JP7091400B2 - 核酸の多重検出 - Google Patents

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Description

相互参照
本出願は、その出願が参照によって本明細書に組み入れられる２０１３年１２月２日に出願された英国出願第１３２１１９６．６号の優先権を主張する。
技術分野
本発明は、特定の配列を結合するプローブを並行して用いて複数の核酸配列を検出する多重（マルチプレックス）方法に関する。本発明はまた、核酸の種属の定量にも関するものであり、たとえば、胎児異数性の非侵襲性出生前診断におけるそのような方法の使用を含む、試料における２つの異なる染色体の相対量を決定することにも関する。
多数の疾患は、その種について正常な数の染色体または染色体断片に比べた場合の、個体の細胞における染色体の数の不均衡（異数性）または染色体断片の数の不均衡（部分異数性）が原因で生じ、またはそれを特徴とする。ヒトの二倍体ゲノムは２３対の染色体：１～２２の対合染色体と性染色体ＸＸまたはＸＹを有する。用語、モノソミー及びトリソミーは染色体の欠失または過剰を指す一方で、部分的なモノソミー及び部分的なトリソミーは染色体の一部のそれぞれ喪失または獲得によって生じる遺伝物質の不均衡を指す。個体のゲノムにおける異数性及び部分異数性は、たとえば、ダウン症候群（ヒト第２１染色体のトリソミー）及びターナー症候群（性染色体のモノソミーまたは部分モノソミー）のような先天性疾患に関連する。異数性及び部分異数性は、成人の組織における体細胞突然変異を介しても生じ得る。たとえば、多数の癌細胞は染色体の脆弱性を示し、染色体断片の転座及び腫瘍細胞の異数性をもたらす。
染色体異常に関連する疾患を診断する方法が開発されている。従来の核型分析の方法は、組織試料を入手することと、染色体を染色することと、光学顕微鏡下で調べることとを含んでいた。Ｓｃｈｒｏｃｋら．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３（５２７４）：４９４－４９７，１９９６）は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）を用いてヒトの染色体すべてを異なる色で同時に視覚化する多色スペクトル核型分析を記載した。染色体特異的なＤＮＡを異なる蛍光色素分子で標識することによって各染色体について蛍光で標識したプローブを作製した。スペクトルで区別できる蛍光色素分子の数が限定されているので、コンビナトリアル標識法を用いて必要な数の異なる放射スペクトルを生成した。蛍光顕微鏡に連結した干渉計を用いて、コンビナトリアル標識によって生成されたスペクトルの差異を捕捉し、解析した。次いで画像処理ソフトウエアによって各スペクトルの異なる組み合わせに色を割り当て、個々の着色された染色体の視覚化を可能にした。
比較ゲノムハイブリッド形成（ＣＧＨ）には、比較される２つの供給源、最も一般的には、試験供給源及び参照供給源からのＤＮＡの単離と、異なる色（普通、赤色と緑色）の蛍光色素分子による各ＤＮＡ試料の独立した標識と、一本鎖にするようなＤＮＡの変性と、染色体の正常な分裂中期標本に対する１：１比での２つの得られた試料のハイブリッド形成が関与し、標識されたＤＮＡ試料は元々の遺伝子座でそれに結合するであろう。蛍光顕微鏡とコンピュータソフトウエアを用いて、次いで、２つの供給源間の染色体の差異の特定のために各染色体の長さに沿って異なって着色された蛍光シグナルを比較する。染色体の特定の領域における試験試料の色のさらに高い強度は、相当する供給源試料におけるその領域の物質の獲得を示す一方で、参照試料の色のさらに高い強度は特定の領域における試験試料での物質の喪失を示す。中性の色（蛍光色素分子の標識が赤色と緑色である場合、黄色）はその位置における２つの試料の間で差異がないことを示す。ＣＧＨは、Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８（５０８３）：８１８－２１，１９９２及びＰｉｎｋｅｌら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０（２）：２０７－１１，１９９８によって記載された。
さらに最近、ゲノム規模でコピー数を定量するデジタルのまたはバーチャルの核型分析法が開発されている（Ｗａｎｇら，ＰＮＡＳ，９９（２５）：１６１５６－１６１６１，２００２）。デジタル核型分析は、従来の核型分析または染色体に基づくＣＧＨに比べて高い解像度で検出されるコピー数の差異を可能にする。ゲノム全体にわたる特定の遺伝子座に由来する短い配列を単離し、列挙する。各２１ｂｐのタグをゲノムにおける特定の位置から得ることができ、一般に、それらが由来したゲノム遺伝子座を独自に特定するのに十分な情報を含有する。従って、タグは正確な染色体の位置に一致することができ、ＤＮＡ配列含量における異常を検出するために移動ウインドウにわたってタグの密度を評価することができる。配列タグをその染色体位置に一致させる方法には、高処理能力配列決定、アレイ比較ゲノムハイブリッド形成及びＳＮＰアレイの使用が挙げられる。
アレイは、ゲノムにおける目的の領域に対して相補性である数百から数百万のプローブで構成される。試験試料に由来するＤＮＡが断片化され、標識されたアレイとハイブリッド形成する。各プローブについてのハイブリッド形成のシグナル強度は、アレイの各位置について定量される。アレイ上での各プローブのアドレス及びゲノムにおける各プローブのアドレスを知って、アルゴリズムを用いてプローブを染色体の順に並べ、コンピュータでゲノムを再構築する。デジタル核型分析の解像度はアレイ上のプローブの密度に左右される。
高い精度の解析が必要とされる領域の１つが非侵襲性の出生前の核型分析である。妊娠した母親はその血中に無細胞性の循環するＤＮＡを運んでおり、その４～３０％は胎児に由来する。各染色体を起源とする豊富な無細胞ＤＮＡを測定することによって胎児の核型を決定することは可能である。たとえば、無細胞ＤＮＡが９５％の母親ＤＮＡと５％の胎児ＤＮＡから成り、胎児が第２１染色体のトリソミーを有する（ダウン症候群）のであれば、第２１染色体に由来する無細胞ＤＮＡの総量は、同じサイズの他のゲノム領域のそれよりも２．５％多いはずである。胎児ＤＮＡにおける染色体異数性を観察することは、異なる染色体の相対量におけるそのように些細な不均衡を検出する非常に精度の高い測定を必要とする。患者及び臨床医にとって好都合であり、受け入れ可能である方法を提供するために相対的に少ない試料で作業する必要性によって困難さの度合いが増す。
単一のＤＮＡ分子または少ないＤＮＡ分子に由来する特定の標的の解析は従来から技術的な難題である。下流の解析手順のために十分なシグナルを達成するには通常、ＤＮＡをコピーする方法が必要とされる。たとえば、ＤＮＡ配列決定、ゲル電気泳動、及びＤＮＡマイクロアレイのような解析方法は通常、提供された試料におけるＤＮＡのシグナル増幅を必要とする。特定のＤＮＡ標的を増幅する最も一般的な増幅法はＰＣＲであり、それはＤＮＡ試料から特定の標的の数百万（または数十億）のコピーを提供することができる。しかしながら、解析のためにゲノム試料の多数の領域を増幅することが所望である場合、同一の反応混合物で一緒に複数の異なる増幅を行う結果、増幅の作為が生じ得る。また、増幅された核酸産物の絶対量に比べて相対量における元々の差異がごくわずかであり得るので、且つ様々な配列が様々な効率で増幅され得るので、増幅の工程が、試料における配列の相対量に関する情報の喪失を生じる可能性がある。
本明細書で記載される方法の一部の実施形態は、複数の独特の標的配列を含有する目的の核酸種属（たとえば、染色体）が複数の特異的なプローブを用いて検出される新規のアプローチを紹介する。複数のプローブを用いて検出可能なシグナルを提供し、その際、シグナルの大きさは標的配列を認識するプローブの数に比例する。複数のプローブに由来する個々のシグナルが検出可能な単一の累積シグナルに変換され、多重プロービングを介して個々のシグナルを増幅する。１０以上のプローブが１０倍以上のシグナル増幅を生じる。生成されるシグナルは標的認識の際、正しく反応したプローブに依存し、配列特異的なハイブリッド形成と酵素触媒を用いて、シグナルが得られる特異的な産物を生成する。
一部の実施形態は、シグナル増幅工程として目的の標的分子の核酸配列上で複数の遺伝子座の検出を使用するので、反応したプローブの産物の増幅を必要とすることなくシグナルの生成及び検出を可能にする。しかしながら、多重産物からのシグナルは従来のシグナル増幅工程によって任意で増幅されてもよい。シグナルのクローン性増幅を行ってもよい。好適な増幅法には、ローリングサークル増幅、架橋ＰＣＲ、ｅｍＰＣＲ及びデジタルＰＣＲが挙げられる。
その標的配列を認識する各プローブはライゲーション産物を生成し、各プローブのハイブリッド形成によって生成されたライゲーション産物は個々に検出可能であってもよいので、個々のシグナルはそれぞれから検出可能である。しかしながら、本方法の一部の実施の洗練された特徴は、これらの個々のシグナルが個々に検出される必要はないが、代わりに累積シグナルに統合され、累積シグナルが検出されるということである。累積シグナルは個々のシグナルの組み合わせなので、ライゲーション産物を検出する及び／または定量するのに使用することができるということは、検討中の核酸種属の存在または量を表している。これによって、配列決定及びマイクロアレイが関与する方法に比べてプローブのシグナルのさらに早い統合が可能になり、領域全体にわたって個々のシグナルが複数のプローブために生成され、次いでシグナルは領域を表す解析で統合される。シグナルは検出の前に統合されるので、個々のシグナルは別々にマッピングされることはなく、または問いただされることはない。これによってさらに単純な読み取り方式が可能になる。
多重化によるシグナル増幅の方法を用いて試料における目的の核酸種属を検出することができ、たとえば、核酸種属は複雑な核酸試料における軽微な成分または微量成分である。多重化による増幅は信頼できる検出を可能にする。これを用いて、診断目的で、たとえば、患者の試料のような試料にて微生物の核酸を検出してもよい。複数の種属の微生物の核酸に特異的なプローブで試料を探査して存在するそれらを検出し、特定してもよい。これは、細菌、ウイルス及び真菌のような感染性疾患の作用因子の検出に有用である。特定の核酸転写物が検出されてもよい。多重化による増幅を用いて核酸種属を定量してもよい。核酸の２以上の種属－１以上の目的の種属及び１以上の参照核酸種属－を探査することによって、本方法は試料における２つの種属の相対量の定量を可能にする。方法は、染色体または染色体遺伝子座の検出または定量に、たとえば、染色体のコピー数の検出に適用されると特に有用である。特定の値の適用は、癌及び先天的な異数性の診断を含む、染色体異常を特定するそのような方法の使用である。非侵襲性の出生前診断（ＮＩＰＴ）のための使用が特に記載される。多数の標的配列を含む大きな核酸が問い正される／検出される場合、特にそれらの核酸が低モル量で存在するのであれば、且つそれらが非常に高い精度で測定されまたは定量されなければならない場合、ＮＩＰＴと同様に、本方法が特に役に立つ。
一揃いのプローブに試料を接触させることによって試料における核酸の種属が検出されてもよく、その際、各プローブは検出される核酸の種属における区別できる標的配列を特異的に認識し、且つ各プローブによる各標的配列の認識は産物を生成し、該産物に由来するシグナルの組み合わせである累積シグナルを検出し、シグナルの検出は試料における核酸の種属の存在を示す。核酸の種属は累積シグナルを定量してシグナルのレベルを決定することによって定量されてもよく、その際、シグナルのレベルは試料における核酸の種属の量に比例し、それによって試料における核酸の種属の量を決定する。第１の一揃いのプローブ及び第２の一揃いのプローブに試料を接触させることによって核酸の第２の種属または参照種属と比べて核酸の第１の種属を定量してもよく、その際、第１の一揃いのプローブのそれぞれは核酸の第１の種属の範囲内で区別できる標的配列を特異的に認識し、且つ第２の一揃いのプローブのそれぞれは核酸の第２の種属または参照種属の範囲内で区別できる標的配列を特異的に認識する。第１及び第２の累積シグナルが検出され、第１の累積シグナルは、標的配列を認識する第１の一揃いのプローブによって生成される産物に由来する個々のシグナルの組み合わせであり、且つ第２の累積シグナルは、標的配列を認識する第２の一揃いのプローブによって生成される産物に由来する個々のシグナルの組み合わせである。第１及び第２のシグナルが定量されて、それぞれ第１及び第２のシグナルのレベルを決定し、それらは試料における核酸の第１及び第２の種属の量に比例する。従って、試料における第１及び第２の核酸種属の相対量は第１及び第２のシグナルのレベルを比較することによって決定されてもよい。
たとえば、累積シグナルは、その標的配列を認識するプローブのクローンで増幅された及び／または標識された産物、たとえば、ローリングサークル増幅の産物の、または各産物が蛍光シグナルを放射する産物すべてから放射される蛍光シグナルの要約された列挙であってもよい。核酸の複数の種属の相対量を定量することについては、各種属に異なるシグナルを使用し、たとえば、ある一揃いのプローブの産物は別の一揃いのプローブの産物と比べて異なる波長またはスペクトルの蛍光を放射してもよい。
プローブの標的認識がハイブリッド形成と酵素的識別の双方を頼りにする場合、優位が得られるので、シグナルの出力は正しい酵素プローブ反応によって決まる。好ましくは、プローブによる標的配列の認識はプローブの標的配列とのハイブリッド形成とライゲーション産物の生成を含み、ライゲーション産物の生成はプローブの標的配列との特異的なハイブリッド形成に依存する。本方法での使用に特に好適であるように設計されるプローブが本明細書で記載される。しかしながら、プローブはプローブのいずれか１つの設計に限定されることはなく、たとえば、パドロックプローブ、セレクタプローブ、オリゴヌクレオチドライゲーションプローブ、分子反転プローブ、及び直列プローブを含む種々の既知の核酸プローブが好都合に使用されてもよい。
本開示の第１の態様は
各プローブが検出される核酸の種属の中で区別できる標的配列を特異的に認識する一揃いのプローブに試料を接触させることと、
核酸の種属における標的配列が少なくとも部分的に一本鎖である条件を提供することと、
プローブが標的配列とハイブリッド形成し、且つライゲーション産物を生成し、各ライゲーション産物がライゲーション接合部を含む、アニーリング及びライゲーションの条件を提供することと、
ライゲーション産物すべてに由来する個々のシグナルの組み合わせである累積シグナルを検出することとを含み、
その際、シグナルの検出が試料における核酸の種属の存在を示す、
試料における核酸の種属を検出する方法を提供する。
本開示の第２の態様は、
各プローブが定量される核酸の種属の中で区別できる標的配列を特異的に認識する一揃いのプローブに試料を接触させることと、
核酸の種属における標的配列が少なくとも部分的に一本鎖である条件を提供することと、
プローブが標的配列とハイブリッド形成し、且つライゲーション産物を生成し、各ライゲーション産物がライゲーション接合部を含む、アニーリング及びライゲーションの条件を提供することと、
ライゲーション産物すべてに由来する個々のシグナルの組み合わせである累積シグナルを検出することと、
累積シグナルを定量してシグナルのレベルを決定することとを含み、
その際、シグナルのレベルは試料における核酸の種属の量に比例し、それによって試料における核酸の種属の量を決定する、
試料における核酸の種属を定量する方法を提供する。
ある方法を使用して、試料における核酸の第２の種属に比べて核酸の第１の種属を定量してもよい。従って、該方法は、
第１の一揃いのプローブがそれぞれ核酸の第１の種属の中で区別できる標的配列を特異的に認識し、且つ第２の一揃いのプローブがそれぞれ核酸の第２の種属の中で区別できる標的配列を特異的に認識する、第１の一揃いのプローブ及び第２の一揃いのプローブに試料を接触させることと、
核酸の第１及び第２の種属における標的配列が少なくとも部分的に一本鎖である条件を提供することと、
プローブが標的配列とハイブリッド形成し、且つライゲーション産物を生成し、各ライゲーション産物がライゲーション接合部を含む、アニーリング及びライゲーションの条件を提供することと、
第１の一揃いのプローブによって生成されるライゲーション産物に由来する個々のシグナルの組み合わせである第１の累積シグナルを検出し、それを定量して、第１のシグナルのレベルが試料における核酸の第１の種属の量に比例する、第１のシグナルのレベルを決定することと、
第２の一揃いのプローブによって生成されるライゲーション産物に由来する個々のシグナルの組み合わせである第２の累積シグナルを検出し、それを定量して、第２のシグナルのレベルが試料における核酸の第２の種属の量に比例する、第２のシグナルのレベルを決定することと、
第１及び第２のシグナルのレベルを比較し、それによって試料における第１及び第２の核酸種属の相対量を決定することを含んでもよい。
別の態様は、
第１の一揃いのプローブがそれぞれ第１の染色体または染色体遺伝子座の中で区別できる標的配列を特異的に認識し、且つ第２の一揃いのプローブがそれぞれ第２の染色体または染色体遺伝子座の中で区別できる標的配列を特異的に認識する、第１の一揃いのプローブ及び第２の一揃いのプローブに試料を接触させることと、
第１及び第２の染色体または染色体遺伝子座における標的配列が少なくとも部分的に一本鎖である条件を提供することと、
プローブが標的配列とハイブリッド形成し、且つライゲーション産物を生成し、各ライゲーション産物がライゲーション接合部を含む核酸の環状物である、アニーリング及びライゲーションの条件を提供することと、
核酸の環状物のローリングサークル複製のための条件を提供することと、
ローリングサークル複製の産物は第１の一揃いのプローブによって生成されるライゲーション産物から増幅されて第１のカウントを提供する、第１のローリングサークル複製の産物の数を数えることと、
第２のローリングサークル複製の産物は第２の一揃いのプローブによって生成されるライゲーション産物から増幅されて第２のカウントを提供する、第２のローリングサークル複製の産物の数を数えることと、
第１及び第２のカウントを比較し、それによって試料における第１及び第２の核酸種属の相対量を決定することを含む、
試料における第２の染色体または染色体遺伝子座に比べて第１の染色体または染色体遺伝子座を定量する方法を提供する。
これらの実施形態では、ローリングサークル増幅の産物は、
（ａ）基質の表面にばらまかれた複数の複合体を含む基質を得ることと、
（ｂ）基質の領域に存在する、第１のＲＣＡ産物の数を数え、且つ独立して第２のＲＣＡ産物の数を数えることによって個々に数えられてもよく、その際、複合体のそれぞれは単一のＲＣＡ産物と、ＲＣＡ産物とハイブリッド形成する複数の標識されたオリゴヌクレオチドプローブとを含み、第１のローリングサークル増幅産物に相当する複合体及び第２のローリングサークル増幅産物に相当する複合体は区別可能に標識される。この実施形態では、オリゴヌクレオチドが蛍光標識されてもよい。
一般に、プローブの数は検出されるまたは定量される核酸の各種属について少なくとも１０であろう。コースの数は、プローブの分子の絶対数ではなく異なるプローブの数を指す。従って、核酸は少なくとも１０の異なる特定の標的配列を含有するであろうし、累積シグナルは少なくとも１０の独特のプローブの個々のシグナルの組み合わせであり、この累積シグナルが核酸における種属の１つを表す。高いレベルまたは多重化を用いてシグナル増幅のかなり高いレベルを得ることができる。たとえば、検出されるまたは定量される核酸の各種属について少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００またはさらに大きい数のプローブを使用してもよい。
言及されるように、種々のプローブの設計が本方法での使用に好適である。その標的配列への正しいハイブリッド形成に続いてライゲーション産物を生成するプローブには以下が挙げられる：
