JP2008520975A - Ｔｉｒｆ単分子分析および核酸を配列決定する方法 - Google Patents

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Abstract

単分子の存在を分析する装置は、試料を上に配置する試料プレート（３０’）を備える。一実施形態では、この装置は、試料中で蛍光を励起するのに適した２つの異なる波長の照明光を提供する２つのレーザ（４６’、４６”）と、バンドパスフィルタ（５０’、５５”）、発散レンズ（５４’、５４”）、視野絞り（６２’）、および内部全反射対物レンズ（７４’）を介して試料上に照明光を方向づける収束レンズ（６６’）を含むコリメータと、照明光に応答して前記試料によって生成される蛍光像を検出する手段（３４’、３４”）とを備える。一実施形態では、この装置は、レーザ（３８’）と、ビームスプリッタキューブ（８６’）と、収束レンズ（９０’）と、オートフォーカス用ダイクロイック（９４’）とを含むオートフォーカスモジュールをさらに備え、それによって、試料に対する対物レンズの合焦を維持する。

Description

発明の分野
本発明は、一般に単分子の光学的な検出および分析に関し、より詳細には、内部全反射を利用した単分子の光学的な検出に関する。
発明の背景
単分子を分析することにより、研究者は核酸鎖内の塩基配列を分析することができる。これは、対象とする核酸に対する相補鎖を一度に１つの塩基ずつ構築し、どの塩基が組み込まれたかを判定することによって行う。この操作を何百もの核酸試料に対して同時に行うことによって、比較的短時間で大型ゲノムの配列を決定することができる。
この形態の配列決定を行うために、クロマトグラフィカラムから放射性核種検出に至るまで多くの技術が使われてきた。これらの方法の大部分は、単一塩基の付加を繰り返し検出する際に難点がある。
本発明は、複数のＤＮＡ試料への塩基の付加を一度に検出し記録するだけでなく、それを繰り返し精度よく行うための仕組みを提供する。
発明の要旨
一態様では、本発明は、内部全反射蛍光（ＴＩＲＦ）を利用して単分子の存在を分析する装置に関する。一実施形態では、単分子分析装置は、試料が上に配置された支持部と、異なる波長の光を生成する少なくとも２つのレーザと、内部全反射（ＴＩＲ）対物レンズを介して試料に光を方向づけるコリメータと、光に応答して試料中の単分子によって生成される蛍光発光を受ける受光部と、蛍光発光中の各波長を検出する検出器とを備える。別の実施形態では、この装置は、試料に対する対物レンズの合焦を維持するための合焦用レーザをさらに備える。
一実施形態では、コリメータは、バンドパスフィルタと、バンドパスフィルタに光学的に接続された発散レンズと、発散レンズに光学的に接続されたコリメートレンズと、コリメートレンズに光学的に接続された視野絞りと、視野絞りに光学的に接続された収束レンズとを備える。別の実施形態では、受光部は、チューブレンズと、チューブレンズに光学的に接続されたバンドパスフィルタとを備える。
別の実施形態では、支持部は、フローセルに関連づけられたステージである。別の実施形態では、カメラは、蛍光発光によって生成される画像を保存し分析するためのコンピュータに接続される。
別の実施形態では、単分子分析装置は、第１レーザと、前記レーザに光学的に接続されたバンドパスフィルタと、バンドパスフィルタに光学的に接続された少なくとも１つの第１レンズと、第２レーザと、第２レーザに光学的に接続された第２バンドパスフィルタと、第２バンドパスフィルタに光学的に接続された少なくとも１つの第２レンズと、少なくとも１つの第１レンズおよび少なくとも１つの第２レンズに光学的に接続されたダイクロイックビームコンバイナーとを備える。コリメータは、ダイクロイックビームコンバイナーに光学的に接続される。コリメータに光学的に接続された視野絞り、試料に焦点を合わるために、前記第１および第２のレーザからの光を対物レンズに通過させ、かつ前記試料からの蛍光発光を検出器に通過させる照射用ダイクロイックレンズ。カメラ用ダイクロイックフィルタは、第１カメラに第１波長の光を通過させ、第２カメラに第２波長の光を通過させるように位置決めされる。第１および第２のカメラに接続され、蛍光発光を分析するコンピュータ。
一実施形態では、この装置は、試料を上に配置する試料プレートと、２つの波長の光を提供する１つまたは複数の光源と、前記試料上にコリメートされた規定サイズの光のスポットを生成するコリメータと、前記各波長の光により試料によって生成される蛍光像の受光部であって、非蛍光を減少させる受光部と、前記各波長の光により試料によって生成される蛍光像を検出する検出器とを備える。一実施形態では、この装置は、前記試料の蛍光像の合焦を維持する装置をさらに備える。別の実施形態では、２つの波長の光を提供する光源は２つのレーザを含む。
別の実施形態では、コリメータは、バンドパスフィルタと、バンドパスフィルタに光学的に接続された発散レンズと、発散レンズに光学的に接続されたコリメートレンズと、コリメートレンズに光学的に接続された視野絞りと、視野絞りに光学的に接続された収束レンズとを備える。別の実施形態では、受光部は、チューブレンズと、チューブレンズに光学的に接続されたバンドパスフィルタとを備える。一実施形態では、検出器はカメラを含む。
別の態様では、本発明は、単分子を分析する方法に関する。この方法は、試料を提供するステップと、２つの異なる波長の光を生成するステップと、内部全反射対物レンズを介して試料上に２つの異なる波長の光を方向づけるステップと、２つの異なる波長の光に応答して試料中の単分子によって生成される蛍光発光を受けるステップと、蛍光発光を検出するステップとを含む。別の態様では、本発明は、単分子を分析する方法に関する。この方法は、試料を提供するステップと、２つの異なる波長の光を生成するステップと、内部全反射対物レンズを介して試料上に２つの異なる波長の光を方向づけるステップと、２つの異なる波長の光に応答して試料中の単分子によって生成される蛍光発光を受けるステップと、蛍光発光を検出するステップとを含む。
