前工程）を有し、且つ、
請求項１〜４のいずれかの請求項記載の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程とを有する第Ｃ工程（本工程） - 請求項１〜８のいずれかの請求項記載の方法の工程として、下記の２つの工程をさらに追加的に有することを特徴とするメチル化割合の測定方法。
（４）請求項１〜８のいずれかの請求項記載の方法の第一工程を行った後、請求項１〜８のいずれかの請求項記載の方法の第二工程を行うことなく、請求項１〜８のいずれかの請求項記載の方法における第三工程を行うことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域のＤＮＡ（メチル化されたＤＮＡ及びメチルされていないＤＮＡの総量）を検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第四工程、及び、
（５）請求項１〜８のいずれかの請求項記載の第三工程により定量されたＤＮＡの量と、第四工程により定量されたＤＮＡの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの割合を算出する第五工程 - 生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかの請求項記載の方法。
- 生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかの請求項記載の方法。
- 生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかの請求項記載の方法。
- 生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、当該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかの請求項記載の方法。
- 生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、少なくとも１種類以上の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかの請求項記載の方法。
- 少なくとも１種類以上の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかの請求項記載の方法。
- 少なくとも１種類以上の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHhaIであることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかの請求項記載の方法。
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