CN102686997A - 单分子侦测系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例提供一单分子侦测系统及多种侦测单分子目标物或测序核酸的方法。所述单分子侦测系统包含：一可动式光耦合器(100)、一导波器(110)、以及一光侦测器(102)。导波器(110)包含：一核心层(112)和一第一被覆层(114)，其中至少一可动式光耦合器(100)应接位置(104)可形成于至少第一被覆层(114)中。在所述方法中，所述侦测系统用于侦测单分子目标物或测序核酸。

Description

单分子侦测系统及方法

优先权信息

本申请要求2010年3月15日提交的美国申请流水号61/314037的优先权，将该申请通过提述以其整体并入本文。

技术领域

本发明关于单分子侦测系统及使用此侦测系统以侦测目标物的方法。此外，本发明尚关于一侦测系统，其包括一可动式光耦合器、一导波管、以及一光侦测器。本发明亦关于将样本加载至单分子侦测系统的方法。本发明还关于单分子侦测的方法，包括单分子核酸测序的方法。

背景技术

大部分传统的化学或生物化学分析系根据“大批(bulk)”检测。在上述检测中，检测在样本溶液之特定体积中的复数个分子的集体行为(collectivebehavior)，以决定分子的特性。然而，在很多情况下，并无法利用大批的检测方法，例如当样本体积太小或目标物的浓度太低，使得在侦测目标分子上，产生灵敏度之技术的限制时。最近几年，单分子的侦测已经变得可行。单分子侦测提供远高于传统上大批检测的灵敏度，以及提供更详细的信息。单分子的仪器灵敏度的发展亦预告了高灵敏度的生物分子侦测及诊断的新契机，如Qiu,H.等人所描述，“细胞激素及化学激素的高灵敏度侦测之荧光单分子计数分析(Fluorescence single-molecule counting assays for high-sensitivitydetection of cytokines and chemokines)”，Clinical Chemistry 53(11):2010-2012(2007)。

Moerner,W.E.与Fromm,D.P提供实现单分子侦测的方法的描述，”回顾评论：单分子荧光光谱及显微镜使用的方法(REVIEW ARTICLE:Methods ofsingle-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy)”，Review ofScientific Instruments 74(8):3597-3619(2003)，以及Walter,N.G.等人”自己动手指南：如何使用现代单分子工具组(Do-it-yourself guide:how to use themodern single-molecule toolkit)”，Nature Methods 5:475-489(2008)。这些回顾评论亦讨论了所属技术领域中，已经用于或计划用于单分子侦测之习知的方法与设备。单分子侦测的应用包括单分子DNA序列、单分子生物标志侦测以及微型化的流式细胞计数侦测。

单分子侦测的最佳化系统及方法在加速DNA测序技术上具有很大的潜力。人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)刺激了DNA测序通量上的快速增加。这种增加，随着技术的改进，使得测序的成本相对应的下跌。虽然第一组基因组需要费时13年并花费将近三十亿美金才得以完成测序，然而已经可预见DNA测序技术最终将使得个人的染色体测序变得足以负担，并且成为一般临床照护中不可或缺的一部分(McGuire et al.,Science317:1687(2007))。对于病患及健康照护提供者来说，个人的基因组代表一医学治疗上之方法的根本转变(paradigm shift)。藉由管理疾病的遗传危险因子(genetic risk factors)，健康照护提供者可更容易地实践预防医学，并且提供定制化的治疗。利用已完成的基因组大银行，药物设计以及给药可更有效率，因此加速了药物基因组学(pharmacogenomics)之新生领域的发展。然而，上述的加速系仰赖健全的、高通量的、以及低成本的DNA测序技术的实现。

为了完成单分子侦测，光学系统必须可以选择性地激发在复杂环境中所关注的重要分子，并且能够避免背景噪声的干扰，以及侦测自此单分子发射出来了微弱光线。完成单一分子侦测的方法之一系将此所关注的重要分子上置于一固定空间内，加强自单分子发射出来之光线的侦测。美国专利号U.S.Patent No.6,917,726揭露了一显微镜系统的产生，此显微镜系统合并一零阶模态导波管(zero-mode waveguide,ZMW)，可利用纳米级的管井(nano-scalewells)来加强单分子的侦测，上述纳米级的管井限定了激发光场(excitationlight fields)。在这些限定了激发光场的纳米井(nanowells)中之分子的配置，大大地降低了杂讯，因而使来自单分子发射出来的光的侦测能力增强。亦可参见，例如，美国专利号U.S.Patent No.6,917,726、U.S.Patent No.7,170,050、以及U.S.Patent No.7,486,865。然而，将单分子样本加载激发场，需要在纳米井中的分子贴附至ZMW的底部，这不仅困难且效率欠佳(Eid et al.,Science,323:133-138(2009))。只有含有一个单分子样本的管井有用，而空的管井或含有多重单分子样本的管井则无效。

美国专利公开号U.S.patent publication no.2010/0009872揭露了具有较高成功率之改进样品承载的方法。这些方法利用一纳米级粒子携带一单分子样本至纳米井的顶部开口，并且传送样本至管井的底部而可将样本曝露在激发场下。然而，上述过程包含了多个步骤及化学反应以便将单分子样本自纳米粒子载体转移至管井的底部。此外，已承载的管井几乎不可能或极为困难再被利用。

国际专利公开号International Patent Publication Number WO 2009/017678揭露单分子核酸测序的方法，其中一单聚合酶固定在一表面上以重复测序一环状核酸模板(circular nucleic acid template)，进而改进单分子测序的准确度。在上述单分子测序的光学侦测的方法中，反应物直接固定在表面上将反应限制在10的-21次方公升(zeptoliter)的体积内。然而将一酶或一核酸的单分子结合至表面上的困难，限制了高通量测序的运用。此外，一旦聚合酶失去活性，聚合酶直接固定在表面上的测序反应都将被终止，阻止在此处的测序分析之完成。为了固定一分子或酶于适当的位置，如WO 2009/017678中所述，必须明确界定表面的区域，以及必须精确控制此区域的化学性质。这使得设备制造变得困难并且增加了成本。

因此，业界亟需侦测单分子目标物的改善系统及方法。

发明内容

本发明提供一种单分子侦测系统，包括：a)一可动式光耦合器；b)一导波器；包括：一核心层；以及一第一被覆层；其中至少一该可动式光耦合器之应接位置至少形成于该第一被覆层中；以及c)一光侦测器。

本发明另提供一种单分子目标物的侦测方法，包括：a)将一入射光自一光源引导进入一导波器，从而在该导波器中形成一激发光；b)将一单分子目标物定位(localizing)于一可动式光耦合器上；c)将(b)的可动式光耦合器定位(localizing)于一应接位置处，该应接位置为形成于该导波器之至少一第一被覆层中之一可动式光耦合器的应接位置；以及d)藉由该激发光来激发被定位(localized)于该可动式光耦合器上之该单分子目标物，使该单分子目标物发射出一光线以被一光侦测器侦测。

本发明尚提供一种单分子目标物的侦测方法，包括：a)提供一侦测装置，包括：i)一可动式光耦合器ii)一导波器，包括：一核心层；以及一第一被覆层，其中至少一该可动式光耦合器之应接位置至少形成于该第一被覆层中；以及iii)一光侦测器；b)提供至少一结合部分，其能够与一单分子目标物结合；c)将至少一该结合部分个别地定位(localizing)于该可动式光耦合器上；d)提供一单分子目标物分子给该定位于该可动式光耦合器上的至少一结合部分；e)将定位有该至少一结合部分及单分子目标物的该可动式光耦合器定位(localizing)于该应接位置处；f)将一入射光自一光源引导进入该导波器，从而形成一激发光于该导波器中；h)藉由该激发光来激发该单分子目标物分子，使得该单分子目标物发射出一光线以被一光侦测器侦测，其中该单分子目标物分子结合至该定位于该可动式光耦合器上的至少一结合部分，且该至少一结合部分定位于该可动式光耦合器上。

本发明更提供一种核酸的测序方法，包括：a)提供一侦测装置，包括：i)一可动式光耦合器；ii)一导波器，包括：一核心层；以及一第一被覆层，其中至少一该可动式光耦合器之应接位置至少形成于该第一被覆层中；以及iii)一光侦测器；b)提供至少一核酸分子；c)将该至少一核酸分子个别地定位(localizing)于该可动式光耦合器上；d)将该定位有该至少一核酸的可动式光耦合器定位(localizing)于该应接位置；e)将该定位有该至少一核酸分子进行该至少一核酸分子的单分子合成测序，其中该单分子核酸的合成测序导致产生一发射光，该发射光与至少一该核酸中的碱基之特性有关；f)利用该侦测器侦测该发射光，产生一输出讯号；以及g)处理该输出讯号以决定至少一该核酸所包含的碱基之特性。

为让本发明所述之目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举出较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如后。可藉由在申请专利范围中所特别指出的要素和组合来了解及得到本发明所述之目的、特征、和优点。

应可了解，本发明说明书之描述与图式亦仅仅作为说明之用而非用来限定本发明。本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。

本说明书中所附图式系用来配合本发明之说明，并成为本发明之说明的一部分，与说明书中所述内容共同描述本发明之多个实施例，用来解释其原理。

附图简述

图1系依据本发明的某些实施例之侦测系统的示意图。

图2系依据本发明的一些实施例之侦测系统的两示意图。

图3系依据本发明的某些实施例之不同的应接位置设计的示意图。

图4系依据本发明的某些实施例之侦测系统的示意图。

图5系依据本发明的一些实施例之可动式光耦合器，以及经表面修饰之导波器应接位置的示意图。

图6系依据本发明的一些实施例之可动式光耦合器，以及经表面修饰之导波器应接位置的示意图。

图7系具有一可动式光耦合器之示范侦测系统的示意图，其中此可动式光耦合器受到一磁场的辅助，以一特定的方向面向一应接位置。

图8系描述一产生一单股环状目标核酸的示范方法。

图9系一示范可动式光耦合器的示意图，其中上述可动式光耦合器的表面上具有一核酸合成反应的复合物。

图10系一示范可动式光耦合器的示意图，其中上述可动式光耦合器的表面上具有一核酸合成反应的复合物。

图11系一示范可动式光耦合器的示意图，其中上述可动式光耦合器的表面上具有一核酸合成反应的复合物。

图12系描述一产生一双链环状目标核酸的示范方法。

图13系提供一在一可动式光耦合器上之变性的双链环状目标核酸之示意图。

图14系一示范侦测系统结构的示意图，此侦测系统的结构系用于仿真由入射的激发光波产生之稳态电磁场。

图15系一仿真的侦测系统之运算的稳态横向电场模态(TE模态)电场之等高线图。

图16系一仿真的侦测系统之运算的稳态横向磁场模态(TM模态)电场之等高线图。

图17系一仿真的侦测系统之运算的稳态磁场之等高线图。

图18A、B、C系一稳态电磁场之等高线图，其中在侦测系统结构中之上述稳态电磁场系由入射的激发光波所产生，且在侦测系统结构中，纳米井不会分别延伸进入核心层、部分延伸进入核心层、以及完全延伸穿过核心层。

图19系一示范侦测系统结构的示意图，此侦测系统的结构系用于仿真由入射的激发光波产生之稳态电磁场。

图20系一仿真的侦测系统之运算的稳态电场之等高线图。

图21系一仿真的侦测系统之运算的稳态电场之等高线图。

图22系一仿真的侦测系统之运算的稳态电场之等高线图。

实施方式

本发明接下来将会提供许多不同的实施例以实施本发明中不同的特征。各特定实施例中的组成及配置将会在以下作描述以简化本发明。这些为实施例并非用于限定本发明。此外，一第一组件形成于一第二组件“上方”、“之上”、“下方”或“之下”可包含实施例中的第一组件与第二组件直接接触，或也可包含第一组件与第二组件之间更有其它额外组件使第一组件与第二组件无直接接触。各种组件可能以任意不同比例显示以使图示清晰简洁。此外，在本发明各种不同的范例中，为了简化与清晰的目的，将重复地使用组件符号及字母，然而其本身并不决定各种实施例及/或结构配置之间的关系。

本发明实施例包括一侦测系统及使用此侦测系统来侦测一如单分子目标物的目标物的方法。上述侦测系统可以侦测自目标物发射出来的微弱光线。

为了完成单分子侦测，光学系统必须可以选择性地激发在复杂环境中所关注的重要分子，并且能够避免背景噪声的干扰，以及侦测自此单分子发射出来了微弱光线。为了完成单分子侦测，在一实施例中，系统至少需具备以下两个条件：1)兼具固定的激发空间(excitation space)以及固定的观测空间observation space)；2)上述固定的激发空间及固定的观测空间应该完全或部份重叠，且该重叠的区域应该够小到足以确保自目标单分子发射出来的光线高于背景值，以产生可检测出来的信号噪声比(signal-to-noise ratio,SNR)。例如，重叠区域的体积通常必须接近或小于千万分之一升(femtoliter)。尤其是，重叠区域的体积通常必须在10的-18次方公升(attoliter)至10的-21次方公升(zeptoliter)的范围之间。此外，防止激发光到达侦测器也是很重要的。

本发明实施例利用一可动式光耦合器来携带一单分子样本至一应接位置，克服了加载一单分子样本至一侦测系统上的困难，其中上述应接位置系用来使可动式光耦合器形成于导波器中。适合单分子侦测之固定的空间可形成于可动式光耦合器靠接(docks)在应接位置之后。可动式光耦合器及应接位置的设计，可防止第二耦合器靠接至同一个应接位置。在一实施例中，在将耦合器引导至导波器之前，如酶等的单分子样本，可被定位至耦合器，且在一实施例中，可预先筛选(pre-screened)全部或一个承载之耦合器的样本，以确保每一个耦合器只携带一个样本分子。由于样本分子可与光耦合器维持在一起，藉由移除及抛弃光耦合器，即可重复使用上述装置。由于耦合器携带着样本分子，所以不需要为了直接将样本分子连结至导波器的表面而修饰其表面，因此简化了装置的制造。

本发明提供一侦测一单分子目标物的系统，其中上述侦测系统包括一可动式光耦合器(movable light coupler)、一光侦测器、以及一导波器(waveguide)，上述导波器包括一核心层(core layer)、一第一被覆层(firstcladding layer)、以及至少一应接位置(adapter site)用于上述可动式光耦合器，此可动式光耦合器形成于至少上述第一被覆层中。在一些实施例中，上述侦测器包括一光源。

在一些实施例中，上述可动式光耦合器能够将一目标物定位于至少一应接位置，上述应接位置至少形成于导波器的第一被覆层中，从而将目标物定位，以便在固定的激发空间及固定的观测空间之重叠的空间内侦测目标物，亦即，适用于单分子侦测的固定空间乃藉由将一可动式光耦合器靠接至一应接位置所形成。在一些实施例中，可动式光耦合器的应接位置为一纳米井(nanowell)。在一些实施例中，可动式光耦合器为纳米级粒子。在一些实施例中，可动式光耦合器为一纳米级球体。

如本说明书中所采用的用语”固定的激发空间”、”激发空间”、以及”激发区(excitation zone)”皆表示一空间，在此空间中激发荧光基团(fluorophore)或其它发光的目标物，并且当其进入此空间时即会发射出光线。

如本说明书中所采用的用语”观测空间”以及”固定观测空间”代表一空间，在此空间中，可利用侦测器侦测由定位在此空间中的荧光基团或其它发光的目标物所发射出来的光线。

如本说明书中所采用之”适用于单分子侦测的固定空间”，系用于表示一空间，在此空间中激发空间与观测空间重叠。当一单分子发光的目标物定位于此重叠的空间中时，可利用侦测器侦测此目标物。

如本说明书中所采用之”可动式光耦合器”，意指一可动式的目标物，其可改变激发光的行为，包括：例如，光的强度场分布(intensity field distribution)的形状、光行径的方向、光的波长。

如本说明书中所采用之”应接位置”，意指一能够容纳可动式光耦合器的空间。

如本说明书中所采用之”靠接(docking)”，系关于一可动式光耦合器及一应接位置，意指一可动式光耦合器放入一应接位置，从而促进适用于单分子侦测的固定空间之形成。

在一些实施例中，激发光无法穿透可动式光耦合器，因此适用于单分子侦测的固定空间是由可动式光耦合器所形成，阻挡了来自导波器的激发光使其不会散播至整体空间。在一些实施例中，可动式光耦合器具有一表面，其能够反射激发光，因此适用于单分子侦测的固定空间形成于可动式光耦合器将激发光反射回导波器的区域。

在一些实施例中，激发光可穿透或部分穿透可动式光耦合器，以及在至少形成于导波器的第一被覆层中的应接位置设置可动式光耦合器，可使激发区自一沿着导波器之核心层传播并且与可动式光耦合器耦合的光波，形成于可动式光耦合器的表面周围，其中适用于单分子侦测的固定空间形成于可动式光耦合器与应接位置之间。在一些实施例中，选择可动式光耦合器的折射率(refraction index)以加强光耦合的层级。在一些实施例中，激发光可穿透或部分穿透可动式光耦合器，以及在至少形成于导波器的第一被覆层中的应接位置设置可动式光耦合器，可使激发区自一沿着导波器之核心层传播并且与可动式光耦合器耦合的光波，形成于可动式光耦合器的表面周围，因此产生一围绕着可动式光耦合器的表面之适用于单分子侦测的固定空间。