本発明のシステムは、好ましくは、配列決定すべき核酸二重鎖を含むスライド、アレイ、チャネル、ビーズ、気泡などとともに動作するように構成される。好ましい実施形態では、ステージは、二重鎖を担持するガラスまたは溶融石英製のスライドを収容するフローセルを支持する。好ましいスライドは、エポキシド、高分子電解質の複数の層、核酸を結合するのに適した他の被覆で被覆される。極めて好ましい実施形態では、以下で説明するように、スライドはエポキシドで被覆され、核酸はアミン結合によって直接付着される。テンプレートまたはプライマ、あるいはその両方を表面に付着させてもよい。他の実施形態では、エポキシド被覆を誘導体化して二重鎖付着の助けとする。例えば、ストレプトアビジンでエポキシドを誘導体化することができ、二重鎖（プライマまたはテンプレート、あるいはその両方）は、ストレプトアビジンに付着するビオチン末端を有し得る。あるいは、抗原／抗体対または受容体／リガンド対などの他の結合対を用いてもよい。理想的には、エポキシド表面を不動態化してバックグラウンドを減少させる。不動態化は、開いたエポキシド環に付着する分子に表面を暴露することによって実施し得る。このような分子の例には、アミン、リン酸および界面活性剤があるが、これらに限定されるものではない。
本発明のシステムは、合成によるテンプレート依存配列決定反応を実施するのに有用である。典型的には、これらの反応は、画像化する表面に二重鎖を付着させ、その後、ポリメラーゼの存在下で複数の光学的に標識されたヌクレオチド三リン酸塩に暴露することを必要とする。テンプレートの配列は、二重鎖のプライマ部分の３’末端に組み込まれた標識されたヌクレオチドの順序によって決定される。これは、以下で説明するように、リアルタイムで行うこともできるし、ステップアンドリピートモードで行うこともできる。リアルタイム分析では、組み込まれる各ヌクレオチドに異なる光学標識を付着させ、複数のレーザを使用して組み込まれたヌクレオチドを励起することが有用である。このような改変は、当業者には周知である。
本発明の上記その他の目的、態様、特徴および利点は、以下の説明を添付の図面と併せ読むことによってより明らかになり、よりよく理解されるであろう。
好ましい実施形態の説明
全体を概観すると、本発明には３つの主要な実施形態がある。第１の実施形態では、単分子を検出し分析するＴＩＲＦシステムにおいて複数の励起波長を蛍光プローブとともに使用する。第２の実施形態では、単分子を検出し分析するＴＩＲＦを用いる場合と用いない場合とで、単一波長をオートフォーカスとともに使用する。第３の実施形態では、単分子を検出し分析するオートフォーカス付きＴＩＲＦシステムにおいて複数の波長を蛍光プローブとともに使用する。
図１を参照すると、この装置の全体概略図が示されている。図に示す実施形態における光学配置１０は、光源１４、試料部１８、および信号検出部２２を備える。光源１４からの光は、試料部１８の試料プレート３０に方向づけられ、それによって試料の単分子が蛍光を発する。試料プレート３０からの蛍光は、フィルタリングされ、検出部２２の検出器３４によって検出される。様々な特定波長の光源部１４は様々な波長の光を供給することができ、それらを検出部２２によって検出することができる。
より詳細には、この実施形態では、光源１４は、対象とする様々な波長に調整可能な、あるいは、対象とする様々な波長の他のレーザに交換可能なレーザ４６を含む。レーザ４６からの光は、レーザ４６の波長を中心としたある帯域の波長を通過させるバンドパスフィルタ５０を通過する。次いで、この光は、サイズ設定用コリメータを通過する。このサイズ設定用コリメータは、試料を照射するために光ビームを拡げる発散レンズ５４と、ビーム経路を平行にするコリメーションレンズ５８と、ビームのサイズを小さくする視野絞り６２と、適切なスポットサイズを作り出す収束レンズ６６とを含む。
次いで、光は、入射ビームの方向に対して４５°傾いた照射用ダイクロイック７０によって反射され、ＴＩＲ油浸対物レンズ７４を通って試料プレート３０に至る。試料プレート３０は、移動可能なＸ−Ｙステージ上で位置決めされている。試料プレート３０上の分子からの蛍光その他の光は、油浸対物レンズ７４を通過して戻り、照射用ダイクロイック７０を通り、チューブレンズ７６を通過する。チューブレンズ７４を通過した後で、この光は第１バンドパスフィルタ７８を通過する。第１バンドパスフィルタ７８は、光学配置全体を通過してきた光源４６からの励起光の波長を、それがカメラ３４に到達する前に、試料中の蛍光体によって生成された蛍光から除去するためのものである。
図２も参照すると、オートフォーカス部２６を含む本発明の別の実施形態が示されている。この実施形態では、オートフォーカス部２６の光源３８から試料プレート３０によって反射されて検出器４２に至る光を測定することによって、試料の蛍光画像の合焦が維持される。試料プレート３０がそのＸ−Ｙ位置決め装置によって移動するときにプレート上の試料の合焦を維持するために、一実施形態では赤外光源である光源３８からの光は、５０／５０ビームスプリッタキューブ８６を通過し、またそれによって反射される。５０／５０ビームスプリッタキューブ８６によって反射された光は、収束レンズ９０を通って、照射用ダイクロイック７０からの光路中に、その光路に対して４５°で位置決めされたオートフォーカス用ダイクロイック９４に至る。オートフォーカス用ダイクロイック９４で反射されたビームは、照射用ダイクロイック７０およびＴＩＲ油浸対物レンズ７４を通って、試料プレート３０に至る。
この光は、試料プレート３０によって反射され、油浸対物レンズ７４および照射用ダイクロイック７０を通って戻り、オートフォーカス用ダイクロイック９４によって反射される。この反射光は、収束レンズ９０およびビームスプリッタキューブ８６を通過して戻り、オートフォーカス用検出器４２に到達する。
