KR20120030116A - 단일-분자 검출 시스템 및 방법 - Google Patents

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Abstract

단일-분자 검출 시스템 및 단일-분자 개체를 검출하거나 핵산을 시퀀싱하는 방법들이 제공된다. 단일-분자 검출 시스템은 이동식 광 커플러(100), 도파관(110) 및 광 검출기(102)를 포함한다. 도파관(110)은 코어층(112) 및 제1 클래딩층(114)을 포함하며, 이동식 광 커플러(100)에 대한 적어도 하나의 어댑터 사이트(104)가 적어도 제1 클래딩층(114) 내에 형성된다. 검출 시스템은 단일-분자 개체를 검출하거나 핵산을 시퀀싱하는데 사용된다.

Description

단일-분자 검출 시스템 및 방법{SINGLE-MOLECULE DETECTION SYSTEM AND METHODS}
본 발명은 단일-분자 검출 시스템 및 상기 검출 시스템을 사용하여 개체를 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이동식 광 커플러, 도파관 및 광 검출기를 포함하는 검출 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단일-분자 검출 시스템에 샘플을 로딩하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 단일-분자 핵산 시퀀싱 방법을 포함하는 단일-분자 검출 방법에 관한 것이다.
종래의 화학적 또는 생화학적 분석은 대부분 "벌크" 측정을 기반으로 한다. 이러한 측정에 있어서, 샘플(sample) 용액의 일정한 체적 내에서 복수의 분자들의 집단적인 행동은 상기 분자들의 특성들을 알아내도록 측정된다. 그러나, 많은 경우에 있어서, 벌크 측정 접근 방법은 샘플 부피가 너무 작거나, 표적 분자의 농도가 너무 낮아 기존 기술로는 표적 분자들의 검출에의 감도가 한계가 있는 경우와 같을 때는 활용될 수 없다. 근래 들어, 단일 분자들의 검출이 가능하게 되었다. 단일 분자 검출은 보다 높은 감도를 제공하며, 종래의 벌크 측정에 비하여 보다 상세한 정보를 제공한다. 단일 분자 계기 감도도 Qiu H. 등의 "사이토킨(cytokines) 및 케모킨(chemokines)의 고감도 검출을 위한 형광성 단일 분자 계측 분석"(임상화학 53(11): 2010-2012(2007))에 기재된 바와 같이 고감도 생화학적 분자 검출 및 진단에 새로운 기회들을 부여한다.
단일 분자 검출을 구현하기 위한 접근 방법에 대해서는, Moemer W.E와 Fromm D.P의 "검토 논문; 단일 분자 형광 분광법 및 현미경 관찰법"(과학 계기 리뷰 74(8): 3597-3619(2003))와 Walter N.G 등의 "직접제작 안내: 최신 단일 분자 도구 세트를 어떻게 사용하는 가"(NATURE METHODS:475-489(2008))에 제공되어 있다. 이러한 리뷰들은 단일 분자 검출을 위해 사용되어 왔거나 제안되어 왔던 종래에 알려진 방법들과 장치들에 대해서도 논의하고 있다.
단일 분자 검출을 위한 최적화된 시스템들과 방법들은 DNA 염기서열 분석 기술을 촉진시키는 대단한 잠재성을 가진다. 인간 게놈 프로젝트(HGP)는 DNA 염기서열 분석 효율의 커다란 증가에 박차를 가하고 있다. 기술적 개선에 수반하는 이와 같은 증가는 염기서열 분석 비용에 대응되는 감소를 가져온다. 첫 번째 게놈에 대한 염기서열 분석을 완료하는 데 13년의 기간과 거의 300억 달러의 비용이 요구되었지만, DNA 염기서열 분석 기술들은 궁극적으로 통상적인 임상 치료(McGuire 등의 사이언스 317:1687(2007))에 없어서는 안 될 요소로서 개인 유전체 분석을 위해 충분하게 감당하게 될 수 있을 것으로 예상되고 있다. 사람의 게놈들은 환자들과 의료 서비스 제공자들 모두를 위한 의료에서 패러다임 전환(paradigm shift)을 의미한다. 질병에 대한 유전적 위험 요소들을 관리함에 의해, 의료 서비스 제공자들은 보다 신속하게 예방 약품을 처방하고 고객의 수요에 맞춘 처방을 제공할 수 있다. 거대한 완성된 게놈 은행에 의해, 의약 설계와 관리가 보다 효율적이 될 수 있으며, 이에 따라 게놈약학(pharmacogenomics)의 초기 분야를 촉진시킨다. 그러나, 이러한 촉진은 철저하고, 고효율이며 저비용인 DNA 염기서열 분석 기술들에 의존하게 된다.
단일 분자 검출을 구현하기 위하여, 광학 시스템은 복잡한 환경에서 관심의 대상이 되는 분자를 선택적으로 자극할 수 있어야 하고, 배경 노이즈로부터의 간섭을 피할 수 있어야 하며, 단일 분자로부터 발생되는 약한 광을 검출할 수 있어야 한다. 단일 분자 검출을 구현하기 위한 접근 방법들 중 하나는 관심의 대상이 되는 분자를 하나의 분자로부터 방출되는 광을 용이하게 검출할 수 있는 한정된 공간 내에 위치시키는 것이다. 미국 특허 6,917,726에는 한정된 여기 광 필드가 생성되는 나노 크기의 웰들(wells)을 이용하여 단일 분자들을 용이하게 검출할 수 있는 제로-모드 웨이브 가이드(ZMW)를 구비하는 현미경 시스템이 개시되어 있다. 이러한 나노 웰들 내의 분자들의 배치와 이에 따른 한정된 여기 광 필드는 노이즈를 상당히 최소화하며, 이에 따라 단일 분자로부터 방출되는 광에 대한 검출력을 향상시킨다. 또한, 예를 들면, 미국 특허 6,917,726, 미국 특허 7,170,050 및 미국 특허 7,468,865도 참조가 된다. 그러나, 상기 여기 광 필드 내로의 단일 분자 샘플의 로딩에는 상기 나노 웰들 내의 제로-모드 웨이브 가이드(ZMW)의 바닥에 상기 분자들을 부착이 요구되며, 이는 어렵고 비효율적이다(Eid 등의 사이언스 323:133-138(2009)). 하나의 단일 분자 샘플을 함유하는 웰들만이 유용한 반면, 비어있는 웰들이나 다중 단일 분자 샘플들을 포함하는 웰들은 그렇지 않다.
미국 공개 특허 2010/0009872에는 높은 성공률을 갖는 개선된 샘플 로딩 방법들이 개시되어 있다. 이와 같은 방법들은 단일 분자를 나노 웰의 상단 개구로 이송하고 샘플을 상기 웰의 바닥으로 배분하는 데 나노 사이즈 파티클을 활용한다. 그러나, 이러한 과정에는 단일 분자 샘플을 나노 파티클 운반체로부터 상기 웰의 바닥으로 전달하는 데 많은 단계들과 화학적 반응들이 수반된다. 또한, 로딩된 웰들은 재사용하기 불가능하거나 어렵게 된다.
국제 공개 특허 WO 2009/017678에는 원형의 핵산 템플릿(template)을 반복적으로 배열 순서를 규명하도록 단일 중합효소(polymerase)가 표면상에 고정되어, 단일 분자 배열순서 결정의 정확성을 향상시킬 수 있는 단일 분자 핵산 배열순서 결정 방법이 개시되어 있다. 단일 분자 배열순서 결정을 광학적으로 검출하는 방법에 있어서, 표면상의 직접적인 반응물들의 고정은 제토리터(zeptoliter) 체적 내로 반응들을 제한한다. 그러나, 상기 표면상으로의 효소 또는 핵산의 단일 분자의 결합의 어려움으로 고효율의 이용에 한계가 있다. 또한, 중합효소가 상기 표면상에 직접적으로 고정되는 배열순서 결정 반응은 배열순서 결정 분석의 완료를 방지하도록 상기 중합효소가 그 활성을 상실하면 언제든지 종료하게 된다. 분자 또는 효소를 위치에 고정하기 위하여, WO 2009/017678에 기재되어 있는 바와 같이, 표면의 영역이 잘 정의되어야 하며, 이러한 영역의 화학적 특성이 정확하게 조절되어야 한다. 이는 장치 제조의 곤란성을 야기하고 비용의 증가를 초래한다.
따라서, 단일 분자 대상체들을 검출하기 위한 개선된 시스템들 및 방법들이 요구된다.
본 발명의 목적은 단일-분자와 같은 개체를 검출하는 검출 시스템 및 상기 검출 시스템을 이용한 검출 방법들을 제공하는 것이다.
단일-분자 개체와 같은 개체를 검출하는 시스템이 제공된다. 상기 검출 시스템은 이동식 광 커플러, 광 검출기, 및 코어층, 제1 클래딩층 및 적어도 상기 제1 클래딩층 내에 형성된 상기 이동식 광 커플러를 위한 적어도 하나의 어댑터 사이트를 포함하는 도파관을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 검출 시스템은 광원을 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 개체를 적어도 상기 도파관의 상기 제1 클래딩층 내에 형성된 상기 적어도 하나의 어댑터 사이트에 위치시킬 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러에 대한 상기 어댑터 사이트는 나노웰이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 나노-스케일 입자이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 나노-스케일 스피어이다.
추가적으로, 단일-분자 개체를 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 a) 광원으로부터 입사광을 도파관 내부로 도입하여 상기 도파관 내에 여기광을 형성하는 단계, b) 단일-분자 개체를 이동식 광 커플러 상에 위치시키는 단계, c) (b)의 상기 이동식 광 커플러를 적어도 상기 도파관의 제1 클래딩층 내에 형성된 이동식 광 커플러를 위한 어댑터 사이트에 위치시키는 단계, 및 d) 상기 여기광에 의해 상기 이동식 광 커플러 상에 위치된 단일-분자 개체를 여기시켜 상기 단일-분자 개체가 광 검출기에 의해 검출되도록 광을 방사하도록 유도하는 단계를 포함한다.
단일-분자 개체를 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 a) (i) 이동식 광 커플러, (ii) 코어층 및 제1 클래딩 층을 포함하며, 상기 이동식 광 커플러에 대한 적어도 하나의 어댑터 사이트가 적어도 상기 제1 클래딩층 내에 형성된 도파관, 및 (iii) 광 검출기를 포함하는 검출 장치를 제공하는 단계; b) 단일-분자 개체에 결합가능한 적어도 하나의 결합 잔기를 제공하는 단계; c) 상기 적어도 하나의 결합 잔기를 개별적으로 상기 이동식 광 커플러의 표면 상에 위치시키는 단계; d) 상기 이동식 커플러 상에 위치된 하나의 결합 잔기에 단일-분자 개체 샘플을 제공하는 단계; e) 상기 적어도 하나의 결합 잔기 및 단일-분자 개체가 위치된 상기 이동식 광 커플러를 상기 어댑터 사이트에 위치시키는 단계; f) 광원으로부터 입사광을 상기 도파관 내부로 도입하여 상기 도파관 내에서 여기광을 형성하는 단계; 및 g) 상기 여기광에 의해, 상기 이동식 광 커플러 상에 위치된 상기 적어도 하나의 결합 잔기에 결합된 단일-분자 개체를 여기시켜 상기 단일-분자 개체가 광 검출기에 의해 검출될 수 있는 광을 방사하도록 유도하는 단계를 포함한다.
핵산을 시퀀싱하는 방법에 제공된다. 상기 방법은 a) (i) 이동식 광 커플러, (ii) 코어층 및 제1 클래딩 층을 포함하며, 상기 이동식 광 커플러에 대한 적어도 하나의 어댑터 사이트가 적어도 상기 제1 클래딩층 내에 형성된 도파관, 및 (iii) 광 검출기를 포함하는 검출 장치를 제공하는 단계; b) 적어도 하나의 핵산 분자를 제공하는 단계; c) 상기 적어도 하나의 핵산 분자를 개별적으로 상기 이동식 광 커플러 상에 위치시키는 단계; d) 적어도 하나의 핵산 분자가 위치된 상기 이동식 광 커플러를 상기 어댑터 사이트에 위치시키는 단계; e) 상기 적어도 하나의 핵산 분자의 단일 분자 합성에 의한 시퀀싱(sequencing-by-synthesis)을 수행하는 단계, 상기 단일 분자 핵산 합성에 의한 시퀀싱은 상기 핵산 내의 적어도 하나의 염기의 동일성과 상호연관된 방출광을 생성한다; f) 상기 방출광을 상기 검출기로 검출하여 출력 신호를 생성하는 단계; 및 g) 상기 출력 신호를 처리하여 상기 핵산에 포함되는 적어도 하나의 염기의 동일성을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점들은 부분적으로는 하기의 상세한 설명에서 설명될 것이며, 부분적으로는 상기 상세한 설명으로부터 명백히 이해되거나 실시예들의 실행에 의해 이해될 수 있을 것이다. 본 발명의 목적들 및 이점들은 첨부되는 청구항들에서 구체적으로 지시되는 구성요소들 및 결합관계의 수단에 이해 실현되고 획득될 수 있을 것이다.
전술한 일반적인 설명 및 하기의 상세한 설명은 모두 예시적인 것이며 청구되는 실시예들의 범위를 제한하는 것이 아님을 이해해야 한다.
본 출원 명세서에 병합되어 일부를 구성하는 첨부 도면들은 상세한 설명과 결합되어 본 발명의 일부 실시예들을 도시하며 이에 대한 주요 원칙들을 설명하기 위해 제공된다.
본 출원은 적어도 하나의 컬러로 표시된 도면을 포함한다. 상기의 컬러 도면들의 복사본은 미국특허상표청에 적절한 비용과 함께 청구할 경우 제공받을 수 있다.
도 1은 예시적인 실시예들에 따른 검출 시스템의 개략도이다.
도 2는 일부 실시예들에 있어서 검출 시스템을 나타내는 두 개략적인 도면들이다.
도 3은 예시적인 실시예들에 따른 상이한 어댑터 사이트 디자인들을 나타내는 개략도이다.
도 4는 예시적인 실시예들에 따른 검출 시스템을 나타내는 개략도이다.
도 5는 일부 실시예들에 있어서 이동식 광 커플러 및 표면 변형된 도파관 어댑터 사이트를 나타내는 개략도이다.
도 6은 일부 실시예들에 있어서 이동식 광 커플러 및 표면 변형된 도파관 어댑터 사이트를 나타내는 개략도이다.
도 7은 자기장에 의해 특정한 배향으로 어댑터 사이트를 향해 배향된 이동식 광 커플러를 갖는 예시적인 검출 시스템의 개략도이다.
도 8은 단일-가닥 원형 표적 핵산을 생산하는 예시적인 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 9는 표면 상에 핵산-합성 반응 착물이 위치된 예시적인 이동식 광 커플러를 나타내는 개략도이다.
도 10은 표면 상에 핵산-합성 반응 착물이 위치된 예시적인 이동식 광 커플러를 나타내는 개략도이다.
도 11은 표면 상에 핵산-합성 반응 착물이 위치된 예시적인 이동식 광 커플러를 나타내는 개략도이다.
도 12는 이중-가닥 원형 표적 핵산을 생산하는 예시적인 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 13은 이동식 광 커플러의 표면 상에 위치된, 변성된 이중-가닥 원형 표적 핵산을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 14는 입사 여기광 파동에 의해 생성되는 정상 전자기장의 시뮬레이션에 사용되는 예시적인 검출 시스템 배열을 나타내는 개략도이다.
도 15는 시뮬레이션된 검출 시스템에 대한 계산된 정상 TE-모드 전기장의 등고선 지도이다.
도 16은 시뮬레이션된 검출 시스템에 대한 계산된 정상 TM-모드 전기장의 등고선 지도이다.
도 17은 시뮬레이션된 검출 시스템에 대한 계산된 정상 자기장의 등고선 지도이다.
도 18, 도 19 및 도 20은 각각 나노웰이 코어층 내부로 연장하지 않는 배열, 코어층 내부로 부분적으로 연장하는 배열 및 코어층 내부로 완전히 연장하는 배열의 검출 시스템 내에서 입사 여기광 파동에 의해 생성된 정강상 전자기장의 등고선 지도들이다.
도 21은 입사 여기광 파동에 의해 생성되는 정상 전자기장의 시뮬레이션에 사용되는 예시적인 검출 시스템 배열을 나타내는 개략도이다.
도 22는 시뮬레이션된 검출 시스템에 대한 계산된 정상 전기장의 등고선 지도이다.
도 23은 시뮬레이션된 검출 시스템에 대한 계산된 정상 전기장의 등고선 지도이다.
도 24는 시뮬레이션된 검출 시스템에 대한 계산된 정상 전기장의 등고선 지도이다.
실시예들은 검출 시스템 및 단일-분자 개체와 같은 개체를 검출하기 위해 상기 검출 시스템을 사용하는 방법을 포함한다. 상기 검출 시스템은 상기 개체로부터 방출되는 약한 광을 검출할 수 있다.
단일-분자를 검출하기 위해서, 광학 시스템은 복잡한 환경에서 관심대상인 분자를 선택적으로 여기시킬 수 있어야 하고, 배경 노이즈로부터의 간섭을 회피하고 상기 단일-분자로부터 방출되는 약한 광을 검출할 수 있어야 한다. 단일-분자를 검출하기 위해서, 또한 일 실시예에 있어서, 시스템은 적어도 다음의 두 기준을 충족시킬 수 있다: 1) 한정된 여기 공간 및 한정된 관측 공간을 가져야 하며. 2) 상기의 한정된 여기 공간 및 한정된 관측 공간은 완전히 혹은 부분적으로 중첩되며, 중첩된 영역은 표적 단일 분자로부터 방출된 광이 배경보다 높아 검출 가능한 신호-대-노이즈 비율(signal-to-noise ratio: SNR)을 제공할 수 있도록 충분히 작아야 한다. 예를 들면, 상기 중첩된 영역의 부피는 펨토리터 단위이거나 이보다 더 작을 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 중첩된 영역의 부피는 아토리터 내지 젭토리터 범위일 수 있다. 또한, 여기광이 검출기에 도달하는 것을 방지하는 것이 중요할 수 있다.
실시예들에 의하면, 단일-분자 샘플을 도파관(waveguide) 내에 형성된 이동식 광 커플러에 대한 어댑터 사이트로 운반하는 상기 이동식 광 커플러를 사용함으로써 단일-분자 샘플을 검출 시스템에 로딩함에 있어 곤란성을 극복할 수 있다. 단일 분자 검출에 적합한 한정된 공간이 상기 이동식 광 커플러가 상기 어댑터 사이트에 도킹된 이후 형성될 수 있다. 상기 이동식 광 커플러 및 어댑터 사이트의 디자인은 제2 커플러가 동일한 어댑터 사이트에 도킹하는 것을 방지할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 예를 들면 효소와 같은 상기 단일 분자 샘플은 상기 커플러가 상기 도파관에 도입되기 전에 상기 커플러에 로딩될 수 있으며, 일 실시예에 있어서, 모든 혹은 로딩된 커플러의 샘플은 예비-스크린되어 각 커플러가 오직 하나의 샘플 분자를 운반하는 것을 보장할 수 있다. 샘플 분자들은 상기 광 커플러들과 연관되어 유지될 수 있으므로, 검출 이후 상기 커플러들을 제거하거나 배출함으로써 장치를 재사용할 수 있다. 상기 샘플 분자는 상기 커플러에 의해 운반되므로, 상기 샘플 분자를 도파관 표면에 직접적으로 연결시키기 위해 상기 도파관 표면을 변형시킬 필요가 없다. 따라서 장치 제조를 단순화할 수 있다.
단일-분자 개체와 같은 개체를 검출하는 시스템이 제공되며, 상기 검출 시스템은 이동식 광 커플러, 광 검출기, 및 코어층, 제1 클래딩층(cladding layer) 및 적어도 제1 클래딩층 내에 형성된 상기 이동식 광 커플러에 대한 적어도 하나의 어댑터 사이트를 포함하는 도파관을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 상기 도파관의 적어도 상기 제1 클래딩 층 내에 형성된 상기 적어도 하나의 어댑터 사이트로 개체를 위치시킨다. 따라서 검출되는 상기 개체를 한정된 여기 공간 및 한정된 관측 공간이 중첩하는 공간, 즉 이동식 광 커플러가 어댑터 사이트로 도킹됨으로써 형성되는 단일-분자 검출에 적합한 한정된 공간 내부로 위치시킬 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 나노-스케일 입자이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 나노-스케일 스피어(sphere)이다.
본 출원에서 사용되는 용어 "한정된 여기 공간(confined excitation space)", "여기 공간" 및 "여기 존(zone)"들은 모두 형광단(fluorophore) 혹은 다른 광-방출 개체가 진입시 여기되어 광을 방출하는 공간을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "관측 공간(observable space)" 및 "한정된 관측 공간"은 상기 공간 내에 위치된 형광단 혹은 다른 광-방출 개체에 의해 방출된 광이 검출기에 의해 검출될 수 있는 공간을 지칭한다.
본 출원에 사용되는 용어 "단일-분자 검출에 적합한 한정된 공간"은 여기 공간 및 관측 공간이 중첩하는 공간을 지칭하기 위해 사용된다. 단일-분자 광 방출 개체가 상기의 중첩된 공간 내에 위치되는 경우, 상기 개체는 검출기에 의해 검출될 수 있다.
본 출원에 사용되는 용어 "이동식 광 커플러(movable light coupler)"는 예를 들면, 광의 강도 필드 분포 형상, 광의 이동 방향 및 광의 파장을 포함하는 여기 광의 행동을 변경할 수 있는 이동가능한 개체를 지칭한다.
본 출원에 사용된 용어 "어댑터 사이트(adapter site)"는 이동식 광 커플러를 수용할 수 있는 공간을 지칭한다.