在一些实施例中，可动式光耦合器能够吸收来自导波器的第一激发光，然后发射出第二激发光。

本发明提供了一种单分子目标物的侦测方法，包括下列步骤：a)将一入射光自一光源引导进入一导波器，进而在导波器中形成一激发光；b)将一单分子目标物定位于一可动式光耦合器的表面上；c)将(b)之可动式光耦合器定位于一应接位置，好让一可动式光耦合器形成于至少一导波器的第一被覆层中；以及d)藉由激发光来激发被定位于可动式光耦合器上之单分子目标物，使单分子目标物发射出一光线以被一光侦测器侦测。在一些实施例中，为了让一可动式光耦合器形成于至少一导波器的第一被覆层中，可动式光耦合器定位于应接位置以形成一适用于单分子侦测的固定空间。

在一些实施例中，单分子目标物的侦测方法，包括：将光耦合器以一特定的方向定位(located)于应接位置。在一些实施例中，上述方法包括：藉由一磁场，将光耦合器以一特定的方向定位(located)于应接位置。在进一步的实施例中，藉由施予一横跨应接位置的电位(electric potential)，将光耦合器以一特定的方向定位(located)于应接位置。在一些实施例中，藉由将一或多个在一光耦合器转切器位置的表面修饰的引入，将光耦合器以一特定的方向定位(located)于应接位置，其中应接位置会吸引或排斥光耦合器的表面。

本发明提供一种一单分子目标物的侦测方法，包括下列步骤：a)提供一侦测装置，包括：i)一可动式光耦合器；ii)一导波器，包括：一核心层；以及一第一被覆层，其中至少一可动式光耦合器之应接位置至少形成于第一被覆层中；以及iii)一光侦测器；b)提供至少一结合部分，其能够与一单分子目标物结合；c)将至少一结合部分个别地定位于可动式光耦合器上；d)提供一单分子目标物分子给一定位于可动式光耦合器上的结合部分；e)将可动式光耦合器定位于应接位置，其中至少一结合部分及单分子目标物位于可动式光耦合器上；f)将一入射光自一光源引导进入导波器，从而形成一激发光于导波器中；g)藉由激发光来激发单分子目标物分子，其中单分子目标物分子结合至至少一定位于可动式光耦合器上的结合部分，使得单分子目标物发射出一光线以被一光侦测器侦测。在一些实施例中，将可动式光耦合器定位于应接位置，其中至少一结合部分与单分子目标物定位于光耦合器上，产生一适用于单分子侦测的固定空间，其中欲侦测的单分子目标物定位于此固定空间中。

本发明提供一种一核酸的测序方法，包括下列步骤：a)提供一侦测装置，包括：i)一可动式光耦合器；ii)一导波器，包括：一核心层；以及一第一被覆层，其中至少一可动式光耦合器之应接位置至少形成于第一被覆层中；以及iii)一光侦测器；b)提供至少一核酸分子；c)将至少一核酸分子个别地定位于可动式光耦合器上；d)将可动式光耦合器定位于应接位置处，其中至少一核酸位于可动式光耦合器上；e)进行至少一核酸分子的单分子合成测序，其中单分子核酸的合成测序导致产生一发射光，上述发射光与至少一核酸中的碱基之特性有关；f)利用侦测器侦测发射光，产生一输出讯号；以及g)处理输出讯号以决定至少一核酸所包含的碱基之特性。

侦测系统可作为系统的一部分，用于生物分子侦测的方法或过程，生物分子侦测包括：核酸杂交(nucleic acid hybridization)，或例如全基因组测序(whole-genome sequencing)、转录概况分析(transcriptional profiling)、比较性转录概况分析(comparative transcriptional profiling)、或基因鉴定(geneidentification)等的测序。

下文中，将配合图示详细地描述实施例。在整个图式中任何可能的地方，相似之组件系使用相同之组件符号。

1.侦测系统

此处所描述的侦测系统可侦测一目标物，如一单分子目标物。上述目标物可为一冷光源(source of luminescence)，例如一荧光染料分子(fluorescentdye molecule)、一磷光染料分子(phosphorescent dye molecule)、一量子点(quantum dot)、或一发光的纳米粒子(light-emitting nanoparticle)。上述目标物亦可为一光散射(light-scattering)粒子。此外，上述目标物可为一没有发光能力的目标分子(target molecule)，但其可黏附至一标记对象(labeling object)。因此，可藉由标记对象来辨识目标分子。不只一个标记对象可黏附至一目标分子。上述目标物可为一目标分子，其不具有发光能力，且黏附至多个能够相继依序发光的标记对象。(例如荧光共振能量转移(Fluorescence resonanceenergy transfer,FRET)，其中第一波长的光自至少一第一受激发的荧光分子发射出来，且至少部分被一第二荧光分子吸收，此第二荧光分子转而发射出一第二光线，亦即第二波长的发射光)。

1.1 侦测系统概述

侦测系统可包括一可动式光耦合器、一侦测器、以及一导波器，其中导波器包括一可动式光耦合器的应接位置。

侦测系统可更包括至少一能够发射光线的光源，然后上述光线被至少部分合并进入导波器中，作为激发光以激发目标物。光源可为，例如：如氦氖激光(He-Ne laser)等的激光，以及激光二极管(laser diode,LD)、发光二极管(light emitting diode,LED)、有机发光二极管(organic light emitting diode,OLED)、量子点发光二极管(quantum dot light emitting diode,QLED)、光纤(fiber light)、或弧光放电荧光灯(arc discharge fluorescent lamp)。侦测系统可包括一光源耦合器。上述光源耦合器可将至少部分自至少一光源发射出来的光合并进入导波器中。上述光源耦合器可为，例如棱镜耦合器(prism coupler)、光栅耦合器(grating coupler)、侧向注入耦合器(side-injection coupler)、垂直注入耦合器(vertical-injection coupler)、或同向耦合器(co-directional coupler)。

导波器可为沟道波导(channel waveguide)或平面波导(planar waveguide)。导波器可包括一核心层以及至少一被覆层。例如，如果导波器为沟道波导，其可包括一核心层以及一围绕着核心层的被覆层。另举一个范例，若导波器为平面波导，其可包括一核心层以及一配置在核心层上的被覆层，或核心层夹在两个被覆层中间。核心层可具有比至少一被覆层更高的折射率。激发光可在导波器的核心层中传播。提供一描述于美国专利(U.S.Patent ApplicationNo.12/720,352，申请日March 9,2010；U.S.Patent Application No.12/801,503，申请日June 11,2010；以及U.S.Patent Application No.12/805,411，申请日July29,2010)中之适用于侦测系统中的导波器及其特征，其中参考各个上述完整的美国专利以并入本发明中。

侦测系统可包括一导波器，其包括至少一可动式光耦合器的应接位置。应接位置可至少形成于上述至少一导波器的的被覆层中。应接位置可为一包含一上部开口及一底面的纳米井，其中的上部开口可比底面大。上述纳米井可延伸穿过部份之上述至少一被覆层的厚度、上述至少一被覆层全部厚度、上述至少一被覆层的全部厚度与上述核心层的部分厚度、上述至少一被覆层的全部厚度与上述核心层全部厚度。有效的激发区之下部边界可为纳米井的底部。在纳米井应接位置中，可由垂直于纵向之核心层的方向(亦即在下文中所述之垂直方向)之激发光所能够到达的距离，来定义有效的激发区之上部边界。

本发明之侦测系统的实施例，包括一可动式光耦合器，其可将一单分子目标物定位于至少一导波器的应接位置。可动式光耦合器可为一纳米级粒子。上述可动式光耦合器可为一纳米级球体或一非球形的纳米级粒子。当一可动式光耦合器靠接(docks)在导波器中的应接位置后，即可形成适用于单分子侦测之固定的激发空间(有效的激发空间)，且上述待测的目标物可定位于此固定空间中。当一可动式光耦合器靠接于应接位置时，其可防止第二个可动式光耦合器靠接于相同的应接位置。

上述可动式光耦合器可包括至少一性质，藉由此性质，上述光耦合器可粘附至应接位置，包括：例如表面性质或磁性，以加速靠接。在一些实施例中，上述光耦合器包括至少一性质，其可包括不对秤的表面性质，藉由此适当的性质，上述光耦合器可以一特定方向定位于上述至少一应接位置。在一些实施例中，光耦合器可于应接位置中，将一单分子目标物定位于一邻近导波器的核心层之表面的固定空间中，其中一目标物被定位于一有效的激发区中，上述有效的激发区自一受到光波激发并沿着导波器的核心层传播的光场，形成于应接位置中。

导波器的核心层可具有较上述至少导波器之第一被覆层更高的折射率。在一些实施例中，可动式光耦合器系由一材料所组成，上述材料的折射率大体上与环境溶液或上述至少导波器之第一被覆层之材料的折射率近似。在进一步的实施例中，可动式光耦合器系由一材料所组成，其折射率大于上述至少导波器之第一被覆层之材料的折射率。在一些实施例中，可动式光耦合器系由一材料所组成，其折射率大体上与导波器之核心层的折射率近似或相等。在一些实施例中，可动式光耦合器能够与一受到沿着核心层传波之光波激发的衰减光场(evanescent light field)耦合，藉此可围绕着光耦合器的表面形成一有效的激发区。

一些实施例中，可动式光耦合器不透光且可将激发光局限于其表面，因此藉由上述可动式光耦合器阻挡来自导波器的激发光散播至整体空间，来形成上述适用于单分子侦测的固定空间。在一些实施例中，可动式光耦合器会反射光线。在一些实施例中，可动式光耦合器会反射激发光。在一些实施例中，可动式光耦合器能够吸收由导波器发射出来的激发光，然后本身发射出可激发待测分子的光线。

侦测系统的导波器组件可包括复数个应接位置。因此，此系统亦可用于监测大量的目标物。

上述侦测系统可包括一侦测自目标物发射出来之光线的光侦测器。上述侦测器可包括一光学传感器(optical sensor)，其能够至少吸收部分于其上的入射光线，并产生对应此光线的输出讯号。上述光学传感器可为例如一p-n光电二极管、一p-i-n光电二极管、一多接面光电二极管(multi-junction)、雪崩光电二极管(avalanche photodiode,APD)、一光敏晶体管(phototransistor)、一量子井红外线光探测器(quantum-well infrared photodetector,QWIP)、光电导型光学传感器(photoconductive type optical sensor)、光电伏打型光学传感器(photovoltaic type optical sensor)、一在特殊应用集成电路(Application SpecificIntegrated Circuit,ASIC)上的薄膜(thin-film on ASIC,TFA)、一金属半导体金属(metal-semiconductor-metal,MSM)光探测器、电荷耦合装置(charge coupleddevice,CCD)、一互补式金氧半导体(ComplementaryMetal-Oxide-Semiconductor,CMOS)、或一上述之结合。

在一些实施例中，光侦测器包括控制光侦测器的运作之控制电路。控制电路可包括一讯号放大器(signal amplifier)的电路、模拟/数字信号转换器(A/D convertor)、积分器(integrator)、比较器(comparator)、逻辑电路(logiccircuit)、读出电路(readout circuit)、内存、微处理器(microprocessor)、时钟、及/或地址(address)。

光侦测器可配置于自目标物发射出来的光可到达的地方。例如，光侦测器可配置于核心层之相对于应接位置的对侧。也就是说，若应接位置以垂直方向配置于核心层的一侧上，光侦测器则以垂直方向配置于核心层的另一侧上。

图1系描述一本发明所提供之侦测系统的示意图。上述侦测系统可包括一可动式光耦合器100以及一集成组件(integrated component)，上述机体组件包括一平面导波器110、一侦测器102、以及一可动式光耦合器的应接位置104，藉由可动式光耦合器，应接位置可靠近(accessible)可动式光耦合器100及环绕的样本溶液120。导波器110可包括一核心层112、一上部被覆层114、以及一下部被覆层116。平面导波器110可形成于一基板上(未显示)。光侦测器102可形成于上述基板上或基板内。光源130可发射一光线135，藉由光源耦合器140，可将光线135至少部分合并进入平面导波器110。合并进入平面导波器110的光线可沿着平面导波器110的核心层传播，并作为激发光145。

图2的两个版面各系描述一本发明所提供之侦测系统的示意图。在一些实施例中，可动式光耦合器100系由一材料所组成，相较于核心层112的材料之反射率，上述材料的反射率与环境样本溶液120或上述导波器的至少第一被覆层114之反射率更相近。在这样的实施例中，自一光源(未显示)沿着导波器的核心层传播的光源，其在一应接位置内，可诱发一邻近核心层的表面的衰减光场，进而在应接位置的底部之固定空间中形成一有效的激发区150(左边版面)。在进一步的实施例中，可动式光耦合器系由一材料所组成，上述材料的反射率大于上述导波器的至少第一被覆层114之反射率，及/或大体上与导波器的核心层之反射率相似或相等。在这样的实施例中，在应接位置中的核心层表面附近，光耦合器可与一衰减光场耦合，此衰减光场受到一自一光源沿着导波器的核心层传播之光波的诱发(未显示)，进而在位于可动式光耦合器与导波器的核心层之间的固定空间中，形成一有效的激发区160，并围绕着光耦合器的表面(右边版面)。

1.2 侦测系统的组件

1.2.1导波器

如图1中所示，在一些实施例中，平面导波器110可包括一核心层112、一上部被覆层114、以及一下部被覆层116。核心层112可包括一具有反射率n₂的材料，例如：硅钛氧化物(silicon-titanium oxide,Si_xTi_1-xO₂，其中0<x<1)、氧化钛(titanium oxide)、氧化钽(tantalum oxide)、氧化铌(niobium oxide)、氧化铪(hafnium oxide)、氧化铝(aluminum oxide)、氧化锆(zirconium oxide)、氮化硅(silicon nitride)、氮化铝(silicon nitride)、氮化钛(titanium nitride)、聚碳酸酯(polycarbonate,PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)、或Su8。上部及下部的被覆层114和116可包括分别具有折射率n₃及n₄的材料。上部及下部的被覆层114和116的材料可相同或相异。适用于上部及下部的被覆层114和116的材料可包括，例如：氧化硅(silicon oxide)、氟化镁(magnesium fluoride)、氟化钙(calcium fluoride)、氧化铝、Su8、PMMA、或聚碳酸酯。核心层的折射率n₂可大于上部及下部的被覆层114和116之折射率n₃及n₄。

以单分子侦测而言，必须避免激发光到达侦测器。在平面导波器中，核心层的表面可能不如预期中的平滑。核心层粗糙的表面可散射一部分的激发光。据估计，核心层的表面粗糙度约0.3nm，约0.01%的激发光会被散射并产生噪声。为了降低来自在核心层中传播的激发光之表面散射的噪声，可在导波器与侦测器之间增加一激发光滤光片，以降低到达侦测器之经散射的激发光的量。在一些实施例中，滤光片为一多层干涉滤光片(multilayerinterference filter)。在一些实施例中，滤光片系由可吸收激发光的材料所构成的膜层。

在一些实施例中，侦测系统中可包括保护层(protection layer(s))，以吸收经散射的激发光，及/或阻挡来自侦测系统外的环境光线(ambient light)，以便增加信号噪声比(signal-to-noise,S/N)，如美国专利(US Application Serial Number12/801,503，申请日June 11,2010,and in U.S.Patent Application No.12/805,411，申请日July 29,2010)所述。保护层可形成于上部被覆层之上，及/或下部保护层可形成于下部被覆层之下。在一些实施例中，保护层系由一不透明的材料所组成，例如金属或合金。在一些实施例中，一针孔可形成于下部保护层中，此针孔位于应接位置的下方。在应接位置中之有效的激发区内，自一目标物发射出来的光线可穿过上述针孔，并且被位于下部保护层下方的光侦射器侦测。

1.2.2应接位置

如图1与图2中所示，至少一可动式光耦合器应接位置104可形成于至少导波器的上部被覆层114中。应接位置可为一纳米井。上述纳米井的上部开口可比纳米井的底面大。纳米井的形状没有一定。例如，纳米井的横截面可为环形、椭圆形、矩形、正方形、或菱形。纳米井应接位置之底部的尺寸大小亦未受到限制。例如，纳米井的底部可约小于激发光的波长。在一些实施例中，纳米井的底部可小于约激发光波长的二分之一、四分之一、或八分之一。此处所述之”尺寸大小”系指直径、长轴的长度、或长边的长度。若纳米井的横截面为正方形或菱形，”尺寸大小”可表示边长。在一实施例中，纳米井之上部开口的长度(亦即所谓的直径、长轴的长度、或长边的长度)可为约1μm至约10μm，以及纳米井的底部的直径可为约10nm至约500nm，纳米井的侧壁与垂直纳米井的底部的方向之间所形成的夹角小于约60度。上述这样的结构可确保只有单一可动式光耦合器能够进入邻近纳米井的底部之区域。

部分的激发光可进入应接位置104，且可随着应接位置104的空间限制，在应接位置的至少一部分形成一有效的激发区105，如图1与图2中所示。可以了解的是，在图1中所使用的组件符号系显示出有效的激发区之上部的大概边界。当一目标物进入上述有效的激发区150，其可被激发光所激发，并且发射出光线以被侦测器102所侦测。在有效的激发区之外，目标物可能无法被激发光所激发，或其发射出来的光线无法到达光侦测器。可以了解的是，图1中的虚线并非用来限制有效的激发区之上部边界的形状。例如，有效的激发区之上部边界可为弯曲的形状。

依据不同的情况，例如在导波器中延伸之纳米井的位置及/或纳米井的深度，可形成不同之有效的激发区。此外，在有效的激发区中的电磁场可为，例如，一衰减场(evanescent field)、一衰减场与移动场(travelling fields)的混合、或一移动场，其详细描述如下。

