JP5878486B2 - １分子検出システムおよび方法 - Google Patents

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Description

［優先権情報］
本出願は、２０１０年３月１５日に出願された米国特許出願第６１／３１４，０３７号の優先権を主張し、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
［技術分野］
本出願は、対象物（object）を検出するための１分子検出システムおよび当該検出システムを用いる方法に関する。さらに、本出願は、移動可能な光結合器、導波路、および光検出器を含む検出システムに関する。本出願はまた、１分子検出システムに試料をロードする方法に関する。本出願はさらに、１分子核酸のシークエンシングの方法を含む１分子検出の方法に関する。
従来の化学または生化学分析の大半は、“バルク”測定に基づくものである。かかる測定においては、分子の特性を決定するために、一定体積の試料溶液中の複数の分子の集団挙動（collective behavior）が測定される。しかしながら、例えば標的分子の検出におけるある技術の検出限界に対し、試料の体積が小さすぎる、または標的分子の濃度が低すぎる場合など、多くの状況において、バルク測定のアプローチを用いることができない。近年、１分子の検出が可能となった。１分子検出は従来のバルク測定に比べ、はるかに高い感度を提供すると共に、より詳細な情報を提供する。１分子の計測器の感度の向上はまた、非特許文献１に記載されているように、高感度な生体分子検出および診断の新たな可能性を期待させる。
１分子検出を実現するためのアプローチについての記載が非特許文献２および３に示されている。これらの概説は、１分子検出に対して用いられている、または提案されている、当該分野において知られた方法および装置についても論じている。１分子検出の応用例としては、１分子ＤＮＡシークエンシング、１分子バイオマーカー検出および微小なフローサイトメトリーのような検出（miniaturized flow-cytometry-like detection）が挙げられる。
最適化された１分子検出のシステムおよび方法には、ＤＮＡシークエンシング技術を促進させる大きな可能性がある。ヒトゲノム計画（ＨＧＰ）はＤＮＡシークエンシングのスループットの大幅な増加を促した。技術の改良に加え、この増加は、対応するシークエンシングのコストの低下をもたらした。最初のゲノムは、完全に配列を解析するために１３年の歳月および３０億ＵＳドル近くを要したが、ＤＮＡシークエンシング技術は最終的に、個人ゲノム解読を日常的臨床治療の不可欠な要素とするために十分に手の届く価格となり得ると予測されていた（非特許文献４参照）。患者と医療従事者の両方にとって、個人ゲノムは医療におけるパラダイムシフトを意味する。疾患の遺伝的危険因子を把握することによって、医療従事者はより容易に予防医学を実践でき、かつオーダーメイドの治療を提供できるようになる。完全なゲノムの多数のバンクによって、薬物設計および薬剤投与がより効率的となり、これにより創成期にある薬理ゲノミクス（pharmacogenomics）の分野が促進され得る。しかし、この促進は、確実な、ハイスループットの、かつ低コストなＤＮＡシークエンシング技術の実現に依存することとなろう。
１分子検出を実現するためには、光学システムは、複雑な環境下で目的の分子を選択的に励起させることのできるものでなければならず、かつバックグラウンドノイズによる干渉を回避できると共に、その１分子から放射される弱い光を検出できなくてはならない。１分子検出を実現するためのアプローチの１つは、１つの分子から放射される光の検出を容易にする限定空間（confined space）内に、目的の分子を位置させるというものである。特許文献１は、ゼロモード導波路（zero-mode waveguide)（ＺＭＷ）を組み込んだ顕微鏡システムを開示しており、これは、規定の励起光場（defined excitation light fields）が作られるナノスケールウェルを用いることにより１分子の検出を容易にすることができる。これらナノウェル内に、そしてしたがってこれら規定の励起光場内に、分子を配置させることによって、ノイズが著しく抑えられ、これにより１分子から放射される光の検出能が高まる。例えば特許文献１、特許文献２、および特許文献３をさらに参照されたい。しかしながら、１分子試料の励起場中へのローディングには、ナノウェル内のＺＭＷの底部への分子の付着が必要であるが、これは困難かつ非効率的である（非特許文献５参照）。１つの１分子試料を含むウェルのみが有用であり、空のウェルまたは複数の１分子試料を含むウェルは使用できない。
成功率のより高い改良された試料ローディングの方法が特許文献４に開示されている。これらの方法は、ナノスケール粒子を利用して、１分子試料をナノウェルの上部開口部に運ぶと共に、試料が励起場にさらされ得るウェルの底部まで試料を供給する。しかしながら、このプロセスは１分子試料をナノ粒子担体からウェルの底部まで移送するための多数の工程および化学反応を必要とする。さらに、ロードされたウェル（loaded wells）は再利用することが不可能あるいは困難である。
特許文献５は、環状の核酸鋳型を繰り返しシークエンシングするために単一のポリメラーゼが表面上に固定化されており、これにより１分子シークエンシングの精度が向上する１分子核酸シークエンシングの方法を開示した。１分子シークエンシングの光学的検出に関するこの方法において、反応物質の表面上への直接的な固定化により、反応はゼプトリットル体積以内に制限される。しかしながら、酵素または核酸の１分子を表面上へ結合させることの難しさによって、ハイスループットのための利用は制限される。さらに、ポリメラーゼが表面上に直接固定化されているシークエンシング反応は、ポリメラーゼがその活性を失うとすぐに終了し、その部位におけるシークエンシング分析の完了を妨げる。分子または酵素を所定の位置に固定化するためには、特許文献５に記載されているように、表面の領域が明確に規定され（well-defined）ていなければならず、かつ、その領域の化学的性質が的確に制御されなければならない。このことは、装置の製造に関して難題となり、コストを増加させる。
米国特許第６，９１７，７２６号明細書 米国特許第７，１７０，０５０号明細書 米国特許第７，４８６，８６５号明細書 米国特許出願公開第２０１０／０００９８７２号明細書 国際公開第２００９／０１７６７８号
Ｑｉｕ, Ｈら、"Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ"、ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ５３（１１）：２０１０−２０１２（２００７） Ｍｏｅｒｍｅｒ, Ｗ．Ｅ．およびＦｒｏｍｍ, Ｄ．Ｐ．、"ＲＥＶＩＥＷ ＡＲＴＩＣＬＥ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ", ＲＥＶＩＥＷ ＯＦ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ ７４（８）：３５９７−３６１９（２００３） Ｗａｌｔｅｒ, Ｎ．Ｇ．ら、"Ｄｏ−ｉｔ−ｙｏｕｒｓｅｌｆ ｇｕｉｄｅ： ｈｏｗ ｔｏ ｕｓｅ ｔｈｅ ｍｏｄｅｒｎ ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｏｏｌｋｉｔ", ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＴＨＯＤＳ ５：４７５−４８９（２００８） ＭｃＧｕｉｒｅら、ＳＣＩＥＮＣＥ ３１７：１６８７（２００７） Ｅｉｄら、ＳＣＩＥＮＣＥ，３２３：１３３−１３８（２００９）
したがって、１分子対象物（single-molecule objects）の検出のための改良されたシステムおよび方法が必要とされている。
例えば１分子対象物などの対象物を検出するためのシステムが提供され、ここで前記検出システムは、移動可能な光結合器、光検出器、ならびに、コア層、第１のクラッド層、および少なくとも第１のクラッド層中に形成される移動可能な光結合器のための少なくとも１つのアダプター部位を含む導波路を含む。いくつかの実施形態において、検出システムは光源を含む。
いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器は、導波路の少なくとも第１のクラッド層中に形成される少なくとも１つのアダプター部位に対象物を局在化させることができる。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器のためのアダプター部位はナノウェル（nanowell）である。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器はナノスケール粒子（nano-scale particle）である。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器はナノスケール球体（nano-scale sphere）である。
さらに、１分子対象物を検出する方法であって、ａ）光源からの入射光を導波路に導入することにより、導波路中に励起光を形成する工程、ｂ）移動可能な光結合器上に１分子対象物を局在化させる工程、ｃ）（ｂ）の移動可能な光結合器を、導波路の少なくとも第１のクラッド層中に形成される移動可能な光結合器のためのアダプター部位に局在化させる工程、およびｄ）移動可能な光結合器上に局在化された１分子対象物を励起光により励起することによって、１分子対象物に光検出器により検出され得る光を放射させる工程、を含む方法が提供される。
１分子対象物を検出する方法であって、ａ）（ｉ）移動可能な光結合器、（ii）コア層および第１のクラッド層を含む導波路であって、移動可能な光結合器のための少なくとも１つのアダプター部位が少なくとも第１のクラッド層中に形成されている導波路、および（iii）光検出器、を含む検出装置を提供する工程、ｂ）１分子対象物を結合させることのできる少なくとも１つの結合部位（binding moiety）を提供する工程、ｃ）少なくとも１つの結合部位を移動可能な光結合器の表面上に個々に局在化させる工程、ｄ）移動可能な結合器上に局在化された１つの結合部位に、１分子対象物試料を提供する工程、ｅ）少なくとも１つの結合部位および１分子対象物がその上に局在化されている移動可能な光結合器を、アダプター部位に局在化させる工程、ｆ）光源からの入射光を導波路に導入し、それにより導波路中に励起光を形成する工程、ならびにｇ）移動可能な光結合器上に局在化された少なくとも１つの結合部位に結合した１分子対象物を励起光により励起して、１分子対象物に光検出器により検出され得る光を放射させる工程、を含む方法が提供される。
核酸をシークエンシングする方法であって、ａ）（ｉ）移動可能な光結合器、（ii）コア層および第１のクラッド層を含む導波路であって、移動可能な光結合器のための少なくとも１つのアダプター部位が少なくとも第１のクラッド層中に形成されている導波路、および（iii）光検出器、を含む検出装置を提供する工程、ｂ）少なくとも１つの核酸分子を提供する工程、ｃ）移動可能な光結合器上に少なくとも１つの核酸分子を個々に局在化させる工程、ｄ）少なくとも１つの核酸分子がその上に局在化されている移動可能な光結合器をアダプター部位に局在化させる工程、ｅ）少なくとも１つの核酸分子の合成による１分子シークエンシング（single molecule sequencing-by-synthesis）を行う工程であって、合成による１分子核酸のシークエンシングが、核酸中の少なくとも１つの塩基のアイデンティティに相関する放射光（emitted light）を産生する工程、ｆ）検出器を用いて放射光を検出することにより、出力信号を得る工程、ならびにｇ）出力信号を処理して、核酸に含まれる少なくとも１つの塩基のアイデンティティを決定する工程、を含む方法が提供される。
さらなる目的および長所は、一部は以下の説明中に記載され、そして、一部は当該説明から明らかであるかまたは、実施形態の実施によって知ることができるであろう。本発明の目的および長所は、添付の特許請求の範囲中で特に示された要素および組み合わせによって実現および達成されるであろう。
ここで請求するように、上記の概要および下記の詳細な説明はいずれも、例示的な、かつ説明を目的としたものにすぎず、実施形態を限定するものではないと理解されるべきである。
本明細書に組み込まれ、かつその一部を成す添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を図解し、そして、本記載と共に、本発明の原理を解説する役目を果たす。
本発明によれば、１分子対象物の検出に用いられる改良されたシステムおよび方法が提供される。
本特許または出願書類は、少なくとも１枚のカラーで作成された図面を含んでいる。カラーの図面（複数のカラーの図面）を含む本特許または特許出願公報の写しは、請求および必要な手数料の納付によって米国特許商標庁より提供されるであろう。
図１は、特定の実施形態に従った検出システムの概略図である。 図２は、いくつかの実施形態による検出システムの２つの概略図を示している。 図３は、特定の実施形態に従った異なるアダプター部位のデザインを示す概略図である。 図４は、特定の実施形態による検出システムを示す概略図である。 図５は、いくつかの実施形態による表面修飾を有する移動可能な光結合器および導波路のアダプター部位の略図を示している。 図６は、いくつかの実施形態による表面修飾を有する移動可能な光結合器および導波路のアダプター部位の略図を示している。 図７は、磁場を用いて、特定の向きでアダプター部位に配置された移動可能な光結合器を有する例示的な検出システムの概略図である。 図８は、一本鎖の環状標的核酸を製造する例示的な方法を示している。 図９は、その表面上に局在化された核酸合成反応複合体を有する例示的な移動可能な光結合器の略図である。 図１０は、その表面上に局在化された核酸合成反応複合体を有する例示的な移動可能な光結合器の略図である。 図１１は、その表面上に局在化された核酸合成反応複合体を有する例示的な移動可能な光結合器の略図である。 図１２は、二本鎖の環状標的核酸を製造する例示的な方法を示している。 図１３は、移動可能な光結合器の表面上に局在化された、変性された二本鎖の環状標的核酸の概略図を提供している。 図１４は、入射励起光波によって生じる定常電磁場のシミュレーションのために使用された例示的な検出システムの構成の略図を示している。 図１５は、シミュレートされた検出システムにおける算出された定常ＴＥ−モード電場の等高線マップ（contour map）を示している。 図１６は、シミュレートされた検出システムにおける算出された定常ＴＭ−モード電場の等高線マップを示している。 図１７は、シミュレートされた検出システムにおける算出された定常磁場の等高線マップを示している。 図１８Ａは、ナノウェルがコア層中に延伸していない検出システムの構成において、入射励起光波によって生じる定常電磁場の等高線マップを示している。 図１８Ｂは、ナノウェルが部分的にコア層中に延伸している検出システムの構成において、入射励起光波によって生じる定常電磁場の等高線マップを示している。 図１８Ｃは、ナノウェルがコア層を通じて完全に延伸している検出システムの構成において、入射励起光波によって生じる定常電磁場の等高線マップを示している。 図１９は、入射励起光波によって生じる定常電磁場のシミュレーションのために使用される例示的な検出システムの構成の略図を示している。 図２０は、シミュレートされた検出システムにおける算出された定常電場の等高線マップを示している。 図２１は、シミュレートされた検出システムにおける算出された定常電場の等高線マップを示している。 図２２は、シミュレートされた検出システムにおける算出された定常電場の等高線マップを示している。
実施形態は、たとえば１分子対象物などの対象物を検出するための検出システム、および前記検出システムを用いる方法を含む。前記検出システムは、対象物から放射される弱い光を検出することができる。
光学システムは、１分子検出を実現するために、複雑な環境下で目的の分子を選択的に励起することのできるものでなければならず、かつバックグラウンドノイズによる干渉を回避できると共に、その１分子から放射される弱い光を検出できなければならない。そして、１実施形態において、１分子検出を実現するために、システムは、少なくとも次の２つの基準、すなわち、１）限定された励起空間（confined excitation space）および限定された観測空間（confined observation space）の両方を有していること、ならびに２）限定された励起空間および限定された観測空間が完全にまたは部分的に重なっており、かつその重なり合う領域が、検出可能な信号対ノイズ比（ＳＮＲ）を実現するべく目的の１分子から放射される光がバックグラウンドよりも確実に高くなるよう十分に小さくなければならないこと、という基準を有している必要があろう。例えば、重なり合う領域の体積は、多くの場合、およそフェムトリットル（femtoliter）、またはフェムトリットルよりも小さくなければならない。より具体的には、重なり合う領域の体積は、多くの場合、アトリットル（attoliter）からゼプトリットル（zeptoliter）の範囲になければならない。また、励起光が検出器に到達しないようにすることも重要であろう。
実施形態は、導波路中に形成される移動可能な光結合器のためのアダプター部位へ１分子試料を運ぶために移動可能な光結合器を用いることによって、１分子試料を検出システムにロードするという困難を克服している。１分子検出に適する限定空間は、移動可能な光結合器がアダプター部位に結合した後に形成されてもよい。移動可能な光結合器およびアダプター部位は、同一のアダプター部位に第２の結合器が結合しないように設計されてもよい。１実施形態において、１分子試料、例えば酵素は、結合器が導波路に導入される前に結合器にロードされてもよく、また１実施形態においては、各結合器がただ一つの試料分子を担持しているか確認するためにロードされた結合器（loaded couplers）の全てまたは一部がプレスクリーニングされてもよい。試料分子は光結合器に結合されたままであるため、検出後に結合器を除去および廃棄することによって、装置は再利用されてもよい。試料分子は結合器により担持されているので、試料分子をその表面に直接結合させるために導波路の表面を修飾する必要がなく、よって装置の製造が簡便化される。
たとえば１分子対象物などの対象物を検出するためのシステムが提供され、前記検出システムは、移動可能な光結合器、光検出器、ならびに、コア層、第１のクラッド層、および少なくとも第１のクラッド層中に形成される移動可能な光結合器のための少なくとも１つのアダプター部位を含む導波路、を含む。いくつかの実施形態において、前記検出システムは光源を含む。
いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器は、導波路の少なくとも第１のクラッド層中に形成される少なくとも１つのアダプター部位に対象物を局在化させることができ、これによって限定された励起空間と限定された観測可能空間とが重なり合う空間、すなわち移動可能な光結合器のアダプター部位への結合により形成される１分子検出に適した限定空間内に、検出される対象物が局在化される。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器のためのアダプター部位はナノウェル（nanowell）である。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器はナノスケール粒子（nano-scale particle）である。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器はナノスケール球体（nano-scale sphere）である。
本明細書において、用語“限定された励起空間（confined excitation space)”、“励起空間（excitation space)”および“励起ゾーン（excitation zone)”はいずれも、蛍光団（fluorophore）または他の発光対象物（light emitting object）がそこに入ると励起され、発光するであろう空間を表す。
本明細書において、用語“観測可能空間（observable space)”および“限定された観測可能空間（confined observable space)”は、その空間内に位置している蛍光団または他の発光対象物から放射される光が検出器により検出され得る空間を表す。
本明細書において、“１分子検出に適する限定空間（confined space suitable for single-molecule detection)”は、励起空間と観測可能空間とが重なり合う空間を表すために用いられる。１分子発光対象物がその重なり合う空間内に局在化されると、対象物が検出器によって検出され得る。
本明細書において、“移動可能な光結合器（movable light coupler)”とは、例えば光強度場の分布（light intensity field distribution）の形状、光の進行方向、および光の波長などを含む励起光の挙動を変えることのできる移動可能な物体を指す。
“アダプター部位（adapter site)”とは、本明細書においては、移動可能な光結合器を収容できる空間を指す。
移動可能な光結合器およびアダプター部位に関して用いられる用語“結合する（docking)”は、移動可能な光結合器がアダプター部位に適合して、これにより１分子検出に適した限定空間の形成を容易にすることを指す。
いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器は励起光に不透明であり、そのため１分子検出に適した限定空間が、移動可能な光結合器が導波路からの励起光がバルク空間（bulk space）に広がるのを妨げることによって形成される。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器は励起光を反射することのできる表面を有しており、そのため１分子検出に適した限定空間が、移動可能な光結合器が励起光を導波路に戻る方向へ反射する領域内に形成される。
いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器は励起光に透明または部分的に透明であり、そして、導波路の少なくとも第１のクラッド層中に形成されるアダプター部位への移動可能な光結合器の留置（placement）は、導波路のコア層に沿って伝播し、そして移動可能な光結合器に導かれる光波から、移動可能な光結合器の表面の周りに励起ゾーンを形成させるが、ここで、１分子検出に適した限定空間は、移動可能な光結合器とアダプター部位との間の空間内に形成される。いくつかの実施形態においては、移動可能な光結合器の屈折率は、光結合の度合い（level）を強めるよう選択される。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器は励起光に透明または部分的に透明であり、導波路の少なくとも第１のクラッド層中に形成されるアダプター部位への移動可能な光結合器の留置は、導波路のコア層に沿って伝播し、そして移動可能な光結合器に導かれる光波から、移動可能な光結合器の表面の周りに励起ゾーンを形成させ、これによって移動可能な光結合器の表面の周りに１分子検出に適した限定空間が作り出される。
いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器は、導波路からの第１の励起光を吸収し、そしてその後第２の励起光を放射することができる。