이동식 광 커플러 및 어댑터 사이트와 관련하여 사용되는 용어 "도킹(docking)"은 어댑터 사이트 내부에 이동식 광 커플러가 장착되어, 단일-분자 검출에 적합한 한정된 공간 형성을 촉진하는 것을 지칭한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 여기 광에 대해 불투명하여, 단일-분자 검출에 적합한 상기 한정된 공간은 상기 도파관으로부터의 상기 여기 광이 벌크(bulk) 공간으로 퍼지는 것을 방지하는 상기 이동식 광 커플러에 의해 형성된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 여기광을 반사시킬 수 있는 표면을 가지며, 따라서 단일-분자 검출에 적합한 상기 한정된 공간은 상기 이동식 광 커플러가 여기 광을 상기 도파관을 향해 반사시키는 영역 내에 형성된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 여기 광에 대해 투명하거나 부분적으로 투명하며, 상기 이동식 광 커플러가 상기 도파관의 적어도 상기 제1 클래딩층 내에 형성된 상기 어댑터 사이트로 위치되면 여기 존이 상기 도파관의 상기 코어층을 따라 전파되며 상기 이동식 광 커플러에 커플링되는 광 파장으로부터 상기 이동식 광 커플러의 표면 주위에 형성될 수 있다. 여기서, 단일-분자 검출에 적합한 한정된 공간은 상기 이동식 광 커플러 및 상기 어댑터 사이트 사이의 공간 내에 형성된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러의 굴절률은 광 커플링 레벨을 증진시키기 위해 선택된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 여기 광에 대해 투명 혹은 부분적으로 투명하며, 상기 이동식 광 커플러가 상기 도파관의 적어도 상기 제1 클래딩층 내에 형성된 상기 어댑터 사이트에 위치되면 여기 존이 상기 도파관의 상기 코어층을 따라 전파되며 상기 이동식 광 커플러에 커플링되는 광 파장으로부터 상기 이동식 광 커플러의 표면 주위에 형성될 수 있다. 이에 따라, 단일-분자 검출에 적합한 한정된 공간이 상기 이동식 광 커플러의 표면 주위에 생성된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 상기 도파관으로부터 제1 여기 광을 흡수하여 제2 여기 광을 방출할 수 있다.
단일-분자 개체를 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 a) 광원으로부터 입사광을 도파관 내부로 도입하여 상기 도파관 내에 여기광을 형성하는 단계, b) 단일-분자 개체를 이동식 광 커플러 표면 상에 위치시키는 단계, c) (b)의 상기 이동식 광 커플러를 상기 도파관의 적어도 제1 클래딩층 내에 형성된 이동식 광 커플러를 위한 어댑터 사이트에 위치시키는 단계, 및 d) 상기 여기광에 의해 상기 이동식 광 커플러 상에 위치된 단일-분자 개체를 여기시켜 상기 단일-분자 개체가 광 검출기에 의해 검출되도록 광을 방사하도록 유도하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러를 상기 도파관의 적어도 제1 클래딩층 내에 형성된 이동식 광 커플러를 위한 어댑터 사이트에 위치시킴으로써 단일-분자 검출에 적합한 한정된 공간이 형성된다.
일부 실시예들에 있어서, 단일-분자 개체를 검출하는 방법은 이동식 광 커플러를 특정한 배향으로 어댑터 사이트에 위치시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 이동식 광 커플러를 자기장에 의해 특정한 배향으로 어댑터 사이트에 위치시키는 단계를 포함한다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 어댑터 사이트를 가로지르는 전기 포텐셜을 적용함으로써 특정한 배향으로 상기 어댑터 사이트에 위치된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는광 커플러의 표면을 끌어들이거나 밀어내는 광 커플러 어댑터 사이트에서 일 이상의 표면 변형을 도입함으로써 특정한 배향으로 어댑터 사이트에 위치된다.
단일-분자 개체를 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 a) (i) 이동식 광 커플러, (ii) 코어층 및 제1 클래딩 층을 포함하며, 상기 이동식 광 커플러에 대한 적어도 하나의 어댑터 사이트가 적어도 상기 제1 클래딩층 내에 형성된 도파관, 및 (iii) 광 검출기를 포함하는 검출 장치를 제공하는 단계; b) 단일-분자 개체에 결합가능한 적어도 하나의 결합 잔기를 제공하는 단계; c) 상기 적어도 하나의 결합 잔기를 개별적으로 상기 이동식 광 커플러의 표면 상에 위치시키는 단계; d) 상기 이동식 커플러 상에 위치된 하나의 결합 잔기에 단일-분자 개체 샘플을 제공하는 단계; e) 상기 적어도 하나의 결합 잔기 및 단일-분자 개체가 위치된 상기 이동식 광 커플러를 상기 어댑터 사이트에 위치시키는 단계; f) 광원으로부터 입사광을 상기 도파관 내부로 도입하여 상기 도파관 내에서 여기광을 형성하는 단계; 및 g) 상기 여기광에 의해, 상기 이동식 광 커플러 상에 위치된 상기 적어도 하나의 결합 잔기에 결합된 단일-분자 개체를 여기시켜 상기 단일-분자 개체가 광 검출기에 의해 검출될 수 있는 광을 방사하도록 유도하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 결합 잔기 및 단일-분자 개체가 위치된 이동식 광 커플러가 어댑터 사이트에 위치되면 단일-분자 검출에 적합한 한정된 공간이 생성되고, 검출되는 상기 단일-분자 개체는 상기 한정된 공간 내에 위치된다.
핵산을 시퀀싱하는 방법에 제공된다. 상기 방법은 a) (i) 이동식 광 커플러, (ii) 코어층 및 제1 클래딩 층을 포함하며, 상기 이동식 광 커플러에 대한 적어도 하나의 어댑터 사이트가 적어도 상기 제1 클래딩층 내에 형성된 도파관, 및 (iii) 광 검출기를 포함하는 검출 장치를 제공하는 단계; b) 적어도 하나의 핵산 분자를 제공하는 단계; c) 상기 적어도 하나의 핵산 분자를 개별적으로 상기 이동식 광 커플러 상에 위치시키는 단계; d) 적어도 하나의 핵산 분자가 위치된 상기 이동식 광 커플러를 상기 어댑터 사이트에 위치시키는 단계; e) 상기 적어도 하나의 핵산 분자의 단일 분자 합성에 의한 시퀀싱(sequencing-by-synthesis)을 수행하는 단계, 상기 단일 분자 핵산 합성에 의한 시퀀싱은 상기 핵산 내의 적어도 하나의 염기의 동일성과 상호연관된 방출광을 생성한다; f) 상기 방출광을 상기 검출기로 검출하여 출력 신호를 생성하는 단계; 및 g) 상기 출력 신호를 처리하여 상기 핵산에 포함되는 적어도 하나의 염기의 동일성을 결정하는 단계를 포함한다.
검출 시스템은 핵산 혼성화 또는 예를 들면, 전체-게놈 시퀀싱, 전사 프로파일링, 비교 전사 프로파일링 혹은 유전자 식별을 위한 시퀀싱을 포함하는 생분자 검출의 방법 및 공정들을 위한 시스템의 일부로서 사용될 수 있다. 또한 생분자 검출은, 예를 들면 단백질/단백질, 항체/항원, 리셉터/리간드 및 핵산/단백질 등의 결합 상호작용의 검출 및/또는 측정을 포함할 수 있다. 이러한 적용례들은 분석 혹은 진단 공정 및 방법들에 유용하다.
이하에서는 도면들을 참조로 실시예들에 대해 상세하게 설명할 것이다. 가능한 경우, 도면 전체적으로 동일한 참조 부호들이 동일한 또는 유사한 부분들을 언급하기 위해 사용될 것이다.
1. 검출 시스템
본 출원에 개시되는 검출 시스템은 단일-분자 개체와 같은 개체를 검출할 수 있다. 상기 개체는 형광 염색 분자, 인광 염색 분자, 양자점 혹은 발광 나노입자와 같은 발광원일 수 있다. 상기 개체는 또한 광-산란 입자일 수 있다. 추가적으로, 상기 개체는 발광 능력이 없는 표적 분자일 수 있으나, 광을 방출할 수 있는 라벨링(labeling) 개체(예를 들면, 형광 염색 분자, 인광 염색 분자 또는 양자점)에 부착될 수 있다. 특정한 라벨링 개체가 특정 표적 분자에 부착될 수 있다. 따라서, 상기 표적 분자는 상기 라벨링 개체를 통해 식별될 수 있다. 일 이상의 라벨링 개체가 하나의 표적 분자에 부착될 수 있다. 상기 개체는 발광 능력을 보유하지 않으며 순차적으로 광을 방출할 수 있는 복수의 라벨링 개체에 부착되는 표적 분자일 수 있다(예를 들면, FRET: 제1 파장의 광이 적어도 제1 여기 형광 분자로부터 방출되고 제2 형광 분자에 의해 적어도 부분적으로 흡수되고, 이어서 제2 광, 즉 제2 파장의 광을 방출)
1-1. 검출 시스템의 개괄
상기 검출 시스템은 이동식 광 커플러, 검출기 및 도파관을 포함할 수 있으며, 상기 도파관은 상기 이동식 광 커플러에 대한 어댑터 사이트를 포함한다.
상기 검출 시스템은 광을 방출하고 이어서 여기광이 개체를 여기시킬 때 상기 도파관 내부로 적어도 부분적으로 커플링되는 적어도 하나의 광원을 포함한다. 상기 광원은, 예를 들면 He-Ne 레이저 및 레이저 다이오드(LD)와 같은 레이저, 발광 다이오드(LED), 유기 발광 다이오드(OLED), 양자점 발광 다이오드(QLED), 광섬유 또는 아크 방출 형광 램프일 수 있다. 상기 검출 시스템은 광원 커플러를 포함할 수 있다. 상기 광원 커플러는 상기 적어도 하나의 광원으로부터 방출된 광의 적어도 일부를 상기 도파관 내부로 커플링할 수 있다. 상기 광원 커플러는, 예를 들면 프리즘 커플러, 격자 커플러, 측면-주입 커플러, 수직-주입 커플러 혹은 공-방향(co-directional) 커플러일 수 있다.
상기 도파관은 채널 도파관 혹은 평면 도파관일 수 있다. 상기 도파관은 코어층 혹은 적어도 하나의 클래딩층을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 도파관이 채널 도파관인 경우, 코어층과 상기 코어층을 둘러싸는 클래딩층을 포함할 수 있다. 다른 예로서, 상기 도파관이 평면 도파관인 경우, 코어층 및 상기 코어층 상에 배치되는 하나의 클래딩 층 혹은 상기 코어층을 샌드위칭하는 두 개의 클래딩층을 포함할 수 있다. 상기 코어층은 상기 적어도 하나의 클래딩층보다 높은 굴절률을 가질 수 있다. 여기광은 상기 도파관의 상기 코어층 내에서 전파될 수 있다. 상기 검출 시스템에 사용되기에 적합한 예시적인 도파관들 및 그 특징들은 미국 특허 출원 제12/720,352호(출원일: 2010. 3. 9), 미국 특허 출원 제12/801,503호(출원일: 2010. 6. 11) 및 미국 특허 출원 제12/805,411호(출원일: 2010. 7. 29)에 개시되어 있으며, 이들 문헌들은 본 출원에 참조로서 병합된다.
상기 검출 시스템은 이동식 광 커플러에 대한 적어도 하나의 어댑터 사이트를 구비하는 도파관을 포함한다. 상기 어댑터 사이트는 상기 도파관의 상기 적어도 하나의 클래딩층 내에 형성될 수 있다. 상기 어댑터 사이트는 상부 개구부 및 하부 표면을 포함하는 나노웰(nanowell)일 수 있으며, 상기 상부 개구부는 상기 하부 표면보다 넓거나 클 수 있다. 상기 나노웰은 상기 적어도 하나의 클래딩층의 부분 두께, 상기 적어도 하나의 클래딩 층의 총 두께, 상기 적어도 하나의 클래딩층의 총 두께와 상기 코어층의 부분 두께, 또는 상기 적어도 하나의 클래딩층의 총 두께와 상기 코어층의 총 두께를 통해 연장할 수 있다. 유효 여기 존의 하부 경계는 상기 나노웰의 하부일 수 있다. 상기 유효 여기 존의 상부 경계는 여기광이 상기 코어층의 종방향에 수직한 방향(이하에서는, 수직 방향으로 지칭함)으로 상기 나노웰 어댑터 사이트에 도달할 수 있는 거리에 의해 정의된다.
상기 검출 시스템의 실시예들은 단일-분자 개체를 상기 도파관의 상기 적어도 하나의 어댑터 사이트에 위치시킬 수 있는 이동식 광 커플러를 포함한다. 상기 이동식 광 커플러는 나노-스케일 입자일 수 있다. 상기 이동식 광 커플러는 나노-스케일 스피어 또는 비구형의 나노-스케일 입자일 수 있다. 이동식 광 커플러가 상기 도파관 내의 어댑터 사이트에 도킹되면, 단일-분자 검출에 적합한 한정된 여기 공간(유효 여기 공간)이 형성되며 검출되는 상기 개체는 상기 한정된 공간 내에 위치될 수 있다. 이동식 광 커플러가 어댑터 사이트에 도킹되면, 이는 제2 이동식 광 커플러가 동일한 어댑터 사이트에 도킹되는 것을 방지할 수 있다.
상기 이동식 광 커플러는, 예를 들면 표면 특성 혹은 도킹을 촉진하는 자기적 특성과 같이 상기 광 커플러가 상기 어댑터 사이트에 결합될 수 있는 적어도 하나의 특성을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 특정 배향으로 상기 적어도 하나의 어댑터 사이트에 위치되도록 하는 적어도 하나의 특성을 포함할 수 있다. 상기 광 커플러가 특정한 배향으로 상기 적어도 하나의 어댑터 사이트에 위치될 수 있도록 하는 적절한 특성들은 비대칭 표면 특성들을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 상기 어댑터 사이트 내의 상기 도파관의 코어층 표면에 인접한 한정된 공간 내에 단일-분자 개체를 위치시킬 수 있으며, 개체는 상기 도파관의 상기 코어층을 따라 전파하는 광 파동에 의해 유도되는 광 필드로부터 상기 어댑터 사이트 내에 형성된 유효 여기 존 내에 위치된다.
상기 도파관의 상기 코어층은 상기 도파관의 적어도 상기 제1 클래딩층보다 높은 굴절률을 가질 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 주변 용액 혹은 상기 도파관의 적어도 상기 제1 클래딩층의 물질의 굴절률과 실질적으로 유사한 굴절률을 갖는 물질로 형성될 수 있다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 상기 도파관의 적어도 상기 제1 클래딩층의 굴절률보다 큰 굴절률을 갖는 물질로 형성될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 상기 도파관의 상기 코어층과 실질적으로 유사하거나 동등한 굴절률을 갖는 물질로 형성될 수 있다. 일부 실시예들에 잇어서, 상기 광 커플러는 상기 코어층을 따라 전파하는 광 파동에 의해 유도되는 소산 광 필드(evanescent light filed)와 커플링될 수 있으며, 이에 따라 유효 여기 존이 상기 광 커플러 표면 주위에 형성된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 불투명하며 그 표면에 여기광을 한정시킬 수 있다. 이에 따라, 상기 도파관으로부터의 여기광이 벌크 공간으로 퍼지는 것을 차단하는 상기 이동식 광 커플러에 의해 단일-분자 검출에 적합한 한정된 공간이 형성된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 여기광을 반사시킬 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 상기 도파관에 의해 방출되는 여기광을 흡수할 수 있으며, 이어서 검출되는 분자들을 여기시킬 수 있는 광을 자체적으로 방출할 수 있다.
상기 검출 시스템의 도파관의 구성은 복수의 어댑터 사이트들을 포함할 수 있다. 그러므로, 상기 시스템은 다수의 개체들을 모니터링하는데 또한 사용될 수 있다.
상기 검출 시스템은 개체로부터 방출되는 광을 검출하는 광 검출기를 포함할 수 있다. 상기 광 검출기는 광학 센서를 포함할 수 있으며, 이는 입사되는 광을 적어도 부분적으로 흡수하여 상기 광에 응답하여 출력 신호들을 생성할 수 있다. 상기 광학 센서는, 예를 들면 p-n 포토다이오드, p-i-n 포토다이오드, 멀티-정션 포토다이오드, 애벌랜치 포토다이드(APD), 포토트랜지스터, 양자-웰 적외선 포토디텍터(QWIP), 광전도성 타입 광학 센서, 광전압 타입 광학 센서, 박막-온 ASIC(TFA), 금속-반도체-금속(MSM) 포토디텍터, 전하 결합 장치(charge coupled device, CCD), CMOS 센서 혹은 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 광 검출기는 상기 광 검출기의 동작을 제어하는 제어 회로를 포함한다. 상기 제어 회로는 신호 증폭기, A/D 컨버터, 적분기, 비교기, 로직 회로, 판독 회로, 메모리, 마이크로프로세서, 시계 및/또는 어드레스 회로를 포함할 수 있다.
상기 광 검출기는 개체로부터 방출된 광이 도달할 수 있는 장소에 배치될 수 있다. 예를 들면, 상기 광 검출기는 상기 어댑터 사이트에 대해 상기 코어층의 반대 측면에 배치될 수 있다. 즉, 상기 어댑터 사이트가 수직 방향으로 상기 코어층의 일측 상에 배치되면, 상기 광 검출기는 상기 수직 방향으로 상기 코어층의 타측 상에 배치될 수 있다. 상기 검출 시스템은 상기 코어층과 상기 검출기 사이에 적어도 하나의 필터를 더 포함할 수 있다.
예시적인 검출 시스템의 개략적인 도면이 도 1에 제공된다. 상기 검출 시스템은 이동식 광 커플러(100) 및 평면 도파관(110), 검출기(102) 및 이동식 광 커플러에 대한 어댑터 사이트(104)를 포함하는 집적된 구성을 포함할 수 있다. 상기 어댑터 사이트는 이동식 광 커플러(100) 및 주변 샘플 용액(120)에 접근가능하다. 도파관(110)은 코어층(112), 상부 클래딩층(114) 및 하부 클래딩층(116)을 포함할 수 있다. 평면 도파관(110)은 기판(도시되지 않음) 상에 형성될 수 있다. 광 검출기(102)는 상기 기판 상에 혹은 내부에 형성될 수 있다. 광원(130)은 광(135)을 방출할 수 있으며, 이는 광원 커플러(140)에 의해 평면 도파관(110) 내부로 적어도 부분적으로 커플링될 수 있다. 평면 도파관(110) 내부로 커플링된 광은 평면 도파관(110)의 상기 코어층을 따라 전파되며 여기광(145)으로 제공될 수 있다.
예시적인 검출 시스템의 개략적인 도면이 도 2에 각각 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 이동식 광 커플러(100)는 코어층(112) 물질의 굴절률보다 주변 샘플 용액(120) 또는 상기 도파관의 적어도 제1 클래딩층(114)의 굴절률에 가까운 굴절률을 갖는 물질로 형성될 수 있다. 이러한 실시예들에 있어서, 광원(도시되지 않음)으로부터 상기 도파관의 상기 코어층을 따라 전파되는 광 파동은 상기 어댑터 사이트 내의 상기 코어층의 표면에 근접한 소산 광 필드를 유도할 수 있다. 이에 따라, 상기 어댑터 사이트의 저부의 한정된 공간 내에 유효 여기 존(150)을 형성할 수 있다(좌측 도면). 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 상기 도파관의 적어도 상기 제1 클래딩층의 굴절률보다 크거나 및/또는 상기 도파관의 상기 코어층의 굴절률과 실질적으로 유사 혹은 동등한 굴절률을 갖는 물질로 형성될 수 있다. 이러한 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 광원(도시되지 않음)으로부터 상기 도파관의 상기 코어층을 따라 전파하는 광 파동에 의해 상기 어댑터 사이트 내의 상기 코어층 표면에 근접하여 유도되는 소산 광 필드를 커플링할 수 있으며, 이에 따라 상기 이동식 광 커플러와 상기 도파관의 상기 코어층 사이 및 상기 광 커플러의 표면 주위로 한정된 공간 내에 유효 여기 존(160)을 형성할 수 있다(우측 도면).
1-2. 검출 시스템의 구성
1-2-1. 도파관
도 1에 도시된 바와 같이, 일부 실시예들에 있어서, 평면 도파관(110)은 코어층(112), 상부 클래딩층(114) 및 하부 클래딩층(116)을 포함할 수 있다. 코어층(112)은 실리콘-티타늄 산화물(SiXTi1-XO2, 0 < X < 1), 티타늄 산화물, 탄탈륨 산화물, 니오븀 산화물, 하프늄 산화물, 알루미늄 산화물, 지르코늄 산화물, 실리콘 질화물, 알루미늄 질화물, 티타늄 질화물, 폴리카보네이트(PC), PMMA 또는 Su8 과 같은 굴절률 n2를 갖는 물질을 포함할 수 있다. 상부 및 하부 클래딩층들(114, 116)은 각각 굴절률 n3 및 n4의 물질들을 포함할 수 있다. 상부 및 하부 클래딩층들(114, 116)의 물질들을 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 상부 클래딩층(114) 혹은 하부 클래딩층(116)에 적합한 물질은, 예를 들면 실리콘 산화물, 마그네슘 불화물, 칼슘 불화물, 알루미늄 산화물, Su8, PMMA 또는 폴리카보네이트를 포함할 수 있다. 코어층(112)의 굴절률 n2는 상부 및 하부 클래딩층들(114, 116)의 굴절률들인 n3 및 n4 보다 큰 값을 가질 수 있다.
단일-분자 검출을 위해, 여기광이 상기 검출기에 도달하는 것을 방지할 필요가 있을 수 있다. 평면 도파관에 있어서, 상기 코어층의 표면은 원하는 것만큼 평활하지 않을 수 있다. 상기 코어층이 거친 표면을 갖는 경우 상기 여기광의 일부를 산란시킬 수 있다. 약 0.3nm의 표면 거칠기를 갖는 코어층에 있어서, 약 0.01%의 여기광이 산란되어 노이즈를 발생시킬 수 있다고 측정되어 왔다. 상기 코어층 내에서 전파되는 여기광의 표면 산란으로부터 발생하는 상기 노이즈를 감소시키기 위해, 여기광 필터가 상기 도파관 및 검출기 사이에 부가되어 상기 검출기에 도달하는 산란된 여기광의 양을 감소시킬 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 필터는 복층의 간섭 필터이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 필터는 여기광을 흡수할 수 있는 물질로 형성된 단일층이다.
일부 실시예들에 있어서, 보호층(들)이 상기 검출 시스템 내에 포함되어 산란된 여기광을 흡수 및/또는 상기 검출 시스템 외부의 주변광을 차단하여 신호-대-노이즈(S/N) 비율을 증가시킬 수 있다. 이는 미국 특허 출원 제12/801,503호(출원일: 2010. 6. 11) 및 미국 특허 출원 제12/805,411호(출원일: 2010. 7. 29)에 개시되어 있다. 보호층은 상부 클래딩층의 상부에 형성될 수 있으며, 및/또는 하부 보호층이 하부 클래딩층의 아래에 형성될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 보호층은 금속 혹은 합금과 같은 불투명 물질로 형성될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 핀홀(pinhile)이 상기 어댑터 사이트 아래 위치의 하부 보호층 내에 형성될 수 있다. 상기 어댑터 사이트의 상기 유효 여기 존 내의 개체로부터 방출된 광은 상기 핀홀을 통과하여 상기 하부 보호층 아래의 광 검출기에 의해 검출될 수 있다.
