KR20220015443A

KR20220015443A - 전사 릴레이 시스템

Info

Publication number: KR20220015443A
Application number: KR1020217042717A
Authority: KR
Inventors: 리온 옌-리 찬; 애런 로스 쿠퍼; 헨리 찬
Original assignee: 옥탄트, 인크.
Priority date: 2019-05-28
Filing date: 2020-05-27
Publication date: 2022-02-08
Also published as: US20220177897A1; JP2022536257A; EP3976795A1; CA3140902A1; WO2020243164A1; CN114585741A; MA56037A; AU2020283935A1

Abstract

본원에서는 단백질 발현에서 배경 신호를 감소시키는 데, 및 리포터 검정법에 유용한 전사 릴레이 시스템을 기술한다. 상기 시스템은, 프로모터 서열이 리포터 분자의 전사를 활성화시키는 합성 전사 인자의 발현을 제어하는 것인 핵산 시스템을 이용한다.

Description

전사 릴레이 시스템

상호 참조

본 출원은 2019년 5월 28일 출원된 미국 가출원 제62/853,637호을 우선권으로 주장하며, 상기 가출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함되어 있다.

본원에서는 세포 신호전달 경로 반응을 조사하거나, 세포 신호전달 경로의 길항제 또는 효능제를 스크리닝하거나, 또는 신규한 세포 신호전달 경로를 발견하는 데 유용한 핵산, 시스템 및 방법을 기술한다. 당업계에 이전에 공지된 방법은 리포터 분자를 코딩하는 핵산에 근접한 내인성 반응 요소 조절 프로모터를 이용한다. 이러한 방법은 세포에서 내인성 반응 요소 결합 프로모터의 "누출" 특성에 기인하여 리포터 분자의 높은 수준의 배경 신호로 인해 어려움을 겪게 된다. 또한, 이러한 방법은 높은 변동 계수로 인해 어려움을 겪게 된다. 마지막으로, 이러한 방법은 리포터 활성화의 절대값이 낮은 바, 그 결과로 낮은 신호 대 잡음비로 인해 어려움을 겪게 된다. 본 개시내용의 핵산 및 시스템은 합성 전사 인자 결합 부위에 대해 고도로 선택적인 비-내인성 합성 전사 인자를 사용함으로써 생물학적 변이 수준을 감소시키고, 리포터 신호의 신호 대 잡음비를 증가시키고, 배경 신호를 감소시킨다. 따라서, 리포터 분자의 전사는 내인성 전사 인자에 의해 개시되지 않음으로써, 리포터 분자의 배경 신호를 감소시키고, 신호 대 잡음비를 증가시키는 데 도움이 된다. 이러한 핵산 및 시스템은 예컨대, G-단백질 커플링된 수용체, 수용체 티로신 키나제, 이온 채널 및 핵 수용체와 같은 신호 전달 경로의 소분자 또는 생물학적 작용제 또는 길항제를 스크리닝하는 데 유용하다. 광범위한 측면에서, 시스템은 a) 합성 전사 인자 리딩 프레임의 5' 말단에 근접한 반응 요소 조절 프로모터; 및 b) 합성 전사 인자에 의해 결합될 수 있는 프로모터 요소로서, 상기 프로모터 요소는 리포터 유전자 리딩 프레임의 5' 말단에 근접한 것인 프로모터 요소를 코딩하는 핵산을 포함한다. 본 시스템에서, 리포터 유전자는 리포터 검정법의 다중화를 허용하는 고유한 분자 식별자(UMI: unique molecular identifier)를 포함할 수 있다.

한 측면에서, 본원에서는 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 합성 전사 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 인자 핵산으로서, 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 합성 전사 인자를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 5'에 위치하는 것인 전사 인자 핵산; 및 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 리포터 핵산으로서, 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 리포터를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 5'에 위치하고, 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 합성 전사 인자에 의해 결합될 수 있는 것인 리포터 핵산을 포함하는 전사 릴레이 시스템을 기술한다. 특정 실시양태에서, 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열은 cAMP 반응 요소 뉴클레오티드 서열, NFAT 전사 인자 반응 요소 뉴클레오티드 서열, FOS 프로모터 뉴클레오티드 서열, 또는 혈청 반응 요소 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 제1 전사 인자로부터의 DNA 결합 도메인 및 제2 전사 인자로부터의 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 DNA 결합 도메인은 Gal4, PPR1, Lac9, 또는 LexA로부터의 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 DNA 결합 도메인은 서열 번호 1에 기재된 것과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 DNA 결합 도메인은 서열 번호 1에 기재된 것과 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 DNA 결합 도메인은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 DNA 결합 도메인은 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 전사 활성화 도메인은 VP64, p65, 및 Rta를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 전사 활성화 도메인은 서열 번호 14에 기재된 것과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 전사 활성화 도메인은 서열 번호 14에 기재된 것과 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 전사 활성화 도메인은 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 전사 활성화 도메인은 서열 번호 14의 아미노산 서열 변이체를 포함하고, 상기 서열 변이체는 전사 활성화를 증가 또는 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 상기 합성 전사 인자를 불안정화시키는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자를 불안정화시키는 상기 폴리펩티드 서열은 PEST 또는 CL1 폴리펩티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 Gal4, PPR1, Lac9, 또는 LexA에 의해 결합될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 리포터는 형광 단백질, 루시페라제 단백질, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 분비된 태반 알칼리성 포스파타제, 또는 고유한 분자 식별자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 리포터는 형광 단백질, 루시페라제 단백질, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 또는 분비된 태반 알칼리성 포스파타제, 및 UMI를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 고유한 분자 식별자는 시험 폴리펩티드에 고유한 것이고, 상기 시험 폴리펩티드는 상기 리포터 핵산에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 상기 전사 인자 핵산은 전사 억제인자에 의해 결합될 수 있는 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열에 근접한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 전사 인자 핵산은 상기 합성 전사 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 mRNA의 5' 비번역 영역을 연장하는 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열에 근접한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 mRNA의 상기 5' 비번역 영역은 상기 합성 전사 인자의 번역을 감소시키는 하나 이상의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 전사 인자 핵산 및 상기 리포터 핵산은 단일 핵산의 성분이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같이, 상기 릴레이 시스템을 포함하는 세포를 기술한다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 진핵 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 포유동물 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 전사 인자 핵산, 리포터 핵산, 또는 전사 인자 핵산과 리포터 핵산 모두 단일 카피로서 세포의 게놈 내로 통합된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같이, 상기 릴레이 시스템을 포함하는 세포 집단을 기술한다. 특정 실시양태에서, 상기 세포 집단은 진핵 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 세포 집단은 포유동물 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 또는 세포 집단은 높은 기초 리포터 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 또는 세포 집단은 높은 기초 리포터 활성이 배경보다 적어도 약 30x 더 큰 것을 포함하고, 여기서 배경은 리포터를 포함하지 않는 모세포 또는 모세포주에 대해 관찰된 리포터 활성의 수준이다. 특정 실시양태에서, 세포 또는 세포 집단은 리포터 활성에 대해 낮은 생물학적 변동 계수를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 또는 세포 집단은 리포터 활성에 대한 낮은 생물학적 변동 계수가 약 0.5 미만인 것을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같이, 반응 요소 조절 프로모터의 활성에 대한 시험 작용제의 효과를 시험하는 방법으로서, 세포 또는 세포 집단을 상기 시험 물질과 접촉시키는 단계를포함하는 방법을 기술한다. 특정 실시양태에서, 상기 시험 작용제는 화학물질이다.

도 1a는 전사 인자 핵산(좌측) 및 리포터 핵산(우측)을 보여주는, 전사 릴레이 시스템의 개략도를 도시한 것이다.
도 1b는 고유한 RNA 서열을 포함하는 리포터를 코딩하는 핵산 서열을 도시한 것이다.
도 2는 단일 통합된 CRE-루시페라제를 보유하는 세포(회색) 및 반무작위적으로 통합된 CRE-Gal4-VPR의 다중 카피와 함께 단일 통합된 UAS-루시페라제를 보유하는 세포(검정색)에 대한 리포터 산출량을 보여주는 것이다.
도 3은 삼중으로 실행된, 도 2에 도시된 각 샘플에 대한 변동 계수를 보여주는 것이다.
도 4는 Gal4-VPR 프로모터 뉴클레오티드 서열 상의 탈안정화 서열 태그(데그론(degron) 태그)가 전사 릴레이 시스템 유도 배수에 미치는 효과를 보여주는 것이다.
도 5는 NFAT-릴레이 이소클론 세포주로부터 생성된 세포 라이브러리를 보여주는 것이다. 세포주를 양성 대조군 화합물을 이용하여 Gq 커플링된 GPCR에 대한 NFAT-릴레이 리포터 활성을 검출할 수 있는 그의 능력에 대하여 스크리닝하였다. 위발견율(FDR: false discovery rate)이 0.001 미만이거나, 또는 최대_Q(max_Q)가 3 초과인 신호를 생성한 수용체-화합물 조합을 유의적인 히트로 간주하였다. 라이브러리 cb29 및 cb37이 본 스크린에서 가장 유의적인 히트를 생성하였다.
도 6은 세포 라이브러리를 생성하는 데 사용된 이소클론 세포주의 기초 활성대 변동 계수(variance)를 보여주는 것이다.

한 측면에서, 본원에서는 전사 릴레이 시스템으로서, (a) 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 합성 전사 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 인자 핵산으로서, 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 합성 전사 인자를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 5'에 위치하는 것인 전사 인자 핵산; 및 (b) 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 리포터 핵산으로서, 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 리포터를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 5'에 위치하고, 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 합성 전사 인자에 의해 결합될 수 있는 것인 리포터 핵산을 포함하는 전사 릴레이 시스템을 기술한다.

또 다른 측면에서, 본원에서는 반응 요소 조절 프로모터의 활성에 대한 시험 물질의 효과를 검정하는 방법으로서, (a) 세포를 시험 물질과 접촉시키는 단계로서, 상기 세포는 (i) 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 합성 전사 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 인자 핵산으로서, 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 합성 전사 인자를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 5'에 위치하는 것인 전사 인자 핵산; 및 (ii) 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 리포터 핵산으로서, 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 리포터를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 5'에 위치하고, 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 합성 전사 인자에 의해 결합될 수 있는 것인 리포터 핵산을 포함하는 것인 단계; 및 (b) 상기 리포터의 전사를 측정하는 적어도 하나의 검정법을 수행하는 단계를 포함하는 방법을 기술한다.

하기 설명에서, 특정의 구체적인 상세한 내용은 다양한 실시양태의 완전한 이해를 제공하기 위해 기술된다. 그러나, 당업자는 제공된 실시양태가 이들 상세한 내용 없이도 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 명세서 및 하기의 청구범위 전역에 걸쳐 "포함하다(comprise)"라는 단어 및 예컨대, 포함한다(comprises) 및 "포함하는"과 같은 상기 단어의 변이는 개방형의 포괄적인 의미, 즉, "~을 포함하나, 이에 제한되지 않는다"라는 의미로 해석되어야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 단수 형태는 문맥상 명백히 다르게 언급되지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. 또한, 용어 "또는"은 문맥상 명백히 다르게 언급하지 않는 한, 일반적으로 "및/또는"을 포함하는 의미로 사용된다는 것에 주의하여야 한다. 추가로, 본원에서 제공되는 표제는 단지 편의를 위한 것이며, 청구된 실시양태의 범주 또는 의미를 설명하지 않는다.