１分子対象物を検出する方法であって、ａ）光源からの入射光を導波路に導入し、これにより導波路中に励起光を形成する工程、ｂ）移動可能な光結合器の表面上に１分子対象物を局在化する工程、ｃ）（ｂ）の移動可能な光結合器を、導波路の少なくとも第１のクラッド層中に形成される移動可能な光結合器のためのアダプター部位に局在化する工程、およびｄ）移動可能な光結合器上に局在化された１分子対象物を励起光により励起し、１分子対象物に光検出器により検出され得る光を放射させる工程、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、導波路の少なくとも第１のクラッド層中に形成される移動可能な光結合器のためのアダプター部位への移動可能な光結合器の局在化により、１分子検出に適した限定空間が形成される。
いくつかの実施形態において、１分子対象物を検出する方法は、移動可能な光結合器をアダプター部位に特定の向き（specific orientation）で局在化させることを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、磁場によって、移動可能な光結合器をアダプター部位に特定の向きで局在化させることを含む。さらなる実施形態においては、アダプター部位への電位の印加により、光結合器がアダプター部位に特定の向きで局在化される。いくつかの実施形態において、光結合器の表面と引き付け合うおよび／または反発する光結合器のアダプター部位への１つまたはそれ以上の表面修飾の導入により、光結合器がアダプター部位に特定の向きで局在化される。
１分子対象物を検出する方法であって、ａ）（ｉ）移動可能な光結合器、（ii）コア層および第１のクラッド層を含む導波路であって、移動可能な光結合器のための少なくとも１つのアダプター部位が少なくとも第１のクラッド層中に形成されている導波路、および（iii）光検出器、を含む検出装置を提供する工程、ｂ）１分子対象物を結合させることのできる少なくとも１つの結合部位（binding moiety）を提供する工程、ｃ）移動可能な光結合器の表面上に少なくとも１つの結合部位を個々に局在化させる工程、ｄ）移動可能な結合器上に局在化された１つの結合部位に１分子対象物試料を提供する工程、ｅ）少なくとも１つの結合部位および１分子対象物がその上に局在化されている移動可能な光結合器をアダプター部位に局在化させる工程、ｆ）光源からの入射光を導波路に導入し、導波路中で励起光を形成する工程、ならびにｇ）移動可能な光結合器上に局在化された少なくとも１つの結合部位に結合した１分子対象物を励起光により励起し、１分子対象物に光検出器により検出され得る光を放射させる工程、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの結合部位および１分子対象物がその上に局在化されている移動可能な光結合器のアダプター部位への局在化により、１分子検出に適した限定空間が作製され、ここで、検出される１分子対象物は前記限定空間内に局在化されている。
核酸をシークエンシングする方法であって、ａ）（ｉ）移動可能な光結合器、（ii）コア層および第１のクラッド層を含む導波路であって、移動可能な光結合器のための少なくとも１つのアダプター部位が少なくとも第１のクラッド層中に形成されている導波路、および（iii）光検出器、を含む検出装置を提供する工程、ｂ）少なくとも１つの核酸分子を提供する工程、ｃ）移動可能な光結合器上に少なくとも１つの核酸分子を個々に局在化させる工程、ｄ）少なくとも１つの核酸がその上に局在化されている移動可能な光結合器をアダプター部位に局在化させる工程、ｅ）少なくとも１つの核酸分子の合成による１分子シークエンシング（single molecule sequencing-by-synthesis）を行う工程であって、合成による１分子核酸のシークエンシングが、核酸中の少なくとも１つの塩基のアイデンティティに相関する放射光（emitted light）を生じさせ、ｆ）検出器を用いて放射光を検出することにより、出力信号を得る工程、ならびにｇ）出力信号を処理して、核酸に含まれる少なくとも１つの塩基のアイデンティティを決定する工程、を含む方法が提供される。
検出システムは、核酸ハイブリダイゼーションもしくは例えば全ゲノムシークエンシング（whole-genome sequencing）などのためのシークエンシング、転写プロファイリング（transcriptional profiling）、比較転写プロファイリング（comparative transcriptional profiling）または遺伝子同定（gene identification）を含む生体分子検出のためのシステムの一部として、または、その方法および処理過程において用いられ得る。生体分子検出はまた、例えばタンパク質／タンパク質、抗体／抗原、受容体／リガンドおよび核酸／タンパク質などの結合相互作用（binding interactions）の検出ならびに／または測定を含んでもよい。これらの適用は、分析的または診断的な処理過程および方法に有用である。
以下、図面を参照にして実施形態が詳細に説明される。同じまたは類似する部分に言及するために、可能な限り図面全体を通して同じ参照番号が用いられるであろう。
１．検出システム
本明細書に記載される検出システムは、たとえば１分子対象物などの対象物を検出することができる。対象物は、たとえば蛍光色素分子、リン光色素分子、量子ドットまたは発光ナノ粒子などの発光源（source of luminescence）であってもよい。また対象物は光散乱粒子であってもよい。さらに、対象物は、発光能を備えない標的分子であってもよいが、光を放射することのできる標識物（labeling object)（例えば、蛍光色素分子、リン光色素分子、または量子ドット）に付着され得る。ある標識物は特定の標的分子に付着し得る。このため、標的分子は標識物を介して同定され得る。２つ以上の標識物が、１つの標的分子に付着されてもよい。対象物は、発光能を備えず、かつ順番に光を放射することのできる複数の標識物（例えば、第１の波長の光が、少なくとも第１の励起された蛍光分子（excited fluorescent molecule）から放射され、そして、第２の蛍光分子により少なくとも部分的に吸収され、ここで第２の蛍光分子が第２の光、すなわち第２の波長の光を放射するＦＲＥＴ）に付着される標的分子であってよい。
１．１ 検出システムの概要
本検出システムは、移動可能な光結合器、検出器および導波路を含んでいてもよく、ここで前記導波路は移動可能な光結合器のためのアダプター部位を含む。
本検出システムは少なくとも１つの光源をさらに含んでいてもよく、前記光源は光を放射することができ、前記光は次いで、対象物を励起するための励起光として少なくとも部分的に導波路の中に導かれてもよい。光源は例えば、Ｈｅ−Ｎｅレーザーおよびレーザーダイオード（ＬＤ）などのレーザー、発光ダイオード（ＬＥＤ）、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）、量子ドット発光ダイオード（ＱＬＥＤ）、ファイバーライト（fiber light）、またはアーク放電蛍光ランプ（arc discharge fluorescent lamp）であってもよい。本検出システムは光源結合器（light source coupler）を含んでいてもよい。光源結合器は、少なくとも１つの光源から放射される光の少なくとも一部を導波路の中に導き得る。光源結合器は例えば、プリズム結合器、回折格子結合器、横注入型結合器（side-injection coupler）、垂直注入型結合器（vertical-injection coupler）、または同方向結合器（co-directional coupler）であってもよい。
導波路はチャネル導波路または平面導波路であってもよい。導波路はコア層および少なくとも１つのクラッド層を含んでいてもよい。例えば、導波路がチャネル導波路である場合、それはコア層とコア層を取り囲むクラッド層とを含んでいてもよい。別の例として、導波路が平面導波路である場合、それはコア層と、コア層上に配置される１つのクラッド層またはコア層を挟む２つのクラッド層とを含んでいてもよい。コア層は、少なくとも１つのクラッド層よりも高い屈折率を有し得る。励起光は導波路のコア層中を伝播してもよい。本検出システムへの使用に適した例示的な導波路およびその特徴は、２０１０年３月９日に出願された米国特許出願第１２／７２０，３５２号明細書、２０１０年６月１１日に出願された米国特許出願第１２／８０１，５０３号明細書、および２０１０年７月２９日に出願された米国特許出願第１２／８０５，４１１号明細書に記載されており、それらの全体がそれぞれ参照として本明細書に組み込まれる。
本検出システムは、移動可能な光結合器のための少なくとも１つのアダプター部位を含む導波路を含んでもよい。アダプター部位は、導波路の少なくとも１つのクラッド層内に少なくとも形成され得る。アダプター部位は、上部開口部および底部表面を含むナノウェル（nanowell）であってもよく、ここで前記上部開口部が底部表面と比較して大きくてもよい。ナノウェルは、少なくとも１つのクラッド層の厚みの一部、少なくとも１つのクラッド層の全層、少なくとも１つのクラッド層の全層およびコア層の厚みの一部、または少なくとも１つのクラッド層の全層およびコア層の全層まで伸びていてもよい。有効な励起ゾーンの下方の境界はナノウェルの底部であり得る。有効な励起ゾーンの上方の境界は、ナノウェルアダプター部位内において、コア層の長手方向に垂直な方向（以下、垂直方向という）に励起光が到達できる距離によって定義され得る。
検出システムの実施形態は、導波路の少なくとも１つのアダプター部位に１分子対象物を局在化させることのできる移動可能な光結合器を含む。移動可能な光結合器はナノスケール粒子であってもよい。移動可能な光結合器はナノスケール球体または非球状（nonspheroidal）ナノスケール粒子であってもよい。移動可能な光結合器が導波路中のアダプター部位に結合すると、１分子検出に適した限定された励起空間（有効な励起空間）が形成され、そして、検出される対象物がその限定空間内に局在化され得る。移動可能な光結合器がアダプター部位に結合した場合、同じアダプター部位に第２の移動可能な光結合器が結合することを防ぐことができる。
移動可能な光結合器は、例えば結合を容易にする表面特性または磁気特性などを含む、それによって光結合器がアダプター部位に引き寄せられ得る少なくとも１つの特性を含み得る。いくつかの実施形態において、光結合器は、それによって光結合器が少なくとも１つのアダプター部位に特定の向き（specific orientation）で局在化され得る少なくとも１つの性質を含む。それによって光結合器が少なくとも１つのアダプター部位に特定の向きで局在化され得るような好適な特性としては、非対称な表面特性（asymmetric surface properties）が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、光結合器は、アダプター部位内における導波路のコア層の表面近傍の限定空間内に１分子対象物を局在化させることができ、ここで対象物は、導波路のコア層に沿って伝播する光波により誘導される光場からアダプター部位内に形成される有効な励起ゾーン内に局在化される。
導波路のコア層は、導波路の少なくとも第１のクラッド層よりも高い屈折率を有していてもよい。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器は、周囲の溶液の屈折率または導波路の少なくとも第１のクラッド層の材料の屈折率と実質的に同様の屈折率を有する材料から作製される。さらなる実施形態において、移動可能な光結合器は、導波路の少なくとも第１のクラッド層の屈折率よりも大きい屈折率を有する材料から作製される。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器は、導波路のコア層の屈折率と実質的に同様のまたは等しい屈折率を有する材料から作製される。いくつかの実施形態において、光結合器は、コア層に沿って伝播する光波により誘起されるエバネッセント光場（evanescent light field）を連結することができ、それによって有効な励起ゾーンが光結合器の表面の周りに形成される。
いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器は不透明であり、そして、励起光をその表面にとどめる（confine）ことができ、それによって、１分子検出に適した限定空間が、移動可能な光結合器が導波路からの励起光がバルク空間に広がるのを妨げることにより形成される。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器は光を反射するものである。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器は励起光を反射するものである。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器は、導波路から放射される励起光を吸収し、そしてその後、自らが検出される分子を励起することのできる光を放射することができる。
本検出システムの導波路の構成要素には、複数のアダプター部位が含まれていてもよい。よって、前記システムは多数の対象物をモニターするために用いることもできる。
本検出システムは、対象物から放射される光を検出する光検出器を含んでもよい。光検出器は、そこへ入射する光を少なくとも部分的に吸収し、そして、その光に対応して出力信号を発生させることができる光学センサーを含んでいてもよい。光学センサーは、例えばｐ−ｎフォトダイオード、ｐ−ｉ−ｎフォトダイオード、多重接合フォトダイオード（multi-junction photodiode）、アバランシェフォトダイオード（avalanche photodiode，ＡＰＤ）、フォトトランジスタ、量子井戸赤外線検出器（quantum-well infrared photodetector)（ＱＷＩＰ）、光伝導型光学センサー（photoconductive type optical sensor）、光起電力型光学センサー（photovoltaic type optical sensor）、ＡＳＩＣ上薄膜（thin-film on ASIC)（ＴＦＡ）、金属−半導体−金属（ＭＳＭ）光検出器、電荷結合素子（ＣＣＤ）、ＣＭＯＳセンサー、またはこれらの組み合わせであってよい。
いくつかの実施形態において、光検出器は、光検出器の動作を制御するための制御回路を含む。制御回路は、信号増幅器の回路、Ａ／Ｄコンバータ、積分器、コンパレータ、論理回路、読み出し回路、メモリ、マイクロプロセッサ、クロック、および／またはアドレスを含んでいてもよい。
光検出器は、対象物から放射される光が到達できる位置に配置され得る。例えば、光検出器は、コア層の、アダプター部位に対して反対側に配置され得る。すなわち、アダプター部位がコア層の垂直方向における一側面に配置される場合、光検出器はコア層の垂直方向における他方の側面に配置され得る。本検出システムは、コア層と検出器との間に少なくとも１つのフィルターをさらに含んでいてもよい。
例示的な検出システムの概略図が図１に示されている。本検出システムは、移動可能な光結合器１００、ならびに、平面導波路１１０、検出器１０２および移動可能な光結合器のためのアダプター部位１０４を含む一体化された構成要素（integrated component）を含んでいてもよく、これによって移動可能な光結合器１００および周囲の試料溶液１２０がアダプター部位に接近しやすく（accessible）なる。導波路１１０はコア層１１２、上方クラッド層１１４および下方クラッド層１１６を含んでもよい。平面導波路１１０は基板（図示せず）上に形成され得る。光検出器１０２は基板上または基板内に形成され得る。光源１３０は光１３５を放射することができ、その光は光源結合器１４０によって平面導波路１１０中に少なくとも部分的に導かれ得る。平面導波路１１０中に導かれた光は平面導波路１１０のコア層に沿って伝播し、励起光１４５として機能する。
例示的な検出システムの概略図が図２の各パネルに示されている。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器１００は、コア層１１２の材料の屈折率に比べ、周囲の試料溶液１２０の屈折率または導波路の少なくとも第１のクラッド層１１４の屈折率により近い屈折率を有する材料で作製される。かかる実施形態では、光源（図示せず）から導波路のコア層に沿って伝播する光波は、アダプター部位内のコア層の表面近傍にエバネッセント光場を誘起することができ、これによりアダプター部位の底面の限定空間中に有効な励起ゾーン１５０が形成される（左側のパネル）。さらなる実施形態において、移動可能な光結合器は、導波路の少なくとも第１のクラッド層の屈折率よりも大きい、および／または、導波路のコア層の屈折率と実質的に同様のもしくは等しい屈折率を有する材料から作製される。かかる実施形態では、光結合器は、光源（図示せず）から導波路のコア層に沿って伝播する光波によりアダプター部位内のコア層の表面近傍に誘起されたエバネッセント光場を連結させることができ、これにより、移動可能な光結合器と導波路のコア層との間の限定空間内および光結合器の表面の周りに有効な励起ゾーン１６０が形成される（右側のパネル）。
１．２ 検出システムの構成要素
１．２．１ 導波路
図１に示されるように、いくつかの実施形態において、平面導波路１１０は、コア層１１２、上方クラッド層１１４および下方クラッド層１１６を含み得る。コア層１１２は、たとえば酸化シリコン−チタン（silicon-titanium oxide)（ＳｉxＴｉ1-xＯ2、ここで０＜ｘ＜１）、酸化チタン（titanium oxide）、酸化タンタル（tantalum oxide）、酸化ニオブ（niobium oxide）、酸化ハフニウム（hafnium oxide）、酸化アルミニウム（aluminum oxide）、酸化ジルコニウム（zirconium oxide）、窒化シリコン（silicon nitride）、窒化アルミニウム（aluminum nitride）、窒化チタン（titanium nitride）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＰＭＭＡ、またはＳｕ８などのｎ２の屈折率を有する材料を含んでいてもよい。上方および下方クラッド層１１４および１１６はそれぞれ、ｎ3およびｎ4の屈折率を有する材料を含んでいてもよい。上方および下方クラッド層１１４および１１６の材料は同じでもよく、また異なっていてもよい。上方クラッド層１１４または下方クラッド層１１６に適した材料には、例えば酸化シリコン（silicon oxide）、フッ化マグネシウム（magnesium fluoride）、フッ化カルシウム（calcium fluoride）、酸化アルミニウム（aluminum oxide）、Ｓｕ８、ＰＭＭＡまたはポリカーボネートが含まれ得る。コア層１１２の屈折率ｎ2は上方および下方クラッド層１１４および１１６の屈折率ｎ3およびｎ4より高くてもよい。
１分子の検出のためには、励起光が検出器に到達しないことが必要であろう。平面導波路においては、コア層の表面が所望のとおりに平坦にならないかもしれない。コア層の粗い表面は、励起光の一部を散乱するかもしれない。約０．３ｎｍの表面粗度を有するコア層の場合、励起光の約０．０１％が散乱されて、ノイズを生じる可能性があることが推定されている。コア内を伝播する励起光の表面散乱に起因するノイズを低減するために、検出器に到達する散乱励起光の量を減らすべく導波路と検出器との間に励起光フィルターが加えられてもよい。いくつかの実施形態において、フィルターは多層干渉フィルター（multilayer interference filter）である。いくつかの実施形態において、フィルターは、励起光を吸収できる材料からなる層である。
いくつかの実施形態において、２０１０年６月１１日に出願された米国特許出願第１２／８０１，５０３号明細書、および２０１０年７月２９日に出願された米国特許出願第１２／８０５，４１１号明細書に記載されているごとく、信号対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を上げるよう、散乱励起光を吸収するおよび／または検出システム外部からの環境光（ambient light）をブロックするべく、検出システム中に保護層（複数の保護層）が含まれていてもよい。保護層は上方クラッド層の上に形成されてもよく、および／または、下方保護層が下方クラッド層の下に形成されてもよい。いくつかの実施形態において、保護層は、金属または合金などの不透明な材料から作製される。いくつかの実施形態では、アダプター部位の下方の位置の下方保護層内にピンホールが形成されてもよい。アダプター部位内の有効な励起ゾーンにおいて対象物から放射される光は、ピンホールを通過し、そして、下方保護層の下方の光検出器によって検出され得る。
１．２．２ アダプター部位
図１および図２に例示されるように、少なくとも１つの移動可能な光結合器のアダプター部位１０４は、導波路の少なくとも上方クラッド層１１４中に形成され得る。アダプター部位はナノウェルであってもよい。ナノウェルの上部開口部は、ナノウェルの底部より大きくてもよい。ナノウェルの形状に限定はない。例えば、ナノウェルの水平断面図は、円形、楕円形、長方形、正方形またはひし形であってもよい。ナノウェルアダプター部位の底部のサイズにもまた限定はない。例えば、ナノウェルの底部のサイズは、励起光のおよその波長よりも小さいものであってもよい。いくつかの実施形態において、ナノウェルの底部のサイズは、励起光の波長の約２分の１、約４分の１、または約８分の１よりも小さい。本明細書において、“サイズ”は、ナノウェルの水平断面図が円形、楕円形または長方形である場合、直径、長軸の長さまたは長辺の長さを表し得る。ナノウェルの水平断面図が正方形またはひし形である場合は、“サイズ”は辺の長さを表し得る。１実施形態において、ナノウェルの上部開口部の長さ（すなわち、直径、長軸の長さまたは長辺の長さ）は、約１から約１０μｍであってもよく、そして、ナノウェルの底部の直径は約１０から約５００ｎｍであってもよく、ナノウェルの底部に垂直な方向に対するナノウェルの側壁の角度は、約６０度よりも小さくてもよい。かかる構成は、ただ１つの移動可能な光結合器だけが、ナノウェルの底部に近い領域に入ることが可能であるようにするであろう。
図１および図２に例示されるように、励起光の一部はアダプター部位１０４に入り、そして、アダプター部位１０４の空間的限定（spatial confinement）と共に、アダプター部位の少なくとも一部に有効な励起ゾーン１５０を形成することができる。図１における参照番号１５０は有効な励起ゾーンの上方のおおよその境界を示していると理解されるべきである。対象物が有効な励起ゾーン１５０に入ると、励起光によって励起され、そして、光検出器１０２により検出され得る光を放射することができる。有効な励起ゾーン１５０の外側では、対象物は励起光によって励起されることができず、または、その放射した光は光検出器に到達できない。図１中の点線は有効な励起ゾーンの上方の境界の形状を限定するものではないことが理解されるべきである。例えば、有効な励起ゾーンの上方の境界は、曲線状であってもよい。
例えばナノウェルの位置および／または導波路中に伸びるナノウェルの深さなどの異なる条件に応じて、異なる有効な励起ゾーンが形成され得る。加えて、有効な励起ゾーンにおける電磁場は、以下により詳細に記載されるように、例えばエバネッセント場、エバネッセントおよび進行（travelling）場の混合、または進行場であってもよい。