图3的示意图显示不同纳米井应接位置设计的实施例，以作为范例。在一些实施例中，纳米井应接位置可延伸穿过部分之上部被覆层的厚度(版面A)。在一些实施例中，纳米井应接位置可延伸穿过上部被覆层的全部厚度(版面B)。对版面A或B中所示之纳米井而言，当激发光在核心层中传播时，虽然可能没有移动光场组件(travelling light field component)，部分在核心层中的移动光线可稍微渗透进入纳米井中。上述渗透进入纳米井中的光线，可能在垂直方向上以指数衰减，并形成一衰减场。此衰减场在纳米井的空间限制下，可形成一有效的激发区于至少部分之邻近核心层的纳米井中。

在一些实施例中，纳米井可延伸穿过上部被覆层的全部厚度，以及核心层的部分厚度(图3，版面C)。在一这样的实施例中，一移动场组件可出现于纳米井中，并且与一衰减场共同形成一有效的激发区于纳米井中。

在一些实施例中，纳米井可延伸穿过上部被覆层的全部厚度以及核心层的全部厚度(图3，版面D)。在一这样的实施例中，大多数之形成激发区的电磁场可为一移动场。

对一如图3版面B中所示之包括一纳米井的平面导波器而言，由于纳米井的底端位于核心层的上表面上，有效的激发区之容量可能与衰减场的有效激发区相等，且可利用下列方程式概略计算：

V=πx(D/2)²xh

其中D为纳米井底部的直径，而h为在纳米井中衰减场渗透的深度。例如，若D及h分别为100nm及100nm，有效的激发区之计算出来的容量大概为1x10^-18公升(1 attoliter)。

在一些实施例中，复数个应接位置可形成于导波器中。在一些实施例中，对各个复数个应接位置而言，可形成光侦测器，来侦测在应接位置之有效的激发区中，自一目标物发射出来的光线。在一些实施例中，一个光侦测器可用于侦测在复数个应接位置之有效的激发区中，自目标物发射出来的光线。

1.2.3 可动式光耦合器

实施例包括一可动式光耦合器，上述可动式光耦合器可能可以将一单分子目标物定位于一形成于至少一导波器之第一被覆层中的应接位置。上述可动式光耦合器可将至少一能够结合一待测之单分子目标物的结合部分定位于其表面上。结合部分可为一单分子或分子复合物(例如，一受体(receptor)、一抗体、一酶、一包含酶的反应复合物(reaction complex)等的多聚体复合物(multimeric complex))，其能够与目标物结合。待测之单分子目标物可结合至上述定位于可动式光耦合器之表面上的结合部分，且此可动式光耦合器系位于应接位置，进而透过此结合部分及光耦合器，将目标物定位在一用于有效的讯号之激发及观测的固定空间中。可动式光耦合器只可具有一个定位于其表面上的结合部分，这样一来，若侦测到单分子目标物结合至表面定位的结合部分(surface-localized binding moiety)，在任合指定时间之侦测到的目标物数量可能不会大于可同时结合至结合部分之目标物数量。因此，一个结合部分一次只与一个目标物结合，侦测系统可侦测一结合至上述结合部分的单分子目标物，此结合部分定位于可动式光耦合器的表面上。

所使用之一个”定位”于可动式光耦合器的表面上之目标物，其包括一非经专一性吸收的目标物于可动式光耦合器之表面上，以及包括一透过一或多个共价键或透过非共价的交互作用，而被系留(tethered)至可动式光耦合器之表面目标物。

在一些实施例中，可动式光耦合器为一纳米级粒子。在一些实施例中，光耦合器为一纳米级球体。上述纳米级球体的直径可从约40nm至1000nm，或从1/10至两倍的激发光之波长。纳米级球体的尺寸大小可根据光侦测器的尺寸大小来决定。例如，可选择单一光侦测器仅能够侦测来自单一球体发射出来的光线之纳米级球体。在一些实施例中，选择纳米级球体的尺寸大小以其应接位置的形状，使纳米级球体可配置于应接位置，其中纳米级球体位于自应接位置的底面起算约10nm至200nm之间的距离。在进一步的实施例中，纳米级粒子为一条状(bar-like)粒子。可动式光耦合器粒子的”长度”指的是自在光耦合器最宽处之光耦合器的一端至另一对面端的距离。例如，球形的光耦合器对应其直径，以及条状粒子的长度系对应条状粒子最远的两端之间的距离。

可动式光耦合器可为一均质(homogenous)固体、一胶质(colloidal)固体或多孔固体、或一由具有聚合物骨架之材料所构成的固体。在一些实施例中，多功能可动式光耦合器包括一或多个金属材料，包括：例如金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、铂(Pt)、镍(Ni)、铬(Cr)、或金属合金。在一些实施例中，光耦合器包括一或多个氧化物材料，包括：例如TiO₂、Ta₂O₅、Nb₂O₅、SiO₂、HfO₂、Al₂O₃、ZrO₂、ZnO、V₂O₅、CeO₂、CdO、Fe₂O₃、Fe₃O₄、Cu₂O、CuO、In₂O₃、La₂O₃、MoO₃、或WO₃。在进一步的实施例中，光耦合器包括一或多个硫化物材料，包括：例如CdS、ZnS、PbS、Au₂S、或Ag₂S。在一些实施例中，光耦合器包括一或多个硒化物材料，包括：例如CdSe、ZnSe、或PbSe。在一些实施例中，光耦合器包括一或多个氮化物材料，包括：例如Si₃N₄、TiN、BN、及GaN。在进一步的实施例中，光耦合器包括一或多个氮化物材料，包括：例如聚苯乙烯(polystyrene)、聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)、聚磷腈(polyphosphazene)、聚丙交酯(polylactide)、丙交酯-共-乙交酯(polylactide-co-glycolide)、聚己酸内酯(polycaprolactone)、多元酸酐(polyanhydride)、聚马来酸(polymaleic acid)及其衍生物、聚氰基丙烯酸烷酯(polyalkylcyanoacrylate)、聚酸酐氧基异丁酸(polyanhydride oxybutyrate)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚原碳酸(polyorthoester)、聚乙二醇(polyethyleneglycol)、多聚左璇赖氨酸(poly-L-lysine)、聚乙醇酸交酯(polyglycolide)、聚甲基异丁烯酸酯(polymethylmethacrylate)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、或上述之共聚物。

在一些实施例中，可动式光耦合器具有一核壳纳米结构(core-shellnanostructur)。上述核心材料可包括一或多个金属材料，包括：例如金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、铂(Pt)、镍(Ni)、铬(Cr)、或一金属合金。在一些实施例中，上述核心材料包括一或多个氧化物材料，包括：例如TiO₂、Ta₂O₅、Nb₂O₅、SiO₂、HfO₂、Al₂O₃、ZrO₂、ZnO、V₂O₅、CeO₂、CdO、Fe₂O₃、Fe₃O₄、Cu2O、CuO、In₂O₃、La₂O₃、MoO₃、或WO₃。在一些实施例中，上述核心材料包括一或多个硫化物材料，包括：例如CdS、ZnS、PbS、Au₂S、或Ag₂S。在进一步的实施例中，上述核心材料包括一或多个硒化物材料，包括：例如CdSe、ZnSe、或PbSe。在一些实施例中，上述核心材料包括一或多个氮化物材料，包括：例如SiN或GaN。在进一步的实施例中，上述核心材料包括一或多个氮化物材料，包括：例如聚苯乙烯(polystyrene)、聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)、聚磷腈(polyphosphazene)、聚丙交酯(polylactide)、丙交酯-共-乙交酯(polylactide-co-glycolide)、聚己酸内酯(polycaprolactone)、多元酸酐(polyanhydride)、聚马来酸(polymaleic acid)及其衍生物、聚氰基丙烯酸烷酯(polyalkylcyanoacrylate)、聚酸酐氧基异丁酸(polyanhydride oxybutyrate)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚原碳酸(polyorthoester)、聚乙二醇(polyethyleneglycol)、多聚左璇赖氨酸(poly-L-lysine)、聚乙醇酸交酯(polyglycolide)、聚甲基异丁烯酸酯(polymethylmethacrylate)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、或上述之共聚物。

上述核壳纳米结构光耦核器的外壳可包括一或多个金属材料，包括：例如金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、铂(Pt)、镍(Ni)、铬(Cr)、或一金属合金。在一些实施例中，上述外壳材料包括一或多个氧化物材料，包括：例如TiO₂、Ta₂O₅、Nb₂O₅、SiO₂、HfO₂、Al₂O₃、ZrO₂、ZnO、V₂O₅、CeO₂、CdO、Fe₂O₃、Fe₃O₄、Cu₂O、CuO、In₂O₃、La₂O₃、MoO₃、或WO₃。在一些实施例中，上述外壳材料包括一或多个硫化物材料，包括：例如CdS、ZnS、PbS、Au₂S、或Ag₂S。在进一步的实施例中，上述外壳材料包括一或多个硒化物材料，包括：例如CdSe、ZnSe、或PbSe。在一些实施例中，上述外壳材料包括一或多个氮化物材料，包括：例如SiN或GaN。在进一步的实施例中，上述外壳材料包括一或多个氮化物材料，包括：例如聚苯乙烯(polystyrene)、聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)、聚磷腈(polyphosphazene)、聚丙交酯(polylactide)、丙交酯-共-乙交酯(polylactide-co-glycolide)、聚己酸内酯(polycaprolactone)、多元酸酐(polyanhydride)、聚马来酸(polymaleic acid)及其衍生物、聚氰基丙烯酸烷酯(polyalkylcyanoacrylate)、聚酸酐氧基异丁酸(polyanhydrideoxybutyrate)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚原碳酸(polyorthoester)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、多聚左璇赖氨酸(poly-L-lysine)、聚乙醇酸交酯(polyglycolide)、聚甲基异丁烯酸酯(polymethylmethacrylate)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、或上述之共聚物。

在一些实施例中，可动式光耦合器系由一材料所构成，与导波器之核心层的材料之折射率相比，上述材料的折射率更接近导波器之第一被覆层的材料之折射率。在一些实施例中，可动式光耦合器系由一材料所构成，与导波器之核心层的材料之折射率相比，上述材料的折射率更接近周围的样本溶液之折射率。在一些实施例中，可动式光耦合器系由一材料所构成，上述材料的折射率介于导波器之第一被覆层的材料之折射率与导波器之核心层的材料之折射率之间。在进一步的实施例中，可动式光耦合器系由一材料所构成，上述材料的折射率大体上与导波器之核心层的材料之折射率相似。在一些实施例中，可动式光耦合器系由一材料所构成，上述材料的折射率与核心层的材料之折射率相等。

在一些实施例中，可动式光耦合器系由折射率为1.487的SiO₂所构成。在一些实施例中，可动式光耦合器系由折射率为1.59的聚苯乙烯所构成。在进一步的实施例中，可动式光耦合器系由折射率为2.0的TiO₂所构成。在一些实施例中，可动式光耦合器系由折射率为2.4的Fe₃O₄所构成。在另一些实施例中，可动式光耦合器系由折射率为2.26的Ta₂O₅所构成。

在一些实施例中，可动式光耦合器具有一核壳结构，其中上述外壳材料系折射率等于1.28的金(Au)。在一些实施例中，可动式光耦合器具有一核壳结构，其中上述外壳材料系折射率等于0.135的银(Ag)。在进一步的实施例中，可动式光耦合器具有一核壳结构，其中上述外壳材料系折射率等于1.9的铂(Pt)。在一些实施例中，可动式光耦合器具有一核壳结构，其中上述外壳材料系折射率等于0.714的铝(Al)。在另一些实施例中，可动式光耦合器具有一核壳结构，其中上述外壳材料系折射率等于1.86的钴(Co)。在一些实施例中，可动式光耦合器具有一核壳结构，其中上述外壳材料系折射率等于1.66的镍(Ni)。

在一些实施例中，可动式光耦合器具有一适当的尺寸大小及反射率，上述反射率与导波器之核心层的材料之反射率十分地相似，以便当光耦合器被置于导波器中的应接位置时，使光耦合器能够与来自一导波器的光线耦合。在这类的实施例中，受激发的光场可围绕着可动式光耦合器的表面形成，进而围绕着光耦合器形成一有效的激发区，其中在光耦合器的表面之一特定距离内，可激发一分子以发射出荧光。

可藉由调整在周围环境中的光学导波器之电场、藉由选择适当的特征(例如材料的组成、形状、以及尺寸大小)、以及藉由配置应接位置的形状，来控制围绕着可动式光耦合器的表面诱导之激发光场的强度。在实施例中，可动式光耦合器系为一球体，在光耦合器的表面之激发光场的强度可运用下列公式来计算：

$P=1-\frac{\left(\frac{I_{\max }}{I_i}\right)}{1+{\left(\frac{23}{\mathrm{\&pi;}}\right)}^2{\sin }^2\left(\frac{\mathrm{\&theta;}}{2}\right)}$ (公式1)，

其中P为激发光场在球体表面的光功率，

(Finesse)由下列公式决定：

r  由下列公式决定：

$r=\sqrt{(1-\mathrm{\&kappa;})\exp (-\mathrm{\&pi;R}{\mathrm{\&alpha;}}_{\mathrm{ring}})},$

Imax/Ii由下列公式决定：

$\frac{I_{\max }}{I_i}=\frac{\mathrm{\&kappa;}[1-\exp (-2\mathrm{\&pi;R}{\mathrm{\&alpha;}}_{\mathrm{ring}})]}{{[1-\sqrt{(1-\mathrm{\&kappa;})\exp (-\mathrm{\&pi;R}{\mathrm{\&alpha;}}_{\mathrm{ring}})}]}^2},$

θ由下列公式决定：

θ＝N_ringk₀2πR，以及

其中R为上述球体之曲率(curvature)的半径，α_ring为球体的模态功率衰减系数(mode power decay coefficient)，N_ring为球体的平衡折射率(equilibriumrefractive index)，κ为功率耦合系数(power coupling coefficient)，以及k₀=2π/λ₀中的λ₀系自由空间波长(free-space wavelength)。在共振情况下，其中光能将会完全转移进入球状的光耦合器，N_ring k₀2πR=2mπ，其中m为一整数，κ=1-exp(-2πR₁α_ring)，其中R₁为外弯曲半径，且P=1。”临界耦合(criticalcoupling)”一辞用于此处以描述这个共振情况。

在一些实施例中，当光耦合器在一特定的范围内被某些分子围绕时，会改变光耦合器的光学性质。在一些实施例中，当光耦合器在一特定的范围内被某些分子围绕时，改变的上述光学性质为折射率、光吸收能力、被耦合器吸收的光的波长、或传播穿过光耦合器之光线的方向。

在一些实施例中，修饰一或多个可动式光耦合器之表面的区域。例如，可修饰纳米级球体之光耦合器的整个表面。表面修饰(Surface modification)有别于具有核壳结构之光耦合器的外壳材料，亦即，包含表面修饰的核壳光耦合器具有外壳材料之外表面的修饰。在进一步的实施例中，可修饰纳米级球体的光耦合器之一半球的表面，然而其余剩下的半球未经修饰。可藉由化学修饰技术(chemical modification techniques)，利用一或多个非均质(heterogeneous)的材料，在整个光耦合器的表面上，或至少一部分之光耦合器的表面上涂层。表面修饰可能有助于将可动式光耦合器定位于应接位置。不对称的表面修饰(Asymmetric surface modification)，例如，仅在一表面上进行修饰，或在相反的表面上进行不同的修饰，可能有助于将可动式光耦合器以一特定的方向定位于应接位置。表面修饰亦可能有助于将单分子目标物定位于光耦合器的表面之一特别的区域，藉由将这样的区域定向至面对导波器的核心层，进而在导波器的核心层附近，将此目标物以及任何与此目标物相关的反应，定位于一介于可动式光耦合器与应接位置的表面之间的固定空间。本发明的实施例提供如图4中所示之一侦测系统的示意图，上述侦测系统包括一纳米级球体光耦合器粒子，其中利用寡核苷酸引物(oligonucleotideprimers)修饰上述粒子于一半球上。利用一寡核苷酸引物，其中上述核苷酸引物能够与镶嵌在一DNA合成反应复合物200之复制的DNA链中的序列杂交，来修饰纳米级球体光耦合器100于其一半的表面上。利用经寡核苷酸修饰之光耦合器的表面，其中上述表面系面向导波器的核心层，光耦合器100于应接位置104的配置，在纳米井应接位置的底部，将反应复合物200定位于固定空间170中。

在一些实施例中，一或多个可动式光耦合器之表面区域的修饰为化学修饰。在一些实施例中，化学修饰为官能基团与光耦合器的表面之共价键结。一共价键结的官能基团(covalently-linked functional group)可为疏水性基团(hydrophobic group)或亲水性基团(hydrophilic group)。合适的疏水性基团包括：例如–Cx(H₂)_xCH₃、-C₆H₅、环氧基、–Si(C_xH_x+1)₂(衍生自具有化学式H₃-Si(C_xH_x+1)₂的化合物，如N-辛基硅烷(N-octylsilane))、-O-Si(C_xH_x+1)₂(衍生自具有化学式R₃-O-Si(C_xH_x+1)₂的化合物，如三甲氧基(辛基)硅烷(trimethoxy(octyl)silane))等等。在一些实施例中，光耦合器为一均质的固体粒子，其系由一金属材料所组成，或为一包含金属的外壳材料之核壳粒子，且疏水性基团透过硫、胺、羰基(carboxyl)、或硫酸根键结，与金属材料进行共价键结。在一些实施例中，光耦合器为一包含金属氧化物或SiO₂之材料的均质固体粒子，或为一包括金属氧化物或SiO₂之材料的核壳粒子，且疏水基团R以-Si-R基团与金属氧化物或SiO₂之材料的氧原子进行共价键结。在一些实施例中，共价键结的官能基团为一亲水性基团，包括：例如-NH₂、-OH、-CO₂H、-OSO₃H。例如，在一些实施例中，光耦合器为一由金属氧化物或SiO₂之材料所组成的均质固体粒子，或为一包含金属氧化物或SiO₂的核壳粒子，且-OH基团与金属氧化物或SiO₂材料进行共价键结。合适的亲水性基团包括带电基团(charged groups)，包括：例如正电基团，如-NH₃ ⁺，或负电基团，如–CO₂ ^-或–OSO₃ ^-。在一些实施例中，共价键结的官能基团为一磁性官能基团(magnetic functional group)。合适的磁性官能基团包括：例如–Fe₃O₄、–Fe₂O₃,、–FePt、–FeNi、–FeCo、–Mg、–Co、-Ni等等。在一些实施例中，共价键结的官能基团为一荧光官能基团。合适的荧光官能基团包括：例如分子的染料，如–FITC、若单明6G(-Rhodamine 6G，–Rh6G)、–Cy3、以及–Cy5，等等，以及纳米粒子/量子点，如–CdSe、–ZnS、-PbS、-PbSe等等。在一些实施例中，利用生物素(biotin)、链霉抗生素蛋白(streptavidin)、抗生素蛋白(avidin)等等，对可动式光耦合器的一表面进行修饰。