（ａ）標的配列とのハイブリッド形成によってプローブが環状化し、プローブ核酸の環状物がライゲーションによって生成されるパドロックプローブ。パドロックプローブはＵＳ５，８５４，０３３（Ｌｉｚａｒｄｉ）、ＷＯ９９／４９０７９（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）及びＵＳ５，８７１，９２１（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ及びＫｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ）にて記載されている。本発明のプローブとして知られる型のパドロックプローブはＵＳ６，８５８，４１２（Ｗｉｌｌｉｓら）にて記載されている。反転プローブはプローブの主鎖に切断部位を含有するパドロックプローブであり、環状化プローブが切断されて線状産物を形成するのを可能にし、それはその後増幅されてもよいし、検出されてもよい。
（ｂ）標的配列に結合する際、架橋オリゴヌクレオチドと一緒に環状化する直列プローブ。標的配列は、それらの間での架橋オリゴヌクレオチドによる２つのプローブ配列のライゲーションを鋳型にする。次いで２つのプローブ配列はライゲーションされて環状物を形成する。この種のプローブはＵＳ２０１３／０１７２２１２（Ａｒｉｏｓａ）にて記載されている。直列プローブはパドロックプローブに類似するが、ライゲーションの間での代わりに、ライゲーションの後での別の工程でプローブを環状化する。
（ｃ）標的環状化プローブ。この種のプローブでは、標的配列の断片は鋳型オリゴヌクレオチドによって環状化される。標的配列への末端同士をその間での介在配列と任意でライゲーションすることができる。標的環状化プローブはＷＯ２００８／０３３４４２（Ｓｔａｎｆｏｒｄ）に記載されている。ＥＰ１９９７９０９（ＷＯ９９／４９０７９に由来する）は、定義される５’標的配列及び定義される３’標的配列に対して相補性である２つの隣接する配列を有するので、標的配列のプローブとのハイブリッド形成は標的末端を標的末端の鋳型ライゲーションに結び付けて標的核酸を環状化するプローブを記載している。
（ｄ）標的配列の末端に対して相補性の１または２の突出末端を有する二本鎖セレクタ構築物であるセレクタプローブ、それは標的配列とハイブリッド形成し、且つ標的配列の各末端にライゲーションされて、プローブ核酸と標的配列とを含有する環状または線状のライゲーション産物を形成する。種々のセレクタプローブが知られている。セレクタは、たとえば、ＷＯ２００５／１１１２３６（Ｄａｈｌ）；ＷＯ２０１１／００９９４１（Ｏｌｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）；ＷＯ２０１１／０６７３７８（Ｏｌｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）及びＷＯ２００８／１５３４９２（Ａｇｉｌｅｎｔ）にて記載されている。
（ｅ）ＯＬＡ（オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ）プローブ。これらのプローブはＳＮＰ遺伝子型分析での使用について記載されている。各プローブは、一方のオリゴヌクレオチドの５’末端が他方のオリゴヌクレオチドの３’末端に隣接してアニールし、次いで末端がライゲーションされるように、標的配列の隣接する領域とハイブリッド形成する一対のオリゴヌクレオチドを含む。ＯＬＡプローブ法の型には、上流ギャップ充填重合（ゴールデンゲートアッセイ）または２つの隣接プローブ間での追加のオリゴヌクレオチドのライゲーションによるギャップの充填（ＤＡＮＳＲアッセイ）が挙げられる。ゴールデンゲートアッセイは、Ｆａｎ，Ｊ．Ｂら，Ｈｉｇｈｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．６８，６９－７８（２００３）にて記載された。ＤＡＮＳＲアッセイは、Ａ．Ｂ．Ｓｐａｒｋｓ，Ｅ．Ｔ．Ｗａｎｇ，Ｃ．Ａ．Ｓｔｒｕｂｌｅら，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｔｒｉｓｏｍｙ，Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．（２０１２）にて記載された。
一般に、本方法で使用するのに望ましいプローブは、標的配列とハイブリッド形成し、且つライゲーション産物を生成するプローブであり、その際、ライゲーション産物の生成は標的配列とのプローブの特異的なハイブリッド形成に依存する。これには上記で列記した例のプローブすべてが含まれる。好ましくは、ライゲーション産物は二重ライゲーション（たとえば、セレクタプローブと直列プローブ）の産物である。好ましくは、ライゲーション産物には標的配列自体が含まれ、たとえば、標的配列が核酸種属の断片である場合、その断片自体がプローブにライゲーションされるので、ライゲーション産物に組み込まれる。これによって、産物の配列決定を行うことにより標的配列が検証されるのが可能になる。ライゲーション産物は環状または線状の核酸であってもよいが、たとえば、ローリングサークル複製の産物をクローンで増殖し、検出する能力のような、環状産物（たとえば、パドロックプローブ、セレクタプローブまたは標的環状化プローブを用いた）による特定の利点がある。
従って、場合によっては、本方法で使用されるプローブは上記特徴の１以上を有するであろう。
本明細書で記載されるのは、本方法の方法で使用するのに理想的であるプローブの新規の設計である。プローブは、（種々の実施形態で）上記の特質のすべてを含む特徴の特に望ましい組み合わせを有する。これら新規のプローブは、
標的断片よりも長く、内部標的相補性配列を含有するので標的化オリゴヌクレオチドと標的断片との間でのハイブリッド形成が標的化オリゴヌクレオチドの上流と下流の隣接配列の間に位置する二本鎖配列を形成する標的化オリゴヌクレオチドと、
それぞれ５’及び３’末端を有し、頭部及び尾部の配列がそれぞれ上流及び下流の隣接配列に対して相補性である、頭部及び尾部の配列とを含む。
アニーリング及びライゲーションの条件下で、頭部及び尾部の配列は隣接配列とハイブリッド形成し、標的断片は存在するならば、標的相補性配列とハイブリッド形成し、それによって頭部配列の５’末端及び尾部配列の３’末端と並置して標的配列の末端を位置付ける。頭部配列の５’末端及び標的断片の３’末端は標的化オリゴヌクレオチドの隣接配列とハイブリッド形成し、尾部配列の３’末端及び標的断片の５’末端は標的化オリゴヌクレオチドの隣接配列とハイブリッド形成する。標的断片が存在するならば、標的断片の３’末端が頭部配列の５’末端にライゲーションされて第１のライゲーション接合部を形成し、標的断片の５’末端が尾部配列の３’末端にライゲーションされて第２のライゲーション接合部を形成して、頭部及び尾部の配列と標的断片とを含む核酸の連続鎖を含む二重ライゲーションの産物を生じる。
二重ライゲーションの産物は、本明細書の他のどこかで詳細に説明される特定のプローブ設計に従って環状または線状であってもよい。
本明細書で提供されるのは、試料解析の方法である。特定の実施形態では、方法は、（ａ）断片化したＤＮＡを含む試料（たとえば、制限酵素で消化されている試料）を第１の一揃いのプローブを含むプローブ混合体とハイブリッド形成させることを含み、第１の一揃いのプローブのプローブは、第１の染色体に由来するＤＮＡ断片とハイブリッド形成する場合、第１の染色体における異なる部位（すなわち、異なる配列）とハイブリッド形成し、ライゲーション可能に隣接する接合部を含有する非共有結合性の環状産物を形成する。この文脈で、用語「ライゲーション可能に隣接する」は２つのオリゴヌクレオチド間に介在するヌクレオチドがなく、それらがリガーゼを用いて互いにライゲーションすることができることを意味するように意図される。そのようなプローブの例は上記及び以下で詳細に記載される。そのようなプローブの例は図３及び図４にて例によって説明される。次に、図２で示されるように、方法は、（ｂ）ライゲーション可能に隣接する接合部が一緒にライゲーションされて複数の共有結合した環状のライゲーション産物を生じることを含む。そのようなものとして、方法の次の工程は、（ｃ）ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって共有結合した環状のライゲーション産物を増幅して複数のＲＣＡ産物分子を生じることを含む。次いでＲＣＡ産物を標識し、定量し、それによって試料における第１の染色体に相当するＤＮＡの量の推定値を提供する。環状化産物は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって増幅することができるので検出について有意な利点を提供する。ＲＣＡは単一分子にて環状化産物の数百または数千のコピーを産出し、それによって環状化産物を効果的に増幅し、たとえば、産物のモチーフとハイブリッド形成する標識したオリゴヌクレオチドを用いてそれらを個々に検出するのを相対的に容易にする。個々のＲＣＡ産物からのシグナルを定量することは、多数の応用（たとえば、無細胞ＤＮＡの解析による非侵襲性出生前診断）では、特定の染色体（たとえば、第２１染色体）に相当する断片の数が完全に正確に且つ偏りなく決定される必要があるので、重要である。典型的な解析方法は、周知のように、一部の配列が他よりもはるかに高い効率で増幅されるという点で非常に偏った手順であるＰＣＲを使用する。これによって多数の診断の試みについてＰＣＲに基づく戦略が実行困難になっている。
図８はローリングサークル増幅の産物がどのように定量され得るのかを説明する。この方法では、定量する工程は、工程（ｃ）で作出されたローリングサークル増幅の個々の産物分子を互いに分離し、定義された面積または容積にてローリングサークル増幅の個々の産物分子を数えることによって実施されてもよい。図８で示されるように、標的配列Ｘと隣接配列Ａ及びＢとを含む環状化産物２２（環状化産物２２ａ、２２ｂ、２２ｃ及び２２ｄで構成された）はプライマー５２によって増幅され、一揃いのＲＣＡ産物を生じる。次いでＲＣＡ産物を表面上にばらまき、ＲＣＡ産物の数を顕微鏡で直接数えることができ、その際、用語「ばらまくこと」はＲＣＡ産物が平面基材の表面上に沈着され、広げられることを意味するように意図される。ＲＣＡ産物は基材に結合する必要はないが、特定の場合、結合することができる（たとえば、ビオチン等を介して）。
これらの実施形態では、定量する工程は、（ｉ）標識されたオリゴヌクレオチドをＲＣＡ産物分子とハイブリッド形成させることと、（ｉｉ）基材の表面上で定義された面積にて標識された複合体の数を数えることとによって実施されてもよく、その際、標識されたオリゴヌクレオチドはＲＣＡ産物における反復する配列とハイブリッド形成し、それによって、それぞれ単一のＲＣＡ産物とＲＣＡ産物とハイブリッド形成する複数の標識されたオリゴヌクレオチドを含む複数の複合体を作出する。図２で示されるように、検出の点では、ＲＣＡ産物は、単一の環状化産物であるＲＣＡ産物自体とＲＣＡ産物における反復する配列とハイブリッド形成する複数の標識されたオリゴヌクレオチドを含有する複合体の一部である。
認識されるように、ＲＣＡ産物は基材上にばらまかれる前に、または後で標識することができる。そのようなものとして、これらの実施形態では、定量する工程は、（ａ）基材の表面上にばらまかれた標識された複合体を含む基材を得ることと、（ｂ）基材の第１の面積に存在するＲＣＡ産物の数を数えることとによって実施されてもよい。方法は、他の環状産物を同時に定量することができるように多重化されてもよい。たとえば、方法で使用される一揃いのプローブは区別できる配列を含有してもよく（たとえば、第２１染色体のプローブは第１の配列を含有してもよく、第１８染色体のプローブは第２の配列を含有してもよい）、それらのプローブの環状化の結果作製された異なる一揃いのプローブは、第１及び第２の配列とハイブリッド形成する、区別可能に標識されたオリゴヌクレオチドを用いて区別することができる。
これらの実施形態では、方法は、（ａ）基材の表面上にばらまかれた第１及び第２の複数の複合体を含む基材を得ることと、（ｂ）基材の第１の面積に存在する第１の複数のＲＣＡ産物の数を数え、独立して第２の複数のＲＣＡ産物の数を数えることとを含み、その際、複合体のそれぞれは単一のＲＣＡ産物とＲＣＡ産物に対してハイブリッド形成する複数の標識されたオリゴヌクレオチドプローブとを含み、第１及び第２の複数の複合体は区別可能に標識され、第１及び第２の複数の複合体は異なる染色体に相当する。この実施形態では、オリゴヌクレオチドは蛍光で標識されてもよい。主題の方法で有用な好適な区別可能な蛍光標識の対には、Ｃｙ－３とＣｙ－５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、クエーサー５７０とクエーサー６７０（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）、アレクサフルオロ５５５とアレクサフルオロ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＢＯＤＩＰＹ Ｖ－１００２とＢＯＤＩＰＹ Ｖ１００５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＰＯＰＯ－３とＴＯＴＯ－３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）及びＰＯＰＲＯ３ ＴＯＰＲＯ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）が挙げられる。さらに、好適な区別可能な検出可能な標識はＫｒｉｃｋａら．（Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１１４－２９，２００２）にて見いだされ得る。
一部の実施形態は、試料は、ゲノムＤＮＡ、たとえば、植物、動物（たとえば、爬虫類、哺乳類、昆虫類、蠕虫類、魚類等）、組織試料、細菌、真菌（たとえば、酵母）、ファージ、ウイルス、死体組織、考古学的な／古代の試料等を含む実際任意の生物に由来するゲノムＤＮＡの断片を含有してもよい。特定の実施形態では、方法で使用されるゲノムＤＮＡは哺乳類に由来してもよく、その際、特定の実施形態では、哺乳類はヒトである。例となる実施形態では、ゲノム試料は、たとえば、ヒト、マウス、ラットまたはサルの細胞のような哺乳類細胞に由来するゲノムＤＮＡを含有してもよい。試料は、培養細胞または臨床試料の細胞、たとえば、組織生検、法医学試料の擦り取りまたは洗浄物または細胞（たとえば、事件現場で採取された試料の細胞）から作製されてもよい。特定の実施形態では、核酸試料は、たとえば、細胞、組織、体液及び糞便のような生体試料から得られてもよい。当該体液には、血液、血清、血漿、唾液、粘液、痰、脳脊髄液、胸膜液、涙液、乳管液、リンパ液、唾液、脳脊髄液、滑液、尿、羊水、及び精液が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、試料は、対象、たとえば、ヒトから得られてもよい。一部の実施形態では、解析される試料は、血液、たとえば、妊娠女性の血液から得られる無細胞ＤＮＡの試料であってもよい。特定の実施形態では、ゲノムＤＮＡは、断片化に先立って、たとえば、全ゲノム増幅法を用いて増幅させてもよい。試料は、微生物のＤＮＡ、たとえば、ウイルスまたは細菌のゲノムに由来するＤＮＡを含有してもよい。
任意の実施形態では、プローブ混合体は第２の一揃いのプローブを含み、第２の一揃いのプローブのプローブは第２の染色体における異なる部位とハイブリッド形成し、第２の染色体に由来するＤＮＡ断片とハイブリッド形成する際、ライゲーション可能に隣接する接合部を含有する環状産物を非共有結合で形成する。この方法では、定量する工程は、第１及び第２の染色体に相当するローリングサークル増幅産物の分子の数を別々に定量し、それによって試料における第１及び第２の染色体に相当するＤＮＡの相対量の推定値を提供することを含む。上記で言及されたように、第１及び第２の染色体に相当するＲＣＡ産物は、区別可能に標識されたオリゴヌクレオチドをそれらとハイブリッド形成させ、支持体、たとえば、顕微鏡スライドの表面上にそれらをばらまくことによって別々に定量することができる。
方法を用いて亜染色体領域も調べてもよい。これらの実施形態では、第１の一揃いのプローブが染色体の第１の領域における異なる部位とハイブリッド形成してもよい。これらの実施形態では、プローブ混合体は第２の一揃いのプローブを含んでもよく、その際、第２の一揃いのプローブのプローブは、第１の染色体の第２の領域における異なる部位とハイブリッド形成し、第２の染色体に由来するＤＮＡ断片とハイブリッド形成する際、ライゲーション可能に隣接する接合部を含有する環状産物を非共有結合で形成する。この方法では、定量する工程は、第１の染色体の第１及び第２の領域に相当するローリングサークル増幅産物の分子の数を別々に定量し、それによって試料における染色体の第１及び第２の領域に相当するＤＮＡの相対量の推定値を提供することを含む。上記で言及されたように、第１及び第２の染色体に相当するＲＣＡ産物は、区別可能に標識されたオリゴヌクレオチドをそれらとハイブリッド形成させ、支持体、たとえば、顕微鏡スライドの表面上にそれらをばらまくことによって別々に定量することができる。
非侵襲性出生前試験の実施形態については、他の染色体異常（たとえば、他のトリソミー、または特定の領域の欠失若しくは挿入）を調べることができるけれども、標的断片は、たとえば、ヒトの第２１、第１３または第１８染色体に由来し得る。コピー数の多様性は、特定の染色体で欠失しているまたは増幅されているゲノムの相対的に大きな領域に相当するゲノムＤＮＡの変化である。ＣＮＶは、たとえば、欠失、重複、逆位及び転座のようなゲノム再構成が原因で生じ得る。コピー数の多様性は癌（Ｃａｐｐｕｚｚｏ，Ｆ，Ｈｉｒｓｃｈら，（２００５），９７（９）：６４３－６５５）、自閉症（Ｓｅｂａｔ，Ｊら，（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１６，（５８２３）：４４５－９）及び統合失調症（Ｓｔ．Ｃｌａｉｒ，Ｄ．（２００８）．Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ Ｂｕｌｌ，３５（１）：９－１２）を含む神経障害（Ｓｅｂａｔ，Ｊ．ら，（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１６，（５８２３）：４４５－９）の種々の形態に関連している。特定の細胞集団における目的の染色体またはその一部のコピー数の多様性の検出は、疾患または障害の診断用または予後診断用の遺伝指標を特定する強力なツールであることができる。一部の実施形態では、第１の染色体は第２１染色体であり、第２の染色体は第１３染色体及び第１８染色体から選択される。
任意の実施形態では、非共有結合の環状産物は試料に由来するＤＮＡの断片を含む。図３及び図４で示される実施では、方法で使用されるプローブは、（ｉ）頭部及び尾部の配列が第１のオリゴヌクレオチド分子の末端にある頭部及び尾部の配列と、（ｉｉ）順に、頭部配列に対して相補性である上流の隣接配列と標的配列に対して相補性である標的相補性配列と尾部配列に対して相補性である下流の隣接配列とを含むスプリント配列とを含んでもよい。これらの実施形態では、非共有結合の環状産物において、標的断片の末端は第１のオリゴヌクレオチド分子における頭部及び尾部の配列の末端にライゲーション可能に隣接する。これらの実施形態では、スプリント配列は第１のオリゴヌクレオチド分子の中にあってもよい。或いは、スプリント配列は第２のオリゴヌクレオチド分子の中にあってもよい。
一部の実施形態では、方法は、少なくとも５０（たとえば、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００または少なくとも５，０００）の前記プローブの一揃いと試料をハイブリッド形成させることを含み、その際、前記プローブは同じ染色体（たとえば、ヒトの第２１、第１３または第１８染色体）上の異なる断片を標識とし、方法は、標的断片を含む複数の環状産物を生じる。作出された環状産物の数は、たとえば、上述のように、ＲＣＡを用いてそれらを増幅し、ＲＣＡ産物の数を数えることによって定量することができる。
当業者は以下で記載される図面が説明目的だけのためのものであることを理解するであろう。図面は本教示の範囲を限定するようには決して意図されない。
