CN102643852B - 光可控的基因表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种光可控基因表达系统，包括：a)重组光敏转录因子编码基因，所述重组光敏转录因子包括作为DNA结合结构域的第一多肽、作为光敏结构域的第二多肽和作为转录调节结构域的第三多肽；b)靶转录单元，包括被所述第一多肽识别/结合的至少一个反应元件、被第三多肽调节的启动子和待转录核酸序列。本发明还提供包含这种光可控基因表达系统的真核表达载体，及用这种光可控基因表达系统在宿主细胞中调控基因表达的方法。本发明还提供装有所述光可控基因表达系统各组分的试剂盒。本发明的光可控基因表达系统诱导快速、高效且强，比其他诱导剂安全，毒性小或无毒性；它可以在时间和空间上控制基因的表达。

Description

光可控的基因表达系统

技术领域

本发明涉及生物技术中的遗传工程或合成生物学领域。具体的说，本发明涉及基因表达领域。更具体的说，本发明涉及新的基于光调控蛋白的可诱导基因表达系统和采用该表达系统调控宿主细胞中基因表达的方法。

背景技术

在遗传工程领域，准确控制基因的表达可为研究和控制发育及其他生理过程提供有价值的工具。基因表达是复杂的生物学过程，包括许多蛋白-蛋白之间的特异性相互作用。基因表达的第一步是DNA转录为RNA，须将转录因子递送到控制基因转录的启动子附近。转录因子，也称为序列特异性DNA结合蛋白，是一种能够特异性结合启动子DNA序列导致下游基因DNA序列转录成RNA的蛋白质。转录因子可以是单一蛋白质或蛋白质复合体，它与启动子的识别/结合能启动或阻止RNA聚合酶将DNA转录为RNA，可分为转录激活因子或转录阻遏因子。通常，转录因子至少含一个DNA结合结构域，并能募集协同因子(或称辅激活蛋白)共同作用而结合启动子区的正确位点从而启动基因转录。转录因子除含DNA结合结构域外一般还含转录激活结构域或转录阻遏结构域，转录激活结构域可相距DNA结合域适当距离。传统的转基因方法采用通用性或细胞类型特异性启动子启动转基因的转录表达。用含目的基因和相应启动子的DNA构建物(也称为靶转录元件)转染宿主细胞进入细胞质或整合到宿主细胞基因组中，当加入相应的转录因子与启动子结合后，即可引发目的基因在给定细胞类型中转录然后翻译表达为相应的蛋白质。

调节外源基因在细胞中转录表达的另一种方法是采用可诱导型启动子。这种可诱导型启动子具体包括两大类：(1)化学物质可诱导的启动子和基因表达系统，和(2)物理方法可诱导的启动子和基因表达系统。化学诱导物质包括小分子药物，其典型的例子是抗生素如四环素[Gossen，M.和H.Bujard等，Proc Natl Acad Sci U S A，1992.89(12)：5547-5551；Gossen，M.等.，Science，1995.268(5218)：1766-1769]和链霉素[Fussenegger，M.等.，NatBiotechnol，2000.18(11)：1203-1208.]；激素[Wang，Y.等.，Proc Natl Acad Sci U S A，1994.91(17)：8180-8184]及其类似物；金属离子(典型的例子是铜离子)[Mullick，A.等，BMCBiotechnol，2006.6：43.]及其他诱导物如乙醛[Weber，W.等.Nat Biotechnol，2004.22(11)：1440-1444.；Weber，W.，等，Metab Eng，2005.7(3)：174-181.]。物理方法可诱导的启动子和基因表达系统主要包括，紫外线(UV)调控的“囚笼(caged)”技术[Keyes，W.M.和A.A.Mills，Trends Biotechnol，2003.21(2)：53-55.]；远红外光控制热激效应介导的基因表达系统[Kamei，Y.等，Nat Methods，2009.6(1)：79-81.]。

以上方法中化学物质可诱导的启动子和基因表达系统虽已获得较广泛应用，但存在一些缺点，如：(1)一些诱导物具有多效性，会影响其它内源基因的表达，从而使结果分析复杂化。如重金属离子诱导的基因表达系统，重金属离子不仅能诱导目的基因表达，还会引起细胞内其它重金属离子诱导的基因的表达；(2)一些诱导物有潜在毒性从而影响其它基因的功能，例如重金属离子对细胞有毒性，因而不能用于动物或人体；(3)许多启动子体系在非诱导状态下启动表达的活性很高，不能彻底关闭被调节基因，加入诱导剂前后的基因表达量比值(本文中也称为诱导表达倍数)较低，如激素表达系统[Wang，Y.等.，Proc Natl Acad Sci U S A，1994.91(17)：8180-8184]，这类启动子体系不适合用于表达毒性基因以及低表达量即可引起显著生物学效应的基因；(4)有些化学物质所诱导的基因表达系统的转录因子由两种或两种以上蛋白质共同构成，例如基于FKBP-FRAP的基因表达系统[Rivera，V.M.等.，Nat Med，1996.2(9)：1028-1032.]，其转录因子由两种融合蛋白构成，导入细胞两种不同蛋白的基因构建物比导入一种蛋白基因构建物困难更大或导入效率差；(5)化学诱导物只能在时间上调节基因的表达，不能在空间上特异性调控某些细胞及组织的基因表达。

而如上所述，现有的大部分物理方法可诱导的基因表达系统对细胞的毒性高，如UV诱导的囚笼技术可能造成对细胞的不可逆性损伤；或远红外激光控制热激效应的诱导表达系统可能激活其他内源基因的表达，其设备操作复杂且昂贵[Kamei，Y.等，NatMethods，2009.6(1)：79-81.]。

然而，光是一种易于时间和空间操作的诱导物，一般对细胞无上述毒性，可采用的方法是把远源进化物种的光可调节蛋白(也称为光敏蛋白)引入高等真核细胞内，将它们改造成为光调节的转录因子，便于光照调控目的基因的表达。预期这些蛋白质不会干扰真核细胞的生理过程，在真核细胞中不会引起多重效应或非特异效果。目前这方面的报道很少。Shimizu-Sato等人报道了适用于酵母细胞的光控基因表达系统[Shimizu-Sato，S.等.，NatBiotechnol，2002.20(10)：1041-1044.]、美国专利US6858429叙述了通过基因工程技术将植物蛋白(植物色素phytochrome，简写为Phy)和植物色素相互作用因子(phytochromeinteracting factor，简写为PIF3)分别与双杂交系统的酵母菌Gal4蛋白的DNA结合结构域或Gal4的转录激活结构域(GAD)相连，构成Gal4-Phy和PIF3-GAD两种融合蛋白，当用红光照射时Gal4-Phy与PIF3-GAD两个融合蛋白分子相互作用而结合，其中Gal4的转录激活结构域(AD)被带到启动子附件从而启动下游基因转录；而用远红外光刺激可使相互作用的这两种融合蛋白解离，其中Gal4的AD不再结合于启动子从而终止下游基因的转录。虽然这个光诱导的启动子系统具有可逆性、诱导表达水平较高等优点，但其缺点是植物色素Phy需在其生色团藻青素(Phycocyanobilin)存在下才能与PIF3相互作用，而酵母细胞及哺乳动物细胞不含这种物质，必需外源加入宿主细胞中；而且此系统基于双杂交原理，转录因子由两种完整融合蛋白共同构成，操作复杂。而且其基因构建物较大导入细胞相对困难，限制了此系统的广泛应用。

目前已知的其它光敏蛋白还有：以黄素类物质为生色团的光敏蛋白(亦称为黄素蛋白家族蓝光受体)，分为三类：一是含光-氧-电压(light-oxygen-voltage，LOV)结构域的光受体蛋白，如光敏色素；二是类似光裂解酶的隐花色素(photolyase-like cryptochromes)；第三类是近些年来才发现的利用FAD的蓝光蛋白(blue light using FAD，BLUF)。光敏色素是含LOV结构域的光受体蛋白质最多的一类，研究较多的有向光素1(phototropin 1)、白领-1(WC-1)、白领-2(WC-2)、PYP(光敏黄色蛋白，photoactive yellow protein)、Phy3、VIVID等。光敏色素通常是膜偶联激酶蛋白，在蓝光照射下发生自磷酸化改变激酶活性而调控相关的生理过程。大多数光敏色素的C端为丝氨酸/苏氨酸激酶结构域N端为结合黄素分子的两个LOV结构域，蓝光照射时LOV结构域与黄素分子共价结合生成黄素-半胱酰胺加成产物引起黄素结合口袋空间构象变化，导致C端激酶结构域改变其激酶活性，但此过程完全可逆。此外，两个LOV结构域中，LOV2光敏性比LOV1更高。Masayuki Yazawa等利用拟南芥的FKF1(flavin-binding，kelch repeat，fbox 1)与GI(GIGANTEA)蛋白二者经蓝光激发后可发生相互作用的原理，将FKF1和GI分别与双杂交系统酵母菌Gal4的DNA结合结构域和单纯疱疹病毒颗粒蛋白16(VP16)的转录激活结构域(AD)相连，组成Gal4-FKF1和VP16-GI双转录因子[Yazawa，M.，等，NatBiotechnol，2009.27(10)：941-945.]。Gal4-FKF1因其中的Gal4含有DNA结合结构域可先结合启动子但单独不能启动转录，用蓝光刺激时VP16-GI即与Gal4-FKF1相互作用(具体是FKF1与GI相互作用)方才启动下游基因转录。这个系统的缺点是FKF1和GI蛋白基因构建物较大导入细胞较难和诱导目的蛋白表达提高的倍数较低，最高仅为5倍左右。来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的隐花色素是第一个被分离得到的植物蓝光光敏蛋白，研究比较多的有隐花色素1(Cryptochromes 1，CRY1)、隐花色素2(Cryptochromes 2，CRY2)、光敏色素A(phytochrome A，phyA)和光敏色素B(phytochrome B，phyB)等，主要功能是接受昼夜节律光调节高等植物的生长和运动。隐花色素的氨基酸序列和生色团组成与光裂解蛋白很相似，多数隐花色素的大小为70kD-80kD，包含相对保守的N端PHR(光裂酶相关)结构域和长度差异较大的C端未知结构域，其PHR结构域可非共价结合黄素。有研究利用拟南芥CRY2(隐花色素2)与CIB1(隐花色素2相互作用的螺旋环螺旋1)蛋白二者经蓝光激发后可发生相互作用，将CRY2和CIB1分别与双杂交系统的酵母菌Gal4的DNA结合结构域和Gal4的转录激活结构域(GAD)相连，组成Gal4-CRY2和CIB1-GAD双转录因子，用蓝光刺激时CIB1-GAD与已与Gal4反应元件结合的Gal4-CRY2相互作用(具体是CRY2与CIB1相互作用)在酵母细胞中可启动下游基因表达[Kennedy，M.J.，等.，Nat Methods，2010.7(12)：973-975]。该系统无需加入外源生色团，但此系统也是基于双杂交原理，转录因子由两种完整融合蛋白共同构成，操作复杂。而且在非诱导状态下目的基因也有一定的表达，因而应用有限。包含BLUF结构域的蓝光受体蛋白和包含LOV结构域的光受体蛋白与隐花色素不同的是，前者光照激活后不会与黄素生色团反应生成共价产物，而是导致生色团构象变化引起黄色吸收光发生10nm红移。包含BLUF结构域的光受体蛋白研究最多的是AppA，它是球状红杆菌(Rhodobactersphaeroides)的一种转录抗阻遏蛋白，黑暗时AppA与细胞中的一种PpsR转录因子结合形成AppA-PpsR2复合物，使PpsR不能结合DNA；强蓝光照射可使AppA从复复合物上解离而释放PpsR形成四聚体结合于特定DNA序列导致阻遏相关基因的转录。