1-2-2. 어댑터 사이트
도 1 및 도 2에 예시된 바와 같이, 적어도 하나의 이동식 광 커플러 어댑터 사이트(104)가 상기 도파관의 적어도 상부 클래딩층(114) 내에 형성될 수 있다. 상기 어댑터 사이트는 나노웰일 수 있다. 상기 나노웰의 상부 개구부는 상기 나노웰의 하부보다 넓을 수 있다. 상기 나노웰의 형상은 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 나노웰의 수평 단면은 원, 타원, 직사각형, 정사각형 혹은 다이아몬드 형상을 가질 수 있다. 상기 나노웰 어댑터 사이트의 하부의 사이즈 역시 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 나노웰의 하부 사이즈는 대략 여기광의 파장보다 작을 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 나노웰의 하부 사이즈는 상기 여기광 파장의 약 1/2, 약 1/4 혹은 약 1/8 보다 작을 수 있다. 본 출원에 사용되는 용어"사이즈"는 상기 나노웰의 수평 단면이 원형, 타원형 혹은 직사각형을 갖는 경우 지름, 장축의 길이 혹은 긴 변의 길이룰 지칭할 수 있다. 상기 나노웰의 수평 단면이 정사각형 혹은 다이아몬드 형상을 갖는 경우, "사이즈"는 변의 길이를 지칭할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 나노웰의 상부 개구부의 길이(즉, 지름, 장축의 길이 혹은 긴 병의 길이)는 약 1 내지 약 10㎛ 일 수 있으며, 상기 나노웰의 하부 지름은 약 10 내지 약 500nm 일 수 있고, 상기 나노웰 측벽의 상기 나노웰의 하부에 수직한 방향에 대한 각도는 60도 보다 작을 수 있다. 이러한 형상은 단지 하나의 이동식 광 커플러가 상기 나노웰의 하부에 근접한 영역으로 진입할 수 있도록 보장한다.
도 1 및 도 2에 예시된 바와 같이, 여기광의 일부는 어댑터 사이트(104)에 진입하여, 어댑터 사이트(104)의 공간적 한정과 함께 상기 어댑터 사이트의 적어도 일부 내에 유효 여기 존(150)을 형성할 수 있다. 도 1의 참조 부호 150은 상기 유효 여기 존의 대략적인 상부 경계를 지칭함을 이해해야 한다. 개체가 유효 여기 존(150)으로 진입하면, 이는 여기광에 의해 여기되어 광 검출기(102)에 의해 검출되는 광을 방출할 수 있다. 유효 여기 존(150) 외부에서는, 개체가 상기 여기광에 의해 여기되지 않거나 이로부터 방출된 광이 상기 광 검출기에 도달할 수 없다. 도 1의 점선은 상기 유효 여기 존의 상부 경계의 형상을 제한하지 않음을 이해해야 한다. 예를 들면, 상기 유효 여기 존의 상부 경계는 곡선 형상일 수 있다.
상기 나노웰의 위치 및/또는 상기 도파관 내에서 연장하는 상기 나노웰의 깊이와 같은 상이한 조건들에 따라, 상이한 유효 여기 존이 형성될 수 있다. 추가적으로, 상기 유효 여기 존 내의 전자기장은, 예를 들면 소산장(evanescent filed), 소산장 및 이동장(travelling field)의 혼합 혹은 이동장일 수 있다. 이에 대해서는 하기에서 상세히 설명한다.
도 3은 서로 다른 나노웰 어댑터 사이트 디자인들의 예시적인 실시예들을 개략적으로 나타낸다. 일부 실시예들에 있어서, 나노웰 어댑터 사이트는 상기 상부 클래딩층의 두께에 대해 부분적으로 연장할 수 있다(A). 일부 실시예들에 있어서, 나노웰 어댑터 사이트는 상기 상부 클래딩층의 총 두께로 연장할 수 있다(B). A와 B에 도시된 나노웰들에 있어서, 여기광이 상기 코어층 내에서 전파될 때, 상기 나노웰 내에서 이동하는 광 필드 성분이 없더라도 상기 코어층 내에서 이동하는 광의 일부가 상기 나노웰 내부로 미약하게 침투할 수 있다. 상기 나노웰 내부로 침투하는 광은 상기 수직 방향으로 기하급수적으로 쇠퇴하여 소산장을 형성할 수 있다. 이러한 소산장은 상기 나노웰의 공간적 한정과 함께, 상기 코어층에 인접한 상기 나노웰의 적어도 일부 내에 유효 여기장을 형성할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 나노웰은 상기 상부 클래딩층의 총 두꼐 및 상기 코어층의 부분 두께에 대해 연장할 수 있다(C). 이러한 실시예에 있어서, 이동장 성분이 상기 나노웰에 나타날 수 있으며, 소산장과 함께 상기 나노웰 내에 유효 여기장을 형성할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 나노웰은 상기 상부 클래딩층의 총 두께 및 상기 코어층의 총 두께에 대해서 연장할 수 있다(D). 이러한 실시예에 있어서, 상기 나노웰 내에 여기 존을 형성하는 대부분의 전자기장은 이동장일 수 있다.
도 3의 B에 도시된 나노웰을 포함하는 평면 도파관에 있어서, 상기 나노 웰의 하부 바닥은 상기 코어층의 상면 상에 위치하므로, 상기 유효 여기 존의 부피는 소산장의 유효 영역과 동일할 수 있으며, 하기의 식에 의해 대략적으로 계산될 수 있다.
Figure pct00001
상기의 식에서, D는 상기 나노웰 하부의 지름이며, h는 상기 나노웰 내의 소산장의 투과 깊이이다. 예를 들면, D 및 h가 각각 100nm 및 100nm인 경우, 계산된 유효 여기 존의 부피는 대략 1 x 10-18 리터(1 아토리터)이다.
일부 실시예들에 있어서, 복수의 어댑터 사이트들이 상기 도파관 내에 형성될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 복수의 어댑터 사이트들 각각에 대해 광 검출기가 형성되어 상기 어댑터 사이트의 유효 여기 존 내의 개체로부터 방출되는 광을 검출할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 하나의 광 검출기가 복수의 어댑터 사이트들의 유효 여기 존들 내의 개체들로부터 방출되는 광을 측정하는데 사용될 수 있다.
1-2-3. 이동식 광 커플러
실시예들은 단일-분자 개체를 도파관의 적어도 제1 클래딩층 내에 형성된 어댑터 사이트에 위치시킬 수 있는 이동식 광 커플러를 포함한다. 상기 이동식 광 커플러는 그 표면에 검출되는 단일-분자 개체와 결합가능한 적어도 하나의 결합 잔기를 위치시킬 수 있다. 결합 잔기는 상기 개체와 결합할 수 있는 단일 분자 혹은 분자 복합체(예를 들면, 리셉터, 항체, 효소, 또는 효소를 포함하는 반응 복합체와 같은 다량체)일 수 있다. 검출되는 단일-분자 개체는 어댑터 사이트에 위치된 이동식 광 커플러의 표면 상에 위치된 결합 잔기에 결합하고, 이에 따라 상기 결합 잔기 및 광 커플러를 통해 상기 개체를 유효한 신호 여기 및 관측을 위한 한정된 공간에 위치시킨다. 상기 이동식 광 커플러는 그 표면에 위치된 오직 하나의 결합 잔기를 포함할 수 있으며, 단일-분자 개체의 상기의 표면-위치된 결합 잔기로의 결합이 검출되는 경우 특정 시점에 검출되는 개체들의 수는 상기 결합 잔기에 동시에 결합할 수 있는 개체들의 수보다 크지 않을 수 있다. 따라서, 하나의 결합 잔기가 동시에 오직 하나의 개체와 결합하는 경우, 검출 시스템은 상기 이동식 광 커플러의 표면 상에 위치된 상기 결합 잔기에 결합한 단일 개체를 검출할 수 있다.
본 출원에서, 이동식 광 커플러의 표면 상에 "위치된"개체는 이동식 광 커플러의 표면상에 비특이적으로 흡착된 개체 및 일 이상의 공유 결합 혹은 비공유 상호작용 등을 통해 이동식 광 커플러의 표면 상에 매달린 개체를 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 나노-스케일 입자이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 나노-스케일 스피어이다. 상기 나노-스케일 스피어는 약 40nm 내지 1000nm의 지름 또는 여기광 파장의 약 1/10 내지 2배의 지름을 가질 수 있다. 상기 나노-스케일 스피어의 사이즈는 상기 광 검출기의 사이즈에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 나노-스케일 스피어의 사이즈는 단일 광 검출기가 오직 하나의 스피어로부터 발생된 광을 검출할 수 있도록 선택될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 나노-스케일 스피어의 사이즈 및 상기 어댑터 사이트의 형상은 상기 나노스피어가 상기 어댑터의 사이트의 하부 표면으로부터 약 10nm 내지 200nm의 거리로 상기 어댑터 사이트에 위치되도록 선택될 수 있다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 비구형(nonspheroidal)의 나노-스케일 입자이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 나노-스케일 입자는 바-유사형(bar-like) 입자이다. 이동식 광 커플러의 "길이"는 상기 광 커플러의 최대 면적 지점에서 상기 광 커플러의 일단에서 타단까지의 거리를 지칭한다. 예를 들면, 구형 광 커플러의 길이는 이의 지름에 상응하며, 바-유사형 입자의 길이는 상기 바의 가장 원거리의 단부 사이의 거리이다.
상기 이동식 광 커플러는 균질한 고체, 콜로이드 혹은 다공성 고체, 또는 고분자 주쇄를 갖는 물질로 구성된 고체일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 다관능성 이동식 광 커플러는, 예를 들면 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 백금(Pt), 니켈(Ni), 크롬(Cr) 혹은 금속 합금을 포함하는 일 이상의 금속 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 일 이상의 산화물 재료들, 예를 들면 TiO2, Ta2O5, Nb2O5, SiO2, HfO2, Al2O3, ZrO2, ZnO, V2O5, CeO2, CdO, Fe2O3, Fe3O4, Cu2O, CuO, In2O3, La2O3, MoO3, 또는 WO3을 포함할 수 있다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 예를 들면, CdS, ZnS, PbS, Au2S 혹은 Ag2S를 포함하는 일 이상의 황화물 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는, 예를 들면 CdSe, ZnSe 혹은 PbSe를 포함하는 일 이상의 셀렌화물(selenide)을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는, 예를 들면 Si3N4, TiN, BN 및 GaN을 포함하는 일 이상의 질화물을 포함할 수 있다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는, 예를 들면 폴리스티렌, 폴리에틸렌이민, 폴리포스파젠(polyphosphazene), 폴리락타이드(polylactide), 폴리락타이드-코-글리콜라이드(polylactide-co-glycolide), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리말레산(polymaleic acid) 및 이의 유도체들, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리안하이드라이드 옥시부티레이트(polyanhydride oxybutyrate), 폴리카보네이트, 폴리오쏘에스테르(polyorthoester), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-L-리신, 폴리글리콜라이드, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈 혹은 이들의 공중합체를 포함하는 일 이상의 고분자 물질을 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 코어-쉘(core-shell) 나노구조를 갖는다. 코어 물질은, 예를 들면 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 백금(Pt), 니켈(Ni), 크롬(Cr) 혹은 금속 합금을 포함하는 일 이상의 금속 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 코어 물질은 일 이상의 산화물 재료들, 예를 들면 TiO2, Ta2O5, Nb2O5, SiO2, HfO2, Al2O3, ZrO2, ZnO, V2O5, CeO2, CdO, Fe2O3, Fe3O4, Cu2O, CuO, In2O3, La2O3, MoO3, 또는 WO3을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 코어 물질은 CdS, ZnS, PbS, Au2S 혹은 Ag2S를 포함하는 일 이상의 황화물 물질을 포함할 수 있다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 코어 물질은 예를 들면 CdSe, ZnSe 혹은 PbSe를 포함하는 일 이상의 셀렌화물(selenide)을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 코어 물질은, 예를 들면 SiN 혹은 GaN을 포함하는 일 이상의 질화물을 포함한다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 코어 물질은, 예를 들면 예를 들면 폴리스티렌, 폴리에틸렌이민, 폴리포스파젠, 폴리락타이드, 폴리락타이드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말레산 및 이의 유도체들, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리안하이드라이드 옥시부티레이트, 폴리카보네이트, 폴리오쏘에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-L-리신, 폴리글리콜라이드, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈 혹은 이들의 공중합체를 포함하는 일 이상의 고분자 물질을 포함한다.
코어-쉘 나노구조 광 커플러의 쉘은 예를 들면 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 백금(Pt), 니켈(Ni), 크롬(Cr) 혹은 금속 합금을 포함하는 일 이상의 금속 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 쉘 물질은 일 이상의 산화물 재료들, 예를 들면 TiO2, Ta2O5, Nb2O5, SiO2, HfO2, Al2O3, ZrO2, ZnO, V2O5, CeO2, CdO, Fe2O3, Fe3O4, Cu2O, CuO, In2O3, La2O3, MoO3, 또는 WO3을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 쉘 물질은 CdS, ZnS, PbS, Au2S 혹은 Ag2S를 포함하는 일 이상의 황화물 물질을 포함할 수 있다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 쉘 물질은 예를 들면 CdSe, ZnSe 혹은 PbSe를 포함하는 일 이상의 셀렌화물(selenide)을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 쉘 물질은, 예를 들면 SiN 혹은 GaN을 포함하는 일 이상의 질화물을 포함한다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 쉘 물질은, 예를 들면 예를 들면 폴리스티렌, 폴리에틸렌이민, 폴리포스파젠, 폴리락타이드, 폴리락타이드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말레산 및 이의 유도체들, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리안하이드라이드 옥시부티레이트, 폴리카보네이트, 폴리오쏘에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-L-리신, 폴리글리콜라이드, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈 혹은 이들의 공중합체를 포함하는 일 이상의 고분자 물질을 포함한다,
일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 상기 도파관의 상기 코어층 물질의 굴절률보다 상기 도파관의 상기 제1 클래딩층 물질의 굴절률에 더 가까운 굴절률을 갖는 물질로 형성된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 상기 도파관의 상기 코어층 물질의 굴절률보다 주변 샘플 용액의 굴절률에 더 가까운 굴절률을 갖는 물질로 형성된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광플러는 상기 도파관의 상기 제1 클래딩층의 굴절률 및 상기 도파관의 상기 코어층의 굴절률 사이의 중간값인 굴절룰을 갖는 물질로 형성된다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 상기 도파관의 상기 코어층의 굴절률과 실질적으로 유사한 굴절률을 갖는 물질로 형성된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 상기 코어층의 굴절률과 동등한 굴절률을 갖는 물질로 형성된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 1.487의 굴절률을 갖는 SiO2로 구성된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 1.59의 굴절률을 갖는 폴리스티렌으로 구성된다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 2.0의 굴절률을 갖는 TiO2로 구성된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 2.4의 굴절률을 갖는 Fe3O4로 구성된다. 또 다른 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 2.26의 굴절률을 갖는 Ta2O5로 구성된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 코어-쉘 구조를 가지며. 쉘 물질은 1.28의 굴절률을 갖는 금(Au)이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 쉘 물질은 0.135의 굴절률을 갖는 은(Ag)이다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 쉘 물질은 1.9의 굴절률을 갖는 백금(Pt)이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 쉘 물질은 0.714의 굴절률을 갖는 알루미늄(Al)이다. 또 다른 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 쉘 물질은 1.86의 굴절률을 갖는 코발트(Co)이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 쉘 물질은 1.66의 굴절률을 갖는 니켈(Ni)이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 적절한 사이즈 및 상기 도파관의 상기 코어층 물질의 굴절률에 충분히 유사한 굴절률을 가지며, 이에 따라 상기 광 커플러는 상기 도파관의 어댑터 사이트에 위치되었을 때 도파관으로부터의 광을 커플링할 수 있다. 이러한 실시예들에 있어서, 유도된 광 필드가 상기 이동식 광 커플러 표면 주위로 형성될 수 있으며, 이에 따라 상기 광 커플러 주위로 유효 여기 존을 형성할 수 있다. 이 때, 분자는 상기 광 커플러 표면의 특정 거리 내에서 여기되어 형광을 방출할 수 있다.
상기 이동식 광 커플러 표면 주위에 유도되는 여기광 필드의 강도는 주변 환경내의 광학적 도파관의 전기장을 조절함으로써, 상기 광 커플러의 적절한 특성들(예를 들면, 물질 조성, 형상 및 사이즈)을 선택함으로써, 상기 어댑터 사이트의 형상을 조절함으로써 제어될 수 있다. 상기 이동식 광 커플러가 스피어인 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러 표면에서의 여기광 강도는 하기의 수식에 의해 계산될 수 있다.
Figure pct00002
(수식 1)
상기 수식에서 P는 스피어 표면 상의 여기광 필드의 광출력이고,
Figure pct00003
(피네스, Finesse)는 하기의 수식에 의해 결정된다.
Figure pct00004
r은 하기의 수식에 의해 결정된다.
Figure pct00005
I max /I i는 하기의 수식에 의해 결정된다.
Figure pct00006
θ는 하기의 수식에 의해 결정된다.
Figure pct00007
여기서, R은 스피어의 곡률 반경아고, α ring 은 스피어의 모드파워 감쇠 계수이고, N ring 은 스피어의 평형 굴절률이고, κ는 파워 커플링 계수이며, k0 = 2π/λ0(λ0은 자유-공간 파장)이다. 광 에너지가 완전히 스피어형 광 커플러 내부로 전달되는 공명 조건에서, N ring k02πR = 2mπ 이고(m은 정수), κ = 1-exp(-2πR1 α ring )이고(R1은 외측 곡률 반경), P=1이다. 본 출원에 사용되는 용어"유효 커플링(critical coupling)"은 이러한 공명 조건을 지칭한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러의 광학적 특성은 상기 광 커플러가 일정 범위 내의 특정한 분자들에 의해 둘러싸일 때 변화한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러가 일정 범위 내의 특정한 분자들에 의해 둘러싸일 때 변화하는 상기 광학적 특성은 굴절률, 광흡수력, 상기 커플러에 의해 흡수된 광의 파장 또는 상기 광 커플러를 통해 전파되는 광의 방향이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러의 표면의 일 이상의 영역이 변형될 수 있다. 예를 들면, 나노-스케일 스피어 광 커플러의 전체 표면이 변형될 수 있다. 표면 변형은 코어-쉘 구조를 갖는 광 커플러의 쉘 물질과 구별된다. 즉, 표면 변형을 포함하는 코어-쉘 광 커플러는 상기 쉘 물질의 외측 표면의 변형을 갖는다. 일 실시예에 있어서, 나노-스케일 스피어 광 커플러의 한쪽 반구의 표면은 변형되고 나머지 반구는 비변형될 수 있다. 상기 광 커플러의 표면은 화학적 변형 기술에 의해 일 이상의 이종 물질들을 사용하여 전체 표면에 걸쳐, 또는 적어도 표면 일부에 걸쳐 코팅될 수 있다. 표면 변형은 상기 이동식 광 커플러를 어댑터 사이트에 위치시키는 역할을 할 수 있다. 예를 들면 한 쪽 표면만 변형하거나 반대 표면들에 상이한 변형을 가하는 것과 같은 비대칭 표면 변형은 상가 이동식 광 커플러를 특정 배향으로 어댑터 사이트에 위치시키는 역할을 할 수 있다. 표면 변형은 단일-분자 개체를 상기 광 커플러 표면의 특정한 영역에 위치시키는 역할을 할 수 있다. 이에 따라 이러한 영역은 상기 도파관의 상기 코어층을 향하도록 배향되고, 상기 이동식 광 커플러 및 상기 도파관의 상기 코어층에 인접한 상기 어댑터 사이트의 표면 사이의 한정된 공간 내에 상기 개체를 위치시키고 상기 개체와 연관되는 반응을 유도한다. 올리고뉴클레오티드-프라이머들로 한쪽 반구가 변형된 나노-스케일 스피어 광 커플러 입자를 포함하는 예시적인 검출 시스템이 개략적으로 도 4에 도시된다. 나노-스케일 스피어 광 커플러(100)는 DNA 합성 반응 복합체(200)의 복제 DNA 가닥 내에 내장된 시퀀스들에 혼성가능한 올리고뉴클레오티드 프라이머들로 표면의 반쪽이 변형된다. 광 커플러의 올리고뉴클레오티드-변형된 표면이 도파관의 코어층을 향하도록 광 커플러(100)이 어댑터 사이트(104)에 위치되면 나노웰 어댑터 사이트(104) 하부의 한정된 공간(170) 내에 반응 복합체(200)가 위치된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러 표면의 일 이상의 영역들의 변형은 화학적 변형이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 화학적 변형은 상기 광 커플러의 표면으로의 작용기의 공유 결합이다. 공유결합된 작용기는 소수성기 혹은 친수성기일 수 있다. 적절한 소수성기들은, 예를 들면 -Cx(H2)xCH3, -C6H6, 에폭시기, -Si(CxHx+1)2(N-옥틸실란(N-octylsilane)과 같은 H3-Si(CxHx+1)2 구조식을 갖는 화합물로부터 유도되는), -O-Si(CxHx+1)2 (트리메톡시(옥틸)실란과 같은 R3-O-Si(CxHx+1)2 구조식을 갖는 화합물로부터 유도되는) 등을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 금속 물질로 구성된 균질한 고체 입자이거나 금속 쉘 물질을 포함하는 코어-쉘 입자이고, 소수성기는 황, 아민, 카르복실 혹은 포스페이트 결합을 통해 상기 금속에 공유결합된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 금속 산화물 혹은 SiO2로 구성된 균질한 고체 입자이거나 금속 산화물 혹는 SiO2를 포함하는 코어-쉘 입자이고, 소수성기 R은 상기 금속 산화물 혹은 SiO2 물질의 산소 원자들에 -Si-R 기로서 공유 결합된다. 일부 실시예들에 있어서, 공유결합된 작용기는 예를 들면 -NH2, -OH, -CO2H, -OSO3H를 포함하는 친수성기이다. 예를 들면, 일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 금속 산화물 혹은 SiO2 물질로 구성된 균질한 고체 입자이거나 금속 산화물 혹은 SiO2 쉘 물질을 포함하는 코어-쉘 입자이고, -OH 기가 상기 금속 산화물 혹은 SiO2 물질에 공유 결합된다. 적절한 친수성기들은, 예를 들면 -NH3 +와 같은 양전하 기 혹은 -CO2 - 혹은 -OSOS3 -와 같은 음전하 기들을 포함하는 전하를 갖는 기들을 더 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 공유결합된 작용기는 자성 작용기이다, 적절한 자성 작용기들은, 예를 들면 -Fe3O4, -Fe2O3, -FePt, -FeNi, -FeCo, -Mg, -Co, -Ni 등을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 공유결합된 작용기는 형광 작용기이다. 적절한 형광 작용기들은, 예를 들면 -FITC, -Rhodamine 6G(Rh6G), -Cy3, 및 -Cy5 등과 같은 분자 염료들과 -CdSe, -ZnS, -PbS, -PbSe 등과 같은 나노입자/양자점들을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러의 표면은 비오틴, 스트렙타아비딘, 아비딘 등으로 공유적으로 변형될 수 있다.