在进一步的实施例中，化学修饰为一非共价修饰。非共价修饰可为具有聚合物材料的涂层。在一些实施例中，例如，光耦合器为一由金属材料所组成之均质的固体粒子，或为一包含金属的外壳材料之核壳粒子，以及利用如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)等的亲水性聚合物对一光耦合器的表面进行涂层。

在一些实施例中，仅有一可动式光耦合器的表面区域被修饰，而其余剩下之可动式光耦合器的表面区域则未经修饰。在一些实施例中，可动式光耦合器的表面之经修饰的区域占可动式光耦合器之表面的约10%至90%。用来描述这类实施例中的”占可动式光耦合器之表面的约10%至90%”系为了表示可动式光耦合器的表面之经修饰的区域可为自略小于可动式光耦合器之表面的10%至略大于可动式光耦合器之表面的90%之间的任何值。在进一步的实施例中，可动式光耦合器的表面之经修饰的区域略小于可动式光耦合器之表面的10%。在另一个进一步的实施例中，可动式光耦合器的表面之经修饰的区域略大于可动式光耦合器之表面的90%。

在一些实施例中，对可动式光耦合器的表面之两个区域进行修饰，如图5A中所示。在一些实施例中，光耦合器包括利用官能基团或具有相反性质(opposing properties)的涂层来进行表面修饰的两个区域。例如，一光耦合器的表面被修饰以具有一疏水性的表面特性。在进一步的实施例中，利用正电基团对光耦合器的一表面进行修饰，然而利用负电基团对相反的表面进行修饰。在一些实施例中，光耦合器的一表面被修饰以吸引并保留DNA，也就是说，利用带正电的官能基团，或利用能够与在一目标DNA分子中的序列杂交之寡核苷酸，对表面进行修饰，虽然光耦合器的其它表面不会吸引DNA。

在进一步的实施例中，可动式光耦合器包括两个利用具有不同类型的性质之官能基团或涂层进行表面修饰的区域。例如，在一些实施例中，利用一磁性官能基团对一可动式光耦合器的表面区域进行修饰，而利用一荧光官能基团对可动式光耦合器之另一个相反的表面进行修饰。在一些实施例中，应接位置形成于至少包含一或多个表面修饰之导波器的第一被覆层中。导波器可包括一第一被覆层以及一第二被覆层，如图5B中所示，其中在应接位置的底部，第一(下部)被覆层以及一核心层的表面(未显示)，包括一表面修饰3，其吸引在可动式光耦合器100上的表面修饰1，及/或排斥在可动式光耦合器100上的表面修饰2，且其中上述第二(上部)被覆层包括一与表面修饰2相容(compatible)的表面修饰4。导波器可包括一第一被覆层，上述第一被覆层包括表面修饰3(与在衔接的底部之核心层的表面一起)以及表面修饰4两者，如图6中所示，其中表面修饰3吸引在可动式光耦合器100上的表面修饰1，,及/或排斥在可动式光耦合器100上的表面修饰2，且其中上述第二(上部)被覆层包括一与表面修饰2相容(compatible)的表面修饰4。例如，图5及图6中所示之表面修饰1及表面修饰3，可能本质上为亲水性，然而表面修饰2及表面修饰4本质上为疏水性。在一些实施例中，应接位置104的表面3为亲水性，其包括一部分选自硅(silicon)、二氧化硅(silica)、金属、或金属氧化物，且表面4为疏水性。然而，若应接位置104的表面是由具有亲水性质的材料所构成，则可将其修饰成疏水性。例如，若应接位置104的表面是由亲水性的硅酸盐(silicate)或金属所构成，则可将其修饰为疏水性的用途，例如R1_x-Si(O-R2)_4-x(其中R1为疏水性基团，例如烷链–(CH₂)_n-CH₃，以及R2为C_nH_2n+1，其中x及n为整数，且1≤x≤3)，或用途，例如，具有官能基团的聚合物，系选自：–COOH、–PO₃H₂、–SH、或-NH₂。在另一实施例中，若纳米井120的底面是由疏水性的金属氧化物所构成，则可将其修饰为亲水性的用途，例如R1_x-Si(O-R2)_4-x(其中R1为疏水性基团，例如烷链-(CH₂)_n-CH₃，以及R2为C_nH_2n+1，其中x及n为整数，且1≤x≤3)，或用途，例如，具有官能基团的聚合物，系选自：-COOH、-PO₃H₂、-SH、或-NH₂。藉由使应接位置104的上表面为疏水性，但维持应接位置104的底面为亲水性，可动式光耦合器可配置于邻近应接位置的底部之有效激发区内，而非朝上或面向应接位置的侧壁表面，其中上述可动式光耦合器包括一疏水性表面以及一亲水性表面(参阅下文中光耦合器表面修饰之描述)。因此，定位于可动式光耦合器的表面区域的分子，或来自样本溶液120的分子，上述样本溶液120与定位于可动式光耦合器的表面区域的分子相互作用，在邻近应接位置的底部之固定空间中，上述分子可有效的被进入有效激发区的激发光所激发。

进一步参阅图5及图6中所示之实施例，在一些实施例中，表面修饰1及表面修饰3为带有相反电荷之基团的表面修饰，亦即，表面1带有正电，而表面3带有负电，以此类推。

在一些实施例中，至少一可动式光耦合器的表面区域被寡核苷酸所修饰。图4为实施例中的侦测系统之示意图，上述侦测系统包括一可动式光耦合器，其中上述可动式光耦合器包括被寡核苷酸所修饰的表面。。在一些实施例中，上述寡核苷酸系与用于核酸合成反应中之测序引物(sequencingprimer)之序列互补(complementary)。在进一步的实施例中，寡核苷酸具有随机序列(random sequences)。寡核苷酸的长度可为10至20、20至30、30至40、40至50、50至60、60至80、或80至100个核苷酸。应可了解，这些核苷酸长度的范围仅为概略范围，且寡核苷酸之长度的特定范围包括多个核苷酸，其长度范围仅为”大约”数，亦即，长度为10至100个核苷酸的寡核苷酸，系包括长度为约10至100个核苷酸的寡核苷酸。寡核苷酸的长度可少于10个核苷酸。寡核苷酸可为，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或大于30个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸的长度系对应于测序引物的长度。在一些实施例中，寡核苷酸的长度比测序引物短。寡核苷酸可直接连结至可动式光耦合器，或其可连结至寡核苷酸可与可动式光耦合器相耦合的部分，亦即，一生物素(biotin)基团，此生物素基团可接合至一链霉抗生素蛋白(streptavidin)或抗生素蛋白(avidin)，其中上述链霉抗生素蛋白(streptavidin)或抗生素蛋白(avidin)连结至可动式光耦合器的表面。

利用所属技术领域中已知的过程，可在可动式光耦合器上采用(introduced)一个区域的表面修饰。例如，藉由暂时遮蔽一部分的光耦合器，但对可动式光耦合器的表面之剩余的部分进行修饰，可将一区域的表面修饰引入。例如，遮蔽纳米级球体之光耦合器的一半球，但对另一半球进行修饰。在一些实施例中，藉由将一或多个光耦合器配置于基板上(例如，玻璃或硅基板)、将异质材料沉积于配置在基板上之耦合器的表面上、然后运用剥离法(lift-off method)将可动式光耦合器自基板移除，使光耦合器被部分涂布上异质材料(heterogenous material)。可藉由旋转涂布(spin-coating)、浸渍涂布(dip-coating)、包埋(embedding)、纳米压印(nanoimprinting)、纳米油墨印刷(nano ink-printing)、纳米粒子自动组装技术(nano-particle self assemblytechnology)的运用(例如，纳米粒子于基板上的自动组装，上述基板经过化学微影技术(chemical lithography)进行预图案化(pre-patterned))、或藉由类似的方法，以进行光耦合器于基板上的配置。藉由如溅镀沉积(sputter deposition)、磁电管溅镀沉积(magnetron sputter deposition)、蒸镀(evaporation)、原子层沉积(atomic layer deposition)、化学气相沉积(chemical vapor deposition，CVD)、物理气相沉积(physical vapor deposition，PVD)、电子束(例如电子枪(e-gun))沉积(electron beam deposition)、电浆沉积(plasma deposition)、激光瞬态沉积(laser flash evaporation)(例如汽化金属沉积(evaporated metal deposition))等等，这类的方法可将异质材料沉积于光耦合器上。剥离法可为超音波搅拌(ultrasonic agitation)、化学处理(例如使用丙酮处理)、磁剥离(magnetic lift-off)、或利用刀片(razor blade)的辅助将沉积层自然地剥除。实施例中的过程适用于可动式光耦合器之粒子的生产，上述粒子具有不均匀(asymmetric)的表面修饰，其描述于Park,H.,et al.，“Multifunctional nanoparticles for photothermallycontrolled drug delivery and magnetic resonance imaging enhancement,”Small4(2):192-196(2008)；International Patent Publication Number WO2008/002101，标题为“Multi-functional nanoparticles partially-deposited withgold film”；Anker,J.N.,et al.,“Magnetically-Modulated Optical Nanoprobes(MagMOONs)and Systems,”Journal of Magnetism and Magnetic Materials293:655-662(2005)；Perro,A.,et al.,“Design and synthesis of Janus micro-andnanoparticles,”Journal of Materials Chemistry 15:3745-3760(2005)；McNaughton,B.H.,et al.,“Fabrication of uniform half-shell magneticnanoparticles and microspheres with applications as magnetically modulatedoptical nanoprobes,”arXiv:cond-mat/0506418v1,June 16,2005,1-6；以及Wu,L.Y.,et al.,“Bioinspired nanocorals with decoupled cellular targeting and sensingfunctionality，Small 6(4):503-507(2010)，上述各个文献皆整篇纳入本说明书作为参考。

1.2.4 于应接位置处的可动式光耦合器之直接定位

在一些实施例中，具有一单分子目标物之表面定位的接合部分的可动式光耦合器的粒子(亦即，能够与一单分子目标物接合的分子或分子复合物)，被定位于应接位置，上述应接位置系利用电场、磁场或利用亲水性表面特性或其它的化学性质，形成于导波器中。

藉由施予磁场至应接位置，可将一包括磁性材料及/或其表面具有磁性官能基团修饰的光耦合器定位于应接位置，如图7中所示。例如，经微制造的线圈(micro-fabricated coils)可被配置于应接位置之下。当电流穿过经微制造的线圈，线圈可产生一磁场，上述磁场将存在于样本溶液中的光耦合器导引进入应接位置，并且将光耦合器困在衔接地址的底部。困住磁性纳米粒子之适合的方法描述于Ramadan,Q.,et al.,“Customized trapping of magneticparticles,”Microfluid Nanofluid 6:53–62(2009)，在此处引用作为参考。

藉由施予横跨应接位置的电位能，可将被带电的官能基团所修饰的光耦合器定位于应接位置。例如，经微制造的电极可以载玻片的形式被安置于应接位置的底部，上述载玻片外涂布了一导电材料层以作为电极。对电极运用如直流电等电流，产生一穿过应接位置的电场，上述应接位置作为一电泳粒子诱捕系统(electrophoretic particle entrapment system)，其将经修饰的光耦合器导引进入应接位置。将纳米粒子导引至特定侦测器位置之合适的电泳技术描述于Han,J.,et al.,“High performance electrophoresis system for site-specificentrapment of nanoparticles in a nanoarray”,Proc.SPIE 7574:75740L(2010)，以及Velev,O.D.,et al.,“Particle-localized AC and DC manipulation andelectrokinetics”,Annu.Rep.Prog.Chem.,Sect.C,105:213-246(2009)，在此处引用作为参考。

1.2.5系统之其它非必需的组件(Optional Components)

在一些实施例中，如图4中所示，滤光片(optical filter)118可配置于核心层112与侦测器102之间。在一些实施例中，滤光片可配置于下部之被覆层(未显示于图4中)与光侦测器102之间。在一些实施例中，滤光片可配置于下部之保护层(未显示)与光侦测器102之间。在一些实施例中，下部之保护层本身可作为一滤光片。滤光片可让在一特定波长范围内的光线穿过，但至少部分挡住在上述特定波长范围以外的光线。因此，藉由适当地选择滤光片118，可让自目标物发射出来的光线穿过，但却减弱由激发光所造成的噪声，以便改善信号噪声比(S/N ratio)。

可动式光耦合器及待测之目标物可被包含于一可填充应接位置104的样本溶液120中。在一些实施例中，可利用一微流体管道(microfluidicchannel)(未显示)将样本溶液导入应接位置。微流体管道可被设计成一次让一个目标物通过应接位置，以便实现类流氏细胞计数的侦测(flow-cytometry-like detection)。

在一些上述图式中，其示意图显示侦测系统的结构，为了简化的目的，一些组件并未显示出来。例如，图2中的各个版面仅显示可动式光耦合器100、导波器110、以及应接位置104等侦测系统的组件。侦测系统的其它组件则未显示。应可了解，在这些图式中所示之侦测系统亦可包括其它如此处所揭示的组件。例如，在图2的各个版面中所示之侦测系统亦可包括一光侦测器、一封套(cover)、保护层、一光源、及/或一滤光片。

2.侦测与应用的方法

在另一实施例中，本发明系关于利用此处所揭示的侦测系统来侦测一目标物的方法，上述目标物例如单分子目标物。如本说明书中所用，”单分子目标物”一辞包括：一由单分子所构成的目标物、或由多个非共价连结的分子(multiple noncovalently linked molecules)，如单一多聚体的聚肽复合物(multimeric polypeptide complex)或单一片段之双链DNA，所构成的单一目标物。包括上述目标物的样本溶液可被填充于应接位置中，上述应接位置形成于侦测器的导波器中。由一光源所发射的入射光可被光耦合器至少部分耦合进入导波器中，并且在导波器的核心层中传播。被耦合进入导波器中的光线可作为一激发光，并且可至少部分耦合至一定位于形成于导波器中之应接位置的可动式光耦合器。当目标物进入在应接位置底部的有效激发区，及/或围绕定位于应接位置之光耦合器的表面时，目标物可被激发光所激发，并且发射出一光线以被一光侦测器侦测。

此外，本发明提供一种一单分子目标物的侦测方法，包括：a)将一入射光自一光源引导进入一导波器，从而在导波器中形成一激发光；b)将一单分子目标物定位于一可动式光耦合器上；c)将b)的可动式光耦合器定位于一应接位置处，好让一可动式光耦合器形成于至少一导波器的第一被覆层中；以及d)藉由激发光来激发被定位于可动式光耦合器上之单分子目标物，使单分子目标物发射出一光线以被一光侦测器侦测。在一些实施例中，为了让可动式光耦合器形成于至少一导波器的第一被覆层中，可动式光耦合器定位于应接位置以形成一适合于单分子侦测的固定空间。

此外，本发明尚提供一种一单分子目标物的侦测方法，包括：a)提供一侦测装置，包括：i)一可动式光耦合器；ii)一导波器，包括：一核心层；以及一第一被覆层，其中至少一可动式光耦合器之应接位置至少形成于第一被覆层中；以及iii)一光侦测器；b)提供至少一结合部分，其能够与一单分子目标物结合；c)将至少一结合部分个别地定位(localizing)于可动式光耦合器上；d)提供一单分子目标物分子给至少一结合部分，其中至少一结合部分位于可动式光耦合器上；e)将可动式光耦合器定位(localizing)于应接位置处，其中至少一结合部分及单分子目标物位于可动式光耦合器上；f)将一入射光自一光源引导进入导波器，从而形成一激发光于导波器中；g)藉由激发光来激发单分子目标物分子，其中单分子目标物分子结合至至少一结合部分，其中至少一结合部分位于可动式光耦合器上，使得单分子目标物发射出一光线以被一光侦测器侦测。

在一些实施例中，侦测单分子目标物的方法系关于侦测目标分子及/或分子复合物，例如受体配体(receptor ligands)及受体复合物(receptor complexes)、抗原及抗体、或游离的核苷酸三磷酸(free nucleotide triphosphates)及核酸合成反应复合物之交互作用的方法。在一些实施例中，上述方法包括侦测一被标定的分子。在一些实施例中，上述标定采用荧光标记(fluorescent label)。在一些实施例中，上述标定采用荧光分子(fluorescent molecule)。在进一步的实施例中，上述标定采用荧光蛋白质。在特定的实施例中，上述标定采用一量子点。在一些实施例中，上述标定采用一荧光共振能量转移(Fluorescenceresonance energy transfer,FRET)的供体/受体对(donor/acceptor pair)。上述侦测系统，以及使用此侦测系统的方法，可运用于，例如，核酸侦测、DNA测序、生物标记的辨识(biomarker identification)、或流式细胞计数。上述侦测系统能够侦测并处理低强度的光讯号，使得单分子侦测变得可能。