図３は、ナノウェルアダプター部位の異なるデザインを有する実施形態を例として概略的に示している。いくつかの実施形態において、ナノウェルアダプター部位は、上方クラッド層の厚みの一部まで伸びていてもよい（パネルＡ）。いくつかの実施形態において、ナノウェルアダプター部位は、上方クラッド層の全層まで伸びていてもよい（パネルＢ）。パネルＡまたはＢに示されるナノウェルの場合、励起光がコア層中を伝播するときに、ナノウェル中に進行光場（travelling light field）の成分は存在しないかもしれないが、コア層中を進行する光の一部がナノウェル中にわずかに浸透するかもしれない。ナノウェル中に浸透する光は垂直方向に指数関数的に減衰し、エバネッセント場を形成する。このエバネッセント場は、ナノウェルの空間的限定と共に、コア層近傍のナノウェルの少なくとも一部に有効な励起ゾーンを形成することができる。
いくつかの実施形態において、ナノウェルは、上方クラッド層の全層およびコア層の厚みの一部まで伸びていてもよい（図３のパネルＣ）。かかる実施形態では、進行場の成分がナノウェル中に現れ、そしてエバネッセント場と共に、ナノウェル中に有効な励起ゾーンを形成することができる。
いくつかの実施形態において、ナノウェルは、上方クラッド層の全層およびコア層の全層まで伸びていてもよい（図３のパネルＤ）。かかる実施形態では、ナノウェル中に励起ゾーンを形成する電磁場の大部分が進行場であり得る。
図３のパネルＢに示されたナノウェルを含む平面導波路の場合、ナノウェルの下端部（bottom end）がコア層の上方表面上に位置しているため、有効な励起ゾーンの体積は、エバネッセント場の有効領域と等しくなり得、かつ以下の式を用いて近似的に計算することができる。
ここで、Ｄはナノウェルの底部の直径であり、そして、ｈはナノウェル中のエバネッセント場の浸透の深さである。例えば、Ｄおよびｈがそれぞれ、１００ｎｍおよび１００ｎｍである場合、有効な励起ゾーンの算出体積は、約１×１０-18リットル（１アトリットル）である。
いくつかの実施形態では、複数のアダプター部位が導波路中に形成されてもよい。いくつかの実施形態において、複数のアダプター部位の各々について、アダプター部位の有効な励起ゾーン中の対象物から放射される光を検出するために、光検出器が形成され得る。いくつかの実施形態においては、複数のアダプター部位の有効な励起ゾーン中の対象物から放射される光を検出するために、１つの光検出器が用いられてもよい。
１．２．３ 移動可能な光結合器
実施形態は、導波路の少なくとも第１のクラッド層中に形成されるアダプター部位に１分子対象物を局在化させることのできるであろう移動可能な光結合器を含む。移動可能な光結合器はその表面上に、検出される１分子対象物を結合することのできる少なくとも１つの結合部位（binding moiety）を局在化させることができる。結合部位は、対象物を結合することのできる単一分子または分子複合体（例えば、受容体、抗体、酵素、もしくは、酵素を含む反応複合体などの多量体）であってもよい。検出される１分子対象物は、アダプター部位に位置している移動可能な光結合器の表面上に局在化された結合部位に結合することができ、これにより、結合部位および光結合器を介して、有効な信号励起および観測のための限定空間内に対象物が局在化される。表面に局在化した（surface-localized）結合部位への１分子対象物の結合が検出される場合に、任意の時点で検出される対象物の数が結合部位に同時に結合できる対象物の数より大きくならないよう、移動可能な光結合器はその表面上に１つの結合部位のみを局在化してもよい。よって、結合部位が一度にただ１つの対象物と結合する場合、本検出システムは、移動可能な光結合器の表面上に局在化された結合部位に結合している１つの対象物を検出し得る。
本明細書において、移動可能な光結合器の表面上に“局在化”される対象物としては、移動可能な光結合器の表面上に非特異的に吸収される対象物、および、１つまたはそれ以上の共有結合または非共有的な相互作用を介して移動可能な光結合器の表面に連結される対象物が挙げられる。
いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器はナノスケール粒子である。いくつかの実施形態において、光結合器はナノスケール球体である。ナノスケール球体は約４０ｎｍから１０００ｎｍまたは励起光の波長の約１／１０から２倍の直径を有していてもよい。ナノスケール球体のサイズは光検出器のサイズに応じて決められ得る。例えば、ナノスケール球体のサイズは、１つの光検出器がただ１つの球体から放射される光だけを検出できるように選択されてもよい。いくつかの実施形態において、ナノスケール球体のサイズおよびアダプター部位の形状は、ナノ球体がアダプター部位の底部表面から約１０ｎｍから２００ｎｍのあいだの距離で、アダプター部位に位置され得るように選択される。さらなる実施形態において、光結合器は非球状（nonspheroidal）ナノスケール粒子である。いくつかの実施形態において、ナノスケール粒子は棒状（bar-like）粒子である。移動可能な光結合器粒子の“長さ”とは、光結合器の最も幅の広い位置における光結合器の一端部から向かいの端部（opposite end）までの距離のことを指す。例えば、球状の光結合器の長さはその直径に相当し、そして棒状粒子の長さは棒の最遠端部（far ends）間の距離である。
移動可能な光結合器は、均質固体（homogenous solid）、コロイド（colloidal）もしくは多孔質固体（porous solid）、またはポリマー骨格を有する材料からなる固体であってもよい。いくつかの実施形態において、多機能の移動可能な光結合器は、例えば、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、白金（Ｐｔ）、ニッケル（Ｎｉ）、クロム（Ｃｒ）または金属合金を含む１つまたはそれ以上の金属材料を含む。いくつかの実施形態において、光結合器は、例えばＴｉＯ2、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＳｉＯ2、ＨｆＯ2、Ａｌ2Ｏ3、ＺｒＯ2、ＺｎＯ、Ｖ2Ｏ5、ＣｅＯ2、ＣｄＯ、Ｆｅ2Ｏ3、Ｆｅ3Ｏ4、Ｃｕ2Ｏ、ＣｕＯ、Ｉｎ2Ｏ3、Ｌａ2Ｏ3、ＭｏＯ3またはＷＯ3を含む１つまたはそれ以上の酸化物材料を含む。さらなる実施形態において、光結合器は、例えばＣｄＳ、ＺｎＳ、ＰｂＳ、Ａｕ2ＳまたはＡｇ2Ｓを含む１つまたはそれ以上の硫化物材料を含む。いくつかの実施形態において、光結合器は、例えばＣｄＳｅ、ＺｎＳｅまたはＰｂＳｅを含む１つまたはそれ以上のセレン化物材料を含む。いくつかの実施形態において、光結合器は、例えばＳｉ3Ｎ4、ＴｉＮ、ＢＮおよびＧａＮを含む１つまたはそれ以上の窒化物材料を含む。さらなる実施形態において、光結合器は、例えばポリスチレン（polystyrene）、ポリエチレンイミン（polyethyleneimine）、ポリホスファゼン（polyphosphazene）、ポリラクチド（polylactide）、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（polylactide-co-glycolide）、ポリカプロラクトン（polycaprolactone）、ポリ酸無水物（polyanhydride）、ポリマレイン酸（polymaleic acid）およびその誘導体、ポリアルキルシアノアクリレート（polyalkylcyanoacrylate）、ポリ酸無水物オキシブチレート（polyanhydride oxybutyrate）、ポリカーボネート（polycarbonate）、ポリオルトエステル（polyorthoester）、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol）、ポリ−Ｌ−リジン（poly-L-lysine）、ポリグリコリド（polyglycolide）、ポリメチルメタクリレート（polymethylmethacrylate）、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone）、またはこれらのコポリマーを含む１つまたはそれ以上のポリマー材料を含む。
いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器はコアシェルナノ構造（core-shell nanostructure）を有する。コア材料は、例えば金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、白金（Ｐｔ）、ニッケル（Ｎｉ）、クロム（Ｃｒ）または金属合金を含む１つまたはそれ以上の金属材料を含んでもよい。いくつかの実施形態において、コア材料は、例えばＴｉＯ2、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＳｉＯ2、ＨｆＯ2、Ａｌ2Ｏ3、ＺｒＯ2、ＺｎＯ、Ｖ2Ｏ5、ＣｅＯ2、ＣｄＯ、Ｆｅ2Ｏ3、Ｆｅ3Ｏ4、Ｃｕ2Ｏ、ＣｕＯ、Ｉｎ2Ｏ3、Ｌａ2Ｏ3、ＭｏＯ3またはＷＯ3を含む１つまたはそれ以上の酸化物材料を含む。いくつかの実施形態において、コア材料は、例えばＣｄＳ、ＺｎＳ、ＰｂＳ、Ａｕ2ＳまたはＡｇ2Ｓを含む１つまたはそれ以上の硫化物材料を含む。さらなる実施形態において、コア材料は、例えばＣｄＳｅ、ＺｎＳｅまたはＰｂＳｅを含む１つまたはそれ以上のセレン化物材料を含む。いくつかの実施形態において、コア材料は、例えばＳｉＮまたはＧａＮを含む１つまたはそれ以上の窒化物材料を含む。さらなる実施形態において、コア材料は、例えばポリスチレン（polystyrene）、ポリエチレンイミン（polyethyleneimine）、ポリホスファゼン（polyphosphazene）、ポリラクチド（polylactide）、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（polylactide-co-glycolide）、ポリカプロラクトン（polycaprolactone）、ポリ酸無水物（polyanhydride）、ポリマレイン酸（polymaleic acid）およびその誘導体、ポリアルキルシアノアクリレート（polyalkylcyanoacrylate）、ポリ酸無水物オキシブチレート（polyanhydride oxybutyrate）、ポリカーボネート（polycarbonate）、ポリオルトエステル（polyorthoester）、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol）、ポリ−Ｌ−リジン（poly-L-lysine）、ポリグリコリド（polyglycolide）、ポリメチルメタクリレート（polymethylmethacrylate）、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone）、またはこれらのコポリマーを含む１つまたはそれ以上のポリマー材料を含む。
コアシェルナノ構造の光結合器のシェルは、例えば金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、白金（Ｐｔ）、ニッケル（Ｎｉ）、クロム（Ｃｒ）または金属合金を含む１つまたはそれ以上の金属材料を含んでもよい。いくつかの実施形態において、シェル材料は、例えばＴｉＯ2、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＳｉＯ2、ＨｆＯ2、Ａｌ2Ｏ3、ＺｒＯ2、ＺｎＯ、Ｖ2Ｏ5、ＣｅＯ2、ＣｄＯ、Ｆｅ2Ｏ3、Ｆｅ3Ｏ4、Ｃｕ2Ｏ、ＣｕＯ、Ｉｎ2Ｏ3、Ｌａ2Ｏ3、ＭｏＯ3またはＷＯ3を含む１つまたはそれ以上の酸化物材料を含む。いくつかの実施形態において、シェル材料は、例えばＣｄＳ、ＺｎＳ、ＰｂＳ、Ａｕ2ＳまたはＡｇ2Ｓを含む１つまたはそれ以上の硫化物材料を含む。さらなる実施形態において、シェル材料は、例えばＣｄＳｅ、ＺｎＳｅまたはＰｂＳｅを含む１つまたはそれ以上のセレン化物材料を含む。いくつかの実施形態において、シェル材料は、例えばＳｉＮまたはＧａＮを含む１つまたはそれ以上の窒化物材料を含む。さらなる実施形態において、シェル材料は、例えばポリスチレン（polystyrene）、ポリエチレンイミン（polyethyleneimine）、ポリホスファゼン（polyphosphazene）、ポリラクチド（polylactide）、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（polylactide-co-glycolide）、ポリカプロラクトン（polycaprolactone）、ポリ酸無水物（polyanhydride）、ポリマレイン酸（polymaleic acid）およびその誘導体、ポリアルキルシアノアクリレート（polyalkylcyanoacrylate）、ポリ酸無水物オキシブチレート（polyanhydride oxybutyrate）、ポリカーボネート（polycarbonate）、ポリオルトエステル（polyorthoester）、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol）、ポリ−Ｌ−リジン（poly-L-lysine）、ポリグリコリド（polyglycolide）、ポリメチルメタクリレート（polymethylmethacrylate）、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone）、またはこれらのコポリマーを含む１つまたはそれ以上のポリマー材料を含む。
いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器は、導波路のコア層の材料の屈折率に比べ、導波路の第１のクラッド層の材料の屈折率により近い屈折率を有する材料から作製される。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器は、導波路のコア層の材料の屈折率に比べ、周囲の試料溶液の屈折率により近い屈折率を有する材料から作製される。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器は、導波路の第１のクラッド層の屈折率と導波路のコア層の屈折率の中間の屈折率を有する材料から作製される。さらなる実施形態において、光結合器は、導波路のコア層の屈折率と実質的に同様な屈折率を有する材料から作製される。いくつかの実施形態において、光結合器は、コア層の屈折率に等しい屈折率を有する材料から作製される。
いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器はＳｉＯ2からなり、屈折率は１．４８７である。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器はポリスチレンからなり、屈折率は１．５９である。さらなる実施形態において、光結合器はＴｉＯ2からなり、屈折率は２．０である。いくつかの実施形態において、光結合器はＦｅ3Ｏ4からなり、屈折率は２．４である。別のさらなる実施形態において、光結合器はＴａ2Ｏ5からなり、屈折率は２．２６である。
いくつかの実施形態において、光結合器はコアシェル構造を有し、ここでシェル材料は金（Ａｕ）であり、屈折率は１．２８である。いくつかの実施形態において、シェル材料は銀（Ａｇ）であり、屈折率は０．１３５である。さらなる実施形態において、シェル材料は白金（Ｐｔ）であり、屈折率は１．９である。いくつかの実施形態において、シェル材料はアルミニウム（Ａｌ）であり、屈折率は０．７１４である。別のさらなる実施形態において、シェル材料はコバルト（Ｃｏ）であり、屈折率は１．８６である。いくつかの実施形態において、シェル材料はニッケル（Ｎｉ）であり、屈折率は１．６６である。
いくつかの実施形態において、導波路内のアダプター部位に位置しているときに光結合器が導波路からの光に連結することができるように、移動可能な光結合器は、適切なサイズおよび導波路のコア層の材料の屈折率に十分に類似した屈折率を有する。かかる実施形態において、誘起された（induced）光場は、移動可能な光結合器の表面の周りに形成され、これによって光結合器の周りに有効な励起ゾーンが形成され、ここで、光結合器の表面から特定の距離内で分子が励起され蛍光光を放射することができる。
移動可能な光結合器の表面の周りに誘起される励起光場の強度は、周囲の環境における光導波路の電場を調節すること、光結合器として適切な特性（例えば、材料の組成、形状およびサイズ）を選択すること、ならびに、アダプター部位の形状を設定すること（configuring）によって制御され得る。移動可能な光結合器が球体である実施形態では、光結合器の表面における励起光場の強度は、以下の式により計算できる。
ここで、Ｐは球体表面における励起光場の光強度（optical power）であり、
は次の式
によって決定され、
γは次の式
によって決定され、
Ｉmax／Ｉiは次の式
によって決定され、
θは次の方程式
によって決定される。
そしてここで、Ｒは球体の曲率半径であり、αringは球体のモードパワー減衰係数（mode power decay coefficient）であり、Ｎringは球体の平衡屈折率（equilibrium refractive index）であり、κはパワー結合係数（power coupling coefficient）であり、そしてｋ0＝２π／λ0である（ここで、λ0は自由空間波長である）。光エネルギーが完全に球状光結合器内に移動する共鳴状態においては、Ｎringｋ0２πＲ＝２ｍπであり、ここでｍは整数であり、κ＝１−ｅｘｐ（−２πＲ1αring）であり（ここで、Ｒ1は外側の曲げ半径である）、かつＰ＝１である。本明細書において用語“臨界結合”は、この共鳴状態を示すために用いられる。
いくつかの実施形態において、光結合器の光学特性は、光結合器が特定の範囲内で特定の分子に取り囲まれる場合に変化する。いくつかの実施形態では、光結合器が特定の範囲内で特定の分子に取り囲まれるときに変化する光学特性は、屈折率、光吸収能、結合器により吸収される光の波長、または、光結合器を通って伝播する光の方向である。
いくつかの実施形態では、移動可能な光結合器の表面の１つまたはそれ以上の領域が修飾される。例えば、ナノスケール球体光結合器の表面全体が修飾されてもよい。表面修飾は、コアシェル構造を有する光結合器のシェル材料とは区別されるものであって、すなわち、表面修飾を含むコアシェル光結合器とは、シェル材料の表面外側の修飾を有するということである。さらなる例において、ナノスケール球体光結合器の一方の半球の表面は修飾されてもよいが、残りの半球は修飾されない。光結合器の表面は、その表面全体またはその表面の少なくとも一部が、化学的修飾技術により１つまたはそれ以上の不均一物質（heterogeneous materials）でコートされてもよい。表面修飾は、移動可能な光結合器をアダプター部位に局在化させるために用いられてもよい。非対称表面修飾（asymmetric surface modification）、例えばある１つの表面のみの修飾、または向かい合う表面（opposite surfaces）への異なる修飾は、移動可能な光結合器を特定の向きでアダプター部位に局在化させるために用いられてもよい。表面修飾はまた、光結合器の表面の特定領域に１分子対象物を局在化させるために用いられてもよく、これによりかかる領域が導波路のコア層の方を向くような位置に合わせられ、その結果対象物および対象物が関与するあらゆる反応が、移動可能な光結合器と導波路のコア層近傍のアダプター部位の表面との間の限定空間内に局在化される。一方の半球がオリゴヌクレオチドプライマーで修飾されているナノスケール球体光結合器粒子を含む例示的な検出システムの略図が図４に示されている。ナノスケール球体光結合器１００は、ＤＮＡ合成反応複合体２００の複製ＤＮＡ鎖（replicating DNA strand）中に組み込まれた配列にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドプライマーで、その表面の半分が修飾されている。光結合器のオリゴヌクレオチド修飾された表面が導波路のコア層の方を向いた状態でのアダプター部位１０４への光結合器１００の配置（positioning）によって、ナノウェルアダプター部位１０４の底部における限定空間１７０内に反応複合体２００が局在化される。
いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器の表面の１つまたはそれ以上の領域の修飾は化学修飾である。いくつかの実施形態において、化学修飾は、光結合器の表面への官能基の共有結合である。共有結合される官能基は疎水基または親水基であってもよい。適切な疎水基としては例えば、−Ｃx（Ｈ2）xＣＨ3、−Ｃ6Ｈ6、エポキシ基、−Ｓｉ（ＣxＨx+1）2（Ｎ−オクチルシランなどの式Ｈ3−Ｓｉ（ＣxＨx+1）2を有する化合物から誘導される）、−Ｏ−Ｓｉ（ＣxＨx+1）2（トリメトキシオクチルシランなどの式Ｒ3−Ｏ−Ｓｉ（ＣxＨx+1）2を有する化合物から誘導される）などが挙げられる。いくつかの実施形態において、光結合器は、金属材料からなる均質固体粒子（homogenous solid particle）、または金属シェル材料を含むコアシェル粒子であり、そして疎水基は、硫黄（sulfur）、アミン（amine）、カルボキシル（carboxyl）またはリン酸（phosphate）結合（linkage）を介して金属材料と共有結合される。いくつかの実施形態において、光結合器は、金属酸化物もしくはＳｉＯ2材料からなる均質固体粒子、または、金属酸化物もしくはＳｉＯ2シェル材料を含むコアシェル粒子であり、そして疎水基Ｒは、−Ｓｉ−Ｒ基として金属酸化物またはＳｉＯ2材料の酸素原子と共有結合される。いくつかの実施形態において、共有結合される官能基は、例えば−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯ2Ｈ、−ＯＳＯ3Ｈを含む親水基である。例えば、いくつかの実施形態において、光結合器は金属酸化物もしくはＳｉＯ2材料からなる均質固体粒子、または、金属酸化物もしくはＳｉＯ2シェル材料を含むコアシェル粒子であり、そして−ＯＨ基は、金属酸化物またはＳｉＯ2材料と共有結合される。適切な親水基としてはさらに、例えば−ＮＨ3 +などの正荷電基（positively-charged groups）、または、−ＣＯ2 -もしくは−ＯＳＯ3 -などの負荷電基（negatively-charged groups）を含む荷電基（charged groups）が挙げられる。いくつかの実施形態において、共有結合される官能基は磁性官能基（magnetic functional group）である。適した磁性基としては、例えば−Ｆｅ3Ｏ4、−Ｆｅ2Ｏ3、−ＦｅＰｔ、−ＦｅＮｉ、−ＦｅＣｏ、−Ｍｇ、−Ｃｏ、−Ｎｉなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、共有結合される官能基は蛍光性官能基である。適切な蛍光性基としては、例えば−ＦＩＴＣ、−ローダミン６Ｇ（−Ｒｈ６Ｇ）、−Ｃｙ３および−Ｃｙ５などの分子色素（molecular dyes）、ならびに−ＣｄＳｅ、−ＺｎＳ、−ＰｂＳ、−ＰｂＳｅなどのナノ粒子／量子ドットが挙げられる。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器の表面は、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジンなどで共有結合的に修飾される。