추가적인 실시예들에 있어서, 상기 화학적 변형은 비공유 변형일 수 있다. 상기 비공유 변형은 고분자 물질 코팅일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 예를 들면 상기 광 커플러는 금속 물질로 구성된 균질한 고체 입자이거나 금속 쉘 물질을 포함하는 코어-쉘 입자이고, 상기 광 커플러의 표면은 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 친수성 고분자로 코팅된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러 표면의 오직 일 영역만이 변형되고 상기 광 커플러의 나머지 표면은 비변형된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러 표면의 변형된 영역은 상기 이동식 광 커플러 표면의 약 10 내지 90%이다. 이러한 실시예들에 있어서, "상기 이동식 광 커플러 표면의 약 10 내지 90%"는 상기 이동식 광 커플러 표면의 변형된 영역이 상기 광 커플러 표면의 10%에 약간 미만에서 90%를 약간 초과하는 임의의 값일 수 있음을 의미한다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러 표면의 변형된 영역은 상기 광 커플러 표면의 10% 미만일 수 있다. 또 다른 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러 표면의 변형된 영역은 상기 광 커플러 표면의 90%를 초과할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 변형된 표면(1) 및 변형된 표면(2)을 나타내는 도 5의 A에 도시된 바와 같이, 상기 이동식 광 커플러 표면의 두 영역들이 변형될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 반대 특성들을 갖는 작용기들 혹은 코팅들로 표면 변형된 두 영역들을 포함한다. 예를 들면, 상기 광 커플러의 일 표면은 소수성 표면 특성을 갖도록 변형될 수 있으며, 반대 측 표면은 친수성 표면 특성을 갖도록 변형될 수 있다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러의 일 표면은 양전하 기로 변형되고, 반대 측 표면은 음전하 기로 변형될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러의 일 표면은 DNA를 끌어들여 유지하도록 변형된다. 예를 들면, 상기 표면은 양전하 작용기로 변형되거나 표적 DNA 분자 내의 서열들에 혼성화 가능한 올리고뉴클레오티드로 변형된다. 반면, 상기 광 커플러의 반대 측 표면은 DNA를 끌어들이지 않는다.
추가적인 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 상이한 특성의 타입을 갖는 작용기들 혹은 코팅으로 표면 변형된 두 영역들을 포함한다. 예를 들면, 일부 실시예들에 있어서, 이동식 광 커플러 표면의 일 영역은 자성 작용기로 변형되고, 상기 이동식 광 커플러의 반대 측 표면은 형광 작용기로 변형된다.
일부 실시예들에 있어서, 도파관의 적어도 제1 클래딩층 내에 형성된 어댑터 사이트의 표면은 일 이상의 표면 변형을 포함한다. 상기 도파관은 도 5의 B에 도시된 바와 같이, 제1 클래딩층 및 제2 클래딩층을 포함할 수 있으며, 상기 제1(하부) 클래딩층 및 어댑터 사이트 하부의 코어층(도시되지 않음) 표면은 이동식 광 커플러(100) 상의 표면 변형(1)을 끌어들이는 및/또는 이동식 광 커플러(100) 상의 표면 변형(2)을 밀어 내는 표면 변형(3)을 포함하고, 상기 제2(상부) 클래딩층은 이동식 광 커플러(100) 상의 표면 변형(2)와 양립가능한 표면 변형(4)를 포함한다. 도 6에 도시된 바와 같이, 상기 도파관은 표면 변형(3)(어댑터 사이트 하부의 코어층 표면과 함께) 및 표면 변형(4)을 포함하는 제1 클래딩층을 포함하고, 표면 변형(3)은 이동식 광 커플러(100) 상의 표면 변형(1)을 끌어들이거나 및/또는 이동식 광 커플러(100) 상의 표면 변형(2)을 밀어내고, 표면 변형(4)은 이동식 광 커플러(100) 상의 표면 변형(2)와 양립가능하다. 예를 들면, 도 5 및 도 6에 도시된 표면 변형들(1, 3)은 친수성일 수 있으며, 표면 변형들(2, 4)은 소수성일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 어댑터 사이트(104)의 표면(3)은 실리콘, 실리카, 금속 혹은 금속 산화물로부터 선택된 부재를 포함하며 소수성이고, 표면(4)는 소수성이다. 그러나, 어댑터 사이트(104)의 표면이 친수성을 갖는 물질로 형성된 경우, 이는 소수성으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 어댑터 사이트(104) 표면이 친수성을 갖는 실리케이트 혹은 금속으로 형성된 경우, 이는 예를 들면 R1x-Si(O-R2)4-x (R1은 알킬 사슬 -(CH2)n-CH3과 같은 소수성기이고, R2는 CnH2n+1 이고 x 및 n은 정수이고, 1≤x≤3) 또는, 예를 들면 -COOH, -PO3H2, -SH 혹은 -NH2 로부터 선택된 작용기를 갖는 고분자를 사용하여 소수성으로 변형될 수 있다. 다른 실시예로서, 어댑터 사이트(104) 표면이 친수성을 갖는 금속 산화물로 형성된 경우, 예를 들면 R1x-Si(O-R2)4-x(R1은 알킬 사슬 -(CH2)n-CH3과 같은 소수성기이고, R2는 CnH2n+1 이고 x 및 n은 정수이고, 1≤x≤3) 또는, 예를 들면 -COOH, -PO3H2, -SH 혹은 -NH2 로부터 선택된 작용기를 갖는 고분자를 사용하여 소수성으로 변형될 수 있다. 어댑터 사이트(104)의 상부 표면을 소수성화하고 어댑터 사이트(104)의 하부 표면을 친수성으로 유지함으로써, 하나의 소수성 표면 및 하나의 친수성 표면을 포함하는 이동식 광 커플러(하기의 광 커플러 표면 변형에 대한 설명 참조)는 친수성 표면이 상기 어댑터 사이트 표면 측벽 상부로 혹은 측벽을 향하기 보다는 상기 어댑터 사이트 하부에 인접한 유효 여기 존 내에 배치되는 특정 배향으로 상기 어댑터 사이트에 배치될 수 있다. 따라서, 상기 이동식 광 커플러 표면의 일 영역(예를 들면, 본 실시예에서 친수성 표면) 상에 위치한 분자, 또는 상기 광 커플러 표면 상에 위치한 상기 분자와 상호 작용하는 샘플 용액(120)으로부터의 분자는 상기 어댑터 사이트 하부에 인접한 한정된 공간 내의 상기 유효 여기 존으로 진입하는 여기광에 의해 효과적으로 여기될 수 있다.
도 5 및 도 6에 도시된 실시예들을 더 참조하면, 일부 실시예들에 있어서, 표면 변형들(1, 3)은 반대 전하를 갖는 기들로 표면 변형된다. 즉, 표면(1)은 양전하를 띄고, 표면(3)은 음전하를 띄며, 그 반대일 수도 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러 표면의 적어도 일 영역은 올리고뉴클레오티드들로 변형된다. 올리고뉴클레오티드들에 의한 표면 변형을 갖는 이동식 광 커플러를 포함하는 예시적인 검출 시스템의 개략도가 도 4에 도시된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드들은 핵산 합성 반응에서 활용되는 시퀀싱 프라이머의 시퀀스에 상보적이다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드들은 랜덤 시퀀스들을 갖는다. 상기 올리고뉴클레오티드들은 10 내지 100의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예를 들면, 상기 올리고뉴클레오티드들은 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 50 내지 60, 60 내지 80 또는 80 내지 100의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 길이 범위는 대략적인 것이며, 뉴클레오티드 길이에 대한 특정된 범위는 상기 범위 내의 대략적인 뉴클레오티드들을 포함함을 이해해야 한다. 예를 들면, 10 내지 100 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드는 약 10 내지 100 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 상기 올리고뉴클레오티드들의 길이는 10 뉴클레오티드 미만일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드들은, 예를 들면 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 30 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드들의 길이는 상기 시퀀싱 프라이머의 길이에 상응한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드들은 상기 시퀀싱 프라이머의 길이보다 짧을 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드들은 상기 이동식 광 커플러에 직접 연결될 수 있으며, 또는 상기 올리고뉴클레오티드들이 이동식 광 커플러에 커플링될 수 있게 하는 잔기에 연결될 수 있다(예를 들면, 이동식 광 커플러 표면에 연결된 스트렙타아비딘 혹은 아비딘에 결합하는 비오틴 기).
표면 변형된 영역은 당해 기술 분야에 공지된 제조 공정을 사용하여 상기 이동식 광 커플러 상에 도입될 수 있다. 예를 들면, 표면 변형된 영역은 상기 광 커플러의 일부분을 임시적으로 마스킹하고 상기 광 커플러 표면의 나머지 영역을 변형함으로써 도입될 수 있다. 예를 들면, 나노-스케일 스피어 광 커플러의 한쪽 반구는 마스킹되고 다른 쪽 반구는 표면 변형을 수용할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 광 커플러는 기판(예를 들면, 유리 혹은 실리콘 기판) 상에 일 이상의 광 커플러를 정렬하고, 기판에 정렬된 상기 커플러 표면 상에 이종의 물질을 증착하고, 이어서 리프트-오프(lift-off) 방법을 활용하여 상기 기판으로부터 변형된 광 커플러를 제거하는 공정에 의해 이종의 물질로 부분적으로 코팅된다. 기판 상의 광 커플러 정렬은 스핀-코팅, 딥-코팅, 임베딩, 나노임프린팅, 나노 잉크-프린팅, 나노입자 셀프 어셈블리 기술(예를 들면, 화학 리소그래피에 의해 예비-패터닝된 기판 상의 나노입자들의 셀프-어셈블리) 또는 유사한 방법들에 의해 수행될 수 있다. 상기 광 커플러 상의 이종 물질 증착은 스퍼터링 증착, 마그네트론 스퍼터링 증착, 기화(evaporation), 원자층 증착, 화학 기상 증착, 물리 기상 증착(PVD), 전자빔(예를 들면, 전자총) 증착, 플라즈마 증착, 레이저 플래쉬 기화(예를 들면, 기화된 금속 증착) 등의 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 리프트-오프 방법은 초음파 교반, 화학적 처리(예를 들면, 아세톤 처리), 마그네틱 리프트-오프 혹은 레이저 블레이드로 증착된 층을 물리적으로 벗겨내는 방법 등을 포함할 수 있다. 비대칭 표면 변형을 갖는 이동식 광 커플러 입자들의 생산에 적합한 예시적인 제조 공정들은 Park, H. 등의 "Multifunctional nanoparticles for photothermally controlled drug delivery and magnetic resonance imaging enhancement," Small 4(2):192-196 (2008); International Patent Publication Number WO2008/002101, entitled "Multi-functional nanoparticles partially-deposited with gold film" Anker, J.N. 등의 "Magnetically-Modulated Optical Nanoprobes (MagMOONs) and Systems," Journal of Magnetism and Magnetic Materials 293:655662 (2005); Perro, A. 등의 "Design and synthesis of Janus micro- and nanoparticles," Journal of Materials Chemistry 15: 3745-3760 (2005); McNaughton, B.H. 등의 "Fabrication of uniform half-shell magnetic nanoparticles and microspheres with applications as magnetically modulated optical nanoprobes," arXiv:cond-mat/0506418v1, June1-6; 및 Wu, L.Y. 등의 "Bioinspired nanocorals with decoupled cellular targeting and sensing functionality, Small 6(4):503-507 (2010) 과 같은 문헌들에 설명되어 있으며, 이들 문헌 각각은 본 출원에 참조로서 병합된다.
1-2-4. 어댑터 사이트에 대한 이동식 광 커플러의 지시된 위치화
일부 실시예들에 있어서, 단일-분자 개체에 대해 표면-위치된 결합 잔기를 갖는 이동식 광 커플러 입자(즉, 단일-분자 개체에 결합가능한 분자 혹은 분자 복합체)는 전기장, 자기장을 사용하거나 친수성 표면 성질 혹은 상기 광 커플러의 디자인에 따라 다른 화학적 특성을 사용하여 도파관 내에 형성된 어댑터 사이트에 위치된다.
자성 물질들을 포함하거나 및/또는 표면이 자성 작용기들로 변형된 광 커플러는 도 7에 도시된 바와 같이 어댑터 사이트에 자기장을 적용함으로써 어댑터 사이트에 위치될 수 있다. 예를 들면, 마이크로-제조된 코일들이 상기 어댑터 사이트 아래에 배치될 수 있다. 전류가 상기 마이크로-제조된 코일들을 통해 흐르면, 상기 코일들은 샘플 용액 내에 존재하는 광 커플러를 어댑터 사이트로 인도하고 상기 어댑터 사이트의 하부에 대향하여 상기 광 커플러를 트랩(trap)하는 자기장을 생성할 수 있다. 자성 나노-입자들을 트랩핑하는 적절한 방법이 Ramadan, Q. 등의 "Customized trapping of magnetic particles," Microfluid Nanofluid 6:5362 (2009)에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 출원에 참조로서 병합된다.
전하를 갖는 작용기로 변형된 광 커플러는 상기 어댑터 사이트를 가로지르는 전기 포텐셜의 적용에 의해 어댑터 사이트에 위치될 수 있다. 예를 들면, 마이크로-제조된 전극들이 전극으로 작용할 수 있는 도전 물질층으로 코팅된 유리 슬라이드 형태로 어댑터 사이트의 하부에 배치될 수 있다. 예를 들면, 직류 전류와 같은 전류가 상기 전극으로 적용되면 상기 어댑터 사이트 내부로 상기 변형된 광 커플러를 인도하는 전기영동 입자 포획 시스템으로 기능하는 어댑터 사이트를 통해 전기장이 발생된다. 특정 검출 사이트로 나노-입자를 인도하는 적절한 전기영동 기술들이 Han, J. 등의 "High performance electrophoresis system for site-specific entrapment of nanoparticles in a nanoarray", Proc. SPIE 7574:75740L (2010) 및 in Velev, O.D., 등의 "Particle-localized AC and DC manipulation and electrokinetics", Annu. Rep. Prog. Chem., Sect., 105:213-246 (2009) 문헌에 개시되어 있으며, 이들 문헌 각각은 본 출원에 참조로서 병합된다.
1-2-5. 시스템의 다른 광학적 구성들
일부 실시예들에 있어서, 도 4에 도시된 바와 같이, 광학 필터(118)가 코어층(112) 및 검출기(102) 사이에 배치될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 필터는 하부 클래딩 층(도 4에 도시되지 않음) 및 광 검출기(102) 사이에 배치될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 광학 필터는 하부 보호층(도시되지 않음) 및 광 검출기(102) 사이에 배치될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서 하부 보호층 자체가 광학 필터로 제공될 수 있다. 광학 필터는 특정 범위의 파장의 광을 통과시키면서 상기 특정 범위를 벗어나는 파장의 광은 최소한 부분적으로 차단할 수 있다. 그러므로, 적절한 광학 필터(118)를 선택함에 의해, 개체로부터 방출되는 광은 통과되나 여기광에 의해 발생하는 노이즈는 감소된다. 따라서 S/N 비율이 향상될 수 있다.
상기 이동식 광 커플러 및 검출되는 개체는 어댑터 사이트(104)를 채우는 샘플 용액(120) 내에 함유될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 마이크로유체 채널(도시되지 않음)이 상기 어댑터 사이트 내부의 샘플 용액으로서 사용될 수 있다. 상기 마이크로유체 채널은 표적 개체들이 한 번에 상기 어댑터 사이트를 통과하는 방식으로 디자인되어 유동-세포 유사(flow cytometry-like) 검출을 구현할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 커버(도시되지 않음)가 상기 검출 시스템 상부에 형성되어 상기 샘플 용액을 저장하거나 및/또는 주변 광을 차단할 수 있다.
검출 시스템들의 구조를 개략적으로 나타낸 상기에 설명한 일부 도면들에서는, 설명의 단순화를 위해 일부 구성들은 도시하지 않았다. 예를 들면, 도 2의 각 도면은 상기 검출 시스템의 이동식 광 커플러(100), 도파관(110) 및 어댑터 사이트(104)의 구성만을 도시하였다. 상기 검출 시스템의 다른 구성들은 도시되지 않았다. 상기의 도면들에 도시된 검출 시스템들은 본 명세서에 개시된 다른 구성들 역시 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들면, 도 2에 도시된 검출 시스템은 광 검출기, 커버, 보호층(들), 광원 및/또는 광학 필터 역시 포함할 수 있다.
2. 검출 및 적용 방법
본 발명의 다른 측면들은 본 출원에 개시된 검출 시스템을 사용하여 단일-분자 개체와 같은 개체를 검출하는 방법과 연관된다. 본 출원에 사용되는 용어"단일-분자 개체(single molecule object)"는 단일 분자 및 단일 다량 폴리펩티드 복합체 혹은 이중-가닥 DNA의 단일 세그먼트와 같은 다중 비공유 결합 분자들로 구성된 단일 개체로 구성된 개체를 포함한다. 상기 개체를 포함하는 샘플 용액으로 상기 검출 시스템의 도파관 내에 형성된 어댑터 사이트가 채워질 수 있다. 광원으로부터 방출된 입사광은 상기 도파관 내부에서 상기 광 커플러에 의해 적어도 부분적으로 커플링되고 상기 도파관의 코어층 내에서 전파된다. 상기 도파관 내부로 커플링된 광은 여기광으로 제공될 수 있으며, 상기 도파관 내에 형성된 어댑터 사이트에 위치한 이동식 광 커플러에 최소한 부분적으로 커플링될 수 있다. 상기 개체는, 상기 어댑터 사이트 하부의 유효 여기 존에 진입하거나 및/또는 상기 어댑터 사이트에 위치된 상기 광 커플러 표면을 둘러쌀 때, 상기 여기광에 의해 여기되고 광 검출기에 의해 검출될 수 있는 광을 방출할 수 있다.
추가적으로, 단일-분자 개체를 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 a) 광원으로부터 입사광을 도파관 내부로 도입하여 상기 도파관 내에 여기광을 형성하는 단계, b) 단일-분자 개체를 이동식 광 커플러 상에 위치시키는 단계, c) (b)의 상기 이동식 광 커플러를 상기 도파관의 적어도 제1 클래딩층 내에 형성된 이동식 광 커플러를 위한 어댑터 사이트에 위치시키는 단계, 및 d) 상기 여기광에 의해 상기 이동식 광 커플러 상에 위치된 단일-분자 개체를 여기시켜 상기 단일-분자 개체가 광 검출기에 의해 검출되도록 광을 방사하도록 유도하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러를 상기 도파관의 적어도 제1 클래딩층 내에 형성된 이동식 광 커플러를 위한 어댑터 사이트에 위치시킴으로써 단일-분자 검출에 적합한 한정된 공간이 형성된다.
추가적으로, 단일-분자 개체를 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 a) (i) 이동식 광 커플러, (ii) 코어층 및 제1 클래딩 층을 포함하며, 상기 이동식 광 커플러에 대한 적어도 하나의 어댑터 사이트가 적어도 상기 제1 클래딩층 내에 형성된 도파관, 및 (iii) 광 검출기를 포함하는 검출 장치를 제공하는 단계; b) 단일-분자 개체에 결합가능한 적어도 하나의 결합 잔기를 제공하는 단계; c) 상기 적어도 하나의 결합 잔기를 개별적으로 상기 이동식 광 커플러의 표면 상에 위치시키는 단계; d) 상기 이동식 커플러 상에 위치된 하나의 결합 잔기에 단일-분자 개체 샘플을 제공하는 단계; e) 상기 적어도 하나의 결합 잔기 및 단일-분자 개체가 위치된 상기 이동식 광 커플러를 상기 어댑터 사이트에 위치시키는 단계; f) 광원으로부터 입사광을 상기 도파관 내부로 도입하여 상기 도파관 내에서 여기광을 형성하는 단계; 및 g) 상기 여기광에 의해, 상기 이동식 광 커플러 상에 위치된 상기 적어도 하나의 결합 잔기에 결합된 단일-분자 개체를 여기시켜 상기 단일-분자 개체가 광 검출기에 의해 검출될 수 있는 광을 방출하도록 유도하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 결합 잔기 및 단일-분자 개체가 위치된 이동식 광 커플러가 어댑터 사이트에 위치되면 단일-분자 검출에 적합한 한정된 공간이 생성되고, 검출되는 상기 단일-분자 개체는 상기 한정된 공간 내에 위치된다.
일부 실시예들에 있어서, 단일-분자 개체를 검출하는 방법은 표적 분자들 및/또는 분자 복합체들, 예를 들면 리셉터 리간드들 및 리셉터 복합체들, 항원들 및 항체들, 혹은 자유 뉴클레오티드 트리포스페이트들 및 핵산-합성 반응 복합체들의 상호작용을 검출하는 방법과 연관된다. 일부 실시예들에 있어서, 방법들은 라벨링된 분자의 검출을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 라벨은 형광 라벨이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 라벨은 형광 분자이다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 라벨은 형광 단백질이다. 특정한 실시예들에 있어서, 상기 라벨은 양자점이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 라벨은 FRET 도너/억셉터 쌍의 멤버이다. 상기 검출 시스템 및 이를 이용한 방법은 예를 들면, 핵산 검출, DNA 시퀀싱, 바이오마커 식별 혹은 세포 유동 분석에 적용될 수 있다. 상기 검출 시스템은 단일-분자 검출을 가능케하는 낮은 강도의 광 신호를 검출하고 처리할 수 있다.