此外，本发明提供一种一核酸的测序方法，包括：a)提供一侦测装置，包括：i)一可动式光耦合器；ii)一导波器，包括：一核心层；以及一第一被覆层，其中至少一可动式光耦合器之应接位置至少形成于第一被覆层中；以及iii)一光侦测器；b)提供至少一核酸分子；c)将至少一核酸分子个别地定位(localizing)于可动式光耦合器上；d)将可动式光耦合器定位(localizing)于应接位置处，其中至少一核酸位于可动式光耦合器上；e)进行至少一核酸分子的单分子合成测序，其中单分子核酸的合成测序导致产生一发射光，发射光与至少一核酸中的碱基之特性有关。f)利用侦测器侦测发射光，产生一输出讯号；以及g)处理输出讯号以决定至少一核酸所包含的碱基之特性。

在一些实施例中，上述方法包括形成共价连接(covalent attachments)，像是反应物或标的目标物与标记之间，以及官能基团与表面之间，例如可动式光耦合器的表面或应接位置的表面。例如，准备可动式光耦合器之经寡核苷酸修饰的粒子，为了接合经生物素化的寡核苷酸(biotinylatedoligonucleotides)，链霉抗生素蛋白(streptavidin)修饰的粒子可连接至一光耦合器的表面。在一些实施例中，单分子目标物的接合部分，如多肽或多肽的复合物，可连结至一光耦合器的表面。在本技术领域中，已知多种形成共价连结的方法，例如反应物连接至表面或标记。亦可使用非共价连接的方法。能够利用许多不同的化学修饰以加速连接的形成。化学修饰的范例包括：N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxy succinimide，NHS)基团、胺类(amines)、醛类(aldehydes)、环氧衍生物(epoxides)、羧基(carboxyl groups)、羟基(hydroxylgroups)、酰肼(hydrazides)、疏水性基团、薄膜(membranes)、马来酰亚胺(maleimides)、生物素(biotin)、链霉抗生素蛋白(streptavidin)、硫醇基(thiolgroups)、镍螯合物(nickel chelates)、光敏基团(photoreactive groups)、硼基团(boron groups)、硫酯类(thioesters)、半胱氨酸(cysteines)、二硫化物基团(disulfide groups)、烷基与卤化酰基(acyl halide groups)、谷胱甘肽(glutathiones)、麦芽糖(maltoses)、叠氮化物(azides)、磷酸盐(phosphates)、以及膦类(phosphines)。这些能够很容易的准备，例如，使用标准方法(MicroarrayBiochip Technologies,Mark Schena,Editor,March 2000,Biotechniques Books)。在一些实施例中，利用修饰剂(例如亲电性的修饰剂或亲核性的修饰剂)的适当结合，使连接形成于两个体之间，其中各个个体皆至少包括一修饰剂。

在一些实施例中，藉由利用一存在于一上述个体上的化学修饰剂，以及一其它个体之自然形成的部分(naturally-occurring moiety)，例如胺类或氢硫基(sulfhydryl)，使连接形成于两个体之间。此反应的优点为其能够快速反应且能够避免有毒副产物的产生。这类的修饰剂的范例包括：N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-esters)、醛类(aldehydes)、环氧衍生物(epoxides)、以及硫代酯类(thio-esters)。大部分的蛋白质、肽、糖肽(glycopeptides)等等，具有游离的胺基团，其能够与这类的修饰剂反应，来将这些修饰剂共价连结至这些修饰剂。亦可合成具有内部或末端之胺基团的核酸探针，且其具有商业利用价值(例如IDT或Operon公司)。因此，利用相似的化学反应，生物分子能够接合(共价或非共价)至标记、表面、或其它的反应物。

许多其它的多功能的交联剂(cross-linking agents)可用来将一种修饰剂的化学活性转换成另一种。这些基团可为双官能基团、三官能基团、四官能基团等等。这些基团亦可为同质功能(homo-functional)或异质功能(hetero-functional)。双官能基团之交联剂的例子为X-Y-Z，其中X及Z为两个活性基团，而Y为一连结之连结物。此外，若X及Z为相同的基团，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-esters)，将会产生交联剂，NHS-Y-NHS，其为一同质双官能交联剂(homo-bi-functional cross-linker)，并且可以连结个别包括一胺类的两个体。若X为N-羟基琥珀酰亚胺酯，且Z为马来酰亚胺基团(maleimide group)，将会产生交联剂，NHS-Y-马来酰亚胺，其为一异质双官能交联剂(homo-bi-functional cross-linker)，并且可以连结分别包括一胺类的个体与包括一硫代基团(thio-group)的个体。具有许多不同官能基团的交联剂被广泛的运用。这类官能基团的范例包括：N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-esters)、硫代酯类(thio-esters)、卤烷类(alkyl halides)、卤化酰类(acylhalides)(例如碘乙酰胺，iodoacetamide)、硫醇类(thiols)、胺类(amines)、半胱氨酸(cysteines)、组胺酸(histidines)、二硫化物(di-sulfides)、马来酰亚胺(maleimides)、顺-二醇类(cis-diols)、硼酸(boronic acid)、异羟肪酸(hydroxamicacid)、叠氮化物(azides)、联胺(hydrazines)、膦类(phosphines)、光敏基团(photoreactive groups)(例如：蒽醌，anthraquinone；二苯甲酮，benzophenone)、丙烯酰胺(acrylamide)(例如：acrydite)、亲和性基团(affinity groups)(例如：生物素，biotin；链霉抗生素蛋白，streptavidin；麦芽糖，maltose；麦芽糖接合蛋白，maltose binding protein；谷胱甘肽，glutathione；谷胱甘肽-硫转移酶，glutathione-S-transferase)、醛类(aldehydes)、酮类(ketones)、羧酸类(carboxylic acids)、磷酸盐类(phosphates)、疏水性基团(hydrophobic groups)(例如：苯基，phenyl；胆固醇，cholesterol)等等。

其它的修饰剂替代物(例如光交联(photo-crosslinking)及热交联(thermalcrosslinking))已为本技术领域人员所知。产业上可利用的技术包括，例如，来自Mosiac Technologies(Waltham,MA),ExiqonTM(Vedbaek,Denmark)、Schleicher and Schuell(Keene,N.H.),Surmodics TM(St.Paul,MN)、XenoporeTM(Hawthorne,N.J.),Pamgene(Netherlands)、Eppendorf(Germany)、Prolinx(Bothell,WA)、Spectral Genomics(Houston,TX)、and CombimatrixTM(Bothell,WA)等公司的商品。

2.1用于侦测系统的标记

在一些本说明书中所描述之方法的实施例中，将一或多个标记黏附至标的单分子目标物(亦即，与目标物或其它反应物反应之代测物质、抗体、或其它反应物)，或黏附至探针(probe(s))，例如引物、抗体、或其它能与目标物或其它反应物反应的反应物。任何标记皆能用于单分子目标物或探针上，上述单分子目标物或探针对于得到讯息与目标物的量或存在的相关有帮助。

例如，可使用多种不同的荧光分子，包括小分子、荧光蛋白、以及量子点。有用的荧光分子(荧光团，fluorophore)包括但不限于：1,5 IAEDANS；1,8-ANS；4-Methylumbelliferone；5-carboxy-2,7-dichlorofluorescein；5□Carboxyfluorescein(5-FAM)；5-Carboxynapthofluorescein；5□Carboxytetramethylrhodamine(5-TAMRA)；5-FAM(5-Carboxyfluorescein)；5-HAT(Hydroxy Tryptamine)；5-Hydroxy Tryptamine(HAT)；5-ROX(carboxy-X-rhodamine);5□TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine)；6-Carboxyrhodamine 6G;6-CR 6G;6□JOE;7-Amino-4-methylcoumarin；7-Aminoactinomycin D(7-AAD)；7-Hydroxy-4-methylcoumarin；9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine；ABQ；Acid Fuchsin；ACMA(9□Amino-6-chloro-2-methoxyacridine)；AcridineOrange；Acridine Red；Acridine Yellow；Acriflavin；Acriflavin Feulgen SITSA；AFPs-AutoFluorescent Protein-(Quantum Biotechnologies)；Texas Red；TexasRed-X conjugate；Thiadicarbocyanine(DiSC3)；Thiazine Red R；ThiazoleOrange；Thioflavin 5；Thioflavin S；Thioflavin TCN；Thiolyte；Thiozole Orange；Tinopol CBS(Calcofluor White)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO□PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC(TetramethylRodaminelsoThioCyanate)；True Blue；TruRed；Ultralite；UranineB；Uvitex SFC；WW 781；X-Rhodamine；XRITC；Xylene Orange；Y66F；Y66H；Y66W；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；螯合染剂(interchelating dyes)例如：YOYO-3、Sybr Green、Thiazole orange；Alexa Fluor染剂系列的成员(来自Molecular Probes/Invitrogen)，其涵盖了宽广的光谱范围以及符合一般激发光源的主要输出波长，例如：Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、以及750；Cy荧光染剂系列的成员(GE Healthcare)，其亦涵盖了 宽广的光谱范围，例如：Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7；Oyster荧光染剂的成员(Denovo Biolabels)，例如：Oyster-500、550、-556、645、650、656；Y-Labels系列的成员(Dyomics)，例如，范围介于418nm(DY□415)至844nm(DY-831)具有最大吸收质的范围，例如DY-415、-495、-505、-547、-548、-549、-550、-554、-555、-556、-560、-590、-610、-615、-630、-631、-632、-633、-634、-635、-636、-647、-648、-649、-650、-651、-652、-675、-676、-677、-680、-681、-682、-700、-701、-730、-731、-732、-734、-750、-751、-752、-776、-780、-781、-782、-831、-480XL、-481XL、-485XL、-510XL、-520XL、-521XL；ATTO荧光标记系列的成员(ATTO-TEC GmbH)，例如：ATTO 390、425、465、488、495、520、532、550、565、590、594、610、611X、620、633、635、637、647、647N、655、680、700、725、740；CALFluor染剂系列或Quasar染剂系列的家族(Biosearch Technologies)，例如：CALFluor Gold 540、CAL Fluor Orange 560、Quasar 570、CAL Fluor Red 590、CALFluor Red 610、CAL Fluor Red 635、Quasar 670；量子点，例如：EviTags系列的量子点(Evident Technologies)或Qdot系列的量子点(Invitrogen)，例如：Qdot 525、Qdot565、Qdot585、Qdot605、Qdot655、Qdot705、Qdot 800；荧光素(fluorescein)；若单明(rhodamine)；及/或藻红素(phycoerythrin)；或上述之结合。参阅，例如美国专利申请公开号No.2008/0081769。

在包含定位于在应接位置的可动式光耦合器上之标的核酸之单分子核酸测序的实施例中，可藉由荧光团(fluorophore)的激发及检测，来侦测纳入新生的DNA链中之核苷酸，其中上述荧光团直接连接至新纳入的核苷酸，例如：一荧光团，其连接至三磷酸脱氧核糖核苷(deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP)的β或γ磷酸盐，并且在dNTP纳入成长中的链后，紧接着被分开。在一些实施例中，可利用以荧光共振能量转移(Fluorescenceresonance energy transfer,FRET)技术为基础的检测，来侦测纳入新生链的核苷酸。例如，在一些实施例中，可使用于美国专利US 2010/0035268中所描述之以荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术为基础的检测方法。在这类的实施例中，能够作为荧光供体(fluorescencedonor)的量子点可连结至测序的引物，且用于合成成长中链的dNTP携带一荧光受体基团(fluorescence acceptor group)于其末端(γ)之磷酸基团上。利用检测与dNTP相连接的荧光受体的发射情形，经荧光标定的多磷酸核苷(nucleotide polyphosphate)，在与标的核酸互补的活性位置处，纳入成长中的核苷酸链，接着受激发的量子点荧光供体(Quantum dot fluorescence donor)发生荧光共振能量转移。藉由其各自荧光标记来决定各个被纳入的核苷酸的特性(identity)，其中上述荧光标记在纳入成长中的链后紧接着自核苷酸上被分离。

2.2 核酸侦测

上述侦测系统可用于分子侦测的方法或过程中，例如，核酸测序。此系统，及利用此系统的方法或过程，有助于像是分析或诊断上的应用。

上述侦测系统可用于多种不同的测序方式(sequencing modalities)以及适用于测序单分子。此外，相对于现存的生物芯片装置，上述侦测系统简化了设计、装备、以及生产。

2.2.1 待测分子

适合侦测的核酸可包括任何核酸，包括，例如：DNA、RNA、或PNA(肽核酸，peptide nucleic acid)，且可包含已知或未知的任何序列，包括自然发生或人工合成的序列。核酸可自然地产生、重组制造(recombinantlyproduced)、或化学合成。可根据实际应用而改变待测核酸的长度。在一些实施例中，核酸可包括至少10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000个碱基，或更多。在一些实施例中，核酸可为10至20、10至50、10至100、50至100、50至500、50至1000、50至5000、500至2000、500至5000、或1000至5000个碱基。

用于侦测的核酸可为单链核酸。藉由所属技术领域已知的方法，例如：加热、碱化、或其它化学处理，一单链核酸模板可自一双链分子衍生得来。单链核酸模板亦可藉由化学合成或体外合成(in vitro synthesis.)的方式来制造而得。

在一些实施例中，待测核酸为环状。在一些实施例中，上述方法包括：提供一环状的核酸分子，其包括一段已知序列的插入片段(insert)，上述已知序列可用来作为引物(primer.)的结合位(binding site)。环状的核酸分子可以单链或双链的状态被提供，且一般包括至少一共价闭合链(covalently closedstrand)。双链环状分子可包括一缺口链(nicked strand)或一第二共价闭合链。

在一些实施例中，若已知环状的核酸分子中部分的序列，且其已知序列的片段能够作为核酸的插入片段(例如：可能已知一在包含于环状分子中的基因序列内的保守序列(conserved motif)，或根据一分子在极严苛的条件下，与另一段已知序列的核酸杂交的能力，可知上述分子包含一序列)，则可藉由将环状的核酸分子以环状形式自其来源分离，来提供环状的核酸分子。在一些实施例中，仅能不明确(inexactly)的知道核酸的插入片段的序列，像是当对核酸的认知系来自于严苛的杂交性质(stringent hybridization properties)时就会如此。在一些实施例中，可明确知道核酸的插入片段的序列，像是当环状的核酸分子具有一已知的主链序列(backbone sequence)，或经过精心设计而包含一已知序列时。

在一些实施例中，藉由一体外反应或数个反应的进行，将一线状的核酸样本与一核酸的插入片段一起合并进入一环状的分子，以提供环状的核酸分子。在一些实施例中，上述体外反应或数个反应能够包括藉由连结酶(ligase)的接合反应(ligation)，及/或其它参与反应的链，上述反应例如：藉由各种不同的酶的催化反应，其包含重组酶(recombinases)及拓朴异构酶(topoisomerases)。DNA连结酶(DNA ligase)或RNA连结酶(RNA ligase)可作为酶加入一线状的模板(linear template)之两末端，无论有没有衔接分子(adapter molecule)或连结分子(linkers)，以形成一环状，如第8图中所示范。例如，T4 RNA连结酶(T4 RNA ligase)将单链的DNA或RNA耦合，如Tessier等人在Anal Biochem,158:171-78(1986).CIRCLIGASE(TM)(Epicentre,Madison,Wis.)中所描述，亦可用于催化单链核酸之接合反应。此外，一双链的连结酶，例如E.coli连结酶(E.coli ligase)或T4 DNA连结酶(T4 DNAligase)

在一些实施例中，提供环状核酸分子包括：藉由延伸自至少一包括互补的区域(complementary regions)的引物(上述引物包括：具有已知序列的5’端(5’flaps)之随机的引物(random primers)，上述已知序列能够作为核酸的插入片段)，来复制一核酸的模板；以及将经过放大的核酸变成环状，例如可藉由一连结酶或一重组酶来催化；上述经过放大的核酸可，例如：藉由限制(restriction)或磷酸化作用(phosphorylation)，在环化(circularization)之前，于其末端进行酶处理。

在一些实施例中，藉由进行化学的环化作用来提供环状的核酸分子。化学方法系运用已知的耦合剂(coupling agents)像是BrCN阳性咪唑(BrCN plusimidazole)与二价金属(divalent metal)、N-cyanoimidazole与ZnCl2,1-(3-dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide HCl、以及其它的碳二酰亚胺(carbodiimides)与羰基二咪唑(carbonyl diimidazoles)。藉由缩合(condensing)5’端的磷酸根(5’-phosphate)与3’端的羟基(3’-hydroxyl)，或缩合5’端的羟基(5’-hydroxyl)与3’端的磷酸根(3’-phosphate)，亦可将线状模板的末端加入。

在一些实施例中，环状的核酸分子包括一插入的序列，上述插入的序列可被视为一末端的连结引物(end link primer)，除了此分子为环状因而上述插入的序列不在末端以外。

2.2.1.1 末端连结引物

在一些实施例中，线状的核酸可更包括一或多个耦合至核酸的5’端、3’端、或同时耦合至5’端及3’端两者之末端的连结引物。在特定的实施例中，一末端的连结引物可被固定(affixed)至核酸的3’端。末端的连结引物可用来提供一或多个侦测的引物，例如：测序的引物，之互补的序列。

末端的连结引物为短的核酸分子，通常由少于100个核苷酸所构成。在一些实施例中，末端的连结引物的长度可为至少5、10、15、20、25、30、50、75、90个核苷酸、或更多个核苷酸。在一些实施例中，末端的连结引物的长度可为8至25个核苷酸、10至20个核苷酸、10至30个核苷酸、10至50个核苷酸。在一些实施例中，末端的连结引物可为无支链的(unbranched)，然而，在其它的实施例中，上述末端的连结引物可为有支链的(branched)。