如上所述，目前已有的广泛用于生命科学领域的基因表达系统大多数采用化学诱导剂调控，虽然其诱导效果较好，背景低、表达强度高，但缺点是许多系统具有多效性因而副作用广泛和有潜在的细胞毒性等。更为重要的是，化学诱导剂不能在空间上精确调控基因的表达；而物理方法调节基因表达的系统目前很少，虽能在空间上一定程度调控特定细胞或组织的基因表达，但细胞毒性强可能造成不可逆损伤或实际的操作困难。少数几种基于光敏蛋白的基因表达系统，由于诱导目的蛋白表达水平低、需要加入外源化学物质、转录因子由多种蛋白构成其基因构建物较大难以导入细胞等原因限制了其应用。本申请人认为可以通过新思路创造出一种新的，更优秀的光调控转录表达系统。这个系统可以克服前人研究的缺陷，并可被广泛用于生物医药科学与技术研究中。经过潜心研究，本申请人发明了一种新型的光可控基因表达系统，它由重组光敏转录因子及其对应的靶转录单元两部分组成，具有良好的基因表达调控能力，可以在时间和空间上共同调控基因的表达。

因此，本发明的第一个目的是提供一种新型的光可控基因表达系统。

本发明的第二个目的是提供用所述光可控基因表达系统调节宿主细胞中基因表达的方法。

本发明的第三个目的是提供含有所述光可控基因表达系统的真核表达载体。

本发明的第四个目的是提供装有所述光可控基因表达系统各组分的试剂盒。

发明概述

本发明涉及一种光可控基因表达系统，包括两个部分：a)重组光敏转录因子编码基因，所述重组光敏转录因子包括作为DNA结合结构域的第一多肽、作为光敏结构域的第二多肽和作为转录调节结构域的第三多肽；b)靶转录单元，包括识别/结合所述第一多肽的至少一个反应元件、与之连接的启动子和待转录核酸序列。

按照本发明的光可控基因表达系统，第一部分中重组光敏转录因子的第一多肽为DNA结合结构域，它能够特异性地识别反应元件，单独不能够结合到反应元件上或者是结合能力很弱，需要第二多肽来辅助其结合到反应元件。第一多肽可选自螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、锌指基序或锌簇DNA结合结构域、亮氨酸拉链DNA结合结构域、翼状螺旋DNA结合结构域、翼状螺旋-转角-螺旋、螺旋-环-螺旋DNA结合结构域、高迁移率族DNA结合结构域、B3 DNA结合结构域。第二多肽为光敏结构域，通常来自以黄素类为生色团的光敏蛋白；第三多肽为转录调节结构域，包括转录激活结构域和转录阻遏结构域。

第一多肽、第二多肽和第三多肽之间可以直接连接，也可操作性地通过接头肽连接。接头肽的氨基酸个数是可变的(如0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10个或更多)。

第一多肽、第二多肽可构成一种光可控的DNA结合蛋白融合蛋白(简称为光可控DNA结合蛋白)，可以用于体外研究重组光敏转录因子的DNA结合特点。本发明的光可控基因表达系统中，第二部分靶转录单元中的反应元件、启动子和待转录核酸序列之间也可直接连接，或操作性连接。

按照本发明的光可控基因表达系统，第一部分中的重组光敏转录因子还可进一步包含附加的多肽，如促进重组光敏转录因子融合蛋白向细胞核运输的第四多肽(即细胞核定位信号肽)。第四多肽与第一、第二、第三多肽可直接连接或通过接头肽连接。

本发明还涉及含有本发明的光可控基因表达系统的真核表达载体。所述表达载体可以是单独含有重组光敏转录因子编码基因的载体，也可以是单独含有靶转录单元的真核表达载体，所述靶转录单元中含有反应元件-启动子但待转录核酸序列空缺。或者，也可以是同时含有重组光敏转录因子编码基因和靶转录单元中的反应元件-启动子的真核表达载体。

本发明也涉及用本发明的光可控基因表达系统在宿主细胞中调控基因表达的方法，包括以下步骤：

a)将所述光可控基因表达系统构建在真核质粒表达载体中；

b)引入含被调控基因的宿主细胞；和

c)光照诱导所述宿主细胞，使所述宿主细胞中的被调控的核苷酸进行表达。

本发明的在宿主细胞中调控基因表达的方法，所涉及的光照方法，包括光源的选择和光源的控制。光源非限制地包括LED灯、白炽灯、荧光灯、激光；光照方法包括光照量、光照时间、光照强度及光照频率的选定。用扫描、投影、光模具等方法在空间上控制目的基因的表达也包含在本发明范围中。

本发明进一步涉及一种试剂盒，该试剂盒装有含本发明光可控基因表达系统的真核表达载体或/和转染了所述转录因子的真核表达载体的哺乳动物细胞，及相应的说明书。本发明的试剂盒还可装有含反应元件-启动子、但待转录核酸序列空缺的靶转录单元的真核表达载体。

发明详述

本发明提供一种基于光敏多肽的、光可控基因表达系统，用于在时间和空间上调节目的基因在真核生物宿主细胞中的表达。本发明的光可控基因表达系统涉及至少两个部分：第一部分是能够在宿主细胞中表达的重组光敏转录因子融合蛋白的编码核苷酸序列，该融合蛋白由三个或四个多肽组成，其中第一多肽是其DNA结合结构域，第二多肽为光敏结构域，第三多肽为转录调节结构域，第四多肽为核定位信号片段；第二部分是由反应元件-启动子-待转录核苷酸序列组成的靶转录单元核苷酸序列，其中的反应元件为上述重组光敏转录因子融合蛋白第一多肽所识别/结合的DNA核苷酸基序，启动子通常为最小启动子，也可以是其他完整的启动子。第一部分的三个或四个多肽优选采用有关蛋白的截短的功能活性片段(即结构域)。可通过基因工程技术将本发明的光可控基因表达系统的第一部分和第二部分构建在一个真核表达载体中或分别构建在二个真核表达载体中。针对特定的宿主细胞类型采用不同的常规方法将其导入宿主细胞，使之表达本发明的重组光敏转录因子融合蛋白，用适当波长的光照射可导致其第二光敏多肽二聚化能力改变，使重组光敏转录因子的二聚化能力发生变化，二聚化的转录因子可结合于本发明第二部分靶转录单元核苷酸序列中的反应元件，并通过该融合蛋白的第三多肽的转录激活/阻遏结构域和募集的宿主细胞本身的其它转录辅因子，一起协同作用于该靶转录单元中的启动子，从而调节(启动或阻遏)目的基因的转录和表达。本发明提供的这种光可控基因表达系统，可利用几乎不会损伤细胞或机体的光照射，在时间上和空间上调节目的蛋白基因在真核宿主细胞中的表达。

本发明的这种光可控基因表达系统，可利用不同的光源和光照条件在空间上调节目的蛋白基因在真核宿主细胞中的表达。所用的光廉价、易于获得、对细胞没有毒性。

本文所用术语的定义和解释

“光可控”，“光敏”和“光诱导”的蛋白在本文中含义相同，可互换使用，指对光照敏感的、可用相应波长的光以不同强度或不同频率照射，调节该蛋白的构象或构型从而影响其活性，包括激活、增强或阻遏其活性。

“宿主”指真核生物，包括单细胞真核生物如酵母菌，和多细胞真核生物，如植物和动物，尤其是哺乳动物，包括人。

“宿主细胞”指构成真核生物组织的细胞和已建立的真核生物细胞系，只要这些细胞或细胞系与待表达的目的蛋白质、所用的筛选体系或发酵培养体系相容。包括单细胞真核生物细胞，如培养的BY4741和AH109酿酒酵母菌细胞、裂殖酵母菌、P.pastoris酵母菌、乳酸克雷伯氏菌、H.polymorpha菌(其综述见Fleer等人Curr Opin Biotechnol，1992.3(5)：486-496和真菌细胞。已建立的可体外传代培养永生不死的哺乳动物细胞系，其非限制性的例子包括：人胚肾上皮细胞(HEK293)、非洲绿猴肾成纤维细胞COS-7、人宫颈癌细胞(Hela)、小鼠成纤维细胞(NIH 3T3)等。宿主细胞也包括正常细胞，如出于基因治疗目的离体转基因或同源重组的动物胚胎细胞，对基因治疗目的有特殊价值的细胞类型，包括造血干细胞、成骨细胞、肝细胞、白细胞、神经元细胞和皮肤上皮及气管上皮细胞；离体转基因或同源重组的动物胚胎干细胞和受精卵细胞。。宿主细胞还包括非哺乳动物的真核细胞，如昆虫(例如Sp.frugiperda)细胞，和植物细胞，如；转基因植物细胞。所谓转基因细胞包括转入了本发明重组光敏转录因子基因和/或含目的蛋白基因的靶转录单元的细胞，本发明的重组光敏转录因子通过可控的光照射能很好地调节目的基因在这些细胞中的表达。在昆虫细胞中的表达可采用杆状病毒表达载体(见例如O′Reilly等人(1992)《杆状病毒表达载体：实验手册》，Stockton出版社)，可用的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith，G.E.，M.D.Summers，和M.J.Fraser，Mol Cell Biol，1983.3(12)：2156-2165)和pVL系列((Luckow，V.A.和M.D.Summers，Virology，1989.170(1)：31-39)。

“目的蛋白”也可称为“感兴趣蛋白”指任何有用的蛋白，例如可用于预防或治疗目的或其他用途的、需要在真核宿主细胞中表达的有用真核生物蛋白质，包括天然的或人工修饰或突变的有用蛋白质，特别是必须经翻译后修饰(如糖基化、酰胺化等修饰)才有活性的蛋白质，它们在真核细胞中表达才能获得这种修饰。

“报告蛋白”为目的蛋白的一种，指其表达容易被检测的有用蛋白质。为便于检测本发明基于光敏多肽的、光可诱导的目的蛋白基因表达系统的效果，可以选择以下已知的广泛应用的报告蛋白：萤火虫荧光素酶(Fluc)、绿色荧光蛋白(GFP)，氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)等。但本发明的光可诱导目的蛋白基因表达系统不限于表达报告蛋白，而可用于表达任何有用的目的蛋白。