추가적으로, 핵산을 시퀀싱하는 방법에 제공된다. 상기 방법은 a) (i) 이동식 광 커플러, (ii) 코어층 및 제1 클래딩 층을 포함하며, 상기 이동식 광 커플러에 대한 적어도 하나의 어댑터 사이트가 적어도 상기 제1 클래딩층 내에 형성된 도파관, 및 (iii) 광 검출기를 포함하는 검출 장치를 제공하는 단계; b) 적어도 하나의 핵산 분자를 제공하는 단계; c) 상기 적어도 하나의 핵산 분자를 개별적으로 상기 이동식 광 커플러 상에 위치시키는 단계; d) 적어도 하나의 핵산 분자가 위치된 상기 이동식 광 커플러를 상기 어댑터 사이트에 위치시키는 단계; e) 상기 적어도 하나의 핵산 분자의 단일 분자 합성에 의한 시퀀싱(sequencing-by-synthesis)을 수행하는 단계, 상기 단일 분자 핵산 합성에 의한 시퀀싱은 상기 핵산 내의 적어도 하나의 염기의 동일성과 상호연관된 방출광을 생성한다; f) 상기 방출광을 상기 검출기로 검출하여 출력 신호를 생성하는 단계; 및 g) 상기 출력 신호를 처리하여 상기 핵산에 포함되는 적어도 하나의 염기의 동일성을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 시약 혹은 표적 개체들 및 라벨들 사이, 작용기들 및 표면들(예를 들면, 이동식 광 커플러 혹은 어댑터 사이트의 표면들) 사이에서 공유 부착을 형성하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드들로 변형된 이동식 광 커플러 입자들을 제조하기 위해, 스트렙타아비딘이 비오틴화된 올리고뉴클레오티드들애 결합하기 위해 광 커플러의 표면에 연결될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 폴리펩티드 혹은 폴리펩티드 복합체와 같은 단일-분자 개체 결합 잔기가 광 커플러의 표면에 결합될 수 있다. 예를 들면, 시약의 표면 혹은 라벨에 대한 공유 부착을 형성하는 다양한 방법들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다, 비공유 부착 방법들도 사용될 수 있다. 다수의 상이한 화학적 변형제들이 부착 형성을 촉진하는데 사용될 수 있다. 화학적 변형제들의 예들로서, N-히드록시 숙신이미드(NHS) 그룹, 아민, 알데히드, 에폭사이드, 카르복실기, 히드록실기, 히드라자이드, 소수성기, 멤브레인, 말레이미드, 비오틴, 스트렙타아비딘, 티올기, 니켈 킬레이트, 광반응기, 붕소기, 티오에스테르, 시스테인, 디설파이드기, 알킬 및 아실 할라이드 기, 글루타티온, 말토오스, 아자이드, 포스페이트 및 포스핀 등을 들 수 있다. 이들은 예를 들면 표준적인 방법들(Microarray Biochip Technologies, Mark Schena, Editor, March 2000, Biotechniques Books)을 사용하여 용이하게 제조될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 절절한 변형제의 조합(예를 들면, 친전자성 변형제 및 친핵성 변형제)을 사용하여 두 개체들 사이의 부착이 형성되며, 각 개체는 적어도 하나의 변형제를 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 개체들 중 하나에 존재하는 화학적 변형제 및 다른 개체의 예를 들면 아민 혹은 설프히드릴과 같은 천연-발생 잔기를 사용하여 두 개체들 사이에 부착이 형성된다. 일부 실시예들에 있어서, 아민에 반응하는 변형제가 사용된다. 상기 반응의 이점은 반응이 빠르며 독성 부산물의 생성을 피할 수 있다는 것이다. 이러한 변형제들의 예들은 NHS-에스테르, 알데히드, 에폭사이드, 아실 할라이드 및 티오-에스테르를 포함한다. 대부분의 단백질, 펩티드, 글리코펩티드 등은 자유 아민기들을 가지며, 이는 상기의 변형제와 반응하여 상기의 변형제들에 공유적으로 연결될 수 있다. 내부 혹은 말단 아민기들을 갖는 핵산 프로브들 또한 합성될 수 있으며 상업적으로 이용가능하다(예를 들면, IDT 혹은 Operon으로부터). 따라서, 생분자들은 예를 들면 공유적으로 혹은 비공유적으로 라벨, 표면 혹은 유사한 화학을 사용하여 기타 시약들에 결합될 수 있다.
다양한 다른 다관능성 가교-결합 제제들이 한 종류의 변형제의 화학 반응성을 다른 것으로 전환하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 그룹들은 이관능성, 삼관능성, 사관능성 등을 가질 수 있다. 이들은 또한 호모-관능성 혹은 헤테로-관능성을 가질 수 있다. 이관능성 가교결합제(cross-linker)의 예로서 X-Y-Z를 들 수 있으며, X 및 Z는 두 반응성 그룹들이며, Y는 연결 링커이다. 추가적으로, X 및 Z가 NHS-에스테르와 같은 동일한 그룹인 경우, 이에 따른 가교결합제는 NHS-Y-NHS로서 호모-이관능성 가교결합제이며 각각 아민을 포함하는 두 개체들을 연결할 수 있다. X가 NHS-에스테르이고 Z는 말레이미드인 경우, 얻어지는 가교결합제는 NHS-Y-말레이미드로서 헤테로-이관능성 가교결합제이며 아민을 포함하는 개체와 티오-그룹을 포함하는 개체를 연결할 수 있다. 다양한 상이한 관능성 그룹들을 갖는 가교결합제들이 널리 이용가능하다. 이러한 관능성 그룹들의 예들은 NHS-에스테르, 티오-에스테르, 알킬 할라이드, 아실 할라이드(예를 들면, 요오드아세트아미드), 티올, 아민, 시스테인, 히스티딘, 디-설파이드, 말레이미드, 시스-디올, 붕산, 히드록삼산, 아자이드, 히드라진, 포스핀, 광반응성 그룹(예를 들면, 안트라퀴논, 벤조페논), 아크릴아미드(예를 들면, 아크리다이트(acrydite)), 친화성 그룹(예를 들면, 비오틴, 스트렙타아비딘, 말토오스, 말토오스 결합 단백질, 글루타티온, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제), 알데히드, 케톤, 카르복실산, 포스페이트, 소수성 그룹(예를 들면, 페닐, 콜레스테롤) 등을 포함한다.
다른 대체적 변형제들(예를 들면 광-가교결합 및 열 가교결합)이 당해 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자들에 알려져 있다. 상업적으로 사용가능한 기술들은, 예를 들면 Mosiac Technologies(Waltham, MA), ExiqonTM(Vedbaek, Denmark), Schleicher and Schuell(Keene, N.H.), SurmodicsTM(St. Paul, MN), XenoporeTM (Hawthorne, N.J.), Pamgene(Netherlands), Eppendorf(Germany), Prolinx(Bothell, WA), Spectral Genomics(Houston, TX) 및 CombimatrixTM(Bothell, WA)로부터 얻을 수 있다.
2-1. 검출 시스템과 사용되는 라벨
본 출원에 개시된 방법들의 일부 실시예들에 있어서, 일 이상의 라벨이 표적 단일-분자 개체(들)(즉, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 검출되는 물질)에 부착되거나, 프라이머, 항체 혹은 상기 개체(들) 혹은 다른 시약(들)과 상호작용하는 시약들과 같은 프로브(들)에 부착된다. 임의의 라벨이 상기 단일-분자 개체 혹은 상기 개체의 양 혹은 존재 신호의 상호연관에 있어 유용할 수 있는 프로브 상에 사용될 수 있다.
예를 들면, 소분자, 형광 단백질 및 양자점을 포함하는 광범위한 형광 분자들이 활용될 수 있다. 유용한 형광 분자들(형광단)은 비제한적인 예로서 1,5 IAEDANS; 1,8-ANS; 4-메틸움벨리페론(4-Methylumbelliferone); 5-카르복시-2,7-디클로로플루오레세인; 5-카르복시플루오레세인5(5-FAM); 5-카르복시나프토플루오레세인(5-Carboxynapthofluorescein); 5-카르복시테트라메틸로다민(5-TAMRA); 5-FAM (5-카르복시플루오레세인); 5-HAT(히드록시 트립타민); 5-히드록시 트립타민(HAT); 5-ROX(카르복시-X-로다민); 5-TAMRA(5-카르복시테트라메틸로다민); 6-카르복시로다민 6G; 6-CR 6G; 6JOE; 7-아미노-4-메틸쿠마린; 7-아미노악티노마이신 D (7-AAD); 7-히드록시-4-메틸쿠마린; 9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘; ABQ; 산 푹신(Acid Fuchsin); ACMA(9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘); 아크리딘 오렌지; 아크리딘 레드; 아크리딘 옐로우; 아크리플라빈; 아클리플라빈 포일겐 SITSA; AFPs-AutoFluorescent Protein(Quantum Biotechnologies); 텍사스 레드; 텍사스 레드-X 콘쥬게이트; 티아디카르보시아닌(DiSC3); 티아진 레드 R; 티아졸 오렌지; 티오플라빈 5; 티오플라빈 S; 티오플라빈 TCN; 티올라이트; 티오졸 오렌지; Tinopol CBS(Calcofluor White); TMR; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; TriColor(PE-Cy5); TRITC(TetramethylRodaminelsoThioCyanate); True Blue; TruRed; Ultralite; Uranine B; Uvitex SFC; WW 781; X-로다민; XRITC; 크실렌 오렌지; Y66F; Y66H; Y66W; YO-PRO-1; YO-PRO-3; YOYO-1; YOYO-3, Sybr Green, 티아졸 오렌지와 같은 인커킬레이팅 염료; Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 및 750과 같은 넓은 스펙트럼을 커버하며 공통 여기원들의 주요 출력 파장과 매치되는 Alexa Fluor 염료 시리즈(Molecular Probes/Invitrogen) 멤버들; Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7과 같은 넓은 스펙트럼을 커버하는 Cy 염료 형광단 시리즈(GE Healthcare) 멤버들; Oyster-500, -550, -556, 645, 650, 656과 같은 Oyster 염료 형광단(Denovo Biolabels) 멤버들; DY-415, -495, -505,-547, -548, -549, -550, -554, -555, -556, -560, -590, -610, -615, -630, -631, -632, -633,-634, -635, -636, -647, -648, -649, -650, -651, -652, -675, -676, -677, -680, 681, -682,-700, -701, -730, -731, -732, -734, -750, -751, -752, -776, -780, -781, -782, -831,-480XL, -481XL, -485XL, -510XL, -520XL, -521XL과 같은 418nm (DY415) 내지 844 nm(DY-831)의 최대 흡수 범위를 갖는 DY-라벨 시리즈(Dyomics) 멤버들; ATTO 390, 425, 465, 488, 495, 520, 532, 550, 565, 590, 594, 610, 611X, 620, 633, 635, 637, 647, 647N, 655, 680, 700, 725, 740과 같은 ATTO 형광 라벨 시리즈(ATTO-TEC GmbH) 멤버들; CAL Fluor Gold 540, CAL Fluor Orange 560, Quasar 570, CAL Fluor Red 590, CAL Fluor Red 610, CAL Fluor Red 635, Quasar 670과 같은 CAL Fluor 시리즈 혹은 Quasar 시리즈 염료(Biosearch Technologies); quantum dots, such as quantum dots of the EviTags 시리즈(Evident Technologies)의 양자점 또는 Qdot 525, Qdot565, Qdot585, Qdot605, Qdot655, Qdot705, Qdot 800과 같은 Qdot 시리즈(Invitrogen) 양자점과 같은 양자점; 플루오레세인; 로다민; 및/또는 피코에리트린(phycoerythrin); 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.(예를 들면, U.S. 출원 공보 제2008/0081769호)
어댑터 사이트에 위치된 이동식 광 커플러 상에 위치된 표적 핵산의 단일-분자 핵산 시퀀싱을 포함하는 실시예들에 있어서, 발생기의 DNA 가닥과 병합된 뉴클레오티드들이 여기 및 주입되는 뉴클레오티드에 직접적으로 연결된 형광단, 예를 들면 dNTP의 베타 혹은 감마 포스페이트에 연결되고 dNTP의 성장하는 가닥 내부로 병합시 분해되는 형광단의 검출에 의해 검출될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 발생기 가닥 내부로 병합된 뉴클레오티드들이 형광 공명 에너지 전달(FRET)-기반 검출을 사용하여 검출된다. 예를 들면, 미국 특허 출원 제2010/0035268호에 개시된 FRET-기반 방법이 사용될 수 있다. 이러한 실시예들에 있어서, 형광 도너로서 작용가능한 양자점이 시퀀싱 프라이머에 연결될 수 있으며, 성장하는 가닥을 합성하는데 사용되는 dNTP들이 형광 억셉터 그룹을 이들의 말단(감마) 포스페이트 그룹에 전달한다. 형광-라벨링된 뉴클레오티드 폴리포스페이트들의 표적 핵산에 상보적인 활성 사이트에서 성장하는 뉴클레오티드 가닥 내부로의 병합이 여기된 양자점 형광 도너로부터의 형광 공명 에너지 전달에 따르는 dNTP-결합 형광 억셉터들의 방출을 실시간으로 검출함으로써 검출된다. 각 병합된 뉴클레오티드의 동일성은 이의 형광 라벨에 의해 결정되며, 상기 형광 라벨은 상기 성장하는 가닥 내부로 병합시 상기 뉴클레오티드로부터 분리된다.
2-2. 핵산 검출
상기 검출 시스템은, 예를 들면 핵산 시퀀싱과 같은 분자 검출 방법 혹은 처리에 사용될 수 있다. 이러한 시스템 및 이를 사용하는 방법 혹은 처리는 예를 들면 분석 및 진단 적용에 유용하다.
상기 검출 시스템은 다양한 시퀀싱 방식과 함께 사용될 수 있으며 단일 분자들을 시퀀싱 하는데 적합할 수 있다. 추가적으로, 상기 검색 시스템은 간단한 디자인, 어셈블리 및 현존하는 바이오칩 장치들에 비해 용이하게 생산될 수 있다.
2-2-1. 검출되는 분자들
검출에 적합한 핵산들은 예를 들면, DNA, RNA, 혹은 PNA(peptide nucleic acid)를 포함하는 임의의 핵산을 포함할 수 있으며, 천연 발생 혹은 인공 시퀀스들을 포함하는 공지 및 비공지의 임의의 서열을 함유할 수 있다. 상기 핵산은 천연적으로 유래되거나, 재조합 생산되거나 화학적으로 합성된 것일 수 있다. 상기 핵산은 천연-발생 뉴클레오티드들, 자연에 존재하지 않는 뉴클레오티드 유사체들, 혹은 변형된 뉴클레오티드들을 포함할 수 있다. 검출되는 핵산의 길이는 실제 적용례에 따라 변할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 핵산은 적어도 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000, 20000 염기들 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 핵산은 10 내지 20, 10 내지 50, 10 내지 100, 50 내지 100, 50 내지 500, 50 내지 1000, 50 내지 5000, 500 내지 2000, 500 내지 5000, 1000 내지 5000 염기들을 포함할 수 있다.
핵산은 검출을 위해 단일-가닥일 수 있다. 단일 가닥 핵산 주형들은 예를 들면, 가열 혹은 알칼리 또는 다른 화학적 처리를 포함하는 당해 기술 분야에 공지된 수단들에 의해 이중 가닥 분자로부터 수득될 수 있다. 또한 단일 가닥 핵산 주형들은 예를 들면 화학적 혹은 생체외 합성에 의해 생산될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 검출되는 핵산은 원형이다. 일부 실시예들에 잇어서, 상기 방법은 프라이머에 대한 결합 사이트로서 사용될 수 있는, 공지된 시퀀스의 삽입을 포함하는 원형 핵산 분자를 제공하는 단계를 포함한다. 상기 원형 핵산 분자는 단일 혹은 이중 가닥 상태로 제공될 수 있으며, 일반적으로 적어도 하나의 공유적으로 폐쇄된 가닥을 포함할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 시퀀스의 일부과 공지되어 핵산 삽입으로 제공될 수 있는 경우, 상기 원형 핵산 분자는 이의 소스로부터 원형 형태로 분리함으로써 제공된다(예를 들면, 원형 분자 내에 함유된 유전자의 시퀀스 내에 보존된 모티프가 공지될 수 있고, 혹은 상기 분자가 높은 스트린젠시(stringency) 조건하에 공지된 시퀀스의 다른 핵산에 혼성화하는 능력에 기초한 시퀀스를 함유하는 것으로 알려질 수 있다). 일부 실시예들에 있어서, 상기 원형 핵산 분자가 공지된 주쇄 시퀀스를 갖거나 특정의 알려진 시퀀스로 조작된 경우와 같이 상기 핵산 삽입의 시퀀스는 단지 부정확하게 알려질 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 원형 핵산 분자는 생체외 반응 또는 선형 핵산 샘플을 핵산 삽일을 따라 원형 분자 내부로 병합하는 반응들을 수행함으로써 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기의 반응들은 리가제에 의한 리게이션(ligation) 및/또는 리컴비나제(recombinase) 및 토포아이소머라제(topoisomerase)를 포함하는 다양한 효소들에 의해 촉매되는 기타의 가닥 결합 반응들을 포함한다. DNA 리가제 혹은 RNA 리가제는 도 8에 도시된 바와 같이, 어댑터 분자 혹은 링커들 존재 혹은 부존재 하에 선형 주형의 두 말단들을 효소적으로 결합하는데 사용되어 원형을 형성할 수 있다. 예를 들면, T4 RNA 리가제는 Tessier 등의, Anal Biochem, 158: 171-78 (1986)에서 설명되는 바와 같이, 단일-가닥 DNA 혹은 RNA를 결합한다. 또한 CIRCLIGASE(TM)(Epicentre, Madison, Wis.)가 단일 가닥 핵산의 리게이션을 촉매하는데 사용될 수 있다. 이와는 달리, E. coli 혹은 T4 DNA 리가제와 같은 이중 가닥 리가제가 원형화(circulaization) 반응을 수행하는데 사용될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 원형 핵산 분자를 제공하는 단계는 상보 영역들을 포함하는 적어도 하나의 프라이머(핵산 삽입으로 제공될 수 있는 알려진 시퀀스의 5'플랩(flap)들을 갖는 랜덤 프라이머들을 포함할 수 있다)로부터 연장시킴으로써 핵산 주형을 복제하는 단계 및 리가제 혹은 리컴비나제에 의해 촉매될 수 있는 증폭된 핵산을 원형화하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 증폭된 핵산은, 예를 들면 원형화 전에 제한 혹은 인산화에 의해 이의 말단에서 처리될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 원형 핵산 분자는 화학적 원형화를 수행함으로써 제공된다. 화학적 방법은 BrCN 부가 이미다졸 및 이가 금속, ZnCl2 처리된 N-시아노이미다졸, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3 에틸카르보이미디 HCl, 및 다른 카르보이미드들 및 카르보닐 디이미다졸과 같은 공지된 커플링 제제들을 활용할 수 있다. 선형 주형의 말단들은 5'-포스페이트 및 3'-히드록실, 혹은 5'-히드록실 및 3'-포스페이트를 축합함으로써 결합될 수도 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 원형 핵산 분자는 분자가 원형이므로 말단에 존재하지 않는 다는 것을 제외하고는 말단 결합(end link) 프라이머(후술함)로 간주되는 삽입 시퀀스를 함유한다.
2-2-1-1. 말단 결합 프라이머(End Link Primer)
일부 실시예들에 있어서, 선형 핵산은 핵산의 5'말단, 3'말단 또는 5'말단 및 3'말단 양 쪽에 결합되는 일 이상의 말단 결합 프라이머들을 더 포함할 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 말단 결합 프라이머는 핵산의 3'말단에 부착될 수 있다. 말단 결합 프라이머들은 예를 들면, 시퀀싱 프라이머와 같은 일 이상의 검출 프라이머들에 대해 상보적 시퀀스를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
말단 결합 프라이머들은 통상적으로 100 뉴클레오티드 미만으로 구성된 짧은 핵산 분자들이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 말단 결합 프라이머는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 75, 90 뉴클레오티드 길이 혹은 그 이상일 수 있다. 특정한 실시예들에 있어서, 말단 결합 프라이머들은 8 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 30 혹은 10 내지 50 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 말단 결합 프라이머들은 분지되지 않을 수 있으나, 다른 실시예들에 있어서, 분지될 수도 있다.
상기 말단 결합 프라이머는 예를 들면, 시퀀싱 프라이머와 같은 핵산을 검출하는데 사용되는 일 이상의 프라이머들의 상보체로 제공될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 프라이머는 혼성화에 의해 핵산을 검출하는데 사용될 수 있으며, 예를 들면 상기 프라이머는 형광 라벨과 같은 검출가능한 라벨을 함유할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 말단 결합 프라이머의 5'말단은 시퀀싱 프라이머에 상보적인 시퀀스를 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 시퀀싱 프라이머에 상보적인 상기 말단 결합 프라이머 시퀀스는 상기 시퀀싱 프라이머의 3'말단이 시퀀싱되는 핵산 내의 첫번째 뉴클레오티드에 바로 인접하도록 배향될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 말단 결합 프라이머들은 예를 들면, DNA 리가제와 같은 리가제에 의해 검출될 수 있는 핵산의 말단들에 부가될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 말단 결합 프라이머 및 검출되는 핵산은 모두 리게이션 전에 단일 가닥일 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 이들은 모두 이중 가닥일 수 있다. 또 다른 실시예들에 있어서, 하나는 단일 가닥이고 다른 하나는 이중 가닥일 수 있다. 리게이션은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 폴로니(polony) 시퀀싱 방법에 있어서, Shendure 등은(Science, 309:1728-1732 [2005]) T30 말단 결합 프라이머(32bp)를 New England Biolabs(NEB) Quick LigationTM 키트로 샘플 DNA 세그먼트에 리게이션하였다. 여기서, 리게이션 반응 용액은 1X Quick 리게이션 버퍼 내에 0.26 pmole의 DNA, 0.8pmole의 T30 말단 결합 프라이머, 4.0㎕의 T4 DNA 리가제를 포함하였다. 혼합 후에, 상기 반응 용액은 상온에서 약 10분 동안 배양되었고, 이어서 얼음 위에 위치시켰다, 리게이션 반응은 65℃에서 10분 동안 샘플을 가열함으로써 정지되었다.
