CN116625999B - 一种评估零模波导孔有效载样的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种评估零模波导孔有效载样的方法，包括：制备酶‑引物‑模板三元复合物；将三元复合物和芯片绑定；对芯片进行荧光淬灭，找到具有单个荧光的孔；对芯片进行荧光累积，找到荧光能够持续累积的孔；确定荧光淬灭阶段具有单个荧光，且荧光累积阶段荧光能够持续累积的孔为有效载样孔。本发明还公开了上述方法的应用。本发明构建了一种评估零模波导孔有效载样的方法，使用一种简单的酶‑引物‑模板三元复合物作为研究模型，利用荧光淬灭和荧光累积的过程进行双重判定，有利于更精准地筛选出单分子实时测序的有效载样孔。同时，还能够用于整个测序体系的优化，通过调整来优化有效载样率。

Description

一种评估零模波导孔有效载样的方法及其应用
技术领域
本发明属于基因测序技术领域，具体涉及一种评估零模波导孔有效载样的方法及其应用。
背景技术
科学家们对于遗传物质的早期探索是艰难而又缓慢的，从发现遗传物质的存在，到确认DNA是遗传物质并提出DNA双螺旋模型，经历了近一个世纪的探索。19世纪60年代，孟德尔提出分离定律和自由组合定律；直到1953年，沃森和克里克提出了DNA双螺旋模型，人们才对DNA的形态才有了初步的认知。而在这之后，对于DNA的研究进入了飞速发展的阶段。1987年启动的人类基因组计划，完成了30亿个碱基对的测序，总共花了6个国家13年的时间。而2023年的今天，一个完整的基因组测序，从采样到测序到分析，只需要花费一周的时间。这一切，都得益于基因测序技术的诞生和迭代。
自从20世纪70年代一代测序技术问世以来，基因测序技术在几十年间不断发展，已经形成了各具特色的几代测序方法。其中一代测序有两种代表性的方法，分别是链终止法，也常被称为Sanger测序法，以及化学裂解法。一代测序的准确率可达99.999％，一次可以读取600-1000bp左右的碱基，直到现在，仍然是行业内的金标准，但一代测序的通量低，成本高。这也促进了二代测序的诞生，二代测序以大规模高通量平行测序为主要特征，准确率能够超过99.9％，高通量使得DNA的测序成本大幅下降，研究显示，2007年至2012年，DNA测序单个碱基的原始成本下降了四个数量级。罗氏、Illimina、赛默飞等二代测序公司展开了激烈的竞争，成本的下降及商业上的推广使得二代测序成为当前市场上的主流使用方法。但同时由于二代测序读长短，且需要进行模板扩增，所以在过程中会引入复制错误、酶的偏好性、GC bias、算法的偏好性等系统性偏差，使得二代测序对于一些结构变异、重复性序列等信息的检测准确性不够。而三代测序则能够很好地处理这些问题。三代测序以单分子测序为主要特征，读长可达100kb，逐渐成为当前研究的热点以及未来测序发展的主要趋势。三代测序主要分为纳米孔测序技术和单分子实时测序技术(SMRT)；单分子实时测序技术(SMRT)是三代测序中应用比较广泛且已经大规模商业化的核心技术。
SMRT测序技术的核心在于使用磷酸位标记的dNTP搭配直径在50-200nm的零模波导孔(ZMW)形成分散在各个孔内的单分子荧光，利用单分子荧光实时显示DNA聚合的反应过程，再使用单分子荧光成像系统进行观察、捕获和分析。在这个过程中有效载样是实现单分子实时测序的必要条件，有效载样率及ZMW数量决定了测序通量。为了保证测序过程的顺利进行，进孔的样本需要同时满足以下几个条件：
(1)孔内含有酶-引物-模板三元复合物，而不仅仅是单个酶分子、单个引物分子、单个引物-模板二元复合物分子；
(2)单个酶-引物-模板三元复合物进孔且固定在孔底，而不是空的孔、双复合物分子孔或多复合物分子孔；
(3)整体过程中保证酶活性，确保后续滚环复制顺利进行。