図２ａを参照すると、オートフォーカス部２６が、ダイクロイック９４および試料部１８とともに示されている。この実施形態におけるオートフォーカスでは、斜めビーム動作法が用いられる。この実施形態では、光源３８は、ビームスプリッタキューブ８６にキューブ８６の対角線からずれた角度でビームを投影する。反射ビーム４０は、ダイクロイック９４によって反射され、レンズ７４によって試料プレート３０上で結像する。試料３０からの戻り光は、レンズ７４によって結像してダイクロイック９４に戻り、このビームはダイクロイック９４によって反射されてビームスプリッタキューブ８６に戻る。
試料がレンズ７４から正しい焦点位置にあると、ダイクロイック９４からの反射光は、ビームスプリッタキューブ８６を通過し、オートフォーカス用検出器４２に当たるように角度が選択される。オートフォーカス用検出器４２は、２つの隣接する光電セル検出器４２ａおよび４２ｂを備える。このビームが合焦状態にあるときには、ダイクロイック９４からの反射光４１は、検出器４２ａおよび４２ｂに等しく当たる。
試料プレート３０が（想像線で示すように）移動すると、レンズ７４から試料プレート３０までの経路が変化し、それによって、（想像線で示す）戻りビーム４３がダイクロイック９４に異なる角度で当たり、反射されて軸がずれた状態でビームスプリッタキューブ８６に至る。ビーム４３は、キューブ８６を通過すると、２つの隣接する光電セル４２ａおよび４２ｂの一方の４２ｂに、他方の４２ａよりも多く当たる。そのため、光電セル４２ａおよび４２ｂには、互いに異なる電圧が生じる。次いで、この電圧差を用いて、レンズ７４に取り付けられた（図示しない）モータを制御してレンズまたはステージを移動させ、それによって試料３０を再び合焦状態にする。試料３０が合焦状態になると、これら２つの光電セル検出器４２ａおよび４２ｂは等しく照明され、電圧差はほぼゼロに戻り、モータはレンズ７４の移動を停止する。このように、この光学系は、試料に直交する動きを、検出器４２を横切る横方向の動きに変換する。
オートフォーカス用光源３８からの光が検出器３４に到達しないようにするために、試料からの光は、バンドパスフィルタ７８を通過した後で、試料の蛍光波長のうち最大強度の波長を中心とするノッチを有するノッチフィルタ８２を通過し、その後、検出器３４に到達する。この実施形態は、すぐ前で説明したように、ＴＩＲ油浸対物レンズ７４を用いる場合と用いない場合とで、単一波長励起光源または多波長励起光源とともに用いることができる。
所望の出力の多波長光源および多波長検出器は望ましい波長では容易には入手できないので、図３に、２つの異なる波長でほぼ同時測定が可能な、別光源を使用するオートフォーカス付きシステムの実施形態を示す。この実施形態では、６４７ｎｍおよび５３２ｎｍの異なる波長にそれぞれ設定された２つのレーザ４６’および４６”からビームが得られ、これらのビームは、偏向ミラー１００および１００’によって反射され、バンドパスフィルタ５０’および５０”を通る。一実施形態では、５３２ｎｍのレーザ４６”は２Ｗのレーザであり、６４７ｎｍのレーザ４６’は８００ｍＷのレーザである。この実施形態では、バンドパスフィルタ５０’および５０”はそれぞれ、６４７ｎｍおよび５３２ｎｍを通過させるように中心波長が設定される。
次いで、第１のビームは、発散レンズ５４’およびリレーレンズ１０４を通過し、その後、偏向ミラー１０８によって向きが変わる。同様に、第２のビームは、発散レンズ５４”およびリレーレンズ１０４’を通過し、その後、２つのレーザ４６’および４６”からのビームの光路に対して４５°に位置決めされたダイクロイックビーム結合器１０８において第１ビームと合成される。次いで、これら２つのビームは、これらのビーム経路を平行にするコリメーションレンズ５８’と、ビームのサイズを小さくする視野絞り６２’と、試料プレート３０’のところで適切なスポットサイズを作り出す収束レンズ６６’とを含むコリメータを通過する。
次いで、これらの光ビームは、照射用ダイクロイック７０’によって反射され、ニコン製の開口数１．４５のＴＩＲ油浸対物レンズ７４’を通って試料プレート３０’に至る。試料プレート３０’は、移動可能なＸ−Ｙステージ上で位置決めされる。一実施形態では、このＸ−Ｙ試料ステージは、フローセル用の試料プレートを備え、そのため、システムの動作中に繰り返し試薬を流し、反応を起こさせることができる。
試料プレート３０’上の分子からの蛍光その他の光は、ＴＩＲ油浸対物レンズ７４’を通過して戻り、照射用ダイクロイック７０’を通り、チューブレンズ７６’を含む受光部を通る。チューブレンズ７６’を通過した後で、これらの光ビームは、検出器用ダイクロイック１１２によって反射され、６５０ｎｍエッジフィルタ１１６、ビームの楕円形状を取り除く補償プレート１２０、第１の７００ｎｍバンドパスフィルタ７８’、および７８５ｎｍノッチフィルタ８２’を通り、その後、赤色光用の検出器３４’に到達する。この実施形態では、検出器３４はＣＣＤカメラ３４’である。
同時に、試料からの光の一部は、検出器用ダイクロイック１１２によって反射され、５８０ｎｍバンドパスフィルタ７８”および７８５ｎｍノッチフィルタ８２”を通過し、その後、緑色光用の検出器３４”に到達する。一実施形態では、この検出器はＣＣＤカメラ３４”である。ＣＣＤカメラ３４’および３４”からの画像は、（図示しない）コンピュータによって収集され、分析される。
試料プレート３０’がそのＸ−Ｙ位置決め装置によって移動するときにプレート上の試料の合焦を維持するために、５ｍＷの赤外光源３８’からの７８５ｎｍの赤外光は、５０／５０ビームスプリッタキューブ８６’によって反射され、またそれを通過する。５０／５０ビームスプリッタキューブ８６’によって反射された光は、収束レンズ９０’を通って、照射用ダイクロイック７０’の光路中に、その光路に対して４５°傾いたオートフォーカス用ダイクロイック９４’に至る。オートフォーカス用ダイクロイック９４で反射された赤外ビームは、照射用ダイクロイック７０’およびＴＩＲ油浸対物レンズ７４’を通過して、試料プレート３０’に至る。この光は、試料プレート３０’によって反射され、ＴＩＲ油浸対物レンズ７４’を通って戻り、オートフォーカス用ダイクロイック９４’によって反射される。この反射光は、収束レンズ９０’および５０／５０ビームスプリッタキューブ３４”を通過して戻り、オートフォーカス用検出器４２’に到達する。