본원에서 사용되는 바 용어 "약"은 언급된 양의 10%만큼 가까운 양을 지칭한다.

용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며, 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하고, 최소 길이로 제한되지 않는다. 제공된 폴리펩티드 쇄 및 다른 펩티드, 예컨대, 링커 및 결합 펩티드를 비롯한 펩티드는 천연 및/또는 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드의 발현 후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 시알화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는, 상기 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 원래 서열 또는 천연 서열과 관련하여 변형을 포함할 수 있다. 이들 변형은 위치 지정 돌연변이유발법을 이용하는 것과 같이 의도적인 것일 수 있거나, 또는 예컨대, PCR 증폭에 기인한 오류 또는 단백질을 생성하는 호스트의 돌연변이를 통해 이루어진 것과 같이 우발적인 것일 수 있다.

참조 폴리펩티드 서열 대비 서열 동일성(%)은 서열을 정렬하고, 필요하다면 최대 서열 동일성(%)을 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 및 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않으면서, 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율(%)이다. 아미노선 서열 동일성(%)을 결정하기 위한 목적의 정렬은 공지된 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 비교하려는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 알고리즘을 포함하는, 서열을 정렬하기 위해 적합한 파라미터가 결정될 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성(%) 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 게넨테크, 인크.(Genentech, Inc)가 저작자이며, 소스 코드는 미국 저작권청(U.S. Copyright Office: 미국 워싱턴 D.C. 20559 소재)에 사용 설명서와 함께 제출되었고, 미국 저작권 등록번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 게넨테크, 인크.(미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)로부터 공개적으로 이용할 수 있거나, 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 운영 체계에서의 사용을 위해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변경되지 않는다.

ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 A의 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 아미노산 서열 동일성(%)(대안적으로 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 특정 아미노산 서열 동일성(%)을 갖거나, 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 표현될 수도 있다)은 하기와 같이 계산된다: 100 x 분수 X/Y, 여기서, X는 ALIGN-2 프로그램의 A 및 B의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로서 점수화된 아미노산 잔기의 개수이고, 여기서, Y는 B 내의 아미노산 잔기의 총 개수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성(%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성(%)과 동일하지 않다는 것을 이해할 것이다. 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 아미노산 서열 동일성(%) 값은 바로 앞 문단에서 기술한 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 구할 수 있다.

본원에서 참조 서열 대비로 핵산 서열을 기술하기 위해 사용될 때, "동일성," "동일한," 또는 "% 동일한"이라는 용어는 문헌 [Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, modified as in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)]에 기술된 바와 같은 공식을 이용하여 결정될 수 있다. 상기 공식은 문헌 [Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990)]의 기본 국부 정렬 검색 도구(BLAST: basic local alignment search tool) 프로그램에 도입된다. 서열 동일성(%)은 본 출원의 출원일 현재 가장 최신 버전의 BLAST를 사용하여 결정될 수 있다.

본원에 기술된 시스템의 폴리펩티드는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 핵산은 2개 이상의 뉴클레오티드 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 한 유형이다. 특정 실시양태에서, 핵산은 세포 내로 폴리펩티드 코딩 폴리뉴클레오티드를 전달하기 위해 사용될 수 있는 벡터의 성분이다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "벡터"는 연결되어 있는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 한 유형의 벡터는 게놈 통합된 벡터, 또는 "통합 벡터"인데, 이는 숙주 세포의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다. 또 다른 유형의 벡터는 "에피솜" 벡터, 예컨대, 염색체외 복제가 가능한 핵산이다. 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"라고 지칭된다. 적합한 벡터는 플라스미드, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 발현 벡터에서, 조절 요소, 예컨대, 전사 제어에 사용하기 위한 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래될 수 있다. 일반적으로 복제 기점에 의해 부여되는 숙주 내에서 복제할 수 있는 능력 및 형질전환체의 인식을 용이하게 할 수 있는 선별 유전자가 추가로 도입될 수 있다. 바이러서, 예컨대, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노연관 바이러스 등으로부터 유래된 벡터가 사용될 수 있다. 플라스미드 벡터는 염색체 위치 내로의 통합을 위해 선형화될 수 있다. 벡터는 게놈에서 정의된 위치 또는 제한된 부위 세트로 부위 특이적 통합을 지시하는 서열을 포함할 수 있다(예컨대, AttP-AttB 재조합). 추가로, 벡터는 통합을 위해 전이성 인자로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "형질감염" 또는 "형질감염된"이라는 용어는 실험실 내에서 통상적으로 사용되는 프로세스를 통해 세포 내로 외인성 핵산을 의도적으로 도입하는 방법을 지칭한다. 형질감염은 예를 들어, 리포펙션, 인산칼슘 침천, 바이러스 형질도입, 또는 전기천공에 의해 수행될 수 있다. 형질감염은 일시적이거나, 또는 안정적인 형질감염일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "형질감염 효율"은 세포 집단이 외인성 핵산을 포함하는 크기 또는 정도를 지칭한다. 형질감염 효율은 시스템 내의 전체 세포 집단과 비교하여 외인성 핵산이 도입된 주어진 집단 중의 세포 백분율(%)로 측정될 수 있다. 형질감염 효율은 일시적으로 및 안정적으로 형질감염된 세포, 둘 모두에서 측정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "생물학적 활성화 폴리펩티드"는 유전자 발현을 조정하는 세포에 의해 발현되는 폴리펩티드를 지칭한다. 생물학적 활성화 폴리펩티드는 직접적으로, 자극에 대한 반응으로 하나 이상의 중간 분자 또는 폴리펩티드를 통한 신호전달을 통해, 또는 임의의 다른 기전을 통해 유전자 발현을 조정할 수 있다. 생물학적 활성화 폴리펩티드는 막관통 폴리펩티드(예컨대, 수용체 또는 채널 단백질), 세포내 폴리펩티드(예컨대, 신호 전달 중간 매개체), 세포외 폴리펩티드, 또는 분비된 폴리펩티드일 수 있다.

본원에서 사용되는 바 "리포터 활성"은 리포터로부터의 실험적 판독값을 지칭한다. 예를 들어, 루시페라제 리포터는 적절한 기질과 함께 배양될 때 발광 판독값을 갖게 된다. 형광 단백질과 같은 다른 리포터는 기질이 필요하지 않을 수 있지만, 예를 들어, 현미경법 또는 형광 플레이트 판독기를 통해 측정될 수 있다.

시스템 개요

본원에 기술된 시스템, 핵산, 및 방법은 반응 요소 결합 프로모터의 존재 및/또는 활성화 수준을 스크리닝하는 데 유용하다. 본원에 기술된 핵산, 시스템 및 방법은 전통적인 리포터 시스템보다 낮은 수준의 배경 신호로 전사를 활성화시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 반응 요소 결합 프로모터는 세포 신호전달 캐스케이드 끝에서 활성화된다. 특정 실시양태에서, 반응 요소 결합 프로모터의 존재는 예컨대, 물리적 또는 화학적 자극과 같은 외부 자극 전후에 측정될 수 있거나, 병렬로 실행되는 대조군 조건과 비교될 수 있다. 화학적 자극은 효능작용성 또는 길항성 소분자 또는 생물학적 분자일 수 있다. 특정 실시양태에서, 시스템은 약제 발견 목적을 위한 스크리닝에 유용하다. 시스템은 최소한 반응 요소 조절 프로모터, 합성 전사 인자 프로모터, 합성 전사 인자 및 리포터를 포함하는 핵산(들)을 포함한다. 반응 요소 조절 프로모터는 합성 전사 인자에 대해 5'에 위치하고, 반응 요소 결합 프로모터가 존재할 때, 합성 전사 인자의 전사를 활성화시킨다. 이어서, 번역시 합성 전사 인자는 리포터를 코딩하는 핵산 서열에 대해 5'에 위치하는 합성 전사 인자 프로모터에 결합할 수 있다. 결합된 동안 합성 전사 인자 프로모터는 리포터를 코딩하는 핵산 서열의 전사를 활성화시킨다. 특정 실시양태에서, 리포터는 폴리펩티드이다. 특정 실시양태에서, 리포터는 UMI이다. 시스템의 추가의 임의적인 특징은 전사 억제인자에 의해 결합될 수 있는 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열에 근접한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 반응 요소 조절된 프로모터 뉴클레오티드 서열에 근접한 뉴클레오티드 서열은 합성 전사 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 mRNA의 5' 비번역 영역을 연장한다. 특정 실시양태에서, 합성 전사 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 mRNA의 5' 비번역 영역은 합성 전사 인자의 번역을 감소시키는 하나 이상의 서열을 갖는다.

본 발명의 하나의 비제한적인 실시양태가 도 1a에 제시되어 있다. 전사 인자 핵산(100)이 좌측에 제시되어 있다. 전사 인자 핵산(100)에는 합성 전사 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(104)의 5' 위치에 반응 요소 조절 프로모터 핵산(102)이 존재한다. 우측에는 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(114)의 5'에 위치하는 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열(112)을 함유하는 리포터 핵산(110)이 있다. 특정 실시양태에서, 전사 인자 핵산 및 리포터 핵산은 별도의 핵산 분자, 예를 들어, 별도의 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 존재한다. 특정 실시양태에서, 전사 인자 핵산 및 리포터 핵산은 선형이다. 특정 실시양태에서, 전사 인자 핵산 및 리포터 핵산은 플라스미드, 바이러스 벡터, 선형 또는 임의의 다른 구성일 수 있는 동일한 핵산 상에 존재한다.

리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 한 비제한적인 실시양태가 도 1b에 제시되어 있다. 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(114)은 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(122) 뿐만 아니라, UMI를 코딩하는 핵산 서열(124)을 포함한다. 서열(124)은 또한 고유한 분자 식별자(UMI)로 알려져 있다. UMI는 UMI는 (102)에서 반응 요소 조절 프로모터 핵산의 활성화를 초래하는 특정 생물학적 활성화 폴리펩티드를 확인할 수 있다. 비제한적인 예로서, 생물학적 활성화 폴리펩티드는 특정 G-커플링된 단백질 수용체를 포함할 수 있으며, 이 중 수백 개가 알려져 있다. 따라서, UMI 요소를 통해 다중 포맷으로 수개의 상이한 생물학적 활성화 폴리펩티드의 신호 전달에 대한 쉽고 빠르게 조사할 수 있다. 추가로, 릴레이 시스템은 반응 요소 조절 프로모터를 통한 배경 신호전달을 감소시킨다. 이로써, 더욱 정확하게 정량화할 수 있고, 생물학적 활성화 폴리펩티드를 활성화시킬 수 있는 화합물에 대한 임의의 다중 스크리닝에서 위양성 시험 화합물의 개수를 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 존재하지 않는다. 특정 실시양태에서, UMI를 코딩하는 핵산 서열은 존재하지 않는다. 특정 실시양태에서, UMI를 코딩하는 핵산 서열은 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 5'에 위치한다. 특정 실시양태에서, 리포터 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 UMI를 코딩하는 핵산 서열의 5'에 위치한다.

특정 실시양태에서, 리포터를 코딩하는 핵산은 리포터 폴리펩티드를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 상기 리포터 폴리펩티드는 직접 검출될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 리포터 폴리펩티드는 기질에 대한 단백질의 효소 활성에 대해 검출가능한 신호를 생성한다. 특정 실시양태에서, 리포터 폴리펩티드의 검출은 정량적으로 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 리포터 폴리펩티드는 루시페라제 단백질, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 분비된 태반 알칼리성 포스파타제, 또는 그의 조합을 포함한다. 상기 리포터 폴리펩티드가 루시페라제 단백질인 특정 실시양태에서, 기질의 비제한적인 예로 반딧불이 루시페린, 라티아 루시페린, 박테리아 루시페린, 코엘렌테라진, 디노플라겔레이트 루시페린, 바굴린, 및 3-하이드록시 히스피딘을 포함한다.

