TWI461684B

TWI461684B - 單分子偵測系統及方法

Info

Publication number: TWI461684B
Application number: TW100108476A
Authority: TW
Inventors: Chung Fan Chiou; Ying Chih Pu; Chao Chi Pan; Chih Tsung Shih; Ming Chia Li; Chein Shiu Kuo; Hung Chi Chien; Chang Sheng Chu
Original assignee: Ind Tech Res Inst
Priority date: 2010-03-15
Filing date: 2011-03-14
Publication date: 2014-11-21
Also published as: JP5937658B2; AU2011229691B2; CN102686997A; AU2011229691A1; JP5878486B2; JP2013522605A; JP2015072276A; EP2430428C0; US9482615B2; KR101352144B1; WO2011113345A1; CN102686997B; CA2763100A1; EP2430428B1; US20170009286A1; CA2763100C; US20110223590A1; TW201137341A; EP2430428A1; WO2011113345A4

Description

單分子偵測系統及方法

本發明關於單分子偵測系統及使用此偵測系統以偵測目標物的方法。此外，本發明尚關於一偵測系統，其包括一可動式光耦合器、一導波管、以及一光偵測器。本發明亦關於將樣本載入至單分子偵測系統的方法。本發明還關於單分子偵測的方法，包括單分子核酸定序的方法。

大部分傳統的化學或生物化學分析係根據”大批(bulk)”檢測。在上述檢測中，檢測在樣本溶液之特定體積中的複數個分子的集體行為(collective behavior)，以決定分子的特性。然而，在很多情況下，並無法利用大批的檢測方法，例如當樣本體積太小或目標物的濃度太低，使得在偵測目標分子上，產生靈敏度之技術的限制時。最近幾年，單分子的偵測已經變得可行。單分子偵測提供遠高於傳統上大批檢測的靈敏度，以及提供更詳細的資訊。單分子的儀器靈敏度的發展亦預告了高靈敏度的生物分子偵測及診斷的新契機，如Qiu,H.等人所描述，”細胞激素及化學激素的高靈敏度偵測之螢光單分子計數分析(Fluorescence single-molecule counting assays for high-sensitivity detection of cytokines and chemokines)”，Clinical Chemistry 53(11):2010-2012(2007)。

Moerner,W.E.與Fromm,D.P提供實現單分子偵測的方法的描述，”回顧評論：單分子螢光光譜及顯微鏡使用的方法(REVIEW ARTICLE: Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy)”，Review of Scientific Instruments 74(8): 3597-3619(2003)，以及Walter,N.G.等人”自己動手指南：如何使用現代單分子工具組(Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit)”，Nature Methods 5:475-489(2008)。這些回顧評論亦討論了所屬技術領域中，已經用於或計畫用於單分子偵測之習知的方法與設備。單分子偵測的應用包括單分子DNA序列、單分子生物標誌偵測以及微型化的流式細胞計數偵測。

單分子偵測的最佳化系統及方法在加速DNA定序技術上具有很大的潛力。人類基因體計畫(Human Genome Project,HGP)刺激了DNA定序通量上的快速增加。這種增加，隨著技術的改進，使得定序的成本相對應的下跌。雖然第一組基因體需要費時13年並花費將近三十億美金才得以完成定序，然而已經可預見DNA定序技術最終將使得個人的染色體定序變得足以負擔，並且成為一般臨床照護中不可或缺的一部分(McGuire et al.,Science 317:1687(2007))。對於病患及健康照護提供者來說，個人的基因體代表一醫學治療上之方法的根本轉變(paradigm shift)。藉由管理疾病的遺傳危險因子(genetic risk factors)，健康照護提供者可更容易地實踐預防醫學，並且提供客製化的治療。利用已完成的基因體大銀行，藥物設計以及給藥可更有效率，因此加速了藥物基因體學(pharmacogenomics)之新生領域的發展。然而，上述的加速係仰賴健全的、高通量的、以及低成本的DNA定序技術的實現。

為了完成單分子偵測，光學系統必須可以選擇性地激發在複雜環境中所關注的重要分子，並且能夠避免背景雜訊的干擾，以及偵測自此單分子發射出來了微弱光線。完成單一分子偵測的方法之一係將此所關注的重要分子上置於一固定空間內，加強自單分子發射出來之光線的偵測。美國專利號U.S. Patent No. 6,917,726揭露了一顯微鏡系統的產生，此顯微鏡系統合併一零階模態導波管(zero-mode waveguide,ZMW)，可利用奈米級的管井(nano-scale wells)來加強單分子的偵測，上述奈米級的管井限定了激發光場(excitation light fields)。在這些限定了激發光場的奈米井(nanowells)中之分子的配置，大大地降低了雜訊，因而使來自單分子發射出來的光的偵測能力增強。亦可參見，例如，美國專利號U.S. Patent No. 6,917,726、U.S. Patent No. 7,170,050、以及U.S. Patent No. 7,486,865。然而，將單分子樣本載入激發場，需要在奈米井中的分子貼附至ZMW的底部，這不僅困難且效率欠佳(Eid et al.,Science,323:133-138(2009))。只有含有一個單分子樣本的管井有用，而空的管井或含有多重單分子樣本的管井則無效。

美國專利公開號U.S. patent publication no. 2010/0009872揭露了具有較高成功率之改進樣品承載的方法。這些方法利用一奈米級粒子攜帶一單分子樣本至奈米井的頂部開口，並且傳送樣本至管井的底部而可將樣本曝露在激發場下。然而，上述製程包含了多個步驟及化學反應以便將單分子樣本自奈米粒子載體轉移至管井的底部。此外，已承載的管井幾乎不可能或極為困難再被利用。

國際專利公開號International Patent Publication Number WO 2009/017678揭露單分子核酸定序的方法，其中一單聚合脢固定在一表面上以重複定序一環狀核酸模板(circular nucleic acid template)，進而改進單分子定序的準確度。在上述單分子定序的光學偵測的方法中，反應物直接固定在表面上將反應限制在10的-21次方公升(zeptoliter)的體積內。然而將一酵素或一核酸的單分子結合至表面上的困難，限制了高通量定序的運用。此外，一旦聚合脢失去活性，聚合脢直接固定在表面上的定序反應都將被終止，阻止在此處的定序分析之完成。為了固定一分子或酵素於適當的位置，如WO 2009/017678中所述，必須明確界定表面的區域，以及必須精確控制此區域的化學性質。這使得設備製造的變得困難並且增加了成本。因此，業界亟需偵測單分子目標物的改善系統及方法。

本發明提供一種單分子偵測系統，包括：(a)一可動式光耦合器；(b)一導波器；包括：一核心層；以及一第一被覆層；其中至少一該可動式光耦合器之應接位置至少形成於該第一被覆層中；以及(c)一光偵測器。

本發明另提供一種單分子目標物的偵測方法，包括：(a)將一入射光自一光源引導進入一導波器，從而在該導波器中形成一激發光；(b)將一單分子目標物定位(localizing)於一可動式光耦合器上；(c)將(b)的可動式光耦合器定位(localizing)於一應接位置處，該應接位置為形成於該導波器之至少一第一被覆層中之一可動式光耦合器的應接位置；以及(d)藉由該激發光來激發被定位(localized)於該可動式光耦合器上之該單分子目標物，使該單分子目標物發射出一光線以被一光偵測器偵測。

本發明尚提供一種單分子目標物的偵測方法，包括：(a)提供一偵測裝置，包括：(i)一可動式光耦合器(ii)一導波器，包括：一核心層；以及一第一被覆層，其中至少一該可動式光耦合器之應接位置至少形成於該第一被覆層中；以及(iii)一光偵測器；(b)提供至少一結合部分，其能夠與一單分子目標物結合；(c)將該至少一該結合部分個別地定位(localizing)於該可動式光耦合器上；(d)提供一單分子目標物分子給該定位於該可動式光耦合器上的至少一結合部分；(e)將定位有該至少一結合部分及單分子目標物的該可動式光耦合器定位(localizing)於該應接位置處；(f)將一入射光自一光源引導進入該導波器，從而形成一激發光於該導波器中；(g)藉由該激發光來激發該單分子目標物分子，使得該單分子目標物發射出一光線以被一光偵測器偵測，其中該單分子目標物分子結合至該定位於該可動式光耦合器上的至少一結合部分，且該至少一結合部分定位於該可動式光耦合器上。

本發明更提供一種核酸的定序方法，包括：(a)提供一偵測裝置，包括：(i)一可動式光耦合器；(ii)一導波器，包括：一核心層；以及一第一被覆層，其中至少一該可動式光耦合器之應接位置至少形成於該第一被覆層中；以及(iii)一光偵測器；(b)提供至少一核酸分子；(c)將該至少一核酸分子個別地定位(localizing)於該可動式光耦合器上；(d)將該定位有該至少一核酸的可動式光耦合器定位(localizing)於該應接位置；(e)將該定位有該至少一核酸分子進行該至少一核酸分子的單分子合成定序，其中該單分子核酸的合成定序導致產生一發射光，該發射光與至少一該核酸中的鹼基之特性有關；(f)利用該偵測器偵測該發射光，產生一輸出訊號；以及(g)處理該輸出訊號以決定至少一該核酸所包含的鹼基之特性。

為讓本發明所述之目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉出較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如後。可藉由在申請專利範圍中所特別指出的要素和組合來瞭解及得到本發明所述之目的、特徵、和優點。

應可瞭解，本發明說明書之描述與圖式亦僅僅作為說明之用而非用來限定本發明。本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

本說明書中所附圖式係用來配合本發明之說明，並成為本發明之說明的一部分，與說明書中所述內容共同描述本發明之多個實施例，用來解釋其原理。

本發明接下來將會提供許多不同的實施例以實施本發明中不同的特徵。各特定實施例中的組成及配置將會在以下作描述以簡化本發明。這些為實施例並非用於限定本發明。此外，一第一元件形成於一第二元件“上方”、“之上”、“下方”或“之下”可包含實施例中的第一元件與第二元件直接接觸，或也可包含第一元件與第二元件之間更有其他額外元件使第一元件與第二元件無直接接觸。各種元件可能以任意不同比例顯示以使圖示清晰簡潔。此外，在本發明各種不同的範例中，為了簡化與清晰的目的，將重複地使用元件符號及字母，然而其本身並不決定各種實施例及/或結構配置之間的關係。

本發明實施例包括一偵測系統及使用此偵測系統來偵測一如單分子目標物的目標物的方法。上述偵測系統可以偵測自目標物發射出來的微弱光線。

為了完成單分子偵測，光學系統必須可以選擇性地激發在複雜環境中所關注的重要分子，並且能夠避免背景雜訊的干擾，以及偵測自此單分子發射出來了微弱光線。為了完成單分子偵測，在一實施例中，系統至少需具備以下兩個條件：1)兼具固定的激發空間(excitation space)以及固定的觀測空間observation space)；2)上述固定的激發空間及固定的觀測空間應該完全或部份重疊，且該重疊的區域應該夠小到足以確保自目標單分子發射出來的光線高於背景值，以產生可檢測出來的信號雜訊比(signal-to-noise ratio,SNR)。例如，重疊區域的體積通常必須接近或小於千萬分之一升(femtoliter)。尤其是，重疊區域的體積通常必須在10的-18次方公升(attoliter)至10的-21次方公升(zeptoliter)的範圍之間。此外，防止激發光到達偵測器也是很重要的。

本發明實施例利用一可動式光耦合器來攜帶一單分子樣本至一應接位置，克服了載入一單分子樣本至一偵測系統上的困難，其中上述應接位置係用來使可動式光耦合器形成於導波器中。適合單分子偵測之固定的空間可形成於可動式光耦合器靠接(docks)在應接位置之後。可動式光耦合器及應接位置的設計，可防止第二耦合器靠接至同一個應接位置。在一實施例中，在將耦合器引導至導波器之前，如酵素等的單分子樣本，可被定位至耦合器，且在一實施例中，可預先篩選(pre-screened)全部或一個承載之耦合器的樣本，以確保每一個耦合器只攜帶一個樣本分子。由於樣本分子可與光耦合器維持在一起，藉由移除及拋棄光耦合器，即可重複使用上述裝置。由於耦合器攜帶著樣本分子，所以不需要為了直接將樣本分子連結至導波器的表面而改質其表面，因此簡化了裝置的製造。

本發明提供一偵測一單分子目標物的系統，其中上述偵測系統包括一可動式光耦合器(movable light coupler)、一光偵測器、以及一導波器(waveguide)，上述導波器包括一核心層(core layer)、一第一被覆層(first cladding layer)、以及至少一應接位置(adapter site)用於上述可動式光耦合器，此可動式光耦合器形成於至少上述第一被覆層中。在一些實施例中，上述偵測器包括一光源。

在一些實施例中，上述可動式光耦合器能夠將一目標物定位於至少一應接位置，上述應接位置至少形成於導波器的第一被覆層中，從而將目標物定位，以便在固定的激發空間及固定的觀測空間之重疊的空間內偵測目標物，亦即，適用於單分子偵測的固定空間乃藉由將一可動式光耦合器靠接至一應接位置所形成。在一些實施例中，可動式光耦合器的應接位置為一奈米井(nanowell)。在一些實施例中，可動式光耦合器為奈米級粒子。在一些實施例中，可動式光耦合器為一奈米級球體。

如本說明書中所採用的用語”固定的激發空間”、”激發空間”、以及”激發區(excitation zone)”皆表示一空間，在此空間中激發螢光基團(fluorophore)或其他發光的目標物，並且當其進入此空間時即會發射出光線。

如本說明書中所採用的用語”觀測空間”以及”固定觀測空間”代表一空間，在此空間中，可利用偵測器偵測由定位在此空間中的螢光基團或其他發光的目標物所發射出來的光線。

如本說明書中所採用之”適用於單分子偵測的固定空間”，係用於表示一空間，在此空間中激發空間與觀測空間重疊。當一單分子發光的目標物定位於此重疊的空間中時，可利用偵測器偵測此目標物。

如本說明書中所採用之”可動式光耦合器”，意指一可動式的目標物，其可改變激發光的行為，包括：例如，光的強度場分布(intensity field distribution)的形狀、光行徑的方向、光的波長。

如本說明書中所採用之”應接位置”，意指一能夠容納可動式光耦合器的空間。

如本說明書中所採用之”靠接(docking)”，係關於一可動式光耦合器及一應接位置，意指一可動式光耦合器放入一應接位置，從而促進適用於單分子偵測的固定空間之形成。

在一些實施例中，激發光無法穿透可動式光耦合器，因此適用於單分子偵測的固定空間是由可動式光耦合器所形成，阻擋了來自導波器的激發光使其不會散播至整體空間。在一些實施例中，可動式光耦合器具有一表面，其能夠反射激發光，因此適用於單分子偵測的固定空間形成於可動式光耦合器將激發光反射回導波器的區域。

在一些實施例中，激發光可穿透或部分穿透可動式光耦合器，以及在至少形成於導波器的第一被覆層中的應接位置設置可動式光耦合器，可使激發區自一沿著導波器之核心層傳播並且與可動式光耦合器耦合的光波，形成於可動式光耦合器的表面周圍，其中適用於單分子偵測的固定空間形成於可動式光耦合器與應接位置之間。在一些實施例中，選擇可動式光耦合器的折射率(refraction index)以加強光耦合的層級。在一些實施例中，激發光可穿透或部分穿透可動式光耦合器，以及在至少形成於導波器的第一被覆層中的應接位置設置可動式光耦合器，可使激發區自一沿著導波器之核心層傳播並且與可動式光耦合器耦合的光波，形成於可動式光耦合器的表面周圍，因此產生一圍繞著可動式光耦合器的表面之適用於單分子偵測的固定空間。

在一些實施例中，可動式光耦合器能夠吸收來自導波器的第一激發光，然後發射出第二激發光。

本發明提供了一種單分子目標物的偵測方法，包括下列步驟：(a)將一入射光自一光源引導進入一導波器，進而在導波器中形成一激發光；(b)將一單分子目標物定位於一可動式光耦合器的表面上；(c)將(b)之可動式光耦合器定位於於一應接位置，好讓一可動式光耦合器形成於至少一導波器的第一被覆層中；以及(d)藉由激發光來激發被定位於可動式光耦合器上之單分子目標物，使單分子目標物發射出一光線以被一光偵測器偵測。在一些實施例中，為了讓一可動式光耦合器形成於至少一導波器的第一被覆層中，可動式光耦合器定位於應接位置以形成一適用於單分子偵測的固定空間。

在一些實施例中，單分子目標物的偵測方法，包括：將光耦合器以一特定的方向定位(located)於應接位置。在一些實施例中，上述方法包括：藉由一磁場，將光耦合器以一特定的方向定位(located)於應接位置。在進一步的實施例中，藉由施予一橫跨應接位置的電位(electric potential)，將光耦合器以一特定的方向定位(located)於應接位置。在一些實施例中，藉由將一或多個在一光耦合器轉切器位置的表面改質的引入，將光耦合器以一特定的方向定位(located)於應接位置，其中應接位置會吸引或排斥光耦合器的表面。