为了提高ZMW的单分子载样，现有的一些技术包括：直接提高ZMW数量、借助磁场或电场的辅助、改变DNA结构等。例如最新的Revio系统中，ZMW数量达到了2500万，单独提高ZMW的数量只能提高载样孔的数目而不能改善载样的比例；利用磁珠辅助酶-引物-模板三元复合物分子载样，相比自由扩散的方法载样效率高，但只适合片段较短的文库；利用电场辅助载样，是通过对芯片进行改造，在每个ZMW中形成电场，有助于带有负电荷的三元复合物进孔，但芯片改造进一步拉高了成本而且纳米级别的制造工艺困难。另外还有一些通过改变DNA构型来辅助载样的方法，例如通过DNA折纸技术将单链线性DNA的形状变成方形或圆形，使其更容易进入ZMW中；利用亚精胺等DNA凝聚剂改变DNA构型辅助进孔等。为了确认以上方法是否能够增加单分子实时测序中的有效载样，需要进行评估，但是现有的评估方法无法满足单分子实时测序中评估有效载样的需求：首选在现有的评估ZMW载样的方法中，使用的模型都是单纯的单链或者双链DNA，在评估过程中，仅以DNA分子作为观测对象，通过荧光淬灭的阶梯数来判断ZMW孔内的DNA分子个数，即只考察了孔内分子的数目。而单分子实时测序环境下，除了三元复合物的数目，还需要考察三元复合物的反应活性，以便验证后续滚环复制能否顺利进行；其次，现有评估方法的溶液体系过于单一，与单分子实时测序的溶液体系有较大偏差。在ZMW孔常见的使用案例中，使用的溶液体系往往只含有一种物质，目标分子的干扰因素较少。而单分子实时测序环境下，溶液体系内除了三元复合物分子，还存在多种其他分子，如单个单种分子、二元复合物分子等，干扰因素较多，如果评估时使用的溶液体系及模型过于简单，则会带来较大的偏差；此外，在单分子实时测序过程中，缺少针对载样这一中间步骤有效的评估方法。实际测序中，对于有效载样的评估往往需要通过后验证的方法，即在采样、提取DNA及质检、构建文库及质检、上机测序、下机数据处理与分析的测序流程之后，才能对本次有效载样的情况进行统计、评估与分析，整体需要消耗来之不易的样本、需要较高的实验条件和水准、需要花费将近一周的时间，对于载样这样一个测序的中间步骤来说，研究的时间和金钱成本都很高。
综上所述，现有的评估方法往往由于溶液体系和模型的限制，仅关注和评估ZMW孔内的分子个数，而无法评估孔内的反应活性；而且溶液体系及模型与实际测序情况存在较大偏差，无法满足单分子实时测序中评估有效载样的需求。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于现有技术中关于单分子实时测序的载样这一步骤，没有特定且简易的方法对有效载样进行较为准确的评估及判定这一缺陷，从而提供一种评估零模波导孔有效载样的方法及其应用。
为此，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种评估零模波导孔有效载样的方法，包括如下步骤：
S1：制备酶-引物-模板三元复合物；
S2：将三元复合物和芯片绑定；
S3:对芯片进行荧光淬灭，并对荧光淬灭过程进行拍摄，找到具有单个荧光的孔；
S4：添加启动试剂，启动聚合反应，对芯片进行荧光累积，并对荧光累积结果进行拍摄，找到荧光能够持续累积的孔；
S5：确定荧光淬灭阶段具有单个荧光，且荧光累积阶段荧光能够持续累积的孔为有效载样孔。
进一步地，步骤S1中的酶-引物-模板三元复合物中所述模板为单链环形模板，具体制备方法包括：
合成长度50～140nt的单链DNA模板，序列中A、T、C、G四种碱基中的一种碱基的数量只有一个(即该单个碱基在单链环形模板中的出现频率是每隔30-140碱基出现一次)，其余碱基的数量大于一；
使用环化酶或T4 DNA连接酶对所述单链DNA模板进行环化，并使用柱纯化法或磁珠纯化法或胶回收纯化法等方法对环化产物进行纯化，得到所述单链环形模板；具体为使用5U～20U/μL的环化酶，在1x环化酶buffer、2.5～10mM氯化锰、0.05～0.2mM ATP、1M甜菜碱的体系中，对5～20uM的模板进行环化，环化时PCR程序为60℃1～16h，80℃10min；使用60～100U的Exonuclease I和600～1000U的ExonucleaseⅢ对未成环的线性DNA进行消化处理，程序为37℃30～45min；80℃15min。随后使用Gel DNA Extraction MiniKit(诺唯赞)对环化产物进行纯化。环化时使用的酶包括但不限于T4DNA连接酶、环化酶等。纯化方法包括但不限于柱纯化法、磁珠纯化法、胶回收纯化法等。