다른 실시예들에 있어서, 상기 말단 결합 프라이머는 시퀀싱되는 핵산 상에서 합성될 수 있다. 예를 들면, 상기 말단 결합 프라이머는 예를 들면, 말단 트랜스퍼라제에 의해 부가된 호모폴리머일 수 있다. 예를 들면, Harris 등은 (Science 320:106-109 [2008]) DNA 주형에 폴리-A 꼬리를 부가하였으며, 이는 바이러스 게놈의 단일 분자 시퀀싱에 있어서 폴리-T 시퀀싱 프라이머에 대해 상보체로서 제공된다.
2-2-1-2. 시퀀싱 프라이머
시퀀싱 프라이머는 검출되는 핵산의 세그먼트 혹은 이에 수반되는 말단 결합 프라이머에 상보적인 단일-가닥 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 시퀀싱 프라이머는 적어도 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 뉴클레오티드 길이 혹은 그 이상의 길이를 가질 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 시퀀싱 프라이머는 8 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 30 혹은 10 내지 50 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 상기 시퀀싱 프라이머는 천연-발생 뉴클레오티드, 자연에 존재하지 않는 뉴클레오티드 유사체 혹은 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 임의의 타입의 뉴클레오티드로 형성될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 시퀀싱 프라이머는 예를 들면, 잠금 핵산(locked nucleic acids, LNAs; 다중핵산 내의 증진된 염기 적층 상호작용을 제공하는 변형된 리보뉴클레오티드)과 같은 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. LNA의 활용예로서, Levin 등은 (Nucleic Acid Research 34(20):142 [2006]) LNA-함유 프라이머가 향상된 특이성을 가지며 대응하는 비잠금 프라이머에 대해 보다 강한 결합을 보임을 밝혔다. 프라이머 내의 상이한 위치에 3개의 LNA 뉴클레오티드들(in caps)을 함유하는 MCP1 프라이머(5'-cttaaattttcttgaat-3')의 3개의 변이체들이 만들어졌다: MCP1-LNA-3'(5'-cttaaattttCtTgaAt-3'); MCP1-LNA-5'(5'-CtTaAattttcttgaat-3'); 및 MCP1-LNA-even (5'-ctTaaatTttctTgaat-3'). 모든 LNA-치환된 프라이머들는 증가된 Tm을 가졌으며, MCP1-LNA-5' 프라이머는 특히 증가된 시퀀싱 정확도(Phred Q30 counts)를 보였다. 이에 따라, 특정한 실시예들에 있어서, 상기 시퀀싱 프라이머는 이의 5'영역, 즉 5'1/2, 세 번째, 혹은 1/4 지점에 적어도 하나의 잠금 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
시퀀싱 프라이머들 및 단일-가닥 표적 핵산들(즉, 적어도 하나의 말단 결합 프라이머를 포함하는 시퀀싱되는 핵산)은 핵산 중합 효소, dNTPs 및 핵산 중합을 위한 적절한 버퍼와 결합 전 혹은 결합 후에 혼성화되고, 이어서 이동식 광 커플러에 흡착될 수 있다. 상기 시퀀싱 프라이머 및 샘플 핵산은 상기 샘플 핵산을 5X SSC(또는 5X SSPE), 0.1% Tween 20(또는 0.1% SDS), 및 0.1% BSA 버퍼와 같은 염-함유 용액 내의 과량 몰의 시퀀싱 프라이머와 혼합함으로써 혼성화 될 수 있다. 상기 혼합물은 65℃에서 적어도 5분동안 가열하고 서서히 상온으로 냉각되어, 프라이머/주형 어닐링을 가능케 할 수 있다. 잔여 프라이머들은 예를 들면, 분자체를 포함하는 적절한 수단들에 의해 제거될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 표적 핵산은 핵산-합성 반응 복합체로서 이동식 광 커플러 상에 위치되고, 폴리머라제 혹은 표적 핵산의 표면으로의 요구되는 고정화 없이는 도파관 어댑터 사이트의 한정된 공간내에서 합성 반응이 위치되지 않는다. 이동식 광 커플러의 표면 상에 위치된 핵산 합성 반응 복합체를 제조하기 위해, 상술한 바와 같이 제조된 원형화된 표적 핵산은 시퀀싱 프라이머, 핵산 중합 효소, dNTPs 및 핵산 합성을 위한 적절한 버퍼와 결합될 수 있다. 폴리머라제는 복수 사이클로 원형화된 주형 주변으로 진행할 수 있으며, 주형 가닥의 다중 복제물을 포함하는 성장 발생기 가닥(growing nascent strand)을 생성한다. 도 9에 도시된 바와 같이, 중합 복합체는 이어서 표면 상에 올리고뉴클레오티드로 변형된 이동식 광 커플러와 결합될 수 있다. 따라서 이러한 실시예들에 있어서, 표적 가닥 주형과 폴리머라제 어느 것도 그 자체로 표면 상에 고정화되지 않는다. 올리고뉴클레오티드는 그 다중 복제물이 상기 성장 발생기 가닥에 내장된 시퀀싱 프라이머 시퀀스에 혼성화하는 시퀀스를 포함할 수 있다. 이러한 내장된 시퀀스들은 도 10에 도시된 바와 같이, 상기 광 커플러의 표면에 결합된 상기 올리고뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드들은 랜던 시퀀스를 포함하며, 이는 도 11에 도시된 바와 같이 다양한 위치의 상기 성장 발생기 가닥에 혼성화할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 도 9에 도시된 바와 같이 전체 표면에 걸쳐 올리고뉴클레오티드들로 변형될 수 있다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 도 10 및 도 11에 도시된 바와 같이 표면의 일부 만이 올리고뉴클레오티드들로 변형될 수 있다,
일부 실시예들에 있어서, 도 12에 도시된 바와 같이 병합된 비오틴화된 우라실 염기들을 갖는 가닥을 포함하는 이중-가닥 표적 시퀀스는 단일-가닥 표적 핵산의 두 말단에 혼성화될 수 있는 결합 프라이머를 사용하여 원형 단일-가닥 표적 가닥을 제조하고, 비오틴화된 dUTP가 보충된 핵산 폴리머라제 및 dNTP 혼합물로 제2 가닥을 중합함으로써 생성된다. 상기 이중-가닥 표적은 변성되고 스트렙타아비딘-변형된 광 커플러 입자들과 결합되어, 도 13의 A에 도시된 바와 같이 비오틴화된 가닥에 의해 변성된 표적 가닥을 상기 광 커플러에 흡착시킬 수 있다. 폴리머라제, dNTPs, 시퀀싱 프라이머 및 핵산 합성에 적절한 버퍼 요소들을 첨가하면, 핵산-합성 반응 복합체가 형성되고, 상기 복합체는 도 13의 B 및 C에 도시된 바와 같이, 폴리머라제 혹은 표적 핵산의 고정화 없이 이동식 광 커플러의 표면에 흡착된다. 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼 요소들은 어댑터 사이트에 흡착된 주형에 상기 광 커플러의 위치 전 혹은 위치 이후에 첨가될 수 있다.
말단 결합 및 시퀀싱 프라이머들을 포함하는 프라이머들은 시퀀스의 시각 검사 혹은 컴퓨터-보조 프라이머 디자인을 포함하는 적절한 수단들에 의해 디자인될 수 있다. DNAStarTM(DNAStar, Inc., Madison, WI), OLIGO 4.0(National Biosciences, Inc.), Vector NTI(Invitrogen), Primer Premier 5(Premierbiosoft), 및 Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)을 포함하는 다양한 소프트웨어 패키지들이 프라이머 디자인을 보조하는데 사용될 수 있다. 프라이머들은 예를 들면, 시퀀싱되는 분자, 특이성, 길이, 바람직한 융점, 이차 구조, 프라이머 이합체, GC 함량, 버퍼 용액의 pH와 이온 강도 및 사용되는 효소(즉, 폴리머라제 혹은 리가제) 등을 고려하여 디자인될 수 있다(예를 들면, Joseph Sambrook and David Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (2001) 참조).
2-2-2. 시퀀싱 방식
일부 실시예들은 핵산을 시퀀싱하는 방법이다, 상기 방법은 a) (i) 이동식 광 커플러, (ii) 코어층 및 제1 클래딩 층을 포함하며, 상기 이동식 광 커플러에 대한 적어도 하나의 어댑터 사이트가 적어도 상기 제1 클래딩층 내에 형성된 도파관, 및 (iii) 광 검출기를 포함하는 검출 장치를 제공하는 단계; b) 적어도 하나의 핵산 분자를 제공하는 단계; c) 상기 적어도 하나의 핵산 분자를 개별적으로 상기 이동식 광 커플러 표면 상에 위치시키는 단계; d) 표면 상에 상기 적어도 하나의 핵산 분자가 위치된 상기 이동식 광 커플러를 상기 어댑터 사이트에 위치시키는 단계; e) 상기 적어도 하나의 핵산 분자의 단일 분자 합성에 의한 시퀀싱(sequencing-by-synthesis)을 수행하는 단계, 상기 단일 분자 핵산 합성에 의한 시퀀싱은 상기 핵산 내의 적어도 하나의 염기의 동일성과 상호연관된 방출광을 생성한다; f) 상기 방출광을 상기 검출기로 검출하여 출력 신호를 생성하는 단계; 및 g) 상기 출력 신호를 처리하여 상기 핵산에 포함되는 적어도 하나의 염기의 동일성을 결정하는 단계를 포함한다.
이러한 방법들에 있어서, "상기 적어도 하나의 핵산 분자를 개별적으로 상기 이동식 광 커플러 표면 상에 위치시키는 단계 및 표면 상에 상기 적어도 하나의 핵산 분자가 위치된 상기 이동식 광 커플러를 상기 어댑터 사이트에 위치시키는 단계"는 단일 핵산 분자가 어댑터 사이트에 위치된 이동식 광 커플러에 위치될 수 있으며, 즉 하나(및 하나를 초과하지 않는)의 핵산 분자가 위치된 적어도 하나의 어댑터 사이트가 존재할 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다. 일부 실시예들에 있어서, 그 표면 상에 위치된 핵산 분자를 포함하는 하나(및 하나를 초과하지 않는) 이동식 광 커플러를 각각 포함하는 복수의 어댑터 사이트틀이 존재할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 동작시, 상기 복수의 어댑터 사이트들의 일부는 표면 상에 각각 하나의 표적 핵산 분자를 갖는 광 커플러들을 포함하며, 다른 어댑터 사이트들은 광 커플러를 포함하지 않거나 표면-위치된 표적 핵산 분자를 갖지 않는 광 커플러를 포함한다. 즉, 샘플 용액 내에 표면-위치된 핵산을 갖는 광 커플러들의 농도는 모든 어댑터 사이트들이 표면-위치된 핵산을 갖는 광 커플러들을 포함하지 않도록 하는 특정의 값보다 작다. 이는 2 이상의 핵산 분자들이 시퀀싱이 원료되기 전에 어댑터 사이트에 위치되는 시나리오를 방지할 수 있으며, 따라서 하나의 시퀀싱 결과가 2 이상의 분자로부터의 정보를 포함하지 않도록 방지할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시예들에 있어서, 검출되거나 식별되는 어댑터 사이트들에 위치된 생물학적 분자들의 낮은 농도에 기인하여, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 혹은 1% 이하의 어댑터 사이트들이 신호를 발생할 수 있다. 제1 표적 핵산이 어댑터 사이트에 위치된 광 커플러 표면으로부터 분리되고 제2 핵산이 이어서 상기 어댑터 사이트에 위치된 동일한 광 커플러와 연관되는 경우, 상기 제1 핵산 시퀀싱의 결과는 병합된 뉴클레오티드들의 검출에 있어서 임의의 갭 및/또는 결정되는 뉴클레오티드 시퀀스들의 차이에 의해 상기 제2 핵산 시퀀싱 결과와 구별될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 단일 분자 핵산 합성에 의한 시퀀싱은 화학발광을 통해 광 방출을 유도한다. 주목할 것은, 이러한 실시예들에 있어서, 화학발광이 화학 에너지로부터 광을 생성하기 때문에 장치가 광원을 포함할 필요가 없다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 장치는, 예를 들면 상기 단일 분자 핵산 합성에 의한 시퀀싱을 유도하여 형광을 통해 광을 방출하기 위한 여기광을 제공하는데 사용될 수 있는 광원을 더 포함한다.
상기 검출 장치 및 방법은 당해 기술 분야에 공지된 수단에 의해 핵산을 검출 및 시퀀싱하는데 사용될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제6,946,249호 및 Shendure 둥의 Nat. Rev. Genet. 5:335-44 (2004) 참조). 이러한 시퀀싱 방식은 당해 기술 분야에 공지된 단일-분자 시퀀싱 방법들로부터 선택될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 시퀀싱 방법들은 DNA 폴리머라제 혹은 DNA 리가제의 특이성에 의존할 수 있으며, 예를 들면 염기 확장 시퀀싱(단일 염기 단계적 확장) 및 합성에 의한 다중-염기 시퀀싱(multi-base sequencing-by-synthesis, 예를 들면 말단-라벨링된 뉴클레오티드들로 시퀀싱)을 포함할 수 있다.
단일-분자 시퀀싱 방식에 있어서, 상기 검출 시스템은 단일 분자들을 재시퀀싱할 수 있는 이점을 제공할 수 있다. 예를 들면, 시퀀싱되는 주형 핵산 분자는 시퀀싱 프라이머와 함께 원형으로 제공될 수 있다. 재시퀀싱은 복수의 시퀀싱 사이클들을 수행하여 실행되며, 주형 핵산 분자 내의 뉴클레오티드들의 수보다 큰 시퀀스 해독을 얻을 수 있다. 따라서, 상기 시퀀싱 해독은 상기 주형 핵산 분자 내의 적어도 하나의 위치의 염기를 중복적으로 식별하는 정보를 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 시퀀싱 해독은 상기 주형 핵산 분자 내의 염기들의 적어도 25%, 50%, 75%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를 중복적으로 식별하는 정보를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 시퀀싱 해독은 3배, 4배, 5배, 7배 혹은 10배 또는 그 이상의 중복 정도로 상기 주형 핵산 분자 내의 염기들의 적어도 25%, 50%, 75%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 혹은 100%를 식별하는 정보를 포함한다. 동일한 분자를 재시퀀싱함으로써, 시퀀싱 에러가 시퀀싱 해독 수의 지수적으로 떨어질 것으로 기대된다. 예를 들면, 단일 해독에 대한 염기 당 에러율이 10-3인 경우, 두 번 해독 이후에는 이는 (10-3)2, 즉 10-6으로 떨어진다. 이는 시퀀싱에 사용되는 변형된 뉴클레오티드들이 이들의 라벨 또는 차단기(blocking group)들을 손실하여 예를 들면 스퓨리어스(spurious) 결실을 초래할 수 있으므로 단일-분자 시퀀싱에 있어 특히 유리하다.
뉴클레오티드들 상의 효소 및 형광단 라벨의 생존 능력은 핵산 합성 반응이 진행됨에 따라 점진적으로 감소될 수 있다. 시퀀스 해독 속도가 감소될 때, 반응 혼합물은 검출 시스템으로부터 세척되어 제거되고, 연속적인 시퀀스 해독을 위해 새로운 용액으로 교체될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 반응 혼합물은 세척 및 교체 보다는 새로운 시약들로 보충될 수 있다.
일반적으로, 단일-분자 시퀀싱에 있어서, 시퀀싱되는 적어도 하나의 핵산 분자는 프라이머와 접촉된다. 상기 프라이머는 예를 들면, 적어도 하나의 효소-촉매된 중합반응 혹은 리게이션 반응을 수행함으로써 변형된다. 상기의 적어도 하나의 반응은 핵산 내의 적어도 하나의 염기의 동일성과 상호연관된 광의 방출을 유도한다. "광의 방출을 유도"하는 것은 적어도 하나의 반응이 상기 핵산 내의 적어도 하나의 염기의 동일성과 연관되는 광방출이 일어나는 적어도 하나의 조건을 유도하는 것을 의미하는 것으로 이해된다: 이는 여기광, 화학 혹은 생물학적 발광 시스템 등을 통해 일어날 수 있다. 상기 적어도 하나의 조건은 예를 들면, 상기 적어도 하나의 반응의 산물 내부로의 형광단의 병합, 또는 파이로포스페이트의 방출을 포함할 수 있다. 따라서, 광은 외부의 여기의 존재 혹은 부존재하에 생성될 수 있다. 예를 들면, 단일-분자 시퀀싱은 예를 들면, 형광 라벨과 같은 공유-결합된 검출가능한 라벨 및 2차 확장을 방지하는 차단기를 포함하는 가역 말단 베이스 유사체들로 수행될 수 있으며, 상기 유사체는 여기되어 프라이머에 부가된 이후에 검출되고, 상기 라벨 및 차단기는 부가 후에 제거되어 또 다른 확장 라운드를 가능케한다. 이와는 달리, 파이로포스페이트와 같은 확장 단계의 산물은 파이로포스페이트-의존적 방식에 의해 광을 방출하는 화학 혹은 생물학적 발광 검출 시스템을 제공함으로써 외부 여기 없이 검출될 수 있다. 상술한 그리고 다른 방식들이 하기에 더 상세하게 논의된다.
방출된 광은 핵산 내의 적어도 하나의 염기의 동일성과 상호연관된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 상호연관은 일시적일 수 있다: 예를 들면, 광이 방출된 시간은 상이한 염기 유사체들이 상이한 시간에서 중합 반응에 사용되기 위해 제공되는 경우에서와 같이 적어도 하나의 염기의 동일성을 나타낸다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 상호 연관은 스펙트럼일 수 있다: 예를 들면, 방출된 광의 스펙트럼은 상이한 형광단을 포함하는 상이한 염기 유사체들이 중합 반응에 사용되기 위해 제공되는 경우에서와 같이 상기 적어도 하나의 염기의 동일성을 나타낸다.
일부 실시예들에 있어서, 단일-분자 핵산 시퀀싱은 다중 시퀀싱 사이클들을 포함한다. 시퀀싱 사이클은 적어도 하나의 염기의 동일성과 상호연관된 광의 발출을 유도하는 사건들이 제1 염기가 식별된 이후에 핵산 내의 적어도 제2 염기를 식별하기 위해 반복되는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 단일-분자 핵산 시퀀싱을 포함하는 방법들에 있어서, 상기 단일-분자 핵산 시퀀싱은 핵산 내의 적어도 주어진 수의 염기들의 동일성과 총체적으로 상호연관되는 적어도 주어진 수의 광의 방출을 유도하는 적어도 주어진 수의 시퀀싱 사이클들을 포함할 수 있으며, 상기 방법은 상기 핵산 내의 적어도 주어진 수의 염기들을 식별하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 주어진 수는 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 혹은 500일 수 있다.
시퀀싱 방법들은 핵산 내의 일 이상의 염기의 동일성을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 단일-분자 핵산 시퀀싱이 수행되면 적어도 제1 광학 센서 및 제2 광학 센서를 포함하는 적어도 하나의 광 검출기로 검출되는 광의 방출이 유도되며, 상기 적어도 2개의 광학 센서들로부터의 출력 신호가 처리되는 일부 실시예들에 있어서, 핵산 내의 적어도 하나의 염기의 동일성이, 적어도 하나의 처리 결과를 적어도 하나의 알려진 타입에 상응하는 적어도 하나의 공지된 결과와 비교함으로써 결정될 수 있다.
예를 들면, 상기 처리 결과는 반응이 일어난 시간을 지시할 수 있다: 방출된 광이 일시적으로 핵산 내의 적어도 하나의 염기의 동일성과 상호연관되었을 때, 상기 시간은 상기 핵산 내의 적어도 하나의 염기를 식별하는데 사용될 수 있다.
또 다른 실시예에 있어서, 상기 처리 결과는 어느 형광단이 반응 산물 내부로 병합되었는지에 대한 결정일 수 있다: 방출된 광이 핵산 내의 적어도 하나의 염기의 동일성과 스펙트럼에 의해 상호연관되었을 때, 상기 결정은 상기 핵산 내의 적어도 하나의 염기를 식별하는 데 사용될 수 있다.
2-2-2-1. 염기 확장 시퀀싱: 계단형 확장
일부 실시예들에 있어서, 검출 시스템은 염기 확장 시퀀싱 동안 발생된 광을 검출하는데 이용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 염기 확장 시퀀싱은 시퀀싱될 단일-가닥 핵산, 시퀀싱될 핵산의 3'말단과 연관된 말단 연결 프라이머, 및 이에 어닐링(anneal)될 시퀀싱 프라이머를 포함하는 부분적 이중(duplex) 샘플을 제공함으로써 개시된다. 일부 실시예들에서, 폴리머라제 및 변형된 뉴클레오티드들은 이후 적절한 버퍼에서 상기 광 검출 시스템에 적용된다. 일부 실시예들에서, 상기 뉴클레오티드들은 공유결합으로-연결된 검출가능한 라벨, 예를 들어 형광 라벨, 및 임의의 2차 확장을 방지하는 차단기(blocking group)를 포함할 수 있다. 이에 따라, 상기 시퀀싱은 단일 뉴클레오티드를 시퀀싱 프라이머의 상기 3'말단에 추가한 이후에 중단된다.
염기 확장 시퀀싱 반응의 일 실시예의 제1 단계에서, 형광 차단기를 갖는 뉴클레오티드는 DNA 폴리머라제에 의해서 시퀀싱 프라이머의 상기 3'말단에 추가될 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 형광 라벨은 상기 차단기로 역할할 수 있다. 다른 실시예들에서, 그들은 분리된 잔기들일 수 있다. 단일 뉴클레오티드는 시퀀싱 프라이머의 상기 3'말단에 병합될 수 있고, 그 라벨에 의해서 대응하는 광 검출기에 의해 식별될 수 있다. 상기 형광 라벨 및 차단기는 이후, 예를 들어 화학적 또는 효소 용해에 의해 제거되어 염기 확장의 추가적인 사이클을 가능하게 한다. 특정 실시예들에서, 상기 라벨 및 차단기들은 동시에 또는 순서에 관계없이 순차적으로 제거될 수 있다. 추가될 염기의 순서를 컴파일함으로써, 상기 샘플 핵산의 상기 시퀀스는 상기 3'에서 5'방향으로 한번에 1개의 염기씩 추정될 수 있다.