本發明提供一種一單分子目標物的偵測方法，包括下列步驟：(a)提供一偵測裝置，包括：(i)一可動式光耦合器；(ii)一導波器，包括：一核心層；以及一第一被覆層，其中至少一可動式光耦合器之應接位置至少形成於第一被覆層中；以及(iii)一光偵測器；(b)提供至少一結合部分，其能夠與一單分子目標物結合；(c)將至少一結合部分個別地定位於可動式光耦合器上；(d)提供一單分子目標物分子給一定位於可動式光耦合器上的結合部分；(e)將可動式光耦合器定位於應接位置，其中至少一結合部分及單分子目標物位於可動式光耦合器上；(f)將一入射光自一光源引導進入導波器，從而形成一激發光於導波器中；(g)藉由激發光來激發單分子目標物分子，其中單分子目標物分子結合至至少一定位於可動式光耦合器上的結合部分，使得單分子目標物發射出一光線以被一光偵測器偵測。在一些實施例中，將可動式光耦合器定位於應接位置，其中至少一結合部分與單分子目標物定位於在光耦合器上，產生一適用於單分子偵測的固定空間，其中欲偵測的單分子目標物定位於此固定空間中。

本發明提供一種一核酸的定序方法，包括下列步驟：(a)提供一偵測裝置，包括：(i)一可動式光耦合器；(ii)一導波器，包括：一核心層；以及一第一被覆層，其中至少一可動式光耦合器之應接位置至少形成於第一被覆層中；以及(iii)一光偵測器；(b)提供至少一核酸分子；(c)將至少一核酸分子個別地定位於可動式光耦合器上；(d)將可動式光耦合器定位於應接位置處，其中至少一核酸位於可動式光耦合器上；(e)進行至少一核酸分子的單分子合成定序，其中單分子核酸的合成定序導致產生一發射光，上述發射光與至少一核酸中的鹼基之特性有關。(f)利用偵測器偵測發射光，產生一輸出訊號；以及(g)處理輸出訊號以決定至少一核酸所包含的鹼基之特性。

偵測系統可作為系統的一部分，用於生物分子偵測的方法或製程，生物分子偵測包括：核酸雜交(nucleic acid hybridization)，或例如全基因體定序(whole-genome sequencing)、轉錄概況分析(transcriptional profiling)、比對的轉錄概況分析(comparative transcriptional profiling)、或基因鑑定(gene identification)等的定序。

下文中，將配合圖示詳細地描述實施例。在整個圖式中任何可能的地方，相似之元件係使用相同之元件符號。

1.　偵測系統

此處所描述的偵測系統可偵測一目標物，如一單分子目標物。上述目標物可為一冷光源(source of luminescence)，例如一螢光染料分子(fluorescent dye molecule)、一磷光染料分子(phosphorescent dye molecule)、一量子點(quantum dot)、或一發光的奈米粒子(light-emitting nanoparticle)。上述目標物亦可為一光散射(light-scattering)粒子。此外，上述目標物可為一沒有發光能力的目標分子(target molecule)，但其可黏附至一標籤對象(labeling object)。因此，可藉由標籤對象來辨識目標分子。不只一個標籤對象可黏附至一目標分子。上述目標物可為一目標分子，其不具有發光能力，且黏附至多個能夠相繼依序發光的標籤對象。(例如螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)，其中第一波長的光自至少一第一受激發的螢光分子發射出來，且至少部分被一第二螢光分子吸收，此第二螢光分子轉而發射出一第二光線，亦即第二波長的發射光)。

1.1偵測系統概述

偵測系統可包括一可動式光耦合器、一偵測器、以及一導波器，其中導波器包括一可動式光耦合器的應接位置。

偵測系統可更包括至少一能夠發射光線的光源，然後上述光線被至少部分合併進入導波器中，作為激發光以激發目標物。光源可為，例如：如氦氖雷射(He-Ne laser)等的雷射，以及雷射二極體(laser diode,LD)、發光二極體(light emitting diode,LED)、有機發光二極體(organic light emitting diode,OLED)、量子點發光二極體(quantum dot light emitting diode,QLED)、光纖(fiber light)、或弧光放電螢光燈(arc discharge fluorescent lamp)。偵測系統可包括一光源耦合器。上述光源耦合器可將至少部分自至少一光源發射出來的光合併進入導波器中。上述光源耦合器可為，例如稜鏡耦合器(prism coupler)、光柵耦合器(grating coupler)、側向注入耦合器(side-injection coupler)、垂直注入耦合器(vertical-injection coupler)、或同向耦合器(co-directional coupler)。

導波器可為頻道波導(channel waveguide)或平面波導(planar waveguide)。導波器可包括一核心層以及至少一被覆層。例如，如果導波器為頻道波導，其可包括一核心層以及一圍繞著核心層的被覆層。另舉一個範例，若導波器為平面波導，其可包括一核心層以及一配置在核心層上的被覆層，或核心層夾在兩個被覆層中間。核心層可具有比至少一被覆層更高的折射率。激發光可在導波器的核心層中傳播。提供一描述於美國專利(U.S. Patent Application No. 12/720,352，申請日March 9,2010；U.S. Patent Application No. 12/801,503，申請日June 11,2010；以及U.S. Patent Application No. 12/805,411，申請日July 29,2010)中之適用於偵測系統中的導波器及其特徵，其中參考各個上述完整的美國專利以併入本發明中。

偵測系統可包括一導波器，其包括至少一可動式光耦合器的應接位置。應接位置可至少形成於上述至少一導波器的的被覆層中。應接位置可為一包含一上部開口及一底面的奈米井，其中的上部開口可比底面大。上述奈米井可延伸穿過部份之上述至少一被覆層的厚度、上述至少一被覆層全部厚度、上述至少一被覆層的全部後度與上述核心層的部分厚度、上述至少一被覆層的全部後度與上述核心層全部厚度。有效的激發區之下部邊界可為奈米井的底部。在奈米井應接位置中，可由垂直於縱向之核心層的方向(亦即在下文中所述之垂直方向)之激發光所能夠到達的距離，來定義有效的激發區之上部邊界。

本發明之偵測系統的實施例，包括一可動式光耦合器，其可將一單分子目標物定位於至少一導波器的應接位置。可動式光耦合器可為一奈米級粒子。上述可動式光耦合器可為一奈米級球體或一非球形的奈米級粒子。當一可動式光耦合器靠接(docks)在導波器中的應接位置後，即可形成適用於單分子偵測之固定的激發空間(有效的激發空間)，且上述待測的目標物可定位於此固定空間中。當一可動式光耦合器靠接於應接位置時，其可防止第二個可動式光耦合器靠接於相同的應接位置。

上述可動式光耦合器可包括至少一性質，藉由此性質，上述光耦合器可黏附至應接位置，包括：例如表面性質或磁性，以加速靠接。在一些實施例中，上述光耦合器包括至少一性質，其可包括不對秤的表面性質，藉由此適當的性質，上述光耦合器可以一特定方向定位於上述至少一應接位置。在一些實施例中，光耦合器可於應接位置中，將一單分子目標物定位於一鄰近導波器的核心層之表面的固定空間中，其中一目標物被定位於一有效的激發區中，上述有效的激發區自一受到光波激發並沿著導波器的核心層傳播的光場，形成於應接位置中。

導波器的核心層可具有較上述至少導波器之第一被覆層更高的折射率。在一些實施例中，可動式光耦合器係由一材料所組成，上述材料的折射率大體上與環境溶液或上述至少導波器之第一被覆層之材料的折射率近似。在進一步的實施例中，可動式光耦合器係由一材料所組成，其折射率大於上述至少導波器之第一被覆層之材料的折射率。在一些實施例中，可動式光耦合器係由一材料所組成，其折射率大體上與導波器之核心層的折射率近似或相等。在一些實施例中，可動式光耦合器能夠與一受到沿著核心層傳波之光波激發的衰減光場(evanescent light field)耦合，藉此可圍繞著光耦合器的表面形成一有效的激發區。

一些實施例中，可動式光耦合器不透光且可將激發光侷限於其表面，因此藉由上述可動式光耦合器阻擋來自導波器的激發光散播至整體空間，來形成上述適用於單分子偵測的固定空間。在一些實施例中，可動式光耦合器會反射光線。在一些實施例中，可動式光耦合器會反射激發光。在一些實施例中，可動式光耦合器能夠吸收由導波器發射出來的基發光，然後本身發射出可激發待測分子的光線。

偵測系統的導波器組件可包括複數個應接位置。因此，此系統亦可用於監測大量的目標物。

上述偵測系統可包括一偵測自目標物發射出來之光線的光偵測器。上述偵測器可包括一光學感測器(optical sensor)，其能夠至少吸收部份於其上的入射光線，並產生對應此光線的輸出訊號。上述光學感測器可為例如一p-i-n光電二極體、一多接面光電二極體(multi-junction)、雪崩光電二極體(avalanche photodiode,APD)、一光電晶體(phototransistor)、一量子井紅外線光探測器(quantum-well infrared photodetector,QWIP)、光電導型光學感測器(photoconductive type optical sensor)、光電伏打型光學感測器(photovoltaic type optical sensor)、一在特殊應用集成電路(Application Specific Integrated Circuit,ASIC)上的薄膜(thin-film on ASIC,TFA)、一金屬半導體金屬(metal-semiconductor-metal,MSM)光探測器、電荷耦合裝置(charge coupled device,CCD)、一互補式金氧半導體(Complementary Metal-Oxide-Semiconductor,CMOS)、或一上述之結合。

在一些實施例中，光偵測器包括控制光偵測器的運作之控制電路。控制電路可包括一訊號放大器(signal amplifier)的電路、類比/數位信號轉換器(A/D convertor)、積分器(integrator)、比較器(comparator)、邏輯電路(logic circuit)、讀出電路(readout circuit)、記憶體、微處理器(microprocessor)、時鐘、及/或位址(address)。

光偵測器可配置於自目標物發射出來的光可到達的地方。例如，光偵測器可配置於核心層之相對於應接位置的對側。也就是說，若應接位置以垂直方向配置於核心層的一側上，光偵測器則以垂直方向配置於核心層的另一側上。

第1圖係描述一本發明所提供之偵測系統的示意圖。上述偵測系統可包括一可動式光耦合器100以及一積體元件(integrated component)，上述機體元件包括一平面導波器110、一偵測器102、以及一可動式光耦合器的應接位置104，藉由可動式光耦合器，應接位置可靠近(accessible)可動式光耦合器100及環繞的樣本溶液120。導波器110可包括一核心層112、一上部被覆層114、以及一下部被覆層116。平面導波器110可形成於一基板上(未顯示)。光偵測器102可形成於上述基板上或基板內。光源130可發射一光線135，藉由光源耦合器140，可將光線135至少部分合併進入平面導波器110。合併進入平面導波器110的光線可沿著平面導波器110的核心層傳播，並作為激發光145。

第2圖的兩個版面各係描述一本發明所提供之偵測系統的示意圖。在一些實施例中，可動式光耦合器100係由一材料所組成，相較於核心層112的材料之反射率，上述材料的反射率與環境樣本溶液120或上述導波器的至少第一被覆層114之反射率更相近。在這樣的實施例中，自一光源(未顯示)沿著導波器的核心層傳播的光源，其在一應接位置內，可誘發一鄰近核心層的表面的衰減光場，進而在應接位置的底部之固定空間中形成一有效的激發區150(左邊版面)。在進一步的實施例中，可動式光耦合器係由一材料所組成，上述材料的反射率大於上述導波器的至少第一被覆層114之反射率，及/或大體上與導波器的核心層之反射率相似或相等。在這樣的實施例中，在應接位置中的核心層表面附近，光耦合器可與一衰減光場耦合，此衰減光場受到一自一光源沿著導波器的核心層傳播之光波的誘發(未顯示)，進而在位於可動式光耦合器與導波器的核心層之間的固定空間中，形成一有效的激發區160，並圍繞著光耦合器的表面(右邊版面)。

1.2　偵測系統的組件

1.2.1　導波器

如第1圖中所示，在一些實施例中，平面導波器110可包括一核心層112、一上部被覆層114、以及一下部被覆層116。核心層112可包括一具有反射率n₂ 的材料，例如：矽鈦氧化物(silicon-titanium oxide,Si_x Ti_1-x O₂ ，其中0<x<1)、氧化鈦(titanium oxide)、氧化鉭(tantalum oxide)、氧化鈮(niobium oxide)、氧化鉿(hafnium oxide)、氧化鋁(aluminum oxide)、氧化鋯(zirconium oxide)、氮化矽(silicon nitride)、氮化鋁(silicon nitride)、氮化鈦(titanium nitride)、聚碳酸酯(polycarbonate,PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)、或Su8。上部及下部的被覆層114和116可包括分別具有折射率n₃ 及n₄ 的材料。上部及下部的被覆層114和116的材料可相同或相異。適用於上部及下部的被覆層114和116的材料可包括，例如：氧化矽(silicon oxide)、氟化鎂(magnesium fluoride)、氟化鈣(calcium fluoride)、氧化鋁、Su8、PMMA、或聚碳酸酯。核心層的折射率n₂ 可大於上部及下部的被覆層114和116之折射率n₃ 及n₄ 。

以單分子偵測而言，必須避免激發光到達偵測器。在平面導波器中，核心層的表面可能不如預期中的平滑。核心層粗糙的表面可散射一部分的激發光。據估計，核心層的表面粗糙度約0.3 nm，約0.01%的激發光會被散射並產生雜訊。為了降低來自在核心層中傳播的激發光之表面散射的雜訊，可在導波器與偵測器之間增加一激發光濾光片，以降低到達偵測器之經散射的激發光的量。在一些實施例中，濾光片為一多層干涉濾光片(multilayer interference filter)。在一些實施例中，濾光片係由可吸收激發光的材料所構成的膜層。

在一些實施例中，偵測系統中可包括保護層(protection layer(s))，以吸收經散射的激發光，及/或阻擋來自偵測系統外的環境光線(ambient light)，以便增加信號雜訊比(signal-to-noise,S/N)，如美國專利(US Application Serial Number 12/801,503，申請日June 11,2010,and in U.S.Patent Application No.12/805,411，申請日July 29,2010)所述。保護層可形成於上部被覆層之上，及/或下部保護層可形成於下部被覆層之下。在一些實施例中，保護層係由一不透明的材料所組成，例如金屬或合金。在一些實施例中，一針孔可形成於下部保護層中，此針孔位於應接位置的下方。在應接位置中之有效的激發區內，自一目標物發射出來的光線可穿過上述針孔，並且被位於下部保護層下方的光偵射器偵測。

1.2.2　應接位置

如第1圖與第2圖中所示，至少一可動式光耦合器應接位置104可形成於至少導波器的上部被覆層114中。應接位置可為一奈米井。上述奈米井的上部開口可比奈米井的底面大。奈米井的形狀沒有一定。例如，奈米井的橫截面可為環形、橢圓形、矩形、正方形、或菱形。奈米井應接位置之底部的尺寸大小亦未受到限制。例如，奈米井的底部可約小於激發光的波長。在一些實施例中，奈米井的底部可小於約激發光波長的二分之一、四分之一、或八分之一。此處所述之”尺寸大小”係指直徑、長軸的長度、或長邊的長度。若奈米井的橫截面為正方形或菱形，”尺寸大小”可表示邊長。在一實施例中，奈米井之上部開口的長度(亦即所謂的直徑、長軸的長度、或長邊的長度)可為約1μm至約10μm，以及奈水井的底部的直徑可為約10nm至約500nm，奈米井的側壁與垂直奈米井的底部的方向之間所形成的夾角小於約60度。上述這樣的結構可確保只有單一可動式光耦合器能夠進入鄰近奈米井的底部之區域。

部分的激發光可進入應接位置104，且可隨著應接位置104的空間限制，在應接位置的至少一部分形成一有效的激發區105，如第1圖與第2圖中所示。可以了解的是，在第1圖中所使用的元件符號係顯示出有效的激發區之上部的大概邊界。當一目標物進入上述有效的激發區150，其可被激發光所激發，並且發射出光線以被偵測器102所偵測。在有效的激發區之外，目標物可能無法被激發光所激發，或其發射出來的光線無法到達光偵測器。可以了解的是，第1圖中的虛線並非用來限制有效的激發區之上部邊界的形狀。例如，有效的激發區之上部邊界可為彎曲的形狀。

依據不同的情況，例如在導波器中延伸之奈米井的位置及/或奈米井的深度，可形成不同之有效的激發區。此外，在有效的激發區中的電磁場可為，例如，一衰減場(evanescent field)、一衰減場與移動場(travelling fields)的混合、或一移動場，其詳細描述如下。

第3圖的示意圖顯示不同奈米井應接位置設計的實施例，以作為範例。在一些實施例中，奈米井應接位置可延伸穿過部份之上部被覆層的厚度(版面A)。在一些實施例中，奈米井應接位置可延伸穿過上部被覆層的全部厚度(版面B)。對版面A或B中所示之奈米井而言，當激發光在核心層中傳播時，雖然可能沒有移動光場組件(travelling light field component)，部分在核心層中的移動光線可稍微滲透進入奈米井中。上述滲透進入奈米井中的光線，可能在垂直方向上以指數衰減，並形成一衰減場。此衰減場在奈米井的空間限制下，可形成一有效的激發區於至少部分之鄰近核心層的奈米井中。