步骤S1中，酶-引物-模板三元复合物的制备方法为将单链环形模板与带有荧光和固定基团的引物进行退火处理，形成引物-环形模板复合物；具体为使引物：模板的摩尔比为1：2～20，退火时PCR程序为80℃2min，30min内缓慢降温至4℃。然后添加phi29聚合酶使其终浓度为20～300nM，在1X phi29酶buffer中4℃孵育10min至2h得到所述酶-引物-模板三元复合物。
优选地，所述引物上的固定基团包括但不限于生物素、链霉亲和素、氨基中的至少一种；
荧光包括但不限于香豆素系列的染料、荧光素系列染料如FAM或FITC、AlexaFluor系列染料如AF405、AF488、AF555、AF568、AF633或AF647等、Cy系列染料如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7或Cy7.5等、罗丹明系列染料如罗丹明绿Rhod G、罗丹明红Rhod Red、罗丹明6G、四甲基罗丹明TAMRA、X-罗丹明ROX、德州红Texas Red或硅基罗丹明SiR等、以及其他诸如CF系列、DY系列、HiLyte Fluor系列、HiLyte Plus系列、iFluor系列、PromoFluor系列染料等。
进一步地，步骤S2中，将芯片经高分子化合物钝化处理后，在孔内玻璃表面修饰氨基、链霉亲和素或生物素中的一种，将步骤S1得到的三元复合物添加在芯片中孵育固定；具体为先使用饱和的链霉亲和素对芯片进行处理，室温孵育10min至2h，再使用1X phi29酶buffer清洗10次。之后再将孵育后的三元复合物添加在经链霉亲和素处理后的芯片中，4℃孵育10min至2h。
所述芯片为是孔径80～200nm，孔间距5～15μm的零模波导芯片，每个芯片上零模波导孔数量为2000～150000个。
步骤S3为，将芯片用1×reaction buffer(50mM ACES(pH7.0)、75mM醋酸钾、5mMDTT)清洗10次，保留40uL 1×reaction buffer在芯片中，用50uL的油密封。然后在引物所带荧光对应的光源下拍摄，光源不限于紫外灯、汞灯、LED、激光等；在高倍物镜20～100×下进行校准和观察，以1～100帧/s的帧率进行连续拍摄，拍摄装置和仪器不限于自组装仪器、激光共聚焦显微镜、TIRF等仪器，记录每个孔的荧光值随时间变化的曲线，每个孔的荧光值的计算方法包括且不限于每个孔的多个像素点的平均荧光强度、每个孔内的多个像素点的荧光强度标准差、每个孔内最亮的像素点周围的9-25个像素点取平均荧光强度或标准差等。根据荧光值随时间淬灭所经历的步骤数对孔内荧光的个数进行统计，无明显步骤视为无荧光，有单个步骤视为含有单个荧光，有多个步骤视为多个荧光。进而挑选出只有一个荧光的孔。密封所使用的油包括但不限于石蜡油、硅油等
步骤S4为，向芯片中添加启动试剂启动滚环复制，黑暗中反应5min-10h后，用水或1×phi29酶buffer清洗10遍，对照组的启动试剂中缺少三种无荧光修饰的dNTP，其余操作与实验组相同。然后在启动试剂荧光对应的光源下拍摄，光源不限于紫外灯、汞灯、LED、激光等；在高倍物镜20～100X下进行校准和观察，以1～100帧/s的帧率进行连续拍摄，拍摄装置和仪器不限于自组装仪器、激光共聚焦显微镜、TIRF等仪器，记录每个孔的荧光值随时间的变化曲线，每个孔的荧光值的计算方法包括且不限于每个孔的多个像素点的平均荧光强度、每个孔内的多个像素点的荧光强度标准差、每个孔内最亮的像素点周围的9-25个像素点取平均荧光强度或标准差等。找到拉开激光挡板后能够看到所有孔的第一帧，定为关键帧。以无滚环复制的对照组的关键帧为参考，设置区分是否发生累积的阈值，阈值的选择包括且不限于平均荧光强度、标准差、最大荧光强度、平均值+2倍标准差、平均值+3倍标准差、2倍平均值、关键帧上每个孔所占面积、每个孔的荧光变化曲线及淬灭步骤等，找出实验组相应参数明显区别于对照组的孔，视为荧光能够累积的孔。