특정 실시양태에서, 리포터를 코딩하는 핵산은 UMI를 코딩한다. 상기 UMI는 핵산에 고유한 뉴클레오티드의 짧은 서열을 포함한다. 상기 UMI는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 상기 UMI는 차세대 시퀀싱 방법과 같이 상기 UMI의 서열 결정을 가능하게 하는 임의의 적절한 방식으로 검출될 수 있다. 상기 UMI를 검출하는 방법은 정량적일 수 있으며, 차세대 시퀀싱 방법을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에서는 약물 발견에 사용하기 위한 전사 인자 핵산 및 리포터 핵산을 코딩하는 핵산(들)을 포함하는 시스템을 효율적으로 활용 방법을 기술한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 핵산(들)이 세포에 의해 내재화 및 발(예컨대, 형질감염)되기에 충분한 조건하에 핵산(들)을 세포 또는 세포 집단과 접촉시키는 단계; 물리적 또는 화학적 자극과 세포를 접촉시키는 단계; 및 하나 이상의 검정법에 의해 리포터 요소의 활성화를 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 전사 인자 핵산 및 리포터 핵산을 코딩하는 핵산(들)을 포함하는 세포 또는 세포 집단을 접촉시키는 단계; 및 하나 이상의 검정법에 의해 리포터 요소의 활성화를 측정하는 단계를 포함한다.

반응 요소 조절 프로모터

반응 요소는 특정 전사 인자에 결합하고 유전자의 전사를 조절할 수 있는 유전자 프로모터 영역 내의 짧은 DNA 서열이다. 특정 반응 요소는 특정 프로모터에 특이적이다. 일부 반응 요소는 내인성 전사 인자에 의해 결합될 수 있다. 동일한 반응 요소의 다중 카피는 뉴클레오티드 서열의 다른 부분에 위치하여 동일한 자극에 대한 반응으로 다른 유전자를 활성화시킬 수 있다. 본원에 기술된 시스템에 도입될 수 있는 반응 요소의 비제한적인 예로는 cAMP 반응 요소(CRE: cAMP response element), B 인식 요소, AhR-, 다이옥신- 또는 생체이물 반응 요소, HIF-반응 요소, 호르몬 반응 요소, 혈청 반응 요소, 레티노산 반응 요소, 퍼옥시좀 증식체 호르몬 반응 요소, 금속 반응 요소, DNA 손상 반응 요소, IFN 자극 반응 요소, ROR 반응 요소, 글루코코르티코이드 반응 요소, 칼슘 반응 요소 CaRE1, 항산화제 반응 요소, p53 반응 요소, 갑상선 호르몬 반응 요소, 성장 호르몬 반응 요소, 스테롤 반응 요소, 폴리콤 반응 요소 및 비타민 D 반응 요소를 포함한다.

반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 유전자의 전사를 조절하는 다른 분자를 동원하는 데 도움을 주는 하나 이상의 반응 요소를 함유하는 핵산 영역이다. 세포는 유전자의 전사를 조정하기 위해 내인성 단백질을 이용하는 다수의 반응 요소 조절 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 내인성 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열이 리포터의 전사를 직접 조절하는 상황에서 내인성 프로모터의 존재로 인해 높은 수준의 배경 신호가 존재한다. 시스템을 함유하는 세포에 내인성이 아닌 전사 인자를 갖는 리포터의 전사를 조절하는 시스템은 내인성 전사 인자를 갖는 리포터의 전사를 조절하는 시스템에 비해 이점을 가질 것이다. 그러한 시스템의 한 가지 이점은 상기 리포터의 배경 생산이 더 낮다는 것이 될 것이다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 전사 릴레이 시스템은 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 합성 전사 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 인자 핵산을 포함하고, 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 합성 전사 인자를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 5'에 위치한다. 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 합성 전사 인자 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 합성 전사 인자의 발현을 제어하는 역할을 한다. 특정 실시양태에서, 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열은 cAMP 반응 요소 뉴클레오티드 서열, NFAT 전사 인자 반응 요소 뉴클레오티드 서열, FOS 프로모터 뉴클레오티드 서열, 혈청 반응 요소 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열은 cAMP 반응 요소 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열은 NFAT 전사 인자 반응 요소 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열은 FOS 프로모터 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열은 혈청 반응 요소 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열은 cAMP 반응 요소 뉴클레오티드 서열, NFAT 전사 인자 반응 요소 뉴클레오티드 서열, FOS 프로모터 뉴클레오티드 서열, 및/또는 혈청 반응 요소 뉴클레오티드 서열의 임의 조합을 포함한다.

특정 실시양태에서, 상기 반응 요소 조절 프로모터는 전사 인자에 의해 결합될 수 있다. 통상의 전사 인자의 비제한적인 예로는 LexA, Gal4, VP16(단순 헤르페스 바이러스 유래), 열 충격 인자(HSF: heat shock factor), NFAT, CREB, 또는 그의 조합을 포함한다. 본원에 기술된 시스템은 리포터 검정에서 일반적으로 또는 잠재적으로 사용할 수 있는 임의의 전사 인자, 또는 그의 임의 조합과 양립할 수 있다.

특정 실시양태에서, 상기 반응 요소 조절 프로모터는 내인성 전사 인자에 의해 결합된다. 내인성 전사 인자는 유기체, 조직 또는 세포에 자연적으로 존재하는 전사 인자이다. 내인성 전사 인자의 존재는 상기 전사 릴레이가 존재하는 시스템에 의존할 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 내인성 전사 인자는 배경 속도로 합성 전사 인자의 전사를 촉진시킨다.

특정 실시양태에서, 상기 전사 인자 핵산은 전사 억제인자에 의해 결합될 수 있는 상기 반응 요소 조절 프로모터 핵산 서열에 근접한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 전사 억제인자는 원위 뉴클레오티드 서열의 전사를 억제시킨다. 통상의 전사 억제인자의 비제한적인 예로는 TetR, lac 억제인자, KRAB 억제인자, 및 그의 조합을 포함한다. 본원에 기술된 시스템은 리포터 검정에서 일반적으로 또는 잠재적으로 사용할 수 있는 임의의 억제인자, 또는 그의 임의 조합과 양립할 수 있다.

특정 실시양태에서, 상기 전사 인자 핵산은 상기 합성 전사 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 mRNA의 5' 비번역 영역을 연장하는 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열에 근접한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 mRNA의 상기 5' 비번역 영역은 상기 합성 전사 인자의 번역을 감소시키는 하나 이상의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자의 번역을 감소시키는 상기 하나 이상의 서열은 상기 합성 전사 인자의 번역을 감소시키는 2차 구조를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자의 번역을 감소시키는 상기 하나 이상의 서열은 RNA 결합 단백질에 의한 결합에 영향을 주는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자의 번역을 감소시키는 상기 하나 이상의 서열은 상류 오픈 리딩 프레임을 포함한다.

검정 방법

상기 기술된 시스템은 다양한 방법을 사용하여 효과적으로 이용될 수 있다. 시스템은 정상 상태에서 및 물리적 또는 화학적 자극에 대한 반응으로 세포 신호전달 경로의 활성을 조사하는 방법에서 유용하다. 리포터 요소가 특정 리포터 요소에 메이팅된 UMI 서열을 포함하는 경우, 상기 시스템은 다중화된 검정법에서 효율적으로 활용될 수 있다.

한 비제한적인 예시적인 예에서, 복수의 세포를 다중웰 플레이트의 한 웰에서 인큐베이션시킨다. 복수의 세포를 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 리포터 핵산으로 형질감염시킨다. 세포는 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 합성 전사 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 인자 핵산을 이미 포함하고 있을 수 있거나, 또는 상기 전사 인자 핵산으로 형질감염될 수 있다. 이어서, 형질감염된 세포를 화학적 자극과 접촉시킨다. 리포터 유전자가 발현될 수 있도록 하는 충분한 시간이 경과한 후, 세포 용해물을 수확하고, 상기 리포터 유전자의 활성화를 정량화한다. 상기 예에서, 리포터 유전자의 존재가 증가하였다면, 이는 화학적 자극이 상기 반응 요소 조절 프로모터에 결합하는 전사 인자(들)의 활성을 증가시켰다는 것을 시사하는 것이 될 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 반응 요소 조절 프로모터에 결합하는 상기 전사 인자(들)는 세포-신호전달 캐스케이드 후에 증가된 활성을 갖는다.

상기 리포터 유전자가 기질과의 상호작용시 검출가능한 신호를 생성하는 효소를 포함하는 실시양태에서, 당업계에 공지된 표준 검정법을 이용하여 상기 리포터 유전자의 활성화를 정량화할 수 있다. 상기 리포터 유전자가 형광 분자를 포함하는 실시양태에서, 상기 리포터 유전자의 활성화는 형광 현미경법 또는 형광 플레이트 판독기에 의해 측정될 수 있고, 세포 용해를 필요로 하지 않을 수 있다. 상기 형광 분자는 살아있는 세포에서 리포터 활성화를 측정하는 데 유용하다. 상기 리포터 유전자가 UMI를 포함하는 실시양태에서, mRNA는 역전사되고, UMI의 시퀀싱은 차세대 시퀀싱 기술에 의해 수행된다.

특정 실시양태에서, 검정법은 예컨대, 6, 12, 24, 48, 96, 또는 384-웰 포맷과 같은 다중웰 포맷으로 수행된다. 특정 실시양태에서, 각 웰에는 상이한 시험 화학물질이 공급되거나, 또는 시험 화학물질은 이중, 삼중 또는 사중 웰로 공급된다. 검정법은 또한 하나 이상의 양성 또는 음성 대조군 웰을 포함할 수 있다.

합성 전사 인자

합성 전사 인자는 유전자 발현을 표적화하고, 조정할 수 있는 인공 단백질이다. 일부 합성 전사 인자는 다수의 상이한 유전자로부터의 도메인을 함유하는 키메라 단백질이다. 특정 실시양태에서, 합성 전사 인자는 한 유전자로부터의 DNA 결합 도메인 및 또 다른 유전자로부터의 전사 조절 도메인을 포함한다.

본원에 기술된 방법, 핵산, 및 시스템에서, 전사 활성화 폴리펩티드는 전사 인자 핵산 상에서 코딩된다. 특정 실시양태에서, 상기 전사 활성화 폴리펩티드는 합성 전사 인자이다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 키메라 단백질이다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 제1 전사 인자로부터의 DNA 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 제2 전사 인자로부터의 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 제1 전사 인자는 상기 제2 전사 인자와 상이하다.

특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 임의의 내인성 전사 인자보다 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열에 대하여 더 높은 특이성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 내인성 프로모터가 결합하지 못하는 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열에 결합한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 내인성 전사 인자를 사용하는 경우에 발생하는 것보다 더 적게 배경을 생산한다.