さらなる実施形態において、化学修飾は非共有的修飾（noncovalent modification）である。非共有的修飾は、ポリマー材料を用いたコーティングであってよい。いくつかの実施形態において、例えば光結合器は、金属材料からなる均質固体粒子、または、金属シェル材料を含むコアシェル粒子であり、そして、光結合器の表面はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーでコートされる。
いくつかの実施形態では、移動可能な光結合器の表面のある１つの領域だけが修飾され、光結合器の残りの表面は修飾されない。いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器の表面の修飾される領域は、移動可能な光結合器の表面の約１０から９０％である。かかる実施形態を説明するために用いられる“移動可能な光結合器の表面の約１０から９０％”は、移動可能な光結合器の表面の修飾される領域が光結合器の表面のわずかに１０％より少ない状態からわずかに９０％より多い状態までの範囲であってよいことを示すよう意図されている。さらなる実施形態において、光結合器の表面の修飾される領域は、光結合器の表面の１０％未満である。別のさらなる実施形態では、光結合器の表面の修飾される領域は、光結合器の表面の９０％より大きい。
いくつかの実施形態では、修飾表面１および修飾表面２を示す図５Ａに図式化されているように、移動可能な光結合器の表面の２つの領域が修飾される。いくつかの実施形態において、光結合器は、正反対の特性（opposing properties）を有する官能基またはコーティングを用いた表面修飾の２つの領域を含む。例えば、光結合器の一方の表面は疎水性表面特性を有するように修飾され、一方、反対側の表面は親水性表面特性を有するように修飾されてもよい。さらなる実施形態において、光結合器の一方の表面は正荷電基を用いて修飾され、一方、反対側の表面は負荷電基を用いて修飾される。いくつかの実施形態では、光結合器の一方の表面はＤＮＡを引き付けかつ保持するよう修飾される、例えば、表面は正荷電官能基（positively-charged functional group）を用いて修飾されるか、または標的ＤＮＡ分子中の配列にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを用いて修飾され、一方、光結合器の他方の表面はＤＮＡを引き付けない。
さらなる実施形態において、移動可能な光結合器は、異なるタイプの特性を有する官能基またはコーティングを用いた表面修飾の２つの領域を含む。例えば、いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器の表面の一つの領域は磁性官能基を用いて修飾され、一方、移動可能な光結合器の反対側の表面は蛍光性官能基を用いて修飾される。
いくつかの実施形態において、導波路の少なくとも第１のクラッド層中に形成されたアダプター部位の表面は、１つまたはそれ以上の表面修飾を含む。図５Ｂに図式化されるように、導波路は第１のクラッド層および第２のクラッド層を含んでいてもよく、ここで第１の（下方の）クラッド層およびアダプター部位の底部のコア層（図示せず）の表面は、移動可能な光結合器１００上の表面修飾１を引き付ける、および／または、移動可能な光結合器１００上の表面修飾２と反発する（repels）表面修飾３を含み、そしてここで、第２の（上方の）クラッド層は、移動可能な光結合器１００上の表面修飾２と親和性がある（compatible with）表面修飾４を含む。図６に図式化されるように、導波路は、表面修飾３（アダプター部位の底部のコア層の表面とともに）および４の両方を含む第１のクラッド層を含んでいてもよく、ここで、表面修飾３は、移動可能な光結合器１００上の表面修飾１を引き付ける、および／または、移動可能な光結合器１００上の表面修飾２と反発し、そして、表面修飾４は移動可能な光結合器１００の表面修飾２と親和性がある。例えば、図５および６に図式化される、表面修飾１および３は本質的に親水性であってもよく、一方、表面修飾２および４は本質的に疎水性である。いくつかの実施形態において、アダプター部位１０４の表面３は親水性であり、シリコン、シリカ、金属または金属酸化物から選択される要素を含み、そして表面４は疎水性である。しかしながら、アダプター部位１０４の表面が親水特性を有する材料で作られている場合は、それを疎水性となるよう修飾してもよい。例えば、アダプター部位１０４の表面が親水性を有するシリケート（silicate）または金属で作られている場合、例えばＲ１x−Ｓｉ（Ｏ−Ｒ２）4-x（ここでＲ１は例えばアルキル鎖−（ＣＨ2）n−ＣＨ3などの疎水基であり、そしてＲ２はＣnＨ2n+1であり、かつ、ここでｘおよびｎは整数であって、１≦ｘ≦３である）などを用いて、または、例えば−ＣＯＯＨ、−ＰＯ3Ｈ2、−ＳＨもしくは−ＮＨ2から選択される官能基を有するポリマーなどを用いて、疎水性になるよう修飾されてもよい。別の例として、アダプター部位１０４の表面が親水特性を有する金属酸化物で作られている場合、例えばＲ１x−Ｓｉ（Ｏ−Ｒ２）4-x（ここでＲ１は例えばアルキル鎖−（ＣＨ2）n−ＣＨ3などの疎水基であり、そしてＲ２は−ＣnＨ2n+1であり、かつ、ここでｘおよびｎは整数であって、１≦ｘ≦３である）などを用いて、または、例えば−ＣＯＯＨ、−ＰＯ3Ｈ2、−ＳＨもしくは−ＮＨ2から選択される官能基を有するポリマーなどを用いて、疎水性になるよう修飾されてよい。アダプター部位１０４の上部表面を疎水性とする一方、アダプター部位１０４の底部表面は親水性に保つことにより、１つの疎水性表面および１つの親水性表面を含む移動可能な光結合器（下記の光結合器の表面修飾についての記載を参照）は、その親水性表面が上を向くまたはアダプター部位の側壁表面の方を向くのではなく、アダプター部位の底部近傍の有効な励起ゾーン内に親水性表面が位置しているという特定の向きで、アダプター部位に位置することができる。よって、移動可能な光結合器の表面の１つの領域（例えば、この例では親水性表面）に局在化された分子、または光結合器の表面に局在化された分子と相互作用する試料溶液１２０からの分子が、アダプター部位の底部近傍の限定空間内の有効な励起ゾーンに入る励起光により、効率的に励起され得る。
図５および図６に図式化された実施形態をさらに参照し、いくつかの実施形態において、表面修飾１および３は反対の電荷を有する基を用いた表面修飾、すなわち表面１は正に帯電し、そして表面３は負に帯電している、またはその逆である。
いくつかの実施形態において、移動可能な光結合器の表面の少なくとも１領域がオリゴヌクレオチドで修飾される。オリゴヌクレオチドを用いた表面修飾を含む移動可能な光結合器を含む例示的な検出システムの概略図が図４に示されている。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、核酸合成反応に用いられるシークエンシングプライマー（sequencing primer）の配列に相補的である。さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドはランダム配列（random sequences）を有する。オリゴヌクレオチドは、１０から１００ヌクレオチド長であってよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、１０から２０、２０から３０、３０から４０、５０から６０、６０から８０または８０から１００ヌクレオチド長であってもよい。なお、これらヌクレオチド長の範囲はおおよその（approximate）ものであり、そして、ヌクレオチド長の特定の範囲には、“おおよそ”この範囲内であるヌクレオチドの数が含まれること、例えば、１０から１００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドには、約１０から１００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが含まれるということが理解されるべきである。オリゴヌクレオチドの長さは１０ヌクレオチド未満でもよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３０より多いヌクレオチド長であってよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの長さはシークエンシングプライマーの長さに対応する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはシークエンシングプライマーよりもその長さが短い。オリゴヌクレオチドは、移動可能な光結合器に直接結合されてよく、また、オリゴヌクレオチドが移動可能な光結合器に結合され得る部位（moiety）、例えばビオチン基に結合されてよく、ここでこのビオチン基は、移動可能な光結合器の表面に連結されたストレプトアビジンまたはアビジンに結合し得る。
表面修飾の領域は、当該分野で公知の製造工程を用いて移動可能な光結合器に導入されてもよい。例えば、光結合器の１部分を、光結合器表面の残りの部分が修飾される間、一時的にマスキングする（temporarily masking）ことによって、表面修飾の領域が導入されてもよい。例えば、ナノスケール球体光結合器の一方の半球は、他方の半球が表面修飾に付されている間、マスクされていてよい。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上の光結合器を基板（例えば、ガラスまたはシリコン基板）上に配列し（aligning）、基板上に配列された結合器の表面上に不均一材料（heterogenous material）を堆積し、次いでリフトオフ法（lift-off method）を用いて修飾された光結合器を基板から取り除くという工程によって、光結合器が不均一材料で部分的にコートされる。光結合器の基板上への配列は、スピンコーティング（spin-coating）、ディップコーティング（dip-coating）、埋め込み（embedding）、ナノインプリンティング（nanoimprinting）、ナノインク印刷（nano ink-printing）、ナノ粒子自己集合技術（nano-particle self assembly technology)（例えば、化学的リソグラフィーにより予めパターン化された基板上でのナノ粒子の自己集合）の使用または類似の方法により実施され得る。光結合器上への不均一材料の堆積は、スパッタ堆積（sputter deposition）、マグネトロンスパッタ堆積（magnetron sputter deposition）、蒸着（evaporation）、原子層堆積（atomic layer deposition）、化学気相堆積（chemical vapor deposition）、物理気相堆積（physical vapor deposition, ＰＶＤ）、電子ビーム（例えば、電子銃（e-gun））堆積（electron beam deposition）、プラズマ堆積（plasma deposition）、レーザフラッシュ蒸着（laser flash evaporation)（例えば、蒸着金属堆積（evaporated metal deposition））などの方法によって実施され得る。リフトオフ法は、超音波攪拌（ultrasonic agitation）、化学的処理（chemical treatment)（例えば、アセトンによる処理）、磁気リフトオフ（magnetic lift-off）、または剃刀の刃（razor blade）を用いた堆積層の物理的剥離であってもよい。非対称の表面修飾を有する移動可能な光結合器粒子の製造に適した例示的な製造工程は、Park,H.らの“Multifunctional nanoparticles for photothermally controlled drug delivery and magnetic resonance imaging enhancement,” SMALL 4(2):192-196 (2008)、題名を“Multi-functional nanoparticles partially-deposited with gold film”とする国際公開第２００８／００２１０１号明細書、Anker, J.N.らの“Magnetically-Modulated Optical Nanoprobes (MagMOONs) and Systems,” JOURNAL OF MAGNETISM AND MAGNETIC MATERIALS 293:655-662 (2005)、Perro, A.らの“Design and synthesis of Janus micro- and nanoparticles,” JOURNAL OF MATERIALS CHEMISTRY 15: 3745-3760 (2005)、McNaughton, B.H.らの“Fabrication of uniform half-shell magnetic nanoparticles and microspheres with applications as magnetically modulated optical nanoprobes, ” arXiv:cond-mat/0506418v1, June 16, 2005, 1-6、およびWu, L.Y.ら、“Bioinspired nanocorals with decoupled cellular targeting and sensing functionality, SMALL 6(4):503-507 (2010) に記載されており、それらの全体がそれぞれ参照として本明細書に組み込まれる。
１．２．４ 移動可能な光結合器のアダプター部位への定方向局在化（Directed localization）
いくつかの実施形態において、１分子対象物のための表面局在化（surface-localized）結合部位（すなわち、１分子対象物を結合することのできる一つの分子または分子複合体）を有する移動可能な光結合器粒子は、光結合器のデザインに応じて、電場、磁場を利用して、または、親水性表面特性もしくはその他の化学的特性を利用して、導波路中に形成されるアダプター部位に局在化される。
図７に図式化されるように、磁性材料を含む、および／または、その表面上が磁性官能基を用いて修飾されている光結合器は、アダプター部位への磁場の印加によって、アダプター部位に局在化され得る。例えば、マイクロ加工コイル（micro-fabricated coils）がアダプター部位の下に設置されてもよい。電流がマイクロ加工コイルを通って流れるときに、コイルは、試料溶液中に存在する光結合器をアダプター部位中へと向かわせ、そして、光結合器をアダプター部位の底部にトラップする磁場を発生させることができる。磁性ナノ粒子をトラップするために適した方法がRamadan, Q.ら、“Customized trapping of magnetic particles,” MICROFLUID NANOFLUID 6:53-62 (2009) に記載されており、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
荷電官能基（charged functional groups）を用いて修飾されている光結合器は、アダプター部位を横切る電位の印加によって、アダプター部位に局在化され得る。例えば、マイクロ加工電極（micro-fabricated electrodes）が、電極として機能するように導電材料の層でコートされたスライドガラスの形式で、アダプター部位の底部に設置されてよい。電極への電流、例えば直流の印加によって、修飾された光結合器をアダプター部位内へと向かわせる電気泳動粒子取り込み（electrophoretic particle entrapment）システムとして機能するアダプター部位全体に電場が生じる。ナノ粒子を特定の検出部位に向かわせるために適した電気泳動技術は、Han, J.ら、“High performance electrophoresis system for site-specific entrapment of nanoparticles in a nanoarray”、PROC. SPIE 7574:75740L (2010) およびVelev, O.D.ら、“Particle-localized AC and DC manipulation and electrokinetics”、ANNU. REP. PROG. CHEM., SECT. C、105:213-246 (2009) に記載されており、それらの全体がそれぞれ参照として本明細書に組み込まれる。
１．２．５ システムのその他の光学要素
いくつかの実施形態において、図４に示されるように、光学フィルター１１８がコア層１１２と検出器１０２との間に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、フィルターは下方クラッド層（図４には図示せず）と光検出器１０２との間に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、光学フィルターは下方保護層（図示せず）と光検出器１０２との間に配置されてもよい。いくつかの実施形態では、下方保護層自体が光学フィルターとして機能してもよい。光学フィルターは、一定の範囲内の波長を有する光は通過させるが、一定の範囲外の波長を有する光は少なくとも部分的にブロックすることができる。したがって、光学フィルター１１８を適切に選択することにより、対象物から放射される光は通過できる一方で、励起光により生じるノイズは減少し、その結果Ｓ／Ｎ比が改善する。
移動可能な光結合器および検出されることとなる対象物は試料溶液１２０中に含まれていてもよく、アダプター部位１０４は前記試料溶液で満たされていてもよい。いくつかの実施形態において、マイクロ流体チャネル（microfluidic channel)（図示せず）が、試料溶液をアダプター部位内へ導くために用いられてもよい。マイクロ流体チャネルは、フローサイトメトリーのような（flow-cytometry-like）検出を実現するべく、標的対象物がアダプター部位を一度に１つずつ通過するように設計されてもよい。いくつかの実施形態において、試料溶液を収容するため、および／または、環境光をブロックするために、カバー（図示せず）が検出システムの上に形成されてもよい。
検出システムの構造を概略的に示す上述の図のうち一部は、簡潔にするため、いくつかの構成要素が図示されていない。例えば、図２の各パネルは、検出システムの移動可能な光結合器１００、導波路１１０およびアダプター部位１０４の構成要素だけを示している。検出システムの他の構成要素は示されていない。これらの図に示されている検出システムは本明細書で開示されるその他の構成要素もまた含んでよいことが理解されるべきである。例えば、図２の各パネルに示される検出システムは、光検出器、カバー、保護層（複数の保護層）、光源、および／または光学フィルターをまた含んでもよい。
２．検出の方法および応用
別の局面において、本開示は、本明細書に開示される検出システムを用いて１分子対象物などの対象物を検出する方法に関する。本明細書において、用語“１分子対象物”は、１分子からなる対象物、および、例えば１つの多重体ポリペプチド複合体（multimeric polypeptide complex）または二本鎖ＤＮＡの１のセグメントなどの非共有的に結合された（noncovalently linked）多数の分子からなる１つの対象物を含む。対象物を含む試料溶液で検出システムの導波路中に形成されたアダプター部位が満たされてよい。光源によって放射された入射光は、少なくとも一部が光結合器によって導波路内に導かれ、導波路のコア層内を伝播することができる。導波路内に導かれた光は、励起光として機能することができ、そして少なくとも部分的には導波路内に形成されたアダプター部位に局在化される移動可能な光結合器に連結することができる。対象物は、アダプター部位の底部の、および／または、アダプター部位に局在化された光結合器の表面の周りの有効な励起ゾーンに入ると、励起光によって励起され、そして、光検出器により検出される光を放射することができる。
さらに、１分子対象物を検出する方法であって、ａ）光源からの入射光を導波路に導入し、導波路中に励起光を形成させる工程、ｂ）移動可能な光結合器上に１分子対象物を局在化させる工程、ｃ）（ｂ）の移動可能な光結合器を、導波路の少なくとも第１のクラッド層中に形成される移動可能な光結合器のためのアダプター部位に局在化させる工程、およびｄ）移動可能な光結合器上に局在化された１分子対象物を励起光によって励起し、１分子対象物に光検出器により検出される光を放射させる工程、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、導波路の少なくとも第１のクラッド層中に形成される移動可能な光結合器のためのアダプター部位への移動可能な光結合器の局在化により、１分子検出に適した限定空間が形成される。
さらに、１分子対象物を検出する方法であって、ａ）（ｉ）移動可能な光結合器、（ii）コア層および第１のクラッド層を含む導波路であって、移動可能な光結合器のための少なくとも１つのアダプター部位が少なくとも第１のクラッド層中に形成されている導波路、および（iii）光検出器、を含む検出装置を提供する工程、ｂ）１分子対象物を結合させることのできる少なくとも１つの結合部位（binding moiety）を提供する工程、ｃ）少なくとも１つの結合部位を移動可能な光結合器の表面上に個々に局在化させる工程、ｄ）移動可能な結合器上に局在化された１つの結合部位に１分子対象物試料を提供する工程、ｅ）少なくとも１つの結合部位および１分子対象物がその上に局在化されている移動可能な光結合器をアダプター部位に局在化させる工程、ｆ）光源からの入射光を導波路に導入し、それによって導波路中に励起光を形成する工程、ならびにｇ）移動可能な光結合器上に局在化された少なくとも１つの結合部位に結合した１分子対象物を励起光により励起して、１分子対象物に光検出器により検出され得る光を放射させる工程、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの結合部位および１分子対象物がその上に局在化されている移動可能な光結合器のアダプター部位への局在化により、単位分子検出に適する限定空間が作り出され、ここで、検出される１分子対象物は限定空間内に局在化される。
いくつかの実施形態において、１分子対象物を検出する方法は、標的分子および／または分子複合体、例えば、受容体リガンドおよび受容体複合体、抗原および抗体、または、遊離ヌクレオチドトリフォスフェート（free nucleotide triphosphates）および核酸合成反応複合体（nucleic acid-synthesizing reaction complexes）の相互作用を検出する方法に関する。いくつかの実施形態において、前記方法は、標識分子（labeled molecule）の検出を含む。いくつかの実施形態において、標識は蛍光標識である。いくつかの実施形態において、標識は蛍光分子である。さらなる実施形態において、標識は蛍光タンパク質である。ある実施形態では、標識は量子ドットである。いくつかの実施形態において、標識はＦＲＥＴのドナー／アクセプター対の構成要素（member）である。本検出システム、およびこれを用いる方法は、例えば核酸検出、ＤＮＡシークエンシング、バイオマーカー同定（biomarker identification）、またはフローサイトメトリーに適用され得る。本検出システムは弱い強度の光信号（low intensity light signal）を検出および処理することができ、これは１分子検出を可能とする。