“基因”，蛋白质的“编码核苷酸序列”，“待转录核苷酸序列”在本文中含义相同可互换使用，指天然或重组的携带蛋白质氨基酸序列信息密码子的DNA序列，也指编码功能性RNA，如反义RNA的DNA序列。

“目的蛋白基因”、“目的蛋白的编码核苷酸序列”或简称为“目的基因”在本文中含义相同，可互换使用，指编码目的蛋白的基因，通常为脱氧核糖核酸DNA双链序列。这种基因可包含在宿主细胞的染色体DNA序列中或包含在人工构建的表达载体中，如本发明的靶转录单元序列中。同样，“报告基因”指编码报告蛋白的基因。

“转录”在本文中专指真核生物宿主细胞中通过RNA聚合酶将目的基因转录产生携带该基因信息RNA的过程。真核生物基因的转录比原核生物复杂得多，真核生物的三类RNA聚合酶I、II和III分别转录三类真核基因DNA，产生三类RNA(rRNA、mRNA、tRNA)及反义RNA。文中的转录因子调节的转录过程为RNA聚合酶II启动的转录，即DNA转录为mRNA。“转录调节”本文指真核基因转录的调节，包括启动或阻遏转录，增强或抑制转录，上调或下调转录。

“表达”、“目的蛋白基因表达”、“基因表达”在本文中含义相同可互换使用，指目的基因的DNA序列转录产生携带该基因信息的RNA(mRNA或反义RNA)和该RNA携带的信息在核糖体中被翻译产生目的蛋白二者，即转录产生信息RNA和翻译产生目的蛋白都叫做表达。本文包括这二种含义，主要指产生目的蛋白。

“转录因子”或“转录因子融合蛋白”在本文中含义相同可互换使用，指真核生物的转录因子，它不是一个蛋白质，而是多个相互作用的蛋白或多肽的统称，可以是天然的或人工改造的或人为融合的，包括能识别/结合靶转录单元核苷酸序列中的反应元件的多肽和能募集其它转录激活/阻遏辅因子的多肽，通过与靶转录单元中反应元件的结合和相互作用，与募集的其它转录激活或阻遏辅因子一起作用于待转录核酸序列上游的启动子，从而启动并调节目的蛋白基因的转录。转录因子视其组成的不同可分为“转录激活因子”或“转录阻遏因子”，二者统称“转录因子”。

“靶转录单元”指人造的由反应元件、启动子和待转录核酸序列组成的DNA序列(不是蛋白质)，其中反应元件通常位于启动子上游，有时也可位于启动子下游，待转录核酸序列位于反应元件和启动子的下游，三者可直接相连或操作性(即可隔开若干个核苷酸)相连。

“反应元件”指转录因子特异性识别/结合的一个或多个顺式DNA基序，不同的转录因子有与其相对应的不同的反应元件，转录因子包含能与这种DNA基序结合的结合结构域。当转录因子与其相对应的反应元件特异性结合后，转录因子的第三多肽募集的辅因子协同作用于启动子，激活或阻遏其下游目的基因转录产生相应的RNA。在本发明中，反应元件指能够与重组光敏转录因子的第一多肽特异性识别/结合的DNA基序，例如Gal4的反应元件为长17bp的DNA基序(序列67)。

“启动子”指启动和导致其下游基因转录产生RNA的DNA序列。启动子可以是天然基因的启动子或人工修饰的启动子。不同的启动子可指导基因在不同发育阶段的不同类型的组织或细胞中转录，或对不同环境或生理条件反应时的基因表达。启动子通常可分为“组成型启动子”、“可诱导启动子”或“可调控启动子”；按组织和细胞划分可分为“细胞特异性启动子”、“组织特异性启动子”、“发育特异性启动子”或“细胞分化特异性启动子”。可表达的天然细胞结构蛋白基因上游都有与其相配的启动子，不同的基因DNA片段可以有相同的启动子。可用于表达本发明重组光敏转录因子的常用组成型启动子的非限制性例子有：来源于多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒CMV和猿病毒40(SV40)的启动子。可用于表达本发明重组光敏转录因子的组织特异性启动子的非限制例子还包括清蛋白启动子(肝特异性，Pinkert，C.A.等，Genes Dev，1987.1(3)：268-276)，淋巴特异性启动子(Calame，K.和S.Eaton，Adv Immunol，1988.43：235-275.)，特别是T细胞受体的启动子(Winoto，A.和D.Baltimore，EMBO J，1989.8(3)：729-733)和免疫球蛋白的启动子(Banerji，J.，L.Olson，和W.Schaffner，Cell，1983.33(3)：729-740.；Queen，C.和D.Baltimore，Cell，1983.33(3)：741-748)。神经元特异性启动子(例如，神经纤维启动子，Talbott，R.L.，et al.，Proc Natl Acad Sci U S A，1989.86(15)：5743-5747)，胰特异性启动子(Edlund，T.等.，Science，1985.230(4728)：912-916)和哺乳动物腺特异性启动子(例如，牛乳乳清启动子，美国专利4873316号)。发育调节的启动子也包括在内，例如鼠hox启动子(Kessel，M.和P.Gruss，Science，1990.249(4967)：374-379)和α-胎蛋白启动子(Camper，S.A.和S.M.Tilghman，Genes Dev，1989.3(4)：537-546)。多数真核基因转录起始点上游大约-25于-30位核苷酸处有富含AT的区域称为TATA盒，本文称为“最小启动子”，它确定了目的基因的转录起始位点，但本身不足以有效地启动基因转录。在TATA盒上游还有其它转录必须的核苷酸基序，即本文所述的转录因子其特异性识别/结合的反应元件，该反应元件被其相应的转录因子结合后向最小启动子传达反应性，并在转录因子募集的辅因子协同作用下激活最小启动子引起下游目的基因转录产生相应的RNA。

“载体”、“表达载体”、“基因表达载体”、“重组基因表达载体”或“质粒”在本文中含义相同可互换使用，指能在真核细胞中表达重组目的蛋白的载体，这种真核表达载体可以是人工构建的质粒或重组病毒载体

“转染”指宿主细胞经物理或化学方法，如电穿孔、磷酸钙共沉淀、脂质转染胺或DEAE-葡聚糖介导的转染、DNA粒子轰击和显微注射等处理，使细胞摄入外源加入的携带基因的表达载体，或通过生物学媒介，如逆转录病毒载体、腺病毒载体、受体介导的DNA摄取等将携带基因的表达载体递送入宿主细胞中。这些载体进入宿主细胞后可作为游离体形式存在于胞质中，或整合入细胞染色体中，在适当条件下该细胞可瞬时表达或长期表达载体所携带的基因编码的蛋白质或功能性RNA。这种宿主细胞就叫做被载体转染的细胞。用表达载体转染宿主细胞的方法可参见Sambrooka等人(分子克隆实验手册，第二版，冷泉港出版社(1989))，和其它有关教材。

本发明基于光敏多肽的、光可控基因表达系统第一部分的重组光敏转录因子是由三种或四种功能性多肽片段直接通过肽键串联连接或通过接头肽串联连接形成的融合蛋白。在适当波长的光照射下，该融合蛋白能结合于本发明第二部分靶转录单元核苷酸序列的反应元件，并通过其转录激活/阻遏结构域和募集宿主细胞本身的转录辅因子，一起协同作用于靶转录单元中的启动子，从而启动或阻遏靶转录单元中目的蛋白基因的表达。

本文中，“重组光敏转录因子融合蛋白”与“重组光敏转录因子”含义相同，可互换使用。

本发明的重组光敏转录因子含有第一多肽，该多肽虽能特异性识别所述靶转录单元核苷酸序列中的反应元件但不能与其结合或结合能力弱，只有在第二多肽的协助下转录因子发生同质二聚化后第一多肽方能结合反应元件；第一多肽选自：螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、锌指基序或锌簇DNA结合结构域、亮氨酸拉链DNA结合结构域、翼状螺旋DNA结合结构域、翼状螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、螺旋-环-螺旋DNA结合结构域、高迁移率族DNA结合结构域、B3 DNA结合结构域。分析相关文献，可用作本发明的第一多肽优选包括但不限于：Gal4蛋白的DNA结合结构域、LexA蛋白的DNA结合结构域、Lac阻遏蛋白LacI的DNA结合结构域、λ噬菌体cI阻遏蛋白的DNA结合结构域、四环素阻遏蛋白TetR的DNA结合结构域、色氨酸阻遏蛋白TrpR的DNA结合结构域等，更优选Gal4的DNA结合结构域和LexA的DNA结合结构域。Gal4是酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的转录激活蛋白，能识别/结合基因启动子的上游反应元件-UAS_G基序(序列67)。Gal4的N末端第1-94位氨基酸为DNA结合结构域，此DNA结合结构域是一种锌簇DNA结合结构域，其中第1-65位氨基酸用于DNA特异性识别，第66-94位氨基酸用于二聚化，Gal4需形成同质二聚体才能结合反应元件发挥其作用[Marmorstein，R.等.，Nature，1992.356(6368)：408-411]。基于Gal4/UAS的双杂交系统是用于研究基因表达的一种有效工具。例如，普洛麦格公司(Promega)公司生产的哺乳动物双杂交系统(CheckMate^TM Mammalian Two-Hybrid System)就采用了此Gal4/UAS系统。LexA蛋白是存在于大肠杆菌细胞内的一种转录阻遏蛋白，能调控20多种基因的转录，它二聚化后能识别/结合基因启动子上游的反应元件(序列68)回文结构阻止RNA聚合酶对后面基因的转录。LexA含有202个氨基酸，其DNA结合结构域是一种翼状螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域，其中第1-87位氨基酸用于DNA特异性识别，第88-202位氨基酸用于二聚化，只有二聚化的LexA才能特异性结合相应的反应元件，单体LexA则不能。正常情况下细胞内存在的LexA是二聚体形式，当细胞受到内部或外部SOS信号刺激时，二聚化的LexA被体内某些酶切断分开并从DNA上解离，使得原来被LexA阻遏的基因激活[Fogh，R.H.等，EMBO J，1994.13(17)，3936-3944]。基于LexA的双杂交系统也被用于研究基因表达与蛋白质相互作用。例如，Clontech公司生产的酵母双杂交系统(MATCHMAKER^TM LexA Two-Hybrid System)就是基于此系统。Lac阻遏蛋白LacI能特异性识别/结合大肠杆菌乳糖系统操纵子而调节相关基因的转录。LacI的DNA结合结构域是一种螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域，其中第1-62位氨基酸用于DNA的特异性识别，其特异性识别/结合的DNA保守序列见序列69，只有二聚化或者四聚化的LacI才能与之结合，单体LacI蛋白几乎不能结合[Lewis，M.等，Science，1996.271(5253)，1247-1254]。cI蛋白是λ噬菌体cI基因编码的一种转录阻遏蛋白，它可以阻止λ左、右两个早期起动子的转录导致不能进行复制及细胞分裂的蛋白。cI蛋白含有236个氨基酸，其DNA结合结构域一种螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域，第1-102位氨基酸用于DNA特异性识别，第132-236位氨基酸用二聚化，只有二聚化的cI才能特异性结合相应的反应元件。cI蛋白同质二聚体识别/结合P_L和P_R两个操纵子序列上，每个操纵子各含有cI三个识别结合位点，分为P_L的OL1、OL2和OL3以及P_R的OR1、OR2和OR3。cI与OR1的结合能力相对强些，OR1的保守DNA序列见序列71，单体cI蛋白几乎无这种结合能力[Burz，D.S.，Beckett，D.，Benson，N.，和Ackers，G.K.，Biochemistry，1994.33(28)，8399-8405，Hu，J.C.，O′Shea，E.K.，Kim，P.S.和Sauer，R.T.，Science，1990.250(4986)，1400-1403]。四环素阻遏蛋白(TetR)是存在于很多革兰阴性菌中的一种转录因子，通过结合特定DNA基序阻遏相关基因的转录。TetR蛋白的DNA结合结构域是一种螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域，单体TetR蛋白可形成同质二聚体而识别/结合含有特定DNA序列(序列70)的操纵子上，单体TetR几乎无结合能力[Wissmann，A.等.，EMBO J，1991.10(13)，4145-4152，Ramos，J.L.等.，Microbiol Mol BiolRev，2005.69(2)，326-356]。