특정 실시양태에서, 상기 DNA 결합 도메인은 본 발명의 전사 릴레이 시스템을 함유하는 세포에 대해 비내인성이다. 특정 실시양태에서, 상기 제1 전사 인자로부터의 DNA 결합 도메인은 Gal 4, PPR1, LexA, Lac9, 또는 그의 조합으로부터의 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 DNA 결합 도메인은

에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 DNA 결합 도메인은

에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 상기 DNA 결합 도메인은 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 R15W, K23P, K23T, K23W, K23M, K23N, F68R, F68Q, L69P, L70P, Q9E, Q9A, Q9N, R15K, R15A, R15M, K18R, K18A, K18M, K23R, K23A, K23M, 또는 그의 조합이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 R15W이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 K23P이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 K23T이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 K23W이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 K23M이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 K23N이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 F68R이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 F68Q이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 L69P이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 L70P이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 Q9E이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 Q9A이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 Q9N이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 R15K이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 R15A이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 R15M이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 K18R이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 K18A이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 K18M이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 K23R이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 K23A이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체는 K23M이다.

특정 실시양태에서, 상기 제2 전사 인자로부터의 전사 활성화 도메인은 VP64, p65, 및 Rta, 및 그의 조합으로부터의 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 전사 활성화 도메인은

에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 VPR 아미노산 서열을 갖는 전사 인자를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 VPR 아미노산 서열을 갖는 전사 인자를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 VPR 아미노산 서열을 갖는 전사 인자를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 VPR 아미노산 서열을 갖는 전사 인자를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 VPR 아미노산 서열을 갖는 전사 인자를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 VPR 아미노산 서열을 갖는 전사 인자를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 100% 동일한 VPR 아미노산 서열을 갖는 전사 인자를 코딩한다.

특정 실시양태에서, 합성 전사 인자 상의 전사 활성화 도메인은 전사 활성화를 증가 또는 감소시키는 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 전사 활성화를 증가 또는 감소시키는 아미노산 서열 변이체를 포함하는 상기 전사 활성화 도메인은 서열 번호 14의 서열 변이체이다.

특정 실시양태에서, 전사 인자 핵산의 핵산 서열에 의해 코딩되는 합성 전사 인자는 "데그론"으로도 명명되는, 상기 합성 전사 인자를 불안정화시키는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 전사 인자를 불안정화시키는 상기 폴리펩티드 서열은 PEST 폴리펩티드 서열을 포함한다. PEST 폴리펩티드 서열은 PEST 폴리펩티드 서열은 복수의 아미노산을 함유하는 폴리펩티드 서열로서, 여기서, 상기 폴리펩티드 서열은 아미노산 프롤린, 글루탐산, 세린, 및/또는 트레오닌이 풍부한 것인 폴리펩티드 서열이다. 특정 실시양태에서, 상기 전사 인자를 불안정화시키는 상기 폴리펩티드 서열은 CL1 폴리펩티드 서열을 포함한다. CL1 폴리펩티드 서열은 분해 신호로서 작용할 수 있고, 그 결과로 생성된 합성 전사 인자의 반감기는 더 짧게 단축될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자를 불안정화시키는 상기 폴리펩티드 서열은 리포터의 배경 신호 감소에 도움을 준다.

특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 GAL4-VP16 키메라 전사 인자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 전사 인자는 GAL4-VPR 키메라 전사 인자를 포함한다. Gal4-VPR 키메라 전사 인자의 서열은

에 기재된 서열에 의해 제공된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 인자를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 인자를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 인자를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 인자를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 인자를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 인자를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 인자를 코딩한다.

특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 의해 제공되는 Gal4 DNA 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DNA 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DNA 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DNA 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DNA 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DNA 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DNA 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 DNA 결합 도메인을 포함한다.

특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는

에 기재된 아미노산 서열에 의해 제공되는 VP64로부터의 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 11에 기재된 아미노산 서열과 적어도 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다.

특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는

에 기재된 아미노산 서열에 의해 제공되는 p65로부터의 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열과 적어도 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다.

특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는

에 기재된 아미노산 서열에 의해 제공되는 Rta로부터의 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열과 적어도 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 전사 활성화 도메인을 포함한다.

합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열

합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 합성 전사 인자에 의해 결합될 수 있는 핵산의 서열이다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자 뉴클레오티드 서열은 내인성 전사 인자에 의해 결합되지 않는다. 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 리포터 분자의 전사를 활성화시키기 위해 상기 합성 전사 인자의 동원에 도움을 준다. 상기 리포터 분자는 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치하는 핵산 상에서 코딩된다.

본원에 기술된 방법, 핵산, 및 시스템에서, 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 리포터 핵산 상에서 코딩된다. 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 전사 인자 핵산 상에서 코딩된 합성 전사 인자에 의해 결합될 수 있다. 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치한다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 내인성 전사 인자에 의해 결합되지 않는다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열에 대하여 고도로 특이적이다.

특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 Gal4, PPR1, Lac9, 또는 LexA가 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 결합할 수 있다.

특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 Gal4, PPR1, Lac9, 또는 LexA의 아미노산 서열 변이체가 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체가 결합할 수 있다.

리포터 요소

리포터 핵산은 최소한 합성 전사 인자에 의해 결합될 수 있는 조절 요소 및 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상기 합성 전사 인자에 의해 결합될 수 있는 상기 조절 요소 하류에 위치한다. 상기 합성 전사 인자는 상기 리포터의 발현을 조절한다.

특정 실시양태에서, 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 리포터 유전자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 리포터 유전자는 형광 단백질, 루시페라제 단백질, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 및 분비된 태반 알칼리성 포스파타제로부터 선택되는 리포터를 코딩한다. 이들 리포터 단백질은 특정 효소 활성에 대해 검정될 수 있거나, 형광 리포터의 경우, 형광 방출에 대해 검정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP: green fluorescent protein), 적색 형광 단백질(RFP: red fluorescent protein), 황색 형광 단백질(YFP: yellow fluorescent protein), 또는 청록색 형광 단백질(CFP: cyan fluorescent protein)을 포함한다.

특정 실시양태에서, 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 고유한 서열 식별자(UMI)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI는 시험 폴리펩티드에 대해 고유한 것이고, 상기 시험 폴리펩티드는 상기 리포터 핵산에 의해 코딩되는 것이다. 일반적으로, 상기 UMI의 길이는 8 내지 20개의 뉴클레오티드 길이가 되겠지만, 더욱 긴 길이일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI의 길이는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI의 길이는 8개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI의 길이는 9개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI의 길이는 10개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI의 길이는 11개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI의 길이는 12개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI의 길이는 13개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI의 길이는 14개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI의 길이는 15개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI의 길이는 16개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI의 길이는 17개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI의 길이는 18개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI의 길이는 19개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI의 길이는 20개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI의 길이는 20개 초과의 뉴클레오티드 길이이다.

본원에 기술된 시스템은 합성 전사 인자 결합을 통해 리포터 유전자의 활성화를 제어하는 다수의 상이한 조절 서열을 이용할 수 있다. 조절 서열은 합성 전사 인자 폴리펩티드에 의해 결합될 수 있는 것이다. 일반적으로, 조절 서열이 UMI, 리포터 유전자, 또는 그 둘 모두에 대해 5'에 위치하도록 구성될 것이다. 특정 실시양태에서, 조절 서열은 합성 전사 인자에 의해 결합될 수 있는, Gal4-, PPR1-, 또는 LexA-UAS를 포함한다.

특정 실시양태에서, 리포터는 형광 단백질, 루시페라제 단백질, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 또는 분비된 태반 알칼리성 포스파타제, 및 UMI를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 UMI는 형광 단백질, 루시페라제 단백질, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 또는 분비 태반 알칼리성 포스파타제의 5'에 위치하는 리포터 핵산 상에서 코딩된다. 특정 실시양태에서, 형광 단백질, 루시페라제 단백질, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 또는 분비 태반 알칼리성 포스파타제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상기 UMI의 5'에 위치한다.

UMI의 전사는 특정 릴레이 시스템과 리포터의 연관성을 명시하게 되는 바, 이러한 이유에어 UMI는 동일한 검정법 내에서 상이한 전사 릴레이 시스템의 다중화를 허용한다. UMI의 길이는 충분한 다양성을 통해 동일한 검정법 내에서 상이한 전사 릴레이 시스템의 다중화된 측정할 수 있도록 허용하는 임의의 길이일 수 있다. 상기 길이는 적어도 100, 500, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 또는 10,000개의 전사 릴레이 표적 사이를 구별하는 데 충분한 길이여야 한다. 특정 실시양태에서, 상기 상이한 전사 릴레이 시스템은 상이한 세포에 존재할 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 상이한 전사 릴레이 시스템은 동일한 세포에 존재할 것이다.

리포터 요소는 5' UTR, 또는 3'UTR, 또는 그 둘 모두를 추가로 포함할 수 있다. UTR은 리포터 요소에 대하여 이종성일 수 있다.

리포터 활성화

리포터 분자의 활성화는 루시페라제 단백질, 베타-갈락토시다제 단백질, 베타-글루쿠로니다제 단백질, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 단백질, 분비된 태반 알칼리성 포스파타제 단백질을 검출하는 표준 검정법을 이용하여 측정될 수 있다. 일반적으로, 이는 검출가능한 신호가 검출가능한 신호에 기반하여 생성되는 것인 효소 검정법이다. 예를 들어, 루시페라제 발현은 루시퍼라아제 기질의 존재하에서 발광측정장치에 의해 측정될 수 있다. 형광 리포터는 기질을 필요로 하지 않으며, 신호는 형광 현미경법 또는 형광 플레이트 판독기에 의해 측정될 수 있다. 형광 리포터는 살아있는 세포에서 리포터 활성화화를 측정하는 데 특히 유용하다.

리포터 분자가 고유한 RNA 서열을 포함하는 실시양태에서, 리포터 활성화는 고유한 RNA 서열의 서열 결정을 허용하는 임의의 적합한 방식으로 측정될 수 있으며, 다중 방식으로 서열 결정을 허용하는 방법을 선호한다. 상기 방법은 24시간 기간 내에 적어도 약 100,000, 1,000,000, 10,000,000, 또는 100,000,000개의 DNA 또는 RNA 염기에 대한 정보를 생성할 수 있는 고처리량 시퀀싱 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 차세대 시퀀싱 기술을 이용하여 고유한 RNA 서열의 서열을 결정한다. 차세대 시퀀싱은 많은 종류의 시퀀싱, 예컨대, 파이로시퀀싱, 합성에 의한 시퀀싱, 단일 분자 시퀀싱, 차세대 시퀀싱, 나노포어 시퀀싱, 라이게이션에 의한 시퀀싱, 또는 하이브리드화에 의한 시퀀싱을 포함한다. 차세대 시퀀싱 플랫폼은 일루미나(Illumina)(RNA-Seq) 및 헬리코스(Helicos)(Digital Gene Expression 또는 "DGE")로부터 상업적으로 이용가능한 것을 포함한다. 차세대 시퀀싱은 1) 문헌 [Margulies et al., Nature (2005) 437:376-380 (2005)] 및 미국 특허 제7,244,559호; 제7,335,762호; 제7,21 1,390호; 제7,244,567호; 제7,264,929호; 제7,323,305호에 기술된 방법 및 장치를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 454/로슈 라이프사이언시스(454/Roche Lifesciences); 2) 미국 출원 시리얼 제11/167046호, 미 미국 특허 제7501245호; 제7491498호; 제7,276,720호; 및 미국 특허 출원 공개 제US20090061439호; 제US20080087826호; 제US20060286566호; 제US20060024711호; 제US20060024678호; 제US20080213770호; 및 제US20080103058호에 기술된 바와 같은, 헬리코스 바이오사이언시스 코포레이션(Helicos Biosciences Corporation) (미국 매사추세츠주 케임브리지); 3) 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) (예컨대 SOLiD 시퀀싱); 4) 도버 시스템즈(Dover Systems)(예컨대, Polonator G.007 시퀀싱); 5) 미국 특허 제5,750,341호; 제6,306,597호; 및 제5,969,119호에 기술된 바와 같은, 일루미나, 인크.(Illumina, Inc.); 및 6) 미국 특허 제7,462,452호; 제7,476,504호; 제7,405,281호; 제7,170,050호; 제7,462,468호; 제7,476,503호; 제7,315,019호; 제7,302,146호; 제7,313,308호; 및 US 출원 공개 제US20090029385호; 제US20090068655호; 제US20090024331호; 및 제US20080206764에 기술된 바와 같은, 퍼시픽 바이오 사이언시스(Pacific Biosciences)에 의해 상업화된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