在一些實施例中，奈米井可延伸穿過上部被覆層的全部厚度，以及核心層的部分厚度(第3圖，版面C)。在一這樣的實施例中，一移動場組件可出現於奈米井中，並且與一衰減場共同形成一有效的激發區於奈米井中。

在一些實施例中，奈米井可延伸穿過上部被覆層的全部厚度以及核心層的全部厚度(第3圖，版面D)。在一這樣的實施例中，大多數之形成激發區的電磁場可為一移動場。

對一如第3圖版面B中所示之包括一奈米井的平面導波器而言，由於奈米井的底端位於核心層的上表面上，有效的激發區之容量可能與衰減場的有效激發區相等，且可利用下列方程式概略計算：

V=πx(D/2)² x h

其中D為奈米井底部的直徑，而h為在奈米井中衰減場滲透的深度。例如，若D及h分別為100nm及100nm，有效的激發區之計算出來的容量大概為1 x 10^-18 公升(1 attoliter)。

在一些實施例中，複數個應接位置可形成於導波器中。在一些實施例中，對各個複數個應接位置而言，可形成光偵測器，來偵測在應接位置之有效的激發區中，自一目標物發射出來的光線。在一些實施例中，一個光偵測器可用於偵測在複數個應接位置之有效的激發區中，自目標物發射出來的光線。

1.2.3可動式光耦合器

實施例包括一可動式光耦合器，上述可動式光耦合器可能可以將一單分子目標物定位於一形成於至少一導波器之第一被覆層中的應接位置。上述可動式光耦合器可將至少一能夠結合一待測之單分子目標物的結合部分定位於其表面上。結合部分可為一單分子或分子複合物(例如，一受體(receptor)、一抗體、一酵素、一包含酵素的反應複合物(reaction complex)等的多聚體複合物(multimeric complex))，其能夠與目標物結合。待測之單分子目標物可結合至上述定位於可動式光耦合器之表面上的結合部分，且此可動式光耦合器係位於應接位置，進而透過此結合部分及光耦合器，將目標物定位在一用於有效的訊號之激發及觀測的固定空間中。可動式光耦合器只可具有一個定位於其表面上的結合部分，這樣一來，若偵測到單分子目標物結合至表面定位的結合部分(surface-localized binding moiety)，在任合指定時間之偵測到的目標物數量可能不會大於可同時結合至結合部分之目標物數量。因此，一個結合部分一次只與一個目標物結合，偵測系統可偵測一結合至上述結合部分的單分子目標物，此結合部分定位於可動式光耦合器的表面上。

所使用之一個”定位”於可動式光耦合器的表面上之目標物，其包括一非經專一性吸收的目標物於可動式光耦合器之表面上，以及包括一透過一或多個共價鍵或透過非共價的交互作用，而被繫留(tethered)至可動式光耦合器之表面目標物。

在一些實施例中，可動式光耦合器為一奈米級粒子。在一些實施例中，光耦合器為一奈米級球體。上述奈米級球體的直徑可從約40nm至1000nm，或從1/10至兩倍的激發光之波長。奈米級球體的尺寸大小可根據光偵測器的尺寸大小來決定。例如，可選擇單一光偵測器僅能夠偵測來自單一球體發射出來的光線之奈米級球體。在一些實施例中，選擇奈米及球體的尺寸大小以其應接位置的形狀，使奈米級球體可配置於應接位置，其中奈米級球體位於自應接位置的底面起算約10nm至200nm之間的距離。在進一步的實施例中，奈米級粒子為一條狀(bar-like)粒子。可動式光耦合器粒子的”長度”指的是自在光耦合器最寬處之光耦合器的一端至另一對面端的距離。例如，球形的光耦合器對應其直徑，以及條狀粒子的長度係對應條狀粒子最遠的兩端之間的距離。

可動式光耦合器可為一均質(homogenous)固體、一膠質(colloidal)固體或多孔固體、或一由具有聚合物骨架之材料所構成的固體。在一些實施例中，多功能可動式光耦合器包括一或多個金屬材料，包括：例如金(Au)、銀(Ag)、銅(Cu)、鉑(Pt)、鎳(Ni)、鉻(Cr)、或金屬合金。在一些實施例中，光耦合器包括一或多個氧化物材料，包括：例如TiO₂ 、Ta₂ O₅ 、Nb₂ O₅ 、SiO₂ 、HfO₂ 、Al₂ O₃ 、ZrO₂ 、ZnO、V₂ O₅ 、CeO₂ 、CdO、Fe₂ O₃ 、Fe₃ O₄ 、Cu₂ O、CuO、In₂ O₃ 、La₂ O₃ 、MoO₃ 、或WO₃ 。在進一步的實施例中，光耦合器包括一或多個硫化物材料，包括：例如CdS、ZnS、PbS、Au₂ S、或Ag₂ S。在一些實施例中，光耦合器包括一或多個硒化物材料，包括：例如CdSe、ZnSe、或PbSe。在一些實施例中，光耦合器包括一或多個氮化物材料，包括：例如Si₃ N₄ 、TiN、BN、及GaN。在進一步的實施例中，光耦合器包括一或多個氮化物材料，包括：例如聚苯乙烯(polystyrene)、聚乙烯亞胺(polyethyleneimine)、聚磷腈(polyphosphazene)、聚丙交酯(polylactide)、丙交酯-共-乙交酯(polylactide-co-glycolide),聚己酸內酯(polycaprolactone)、多元酸酐(polyanhydride)、聚馬來酸(polymaleic acid)及其衍生物、聚氰基丙烯酸烷酯(polyalkylcyanoacrylate)、聚酸酐氧基異丁酸(polyanhydride oxybutyrate)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚原碳酸(polyorthoester)、聚乙二醇(polyethylene glycol),多聚左璇賴氨酸(poly-L-lysine)、聚乙醇酸交酯(polyglycolide)、聚甲基異丁烯酸酯(polymethylmethacrylate)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、或上述之共聚物。

在一些實施例中，可動式光耦合器具有一核殼奈米結構(core-shell nanostructur)。上述核心材料可包括一或多個金屬材料，包括：例如金(Au)、銀(Ag)、銅(Cu)、鉑(Pt)、鎳(Ni)、鉻(Cr)、或一金屬合金。在一些實施例中，上述核心材料包括一或多個氧化物材料，包括：例如TiO₂ 、Ta₂ O₅ 、Nb₂ O₅ 、SiO₂ 、HfO₂ 、Al₂ O₃ 、ZrO₂ 、ZnO、V₂ O₅ 、CeO₂ 、CdO、Fe₂ O₃ 、Fe₃ O₄ 、Cu₂ O、CuO、In₂ O₃ 、La₂ O₃ 、MoO₃ 、或WO₃ 。在一些實施例中，上述核心材料包括一或多個硫化物材料，包括：例如CdS、ZnS、PbS、Au₂ S、或Ag₂ S。在進一步的實施例中，上述核心材料包括一或多個硒化物材料，包括：例如CdSe、ZnSe、或PbSe。在一些實施例中，上述核心材料包括一或多個氮化物材料，包括：例如SiN或GaN。在進一步的實施例中，上述核心材料包括一或多個氮化物材料，包括：例如聚苯乙烯(polystyrene)、聚乙烯亞胺(polyethyleneimine)、聚磷腈(polyphosphazene)、聚丙交酯(polylactide)、丙交酯-共-乙交酯(polylactide-co-glycolide),聚己酸內酯(polycaprolactone)、多元酸酐(polyanhydride)、聚馬來酸(polymaleic acid)及其衍生物、聚氰基丙烯酸烷酯(polyalkylcyanoacrylate)、聚酸酐氧基異丁酸(polyanhydride oxybutyrate)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚原碳酸(polyorthoester)、聚乙二醇(polyethyleneglycol),多聚左璇賴氨酸(poly-L-lysine)、聚乙醇酸交酯(polyglycolide)、聚甲基異丁烯酸酯(polymethylmethacrylate)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、或上述之共聚物。

上述核殼奈米結構光耦核器的外殼可包括一或多個金屬材料，包括：例如金(Au)、銀(Ag)、銅(Cu)、鉑(Pt)、鎳(Ni)、鉻(Cr)、或一金屬合金。在一些實施例中，上述外殼材料包括一或多個氧化物材料，包括：例如TiO₂ 、Ta₂ O₅ 、Nb₂ O₅ 、SiO₂ 、HfO₂ 、Al₂ O₃ 、ZrO₂ 、ZnO、V₂ O₅ 、CeO₂ 、CdO、Fe₂ O₃ 、Fe₃ O₄ 、Cu₂ O、CuO、In₂ O₃ 、La₂ O₃ 、MOO₃ 、或WO₃ 。在一些實施例中，上述外殼材料包括一或多個硫化物材料，包括：例如CdS、ZnS、PbS、Au₂ S、或Ag₂ S。在進一步的實施例中，上述外殼材料包括一或多個硒化物材料，包括：例如CdSe、ZnSe、或PbSe。在一些實施例中，上述外殼材料包括一或多個氮化物材料，包括：例如SiN或GaN。在進一步的實施例中，上述外殼材料包括一或多個氮化物材料，包括：例如聚苯乙烯(polystyrene)、聚乙烯亞胺(polyethyleneimine)、聚磷腈(polyphosphazene)、聚丙交酯(polylactide)、丙交酯-共-乙交酯(polylactide-co-glycolide),聚己酸內酯(polycaprolactone)、多元酸酐(polyanhydride)、聚馬來酸(polymaleic acid)及其衍生物、聚氰基丙烯酸烷酯(polyalkylcyanoacrylate)、聚酸酐氧基異丁酸(polyanhydride oxybutyrate)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚原碳酸(polyorthoester)、聚乙二醇(polyethylene glycol),多聚左璇賴氨酸(poly-L-lysine)、聚乙醇酸交酯(polyglycolide)、聚甲基異丁烯酸酯(polymethylmethacrylate)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、或上述之共聚物。

在一些實施例中，可動式光耦合器係由一材料所構成，與導波器之核心層的材料之折射率相比，上述材料的折射率更接近導波器之第一被覆層的材料之折射率。在一些實施例中，可動式光耦合器係由一材料所構成，與導波器之核心層的材料之折射率相比，上述材料的折射率更接近周圍的樣本溶液之折射率。在一些實施例中，可動式光耦合器係由一材料所構成，上述材料的折射率介於導波器之第一被覆層的材料之折射率與導波器之核心層的材料之折射率之間。在進一步的實施例中，可動式光耦合器係由一材料所構成，上述材料的折射率大體上與導波器之核心層的材料之折射率相似。在一些實施例中，可動式光耦合器係由一材料所構成，上述材料的折射率與核心層的材料之折射率相等。

在一些實施例中，可動式光耦合器係由折射率為1.487的SiO₂ 所構成。在一些實施例中，可動式光耦合器係由折射率為1.59的聚苯乙烯所構成。在進一步的實施例中，可動式光耦合器係由折射率為2.0的TiO₂ 所構成。在一些實施例中，可動式光耦合器係由折射率為2.4的Fe₃ O₄ 所構成。在另一些實施例中，可動式光耦合器係由折射率為2.26的Ta₂ O₅ 所構成。

在一些實施例中，可動式光耦合器具有一核殼結構，其中上述外殼材料係折射率等於1.28的金(Au)。在一些實施例中，可動式光耦合器具有一核殼結構，其中上述外殼材料係折射率等於0.135的銀(Ag)。在進一步的實施例中，可動式光耦合器具有一核殼結構，其中上述外殼材料係折射率等於1.9的鉑(Pt)。在一些實施例中，可動式光耦合器具有一核殼結構，其中上述外殼材料係折射率等於0.714的鋁(Al)。在另一些實施例中，可動式光耦合器具有一核殼結構，其中上述外殼材料係折射率等於1.86的鈷(Co)。在一些實施例中，可動式光耦合器具有一核殼結構，其中上述外殼材料係折射率等於1.66的鎳(Ni)。

在一些實施例中，可動式光耦合器具有一適當的尺寸大小及反射率，上述反射率與導波器之核心層的材料之反射率十分地相似，以便當光耦合器被置於導波器中的應接位置時，使光耦合器能夠與來自一導波器的光線耦合。在這類的實施例中，受激發的光場可圍繞著可動式光耦合器的表面形成，進而圍繞著光耦合器形成一有效的激發區，其中在光耦合器的表面之一特定距離內，可激發一分子以發射出螢光。

可藉由調整在週圍環境中的光學導波器之電場、藉由選擇適當的特徵(例如材料的組成、形狀、以及尺寸大小)、以及藉由配置應接位置的形狀，來控制圍繞著可動式光耦合器的表面誘導之激發光場的強度。在實施例中，可動式光耦合器係為一球體，在光耦合器的表面之激發光場的強度可運用下列公式來計算：

其中P為激發光場在球體表面的光功率，(Finesse)由下列公式決定：

r 由下列公式決定：

I _max /I _i 由下列公式決定：

θ由下列公式決定：

θ=Nringk ₀ 2πR,以及

其中R為上述球體之曲率(curvature)的半徑，α_ring 為球體的模態功率衰減係數(mode power decay coefficient)，N_ring 為球體的平衡折射率(equilibrium refractive index)，κ為功率耦合係數(power coupling coefficient)，以及k₀ =2π/λ₀ 中的λ₀ 係自由空間波長(free-space wavelength)。在共振情況下，其中光能將會完全轉移進入球狀的光耦合器，N_ring k₀ 2πR=2mπ，其中m為一整數，κ=1-exp(-2πR₁ α_ring )，其中R1為外彎曲半徑，且P=1。”臨界耦合(critical coupling)”一辭用於此處以描述這個共振情況。

在一些實施例中，當光耦合器在一特定的範圍內被某些分子圍繞時，會改變光耦合器的光學性質。在一些實施例中，當光耦合器在一特定的範圍內被某些分子圍繞時，改變的上述光學性質為折射率、光吸收能力、被耦合器吸收的光的波長、或傳播穿過光耦合器之光線的方向。

在一些實施例中，改質一或多個可動式光耦合器之表面的區域。例如，可改質奈米級球體之光耦合器的整個表面。表面改質(Surface modification)有別於具有核殼結構之光耦合器的外殼材料，亦即，包含表面改質的核殼光耦合器具有外殼材料之外表面的改質。在進一步的實施例中，可改質奈米級球體的光耦合器之一半球的表面，然而其餘剩下的半球未經改質。可藉由化學改質技術(chemical modification techniques)，利用一或多個非均質(heterogeneous)的材料，在整個光耦合器的表面上，或至少一部分之光耦合器的表面上塗層。表面改質可能有助於將可動式光耦合器定位於應接位置。不對稱的表面改質(Asymmetric surface modification)，例如，僅在一表面上進行改質，或在相反的表面上進行不同的改質，可能有助於將可動式光耦合器以一特定的方向定位於應接位置。表面改質亦可能有助於將單分子目標物定位於光耦合器的表面之一特別的區域，藉由將這樣的區域定向至面對導波器的核心層，進而在導波器的核心層附近，將此目標物以及任何與此目標物相關的反應，定位於一介於可動式光耦合器與應接位置的表面之間的固定空間。本發明的實施例提供如第4圖中所示之一偵測系統的示意圖，上述偵測系統包括一奈米級球體光耦合器粒子，其中利用寡核苷酸引子(oligonucleotide primers)改質上述粒子於一半球上。利用一寡核苷酸引子，其中上述核苷酸引子能夠與鑲嵌在一DNA合成反應複合物200之複製的DNA鏈段中的序列雜交，來改質奈米級球體光耦合器100於其一半的表面上。利用經寡核苷酸改質之光耦合器的表面，其中上述表面係面向導波器的核心層，光耦合器100於應接位置104的配置，在奈米井應接位置的底部，將反應複合物200定位於固定空間170中。

在一些實施例中，一或多個可動式光耦合器之表面區域的改質為化學改質。在一些實施例中，化學改質為官能基團與光耦合器的表面之共價鍵結。一共價鍵結的官能基團(covalently-linked functional group)可為疏水性基團(hydrophobic group)或親水性基團(hydrophilic group)。合適的疏水性基團包括：例如-C_x (H₂ )_x CH₃ 、-C₆ H₅ 、環氧基、-Si(C_x H_2x+1 )_n (衍生自具有化學式R_4-n -Si(C_x H_x+1 )_n 的化合物，n為整數1、2、3，如N-辛基矽烷(N-octylsilane))、-O_4-n -Si(C_x H_x+1 )_n (衍生自具有化學式(RO)_4-n -Si(C_x H_2x+1 )_n 的化合物，n為整數1、2、3，如三甲氧基(辛基)矽烷(trimethoxy(octyl)silane))…等等。在一些實施例中，光耦合器為一均質的固體粒子，其係由一金屬材料所組成，或為一包含金屬的外殼材料之核殼粒子，且疏水性基團透過硫、胺、羰基(carboxyl)、或硫酸根鍵結，與金屬材料進行共價鍵結。在一些實施例中，光耦合器為一包含金屬氧化物或SiO₂ 之材料的均質固體粒子，或為一包括金屬氧化物或SiO₂ 之材料的核殼粒子，且疏水基團R以-Si-R基團與金屬氧化物或SiO₂ 之材料的氧原子進行共價鍵結。在一些實施例中，共價鍵結的官能基團為一親水性基團，包括：例如-NH₂ 、-OH、-CO₂ H、-OSO₃ H。例如，在一些實施例中，光耦合器為一由金屬氧化物或SiO₂ 之材料所組成的均質固體粒子，或為一包含金屬氧化物或SiO₂ 的核殼粒子，且-OH基團與金屬氧化物或SiO₂ 材料進行共價鍵結。合適的親水性基團包括帶電基團(charged groups)，包括：例如正電基團，如-NH₃ ⁺ ，或負電基團，如-CO₂ -或-OSO₃ -。在一些實施例中，共價鍵結的官能基團為一磁性官能基團(magnetic functional group)。合適的磁性官能基團包括：例如-Fe₃ O₄ 、-Fe₂ O₃ ,、-FePt、-FeNi、-FeCo、-Mg、-Co、-Ni…等等。在一些實施例中，共價鍵結的官能基團為一螢光官能基團。合適的螢光官能基團包括：例如分子的染料，如-FITC、若單明6G(-Rhodamine 6G，-Rh6G)、-Cy3、以及-Cy5,…等等，以及奈米粒子/量子點，如-CdSe、-ZnS、-PbS、-PbSe…等等。在一些實施例中，利用生物素(biotin)、鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)、抗生素蛋白(avidin)…等等，對可動式光耦合器的一表面進行改質。