所述启动试剂中的四种dNTP中，有一种dNTP带有荧光，其余三种dNTP不带有荧光；
带有荧光的dNTP与模板中只含有一个的碱基互补配对；
荧光的选择不限于香豆素系列的染料、荧光素系列染料如FAM或FITC、AlexaFluor系列染料如AF405、AF488、AF555、AF568、AF633或AF647等、Cy系列染料如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7或Cy7.5等、罗丹明系列染料如罗丹明绿Rhod G、罗丹明红Rhod Red、罗丹明6G、四甲基罗丹明TAMRA、X-罗丹明ROX、德州红Texas Red或硅基罗丹明SiR等、以及其他诸如CF系列、DY系列、HiLyte Fluor系列、HiLyte Plus系列、iFluor系列、PromoFluor系列染料等。
四种dNTP的终浓度为5～10μM；另外还含有0.5～2mM的醋酸锰。
步骤S5具体为，将芯片上同一个位置两个阶段的结果进行定位、统计、比对，找到在淬灭阶段单步淬灭，且累积阶段存在荧光累积的孔，视为有效载样孔，并根据统计结果进一步分析有效载样率、有效载样孔与孔在芯片上位置的关系等。
本发明还提供上述评估零模波导孔有效载样的方法在单分子实时测序方法的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
(1)本发明使用荧光淬灭+荧光累积的双重判定方法对有效载样孔进行精确判断。在酶-引物-模板三元复合物固定在芯片上之后，通过引物上的荧光淬灭情况对进孔的引物个数进行分析，有效剔除存在多个荧光的ZMW孔；后续启动滚环复制，使用荧光标记的dNTP搭配环形模板，在聚合反应过程中实现荧光累积，可以筛选出含有三元复合物且能够顺利反应的ZMW孔；再结合淬灭的结果，就能获得只含有单个酶-引物-模板三元复合物且能够顺利反应的有效载样孔。双重判定使得对有效载样孔的判定更加精确。
(2)本申请研究模型使用了酶-引物-模板三元复合物，代替了简单的双链DNA模板，更加接近实际测序时的载样状态，能够更真实地反映载样时的各种影响因素，降低了模型带来的误差，还有利于进一步研究聚合反应
(3)本方法在荧光累积阶段能够发生滚环复制反应，不仅能够观察进孔情况，还能够对进孔的样本进行功能性验证，观察进孔后能否顺利进行下一步的反应。
(4)简化快捷地获知有效载样情况。在单分子实时测序中，常需要等测序结果下机之后，才能够获知有效载样情况。本方法采用简化的模型，利用荧光淬灭+荧光累积的双重判定，在不需要测序的情况下就能获悉有效载样情况，时间更短，分析的数据更少，有利于研究上机前的实验优化，如试剂的种类和比例、除氧系统的配方等。
(5)本发明构建了一种评估零模波导孔有效载样的方法，使用一种简单的酶-引物-模板三元复合物作为研究模型，更贴近测序时的三元复合物状态；利用荧光淬灭和荧光累积的过程进行双重判定，有利于更精准地筛选出单分子实时测序的有效载样孔，有效避免单个或多个酶分子、单个或多个引物分子、单个或多个引物-模板复合物分子的干扰，还能够通过荧光累积的过程验证酶的活性。同时，这个方法还能够用于整个测序体系的优化，如通过验证DNA凝聚试剂、除氧系统等试剂对于有效载样的影响来进行调整，优化有效载样率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例1中评估零模波导孔有效载样的方法的原理示意图；
图2是本申请实施例1中通过淬灭和累积两个阶段的双重判定结果综合评估零模波导孔有效载样的方法的原理示意图；
图3是本申请实施例1中片段分析结果示意图；
图4是本申请实施例1中在淬灭阶段，无荧光ZMW孔，孔内荧光强度标准差随拍摄帧数变化曲线图；
图5是本申请实施例1中在淬灭阶段，单荧光ZMW孔，孔内荧光强度标准差随拍摄帧数变化曲线图；