末端的连结引物可作为一或多个用于侦测核酸的引物的补体(complement)，例如：测序的引物。在一些实施例中，上述引物可藉由杂交(hybridization)来侦测核酸，例如：上述引物可包含一可侦测的标记，例如一荧光标记(fluorescent label)。在一些实施例中，末端的连结引物之5’端可包括一与测序的引物互补的序列。在一些实施例中，末端的连结引物之与测序的引物互补的序列可被定向(oriented)，使得上述测序的引物之3’端可立刻被调整成在待测核酸中的第一个核苷酸。

在一些实施例中，可藉由连结酶，例如：DNA连结酶，将末端的连结引物加入待测核酸的末端。在一些实施例中，末端的连结引物以及待测核酸，在接合之前两者皆可为单链。在其它的实施例中，两者皆可为双链。在另一实施例中，一个可为单链而另一个可为双链。接合作用已为所属技术领域所熟知。例如，在波隆尼测序方法(polony sequencing method)中，Shendure等人，运用New England Biolabs’(NEB)Quick Ligation^TM试剂组，将一T30末端的连结引物(T30 end link primer，32个碱基对)接合至一样本DNA片段(Science,309:1728-1732[2005])。上述连结反应溶液包括0.26 pMole的DNA、0.8pMole的T30末端连结引物、4.0μl T4 DNA连结酶1倍的Quick LigationBuffer中。在混合之后，将上述反应溶液培养于室温下10分钟，接着放置于冰上。藉由将样本加热至65°C维持10分钟，来终止上述连结反应。

在其它的实施例中，可在待测核酸上合成末端的连结引物。例如：末端的连结引物可为一均质的聚合物(homopolymer)，其中藉由例如：末端转移酶(terminal transferase)来将均质的聚合物(homopolymer)加入。例如，Harris等人(Science 320:106-109[2008])将一多腺嘌呤尾(poly-A tail)加至DNA模板，上述DNA模板作为一在病毒基因组的单分子测序中之多胸腺嘧啶测序引物(poly-T sequencing primer)的补体。

2.2.1.2 测序引物

测序的引物为单链的寡核苷酸，其与待测核酸的片段互补，或与其本身相关之末端的连结引物互补。在一些实施例中，上述测序的引物的长度可为至少8、10、15、20、25、30、34、40、45、50个核苷酸，或更多个。在特定的实施例中，测序的引物的长度可为为8至25个核苷酸、10至20个核苷酸、10至30个核苷酸、10至50个核苷酸。上述测序的引物可由任何类型的核苷酸所构成，包括：自然产生的核苷酸、不存在于自然界的核苷酸相似物(analogs)、或经过修饰的核苷酸。

在一些实施例中，测序的引物可包含经过修饰的核苷酸，例如：锁核酸(locked nucleic acids，LNAs，经过修饰的核糖核酸，其提供在多聚核酸中的经过强化之碱基堆栈的交互作用(enhanced base stacking interactions))。如Levin等人在Nucleic Acid Research 34(20):142[2006]中所描述之LNAs的功用，说明了包含LNA的引物改进了专一性(specificity)，并且相对于对应之未锁引物(unlocked primer)，表现出更强的结合作用。产生包含3 LNA核苷酸(于帽盖(caps)中)之MCP1引物(MCP1 primer，5’-cttaaattttcttgaat-3’)的三个变体(variants)：MCP1-LNA-3’(5’-cttaaattttCtTgaAt-3’)、MCP1-LNA-5’(5’-CtTaAattttcttgaat-3’)、以及MCP1-LNA-even(5’-ctTaaatTttctTgaat-3’)，其中上述三个变体在引物中之不同位置处。所有的LNA取代的引物皆具有强化的Tm，虽然MCP1-LNA-5’引物表现出显着地强化之测序的准确性(PhredQ30计数)。因此，在特殊的实施例中，上述测序引物可包含至少一锁5’酸(locked nucleotide)于其5’的区域，亦即，上述5’二分之一、三分之一、或四分之一的测序引物。

在与核酸聚合酶(nucleic acid polymerizing enzyme)、dNTPs、以及适当的缓冲成分(buffer components)结合之前或之后，测序的引物及单链的目标核酸(亦即将被测序的核酸，包括至少一末端的连结引物)可进行杂交，而且之后可被吸收至可动式光耦合器。可藉由在含盐溶液中，例如：5X SSC(或5XSSPE),0.1% Tween 20(或0.1% SDS)、以及0.1% BSA缓冲液，混合上述样本核酸与一莫耳过量之测序的引物，使上述测序的引物及样本核酸进行杂交。加热上述混合物至65°C，持续5分钟，以及缓慢降温至室温，好让引物/模板进行低温黏着(annealing)。可藉由合适的方法，包括：分子筛(molecularsieve)，来删除残留的引物(residual primers)。

在一些实施例中，目标核酸被定位于一可动式光耦合器上，作为核酸合成反应复合物的一成分，其中上述合成反应不仅不可能被定位于在导波器之应接位置的一固定空间中而不需要将聚合酶(polymerase)，亦不可能将目标核酸固定至一表面。为了准备一定位于可动式光耦合器之表面上的核酸合成反应复合物，一如前述之经过环化的目标核酸，可与核酸合成之一测序的引物、一核酸聚合酶、dNTPs、以及适当的缓冲成分结合。上述聚合酶可在多个周期中(in multiple cycles)，围绕着上述经过环化的模板进行，产生一在成长中之新生的链，上述链包括模板链的多重拷贝(multiple copies)。接着，上述聚合的复合物可与可动式光耦合器结合，上述可动式光耦合器在其表面上利用寡核苷酸进行修饰，如图9中所示。因此，在这类的实施例中，目标链的模板与聚合酶，两者皆非自己本身固定在表面上。上述寡核苷酸可包括：一与测序的引物之序列进行杂交的序列、一与可嵌入在成长中之新生的链内之多重复制进行杂交的序列。这些嵌入的序列可接合至连结在光耦合器之表面的寡核苷酸，如图10中所示。在一些实施例中，上述寡核苷酸包括随机的序列(random sequences)，此序列可在各种不同的位置，与成长中之新生的链进行杂交，如图11中所示。在一些实施例中，可动式光耦合器可于其整个表面上被寡核苷酸修饰，如图9中所示。在进一步的实施例中，可动式光耦合器在其仅有一部分的表面上被寡核苷酸修饰，如图10及图11中所示。

在一些实施例中，一双链的目标序列包括一链，此链具有并入之生物素化的尿嘧啶碱基(incorporated biotinylated uracil bases)，上述双链的目标序列的产生，可藉由利用一连结引物(linking primer)来准备一环状单链的目标链，上述连结引物可与单链的目标核酸之两末端进行杂交，以及藉由利用一核酸聚合酶与一dNTP混合物来聚合第二链，其中利用生物素化的dUTP来补充上述dNTP混合物，如图12中所示。上述双链的目标物可被变性，以及与链霉抗生素蛋白修饰(streptavidin-modified)的光耦合器粒子相结合，进而藉由与其缠绕在一起之生物素化的链的特性，将此经过变性的目标链吸附至光耦合器，如图13A所示。在额外的聚合酶(addition of a polymerase)、dNTPs、一测序的引物、以及适当的缓冲成分上，可形成一核酸合成反应复合物，其中上述复合物被吸附至一可动式光耦合器的表面，而未将聚合酶或目标核酸固定，如图13B及图13C中所示。在光耦合器与在应接位置被吸收的模板之定位之前或之后，可添加聚合酶、dNTPs、以及缓冲成分。

可藉由适当的方法，包括：目视检查(visual inspection)或计算机辅助的引物设计，来设计引物，上述引物包括序列的末端的连结与测序的引物两者。很多的软件包(software packages)可用来辅助引物的设计，包括：DNAStarTM(DNAStar,Inc.,Madison,WI)、OLIGO 4.0(National Biosciences,Inc.)、Vector

(Invitrogen)、Primer Premier 5(Premierbiosoft)、以及Primer3(WhiteheadInstitute for Biomedical Research,Cambridge,MA)。引物的设计可考虑到，例如，待测序的分子、专一性、长度、欲融化的温度、二级结构、以及使用的酶(亦即聚合酶或连结酶)。参见，例如，Joseph Sambrook与David Russell，Molecular Cloning:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，第三版(2001)。

2.2.2 测序模式

一些实施例为测序核酸的方法，其包括下列步骤：a)提供一侦测装置，包括：i)一可动式光耦合器；ii)一导波器，包括：一核心层；以及一第一被覆层，其中至少一可动式光耦合器之应接位置至少形成于第一被覆层中；以及iii)一光侦测器；b)提供至少一核酸分子；c)将至少一核酸分子个别地定位于可动式光耦合器上；d)将可动式光耦合器定位于应接位置处，其中至少一核酸位于可动式光耦合器上；e)进行至少一核酸分子的单分子合成测序，其中单分子核酸的合成测序导致产生一发射光，上述发射光与至少一核酸中的碱基之特性有关。f)利用侦测器侦测发射光，产生一输出讯号；以及g)处理输出讯号以决定至少一核酸所包含的碱基之特性。

在这些方法中，将至少一核酸分子个别地定位于可动式光耦合器上，以及将可动式光耦合器定位于应接位置处，其中至少一核酸位于可动式光耦合器上，被理解为一单核酸分子可被定位于一位于应接位置之可动式光耦合器上，亦即将一个(且不超过一个)核酸分子定位于至少一应接位置中。在一些实施例中，复数个应接位置皆个别含有一个(且不超过一个)可动式光耦合器，其中上述可动式光耦合器个别包括一个定位于其表面上的核酸分子。在一些实施例中，在操作过程期间，一些复数个应接位置包含光耦合器，上述各个光耦合器皆分别包括一个定位于其表面上的目标单核酸子，且其它包含或不包含可动式光耦合器的应接位置，其光耦合器皆不包含表面定位的目标核酸分子。也就是说，在样本溶液中，具有表面定位之核酸分子的光耦合器的强度低于某个特定值，因此，并非所有的应接位置中皆包含具有表面定位之核酸分子的光耦合器。这样可避免在测序完成前，发生两个或两个以上的核酸分子定位于应接位置的情形，、以便避免包含来自大于一个核酸分子的信息之测序的结果。例如，在一些实施例中，少于或等于50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%的应接位置将会产生因为低浓度之定位于待检测或待鉴定的应接位置的生物分子之讯号。在实施例中，第一目标核酸分子从定位于应接位置的光耦合器上游离(dissociates)，接着第二核酸分子随后自同一个定位于应接位置的光耦合器上游离，藉由在合并的核酸(incorporated nucleotides)的侦测中之任何的差距(gap)，及/或藉由在检定核酸序列中的差异，第一核酸测序的结果可与第二核酸测序的结果有所区别。

在一些实施例中，单分子核酸的合成测序(single molecule nucleic acidsequencing-by-synthesis)导致通过化学发光(chemiluminescence)的光线的发射。值得注意的是，在这些实施例中，当化学发光产生来自化学能的光线时，上述装置并不需要包括光源。

在一些实施例中，上述装置更包括一光源，上述光源可用于提供激发的光线，例如，使单分子核酸的合成测序通过荧光发射光线。

藉由所属技术领域中已知的方法，像是回顾例如：美国专利号U.S.PatentNo.6,946,249以及Shendure et al.,Nat.Rev.Genet.5:335-44(2004)，侦测装置及方法可用于侦测及测序核酸。可从所属技术领域中已知的单分子测序的方法中选择测序的模式(sequence modalities)。在一些实施例中，上述测序的方法可仰赖无论是DNA聚合酶(DNA polymerase)或DNA连结酶(DNA ligase)的专一性，以及可包括，例如：碱基延伸测序(base extension sequencing，单一碱基逐步延伸，single base stepwise extensions)、以及多重碱基的合成测序(包括，例如：利用末端标定的核苷酸之测序)。

以单分子测序模式来说，侦测系统可提供能够测序单分子的优势。例如，可提供一待测序的环状模板核酸分子以及一测序的引物。藉由进行复数个测序的周期(sequencing cycles)，以得到比模板核酸分子中的核苷酸数量更多的序列之序列判读(sequence read)，使重复测序能够实现。上述测序的序列判读包含讯息，其中上述讯息反复地(redundantly)辨识了在至少一位于模板核酸分子中之位置的碱基。在一些实施例中，上述测序的序列判读包含讯息，其中上述讯息多余地辨识了至少25%、50%、75%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之在模板核酸分子中的碱基。在一些实施例中，上述测序的序列判读包含讯息，其中上述讯息辨识至少25%、50%、75%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之在模板核酸分子中的碱基，其中上述模板核酸分子具有三倍、四倍、五倍、七倍、或十倍或更多的重复(redundancy)。藉由测序相同的分子，测序错误可望下降，作为测序之序列判读的数量之幂(as the power ofthe number of sequencing reads)。例如，如果每个单一判读的碱基错误率为10^-3，那么在两次判读之后，将会掉至(10^-3)²，亦即10^-6。既然上述用于测序之经过修饰的核苷酸能够失去其标记或封闭基团(blocking group)，导致，例如假性侦测(spurious deletions)，此乃特别有助于单分子测序。

在核苷酸上酶及荧光基团(fluorophore)标记的生存能力(viability)，当核酸合成反应进行时，能够逐渐消失。当测序的序列判读速度慢下来时，能够将反应混合物淘汰离开侦测系统，并且更换新的溶液以进行后续测序的序列判读。在一些实施例中，利用新的反应物来补充上述反应混合物，而不将此反应混合物淘汰及更换。

一般而言，在单分子测序中，至少一个待测的核酸分子与引物接触。例如：藉由进行至少一酶催化的聚合作用(polymerization)或连结反应(ligationreaction)来修饰上述引物。上述至少一个反应造成光线的发射，上述光线与至少一个在核酸中的碱基的性质相关。”造成”光线的发射，其被理解为至少一个反应导致至少一个光线发射的情况发生，上述光线与至少一个在核酸中的碱基的性质相关；此情况的发生可藉由与激发光、化学或生物发光系统(chemi-or bio-luminescent system)等等之间的相互作用。上述至少一种情况可为，例如：荧光基团合并进入至少一反应的产物中、或焦磷酸根(pyrophosphate)的释放。因此，无论是否有外部的激发皆可产生光线。例如，单分子测序的进行可利用可逆性终止子之碱基类似物(reversible terminator base analogs)，其中上述可逆性终止子之碱基类似物(reversible terminator base analogs)包括一共价连结之可侦测的标记，例如：一荧光标记、以及一防止任何二次延伸(secondary extension)的封闭基团(blocking group)，其中在上述类似物被加至引物之后，激发并侦测上述类似物，并且在加入之后移除上述标记与封闭基团，以进行另一轮的延伸(extension)。此外，藉由提供化学或生物发光的侦测系统，其中上述侦测系统以与焦磷酸盐相关(pyrophosphate-dependent)的方式发射光线，可在没有外部激发的情况下侦测延伸步骤的产物，例如一焦磷酸盐。这些模式以及其它的模式将更详细地描述于下文中。

上述发射的光线与至少一个在核酸中的碱基的性质相关。在一些实施例中，上述相关性能够为时间的(temporal)，例如，光线发射的时间显示了至少一个碱基的性质，像是当提供不同的碱基类似物(base analogs)以在不同时间用于一聚合反应中的情形。在一些实施例中，上述相关性可能为光谱的(spectral)，例如，发射光线的光谱显示了至少一个碱基的性质，像是当提供包括不同荧光基团的不同碱基类似物以用于一聚合反应中的情形。

在一些实施例中，单分子核酸测序包括多复位序周期。一个测序周期被理解为造成一光线的发射的情形，上述光线与至少一个在核酸中的碱基的性质相关，为了在一第一碱基被辨识之后，辨识至少一在核酸中的第二碱基，上述情形可被重复。因此，在包括单分子核酸测序的方法中，上述单分子核酸测序能够包括至少一给定数量的测序周期，如此一来造成至少上述给定数量之光线的发射，上述光线集体(collectively)与至少一个在核酸中的碱基的性质相关。在一些实施例中，上述给定的数量可为，例如：2、3、4、5、10、20、50、100、200、或500。

测序的方法能够包括决定一或多个在核酸中的碱基的性质。在一些实施例中，进行单分子核酸测序造成光线的发射，其中利用至少一包括至少一第一光学传感器(optical sensor)及一第二光学传感器的光侦测器来侦测上述光线，并且处理来自上述至少两个光学传感器的输出讯号，藉由将至少一个处理的结果与至少一个已知的结果比对，上述已知的结果对应至少一个已知的类型，能够决定至少一个在核酸中的碱基的性质。

例如，一个处理的结果能够显示一反应发生的时间；当发射的光线在时间上与至少一个在核酸中之碱基的性质相关时，上述时间可被用于辨识至少一个在核酸中的碱基。

在另一个实施例中，一个处理的结果能够决定将荧光基团合并进入一反应的产物中；当发射的光线在光谱上与至少一个在核酸中之碱基的性质相关时，上述决定可被用于辨识至少一个在核酸中的碱基。

2.2.2.1 碱基延伸测序：逐步延伸(Base Extension Sequencing:StepwiseExtension)