마커

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 선별 폴리펩티드 또는 마킹 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 추가 유전자를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 형질감염된 세포에 항생제 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 추가 유전자를 추가로 포함한다. 예를 들어, 핵산은 선별 마커, 예컨대, 네오마이신/G418 내성, 퓨로마이신 내성, 제오신 내성, 또는 블라스티시딘 내성과 같은 항생제 내성을 부여하는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 세포 표면에서 발현되는 에피토프 태그를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 추가 유전자를 추가로 포함한다. 이를 통해 친화성 정제 또는 세포 분류를 수행함으로써 기술된 핵산을 이용하여 형질감염된 세포를 수집할 수 있다. 특정 실시양태에서, 에피토프 태그는 c-Myc 태그, 헤마글루티닌(HA) 태그, 히스티딘 태그, V5 태그, 또는 FLAG 태그를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 핵산은 형광 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 추가 프로모터가 없는 유전자를 추가로 포함한다. 상기 유전자는 형질감염이 통합을 유도하기 위해 의도되고, 특정 위치 또는 랜딩 패드(landing pad)를 위해 표적화되는 경우에 유용하다. 이러한 경우에서, 세포 게놈 내의 "랜딩 패드"는 프로모터가 없는 유전자에서 프로모터의 결여를 보완할 수 있고, 프로모터가 없는 유전자가 의도된 게놈 위치에 통합되는 경우에만 프로모터가 없는 유전자의 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 포함한다. 정확하게 통합된 세포는 유세포 분석법 및 세포 분류에 의해 선별될 수 있다. 또한, 이러한 유형의 마커는 오직 의도된 핵산의 단일 카피만이 게놈 내로 통합되고, 이소성 과다발현의 회피에 도움이 된다는 점을 보장할 수 있다. 특정 실시양태에서, 베이트(bait) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 형질감염된 세포에 항생제 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자; 세포 표면에서 발현되는 에피토프 태그를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자; 또는 형광 폴리펩티드를 코딩하는 프로모터가 없는 유전자를 포함한다.

세포

본원에 기술된 방법에 유용한 세포는 일반적으로 합성 전사 인자 및 리포터 요소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산으로 용이하게 트랜스제닉이 될 수 있는 세포이다. 합성 전사 인자 및 리포터 요소를 코딩하는 시스템 핵산(들)은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 인산칼슘 형질감염, 지질 기반 형질감염(예컨대, Lipofectamine™, Lipofectamine-2000™, Lipofectamine-3000™, 또는 Fugene® HD), 전기천공, 또는 바이러스 형질도입을 이용하여 적합한 세포주 내로 형질감염 또는 형질도입될 수 있다. 세포는 또한 적절한 세포 배양 용기 내에서 전면생장될 때까지 또는 거의 전면생장될 때까지 성장된 동일한 유형의 세포 집단일 수도 있다.

특정 실시양태에서, 사용되는 세포로는 합성 전사 인자를 코딩하는 핵산, 리포터 요소를 포함하는 핵산, 또는 그 둘 모두의 안정한 통합을 포함한다. 안정한 세포주는 선형화된 플라스미드의 무작위 통합, 바이러스 또는 트랜스포존 지정 통합, 또는 예를 들어, AttP와 AttB 부위 사이의 부위 특이적 재조합을 이용하는 지정 통합을 이용하여 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 중 하나는 예컨대, AAVS1 부위와 같은 안전한 랜딩(landing) 부위에서 코딩된다.

특정 실시양태에서, 본 시스템에서 사용되는 세포 또는 세포 집단은 진핵 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포 또는 세포 집단은 포유동물 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포 또는 세포 집단은 인간 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포 또는 세포 집단은 SH-SY5Y, 인간 신경아세포종; Hep G2, 인간 백인 간세포 암종; 293(HEK 293으로도 또한 공지), 인간 배아 신장; RAW 264.7, 마우스 단핵구 대식세포; HeLa, 인간 자궁경부 상피 암종; MRC-5 (PD 19), 인간 태아 폐; A2780, 인간 난소 암종; CACO-2, 인간 백인 결장 선암종; THP 1, 인간 단핵구 백혈병; A549, 인간 백인 폐 암종; MRC-5(PD 30), 인간 태아 폐; MCF7, 인간 백인 유방 선암종; SNL 76/7, 마우스 SIM 계통 배아 섬유아세포; C2C12, 마우스 C3H 근육 근아세포; 주르카트(Jurkat) E6.1, 인간 백혈병 T 세포 림프아세포; U937, 인간 백인 조직구 림프종; L929, 마우스 C3H/An 결합 조직; 3T3 L1, 마우스 배아; HL60, 인간 백인 전골수구 백혈병; PC-12, 래트 부신 크롬친화세포종; HT29, 인간 백인 결장 선암종; OE33, 인간 백인 식도 암종; OE19, 인간 백인 식도 암종; NIH 3T3, 마우스 스위스 NIH 배아; MDA-MB-231, 인간 백인 유방 선암종; K562, 인간 백인 만성 골수성 백혈병; U-87 MG, 인간 교아종 성상세포종; MRC-5 (PD 25), 인간 태아 폐; A2780cis, 인간 난소 암종; B9, 마우스 B 세포 하이브리도마; CHO-K1, 차이니즈 햄스터 난소; MDCK, 개 코커 스패니얼(Cocker Spaniel) 신장; 1321N1, 인간 뇌 성상세포종; A431, 인간 편평상피 암종; ATDC5, 마우스 129 기형암종 AT805 유래; RCC4 PLUS VECTOR ALONE, 네오마이신 내성을 부여하는 pcDNA3 공 발현 벡터를 이용하여 안정하게 형질감염된 신장 세포 암종 세포주 RCC4; HUVEC (S200-05n), 인간 미리 스크리닝된 제대 정맥 혈관 내피 세포(HUVEC: Umbilical Vein Endothelial Cell); 신생아; Vero, 아프리카 녹색 원숭이 신장; RCC4 PLUS VHL, pcDNA3-VHL로 안정하게 형질감염된 신장 세포 암종 세포주 RCC4; Fao, 래트 간종양; J774A.1, 마우스 BALB/c 단핵구 대식세포; MC3T3-E1, 마우스 C57BL/6 두개관; J774.2, 마우스 BALB/c 단핵구 대식세포; PNT1A, SV40으로 불멸화된 인간 사춘기 후 전립선 정상; U-2 OS, 인간 골육종; HCT 116, 인간 결장 암종; MA104, 아프리카 녹색 원숭이 신장; BEAS-2B, 인간 기관지 상피세포, 정상; NB2-11, 래트 림프종; BHK 21(클론 13), 시리아 햄스터 신장; NS0, 마우스 골수종; Neuro 2a, 마우스 알비노 신경아세포종; SP2/0-Ag14, 마우스 x 마우스 골수종, 비증식성; T47D, 인간 유방 종양; 1301, 인간 T-세포 백혈병; MDCK-II, 개 코커 스패니얼 신장; PNT2, SV40으로 불멸화된 인간 전립선 정상; PC-3, 인간 백인 전립선 선암종; TF1, 인간 적백혈병; COS-7, 아프리카 녹색 원숭이 신장, SV40 형질전환; MDCK, 개 코커 스패니얼 신장; HUVEC (200-05n), 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC); 신생아; NCI-H322, 인간 백인 세기관지폐포 암종; SK.N.SH, 인간 백인 신경아세포종; LNCaP.FGC, 인간 백인 전립선 암종; OE21, 인간 백인 식도 편평상피 세포 암종; PSN1, 인간 췌장 선암종; ISHIKAWA, 인간 아시안 자궁내막 선암종; MFE-280, 인간 백인 자궁내막 선암종; MG-63, 인간 골육종; RK 13, 토끼 신장, BVDV 음성; EoL-1 세포, 인간 호산구성 백혈병; VCaP, 인간 전립선 암 전이; tsA201, 인간 배아 신장, SV40 형질전환; CHO, 차이니즈 햄스터 난소; HT 1080, 인간 섬유육종; PANC-1, 인간 백인 췌장; Saos-2, 인간 1차 골원성 육종; 섬유아세포 성장 배지(116K-500), 섬유아세포 성장 배지 키트; ND7/23, 마우스 신경아세포종 x 래트 뉴런 하이브리드; SK-OV-3, 인간 백인 난소 선암종; COV434, 인간 난소 과립막세포 종양; Hep 3B, 인간 간세포 암종; Vero(WHO), 아프리카 녹색 원숭이 신장; Nthy-ori 3-1, 인간 갑상선 여포성 상피세포; U373 MG(웁살라), 인간 교아종 성상세포종; A375, 인간 악성 흑색종; AGS, 인간 백인 위 선암종; CAKI 2, 인간 백인 신장 암종; COLO 205, 인간 백인 결장 선암종; COR-L23, 인간 백인 폐 대세포 암종; IMR 32, 인간 백인 신경아세포종; QT 35, 일본 메추라기(Quail Japanese) 섬유육종; WI 38, 인간 백인 태아 폐; HMVII, 인간 질 악성 흑색종; HT55, 인간 결장 암종; TK6, 인간 림프아세포, 티미틴 키나제 이형접합체; SP2/0-AG14 (AC-FREE), 마우스 x 마우스 하이브리도마 비분비, 무혈청, 동물 성분(AC: animal component) 무함유; AR42J, 또는 래트 외분비 췌장 종양, 또는 그의 임의 조합이다

본원에서는 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 합성 전사 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 인자 핵산을 포함하는 세포 및 세포주로서, 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 합성 전사 인자를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 5'에 위치하는 것인 세포 및 세포주를 기술한다. 특정 실시양태에서, 세포주는 포유동물 세포주이다. 특정 실시양태에서, 반응 요소 조절 프로모터는 cAMP 반응 요소 뉴클레오티드 서열, NFAT 전사 인자 반응 요소 뉴클레오티드 서열, FOS 프로모터 뉴클레오티드 서열, 또는 혈청 반응 요소 뉴클레오티드 서열이다. 특정 실시양태에서, 반응 요소 조절 프로모터는 NFAT 반응 요소 조절 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 세포주는 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 리포터 핵산을 포함하고, 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 리포터를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 5'에 위치하고, 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 합성 전사 인자에 의해 결합될 수 있다.

특정 실시양태에서, 세포주는 높은 기초 리포터 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, 높은 기초 리포터 활성은 배경보다 적어도 약 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 더 크고, 여기서 배경은 리포터를 포함하지 않는 세포 또는 세포주에 대하여 관찰된 리포터 활성 수준이다. 상기와 같은 비교를 위해, 일반적으로, 비교군으로서 사용되는 세포 또는 세포주는 리포터를 포함하는 세포주에 대한 모체가 될 것이다(예컨대, 리포터를 포함하는 HEK293 대 리포터를 포함하지 않는 HEK293).