图6是本申请实施例1中在淬灭阶段，多荧光ZMW孔，孔内荧光强度标准差随拍摄帧数变化曲线图；
图7是本申请实施例1中在淬灭阶段的判定结果示意图；
图8是本申请实施例1中在累积阶段的判定结果示意图；
图9是本申请实施例1中有效载样的最终判定结果示意图；
图10是本申请试验例1中载样阶段是否添加试剂的判定结果的对比图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。
以下具体实施例是对本发明的进一步说明，所举案例并不能列举出本发明的全部实施方式，仅以其中部分实施方式为例进行说明，具体实施例如下：
实施例1
本实施例提供一种评估零模波导孔有效载样的方法，具体步骤如下：
一、模板设计与制备：
1.设计并合成单链线性模板。模板序列为：5’-acccatataaatcaccctaccatcaccataacataccactttGacaataacacactctcaccacaatataaatcc ct-3’(生工)，合成时5’端需要添加磷酸基团，77碱基的序列中只含有一个G。
2.模板环化。使用300U CircLigase II ssDNA Ligase(Epicentre Biotech-nologies)对终浓度为5μM的模板进行环化，溶液中还含有1×CircLigase buffer,2.5mMMnCl2,0.05mM ATP,1M betaine。60℃孵育10h，80℃孵育10min以获得环化产物。使用60U的Exonuclease I(TAKARA)和600U的ExonucleaseⅢ(TAKARA)对未成环的线性DNA进行消化处理，程序为37℃30min；80℃15min。以消化掉未环化的模板，获得较为纯净的环化产物。
3.环化产物纯化及浓缩。随后使用Gel DNA Extraction Mini Kit(诺唯赞)对环化产物进行纯化及浓缩。使用NanoDrop 2000Spectropho-tometer(ThermoFisher Scientific)对产物浓度进行分析与检测。并通过Qsep1DNA Analyzer(Bioptic)对产物片段进行分析，如图3所示，环化后出现代表环形模板的小峰，位于51bp附近；消化后代表线性模板的小峰(55bp附近)消失，说明消化过程充分去除了线性模板；纯化浓缩的过程去除了体系中额外的盐、蛋白等成分，并提高了浓度。Qsep结果对每一个步骤进行了跟踪和验证，证明了环化的成功，环形模板的存在及纯度。
二、获得酶-引物-模板三元复合物：
1.获得引物-模板复合物。设计并合成引物，序列为5’-/Biotin/aaaaagtgattta/iCy3dT/atgggtagggatttatattgtgg-3’(生工)，5’端修饰有生物素基团，序列中标记有Cy3荧光。将引物：模板以1：5的摩尔比添加进1×Phi29MAX DNA Polymerase Reaction Buffer(诺唯赞)并进行退火处理，引物终浓度为500pM，在80℃孵育2min,然后在30min内缓慢降温至4℃。
2.获得酶-引物-模板三元复合物。在引物-模板复合物中添加1×Phi29MAX DNAPolymerase(诺唯赞)，使引物：模板：酶的摩尔比为1：5：10，4℃孵育1h。
三、载样：
使用来自Pacific Biosciences的商业化芯片SMRT Cell 8Pac(8Cells)v3，共含有15万ZMW孔，其芯片上已经经过钝化处理，且ZMW底部的玻璃表面修饰有生物素。先使用饱和的链霉亲和素对芯片进行处理，室温孵育1h，再使用1×reaction buffer(50mM ACES(pH7.0)、75mM醋酸钾、5mM DTT)清洗10次。之后再将孵育后的三元复合物添加在经链霉亲和素处理后的芯片中，4℃孵育1h。
四、淬灭阶段拍摄：