在一些实施例中，侦测装置可被用于侦测在碱基延伸测序期间产生的光线。在一些实施例中，藉由提供一包括一待测的单链核酸之部分重复(partialduplex)的样本核酸、一与待测核酸之3’端相关之末端的连结引物(end linkprimer)、以及一其黏着(anneal)的测序引物，开始进行碱基延伸测序。在一些实施例中，在一适合的缓冲溶液中，聚合酶及经过修饰的核苷酸可应用于上述光侦测装置。在一些实施例中，上述核苷酸可包括一共价连结之可侦测的标记，例如，一荧光标记、以及一保护基团(blocking group)以防止任何二次延伸(secondary extension)。因此，上述测序停止于增加一单一核苷酸至测序引物的3’端之后。

在一碱基延伸测序反应之实施例的第一步骤中，可藉由一ＤＮＡ聚合酶将具有一荧光封闭基团的核苷酸加入至测序引物的3’端。在一些实施例中，上述荧光标记可作为上述封闭基团。在其它的实施例中，上述荧光标记可为独立的基团。一单一核苷酸可在测序引物的3’端被并入，并且藉由其本身的标记被对应的光侦测器辨识。接着，例如，藉由化学或酶溶解作用(lysis)，移除上述荧光标记及封闭基团，以容许碱基延伸额外增加的周期。在一些实施例中，可同时或依序以及以任何顺序，移除标记与封闭基团。藉由编排碱基加入的顺序，可以3’至5’的方向，一次一个碱基地推演出样本核酸的序列。

一般而言，有两种在逐步延伸期间辨认增加之核苷酸的方法。在第一种情形中，四个核苷酸可都具有相同之可侦测的标记，但是以一预先决定的顺序一次增加一个。延伸的核苷酸的性质可取决于上述核苷酸在延伸反应中加入的顺序。在第二种于延伸期间辨认完整(integrated)之碱基的模态中，四个不同的核苷酸可同时加入，且每个核苷酸个自与不同之可侦测的荧光标记耦合。在不同的实施例中，激发光谱或发射光谱及/或标记的强度可能不同。在延伸反应中加入之核苷酸的性质可取决于上述侦测之标记的强度及/或波长(亦即，激发光谱或发射光谱)。

2.2.2.2 合成测序：多步骤延伸(Sequencing by Synthesis:Multi-stepExtension)

在一些实施例中，可利用多重连续的延伸反应(multiple uninterruptedextensions)，例如，不使用封闭基团，来处理合成的测序。在这些实施例中，藉由侦测在核苷三磷酸(nucleoside triphosphate)水解之后，亦即β与γ磷酸盐复合物(phosphate complex)的释放之后，焦磷酸根(pyrophosphate)的释放，可监测上述聚合反应。例如，藉由一在此复合物上的荧光部分(fluorescentmoiety)，可直接侦测此复合物，或例如，藉由将上述磷酸盐耦合至一化学或生物发光侦测系统，可间接侦测此复合物。

在一些实施例中，藉由利用经过末端荧光标定的核苷酸，可基本上(essentially)持续地测序上述样本核酸。末端荧光标定的核苷酸以及其使用的方法之示范的实施例，描述于，例如美国专利号U.S.Patent No.7,361,466以及美国专利公开号U.S.Patent Publication No.2007/0141598，公开于June 21,2007。简言之，上述核苷酸可应用于上述侦测系统，并且当此核苷酸在聚合反应期间被水解时，上述被标定的磷酸根可被对应的光侦测器侦测。在一些实施例中，上述核苷酸可包括：不能区别的(indistinguishable)，例如，相同的(identical)，标记，并且之后以一预先决定的顺序加入。具有不能区别的标记之核苷酸之连续的(Sequential)、循环的(cyclical)增加，还容许多个、不间断的(uninterrupted)聚合步骤，例如，在均聚合物(homopolymer)序列中。

2.2.3 其它的应用

上述侦测装置可同时侦测数百万个核酸片段。如果每个片段的长度为，例如，1000个碱基，一单一装置可一次获得数十亿个以上的碱基序列。下文将讨论本说明书中所提供的系统及方法之其它的应用。

2.2.3.1 全基因组测序(Whole-Genome Sequencing)

上述侦测系统可被用于进行全部或部分基因组的测序，例如：病毒、细菌、真菌、真核细胞、或像是人类等的哺乳动物等之脊椎动物的基因组测序。

染色体DNA(Genomic DNA)可被剪切成至少20、50、100、200、300、500、800、1200、1500个核苷酸或更长之测序的片段。在一些实施例中，被剪切的染色体DNA的长度可为20至50、20至100、20至500、20至1000、500至1200、或500至1500个核苷酸。在一些实施例中，待测序的核酸，与相关之末端的连结引物，可形成单一链、黏着(annealed)至一测序的引物、以及应用于如上述测序的侦测系统。

2.2.3.2 基因表达分析检测(Gene Expression Profiling)

在其它的实施例中，上述侦测系统可用于将基因表达分析检测(geneexpression profiling)的cDNA测序。例如，藉由计算在一装置上侦测的特测序列之相对频率(relative frequency)，可量化mRNA的阶层(mRNA levels)。在如本说明书中所描述的装置上，数百万个cDNA分子可同时被测序。如果一个细胞平均包含350,000个mRNA分子，在一百万个测序反应中，一呈现甚至每个细胞一个复制的转录体(transcript)，预计被测序约三次。因此，利用单一拷贝数的灵敏度(single-copy-number sensitivity)，上述侦测系统适用于单分子测序。在其它的实施例中，上述侦测系统可被用于直接将基因表达分析检测(gene expression profiling)的RNA测序(亦即，直接的RNA测序，参阅例如，Ozsolak et al.,Nature 461:814-818(2009))。

cDNA的合成在所属技术领域中已广为知悉，其通常包括具有选择性富集之mRNA(optional enrichment of mRNA)的全RNA之抽取。藉由以下步骤，包括：例如，第一链之合成的反转录；核糖核酸水解酶(RNAse)处理；移除残留的RNA；上述第一链之随机的六聚体启动(random hexamer priming)；以及藉由DNA聚合酶合成第二链，自mRNA产生cDNA。上述产生的sDNA适用于在本说明书中所述之系统上的测序。分离与准备DNA及RNA两者的方法在所属技术领域中已广为知悉。参见，例如，Joseph Sambrook及DavidRussell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory Press;第三版(2001)。

2.2.3.3 其它的侦测方法

(a)荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)

在一些实施例中，可藉由荧光共振能量转移(Fluorescence resonanceenergy transfer,FRET)，于侦测系统上侦测一分子。如所属技术领域中所知，当一受到激发的供体(donor)分子非辐射地(non-radiatively)转移能量至一受体(acceptor)分子时，上述分子发射出能量，此能量一般为光线，会发生荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)。藉由提供较大的光谱分离(greater spectral separation)，上述光谱分离介于有效激发驱以及侦测中的分子之发射波长之间，荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energytransfer,FRET)能够有助于减少背景光线。由于FRET的效率会以供体与受体之间距离的六次方的速度衰减，荧光共振能量转移(Fluorescence resonanceenergy transfer,FRET)常用于侦测邻近分子间的交互作用。例如，Zhang等人(Nature Materials 4:826-31[2005])藉由FRET来侦测核酸的杂交(hybridization)。被生物素化的核酸标的(biotinylated nucleic acid target)结合至具有抗生物蛋白涂层的量子点供体(avidin-coated quantum dot donor)，接着，上述量子点供体激发Cy5结合的DNA探针(Cy5-conjugated DNA probe)。在一些实施例中，在样本溶液中游离之被标定的分子，以及接合至上述游离的分子且被定位于可动式光耦合器的表面上之被标定的分子或分子复合物，可形成一供体/受体对(donor/acceptor pair，反之亦然)，以用于FRET的侦测。

在一些利用侦测系统之核酸测序的实施例中，经荧光标定的核苷酸可作为一黏附至聚合酶或连结酶之供体发色团(chromophore)的受体发色团(chromophore)。因此，在这些实施例中，上述定位于聚合酶或连结酶上的供体发色团可激发一位于核苷酸上的受体发色团，上述核苷酸正在目标核酸上进行聚合，或正在连结至目标核酸。没有接近聚合酶的核苷酸，由于其荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)的效率快速的下降，可能不会被激发。在一些实施例中，上述供体分子可为，例如，另一个荧光基团(fluorophore)，例如：一量子点。量子点，例如：所属技术领域中已知的半导体量子点，其描述于，例如，国际专利公开号International PatentPublication No.WO 03/003015。将量子点耦合至，例如：所属技术领域中已知的生物分子，如回顾于，例如：Mednitz et al.,Nature Materials 4:235-46(2005)、以及U.S.Patent Publication Nos.2006/0068506及2008/0087843，其分别公开发表于March 30,2006以及April 17,2008。在一些实施例中，量子点可结合(conjugated)至DNA聚合酶分子。如前面已经讨论，将酶结合至交联剂位置，熟知技术者应可了解，当结合荧光基团至，例如，DNA聚合酶或连结酶，必须注意藉由降低任何因为将荧光基团结合至酶之初级、二级、三级结构所造成的影响，以保留酶的功能。

(b)多光子激发(Multi-Photon Excitation)

在一些实施例中，一发色团可被两个或两个以上的光子激发。例如，在一些实施例中，在荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)中，无论是供体发色团或受体发色团皆可透过两个或更多个光子。双光子以及多光子激发进一步描述于，例如，美国专利U.S.Patent Nos.6,344,653以及5,034,613。

(c)时间解析侦测(Time-Resolved Detection)

在一些实施例中，可调整上述激发光源以及一侦测系统的光侦测器，以具有特有的相移(characteristic phase shift)。利用所属技术领域中已知的方法，例如，揭露于美国专利公开号Patent Publication No.2008/0037008，其公开于February 14,2008，可藉由一对应的光侦测器来测量来自一正在侦测系统上被侦测的分子所发出的光线，而不被来自激发光源所干扰。

(d)其它荧光侦测系统及方法

在一些实施例中，方法系关于由至少一在生物细胞中的目标物所发射之光线的侦测，上述生物细胞可为一活细胞或固定细胞(living or fixed cell)。在一些实施例中，至少一目标物选自：至少一包括至少一量子点的目标物、至少一包括至少一荧光蛋白的目标物、以及至少一包括至少一荧光小化学部分(fluorescent small chemical moiety)的目标物。在一些实施例中，至少一目标物经荧光标定，且包括至少一寡核苷酸、多核苷酸、寡肽、多肽、寡糖、多糖、或脂质。

在一些实施例中，上述至少一个目标物包括一固定并且受限制之数量的荧光基团，例如至少20、10、5、或2个荧光基团，上述荧光基团可选自量子点、荧光蛋白、以及荧光小化学部分(fluorescent small chemical moiety)。在一些实施例中，荧光小化学部分具有一介于300至800nm之间的发射峰(emission peak)及/或一至少为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、或0.9的量子产率(quantum yield)(发射的光子/每个峰值吸收波长的光子)。

3.实施例

3.1实施例1、具有核酸合成反应复合物定位于其表面上的纳米球光耦合器之准备

利用第8图中所示的过程来建构一单链环状的DNA模板。将一群(pool)的目标双链核酸片段变性(denatured)并与本身互补的衔接核酸分子(self-complementary adapter nucleic acid molecules)结合。上述衔接核酸分子包括与每个目标核酸片段的末端互补的突出序列(overhanging sequences)。上述衔接分子(adapter molecule)可黏着(anneal)于单链目标链，以及加入一连结的酶以将上述衔接分子连接至每个目标核酸片段。然后，将此连结的产物变性并且与一连结的核酸分子相结合，上述连结的核酸分子与两个连结至各个目标链之末端的衔接分子序列互补。然后，利用一连结的酶将每个目标链环化。

上述经环化的目标链以及经杂交的连结核酸分子，与一DNA聚合酶、dNTP、以及合适的缓冲成分结合，以形成一核酸合成反应复合物(nucleicacid-synthesizing reaction complex)，其中上述连结的核酸分子可作为一测序的引物。接着，以连续的方式复制上述目标链，其中聚合酶重复地围绕着上述环状模板，在上述模板的连续复制(successive replications)中，进行自上述模板新生之链的置换及复制。此产生一新生的DNA链，其包含上述目标核酸之互补链的多重复制片段，藉由一具有上述测序引物之序列的片段，将其中的每个复制的目标核酸互补链分开。

利用链霉抗生素蛋白(streptavidin)对纳米球粒子的表面进行化学修饰。将经生物素化的寡核苷酸引物，其包括一与测序引物(上述连结的核酸分子)的序列互补的序列，与经链霉抗生素蛋白(streptavidin)修饰的纳米球结合，以便将上述经生物素化的引物连结至上述纳米球。将具有上述寡核苷酸涂层的纳米球与上述反应复合物结合，上述反应复合物包括DNA聚合酶、环状的模板链、以及描述于前段(in the preceeding paragraph)中之复制的链。镶嵌在上述复制的链中之测序引物的序列，与固定在纳米球的表面上之上述寡核苷酸杂交，进而将上述反应复合物固定(anchoring)至纳米球的表面，如图9所示。

3.2实施例2、利用特定的引物将核酸合成反应复合物定位于一半球上的纳米球光耦合器之准备

利用链霉抗生素蛋白(streptavidin)修饰在一半球上的一纳米球粒子。将经生物素化的寡核苷酸引物，其各包括一与测序引物(例如，在第8图中所示之连结的核酸分子)之序列互补的序列，与具有链霉抗生素蛋白(streptavidin)涂层的纳米球结合，以便将上述经生物素化的引物连结至上述纳米球之具有链霉抗生素蛋白(streptavidin)涂层的半球。将上述具有寡核苷酸涂层的纳米球，与一反应复合物结合，上述反应复合物包括DNA聚合酶、环状的模板链、以及描述于实施例1中之复制的链。镶嵌在上述复制的链中之测序引物的序列，与固定在纳米球的一半球上之上述互补的寡核苷酸杂交，进而将上述反应复合物固定(anchoring)至纳米球的表面，如图10所示。

3.3 实施例3、利用随机序列的引物将核酸合成反应复合物定位于一半球上的纳米球光耦合器之准备

利用链霉抗生素蛋白(streptavidin)修饰在一半球上的一纳米球。将经生物素化的寡核苷酸引物，其中包括随机的核苷酸序列，与具有链霉抗生素蛋白(streptavidin)涂层的纳米球结合，以便将上述经生物素化的引物连结至上述纳米球之具有链霉抗生素蛋白(streptavidin)涂层的半球。将上述具有寡核苷酸涂层的纳米球，与一反应复合物结合，上述反应复合物包括DNA聚合酶、环状的模板链、以及描述于实施例1中之复制的链。上述新生复制的链与固定在纳米球的一半球上之寡核苷酸杂交，进而将上述反应复合物固定(anchoring)至纳米球的表面，如图11所示。

3.4 实施例4、藉由一经生物素化、双链的模板将核酸合成反应复合物定位于一半球上的纳米球光耦合器之准备

利用在图2中所示之过程，建构一双链之环状的DNA模板。将一群(pool)的目标双链核酸片段变性(denatured)并与本身互补的衔接核酸分子(self-complementary adapter nucleic acid molecules)结合。上述衔接核酸分子包括与每个目标核酸片段之一链的末端互补的突出序列(overhangingsequences)。上述衔接分子(adapter molecule)可黏着(anneal)于单链目标链，以及加入一连结的酶以将上述衔接分子连接至每个目标核酸片段。然后，将此连结的产物变性并且与一连结的核酸分子相结合，上述连结的核酸分子与两个连结至各个目标链之末端的衔接分子序列互补。然后，利用一连结的酶将每个目标链环化。

将一核酸聚合酶以及一由生物素标记的dUTP(biotin-dUTP)来补充之dNTP的混合物，加入至经黏着(annealed)的DNA分子。上述杂交连结的核酸分子可作为一测序引物，并且利用一不具有链置换活性(strand-displacingactivity)的聚合酶，来合成一包括经生物素化的尿嘧啶碱基(uracil bases)。当上述聚合酶完成第二链的合成时，一包含于上述合成反应物中之连结的酶，形成一封闭的、环状的双链DNA。

将上述封闭的、环状的双链DNA变性，并且与一具有被链霉抗生素蛋白(streptavidin)修饰之半球的纳米级粒子混合。待被贴附之单一模板/每个纳米球粒子，以一合适的摩尔数比(molar ratio)，结合上述的DNA与被链霉抗生素蛋白修饰的粒子，如图13A所示。借助与定位于纳米球的表面上之经生物素化的链缠绕在一起，将未经生物素化的链定位于纳米球的表面上。

DNA聚合酶、与目标链互补的测序引物、荧光标记的dNTPs、以及合适的缓冲成分，与纳米球及接合的模板结合，使得DNA合成反应复合物形成于纳米球的表面上(图13B)。聚合酶围绕着上述模板进行，形成一新生合成的链(图13C)。

3.5 实施例5、一具有一表面定位之核酸合成复合物之磁性纳米球于一导波器的应接位置之定位

利用磁性的官能基，将一纳米球粒子均匀地(uniformly)进行表面修饰。将一核酸合成反应复合物定位至在实施例1中所述的纳米球之经磁性修饰的表面上。利用位于上述应接位置之下的经微制造的线圈(micro-fabricatedcoils)，将具有表面定位的反应复合物的纳米球，定位于一形成于一导波器中的应接位置。将电流传递通过上述经微制造的线圈，产生一磁场，上述磁场将具有表面定位之反应复合物的纳米球留置(traps)于上述应接位置。因此，上述反应复合物被定位于光耦合器的表面上，上述光耦合器在导波器中的应接位置，以及可被定位于邻近导波器的核心层之表面的秘密空间中。