在進一步的實施例中，化學改質為一非共價改質。非共價改質可為具有聚合物材料的塗層。在一些實施例中，例如，光耦合器為一由金屬材料所組成之均質的固體粒子，或為一包含金屬的外殼材料之核殼粒子，以及利用如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)等的親水性聚合物對一光耦合器的表面進行塗層。

在一些實施例中，僅有一可動式光耦合器的表面區域被改質，而其餘剩下之可動式光耦合器的表面區域則未經改質。在一些實施例中，可動式光耦合器的表面之經改質的區域佔可動式光耦合器之表面的約10%至90%。用來描述這類實施例中的”佔可動式光耦合器之表面的約10%至90%”係為了表示可動式光耦合器的表面之經改質的區域可為自略小於可動式光耦合器之表面的10%至略大於可動式光耦合器之表面的90%之間的任何值。在進一步的實施例中，可動式光耦合器的表面之經改質的區域略小於可動式光耦合器之表面的10%。在另一個進一步的實施例中，可動式光耦合器的表面之經改質的區域略大於可動式光耦合器之表面的90%。

在一些實施例中，對可動式光耦合器的表面之兩個區域進行改質，如第5A圖中所示。在一些實施例中，光耦合器包括利用官能基團或具有相反性質(opposing properties)的塗層來進行表面改質的兩個區域。例如，一光耦合器的表面被改質以具有一疏水性的表面特性。在進一步的實施例中，利用正電基團對光耦合器的一表面進行改質，然而利用負電基團對相反的表面進行改質。在一些實施例中，光耦合器的一表面被改質以吸引並保留DNA，也就是說，利用帶正電的官能基團，或利用能夠與在一目標DNA分子中的序列雜交之寡核苷酸，對表面進行改質，雖然光耦合器的其他表面不會吸引DNA。

在進一步的實施例中，可動式光耦合器包括兩個利用具有不同類型的性質之官能基團或塗層進行表面改質的區域。例如，在一些實施例中，利用一磁性官能基團對一可動式光耦合器的表面區域進行改質，而利用一螢光官能基團對可動式光耦合器之另一個相反的表面進行改質。在一些實施例中，應接位置形成於至少包含一或多個表面改質之導波器的第一被覆層中。導波器可包括一第一被覆層以及一第二被覆層，如第5B圖中所示，其中在應接位置的底部，第一(下部)被覆層以及一核心層的表面(未顯示)，包括一表面改質3，其吸引在可動式光耦合器100上的表面改質1，及/或排斥在可動式光耦合器100上的表面改質2，且其中上述第二(上部)被覆層包括一與表面改質2相容(compatible)的表面改質4。導波器可包括一第一被覆層，上述第一被覆層包括表面改質3(與在銜接的底部之核心層的表面一起)以及表面改質4兩者，如第6圖中所示，其中表面改質3吸引在可動式光耦合器100上的表面改質1，,及/或排斥在可動式光耦合器100上的表面改質2，且其中上述第二(上部)被覆層包括一與表面改質2相容(compatible)的表面改質4。例如，第5圖及第6圖中所示之表面改質1及表面改質3，可能本質上為親水性，然而表面改質2及表面改質4本質上為疏水性。在一些實施例中，應接位置104的表面3為親水性，其包括一部分選自矽(silicon)、二氧化矽(silica)、金屬、或金屬氧化物，且表面4為疏水性。然而，若應接位置104的表面是由具有親水性質的材料所構成，則可將其改質成疏水性。例如，若應接位置104的表面是由親水性的矽酸鹽(silicate)或金屬所構成，則可將其改質為疏水性的用途，例如R1_x -Si(O-R2)_4-x (其中R1為疏水性基團，例如烷鏈-(CH₂ )_n -CH₃ ，以及R2為C_n H_2n+1 ，其中x及n為整數，且1x3)，或用途，例如，具有官能基團的聚合物，係選自：-COOH、-PO₃ H₂ 、-SH、或-NH₂ 。在另一實施例中，若奈米井120的底面是由疏水性的金屬氧化物所構成，則可將其改質為親水性的用途，例如R1_x -Si(O-R2)_4-x (其中R1為疏水性基團，例如烷鏈-(CH₂ )_n -CH₃ ，以及R2為C_n H_2n+1 ，其中x及n為整數，且1x3)，或用途，例如，具有官能基團的聚合物，係選自：-COOH、-PO₃ H₂ 、-SH、或-NH₂ 。藉由使應接位置104的上表面為疏水性，但維持應接位置104的底面為親水性，可動式光耦合器可配置於鄰近應接位置的底部之有效激發區內，而非朝上或面向應接位置的側壁表面，其中上述可動式光耦合器包括一疏水性表面以及一親水性表面(參閱下文中光耦合器表面改質之描述)。因此，定位於可動式光耦合器的表面區域的分子，或來自樣本溶液120的分子，上述樣本溶液120與定位於可動式光耦合器的表面區域的分子相互作用，在鄰近應接位置的底部之固定空間中，上述分子可有效的被進入有效激發區的激發光所激發。

進一步參閱第5圖及第6圖中所示之實施例，在一些實施例中，表面改質1及表面改質3為帶有相反電荷之基團的表面改質，亦即，表面1帶有正電，而表面3帶有負電，以此類推。

在一些實施例中，至少一可動式光耦合器的表面區域被寡核苷酸所改質。第4圖為實施例中的偵測系統之示意圖，上述偵測系統包括一可動式光耦合器，其中上述可動式光耦合器包括被寡核苷酸所改質的表面。。在一些實施例中，上述寡核苷酸係與用於核酸合成反應中之定序引子(sequencing primer)之序列互補(complementary)。在進一步的實施例中，寡核苷酸具有隨機序列(random sequences)。寡核苷酸的長度可為10至20、20至30、30至40、40至50、50至60、60至80、或80至100個核苷酸。應可瞭解，這些核苷酸長度的範圍僅為概略範圍，且寡核苷酸之長度的特定範圍包括多個核苷酸，其長度範圍僅為”大約”數，亦即，長度為10至100個核苷酸的寡核苷酸，係包括長度為約10至100個核苷酸的寡核苷酸。寡核苷酸的長度可少於10個核苷酸。寡核苷酸可為，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或大於30個核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸的長度係對應於定序引子的長度。在一些實施例中，寡核苷酸的長度比定序引子短。寡核苷酸可直接連結至可動式光耦合器，或其可連結至寡核苷酸可與可動式光耦合器相耦合的部分，亦即，一生物素(biotin)基團，此生物素基團可接合至一鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)或抗生素蛋白(avidin)，其中上述鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)或抗生素蛋白(avidin)連結至可動式光耦合器的表面。

利用所屬技術領域中已知的製程，可在可動式光耦合器上採用(introduced)一個區域的表面改質。例如，藉由暫時遮蔽一部分的光耦合器，但對可動式光耦合器的表面之剩餘的部份進行改質，可將一區域的表面改質引入。例如，遮蔽奈米級球體之光耦合器的一半球，但對另一半球進行改質。在一些實施例中，藉由將一或多個光耦合器配置於基板上(例如，玻璃或矽基板)、將異質材料沉積於配置在基板上之耦合器的表面上、然後運用剝離法(lift-off method)將可動式光耦合器自基板移除，使光耦合器被部分塗佈上異質材料(heterogenous material)。可藉由旋轉塗佈(spin-coating)、浸漬塗佈(dip-coating)、包埋(embedding)、奈米壓印(nanoimprinting)、奈米油墨印刷(nano ink-printing)、奈米粒子自動組裝技術nano-particle self assembly technology的運用(例如，奈米粒子於基板上的自動組裝，上述基板經過化學微影技術(chemical lithography)進行預圖案化(pre-patterned))、或藉由類似的方法，以進行光耦合器於基板上的配置。藉由如濺鍍沉積(sputter deposition)、磁電管濺鍍沉積(magnetron sputter deposition)、蒸鍍(evaporation)、原子層沉積(atomic layer deposition)、化學氣相沉積(chemical vapor deposition，CVD)、物理氣相沉積(physical vapor deposition，PVD)、電子束(例如電子槍(e-gun))沉積(electron beam deposition)、電漿沉積(plasma deposition)、雷射瞬態沉積(laser flash evaporation)(例如汽化金屬沉積(evaporated metal deposition))等等，這類的方法可將異質材料沉積於光耦合器上。剝離法可為超音波攪拌(ultrasonic agitation)、化學處理(例如使用丙酮處理)、磁剝離(magnetic lift-off)、或利用刀片(razor blade)的輔助將沉積層自然地剝除。實施例中的製程適用於可動式光耦合器之粒子的生產，上述粒子具有不均勻(asymmetric)的表面改質，其描述於Park,H.,et al.，“Multifunctional nanoparticles for photothermally controlled drug delivery and magnetic resonance imaging enhancement,”Small 4(2):192-196(2008)；International Patent Publication Number WO 2008/002101，標題為“Multi-functional nanoparticles partially-deposited with gold film”；Anker,J.N.,et al.,“Magnetically-Modulated Optical Nanoprobes(MagMOONs) and Systems,”Journal of Magnetism and Magnetic Materials 293:655-662(2005)；Perro,A.,et al.,“Design and synthesis of Janus micro-and nanoparticles,”Journal of Materials Chemistry 15:3745-3760(2005)；McNaughton,B.H.,et al.,“Fabrication of uniform half-shell magnetic nanoparticles and microspheres with applications as magnetically modulated optical nanoprobes,” arXiv:cond-mat/0506418v1,June 16,2005,1-6；以及Wu,L.Y.,et al.,“Bioinspired nanocorals with decoupled cellular targeting and sensingfunctionality,Small 6(4):503-507(2010)，上述各個文獻皆整篇納入本說明書作為參考。

1.2.4　於應接位置處的可動式光耦合器之直接定位

在一些實施例中，具有一單分子目標物之表面定位的接合部分的可動式光耦合器的粒子(亦即，能夠與一單分子目標物接合的分子或分子複合物)，被定位於應接位置，上述應接位置係利用電場、磁場或利用親水性表面特性或其他的化學性質，形成於導波器中。

藉由施予磁場至應接位置，可將一包括磁性材料及/或其表面具有磁性官能基團修飾的光耦合器定位於應接位置，如第7圖中所示。例如，經微製造的線圈(micro-fabricated coils)可被配置於應接位置之下。當電流穿過經微製造的線圈，線圈可產生一磁場，上述磁場將存在於樣本溶液中的光耦合器導引進入應接位置，並且將光耦合器困在銜接位址的底部。困住磁性奈米粒子之適合的方法描述於Ramadan,Q.,et al.,“Customized trapping of magnetic particles,”Microfluid Nanofluid 6:53-62(2009)，在此處引用作為參考。

藉由施予橫跨應接位置的電位能，可將被帶電的官能基團所修飾的光耦合器定位於應接位置。例如，經微製造的電極可以載玻片的形式被安置於應接位置的底部，上述載玻片外塗佈了一導電材料層以作為電極。對電極運用如直流電等電流，產生一穿過應接位置的電場，上述應接位置作為一電泳粒子誘捕系統(electrophoretic particle entrapment system)，其將經改質的光耦合器導引進入應接位置。將奈米粒子導引至特定偵測器位置之合適的電泳技術描述於Han,J.,et al.,“High performance electrophoresis system for site-specific entrapment of nanoparticles in a nanoarray”,Proc. SPIE 7574:75740L(2010)，以及Velev,O.D.,et al.,“Particle-localized AC and DC manipulation and electrokinetics”,Annu. Rep. Prog. Chem.,Sect. C,105:213-246(2009)，在此處引用作為參考。

1.2.5　系統之其他非必需的組件(Optional Components)

在一些實施例中，如第4圖中所示，濾光片(optical filter)118可配置於核心層112與偵測器102之間。在一些實施例中，濾光片可配置於下部之被覆層(未顯示於第4圖中)與光偵測器102之間。在一些實施例中，濾光片可配置於下部之保護層(未顯示)與光偵測器102之間。在一些實施例中，下部之保護層本身可作為一濾光片。濾光片可讓在一特定波長範圍內的光線穿過，但至少部分擋住在上述特定波長範圍以外的光線。因此，藉由適當地選擇濾光片118，可讓自目標物發射出來的光線穿過，但卻減弱由激發光所造成的雜訊，以便改善信號雜訊比(S/N ratio)。

可動式光耦合器及待測之目標物可被包含於一可填充應接位置104的樣本溶液120中。在一些實施例中，可利用一微流體管道(microfluidic channel)(未顯示)將樣本溶液導入應接位置。微流體管道可被設計成一次讓一個目標物通過應接位置，以便實現類流氏細胞計數的偵測(flow-cytometry-like detection)。

在一些上述圖式中，其示意圖顯示偵測系統的結構，為了簡化的目的，一些組件並未顯示出來。例如，第2圖中的各個版面僅顯示可動式光耦合器100、導波器110、以及應接位置104等偵測系統的組件。偵測系統的其他組件則未顯示。應可瞭解，在這些圖式中所示之偵測系統亦可包括其他如此處所揭示的組件。例如，在第2圖的各個版面中所示之偵測系統亦可包括一光偵測器、一封套(cover)、保護層、一光源、及/或一濾光片。

2.　偵測與應用的方法

在另一實施例中，本發明係關於利用此處所揭示的偵測系統來偵測一目標物的方法，上述目標物例如單分子目標物。如本說明書中所用，”單分子目標物”一辭包括：一由單分子所構成的目標物、或由多個非共價連結的分子(multiple noncovalently linked molecules)，如單一多聚體的聚胜肽複合物(multimeric polypeptide complex)或單一片段之雙股DNA，所構成的單一目標物。包括上述目標物的樣本溶液可被填充於應接位置中，上述應接位置形成於偵測器的導波器中。由一光源所發射的入射光可被光耦合器至少部分耦合進入導波器中，並且在導波器的核心層中傳播。被耦合進入導波器中的光線可作為一激發光，並且可至少部分耦合至一定位於形成於導波器中之應接位置的可動式光耦合器。當目標物進入在應接位置底部的有效激發區，及/或圍繞定位於應接位置之光耦合器的表面時，目標物可被激發光所激發，並且發射出一光線以被一光偵測器偵測。

此外，本發明提供一種一單分子目標物的偵測方法，包括：(a)將一入射光自一光源引導進入一導波器，從而在導波器中形成一激發光；(b)將一單分子目標物定位於一可動式光耦合器上；(c)將(b)的可動式光耦合器定位於一應接位置處，好讓一可動式光耦合器形成於至少一導波器的第一被覆層中；以及(d)藉由激發光來激發被定位於可動式光耦合器上之單分子目標物，使單分子目標物發射出一光線以被一光偵測器偵測。在一些實施例中，為了讓可動式光耦合器形成於至少一導波器的第一被覆層中，可動式光耦合器定位於應接位置以形成一適合於單分子偵測的固定空間。

此外，本發明尚提供一種一單分子目標物的偵測方法，包括：(a)提供一偵測裝置，包括：(i)一可動式光耦合器；(ii)一導波器，包括：一核心層；以及一第一被覆層，其中至少一可動式光耦合器之應接位置至少形成於第一被覆層中；以及(iii)一光偵測器；(b)提供至少一結合部分，其能夠與一單分子目標物結合；(c)將至少一結合部分個別地定位(localizing)於可動式光耦合器上；(d)提供一單分子目標物分子給至少一結合部分，其中至少一結合部分位於可動式光耦合器上；(e)將可動式光耦合器定位(localizing)於應接位置處，其中至少一結合部分及單分子目標物位於可動式光耦合器上；(f)將一入射光自一光源引導進入導波器，從而形成一激發光於導波器中；g)藉由激發光來激發單分子目標物分子，其中單分子目標物分子結合至至少一結合部分，其中至少一結合部分位於可動式光耦合器上，使得單分子目標物發射出一光線以被一光偵測器偵測。