在本发明一优选实施方式中，第一多肽为Gal4蛋白DNA结合结构域(其核酸和蛋白质序列分别为序列1和序列2)的1-65位氨基酸，即其DNA结合结构域的截短体，其单独不能结合反应元件。在本发明另一优选实施方式中，第一多肽为LexA蛋白DNA结合结构域(其核酸和蛋白质序列分别为序列5和序列6)的1-87位氨基酸，即其DNA结合结构域的截短体，其单独不能结合反应元件。在本发明另一优选实施方式中，第一多肽为LacI蛋白DNA结合结构域(其核酸和蛋白质序列分别为序列9和序列10)的1-62位氨基酸，即其DNA结合结构域的截短体，其单独也不能结合反应元件。在本发明另一优选实施方式中，第一多肽为TetR蛋白DNA结合结构域(其核酸和蛋白质序列分别为序列13和序列14)的1-63位氨基酸，即其DNA结合结构域的截短体，其单独也不能结合反应元件。在本发明另一优选实施方式中，第一多肽为cI蛋白DNA结合结构域(其核酸和蛋白质序列分别为序列17和序列18)的1-102位氨基酸，即其DNA结合结构域的截短体，其单独也不能结合反应元件。

本发明重组光敏转录因子融合蛋白中的第二多肽是光敏多肽，该多肽来自以黄素类(FMN或FAD)为生色团的光敏结构域。如含有光-氧-电压(LOV)结构域的光敏蛋白；类似光裂解酶的隐花色素(photolyase-like cryptochromes)；利用FAD的蓝光蛋白(bluelight using FAD，BLUF)。优选含LOV结构域的光敏蛋白，经适当波长光照射后，第二多肽的二聚化能力发生改变，使转录因子的二聚化能力发生变化，二聚化的转录因子结合于相对应的反应元件，从而调节目的基因的表达水平。本发明包括但不限于以下所述的几种优选光敏蛋白或其功能活性截短体。

本发明第一个优选的第二多肽是粗糙链孢霉菌的VIVID蛋白的光敏结构域及其突变体。VIVID是存在于粗糙链孢霉菌(Neurospora crassa)细胞内参与蓝光调控细胞信号传导通路的一种光敏蛋白质。在蓝光照射下它能与黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD，FlavinAdenine Dinucleotide)发生蛋白分子间反应形成二聚体。全长VIVID蛋白含有186个氨基酸，只含一个对光敏感的LOV结构域。研究表明VIVID蛋白缺失了N端36个氨基酸的截短体蛋白(VIVID-36)稳定性比全长蛋白更好，而蓝光照射后形成的VIVID-36二聚体不光照恢复其单体形式的半衰期为18000s，含点突变C71V的VIVID-36二聚化能力更强。在本发明一优选实施方式中，第二多肽是含一个点突变的删除前1-36个氨基酸的VIVID(C71V)、VIVID(N56K)、VIVID(Y50W)突变蛋白(核酸序列分别为23、25、29，氨基酸序列分别为24、26、30)。在本发明一个更优选实施方式中，第二多肽是含二个点突变的删除前1-36个氨基酸VIVID(N56K+C71V)突变蛋白(其核酸和蛋白质序列分别为序列27和序列28)。

本发明第二个优选的第二多肽是燕麦(Avena sativa)光敏色素1基因的LOV2结构域(简写为AsLOV2)[Peter，E.，B.Dick，and S.A.Baeurle，Nat Commun，2010.1(8)：122]。燕麦细胞光敏色素1的N端为LOV1和LOV2光氧电压(LOV)结构域，在蓝光照射下均能与黄素单核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)结合生成一种加成产物。本发明将燕麦光敏色素1的LOV2结构域连接于第一多肽，成功导致可用光照调控转录因子的第一多肽与对相应的反应元件的结合能力。本发明含有AsLOV2(其核酸和蛋白质序列分别为序列41和序列42)第二多肽的转录因子GALP在黑暗时可以结合其对应的反应元件导致目的基因表达，而在光照下这种结合减弱导致目的基因表达水平下调。

本发明第三个优选的第二多肽是无隔藻(Stramenopile algae Vaucheria frigida)金色素1(aureochrome1)蛋白C端的LOV结构域(简写为AuLOV，其核酸和蛋白质序列分别为序列45和序列46)[Takahashi，F.等，Proc Natl Acad Sci U S A，2007.104(49)：19625-19630]。本发明含有AuLOV第二多肽的重组转录因子GAAP光照后二聚化能力增强使目的基因的表达水平上调。

以上所述的第二光敏多肽中，VIVID和AuLOV用适当波长光照射可使由其构成的重组光敏转录因子二聚化增强，导致结合反应元件而启动或上调转录；而AsLOV2构成的重组光敏转录因子，在黑暗时二聚化而结合反应元件，光照反使其解二聚成为单体减弱与反应元件的结合或不再结合，从而阻遏或下调转录。

对来自光敏蛋白的6种不同的LOV结构域进行用Accelry Discovery Studio 2.1进行同源性分析，这几种LOV结构域分别来自VIVID(Nc_VVD)、白领-1(Nc_Wc1)、FKF1(At_FKF1)、金色素1(Vf_Aureo1_LOV)、燕麦向光素1(As_phot_LOV1和As_phot_LOV2)。结果显示，这几种蛋白完全相同的氨基酸约为15％，具有相似性的序列约为36％(图47)。

第一多肽和第二多肽可构成一种光可控的DNA结合蛋白融合蛋白(简称为DNA结合蛋白)。光可控的DNA结合蛋白可用于研究本发明各种重组光敏转录因子的DNA结合能力，尤其是在体外研究重组光敏转录因子的第一多肽和第二多肽构成的完整的具有DNA结合能力的DNA结合结构域及其结合特性的分析，例如结合常数、由二聚化恢复成单体的动力学等，优选出的DNA结合蛋白与第三多肽连接即可构成转录因子。在一个具体的实施方式中，光可控的DNA结合蛋白的第一多肽是Gal4(1-65)，第二多肽是野生型VIVID-36，组成的融合蛋白Gal4-VIVID(WT)(简称为GAV(WT)，其核酸和氨基酸序列84和序列85)与VIVID蛋白的光谱性质相似、且DNA结合能力受光调控，光照前后DNA结合水平具有明显差异，即高浓度水平时黑暗状态的融合蛋白能结合探针、但结合能力弱；光照后在所用到的蛋白浓度范围内对探针都具有结合能力。

本发明的重组光敏转录因子含有第三多肽，该多肽是一种转录调节结构域，可以是转录结构激活域(简写为AD)或转录结构阻遏域。可用作本发明第三多肽的转录结构激活域或转录结构阻遏域包括但不限于：富含酸性氨基酸的转录激活结构域(如VP16和Gal4的AD)、富含脯氨酸的转录激活结构域(如CTF/NF1的氨基酸残基399-499)、富含丝氨酸/苏氨酸的转录激活结构域(如ITF1的氨基酸残基1-427)和富含谷氨酰胺的转录激活结构域(Oct1的氨基酸残基175-269)，Seipel等公开了它们的氨基酸序列和其他有用的转录激活结构域[Seipel，K.，Georgiev，O.和Schaffner，W.，EMBO J，1992.11(13)，4961-4968(1992)]。还有已报导了的Kruppel相关盒(KRAB)转录阻遏结构域[Peng，H.等，J Biol Chem，2000.275(24)：18000-18010]的序列。

在本发明的实施方案中，第三多肽为VP16转录激活结构域(简写为VP16，其核酸和蛋白质序列分别为序列51和序列52)、Gal4转录激活结构域(简写为Gal4AD，其核酸和蛋白质序列分别为序列53和序列54))、通用控制蛋白(Gcn4)的转录激活结构域(其核苷酸和蛋白质序列分别为序列95和序列96)、NF-κB p65转录激活结构域(简写为p65AD，其核酸和蛋白质序列分别为序列49和序列50))，或锌指蛋白354A的KRAB转录阻遏结构域(其核酸和蛋白质序列分别为序列55和序列56)。NF-κB的二类亚基常形成同质或异质二聚体，最常见p65/p50或p65/p65二聚体，p65亚基的转录激活结构域已被广泛应用于构建诱导基因表达的各种系统效果良好[Wang，Y.等，Gene Ther，1997.4(5)，432-441]。Gal4蛋白的转录激活结构域(AD)位于其C-末端768-881位，在这114个氨基酸中有很多酸性氨基酸，能招募酿酒酵母细胞中的其他转录辅助蛋白一起激活启动子导致相关基因的转录[Shimizu-Sato，S.，Huq，E.，Tepperman，J.M.，和Quail，P.H.，NatBiotechnol，2002.20(10)，1041-1044]。酵母Gcn4的转录激活结构域主要位于Gcn4蛋白的N-末端第1-144位氨基酸，它可以招募酿酒酵母细胞中的其他转录辅助蛋白一起激活启动子导致相关基因的转录[Drysdale，C.M.等.，Mol Cell Biol，1995.15(3)：1220-1233]。VP16为单纯疱疹病毒HSV-1的UL48结构基因表达的含490个氨基酸残基的病毒间层蛋白，其羧基端富含酸性氨基酸残基为转录激活结构域。VP16的转录激活结构域已成功用于多种基因表达系统中效果良好[Gossen，M.和H.Bujard等，Proc Natl Acad Sci U S A，1992.89(12)：5547-5551]。在本发明一优选实施方式中，第三多肽采用VP16的转录激活结构域。在本发明另一优选实施方式中，第三多肽采用NF-κB p65转录激活结构域。在本发明另一优选实施方式中，第三多肽采用锌指蛋白354A的KRAB转录阻遏结构域。在本发明另一优选实施方式中，第三多肽采用Gal4转录激活结构域。在本发明另一优选实施方式中，第三多肽采用Gcn4转录激活结构域。