このシステムの動作は、１つには、どちらの構成を用いるかによって決まる。しかし、このシステムの動作は、様々な形態をとり得る試料の調製とは無関係である。配列決定すべき試料ＤＮＡは、必要な場合には一本鎖にし、切断して約２０ｂｐから１００ｂｐのサイズ範囲にある小断片を生成する。断片は、ターミナルトランスフェラーゼまたは別の適切な酵素を用いてポリアデニル化する。約５０ｂｐのポリＡテールが好ましい。次いで、アミノ末端化ＡＴＰを付加し、表面上のエポキシドとの直接アミン付着によってこれらの断片を試料プレート３０’に付着させる。次に、付着させた断片にポリチミジンプライマをハイブリダイズさせる。
２つのレーザ波長による構成を用いる場合、テンプレートのポリＡ部分中のアデニンの１つに、緑色レーザ光によって励起可能な蛍光体を付着させる。この蛍光体がレーザからの緑色光によって照射されると蛍光を発し、その位置が、適切なフィルタを備えたＣＣＤカメラ３４”によって検出され、そのため、緑色光によって励起された蛍光のみがカメラ３４”に到達し得る。この蛍光による方法により、各ヌクレオチド塩基が試料プレート３０’に添加された後で、試料プレート３０’上の断片の位置が決まる。単一波長レーザによる構成を用いる場合、蛍光体を付着させず、組み込まれた蛍光性塩基（以下参照）により蛍光が得られ、それによって、試料プレート３０’上のＤＮＡ断片の位置が決まる。
次に、一度に１つのヌクレオチド種ずつ、プレート３０’上に単一ヌクレオチドを導入する。それぞれの種は、赤色レーザ光によって励起されると蛍光を発する蛍光体を担持している。蛍光標識された各ヌクレオチド種を適切なポリメラーゼ混合物とともに試料プレート３０’上に導入し、反応させた後で、試料プレートを洗浄して、プライマに組み込まれなかったヌクレオチドを除去する。プライマの３’末端に隣接するテンプレートの次のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドだけが組み込まれることになる。
次いで、赤色レーザ光によって試料プレート３０’を照射する。最後に付加したヌクレオチドがこの鎖に組み込まれた場合、この鎖に組み込まれたヌクレオチドは蛍光を発することになる。ヌクレオチドが組み込まれなかった場合、いかなる蛍光も検出されない。この光は、赤色レーザ光によって励起された蛍光のみをＣＣＤカメラ３４’に到達させる適切なフィルタを定位置に備えたＣＣＤカメラによって検出される。
次に、蛍光ヌクレオチドが組み込まれた場合、蛍光体が開裂し、以下で詳細に説明するようにキャップが形成される。次いで、蛍光体が付着した次のヌクレオチド種を付加し、このサイクルを繰り返す。
組み込まれた蛍光を書き留めて各二重鎖にどのヌクレオチドが付加されたかを常時把握することによって、付着した断片に相補的なヌクレオチド塩基の配列が決まる。この配列データと他の断片からの配列データとを組み合わせて、ＤＮＡ試料全体またはゲノム全体の配列を決定することができる。
本発明の単分子システムを使用して、バクテリオファージＭ１３ｍｐ１８の７２４９ヌクレオチドゲノムを配列決定した。精製された一本鎖ウイルス性Ｍ１３ｍｐ１８ゲノムＤＮＡは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社から入手した。約２５μｇのＭ１３ ＤＮＡを、０．１ Ｕ Ｄｎａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）によって１０分間３７℃で消化して、平均断片サイズを４０ｂｐとした。消化したＤＮＡ断片サイズの推定は、あらかじめ成形された変性（ＴＢＥ−Ｕｒｅａ）１０％ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖａｇｅｎ社）上に一定分取量の消化混合物を流し、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）で染色することにより行った。ＤＮａｓｅ Ｉで消化したゲノムＤＮＡを、ＹＭ１０限外ろ過スピンコラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を通してろ過して、約３０ｎｔよりも小さい小型消化産物を除去した。次いで、約２０ｐｍｏｌのろ過したＤＮａｓｅ Ｉ消化物を、周知の方法（Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ， Ｒ、Ｗｕ， Ｒ、１９８０、Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ３’ ｔｅｒｍｉｎｉ ｏｆ ＤＮＡ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６５（１）：４３〜６２頁）に従ってターミナルトランスフェラーゼでポリアデニル化した。平均ｄＡテール長は、５０±５ヌクレオチドであった。次いで、ターミナルトランスフェラーゼを用いて、Ｃｙ３−ｄＵＴＰで断片を標識した。その後、ジデオキシＴＴＰで断片を末端処理した（また、ターミナルトランスフェラーゼを用いて付加した）。得られた断片を再度、ＹＭ１０限外ろ過スピンコラムでろ過して遊離ヌクレオチドを除去し、−２０℃のｄｄＨ２Ｏ中に保存した。
オリゴを付着させるように、エポキシドを被覆したガラススライドを調製した。エポキシドで機能化した４０ｍｍ径の＃１．５ガラスカバースリップ（スライド）は、Ｅｒｉｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国ニューハンプシャー州Ｓａｌｅｍ所在）から入手した。これらのスライドを、３７℃の３×ＳＳＣに１５分間浸漬することによって事前調整した。次に、５００ｐＭ分取量の５’アミノ化ポリｄＴ（５０）（５’末端アミンを伴った長さ５０ｂｐのポリチミジン）を、体積を８０ｍｌとして室温で３０分間、各スライドでインキュベートした。その結果、スライドには、エポキシドとの直接アミン結合によってポリ（ｄＴ５０）プライマが付着した。次いで、これらのスライドをリン酸（１Ｍ）で４時間、室温で処理して表面を不活性化した。その後、これらのスライドを、配列決定に使用するまで、ポリメラーゼ洗浄緩衝液（２０ｍＭ トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％ トリトン Ｘ−１００、ｐＨ ８．０）中で保存した。