특정 실시양태에서, 세포주는 높은 기초 리포터 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, 높은 기초 리포터 활성은 배경보다 적어도 약 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 32x, 50x, 75x, 100x, 200x, 500x, 750x, 1,000x, 2,000x, 5,000x 10,000x, 또는 20,000x 더 크고, 여기서 배경은 리포터를 포함하지 않는 세포 또는 세포주에 대해 관찰되는 리포터 활성 수준이다. 특정 실시양태에서, 세포주는 높은 기초 리포터 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, 높은 기초 리포터 활성은 배경보다 적어도 약 30x 더 크고, 여기서 배경은 리포터를 포함하지 않는 세포 또는 세포주에 대해 관찰되는 리포터 활성 수준이다. 특정 실시양태에서, 높은 기초 리포터 활성은 배경보다 적어도 약 32x 더 크고, 여기서 배경은 리포터를 포함하지 않는 세포 또는 세포주에 대해 관찰되는 리포터 활성 수준이다. 상기와 같은 비교를 위해, 일반적으로, 비교군으로서 사용되는 세포 또는 세포주는 리포터를 포함하는 세포주에 대한 모체가 될 것이다(예컨대, 리포터를 포함하는 HEK293 대 리포터를 포함하지 않는 HEK293).

특정 실시양태에서, 세포주는 기초 리포터 활성에서 낮은 변동을 포함한다. 특정 실시양태에서, 기초 리포터 활성에서 낮은 변동은 약 0.6 미만의 생물학적 변동 계수이다. 특정 실시양태에서, 기초 리포터 활성에서 낮은 변동은 약 0.5 미만의 생물학적 변동 계수이다. 특정 실시양태에서, 기초 리포터 활성에서 낮은 변동은 약 0.4 미만의 생물학적 변동 계수이다. 특정 실시양태에서, 기초 리포터 활성에서 낮은 변동은 약 0.3 미만의 생물학적 변동 계수이다. 특정 실시양태에서, 기초 리포터 활성에서 낮은 변동은 약 0.2 미만의 생물학적 변동 계수이다. 특정 실시양태에서, 기초 리포터 활성에서 낮은 변동은 약 0.1 미만의 생물학적 변동 계수이다.

이론에 얽매이지 않으면서, 변동 감소 및 높은 수준의 기초 활성은, 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 합성 전사 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 인자 핵산을 포함하는 적어도 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 카피를 포함하는 클론 세포주로서, 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 합성 전사 인자를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 5'에 위치하는 것인 세포주를 선택함으로써 획득할 수 있다. 특정 실시양태에서, 반응 요소 조절 프로모터는 cAMP 반응 요소 뉴클레오티드 서열, NFAT 전사 인자 반응 요소 뉴클레오티드 서열, FOS 프로모터 뉴클레오티드 서열, 또는 혈청 반응 요소 뉴클레오티드 서열이다. 특정 실시양태에서, 반응 요소 조절 프로모터는 NFAT 반응 요소 조절 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 세포주는 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 리포터 핵산의 단 1개의 카피를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포주는 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 리포터 핵산의 단 2개의 카피를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포주는 비통합 또는 에피솜 상태로 유지되는 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 리포터 핵산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포주는 세포 신호전달 단백질의 cDNA 또는 다르게는, 인트론이 없는 버전을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 신호전달 단백질은 GPCR 또는 GPCR 서브유닛이다.

특정 실시양태에서, 세포는 G 단백질 커플링된 수용체 패밀리 구성원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 7-(통과)-막관통 도메인 수용체로도 공지된, G 단백질-커플링된 수용체(GPCR: G protein-coupled receptor)는 리간드 결합 세포 표면 신호전달 단백질이다. 리간드가 GPCR에 결합하면, GPCR에서 구조적 변화를 일으키고, 이로써, 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF: guanine nucleotide exchange factor)로 작용할 수 있게 된다. 이어서, GPCR은 GTP에 대한 G 단백질에 결합된 GDP를 교환함으로써 회합된 G 단백질을 활성화시킬 수 있다. 이어서, 결합된 GTP와 함께 G 단백질의 α 서브유닛은 β 및 γ 서브유닛으로부터 해리되어 직접적으로 α 서브유닛 유형(Gα, Gαi/o, Gαq/11, Gα12/13)에 의존하여 세포내 신호전달 단백질 또는 표적 기능성 단백질에 추가로 영향을 미칠 수 있다. 인간 게놈에 코딩된 적어도 약 800개의 GPCR이 있고, 이는 클래스 A, B, 및 C로 크게 나뉘며, 본원의 시스템에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, G 단백질 커플링된 수용체 패밀리 구성원을 코딩하는 핵산은 게놈 내로 통합될 수 있다. 특정 실시양태에서, G 단백질 커플링된 수용체 패밀리 구성원을 코딩하는 핵산은 에피솜에 의해 유지될 수 있다.

특정 실시양태에서, 세포는 수용체 티로신 키나제 패밀리 구성원을 코딩하는 핵산을 포함한다. 수용체 티로신 키나제(RTK: receptor tyrosine kinase)는 많은 폴리펩티드 성장 인자, 사이토카인 및 호르몬에 대한 고친화성 세포 표면 수용체이다. 수용체 티로신 키나제는 정상적인 세포 프로세스의 중요한 조절인자일 뿐만 아니라, 많은 유형의 암의 발생 및 진행에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 본원에 기술된 시스템에서 사용할 수 있는 RTK의 부류 및 임의의 구성원은 다수 존재한다. 특정 실시양태에서, RTK는 RTK 클래스 I(EGF 수용체 패밀리)(ErbB 패밀리); RTK 클래스 II(인슐린 수용체 패밀리); RTK 클래스 III(PDGF 수용체 패밀리); RTK 클래스 IV(VEGF 수용체 패밀리); RTK 클래스 V(FGF 수용체 패밀리); RTK 클래스 VI(CCK 수용체 패밀리); RTK 클래스 VII(NGF 수용체 패밀리); RTK 클래스 VIII(HGF 수용체 패밀리); RTK 클래스 IX(Eph 수용체 패밀리); RTK 클래스 X(AXL 수용체 패밀리); RTK 클래스 XI(TIE 수용체 패밀리); RTK 클래스 XII(RYK 수용체 패밀리); RTK 클래스 XIII(DDR 수용체 패밀리); RTK 클래스 XIV(RET 수용체 패밀리); RTK 클래스 XV(ROS 수용체 패밀리); RTK 클래스 XVI(LTK 수용체 패밀리); RTK 클래스 XVII(ROR 수용체 패밀리); RTK 클래스 XVIII(MuSK 수용체 패밀리); RTK 클래스 XIX(LMR 수용체); 또는 RTK 클래스 XX(미결정) 구성원을 포함한다. 특정 실시양태에서, RTK 패밀리 구성원을 코딩하는 핵산은 게놈 내로 통합될 수 있다. 특정 실시양태에서, RTK 패밀리 구성원을 코딩하는 핵산은 에피솜에 의해 유지될 수 있다.

본원에서는 또한 NFAT 반응 요소를 포함하는 포유동물 세포주를 기술한다. 특정 실시양태에서, NFAT 반응 요소를 포함하는 포유동물 세포주는 cb29를 포함한다.

본원에서는 또한 NFAT 반응 요소를 포함하는 포유동물 세포주를 기술한다. 특정 실시양태에서, NFAT 반응 요소를 포함하는 포유동물 세포주는 cb37을 포함한다.

시스템을 사용하는 방법

본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 세포 내로 형질감염시킬 때 사용될 수 있다. 형질감염은 제한 없이, 리포펙틴, 인산칼슘 침전, 바이러스 형질도입 또는 전기천공을 비롯한, 다양한 형질감염 작용제에 의해 달성될 수 있다. 형질감염은 일시적 또는 안정적인 형질감염일 수 있다. 형질감염이 안정적인 형질감염인 실시양태에서, 안정적으로 형질감염된 세포는 추후 사용을 위해 냉동되거나, 또는 보관될 수 있다.

특정 실시양태에서, 단일 핵산 릴레이 시스템은 세포 집단 내로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 100개, 또는 그 초과의 핵산 릴레이 시스템은 세포 집단 내로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 2개의 핵산 릴레이 시스템이 세포 집단 내로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 3개의 핵산 릴레이 시스템이 세포 집단 내로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 4개의 핵산 릴레이 시스템이 세포 집단 내로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 5개의 핵산 릴레이 시스템이 세포 집단 내로 형질감염된다. 세포 집단이 복수의 핵산 릴레이 시스템으로 형질감염되는 특정 실시양태에서, 상기 복수의 핵산 릴레이 시스템은 상이한 반응 요소 조절 프로모터를 포함한다. 상기 복수의 핵산 릴레이 시스템이 상이한 반응 요소 조절 프로모터를 포함하는 특정 실시양태에서, 상기 복수의 핵산 릴레이 시스템은 상이한 리포터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 상이한 리포터는 UMI를 포함한다.

본 발명의 핵산으로 형질감염된 세포 집단은 임의의 크기일 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 집단은 1,000, 10,000, 100,000, 1,000,000, 10,000,000개 또는 그 초과의 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 1,000개 또는 그 초과의 세포가 하나 이상의 전사 릴레이 시스템으로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 10,000개 또는 그 초과의 세포가 하나 이상의 전사 릴레이 시스템으로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 100,000개 또는 그 초과의 세포가 하나 이상의 전사 릴레이 시스템으로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 1,000,000개 또는 그 초과의 세포가 하나 이상의 전사 릴레이 시스템으로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 10,000,000개 또는 그 초과의 세포가 하나 이상의 전사 릴레이 시스템으로 형질감염된다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 시스템은 다중웰 플레이트 실험에서 이용될 수 있다. 본 발명의 핵산 릴레이 시스템과 양립할 수 있는 다중웰 플레이트의 비제한적인 예로는 6, 12, 24, 48, 96, 384, 또는 1,536 웰 플레이트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 다중웰 플레이트의 각 웰은 단일 전사 릴레이 시스템으로 형질감염된 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다중웰 플레이트의 각 웰은 복수의 전사 릴레이 시스템으로 형질감염된 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 각 웰은, 각 세포 집단이 단일 핵산 릴레이 시스템으로 형질감염된 것인, 다중 세포 집단을 포함한다. 특정 실시양태에서, 각 웰은, 각 세포 집단이 복수의 핵산 릴레이 시스템으로 형질감염된 것인, 다중 세포 집단을 포함한다.