本发明的重组光敏转录因子融合蛋白还可包括第四多肽，该多肽是核定位信号肽用以促进融合蛋白向细胞核运输。如果第一、第二和第三多肽不含核定位信号(NLS)时，可融合加入第四多肽。核定位信号肽典型地包括一段碱性氨基酸。本发明优选的核定位信号肽为猿猴空泡病毒40核定位信号肽(SV40NLS)[Fanara，P.，等.，J Biol Chem，2000.275(28)：21218-21223.]。在一个具体实施方案中，本发明的重组光敏转录因子第一多肽为含有核定位信号的Gal4蛋白，故融合蛋白不含第四多肽。在另一个具体的方案中，第四多肽与第一、第二、第三多肽直接或通过接头相连。

如上面所述，本发明的重组光敏转录因子所含的三种或四种多肽各自可以有多种选择，将三种或四种多肽连接成融合蛋白又可以有多种组合选择，本发明优选具有良好活性的各多肽的功能结构域片段制备重组光敏转录因子融合蛋白，通过在哺乳动物细胞和酵母细胞中表达优选的转录调节能力强的，即光照和黑暗时导致目的基因表达量差异大的该重组光敏转录因子，用于调节待转录核酸序列的表达，但不论如何何种选择与组合，只要能实现本发明所设想的光调控基因表达性能的的重组光敏转录因子各种组合都属于本发明的范围。

本发明基于光敏多肽的、光可控基因表达系统的第二部分是由转录因子特异性识别/结合的反应元件-启动子-待转录核苷酸序列组成的靶转录单元(核苷酸序列)，具体来说，其中反应元件的核苷酸基序视本发明不同实施方式所选的重组光敏转录因子融合蛋白的第一多肽不同而不同。换句语说，反应元件是第一多肽的特异性反应元件，必须根据所选择的第一多肽来选择与其相对应的反应元件。例如，第一多肽为Gal4蛋白的DNA识别/结合结构域时，其相对应的反应元件应为“序列67”基序；第一多肽为LexA蛋白的DNA结合结构域时，其相对应的反应元件应为“序列68”基序；第一多肽为LacI蛋白的DNA结合结构域时，其相对应的反应元件应为“序列69”基序；第一多肽为TetR蛋白的DNA结合结构域时，其相对应的反应元件应为“序列70”基序；第一多肽为cI蛋白的DNA结合结构域时，其相对应的反应元件应为“序列71”基序。靶转录单元中的反应元件至少为一个或可以有多个，在具体的实施方式中，反应元件为1、2、3、4或5个，如果需要或多个效果更好的话优选多个。

与反应元件操作性相连的通常是是最小启动子，此最小启动子本身不足以有效地起启动基因转录，必须和其上游的反应元件一起与转录因子诸成员相互作用后方能激活或上调下游目的基因转录。分析相关文献，可用作本发明最小启动子的包括但不限于：腺病毒主要晚期启动子(核酸序列为序列72)、巨细胞病毒CMV最小启动子(核酸序列为序列75)、酵母Gal1基因的启动子(核酸序列为序列74)，在本发明具体的实施方式中，最小启动子是腺病毒晚期启动子、酵母Gal1启动子，但也可采用其它最小启动子。与反应元件操作性相连的启动子也可以是完整的启动子，这类启动子本身具有启动基因转录的能力，当转录因子结合在反应元件后，可增强或阻遏下游待转录核酸的表达，在另一个具体的实施方式中，启动子为SV40启动子(核酸序列为序列73)。在本发明的本领域技术人员知道，所谓“操作性相连指反应元件与启动子之间或多个反应元件之间不是直接相连而可以隔开若干个核苷酸，只要仍能协同作用即可。

本发明靶转录单元启动子下游是待转录的核苷酸序列，可以是编码目的蛋白或功能性RNA的核苷酸序列。如上面所述，目的蛋白可以是任何有用的蛋白。为了验证本发明系统的效果和便于检测，在本发明的实施例中，采用了示范性的报告蛋白：萤火虫荧光素酶(Fluc，其核酸和氨基酸序列分别为序列76和序列77)、高斯荧光素酶(Gluc，其核酸和氨基酸序列分别为序列78和序列79)、红色荧光蛋白mCherry(其核酸和氨基酸序列分别为序列80和序列81)、绿色荧光蛋白(hrGFP，其核酸和氨基酸序列分别为序列82和序列83)、黄色荧光蛋白(EYFP，其核酸和氨基酸序列分别为序列91和序列92)、β-半乳糖苷酶(LacZ，其核酸和氨基酸序列分别为序列93和序列94)作为目的蛋白，但本发明的目的蛋白不限于这些报告蛋白。待转录的核苷酸序列也可以编码功能性RNA分子，例反义RNA分子。在宿主细胞或动物中表达这种功能性RNA分子可调节宿主细胞内的一些活动，例如，通过抑制编码蛋白的mRNA的翻译，阻止目的蛋白的表达。

可用标准重组DNA技术将本发明光可诱导的目的蛋白基因表达系统的第一部分和第二部分构建在一个真核表达载体中或分别构建在二个真核表达载体中。可用标准技术将这种表达载体引入各种真核宿主细胞群中表达所需目的蛋白；或引入各种真核宿主细胞群中，例如动物胚胎细胞或植物生殖细胞，进一步选择产生有用的转基因生物，如转基因的山羊、绵羊、猪、牛或其它家畜，或转基因植物。

本发明基于光敏多肽的、光可控基因表达系统可用于在真核细胞中表达内源蛋白或外源蛋白，用于基因治疗和利用转基因或同源重组生物体(例如动物或植物)内基因的表达。

本发明提供由三种或四种多肽组成的多种重组光敏转录因子融合蛋白的氨基酸序列、其编码核酸和其真核表达载体。在本发明的一实施方式中，提供重组光敏转录因子Gal4-VIVID-VP16(简写为GAVV(WT))的编码核酸(序列3)、氨基酸序列(序列4)和哺乳动物细胞表达载体pGAVV(WT)。在本发明另一实施方式中，提供重组光敏转录因子Gal4-VIVID-p65(简写为GAVP)的编码核酸(序列31)、氨基酸序列(序列32)和哺乳动物细胞表达载体pGAVP(WT)。在本发明一优选实施方式中，提供其中VIVID含有点突变的三种重组光敏转录因子Gal4-VIVID-p65的编码核酸(序列33、35、39)，氨基酸序列(序列34、36、40)和哺乳动物细胞表达载体pGAVP(C71V)、pGAVP(N56K)和pGAVP(Y50W)，其中括弧中为VIVID中的突变位点。在本发明另一更优选的实施方式中，提供其中VIVID含有双突变的重组光敏转录因子Gal4-VIVID-p65的编码核酸(序列37)、氨基酸序列(序列38)和哺乳动物细胞表达载体pGAVP(N56K+C71V)。在本发明另一实施方式中，提供重组光敏转录因子Gal4-AsLOV2-p65(简写为GALP)的编码核酸(序列43)，氨基酸序列(序列44)和哺乳动物细胞表达载体pGALP。在本发明另一实施方式中，提供重组光敏转录因子Gal4-AuLOV-p65(简写为GAAP)的编码核酸(序列47)，氨基酸序列(序列48)和哺乳动物细胞表达载体pGAAP。在本发明另一优选的实施方式中，提供第一与第二多肽用不同接头肽连接的三种重组光敏转录因子Gal4-VIVID-p65的编码核酸(序列59、61、63)，氨基酸序列(序列60、62、64)和哺乳动物细胞载体pGAVP-9、pGAVP-11和pGAVP-12，其中9、11、12代表不同的接头肽。在本发明另一实施方式中，提供重组光敏转录因子Gal4-VIVID-KRAB(C71V)(简写为GAVK(C71V)的编码核酸(序列57)，氨基酸序列(序列58)和哺乳动物细胞表达载体pGAVK(C71V)。在本发明另一实施方式中，提供一组重组光敏转录因子Gal4-VIVID-Gal4AD-Ln(N56K+C71V)其中n为1、2、3、4、5、6，简写为GVG-Ln(N56K+C71V))的编码核酸(分别为序列97、99、101、103、105和107)，氨基酸序列(分别为序列98、100、102、104、106和108)和哺乳动物细胞表达载体pGPMA-GVG-Ln(N56KC71V)。在本发明另一实施方式中，提供重组光敏转录因子Gal4-VIVID-VP16(N56K+C71V)(简写为GVVP(N56K+C71V))的编码核酸(序列109)，氨基酸序列(序列110)和酿酒酵母菌表达载体pGPMA-GVVP(N56K+C71V)。在本发明另一实施方式中，提供重组光敏转录因子Gal4-VIVID-Gcn4(N56K+C71V)(简写为GVGc(N56K+C71V))的编码核酸(序列111)，氨基酸序列(序列112)和酿酒酵母菌表达载体pGPMA-GVGc(N56K+C71V)。在本发明另一实施方式中，提供一组其中VIVID含有点突变的重组光敏转录因子Gal4-VIVID-Gal4AD的编码核酸(分别为序列113、115、117)，氨基酸序列(分别为序列114、116、118)和酿酒酵母菌表达载体pGPMA-GVG(WT)、pGPMA-GVG(C71V)和pGPMA-GVG(Y50W)。在本发明另一实施方式中，提供重组光敏转录因子Gal4-AsLOV2-Gal4AD(简写为GLG)的编码核酸(序列119)，氨基酸序列(序列120)和酿酒酵母菌表达载体pGPMA-GLG。在本发明另一实施方式中，提供含有第四多肽的重组光敏转录因子NLS-LexA-VIVID-Gal4AD(N56K+C71V)(简写为NLVG(N56K+C71V))的编码核酸(序列7)，氨基酸序列(序列8)和酿酒酵母菌表达载体pGPMA-NLVG(N56K+C71V)。在本发明另一实施方式中，提供含有第四多肽重组光敏转录因子NLS-cI-VIVID-Gal4AD(N56K+C71V)(简写为NCVG(N56K+C71V))的编码核酸(序列19)，氨基酸序列(序列20)和酿酒酵母菌表达载体pGPMA-NCVG(N56K+C71V)。在本发明另一实施方式中，提供含有第四多肽重组光敏转录因子NLS-LacI-VIVID-Gal4AD(N56K+C71V)(简写为NLcVG(N56K+C71V))的编码核酸(序列11)，氨基酸序列(序列12)和酿酒酵母菌表达载体pGPMA-NLcVG(N56K+C71V)。在本发明另一实施方式中，提供含有第四多肽重组光敏转录因子NLS-TetR-VIVID-Gal4AD(N56K+C71V)(简写为NTVG(N56K+C71V))的编码核酸(序列15)，氨基酸序列(序列16)和酿酒酵母菌表达载体pGPMA-NTVG(N56K+C71V)。本领域众所周知，氨基酸的密码子核苷酸有简并性(即某些氨基酸可有二个、或三个、或四个密码子，它们称为该氨基酸的简并密码子)，上述的各种重组光敏转录因子的编码核酸，本发明包括它们各自的所有简并核苷酸序列。上述的各种重组光敏转录因子的氨基酸序列，本发明包括它们各自的所有含保守性缺失、添加、置换修饰但仍保留了其原有功能活性的氨基酸序列类似物。