さらに、核酸をシークエンシングする方法であって、ａ）（ｉ）移動可能な光結合器、（ii）コア層および第１のクラッド層を含む導波路であって、移動可能な光結合器のための少なくとも１つのアダプター部位が少なくとも第１のクラッド層中に形成されている導波路、および（iii）光検出器、を含む検出装置を提供する工程、ｂ）少なくとも１つの核酸分子を提供する工程、ｃ）少なくとも１つの核酸分子を移動可能な光結合器上に個々に局在化させる工程、ｄ）少なくとも１つの核酸がその上に局在化されている移動可能な光結合器をアダプター部位に局在化させる工程、ｅ）少なくとも１つの核酸分子の合成による１分子のシークエンシング（single molecule sequencing-by-synthesis）を行う工程であって、合成による１分子核酸のシークエンシングが、核酸中の少なくとも１つの塩基のアイデンティティに相関する放射光（emitted light）を産生する工程、ｆ）検出器を用いて放射光を検出することにより、出力信号を得る工程、ならびにｇ）出力信号を処理して、核酸に含まれる少なくとも１つの塩基のアイデンティティを決定する工程、を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態において、上記方法は、例えば、試薬（reagents）または標的対象物と標識との間、および、官能基と表面、例えば移動可能な光結合器の表面またはアダプター部位の表面との間に、共有結合（covalent attachment）を形成することを含む。例えば、オリゴヌクレオチドで修飾された移動可能な光結合器粒子を製造するために、ストレプトアビジンがビオチン化されたオリゴヌクレオチドと結合するために光結合器の表面に連結されてもよい。いくつかの実施形態において、例えばポリペプチドまたはポリペプチド複合体などの１分子対象物の結合部位が光結合器の表面に連結され得る。当該分野においては、例えば試薬の表面または標識などへの共有結合を形成するための多くの方法が公知である。非共有結合（non-covalent attachment）の方法もまた用いられ得る。結合の形成を促すために多数の異なる化学修飾剤が用いられ得る。化学修飾剤として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基（N-hydroxy succinimide groups）、アミン類（amines）、アルデヒド類（aldehydes）、エポキシド類（epoxides）、カルボキシル基（carboxyl groups）、ヒドロキシル基（hydroxyl groups）、ヒドラジド類（hydrazides）、疎水基（hydrophobic groupｓ）、膜（membranes）、マレイミド類（maleimides）、ビオチン（biotin）、ストレプトアビジン（streptavidin）、チオール基（thiol groups）、ニッケルキレート類（nickel chelates）、光反応性基（photoreactive groups）、ホウ素基（boron groups）、チオエステル類（thioesters）、システイン類（cysteines）、ジスルフィド基（disulfide groups）、アルキルおよびアシルハライド基（alkyl and acyl halide groups）、グルタチオン類（glutathiones）、マルトース類（maltoses）、アジド類（azides）、フォスフェート類（phosphates）およびホスフィン類（phosphines）が挙げられる。これらは、例えば標準的な方法を用いて容易に製造され得る（MICROARRAY BIOCHIP TECHNOLOGIES, Mark Schena, Editor, March 2000, Biotechniques Books）。いくつかの実施形態において、結合は、適切な修飾剤の組み合わせ（例えば、求電子性の修飾剤および求核性の修飾剤）を用いることにより、２つの構成要素（entities）の間に形成され、ここで、各構成要素は少なくとも１つの修飾剤を含む。
いくつかの実施形態において、構成要素の１つに存在している化学修飾剤と、例えばアミンまたはスルフヒドリルなどの他方の構成要素の天然由来部位（naturally-occurring moiety）を利用することにより、２つの構成要素間に結合が形成される。いくつかの実施形態では、アミン類（amines）に反応する修飾剤が用いられる。この反応の利点は、反応が速く、かつ毒性の副産物の製造を回避できることである。このような修飾剤の例としては、ＮＨＳ−エステル類（NHS-esters）、アルデヒド類（aldehydes）、エポキシド類（epoxides）、アシルハライド類（acyl halides）、およびチオエステル類（thio-esters）が挙げられる。大部分のタンパク質、ペプチド、糖ペプチド（glycopeptides）などは遊離アミン基（free amine groups）を有しており、それらはかかる修飾剤と反応して共有結合でそれらを前記修飾剤に連結することができる。内部または末端アミン基（internal or terminal amine groups）を有する核酸プローブはまた、合成されてもよく、そして（例えば、ＩＤＴまたはＯｐｅｒｏｎから）市販されている。したがって、生体分子が同じような化学的性質（chemistries）を利用して、（例えば共有結合的にまたは非共有結合的に）標識、表面、またはその他の試薬に結合され得る。
その他多くの多官能基性架橋剤（multi-functional cross-linking agents）が、ある種の修飾剤の化学反応性を別のものに変えるために用いられ得る。これらの基（groups）は二官能性（bifunctional）、三官能性（tri-functional）、四官能性（tetra-functional）などであってもよい。これらはまた同種官能性（homo-functional）または異種官能性（hetero-functional）であってもよい。二官能性架橋剤の例はＸ−Ｙ−Ｚであり、ここでＸおよびＺは２つの反応基であり、かつＹは結合リンカー（connecting linker）である。さらに、ＸおよびＺが例えばＮＨＳ−エステルなどの同じ基である場合、得られる架橋剤、ＮＨＳ−Ｙ−ＮＨＳは同種二官能性架橋剤（homo-bi-functional cross-linker）であり、それぞれがアミンを含む２つの構成要素を連結することができる。ＸがＮＨＳ−エステルであり、かつＺがマレイミド基である場合、得られる架橋剤、ＮＨＳ−Ｙ−マレイミドは異種二官能性架橋剤（hetero-bi-functional cross-linker）であり、アミンを含む構成要素をチオ基（thio-group）を含む構成要素に連結することができる。多数の異なる官能基を有する架橋剤が、広く利用可能である。かかる官能基の例としては、ＮＨＳ−エステル類（NHS-esters）、チオ−エステル類（thio-esters）、アルキルハライド類（alkyl halides）、アシルハライド類（acyl halides)（例えばヨードアセトアミド（iodoacetamide））、チオール類（thiols）、アミン類（amines）、システイン類（cysteines）、ヒスチジン類（histidines）、ジスルフィド類（di-sulfides）、マレイミド（maleimide）、cis-ジオール類（cis-diols）、ボロン酸（boronic acid）、ヒドロキサム酸（hydroxamic acid）、アジド類（azides）、ヒドラジン類（hydrazines）、ホスフィン類（phosphines）、光反応性基（photoreactive groups)（例えばアントラキノン（anthraquinone）、ベンゾフェノン（benzophenone））、アクリルアミド（acrylamide)（例えばアクリダイト（acrydite））、親和性基（affinity groups)（例えばビオチン（biotin）、ストレプトアビジン（streptavidin）、マルトース（maltose）、マルトース結合タンパク質（maltose binding protein）、グルタチオン（glutathione）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（glutathione-S-transferase））、アルデヒド類（aldehydes）、ケトン類（ketones）、カルボン酸類（carboxylic acids）、フォスフェート類（phosphates）、疎水性基（hydrophobic groups)（例えばフェニル（phenyl）、コレステロール（cholesterol））などが挙げられる。
その他の修飾剤としての別の方法（alternatives)（例えば光架橋および熱架橋など）が、当業者には公知である。商業的に利用できる技術としては、例えばＭｏｓｉａｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（マサチューセッツ州ウォルサム）、ＥＸＩＱＯＮ(登録商標)（デンマーク、ヴェドバエク）、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ（ニューハンプシャー州キーン）、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ(登録商標)（ミネソタ州セントポール）、ＸＥＮＯＰＯＲＥ(登録商標)（ニュージャージー州ホーソーン）、Ｐａｍｇｅｎｅ（オランダ）、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ドイツ）、Ｐｒｏｌｉｎｘ（ワシントン州ボセル）、Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（テキサス州ヒューストン）、およびＣＯＭＢＩＭＡＴＲＩＸ(登録商標)（ワシントン州ボセル）の技術が挙げられる。
２．１ 検出システムと共に用いる標識
本明細書に記載される方法におけるいくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上の標識が、標的１分子対象物（複数の対象物)（すなわち、例えばヌクレオチドなどの検出される物質（複数の物質）、ヌクレオチド類似体を含む）、プライマー、抗体などのプローブ、または対象物（複数の対象物）もしくは他の試薬（複数の試薬）と相互に作用するその他の試薬（複数のプローブ）に結合される。１分子対象物に、または対象物の量もしくは存在とシグナルとの相関において有用であり得るプローブに、任意の標識が用いられ得る。
例えば、低分子、蛍光タンパク質および量子ドットを含む、多種多様な蛍光分子が利用可能である。有用な蛍光分子（蛍光団（fluorophores））としては、限定はされないが、１，５ ＩＡＥＤＡＮＳ、１，８−ＡＮＳ、４−メチルウンベリフェロン、５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、５−カルボキシナフトフルオレセイン、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン）、５−ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）、５−ヒドロキシトリプタミン（ＨＡＴ）、５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）、６−カルボキシローダミン６Ｇ、６−ＣＲ ６Ｇ、６−ＪＯＥ、７−アミノ−４−メチルクマリン（7-Amino-4-methylcoumarin）、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン、ＡＢＱ、酸性フクシン（Acid Fuchsin）、ＡＣＭＡ（９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン）、アクリジンオレンジ、アクリジンレッド、アクリジンイエロー、アクリフラビン、アクリフラビンフォイルゲン（Acriflavin Feulgen）ＳＩＴＳＡ、ＡＦＰｓ−ＡｕｔｏＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ−（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、テキサスレッド、テキサスレッド−Ｘコンジュゲート（Texas Red-X conjugate）、チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）、チアジンレッドＲ、チアゾールオレンジ、チオフラビン５、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオライト（Thiolyte）、チオゾールオレンジ、チノポールＣＢＳ（カルコフロールホワイト（Calcofluor White））、ＴＭＲ、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、トリカラー（ＰＥ−Ｃｙ５）、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）、トゥルーブルー、トゥルーレッド、ウルトラライト（Ultralite）、ウラニンＢ、ユービテックスＳＦＣ（Uvitex SFC）、ＷＷ ７８１、Ｘ−ローダミン、ＸＲＩＴＣ、キシレンオレンジ、Ｙ６６Ｆ、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３などのインターカレート色素（interchelating dyes）、サイバーグリーン（Sybr Green）、チアゾールオレンジ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００および７５０などの広いスペクトルをカバーすると共に一般的な励起源（common excitation sources）の主出力波長（principal output wavelengths）に適合するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素シリーズのメンバー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７などの同じく広いスペクトルをカバーするＣｙ Ｄｙｅ蛍光団（fluorophore）シリーズのメンバー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｏｙｓｔｅｒ−５００、−５５０、−５５６、６４５、６５０、６５６などのＯｙｓｔｅｒ ｄｙｅ蛍光団（fluorophores）のメンバー（Ｄｅｎｏｖｏ Ｂｉｏｌａｂｅｌｓ）、例えばＤＹ−４１５、−４９５、−５０５、−５４７、−５４８、−５４９、−５５０、−５５４、−５５５、−５５６、−５６０、−５９０、−６１０、−６１５、−６３０、−６３１、−６３２、−６３３、−６３４、−６３５、−６３６、−６４７、−６４８、−６４９、−６５０、−６５１、−６５２、−６７５、−６７６、−６７７、−６８０、６８１、−６８２、−７００、−７０１、−７３０、−７３１、−７３２、−７３４、−７５０、−７５１、−７５２、−７７６、−７８０、−７８１、−７８２、−８３１、−４８０ＸＬ、−４８１ＸＬ、−４８５ＸＬ、−５１０ＸＬ、−５２０ＸＬ、−５２１ＸＬなどの、４１８ｎｍ（ＤＹ−４１５）から８４４ｎｍ（ＤＹ−８３１）までの範囲に吸収極大をもつＤＹ−Ｌａｂｅｌｓシリーズのメンバー（Ｄｙｏｍｉｃｓ）、ＡＴＴＯ３９０、４２５、４６５、４８８、４９５、５２０、５３２、５５０、５６５、５９０、５９４、６１０、６１１Ｘ、６２０、６３３、６３５、６３７、６４７、６４７Ｎ、６５５、６８０、７００、７２５、７４０などの蛍光標識のＡＴＴＯシリーズのメンバー（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ５４０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ５６０、Ｑｕａｓａｒ５７０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ５９０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ６１０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ６３５、Ｑｕａｓａｒ６７０などの色素のＣＡＬ ＦｌｕｏｒシリーズもしくはＱｕａｓａｒシリーズのメンバー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥｖｉＴａｇｓシリーズの量子ドット（Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）もしくは例えばＱｄｏｔ５２５、Ｑｄｏｔ５６５、Ｑｄｏｔ５８５、Ｑｄｏｔ６０５、Ｑｄｏｔ６５５、Ｑｄｏｔ７０５、Ｑｄｏｔ８００などのＱｄｏｔシリーズの量子ドット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの量子ドット、蛍光色素（fluorescein）、ローダミン（rhodamine）、および／またはフィコエリトリン（phycoerythrin）、またはこれらの組み合わせが挙げられる。例えば米国出願公開第２００８／００８１７６９号明細書を参照されたい。
アダプター部位に局在化される移動可能な光結合器上に局在化された標的核酸の１分子核酸シークエンシングを含む実施形態において、新生ＤＮＡ鎖（nascent DNA strand）に取り込まれたヌクレオチドは、取り込まれる（incoming）ヌクレオチドに直接結合された蛍光団、例えばｄＮＴＰのベータまたはガンマフォスフェートに結合されており、そして、伸長鎖（growing strand）中へのｄＮＴＰの取り込み後に開裂される蛍光団などの励起および検出によって検出され得る。いくつかの実施形態では、新生鎖に取り込まれたヌクレオチドは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースの検出を用いて検出される。例えば、いくつかの実施形態において、米国特許出願第２０１０／００３５２６８号明細書に記載されるようなＦＲＥＴベースの方法が用いられ得る。かかる実施形態では、蛍光ドナー（fluorescence donor）として機能し得る量子ドットがシークエンシングプライマー（sequencing primer）に結合されていてもよく、そして、伸長鎖を合成するために用いられるｄＮＴＰｓが蛍光アクセプター基をそれらの末端（ガンマ）フォスフェート基に有する。標的核酸に相補的な活性部位における伸長ヌクレオチド鎖への蛍光団で標識されたヌクレオチドポリリン酸（fluorophore-labeled nucleotide polyphosphates）の取り込みは、励起された量子ドット蛍光ドナーからの蛍光共鳴エネルギー移動に続くｄＮＴＰ結合蛍光アクセプターからの発光を検出することによって、リアルタイムで検出される。取り込まれたそれぞれのヌクレオチドのアイデンティティはその蛍光標識によって決定され、その後、蛍光標識は、伸長鎖への取り込み後にヌクレオチドから開裂される。
２．２ 核酸の検出
本検出システムは、分子検出、例えば核酸シークエンシングなどの方法または処理工程に用いられてもよい。このシステム、およびそれを用いる方法または処理工程は、例えば分析および診断的な適用に有用である。
本検出システムは、多種多様なシークエンシングの様式（modalities）と共に用いられてもよく、そして、１分子をシークエンシングするために適しているであろう。さらに、本検出システムは、現存のバイオチップデバイスに比べて設計、アセンブリ、および製造が簡便化されている。
２．２．１ 検出される分子
検出に適した核酸としては、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡ（ペプチド核酸）などの任意の核酸が挙げられ、そして、天然（naturally occurring）または人工（artificial）の配列を含む、既知および未知両方の任意の配列を含んでいてよい。核酸は、天然由来（naturally derived）、組み替えで製造されたもの（recombinantly produced）、または化学的に合成されたものであってもよい。核酸は、天然のヌクレオチド、自然界には存在しないヌクレオチド類似体、または修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。検出される核酸の長さは、実際の適用に準じて異なり得る。いくつかの実施形態において、核酸は、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００、２００００塩基、またはそれ以上の塩基を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、核酸は、１０から２０、１０から５０、１０から１００、５０から１００、５０から５００、５０から１０００、５０から５０００、５００から２０００、５００から５０００、または１０００から５０００の塩基であってもよい。
核酸は、検出のための一本鎖であってもよい。一本鎖の核酸鋳型は、例えば加熱またはアルカリもしくはその他の化学的処理などを含む当該分野で公知の手段によって二本鎖分子から得られ得る。一本鎖の核酸鋳型はまた、例えば化学的合成またはin vitro合成などによって製造されてもよい。
いくつかの実施形態において、検出される核酸は環状である。いくつかの実施形態において、本方法は、プライマーの結合部位として用いられ得る既知の配列を有するインサート（insert）を含む環状核酸分子（circular nucleic acid molecule）を提供することを含む。環状核酸分子は、一本鎖または二本鎖の状態で提供されてもよく、そして、通常は少なくとも１つの共有結合で閉じられた鎖（covalently closed strand）を含むであろう。二本鎖の環状分子は、ニックの入った鎖（nicked strand）または第２の共有結合で閉じられた鎖を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、環状核酸分子は、その配列の一部が公知であり、そして、それ故に核酸インサートとして機能し得る場合（例えば、環状分子に含まれる遺伝子の配列中の保存されたモチーフが既知であるかもしれず、または高ストリンジェントな条件下で他の公知の配列である核酸にハイブリダイズすることのできるその能力に基づいてある配列を含むことがわかるかもしれない）、そのソース（source）から環状の形態で単離されることによって提供される。いくつかの実施形態において、核酸インサートの配列は、配列情報（knowledge of the sequence）がストリンジェントなハイブリダイゼーションの特性から得られるといった場合のように、不正確にしか知られていない。いくつかの実施形態において、核酸インサートの配列は、環状核酸分子が公知の骨格配列（backbone sequence）を有する、または、公知の配列を含むように設計されている場合のように、正確に知られている。