在一些實施例中，偵測單分子目標物的方法係關於偵測目標分子及/或分子複合物，例如受體配體(receptor ligands)及受體複合物(receptor complexes)、抗原及抗體、或游離的核苷酸三磷酸(free nucleotide triphosphates)及核酸合成反應複合物之交互作用的方法。在一些實施例中，上述方法包括偵測一被標定的分子。在一些實施例中，上述標定採用螢光標記(fluorescent label)。在一些實施例中，上述標定採用螢光分子(fluorescent molecule)。在進一步的實施例中，上述標定採用螢光蛋白質。在特定的實施例中，上述標定採用一量子點。在一些實施例中，上述標定採用一螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)的供體/受質對(donor/acceptor pair)。上述偵測系統，以及使用此偵測系統的方法，可運用於，例如，核酸偵測、DNA定序、生物標記的辨識(biomarker identification)、或流式細胞計數。上述偵測系統能夠偵測並處理低強度的光訊號，使得單分子偵測變得可能。

此外，本發明提供一種一核酸的定序方法，包括：(a)提供一偵測裝置，包括：(i)一可動式光耦合器；(ii)一導波器，包括：一核心層；以及一第一被覆層，其中至少一可動式光耦合器之應接位置至少形成於第一被覆層中；以及(iii)一光偵測器；(b)提供至少一核酸分子；(c)將至少一核酸分子個別地定位(localizing)於可動式光耦合器上；(d)將可動式光耦合器定位(localizing)於應接位置處，其中至少一核酸位於可動式光耦合器上；(e)進行至少一核酸分子的單分子合成定序，其中單分子核酸的合成定序導致產生一發射光，發射光與至少一核酸中的鹼基之特性有關。(f)利用偵測器偵測發射光，產生一輸出訊號；以及(g)處理輸出訊號以決定至少一核酸所包含的鹼基之特性。

在一些實施例中，上述方法包括形成共價連接(covalent attachments)，像是反應物或標的目標物與標記之間，以及官能基團與表面之間，例如可動式光耦合器的表面或應接位置的表面。例如，準備可動式光耦合器之經寡核苷酸改質的粒子，為了接合經生物素化的寡核苷酸(biotinylated oligonucleotides)，鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)改質的粒子可連接至一光耦合器的表面。在一些實施例中，單分子目標物的接合部分，如多胜肽或多胜肽的複合物，可連結至一光耦合器的表面。在本技術領域中，已知多種形成共價連結的方法，例如反應物連接至表面或標記。亦可使用非共價連接的方法。能夠利用許多不同的化學改質以加速連接的形成。化學改質的範例包括：N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxy succinimide，NHS)基團、胺類(amines)、醛類(aldehydes)、環氧衍生物(epoxides)、羧基(carboxyl groups)、羥基(hydroxyl groups)、醯肼(hydrazides)、疏水性基團、薄膜(membranes)、馬來醯亞胺(maleimides)、生物素(biotin)、鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)、硫醇基(thiol groups)、鎳螯合物(nickel chelates)、光敏基團(photoreactive groups)、硼基團(boron groups)、硫酯類(thioesters)、半光胺酸(cysteines)、二硫化物基團(disulfide groups)、烷基與鹵化醯基(acyl halide groups)、麩胺基硫(glutathiones)、麥芽糖(maltoses)、疊氮化物(azides)、磷酸鹽(phosphates)、以及膦類(phosphines)。這些能夠很容易的準備，例如，使用標準方法(Microarray Biochip Technologies,Mark Schena,Editor,March 2000,Biotechniques Books)。在一些實施例中，利用改質劑(例如親電性的改質劑或親核性的改質劑)的適當結合，使連接形成於兩個體之間，其中各個個體皆至少包括一改質劑。

在一些實施例中，藉由利用一存在於一上述個體上的化學改質劑，以及一其他個體之自然形成的部分(naturally-occurring moiety)，例如胺類或氫硫基(sulfhydryl)，使連接形成於兩個體之間。此反應的優點為其能夠快速反應且能夠避免有毒副產物的產生。這類的改質劑的範例包括：N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS-esters)、醛類(aldehydes)、環氧衍生物(epoxides)、以及硫代酯類(thio-esters)。大部分的蛋白質、胜肽、糖肽(glycopeptides)…等等，具有游離的胺基團，其能夠與這類的改質劑反應，來將這些改質劑共價連結至這些改質劑。亦可合成具有內部或末端之胺基團的核酸探針，且其具有商業利用價值(例如IDT或Operon公司)。因此，利用相似的化學反應，生物分子能夠接合(共價或非共價)至標記、表面、或其他的反應物。

許多其他的多功能的交聯劑(cross-linking agents)可用來將一種改質劑的化學活性轉換成另一種。這些基團可為雙官能基團、三官能基團、四官能基團…等等。這些基團亦可為同質功能(homo-functional)或異質功能(hetero-functional)。雙官能基團之交聯劑的例子為X-Y-Z，其中X及Z為兩個活性基團，而Y為一連結之連結物。此外，若X及Z為相同的基團，例如N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS-esters)，將會產生交聯劑，NHS-Y-NHS，其為一同質雙官能交聯劑(homo-bi-functional cross-linker)，並且可以連結個別包括一胺類的兩個體。若X為N-羥基琥珀醯亞胺酯，且Z為馬來醯亞胺基團(maleimide group)，將會產生交聯劑，NHS-Y-馬來醯亞胺，其為一異質雙官能交聯劑(homo-bi-functional cross-linker)，並且可以連結分別包括一胺類的個體與包括一硫代基團(thio-group)的個體。具有許多不同官能基團的交聯劑被廣泛的運用。這類官能基團的範例包括：N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS-esters)、硫代酯類(thio-esters)、鹵烷類(alkyl halides)、鹵化醯類(acyl halides)(例如碘乙醯胺，iodoacetamide)、硫醇類(thiols)、胺類(amines)、半光胺酸(cysteines)、組胺酸(histidines)、二硫化物(di-sulfides)、馬來醯亞胺(maleimides)、順-二醇類(cis-diols)、硼酸(boronic acid)、異羥肪酸(hydroxamic acid)、疊氮化物(azides)、聯胺(hydrazines)、膦類(phosphines)、光敏基團(photoreactive groups)(例如：蒽醌，anthraquinone；二苯甲酮，benzophenone)、丙烯醯胺(acrylamide)(例如：acrydite)、親和性基團(affinity groups)(例如：生物素，biotin；鏈黴抗生素蛋白，streptavidin；麥芽糖，maltose；麥芽糖接合蛋白，maltose binding protein；麩胺基硫，glutathione；麩胺基硫-硫轉移脢，glutathione-S-transferase)、醛類(aldehydes)、酮類(ketones)、羧酸類(carboxylic acids)、磷酸鹽類(phosphates)、疏水性基團(hydrophobic groups)(例如：苯基，phenyl；膽固醇，cholesterol)…等等。

其他的改質劑替代物(例如光交聯(photo-crosslinking)及熱交聯(thermal crosslinking))已為本技術領域人員所知。產業上可利用的技術包括，例如，來自Mosiac Technologies(Waltham,MA),ExiqonTM(Vedbaek,Denmark)、Schleicher and Schuel1(Keene,N.H.),Surmodics TM(St. Paul,MN)、Xenopore TM(Hawthorne,N.J.),Pamgene(Netherlands)、Eppendorf(Germany)、Prolinx(Bothell,WA)、Spectral Genomics(Houston,TX)、and CombimatrixTM(Bothell,WA)等公司的商品。

2.1用於偵測系統的標記

在一些本說明書中所描述之方法的實施例中，將一或多個標記黏附至標的單分子目標物(亦即，與目標物或其他反應物反應之代測物質、抗體、或其他反應物)，或黏附至探子(probe(s))，例如引子、抗體、或其他能與目標物或其他反應物反應的反應物。任何標記皆能用於單分子目標物或探子上，上述單分子目標物或探子對於得到訊息與目標物的量或存在的相關有幫助。

例如，可使用多種不同的螢光分子，包括小分子、螢光蛋白、以及量子點。有用的螢光分子(螢光團，fluorophore)包括但不限於：1,5 IAEDANS；1,8-ANS；4-Methylumbelliferone；5-carboxy-2,7-dichlorofIuorescein；5-Carboxyfluorescein(5-FAM)；5-Carboxynapthofluorescein；5-Carboxytetramethylrhodamine(5-TAMRA)；5-FAM(5-Carboxyfluorescein)；5-HAT(Hydroxy Tryptamine)；5-Hydroxy Tryptamine(HAT)；5-ROX(carboxy-X-rhodamine);5-TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine)；6-Carboxyrhodamine 6G;6-CR 6G;6-JOE;7-Amino-4-methylcoumarin；7-Aminoactinomycin D (7-AAD)；7-Hydroxy-4-methylcoumarin；9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine；ABQ；Acid Fuchsin；ACMA(9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine)；Acridine Orange；Acridine Red；Acridine Yellow；Acriflavin；Acriflavin Feulgen SITSA；AFPs-AutoFluorescent Protein-(Quantum Biotechnologies)；Texas Red；Texas Red-X conjugate；Thiadicarbocyanine(DiSC3)；Thiazine Red R；Thiazole Orange；Thioflavin 5；Thioflavin S；Thioflavin TCN；Thiolyte；Thiozole Orange；Tinopol CBS(Calcofluor White)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC(TetramethylRodaminelsoThioCyanate)；True Blue；TruRed；Ultralite；Uranine B；Uvitex SFC；WW 781；X-Rhodamine；XRITC；Xylene Orange；Y66F；Y66H；Y66W；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；螯合染劑(interchelating dyes)例如：YOYO-3、Sybr Green、Thiazole orange；Alexa Fluor染劑系列的成員(來自Molecular Probes/Invitrogen)，其涵蓋了　寬廣的光譜範圍以及符合一般激發光源的主要輸出波長，例如：Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、以及750；Cy螢光染劑系列的成員(GE Healthcare)，其亦涵蓋了　寬廣的光譜範圍，例如：Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7；Oyster螢光染劑的成員(Denovo Biolabels)，例如：Oyster-500、550、-556、645、650、656；Y-Labels系列的成員(Dyomics)，例如，範圍介於418nm(DY-415)至844nm(DY-831)具有最大吸收質的範圍，例如DY-415、-495、-505、-547、-548、-549、-550、-554、-555、-556、-560、-590、-610、-615、-630、-631、-632、-633、-634、-635、-636、-647、-648、-649、-650、-651、-652、-675、-676、-677、-680、-681、-682、-700、-701、-730、-731、-732、-734、-750、-751、-752、-776、-780、-781、-782、-831、-480XL、-481XL、-485XL、-510XL、-520XL、-521XL；ATTO螢光標記系列的成員(ATTO-TEC GmbH)，例如：ATTO 390、425、465、488、495、520、532、550、565、590、594、610、611X、620、633、635、637、647、647N、655、680、700、725、740；CAL Fluor染劑系列或Quasar 染劑系列的家族(Biosearch Technologies)，例如：CAL Fluor Gold 540、CAL Fluor Orange 560、Quasar 570、CAL Fluor Red 590、CAL Fluor Red 610、CAL Fluor Red 635、Quasar 670；量子點，例如：EviTags系列的量子點(Evident Technologies)或Qdot系列的量子點(Invitrogen)，例如：Qdot 525、Qdot565、Qdot585、Qdot605、Qdot655、Qdot705、Qdot 800；螢光素(fluorescein)；若單明(rhodamine)；及/或藻紅素(phycoerythrin)；或上述之結合。參閱，例如美國專利申請公開號No. 2008/0081769。

在包含定位於在應接位置的可動式光耦合器上之標的核酸之單分子核酸定序的實施例中，可藉由螢光團(fluorophore)的激發及檢測，來偵測納入新生的DNA鏈段中之核苷酸，其中上述螢光團直接連接至新納入的核甘酸，例如：一螢光團，其連接至三磷酸去氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)的β或γ磷酸鹽，並且在dNTP納入成長中的鏈段後，緊接著被分開。在一些實施例中，可利用以螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)技術為基礎的檢測，來偵測納入新生鏈段的核苷酸。例如，在一些實施例中，可使用於美國專利US 2010/0035268中所描述之以螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)技術為基礎的檢測方法。在這類的實施例中，能夠作為螢光供體(fluorescence donor)的量子點可連結至定序的引子，且用於合成成長中鏈段的dNTP攜帶一螢光受質基團(fluorescence acceptorgroup)於其末端(γ)之磷酸基團上。利用檢測與dNTP相連接的螢光受質的發射情形，經螢光標定的多磷酸核苷(nucleotide polyphosphate)，在與標的核酸互補的活性位置處，納入成長中的核苷酸鏈段，接著受激發的量子點螢光供體(Quantum dot fluorescence donor)發生螢光共振能量轉移。藉由其各自螢光標記來決定各個被納入的核苷酸的特性(identity)，其中上述螢光標記在納入成長中的鏈段後緊接著自核苷酸上被分離。

2.2　核酸偵測

上述偵測系統可用於分子偵測的方法或過程中，例如，核酸定序。此系統，及利用此系統的方法或過程，有助於像是分析或診斷上的應用。

上述偵測系統可用於多種不同的定序方式(sequencing modalities)以及適用於定序單分子。此外，相對於現存的生物晶片裝置，上述偵測系統簡化了設計、裝備、以及生產。

2.2.1 Molecules to be Detected待測分子

適合偵測的核酸可包括任何核酸，包括，例如：DNA、RNA、或PNA(肽核酸，peptide nucleic acid)，且可包含已知或未知的任何序列，包括自然發生或人工合成的序列。核酸可自然地產生、重組製造(recombinantly produced)、或化學合成。可根據實際應用而改變待測核酸的長度。在一些實施例中，核酸可包括至少10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000個鹼基，或更多。在一些實施例中，核酸可為10至20、10至50、10至100、50至100、50至500、50至1000、50至5000、500至2000、500至5000、或1000至5000個鹼基。

用於偵測的核酸可為單股核酸。藉由所屬技術領域已知的方法，例如：加熱、鹼化、或其他化學處理，一單股核酸模板可自一雙股分子衍生得來。單股核酸模板亦可藉由化學合成或體外合成(in vitro synthesis.)的方式來製造而得。

在一些實施例中，待測核酸為環狀。在一些實施例中，上述方法包括：提供一環狀的核酸分子，其包括一段已知序列的插入片段(insert)，上述已知序列可用來作為引子(primer.)的結合位(binding site)。環狀的核酸分子可以單股或雙股的狀態被提供，且一般包括至少一共價閉合鏈段(covalently closed strand)。雙股環狀分子可包括一缺口鏈段(nicked strand)或一第二共價閉合鏈段。

在一些實施例中，若已知環狀的核酸分子中部分的序列，且其已知序列的片段能夠作為核酸的插入片段(例如：可能已知一在包含於環狀分子中的基因序列內的保守序列(conserved motif)，或根據一分子在極嚴苛的條件下，與另一段已知序列的核酸雜交的能力，可知上述分子包含一序列)，則可藉由將環狀的核酸分子以環狀形式自其來源分離，來提供環狀的核酸分子。在一些實施例中，僅能不明確(inexactly)的知道核酸的插入片段的序列，像是當對核酸的認知係來自於嚴苛的雜交性質(stringent hybridization properties)時就會如此。在一些實施例中，可明確知道核酸的插入片段的序列，像是當環狀的核酸分子具有一已知的主幹序列(backbone sequence)，或經過精心設計而包含一已知序列時。

在一些實施例中，藉由一體外反應或數個反應的進行，將一線狀的核酸樣本與一核酸的插入片段一起合併進入一環狀的分子，以提供環狀的核酸分子。在一些實施例中，上述體外反應或數個反應能夠包括藉由連結脢(ligase)的接合反應(ligation)，及/或其他參與反應的鏈段，上述反應例如：藉由各種不同的酵素的催化反應，其包含重組脢(recombinases)及拓樸異構脢(topoisomerases)。DNA連結脢(DNA ligase)或RNA連結脢(RNA ligase)可作為酵素加入一線狀的模板(linear template)之兩末端，無論有沒有銜接分子(adapter molecule)或連結分子(linkers)，以形成一環狀，如第8圖中所示範。例如，T4 RNA連結脢(T4 RNA ligase)將單股的DNA或RNA耦合，如Tessier等人在Anal Biochem,158: 171-78(1986). CIRCLIGASE(TM)(Epicentre,Madison,Wis.)中所描述，亦可用於催化單股核酸之接合反應。此外，一雙股的連結脢，例如E. coli連結脢(E. coli ligase)或T4 DNA連結脢(T4 DNA ligase)。

在一些實施例中，提供環狀核酸分子包括：藉由延伸自至少一包括互補的區域(complementary regions)的引子(上述引子包括：具有已知序列的5’端(5’flaps)之隨機的引子(random primers)，上述已知序列能夠作為核酸的插入片段)，來複製一核酸的模板；以及將經過放大的核酸變成環狀，例如可藉由一連結脢或一重組脢來催化；上述經過放大的核酸可，例如：藉由限制(restriction)或磷酸化作用(phosphorylation)，在環化(circularization)之前，於其末端進行酵素處理。