孵育后，将三元复合物绑定在ZMW中。用1×Phi29 MAX DNA Poly-meraseReaction Buffer(诺唯赞)清洗10次，洗去未绑定的三元复合物，并保留40uL 1×Phi29MAX DNA Polymerase Reaction Buffer在芯片中，用50uL的石蜡油密封。使用倒置显微镜，在30mW的532nm激光照射下，以10帧/s的速度对对芯片进行连续拍摄，获得荧光淬灭阶段的连续视频。通过对每一帧图片进行提取，绘制每个ZMW孔的荧光强度及标准差变化曲线，并根据荧光淬灭的步骤数目确定孔内荧光的个数。
荧光强度标准差变化曲线无明显淬灭步骤的孔，视为孔内无荧光，如图4所示；曲线呈单步淬灭视为孔内只含有一个Cy3荧光分子，如图5所示；曲线呈多步淬灭的视为孔内含有多个荧光分子，如图6所示；进而挑选出含有单荧光的ZMW孔如图7所示，984个ZMW孔中，263个孔发生了单步淬灭，即孔内存在单荧光。由于Cy3荧光与引物一一对应，所以孔内有荧光的分子存在4种可能性，即单个引物、单个引物-模板复合物、单个引物-酶复合物、单个酶-引物-模板复合物，如图1淬灭分析获得的结果所示。除此之外，含有单荧光的孔内可能还含有其他不带有荧光的分子。
五、累积阶段拍摄
在拍摄完淬灭阶段的芯片中，加入终浓度为10uM的Cy3-dCTP(脉铂，碱基位标记)、以及其余三种dNTP(Invitrogen)，黑暗中孵育1h以累积荧光，然后使用1×Phi29 MAX DNAPolymerase Reaction Buffer(诺唯赞)清洗10次，并保留40uL 1×Phi29 MAX DNAPolymerase Reaction Buffer在芯片中，用50uL的石蜡油密封。在阴性对照芯片的启动试剂中缺少其余三种dNTP，其他流程与实验组保持一致。使用倒置显微镜，在30mW的532nm激光照射下，以10帧/s的速度对对芯片进行连续拍摄，获得荧光累积结果的淬灭过程的连续视频。
通过对每一帧图片进行提取，绘制每个ZMW孔的荧光强度及标准差变化曲线，并把视野中出现所有ZMW的第一帧，设为关键帧。统计并计算对照芯片在累积阶段的关键帧每个孔内的数据，获得所有孔的荧光强度平均值及标准差，计算平均值+2倍标准差，并以此作为区分实验组的ZMW孔是否发生荧光累积的阈值，对实验组关键帧的ZMW孔进行分类，挑选出荧光强度大于阈值的孔，视为发生荧光累积的孔，结果如图8所示代表了本实施例中对累积阶段984个ZMW孔的分类结果，其中69个孔发生了荧光累积。
六、综合分析
将淬灭阶段的判定结果与累积阶段的判定结果进行对比分析，挑选出在淬灭阶段孔内存在单荧光，且在累积阶段有荧光累积的ZMW孔，代表着孔内有且只有一个酶-引物-模板三元复合物，并且能够在载样后顺利发生反应，判定为有效载样，原理如图2所示。图9为本实施例对有效载样的最终判定结果，984个观测孔中，有30个孔为有效载样。
试验例1
将本发明评估零模波导孔有效载样的方法应用于寻找提高单分子实时测序中ZMW孔有效载样的试剂或方法。
亚精胺是一类DNA凝聚剂，能够将溶液中片段较长的线性DNA链凝聚成团，降低空间位阻，以辅助载样。但其是否同样有助于单分子实时测序的有效载样尚不清楚。使用本发明的评估方法，对比在载样过程中添加/不添加亚精胺，最终有效载样率的差异，进而对亚精胺的作用进行评估。具体流程如下：
一、模板设计与制备
1.设计并合成单链线性模板。模板序列为：5’-acccatataaatcaccctaccatcaccataacataccactttGacaataacacactctcaccacaatataaatcc ct-3’(生工)，合成时5’端需要添加磷酸基团，序列中只含有一个G。
2.模板环化。使用300U CircLigase II ssDNA Ligase(Epicentre Biotech-nologies)对终浓度为5μM的模板进行环化，溶液中还含有1×CircLigase buffer,2.5mMMnCl2,0.05mM ATP,1M betaine。60℃孵育10h，80℃孵育10min以获得环化产物。使用60U的Exonuclease I(TAKARA)和600U的ExonucleaseⅢ(TAKARA)对未成环的线性DNA进行消化处理，程序为37℃30min；80℃15min。以消化掉未环化的模板，获得较为纯净的环化产物。