本发明也提供含有反应元件-启动子，但待转录的核苷酸序列空缺的靶转录单元的真核表达载体，待转录的核苷酸序列空缺是让用户可以自行选择所需的待转录的核苷酸序列，例如目的蛋白的编码基因，用标准的重组DNA技术将其插入本发明的这种表达载体中，与上面所述含本发明重组光敏转录因子基因的表达载体共同转染宿主细胞，来调节待转录核苷酸序列(基因)的表达。

本发明也提供分别转染了本发明各种重组光敏转录因子基因的真核表达载体的哺乳动物细胞，同时提供含有相应的反应元件-启动子-待转录核苷酸序列空缺的靶转录单元的真核表达载体。用户可用标准重组DNA技术将自行选择的待转录核苷酸序列(目的蛋白基因)插入该表达载体中，然后用该重新构建的载体转染已转染了本发明重组光敏转录因子基因的真核表达载体的哺乳动物细胞，并培养这种细胞表达他们所需的目的基因，或供他们研究如何调节目的基因的表达。

本发明还提供装有本发明基因表达调节系统两部分的表达载体或已转染了这种载体的哺乳动物细胞的试剂盒。在一个实施方式中，该试剂盒中一些容器分别装有含本发明一种或多种重组光敏转录因子基因的真核表达载体。在另一个实施方式中，该试剂盒中的一些容器分别装有含本发明一种或多种重组光敏转录因子基因的真核表达载体，另一些容器分别装有含相应反应元件-启动子-待转录核苷酸序列空缺的靶转录单元的真核表达载体。在还有一个实施方式中，该试剂盒中一些容器装有已转染了本发明重组光敏转录因子基因的真核表达载体的哺乳动物细胞，另一些容器装有含相应反应元件-启动子-待转录核苷酸序列空缺的靶转录单元的真核表达载体。

本发明的试剂盒还可以包括相应的光照控制设备，例如LED灯及其调控装置。本发明的所有试剂盒都装有相应的说明书，以说明盒中的各成分、使用目的和使用方法，并提供有关的参考文献目录。

本发明还包括光可控基因表达系统在宿主细胞中调控基因表达的方法，包括步骤：

a)将所述光可控基因表达系统构建在真核质粒表达载体中；

b)引入含被调控基因的宿主细胞；和

c)光照诱导所述宿主细胞，使所述宿主细胞中的被调控的核苷酸进行表达。光照诱导宿主细胞的方法包括光源的选择和光源的使用。光源非限制地包括LED灯、白炽灯、荧光灯、激光。在本发明的一个实施方式中，光源选用蓝色LED(460-470nm)。光照方法包括光照量、光照强度、光照时间、光照频率以及用扫描、投影、光模具等方法在空间上控制目的基因的表达也包含在本发明范围中。在本发明的一个实施方式中，光照强度为0-0.8W/m²不等；在本发明另一个具体实施方式中，光照总量不同，即相同的光照强度和光照总时间，分别每30s光照1s、每60s光照1s、每120s光照1s的光照频率进行光照诱导；在本发明的另一个实施方式中，用打印的投影片作为光模具，在空间上调节不同位置的细胞的目的基因的表达水平；在另一个的在本发明另一个实施方式中，用中性灰度片作为光模具，在空间上调节不同位置的细胞的目的基因的表达水平。

附图简要说明

图1是重叠PCR的示意图；

图2是同源重组连接示意图；

图3为反向PCR的原理；

图4为含有光敏转录因子的哺乳动物细胞表达载体的构建示意图。上方为各光敏转录因子融合蛋白的示意图；下方为环状的表达载体的示意图，表达载体的骨架为pEGFP-N1，原有的EGFP基因被光敏转录因子融合蛋白基因取代。*号表示两个多肽处的接头肽不同；

图5为含有靶转录单元的哺乳动物细胞表达载体的构建示意图。上方为各靶转录单元的示意图，下方为环状的表达载体的示意图，表达载体的骨架为pcDNA3.1(+)-hygro，原CMV启动子区和多克隆位点区被靶转录单元取代；

图6为含有光敏转录因子的酿酒酵母细胞表达载体的构建示意图。上方为各光敏转录因子融合蛋白的示意图，下方为环状的表达载体的示意图，表达载体的骨架为pGADT7，原Gal4AD基因被和多克隆位点区被光敏转录因子融合蛋白取代。*号表示两个多肽处的接头肽不同；

图7为含有靶转录单元的酿酒酵母细胞表达载体的构建示意图。上方为各靶转录单元的示意图；下方为环状的表达载体的示意图，表达载体的骨架为pYES2.1 TOPO；

图8为将Gal4、VIVID(WT)、VP16搭桥PCR的核酸电泳图。左边箭头指的是搭桥PCR产物的目的条带，右边泳道为分子量标准。目的条带在750bp和1000bp之间；

图9为PCR扩增p65AD的核酸电泳图。左边箭头指的是PCR产物的目的条带，右边泳道为分子量标准。目的条带在500bp和1000bp之间；

图10为PCR扩增AsLOV2的核酸电泳图。右边箭头指的是PCR产物的目的条带，左边泳道为分子量标准。目的条带在500bp和250bp之间；

图11为PCR扩增AuLOV的核酸电泳图。右边箭头指的是PCR产物的目的条带，左边泳道为分子量标准。目的条带在500bp和250bp之间；

图12为PCR扩增LexA(1-87)的核酸电泳图。右边箭头指的是PCR产物的目的条带，左边泳道为分子量标准。目的条带在500bp和250bp之间；

图13为PCR扩增LacI(1-62)的核酸电泳图。右边箭头指的是PCR产物的目的条带，左边泳道为分子量标准。目的条带在250bp和100bp之间；

图14为PCR扩增cI(1-102)的核酸电泳图。右边箭头指的是PCR产物的目的条带，左边泳道为分子量标准。目的条带在500bp和250bp之间；

图15为PCR扩增TetR(1-63)的核酸电泳图。左边箭头指的是PCR产物的目的条带，右边泳道为分子量标准。目的条带在250bp和100bp之间；

图16为PCR扩增Gcn4(1-144)的核酸电泳图。右边箭头指的是PCR产物的目的条带，左边泳道为分子量标准。目的条带在500bp和250bp之间；

图17为在表达几种不同转录激活结构域为第三多肽的转录因子的哺乳动物细胞中，光照对Fluc的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为Fluc的活性水平；

图18为在表达以几种VIVID突变体的第二多肽的转录因子的哺乳动物细胞中，光照对Fluc的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为Fluc的活性水平；

图19为在表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)的NIH3T3细胞中，光照对Fluc的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为Fluc的活性水平；

图20为在表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)的COS-7细胞中，光照对Fluc的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为Fluc的活性水平；

图21为在表达第一与第二多肽用不同接头肽连接的重组光敏转录因子GAVP(WT)的哺乳动物细胞中，光照对Fluc的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为Fluc的活性水平；

图22为在表达以AsLOV2为第二多肽的转录因子的哺乳动物细胞中，光照后对Fluc的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为Fluc的活性水平；

图23为在表达以AuLOV为第二多肽的转录因子的哺乳动物细胞中，光照后对Fluc的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为Fluc的活性水平；

图24为在表达以KRAB为第三多肽的转录因子的哺乳动物细胞中，光照对Fluc的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为Fluc的活性水平；

图25为表达重组光敏光诱导转录因子GAVP(C71V)的HEK293单克隆细胞筛选。横轴为单细胞克隆的编号，纵轴为Fluc的活性水平；

图26为在表达重组光敏转录因子GVG(N56K+C71V)的酿酒酵母AH109细胞中，光照对EYFP的表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为EYFP的荧光强度；

图27为在表达重组光敏转录因子GVVP(N56K+C71V)的酿酒酵母AH109细胞中，光照对EYFP的表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为EYFP的荧光强度；

图28为在表达重组光敏转录因子GVGc(N56K+C71V)的酿酒酵母AH109细胞中，光照对LacZ的表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为EYFP的荧光强度；

图29为在表达第二与第三多肽用不同接头肽连接的重组光敏转录因子GVG(N56K+C71V)的酿酒酵母AH109细胞中，光照对LacZ基因的表达水平的调节；

图30为在表达重组光敏转录因子Gal4-VIVID-Gal4AD的酿酒酵母细胞中，检测转录因子表达水平不同时对目的基因表达的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为EYFP的荧光强度；

图31为在表达以几种VIVID突变体的第二多肽的转录因子的酿酒酵母AH109细胞中，光照对EYFP基因的表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为EYFP的荧光强度；

图32为以AsLOV2为第二多肽的转录因子的酿酒酵母AH109细胞中，光照后对EYFP基因的表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为EYFP的荧光强度；

图33为重组光敏转录因子调节含不同个数Gal4反应元件的靶转录单元中EYFP基因表达的差异。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为EYFP的荧光强度；

图34为在表达LexA、LacI、cI和TetR分别为第一多肽的重组光敏转录因子的酿酒酵母AH109细胞中，光照对EYFP的表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为EYFP的荧光强度；

图35为在表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)的细胞中，光照诱导的目的基因表达的时间动力学过程和可逆性过程。横轴为光照时间，开始光照的时刻对应为0小时，纵轴为Fluc的活性水平；

图36为在表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)的细胞中，不同的光照强度对目的基因表达水平的调节。横轴为光照强度，纵轴为Fluc的活性水平；

图37为在表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)的细胞中，不同的光照总量(光照频率)对目的基因表达水平的调节。横轴为光照降低倍数，纵轴为Fluc的活性水平，不同曲线的光照总量(光照频率)不同；

图38为在表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)的细胞中，光照调节mCherry(红色荧光蛋白)基因表达的显微呈像。上图为相差图像，下图为荧光图像；

图39为在表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)的细胞中，光照调节hrGFP(绿色荧光蛋白)基因表达的显微呈像。上面为相差图像，下图为荧光图像；

图40为非还原聚丙烯酰胺电泳(15％)检测荧光蛋白的表达。上图目的条带为hrGFP(绿色荧光蛋白)，下图目的条带为mCherry(红色荧光蛋白)；

图41为RT-PCR鉴定光照/黑暗条件下目的基因Fluc的表达；

图42在表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)的细胞中，用中性灰度片在空间上调控96孔板中培养的细胞的荧光蛋白的表达；

图43为用打印图案投影片给表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)细胞“拍照”得到的ECUST图案。左图为贴有投影片的培养皿的照片，右图为细胞的荧光图像；