配列決定では、これらのスライドを、厚さ５０μｍのガスケットを使用して改変ＦＣＳ２フローセル（米国ペンシルバニア州Ｂｕｔｌｅｒ所在のＢｉｏｐｔｅｃｈｓ社）内に配置した。このフローセルを、内部全反射（ＴＩＲ）対物レンズを搭載したニコン製ＴＥ−２０００倒立顕微鏡を中心に構成した高効率蛍光画像化システムの一部である移動可能なステージ上に配置した。次いで、１００ｍＭのＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳ緩衝液でスライドを洗浄し、温度５０℃にして平衡状態にした。上記で説明した一定分取量のＭ１３テンプレート断片を３×ＳＳＣで希釈し、最終濃度を１．２ｎＭにした。一定分取量１００μｌをフローセルに入れ、スライド上で１５分間インキュベートした。インキュベート後、このフローセルを１×ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／０．１％ＳＤＳで洗浄し、次いで、ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌで洗浄した。受動型真空装置を使用してフローセル全体にわたって流体を引き抜いた。得られたスライドは、Ｍ１３テンプレート／オリグ（ｄＴ）プライマ二重鎖を含んでいた。次いで、配列決定のためにフローセルの温度を３７℃に下げ、フローセルに対物レンズを接触させた。
配列決定では、それぞれシアニン−５標識（ＡＴＰおよびＧＴＰについては７−ｄｅａｚａ位置に、ＣＴＰおよびＵＴＰについてはＣ５位置に（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社））を有するシトシン三リン酸塩、グアニジン三リン酸塩、アデニン三リン酸塩、およびウラシル三リン酸塩を、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８．８、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＨＣｌ、および０．１％のトリトンＸ−１００を含む緩衝液、ならびに１００Ｕ クレノウｅｘｏ−ポリメラーゼ（ＮＥＮ）中に別々に保存した。配列決定は以下のように進めた。
まず、最初の画像化を行って、エポキシド表面上での二重鎖の位置を求めた。Ｍ１３テンプレートに付着させたＣｙ３標識を、５３２ｎｍを放射するように調整されたレーザ（Ｖｅｒｄｉ Ｖ−２レーザ、コヒーレント社、米国カリフォルニア州サンタクララ所在）を使用した励起によって画像化して、二重鎖位置を定めた。各スライドごとに、このステップで画像化された単一蛍光分子だけを計数した。以下で説明するように、６３５ｎｍ放射レーザ（コヒーレント社）を使用してシアニン−５色素を励起することによって、組み込まれたヌクレオチドを画像化した。フローセルに５μＭのＣｙ５ＣＴＰを入れ、スライドに２分間暴露した。インキュベート後、このスライドを１×ＳＳＣ／１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１％ ＳＤＳ／ｐＨ７．０（「ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ」）（それぞれ体積６０μｌで１５回）中で洗浄し、次いで、１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ ７．０（「ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ」）（体積６０μｌで１０回）で洗浄した。次に、３０％アセトニトリルおよび脱気剤緩衝液（１３４μｌ ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ、２４μｌ １００ｍＭ ＴｒｏｌｏｘのＭＥＳ溶液、ｐＨ６．１、１０μｌ ＤＡＢＣＯのＭＥＳ溶液、ｐＨ６．１、８μｌ ２Ｍ グルコース、２０μｌ ＮａＩ（５０ｍＭの原料水溶液）、および４μｌ グルコース酸化酵素）を含む酸素脱気剤を添加した。次いで、このスライドを、６４７ｎｍのＩｎｏｖａ３０１Ｋレーザ（コヒーレント社）を使用して０．２秒間（５００フレーム）画像化し、その後、５３２ｎｍのＶｅｒｄｉ Ｖ−２レーザ（コヒーレント社）で緑色について２秒間画像化して、二重鎖の位置を確認した。検出可能な蛍光が得られた位置を記録した。画像化の後で、フローセルをＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ（６０μｌ）およびＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ（６０μｌ）でそれぞれ５回ずつ洗浄した。次に、フローセルに５０ｍＭのＴＣＥＰを５分間導入することによって、組み込まれたＣＴＰからシアニン−５標識を開裂させ、その後、フローセルをＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ（６０μｌ）およびＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ（６０μｌ）でそれぞれ５回ずつ洗浄した。残りのヌクレオチドに、５０ｍＭのヨードアセトアミドで５分間キャップを形成し、その後、ＳＳＣ／ＨＥＰＥＳ／ＳＤＳ（６０μｌ）およびＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ（６０μｌ）でそれぞれ５回ずつ洗浄した。上記で説明したやり方で脱気剤を再度適用し、スライドを再度画像化して、開裂／キャップ形成ステップの有効性を判定し、組み込まれていない蛍光物体を識別した。