3.环化产物纯化及浓缩。随后使用Gel DNA Extraction Mini Kit(诺唯赞)对环化产物进行纯化及浓缩。使用NanoDrop 2000Spectropho-tometer(ThermoFisher Scientific)对产物浓度进行分析与检测。并通过Qsep1DNA Analyzer(Bioptic)对产物片段进行分析。
二、获得酶-引物-模板三元复合物
1.获得引物-模板复合物。设计并合成引物，序列为5’-/Biotin/aaaaagtgattta/iCy3dT/atgggtagggatttatattgtgg-3’(生工)，5’端修饰有生物素基团，序列中标记有Cy3荧光。引物：模板以1：5的摩尔比添加进1×Phi29MAX DNA Polymerase Reaction Buffer(诺唯赞)并进行退火处理，引物终浓度为500pM，在80℃孵育2min，然后在30min内缓慢降温至4℃。
2.获得酶-引物-模板三元复合物。在引物-模板复合物中添加1×Phi29MAX DNAPolymerase(诺唯赞)，使引物：模板：酶的摩尔比为1：5：10。，4℃孵育1h。
三、载样：
使用来自Pacific Biosciences的商业化芯片SMRT Cell 8Pac(8Cells)v3，共含有15万ZMW孔，根据原理及介绍，芯片上已经经过钝化处理，且ZMW底部的玻璃表面修饰有生物素。先使用饱和的链霉亲和素对芯片进行处理，室温孵育1h，再使用1×reaction buffer(50mM ACES(pH7.0)、75mM醋酸钾、5mM DTT)清洗10次。之后再将孵育后的三元复合物添加在经链霉亲和素处理后的芯片中，4℃孵育1h。
另选一张芯片，在三元复合物与经链霉亲和素处理的芯片孵育时，额外添加终浓度为1mM的亚精胺(阿拉丁)，其余处理及拍摄操作相同。
四、淬灭阶段拍摄
孵育后，部分三元复合物绑定在ZMW中。用1×Phi29 MAX DNA PolymeraseReaction Buffer(诺唯赞)清洗10次，洗去未绑定的三元复合物，并保留40uL 1×Phi29MAX DNA Polymerase Reaction Buffer在芯片中，用50uL的石蜡油密封。使用倒置显微镜，在30mW的532nm激光照射下，以10帧/s的速度对对芯片进行连续拍摄，获得荧光淬灭阶段的连续视频。通过对每一帧图片进行提取，绘制每个ZMW孔的荧光强度及标准差变化曲线，并根据荧光淬灭的步骤数目确定孔内荧光的个数。
荧光强度标准差变化曲线无明显淬灭步骤的孔，视为孔内无荧光；曲线呈单步淬灭视为孔内只含有一个Cy3荧光分子；曲线呈多步淬灭的视为孔内含有多个荧光分子；进而挑选出含有单荧光的ZMW孔，由于Cy3荧光与引物一一对应，所以孔内有荧光的分子存在4种可能性，即单个引物、单个引物-模板复合物、单个引物-酶复合物、单个酶-引物-模板复合物，除此之外，含有单荧光的孔内可能还含有其他不带有荧光的分子。
五、累积阶段拍摄
在拍摄完淬灭阶段的芯片中，加入终浓度为10uM的Cy3-dCTP(脉铂，碱基位标记)、以及其余三种dNTP(Invitrogen)，黑暗中孵育1h以累积荧光，然后使用1×Phi29 MAX DNAPolymerase Reaction Buffer(诺唯赞)清洗10次，并保留40uL 1×Phi29 MAX DNAPolymerase Reaction Buffer在芯片中，用50uL的油密封。阴性对照芯片的启动试剂中缺少其余三种dNTP，其他流程与实验组保持一致。使用倒置显微镜，在30mW的532nm激光照射下，以10帧/s的速度对对芯片进行连续拍摄，获得荧光累积结果的淬灭过程的连续视频。
通过对每一帧图片进行提取，绘制每个ZMW孔的荧光强度及标准差变化曲线，并把视野中出现所有ZMW的第一帧，设为关键帧。统计并计算对照芯片在累积阶段的关键帧每个孔内的数据，获得所有孔的荧光强度平均值及标准差，计算平均值+2倍标准差，并以此作为区分实验组的ZMW孔是否发生荧光累积的阈值，对实验组关键帧的ZMW孔进行分类，挑选出荧光强度大于阈值的孔，视为发生荧光累积的孔。