일반적으로, 계단형 확장 동안 추가될 뉴클레오티드를 인식하는 2가지 방법이 있다. 첫 번째 경우, 4개의 뉴클레오티드들은 모두 동일한 검출가능한 라벨을 가지지만, 미리 정해진 순서로 한번에 하나씩 추가된다. 상기 확장된 뉴클레오티드의 동일성은 상기 확장 반응에서 추가된 상기 뉴클레오티드의 순서에 의해서 결정된다. 확장하는 동안 결합된 상기 염기를 인식하는 두 번째 경우, 4개의 다른 뉴클레오티드들은 동시에 추가되고, 각각은 별개의 검출가능한 라벨과 연결된다. 다른 실시예들에서, 상기 라벨들의 여기 또는 방출 스펙트럼들 및/또는 강도는 다를 수 있다. 상기 확장에서 추가되는 뉴클레오티드의 동일성은 상기 검출된 라벨의 강도 및/또는 파장(예를 들어, 여기 또는 방출 스펙트럼들)에 의해서 결정될 수 있다.
2-2-2-2. 합성에 의한 시퀀싱: 다단계 확장
일부 실시예들에서, 합성에 의한 시퀀싱은 복수의 중단되지 않는 확장들로, 예를 들어, 차단기들을 이용하지 않고, 진행될 수 있다. 이러한 실시예들에서, 상기 중합반응은 뉴클레오시드(nucleoside) 트리포스페이트 가수분해 이후에 파이로포스페이트의 방출을, 즉 베타 및 감마 포스페이트 복합체의 방출을 검출함으로써 모니터링 될 수 있다. 이러한 복합체는 직접적으로, 예를 들어 상기 복합체 상에 형광 잔기에 의해서, 또는 간접적으로, 예를 들어 상술한 바와 같이 상기 파이로포스페이트를 화학- 또는 바이오-발광 검출 시스템에 연결하여 검출될 수 있다.
일부 실시예들에서, 상기 샘플 핵산은 말단-포스페이트-라벨링된 뉴클레오티드들을 이용하여 본질적이고 연속적으로 시퀀싱될 수 있다. 말단-포스페이트-라벨링된 뉴클레오티드들 및 그 이용 방법들에 대한 예시적인 실시예들은 미국 특허 번호 7,361,466 및 2007년 6월 21일 공개된 미국 특허 공개 번호 2007/0141598에 설명되어 있다. 간단하게, 상기 뉴클레오티드들은 상기 검출 시스템에 적용될 수 있고, 상기 중합반응 동안 가수분해될 때, 상기 라벨링된 파이로포스페이트는 대응하는 광 검출기에 의해서 검출될 수 있다. 일부 실시예들에서, 4개의 뉴클레오티드들 모두 별개의 라벨들을 포함할 수 있고, 동시에 추가될 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 뉴클레오티드들은 구별할 수 없는, 즉, 동일한 라벨들을 포함하고, 소정의 순서에 따라 순차적으로 추가될 수 있다. 구별할 수 없는 라벨들을 갖는 순차적이고, 주기적인 뉴클레오티드들의 추가는 여전히 복수의, 중단되지 않는 중합 단계들을, 예를 들어 호모폴리머 시퀀스들에서 가능하게 한다.
2-2-3. 추가적인 적용예들
상기 검출 장치는 동시에 수백만 개의 핵산 세그먼트들을 검출할 수 있다. 만약, 각각의 세그먼트가, 예를 들어, 1000개의 염기에 해당하는 길이라면, 단일 장치는 1회에 수십억 개의 염기 시퀀스들까지 획득할 수 있다. 아래에서 설명되는 것은 여기에서 제공되는 상기 시스템들 및 방법들의 추가적인 적용예들이다.
2-2-3-1. 전체-게놈 시퀀싱
상기 검출 시스템은 예를 들어, 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 진핵생물 또는 척추동물, 예를 들어, 포유류, 예를 들어, 인간의 전체적인 또는 부분적인 게놈을 시퀀싱하는데 이용될 수 있다.
게놈 DNA는 시퀀싱을 위해서 적어도 20, 50, 100, 200, 300, 500, 800, 1200, 1500개의 뉴클레오티드 또는 그 이상의 절편로 절단될 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 절단된 게놈 DNA는 20 내지 50, 20 내지 100, 20 내지 500, 20 내지 1000, 500 내지 1200, 500 내지 1500개의 뉴클레오티드들의 길이일 수 있다. 일부 실시예들에서, 연관된 말단 연결 프라이머들에 따라 시퀀싱될 상기 핵산들은 단일 가닥으로 형성되고 시퀀싱 프라이머에 어닐링되고, 상술한 바와 같이 시퀀싱을 위한 상기 검출 시스템에 적용된다.
2-2-3-2. 유전자 발현 프로파일링
다른 실시예들에서, 상기 검출 시스템은 유전자 발현 프로파일링을 위한 cDNA 시퀀스를 하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, mRNA 레벨들은 장치 상에서 검출되는 특정 시퀀스의 상대적 빈도를 측정함으로서 정량화될 수 있다. 수백만 개의 cDNA 분자들은 여기에서 설명되는 바와 같이 장치 상에서 평행하게 시퀀싱될 수 있다. 만약 세포가 평균적으로 350,000 mRNA 분자들을 포함한다면, 세포당 하나의 복제가 있을 때 존재하는 전사체는 백만개의 시퀀싱 반응들에서 약 3배로 시퀀싱될 것으로 기대된다. 따라서 상기 검출 시스템은 단일-복제-숫자 민감도를 이용한 단일-분자 시퀀싱에 적합하다. 다른 실시예들에서, 상기 검출 시스템은 유전자 발현 분석을 위한 RNA를 직접적으로 시퀀싱하는데 이용될 수 있다(즉, 직접적 RNA 시퀀싱, 참조 예를 들어, Ozsolak et al.,Nature 461: 814-818 (2009)).
cDNA 합성은 당해 기술 분야에서 널리 알려져 있고, 전형적으로 mRNA의 선택적인 농축과 함께 전체 RNA 추출을 포함할 수 있다. cDNA는, 예를 들어, 제1 가닥 합성을 위한 역전사, RNAse 처리를 통한 잔류 RNA 제거, 상기 제1 가닥의 랜덤 6합체 프라이밍(random hexamer priming), 및 DNA 폴리머라제에 의한 제2 가닥 합성을 포함하는 단계들에 의해서 mRNA로부터 생산된다. 얻어지는 cDNA는 여기에서 설명되는 상기 시스템들 상에서 시퀀싱하는데 적합하다. DNA와 RNA를 모두 제조하고 분리하는 방법들은 당해 기술 분야에서 널리 알려져 있다. 예를 들어, Joseph Sambrook and David Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (2001)을 참조할 수 있다.
2-2-3-3. 추가적인 검출 방법들
(a) FRET
일부 실시예들에서, 분자는 상기 검출 시스템 상에서 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer; FRET)(또한 포스터 공명 에너지 전이(Forster resonance energy transfer; FRET)로 알려짐)에 의해서 검출될 수 있다. 당해 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 여기된 도너 분자가 비복사(non-radiatively)방식으로 억셉터 분자에 에너지를 전달할 때, FRET이 일어나고, 상기 억셉터 분자는 상기 에너지를 주로 광으로 방출한다. FRET은, 예를 들어, 검출될 분자의 유효 여기(effective excitation)와 방출 파장 사이의 보다 큰 스펙트럼 분리를 제공함으로써, 백그라운드 광을 감소시키는 것을 도울 수 있다. 그 효율이 도너와 억셉터 분자들 사이의 거리의 여섯 제곱에 따라 감소하기 때문에, FRET은 근접한 분자 상호작용들을 검출하는데 자주 이용된다. 예들 들어, Zhang et al. (Nature Materials 4:826-31 [2005])은 FRET을 통해서 핵산 혼성화를 검출했다. 상기 문헌에서, 비오틴화된 핵산 표적은 아비딘(avidin)-코팅된 양자점 도너에 콘쥬게이트되고, 상기 양자점 도너는 이후 Cy5-conjugated DNA 프로브를 여기시켰다. 일부 실시예들에서, 샘플 용액 내에서 자유로운 라벨링된 분자 및 상기 자유 분자에 결합되고, 이동식 광 커플러의 표면 상에 위치된 라벨링된 분자 또는 분자 복합체가 FRET에 의한 검출을 위한 도너/억셉터(또는 그 반대) 쌍을 형성할 수 있다.
상기 검출 시스템을 이용하는 핵산 시퀀싱의 일부 실시예들에서, 형광으로 라벨링된 뉴클레오티드들은 폴리머라제 또는 리가제에 부착된 도너 발색단에 대한 억셉터 발색단으로 기능한다. 따라서 이들 실시예들에서, 상기 도너 발색단은 상기 폴리머라제 또는 리가제 상에 위치되고, 상기 표적 핵산 상에서 중합되는 또는 결합되는 뉴클레오티드 상의 억셉터 발색단을 여기할 수 있다. 상기 폴리머라제에 근접하지 않은 뉴클레오티드들은 FRET 효율의 빠른 감소로 인해서 여기되지 않을 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 도너 분자는 예를 들어, 다른 형광단, 예들 들어, 양자점일 수 있다. 양자점들, 예를 들어 반도체 양자점들은 당해 기술 분야에서 알려져 있고, 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO 03/003015에서 설명된다. 예를 들어 생분자들에서 양자점들을 커플링하는 것의 의미는 당해 기술분야에서 알려져 있고, 예를 들어, Mednitz et al., Nature Materials4:235-46 (2005) 및 각각 2006년 3월 20일과 2008년 4월 17일에 공개된 미국 특허 공개 번호 2006/0068506 및 2008/0087843에서 설명되었다. 일부 실시예들에서, 양자점들은 DNA 폴리머라제 분자에 콘쥬게이트될 수 있다. 이미 설명된 바와 같이 효소들을 결합 사이트들에 콘쥬게이팅함에 있어서, 형광단들을 예를 들어, DNA 폴리머라제 또는 리가제에 콘쥬게이팅할 때, 상기 효소의 제1, 제2 및 제3 구조들 상에 상기 형광단을 콘쥬게이팅하는 모든 효과를 완화시킴으로서 효소 기능을 보존하는데 주의를 기울여야 한다는 것을 숙련된 기술자들은 의문을 가지지 않고 인식할 수 있다.
(b) 다-광자(multi-photon) 여기
일부 실시예들에서, 발색단은 2개 또는 그 이상의 광자들에 의해서 여기될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예들에서, FRET에서 도너 또는 억셉터 발색단 중에서 어느 하나에 의한 여기는 2개 또는 그 이상의 광자들을 통해서 일어날 수 있다. 2개의 광자 및 다-광자 여기는 예를 들어, 미국 특허 번호 6,344,653 및 5,034,613에서 상세히 설명된다.
(c) 시분해 검출
일부 실시예들에서, 검출 시스템의 여기 광원 및 광 검출기들은 특유의 위상 변이를 가지도록 변조될 수 있다. 당해 기술 분야에서 알려진 방법, 예를 들어 2008년 2월 14일에 공개된 미국 특허 공개 번호 2008/0037008에서 공개된 방법들을 이용할 때, 분자로부터 방출되어서 상기 검출 시스템 상에서 검출되는 광은 대응하는 광 검출기에 의해서 여기 광원으로부터의 간섭없이 측정될 수 있다.
(d) 다른 형광 검출 시스템들 및 방법들
일부 실시예들에서, 방법들은 살아있는 또는 고정된 세포일 수 있는 생물학적 세포 내의 적어도 하나의 개체에 의해서 방출된 광의 검출과 관련된다. 일부 실시예들에서, 상기 적어도 하나의 개체는 적어도 하나의 양자점을 포함하는 적어도 하나의 개체, 적어도 하나의 형광 단백질을 포함하는 적어도 하나의 개체 및 적어도 하나의 형광 소형 화학적 잔기를 포함하는 적어도 하나의 개체로부터 선택된다. 일부 실시예들에서, 상기 적어도 하나의 개체는 형광으로 라벨링되고, 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 올리고펩타이드, 올리고당, 다당류 또는 지질을 포함한다.
일부 실시예들에서, 상기 적어도 하나의 개체는 최대 20, 10, 5, 또는 2개의 형광단과 같이 고정되고 제한된 숫자의 형광단을 포함하고, 이는 양자점들, 형광 단백질들, 및 형광 소형 화학 잔기들로부터 선택된다. 형광 소형 화학 잔기들의 많은 실험예들이 위에서 논의되었다. 일부 실시예들에서, 형광 소형 화학 잔기들은 300㎚ 및 800㎚사이의 방출 피크를 및/또는 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 또는 0.9의 양자 수율(흡수된 피크 흡수 파장의 광자에 대한 방출된 광자의 분율)을 가진다.
3. 실시예들
3-1. 실시예 1 - 표면 상에 위치된 핵산-합성 반응 복합체를 갖는 나노- 스피어 광 커플러의 제조
단일-가닥(single-stranded) 원형 DNA 주형이 도 8에서 도시된 상기 공정을 이용하여 구성된다. 표적 이중-가닥 핵산 절편들의 풀(pool)이 변성되고 자기-상보적 어댑터 핵산 분자들과 결합된다. 상기 어댑터 핵산 분자들을 각각의 상기 표적 핵산 절편들의 하나의 가닥의 말단들에 상보적인 돌출된 시퀀스(overhanging sequence)들을 포함한다. 상기 어댑터 분자들은 상기 단일-가닥 표적 가닥들에 어닐링되고, 리게이팅 효소는 상기 어댑터 분자들을 각각의 상기 표적 핵산 단편들에 결합시키도록 추가된다. 이러한 리게이션의 결과물들은 이후 변되고, 각각의 표적 가닥의 말단들에 결합된 양쪽의 분자 시퀀스들에 상보적인 연결 핵산 분자들과 결합된다. 각각의 표적 가닥은 이후 리게이팅 효소를 이용하여 원형이 된다.
상기 원형화된 표적 가닥 및 혼성화된 연결 핵산 분자는 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 적절한 버퍼 요소들과 결합되어 핵산-합성 반응 복합체를 형성하고, 상기 연결 핵산 분자는 시퀀싱 프라이머로 기능한다. 상기 폴리머라제는 상기 원형 주형 주위를 반복적으로 진행하고, 연속적인 주형의 복제시 발생기 가닥을 상기 주형으로부터 분리시켜서, 상기 표적 가닥은 이후 연속적인 방법으로 복제된다. 이것은 상기 표적 시퀀스의 보체(complement)의 복수의 복제들을 포함하는 DNA의 발생기 가닥을 생산하고, 이들 복제물들은 각기 상기 시퀀싱 프라이머의 시퀀스를 가지는 세그먼트에 의해서 분리된다.
나노-스피어 입자의 표면은 스트렙타아비딘(streptavidin)으로 화학적으로 변형된다. 상기 시퀀싱 프라이머(상기 연결 핵산 분자)의 시퀀스에 상보적인 시퀀스를 포함하는 비오틴화된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 스트렙타아비딘-변형된 나노-스피어와 결합되고, 상기 비오틴화된 프라이머들을 상기 나노-스피어에 연결한다. 올리고뉴클레오티드-코팅된 나노-스피어는 아래 단락에서 설명되는 상기 DNA 폴리머라제, 원형 주형 가닥 및 복제된 가닥을 포함하는 반응 복합체와 결합된다. 상기 복제된 가닥 내에 내장된 상기 시퀀싱 프라이머 시퀀스들은 상기 나노-스피어의 표면 상에 고정화된 상기 올리고뉴클레오티드들에 대해서 혼성화되어, 도 9에서 도시된 바와 같이 상기 반응 복합체를 상기 나노-스피어의 표면에 고정(anchor)시킨다.
3-2. 실시예 2 - 특정 프라이머들을 이용하여 하나의 반구 상에 위치된 핵산-합성 반응 복합체를 갖는 나노-스피어 광 커플러의 제조
나노-스피어 입자는 스트렙타아비딘으로 하나의 반구 상에서 변형된다. 시퀀싱 프라이머(예를 들어, 도 8에 도시된 바와 같이 연결 핵산 분자)의 시퀀스에 상보적인 시퀀스를 각기 포함하는 비오틴화된 올리고뉴클레오티드 프라이머들은 스트렙타아비딘-변형된 나노-스피어와 결합되고, 상기 나노-스피어의 상기 스트렙타아비딘-코팅된 반구에 상기 비오틴화된 프라이머들을 연결한다. 상기 올리고뉴클레오티드-코팅된 나노-스피어는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 DNA 폴리머라제, 원형 주형 가닥 및 복제된 가닥을 포함하는 반응 복합체와 결합된다. 상기 복제된 가닥 내에 내장된 상기 시퀀싱 프라이머 시퀀스들은 상기 나노-스피어의 하나의 반구 상에 고정된 상기 상보적 올리고뉴클레오티드들에 대해서 혼성화되어 도 10에서 도시된 바와 같이 상기 반응 복합체를 상기 나노-스피어의 표면에 고정(anchor)시킨다.
3-3. 실시예 3 - 랜덤 시퀀스 프라이머들을 이용하여 하나의 반구 상에 위치된 핵산-합성 반응 복합체를 갖는 나노-스피어 광 커플러의 제조
나노-스피어는 스트렙타아비딘으로 하나의 반구 상에서 변형된다. 랜덤 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 비오틴화된 올리고뉴클레오티드 프라이머들은 스트렙타아비딘-변형된 나노-스피어와 결합되어서, 상기 비오틴화된 프라이머들을 상기 나노-스피어의 상기 스트렙타아비딘-코팅된 반구에 연결한다. 상기 올리고뉴클레오티드-코팅된 나노-스피어는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 DNA 폴리머라제, 원형 주형 및 복제된 가닥을 포함하는 반응 복합체와 결합된다. 발생기(nascent) 복제된 가닥은 상기 나노-스피어의 하나의 반구 상에 고정된 상기 올리고뉴클레오티드들에 혼성화화되어서, 도 11에서 도시된 바와 같이 상기 반응 복합체를 상기 나노-스피어의 상기 표면에 고정시킨다.
3-4. 실시예 4 - 비오틴화된 이중-가닥 템플릿에 의한 하나의 반구 상에 위치된 핵산-합성 반응 복합체를 갖는 나노-스피어 광 커플러의 제조
이중-가닥 원형 DNA 주형이 도 12에서 도식화된 상기 공정을 이용하여 구성된다. 표적 이중-가닥 핵산 절편들의 풀(pool)이 변성되고 자기-상보적 어댑터 핵산 분자들과 결합된다. 상기 어댑터 핵산 분자들은 각각의 상기 표적 핵산 절편들의 하나의 가닥의 말단들에 상보적인 돌출된 시퀀스들을 포함한다. 상기 어댑터 분자들은 상기 단일-가닥 표적 가닥과 어닐링되어, 리게이팅 효소는 상기 어댑터 분자들을 각각의 표적 핵산 절편에 결합시키도록 추가된다. 이러한 리게이션 결과물들은 이후 변성되고, 각각의 표적 가닥의 말단들에 결합된 양쪽의 어댑터 분자 시퀀스들에 상보적인 연결 핵산 분자와 결합된다. 각각의 표적 가닥은 이후 리게이팅 효소를 이용하여 원형이 된다.
비오틴-디옥시우리딘삼인산염(biotin-dUTP)로 보충된 핵산 폴리머라제 및 dNTP 혼합물은 상기 어닐링된 DNA 분자들에 추가된다. 상기 혼성화된 연결 핵산 분자들은 시퀀싱 프라이머로 기능하고, 비오틴화된 우라실(uracil) 염기들을 포함하는 제2 가닥은 가닥-대체(strand-displacing) 활성없이 폴리머라제를 이용하여 합성된다. 상기 폴리머라제가 상기 제2 가닥의 합성을 완료할 때, 상기 합성 혼합물 내에 포함된 리게이팅 효소는 폐쇄된, 원형의, 이중-가닥 DNA를 형성한다.
상기 폐쇄된, 원형의, 이중-가닥 DNA는 변성되고 스트렙타아비딘으로 변형된 하나의 반구를 갖는 나노-스케일 입자와 혼합된다. 상기 DNA 및 스트렙타아비딘-변형된 입자는 도 13의 A에서 도시된 바와 같이 나노-스피어 입자 당 단일 주형이 붙기 위해서 적절한 몰 비율로 결합된다. 비오틴화되지 않는 가닥은 상기 나노-스피어의 상기 표면 상에 위치된 상기 비오틴화된 가닥과 연관됨으로써 상기 나노-스피어의 상기 표면 상에 위치된다.
DNA 폴리머라제, 상기 표적 가닥에 상보적인 시퀀싱 프라이머, 형광으로 라벨링된 dNTPs, 및 적절한 버퍼 요소들은 상기 나노-스피어 및 결합된 주형과 결합되어서 DNA-합성 반응 복합체가 상기 나노-스피어의 상기 표면 상에 형성되도록 한다(도 13의 B). 상기 폴리머라제는 상기 주형 주위를 진행하여, 발생기(nascent) 합성된 가닥을 형성한다(도 13의 C).
3-5. 실시예 5 - 표면-위치된 핵산-합성 복합체를 갖는 자성 나노-스피어의 어댑터 사이트를 도파관에 위치시킴.
나노-스피어 입자는 자성 작용기들로 균일하게 표면-변형된다. 핵산-합성 반응 복합체는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 상기 나노-스피어의 상기 자기적으로-변형된 표면 상에 위치된다. 표면-위치된 반응 복합체를 갖는 상기 나노-스피어는 상기 어댑터 사이트 아래에 위치된 마이크로 코일들(micro-fabricated coils)의 이용을 통해서 도파관 내에 형성된 어댑터 사이트에 위치된다. 상기 마이크로 코일들을 관통하는 전류를 통과시키는 것은 상기 어댑터 사이트에 표면-위치된 반응 복합체를 갖는 상기 나노-스피어를 트랩(trap)하는 자기장을 형성한다. 따라서 상기 반응 복합체는 상기 도파관 내의 어댑터 사이트에서 광 커플러의 표면 상에 위치되고, 상기 도파관의 상기 코어층의 상기 표면 근처의 한정된 공간 내에 위치된다.
3-6. 실시예 6 - 표면-위치된 핵산-합성 복합체를 갖는 비대칭 자성 나노-스피어의 어댑터 사이트를 도파관에 위치시킴.
