CN101654712A

CN101654712A - 核酸单分子测序方法

Info

Publication number: CN101654712A
Application number: CN200910308163A
Authority: CN
Inventors: 王志民; 詹黎; 程秀兰
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2009-10-10
Filing date: 2009-10-10
Publication date: 2010-02-24

Abstract

一种生物技术领域的核酸单分子测序方法，包括如下步骤：分别检测脱氧腺苷5’一磷酸、脱氧鸟苷5’一磷酸、脱氧胞苷5’一磷酸、脱氧胸苷5’一磷酸、甲基化脱氧胞苷5’一磷酸、腺苷一5’磷酸、鸟苷5’一磷酸、胞苷5’一磷酸和尿苷5’一磷酸的拉曼光谱信号，建立标准曲线；利用外切酶酶切待测核酸分子，检测酶切后产物通过零模波导时受激光激发而发射的拉曼光谱信号；根据步骤一所得标准曲线，将步骤二所得拉曼光谱信号转换为具体的核苷酸，结合外切酶的切割方向，获得待测核酸分子的具体序列。利用本发明的方法，可以直接测定无标记的天然核酸序列，测定速度快、测定质量高、测定费用低。

Description

核酸单分子测序方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的测序方法，具体是一种核酸单分子测序方法。

背景技术

随着后基因组世代的到来，对DNA和RNA等生物大分子序列测定的需求大量增加。但目前的测序方法存在速度慢、费用高、有缺口、测序长度短或准确率底等问题，制约了相关学科的发展。2009年6月23日NCBI公布的结果，已完成真核生物基因组测序的22个，完成组装的174个，正在进行的172个。实际上，这仅仅是拉开了大规模基因组测序的序幕，因为对基因组测序的需要是多方面的，如个性化测序、动植物遗传改良中的单个个体测序、病原微生物的监控等等。但是，目前的方法难以满足多种测序的需求。当前的方法存在多种缺陷：速度慢、费用高、精确性差和一次性测序长度短，所以要研发新的测序技术以替代当前的测序方法。

经对现有技术的文献检索发现，John Eid等(2009)在《科学》以“单聚合酶分子的实时DNA测序”((Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules，Science，323∶133～138))为题报道了其研究结果：以零模波导(zero-mode waveguide，简称ZMW)将光聚集在亚波长特定区域内增强激发分子荧光发射、而较远的荧光迅速衰减的原理为基础，将DNA聚合酶固定于ZMW底部，与待测序单链DNA结合，将4种不同荧光标记的脱氧核苷三磷酸(简称dNMPs)，加入反应体系，只有正确配对而加入延伸链的dNMP所携带的荧光分子能被检测，实时检测加入的核苷酸，获得序列信息，再将ZMW做成阵列，提高测序通量。结果每一个ZMW的平均速度在4.7±1.7碱基/秒，准确率99.3％。因这种方法必需采用昂贵的荧光标记的dNMPs，因此，测序费用成了该方法广泛应用的主要限制因素。另外，准确率也远低于测序界提出的99.99％。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种核酸单分子测序方法。本发明可以直接测定无标记的天然核酸(包括DNA和RNA)序列，测定速度快、测定质量高、测定费用低。

本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明包括如下步骤：

步骤一，分别检测脱氧腺苷5’一磷酸、脱氧鸟苷5’一磷酸、脱氧胞苷5’一磷酸、脱氧胸苷5’一磷酸、甲基化脱氧胞苷5’一磷酸、腺苷一5’磷酸、鸟苷5’一磷酸、胞苷5’一磷酸和尿苷5’一磷酸的拉曼光谱信号，建立标准曲线；

步骤二，利用外切酶酶切待测核酸分子，检测酶切后产物通过零模波导(ZMW)时受激光激发而发射的拉曼光谱信号；

步骤三，根据步骤一所得标准曲线，将步骤二所得拉曼光谱信号转换为具体的核苷酸，结合外切酶的切割方向，获得待测核酸分子的具体序列。

步骤二中，所述外切酶为每次只降解1个核苷酸，每秒降解15～1000个核苷酸的外切酶。

步骤二中，所述零模波导为金属薄膜基底中的圆形纳米孔，纳米孔的内径为50nm，深度为100nm。

步骤二中，所述零模波导为阵列形式。

步骤二中，所述拉曼光谱信号进行如下处理：用透镜收集拉曼光谱信号，之后透过滤波器去除杂散的激发光。

本发明可以直接测定无标记的天然核酸序列，测定速度快、测定质量高、测定费用低、基本不留缺口，可满足以DNA序列为基础的动植物及微生物的遗传改良、有害微生物的控制和各种生物基因组的大规模核酸测序的各种需求。本发明的方法不仅可检测核苷和脱氧核苷5’一磷酸，还可检测天然真核生物DNA中的甲基化胞苷。

附图说明

图1为测序流程示意图；

图2为拉曼光谱信号检测装置。

具体实施方式

以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

如图1所示：在流室1，将1条靶核酸(双链DNA或单链DNA或RNA)的3’或5’端固定，用每次只降解1个核苷酸、每秒降解约15～1000个核苷酸、延续性长的外切酶(双链DNA或单链DNA或RNA外切酶)降解靶核酸，在流室2真空负压作用下，降解产物按它们在原靶核酸中的相对位置，有序地自流室1向流室2移动过程中通过ZMW，激光激发核苷酸并记录拉曼光谱信号。拉曼光谱信号用大数值孔径的透镜收集，透过高消光比的Notch滤波器去除杂散的激发光后，进入高灵敏光谱仪系统记录并分析核苷酸的拉曼特性光谱。单个核苷酸在通过ZMW时的拉曼光谱信号，由于不同的核苷酸dNMPs或rNMPs(简称nt)的分子结构的差异，具有不同的光学声子模式，当通过ZMW有效区域被激光激发，会激发出不同的拉曼特征光谱，光谱检测系统记录拉曼光谱信号，最后将拉曼光谱信号转换为各自的特征谱线，并建立标准曲线。