目的のＤＮＡ標的種属を複数の標識された線状プローブに接触させ、結合した標識に由来する累積シグナルが検出される主題の方法の一実施形態を模式的に説明する図である。 ローリングサークル増幅によってクローン性に増幅される複数の環状化プローブに目的のＤＮＡ標的種属を接触させ、増幅された産物の累積シグナルが検出される主題の方法の一実施形態を模式的に説明する図である。 その標的断片に結合した環状化主鎖オリゴヌクレオチドを含むプローブを示す図である。２つの型、Ａ及びＢにてプローブを説明する。 結合した標的断片を伴った環状化した単一のオリゴヌクレオチドプローブを示す図である。 結合した標的断片を伴った、標的化オリゴヌクレオチドとループ化主鎖オリゴヌクレオチドから構成される環状化二重ループ化プローブを示す図である。 結合した標的断片を伴った、標的化オリゴヌクレオチドと線状主鎖オリゴヌクレオチドから構成される線状ループ化プローブを示す図である。 結合した標的断片を伴った、２つの主鎖オリゴヌクレオチドを含む線状プローブを示す図である。 ＲＣＡ産物を数えることができる方法を示す図である。 本明細書で記載される方法の特異性を示すゲルの画像である。 本明細書で記載される方法の精度を示すグラフである。 （Ａ）スライドの表面上での標識されたＲＣＡ産物の画像である。（Ｂ）個々のＲＣＡ産物を数えることによって、異なる染色体に由来する断片の比をいかに正確に決定できるかを示す図である。
標的配列の多重認識
検出されるまたは定量される核酸の種属には複数の標的配列が含まれる。これらの標的配列は互いに異なる。従って、それらは重なり合ってもよいが、核酸上で空間的に異なる位置を表すであろう。核酸の所与の種属の範囲内での標的配列は、重なり合ってもよいし、重なり合わなくてもよいし、または重なり合う及び重なり合わない標的配列の混合物であってもよい。好ましくは、標的配列は重なり合わない。効果的には、核酸の種属のための一揃いの標的配列は核酸の同じ種属の検出について異なるエピトープを表す。
普通、核酸には少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１，０００、または少なくとも１０，０００の異なる標的配列があり、それらのそれぞれが探査され得る。
プローブの好適な濃度は試料における核酸の種属の濃度（または予想される濃度）に基づいて決定されてもよい。実施例で説明されるように、プローブはプローブ当たり１０ｐＭの濃度で試料に添加されてもよい。試料が複数のプローブ（たとえば、一揃いのプローブ）に接触させられる場合、個々のプローブの濃度は１０ｐＭであってもよい。好ましくは、プローブは、検出されるまたは定量される目的の核酸種属の予想濃度を超えて使用される。過剰なプローブの使用は試料に存在する標的配列のコピーすべてが認識されるのを保証するはずである。これによって検出の感度が最大化される。また、方法に定量が関与する場合、それは、一揃いのプローブに由来するライゲーション産物または累積シグナルの検出が試料における標的配列の量に比例することを保証する。
核酸の一方の種属が別の種属に比べて定量されるべきである場合、標的配列は核酸のその種属に対して特異的であり、すなわち、核酸の他の種属では見いだされず、好ましくは、試料に存在し得る核酸の他のどんな種属にも見いだされない。
多数の診断応用及び他の応用については、核酸の種属は染色体または染色体遺伝子座であり、たとえば、ヒトの染色体または染色体遺伝子座である。従って、各標的配列の断片は生物のゲノムのその１つの染色体に特異的であり得る。言い換えれば、それはゲノムのたった１つの染色体で見いだされてもよく、そのゲノムの他の染色体で見いだされなくてもよい。一般に、本方法はヒトゲノムの解析に使用され、その場合、標的配列は１本のヒト染色体に対して特異的な断片であってもよく、すなわち、その染色体で見いだされ、他のヒト染色体では見いだされなくてもよい。たとえば、標的配列は第２１染色体に対して特異的であってもよい。標的配列は染色体の１つの遺伝子座に対して特異的であってもよい。従って、それらはその染色体遺伝子座にて見いだされてもよく、同じゲノムの同一の染色体または他の染色体の他の遺伝子座では見いだされなくてもよい。たとえば、標的配列はヒト染色体の１つの遺伝子座に対して特異的であってもよい。
試料における核酸の所与の種属は幾つかの変異性を包含してもよく、たとえば、試料は異なる個体の染色体、たとえば、母親ＤＮＡと胎児ＤＮＡを含有する母親の血液から得られる核酸を含んでもよい。ここで、目的の種属は特定の染色体であってもよいが、胎児起源であれ、母親起源であれその染色体のコピーすべてを検出することが好都合である。従って、目的の種属は１つの染色体または染色体遺伝子座であってもよく、標的配列は、染色体または染色体遺伝子座の母親コピー及び胎児コピーの双方にてその染色体または遺伝子座にて見いだされる。
核酸の種属は断片化されてもよい。標的配列は、核酸の種属の断片の配列、すなわち、標的断片であってもよい。
好ましくは、標的配列はその配列が事前に定義される断片である。末端を含む断片全体の配列が既知であってもよい。事前に定義された配列の既知の断片は、核酸の種属の無作為ではなく特異的な断片化によって作出することができる。特異的な断片化法には、制限酵素による消化、ＰＣＲ（たとえば、多重化ＰＣＲ）、及び他の酵素、リボザイムまたはそのような技法の組み合わせを含む配列指向の断片末端定義の他の方法が挙げられる。
断片化の好まれる方法は、制限エンドヌクレアーゼまたは２以上の制限エンドヌクレアーゼの組み合わせによる消化である。従って、試料は核酸の制限酵素消化物であってもよく、標的配列は制限断片であってもよい。
種々の特異的な核酸切断酵素が知られており、特定の核酸配列の範囲内にて事前に定義された位置で切断する酵素、または特定の核酸認識配列の後若しくは前で切断するエンドヌクレアーゼ酵素及びニッキング酵素（側鎖切断酵素）を含む好適な酵素が本方法で使用されてもよい。リボザイムのような触媒核酸も同様にＤＮＡの断片化に使用することができる。酵素は二本鎖核酸を切断して平滑末端若しくは付着末端を生じてもよく、または一本鎖核酸を切断してもよい。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、及びＶ型を含む種々の型の制限酵素が知られている。好適な酵素または酵素の組み合わせを所望のように本方法での使用のために選択することができる。たとえば、相当する相溶性の制限酵素緩衝液にて試料（たとえば、１０ｎｇのＤＮＡ）における核酸を制限酵素（たとえば、１Ｕ）で消化してもよい。好適な条件下（たとえば、３７℃で１時間）反応物をインキュベートし、その後、酵素を不活化してもよい（たとえば、８０℃で２０分間）。
断片化した核酸を提供する別の好都合な方法は、核酸の種属に由来する特定の線状配列の増幅のためのプライマーの使用である。複数の特異的なプライマー対で核酸を処理し、複数の特異的な断片を増幅する多重化ＰＣＲを使用することができる。この場合、標的配列の末端はプライマー対の配列に相当する。
核酸の試料は、たとえば、患者からの生体組織または体液の試料として好適な方法で提供されてもよい。試料は、血液試料、全血、血漿または血清、組織試料、たとえば、組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋した試料であってもよく、または血液若しくは組織から抽出した核酸の試料であってもよい。
試料は核酸を含有する試料であってもよい。試料に含有される核酸はＤＮＡ及び／またはＲＮＡであってもよい。試料は、複合体、たとえば、全ゲノムのＤＮＡ、または生物全体、組織または細胞集団、またはその分画に由来するｃＤＮＡであってもよい。この点で、それは核酸単離手順若しくは細胞溶解手順の直接産物であってもよく、またはそれはさらに何らかの方法で分画化され、または精製されてもよく、たとえば、それは何らかの方法で部分的に若しくは完全に分離されている、または多少なりとも処理されている核酸、たとえば、ｃＤＮＡを生じるＲＮＡであってもよい。試料は、真核または原核またはウイルスの供給源に由来してもよく、たとえば、微生物（たとえば、細菌または真菌）、植物または動物に由来してもよい。従って、たとえば、検出されるまたは定量される核酸の種属は微生物のＤＮＡであってもよい。好ましくは、試料はヒト起源であり、たとえば、ヒトのゲノムＤＮＡである。試料は動物に由来する組織または血液の試料であってもよく、検出されるまたは定量される核酸は微生物、たとえば、細菌、ウイルスまたは真菌のものである。多数の診断応用及び他の応用については、試料は断片化された染色体（たとえば、ヒトの染色体または微生物の染色体）の試料である。非侵襲性出生前診断に関する方法については、試料は妊娠女性の血液に由来し、胎児ＤＮＡを含む。他の例では、検出されるまたは定量される核酸は腫瘍に関連するＤＮＡである。
試料における核酸の所与の種属は、幾つかの変異性を包含してもよく、たとえば、試料は異なる個体の染色体、たとえば、母親ＤＮＡと胎児ＤＮＡを含有する母親の血液から得られる核酸を含んでもよい。ここで、目的の種属は特定の染色体であってもよいが、胎児起源であれ、母親起源であれその染色体のコピーすべてを検出することが好都合である。従って、目的の種属は１つの染色体または染色体遺伝子座であってもよく、標的配列は、染色体または染色体遺伝子座の母親コピー及び胎児コピーの双方にてその染色体または遺伝子座から得られる。
本方法は試験管内の試料で実施されてもよい。従って、方法は一般にヒトまたは動物の体にて生体内で行われる診断方法、または手術または治療によるヒトまたは動物の体の治療方法を含まない。にもかかわらず、試験管内の診断法の結果を用いて患者のその後の治療に情報を与えてもよい。
標的核酸を変性させること
プローブは、ハイブリッド形成を介して少なくとも部分的には一本鎖の形態で標的配列を認識し、結合する。プローブ、特に完全長の標的配列とハイブリッド形成するものの幾つかの設計については、標的配列は完全に一本鎖であるべきである。他のプローブ、たとえば、標的配列の最良の領域とハイブリッド形成するものについては、部分的に一本鎖の標的核酸が必要とされる。従って、採用されるプローブの型に応じて、標的配列の結合部位をプローブにさらすように好適な条件が提供されるべきである。
試料における標的配列がすでに一本鎖ではない、または少なくとも部分的に一本鎖でではないのであれば、その相補性の核酸鎖から一本鎖の標的配列を分離するように条件が提供されるべきである。そのような条件は変性条件であってもよく、または場合によっては、エキソヌクレアーゼによる処理であってもよい。
変性条件はその相補性配列から標的配列を分離するのに十分に高い温度であってもよい。変性条件は９５℃にて好適な時間、たとえば、１０分間のインキュベートであってもよい。或いは、化学変性を行ってもよい。
相補性及びハイブリッド形成
プローブと標的配列との間での特異的な結合は本方法の方法の重要な特徴である。プローブは好ましくは標的配列を認識する一本の標的相補性配列を含む。しかしながら、たとえば、パドロックプローブ及びセレクタプローブによって説明されるように、プローブは標的配列の様々な領域に対して相補性の複数の配列を含んでもよい。
標的配列に対する最大の特異性は、プローブが標的配列または標的配列の領域に対して正確に相補性である標的相補性配列を含むのであれば達成されるので、プローブと標的配列の間で完全なハイブリッド形成が存在する。しかしながら、これはあらゆる場合で必須であるわけではなく、たとえば、試料に存在する正確な対立遺伝子にかかわらず、標的配列を検出することが所望である場合、対立遺伝子の変異を示す配列の検出を可能にするには、程度の低いミスマッチは受け入れられてもよい。或いは、変異体配列のために複数のプローブを設計することができる。これは、異なる対立遺伝子または突然変異の検出及び識別の双方を可能にすることができる。プローブの大半はその標的配列に対する完全な相補性を有するが、一部のプローブは軽微なミスマッチを持つ標的を結合してもよいことが想定される。
一部の実施形態では、本方法で使用されるプローブはそれぞれ、標的配列または標的配列の領域と共に５未満の塩基対ミスマッチを有する標的相補性配列を含む。標的の配列または領域と標的相補性配列との間にて任意で１、２、３または４の塩基対ミスマッチがあってもよい。ミスマッチは、相当する塩基が１つの配列に不在である点であってもよいので相補性配列はミスマッチの点でループを形成し、または、非相補性のヌクレオチドが１つの配列で存在するので他の配列の相当する位置で塩基と対合しない場合、存在してもよい。正しくない塩基対合、すなわち、ＡまたはＴのＣまたはＧとの対合がある場合、ミスマッチ近傍のヌクレオチド間での塩基対合のせいで標的配列と標的化オリゴヌクレオチドの標的相補性配列との間でハイブリッド形成は生じるが、２つの鎖の塩基間で水素結合は生じない。ミスマッチは揺らぎ塩基であってもよい。揺らぎ塩基は正常では、標的断片にて既知の遺伝的変異の位置で対合する標的相補性配列における位置に相当することになる。プローブは、揺らぎ塩基の位置について特定の合成サイクルの間に１または数個のジデオキシヌクレオチドを付加することによって合成されてもよい。これは通常、従来のオリゴヌクレオチドの合成の場合である。或いは、各遺伝的変異体について１つ、複数の別々のプローブが作出されてもよい。これは通常、マイクロアレイに基づく合成を用いてプローブが合成される場合である。揺らぎ塩基はコドン間の単一のヌクレオチドの差異に相当してもよく、その際、異なるコドンは同じアミノ酸をコードする。
一般に、さらに長い標的配列またはその領域とハイブリッド形成するためのさらに長い標的相補性配列は短い標的相補性配列と比べて多数のミスマッチを認容し得る。標的相補性配列は、たとえば、標的配列またはその領域との多くても８のうち１、９のうち１または１０のうち１の塩基対ミスマッチを有してもよい。そのようなミスマッチは、標的相補性配列及び標的配列またはその領域の内部領域に限定されるべきなので、たとえば、制限酵素の消化によって、それらがライゲーションまたは配列特異的な標的の断片化を阻害することはない。従って、好ましくは、標的配列の各末端で末端の６～８ヌクレオチドにて、好ましくは末端の１０ヌクレオチドにて標的配列と標的相補性配列の間で完全な相補性がある。
好ましくは、プローブは、標的配列と同じ長さである単一の標的相補性配列を含む。従って、完全長の標的配列が標的相補性配列によって結合される。標的配列の標的化オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は２つの核酸分子間の単一の結合事象を表し、標的分子の２つの末端を結合する、または標的の隣接しない２つの領域を結合するプローブと対照的である。
標的相補性配列は少なくとも１０ヌクレオチド、たとえば、少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有してもよい。それは２０、２５、３０、３５または４０のヌクレオチドの長さであってもよい。好まれる範囲には１０～２０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、及び１０～４０ヌクレオチドが含まれる。そのような相対的に短い標的相補性配列は対応して短い標的配列を結合するのに好適である。短い配列は、ＤＮＡリガーゼが塩基対ミスマッチに感受性であり、一致した配列を優先的に完全にライゲーションするので、二重ライゲーション反応の特異性に寄与する。二本鎖配列に結合するＤＮＡリガーゼのフットプリントにミスマッチが存在する場合、配列はライゲーションされなくてもよく、それは、異なるが類似する配列の配列に優先して標的配列を検出することにおいて高い特異性を保証する追加の校正工程を提供する。ＤＮＡリガーゼは通常、ニックの各側で６～８塩基のフットプリントを有する。従って、標的配列が２０塩基であれば、１２～１６の塩基がリガーゼの特異性によってカバーされるであろう。
プローブのハイブリッド形成はハイブリッド形成した配列の特に中央部分におけるミスマッチを差別する一方で、ライゲーションは標的の末端でのミスマッチを差別するであろう。これは一緒に高い特異性の検出を生成する。
本明細書の他のどこかでさらに詳細に記載されるように、プローブは好ましくは、
標的配列よりも長く、且つ内部標的相補性配列を含有するので、標的化オリゴヌクレオチドと標的配列との間のハイブリッド形成が標的化オリゴヌクレオチドの上流と下流の隣接配列の間に位置する二本鎖配列を形成する標的化オリゴヌクレオチドと、
それぞれ遊離の５’末端及び３’末端を有し、頭部及び尾部の配列がそれぞれ上流及び下流の隣接配列に対して相補性である、頭部及び尾部の配列とを含む。
これらのプローブは、核酸の種属が断片化され、標的配列が定義された配列の断片である場合、使用するのに特に好適である。標的化オリゴヌクレオチドは標的相補性配列と同様に隣接配列を含むので、標的配列よりも長い。上流の隣接配列は標的化オリゴヌクレオチドにおける標的相補性配列の上流または５’にある。下流の隣接配列は標的化オリゴヌクレオチドにおける標的相補性配列の下流または３’にある。従って、標的相補性配列は標的化オリゴヌクレオチドに対して内部にあり、上流及び下流の隣接配列が隣接するので、標的化オリゴヌクレオチドの末端を含まない。
標的配列と標的相補性配列のハイブリッド形成によって生じる二本鎖配列は、それが標的とプローブとのハイブリッドであるので、ハイブリッド二本鎖配列と見なされてもよい。通常、二本鎖配列は二重らせん構造を採用し、標的配列は二重らせんの一方の鎖であり、且つ標的化オリゴヌクレオチドは他方の鎖である。ハイブリッド二本鎖配列には標的化オリゴヌクレオチドの上流と下流の隣接配列が隣接し、それは次に頭部及び尾部の配列とハイブリッド形成して二本鎖配列を生じる。再び、これらは通常、二本鎖核酸の正常な二重らせん構造を採用する。
上流及び下流の隣接配列は好ましくは互いに異なり、すなわち、好ましくは異なる配列を有する。頭部配列は上流の隣接配列に対して相補性であるが、下流の隣接配列に対してはそうでなく、且つ尾部配列は下流の隣接配列に対して相補性であるが、上流の隣接配列に対してはそうでないことが好まれる。これは、頭部及び尾部の配列がそれぞれ上流及び下流の隣接配列とのみハイブリッド形成することを保証する。
頭部配列は普通、上流の隣接配列と同じ長さであるだろう。尾部配列は普通、下流の隣接配列と同じ長さであるだろう。
隣接配列の正常な長さは１０～４０の間のヌクレオチド、たとえば、１０～２０または１０～３０のヌクレオチドの間である。隣接配列は互いに同じ長さであってもよい。隣接配列の一方または双方が標的相補性配列と同じ長さであってもよい。従って、上流及び／または下流の隣接配列は少なくとも１０ヌクレオチド、たとえば、少なくとも１５ヌクレオチドを有してもよい。それは２０、２５、３０、３５または４０までのヌクレオチドの長さであってもよい。
好ましくは、頭部配列は上流の配列の相補体である。好ましくは、尾部配列は下流の配列の相補体である。頭部及び尾部の配列が標的配列へのライゲーションのために正しく位置するようにプローブの最適な結合には配列の完全な一致が望ましい。しかしながら、任意で、頭部配列と上流の隣接配列との間、及び／または尾部配列と下流の隣接配列との間で１、２、３または４の塩基対ミスマッチがあってもよい。好ましくは、５未満の塩基対ミスマッチがある。
標的相補性配列以外に、プローブは普通、標的配列に対して、または試料に存在してもよい他の核酸に対して相補性であるべきではない。これは、標的以外の核酸へのプローブの望ましくないハイブリッド形成を回避するためである。従って、プローブがヒトのゲノムＤＮＡの配列を結合するためのものであるならば、標的相補性配列以外の配列がヒトのゲノムＤＮＡに対して相補性でないようにプローブが設計されるので、プローブは標的配列とのみハイブリッド形成し、試料における他の核酸とはハイブリッド形成しない。
プローブは１以上のカスタム配列を含んでもよい。カスタム配列はプローブの他の領域に対してまたは標的配列に対して相補性ではない－言い換えれば、それはアニーリング条件下でプローブの他の領域（カスタム配列の外側）と、または標的配列とハイブリッド形成しない。カスタム配列をたとえば、バーコードまたは標識として検出に使用して本明細書の他のどこかで記載されるように一揃いに属するプローブを特定してもよい。
ライゲーション産物の生成
アニーリング及びライゲーションの条件下で、プローブはその標的配列とハイブリッド形成し、ライゲーションされてライゲーション産物を生成する。各プローブとのハイブリッド形成はライゲーション産物の生成を生じる。従って、ライゲーション産物の生成はプローブとその標的配列との特異的なハイブリッド形成に依存する。
ライゲーション産物はプローブ核酸または標的核酸を含んでもよく、またはそれから成ってもよく、またはプローブと標的核酸の双方を含んでもよい。ライゲーション産物は核酸の５’の核酸の３’へのライゲーションによって形成されるライゲーション接合部を含む。複数の核酸が一緒にライゲーションされる場合、２つのライゲーション接合部があってもよい。
形成されるライゲーション産物の種類は、使用されるプローブの種類に左右される。ライゲーション産物は核酸の環状物であってもよいし、または線状の核酸分子であってもよい。