在一些實施例中，藉由進行化學的環化作用來提供環狀的核酸分子。化學方法係運用已知的耦合劑(coupling agents)像是BrCN陽性咪唑(BrCN plus imidazole)與二價金屬(divalent metal)、N-cyanoimidazole與ZnCl2,1-(3-dimethylaminopropyl)-3　ethylcarbodiimide HCl、以及其他的碳二醯亞胺(carbodiimides)與羰基二咪唑(carbonyl diimidazoles)。藉由縮合(condensing)5’端的磷酸根(5’-phosphate)與3’端的羥基(3’-hydroxyl)，或縮合5’端的羥基(5’-hydroxyl)與3’端的磷酸根3’-phosphate，亦可將線狀模板的末端加入。

在一些實施例中，環狀的核酸分子包括一插入的序列，上述插入的序列可被視為一末端的連結引子(end link primer)，除了此分子為環狀因而上述插入的序列不在末端以外。

2.2.1.1　末端連結引子

在一些實施例中，線狀的核酸可更包括一或多個耦合至核酸的5’端、3’端、或同時耦合至5’端及3’端兩者之末端的連結引子。在特定的實施例中，一末端的連結引子可被固定(affixed)至核酸的3’端。末端的連結引子可用來提供一或多個偵測的引子，例如：定序的引子，之互補的序列。

末端的連結引子為短的核酸分子，通常由少於100個核苷酸所構成。在一些實施例中，末端的連結引子的長度可為至少5、10、15、20、25、30、50、75、90個核苷酸、或更多個核苷酸。在一些實施例中，末端的連結引子的長度可為8至25個核苷酸、10至20個核苷酸、10至30個核苷酸、10至50個核苷酸。在一些實施例中，末端的連結引子可為無支鏈的(unbranched)，然而，在其他的實施例中，上述末端的連結引子可為有支鏈的(branched)。

末端的連結引子可作為一或多個用於偵測核酸的引子的配對(complement)，例如：定序的引子。在一些實施例中，上述引子可藉由雜交(hybridization)來偵測核酸，例如：上述引子可包含一可偵測的標記，例如一螢光標記(fluorescent label)。在一些實施例中，末端的連結引子之5’端可包括一與定序的引子互補的序列。在一些實施例中，末端的連結引子之與定序的引子互補的序列可被定向(oriented)，使得上述定序的引子之3’端可立刻被調整成在待測核酸中的第一個核苷酸。

在一些實施例中，可藉由連結脢，例如：DNA連結脢，將末端的連結引子加入待測核酸的末端。在一些實施例中，末端的連結引子以及待測核酸，在接合之前兩者皆可為單股。在其他的實施例中，兩者皆可為雙股。在另一實施例中，一個可為單股而另一個可為雙股。接合作用已為所屬技術領域所熟知。例如，在波隆尼定序方法(polony Sequencing method)中，Shendure等人，運用New England Biolabs’(NEB) Quick Ligation^TM 試劑組，將一T30末端的連結引子(T30 end link primer，32個鹼基對)接合至一樣本DNA片段(Science,309:1728-1732[2005])。上述連結反應溶液包括0.26 pMole的DNA、0.8 pMole的T30末端連結引子、4.0 μl T4 DNA連結脢1倍的Quick Ligation Buffer中。在混合之後，將上述反應溶液培養於室溫下10分鐘，接著放置於冰上。藉由將樣本加熱至65℃維持10分鐘，來終止上述連結反應。

在其他的實施例中，可在待測核酸上合成末端的連結引子。例如：末端的連結引子可為一均質的聚合物(homopolymer)，其中藉由例如：末端轉移脢(terminal transferase)來將均質的聚合物(homopolymer)加入。例如，Harris等人(Science 320:106-109[2008])將一多腺嘌呤尾(poly-A tail)加至DNA模板，上述DNA模板作為一在病毒基因體的單分子定序中之多胸腺嘧啶定序引子(poly-T sequencing primer)的配對。

2.2.1.2　定序引子

定序的引子為單股的寡核苷酸，其與待測核酸的片段互補，或與其本身相關之末端的連結引子互補。在一些實施例中，上述定序的引子的長度可為至少8、10、15、20、25、30、34、40、45、50個核苷酸，或更多個。在特定的實施例中，定序的引子的長度可為為8至25個核苷酸、10至20個核苷酸、10至30個核苷酸、10至50個核苷酸。上述定序的引子可由任何類型的核苷酸所構成，包括：自然產生的核苷酸、不存在於自然界的核苷酸相似物(analogs)、或經過改質的核苷酸。

在一些實施例中，定序的引子可包含經過改質的核苷酸，例如：鎖核酸(locked nucleic acids，LNAs，經過改質的核糖核酸，其提供在多聚核酸中的經過強化之鹼基堆疊的交互作用(enhanced base stacking interactions))。如Levin等人在Nucleic Acid Research 34(20):142[2006]中所描述之LNAs的功用，說明了包含LNA的引子改進了專一性(specificity)，並且相對於對應之未鎖引子(unlocked primer)，表現出更強的結合作用。產生包含3 LNA核苷酸(於帽蓋(caps)中)之MCP1引子(MCP1 primer，5’-cttaaattttcttgaat-3’)的三個變體(variants)：MCP1-LNA-3’(5’-cttaaattttCtTgaAt-3’)、MCP1-LNA-5’(5’-CtTaAattttcttgaat-3’)、以及MCP1-LNA-even(5’-ctTaaatTttctTgaat-3’)，其中上述三個變體在引子中之不同位置處。所有的LNA取代的引子皆具有強化的Tm，雖然MCP1-LNA-5’引子表現出顯著地強化之定序的準確性(Phred Q30計數)。因此，在特殊的實施例中，上述定序引子可包含至少一鎖5’酸(locked nucleotide)於其5’的區域，亦即，上述5’二分之一、三分之一、或四分之一的定序引子。

在與核酸聚合酵素(nucleic acid polymerizing enzyme)、dNTPs、以及適當的緩衝成分(buffer components)結合之前或之後，定序的引子及單股的目標核酸(亦即將被定序的核酸，包括至少一末端的連結引子)可進行雜交，而且之後可被吸收至可動式光耦合器。可藉由在含鹽溶液中，例如：5X SSC(或5X SSPE),0.1% Tween 20(或0.1% SDS)、以及0.1% BSA緩衝液，混合上述樣本核酸與一莫耳過量之定序的引子，使上述定序的引子及樣本核酸進行雜交。加熱上述混合物至65℃，持續5分鐘，以及緩慢降溫至室溫，好讓引子/模板進行低溫黏著(annealing)。可藉由合適的方法，包括：分子篩(molecular sieve)，來刪除殘留的引子(residual primers)。

在一些實施例中，目標核酸被定位於一可動式光耦合器上，作為核酸合成反應複合物的一成分，其中上述合成反應不僅不可能被定位於在導波器之應接位置的一固定空間中而不需要將聚合脢(polymerase)，亦不可能將目標核酸固定至一表面。為了準備一定位於可動式光耦合器之表面上的核酸合成反應複合物，一如前述之經過環化的目標核酸，可與核酸合成之一定序的引子、一核酸聚合酵素、dNTPs、以及適當的緩衝成分結合。上述聚合脢可在多個週期中(in multiple cycles)，圍繞著上述經過環化的模板進行，產生一在成長中之新生的鏈段，上述鏈段包括模板鏈段的多重複製(multiple copies)。接著，上述聚合的複合物可與可動式光耦合器結合，上述可動式光耦合器在其表面上利用寡核苷酸進行改質，如第9圖中所示。因此，在這類的實施例中，目標鏈段的模板與聚合脢，兩者皆非自己本身固定在表面上。上述寡核苷酸可包括：一與定序的引子之序列進行雜交的序列、一與可嵌入在成長中之新生的鏈段內之多重複製進行雜交的序列。這些嵌入的序列可接合至連結在光耦合器之表面的寡核苷酸，如第10圖中所示。在一些實施例中，上述寡核苷酸包括隨機的序列(random sequences)，此序列可在各種不同的位置，與成長中之新生的鏈段進行雜交，如第11圖中所示。在一些實施例中，可動式光耦合器可於其整個表面上被寡核苷酸改質，如第9圖中所示。在進一步的實施例中，可動式光耦合器在其僅有一部分的表面上被寡核苷酸改質，如第10圖及第11圖中所示。

在一些實施例中，一雙股的目標序列包括一鏈段，此鏈段具有併入之生物素化的尿嘧啶鹼基(incorporated biotinylated uracil bases)，上述雙股的目標序列的產生，可藉由利用一連結引子(linking primer)來準備一環狀單股的目標鏈段，上述連結引子可與單股的目標核酸之兩末端進行雜交，以及藉由利用一核酸聚合脢與一dNTP混合物來聚合第二鏈段，其中利用生物素化的dUTP來補充上述dNTP混合物，如第12圖中所示。上述雙股的目標物可被變性，以及與鏈黴抗生素蛋白改質(streptavidin-modified)的光耦合器粒子相結合，進而藉由與其纏繞在一起之生物素化的鏈段的特性，將此經過變性的目標鏈段吸附至光耦合器，如第13A圖所示。在額外的聚合脢(addition of a polymerase)、dNTPs、一定序的引子、以及適當的緩衝成分上，可形成一核酸合成反應複合物，其中上述複合物被吸附至一可動式光耦合器的表面，而未將聚合脢或目標核酸固定，如第13B圖及第13C圖中所示。在光耦合器與在應接位置被吸收的模板之定位之前或之後，可添加聚合脢、dNTPs、以及緩衝成分。

可藉由適當的方法，包括：目視檢查(visual inspection)或電腦輔助的引子設計，來設計引子，上述引子包括序列的末端的連結與定序的引子兩者。很多的套裝軟體(software packages)可用來輔助引子的設計，包括：DNAStarTM(DNAStar,Inc.,Madison,WI)、OLIGO 4.0(National Biosciences,Inc.)、Vector NTI(Invitrogen)、Primer Premier 5(Premierbiosoft)、以及Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,MA)。引子的設計可考慮到，例如，待定序的分子、專一性、長度、欲融化的溫度、二級結構、以及使用的酵素(亦即聚合脢或連結脢)。參見，例如，Joseph Sambrook與David Russell，Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，第三版(2001)。

2.2.2　定序模式

一些實施例為定序核酸的方法，其包括下列步驟：(a)提供一偵測裝置，包括：(i)一可動式光耦合器；(ii)一導波器，包括：一核心層；以及一第一被覆層，其中至少一可動式光耦合器之應接位置至少形成於第一被覆層中；以及(iii)一光偵測器；(b)提供至少一核酸分子；(c)將至少一核酸分子個別地定位於可動式光耦合器上；(d)將可動式光耦合器定位於應接位置處，其中至少一核酸位於可動式光耦合器上；(e)進行至少一核酸分子的單分子合成定序，其中單分子核酸的合成定序導致產生一發射光，上述發射光與至少一核酸中的鹼基之特性有關。(f)利用偵測器偵測發射光，產生一輸出訊號；以及(g)處理輸出訊號以決定至少一核酸所包含的鹼基之特性。

在這些方法中，將至少一核酸分子個別地定位於可動式光耦合器上，以及將可動式光耦合器定位於應接位置處，其中至少一核酸位於可動式光耦合器上，被理解為一單核酸分子可被定位於一位於應接位置之可動式光耦合器上，亦即將一個(且不超過一個)核酸分子定位於至少一應接位置中。在一些實施例中，複數個應接位置皆個別含有一個(且不超過一個)可動式光耦合器，其中上述可動式光耦合器個別包括一個定位於其表面上的核酸分子。在一些實施例中，在操作過程期間，一些複數個應接位置包含光耦合器，上述各個光耦合器皆分別包括一個定位於其表面上的目標單核酸子，且其他包含或不包含可動式光耦合器的應接位置，其光耦合器皆不包含表面定位的目標核酸分子。也就是說，在樣本溶液中，具有表面定位之核酸分子的光耦合器的強度低於某個特定值，因此，並非所有的應接位置中皆包含具有表面定位之核酸分子的光耦合器。這樣可避免在定序完成前，發生兩個或兩個以上的核酸分子定位於應接位置的情形，、以便避免包含來自大於一個核酸分子的資訊之定序的結果。例如，在一些實施例中，少於或等於50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%的應接位置將會產生因為低濃度之定位於待檢測或待鑑定的應接位置的生物分子之訊號。在實施例中，第一目標核酸分子從定位於應接位置的光耦合器上游離(dissociates)，接著第二核酸分子隨後自同一個定位於應接位置的光耦合器上游離，藉由在合併的核酸(incorporated nucleotides)的偵測中之任何的差距(gap)，及/或藉由在檢定核酸序列中的差異，第一核酸定序的結果可與第二核酸定序的結果有所區別。

在一些實施例中，單分子核酸的合成定序(single molecule nucleic acid sequencing-by-synthesis)導致通過化學發光(chemiluminescence)的光線的發射。值得注意的是，在這些實施例中，當化學發光產生來自化學能的光線時，上述裝置並不需要包括光源。

In some embodiments,the apparatus further comprises a light source,which may be used to provide excitatory light,e.g.,for causing the single molecule nucleic acid sequencing-by-synthesis to emit light via fluorescence.在一些實施例中，上述裝置更包括一光源，上述光源可用於提供激發的光線，例如，使單分子核酸的合成定序通過螢光發射光線。

藉由所屬技術領域中已知的方法，像是回顧例如：美國專利號U.S. Patent No.6,946,249以及Shendure et al.,Nat. Rev. Genet. 5:335-44(2004)，偵測裝置及方法可用於偵測及定序核酸。可從所屬技術領域中已知的單分子定序的方法中選擇定序的模式(sequence modalities)。在一些實施例中，上述定序的方法可仰賴無論是DNA聚合脢(DNA polymerase)或DNA連結脢(DNA ligase)的專一性，以及可包括，例如：鹼基延伸定序(base extension sequencing，單一鹼基逐步延伸，single base stepwise extensions)、以及多重鹼基的合成定序(包括，例如：利用末端標定的核苷酸之定序)。

以單分子定序模式來說，偵測系統可提供能夠定序單分子的優勢。例如，可提供一待定序的環狀模板核酸分子以及一定序的引子。藉由進行複數個定序的週期(sequencing cycles)，以得到比模板核酸分子中的核苷酸數量更多的序列之依序判讀(Sequence read)，使重複定序能夠實現。上述定序的依序判讀包含訊息，其中上述訊息反覆地(redundantly)辨識了在至少一位於模板核酸分子中之位置的鹼基。在一些實施例中，上述定序的依序判讀包含訊息，其中上述訊息多餘地辨識了至少25%、50%、75%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之在模板核酸分子中的鹼基。在一些實施例中，上述定序的依序判讀包含訊息，其中上述訊息辨識至少25%、50%、75%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之在模板核酸分子中的鹼基，其中上述模板核酸分子具有三倍、四倍、五倍、七倍、或十倍或更多的重複(redundancy)。藉由定序相同的分子，定序錯誤可望下降，作為定序之依序判讀的數量之功率(as the power of the number of sequencing reads)。例如，如果每個單一判讀的鹼基錯誤率為10-3，那麼在兩次判讀之後，將會掉至(10-3)2，亦即10-6。既然上述用於定序之經過改質的核苷酸能夠失去其標記或保護基團(blocking group)，導致，例如假性偵測(spurious deletions)，此乃特別有助於單分子定序。

在核苷酸上酵素及螢光基團(fluorophore)標記的生存能力(viability)，當核酸合成反應進行時，能夠逐漸消失。當定序的依序判讀速度慢下來時，能夠將反應混合物淘汰離開偵測系統，並且更換新的溶液以進行後續定序的依序判讀。在一些實施例中，利用新的反應物來補充上述反應混合物，而不將此反應混合物淘汰及更換。

一般而言，在單分子定序中，至少一個待測的核酸分子與引子接觸。例如：藉由進行至少一酵素催化的聚合作用(polymerization)或連結反應(ligation reaction)來改質上述引子。上述至少一個反應造成光線的發射，上述光線與至少一個在核酸中的鹼基的性質相關。”造成”光線的發射，其被理解為至少一個反應導致至少一個光線發射的情況發生，上述光線與至少一個在核酸中的鹼基的性質相關；此情況的發生可藉由與激發光、化學或生物發光系統(chemi-or bio-luminescent system)…等等之間的相互作用。上述至少一種情況可為，例如：螢光基團合併進入至少一反應的產物中、或焦磷酸根(pyrophosphate)的釋放。因此，無論是否有外部的激發皆可產生光線。例如，單分子定序的進行可利用可逆性末端終結子之鹼基類似物(reversible terminator base analogs)，其中上述可逆性末端終結子之鹼基類似物(reversible terminator base analogs)包括一共價連結之可偵測的標記，例如：一螢光標記、以及一防止任何二次延伸(secondary extension)的保護基團(blocking group)，其中在上述類似物被加至引子之後，激發並偵測上述類似物，並且在加入之後移除上述標記與保護基團，以進行另一輪的延伸(extension)。此外，藉由提供化學或生物發光的偵測系統，其中上述偵測系統以與焦磷酸鹽相關(pyrophosphate-dependent)的方式發射光線，可在沒有外部激發的情況下偵測延伸步驟的產物，例如一焦磷酸鹽。這些模式以及其他的模式將更詳細地描述於下文中。