六、综合分析
将淬灭阶段的判定结果与累积阶段的判定结果进行对比分析，挑选出在淬灭阶段孔内存在单荧光，且在累积阶段有荧光累积的ZMW孔，代表着孔内有且只有一个酶-引物-模板三元复合物，并且能够在载样后顺利发生反应，判定为有效载样。
对载样过程中添加亚精胺的芯片进行统计分析，获得其在淬灭阶段、累积阶段及最终有效载样的评估判定结果。进一步统计每个阶段的占比，并与未添加的芯片进行比对，如图10所示。结果表明，在本发明所述方法的溶液体系及观测模型下，是否添加亚精胺对单分子实时测序中的有效载样并无显著差异。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种评估零模波导孔有效载样的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：制备酶-引物-模板三元复合物；
S2：将三元复合物和芯片绑定；
S3: 对芯片进行荧光淬灭，并对荧光淬灭过程进行拍摄，找到具有单个荧光的孔；
S4：添加启动试剂，启动聚合反应，对芯片进行荧光累积，并对荧光累积结果进行拍摄，找到荧光能够持续累积的孔；
S5：确定荧光淬灭阶段具有单个荧光，且荧光累积阶段荧光能够持续累积的孔为有效载样孔；
所述步骤S4为，向芯片中添加启动试剂启动滚环复制，在黑暗中反应后清洗，然后在启动试剂荧光对应的光源下拍摄，光源包括紫外灯、汞灯、LED、激光中的任意一种；在荧光对应的光源下拍摄，以1~100帧/s的帧率进行连续拍摄，记录每个孔的荧光值变化曲线，挑选出荧光能够累积的孔；
所述启动试剂中的四种dNTP中，有一种dNTP带有荧光，其余三种dNTP不带有荧光；
带有荧光的dNTP与模板中只含有一个的碱基互补配对。
2.根据权利要求1所述的评估零模波导孔有效载样的方法，其特征在于，步骤S1中的酶-引物-模板三元复合物中所述模板为单链环形模板，具体制备方法包括：
合成长度50~140nt的单链DNA模板，序列中A、T、C、G四种碱基中的一种碱基的数量只有一个，其余碱基的数量大于一；
使用环化酶或T4 DNA连接酶对所述单链DNA模板进行环化，并进行纯化，得到所述单链环形模板。
3.根据权利要求1或2所述的评估零模波导孔有效载样的方法，其特征在于，步骤S1中，酶-引物-模板三元复合物的制备方法为将单链环形模板与带有荧光和固定基团的引物进行退火处理，形成引物-环形模板复合物；然后添加phi29聚合酶孵育得到所述酶-引物-模板三元复合物。
4.根据权利要求3所述的评估零模波导孔有效载样的方法，其特征在于，
所述引物上的固定基团包括但不限于生物素、链霉亲和素、氨基中的至少一种；
荧光包括但不限于香豆素系列的染料、荧光素系列染料、Alexa Fluor系列染料、Cy系列染料、罗丹明系列染料、德州红Texas Red或硅基罗丹明SiR中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的评估零模波导孔有效载样的方法，其特征在于，
步骤S2中，将芯片经钝化处理后，在孔内玻璃表面修饰氨基、链霉亲和素或生物素中的一种，将步骤S1得到的三元复合物添加在芯片中孵育固定；
所述芯片为孔径80~200nm，孔间距5~15μm的零模波导芯片，每个芯片上零模波导孔数量为2000~150000个。
6.根据权利要求5所述的评估零模波导孔有效载样的方法，其特征在于，所述步骤S3为，将芯片清洗后用油密封，然后在引物所带荧光对应的光源下拍摄，以1~100帧/s的帧率进行连续拍摄，记录每个孔的荧光值变化曲线，根据荧光淬灭的形态挑选出只有一个荧光的孔。
7.权利要求1-6任一项所述的评估零模波导孔有效载样的方法在单分子实时测序方法的应用。
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