いくつかの実施形態において、環状核酸分子は、直鎖状核酸試料を核酸インサートと共に環状分子中へ組み込むためのin vitro反応または複数の反応を行うことによって提供される。いくつかの実施形態において、in vitroの反応または複数の反応には、リガーゼによるライゲーション、ならびに／または、リコンビナーゼおよびトポイソメラーゼを含む種々の酵素により触媒され得るようなその他の鎖結合反応（strand joining reactions）を含み得る。図８に例示されるように、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼが、円を形成するために、アダプター分子またはリンカーを用いてまたは無しで、直鎖状鋳型の両端を酵素的に結合させる（enzymatically join）ために用いられ得る。Tessierら、ANAL BIOCHEM, 158: 171-78 (1986) に記載されるように、例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼは一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを連結する。また、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ(登録商標)（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ウィスコンシン州マディソン）がまた、一本鎖核酸のライゲーションを触媒するために用いられてもよい。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＴ４ ＤＮＡリガーゼなどの二本鎖リガーゼが、環状化反応（circularization reaction）を行うために用いられてもよい。
いくつかの実施形態において、環状核酸分子を提供することは、相補領域を含む少なくとも１つのプライマー（核酸インサートとして機能し得る公知の配列の５’フラップ（flaps）を有するランダムプライマーを含み得る）から伸長することによって核酸鋳型を複製すること、および、リガーゼまたはリコンビナーゼにより触媒され得るような増幅された核酸を環状化することを含み、増幅された核酸は、いくつかの実施形態では、環状化に先立ち、例えば制限（restriction）またはリン酸化反応（phosphorylation）などによってその末端が処理されてよい。
いくつかの実施形態において、環状核酸分子は、化学的な環状化（chemical circularization）を行うことによって提供される。化学的な手法では、イミダゾール（imidazole）および二価金属、ＺｎＣｌ2とともにＮ−シアノイミダゾール（N-cyanoimidazole）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３エチルカルボジイミド塩酸塩（1-(3-dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide HCl）、ならびにその他のカルボジイミド類（carbodiimides）およびカルボニルジイミダゾール類（carbonyl diimidazoles）に加えてＢｒＣＮなどの公知のカップリング剤を用いる。直鎖状鋳型（linear template）の末端はまた、５’−フォスフェートおよび３’−ヒドロキシル（3'-hydroxyl）、または、５’−ヒドロキシルおよび３’−フォスフェートを縮合することによって連結されてもよい。
いくつかの実施形態において、環状核酸分子は、前記分子が環状であるので末端に存在しないということを除いて、末端連結プライマー（end link primer)（後述する）と見なされ得るインサート配列を含む。
２．２．１．１ 末端連結プライマー（End Link Primer）
いくつかの実施形態において、直鎖状核酸は、核酸の５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端の両方に連結される１つまたはそれ以上の末端連結プライマーをさらに含んでいてもよい。特定の実施形態では、末端連結プライマーは核酸の３’末端に固定（affixed）されてもよい。末端連結プライマーは、１つまたはそれ以上の検出プライマー（detecting primers）、例えばシークエンシングプライマー（sequencing primer）などのための相補配列を提供するために用いられ得る。
末端連結プライマーは、通常１００ヌクレオチド未満からなる短い核酸分子である。いくつかの実施形態において、末端連結プライマーは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７５、９０ヌクレオチド長、またはそれ以上であってもよい。ある実施形態では、末端連結プライマーは、８から２５、１０から２０、１０から３０、または１０から５０のヌクレオチド長であってよい。いくつかの実施形態において、末端連結プライマーは分岐していない（unbranched）が、他の実施形態では分岐していてもよい。
末端連結プライマーは、核酸を検出するために用いられる１つまたはそれ以上のプライマー、例えばシークエンシングプライマーの相補体（complement）として機能し得る。いくつかの実施形態において、プライマーは、ハイブリダイゼーションによって核酸を検出するために用いられてもよく、例えば、プライマーは検出可能な標識、例えば蛍光標識などを含み得る。いくつかの実施形態において、末端連結プライマーの５’末端は、シークエンシングプライマーに相補的な配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、シークエンシングプライマーに相補的である末端連結プライマーの配列はシークエンシングプライマーの３’末端が、シークエンシングされる核酸中の第１のヌクレオチドに直接隣接するように配向されてもよい。
いくつかの実施形態において、末端連結プライマーは、リガーゼ、例えばＤＮＡリガーゼなどによって検出される核酸の末端に加えられてもよい。いくつかの実施形態において、末端連結プライマーおよび検出される核酸は、ライゲーション前はどちらも一本鎖であってもよい。他の実施形態では、両方が二本鎖であってもよい。さらに他の実施形態では、一方が一本鎖で、他方が二本鎖であってもよい。ライゲーションは当該分野において広く公知である。例えば、ポロニーシークエンシング法（polony sequencing method）において、Shendureら（SCIENCE, 309:1728-1732 [2005]）は、ニューイングランドバイオラボ（ＮＥＢ）のＱｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ(登録商標)キットを用いてＴ３０末端連結プライマー（３２ｂｐ）を試料ＤＮＡ断片にライゲートした。ここで、ライゲーション反応溶液は、ＤＮＡ０．２６ピコモル（pmole）、Ｔ３０末端連結プライマー０．８ピコモル、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ４．０μＬを１×Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ中に含む。混合した後、その反応溶液を室温で約１０分間培養してから、氷上に置いた。試料を６５℃で１０分間加熱することによってライゲーション反応を停止させた。
他の実施形態において、末端連結プライマーは、シークエンシングされる核酸上で合成されてもよい。例えば、末端連結プライマーは、例えばターミナルトランスフェラーゼ（terminal transferase）などにより加えられるホモポリマーであってよい。例えば、Harrisら（SCIENCE 320:106-109 [2008]）は、ウィルスゲノムの１分子シークエンシングにおいてポリ−Ｔシークエンシングプライマー（poly-T sequencing primer）の相補体として機能するポリ−Ａ尾部（poly-A tail）をＤＮＡ鋳型に加えた。
２．２．１．２ シークエンシングプライマー（sequencing Primer）
シークエンシングプライマーは、検出されることとなる核酸の断片または結合された（associated）末端連結プライマーに相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、シークエンシングプライマーは少なくとも８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。特定の実施形態において、シークエンシングプライマーは、８から２５、１０から２０、１０から３０、または１０から５０のヌクレオチド長であってもよい。シークエンシングプライマーは、天然のヌクレオチド、天然界に存在しないヌクレオチド類似体、または修飾ヌクレオチドを含む任意のタイプのヌクレオチドで構成されてもよい。
いくつかの実施形態において、シークエンシングプライマーは、修飾ヌクレオチド、例えばロックド核酸（locked nucleic acids)（ＬＮＡｓ、ポリ核酸中に強化された塩基のスタッキング相互作用（base stacking interactions）を提供する修飾リボヌクレオチド）を含んでいてもよい。ＬＮＡｓの有用性の実例として、Levinら（Nucleic Acid RESEARCH 34(20):142 [2006]）は、ＬＮＡを含んだプライマーの特異性が改善され、そして、対応する非ロックド（unlocked）プライマーに比べより強力な結合を示すことを明らかにした。プライマー中の異なる位置で３つのＬＮＡヌクレオチドを含む（キャップ中）ＭＣＰ１プライマー（５’−ｃｔｔａａａｔｔｔｔｃｔｔｇａａｔ−３’）の３つの変異体（variants）、すなわちＭＣＰ１−ＬＮＡ−３’（５’−ｃｔｔａａａｔｔｔｔＣｔＴｇａＡｔ−３’）、ＭＣＰ１−ＬＮＡ−５’（５’−ＣｔＴａＡａｔｔｔｔｃｔｔｇａａｔ−３’）およびＭＣＰ１−ＬＮＡ−ｅｖｅｎ（５’−ｃｔＴａａａｔＴｔｔｃｔＴｇａａｔ−３’）が作製された。全てのＬＡＮ置換（LNA-substituted）プライマーはＴmが上昇し、ＭＣＰ１−ＬＮＡ−５’プライマーは特に増強されたシークエンシング精度を示した（Ｐｈｒｅｄ Ｑ３０ ｃｏｕｎｔｓ）。したがって、特定の実施形態において、シークエンシングプライマーは、少なくとも１つのロックドヌクレオチドを、その５'領域内に、すなわちシークエンシングプライマーの５'末端の半分、３分の１、または４分の１内に含んでいてもよい。
シークエンシングプライマーおよび一本鎖の標的核酸（すなわち、少なくとも１つの末端連結プライマーを含む、シークエンシングされる核酸）は、核酸重合酵素（nucleic acid polymerizing enzyme）、ｄＮＴＰｓ、および、核酸の重合に適したバッファー成分と混ぜ合わされる前または後に、ハイブリダイズされてもよく、その後移動可能な光結合器に取り込まれてもよい。シークエンシングプライマーおよび試料の核酸は、例えば５×ＳＳＣ（または５×ＳＳＰＥ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（または０．１％ＳＤＳ）、および０．１％ＢＳＡバッファーなどの塩含有溶液中で試料核酸をモル過剰のシークエンシングプライマーと混合することによりハイブリダイズされ得る。混合物は少なくとも５分間６５℃で加熱され、プライマー／鋳型のアニーリングを可能とするために、ゆっくりと室温まで冷却され得る。残余のプライマーは、例えば、分子ふるいなどの適切な手段により除去され得る。
いくつかの実施形態において、標的核酸は、核酸-合成反応複合体（nucleic acid-synthesizing reaction complex）の構成要素（component）として移動可能な光結合器上に局在化され、ここで、ポリメラーゼまたは標的核酸の表面への固定化を必要とすることなく、合成反応が導波路のアダプター部位における限定空間内に局在化され得る。移動可能な光結合器の表面上に局在化される核酸−合成反応複合体を製造するために、記載したように作製された環状の（circularized）標的核酸が、シークエンシングプライマー、核酸重合酵素、ｄＮＴＰｓ、および、核酸の合成に適切なバッファー成分と混ぜ合わされてもよい。ポリメラーゼは環状鋳型の回りにおいて複数のサイクル作用し、鋳型鎖の複数のコピーを含む伸長新生鎖（growing nascent strand）を作製する。図９に概略的に示されているように、重合複合体は、その後、その表面上がオリゴヌクレオチドを用いて修飾されている移動可能な光結合器に結合され得る。よって、かかる実施形態では、標的鎖鋳型およびポリメラーゼのいずれも、それ自体は表面上に固定化されない。オリゴヌクレオチドはシークエンシングプライマーの配列にハイブリダイズする配列を含んでいてよく、その複数コピーが伸長新生鎖中に組み込まれ得る。図１０に概略的に示されているように、これら組み込まれた配列は、光結合器の表面に結合されたオリゴヌクレオチドに結合することができる。図１１に概略的に示されているように、いくつかの実施形態においては、オリゴヌクレオチドは様々な位置で伸長新生鎖にハイブリダイズすることのできるランダム配列を含む。図９に示されるように、いくつかの実施形態においては、移動可能な光結合器は、その表面全体にわたってオリゴヌクレオチドを用いて修飾されていてもよい。図１０および図１１に示されるように、さらなる実施形態では、移動可能な光結合器は、その表面上の一部のみがオリゴヌクレオチドを用いて修飾されている。
図１２に示されるように、いくつかの実施形態において、組み込まれたビオチン化ウラシル塩基（biotinylated uracil bases）を有する鎖を含む二本鎖の標的配列は、一本鎖標的核酸の両末端にハイブリダイズすることのできる連結プライマー（linking primer）を用いて環状の一本鎖標的鎖を作製することにより、そして、核酸ポリメラーゼおよびビオチン化ｄＵＴＰが加えられたｄＮＴＰ混合物を用いて第２の鎖を重合することによって、作製される。図１３Ａに示されるように、二本鎖標的は変性され、そして、ストレプトアビジン修飾された光結合器粒子に結合されてもよく、これにより、結びつくビオチン化鎖に基づき、変性標的鎖が光結合器に取り込まれる。ポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、シークエンシングプライマー、および、核酸の合成に適切なバッファー成分の添加により、核酸-合成反応複合体が形成され、ここで、図１３Ｂおよび１３Ｃに示されるように、前記複合体は、ポリメラーゼまたは標的核酸の固定化なしに、移動可能な光結合器の表面に取り込まれる。ポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓおよびバッファー成分は、鋳型が取り込まれた光結合器のアダプター部位への局在化の前または後に添加されてもよい。
末端連結プライマーおよびシークエンシングプライマーの両者を含むプライマーは、配列の視覚的検査（visual inspection）またはコンピュータを用いた（computer-assisted）プライマー設計を含む適切な手段により設計されてもよい。ＤＮＡＳｔａｒ(登録商標)（ＤＮＡＳｔａｒ社、ウィスコンシン州マディソン）、ＯＬＩＧＯ ４．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ(登録商標)（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５（Ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ社）、およびＰｒｉｍｅｒ３（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，マサチューセッツ州ケンブリッジ）を含む多数のソフトウェアパッケージが、プライマー設計を補助するために利用可能である。プライマーは、例えば、シークエンシングされる分子、特異性、長さ、所望の融解温度、二次構造、プライマーダイマー（primer dimers）、ＧＣ含量、バッファー溶液のｐＨおよびイオン強度、ならびに、使用される酵素（すなわち、ポリメラーゼまたはリガーゼ）などを考慮に入れて設計され得る。例えば、Joseph SambrookおよびDavid Russell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (2001）を参照されたい。
２．２．２ シークエンシングの様式（Sequencing Modalities）
いくつかの実施形態は、核酸をシークエンシングする方法であって、ａ）（ｉ）移動可能な光結合器、（ii）コア層および第１のクラッド層を含む導波路であって、移動可能な光結合器のための少なくとも１つのアダプター部位が少なくとも第１のクラッド層中に形成されている導波路、および（iii）光検出器、を含む検出装置を提供する工程、ｂ）少なくとも１つの核酸分子を提供する工程、ｃ）少なくとも１つの核酸分子を移動可能な光結合器の表面上に個々に局在化させる工程、ｄ）少なくとも１つの核酸がその表面上に局在化されている移動可能な光結合器をアダプター部位に局在化させる工程、ｅ）少なくとも１つの核酸分子の合成による１分子シークエンシング（single molecule sequencing-by-synthesis）を行う工程であって、合成による１分子核酸のシークエンシングが、核酸中の少なくとも１つの塩基のアイデンティティに相関する放射光を産生する工程、ｆ）検出器を用いて放射光を検出することにより、出力信号を得る工程、ならびにｇ）出力信号を処理して、核酸に含まれる少なくとも１つの塩基のアイデンティティを決定する工程、を含む方法である。
これらの方法において、“少なくとも１つの核酸分子を移動可能な光結合器の表面上に個々に局在化させる、および、その表面上に局在化された少なくとも１つの核酸を有する移動可能な光結合器をアダプター部位に局在化させる”とは、アダプター部位に局在化されている移動可能な光結合器上に１つの核酸分子が位置し得ること、すなわち、１つの（１つよりも多くない）核酸分子が局在化されている少なくとも１つのアダプター部位が存在することを意味すると理解される。いくつかの実施形態において、その表面上に局在化された核酸分子を含む１つの（１つよりも多くない）移動可能な光結合器をそれぞれが個別に収容する複数のアダプター部位が存在する。いくつかの実施形態において、操作中、複数のアダプター部位のいくつかは、その表面上に局在化された１つの標的核酸分子をそれぞれ有する光結合器を収容しており、そして、他のアダプター部位は、光結合器を収容しないか、表面局在化（surface-localized）の標的核酸分子を有さない光結合器を収容するかのどちらかである。つまり、試料溶液中における表面局在化の核酸を有する光結合器の濃度はある特定の値よりも低いため、全てのアダプター部位がそれらの中に表面局在化の核酸を有する光結合器を収容させるわけではない。このことは、シークエンシングが完了する前に２つまたはそれ以上の核酸分子がアダプター部位に局在化するという事態を防ぎ、１つのシークエンシングの結果に２つ以上の分子からの情報を含むことを防ぐことができる。例えば、いくつかの実施形態において、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％より小さいか同等のアダプター部位が、アダプター部位に局在化された検出または同定される生体分子の低い濃度に起因するシグナルを生じる。第１の標的核酸がアダプター部位に局在化された光結合器の表面から解離し、そして続いて、第２の核酸がアダプター部位に局在化された同一の光結合器に結合するという例においては、組み込まれたヌクレオチドの検出における任意のギャップ（gap）によって、および／または、決定されたヌクレオチド配列における相違によって、第１の核酸のシークエンシングの結果は第２の核酸のシークエンシングの結果からと区別され得る。
いくつかの実施形態において、合成による１分子核酸のシークエンシング（sequencing-by-synthesis）は、化学発光（chemiluminescence）を介した光の放射を導く。とりわけ、これらの実施形態においては、化学発光が化学エネルギーから光を生成するため、装置が光源を含んでいる必要はない。
いくつかの実施形態では、本装置はさらに光源を含み、それは、例えば１分子核酸の合成によるシークエンシングによって蛍光（fluorescence）を介して光を放射するように、励起光（excitatory light）を提供するために用いられ得る。
本検出装置および方法は、例えば米国特許第６，９４６，２４９号明細書、およびShendureら、Nat. Rev. Genet. 5:335-44 (2004) に概説されているような当該分野において公知の手段により核酸を検出およびシークエンシングするために用いられ得る。シークエンシングの様式は、当該分野で公知の１分子シークエンシング法から選ばれ得る。いくつかの実施形態において、シークエンシング法はＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼの特異性に依存し、そして、例えば塩基伸長シークエンシング（１塩基段階的伸長（single base stepwise extensions））および合成による多塩基シークエンシング（例えば、末端標識されたヌクレオチドを用いたシークエンシングを含む）を含んでもよい。
１分子のシークエンシングの様式のために、本検出システムは１分子を再シークエンシング（resequence）できるという利点を提示することができる。例えば、シークエンシングされる鋳型核酸分子がシークエンシングプライマーと共に環状の形式で提供され得る。再シークエンシングは、鋳型核酸分子中のヌクレオチドの数よりも多いシークエンス読み取り（sequence read）が得られるような複数のシークエンシングサイクルを実行することによって達成され得る。よって、シークエンシング読み取りは、鋳型核酸分子中の少なくとも１つの位置における塩基を重複して同定している（redundantly identifies）情報を含む。いくつかの実施形態において、シークエンシング読み取りは、鋳型核酸分子中の塩基の少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を重複して同定する情報を含む。いくつかの実施形態において、シークエンシング読み取りは、鋳型核酸分子中の塩基の少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を３倍、４倍、５倍、７倍、または１０倍もしくは１０倍より大きい重複度（redundancy）で同定する情報を含む。同じの分子を再シークエンシングすることにより、シークエンシングエラーは、シークエンシング読み取りの数のべき乗で減少することが期待される。例えば、１回の読み取りの、一塩基当たりのエラー率が１０-3である場合、２回の読み取りの後、これは（１０-3）2、すなわち１０-6に下がる。このことは、シークエンシングに用いられる修飾ヌクレオチドが、それらの標識または保護基を失い、例えば、擬似の欠失（spurious deletions）をもたらし得るため、１分子のシークエンシングに特に利点がある。
酵素およびヌクレオチド上の蛍光団標識の生存率（viability）は、核酸合成反応が進むにつれて徐々に失われ得る。シークエンス読み取りの速度が低下すると、シークエンス読み取りのために、反応混合物が検出システムから洗い流され（washed out）、新たな溶液に取り替えられ得る。いくつかの実施形態では、反応混合物は、洗い流され、そして、取り替えられるよりも、新たな試薬によって補充される。