上述發射的光線與至少一個在核酸中的鹼基的性質相關。在一些實施例中，上述相關性能夠為時間的(temporal)，例如，光線發射的時間顯示了至少一個鹼基的性質，像是當提供不同的鹼基類似物(base analogs)以在不同時間用於一聚合反應中的情形。在一些實施例中，上述相關性可能為光譜的(spectral)，例如，發射光線的光譜顯示了至少一個鹼基的性質，像是當提供包括不同螢光基團的不同鹼基類似物以用於一聚合反應中的情形。

在一些實施例中，單分子核酸定序包括多重定序週期。一個定序週期被理解為造成一光線的發射的情形，上述光線與至少一個在核酸中的鹼基的性質相關，為了在一第一鹼基被辨識之後，辨識至少一在核酸中的第二鹼基，上述情形可被重複。因此，在包括單分子核酸定序的方法中，上述單分子核酸定序能夠包括至少一給定數量的定序週期，如此一來造成至少上述給定數量之光線的發射，上述光線集體(collectively)與至少一個在核酸中的鹼基的性質相關。在一些實施例中，上述給定的數量可為，例如：2、3、4、5、10、20、50、100、200、或500。

定序的方法能夠包括決定一或多個在核酸中的鹼基的性質。在一些實施例中，進行單分子核酸定序造成光線的發射，其中利用至少一包括至少一第一光學感測器(optical sensor)及一第二光學感測器的光偵測器來偵測上述光線，並且處理來自上述至少兩個光學感測器的輸出訊號，藉由將至少一個處理的結果與至少一個已知的結果比對，上述已知的結果對應至少一個已知的類型，能夠決定至少一個在核酸中的鹼基的性質。

例如，一個處理的結果能夠顯示一反應發生的時間；當發射的光線在時間上與至少一個在核酸中之鹼基的性質相關時，上述時間可被用於辨識至少一個在核酸中的鹼基。

在另一個實施例中，一個處理的結果能夠決定將螢光基團合併進入一反應的產物中；當發射的光線在光譜上與至少一個在核酸中之鹼基的性質相關時，上述決定可被用於辨識至少一個在核酸中的鹼基。

2.2.2.1　鹼基延伸定序：逐步延伸(Base Extension Sequencing: Stepwise Extension)

在一些實施例中，偵測裝置可被用於偵測在鹼基延伸定序期間產生的光線。在一些實施例中，藉由提供一包括一待測的單股核酸之部分重複(partial duplex)的樣本核酸、一與待測核酸之3’端相關之末端的連結引子(end link primer)、以及一其黏著(anneal)的定序引子，開始進行鹼基延伸定序。在一些實施例中，在一適合的緩衝溶液中，聚合脢及經過改質的核苷酸可應用於上述光偵測裝置。在一些實施例中，上述核苷酸可包括一共價連結之可偵測的標記，例如，一螢光標記、以及一保護基團(blocking group)以防止任何二次延伸(secondary extension)。因此，上述定序停止於增加一單一核苷酸至定序引子的3’端之後。

在一鹼基延伸定序反應之實施例的第一步驟中，可藉由一DNA聚合脢將具有一螢光保護基團的核苷酸加入至定序引子的3’端。在一些實施例中，上述螢光標記可作為上述保護基團。在其他的實施例中，上述螢光標記可為獨立的基團。一單一核苷酸可在定序引子的3’端被併入，並且藉由其本身的標記被對應的光偵測器辨識。接著，例如，藉由化學或酵素溶解作用(lysis)，移除上述螢光標記及保護基團，以容許鹼基延伸額外增加的週期。在一些實施例中，可同時或依序以及以任何順序，移除標記與保護基團。藉由編排鹼基加入的順序，可以3’至5’的方向，一次一個鹼基地推演出樣本核酸的序列。

一般而言，有兩種在逐步延伸期間辨認增加之核苷酸的方法。在第一種情形中，四個核苷酸可都具有相同之可偵測的標記，但是以一預先決定的順序一次增加一個。延伸的核苷酸的性質可取決於上述核苷酸在延伸反應中加入的順序。在第二種於延伸期間辨認完整(integrated)之鹼基的模態中，四個不同的核苷酸可同時加入，且每個核苷酸個自與不同之可偵測的螢光標記耦合。在不同的實施例中，激發光譜或發射光譜及/或標記的強度可能不同。在延伸反應中加入之核苷酸的性質可取決於上述偵測之標記的強度及/或波長(亦即，激發光譜或發射光譜)。

2.2.2.2　合成定序：多步驟延伸(Sequencing by Synthesis: Multi-step Extension)

在一些實施例中，可利用多重連續的延伸反應(multiple uninterrupted extensions)，例如，不使用保護基團，來處理合成的定序。在這些實施例中，藉由偵測在核苷三磷酸(nucleoside triphosphate)水解之後，亦即β與γ磷酸鹽複合物(phosphate complex)的釋放之後，焦磷酸根(pyrophosphate)的釋放，可監測上述聚合反應。例如，藉由一在此複合物上的螢光部分(fluorescent moiety)，可直接偵測此複合物，或例如，藉由將上述磷酸鹽耦合至一化學或生物發光偵測系統，可間接偵測此複合物。

在一些實施例中，藉由利用經過末端螢光標定的核苷酸，可基本上(essentially)持續地定序上述樣本核酸。末端螢光標定的核苷酸以及其使用的方法之示範的實施例，描述於，例如美國專利號U.S. Patent No. 7,361,466以及美國專利公開號U.S. Patent Publication No. 2007/0141598，公開於June 21,2007。簡言之，上述核苷酸可應用於上述偵測系統，並且當此核苷酸在聚合反應期間被水解時，上述被標定的磷酸根可被對應的光偵測器偵測。在一些實施例中，上述核苷酸可包括：不能區別的(indistinguishable)，例如，相同的(identical)，標記，並且之後以一預先決定的順序加入。具有不能區別的標記之核苷酸之連續的(Sequential)、循環的(cyclical)增加，還容許多個、不間斷的(uninterrupted)聚合步驟，例如，在均聚合物(homopolymer)序列中。

2.2.3　其他的應用

上述偵測裝置可同時偵測數百萬個核酸片段。如果每個片段的長度為，例如，1000個鹼基，一單一裝置可一次獲得數十億個以上的鹼基序列。下文將討論本說明書中所提供的系統及方法之其他的應用。

2.2.3.1　全基因體定序(Whole-Genome Sequencing)

上述偵測系統可被用於進行全部或部分基因體的定序，例如：病毒、細菌、真菌、真核細胞、或像是人類等的哺乳動物等之脊椎動物的基因體定序。

染色體DNA(Genomic DNA)可被剪切成至少20、50、100、200、300、500、800、1200、1500個核苷酸或更長之定序的片段。在一些實施例中，被剪切的染色體DNA的長度可為20至50、20至100、20至500、20至1000、500至1200、或500至1500個核苷酸。在一些實施例中，待定序的核酸，與相關之末端的連結引子，可形成單一鏈段、黏著(annealed)至一定序的引子、以及應用於如上述定序的偵測系統。

2.2.3.2　基因表現分析檢測(Gene Expression Profiling)

在其他的實施例中，上述偵測系統可用於將基因表現分析檢測(gene expression profiling)的cDNA定序。例如，藉由計算在一裝置上偵測的特定序列之相對頻率(relative frequency)，可量化mRNA的階層(mRNA levels)。在如本說明書中所描述的裝置上，數百萬個cDNA分子可同時被定序。如果一個細胞平均包含350,000個mRNA分子，在一百萬個定序反應中，一呈現甚至每個細胞一個複製的轉錄體(transcript)，預計被定序約三次。因此，利用單一複製數的靈敏度(single-copy-number sensitivity)，上述偵測系統適用於單分子定序。在其他的實施例中，上述偵測系統可被用於直接將基因表現分析檢測(gene expression profiling)的RNA定序(亦即，直接的RNA定序，參閱例如，Ozsolak et al.,Nature 461: 814-818(2009))。

cDNA的合成在所屬技術領域中已廣為知悉，其通常包括具有選擇性富集之mRNA(optional enrichment of mRNA)的全RNA之抽取。藉由以下步驟，包括：例如，第一鏈段之合成的反轉錄；核糖核酸水解脢(RNAse)處理；移除殘留的RNA；上述第一鏈段之隨機的六聚體啟動(random hexamer priming)；以及藉由DNA聚合脢合成第二鏈段，自mRNA產生cDNA。上述產生的sDNA適用於在本說明書中所述之系統上的定序。分離與準備DNA及RNA兩者的方法在所屬技術領域中已廣為知悉。參見，例如，Joseph Sambrook及David Russell,Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press；第三版(2001)。

2.2.3.3　其他的偵測方法

(a)　螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)

在一些實施例中，可藉由螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)，於偵測系統上偵測一分子。如所屬技術領域中所知，當一受到激發的供體(donor)分子非輻射地(non-radiatively)轉移能量至一受質(acceptor)分子時，上述分子發射出能量，此能量一般為光線，會發生螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)。藉由提供較大的光譜分離(greater spectral separation)，上述光譜分離介於有效激發驅以及偵測中的分子之發射波長之間，螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)能夠有助於減少背景光線。由於FRET的效率會以供體與受質之間距離的六次方的速度衰減，螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)常用於偵測鄰近分子間的交互作用。例如，Zhang等人(Nature Materials 4:826-31[2005])藉由FRET來偵測核酸的雜交(hybridization)。被生物素化的核酸標的(biotinylated nucleic acid target)結合至具有抗生物蛋白塗層的量子點供體(avidin-coated quantum dot donor)，接著，上述量子點供體激發Cy5結合的DNA探針(Cy5-conjugated DNA probe)。在一些實施例中，在樣本溶液中游離之被標定的分子，以及接合至上述游離的分子且被定位於可動式光耦合器的表面上之被標定的分子或分子複合物，可形成一供體/受質對(donor/acceptor pair，反之亦然)，以用於FRET的偵測。

在一些利用偵測系統之核酸定序的實施例中，經螢光標定的核苷酸可作為一黏附至聚合脢或連結脢之供體發色團(chromophore)的受質發色團(chromophore)。因此，在這些實施例中，上述定位於聚合脢或連結脢上的供體發色團可激發一位於核苷酸上的受質發色團，上述核苷酸正在目標核酸上進行聚合，或正在連結至目標核酸。沒有接近聚合脢的核苷酸，由於其螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)的效率快速的下降，可能不會被激發。在一些實施例中，上述供體分子可為，例如，另一個螢光基團(fluorophore)，例如：一量子點。量子點，例如：所屬技術領域中已知的半導體量子點，其描述於，例如，國際專利公開號International Patent Publication No. WO 03/003015。將量子點耦合至，例如：所屬技術領域中已知的生物分子，如回顧於，例如：Mednitz et al.,Nature Materials 4:235-46(2005)、以及U.S. Patent Publication Nos. 2006/0068506及2008/0087843，其分別公開發表於March 30,2006以及April 17,2008。在一些實施例中，量子點可結合(conjugated)至DNA聚合脢分子。如前面已經討論，將酵素結合至交聯劑位置，熟知技術者應可瞭解，當結合螢光基團至，例如，DNA聚合脢或連結脢，必須注意藉由降低任何因為將螢光基團結合至酵素之初級、二級、三級結構所造成的影響，以保留酵素的功能。

(b)　多光子激發(Multi-Photon Excitation)

在一些實施例中，一發色團可被兩個或兩個以上的光子激發。例如，在一些實施例中，在螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)中，無論是供體發色團或受質發色團皆可透過兩個或更多個光子。雙光子以及多光子激發進一步描述於，例如，美國專利U.S. Patent Nos. 6,344,653以及5,034,613。

(c)　時間解析偵測(Time-Resolved Detection)

在一些實施例中，可調整上述激發光源以及一偵測系統的光偵測器，以具有特有的相移(characteristic phase shift)。利用所屬技術領域中已知的方法，例如，揭露於美國專利公開號Patent Publication No. 2008/0037008，其公開於February 14,2008，可藉由一對應的光偵測器來測量來自一正在偵測系統上被偵測的分子所發出的光線，而不被來自激發光源所干擾。

(d)　其他螢光偵測系統及方法

在一些實施例中，方法係關於由至少一在生物細胞中的目標物所發射之光線的偵測，上述生物細胞可為一活細胞或固定細胞(living or fixed cell)。在一些實施例中，至少一目標物擇自：至少一包括至少一量子點的目標物、至少一包括至少一螢光蛋白的目標物、以及至少一包括至少一螢光小化學部分(fluorescent small chemical moiety)的目標物。在一些實施例中，至少一目標物經螢光標定，且包括至少一寡核苷酸、多核苷酸、寡胜肽、多胜肽、寡糖、多糖、或脂質。

在一些實施例中，上述至少一個目標物包括一固定並且受限制之數量的螢光基團，例如至少20、10、5、或2個螢光基團，上述螢光基團可擇自量子點、螢光蛋白、以及螢光小化學部分(fluorescent small chemical moiety)。在一些實施例中，螢光小化學部分具有一介於300至800nm之間的發射峰emission peak及/或一至少為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、或0.9的量子產率(quantum yield)(發射的光子/每個峰值吸收波長的光子)。

3.　實施例

3.1　實施例1、具有核酸合成反應複合物定位於其表面上的奈米球光耦合器之準備

利用第8圖中所示的製程來建構一單股環狀的DNA模板。將一群(pool)的目標雙股核酸片段變性(denatured)並與本身互補的銜接核酸分子(self-complementary adapter nucleic acid molecules)結合。上述銜接核酸分子包括與每個目標核酸片段的末端互補的突出序列(overhanging sequences)。上述銜接分子(adapter molecule)可黏著(anneal)於單股目標鏈段，以及加入一連結的酵素以將上述銜接分子連接至每個目標核酸片段。然後，將此連結的產物變性並且與一連結的核酸分子相結合，上述連結的核酸分子與兩個連結至各個目標鏈段之末端的銜接分子序列互補。然後，利用一連結的酵素將每個目標鏈段環化。

上述經環化的目標鏈段以及經雜交的連結核酸分子，與一DNA聚合脢、dNTP、以及合適的緩衝成分結合，以形成一核酸合成反應複合物(nucleic acid-synthesizing reaction complex)，其中上述連結的核酸分子可作為一定序的引子。接著，以連續的方式複製上述目標鏈段，其中聚合脢重複地圍繞著上述環狀模板，在上述模板的連續複製(successive replications)中，進行自上述模板新生之鏈段的置換及複製。此產生一新生的DNA鏈段，其包含上述目標核酸之互補鏈段的多重複製片段，藉由一具有上述定序引子之序列的片段，將其中的每個複製的目標核酸互補鏈段分開。

利用鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)對奈米球粒子的表面進行化學改質。將經生物素化的寡核苷酸引子，其包括一與定序引子(上述連結的核酸分子)的序列互補的序列，與經鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)改質的奈米球結合，以便將上述經生物素化的引子連結至上述奈米球。將具有上述寡核苷酸塗層的奈米球與上述反應複合物結合，上述反應複合物包括DNA聚合脢、環狀的模板鏈段、以及描述於前段(in the preceeding paragraph)中之複製的鏈段。鑲嵌在上述複製的鏈段中之定序引子的序列，與固定在奈米球的表面上之上述寡核苷酸雜交，進而將上述反應複合物固定(anchoring)至奈米球的表面，如第9圖所示。

3.2　實施例2、利用特定的引子將核酸合成反應複合物定位於一半球上的奈米球光耦合器之準備

利用鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)改質在一半球上的一奈米球粒子。將經生物素化的寡核苷酸引子，其各包括一與定序引子(例如，在第8圖中所示之連結的核酸分子)之序列互補的序列，與具有鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)塗層的奈米球結合，以便將上述經生物素化的引子連結至上述奈米球之具有鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)塗層的半球。將上述具有寡核苷酸塗層的奈米球，與一反應複合物結合，上述反應複合物包括DNA聚合脢、環狀的模板鏈段、以及描述於實施例1中之複製的鏈段。鑲嵌在上述複製的鏈段中之定序引子的序列，與固定在奈米球的一半球上之上述互補的寡核苷酸雜交，進而將上述反應複合物固定(anchoring)至奈米球的表面，如第10圖所示。

3.3　實施例3、利用隨機序列的引子將核酸合成反應複合物定位於一半球上的奈米球光耦合器之準備

利用鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)改質在一半球上的一奈米球。將經生物素化的寡核苷酸引子，其中包括隨機的核苷酸序列，與具有鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)塗層的奈米球結合，以便將上述經生物素化的引子連結至上述奈米球之具有鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)塗層的半球。將上述具有寡核苷酸塗層的奈米球，與一反應複合物結合，上述反應複合物包括DNA聚合脢、環狀的模板鏈段、以及描述於實施例1中之複製的鏈段。上述新生複製的鏈段與固定在奈米球的一半球上之寡核苷酸雜交，進而將上述反應複合物固定(anchoring)至奈米球的表面，如第11圖所示。