图2为本实施例拉曼光谱信号检测装置，如图所示：在纳米通道中嵌入一个ZMW，该ZMW与拉曼光谱检测系统连接，ZMW为金属薄膜基底中的一圆形纳米孔，内径在50nm，深度在100nm，纳米通道的底部宽度≤ZMW的内径，相对应的顶部面为通光材料，如Al₂O₃、玻璃或SiO₂，纳米通道的长度为50nm～毫米级；纳米通道上游连接一个流室(流室1)，下游连接一个与抽真空接口相连的封闭流室(流室2)。

实施例1

DNA片段测序

步骤一，dNMPs笔迹的检测

向镶有零模波导的纳米通道连接的流室1中加入水或水溶液，每次只加入一种超稀释的核苷酸，打开抽真空和拉曼光谱检测系统记载单个核苷酸通过ZMW时的光谱信号；如此对各类核苷酸的拉曼光谱信号进行检测，最后确定各自特异声子振动的特征光谱，建立标准曲线，并编写软件。

步骤二，单分子DNA片段的固定

将一个携带一条靶核酸分子的磁珠固定到测序单元流室1的磁铁上，实现一条靶核酸一端固定。将此测序单元制作成阵列，最后使整个阵列的每一个测序单元都有一条靶核酸。

步骤三，序列检测

向流室1添加含外切酶的缓冲液，待单个酶分子与DNA结合后，添加镁离子，在外切酶作用下，DNA逐一被剪切成单个碱基；立即打开流室2端的真空开关，以在流室1和流室2间产生负压，使切下的核苷酸按照在DNA中的顺序依次自流室1通过纳流体通道向流室2流动，其间穿过ZWM时，激光和拉曼光谱检测系统收集信号，用透镜收集拉曼光谱信号，之后透过Notch滤波器去除杂散的激发光，之后用软件判别碱基的类别而实现读取DNA序列的目的。

本实施例的检测速度取决于外切酶活性，目前最快的外切酶的活性约为1000nts/秒，即每个测序单元每秒检测1000核苷酸序列，每小时最快可检测3600knt(千核苷酸)。高通量核酸测序仪的测序速度＝阵列中的测序单元数×测序单元测序速度，如果是100×100阵列，则测序仪的测序最高速度为36000mnt(百万核苷酸)，测序准确性≥99.99％。

本实施例的实施效果：测序准确性≥99.99％。

实施例2

完整染色体测序

步骤一，单分子操作：用光学显微镜、流式细胞仪或其他方法辅助，提取单条染色体，去除组蛋白，按实施例1的方法将染色体固定在磁珠上。

步骤二，染色体固定：将带有1条完整染色体的磁珠固定到安装在一个测序单元流室1的磁铁上，以此制作阵列，最后使整个阵列的每一个测序单元都有一条染色体。

步骤三，序列检测：在流室1加核酸外切酶及缓冲液，待单个酶分子与DNA结合后，添加镁离子，立即打开抽真空装置，收集拉曼光谱信号，并用软件读取DNA序列。

本实施例的实施效果：以整条染色体为底物进行测序，虽然阵列的作用得不到像实施例1那样的充分发挥(如人类体细胞有46条染色体，因此只有46个测序单元的阵列就可满足测序，人类最长的第一染色体约245,203,898nt，在外切酶活性为1000nts/秒，约需68小时)，而使速度下降，但最后的序列无需拼接和组装，可解决当前测序方法中存在的缺口问题。测序准确性≥99.99％。

实施例3

RNA测序

步骤一，rNMPs笔迹的检测同实施例1，根据它们产生的特异拉曼光谱信号建立标准曲线。

步骤二，按照实施例1的方法将RNA单分子固定到流室1，用RNA外切酶逐个降解核苷酸，核苷酸通过ZWM时，记录拉曼光谱数据，根据标准曲线将拉曼光谱信号转换为序列信息。

步骤三，亦可以RNA为模板，通过反转录酶合成cDNA(互补DNA)，再按实施例1的步骤获得RNA的序列。

本实施例的实施效果：适于本实施例的RNA/DNA外切酶活性在1000nts/秒为宜，如检测mRNA序列，按mRNA平均长度1000nts计，100×100的阵列，即每秒可完成10000个mRNA或cDNA序列的测定。测序准确性≥99.99％。

Claims

1.一种核酸单分子测序方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤二，利用外切酶酶切待测核酸分子，检测酶切后产物通过零模波导时受激光激发而发射的拉曼光谱信号；

2.根据权利要求1所述的核酸单分子测序方法，其特征是，步骤二中，所述外切酶为每次只降解1个核苷酸，每秒降解15～1000个核苷酸的外切酶。

3.根据权利要求1所述的核酸单分子测序方法，其特征是，步骤二中，所述零模波导为金属薄膜基底中的圆形纳米孔，内径为50nm，深度为100nm。

4.根据权利要求1所述的核酸单分子测序方法，其特征是，步骤二中，所述零模波导为阵列形式。

5.根据权利要求1所述的核酸单分子测序方法，其特征是，步骤二中，所述拉曼光谱信号进行如下处理：用透镜收集拉曼光谱信号，之后透过滤波器去除杂散的激发光。