一般に、１分子シークエンシングにおいては、シークエンシングされる少なくとも１つの核酸分子がプライマーに接触する。プライマーは、例えば少なくとも１つの酵素を触媒とする重合またはライゲーション反応を行うことによって修飾される。この少なくとも１つの反応は、核酸中の少なくとも１つの塩基のアイデンティティと相関する光の発光を生じさせる。光の放射“を導く（leading to)”とは、少なくとも１つの反応が、核酸中の少なくとも１つの塩基のアイデンティティと相関する発光がおこる少なくとも１つの条件をもたらすことを意味すると理解され、これは、励起光（excitatory light）との相互作用、化学または生物発光システムなどを介して起こり得るものであり得る。少なくとも１つの条件は、例えば、少なくとも１つの反応の生成物中への蛍光団の組み込み、またはピロリン酸（pyrophosphate）の遊離であり得る。よって、光は外部励起の有無にかかわらず生じ得る。例えば、１分子シークエンシングは、例えば蛍光標識などの共有結合された検出可能な標識、およびいかなる第２の伸長をも防ぐ保護基を含む可逆的なターミネーター塩基類似体（reversible terminator base analogs）を用いて実行でき、ここで、前記類似体はプライマーに添加された後に励起および検出され、そして、標識および保護基は付加後に除去されて、次の伸長を可能とする。あるいは、ピロリン酸依存的（pyrophosphate-dependent）様式で光を放射する化学発光または生物発光検出システムを提供することによって、ピロリン酸などの伸長工程における生成物が外部励起なしに検出され得る。これらおよびその他の様式は、以下により詳細に論じられる。
放射される光は、核酸中の少なくとも１つの塩基のアイデンティティに相関がある。いくつかの実施形態では、その相関関係は時間的な（temporal）であり得る；例えば異なる時間において異なる塩基類似体が重合反応に用いられるために提供される場合のように、例えば光の放射の時間が少なくとも１つの塩基のアイデンティティを示す。いくつかの実施形態において、相関はスペクトル的（spectral）であり得る；例えば、異なる蛍光団を含む異なる塩基類似体が重合反応に用いられるために提供される場合のように、放射された光のスペクトルが少なくとも１つの塩基のアイデンティティを示す。
いくつかの実施形態において、１分子核酸シークエンシングは複数のシークエンシングサイクルを含む。シークエンシングサイクルとは、第１の塩基が同定された後に核酸中の少なくとも第２の塩基を同定するために繰り返されるであろう、少なくとも１つの塩基のアイデンティティに相関する光の放射を導く事象（events）のことを意味するものと理解される。よって、１分子核酸シークエンシングを含む方法において、１分子核酸シークエンシングは、核酸中の少なくとも一定数の塩基のアイデンティティと共同で（collectively）相関のある少なくとも一定数の光の放射を導く少なくとも一定数のシークエンシングサイクルを含んでいてもよく、そして、前記方法は、核酸中の少なくとも一定数の塩基を同定することを含む。いくつかの実施形態において、一定数とは、例えば２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００または５００であってもよい。
シークエンシング方法は、核酸中の１つまたはそれ以上の塩基のアイデンティティを決定することを含み得る。１分子核酸シークエンシングを行うことが、少なくとも第１の光学センサーおよび第２の光学センサーを含む少なくとも１つの光検出器を用いて検出される光の放射を導き、そして、前記少なくとも２つの光学センサーからの出力シグナルが処理されるいくつかの実施形態では、核酸中の少なくとも１つの塩基のアイデンティティは、少なくとも１つの処理結果を、少なくとも１つの既知のタイプに対応する少なくとも１つの既知の結果と比較することによって、決定され得る。
例えば、処理の結果は、反応が起こった時を示すことができる；放射された光が核酸中の少なくとも１つの塩基のアイデンティティと時間的に相関がある場合、前記の時は、核酸中の少なくとも１つの塩基を同定するために用いられ得る。
別の例では、処理の結果は、蛍光団が反応の生成物中に組み込まれたという判定（determination）であり得る；放射された光が核酸中の少なくとも１つの塩基のアイデンティティとスペクトル的に相関がある場合、前記判定は、核酸中の少なくとも１つの塩基を同定するために用いられ得る。
２．２．２．１ 塩基伸長シークエンシング:段階的伸長（Stepwise Extension）
いくつかの実施形態において、検出システムは、塩基伸長シークエンシング中に発生された光を検出するために用いられてもよい。いくつかの実施形態において、塩基伸長シークエンシングは、シークエンシングされる一本鎖核酸、シークエンシングされる核酸の３’末端に連結された（associated with）末端連結プライマー、およびそれにアニールされたシークエンシングプライマーを含む一部二本鎖（partial duplex）の試料核酸を提供することにより開始する。いくつかの実施形態では、その後ポリメラーゼおよび修飾ヌクレオチドが適切なバッファー中で光検出システムに適用されてもよい。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは共有結合している検出可能な標識、例えば、蛍光標識、および、いかなる二次的な伸長をも防ぐための保護基を含んでいてもよい。したがって、シークエンシングプライマーの３’末端への１つのヌクレオチドの付加の後、シークエンシングは停止する。
塩基伸長シークエンシング反応の１実施形態の第１工程において、蛍光保護基を有するヌクレオチドが、ＤＮＡポリメラーゼにより、シークエンシングプライマーの３’末端に付加され得る。いくつかの実施形態において、蛍光標識は、保護基として機能し得る。別の実施形態では、それらは別個の部位（moieties）であってもよい。１つのヌクレオチドがシークエンシングプライマーの３’末端に組み込まれることができ、そして、対応する光検出器によってその標識により同定される。蛍光標識および保護基はその後、例えば、化学的溶解または酵素溶解などにより除去され、塩基伸長のさらなるサイクルが可能となる。ある実施形態では、標識および保護基は、同時にまたは順次、そして任意の順序で除去され得る。付加される塩基の順序を編集する（compiling）ことによって、試料核酸の配列が、１度に１塩基ずつ、３’から５’方向に推定され得る。
一般的に、段階的伸長中に付加されるヌクレオチドを認識するための方法は２つある。第１の場合では、４種のヌクレオチドは全て、同じ検出可能な標識を有しているが、一度に１つずつ所定の順で付加される。伸長されたヌクレオチドのアイデンティティは、伸長反応中にヌクレオチドが付加される順番により決定され得る。伸長中に組み入れられる（integrated）塩基を認識する第２のモードでは、４種の異なるヌクレオチドが同時に付加され、そして、それぞれが異なる検出可能な標識に連結されている。異なる実施形態において、標識の励起もしくは発光スペクトルおよび／または強度が異なっていてもよい。伸長において付加されるヌクレオチドのアイデンティティは、検出された標識の強度および／または波長（すなわち、励起または発光スペクトル）により決定され得る。
２．２．２．２ 合成によるシークエンシング：多段階伸長（Multi-step Extension）
いくつかの実施形態において、合成によるシークエンシングは、例えば、保護基を用いずに、多数の連続した伸長とともに進行してもよい。これらの実施形態では、重合反応が、ヌクレオシド三リン酸加水分解後のピロリン酸の遊離、すなわちベータおよびガンマリン酸複合体の遊離を検出することにより観測され得る。この複合体は、上述したように、例えば複合体上の蛍光部位により直接的に、または、例えばピロリン酸を化学もしくは生物発光検出システムに連結させることによって間接的に、検出され得る。
いくつかの実施形態において、試料核酸は、末端リン酸標識（terminal-phosphate-labeled）ヌクレオチドを用いることにより本質的に連続してシークエンシングされ得る。末端リン酸標識ヌクレオチドおよびそれらの使用方法の例示的な実施形態は、例えば、米国特許第７，３６１，４６６号明細書および２００７年６月２１日に公開された米国特許出願公開第２００７／０１４１５９８号明細書に記載されている。簡単には、ヌクレオチドが検出システムに適用され、そして、重合反応中に加水分解された時に、標識されたピロリン酸が対応する光検出器により検出され得る。いくつかの実施形態において、４種すべてのヌクレオチドは異なる標識を含み、そして、同時に添加され得る。いくつかの実施形態においては、ヌクレオチドは区別できない（indistinguishable）、例えば同一の標識を含み、そして順次所定の順で添加され得る。順次的、循環的（cyclical）な、区別できない標識を有するヌクレオチドの付加でもまた、例えばホモポリマー配列において複数の連続した重合工程を可能とする。
２．２．３ さらなる応用
本検出装置は、何百万もの核酸のセグメントを同時に検出することができる。各セグメントが、例えば、１０００塩基長である場合、１つの装置は、何十億以上もの塩基配列を一度に得ることができる。以下で論じられることは、本明細書において提供されるシステムおよび方法のさらなる応用である。
２．２．３．１ 全ゲノムシークエンシング
本検出システムは、例えば、ウィルス、バクテリア、菌類、真核生物、または例えば哺乳動物、例えばヒトなどの脊椎動物の全ゲノムまたは部分ゲノムシークエンシングを行うために用いられ得る。
シークエンシングのために、ゲノムＤＮＡは、少なくとも２０、５０、１００、２００、３００、５００、８００、１２００、１５００ヌクレオチド長、またはそれより長いフラグメントにせん断され得る。いくつかの実施形態において、せん断されたゲノムＤＮＡは、２０〜５０、２０〜１００、２０〜５００、２０〜１０００、５００〜１２００、または５００〜１５００ヌクレオチド長であってよい。いくつかの実施形態において、シークエンシングされる核酸は、連結された末端連結プライマーと共に、一本鎖とされ、シークエンシングプライマーとアニールされ、そして、シークエンシングのために、上述のように、本検出システムに適用され得る。
２．２．３．２ 遺伝子発現プロファイリング
別の実施形態において、本検出システムは、遺伝子発現プロファイリングのためにｃＤＮＡをシークエンスするために用いられ得る。例えば、ｍＲＮＡレベルが、特定のシークエンスが装置上で検出される相対頻度を測定することにより定量化され得る。本明細書において記載されるように、数百万個のｃＤＮＡ分子が装置上で並行してシークエンシングされ得る。１つの細胞が平均して３５００００個のｍＲＮＡ分子を含むとすると、細胞あたりたった１コピー存在する転写産物ですら、１００万のシークエンシング反応中に、およそ３回シークエンシングされると期待される。したがって、本検出システムは、１つのコピー数感度（single-copy-number sensitivity）を有する１分子シークエンシングとして適切である。他の実施形態において、本検出システムは、遺伝子発現プロファイリングのために直接的にＲＮＡをシークエンシングするために用いられ得る（すなわち、直接ＲＮＡシークエンシング（direct RNA sequencing）、例えば、Ozsolakら、NATURE 461: 814-818 (2009) を参照されたい）。
ｃＤＮＡ合成は、当該分野において広く公知であり、そして通常、任意的なｍＲＮＡの濃縮を伴う全ＲＮＡ抽出を含む。ｃＤＮＡは、例えば、第一鎖合成のための逆転写、残存ＲＮＡを除去するためのＲＮＡｓｅ処理、第一鎖のランダムヘキサマープライミング、およびＤＮＡポリメラーゼによる第二鎖合成などを含む工程によりｍＲＮＡから製造される。結果として得られるｃＤＮＡは、本明細書において記載されるシステム上でのシークエンシングに適している。ＤＮＡおよびＲＮＡ両者の単離および調製の方法は、当該分野においてよく知られている。例えば、Joseph SambrookおよびDavid Russell、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (2001) を参照されたい。
２．２．３．３ さらなる検出法
（ａ）ＦＲＥＴ
いくつかの実施形態において、分子は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ、フェルスター（Foerster）共鳴エネルギー移動としても知られる）により、本検出システム上で検出され得る。当該分野で知られているように、ＦＲＥＴは、励起されたドナー分子がエネルギーを無放射的に（non-radiatively）アクセプター分子へ移動する際に起こり、エネルギー、通常、光を放射する。ＦＲＥＴは、例えば、検出されている分子の有効励起および発光波長の間のより良好なスペクトル分離を提供することなどによって、背景光を低減するために有用であり得る。ＦＲＥＴはしばしば、ドナーおよびアクセプター分子の間の距離の６乗でその効率が減少することから、近接する分子の相互作用を検出するために用いられる。例えば、Zhangら（Nature Materials,4:826-31 (2005) ）は、ＦＲＥＴにより核酸のハイブリダイゼーションを検出した。ここでは、ビオチン化核酸標的がアビジンコートされた量子ドットのドナーに共役され、その後Ｃｙ５で共役されたＤＮＡプローブを励起した。いくつかの実施形態において、試料溶液中で遊離の標識された分子と、この遊離分子に結合し、そして、移動可能な光結合器の表面上に局在化されている標識された分子または分子複合体とが、ＦＲＥＴによる検出のためのドナー／アクセプター（またはその逆）のペアを形成し得る。
本検出システムを用いる核酸シークエンシングのいくつかの実施形態において、蛍光標識されたヌクレオチドは、ポリメラーゼまたはリガーゼに付着したドナー発色団のためのアクセプター発色団として機能し得る。したがって、これらの実施形態では、ポリメラーゼまたはリガーゼ上に位置するドナー発色団は、標的核酸上に重合されているまたはこれにライゲートされているヌクレオチド上のアクセプター発色団を励起することができる。ポリメラーゼに近接していないヌクレオチドは、ＦＲＥＴ効率の急速な低下のために励起され得ない。いくつかの実施形態において、ドナー分子は、例えば量子ドットなどの例えば別の蛍光団であってもよい。量子ドット、例えば半導体量子ドットは、当該分野において公知であり、例えば国際公開第０３／００３０１５号明細書に記載されている。量子ドットを、例えば生体分子に連結させる手段は、例えばMednitzら、Nature Materials 4:235-46（2005)、ならびに２００６年３月３０日および２００８年４月１７日にそれぞれ公開された米国特許出願公開第２００６／００６８５０６号明細書および第２００８／００８７８４３号明細書に概説されているように、当該分野において公知である。いくつかの実施形態では、量子ドットは、ＤＮＡポリメラーゼ分子に共役されていてもよい。酵素をリンカー部位に共役するために、すでに上述したように、蛍光団を例えばＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼなどに共役させるときに、蛍光団を共役させることの酵素の一次、二次および三次構造への影響を軽減することにより酵素機能が保たれるように注意を払わなければならないということを、当業者は間違いなく理解するであろう。
（ｂ）多光子励起（Multi-Photon Excitation）
いくつかの実施形態では、発色団は、２つまたはそれ以上の光子により励起され得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＦＲＥＴにおけるドナーまたはアクセプター発色団の励起は、２つまたはそれ以上の光子によるものであってよい。２光子および多光子励起は、例えば、米国特許第６，３４４，６５３号明細書および第５，０３４，６１３号明細書にさらに記載されている。
（ｃ）時間分解検出（Time-Resolved Detection）
いくつかの実施形態において、検出システムの励起光源および光検出器は、特有の位相シフトをもつように調節され得る。当該分野で公知の方法を用いて、例えば、２００８年２月１４日に公開された米国特許出願公開第２００８／００３７００８号明細書に開示されているように、本検出システム上で検出されている分子から放射される光は、励起光源からの干渉なしに、対応する光検出器で測定され得る。
（ｄ）その他の蛍光検出システムおよび方法
いくつかの実施形態において、方法は、生細胞または固定細胞であり得る生体細胞中の少なくとも１つの対象物により発せられる光の検出に関する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの対象物は、少なくとも１つの量子ドットを含む少なくとも１つの対象物、少なくとも１つの蛍光タンパク質を含む少なくとも１つの対象物、および、少なくとも１つの蛍光性の小さな化学的部位（fluorescent small chemical moiety）を含む少なくとも１つの対象物から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの対象物は、蛍光標識され、そして、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、オリゴ糖、多糖、または脂質を含む。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの対象物は、量子ドット、蛍光タンパク質および蛍光性の小さな化学的部位から選択され得る、一定の、そして、限定された数の蛍光団、例えば最大で２０、１０、５または２つの蛍光団を含む。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの対象物は、量子ドット、蛍光タンパク質および蛍光性の小さな化学的部位から選択される１つの蛍光団のみを含む。蛍光性の小さな化学的部位の多くの例は、上述されている。いくつかの実施形態において、蛍光性の小さな化学的部位は、３００から８００ｎｍの間の発光ピーク、および／または、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８もしくは０．９の量子収率（吸収されたピークの吸収波長の光子に対する放射された光子の割合）をもつ。
３．実施例
３．１ 実施例１−その表面上に核酸合成反応複合体が局在化されたナノ球体光結合器の製造
図８に図式化された処理工程を用いて一本鎖環状ＤＮＡ鋳型を構築する。標的二本鎖核酸フラグメントのプールを変性させ、そして、自己相補的（self-complementary）アダプター核酸分子と結合させる。アダプター核酸分子は、標的核酸フラグメントのそれぞれの一本の鎖の末端に相補的である突出配列（overhanging sequences）を含む。アダプター分子は一本鎖標的鎖にアニールすることができ、そして、アダプター分子を標的核酸フラグメントのそれぞれに連結させるためにライゲーション酵素（ligating enzyme）を加える。次いで、このライゲーションの生成物を変性させ、そして、各標的鎖の末端に連結された両方のアダプター分子配列に相補的な結合核酸分子（linking nucleic acid molecule）と結合させる。次いで、ライゲーション酵素を用いて各標的鎖を環状化する。
環状化された標的鎖およびハイブリダイズされた結合核酸分子をＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、および、適切なバッファー成分と混ぜ合わせて、核酸合成反応複合体を形成させ、ここで、結合核酸分子はシークエンシングプライマーとして機能する。次いで、標的鎖を連続的様式で複製し、ここで、ポリメラーゼは環状鋳型の回りで繰り返し作用し、鋳型の連続的な複製において鋳型から新生鎖を移動させる（displacing）。これにより、標的配列の相補体の多数のコピーを含むＤＮＡの新生鎖が製造され、ここで、これらコピーの各々は、シークエンシングプライマーの配列を有するセグメントによって隔てられる。
ナノ球体粒子の表面をストレプトアビジンを用いて化学修飾する。シークエンシングプライマー（結合核酸分子）の配列に相補的な配列を含むビオチン化オリゴヌクレオチドプライマーを、ストレプトアビジン修飾のナノ球体と結合させ、これによりビオチン化プライマーをナノ球体に連結させる。オリゴヌクレオチドコートされたナノ球体を、前の段落で記載したＤＮＡポリメラーゼ、環状鋳型鎖および複製鎖（replicated strand）を含む反応複合体と結合させる。複製鎖に取り込まれたシークエンシングプライマーの配列が、ナノ球体の表面上に固定化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、これによって図９に図示されるように反応複合体をナノ球体の表面に固定（anchoring）させる。
３．２ 実施例２−特定のプライマーを用いた、一方の半球上に核酸合成反応複合体が局在化されたナノ球体光結合器の製造
ナノ球体粒子は一方の半球上をストレプトアビジンで修飾される。シークエンシングプライマー（例えば、図８に示されるような結合核酸分子）の配列に相補的な配列をそれぞれ含むビオチン化オリゴヌクレオチドプライマーを、ストレプトアビジン修飾のナノ球体と結合させ、これによりビオチン化プライマーをストレプトアビジンコートされたナノ球体の半球に連結させる。オリゴヌクレオチドでコートされたナノ球体を、実施例１で記載したようなＤＮＡポリメラーゼ、環状鋳型鎖および複製鎖を含む反応複合体と結合させる。複製鎖に取り込まれたシークエンシングプライマーの配列が、ナノ球体の一方の半球上に固定された相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、これによって図１０に図示されるように反応複合体をナノ球体の表面に固定させる。
３．３ 実施例３−ランダム配列プライマーを用いた、一方の半球上に核酸合成反応複合体が局在化されたナノ球体光結合器の製造
ナノ球体粒子は一方の半球上をストレプトアビジンで修飾される。ランダムヌクレオチド配列をそれぞれ含むビオチン化オリゴヌクレオチドプライマーを、ストレプトアビジン修飾のナノ球体と結合させ、これによりビオチン化プライマーをストレプトアビジンコートされたナノ球体の半球に連結させる。オリゴヌクレオチドでコートされたナノ球体を、実施例１で記載したようなＤＮＡポリメラーゼ、環状鋳型鎖および複製鎖を含む反応複合体と結合させる。新生複製鎖（nascent replicated strand）が、ナノ球体の一方の半球上に固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、これによって図１１に図示されるように反応複合体をナノ球体の表面に固定させる。
３．４ 実施例４−ビオチン化された二本鎖鋳型による、一方の半球上に核酸合成反応複合体が局在化されたナノ球体光結合器の製造
図１２に図式化された処理工程を用いて二本鎖環状ＤＮＡ鋳型を構築する。標的二本鎖核酸フラグメントのプールを変性させる、そして、自己相補的アダプター核酸分子と結合させる。アダプター核酸分子は、標的核酸フラグメントのそれぞれの一本の鎖の末端に相補的である突出配列（overhanging sequences）を含む。アダプター分子は各一本鎖標的鎖にアニールすることができ、そして、アダプター分子を各標的核酸フラグメントに連結させるためにライゲーション酵素（ligating enzyme）を加える。次いで、このライゲーションの生成物を変性させ、そして、各標的鎖の末端に連結された両方のアダプター分子配列に相補的な結合核酸分子（linking nucleic acid molecule）と結合させる。次いで、ライゲーション酵素を用いて各標的鎖を環状化する。
アニールされたＤＮＡ分子に、核酸ポリメラーゼおよびビオチン-ｄＵＴＰで補充されたｄＮＴＰ混合物を加える。ハイブリダイズされた結合核酸分子はシークエンシングプライマーとして機能し、そして、ビオチン化ウラシル塩基（biotinylated uracil bases）を含む第２の鎖を、鎖置換活性（strand-displacing activity）をもたないポリメラーゼを用いて合成する。ポリメラーゼが第２の鎖の合成を完了するとき、その合成混合物に含まれるライゲーション酵素は、閉じた環状の二本鎖ＤＮＡを形成する。