3.4　實施例4、藉由一經生物素化、雙股的模板將核酸合成反應複合物定位於一半球上的奈米球光耦合器之準備

利用在第2圖中所示之製程，建構一雙股之環狀的DNA模板。將一群(pool)的目標雙股核酸片段變性(denatured)並與本身互補的銜接核酸分子(self-complementary adapter nucleic acid molecules)結合。上述銜接核酸分子包括與每個目標核酸片段之一鏈段的末端互補的突出序列(overhanging sequences)。上述銜接分子(adapter molecule)可黏著(anneal)於單股目標鏈段，以及加入一連結的酵素以將上述銜接分子連接至每個目標核酸片段。然後，將此連結的產物變性並且與一連結的核酸分子相結合，上述連結的核酸分子與兩個連結至各個目標鏈段之末端的銜接分子序列互補。然後，利用一連結的酵素將每個目標鏈段環化。

將一核酸聚合脢以及一由生物素標記的dUTP(biotin-dUTP)來補充之dNTP的混合物，加入至經黏著(annealed)的DNA分子。上述雜交連結的核酸分子可作為一定序引子，並且利用一不具有鏈段置換活性(strand-displacing activity)的聚合脢，來合成一包括經生物素化的尿嘧啶鹼基(uracil bases)。當上述聚合脢完成第二鏈段的合成時，一包含於上述合成反應物中之連結的酵素，形成一封閉的、環狀的雙股DNA。

將上述封閉的、環狀的雙股DNA變性，並且與一具有被鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)改質之半球的奈米級粒子混合。待被貼附之單一模板/每個奈米球粒子，以一合適的莫耳數比(molar ratio)，結合上述的DNA與被鏈黴抗生素蛋白改質的粒子，如第13A圖所示。借助與定位於奈米球的表面上之經生物素化的鏈段纏繞在一起，將未經生物素化的鏈段定位於奈米球的表面上。

DNA聚合脢、與目標鏈段互補的定序引子、螢光標記的dNTPs、以及合適的緩衝成分，與奈米球及接合的模板結合，使得DNA合成反應複合物形成於奈米球的表面上(第13B圖)。聚合脢圍繞著上述模板進行，形成一新生合成的鏈段(第13C圖)。

3.5　實施例5、一具有一表面定位之核酸合成複合物之磁性奈米球於一導波器的應接位置之定位

利用磁性的官能基，將一奈米球粒子均勻地(uniformly)進行表面改質。將一核酸合成反應複合物定位至在實施例1中所述的奈米球之經磁性改質的表面上。利用位於上述應接位置之下的經微製造的線圈(micro-fabricated coils)，將具有表面定位的反應複合物的奈米球，定位於一形成於一導波器中的應接位置。將電流傳遞通過上述經微製造的線圈，產生一磁場，上述磁場將具有表面定位之反應複合物的奈米球留置(traps)於上述應接位置。因此，上述反應複合物被定位於光耦合器的表面上，上述光耦合器在導波器中的應接位置，以及可被定位於鄰近導波器的核心層之表面的秘密空間中。

3.6　實施例6、一具有一表面定位之核酸合成複合物之 不對稱的磁性奈米球於一導波器的應接位置之定位

利用磁性的官能基，於一奈米球粒子之部分的表面上進行表面改質。一核酸合成反應複合物被定位至在實施例2-4中所述的奈米球之上述經磁性改質的表面上，其中上述奈米球之被磁性官能基改質之相同的表面，亦被鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)改質。利用位於上述應接位置之下的經微製造的線圈(micro-fabricated coils)，將具有表面定位的反應複合物的奈米球，定位於一形成於一導波器中的應接位置。將電流傳遞通過上述經微製造的線圈，產生一磁場，上述磁場將具有被吸收之反應複合物的奈米球留置(traps)於上述應接位置。因此，上述反應複合物被定位於光耦合器的表面上，上述光耦合器被定位於導波器中，上述導波器位於鄰近導波器的核心層之表面的秘密空間中。

3 .7　實施例7、一具有一表面定位之核酸合成複合物之經導電材料改質的奈米球於一導波器的應接位置之定位

利用導電材料(conducting material)，例如包括帶電荷之官能基團的材料，均勻地改質一奈米球粒子。將一核酸合成反應複合物定位至在實施例1中所述的奈米球之經導電材料改質的表面上。利用於上述應接位置之經微製造的電極(micro-fabricated electrode)，將具有表面定位的反應複合物的奈米球，定位於一形成於一導波器中的應接位置。上述經微製造的電極包括一位於應接位置之下的玻片，其中上述玻片具有一導電材料，例如氧化銦錫(indium tin oxide)，的塗層，上述導電材料作為電極的導電表面(electrode conducting surface)。一玻片，其具有一導電材料的相似塗層，並且位於包含載有上述反應複合物之奈米球的相同溶液之上，此玻片作為抵銷電極(counteracting electrode)。將電流傳遞通過上述經微製造的電極，產生一在電極之間的電位差，上述電極將具有表面定位之反應複合物的奈米球留置(traps)於上述應接位置。因此，上述反應複合物被定位於光耦合器的表面上，上述光耦合器在導波器中的應接位置，以及可被定位於鄰近導波器的核心層之表面的秘密空間中。

3.8　實施例8、一具有一表面定位之核酸合成複合物之經導電材料不對稱地改質的奈米球於一導波器的應接位置之定位

利用導電材料，於一奈米球粒子之部分的表面上進行表面改質。一核酸合成反應複合物被定位至在實施例2-4中任一個所述的奈米球之經導電材料改質的表面上，其中上述奈米球之被導電材料改質之相同的表面，亦被鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)改質。利用位於上述應接位置之經微製造的電極(micro-fabricated electrode)，將具有表面定位的反應複合物的奈米球，定位於一形成於一導波器中的應接位置。上述經微製造的電極包括一位於應接位置之下的玻片，其中上述玻片具有一導電材料，例如氧化銦錫(indium tin oxide)，的塗層，上述導電材料作為電極的導電表面(electrode conducting surface)。一玻片，其具有一導電材料的相似塗層，並且位於包含載有上述反應複合物之奈米球的相同溶液之上，此玻片作為抵銷電極(counteracting electrode)。將電流傳遞通過上述經微製造的電極，產生一在電極之間的電位差，利用被導電材料改質之奈米球的表面，以及面向導波器之核心層的反應複合物，上述電極將具有表面定位之反應複合物的奈米球留置(traps)於上述應接位置。因此，上述反應複合物被定位於鄰近導波器的核心層之表面的秘密空間中的應接位置。

3.9　實施例9、一具有一表面定位之核酸合成複合物之經親水性基團改質的奈米球於一導波器的應接位置之定位

利用親水性官能基團於奈米球粒子的一半球，以及利用疏水性基團於奈米球粒子的其他半球上，改質一奈米球粒子。一核酸合成反應複合物被定位於在實施例2-4中任一個所述的奈米球之親水性表面上，其中上述奈米球之被親水性基團改質之相同的表面，亦被鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)改質。具有表面定位反應複合物的的奈米球被定位於一應接位置，上述應接位置在反應位置處具有親水性的表面改質，並且在反應位置外具有疏水性的表面改質，如第6圖中所示(其中表面1與表面3為親水性，表面2與表面4為疏水性)。利用具有被安置在反應位置處的定位反應複合物之奈米球的親水性表面，上述奈米球定向(orients)於應接位置，並且面向導波器的核心層。因此，上述反應複合物被定位於鄰近導波器的核心層之表面的秘密空間中的應接位置。

3.10　實施例10、一定位於一可動式光耦合器上之核酸合成反應複合物的定序

一被定位於一奈米球粒子上的核酸合成反應複合物，上述核酸合成反應複合物被定位於一形成於在實施例5-9中任一個所述的導波器中的一應接位置。上述樣本溶液包括：利用各個dATP、dCTP、dGTP、以及dTTP之獨特的螢光基團，於其β及γ位置之磷酸根處標記的dNTPs。可利用外加的定序反應物，例如DNA聚合脢與合適的緩衝成分，來補充上述樣本溶液。介於DNA複製叉(DNA replication fork)與奈米球的表面之間的距離範圍介於數十至數百奈米。在上述合成反應的各個步驟，標記的dNTPs的四種類型中的一種與上述反應複合物的活性位置結合(associates)，其中其鹼基與上述目標核酸之對應的鹼基相配對。上述螢光標記被消逝波場(evanescent light field)激發，上述消逝波場形成於應接位置的底部，及/或被自奈米球之表面所輻射發散(radiating)的光場激發。將螢光標記的多磷酸核苷酸(nucleotide polyphosphate)於活性位置合併進入生長中的核苷酸鏈段，藉由偵測dNTP連結之螢光基團(dNTP-linked fluorophore)的發射，可即時(real-time)偵測上述合併反應。各個被合併的核苷酸的特性取決於其螢光標記，其中在合併進入上述生長中的鏈段之後，緊接著將上述螢光標記與核苷酸分開。藉由將於聚合反應期間偵測之螢光發射訊息的序列轉換成一核酸序列，來衍生(derived)出目標核酸的序列。

3.11　實施例11、藉由光耦合至奈米球，在直徑350nm之奈米球光耦合器的表面周圍產生的激發光場之模擬

傳遞穿過包括一應接位置以及一奈米球光耦合器之單一模態的導波器(single mode waveguide)的激發光之模擬，說明一奈米球可與來自單一模態的導波器的光線耦合。第14圖中說明一包括一單一模態的導波器之模擬的偵測系統，上述單一模態的導波器包括一可動式光耦合器的應接位置、以及一奈米球光耦合器。在上述模擬的系統中，上述光耦合器之奈米球(Ta2O5)以及導波器之核心層(Ta2O5)兩者的折射率皆為2.26。上述單一模態之導波器的厚度為100 nm，以及下部被覆層(lower cladding layer)的厚度為500 nm。上述導波器的被覆層係由SiO2所組成，其折射率為1.487。上述可動式光耦合器奈米球之直徑為350 nm，並且被配置於應接位置。上述應接位置係為一倒置的(inverted)、圓錐形的奈米井，且上述奈米井具有一為112.6°的全張角度(opening angle，亦即自圓錐的一邊至正對面的一邊)。上述奈米井之環狀底部的直徑為100 nm，並且以折射率為1.33的水來填充上述奈米井。在這樣的結構中，光耦合器核心層皆允許具有單一橫向電波(transverse electric，TE)以及橫向磁波(transverse magnetic，TM)模態之光波的傳播。

入射光的波長為473 nm。利用無耗損的馬克斯威爾方程式(source-free Maxwell’s equations)，來計算在上述系統中之穩態電場(stationary electric field)及穩態磁場的分佈。(參見Katrin Schmitt與Christian Hoffmann,“High-Refractive-Index Waveguide Platforms for Chemical and Biosensing”,in Optical Guided-wave Chemical and Biosensors I,Springer Series on Chemical Sensors and Biosensors 7,21(M. Zourob與A. Lakhtakia eds.,2009.))。

在此結構中，橫向電波模態場域(TE-mode field)以及橫向磁波模態場域(TM-mode field)，兩者皆沿著導波器的核心層以及上述奈米球的表面區域傳播，如第15圖(橫向電波模態場域)及第16圖(橫向磁波模態場域)中所示。如同上述穩態電場，一部分的穩態磁場自核心層轉移至上述奈米球的表面區域，如第17圖中所示。

在進一步的模擬中，將應接位置延伸進入導波器的核心層。上述系統的特定能量場分布顯示於第18A、B、C圖中，其中上述奈米井不會延伸進入上述核心層、部份延伸進入上述核心層、以及完全延伸進入上述核心層。在第18A、B、C圖的左邊之圖式(標記(a))描述在導波器中的能量場分布之特定強度的輪廓(intensity contours)。在第18A、B、C圖的右邊之圖式(標記(b))描述當奈米球被置於應接位置時，在系統中的能量場分布之特定強度的輪廓(intensity contours)。在奈米球不存在的情況下，且基於上述三種奈米井延伸的情形時，模擬皆顯示出特定能量在導波器中的傳遞。然而，當奈米球被置於應接位置時，導波器中的傳遞能量即耦合至奈米球之表面。隨著應接位置延伸進入導波器之核心層的距離增加，耦合至奈米球之表面能量強度也跟著增加。

3.12　實施例12、藉由光耦合至奈米球，在直徑350nm之奈米球光耦合器的表面周圍產生的激發光場之模擬

與實施例11中所描述的模擬方式相似，Ta₂ O₅ 光耦合器奈米球的直徑為100 nm。單一模態波長之Ta₂ O₅ 核心層的厚度為100 nm。導波器的被覆層係由SiO₂ 所構成。下部被覆層的厚度為500 nm。上述應接位置為一圓錐形的奈米井，且此圓錐形的奈米井的全張角度(亦即自圓錐的一邊至正對面的一邊)為112.6°。上述奈米井之環狀底部的直徑為100 nm，並且以折射率為1.33的水來填充上述奈米井。第19圖係根據此結構所模擬之偵測系統的示意圖。入射波為一波長473 nm之TE偏極光場(TE-polarized optical field)。上述電場傳遞於導波器之核心層，如第20圖(a，右邊圖式)中所示，第20圖(a)係上述模擬之穩態電場之分佈。上述模擬系統的特定能量分布如第20圖(b)中所示，其說明了在上述導波器中的傳遞能量耦合至奈米球之表面(在右邊以高放大倍率顯示)。

在進一步的模擬中，利用第19圖所示的系統，但是導波器之核心層的厚度為50 nm而非100 nm。入射波為一波長473 nm之TE偏極光場(TE-polarized optical field)。上述模擬之靜電場分布顯示於第21圖中。導波器中的傳遞能量耦合至奈米球之表面顯示於第21圖之下面的圖式中。

在進一步的模擬中，，利用第19圖所示的系統，但是導波器之核心層的厚度為150 nm而非100 nm。入射波為一波長473 nm之TE偏極光場(TE-polarized optical field)。上述模擬之穩態電場分布顯示於第22圖中。導波器中的傳遞能量耦合至奈米球之表面顯示於第22圖之下面的圖式中。

在這些結構中，一部分的穩態電場及其能量，自導波器的核心層耦合至奈米球之表面的下方區域，如第20、21、及22圖中所示。

雖然本發明已詳細描述並參照其具體實施例，然可瞭解的是，以上描述係為性質上的示範與說明，其旨在說明本發明與其最佳實施例。透過常規的試驗，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種不同之更動與潤飾。因此本發明之保護範圍並不限於以上描述，當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

100．．．可動式光耦合器

102．．．偵測器

104．．．應接位置

110．．．導波器

112．．．核心層

114．．．上部被覆層

116．．．下部被覆層

118．．．濾光片

120．．．環境樣本溶液

130．．．光源

135．．．光線

140．．．光源耦合器

145．．．激發光

150．．．有效的激發區

160．．．有效的激發區

170．．．固定空間

1．．．表面改質

2．．．表面改質

3．．．表面改質

4．．．表面改質

第1圖係依據本發明的某些實施例之偵測系統的示意圖。

第2圖係依據本發明的一些實施例之偵測系統的兩示意圖。

第3圖係依據本發明的某些實施例之不同的應接位置設計的示意圖。

第4圖係依據本發明的某些實施例之偵測系統的示意圖。

第5A、5B圖係依據本發明的一些實施例之可動式光耦合器，以及經表面改質之導波器應接位置的示意圖。

第6圖係依據本發明的一些實施例之可動式光耦合器，以及經表面改質之導波器應接位置的示意圖。

第7圖係具有一可動式光耦合器之示範偵測系統的示意圖，其中此可動式光耦合器受到一磁場的輔助，以一特定的方向面向一應接位置。

第8圖係描述一產生一單股環狀目標核酸的示範方法。

第9圖係一示範可動式光耦合器的示意圖，其中上述可動式光耦合器的表面上具有一核酸合成反應的複合物。

第10圖係一示範可動式光耦合器的示意圖，其中上述可動式光耦合器的表面上具有一核酸合成反應的複合物。

第11圖係一示範可動式光耦合器的示意圖，其中上述可動式光耦合器的表面上具有一核酸合成反應的複合物。

第12圖係描述一產生一雙股環狀目標核酸的示範方法。

第13圖係提供一在一可動式光耦合器上之變性的雙股環狀目標核酸之示意圖。

第14圖係一示範偵測系統結構的示意圖，此偵測系統的結構係用於模擬由入射的激發光波產生之穩態電磁場。

第15圖係一模擬的偵測系統之運算的穩態橫向電場模態(TE模態)電場之等高線圖。

第16圖係一模擬的偵測系統之運算的穩態橫向磁場模態(TM模態)電場之等高線圖。

第17圖係一模擬的偵測系統之運算的穩態磁場之等高線圖。

第18A、B、C圖係一穩態電磁場之等高線圖，其中在偵測系統結構中之上述穩態電磁場係由入射的激發光波所產生，且在偵測系統結構中，奈米井不會分別延伸進入核心層、部分延伸進入核心層、以及完全延伸穿過核心層。

第19圖係一示範偵測系統結構的示意圖，此偵測系統的結構係用於模擬由入射的激發光波產生之穩態電磁場。

第20圖係一模擬的偵測系統之運算的穩態電場之等高線圖。

第21圖係一模擬的偵測系統之運算的穩態電場之等高線圖。

第22圖係一模擬的偵測系統之運算的穩態電場之等高線圖。