環状ライゲーション産物を形成するプローブの例はパドロックプローブである。たとえば、標準の、ギャップフィル、分子反転プローブ（ＭＩＰ）のような種々の型のパドロックプローブが知られている。パドロックプローブは、末端での標的相補性配列とその中間での非標的相補性配列を伴った線状オリゴヌクレオチドである。アニーリング及びライゲーションの条件下で、標的相補性配列はヘッドトゥテールで突き合わされ標的配列の隣接する領域とハイブリッド形成し、ライゲーションされて核酸の環状物を形成する。従って、標的配列とハイブリッド形成することによってプローブが環状化し、ライゲーション産物はプローブ核酸の環状物である。環状のライゲーション産物は通常、線状プローブの５’末端と３’末端が一緒にライゲーションされるライゲーション接合部を１つ含有する。架橋オリゴヌクレオチドやギャップフィルプローブを含む変形が知られる。プローブはプローブ主鎖に切断部位を含有して環状化されたライゲーション産物が切断されて線状産物を形成するのを可能にしてもよく、それはその後、増幅され、検出されてもよい（ＭＩＰ）。
好ましくは、プローブの標的配列とのハイブリッド形成は、標的配列へのライゲーションのためのプローブのオリゴヌクレオチドを位置付ける。従って、標的配列はライゲーション産物に組み込まれてもよい。これによって、標的配列がライゲーション産物を配列決定することによって検証されるのが可能になるので、パドロックプローブのようなプローブで利点である。好ましくは、プローブは標的配列の各末端にライゲーションされて標的配列の各末端でライゲーション接合部を形成する。そのような方法では、検出されるまたは定量される核酸の種属は好ましくは断片化されて標的配列に相当する標的断片を生じるであろう。次いで標的断片の末端がプローブの末端にライゲーションされてライゲーション産物の中で標的配列を捕捉することができる。そのような場合では、標的断片は両端での高度に特異的な反応でライゲーションされる。標的断片は通常、核酸の特異的な断片化の産物なので、これらの末端は普通、特異的な所定の配列を有する。ライゲーション工程では、これらの末端は、それぞれ頭部及び尾部の配列への配列依存性のライゲーションによって特異的に検出される。好ましくは、標的断片のプローブへの結合は、２つの完全に一致したライゲーション可能な接合部を創り出し、１つは標的断片の３’末端と頭部配列の５’末端との間であり、１つは標的断片の５’末端と尾部配列の３’末端との間である。
２つの末端が相補性配列の隣接するヌクレオチドに対合した塩基である場合、核酸の５’末端の核酸の３’末端へのライゲーションが起こり得る。各末端ヌクレオチドの隣接するヌクレオチドへの塩基対合は、２つの末端間でニックを含有する核酸鎖を形成する。２つの末端のライゲーションはＤＮＡリガーゼによって触媒することができる。従って、ライゲーションの条件を提供することは普通、ＤＮＡリガーゼ酵素とそのもとでＤＮＡリガーゼが２つの末端をライゲーションして連続した核酸鎖を形成する、ニックを閉じる反応条件とを提供することを含むであろう。たとえば、アンプリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）のような多数のリガーゼが市販されており、その好適な条件は１Ｕの酵素を加え、リガーゼ緩衝液にて５５℃で１時間インキュベートすることである。
標的配列を組み入れるライゲーション産物を生成するプローブの例はセレクタプローブである。これらのプローブは、標的配列の末端に対して相補性の１または２の突出末端を有する二本鎖セレクタ構築物であり、それは、標的配列とハイブリッド形成し、標的配列の末端にライゲーションされて、プローブ核酸と標的配列を含有する環状または線状のライゲーション産物を形成する。アニーリング及びライゲーションの条件下では、セレクタの末端配列は断片の末端配列とハイブリッド形成し、セレクタにライゲーションされる。プローブがそれぞれ突出末端を有する１対のセレクタ構築物を含む場合、ライゲーション産物が２つのプローブ配列間で標的配列を含む線状核酸であるように、それぞれが標的断片の末端の１つにライゲーションされてもよい。プローブが２つの突出末端を有する単一のセレクタ構築物を含む場合、ライゲーション産物が標的配列とプローブ核酸を含む環状核酸であるように、それが標的断片の各末端にライゲーションされてもよい。双方の場合、ライゲーション産物は２つのライゲーション接合部を含む。
好適なプローブの多数の他の例は本明細書の他のどこかで記載されている。
一部の実施形態では、本方法は、
標的断片よりも長く、内部標的相補性配列を含有するので標的化オリゴヌクレオチドと標的断片との間でのハイブリッド形成が標的化オリゴヌクレオチドの上流と下流の隣接配列の間に位置する二本鎖配列を形成する標的化オリゴヌクレオチドと、
頭部及び尾部の配列がそれぞれ５’及び３’末端を有し、それぞれ上流及び下流の隣接配列に対して相補性である、頭部及び尾部の配列とを含むプローブを使用してもよく、その際、アニーリング及びライゲーションの条件下では、頭部及び尾部の配列は隣接配列とハイブリッド形成し、標的配列は、存在するならば、標的相補性配列とハイブリッド形成し、それによって頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端に並置して標的配列の末端を位置付け、標的断片の３’末端は頭部配列の５’末端にライゲーションされて第１のライゲーション接合部を形成し、標的断片の５’末端は尾部配列の３’末端にライゲーションされて第２のライゲーション接合部を形成し、頭部及び尾部の配列と標的断片を含む核酸の連続鎖を含む二重ライゲーションの産物を生じる。
これらのプローブでは、隣接配列間における標的相補性配列の位置のせいで、頭部及び尾部の配列へのライゲーションのために標的化オリゴヌクレオチドは標的断片を鋳型とする。標的断片の存在下でのアニーリング条件下では、頭部及び尾部の配列は隣接配列とハイブリッド形成し、頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端との間でギャップを定義する。標的断片は、ギャップにて標的相補性配列とハイブリッド形成する。従って、頭部及び尾部の配列と標的断片の標的化オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、頭部配列の５’末端と並置して標的断片の３’末端を位置付け、尾部配列の３’末端と並置して標的断片の５’末端を位置付ける。
並置して２つの末端を位置付けることは、末端を一緒にライゲーションするＤＮＡリガーゼについての基質を提供する。頭部配列の５’末端と標的断片の３’末端が標的化オリゴヌクレオチドの隣接するヌクレオチドとハイブリッド形成し、尾部配列の３’末端と標的断片の５’末端が標的化オリゴヌクレオチドの隣接するヌクレオチドとハイブリッド形成することが好ましい。従って、上流の隣接配列は介在ヌクレオチドを伴わずに標的相補性配列に直接隣接してもよい。同様に、下流の隣接配列は介在ヌクレオチドを伴わずに標的相補性配列に直接隣接してもよい。隣接する３’及び５’の末端は、それらの間でニックを封止するＤＮＡリガーゼによって直接ライゲーションされて連続した核酸鎖を形成することができる。
二重ライゲーションの産物、すなわち、頭部配列と尾部配列の双方の標的断片へのライゲーションの産物は核酸の連続する鎖である。それはニックまたはギャップを含有しないという意味で連続しているので鎖におけるヌクレオチドすべては共有結合する。
頭部及び尾部の配列と標的断片とを含む核酸の連続した鎖が核酸の環状物であるようにプローブが設計されてもよい。環状物なる用語はここでは、遊離の末端がない、鎖が閉鎖ループであるトポロジーを指す。
標的断片の存在下でアニーリング条件下では、頭部及び尾部の配列は隣接配列とハイブリッド形成し、頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端との間でのギャップを定義する。標的断片はギャップにて標的相補性配列とハイブリッド形成し、それによって頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端に並置して標的断片の末端を位置付け、標的断片と頭部及び尾部の配列を含む核酸の環状物を完成させる。
環状物を形成する核酸分子はその末端を並んで有する。末端のライゲーションは少なくとも頭部及び尾部の配列と標的断片とを含む核酸の連続した環状鎖を生じる。
核酸の環状物を形成するプローブには頭部及び尾部の配列が単一の核酸分子で提供されるプローブが挙げられる。たとえば、標的化オリゴヌクレオチドに加えて、プローブはそれぞれ５’末端及び３’末端で頭部及び尾部の配列を有する主鎖オリゴヌクレオチドを含んでもよく、その際、主鎖オリゴヌクレオチドの頭部及び尾部の配列はアニーリング条件下で標的化オリゴヌクレオチドの隣接配列にトランスで結合する。主鎖オリゴヌクレオチドは頭部及び尾部の配列の間でカスタム配列を含んでもよい。図３は、そのようなプローブの実施形態を説明する。或いは、主鎖オリゴヌクレオチドの頭部及び尾部の配列はその間にカスタム配列を持たずに隣接してもよい。
別の例では、頭部及び尾部の配列は標的化オリゴヌクレオチドの末端にあってもよく、アニーリング条件下で隣接配列にシスで結合してもよい。標的化オリゴヌクレオチドは標的化オリゴヌクレオチドと頭部及び／または尾部の配列との間でカスタム配列を含んでもよい。図４はそのようなプローブの実施形態を説明する。
核酸の環状物を形成するプローブには頭部及び尾部の配列が異なる核酸分子で提供されるプローブも挙げられる。そのような場合、アニーリング条件下で生じる核酸の環状物は少なくとも３つの核酸分子－標的断片と頭部配列と尾部配列とを含むであろう。核酸分子の末端は前に言及したようにすべて並置するであろう。そのような場合、核酸の連続した環状鎖を形成するには２回を超えるライゲーション反応が必要とされる。例は、尾部配列が標的化オリゴヌクレオチドの３’末端であり、且つプローブがその５’末端で頭部配列を有する主鎖オリゴヌクレオチドを含む場合である。アニーリング条件下では、尾部配列は標的化オリゴヌクレオチドの下流の隣接配列にシスで結合し、主鎖オリゴヌクレオチドの頭部配列は標的化オリゴヌクレオチドの上流の隣接配列にトランスで結合する。シスで結合することは、結合が同一核酸上で生じ、すなわち、核酸の一本鎖が、異なる領域が接合され、ハイブリッド形成する三次元構造を形成することを意味する。トランスで結合することは、異なる核酸分子間で結合が生じることを意味する。任意で、主鎖オリゴヌクレオチドはアニーリング条件下でヘアピン構造を形成する１対の反転反復配列を含み、それによって標的化オリゴヌクレオチドの５’末端に並置する主鎖オリゴヌクレオチドの３’末端を位置付ける。２つの末端の間にはニックがある。この種のプローブは図５で説明される。ライゲーション用の条件が提供される場合、標的化オリゴヌクレオチドの５’末端は主鎖オリゴヌクレオチドの３’末端にライゲーションされる。二重ライゲーションの産物は、標的化オリゴヌクレオチドと標的断片と主鎖オリゴヌクレオチドとを含む核酸の環状物である。或いは、標的化オリゴヌクレオチドの５’末端と主鎖オリゴヌクレオチドの３’末端との間にギャップがある場合、図５で示されるプローブはライゲーションによって環状化されないであろう－代わりに、頭部及び尾部の配列と標的断片を含む核酸の連続した鎖は核酸の線状鎖である。
或いはプローブは、頭部配列が標的化オリゴヌクレオチドの５’末端にあり、プローブがその３’末端で尾部配列を有する主鎖オリゴヌクレオチドを含むように、反対の配向で配置されてもよい。この場合、アニーリング条件下で、頭部配列は標的化オリゴヌクレオチドの上流の隣接配列にシスで結合し、主鎖オリゴヌクレオチドの尾部配列は標的化オリゴヌクレオチドの下流の隣接配列にトランスで結合する。再び、主鎖オリゴヌクレオチドは、アニーリング条件下でヘアピン構造を形成し、標的化オリゴヌクレオチドの３’末端に並置する主鎖オリゴヌクレオチドの５’末端を位置付ける１対の反転反復配列を含んでもよい。二重ライゲーションの産物が、標的化オリゴヌクレオチドと標的断片と主鎖オリゴヌクレオチドとを含む核酸の環状物であるように、次いで、標的化オリゴヌクレオチドの３’末端が主鎖オリゴヌクレオチドの５’末端にライゲーションされる。或いは、上記で言及したように、アニーリングが、標的化オリゴヌクレオチドの３’末端の近傍にあるが、１以上のヌクレオチドのギャップによって分離された主鎖オリゴヌクレオチドの５’末端を位置付けてもよい。そのとき、ライゲーション産物は頭部及び尾部の配列と標的断片を含む核酸の連続した線状鎖であるだろう。
主鎖オリゴヌクレオチドは反転反復配列との間でカスタム配列を含んでもよいので、図５で説明されるように、アニーリング条件下では主鎖オリゴヌクレオチドはヘアピンループを形成する。
言及されたように、頭部及び尾部の配列と標的断片を含む核酸の連続鎖が核酸の線状鎖であるようにプローブが設計されてもよい。標的断片の存在下でのアニーリング条件下では、頭部及び尾部の配列は隣接配列とハイブリッド形成して、頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端との間でギャップを定義する。標的断片はギャップにて標的相補性配列とハイブリッド形成し、それによって頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端とに並置する標的断片の末端を位置付け、且つ、標的断片と頭部及び尾部の配列を含む核酸の鎖を完成させる。鎖を形成する核酸分子はその末端を並んで有する。用語、並置は本明細書の他のどこかで議論されている。ライゲーションされる末端間にニックがある。末端のライゲーションは、少なくとも頭部及び尾部の配列と標的断片を含む核酸の連続する鎖を生じる。
プローブは、その３’末端で尾部配列を有する標的化オリゴヌクレオチドと、その５’末端で頭部配列を有する線状の主鎖オリゴヌクレオチドとを含んでもよい。アニーリング条件下では、尾部配列は標的化オリゴヌクレオチドの下流の隣接配列にシスで結合し、且つ主鎖オリゴヌクレオチドの頭部配列は標的化オリゴヌクレオチドの上流の隣接配列にトランスで結合する。標的化オリゴヌクレオチドは下流の隣接配列と尾部配列との間でカスタム配列を含んでもよいので、アニーリング条件下では、標的化オリゴヌクレオチドはヘアピンループを形成する。アニーリング条件下で形成された核酸の線状鎖は主鎖オリゴヌクレオチドと標的断片と標的化オリゴヌクレオチドとを含む。図６はこの配置を説明する。
プローブは逆向きの配向で同等に配置されてもよく、その際、頭部配列は標的化オリゴヌクレオチドの５’末端にあり、プローブはその３’末端に尾部配列を有する主鎖オリゴヌクレオチドを含む。この場合、頭部配列は標的化オリゴヌクレオチドの上流の隣接配列にシスで結合し、主鎖オリゴヌクレオチドの尾部配列は標的化オリゴヌクレオチドの下流の隣接配列にトランスで結合する。
ライゲーションの産物として線状の核酸鎖を形成する別の形態のプローブは別々の主鎖オリゴヌクレオチドにて頭部及び尾部の配列を含むプローブである。そのようなプローブは、遊離の５’末端を有する頭部配列を含む主鎖オリゴヌクレオチドと遊離の３’ 末端を有する尾部配列を含む主鎖オリゴヌクレオチドとを含み、アニーリング条件下では、頭部及び尾部の配列は標的化オリゴヌクレオチドの隣接配列にトランスで結合する。主鎖オリゴヌクレオチドの一方または双方はさらにカスタム配列を含んでもよい。図７はこの種のプローブを説明する。
好ましくは、ライゲーションされない形態でのプローブのオリゴヌクレオチドは線状である。だから好ましくは、標的化オリゴヌクレオチドは線状の核酸分子である。１以上の主鎖オリゴヌクレオチドを含むプローブについては、それらも好ましくは線状である。これはライゲーションされたプローブとライゲーションされていないプローブの間での好都合な差別化を可能にし、ＤＮＡの環状物は、プローブの環状化の実施形態での上手くいったライゲーションの結果としてのみ形成される。線状の核酸分子はローリングサークル複製によって増幅されない。
産物の増幅
本方法におけるシグナルの検出は、配列特異的なハイブリッド形成と、シグナルが得られる特定の産物を生成する酵素触媒とを用いた、標的認識に続いて正しく反応したプローブによって生成されるまたはそれに由来するシグナルに依存する。本方法は、シグナル増幅工程として目的の標的分子の核酸種属における複数の遺伝子座の検出を使用するので、反応したプローブの産物の増幅を必要とすることなく、シグナルの生成及び検出を可能にする。ライゲーションの産物を増幅することなく、シグナルが得られてもよいし、累積シグナルが検出されてもよい。しかしながら、任意で、多重化産物からのシグナルを従来のシグナル増幅工程によって増幅してもよい。
方法には検出の前にライゲーション産物を濃縮することが含まれてもよい。増幅及び／または固相化学法によって産物が濃縮されてもよい。試料をエキソヌクレアーゼ（たとえば、λエキソヌクレアーゼ）によって処理し、線状核酸産物を消化することによって環状核酸産物を選択的に濃縮してもよい。一般に、ライゲーション産物がエキソヌクレアーゼ分解から保護されている場合、エキソヌクレアーゼ分解を用いてライゲーション産物を濃縮してもよい。次いでエキソヌクレアーゼは、重合を含むそれに続く工程の前に、たとえば、ローリングサークル増幅の前に不活化される（たとえば、熱によって）べきである。実施例２で説明されるように、１Ｕのエキソヌクレアーゼを加えて未反応のプローブ及び断片を取り除く。好適な条件は、相当するエキソヌクレアーゼ緩衝液にて３７℃で１時間のインキュベートとその後の８０℃で２０分間の酵素の不活化である。捕捉／検出の方法が使用される場合、ライゲーション産物は捕捉部分を介して産物を固相に捕捉することによって濃縮されてもよい。実施例１で説明されるように、線状のライゲーション産物を含有する溶液を、２００ｍｌの最終容量のトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３．５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０７％のＴｗｅｅｎ－２０にて１０ｍｌのＭ－２８０ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に混合し、室温にて１５分間インキュベートしてもよい。インキュベートの後、環状磁石を用いてビーズを回収し、上清を取り除く。ライゲーション産物を濃縮する他の方法には、特にサイズ選択ライゲーション産物が挙げられる。
クローン性増幅によってライゲーション産物を増幅してもよい。好適な増幅法には、ローリングサークル増幅（以下を参照）、架橋ＰＣＲ（Ａｄｅｓｓｉ，Ｃ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０００，Ｏｃｔ．１５；２８（２０）：Ｅ８７）、乳化ＰＣＲ（エマルジョンにおけるデジタルＰＣＲはＤｒｅｓｓｍａｎ，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３，Ｊｕｌ．２２；１００（１５）：８８１７－２２．Ｅｐｕｂ，２００３，Ｊｕｌ．１１にて記載された）、及びデジタルＰＣＲ（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ及びＫｉｎｚｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９９，Ａｕｇ．３；９６（１６）：９２３６－４１）が挙げられる。ゲルにおけるクローン性の局在増幅はＭｉｔｒａ及びＣｈｕｒｃｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，１５；２７（２４）：ｅ３４にて記載された。本方法の実施形態は、ライゲーション産物を増幅することと、増幅された産物に由来する個々のシグナルの組み合わせである累積シグナルを得ることを含んでもよい。好ましくは、ライゲーション産物はライゲーション接合部を横切って、または二重ライゲーションの産物については双方のライゲーション接合部を横切って増幅される。