閉じた環状の二本鎖ＤＮＡを変性させ、そして、一方の半球がストレプトアビジンで修飾されたナノスケール粒子と混合する。図１３Ａに図示されるように、ＤＮＡとストレプトアビジン修飾の粒子は、ナノ球体粒子あたりに付着する１つの鋳型に適したおおよそのモル比で結合される。ビオチン化されていない鎖は、ナノ球体の表面上に局在化されたビオチン化鎖と結びつくことによって、ナノ球体の表面上に局在化する。
ＤＮＡポリメラーゼ、標的鎖に相補的なシークエンシングプライマー、蛍光標識されたｄＮＴＰｓ、および、適切なバッファー成分をナノ球体と混ぜ合わせ、そして、鋳型と結合させて、ＤＮＡ合成反応複合体をナノ球体の表面上に形成させる（図１３Ｂ）。ポリメラーゼは鋳型の周りで作用し、新生合成鎖（nascent synthesized strand）を形成する（図１３Ｃ）。
３．５ 実施例５−表面局在化核酸合成複合体（surface-localized nucleic acid-synthesizing complex）を有する磁性ナノ球体の導波路のアダプター部位への局在化
ナノ球体粒子を磁性官能基（magnetic functional groups）を用いて均一に表面修飾する。核酸合成反応複合体を、実施例１に記載したように、ナノ球体の磁気的に修飾された表面上に局在化させる。アダプター部位の下に配置されるマイクロ加工コイル（micro-fabricated coils）を用いて、表面局在化反応複合体を有するナノ球体を、導波路中に形成されたアダプター部位に局在化させる。マイクロ加工コイルに電流を通すことにより、表面局在化反応複合体を有するナノ球体をアダプター部位にトラップする磁場が生じる。こうして、反応複合体を、導波路中のアダプター部位の光結合器の表面上に局在化させ、そして、導波路のコア層の表面近傍の限定空間内に局在化し得る。
３．６ 実施例６−表面局在化核酸合成複合体を有する非対称的（asymmetrically）磁性ナノ球体の導波路のアダプター部位への局在化
ナノ球体粒子の表面の一部を磁性官能基で修飾する。核酸合成反応複合体を、実施例２から４のいずれかにおいて記載したように、ナノ球体の磁気的に修飾された表面上に局在化させ、ここで、磁性官能基で修飾されているナノ球体の同じ表面がまた、ストレプトアビジンを用いて修飾される。アダプター部位の下に配置されるマイクロ加工コイルを用いて、表面局在化反応複合体を有するナノ球体を、導波路中に形成されたアダプター部位に局在化させる。マイクロ加工コイルに電流を通すことにより、反応複合体が取り込まれた磁気的に修飾された表面を導波路のコア層に向かわせて、反応複合体が取り込まれたナノ球体をアダプター部位にトラップする磁場が生じる。こうして、反応複合体を、導波路のコア層の表面近傍の限定空間内のアダプター部位に局在化させる。
３．７ 実施例７−表面局在化核酸合成複合体（surface-localized nucleic acid-synthesizing complex）を有する導電材料で修飾されたナノ球体の導波路のアダプター部位への局在化
ナノ球体粒子を導電材料、すなわち荷電基を含む材料で均一に表面修飾する。核酸合成反応複合体を、実施例１で記載したように、ナノ球体の導電材料で修飾された表面上に局在化させる。アダプター部位でマイクロ加工電極（micro-fabricated electrode）を用いることにより、表面局在化反応複合体を有するナノ球体を、導波路中に形成されたアダプター部位に局在化させる。マイクロ加工電極は、アダプター部位の下に配置されるスライドガラスを含み、ここで、前記スライドガラスは導電材料、例えばインジウムスズ酸化物の層でコートされており、電極の導電面として機能する。同じように導電材料でコートされ、そして、反応複合体がロードされたナノ球体を含む試料溶液の上に位置するスライドガラスは、相殺電極（counteracting electrode）として機能する。マイクロ加工電極に電流を印加して、表面局在化反応複合体を有するナノ球体をアダプター部位にトラップする電極間の電位差を生じさせる。こうして、反応複合体を、導波路中のアダプター部位における光結合器の表面上に局在化させ、そして、導波路のコア層の表面近傍の限定空間内に局在化させ得る。
３．８ 実施例８−導電材料で非対称的に修飾され、かつ表面局在化核酸合成複合体を有するナノ球体の導波路のアダプター部位への局在化
ナノ球体粒子の表面の一部を導電材料で修飾する。核酸合成反応複合体を、実施例２から４のいずれかにおいて記載したように、ナノ球体の導電材料で修飾された表面上に局在化させ、ここで、導電材料で修飾されているナノ球体の同じ表面がまた、ストレプトアビジンを用いて修飾されている。アダプター部位でマイクロ加工電極を用いることにより、表面局在化反応複合体を有するナノ球体を、導波路中に形成されたアダプター部位に局在化させる。マイクロ加工電極は、アダプター部位の下に位置するスライドガラスを含み、ここで、スライドガラスは導電材料、例えばインジウムスズ酸化物の層でコートされており、電極の導電面として機能する。同じように導電材料でコートされており、そして、反応複合体がロードされたナノ球体を含む試料溶液の上に位置するスライドガラスは、相殺電極（counteracting electrode）として機能する。マイクロ加工電極に電流を印加して、導電材料および反応複合体を用いて修飾されたナノ球体の表面を導波路のコア層の方に向かわせて、表面局在化反応複合体を有するナノ球体をアダプター部位にトラップする電極間の電位差を生じさせる。こうして、反応複合体を、導波路のコア層の表面近傍の限定空間内のアダプター部位に局在化させる。
３．９ 実施例９−表面局在化核酸合成複合体（surface-localized nucleic acid-synthesizing complex）を有する親水基で修飾されたナノ球体の導波路のアダプター部位への局在化
ナノ球体粒子の一方の半球を親水性官能基で、その他方の半球を疎水基で修飾する。核酸合成反応複合体を、実施例２から４のいずれかにおいて記載したように、ナノ球体の親水性表面上に局在化させ、ここで、親水基を用いて修飾されるナノ球体の同じ表面がまた、ストレプトアビジンを用いて修飾される。図６に示されるように、表面局在化反応複合体を有するナノ球体を、その反応部位に親水性表面修飾を有し、かつその反応部位外に疎水性表面修飾を有するアダプター部位に局在化させる（ここで、表面１および３は親水性であり、表面２および４は疎水性である）。反応部位に位置する局在化反応複合体を有するナノ球体の親水性表面が導波路のコア層の方を向いている状態で、ナノ球体がアダプター部位に配向される（orients）。こうして、反応複合体を、導波路のコア層の表面近傍の限定空間内のアダプター部位に局在化させる。
３．１０ 実施例１０−移動可能な光結合器上に局在化された核酸合成反応複合体のシークエンシング
ナノ球体粒子上に局在化された核酸合成反応複合体を、実施例５から９のいずれかにおいて記載したように、導波路中に形成されたアダプター部位に局在化させる。試料溶液は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの各々に固有の蛍光団を用いてそれらのベータまたはガンマフォスフェートを標識したｄＮＴＰｓを含む。試料溶液に、ＤＮＡポリメラーゼおよび適切なバッファー成分などの追加のシークエンシング試薬を補充してもよい。ＤＮＡ複製フォークとナノ球体の表面との間の距離は、数十から数百ナノメーターの範囲である。合成反応の各工程において、標識されたｄＮＴＰｓの４種のうち１種が、反応複合体の活性部位と連結し、ここで、標的核酸の対応する塩基と塩基対が形成される。蛍光標識は、アダプター部位の底部に形成されるエバネッセント光場により、および／または、ナノ球体の表面から放射されるエバネッセント光場により、励起される。蛍光団で標識されたヌクレオチドポリリン酸（nucleotide polyphosphate）の活性部位における伸長ヌクレオチド鎖への組み込みを、ｄＮＴＰに結合した蛍光団の発光を検出することによってリアルタイムで検出する。組み込まれたそれぞれのヌクレオチドのアイデンティティをその蛍光標識によって決定し、ここで、蛍光標識は、伸長鎖への組み込み後に、ヌクレオチドから開裂される。標的核酸の配列は、重合反応中に検出された蛍光発光シグナルの配列を核酸配列に変換することによって得られる。
３．１１ 実施例１１−ナノ球体への光の光学的結合（optical coupling）により直径３５０ｎｍのナノ球体光結合器の表面周囲に生じる励起光場のシミュレーション
アダプター部位を含むシングルモード導波路およびナノ球体光結合器を通る励起光伝播のシミュレーションは、ナノ球体がシングルモード導波路からの光を連結させ得ることを実証する。移動可能な光結合器のアダプター部位を含むシングルモード導波路と、ナノ球体光結合器とを含むシミュレートされた検出システムの略図が、図１４に示されている。このシミュレートされたシステムにおいて、ナノ球体の光結合器（Ｔａ2Ｏ5）および導波路のコア層（Ｔａ2Ｏ5）はいずれも屈折率が２．２６である。シングルモード導波路のコア層の厚さは１００ｎｍであり、そして、下方クラッド層の厚さは５００ｎｍである。導波路のクラッド層はＳｉＯ2からなり、屈折率は１．４８７である。移動可能な光結合器のナノ球体の直径は３５０ｎｍであり、アダプター部位に位置している。アダプター部位は逆円錐形の（inverted, cone-shaped）ナノウェルであり、前記ナノウェルの開口角（opening angle)（つまり、錐体の１側面から正反対の側面の間の角度）は１１２．６°である。ナノウェルの円形の底部の直径は１００ｎｍであり、そして、ナノウェルは水で満たされており、その屈折率は１．３３である。かかる構成において、光結合器およびコア層はいずれも、単一横電場（transverse electric,ＴＥ）モードおよび単一横磁場（transverse magnetic,ＴＭ）モードを有する光波を伝播させることができる。
入射光の波長は４７３ｎｍである。システムにおける定常電場および磁場分布をソースフリー（source-free）のマクスウェルの方程式を用いて計算する（参考までに、Katrin SchmittおよびChristian Hoffmann、“High-Refractive-Index waveguide Platforms for Chemical and Biosensing”, in Optical Guided-wave Chemical and Biosensors I, Springer Series on Chemical Sensors and Biosensors 7, 21 (M. Zourob and A. Lakhtakia eds., 2009.) を参照）。
この構成において、ＴＥモードおよびＴＭモードの場はいずれも、図１５（ＴＥモードの場）および図１６（ＴＭモードの場）に示されるように、導波路のコア層およびナノ球体の表面の領域に沿って伝播する。図１７に示されるように、定常電場のように、定常磁場の一部はコア層からナノ球体の表面の領域へ伝わる。
さらなるシミュレーションでは、アダプター部位が導波路のコア層中に延伸している。ナノウェルがコア層中に延伸していない、コア層中へ部分的に延伸している、および完全にコア層中に延伸しているシステムの光場が、それぞれ図１８Ａ、Ｂ、およびＣにトポロジー的に（topologically）示されている。図１８Ａ、Ｂ、およびＣの左側の画像（（ａ）と付してある）は、導波路内の光場の強度等高線（intensity contours）を表している。図１８Ａ、Ｂ、およびＣの右側の画像（（ｂ）を付してある）は、ナノ球体がアダプター部位に位置しているときの検出システム内の光場の強度等高線を表している。ナノ球体が存在しない場合、エネルギーは、３種類の厚さで導波路の周囲を伝播する。しかしながら、ナノ球体がアダプター部位に位置しているとき、ナノ球体の表面に光場が誘起されることとなる。この誘起された光場の強度は、アダプター部位が導波路のコア層中に延伸する距離が大きくなるにしたがって、増大する。
３．１２ 実施例１２−ナノ球体への光の光学的結合により直径１００ｎｍのナノ球体光結合器の表面周囲に生じる励起光場のシミュレーション
実施例１１で記載したのと同様のシミュレーションにおいて、ナノ球体のＴａ2Ｏ5光結合器の直径は１００ｎｍである。シングルモード導波路のＴａ2Ｏ5コア層の厚さは１００ｎｍである。導波路のクラッド層はＳｉＯ2からなる。下方クラッド層の厚さは５００ナノメートルである。アダプター部位は円錐形のナノウェルであり、そして、その円錐ナノウェルの開口角（つまり、錐体の１側面から正反対の側面の間の角度）は１１２．６°である。ナノウェルの円形の底部の直径は１００ｎｍであり、そして、ナノウェルは水で満たされている（屈折率は１．３３）。この構成に基づいてシミュレートした検出システムの概略図が図１９に示されている。入射波は波長４７３ｎｍのＴＥ−偏光光場（TE-polarized optical field）である。シミュレートした定常電場分布の等高線マップを表している図２０（ａ、右側の画像）に示されるように、電場の大部分は導波路のコア層のすぐ近傍に残存している。検出システムの光エネルギーは図２０（ｂ）に示されており、該図は、ナノ球体の下側表面上に誘起された光場を示している（右側に高倍率で示されている）。
さらなるシミュレーションでは、図１９に図示したシステムを用いるが、導波路のコア層の厚さは、１００ｎｍではなく５０ｎｍである。入射波は波長４７３ｎｍのＴＥ−偏光光場（TE-polarized optical field）である。シミュレートされた定常電場分布が図２１に示されている。ナノ球体の下側表面上に誘起された光場が、図２１の下方の画像に示されている。
さらなるシミュレーションでは、図１９に図示したシステムを用いるが、導波路のコア層の厚さは、１００ｎｍではなく１５０ｎｍである。入射波は波長４７３ｎｍのＴＥ−偏光光場（TE-polarized optical field）である。シミュレートされた定常電場分布が図２２に示されている。ナノ球体の下側表面上に誘起された光場が、図２２の下方の画像に示されている。
図２０、２１および２２に示されるように、これらの構成において、定常電場および光エネルギーの一部は、導波路のコア層からナノ球体の表面の下側領域に移動する。

Claims (36)

  1. ａ）移動可能な光結合器、
    ｂ）コア層および第１のクラッド層を含む導波路であって、前記移動可能な光結合器のための少なくとも１つのアダプター部位が少なくとも前記第１のクラッド層中に形成されている導波路、
    ならびに、
    ｃ）光検出器、
    を含む１分子検出システムであって、
    前記移動可能な光結合器が、前記アダプター部位内の前記コア層に隣接するその表面の少なくとも一部に標的分子を担持でき、および、前記標的分子を前記アダプター部位に特定の向きで局在化させることができ、前記移動可能な光結合器が、前記第１のクラッド層の屈折率よりも大きい屈折率を有し、かつ前記移動可能な光結合器の屈折率が前記コア層の屈折率と実質的に同じまたは等しい検出システム。
  2. 前記検出システムが光源をさらに含む請求項１記載の検出システム。
  3. 前記移動可能な光結合器のための前記少なくとも１つのアダプター部位がナノウェルである請求項１記載の検出システム。
  4. 前記ナノウェルの底部に垂直な方向に対する前記ナノウェルの側壁の角度が６０度よりも小さい請求項３記載の検出システム。
  5. 前記ナノウェルが円錐形である請求項３記載の検出システム。
  6. 前記移動可能な光結合器がナノスケール粒子である請求項１記載の検出システム。
  7. 前記ナノスケール粒子が、前記コア層に沿って伝播する光波の波長の約１／１０から２倍までの長さを有する請求項６記載の検出システム。
  8. 前記少なくとも１つのアダプター部位が、前記第１のクラッド層の全層まで延伸している請求項１記載の検出システム。
  9. 前記少なくとも１つのアダプター部位が、前記第１のクラッド層の全層および前記コア層の厚みの一部まで延伸している請求項１記載の検出システム。
  10. 前記少なくとも１つのアダプター部位が、前記第１のクラッド層の全層および前記コア層の全層まで延伸している請求項１記載の検出システム。
  11. 前記コア層が、少なくとも１つの、ＳｉXＴｉ1-XＯ2、ＴｉＯ2、Ｔａ2Ｏ5、Ｎｂ2Ｏ5、ＨｆＯ2、Ａｌ2Ｏ3、ＺｒＯ2、ＺｎＳ、ＳｉＮX、ＡｌＮX、ＴｉＮX、ＰＣ、ＰＭＭＡまたはＳＵ８から選択される材料で作製される請求項１記載の検出システム。
  12. 前記移動可能な光結合器が、酸化物、ポリマー、金属、硫化物、セレン化物または窒化物から選択される材料で作製される請求項１記載の検出システム。
  13. 前記移動可能な光結合器が酸化物で作製される請求項１２記載の検出システム。
  14. 前記酸化物が、ＳｉＯ2、ＴｉＯ2、Ｔａ2Ｏ5またはＦｅ3Ｏ4から選択される請求項１３記載の検出システム。
  15. 前記移動可能な光結合器がポリマーで作製される請求項１２記載の検出システム。
  16. 前記移動可能な光結合器がポリスチレンで作製される請求項１５記載の検出システム。
  17. 前記移動可能な光結合器が、コア材料およびシェル材料を含むコアシェル構造を有している請求項１記載の検出システム。
  18. 前記コア材料およびシェル材料が異なり、そして、それぞれ独立に酸化物、ポリマー、金属、硫化物、セレン化物または窒化物から選択される請求項１７記載の検出システム。
  19. 前記移動可能な光結合器が、前記光結合器が特定の向きで前記アダプター部位に位置できるような特性を備える請求項１記載の検出システム。
  20. 前記移動可能な光結合器が磁性粒子である請求項１記載の検出システム。
  21. 前記移動可能な光結合器の表面の１つまたはそれ以上の領域が修飾される請求項１記載の検出システム。
  22. 前記移動可能な光結合器の表面の１つの領域が修飾される請求項２１記載の検出システム。
  23. 前記移動可能な光結合器の表面の修飾された領域が、前記移動可能な光結合器の表面の約１０から９０％である請求項２２記載の検出システム。
  24. 前記移動可能な光結合器の表面の２つの領域が修飾される請求項２１記載の検出システム。
  25. 前記修飾が化学修飾を含む請求項２１記載の検出システム。
  26. 前記化学修飾が、疎水基または親水基から選択される官能基を用いた修飾である請求項２５記載の検出システム。
  27. 前記親水基が荷電基である請求項２６記載の検出システム。
  28. 前記化学修飾がリガンド配位基を用いた修飾である請求項２５記載の検出システム。
  29. 前記化学修飾がポリマーを用いたコーティングである請求項２５記載の検出システム。
  30. 前記化学修飾が磁性材料を用いた修飾である請求項２５記載の検出システム。
  31. 前記移動可能な光結合器が、前記アダプター部位に対する親和性を有する表面修飾の領域を含む請求項２１記載の検出システム。
  32. 前記移動可能な光結合器が、前記アダプター部位に反発する（repelled）表面修飾の領域を含む請求項２１記載の検出システム。
  33. 前記移動可能な光結合器がオリゴヌクレオチドで修飾される請求項２１記載の検出システム。
  34. １分子対象物を検出する方法であって、
    ａ）光源からの入射光を導波路に導入し、これにより前記導波路中に励起光を形成させる工程、
    ｂ）移動可能な光結合器上に１分子対象物を局在化させる工程、
    ｃ）（ｂ）記載の前記移動可能な光結合器を、前記導波路の少なくとも第１のクラッド層中に形成される移動可能な光結合器のためのアダプター部位に局在化させる工程、および
    ｄ）前記移動可能な光結合器上に局在化された前記１分子対象物を前記励起光によって励起し、前記１分子対象物に光検出器により検出される光を放射させる工程、
    を含む方法であって、
    前記移動可能な光結合器が、前記アダプター部位内の前記コア層に隣接するその表面の少なくとも一部に標的分子を担持でき、および、前記標的分子を前記アダプター部位に特定の向きで局在化させることができ、前記移動可能な光結合器が、前記第１のクラッド層の屈折率よりも大きい屈折率を有し、かつ前記移動可能な光結合器の屈折率が前記コア層の屈折率と実質的に同じまたは等しい方法。
  35. １分子対象物を検出する方法であって、
    ａ）ｉ）移動可能な光結合器、
    ii）コア層および第１のクラッド層を含む導波路であって、前記移動可能な光結合器のための少なくとも１つのアダプター部位が少なくとも前記第１のクラッド層中に形成されている導波路、
    ならびに
    iii）光検出器、
    を含む検出装置を提供する工程、
    ｂ）１分子対象物を結合させることのできる少なくとも１つの結合部位を提供する工程、
    ｃ）前記少なくとも１つの結合部位を前記移動可能な光結合器上に個々に局在化させる工程、
    ｄ）前記移動可能な光結合器上に局在化された前記少なくとも１つの結合部位に、１分子対象物分子を提供する工程、
    ｅ）前記少なくとも１つの結合部位および１分子対象物がその上に局在化されている前記移動可能な光結合器を、前記アダプター部位に局在化させる工程、
    ｆ）光源からの入射光を前記導波路に導入し、これにより前記導波路中に励起光を形成する工程、
    ｈ）前記移動可能な光結合器上に局在化された前記少なくとも１つの結合部位に結合した前記１分子対象物分子を前記励起光により励起して、前記１分子対象物に光検出器により検出される光を放射させる工程、
    を含む方法であって、
    前記移動可能な光結合器が、前記アダプター部位内の前記コア層に隣接するその表面の少なくとも一部に標的分子を担持でき、および、前記標的分子を前記アダプター部位に特定の向きで局在化させることができ、前記移動可能な光結合器が、前記第１のクラッド層の屈折率よりも大きい屈折率を有し、かつ前記移動可能な光結合器の屈折率が前記コア層の屈折率と実質的に同じまたは等しい方法。
  36. 核酸をシークエンシングする方法であって、
    ａ）ｉ）移動可能な光結合器、
    ii）コア層および第１のクラッド層を含む導波路であって、前記移動可能な光結合器のための少なくとも１つのアダプター部位が少なくとも前記第１のクラッド層中に形成されている導波路、
    ならびに
    iii）光検出器、
    を含む検出装置を提供する工程、
    ｂ）少なくとも１つの核酸分子を提供する工程、
    ｃ）前記移動可能な光結合器上に前記少なくとも１つの核酸分子を個々に局在化させる工程、
    ｄ）前記少なくとも１つの核酸分子がその上に局在化されている前記移動可能な光結合器を前記アダプター部位に局在化させる工程、
    ｅ）前記少なくとも１つの核酸分子の合成による１分子シークエンシングを行う工程であって、合成による前記１分子核酸のシークエンシングが、前記核酸中の少なくとも１つの塩基のアイデンティティに相関する放射光を産生する工程、
    ｆ）前記検出器を用いて前記放射光を検出することにより、出力信号を得る工程、ならびに
    ｇ）前記出力信号を処理して、前記核酸に含まれる少なくとも１つの塩基のアイデンティティを決定する工程、
    を含む方法であって、
    前記移動可能な光結合器が、前記アダプター部位内の前記コア層に隣接するその表面の少なくとも一部に標的分子を担持でき、および、前記標的分子を前記アダプター部位に特定の向きで局在化させることができ、前記移動可能な光結合器が、前記第１のクラッド層の屈折率よりも大きい屈折率を有し、かつ前記移動可能な光結合器の屈折率が前記コア層の屈折率と実質的に同じまたは等しい方法。
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