특정 실시양태에서, 시험 작용제는 본 발명의 전사 릴레이 시스템으로 형질감염된 세포에 적용된다. 특정 실시양태에서, 리포터 분자의 전사 활성화 수준은 상기 세포가 상기 시험 작용제에 의해 접촉된 후에 측정된다. 특정 실시양태에서, 상기 시험 작용제는 화학물질, 소분자, 생물학적 분자, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 압타머, 또는 그의 임의 조합이다. 특정 실시양태에서, 단일 시험 작용제가 세포 집단에 적용된다. 특정 실시양태에서, 복수의 시험 작용제가 세포 집단에 적용된다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 전사 릴레이 시스템은 시험 작용제에 대한 GPCR의 반응을 측정하도록 적합화된다. 본 발명의 핵산 시스템은 임의의 GPCR 수용체와의 사용을 위해 적합화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 전사 릴레이 시스템은 cAMP 반응 요소 조절 프로모터를 이용함으로써 GPCR 수용체와의 사용을 위해 적합화된다. GPCR의 비제한적인 예로는 5-하이드록시트립타민 수용체, 아세틸콜린 수용체, 아데노신 수용체, 아드레날린 수용체, 안지오텐신 수용체, 아펠린 수용체, 담즙산 수용체, 봄베신 수용체, 브래디키닌 수용체, 칸나비노이드 수용체, 케메린 수용체, 케모카인 수용체, 콜레시스토키닌 수용체, 도파민 수용체, 엔도텔린 수용체, 포르밀펩티드 수용체, 유리 지방산 수용체, 갈라닌 수용체, 그렐린 수용체, 당단백질 호르몬 수용체, 성선자극호르몬 방출 호르몬 수용체, GPR18, GPR55, GPR119,

G 단백질-커플링된 에스트로겐 수용체, 히스타민 수용체, 하이드록시카복실산 수용체, 키스펩틴 수용체, 류코트리엔 수용체, LPA 수용체, S1P 수용체, 멜라닌 농축 호르몬 수용체, 멜라노코르틴 수용체, 멜라토닌 수용체, 모틸린 수용체, 뉴로메딘 U 수용체, 뉴로펩티드 FF/뉴로펩티드 AF 수용체, 뉴로펩티드 S 수용체, 뉴로펩티드 W/뉴로펩티드 B 수용체, 뉴로펩티드 Y 수용체, 뉴로텐신 수용체, 오피오이드 수용체, 옵신 수용체, 오렉신 수용체, 옥소글루타레이트 수용체, P2Y 수용체, 혈소판 활성화 인자 수용체, 프로키네티신 수용체, 프로락틴 방출 펩티드 수용체, 프로스타노이드 수용체, 프로테이나제 활성화 수용체, QRFP 수용체, 릴랙신 패밀리 펩티드 수용체, 소마토스타틴 수용체, 숙시네이트 수용체, 타키키닌 수용체,티로트로핀 방출 호르몬 수용체, 미량 아민 수용체, 유로텐신 수용체, 바소프레신 및 옥시토신 수용체, 칼시토닌 수용체, 코르티코트로핀 방출 인자 수용체, 글루카곤 수용체 패밀리, 부갑상선 호르몬 수용체, VIP 및 PACAP 수용체, 칼슘 감지 수용체, GABA_B 수용체, 대사성 글루타메이트 수용체, 미각 1 수용체, 프리즐드 클래스 수용체, 접착 클래스 GPCR, 고아 수용체, 및 그의 임의 조합을 포함한다.

본 발명의 핵산은 당업계에서 통상적인 다수의 벡터와 양립할 수 있다. 벡터의 비제한적인 예로는 게놈 통합 벡터, 에피솜 벡터, 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 및 효모 인공 염색체를 포함한다. 본 발명의 핵산과 양립할 수 있는 바이러스 벡터의 비제한적인 예로는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스로부터 유래된 벡터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 게놈에서 정의된 위치 또는 제한된 부위 세트로 부위 특이적 통합을 지시하는 서열을 포함하는 벡터 상에 존재한다(예컨대, AttP-AttB 재조합).

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 전사 릴레이 시스템은 단일 벡터 내로 포함된다. 특정 실시양태에서, 상기 단일 벡터는 일시적으로 세포 내로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 상기 단일 벡터는 세포 내로 안정적으로 형질감염된다.

특정 실시양태에서, 상기 전사 릴레이 시스템은 2개의 벡터에 걸쳐 나뉘어진다. 특정 실시양태에서, 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 합성 전사 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 인자 핵산은 제1 벡터 내로 도입되고, 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열열을 포함하는 리포터 핵산은 제2 벡터 내로 도입된다. 특정 실시양태에서, 상기 제1 벡터 및 상기 제2 벡터는 일시적으로 세포 내로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 상기 제1 벡터 및 상기 제2 벡터는 세포 내로 안정적으로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 상기 제1 벡터는 세포 내로 안정적으로 형질감염되고, 상기 제2 벡터는 일시적으로 세포 내로 형질감염된다. 특정 실시양태에서, 상기 제1 벡터는 일시적으로 세포 내로 형질감염되고, 상기 제2 벡터는 세포 내로 안정적으로 형질감염된다.

본원에 기술된 전사 릴레이 시스템 또는 그의 일부를 포함하는 벡터를 포함하는 벡터는 널리 공지된 다수의 분자 생물학 기술을 이용하여 구성될 수 있다. 증폭, 클로닝, 돌연변이유발, 형질전환 등을 비롯한 상기와 같은 다수의 방법에 대한 상세한 프로토콜은 예컨대, 문헌 [Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (supplemented through 2012) John Wiley & Sons, New York 10 ("Ausubel")]; [Sambrook et al. Molecular Cloning - A Laboratory Manual (4th Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2012 ("Sambrook")]; 및 [Abelson et al. Guide to Molecular Cloning Techniques (Methods in Enzymology) volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA ("Abelson")]에 기술되어 있다.

실시예

하기 예시적인 실시예는 본원에 기술된 조성물 및 방법의 실시양태를 나타내고, 어떤 방식으로든 제한되지 않는다.

실시예 1 - CRE 활성화를 위한 예시적인 GPCR 수용체 스크린

본 실시예에서, 도 1a 및 1b에 구성된 바와 같은 핵산을 포함하는 전사 릴레이 시스템을 사용하여 GPCR 신호전달을 유도하는 잠재적 화합물을 스크리닝한다. 본 실시예의 경우, 도 1a의 핵산은 (Gal4 DNA 결합 도메인 및 키메라 활성화 도메인 VP64-p65-Rta를 포함하는) 합성 전사 인자 Gal4-VPR의 발현을 초래하는 cAMP 반응 요소(CRE) 활성화를 포함한다. 도 1b의 핵산은 Gal4-VPR 합성 전사 인자에 의해 결합되고, 활성화될 수 있는 프로모터를 포함하며, 이는 루시페라제 유전자 및 UMI를 코딩하는 유전자를 포함하는 리포터 요소의 발현을 초래한다. 사용되는 세포는 도 1a 및 1b의 시스템을 코딩하는 안정하게 통합된 핵산(들), 및 주어진 GPCR을 포함한다. 각 UMI는 주어진 GPCR과 연관되어 있으며, CRE 발현이 특정 GPCR로 매핑될 수 있도록 한다. 이를 통해 검정법은 다중화될 수 있다.

1일째, 세포를 DMEM 중 35,000개의 세포/웰로 96 웰 검정 플레이트에 플레이팅한다. 2일째, 배지를 0.5% FBS + DMEM으로 교체한다. 3일째, 배지를 제거하고, 25 ㎕의 Opti-mem 중 원하는 농도로 시험 화합물을 첨가한다. 약 4시간 후, 배지를 제거하고, RNA 추출을 위해 용해 완충제로 대체한다. 표준 방법 또는 키트를 이용하여 RNA를 추출한 후, 이어서, 표준 검정법에 의해 정량화한다. 이어서, 시퀀싱 라이브러리 제조 후 일루미나 MiSeq(Illumina MiSeq)에서 RNAseq를 수행한다.

실시예 2 - NFAT 활성화를 위한 예시적인 GPCR 수용체 스크린

본 실시예에서, 도 1a 및 1b에 구성된 바와 같은 핵산을 포함하는 전사 릴레이 시스템을 사용하여 GPCR 신호전달을 유도하는 잠재적 화합물을 스크리닝한다. 본 실시예의 경우, 도 1a의 핵산은 (Gal4 DNA 결합 도메인 및 키메라 활성화 도메인 VP64-p65-Rta를 포함하는) 합성 전사 인자 Gal4-VPR의 발현을 초래하는 활성화된 T 세포의 핵 인자 반응 요소(NFAT) 활성화를 포함한다. 도 1b의 핵산은 Gal4-VPR 합성 전사 인자에 의해 결합되고, 활성화될 수 있는 프로모터를 포함하며, 이는 루시페라제 유전자 및 UMI를 코딩하는 유전자를 포함하는 리포터 요소의 발현을 초래한다. 사용되는 세포는 도 1a 및 1b의 시스템을 코딩하는 안정하게 통합된 핵산(들), 및 주어진 GPCR을 포함한다. 각 UMI는 주어진 GPCR과 연관되어 있으며, CRE 발현이 특정 GPCR로 매핑될 수 있도록 한다. 이를 통해 검정법은 다중화될 수 있다.

1일째, 세포를 DMEM 중 35,000개의 세포/웰로 96 웰 검정 플레이트에 플레이팅한다. 2일째, 배지를 0.5% FBS + DMEM으로 교체한다. 3일째, 배지를 제거하고, 25 ㎕의 Opti-mem 중 원하는 농도로 시험 화합물을 첨가한다. 약 4시간 후, 배지를 제거하고, RNA 추출을 위해 용해 완충제로 대체한다. 표준 방법 또는 키트를 이용하여 RNA를 추출한 후, 이어서, 표준 검정법에 의해 정량화한다. 이어서, 시퀀싱 라이브러리 제조 후 일루미나 MiSeq에서 RNAseq를 수행한다.

실시예 3 - 다중 GPCR의 CRE 활성화를 위한 예시적인 GPCR 수용체 스크린

본 실시예에서, 각각 도 1a 및 1b에 구성된 바와 같은 핵산을 포함하는 100개 이상의 전사 릴레이 시스템을 사용하여 GPCR 신호전달을 유도하는 잠재적 화합물을 스크리닝한다. 본 실시예의 경우, 도 1a의 각 핵산은 (Gal4 DNA 결합 도메인 및 키메라 활성화 도메인 VP64-p65-Rta를 포함하는) 합성 전사 인자 Gal4-VPR의 발현을 초래하는 cAMP 반응 요소(CRE) 활성화를 포함한다. 도 1b의 각 핵산은 Gal4-VPR 합성 전사 인자에 의해 결합되고, 활성화될 수 있는 프로모터를 포함하며, 이는 루시페라제 유전자 및 UMI를 코딩하는 유전자를 포함하는 리포터 요소의 발현을 초래한다. 사용되는 세포 집단은 각각 도 1a 및 1b의 시스템을 코딩하는 안정하게 통합된 핵산(들), 및 주어진 단일 GPCR을 포함한다. 각 세포 집단이 단일의 고유한 GPCR을 코딩하는 것인 복수의 100개 이상의 세포 집단을 함께 혼합하여 혼합된 세포 집단을 형성한다. 각 UMI는 주어진 GPCR과 연관되어 있으며, CRE 발현이 특정 GPCR로 매핑될 수 있도록 한다. 이를 통해 검정법은 다중화될 수 있다.

1일째, 상기 혼합된 세포 집단을 DMEM 중 35,000개의 세포/웰로 96 웰 검정 플레이트에 플레이팅한다. 2일째, 배지를 0.5% FBS + DMEM으로 교체한다. 3일째, 배지를 제거하고, 25 ㎕의 Opti-mem 중 원하는 농도로 시험 화합물을 첨가한다. 약 4시간 후, 배지를 제거하고, RNA 추출을 위해 용해 완충제로 대체한다. 표준 방법 또는 키트를 이용하여 RNA를 추출한 후, 이어서, 표준 검정법에 의해 정량화한다. 이어서, 시퀀싱 라이브러리 제조 후 일루미나 MiSeq에서 RNAseq를 수행한다.