ライゲーション産物が核酸の環状物ある場合、増幅は、核酸の環状物のローリングサークル複製の条件を提供することと、ローリングサークル複製の産物を検出することとを含んでもよい。ローリングサークル複製は、ＵＳ５，８５４，０３３（Ｌｉｚａｒｄｉ）並びにＦｉｒｅ及びＸｕ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９５，Ｍａｙ，９；９２（１０）：４６４１－５にて記載された。ローリングサークル複製は、鎖置換ポリメラーゼを用いた環状核酸分子の増幅であり、増幅された配列の直列反復を含有する大きなＤＮＡ分子を生じる。ＤＮＡポリメラーゼは、所望な限り進行する進行性ローリングサークル重合反応にてプライマーの伸長と鎖の置換を触媒する。それは、各サイクルが標的配列のコピー数の倍加に限定される単一サイクルのＰＣＲ複製や他の増幅法に比べて何桁も大きい環状化されたプローブ配列の増幅を生じる。鎖置換反応のカスケードを用いて追加の増幅を得ることができる。ローリングサークル複製は高度に分岐したローリングサークル複製であってもよい。高度に分岐したＲＣＡはＬｉｚａｒｄｉら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９８，Ｊｕｌ；１９（３）：２２５－３２によって記載された。ローリングサークル複製の条件は実施例にて説明されるが、たとえば、１Ｕのｐｈｉ２９ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）とのインキュベートを３７℃で１時間、相当するｐｈｉ２９緩衝液とヌクレオチド（ｄＮＴＰ）に加えることができる。
検出
ライゲーション産物は個々に検出可能なので、個々のシグナルは、相当するプローブによる各標的配列の認識から生じるライゲーション産物から入手可能である。しかしながら、本方法では、ライゲーション産物は個々に検出される必要はない。ライゲーション産物に由来する個々のシグナルは累積シグナルに統合され、累積シグナルが検出される。
シグナルの種類及び検出の方法はプローブの種類に基づいて好適に選択することができ、プローブは所望のシグナルの種類及び検出方法を可能にするように設計されてもよい。方法はシグナルまたはシグナル検出手段の特定の種類に限定されず、むしろ、方法は、複数のプローブからの個々のシグナルを単一の累積された検出可能なシグナルに変換し、それによってプロービング工程の多重化の性質を介して個々のシグナルを増幅する方法によって実施することができる。
一般に、ライゲーション産物に由来するシグナルの検出は標的配列へのプローブの結合に続く産物の形成に依存するので標的配列が試料に存在したかどうかを示す。従って、シグナルはライゲーション接合部を含む、二重ライゲーションの産物については双方のライゲーション接合部を含む産物から特異的に得られてもよい。個々のシグナルは各標的配列とのプローブのハイブリッド形成の結果形成される各ライゲーション接合部から入手可能であってもよい。だから、たとえば、一揃いのプローブが目的の種属の１０の標的配列を認識する１０の異なるプローブを含む場合、ライゲーション接合部を含む１０のライゲーション産物があり、１０のライゲーション産物に由来する個々のシグナルの組み合わせである累積シグナルが検出されてもよい。当然この例では、試料には各標的配列の複数のコピーが普通存在し、試料は複数コピーの各プローブに接触するので、分子プローブ、標的配列及びライゲーション産物の実際の数は１０より多くてもよい。
一揃いのプローブによって生成されるライゲーション産物は、その一揃いに特徴的で、且つ異なる一揃いのプローブによって生成されるライゲーション産物から得られるシグナルとは異なる個々のシグナルを生じてもよく、各一揃いのプローブに由来する累積シグナルが区別され、別々に定量されるのを可能にする。たとえば、一揃いの範囲内のプローブは、その一揃いに共通し、且つ他の一揃いのプローブのカスタム配列とは異なるカスタム配列を共有することができ、各一揃いのプローブが好都合に特定されるのを可能にする。各一揃いのプローブは、核酸の配列に特異的な複数の標的配列を結合するための少なくとも５００、６００、７００、８００、９００または少なくとも１，０００の異なるプローブを含有してもよい。たとえば、方法は、第２１、第１３及び第１８染色体のそれぞれに対して１，０００の異なる標的化オリゴヌクレオチドを使用してもよく、且つ３つの異なる一揃いのプローブを使用してもよく、各染色体について１つ、各一揃いが独特のカスタム配列で標識されてもよい。所望であれば、特定の対立遺伝子及び／または遺伝子座をコードするモチーフを高多重化でカスタム配列に組み込むことができる。
試料における２以上の染色体の相対量は、そのそれぞれが１つの染色体に特異的な標的配列を認識する、２以上の一揃いのプローブからの二重ライゲーションの産物に由来する累積シグナルを検出し、異なる累積シグナルを定量することによって決定されてもよい。
ライゲーションの産物からシグナルを得る好都合な方法は、増幅の条件を提供し、増幅産物の存在について調べることである。たとえば、ＮＡＳＰＡ、ＬＡＭＰ、Ｔ７増幅、ＰＣＲ、またはライゲーション産物が環状である場合、ローリングサークル複製のような幾つかの増幅法が可能である。シグナルを得ることには、ライゲーション接合部を横切る増幅及び増幅産物からのシグナルを検出すること（たとえば、ＰＣＲまたはプローブの環状化の実施形態についてはローリングサークル複製によって）、または一方の末端で連続する核酸鎖を捕捉し、その他方の末端を検出することが関与してもよい。たとえば、蛍光標識の検出、酵素結合検出系、抗体介在の標識検出、及び放射線標識の検出のような核酸についての従来の検出系を用いて、増幅されたまたは増幅されないライゲーション産物からシグナルが得られてもよい。好ましくは、ローリングサークル増幅の産物は、標識された検出オリゴヌクレオチドのＲＣＡ産物におけるモチーフ、たとえば、プローブのカスタム配列におけるモチーフとのハイブリッド形成によって検出される。ライゲーション産物の量は試料における標的配列の量と直接比例するので、定量的測定は試料における標的配列の量を確実に表す。この方法の主な利点は、増幅工程が線形であり、高度に進行性の酵素によって触媒されるので、ライゲーション工程を操作して対立遺伝子の区別を得ることができ、ＤＮＡ複製工程が等温性であり、シグナルが厳密に定量的であることである。ＤＮＡポリメラーゼ反応に使用されるプライマーオリゴヌクレオチドは反応混合物における一揃いのプローブすべてについてまたは複数の一揃いのプローブについて同一であってもよい。
シグナル検出の一例は捕捉／標識法を採用する。ここで、ライゲーション産物はライゲーション接合部の一方側に捕捉部分を含み、且つライゲーション接合部の他方側に標識を含み、方法は、捕捉部分を介して基材上にライゲーション産物を捕捉し、基材を洗浄し、基材及び捕捉されたライゲーション産物を含む捕捉分画を保持し、捕捉分画におけるライゲーション産物上の標識を検出することによってライゲーション産物からシグナルを得ることを含む。そのような方法は、ライゲーション産物が線状であるので、産物の一方の末端が捕捉され、他方が検出される場合、特に好適である。しかしながら、ライゲーション産物が環状である場合、切断して環状物を線状産物に変換する工程を含めることによって、その方法を使用することもできる。シグナルは異種の標識またはプローブの配列、たとえば、カスタム配列に由来してもよい。
たとえば、第１及び第２の一揃いのプローブを異なる蛍光標識で標識することによって蛍光シグナルを使用してもよい。従って、方法は、試料における核酸を第１の一揃いのプローブ及び第２の一揃いのプローブに接触させることと、第１及び第２の累積シグナルを検出することとを含み、その際、
第１の累積シグナルは第１の一揃いのプローブによって生成されるライゲーション産物によって放射される第１の波長での蛍光であり、
第２の累積シグナルは第２の一揃いのプローブによって生成されるライゲーション産物によって放射される第２の波長での蛍光である。
これらの実施形態の一部では、第１及び第２の一揃いのプローブによって生成されるライゲーション産物のローリングサークル複製の産物は区別可能に標識される。
捕捉／検出法は、別々の核酸分子（たとえば、別々の核酸分子における頭部及び尾部の配列）を含むプローブと共に使用するのに特に好都合である。そのとき、ライゲーション産物は単一の核酸分子（ライゲーション産物）にて双方の分子の配列（たとえば、頭部及び尾部の配列）を含有するのに対して、ライゲーションされないプローブはそれらを含有しない。従って、一方の配列（たとえば、頭部配列）を含有する核酸分子を捕捉し、洗浄してライゲーションされなかったプローブ核酸を取り除き、次いで捕捉分画における他の配列（たとえば、尾部配列）の存在を検出することによってライゲーション産物からシグナルを得てもよい。ライゲーションされなかったプローブでは、２つの配列は核酸間のハイブリッド形成のみによって接続され、洗浄によって分離されるのに対して、ライゲーションされたプローブは連続した核酸鎖、すなわち、共有結合した鎖にてライゲーション接合部の各側で２つの配列を含有するので、検出はライゲーションされたプローブに特異的である。
言及されたように、プローブは捕捉部分を運ぶように修飾されてもよい。捕捉部分は、たとえば、ビーズのような固相基材への結合を可能にする。好適な捕捉部分は、ストレプトアビジンと対合し、修飾されたプローブ核酸がストレプトアビジンで被覆された固相基材上で単離されるのを可能にするビオチンである。プローブを試料と組み合わせる前にプローブに捕捉部分を提供することが好都合であってもよい。或いは、ライゲーション工程の後に捕捉部分が導入されてもよい。
プローブが、頭部または尾部の配列を含有する主鎖オリゴヌクレオチドと、それぞれ頭部または尾部を含有する別の核酸（標的化オリゴヌクレオチドまたは第２の主鎖オリゴヌクレオチド）を含む場合、これらの核酸分子のいずれかが捕捉部分を運んでもよく、たとえば、ビオチン化されてもよい。
プローブの核酸分子の１つが捕捉部分を運ぶ場合、他は標識を運んでもよい。検出される核酸分子を特定する、たとえば、一揃いのプローブすべてに存在するが、別の一揃いのプローブには存在しないカスタム配列を検出する標識として核酸配列自体を使用することが可能である。相補性のオリゴヌクレオチドを検出に使用してもよい。或いは、核酸は、たとえば、蛍光色素分子のような異種の標識を運んでもよい。異種の標識は核酸自体の一部ではない。使用することができる他の標識には、量子ドット、生物発光、チラミドシグナル増幅のようなシグナル生成酵素のカスケード、及び放射性部分が挙げられる。次いで方法は、標識の存在を検出すること、たとえば、それぞれ、蛍光を検出すること、量子ドットを検出すること、生物発光を検出すること、酵素によって生成されるシグナルを検出すること、または放射活性を検出することを含んでもよい。
例として、シグナルを得ることは、捕捉部分を介して基材上でプローブの主鎖オリゴヌクレオチドを捕捉することと、基材を洗浄してライゲーションされなかったプローブを取り除くことと、基材及び捕捉された主鎖オリゴヌクレオチドを含む捕捉分画を保持することと、捕捉分画において二重ライゲーションの産物からシグナルを得ることとを含んでもよい。二重ライゲーションの産物が標識を運ぶ場合、これは捕捉分画にて標識を検出することを含んでもよい。
捕捉部分はストレプトアビジン－基材に対して親和性を持つビオチン分子であることができる。他の好適な親和性タグには、ヒスチジン含有の配列、たとえば、主鎖オリゴヌクレオチドの精製に使用することができる、コバルト、ニッケル、銅のような不動化金属イオンに対して親和性を持つポリヒスチジンタグが挙げられる。従って、捕捉部分は捕捉される配列、たとえば、Ｈｉｓタグ配列の一部であってもよく、またはそれは核酸自体の一部ではない異質の部分であってもよい。
好適な固相基材は、ビーズであり、たとえば、磁石を用いて捕捉された産物の濃縮を円滑にする磁気ビーズである。基材は捕捉部分に対する結合部材で被覆されてもよく、たとえば、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズをビオチン化プローブと共に使用してもよい。
定量すること
定量は試料における核酸の種属の量を決定する。場合によっては、この量は決定され、既知の対照と比較されてもよく、試料における核酸の絶対量または相対量の決定を可能にする。他の場合では、核酸の複数の種属が試料の中で、たとえば、同時に探査される。これによって核酸の種属が参照として使用されるのが可能になり、互いに比べて核酸の異なる種属を定量し、たとえば、試料が第１染色体よりも第２１染色体を多く含有することを決定する。
分量は濃度または量（たとえば、モルまたは質量）として表されてもよく、濃度が試料の容積によって割られた核酸の量である場合、２つは相互交換可能である。
プローブ
プローブの例及びその特徴はすでに上記で記載されている。一部のさらなる特徴及び例をここで記載する。
プローブ核酸は好ましくはＤＮＡである。しかしながら、それは、天然に存在するまたは存在しない別の核酸であってもよい。ＤＮＡの標準塩基はＡ、Ｔ、Ｃ及びＧであるが、方法のプローブ核酸は任意で非標準のヌクレオチドを含んでもよい。
一般に、本方法の方法で使用するためのプローブは、標的化オリゴヌクレオチドと頭部及び尾部の配列とを含んでもよい。頭部及び尾部の配列は、標的化オリゴヌクレオチドの一部であってもよく、またはその一方若しくは双方は異なる核酸分子上にあってもよい。任意で、プローブは、標的化オリゴヌクレオチドと頭部配列を含む主鎖オリゴヌクレオチドと尾部配列を含む主鎖オリゴヌクレオチドとを含む。従って、プローブは、そのライゲーションされていない形態で１、２または３の核酸分子を含んでもよい。
好ましくは、プローブは、定量されるまたは特定される核酸の種属から生成される定義された配列の断片である標的配列とハイブリッド形成するためのものである。これらの標的配列は標的断片と呼ばれてもよい。
標的化オリゴヌクレオチドは標的断片よりも長く、且つ内部標的相補性配列を含有するので、標的化オリゴヌクレオチドと標的断片との間でのハイブリッド形成は標的化オリゴヌクレオチドの上流の隣接配列と下流の隣接配列との間に位置する二本鎖配列を形成する。頭部及び尾部の配列はそれぞれ遊離の５’及び３’末端を有し、それぞれ上流及び下流の隣接配列に対して相補性である。標的断片の存在下でのアニーリング条件下では、頭部及び尾部の配列は隣接配列とハイブリッド形成し、頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端との間でギャップを定義し、その際、標的断片はギャップにて標的相補性配列とハイブリッド形成し、それによって頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端とに並置して標的断片の末端を位置付ける。
この種のプローブは、
（ｉ）核酸の種属が標的断片に断片化されている試料を提供することと、
（ｉｉ）標的断片が一本鎖である変性条件を提供することと、
（ｉｉｉ）各プローブが検出される核酸の種属の中で異なる標的配列を特異的に認識し、標的配列が標的断片の配列であり、各プローブが、
標的断片より長く、内部標的相補性配列を含有するので、標的化オリゴヌクレオチドと標的断片との間でのハイブリッド形成が標的化オリゴヌクレオチドの上流及び下流の隣接配列の間に位置する二本鎖配列を形成する標的化オリゴヌクレオチドと、
それぞれ遊離の５’及び３’末端を有し、それぞれ上流及び下流の隣接配列に対して相補性である頭部及び尾部の配列
とを含む、一揃いのプローブに試料を接触させることと、
（ｉｖ）頭部及び尾部の配列が隣接配列とハイブリッド形成し、標的断片が存在するならば、プローブの標的相補性配列とハイブリッド形成し、それによって頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端に並置する標的断片の末端を位置付けるアニーリング条件を提供することと、
（ｖ）標的断片が存在するならば、標的断片の３’末端が頭部配列の５’末端にライゲーションされて第１のライゲーション接合部を形成し、標的断片の５’末端が尾部配列の３’末端にライゲーションされて第２のライゲーション接合部を形成して頭部及び尾部の配列と標的断片を含む核酸の連続する鎖を含む二重ライゲーションの産物を生じるようなライゲーションの条件を提供することと、
（ｖｉ）産物すべてに由来する個々のシグナルの組み合わせである累積シグナルを検出することと
を含み、その際、シグナルの検出は試料における核酸の種属の存在を示す、
方法において核酸の種属を検出するのに使用されてもよい。
核酸の種属は、
（ｉ）核酸の種属が標的断片に断片化されている試料を提供することと、
（ｉｉ）標的断片が一本鎖である変性条件を提供することと、
（ｉｉｉ）各プローブが定量される核酸の種属の区別できる標的配列を特異的に認識し、各プローブが、
標的断片より長く、内部標的相補性配列を含有するので、標的化オリゴヌクレオチドと標的断片との間でのハイブリッド形成が標的化オリゴヌクレオチドの上流及び下流の隣接配列の間に位置する二本鎖配列を形成する標的化オリゴヌクレオチドと、
それぞれ遊離の５’及び３’末端を有し、それぞれ上流及び下流の隣接配列に対して相補性である頭部及び尾部の配列
とを含む、一揃いのプローブに試料を接触させることと、
（ｉｖ）頭部及び尾部の配列が隣接配列とハイブリッド形成し、標的断片が存在するならば、プローブの標的相補性配列とハイブリッド形成し、それによって頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端に並置する標的断片の末端を位置付けるアニーリング条件を提供することと、
（ｖ）標的断片が存在するならば、標的断片の３’末端が頭部配列の５’末端にライゲーションされて第１のライゲーション接合部を形成し、標的断片の５’末端が尾部配列の３’末端にライゲーションされて第２のライゲーション接合部を形成して頭部及び尾部の配列と標的断片を含む核酸の連続する鎖を含む二重ライゲーションの産物を生じるようなライゲーションの条件を提供することと、
（ｖｉ）ライゲーション産物すべてに由来する個々のシグナルの組み合わせである累積シグナルを検出することと
（ｖｉｉ）累積シグナルを定量して、シグナルのレベルが試料における核酸の種属の量に比例する、シグナルのレベルを決定し、それによって試料における核酸の種属の分量を決定することと
を含む方法によって定量されてもよい。
方法を用いて、試料における核酸の第２の種属と比べて核酸の第１の種属を定量してもよい。従って、該方法は、
（ｉ）核酸の第１および第２の種属が標的断片に断片化されている試料を提供することと、
（ｉｉ）標的断片が一本鎖である変性条件を提供することと、
（ｉｉｉ）第１の一揃いのプローブが核酸の第１の種属の区別できる標的断片を特異的に認識し、第２の一揃いのプローブが核酸の第２の種属の区別できる標的断片を特異的に認識し、各プローブが、
標的断片より長く、内部標的相補性配列を含有するので、標的化オリゴヌクレオチドと標的断片との間でのハイブリッド形成が標的化オリゴヌクレオチドの上流及び下流の隣接配列の間に位置する二本鎖配列を形成する標的化オリゴヌクレオチドと、
それぞれ遊離の５’及び３’末端を有し、それぞれ上流及び下流の隣接配列に対して相補性である頭部及び尾部の配列
とを含む、第１の一揃いのプローブ及び第２の一揃いのプローブに試料を接触させることと、
（ｉｖ）頭部及び尾部の配列が隣接配列とハイブリッド形成し、標的断片が存在するならば、プローブの標的相補性配列とハイブリッド形成し、それによって頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端に並置する標的断片の末端を位置付けるアニーリング条件を提供することと、
（ｖ）標的断片が存在するならば、標的断片の３’末端が頭部配列の５’末端にライゲーションされて第１のライゲーション接合部を形成し、標的断片の５’末端が尾部配列の３’末端にライゲーションされて第２のライゲーション接合部を形成して頭部及び尾部の配列と標的断片を含む核酸の連続する鎖を含む二重ライゲーションの産物を生じるようなライゲーションの条件を提供することと、
（ｖｉ）第１の一揃いのプローブによって生成されたライゲーション産物に由来する個々のシグナルの組み合わせである第１の累積シグナルを検出し、それを定量して、第１のシグナルのレベルが試料における第１の核酸の量に比例する、第１のシグナルのレベルを決定することと、
（ｖｉｉ）第２の一揃いのプローブによって生成されたライゲーション産物に由来する個々のシグナルの組み合わせである第２の累積シグナルを検出し、それを定量して、第２のシグナルのレベルが試料における第２の核酸の量に比例する、第２のシグナルのレベルを決定することと、
（ｖｉｉｉ）第１のシグナルのレベルと第２のシグナルのレベルを比較し、それによって試料における第１及び第２の核酸の種属の相対量を決定することと
を含んでもよい。
ギャップにおける標的断片のハイブリッド形成が核酸の環状物を完成させるようにプローブが設計されてもよく、環状物は標的断片と頭部及び尾部の配列を含む。
頭部及び／または尾部の配列は好ましくは、プローブの他の領域または標的断片に対して相補性ではないカスタム配列に連結される。