3.6实施例6、一具有一表面定位之核酸合成复合物之不对称的磁性纳米球于一导波器的应接位置之定位

利用磁性的官能基，于一纳米球粒子之部分的表面上进行表面修饰。一核酸合成反应复合物被定位至在实施例2-4中所述的纳米球之上述经磁性修饰的表面上，其中上述纳米球之被磁性官能基修饰之相同的表面，亦被链霉抗生素蛋白(streptavidin)修饰。利用位于上述应接位置之下的经微制造的线圈(micro-fabricated coils)，将具有表面定位的反应复合物的纳米球，定位于一形成于一导波器中的应接位置。将电流传递通过上述经微制造的线圈，产生一磁场，上述磁场将具有被吸收之反应复合物的纳米球留置(traps)于上述应接位置。因此，上述反应复合物被定位于光耦合器的表面上，上述光耦合器被定位于导波器中，上述导波器位于邻近导波器的核心层之表面的秘密空间中。

3.7实施例7、一具有一表面定位之核酸合成复合物之经导电材料修饰的纳米球于一导波器的应接位置之定位

利用导电材料(conducting material)，例如包括带电荷之官能基团的材料，均匀地修饰一纳米球粒子。将一核酸合成反应复合物定位至在实施例1中所述的纳米球之经导电材料修饰的表面上。利用于上述应接位置之经微制造的电极(micro-fabricated electrode)，将具有表面定位的反应复合物的纳米球，定位于一形成于一导波器中的应接位置。上述经微制造的电极包括一位于应接位置之下的玻片，其中上述玻片具有一导电材料，例如氧化铟锡(indium tinoxide)的涂层，上述导电材料作为电极的导电表面(electrode conductingsurface)。一玻片，其具有一导电材料的相似涂层，并且位于包含载有上述反应复合物之纳米球的相同溶液之上，此玻片作为抵销电极(counteractingelectrode)。将电流传递通过上述经微制造的电极，产生一在电极之间的电位差，上述电极将具有表面定位之反应复合物的纳米球留置(traps)于上述应接位置。因此，上述反应复合物被定位于光耦合器的表面上，上述光耦合器在导波器中的应接位置，以及可被定位于邻近导波器的核心层之表面的秘密空间中。

3.8 实施例8、一具有一表面定位之核酸合成复合物之经导电材料不对称地修饰的纳米球于一导波器的应接位置之定位

利用导电材料，于一纳米球粒子之部分的表面上进行表面修饰。一核酸合成反应复合物被定位至在实施例2-4中任一个所述的纳米球之经导电材料修饰的表面上，其中上述纳米球之被导电材料修饰之相同的表面，亦被链霉抗生素蛋白(streptavidin)修饰。利用位于上述应接位置之经微制造的电极(micro-fabricated electrode)，将具有表面定位的反应复合物的纳米球，定位于一形成于一导波器中的应接位置。上述经微制造的电极包括一位于应接位置之下的玻片，其中上述玻片具有一导电材料，例如氧化铟锡(indium tin oxide)，的涂层，上述导电材料作为电极的导电表面(electrode conducting surface)。一玻片，其具有一导电材料的相似涂层，并且位于包含载有上述反应复合物之纳米球的相同溶液之上，此玻片作为抵销电极(counteracting electrode)。将电流传递通过上述经微制造的电极，产生一在电极之间的电位差，利用被导电材料修饰之纳米球的表面，以及面向导波器之核心层的反应复合物，上述电极将具有表面定位之反应复合物的纳米球留置(traps)于上述应接位置。因此，上述反应复合物被定位于邻近导波器的核心层之表面的秘密空间中的应接位置。

3.9 实施例9、一具有一表面定位之核酸合成复合物之经亲水性基团修饰的纳米球于一导波器的应接位置之定位

利用亲水性官能基团于纳米球粒子的一半球，以及利用疏水性基团于纳米球粒子的其它半球上，修饰一纳米球粒子。一核酸合成反应复合物被定位于在实施例2-4中任一个所述的纳米球之亲水性表面上，其中上述纳米球之被亲水性基团修饰之相同的表面，亦被链霉抗生素蛋白(streptavidin)修饰。具有表面定位反应复合物的的纳米球被定位于一应接位置，上述应接位置在反应位置处具有亲水性的表面修饰，并且在反应位置外具有疏水性的表面修饰，如图6中所示(其中表面1与表面3为亲水性，表面2与表面4为疏水性)。利用具有被安置在反应位置处的定位反应复合物之纳米球的亲水性表面，上述纳米球定向(orients)于应接位置，并且面向导波器的核心层。因此，上述反应复合物被定位于邻近导波器的核心层之表面的秘密空间中的应接位置。

3.10 实施例10、一定位于一可动式光耦合器上之核酸合成反应复合物的测序

一被定位于一纳米球粒子上的核酸合成反应复合物，上述核酸合成反应复合物被定位于一形成于在实施例5-9中任一个所述的导波器中的一应接位置。上述样本溶液包括：利用各个dATP、dCTP、dGTP、以及dTTP之独特的荧光基团，于其β及γ位置之磷酸根处标记的dNTPs。可利用外加的测序反应物，例如DNA聚合酶与合适的缓冲成分，来补充上述样本溶液。介于DNA复制叉(DNA replication fork)与纳米球的表面之间的距离范围介于数十至数百纳米。在上述合成反应的各个步骤，标记的dNTPs的四种类型中的一种与上述反应复合物的活性位置结合(associates)，其中其碱基与上述目标核酸之对应的碱基相配对。上述荧光标记被消逝波场(evanescent light field)激发，上述消逝波场形成于应接位置的底部，及/或被自纳米球之表面所辐射发散(radiating)的光场激发。将荧光标记的多磷酸核苷酸(nucleotidepolyphosphate)于活性位置合并进入生长中的核苷酸链，藉由侦测dNTP连结之荧光基团(dNTP-linked fluorophore)的发射，可实时(real-time)侦测上述合并反应。各个被合并的核苷酸的特性取决于其荧光标记，其中在合并进入上述生长中的链之后，紧接着将上述荧光标记与核苷酸分开。藉由将于聚合反应期间侦测之荧光发射讯息的序列转换成一核酸序列，来衍生(derived)出目标核酸的序列。

3.11实施例11、藉由光耦合至纳米球，在直径350nm之纳米球光耦合器的表面周围产生的激发光场之模拟

传递穿过包括一应接位置以及一纳米球光耦合器之单一模态的导波器(single mode waveguide)的激发光之模拟，说明一纳米球可与来自单一模态的导波器的光线耦合。第14图中说明一包括一单一模态的导波器之仿真的侦测系统，上述单一模态的导波器包括一可动式光耦合器的应接位置、以及一纳米球光耦合器。在上述仿真的系统中，上述光耦合器之纳米球(Ta₂O₅)以及导波器之核心层(Ta₂O₅)两者的折射率皆为2.26。上述单一模态之导波器的厚度为100nm，以及下部被覆层(lower cladding layer)的厚度为500nm。上述导波器的被覆层系由SiO₂所组成，其折射率为1.487。上述可动式光耦合器纳米球之直径为350nm，并且被配置于应接位置。上述应接位置系为一倒置的(inverted)、圆锥形的纳米井，且上述纳米井具有一为112.6°的全张角度(opening angle，亦即自圆锥的一边至正对面的一边)。上述纳米井之环状底部的直径为100nm，并且以折射率为1.33的水来填充上述纳米井。在这样的结构中，光耦合器核心层皆允许具有单一横向电波(transverse electric，TE)以及横向磁波(transverse magnetic，TM)模态之光波的传播。

入射光的波长为473nm。利用无耗损的马克斯威尔方程式(source-freeMaxwell’s equations)，来计算在上述系统中之稳态电场(stationary electric field)及稳态磁场的分布。(参见Katrin Schmitt与Christian Hoffmann,“High-Refractive-Index Waveguide Platforms for Chemical and Biosensing”,inOptical Guided-wave Chemical and Biosensors I,Springer Series on ChemicalSensors and Biosensors 7,21(M.Zourob与A.Lakhtakia eds.,2009.))。

在此结构中，横向电波模态场域(TE-mode field)以及横向磁波模态场域(TM-mode field)，两者皆沿着导波器的核心层以及上述纳米球的表面区域传播，如第15图(横向电波模态场域)及第16图(横向磁波模态场域)中所示。如同上述稳态电场，一部分的稳态磁场自核心层转移至上述纳米球的表面区域，如第17图中所示。

在进一步的模拟中，将应接位置延伸进入导波器的核心层。上述系统的特定能量场分布显示于第18A、B、C图中，其中上述纳米井不会延伸进入上述核心层、部分延伸进入上述核心层、以及完全延伸进入上述核心层。在第18A、B、C图的左边之图式(标记(a))描述在导波器中的能量场分布之特定强度的轮廓(intensity contours)。在第18A、B、C图的右边之图式(标记(b))描述当纳米球被置于应接位置时，在系统中的能量场分布之特定强度的轮廓(intensity contours)。在纳米球不存在的情况下，且基于上述三种纳米井延伸的情形时，模拟皆显示出特定能量在导波器中的传递。然而，当纳米球被置于应接位置时，导波器中的传递能量即耦合至纳米球之表面。随着应接位置延伸进入导波器之核心层的距离增加，耦合至纳米球之表面能量强度也跟着增加。

3.12实施例12、藉由光耦合至纳米球，在直径350nm之纳米球光耦合器的表面周围产生的激发光场之模拟

与实施例11中所描述的模拟方式相似，Ta₂O₅光耦合器纳米球的直径为100nm。单一模态波长之Ta₂O₅核心层的厚度为100nm。导波器的被覆层系由SiO₂所构成。下部被覆层的厚度为500nm。上述应接位置为一圆锥形的纳米井，且此圆锥形的纳米井的全张角度(亦即自圆锥的一边至正对面的一边)为112.6°。上述纳米井之环状底部的直径为100nm，并且以折射率为1.33的水来填充上述纳米井。第19图系根据此结构所仿真之侦测系统的示意图。入射波为一波长473nm之TE偏极光场(TE-polarized optical field)。上述电场传递于导波器之核心层，如第20图(a，右边图式)中所示，第20图(a)系上述模拟之稳态电场之分布。上述仿真系统的特定能量分布如第20图(b)中所示，其说明了在上述导波器中的传递能量耦合至纳米球之表面(在右边以高放大倍率显示)。

在进一步的模拟中，利用第19图所示的系统，但是导波器之核心层的厚度为50nm而非100nm。入射波为一波长473nm之TE偏极光场(TE-polarized optical field)。上述模拟之静电场分布显示于第21图中。导波器中的传递能量耦合至纳米球之表面显示于第21图之下面的图式中。

在进一步的模拟中，，利用第19图所示的系统，但是导波器之核心层的厚度为150nm而非100nm。入射波为一波长473nm之TE偏极光场(TE-polarized optical field)。上述模拟之稳态电场分布显示于第22图中。导波器中的传递能量耦合至纳米球之表面显示于第22图之下面的图式中。

在这些结构中，一部分的稳态电场及其能量，自导波器的核心层耦合至纳米球之表面的下方区域，如第20、21、及22图中所示。

Claims (36)

1.一种单分子侦测系统，包括：

a)一可动式光耦合器；

b)一导波器；包括：

一核心层；以及

一第一被覆层；

其中至少一该可动式光耦合器之应接位置至少形成于该第一被覆层中；以及

c)一光侦测器。

2.如权利要求1所述之侦测系统，其中更包括一光源。

3.如权利要求1所述之侦测系统，其中该可动式光耦合器能够将目标分子定位(localize)在该至少一应接位置。

4.如权利要求1所述之侦测系统，其中该至少一该可动式光耦合器之应接位置为一纳米井。

5.如权利要求1所述之侦测系统，其中该可动式光耦合器为一纳米级粒子。

6.如权利要求5所述之侦测系统，其中该纳米级粒子的直径为一光波波长的约1/10至两倍，且该光波沿着该核心层传播。

7.如权利要求1所述之侦测系统，其中该至少一应接位置延伸穿过该第一被覆层的全部厚度。

8.如权利要求1所述之侦测系统，其中该至少一应接位置延伸穿过该第一被覆层的全部厚度，以及该核心层之部分厚度。

9.如权利要求1所述之侦测系统，其中该至少一应接位置延伸穿过该第一被覆层的全部厚度，以及该核心层的全部厚度。

10.如权利要求1所述之侦测系统，其中该核心层系由一材料所构成，且该材料选自至少下列之一：Si_xTi_1-XO₂、TiO₂、Ta₂O₅、Nb₂O₅、HfO₂、Al₂O₃、ZrO₂、ZnS、SiN_x、AlN_x、TiN_x、PC、PMMA、或Su8。

11.如权利要求1所述之侦测系统，其中该可动式光耦合器系由一材料所构成，且该材料选自：氧化物、聚合物、金属、硫化物、硒化物、或氮化物。

12.如权利要求11所述之侦测系统，其中该可动式光耦合器系由一氧化物所构成。

13.如权利要求12所述之侦测系统，其中该氧化物系选自：SiO₂、TiO₂、Ta₂O₅、或Fe₃O₄。

14.如权利要求11所述之侦测系统，其中该可动式光耦合器系由一聚合物所构成。

15.如权利要求14所述之侦测系统，其中该可动式光耦合器系由一聚苯乙烯所构成。

16.如权利要求1所述之侦测系统，其中该可动式光耦合器具有一核壳结构，包括一核心材料及一壳体材料。

17.如权利要求16所述之侦测系统，其中该核心材料及该壳体材料相异，且各自独立地选自：氧化物、聚合物、金属、硫化物、硒化物、或氮化物。

18.如权利要求1所述之侦测系统，其中该可动式光耦合器能够在其表面的至少一部分上携带一目标分子，且该表面邻近在该应接位置中的该核心层。

19.如权利要求18所述之侦测系统，其中该可动式光耦合器具有一性质，藉由该性质，可将该光耦合器以一特定的方向定位(located)于该应接位置。

20.如权利要求19所述之侦测系统，其中该可动式光耦合器为一磁性粒子。

21.如权利要求18所述之侦测系统，其中一或多个该可动式光耦合器之表面区域经过修饰。

22.权利要求21所述之侦测系统，其中一该可动式光耦合器之表面区域经过修饰。

23.如权利要求22所述之侦测系统，其中该可动式光耦合器之修饰区域占该可动式光耦合器之表面的约10%至90%。

24.如权利要求21所述之侦测系统，其中两个该可动式光耦合器之表面区域经过修饰。

25.如权利要求21所述之侦测系统，其中该修饰包括化学修饰。

26.如权利要求25所述之侦测系统，其中该化学修饰为利用一官能基团的修饰，且该官能基选自一亲水性基团或一疏水性基团。

27.如权利要求26所述之侦测系统，其中该亲水性基团为一带电荷的基团。

28.如权利要求25所述之侦测系统，其中该化学修饰为利用一配位体配位基团的修饰。

29.如权利要求25所述之侦测系统，其中该化学修饰为利用一聚合物的被覆涂层。

30.如权利要求25所述之侦测系统，其中该化学修饰为利用一磁性材料的修饰。

31.如权利要求21所述之侦测系统，其中该可动式光耦合器包括一表面修饰的区域，且该表面修饰的区域具有对该应接位置的亲合力。

32.如权利要求21所述之侦测系统，其中该可动式光耦合器包括一表面修饰的区域，且该表面修饰受到该应接位置的排斥。

33.如权利要求21所述之侦测系统，其中该可动式光耦合器被一寡核苷酸修饰。

34.一种单分子目标物的侦测方法，包括：

a)将一入射光自一光源引导进入一导波器，从而在该导波器中形成一激发光；

b)将一单分子目标物定位(localizing)于一可动式光耦合器上；

c)将(b)的可动式光耦合器定位(localizing)于一应接位置，该应接位置为形成于该导波器之至少一第一被覆层中之一可动式光耦合器的应接位置；以及

d)藉由该激发光来激发被定位(localized)于该可动式光耦合器上之该单分子目标物，使该单分子目标物发射出一光线以被一光侦测器侦测。

35.一种单分子目标物的侦测方法，包括：

a)提供一侦测装置，包括：

i)一可动式光耦合器；

ii)一导波器，包括：

一核心层；以及

一第一被覆层，

其中至少一该可动式光耦合器之应接位置至少形成于该第一被覆层中；以及

iii)一光侦测器；

b)提供至少一结合部分，其能够与一单分子目标物结合；

c)将该至少一该结合部分个别地定位(localizing)于该可动式光耦合器上；

d)提供一单分子目标物分子给该定位于该可动式光耦合器上的定位于该可动式光耦合器上的至少一结合部分；

e)将定位有该至少一结合部分及单分子目标物的该可动式光耦合器定位(localizing)于该应接位置处；

f)将一入射光自一光源引导进入该导波器，从而形成一激发光于该导波器中；

g)藉由该激发光来激发该单分子目标物分子，使得该单分子目标物发射出一光线以被一光侦测器侦测，其中该单分子目标物分子结合至该定位于该可动式光耦合器上的至少一结合部分，且该至少一结合部分定位于该可动式光耦合器上。

36.一种核酸的测序方法，包括：

a)提供一侦测装置，包括：

i)一可动式光耦合器；

ii)一导波器，包括：

一核心层；以及

一第一被覆层，

其中至少一该可动式光耦合器之应接位置至少形成于该第一被覆层中；以及

iii)一光侦测器；

b)提供至少一核酸分子；

c)将该至少一核酸分子个别地定位(localizing)于该可动式光耦合器上；

d)将该定位有该至少一核酸的可动式光耦合器定位(localizing)于该应接位置；

e)将该至少一核酸分子进行该单分子合成测序，其中该单分子核酸的合成测序导致产生一发射光，该发射光与至少一该核酸中的碱基之特性有关；

f)利用该侦测器侦测该发射光，产生一输出讯号；以及

g)处理该输出讯号以决定至少一该核酸所包含的碱基之特性。

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