실시예 4 - 전사 릴레이를 사용한 리포터 산출량 증폭

본 실시예에서의 실험은 전사 릴레이를 사용하지 않는 시스템과 비용하여 전사 릴레이 시스템을 사용할 때의 루시페라제 신호 증가, 및 루시페라제 신호의 변동 계수의 감소를 보여준다. 단일 통합된 CRE-루시페라제를 보유하는 HEK293 유래 세포, 또는 반무작위적으로 통합된 CRE-Gal4-VPR의 다중 카피와 함께 단일 통합된 UAS-루시페라제를 보유하는 HEK293 유래 세포를 100 ㎕ DMEM + 10% FBS 중 흰색 벽이 있는 폴리-L-리신 코팅된 96 웰 플레이트에 30,000개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 45 ng 독시사이클린을 포함하는 50 ㎕ Opti-mem을 세포 위에 첨가하였다. 24시간 경과 후, DMSO를 첨가하였다. 세포를 명시된 기간 동안 DMSO로 처리하였다. 명시된 인큐베이션 시간 경과 후, 배지를 흡인하고, 35 ㎕ DMEM으로 대체하고, 제조사의 설명서에 따라 브라이트-글로 루시페라제 어세이(Bright-Glo Luciferase Assay) 키트 [Promega]를 사용하여 세포를 검정하였다. 단일 통합된 CRE-루시페라제를 보유하는 세포(회색) 및 반무작위적으로 통합된 CRE-Gal4-VPR의 다중 카피와 함께 단일 통합된 UAS-루시페라제를 보유하는 세포(검정색)의 결과로 발현된 루시페라제 활성은 도 2에 제시되어 있다. 실험을 기술상 삼중으로 수행하였고, 각 샘플에 대한 변동 계수는 도 3에서 컴퓨팅되었다.

실시예 5 - Gal4 - VPR 상에서 데그론 태그를 사용한

전사 릴레이의 유도 배수 증강

본 실시예에서의 실험은 전사 릴레이 시스템 중 Gal4-VPR 상에 데그론 태그를 포함하였을 때의 루시페라제 신호의 유도 배수 증가를 보여준다. 단일 통합된 TRE-CHRM3::UAS-루시페라제 이중 유전자 카세트 및 다양하게 반무작위적으로 통합된 FOS-Gal4-VPR-CP(데그론 포함) 또는 FOS-Gal4-VPR(데그론 불포함)을 보유하는 HEK293 유래 세포를 100 ㎕ DMEM + 10% FBS 중 흰색 벽이 있는 폴리-L-리신 코팅된 96 웰 플레이트에 30,000개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 45 ng 독시사이클린을 포함하는 50 ㎕ Opti-mem을 세포 위에 첨가하였다. 24시간 경과 후, 세포를 8시간 동안 DMSO로 또는 1 μM 카르바콜로 처리하였다. 명시된 인큐베이션 시간 경과 후, 배지를 흡인하고, 35 ㎕ DMEM으로 대체하고, 제조사의 설명서에 따라 브라이트-글로 루시페라제 어세이 키트 [Promega]를 사용하여 세포를 검정하였다. 그 결과로, DMSO에서의 루시페라제 활성 대비 카르바콜에서의 루시페라제 활성의 비가 도 4에 플롯팅되어 있다.

실시예 6 - NFAT 반응 요소를 포함하는 세포주

본 실시예에 기술된 세포주는 NFAT-반응 요소 전사 릴레이(합성 전사 인자의 전사를 구동시키는 NFAT 프로모터)의 통합된 카피를 갖는다. 카피수 및 통합 부위와 관련하여 유전적 이종성 풀로서 이들 세포주를 생성하였다. 상기 풀로부터, 단일 세포 클론을 단리시키고, 확장시켰다. 이들 세포주를 추가로 사용하여 GPCR 및 UAS-루시페라제-바코드 리포터를 통합시켜 다중으로 NFAT 신호전달을 검출할 수 있는 그의 능력에 대해 시험하였다. 상기 10개의 세포 라이브러리로부터 대조군 효능제 대비 최고 개수의 별개의 GPCR 히트를 검출할 수 있는 2개: 도 5에 제시된 바와 같은, (클론 c713으로부터 구성된) cb29 및 (클론 c708로부터 구성된) cb37이 확인되었다.

중요하게는, 이들 2개의 세포 라이브러리를 발생시킨 이소클론 세포주가 2개의 공통 특성을 공유하는 것으로 밝혀졌다. 첫째, 이들 세포주는 비자극 상태하에서 가장 많은 양의 리포터 발현을 나타냈다(도 6, "기초 활성 - 역 형질감염" 참조). 둘째, 및 가능하게는 의존적인 방식으로, 2개의 상응하는 세포 라이브러리는 최저 수준의 변동을 나타내었다(도 6, "BCV" 참조).

본원에 본 발명의 바람직한 실시양태가 제시되고 기술되었지만, 그러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에 명백할 것이다. 이제, 당업자는 본 발명을 벗어나지 않으면서 다수의 변형, 변화, 및 치환을 착안할 수 있을 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 등록된 특허, 및 다른 문서는 각각의 개별적인 간행물, 특허 출원, 등록된 특허, 또는 다른 문서가 그 전문이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 같이 본원에서 참조로 포함된다. 참조로 포함된 텍스트에 포함된 정의는 그들이 본 개시내용에서의 정의를 반박한다면 배제된다.

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Met His Ile Ser Thr Gly Leu Ser Ile Phe Asp Thr Ser 675 680 685 Leu Phe 690 <210> 11 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 11 Arg Ala Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 1 5 10 15 Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu 20 25 30 Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe 35 40 45 Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp 50 55 60 Met Leu Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 65 70 75 <210> 12 <211> 265 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 12 Gln Tyr Leu Pro Asp Thr Asp Asp Arg His Arg Ile Glu Glu Lys Arg 1 5 10 15 Lys Arg Thr Tyr Glu Thr Phe Lys Ser Ile Met Lys Lys Ser Pro Phe 20 25 30 Ser Gly Pro Thr Asp Pro Arg Pro Pro Pro Arg Arg Ile Ala Val Pro 35 40 45 Ser Arg Ser Ser Ala Ser Val Pro Lys Pro Ala Pro 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Claims

전사 릴레이 시스템으로서,
a) 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 합성 전사 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 인자 핵산으로서, 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 합성 전사 인자를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 5'에 위치하는 것인 전사 인자 핵산; 및
b) 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 리포터 핵산으로서, 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 리포터를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 5'에 위치하고, 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 합성 전사 인자에 의해 결합될 수 있는 것인 리포터 핵산
을 포함하는 전사 릴레이 시스템.
제1항에 있어서, 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열은 cAMP 반응 요소 뉴클레오티드 서열, NFAT 전사 인자 반응 요소 뉴클레오티드 서열, FOS 프로모터 뉴클레오티드 서열, 또는 혈청 반응 요소 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 합성 전사 인자는 제1 전사 인자로부터의 DNA 결합 도메인 및 제2 전사 인자로부터의 전사 활성화 도메인을 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제3항에 있어서, 상기 DNA 결합 도메인은 Gal4, PPR1, Lac9, 또는 LexA로부터의 것인 전사 릴레이 시스템.
제4항에 있어서, 상기 DNA 결합 도메인은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제4항에 있어서, 상기 DNA 결합 도메인은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제4항에 있어서, 상기 DNA 결합 도메인은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제5항에 있어서, 상기 DNA 결합 도메인은 서열 번호 1의 아미노산 서열 변이체를 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제3항에 있어서, 상기 전사 활성화 도메인은 VP64, p65, 및 Rta를 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제9항에 있어서, 상기 전사 활성화 도메인은 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제9항에 있어서, 상기 전사 활성화 도메인은 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제9항에 있어서, 상기 전사 활성화 도메인은 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제10항에 있어서, 상기 전사 활성화 도메인은 서열 번호 14의 아미노산 서열 변이체를 포함하고, 상기 서열 변이체는 전사 활성화를 증가 또는 감소시키는 것인 전사 릴레이 시스템.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 전사 인자는 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 전사 인자는 상기 합성 전사 인자를 불안정화시키는 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제17항에 있어서, 상기 합성 전사 인자를 불안정화시키는 상기 폴리펩티드 서열은 PEST 또는 CL1 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 전사 인자 프로모터 뉴클레오티드 서열은 Gal4, PPR1, Lac9, 또는 LexA에 의해 결합될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터는 형광 단백질, 루시페라제 단백질, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 분비된 태반 알칼리성 포스파타제, 또는 고유한 분자 식별자를 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제20항에 있어서, 상기 리포터는 형광 단백질, 루시페라제 단백질, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 또는 분비된 태반 알칼리성 포스파타제, 및 고유한 분자 식별자를 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 고유한 분자 식별자는 시험 폴리펩티드에 고유한 것이고, 상기 시험 폴리펩티드는 상기 리포터 핵산에 의해 코딩되는 것인 전사 릴레이 시스템.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 인자 핵산은, 상기 전사 억제인자에 의해 결합될 수 있는 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열에 근접한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제23항에 있어서, 상기 전사 인자 핵산은, 상기 합성 전사 인자를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 mRNA의 5' 비번역 영역을 연장하는 상기 반응 요소 조절 프로모터 뉴클레오티드 서열에 근접한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제24항에 있어서, 상기 합성 전사 인자를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 mRNA의 상기 5' 비번역 영역은, 상기 합성 전사 인자의 번역을 감소시키는 하나 이상의 서열을 포함하는 것인 전사 릴레이 시스템.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 인자 핵산 및 상기 리포터 핵산은 단일 핵산의 성분인 전사 릴레이 시스템.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 상기 릴레이 시스템을 포함하는 세포.
제27항에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포를 포함하는 것인 세포.
제27항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포를 포함하는 것인 세포.
제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 인자 핵산, 리포터 핵산, 또는 전사 인자 핵산과 리포터 핵산 모두가 단일 카피로서 세포의 게놈 내로 통합되는 것인 세포.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 상기 릴레이 시스템을 포함하는 세포 집단.
제30항에 있어서, 상기 세포 집단은 진핵 세포 집단을 포함하는 것인 세포 집단.
제30항에 있어서, 상기 세포 집단은 포유동물 세포 집단을 포함하는 것인 세포 집단.
제32항 또는 제33항에 있어서, 전사 인자 핵산, 리포터 핵산, 또는 전사 인자 핵산과 리포터 핵산 모두가 단일 카피로서 세포 집단의 게놈 내로 통합되는 것인 세포 집단.
제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 세포 집단은 높은 기초 리포터 활성을 포함하는 것인 세포 또는 세포 집단.
제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 높은 기초 리포터 활성은 배경보다 적어도 약 30x 더 크고, 여기서 배경은 리포터를 포함하지 않는 모세포 또는 모세포주에 대해 관찰된 리포터 활성의 수준인 세포 또는 세포 집단.
제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 세포 집단은 리포터 활성에 대해 낮은 생물학적 변동 계수를 포함하는 것인 세포 또는 세포 집단.
제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 활성에 대한 낮은 생물학적 변동 계수는 약 0.5 미만인 세포 또는 세포 집단.
반응 요소 조절 프로모터의 활성에 대한 시험 작용제의 효과를 시험하는 방법으로서, 제27항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 세포 집단을 상기 시험 물질과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
제39항에 있어서, 상기 시험 작용제는 소분자 화학물질인 방법.