プローブの一部の実施形態では、単一の核酸分子が頭部及び尾部の配列を含む。
頭部及び尾部の配列はそれらが隣接配列にトランスで結合するように標的化オリゴヌクレオチドから分離されてもよい。たとえば、頭部及び尾部の配列は主鎖オリゴヌクレオチドのそれぞれ５’末端及び３’末端にあってもよい。カスタム配列は主鎖オリゴヌクレオチドの頭部及び尾部の配列の間に含めることができる。そのようなプローブの例は図３に示される。或いは、主鎖オリゴヌクレオチドの頭部及び尾部の配列は、ヌクレオチド配列が介在することなく、隣接していてもよい。そのような場合、標的化オリゴヌクレオチドの隣接配列は主鎖オリゴヌクレオチドの完全長に沿ってハイブリッド形成し、それを環状化してもよい。
頭部配列が標的化オリゴヌクレオチドの５’末端にあり、及び／または尾部配列が標的化オリゴヌクレオチドの３’末端にあるようにプローブが設計されてもよいので、ギャップにおける標的断片のハイブリッド形成は、標的断片と頭部及び尾部の配列と標的相補性配列と隣接配列とを含む核酸の鎖を完成する。頭部及び尾部の配列は標的化オリゴヌクレオチドの末端にあってもよく、隣接配列にシスで結合してもよい。そのようなプローブの例は図４に示される。プローブのこの型では、頭部及び尾部の配列と標的相補性配列はすべて標的断片と共に環状化されるようになる。カスタム配列はオリゴヌクレオチドのループに位置付けすることができる。プローブ核酸は相対的に長いが、事前に組み立てられ、異なるプローブ核酸分子のハイブリッド形成を必要としない１つの分子にオリゴヌクレオチド構造を連結するという利点を有する。
標的化オリゴヌクレオチドとは別の核酸の分子である主鎖オリゴヌクレオチドと共にプローブを設計することもできる。尾部配列が標的化オリゴヌクレオチドの３’末端にあり、頭部配列が主鎖オリゴヌクレオチドの５’末端にあることができる。或いは、頭部配列が標的化オリゴヌクレオチドの５’末端にあり、尾部配列が主鎖オリゴヌクレオチドの３’末端にあることができる。カスタム配列を標的化オリゴヌクレオチドに導入して、たとえば、頭部及び尾部の配列と隣接配列との間でループを提供することができる。このプローブの方法を用いることの利点は、検出配列をループに導入することができ、それが標的相補性配列に関連することであり、それは多重化法、特にハイプレックスな検出スキームによるさらに高い多重化にとって有利であり得る。主鎖オリゴヌクレオチドはさらにカスタム配列を含むことができる。２つのオリゴヌクレオチドにてプローブを提供することによってプローブ核酸分子は単一のオリゴヌクレオチド型よりも短いが、同じ機能を維持する。
プローブの別の設計は２つの主鎖オリゴヌクレオチド上に頭部及び尾部の配列を提供する。従って、プローブは、
標的断片より長く、内部標的相補性配列を含有するので、標的化オリゴヌクレオチドと標的断片との間でのハイブリッド形成が標的化オリゴヌクレオチドの上流及び下流の隣接配列の間に位置する二本鎖配列を形成する標的化オリゴヌクレオチドと、
遊離の５’末端を有する頭部配列を含む主鎖オリゴヌクレオチドと、
遊離の３’末端を有する尾部配列を含む主鎖オリゴヌクレオチド
とを含み、その際、頭部及び尾部の配列はそれぞれ上流及び下流の隣接配列に対して相補性である。
主鎖オリゴヌクレオチドの一方は捕捉部分を運んでもよく、その場合、主鎖オリゴヌクレオチドの他方は検出用に使用され、異種の標識を運んでもよい。一方または双方の主鎖オリゴヌクレオチドはさらにカスタム配列を含んでもよい。代わりにまたはさらに、標的化オリゴヌクレオチドはカスタム配列を含んでもよい。
標的断片の存在下でのアニーリング条件下で、頭部及び尾部の配列は隣接配列とハイブリッド形成して頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端との間でギャップを定義し、その際、標的断片がギャップにて標的相補性配列とハイブリッド形成し、それによって頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端に並置して標的断片の末端を位置付ける。ギャップにおける標的断片のハイブリッド形成は標的断片と頭部及び尾部の配列とを含む核酸の鎖を完成させる。鎖は捕捉部分と標識を運び、本明細書の他のどこかで記載されている捕捉／検出の方法を用いて検出を可能にする。
デジタル核型分析及び非侵襲性の出生前診断
本方法の一部の実施は、標的ＤＮＡの正確な定量が求められる分野にて特定の利点を提供する。これには、多数の核酸に基づく診断法が含まれる。そのような領域の１つは、患者に由来する生体試料（たとえば、血液）における癌ＤＮＡの解析である。別のそのような領域は無細胞ＤＮＡの解析による非侵襲性の出生前診断（ＮＩＰＴ）である。
ＮＩＰＴによる難題は、染色体の異数性を診断するのに必要とされる統計的信頼を達成するために多数の特定のゲノム断片を数えなければならないことである。胎児ＤＮＡは母親ＤＮＡと混合され、妊娠女性の血流における遺伝物質の４～３０％を構成するので、胎児ＤＮＡにおける染色体の異数性を観察することは非常に正確な測定を必要とする。
母親血液の試料における遊離の循環している胎児ＤＮＡを解析するのに本方法が使用されてもよい。１つの染色体の異なる断片に向けられた複数のプローブと第２の染色体の異なる断片に向けられた複数のプローブとを用いることによって、方法は、測定される試料における２つの染色体の相対的な数における不均衡を高い信頼性で可能にする。これによって、母親ＤＮＡの高いバックグランドに対してでさえ胎児ＤＮＡから診断されるトリソミーのような染色体の異数性が認められる。
たとえば、妊娠女性に由来する母親の血液試料を調べてトリソミーのような染色体の異常の診断のために胎児の核酸を検出するのに、患者における腫瘍の存在の診断またはモニタリングのために腫瘍ＤＮＡについて患者の試料を調べるのに、本方法を使用してもよい。他の使用には、微生物の核酸の存在について母親の試料を調べることが挙げられ、その際、微生物の核酸の検出は、たとえば、細菌、ウイルスまたは真菌のような感染性作用因子であり得る微生物による母親の感染を示す。試料は患者に由来する組織または血液の試料であってもよい。
さらに一般的には、数百または数千の異なるプローブを用いることによって本方法の一部の実施は、数百または数千の特定の核酸断片を検出し、多数の診断応用にわたって利点を提供することによって高い精度を達成することができる。特定の疾患に関連する染色体または染色体遺伝子座に由来する多数のＤＮＡ断片を検出することは対照の染色体または遺伝子座と比べてその染色体または遺伝子座の量が測定されるのを可能にするので、試料における軽度の差異でさえ高い信頼性で検出することができる。
短い標的断片を解析することによって、母親血液における大きな比率の高度に断片化された無細胞ＤＮＡを高い効率で解析することができる。このことは、母親血液では非常に少量の無細胞ＤＮＡしか利用できないので重要である。
個体から得られた核酸の試料にて第２の染色体または染色体遺伝子座と比べて第１の染色体または染色体遺伝子座を定量する方法は、
第１の一揃いのプローブのそれぞれが第１の染色体または染色体遺伝子座の中で区別できる標的配列を特異的に認識し、且つ、第２の一揃いのプローブのそれぞれが第２の染色体または染色体遺伝子座の中で区別できる標的配列を特異的に認識する、第１の一揃いのプローブ及び第２の一揃いのプローブに試料を接触させることと、
第１及び第２の染色体または染色体遺伝子座における標的配列が少なくとも部分的に一本鎖である条件を提供することと、
プローブが標的配列とハイブリッド形成し、ライゲーション産物を生成するアニーリング及びライゲーションの条件を提供することと、
第１の一揃いのプローブによって生成されたライゲーション産物に由来する個々のシグナルの組み合わせである第１の累積シグナルを検出し、それを定量して、第１のシグナルのレベルが試料における第１の染色体または染色体遺伝子座の量に比例する、第１のシグナルのレベルを決定することと、
第２の一揃いのプローブによって生成されたライゲーション産物に由来する個々のシグナルの組み合わせである第２の累積シグナルを検出し、それを定量して、第２のシグナルのレベルが試料における第２の染色体または染色体遺伝子座の量に比例する、第２のシグナルのレベルを決定することと、
第１のシグナルのレベルと第２のシグナルのレベルを比較し、それによって試料における第１及び第２の染色体または第１及び第２の染色体遺伝子座の相対量を決定すること
とを含んでもよい。
方法は、胎児における異数性（たとえば、トリソミー）を診断するのに使用されてもよく、その際、核酸の試料は、母親血液から得られた試料であり、母親ＤＮＡと混合された無細胞の胎児ＤＮＡを含有し、第１のシグナルのレベルと第２のシグナルのレベルの同等ではない比は異数性（たとえば、トリソミー）を示す。
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態及び態様を実証し、さらに説明するために提供されるのであって、その範囲を限定するように解釈されるべきではない。
実施例１
この実施例は、本方法を用いた、母親血液における循環する遊離の胎児ＤＮＡの検出及び定量を説明する。
妊娠女性から血液試料を採取し、血漿から循環する遊離のＤＮＡを抽出する。次いで、解析及び定量に供される染色体を起源とするＤＮＡ断片と特異的に反応する標的化された特異的なプローブとそのＤＮＡを反応させる。この実施例では、我々は、第２１染色体及び参照染色体に由来する特定の断片を標的とし、それと反応するいわゆる「ロータスプローブ」の使用を説明する。しかしながら、たとえば、パドロックプローブ／分子反転プローブ（ＭＩＰ）、セレクタプローブ、オリゴヌクレオチドライゲーションプローブのような、特定のＤＮＡ断片を標的とするための他のプローブに基づく技法も代わりに使用されてもよい。
２つの染色体のそれぞれに由来する複数の断片を標的とするロータスプローブが提供される。標的認識の際、プローブは一方の末端が蛍光で標識され、他方がビオチンで標識された相当する断片を持つライゲーション産物を生成する。ライゲーション産物は２つの異なる蛍光色素分子で標識され、それぞれが標的とされる個々の染色体を表す。プロトコールは以下のように説明することができる。
（１）同封の互換性制限酵素緩衝液にて１単位の制限酵素によって１０ｎｇのＤＮＡを消化する。反応物を３７℃で１時間インキュベートし、その後８０℃で２０分間酵素を不活化する。
（２）ＤＮＡ断片を９５℃で１０分間、一本鎖断片に変性させ、プローブ及びリガーゼと混合して線状ライゲーション産物を形成する。プローブのプールを１０ｐＭの個々の濃度で１Ｕのアンプリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）と共に加え、リガーゼ緩衝液にて５５℃で１時間インキュベートする。
（３）ライゲーション産物をストレプトアビジン磁気ビーズに捕捉させる。未反応のプローブ及び断片を取り除くために、溶液を最終容量２００ｍｌのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３．５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０７％のＴｗｅｅｎ－２０における１０ｍｌのＭ－２８０ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、室温で１５分間インキュベートする。インキュベートの後、環状磁石を用いてビーズを回収し、上清を取り除く。
（４）残っているビーズに結合したプローブを検出し、定量する。２つの標識それぞれについて総蛍光強度を測定し、２つの色の間での相対強度を測定する。
（５）出生前診断の場合、最終的な結果は蛍光の相対量に基づく。単純化した例：１０００のゲノム相当物があり、母親血液における循環する遊離のＤＮＡの１０％が胎児由来であり、１０００の第２１染色体を標的とするプローブを使用して総蛍光を生成するのであれば、正常な試料は１，０００，０００の蛍光色素分子のシグナルを生成することになるのに対して２１トリソミーの胎児の試料は相当する１，０５０，０００の蛍光色素分子のシグナルを生成することになる。また、さらに高い統計的精度を達成するには、１０００のプローブが異数性の対象とはされない「標準化」領域を標的としていて、第２の蛍光色素分子で標識されるのであれば、相対量を測定することができる。
実施例２
以下の実施例では、ロータスプローブは２つの染色体のそれぞれに由来する複数の断片を標的とする。標的認識の際、プローブはその相当する断片と共に環状化されたライゲーション産物を生成する。環状化されたライゲーション産物はその後の標識に使用することができる２つの配列モチーフのいずれかを含有し、各配列モチーフは標的とされる２つの染色体のいずれかに相当する。プロトコールは以下のように説明することができる。
（１）同封の互換性制限酵素緩衝液にて１単位の制限酵素によって１０ｎｇのＤＮＡを消化する。反応物を３７℃で１時間インキュベートし、その後８０℃で２０分間酵素を不活化する。
（２）ＤＮＡ断片を９５℃で１０分間、一本鎖断片に変性させ、プローブ及びリガーゼと混合して環状物を形成する。プローブのプールを１０ｐＭの個々の濃度で１Ｕのアンプリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）と共に加え、リガーゼ緩衝液にて５５℃で１時間インキュベートする。
（３）１Ｕのエキソヌクレアーゼを加え、未反応のプローブ及び断片を取り除く。同封のエキソヌクレアーゼ緩衝液にて１Ｕのλ－エキソヌクレアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を３７℃で１時間加え、その後、８０℃で２０分間、酵素を不活化する。
（４）残っている環状物をローリングサークル増幅、ＲＣＡによってコピーする。１Ｕのｐｈｉ２９ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を相当するｐｈｉ２９及びヌクレオチド（ｄＮＴＰ）に３７℃で１時間加える。それぞれ２つの異なる蛍光色素分子で標識された、ＲＣＡ産物に対して相補性のプローブをＲＣＡ混合体に加える。得られる標識されたＲＣＡ産物を個々に数え、２つの色の間でＲＣＡ産物の相対数を測定する。
（５）出生前診断の場合、最終的な結果は蛍光の相対量に基づく。単純化した例：１０００のゲノム相当物があり、母親血液における循環する遊離のＤＮＡの１０％が胎児由来であり、１０００の第２１染色体を標的とするプローブを使用して総蛍光を生成するのであれば、正常な試料は１，０００，０００の蛍光色素分子のシグナルを生成することになるのに対して２１トリソミーの胎児の試料は相当する１，０５０，０００の蛍光色素分子のシグナルを生成することになる。また、さらに高い統計的精度を達成するには、１０００のプローブが異数性の対象とはされない「標準化」領域を標的としていて、第２の蛍光色素分子で標識されるのであれば、相対量を測定することができる。
実施例３
材料及び方法
［試料の調製］各対象から１０ｍｌの血液を無細胞ＤＮＡチューブ（Ｓｔｒｅｃｋ，Ｏｍａｈａ，ＮＥ）に採取した。二重遠心分離プロトコール（１６００ｇで１０分間、その後、１回目の遠心に続いてチューブを移した後、１６０００ｇで１０分間）によって血液から血漿を単離した。製造元のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ ｃｃｆ核酸キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によってｃｆＤＮＡを単離した。得られたＤＮＡを５０μＬの緩衝液（Ｑｉａｇｅｎキットの一部）に溶出した。
［プローブ及び主鎖の設計］本明細書で記載される多重化プローブ法は何千もの染色体断片の特異的な且つ同時の増幅を可能にする。第２１、第１８及び第１３染色体のそれぞれに由来する２５００～５０００の断片（標的）を捕捉するようにプローブを設計した。ゲノムにおける独特の配列、画一化したＡＴ／ＧＣ組成を有し、標的配列に既知の多型またはＣＮＶを含まないように、且つ１８～３５ｂｐの間でのサイズで標的を選択した。各第１３及び第１８染色体に由来する２５００の断片を標的とするプローブを第２１染色体に由来する５０００の断片を標的とするプローブと一緒にプールして単一のオリゴプローブのプールを創り出した。
プローブの例の配列、「Ｎ」は標的相補性配列を表す：
ＡＴＧＴＧＡＣＣＣＴＴＣＣＧＴＣＴＧＴＴＧＡＧＴＴＡＧＧＣＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＧＴＧＣＣＴＴＧＴＣＡＴＴＣＧＧＧＡＧＣＡＣＴＡＡＣＴＧＣＴＧ（配列番号１）
プローブの末端に対して相補性の頭部及び尾部の配列を伴った主鎖を、配列決定及びデジタル計数の双方のための配列モチーフを含むように設計した。結果の節で要点が述べられる実験には２つの主鎖を使用した；第１３及び第１８染色体を標的とするプローブに対して相補性である１つは
（／５Ｐｈｏｓ／ＣＧＣＡＣＡＣＧＡＴＴＡＡＧＧＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＡＡＣＧＧＴＣＧＡＧＴＣＧＧＡＣＡＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＣＴＡＡＡＴＡＧＡＣＧＣＡ）；（配列番号２）であり、第２１染色体を標的とする主鎖の１つは
（／５Ｐｈｏｓ／ＧＧＣＣＴＡＡＣＴＣＡＡＣＡＧＡＣＧＧＡＡＧＧＧＴＣＡＣＡＴＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＡＡＣＧＧＴＣＧＡＧＣＡＧＴＴＡＧＴＧＣＴＣＣＣＧＡＡＴＧＡＣＡＡＧＧＣＡＣＧＡ；（配列番号３）である。
［生化学的なプローブのプロトコール］総容量５５μＬの１×ＮＥＢ４緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及び１×ＢＳＡにおける５ＵのＭｓｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって５０μＬの精製したｃＤＮＡを３７℃で３０分間消化し、その後６５℃で２０分間熱で不活化した。次いで消化されたＤＮＡをプローブ及び主鎖と共にライゲーション混合体と混合した。５５μＬの消化されたＤＮＡを、総容量７０μＬのプローブ（１ｐＭ／プローブ）、主鎖（それぞれ６０ｎＭ）、１×ライゲーション緩衝液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、１００Ｕのアンプリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、１ｍＭのＮＡＤ、及び５ｍＭのＭｇ２＋と混合した。消化された断片を先ず９５℃で５分間、一本鎖に変性させ、その後５５℃で１６時間、ハイブリッド形成及びライゲーションを行った。次いでライゲーション混合体をエキソヌクレアーゼで処理して残っている線状ＤＮＡ分子を取り除いた。ライゲーション反応物を総容量７５μＬの２０ＵのＥｘｏＩ（ＮＥＢ）及び５ＵのＥｘｏＩＩＩ（ＮＥＢ）及び１×ＢＳＡと３７℃で６０分間混合し、その後、６５℃で１０分間、熱で不活化した。
［解析］配列決定の解析については、ｅｘｏ処理した環状物をＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定手段に対して相補性の配列決定プライマーによって増幅し、その後、製造元のプロトコールに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ機器に負荷した。
デジタル解析については、ｅｘｏ処理した反応物をローリングサークル増幅（ＲＣＡ）に供して環状物の鎖状体コピーの別々のＤＮＡ物体を生成した。３７．５μＬのｅｘｏ処理した環状物を、総容量５０μＬの４ｍＭのＤＴＴ、３Ｕのｐｈｉ２９ポリメラーゼ（ＮＥＢ）、０．１μＭのプライマー、１ｍＭのｄＮＴＰ混合体（ＮＥＢ）及び１×ＢＳＡと混合し、３７℃で１時間インキュベートした後、６５℃で１０分間、熱で不活化した。次いで、主鎖配列に対して相補性の蛍光標識されたオリゴヌクレオチドによってＲＣＡ反応物を標識した。５０μＬのＲＣＡ産物を、総容量１００μＬの０．１％のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）、５ｎＭの標識されたオリゴヌクレオチド及び２×ＳＳＣ（Ｓｉｇｍａ）と混合した。標識されたＲＣＡ産物を最終的に、ポリリジン（Ｓｉｇｍａ）を被覆した顕微鏡スライドに載せ、蛍光顕微鏡で数えた。
結果