나노-스피어 입자는 그 표면의 일부 상의 자성 작용기들로 변형된다. 핵산-합성 반응 복합체는 실시예들 2 내지 4 중에서 어느 하나에서 설명된 상기 나노-스피어의 상기 자기적으로-변형된 표면 상에 위치되고, 자성 작용기들로 변형된 상기 나노-스피어의 동일한 표면은 또한 스트렙타아비딘으로 변형된다. 표면-위치된 반응 복합체를 갖는 나노-스피어는 어댑터 사이트 아래에 위치된 마이크로 코일들의 이용에 의해서 도파관 내에 형성된 상기 어댑터 사이트에 위치된다. 상기 마이크로 코일들을 관통하는 전류를 통과시키는 것은 상기 도파관의 상기 코어층을 향하는 흡착된 반응 복합체를 갖는 상기 자기적으로-변형된 표면과 함께 흡착된 반응 복합체를 갖는 상기 나노-스피어를 상기 어댑터 사이트에 트랩한다. 따라서 상기 반응 복합체는 상기 도파관의 상기 코어층의 상기 표면 근처에서 제한된 공간 내의 상기 어댑터 사이트에 위치된다.
3-7. 실시예 7 - 표면-위치된 핵산-합성 복합체를 갖는 도전성 물질-변형 나노-스피어의 어댑터 사이트를 도파관에 위치시킴
나노-스피어 입자는 도전성 물질로, 예를 들어 전하를 갖는 그룹(charged group)들을 포함하는 물질로, 균일하게 표면-변형된다. 핵산-합성 반응 복합체는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 상기 나노-스피어의 상기 도전성 물질-변형 표면 상에 위치된다. 표면-위치된 반응 복합체를 갖는 나노-스피어는 어댑터 사이트에서 마이크로 전극(micro-fabricated electrode)들을 이용에 의해서 도파관 내에 형성된 상기 어댑터 사이트에 위치된다. 상기 마이크로 전극은 상기 어댑터 사이트 아래에 위치된 유리 슬라이드를 포함하고, 상기 유리 슬라이드는 상기 전극 도전성 표면으로 역할하는, 예를 들어 산화 인듐 주석(ITO)과 같은 도전성 물질의 층으로 코팅된다. 도전성 물질로 유사하게 코팅되고, 상기 반응-복합체-로딩된 나노-스피어들을 포함하는 상기 샘플 용액 상부에 위치되는 유리 슬라이드는 대향 전극으로 역할한다. 전류는 상기 마이크로 전극들에 가해져서 상기 전극들 사이에 전기 포텐셜 차이를 형성하고, 이는 표면-위치된 반응 복합체를 갖는 나노-스피어를 상기 어댑터 사이트에 트랩한다. 따라서 상기 반응 복합체는 상기 도파관 내의 어댑터 사이트에서 광 커플러의 상기 표면 상에 위치되고, 상기 도파관의 상기 코어층의 표면 근처의 한정된 공간 내에 위치될 수 있다.
3-8. 실시예 8 - 표면-위치된 핵산-합성 복합체를 가지고, 도전성 물질로 비대칭적으로 변형된 나노-스피어의 어댑터 사이트를 도파관에 위치시킴
나노-스피어 입자는 그 표면의 부분 상에서 도전성 물질로 변형된다. 핵산-합성 반응 복합체는 실시예들 2 내지 4 중에서 어느 하나에서 설명된 상기 나노-스피어의 상기 도전성 물질-변형 표면 상에 위치되고, 도전성 물질로 변형된 상기 나노-스피어의 동일한 표면이 또한 스트렙타아비딘으로 변형된다. 표면-위치된 반응 복합체를 갖는 상기 나노-스피어는 어댑터 사이트에서 마이크로 전극의 사용에 의해서 도파관 내에 형성된 상기 어댑터 사이트에 위치된다. 상기 마이크로 전극은 상기 어댑터 사이트 아래에 위치된 유리 슬라이드를 포함하고, 상기 유리 슬라이드는 상기 전극 도전성 표면으로 역할하는, 예를 들어 산화 인듐 주석(ITO)과 같은 도전성 물질의 층으로 코팅된다. 도전성 물질로 유사하게 코팅되고, 상기 반응-복합체-로딩된 나노-스피어들을 포함하는 상기 샘플 용액 상부에 위치되는 유리 슬라이드는 대향 전극으로 역할한다. 전류는 상기 마이크로 전극들에 가해져서 상기 전극들 사이에 전기 포텐셜 차이를 형성하고, 이는 상기 도파관의 상기 코어층을 향하는 상기 반응 복합체 및 도전성 물질로 변형된 상기 나노-스피어의 표면과 함께, 표면-위치된 반응 복합체를 갖는 상기 나노-스피어를 상기 어댑터 사이트에 트랩한다. 따라서 상기 반응 복합체는 상기 도파관의 상기 코어층의 표면 근처에 한정된 공간 내에서 상기 어댑터 사이트에 위치된다.
3-9. 실시예 9 - 표면-위치된 핵산-합성 복합체를 가지는 친수성기-변형 나노-스피어의 어댑터 사이트를 도파관에 위치시킴
나노-스피어 입자는 하나의 반구 상의 친수성 작용기들 및 그 다른 반구 상의 소수성 작용기들로 변형된다. 핵산-합성 반응 복합체는 실시예 2 내지 4 중 어느 하나에서 설명된 바와 같이 상기 나노-스피어의 상기 친수성 표면 상에 위치되고, 친수성기들로 변형된 상기 나노-스피어의 동일한 표면이 또한 스트렙타아비딘으로 변형된다. 표면-위치된 반응 복합체를 갖는 상기 나노-스피어는 어댑터 사이트에 위치되고, 상기 어댑터 사이트는 도 6에서 도시된 바와 같이(표면(1,3)은 친수성이고, 표면(2,4)는 소수성임) 반응 사이트에서 친수성 표면 변형을 가지고, 상기 반응 사이트의 밖에서 소수성 표면 변형을 가진다. 상기 나노 스피어는 상기 반응 사이트에 배치된 상기 위치된 반응 복합체를 가지는 상기 나노 스피어의 상기 친수성 표면을 갖는 상기 어댑터 사이트에서 상기 도파관의 상기 코어층을 향하도록 배향된다. 따라서 상기 반응 복합체는 상기 도파관의 상기 코어층의 표면 근처의 한정된 공간 내에서 상기 어댑터 사이트에 위치된다.
3-10. 실시예 10 - 이동식 광 커플러 상에 위치된 핵산-합성 반응 복합체의 시퀀싱
핵산-합성 반응 복합체는 실시예들 5 내지 9 중 어느 하나에서 설명된 바와 같이 도파관 내에 형성된 어댑터 사이트에 위치된 나노-스피어 입자상에 위치된다. 상기 샘플 용액은 각각의 dATP, cDTP, dGTP 및 dTTP의 고유의 형광단을 갖는 베타(beta) 또는 감마(gamma) 포스페이트들로 라벨링된 dNTPs를 포함한다. 상기 샘플 용액은 DNA 폴리머라제 및 적절한 버퍼 요소들과 같은 추가적인 시퀀싱 시약들로 보충될 수 있다. DNA 복제 포크(duplication fork) 및 상기 나노-스피어의 표면 사이의 거리는 수십 내지 수백 나노미터의 범위에 있다. 상기 합성 반응의 각 단계에서, dNTPs로 라벨링된 4가지 타입들 중에 하나는 상기 반응 복합체의 상기 활성 사이트와 연관되고, 그 염기는 표적 핵산의 대응하는 염기와 짝을 이룬다. 형광성 라벨은 어댑터 사이의 하면에 형성된 소산 광 필드(evanescent light field) 및/또는 상기 나노-스피어의 상기 표면으로부터 방출하는 상기 소산 광 필드에 의해서 여기된다. 형광단-표시된 뉴클레오티드 폴리포스페이트의 성장하는 뉴클레오티드 가닥의 상기 활성 사이트에서의 결합은 dNTP-연결된 형광단의 방사를 검출함으로써 실시간으로 검출된다. 각 결합된 뉴클레오티드의 동일성은 그 형광 라벨에 의해서 결정되고, 상기 형광 라벨은 이후 상기 성장하는 가닥에 결합한 상기 뉴클레오티드로부터 분리된다. 상기 표적 핵산의 시퀀스는 상기 중합반응 동안 검출된 형광 방출 신호들의 순서를 핵산 시퀀스로 변환하여 얻어진다.
3-11. 실시예 11 - 나노-스피어로 향하는 광의 광학 커플링에 의해서 350㎚-지름 나노-스피어 광 커플러 주위로 형성된 여기 광 필드의 시뮬레이션
어댑터 사이트 및 나노-스피어 광 커플러를 포함하는 단일 모드 도파관을 관통하는 여기광 전파의 시뮬레이션은 나노-스피어가 상기 단일 모드 도파관으로부터의 광과 커플링하는 것을 보여준다. 이동식 광 커플러 어댑터 사이트 및 나노-스피어 광 커플러를 포함하는 단일 모드 도파관을 포함하는 시뮬레이션된 검출 시스템의 개략적인 도면이 도 14에 제공된다. 상기 시뮬레이션된 시스템에서, 상기 광 커플러 나노-스피어(Ta2O5) 및 도파관 핵심층(Ta2O5)은 2.26의 굴절률을 가진다. 상기 단일 모드 도파관의 코어층의 두께는 100㎚이고, 하부 클래딩층의 두께는 500㎚이다. 상기 도파관의 상기 클래딩층들은 1.487의 굴절률을 가지는 실리콘 산화물(SiO2)로 구성된다. 상기 이동식 광 커플러 나노-스피어는 350㎚의 지름을 가지고, 상기 어댑터 사이트에 위치된다. 상기 어댑터 사이트는 역전된, 콘(cone)형 나노웰(nanowell)이고, 상기 나노웰은 112.6°의 개방 각도(즉, 상기 콘의 일 측면으로부터 직접적으로 대향하는 측면까지의 각도)를 가진다. 상기 나노웰의 상기 원형 하부의 지름은 100㎚이고, 상기 나노웰은 1.33의 굴절률을 가지는 물로 채워진다. 이러한 구성에서, 상기 광 커플러 및 상기 코어층은 단일 횡단 전기(single transverse electric(TE)) 및 횡단 자기(transverse magnetic(TM)) 모드로 광파들의 전파를 허용한다.
입사광의 파장은 473㎚이다. 상기 시스템 내에서 정상 전기장 및 자기장 분포는 무료 소스(source free) 맥스웰 방정식을 이용하여 계산된다(Katrin Schmitt and Christian Hoffmann, "High-Refractive-Index Waveguide Platforms for Chemical and Biosensing", in Optical Guided-wave Chemical and Biosensors I, Springer Series on Chemical Sensors and Biosensors 7, 21 (M. Zourob and A. Lakhtakia eds., 2009.) 참조).
이러한 구성에서, TE-모드 및 TM-모드 필드들은 모두 도 15(TE-모드 필드) 및 도 16(TM-모드 필드)에서 도시된 바와 같이 상기 도파관의 상기 코어층 및 상기 나노-스피어의 표면의 영역을 따라서 전파한다. 상기 정상 전기장과 유사하게, 상기 정상 자기장의 일부도 도 17에서 도시된 바와 같이 상기 코어층으로부터 상기 나노-스피어 표면 영역으로 전달된다.
추가적인 시뮬레이션들에서, 상기 어댑터 사이트는 상기 도파관의 상기 코어층 내부로 연장한다. 각기 상기 나노웰이 상기 코어층으로 연장하지 않는 경우, 상기 코어층 내부로 부분적으로 연장하는 경우, 상기 코어층 내부로 전체적으로 연장하는 경우의 상기 시스템의 상기 광 필드가 도 18, 19 및 20에서 위상학적으로 도시된다. 도 18, 19 및 20의 좌측의 이미지들((a)로 표시됨)은 상기 도파관 내에서 상기 광 필드의 강도 등고선들을 도시한다. 도 18, 19 및 20의 우측의 이미지들((b)로 표시됨)은, 상기 나노-스피어가 상기 어댑터 사이트에 위치할 때, 상기 검출 시스템 내에서 상기 광 필드의 강도 등고선들을 도시한다. 상기 나노-스피어가 없을 때, 에너지가 상기 도파관 주위에서 3가지 종류의 두께로 전달된다. 하지만, 상기 나노-스피어가 상기 어댑터 사이트에 위치할 때, 광 필드는 상기 나노-스피어의 표면 상에 유도된다. 상기 어댑터 사이트가 상기 도파층의 상기 코어층으로 연장하는 거리가 증가할수록, 이러한 유도된 광 필드의 강도는 증가한다.
3-12. 실시예 12 - 상기 나노-스피어로 향하는 광의 광학 커플링에 의해서 100㎚-지름 나노-스피어 광 커플러 주위 형성된 여기 광 필드의 시뮬레이션
실시예 11에서 설명된 시뮬레이션과 유사한 시뮬레이션에서, Ta2O5 광 커플러 나노-스피어의 지름은 100㎚이다. 단일 모드 도파관의 Ta2O5 코어층의 두께는 100㎚이다. 상기 도파관의 상기 클래딩층들은 실리콘 산화물(SiO2)로 구성된다. 하부 클래딩층의 두께는 500㎚이다. 상기 어댑터 사이는 콘형 나노웰이고, 상기 콘형 나노웰의 개방 각도(즉, 상기 콘의 일 측면으로부터 직접적으로 대향하는 측면까지의 각도)는 112.6°이다. 상기 나노웰의 상기 원형 하부의 지름은 100㎚이고, 상기 나노웰은 (1.33의 굴절률을 가지는) 물로 채워진다. 이러한 구성에 따른 시뮬레이션된 검출 시스템의 개략적인 도면이 도 21에 제공된다. 입사파는 473㎚파장의 TE-편광된 광학 필드이다. 전기장의 대부분은 도 22에서((a)우측 이미지) 도시된 바와 같이 상기 도파관의 상기 코어층에 직접적으로 근접하게 남아 있고, 도 22의 (a)는 시뮬레이션된 정상 전기장 분포의 등고선 지도를 제공한다. 상기 검출 시스템의 광 에너지는 상기 나노-스피어(높은 자성이고, 우측에 도시됨)의 하부 표면 상에 유도된 상기 광 필드를 도시하는 도 22의 (b)에 도시진다.
추가적인 시뮬레이션에서, 도 21에서 도식화된 상기 시스템이 사용되지만, 상기 도파관의 상기 코어층의 두께는 100㎚ 대신에 50㎚이다. 입사파는 473㎚-파장의 TE-편광된 광학 필드이다. 상기 시뮬레이션된 정상 전기장 분포는 도 23에서 도시되었다. 상기 나노-스피어의 상기 하부 표면 상에 유도된 상기 광 필드는 도 23의 하부 이미지들에 도시되었다.
추가적인 시뮬레이션에서, 도 21에서 도식화된 상기 시스템이 사용되지만, 상기 도파관의 상기 코어층의 두께는 100㎚ 대신에 150㎚이다. 입사파는 473㎚파장의 TE-편광된 광학 필드이다. 상기 시뮬레이션된 정상 전기장 분포는 도 24에서 도시되었다. 상기 나노-스피어의 상기 하부 표면 상에 유도된 상기 광 필드는 도 24의 하부 이미지들에 도시되었다.
이들 구성에서, 상기 정상 전기장 및 상기 광 에너지의 일부가 도 22, 23 및 24에서 도시된 바와 같이 상기 도파관의 상기 코어층으로부터 상기 나노-스피어의 상기 표면의 하부 영역으로 전달된다.

Claims (36)

  1. a) 이동식 광 커플러;
    b) 코어층; 및
    제1 클래딩층을 포함하고,
    상기 이동식 광 커플러에 대한 적어도 하나의 어댑터 사이트가 적어도 상기 제1 클래딩층 내에 형성되는 것을 특징으로 하는 도파관; 및
    c) 광 검출기를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일-분자 검출 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서, 광원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 시스템.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 표적 분자를 상기 적어도 하나의 어댑터 사이트에 위치시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 검출 시스템.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러에 대한 상기 적어도 하나의 어댑터 사이트는 나노웰(nanowell)인 것을 특징으로 하는 검출 시스템.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 나노-스케일 입자인 것을 특징으로 하는 검출 시스템.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 나노-스케일 입자는 상기 코어층을 따라 전파하는 광 파동의 파장의 1/10 내지 2배인 파장을 가지는 것을 특징으로 하는 검출 시스템.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 어댑터 사이트는 상기 제1 클래딩층의 전체 두께를 관통해서 연장하는 것을 특징으로 하는 검출 시스템.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 어댑터 사이트는 상기 제1 클래딩층의 전체 두께 및 상기 코어층의 부분적인 두께를 관통해서 연장하는 것을 특징으로 하는 검출 시스템.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 어댑터 사이트는 상기 제1 클래딩층의 전체 두께 및 상기 코어층의 전체 두께를 관통해서 연장하는 것을 특징으로 하는 검출 시스템.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 코어층은 SixTi1-xO2, TiO2, Ta2O5, Nb2O5, HfO2, Al2O3, ZrO2, ZnS, SiNx, AlNx, TiNx, PC, PMMA 또는 Su8 중에서 선택된 적어도 하나의 물질로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 산화물, 고분자, 금속, 황화물, 셀렌화물 또는 질화물 중에서 선택된 물질로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 산화물로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 산화물은 SiO2, TiO2, Ta2O5, 또는 Fe3O4로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 고분자로 형성되는 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 폴리스티렌으로 형성되는 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 코어 물질과 쉘(shell) 물질을 포함하는 코어-쉘 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 코어 물질 및 쉘 물질은 서로 다르고, 산화물, 고분자, 금속, 황화물, 셀렌화물 또는 질화물로부터 각기 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 표적 분자를 상기 어댑터 사이트 내에서 상기 코어층에 인접한 표면의 적어도 일부 상으로 운반할 수 있는 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 상기 광 커플러가 특정 배향으로 상기 어댑터 사이트에 위치될 수 있도록 하는 성질을 가지는 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 자성 입자인 것을 특징으로 하는 검출 시스템.
  21. 제 18 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러 표면의 하나 이상의 영역들이 변형되는 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러 표면의 하나의 영역이 변형되는 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러 표면의 상기 변형된 영역이 상기 이동식 광 커플러 표면의 10% 내지 90%인 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  24. 제 21 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러 표면의 2개의 영역들이 변형되는 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  25. 제 21 항에 있어서, 상기 변형은 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 화학적 변형은 소수성기(hydrophobic group) 또는 친수성기(hydrophilic group)로부터 선택된 작용기에 의한 변형인 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 친수성기는 전하를 갖는 그룹(charged group)인 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  28. 제 25 항에 있어서, 상기 화학적 변형은 리간드-배위(ligand coordinating) 그룹에 의한 변형인 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  29. 제 25 항에 있어서, 상기 화학적 변형은 고분자 코팅인 것인 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  30. 제 25 항에 있어서, 상기 화학적 변형은 자성 물질에 의한 변형인 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  31. 제 21 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 상기 어댑터 사이트에 대한 친화도를 가지는 표면 변형의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  32. 제 21 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 상기 어댑터 사이트에 의해서 밀려나는 표면 변형의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 장치.
  33. 제 21 항에 있어서, 상기 이동식 광 커플러는 올리고뉴클레오티드로 변형되는 것을 특징으로 하는 검출 시스템.
  34. a) 광원으로부터 입사광을 도파관 내부로 도입하여 상기 도파관 내에 여기광을 형성하는 단계;
    b) 단일-분자 개체를 이동식 광 커플러 표면 상에 위치시키는 단계,
    c) b)의 상기 이동식 광 커플러를 상기 도파관의 적어도 제1 클래딩층 내에 형성된 이동식 광 커플러를 위한 어댑터 사이트에 위치시키는 단계, 및
    d) 상기 여기광에 의해 상기 이동식 광 커플러 상에 위치된 상기 단일-분자 개체를 여기시켜 상기 단일-분자 개체가 광 검출기에 의해 검출되도록 광을 방출하도록 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일-분자 개체 검출 방법.
  35. a) i) 이동식 광 커플러;
    ii) 코어층, 제1 클래딩층을 포함하고, 상기 이동형 광 커플러를 위한 적어도 하나의 어댑터 사이트가 적어도 상기 제1 클래딩층 내에 형성되는 도파관; 및
    iii) 광 검출기를 포함하는 검출 장치를 제공하는 단계;
    b) 단일-분자 개체에 결합가능한 적어도 하나의 결합 잔기를 제공하는 단계;
    c) 상기 적어도 하나의 결합 잔기를 개별적으로 상기 이동식 광 커플러 상에 위치시키는 단계;
    d) 상기 이동식 광 커플러 상에 위치된 상기 적어도 하나의 결합 잔기에 단일-분자 개체 분자(molecule)를 제공하는 단계;
    e) 상기 적어도 하나의 결합 잔기 및 단일-분자 개체가 위치된 상기 이동식 광 커플러를 상기 어댑터 사이트에 위치시키는 단계;
    f) 광원으로부터 입사광을 상기 도파관 내부로 도입하여 상기 도파관 내에서 여기광을 형성하는 단계; 및
    h) 상기 여기광에 의해, 상기 이동식 광 커플러 상에 위치된 상기 적어도 하나의 결합 잔기에 결합된 단일-분자 개체 분자를 여기시켜 상기 단일-분자 개체가 광 검출기에 의해 검출될 수 있는 광을 방출하도록 유도하는 단계를 포함하는 단일-분자 개체 검출 방법.
  36. a) i) 이동식 광 커플러;
    ii) 코어층, 제1 클래딩층을 포함하고, 상기 이동형 광 커플러를 위한 적어도 하나의 어댑터 사이트가 적어도 상기 제1 클래딩층 내에 형성되는 도파관; 및
    iii) 광 검출기를 포함하는 검출 장치를 제공하는 단계;
    b) 적어도 하나의 핵산 분자를 제공하는 단계;
    c) 상기 적어도 하나의 핵산 분자를 개별적으로 상기 이동식 광 커플러 상에 위치시키는 단계;
    d) 상기 적어도 하나의 핵산 분자가 위치된 상기 이동식 광 커플러를 상기 어댑터 사이트에 위치시키는 단계;
    e) 상기 적어도 하나의 핵산 분자의 상기 핵산 내에 적어도 하나의 염기의 동일성과 상호연관된 방출광을 생성하는 단일 분자 합성에 의한 시퀀싱(sequencing-by-synthesis)을 수행하는 단계;
    f) 상기 검출기로 상기 방출된 광을 검출하여 출력 신호를 생성하는 단계; 및
    g) 상기 출력 신호를 처리하여 상기 핵산에 포함된 적어도 하나의 염기의 동일성을 결정하는 단계를 포함하는 핵산을 시퀀싱하는 방법.
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