次いで、上記で説明した手順を、１００ｎＭ Ｃｙ５ｄＡＴＰについて、その後、１００ｎＭ Ｃｙ５ｄＧＴＰについて、最後に、５００ｎＭ Ｃｙ５ｄＵＴＰについて実施した。この手順（ヌクレオチドへの暴露、ポリメラーゼ、洗浄、脱気剤、画像、洗浄、開裂、洗浄、キャップ形成、洗浄、脱気剤、最終画像）を、上記で説明したようにＡＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰについて厳密に繰り返した。ただし、Ｃｙ５ｄＵＴＰについては、２分間でなく５分間インキュベートした。普通ならチミジン三リン酸塩においてメチル基が占めている位置にＣｙ５標識を組み込んだために、チミジンの代わりにウリジンを用いてｄＴＴＰをｄＵＴＰにした。６４サイクルすべてにおいて、この段落および前の段落で説明したように（Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｕ）を実施した。
６４サイクルが完了した後で、画像スタックデータ（すなわち、様々な表面結合二重鎖から得られた単分子配列）をＭ１３基準配列に位置合わせした。得られた画像データを圧縮してホモ重合体領域を縮小した。そのため、配列「ＴＣＡＡＡＧＣ」は、位置合わせに使用するデータタグにおいて「ＴＣＡＧＣ」として表されることになる。同様に、基準配列中のホモ重合体領域を縮小して位置合わせした。上記で説明した配列決定プロトコルにより、（適用する深さに応じて）９８．８％〜９９．９６％の精度で、位置合わせされたＭ１３配列が得られた。個々の単分子配列から得られた読取り長さの範囲は、２〜３３連続ヌクレオチドであり、平均長さは、約１２．６連続ヌクレオチドであった。
上記で得られた配列を、位置合わせアルゴリズムにより、実際のＭ１３直線配列と突き合わせた。Ｍ１３上での得られた配列の配置は、得られた配列とＭ１３の同じ長さの部分との間での最適一致法に基づいて、０、１または２個の生じ得る誤差を考慮に入れて行った。誤差がないように（すなわち、Ｍ１３基準配列中の９個のｍｅｒと厳密に一致するように）得られた９個のｍｅｒをすべて、まずＭ１３と位置合わせした。次いで、誤差が０または１の１０個、１１個、および１２個のｍｅｒを位置合わせした。最後に、誤差が０、１または２の１３個以上のｍｅｒをすべて位置合わせした。１以上の適用深さで、５０６６個の塩基Ｍ１３縮小ゲノムのうち５００１個の塩基を９８．８％の精度で求めた。同様に、５以上の適用深さで、８３．６％のゲノムを９９．３％の精度で、１０以上の適用深さで、５１．９％のゲノムを９９．９６％の精度で求めた。平均適用深さは１２．６ヌクレオチドであった。
上記の説明は、本発明のいくつかの特定の実施形態に限定したが、変更および改変を本発明に加えて、本発明の利点の一部または全部を実現できることができることが明らかである。したがって、発明者の意図は、添付の特許請求の範囲の範囲によってのみ限定される。
図１は、本発明の一般化した実施形態の斜視概略図である。 図２は、オートフォーカスコンポーネントを含む図１の本発明の一般化した実施形態の斜視概略図である。 図２ａは、図２のオートフォーカス部の実施形態のブロック図である。 図３は、本発明の別の実施形態の斜視概略図である。

Claims (54)

  1. 単分子分析装置であって、
    支持部であって、その上に試料が配置されている支持部と、
    異なる波長の光を生成する少なくとも２つのレーザと、
    前記光を内部全反射対物レンズを介して前記試料に方向づけるコリメータと、
    異なる波長の前記光に応答して前記試料中の単分子によって生成される蛍光発光を受ける受光部と、
    前記蛍光発光中の前記各波長を検出する少なくとも１つの検出器
    とを備える単分子分析装置。
  2. 前記試料に対する前記対物レンズの合焦を維持するための合焦用レーザをさらに備える、請求項１に記載の装置。
  3. 前記合焦用レーザは赤外レーザである、請求項２に記載の装置。
  4. 前記コリメータは、バンドパスフィルタと、前記バンドパスフィルタに光学的に接続された発散レンズと、前記発散レンズに光学的に接続されたコリメートレンズと、前記コリメートレンズに光学的に接続された視野絞りと、前記視野絞りに光学的に接続された収束レンズとを備える、請求項１に記載の装置。
  5. 前記受光部は、チューブレンズと、前記チューブレンズに光学的に接続されたバンドパスフィルタとを備える、請求項１に記載の装置。
  6. 前記少なくとも１つの検出器はカメラである、請求項１に記載の装置。
  7. 前記少なくとも２つのレーザは、約５３２ｎｍの波長に調整された第１レーザと、約６４７ｎｍの波長に調整された第２レーザとを含む、請求項１に記載の装置。
  8. 前記コリメータは、視野絞りに光学的に接続された収束レンズを備え、前記視野絞りは、コリメートレンズに光学的に接続される、請求項１に記載の装置。
  9. 前記支持部は、ステージであり、前記ステージ上にフローセルが配置される、請求項１に記載の装置。
  10. 前記フローセルは、前記試料を試薬に暴露するための注入ポートおよび排出ポートを備える、請求項９に記載の装置。
  11. 前記フローセルは、スライドをさらに備えており、前記試料を前記スライド上に配置する、請求項１０に記載の装置。
  12. 前記試料は核酸二重鎖を含む、請求項１に記載の装置。
  13. 前記核酸二重鎖の少なくとも一部は、前記試料における他の核酸二重鎖から単離された状態で光学的に解像可能である、請求項１２に記載の装置。
  14. 前記単分子は、テンプレートと、前記テンプレートにハイブリダイズされるテンプレート依存合成型プライマとを備える核酸二重鎖である、請求項１に記載の装置。
  15. 前記蛍光発光は、合成によるテンプレート依存配列決定の結果、前記二重鎖に組み込まれたヌクレオチドに付着した標識によって生成される、請求項１４に記載の装置。
  16. 前記少なくとも１つのカメラは、前記蛍光発光によって生成される画像を保存し分析するためのコンピュータに接続される、請求項６に記載の装置。
  17. 単分子分析装置であって、
    第１レーザと、
    前記第１レーザに光学的に接続されたバンドパスフィルタと、