本明細書で記載されているプローブ法をＩｌｌｕｍｉｎａの配列決定及びデジタル計数システムで実証した。プローブ法の性能を実証するために、２１トリソミーのＤＮＡ試料を、異なる濃度での正常血漿試料（３～５ｍｌの血漿）から抽出したＤＮＡと混合した。次いでプローブ法を介して試料を実行し、配列決定によって評価した。
図８で示される結果については、１００ｎｇの細胞株ＤＮＡを上述のプロトコールに供した。１０，０００のプローブをプールで混合して、第１３、第１８及び第２１染色体に由来する１０，０００の相当する染色体断片を具体的に環状化した。１０，０００の得られた環状物を次いでＩｌｌｕｍｉｎａの相当するＰＣＲプライマーによって増幅し、配列決定に先立ってゲル上で解析した。レーン１はＤＮＡラダーに相当し、レーン２は消化後のＤＮＡ試料に相当し、レーン３は１０，０００の増幅した断片を伴ったＰＣＲ産物に相当する。
図９で示される結果については、１２の正常血漿試料を、様々な濃度での２１トリソミーのＤＮＡを持つ試料と並行して解析した。ＤＮＡを抽出し、１０Ｋプレックスプローブのプロトコールを介して処理し、最終的にはＩｌｌｕｍｉｎａのシーケンサーで配列決定した。９９％の特異性を提供する信頼間隔を用いて、推定された正規分布に基づいて９０％の感度で陽性試料を検出する。
さらなる記述
以下の条項は本発明の態様を表し、説明の一部である。
（１）試料における核酸の種属の検出方法であって、
各プローブが検出される核酸の種属の中で区別できる標的配列を特異的に認識する、一揃いのプローブに核酸を接触させることと、
核酸の種属における標的配列が少なくとも部分的に一本鎖である条件を提供することと、
プローブがその標的配列とハイブリッド形成し、ライゲーション産物を生成し、各ライゲーション産物はライゲーション接合部を含む、アニーリング及びライゲーションの条件を提供することと、
ライゲーション産物すべてに由来する個々のシグナルの組み合わせである累積シグナルを検出することとを含み、
シグナルの検出が試料における核酸の種属の存在を示す、前記検出方法。
（２）試料における核酸の種属の定量方法であって、
各プローブが検出される核酸の種属の中で区別できる標的配列を特異的に認識する、一揃いのプローブに核酸を接触させることと、
核酸の種属における標的配列が少なくとも部分的に一本鎖である条件を提供することと、
プローブがその標的配列とハイブリッド形成し、ライゲーション産物を生成し、各ライゲーション産物はライゲーション接合部を含む、アニーリング及びライゲーションの条件を提供することと、
ライゲーション産物すべてに由来する個々のシグナルの組み合わせである累積シグナルを検出することと、
累積シグナルを定量して、シグナルのレベルが核酸の種属の量に比例する、シグナルのレベルを決定し、
それによって試料における核酸の種属の量を決定することとを含む、前記定量方法。
（３）試料における核酸の第２の種属と比べた核酸の第１の種属の定量方法であって、
第１の一揃いのプローブが核酸の第１の種属の中で区別できる標的配列を特異的に認識し、且つ第２の一揃いのプローブが核酸の第２の種属の中で区別できる標的配列を特異的に認識する、第１の一揃いのプローブ及び第２の一揃いのプローブに核酸を接触させることと、
核酸の第１及び第２の種属における標的配列が少なくとも部分的に一本鎖である条件を提供することと、
プローブがその標的配列とハイブリッド形成し、ライゲーション産物を生成し、各ライゲーション産物はライゲーション接合部を含む、アニーリング及びライゲーションの条件を提供することと、
第１の一揃いのプローブによって生成されるライゲーション産物に由来する個々のシグナルの組み合わせである第１の累積シグナルを検出して、それを定量し、第１のシグナルのレベルが試料における核酸の第１の種属の量に比例する、第１のシグナルのレベルを決定することと、
第２の一揃いのプローブによって生成されるライゲーション産物に由来する個々のシグナルの組み合わせである第２の累積シグナルを検出して、それを定量し、第２のシグナルのレベルが試料における核酸の第２の種属の量に比例する、第２のシグナルのレベルを決定することと、
第１及び第２のシグナルのレベルを比較し、それによって試料における第１及び第２の核酸種属の相対量を決定することとを含む、前記定量方法。
（４）標的配列が重複しない上記条項のいずれかに記載の方法。
（５）一揃いのプローブが、それぞれ区別できる標的配列を特異的に認識する少なくとも１０のプローブを含む上記条項のいずれかに記載の方法。
（６）一揃いのプローブがそれぞれ区別できる標的配列を特異的に認識する少なくとも１００のプローブを含む条項（５）に記載の方法。
（７）一揃いのプローブがそれぞれ区別できる標的配列を特異的に認識する少なくとも１，０００のプローブを含む条項（６）に記載の方法。
（８）一揃いのプローブがそれぞれ区別できる標的配列を特異的に認識する少なくとも１０，０００のプローブを含む条項（７）に記載の方法。
（９）ライゲーション産物を増幅することと、増幅された産物に由来する個々のシグナルの組み合わせである累積シグナルを得ることとを含む上記条項のいずれかに記載の方法。
（１０）増幅がクローン性増幅である条項（９）に記載の方法。
（１１）ライゲーション接合部を横切ってライゲーション産物を増幅することを含む条項（９）または（１０）に記載の方法。
（１２）ライゲーション産物が二重ライゲーションの産物であり、それぞれ第１及び第２のライゲーション接合部を含む上記条項のいずれかに記載の方法。
（１３）方法が第１及び第２のライゲーション接合部を横切ってライゲーション産物を増幅することを含む条項（１２）に記載の方法。
（１４）ライゲーション産物を増幅することなく、ライゲーション産物に由来する個々のシグナルの組み合わせである累積シグナルを得ることを含む条項（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１５）ライゲーション産物が核酸の環状物である条項（１）～（１３）のいずれかに記載の方法。
（１６）核酸の環状物のローリングサークル複製の条件を提供することと、ローリングサークル複製の産物を検出することとを含む条項（１５）に記載の方法。
（１７）ローリングサークル複製が過剰分岐ローリングサークル複製である条項（１６）に記載の方法。
（１８）ライゲーション産物が線状の核酸である条項（１）～（１４）のいずれかに記載の方法。
（１９）ライゲーション産物がライゲーション接合部の一方側に捕捉部分を含み、ライゲーション接合部の他方側に標識を含み、且つ、方法が、捕捉部分を介して基材上にライゲーション産物を捕捉し、基材を洗浄し、基材と捕捉されたライゲーション産物を含む捕捉分画を保持し、捕捉分画におけるライゲーション産物上の標識を検出することによってライゲーション産物に由来するシグナルを得ることを含む条項（１８）に記載の方法。
（２０）シグナルが蛍光である上記条項のいずれかに記載の方法。
（２１）第１の一揃いのプローブ及び第２の一揃いのプローブに試料における核酸を接触させることと、第１及び第２の累積シグナルを検出することとを含み、
第１の累積シグナルが第１の一揃いのプローブによって生成されるライゲーション産物により放射される第１の波長での蛍光であり、第２の累積シグナルが第２の一揃いのプローブによって生成されるライゲーション産物により放射される第２の波長での蛍光である条項（２０）に記載の方法。
（２２）プローブがライゲーションされてライゲーション産物を生成する上記条項のいずれかに記載の方法。
（２３）プローブと標的配列がライゲーションされてライゲーション産物を生成する条項（２２）に記載の方法。
（２４）ライゲーション産物が標的配列を含む核酸の環状物である上記条項のいずれかに記載の方法。
（２５）核酸の種属が断片化される上記条項のいずれかに記載の方法。
（２６）標的配列が核酸の種属の断片の配列である条項（２５）に記載の方法。
（２７）試料が核酸の制限酵素消化物であり、標的配列が制限断片である条項（２５）または（２６）に記載の方法。
（２８）プローブが標的配列の各末端にライゲーションされる条項（２５）～（２７）のいずれかに記載の方法。
（２９）プローブがそれぞれ、標的断片より長く、内部標的相補性配列を含有するので、標的化オリゴヌクレオチドと標的断片との間でのハイブリッド形成が標的化オリゴヌクレオチドの上流及び下流の隣接配列の間に位置する二本鎖配列を形成する標的化オリゴヌクレオチドと、
それぞれ遊離の５’及び３’末端を有し、それぞれ上流及び下流の隣接配列に対して相補性である頭部及び尾部の配列、とを含み、
アニーリング及びライゲーションの条件下で、頭部及び尾部の配列が隣接配列とハイブリッド形成し、標的断片が存在するならば、標的相補性配列とハイブリッド形成し、それによって頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端に並置して標的断片の末端を位置付け、標的断片の３’末端が頭部配列の５’末端にライゲーションされて第１のライゲーション接合部を形成し、標的断片の５’末端が尾部配列の３’末端にライゲーションされて第２のライゲーション接合部を形成して、頭部及び尾部の配列と標的断片を含む核酸の連続する鎖を含む二重ライゲーションの産物を生じる条項（２８）に記載の方法。
（３０）断片化された核酸の試料が制限酵素消化物であり、標的断片が制限断片である条項（２９）に記載の方法。
（３１）二重ライゲーションの産物を検出する工程が、核酸の連続する鎖の第１及び第２のライゲーション接合部を横切る増幅の条件を提供することと、増幅産物が存在するかどうかを検出することとを含む条項（２８）または（２９）に記載の方法。
（３２）頭部及び尾部の配列と標的断片を含む核酸の連続する鎖が核酸の環状物である条項（２９）～（３１）のいずれかに記載の方法。
（３３）二重ライゲーションの産物を検出する工程が、ローリングサークル複製の条件を提供することと、ローリングサークル複製の産物が存在するかどうかを検出することとを含む条項（３２）に記載の方法。
（３４）ローリングサークル複製が過剰分岐ローリングサークル複製である条項（３３）に記載の方法。
（３５）プローブが１つの核酸分子上で頭部及び尾部の配列を含む条項（３２）～（３４）のいずれかに記載の方法。
（３６）プローブが、その５’及び３’末端にそれぞれ頭部及び尾部の配列を有する主鎖オリゴヌクレオチドを含み、主鎖オリゴヌクレオチドの頭部及び尾部の配列はアニーリング条件下で標的化オリゴヌクレオチドの隣接配列にトランスで結合する条項（３５）に記載の方法。
（３７）主鎖オリゴヌクレオチドが頭部及び尾部の配列の間でカスタム配列を含み、カスタム配列がプローブの他の領域または標的断片に対して相補性ではない条項（３６）に記載の方法。
（３８）主鎖オリゴヌクレオチドの頭部及び尾部の配列が隣接する条項（３６）に記載の方法。
（３９）頭部及び尾部の配列が標的化オリゴヌクレオチドの末端にあり、アニーリング条件下で隣接配列にシスで結合する条項（３２）～（３５）のいずれかに記載の方法。
（４０）標的化オリゴヌクレオチドが標的化オリゴヌクレオチドと頭部及び／または尾部の配列との間でカスタム配列を含み、カスタム配列がプローブの他の領域または標的断片に対して相補性ではない条項（３９）に記載の方法。
（４１）尾部配列が標的化オリゴヌクレオチドの３’末端にあり、プローブがその５’末端で頭部配列を有する主鎖オリゴヌクレオチドを含み、
アニーリング条件下で、尾部配列が標的化オリゴヌクレオチドの下流の隣接配列にシスで結合し、主鎖オリゴヌクレオチドの頭部配列が標的化オリゴヌクレオチドの上流の隣接配列にトランスで結合する条項（２９）～（３４）のいずれかに記載の方法。
（４２）主鎖オリゴヌクレオチドが１対の反転反復配列を含み、
アニーリング条件下で、反転反復配列がヘアピン構造を形成し、それによって標的化オリゴヌクレオチドの５’末端に並置して主鎖オリゴヌクレオチドの３’末端を位置付け、
ライゲーション条件下で、標的化オリゴヌクレオチドの５’末端が主鎖オリゴヌクレオチドの３’末端にライゲーションされるので、二重ライゲーションの産物が、標的化オリゴヌクレオチドと標的断片と主鎖オリゴヌクレオチドとを含む核酸の環状物である条項（４１）に記載の方法。
（４３）頭部配列が標的化オリゴヌクレオチドの５’末端にあり、プローブがその３’末端で尾部配列を有する主鎖オリゴヌクレオチドを含み、
アニーリング条件下で、頭部配列が標的化オリゴヌクレオチドの上流の隣接配列にシスで結合し、主鎖オリゴヌクレオチドの尾部配列が標的化オリゴヌクレオチドの下流の隣接配列にトランスで結合する条項（２９）～（３４）のいずれかに記載の方法。
（４４）主鎖オリゴヌクレオチドが１対の反転反復配列を含み、
アニーリング条件下で、反転反復配列がヘアピン構造を形成し、それによって標的化オリゴヌクレオチドの３’末端に並置して主鎖オリゴヌクレオチドの５’末端を位置付け、
ライゲーション条件下で、標的化オリゴヌクレオチドの３’末端が主鎖オリゴヌクレオチドの５’末端にライゲーションされるので、二重ライゲーションの産物が、標的化オリゴヌクレオチドと標的断片と主鎖オリゴヌクレオチドとを含む核酸の環状物である条項（４３）に記載の方法。
（４５）主鎖オリゴヌクレオチドが反転反復配列との間でカスタム配列を含むので、アニーリング条件下で主鎖オリゴヌクレオチドがヘアピンループを形成する条項（４１）～（４４）のいずれかに記載の方法。
（４６）頭部及び尾部の配列と標的断片とを含む核酸の連続する鎖が核酸の線状鎖である条項（２９）～（３３）のいずれかに記載の方法。
（４７）尾部配列が標的化オリゴヌクレオチドの３’末端にあり、プローブがその５’末端で頭部配列を有する主鎖オリゴヌクレオチドを含み、
アニーリング条件下で、尾部配列が標的化オリゴヌクレオチドの下流の隣接配列にシスで結合し、主鎖オリゴヌクレオチドの頭部配列が標的化オリゴヌクレオチドの上流の隣接配列にトランスで結合する条項（４６）に記載の方法。
（４８）標的化オリゴヌクレオチドが下流の隣接配列と尾部配列との間でカスタム配列を含むので、アニーリング条件下で、標的化オリゴヌクレオチドがヘアピンループを形成する条項（４１）、（４２）または（４７）のいずれかに記載の方法。
（４９）頭部配列が標的化オリゴヌクレオチドの５’末端にあり、プローブがその３’末端で尾部配列を有する主鎖オリゴヌクレオチドを含み、
アニーリング条件下で、頭部配列が標的化オリゴヌクレオチドの上流の隣接配列にシスで結合し、主鎖オリゴヌクレオチドの尾部配列が標的化オリゴヌクレオチドの下流の隣接配列にトランスで結合する条項（４６）に記載の方法。
（５０）標的化オリゴヌクレオチドが頭部配列と上流の隣接配列との間でカスタム配列を含むので、アニーリング条件下で、標的化オリゴヌクレオチドがヘアピンループを形成する条項（４３）、（４４）または（４９）のいずれかに記載の方法。
（５１）主鎖オリゴヌクレオチドが捕捉部分を運ぶ条項（４１）～（４５）または（４７）～（５０）のいずれかに記載の方法。
（５２）プローブが、遊離の５’末端を有する頭部配列を含む主鎖オリゴヌクレオチドと遊離の３’末端を尾部配列を含む主鎖オリゴヌクレオチドとを含み、アニーリング条件下で、頭部及び尾部の配列は標的化オリゴヌクレオチドの隣接配列にトランスで結合する条項（４６）に記載の方法。
（５３）一方のまたは双方の主鎖オリゴヌクレオチドがさらにカスタム配列を含み、カスタム配列がプローブの他の領域または標的断片に対して相補性ではない条項（５２）に記載の方法。
（５４）主鎖オリゴヌクレオチドの一方が捕捉部分を運ぶ条項（５２）または（５３）に記載の方法。
（５５）他方の主鎖オリゴヌクレオチドが異種の標識を運ぶ条項（５４）に記載の方法。
（５６）標識が蛍光色素分子である条項（５５）に記載の方法。
（５７）二重ライゲーションの産物が存在するかどうかを検出する工程が、捕捉部分を介して基材上で主鎖オリゴヌクレオチドを捕捉することと、基材を洗浄してライゲーションされなかったプローブを取り除き、基材と捕捉された主鎖オリゴヌクレオチドとを含む捕捉分画を保持することと、捕捉分画にて二重ライゲーションの産物の存在を調べることとを含む条項（５１）または条項（５４）～（５６）のいずれかに記載の方法。
（５８）二重ライゲーションの産物が存在するかどうかを検出する工程が、捕捉部分を介して基材上で主鎖オリゴヌクレオチドを捕捉することと、基材を洗浄してライゲーションされなかったプローブを取り除き、基材と捕捉された主鎖オリゴヌクレオチドとを含む捕捉分画を保持することと、捕捉分画にて標識の存在を調べることとを含む条項（５５）または（５６）に記載の方法。
（５９）捕捉部分がビオチンである条項（５１）または（５４）～（５８）のいずれかに記載の方法。
（６０）標的相補性配列が１０～３０ヌクレオチドの長さを有する条項（２９）～（５９）のいずれかに記載の方法。
（６１）標的相補性配列が標的断片との５塩基対未満のミスマッチを有する（２９）～（６０）のいずれかに記載の方法。
（６２）標的相補性配列が標的断片の正確な相補体である条項（６１）に記載の方法。
（６３）隣接配列がそれぞれ１０～３０ヌクレオチドの長さを有する条項（２９）～（６２）のいずれかに記載の方法。
（６４）上流及び下流の隣接配列が互いに異なる条項（２９）～（６３）のいずれかに記載の方法。
（６５）頭部配列が上流の隣接配列との５塩基対未満のミスマッチを有し、且つ尾部配列が下流の隣接配列との５塩基対未満のミスマッチを有する条項（２９）～（６４）のいずれかに記載の方法。
（６６）頭部配列が上流の隣接配列の正確な相補体であり、且つ尾部配列が下流の隣接配列の正確な相補体である条項（６５）に記載の方法。
（６７）標的化オリゴヌクレオチドが線状である条項（２９）～（６６）のいずれかに記載の方法。
（６８）試料が断片化されたヒト染色体の試料である条項（２９）～（６７）のいずれかに記載の方法。
（６９）核酸の種属が染色体であり、標的配列がその染色体に特異的なヒトゲノムの断片である条項（６８）に記載の方法。
（７０）核酸の種属が染色体遺伝子座であり、標的配列がヒトゲノムのその遺伝子座に特異的である条項（６８）に記載の方法。
（７１）プローブ核酸がＤＮＡである上記条項のいずれかに記載の方法。
（条項７２）方法が、染色体の複数の断片を結合するための一揃いのプローブに断片化された染色体の試料を接触させることを含み、一揃いのプローブのそれぞれがその染色体に特異的な異なる標的断片を結合するためのものである条項（６８）または（６９）に記載の方法。
（７３）プローブが共通のカスタム配列を共有する条項（７２）に記載の方法。
（７４）方法が、２以上の染色体の複数の断片を結合するための２以上の一揃いのプローブに断片化された染色体の試料を接触させることを含み、
第１の染色体に特異的な複数の標的断片を結合するための第１の一揃いのプローブと、
第２の染色体に特異的な複数の標的断片を結合するための第２の一揃いのプローブと、任意で、
１以上のさらなる染色体に特異的な複数の標的断片を結合するための１以上のさらなる一揃いのプローブとを含む上記条項のいずれかに記載の方法。
（７５）一揃いのプローブのそれぞれが、染色体に特異的な複数の標的断片を結合するための少なくとも５００の異なるプローブを含む条項（７４）に記載の方法。
（７６）一揃いの範囲内でのプローブが、その一揃いに共通し、且つ他の一揃いのプローブのカスタム配列とは異なるカスタム配列を共有する条項（７４）または（７５）に記載の方法。
（７７）各一揃いのプローブについての二重ライゲーションの産物におけるカスタム配列に由来する累積シグナルを検出し、定量することによって試料における２以上の染色体の相対量を決定することを含む条項（７６）に記載の方法。
（７８）染色体（単数）または染色体（複数）がヒトのものである条項（７２）～（７７）のいずれかに記載の方法。
（７９）プローブが二本鎖セレクタ構築物を含み、各個々のセレクタが標的断片の末端に対して相補性である１または２の突出末端配列を含み、
アニーリング及びライゲーションの条件下で、セレクタの末端配列が断片の末端配列とハイブリッド形成し、セレクタにライゲーションされる条項（２８）に記載の方法。
（８０）プローブがパドロックプローブであり、それぞれが末端で標的相補性配列を伴った線状オリゴヌクレオチドとその間での非標的相補性配列とを含み、
アニーリング及びライゲーションの条件下で、標的相補性配列がヘッドトゥテールで突き合わされて標的配列の隣接する領域とハイブリッド形成し、ライゲーションされて核酸の環状物を形成する条項（２２）に記載の方法。
（８１）核酸の種属が染色体または染色体遺伝子座である上記条項のいずれかに記載の方法。
（８２）試料が血液または組織の試料である上記条項のいずれかに記載の方法。
（８３）試料が、妊娠女性の血液に由来する胎児ＤＮＡと母親ＤＮＡの混合体を含有する条項（８２）に記載の方法。