图44为纯化后光可控DNA结合蛋白GAV(WT)的纯度。箭头指的是目的条带；

图45为光可控DNA结合蛋白GAV(WT)的光谱性质；

图46为光可控DNA结合蛋白GAV(WT)的凝胶迁移实验。左右二图泳道从左至右GAV(WT)蛋白浓度分别为5.5μM、2.8μM、1.4μM、0.7μM、0.35μM；探针浓度均为125nM；

图47为6种来自光敏蛋白的不同LOV结构域的同源性分析，其中黑色表示100％相同的氨基酸序列，深灰色表相似性较高的序列，浅灰色表示相似性中等的序列。

具体实施方式

以下用实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如：简·罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》和J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译：《分子克隆实验指南》(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)；J E.科林根等著，李慎涛等译《精编蛋白质科学实验指南》(科学出版社，背景)中的有关章节。本领域普通技术人员按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。

实施例中所用的pEGFP-N1、pGADT7、pGBKT7质粒载体购自Clontech公司，pcDNA3.1(+)-hygro、pYES2.1 TOPO质粒载体购自Invitrogen公司。pG5luc、pBIND、pACT载体购自Promega公司，均为真核表达载体。pcDNA3.1(+)-hygro和pEGFP-N1用于构建用于哺乳细胞内表达目的蛋白的真核表达载体，二者均有CMV启动子，前者具有潮霉素抗性基因，后者具有新霉素抗性基因。pGADT7含有Gal4转录激活结构域基因，pBIND含有酵母菌Gal4的DNA结合结构域基因，pACT含有VP16转录激活结构域基因。pG5luc含有Gal4操纵子、TATA最小启动子元件和萤火虫荧光素酶Fluc基因。pIRES-hrGFP购自Stratagene公司，含有hrGFP基因。pGluc-basic购自NEB公司，含有Gluc基因。pTRIPZ质粒购自Openbiosystem公司，含有SV40启动子序列。pCDFDuet1质粒购自Novagen公司，含有LacI基因。

所有用于PCR的引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。本发明实实例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由华大基因公司完成。本发明实施例所用的Taq DNA聚合酶购自东盛生物，pfu DNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司，PrimeSTAR DNA聚合酶购自TaKaRa公司，三种聚合酶购买时都附带赠送对应聚合酶缓冲液和dNTP。BsrGI、Eco47III、BglII、PstI、HindIII、BamHI等限制性内切酶、T4连接酶、T4磷酸化酶(T4PNK)购自Fermentas公司，购买时附带有10×Tango^TM缓冲液等。实施例中所用的CloneEZ PCR克隆试剂盒(含同源重组酶)购自南京金斯瑞生物科技有限公司(原金思特科技(南京)有限公司)。除非特别声明，无机盐类化学试剂均购自国药集团上海化学试剂公司。卡那霉素(Kanamycin)、氨苄青霉素(Amp)、PNPG和二硫苏糖醇(DTT)购自Ameresco公司；黄素腺苷酸二核苷酸磷酸(FAD)、ATP、咪唑(Imidazole)购自Alfa公司；Gluc检测试剂盒购自NEB公司；D-荧光素钾盐购自Synchem公司；EGTA购自BBI公司；Trizol试剂、胰蛋白酶(Trpsin-EDTA)、特级胎牛血清(FBS)、Lipofectamine2000、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、Opti-mem培养基、青霉素/链霉素双抗购自Invitrogen公司；各种氨基酸购自上海生工生物有限公司；ONPG购自Sigma公司DMEM高糖培养基(无酚红/有酚红)购自Hyclone公司。除特别指出外，细胞培养器皿(如100mm直径细胞培养皿、48孔板等)、移液管等细胞培养一次性器材购自Corning公司。20mm直径玻璃底细胞培养皿购自NEST公司。384孔发光检测白板、384孔荧光检测黑板购自Grenier公司。96方孔细胞培养板购自GE healthcare公司。

本发明实施例中所用的DNA纯化试剂盒购自BBI公司(加拿大)，普通质粒小抽试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；转染级质粒抽提试剂盒购自Omega公司；RNA抽提试剂盒购自Tiangen公司；ImpromII反转录试剂盒购自Promega公司；DC蛋白定量试剂盒购自Bio-rad公司。大肠杆菌Mach1购自Invitrogen公司；大肠杆菌JM109购自Promega公司；大肠杆菌BL21(DE3)购自Novagen公司；细胞系HEK293、COS-7、NIH3T3购白ATCC(美国模式培养物保藏所)；粗糙链孢霉菌(Neurospora crassa)由广西师范大学资源与环境学系谌斌老师慷慨赠送；酿酒酵母AH109购自Clontech公司；BY4741购自Openbiosystem公司。

本发明实施例中用到的主要仪器：Biotek Synergy 2多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)，X-15R高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，Microfuge22R台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，PCR扩增仪(德国Biometra公司)，活体成像系统(美国Kodak公司)。光度计购自日本和光(Sanwa)公司，核酸电泳仪(上海申能博彩公司)，Ti系列倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)，四用紫外分析仪(上海嘉鹏公司)。

本文中的缩写词含义如下：h＝小时，min＝分钟，s＝秒，d＝天，μL＝微升，mL＝毫升，L＝升，bp＝碱基对，mM＝毫摩尔，μM＝微摩尔。

本发明实施例中所用的一部分基因序列通过计算机从NCBI(美国国立生物技术信息中心)检索网站或从购买携带相应基因的商业化质粒的公司的官方网站获得。检索各蛋白编码基因的具体网站如下：

Gluc(高斯荧光素酶)：(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAG54095.1)

hrGFP(人源化绿色荧光蛋白)：(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY613996.1)

Fluc(萤火虫荧光素酶)：(http://www.promega.com/vectors/pG5luc.txt)

Gal4：(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_001148？report＝genbank&from＝79711&to＝ 82356&strand＝true)

VP16(单纯疱疹病毒颗粒蛋白16)：(http://www.promega.com/vectors/pACT.txt)

NF-κB p65：(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/23958349？report＝GenBank)

VIVID(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF338412.1)

Phototropin1(向光素1)：(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/2754822？report＝ genbank&log$＝nucltop&blast_rank＝1&RID＝P49RPCAR01S)

Aureochrome1(金色素1)：(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB252504.1)

Gcn4(酵母通用控制蛋白4)：(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_001137？report＝ genbank&from＝138918&to＝139763&strand＝true)

LacI(乳糖操纵子阻遏蛋白)：(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000913？report＝ genbank&from＝365652&to＝366734&strand＝true)

LexA：(http://biocyc.org/ecoli/sequence？type＝GENE&object＝EG10533)

EYFP(增强型黄色荧光蛋白)：(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/37551795)

本发明实施例中所用的另一部分基因序列均通过计算机从NCBI(美国国立生物技术信息中心)或Uniprot(全球蛋白资源数据库)检索网站查询其氨基酸序列后，利用DNA design 2.0软件将氨基酸序列按照宿主细胞种属密码子偏好性转换成核苷酸序列。检索各蛋白编码基因的具体网站如下：

cI(λ操纵子阻遏蛋白)(http://www.uniprot.org/uniprot/P03034)

TetR(Tn10B class，四环素阻遏物)(http://www.uniprot.org/uniprot/P04483)

mCherry(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY678264.1)

实施例所用方法

(一)聚合酶链式反应(PCR)：

1.目的片段扩增PCR：

扩增步骤(bp表示扩增片段的核苷酸数量)：

2.长片段(＞2500bp)扩增PCR：

扩增步骤(bp表示扩增片段的核苷酸数量)：

或者

(二)核酸内切酶酶切反应：

1.对质粒载体进行双酶切的体系(n代表使体系达到总体积所需要加入的灭菌超纯水μL量)：

2.对PCR产物片段进行双酶切的体系(n含义同上)：

3.将双酶切后PCR产物片段连接入双酶切后的质粒载体成环的体系：

注：PCR产物片段与载体双酶切产物的质量比大致在2∶1-6∶1之间。

(三)DNA片段5’端磷酸化反应然后自身环化反应：

从微生物中抽提出的质粒或者基因组末端都含有磷酸基团，而PCR产物没有，故需对PCR产物的5’端碱基进行磷酸基团加成反应，只有末端含有磷酸基团DNA分子才能发生连接反应。自身环化连接反应指线性化载体的3’端和5’端连接反应。

T4PNK为T4多聚核苷酸激酶的简写，用于对DNA分子的5’端磷酸基团的加成反应。使5’端磷酸化的DNA片段产物自身环化的反应体系：

(四)同源重组连接反应

按照CloneEZ克隆试剂盒，南京金斯瑞生物科技有限公司，原金思特科技(南京)有限公司说明书操作：PCR产物片段扩增时在两侧加入了15bp与线性化载体两侧的15bp核酸序列同源的核苷酸序列，扩增得到的PCR产物两侧15bp核苷酸序列与线性化载体序列两侧核苷酸序列同源，在同源重组酶的作用下，PCR产物片段与线性化载体同源重组连接成环状(见图2)。

注：n值视PCR产物片段的大小而不同，小于1kb时n＝4，1-2kb时n＝6，2-3kb时n＝8，大于3kb时n＝10。

(五)重叠PCR

重叠PCR(overlapping PCR)是常用的将两段不同或相同的基因连接起来的方法。例如图1，将基因AD和基因BC连接起来，首先设计两对引物A、D和C、B，分别用来扩增基因AD和BC，在引物D和引物C的5’端含有一定长度的互补序列。第一轮PCR得到的扩增产物AD和BC经过回收后作为第二轮PCR的模板。

第二轮按常规PCR流程扩增10轮，PCR体系为：

第二轮PCR后加入引物A和引物B，再继续扩增30轮即可得到AD和BC连接了的序列。

(六)反向PCR

反向PCR是下述实施例中用于定点突变、截短突变、插入突变所用的技术。其基本原理参考Takara公司MutaBEST试剂盒说明书写的实验流程。如图3所示，按预定的突变部位设计反向PCR引物，其中一条引物的5’端包含突变的核苷酸序列。用琼脂糖凝胶电泳回收纯化反向PCR扩增产物，再如上面所述进行5’端磷酸化反应然后自身环化，用其转化感受态宿主细胞。

(七)感受态细胞的制备与转化

所有用于感受态细胞制备的溶液和耗材均经过高温高压灭菌处理。

1.挑取单菌落(如Mach1)接种于5mL LB培养基中，37℃摇床过夜。

2.取0.5-1mL过夜培养的菌液转种到50mL LB培养基中，37℃，220rpm/min培养3至5h，直到OD600达到0.5。

3.冰浴预冷细胞2h。

4.4℃4000rpm/min离心10min。

5.弃上清，用5mL预冷的重悬缓冲液悬浮细胞，待均匀后再加入重悬缓冲液至终体积为50mL。

6.冰浴45min。

7.4℃4000rpm/min离心10min，用5mL冰预冷的储存缓冲液重悬细菌。

8.每个EP管中放100μL菌液，-80℃或液氮冻存。

重悬缓冲液：CaCl₂(100mM)、MgCl₂(70mM)、NaAc(40mM)