    前記バンドパスフィルタに光学的に接続された少なくとも１つの第１レンズと、
    第２レーザと、
    前記第２レーザに光学的に接続された第２バンドパスフィルタと、
    前記第２バンドパスフィルタに光学的に接続された少なくとも１つの第２レンズと、
    前記少なくとも１つの第１レンズおよび前記少なくとも１つの第２レンズに光学的に接続されたダイクロイックビームコンバイナーと、
    前記ダイクロイックビームコンバイナーに光学的に接続されたコリメータと、
    前記コリメータに光学的に接続された視野絞りと、
    試料に焦点を合わせるために、前記第１および第２のレーザから対物レンズに通過させ、かつ、前記試料からの蛍光発光をカメラ用ダイクロイックフィルタに通過させる照射用ダイクロイックレンズとを備え、前記カメラ用ダイクロイックフィルタは、第１カメラに第１波長の光を通過させ、第２カメラに第２波長の光を通過させ、
    前記単分子分析装置はさらに、前記第１および第２のカメラに接続され、前記蛍光発光を分析するコンピュータを
    備える、単分子分析装置。
  18. 前記照射用ダイクロイックフィルタに光学的に接続されたチューブレンズをさらに備える、請求項１７に記載の装置。
  19. オートフォーカス用光源をさらに備える、請求項１７に記載の装置。
  20. 前記オートフォーカス用光源は、前記照射用ダイクロイックフィルタに光学的に接続された赤外レーザである、請求項１９に記載の装置。
  21. 前記対物レンズはＴＩＲＦ対物レンズである、請求項１７に記載の装置。
  22. 内部全反射を利用して単分子の存在を分析する装置であって、
    試料プレートであって、その上に試料が配置される試料プレートと、
    ２つの波長の光を提供する光源と、
    前記試料上にコリメートされた規定サイズの光のスポットを生成するサイズ設定コリメータと、
    前記各波長の光により前記試料によって生成される蛍光像中の非蛍光を減少させる受光部と、
    前記受光部に光学的に接続された検出器とを備え、
    前記検出器は、前記各波長の光により前記試料によって生成される前記蛍光像を検出するように位置決めされる、装置。
  23. 前記試料の蛍光像の合焦を維持するオートフォーカス装置をさらに備える、請求項２２に記載の装置。
  24. ２つの波長の光を提供する前記光源は２つのレーザを含む、請求項２２に記載の装置。
  25. 前記試料上にコリメートされた規定サイズの光のスポットを生成する前記サイズ設定コリメータは、
    バンドパスフィルタと、
    前記バンドパスフィルタに光学的に接続された発散レンズと、
    前記発散レンズに光学的に接続されたコリメートレンズと、
    前記コリメートレンズに光学的に接続された視野絞りと、
    前記視野絞りに光学的に接続された収束レンズとを備える、請求項２２に記載の装置。
  26. 前記各波長の光により前記試料によって生成される前記蛍光像を受け、非蛍光を減少させる前記受光部は、
    チューブレンズと、
    前記チューブレンズに光学的に接続されたバンドパスフィルタとを備える、請求項２２に記載の装置。
  27. 前記各波長の光により前記試料によって生成される前記蛍光像を検出する前記検出器はカメラを含む、請求項２２に記載の装置。
  28. 内部全反射を利用して単分子の存在を分析する装置であって、
    試料プレートであって、その上に試料が配置される試料プレートと、
    ２つの波長の光を提供する手段と、
    前記試料上にコリメートされた規定サイズの光のスポットを生成する手段と、
    前記各波長の光により前記試料によって生成される蛍光像を受け、非蛍光を減少させる手段と、
    前記各波長の光により前記試料によって生成される前記蛍光像を検出する手段とを備える、装置。
  29. コリメートされた光のスポットを生成する前記手段はＴＩＲＦ対物レンズを含む、請求項２８に記載の装置。
  30. 前記試料によって生成される蛍光像に自動的に焦点を合わせる手段をさらに備える、請求項２８に記載の装置。
  31. 単分子の存在を分析する装置であって、
    試料プレートであって、その上に試料が配置される試料プレートと、
    蛍光を励起する波長の光を提供する第１レーザと、
    第２波長の光を提供する第２レーザと、
    前記第１レーザから、前記試料上にコリメートされた規定サイズの光のスポットを生成するコリメータと、
    前記コリメートされた光のスポットに応答して前記試料によって生成される蛍光像を検出する検出器と、
    前記第２レーザからの光に応答して蛍光像の焦点を調整するオートフォーカスモジュールとを備える、装置。
  32. 前記試料上にコリメートされた光のスポットを結像させるＴＩＲＦレンズをさらに備える、請求項３１に記載の装置。
  33. 単分子の存在を分析する装置であって、
    試料を保持する手段と、
    蛍光を励起する波長の光を提供する手段と、
    第２波長の光を提供する手段と、
    蛍光を励起する波長の光を提供する前記手段から、前記試料上にコリメートされた規定サイズの光のスポットを生成する手段と、
    前記試料によって生成される蛍光像を検出する手段と、
    第２波長の光を提供する前記手段からの光に応答して蛍光像の焦点を調整する手段とを備える、装置。
  34. 内部全反射を利用して前記試料上にコリメートされた光のスポットを結像させる手段をさらに備える、請求項３１に記載の装置。
  35. 単分子を分析する方法であって、
    試料を提供するステップと、
    ２つの異なる波長の光を生成するステップと、
    内部全反射対物レンズを介して前記試料上に２つの異なる波長の前記光を方向づけるステップと、
    ２つの異なる波長の前記光に応答して前記試料中の単分子によって生成される蛍光発光を受けるステップと、
    前記蛍光発光を検出するステップとを含む、方法。