（８４）検出されるまたは定量される核酸の種属が腫瘍関連のＤＮＡである条項（８１）または（８２）に記載の方法。
（８５）検出されるまたは定量される核酸の種属が微生物ＤＮＡである条項（８１）または（８２）に記載の方法。
（８６）個体から得られる核酸の試料において第２の染色体または染色体遺伝子座と比べて第１の染色体または染色体遺伝子座を定量する方法であって、
第１の一揃いのプローブがそれぞれ第１の染色体または染色体遺伝子座の中での区別できる標的配列を特異的に認識し、且つ第２の一揃いのプローブがそれぞれ第２の染色体または染色体遺伝子座の中での区別できる標的配列を特異的に認識する、第１の一揃いのプローブ及び第２の一揃いのプローブに試料を接触させることと、
第１及び第２の染色体または染色体遺伝子座における標的配列が少なくとも部分的に一本鎖である条件を提供することと、
その条件下でプローブがその標的配列とハイブリッド形成し、ライゲーション産物を生成するアニーリング及びライゲーションの条件を提供することと、
第１の一揃いのプローブによって生成されるライゲーション産物に由来する個々のシグナルの組み合わせである第１の累積シグナルを検出し、それを定量して、第１のシグナルのレベルが試料における第１の染色体または染色体遺伝子座の量に比例する、第１のシグナルのレベルを決定することと、
第２の一揃いのプローブによって生成されるライゲーション産物に由来する個々のシグナルの組み合わせである第２の累積シグナルを検出し、それを定量して、第２のシグナルのレベルが試料における第２の染色体または染色体遺伝子座の量に比例する、第２のシグナルのレベルを決定することと、
第１及び第２のシグナルのレベルを比較し、それによって試料における第１及び第２の染色体または第１及び第２の染色体遺伝子座の相対量を決定することとを含む、前記方法。
（８７）胎児におけるトリソミーを診断するためのものであり、核酸の試料が母親の血液から得られる胎児の無細胞ＤＮＡの試料であり、第１及び第２のシグナルのレベルの同等ではない比がトリソミーを示す条項（８３）または（８６）に記載の方法。
（８８）一本鎖標的核酸断片を結合するための核酸プローブであって、
プローブが、
標的断片より長く、内部標的相補性配列を含有するので、標的化オリゴヌクレオチドと標的断片との間でのハイブリッド形成が標的化オリゴヌクレオチドの上流及び下流の隣接配列の間に位置する二本鎖配列を形成する標的化オリゴヌクレオチドと、それぞれ遊離の５’及び３’末端を有し、頭部及び尾部の配列がそれぞれ上流及び下流の隣接配列に対して相補性である頭部及び尾部の配列とを含むので、
標的断片の存在下でのアニーリング条件下では、頭部及び尾部の配列は隣接配列とハイブリッド形成して頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端との間でギャップを定義し、標的断片がギャップにて標的相補性配列とハイブリッド形成し、それによって頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端とに並置して標的断片の末端を位置付け、
ギャップにおける標的断片のハイブリッド形成が核酸の環状物を完成させ、環状物が標的断片と頭部及び尾部の配列とを含む、前記核酸プローブ。
（８９）頭部及び／または尾部の配列がカスタム配列に連結され、カスタム配列がプローブの他の領域または標的断片に対して相補性ではない条項（８８）に記載の核酸プローブ。
（９０）単一の核酸分子が頭部及び尾部の配列を含む条項（８８）または（８９）に記載の核酸プローブ。
（９１）頭部及び尾部の配列が標的化オリゴヌクレオチドから分離され、隣接配列にトランスで結合する条項（８８）または（８９）に記載のプローブ。
（９２）頭部及び尾部の配列がそれぞれ主鎖オリゴヌクレオチドの５’及び３’末端にある条項（９１）に記載のプローブ。
（９３）主鎖オリゴヌクレオチドが頭部及び尾部の配列の間でカスタム配列を含み、カスタム配列がプローブの他の領域または標的断片に対して相補性ではない条項（９２）に記載のプローブ。
（９４）主鎖オリゴヌクレオチドの頭部及び尾部の配列が隣接する条項（９２）に記載のプローブ。
（９５）一本鎖標的核酸断片を結合するための核酸プローブであって、
プローブが、
標的断片より長く、内部標的相補性配列を含有するので、標的化オリゴヌクレオチドと標的断片との間でのハイブリッド形成が標的化オリゴヌクレオチドの上流及び下流の隣接配列の間に位置する二本鎖配列を形成する標的化オリゴヌクレオチドと、それぞれ遊離の５’及び３’末端を有し、頭部及び尾部の配列がそれぞれ上流及び下流の隣接配列に対して相補性である頭部及び尾部の配列とを含むので、
標的断片の存在下でのアニーリング条件下では、頭部及び尾部の配列は隣接配列とハイブリッド形成して頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端との間でギャップを定義し、標的断片がギャップにて標的相補性配列とハイブリッド形成し、それによって頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端とに並置して標的断片の末端を位置付け、
頭部配列が標的化オリゴヌクレオチドの５’末端にあり、及び／または尾部配列が標的化オリゴヌクレオチドの３’末端にあるので、ギャップにおける標的断片のハイブリッド形成が、標的断片と頭部及び尾部の配列と標的相補性配列と隣接配列とを含む核酸の鎖を完成させる、前記核酸プローブ。
（９６）頭部及び尾部の配列が標的化オリゴヌクレオチドの末端にあり、隣接配列にシスで結合する条項（８８）または（９５）に記載のプローブ。
（９７）尾部配列が標的化オリゴヌクレオチドの３’末端にあり、且つ頭部配列が標的化オリゴヌクレオチドとは離れた主鎖オリゴヌクレオチドの５’末端にある条項（８８）または（９５）に記載のプローブ。
（９８）頭部配列が標的化オリゴヌクレオチドの５’末端にあり、尾部配列が標的化オリゴヌクレオチドとは離れた主鎖オリゴヌクレオチドの３’末端にある条項（８８）または（９５）に記載のプローブ。
（９９）主鎖オリゴヌクレオチドがさらにカスタム配列を含み、カスタム配列がプローブの他の領域または標的断片に対して相補性ではない条項（９７）または（９８）に記載のプローブ。
（１００）一本鎖標的核酸断片を結合するための核酸プローブであって、
プローブが、
標的断片より長く、内部標的相補性配列を含有するので、標的化オリゴヌクレオチドと標的断片との間でのハイブリッド形成が標的化オリゴヌクレオチドの上流及び下流の隣接配列の間に位置する二本鎖配列を形成する標的化オリゴヌクレオチドと、
遊離の５’末端を有する頭部配列を含む主鎖オリゴヌクレオチドと、
遊離の３’末端を有する尾部配列を含む主鎖オリゴヌクレオチドとを含み、
頭部及び尾部のオリゴヌクレオチド配列がそれぞれ上流及び下流の隣接配列に対して相補性であり、
一方の主鎖オリゴヌクレオチドが捕捉部分を運び、且つ他方の主鎖オリゴヌクレオチドが異種の標識を運ぶので
標的断片の存在下でのアニーリング条件下では、頭部及び尾部の配列は隣接配列とハイブリッド形成して頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端の間でギャップを定義し、
標的断片がギャップにて標的相補性配列とハイブリッド形成し、それによって頭部配列の５’末端と尾部配列の３’末端とに並置して標的断片の末端を位置付け、
ギャップにおける標的断片のハイブリッド形成が、標的断片と頭部及び尾部の配列とを含む核酸の鎖を完成させ、鎖が捕捉部分と標識を運ぶ、前記核酸プローブ。
（１０１）捕捉部分がビオチンである条項（１００）に記載のプローブ。
（１０２）標識が蛍光色素分子である条項（１００）または（１０１）に記載のプローブ。
（１０３）一方または双方の主鎖オリゴヌクレオチドがさらにカスタム配列を含み、カスタム配列がプローブの他の領域または標的断片に対して相補性ではない条項（１００）～（１０２）のいずれかに記載のプローブ。
（１０４）標的化オリゴヌクレオチドがさらに、プローブの他の領域または標的断片に対して相補性ではないカスタム配列を含む条項（８８）～（１０３）のいずれかに記載のプローブ。
（１０５）標的相補性配列が１０～３０ヌクレオチドの長さを有する条項（８８）～（１０４）のいずれかに記載のプローブ。
（１０６）標的相補性配列が標的断片との５塩基対未満のミスマッチを有する条項（８８）～（１０５）のいずれかに記載のプローブ。
（１０７）標的相補性配列が標的断片の正確な相補体である条項（１０６）に記載のプローブ。
（１０８）隣接配列がそれぞれ１０～３０のヌクレオチドの長さを有する条項（８８）～（１０７）のいずれかに記載のプローブ。
（１０９）標的化オリゴヌクレオチドの上流及び下流の隣接配列が互いに異なっている条項（８８）～（１０８）のいずれかに記載のプローブ。
（１１０）頭部配列が上流の隣接配列との５塩基対未満のミスマッチを有し、尾部配列が下流の隣接配列との５塩基対未満のミスマッチを有する条項（８８）～（１０９）のいずれかに記載のプローブ。
（１１１）頭部及び尾部の配列が隣接配列の正確な相補体である条項（１１０）に記載のプローブ。
（１１２）標的化オリゴヌクレオチドが線状である条項（８８）～（１１１）のいずれかに記載のプローブ。
（１１３）標的断片が制限エンドヌクレアーゼ断片である条項（８８）～（１１２）のいずれかに記載のプローブ。
（１１４）標的断片がヒトのゲノム断片である条項（８８）～（１１３）のいずれかに記載のプローブ。
（１１５）標的断片が１つの染色体に特異的なヒトのゲノム断片である条項（１１４）に記載のプローブ。
（１１６）標的断片がヒトゲノムの１つの遺伝子座に特異的である条項（１１５）に記載のプローブ。
（１１７）プローブ核酸がＤＮＡである条項（８８）～（１１６）のいずれかに記載のプローブ。
（１１８）一本鎖標的核酸断片を結合するための一揃いのプローブであって、条項（８８）～（１１７）のいずれかに記載の複数のプローブを含み、プローブは複数の異なる標的断片を結合するための複数の異なる標的相補性配列を有する、前記一揃いのプローブ。
（１１９）ヒト染色体の複数の断片を結合するためのものであり、一揃いのプローブのそれぞれがその染色体に特異的な異なる標的断片を結合するためのものである条項（１１８）に記載の一揃いのプローブ。
（１２０）プローブが共通するカスタム配列を共有する条項（１１９）に記載の一揃いのプローブ。
（１２１）２以上のヒト染色体の異なる断片を結合するための一揃いのプローブであって、第１の染色体に特異的な複数の標的断片を結合するための第１の一揃いのプローブと、
第２の染色体に特異的な複数の標的断片を結合するための第２の一揃いのプローブと、任意で、
１以上のさらなる染色体に特異的な複数の標的断片を結合するための１以上のさらなる一揃いのプローブとを含む、前記一揃いのプローブ。
（１２２）一揃いの範囲内でのプローブが、その一揃いに共通し、且つ他の一揃いのプローブのカスタム配列とは異なるカスタム配列を共有する条項（１２１）に記載の一揃いのプローブ。
（１２３）１以上の容器にて溶液中で条項（１１８）～（１２２）のいずれかに記載の一揃いの（単数）または一揃いの（複数）プローブを含むキット。
（１２４）核酸の種属の存在について試料を調べるための条項（８８）～（１１７）のいずれかに記載のプローブ、条項（１１８）～（１２２）のいずれかに記載の一揃いの（単数）または一揃いの（複数）プローブ、または条項（１２３）に記載のキットの使用。
（１２５）核酸の種属から得られる標的断片の存在について試料を調べるための一揃いのプローブの使用であって、
一揃いのプローブのそれぞれが、標的断片の正確な相補体である配列と、標的化オリゴヌクレオチド上で標的断片に隣接してハイブリッド形成する頭部及び尾部のオリゴヌクレオチド配列とを含有する標的化オリゴヌクレオチドを含み、
標的断片とプローブとの間でのハイブリッド形成は頭部及び尾部の配列へのライゲーションのために標的断片を鋳型にする、前記使用。
実施形態は、
（ａ）第１の一揃いのプローブのプローブが
（ｉ）第１の染色体の異なる部位とハイブリッド形成し、
（ｉｉ）第１の染色体に由来するＤＮＡ断片とハイブリッド形成すると、ライゲーション可能に隣接する接合部を含有する非共有結合の環状産物を形成する、第１の一揃いのプローブを含むプローブ混合体と断片化したＤＮＡを含む試料をハイブリッド形成させることと、
（ｂ）ライゲーション可能に隣接する接合部が一緒にライゲーションされて複数の共有結合の環状ライゲーション産物を生じることと、
（ｃ）ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって共有結合の環状ライゲーション産物を増幅して複数のＲＣＡ産物分子を生じることと、
（ｄ）ＲＣＡ産物分子を標識することと、
（ｅ）工程（ｄ）にて生じた標識されたＲＣＡ産物分子の数を定量し、それによって試料における第１の染色体に相当するＤＮＡの量の推定値を提供することとを含む、試料の解析の方法を提供する。
任意の実施形態では、第１の染色体は、第２１、第１３、または第１８染色体である。
任意の実施形態では、プローブ混合体は第２の一揃いのプローブを含んでもよく、その際、第２の一揃いのプローブのプローブは第２の染色体における異なる部位とハイブリッド形成し、第２の染色体に由来するＤＮＡ断片とハイブリッド形成する際、ライゲーション可能に隣接する接合部を含有する非共有結合の環状産物を形成し、工程（ｅ）は、第１及び第２の染色体に相当するローリングサークル増幅産物分子の数を別々に定量し、それによって試料における第１及び第２の染色体に相当するＤＮＡの相対量の推定値を提供することを含む。
一部の実施形態では、第１の一揃いのプローブは第１の染色体の第１の領域における異なる部位とハイブリッド形成する。これらの実施形態では、プローブ混合体は第２の一揃いのプローブを含んでもよく、第２の一揃いのプローブのプローブは、第１の染色体の第２の領域における異なる部位とハイブリッド形成し、第２の染色体に由来するＤＮＡ断片とハイブリッド形成する際、ライゲーション可能に隣接する接合部を含有する非共有結合の環状産物を形成し、工程（ｅ）は、第１の染色体の第１及び第２の領域に相当するローリングサークル増幅産物分子の数を別々に定量し、それによって試料における第１の染色体の第１及び第２の領域に相当するＤＮＡの相対量の推定値を提供することを含む。
任意の実施形態では、第１の染色体は第２１染色体であり、第２の染色体は第１３染色体及び第１８染色体から選択される。
任意の実施形態では、非共有結合の環状産物のそれぞれは試料に由来するＤＮＡの断片を含む。これらの実施形態では、工程（ａ）のプローブは、
（ｉ）第１のオリゴヌクレオチド分子の末端にある頭部及び尾部の配列と、
（ｉｉ）順に
頭部配列に対して相補性である上流の隣接配列と
標的断片に対して相補性である標的相補性配列と
尾部配列に対して相補性である下流の隣接配列、とを含むスプリント配列
とを含んでもよく、
非共有結合の環状産物では、標的断片の末端は第１のオリゴヌクレオチド分子における頭部及び尾部の配列の末端にライゲーション可能に隣接する。
これらの実施形態では、スプリント配列は第１のオリゴヌクレオチド分子にあってもよい。或いは、スプリント配列は第２のオリゴヌクレオチド分子にあってもよい。
任意の実施形態では、試料は制限酵素で消化されてもよい。
任意の実施形態では、試料はゲノムＤＮＡ、たとえば、血液から単離される無細胞ＤＮＡを含む。
任意の実施形態では、試料は妊娠したヒトの血流から単離される無細胞ＤＮＡを含んでもよい。
任意の実施形態では、染色体は組織生検から単離されてもよい。
任意の実施形態では、染色体は微生物の染色体であってもよい。
任意の実施形態では、定量する工程は、工程（ｃ）で作出された個々のローリングサークル増幅産物分子を互いから分離し、定義された面積または容積にて個々のローリングサークル増幅産物分子の数を数えることによって実施されてもよい。
これらの実施形態では、定量する工程は、
（ｉ）標識されたオリゴヌクレオチドがＲＣＡ産物にて反復する配列とハイブリッド形成し、それによって、それぞれ単一のＲＣＡ産物と、ＲＣＡ産物とハイブリッド形成する複数の標識されたオリゴヌクレオチドとを含む複数の複合体を生じる、標識されたオリゴヌクレオチドをＲＣＡ産物分子とハイブリッド形成させることと、
（ｉｉ）標識された複合体の数を数えることによって実施されてもよい。
これらの実施形態では、定量する工程は、
（ａ）基材の表面上にばらまかれた標識された複合体を含む基材を得ることと
（ｂ）基材の第１の領域に存在するＲＣＡ産物の数を数えることによって実施されてもよい。
これらの実施形態では、方法は、
（ａ）複合体のそれぞれが単一のＲＣＡ産物と、ＲＣＡ産物とハイブリッド形成する複数の標識されたオリゴヌクレオチドとを含み、第１及び第２の複数の複合体が区別可能に標識され、第１及び第２の複数の複合体が異なる染色体に相当する、基材の表面上にばらまかれた標識された第１及び第２の複数の複合体を含む基材を得ることと、
（ｂ）基材の第１の領域に存在する、第１の複数のＲＣＡ産物の数を数えることと、独立して第２の複数のＲＣＡ産物の数を数えることとを含む。この実施形態では、オリゴヌクレオチドは蛍光で標識される。
これらの実施形態では、第１の一揃いのプローブは少なくとも５０のプローブを含んでもよい。

Claims (14)

  1. ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）産物の定量方法であって、
    （ａ）基材の表面上にばらまかれた標識されたＲＣＡ産物を含む基材を得ることであって、当該ＲＣＡ産物が基材上にばらまかれる前に標識され、標識されたＲＣＡ産物の各々が、ＲＣＡ産物における反復する配列とハイブリッド形成する標識されたオリゴヌクレオチドを複数含むものである、得ることと、
    （ｂ）基材のある領域に存在する標識されたＲＣＡ産物の数を数えることと
    を含む、方法。
  2. 前記標識されたＲＣＡ産物を含む基材が、一揃いの区別可能に標識されたＲＣＡ産物を多数含み、当該多数の一揃いの区別可能に標識されたＲＣＡ産物が、基材上にばらまかれる前に区別可能に標識される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記多数の一揃いの区別可能に標識されたＲＣＡ産物が、第１の染色体に相当する第１の一揃いのＲＣＡ産物および第２の染色体に相当する第２の一揃いのＲＣＡ産物を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記第１の染色体および第２の染色体が、染色体２１、１８および１３から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記多数の一揃いの区別可能に標識されたＲＣＡ産物が、ヒト染色体１８に相当する一揃いのＲＣＡ産物およびヒト染色体２１に相当する一揃いのＲＣＡ産物を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記基材の表面上にばらまかれた標識されたＲＣＡ産物を含む基材を得ることが、さらに、基材の表面上にばらまかれた第１および第２の複数の標識されたＲＣＡ産物を含む基材を得ることであって、
    （ｉ）当該第１および第２の複数の複合体が区別可能に標識され、
    （ｉｉ）当該第１および第２の複数の複合体が異なる染色体に相当するものである、得ることを含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記第１および第２の複数の標識されたＲＣＡ産物が蛍光標識されている、請求項３に記載の方法。
  8. 前記標識されたＲＣＡ産物の少なくともいくつかが、ヒトゲノムＤＮＡの断片の配列を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記断片が、１０～３０ヌクレオチド長の範囲である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ＲＣＡ産物が、妊娠女性の血液由来のｃｆＤＮＡの断片を含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記基材が、少なくとも１０００の標識されたＲＣＡ産物を含む、請求項１に記載の方法。
  12. 前記ＲＣＡ産物が、ヒトゲノムＤＮＡとカスタム配列とから構成される、請求項１に記載の方法。
  13. 前記基材が、平面支持体である、請求項１に記載の方法。
  14. 前記数えることが、顕微鏡により実施される、請求項１に記載の方法。
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