  36. 前記方向づけるステップは、２つの異なる波長の光をコリメートし、前記光が内部全反射対物レンズを通過した後で、ビームのサイズを小さくして試料のサイズに合わせることを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記蛍光発光を検出するステップの前に、蛍光発光に自動的に焦点を合わせるステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
  38. 単分子を分析する方法であって、
    試料を提供するステップと、
    第１波長の光を生成するステップと、
    内部全反射対物レンズを介して前記試料上に前記第１波長の前記光を方向づけるステップと、
    前記第１波長の前記光に応答して前記試料中の単分子によって生成される蛍光発光を受けるステップと、
    蛍光発光に自動的に焦点を合わせるステップと、
    前記蛍光発光を検出するステップとを含む、方法。
  39. 核酸を配列決定する方法であって、
    （ａ）第１の光学的に検出可能な標識を含む核酸を表面に付着させるステップと、
    （ｂ）前記核酸を第１波長の光に暴露するステップと、
    （ｃ）前記第１波長の光に対する前記第１の光学的に検出可能な標識の応答に基づいて、前記核酸の位置を求めるステップと、
    （ｄ）ポリメラーゼおよび第２の光学的に検出可能な標識を含むヌクレオチドに前記核酸を暴露するステップと、
    （ｅ）組み込まれなかったヌクレオチドを除去するステップと、
    （ｆ）内部全反射を利用して前記核酸を第２波長の光に暴露するステップと、
    （ｇ）前記第２波長の光に対する前記第２の光学的に検出可能な標識の応答に基づいて、前記第２の光学的に検出可能な標識の位置を求めるステップと、
    （ｈ）前記第２の光学的に検出可能な標識を除去または不活性化するステップと、
    （ｉ）第２およびそれ以降のヌクレオチドについて、ステップ（ｄ）から（ｈ）を繰り返すステップとを含む、方法。
  40. 前記第１の光学的に検出可能な標識を前記核酸に付着させるステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記第１の光学的に検出可能な標識を前記核酸に付着させるステップは、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ蛍光体およびターミナルトランスフェラーゼを使用して行う、請求項４０に記載の方法。
  42. 第１波長の光は５３２ｎｍである、請求項４１に記載の方法。
  43. 表面に核酸を付着させるステップは、
    前記表面をポリチミル化する（ｐｏｌｙｔｈｙｍｙｌａｔｉｎｇ）ステップと、
    ターミナルトランスフェラーゼを使用して核酸をポリアデニル化するステップと、
    ポリアデニル化した核酸およびポリチミル化した表面の二重鎖を形成するステップとを含む、請求項３９に記載の方法。
  44. 前記第１波長の光に対する前記第１の光学的に検出可能な標識の応答に基づいて前記核酸の位置を求めるステップは、ＣＣＤカメラで核酸の画像を観察し、画像を記録するステップを含む、請求項３９に記載の方法。
  45. 核酸の画像を観察するステップは、前記第１波長の光をフィルタリングして除去するステップを含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 第２の光学的に検出可能な標識を含む前記ヌクレオチドはシアニン−５蛍光体を含む、請求項３９に記載の方法。
  47. 第２波長の光は６３５ｎｍである、請求項４６に記載の方法。
  48. 内部全反射を利用して第２波長の光に前記核酸を暴露するステップは、内部全反射対物レンズを通して前記第２波長の光を通過させるステップを含む、請求項３９に記載の方法。
  49. 前記第２の光学的に検出可能な標識を除去または不活性化するステップは、
    ＴＣＥＰを使用して標識を除去するステップと、
    ヨードアセトアミドでキャップを形成するステップとを含む、請求項３９に記載の方法。
  50. 核酸を配列決定する方法であって、
    （ａ）表面に核酸を付着させるステップと、
    （ｂ）前記表面を第１波長の光に暴露するステップと、
    （ｃ）前記第１波長の光に応答して、前記表面の画像に自動的に焦点を合わせるステップと、
    （ｄ）ポリメラーゼおよび第１の光学的に検出可能な標識を含むヌクレオチドに前記核酸を暴露するステップと、
    （ｅ）組み込まれなかったヌクレオチドを除去するステップと、
    （ｆ）第２波長の光に前記核酸を暴露するステップと、
    （ｇ）前記第２波長の光に対する前記第１の光学的に検出可能な標識の応答に基づいて、前記第１の光学的に検出可能な標識の位置を求めるステップと、
    （ｈ）前記第１の光学的に検出可能な標識を除去または不活性化するステップと、
    （ｉ）第２およびそれ以降のヌクレオチドについて、ステップ（ｄ）から（ｈ）を繰り返すステップとを含む、方法。
  51. 表面に核酸を付着させるステップは、
    前記表面をポリチミル化するステップと、
    ターミナルトランスフェラーゼを使用して核酸をポリアデニル化するステップと、
    ポリアデニル化した核酸および前記ポリチミル化した表面の二重鎖を形成するステップとを含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記第１の光学的に検出可能な標識はシアニン−５蛍光体を含む、請求項５０に記載の方法。
  53. 第２波長の光は６３５ｎｍである、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記第１の光学的に検出可能な標識を除去または不活性化するステップは、
    ＴＣＥＰを使用して標識を除去するステップと、
    ヨードアセトアミドでキャップを形成するステップとを含む、請求項５０に記載の方法。
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