储存缓冲液：0.5mL DMSO、1.9mL 80％甘油、1mL 10×CaCl₂(1M)、1mL10×MgCl₂(700mM)、1mL 10×NaAc(400mM)、4.6mL ddH2O

转化

1.取100μL感受态细胞于冰浴上融化。

2.加入适当体积的连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30min。通常加入的连接产物的体积少于感受态细胞体积的1/10。

3.将菌液放入42℃水浴中热激90秒，迅速转移至冰浴中放置5min。

4.加入500μL LB培养基，于37℃恒温摇床上200rpm培养1h。

5.将菌液4000rpm/min离心3min，留200μL上清将菌体吹匀，均匀涂布于含适当抗生素的琼脂平板表面，平板于37℃恒温培养箱内倒置过夜。

(八)哺乳动物细胞的培养和瞬时转染

以下实施例中采用的宿主细胞系有：人胚肾上皮细胞293(HEK293细胞)、非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7)和小鼠成纤维细胞(NIH3T3)，这三种细胞均为贴壁细胞。在CO₂培养箱中用含10％胎牛血清(FBS)及链霉素和青霉素高糖培养基(DMEM)培养细胞，生长达到80-90％汇合度时将细胞传代培养。传代培养的方法如下，以100mm直径的培养皿中的细胞为例，吸弃旧培养基，加入5mL的磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，吸弃PBS后，用0.5mL的0.25％的胰蛋白酶消化约1-5min，轻拍培养皿，当几乎全部细胞都脱落时加入2.5mL培养基中和，再将1mL细胞悬液加入到新的含有9mL培养基的100mm的培养皿中，进行传代培养维持生长。

瞬时转染：用于瞬时转染的哺乳动物细胞在转染前一天取细胞接种48孔板或培养皿，接种无酚红含10％FBS的无抗生素高糖DMEM培养基。培养12-16h至细胞汇合度为90-95％时进行转染。转染以48孔板为例，先取含有本发明转录因子基因的质粒和含报告蛋白基因的质粒各0.1μg加入25μL opti-mem培养基中，再加入0.6μL脂转染胺(Lipofectamine2000)和25μL opti-mem培养基，混合均匀后孵育20min形成转染复合物，最后取50μL转染复合物加入到汇合细胞中继续培养。每次实验，为了检测转染是否成功及转染效率，均设对照培养板，用同样的转染方法将含非荧光蛋白报告基因质粒和pEGFP-N1质粒共转染，通过荧光显微镜观察细胞的荧光蛋白表达，表达荧光蛋白的细胞数占细胞总数的百分比即为双质粒转染效率。相同转染方法的转染效率因细胞种类而异，如HEK293细胞用Lipofectamine2000转染效率通常能达到90％以上。由于一次实验时每孔加入质粒的及转染试剂的量相同，故可认为所有样品的转染效率相等，具有可比性。

稳定转染：稳定转染可使导入核苷酸序列稳定整合入细胞基因组中而永久存在。采用与瞬时转染相同的方法，在24孔板中转染宿主细胞，转染48h后，取细胞传代接种100mm直径培养皿，24h后加入筛选抗生素(视质粒所携带抗性基因而定)。例如，携带新霉素抗性基因的质粒，用G418选择转染了该质粒的存活细菌克隆，未转染细胞则死亡。加入的抗生素量视细胞种类不同而异，每2天换液一次。抗生素筛选周期视抗性基因不同而异，例如用G418筛选需要2-3周。由于导入的核苷酸序列整合入基因组是随机的，而且未必是完整的序列，因而对存活细胞需作进一步筛选。计数存活细胞后用培养基稀释传代接种96孔板，每孔40-50个细胞以保证每孔1个细胞或没有细胞。次日用显微镜寻找只有一个细胞的孔并标记，继续用半量浓度的抗生素培养10天。待单细胞长成细胞团传代接种24孔板，再取样用免疫印迹、RT-PCR等方法鉴定各孔细胞是否含有目的基因。

(九)哺乳动物细胞内目的蛋白(Fluc、Gluc)表达的检测方法

在质粒转化宿主细胞后预定时间开始光照。光源为196个小灯泡发出的LED蓝光(460nm-470nm)，从培养板孔下方进行连续照射，用日本和光公司的光度计测定一般光照强度约为0.8W/cm²。也可采用不连续光照，将LED电源连接到数字时间继电器上，用继电器定时开关控制光照频率和光照总量，例如每30s光照1s，或其它光照频率。同时设置以相同方法转染细胞后锡箔纸包裹在相同条件下避光培养(黑暗不光照)的对照。

(1)活性萤火虫荧光素酶(Fluc)蛋白表达的检测

Fluc能与D-荧光素(D-luciferin)结合然后催化ATP转变成AMP，，同时释放波长为562nm的光，该光强度反映了Fluc的酶活性水平。按J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译：《分子克隆实验指南》(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京，549-551页所述方法进行Fluc活性水平测定。

用蓝光照射48孔板中的转染细胞20-48h后，吸弃培养基，用磷酸缓冲液(PBS)洗2次，每孔加入70μL Fluc裂解液震荡1-2min，移至EP试管中离心去除沉淀，取细胞裂解上清液。在Grenier公司的384白色发光板孔中每孔加入10μL裂解上清液和15μL活性分析缓冲液混匀。各孔加入15μL D-荧光素溶液后立即在Bio-tek公司的多功能酶标仪中读取总发光值，仪器灵敏度设置为160。同样方法处理放置黑暗处的不光照细胞孔板。用以下公式通过读出的相对发光单位(RLU)计算出诱导表达倍数(相对发光单位指用同一仪器在相同设置下测定的发光单位)。

诱导表达倍数(Ratio)＝光照细胞裂解上清液平均RLU/黑暗细胞裂解上清液平均RLU

Fluc活性分析缓冲液：15mM磷酸钾(pH 7.8)、25mM双甘氨肽、15mM MgSO₄、4mM EGTA、2mM ATP

Fluc裂解液：25mM双甘氨肽(pH 7.8)、15mM MgSO4、4mM EGTA、1％TritionX-100

D-荧光素溶液：25mM双甘氨肽(pH 7.8)、15mM MgSO4、4mM EGTA、0.2mM D-荧光素钾盐(Synchem公司)

(2)活性高斯荧光素酶(Gluc)蛋白表达的检测

原理：表达的Gluc酶蛋白是一种分泌型蛋白，它能催化其底物腔肠素氧化并发出480nm波长的光而无需ATP的存在，我们采用NEB公司的Gluc活性检测试剂盒按其说明书进行测定。Gluc的样品采集不需要对细胞进行裂解，而是直接取上清液，立即测定或4℃保存1周内测定，由于Gluc的检测灵敏度很高，通常需用DMEM培养基稀释样品2-100倍，使读取值不超出仪器检测的线性范围。现用现配Gluc活性测定工作液，测活前每100μL反应缓冲液中加入1μL腔肠素，将10μL未稀释或稀释后的样品加入384孔白板中，再加入10μL Gluc活性测定工作液后立即放入Bio-tek公司的多功能酶标仪中读取总发光值。可用读取的相对发光单位(RLU)来比较Gluc蛋白表达水平。Gluc蛋白诱导表达倍数的计算公式和方法与Fluc相同。

(十)酵母菌的培养和质粒转化：

酵母菌的培养：

分别用YPD、YPDA培养基和相应营养缺陷的SC培养基(均为本研究室配制经，其中的D-葡萄糖和酵母氮碱经0.22μm滤膜除菌，其他经高温高压除菌)培养酿酒酵母菌株BY4741和AH109。

YPD培养基成分(1L)：20g细菌蛋白胨(Bacteriological Peptone)，10g酵母提取物(Yeast Extract)和20g D-葡萄糖(D-Glucose)。

YPDA培养基成分(1L)：20g细菌蛋白胨(Bacteriological Peptone)，10g酵母提取物(Yeast Extract)、20g D-葡萄糖(D-Glucose)和0.03g腺嘌呤(Adenine)。

SC培养基成分(1L)：

6.7g酵母氮碱，0.1g腺嘌呤，0.1g精氨酸，0.1g半胱氨酸，0.1g亮氨酸，0.1g赖氨酸，0.1g苏氨酸，0.1g色氨酸，0.1g尿嘧啶，0.1g缬氨酸，0.05g天冬氨酸，0.05g组氨酸，0.05g异亮氨酸，0.05g甲硫氨酸，0.05g苯丙氨酸，0.05g脯氨酸，0.05g丝氨酸，0.05g酪氨酸，20g D-葡萄糖。

此外，20g的葡萄糖也可换成20g半乳糖+10g棉籽糖。

酵母菌的质粒转化：采用聚乙二醇/乙酸锂(PEG/LiAc)方法，用质粒转化BY4741或AH109酿酒酵母细胞。采用相应营养缺陷的SC培养基筛选成功转化了质粒的细胞克隆，只有转入目的质粒的酵母细胞才能在相应营养缺陷的SC平板上生长。

转化用的溶液(均已高温高压灭菌)为：

10×TE缓冲液：0.1M Tris-HCl，10mM EDTA，pH 7.5.

10×LiAc缓冲液：1M LiAc，PH 7.5

50％PEG：100mL去离子水中溶解50g PEG3350

1×TE/LiAc缓冲液：8mL去离子水+1mL 10×TE缓冲液+1mL 10×LiAc缓冲液

PEG/LiAc缓冲液：8mL 50％PEG+1mL 10×TE缓冲液+1mL 10×LiAc缓冲液

PEG/LiAc方法转化酿酒酵母细胞步骤如下：

1.从原始的BY4741或AH109培养平板(3个月以内的)上挑取单个菌落(克隆)接种含5mL新鲜YPD(AH109用YPDA)的试管，30℃250rpm培养过夜。

2.取5mL过夜培养菌液接种含50mL新鲜YPD(AH109用YPDA)的锥形瓶培养，菌液的起始OD600控制在0.2-0.3。

3.30℃250rpm培养2-4小时后，当菌液OD600为0.4-0.6时，10000rpm离心5min收菌，弃上清液，用50mL 1×TE重悬酵母细胞，10000rpm离心5min，再用2mL1×TE/LiAc缓冲液重悬酵母细胞。将酵母菌悬浮液分装到1.5mL离心管中，每管0.1mL，30℃静置10min。

4.向离心管中加入0.5μg待转化质粒，用枪头吹打混合均匀；加入600μL PEG/LiAc缓冲液用振荡器混合均匀，30℃摇床200rpm培养30min；加入70μL DMSO用枪头轻轻吹打均匀。

5.置42℃水浴热激15min。冰上放置2min后12000rpm离心5s；弃去上清液用1×TE缓冲液重悬细胞，如此重复一次。用100μL 1×TE缓冲液重悬细胞，均匀涂布相应营养缺陷SC固体培养板上，30℃培养3-5天。

(十一)酵母菌表达的EYFP荧光蛋白的检测

从转化酵母菌板上分别挑取相应的单克隆接种含5mL新鲜SC培养基的试管，黑暗中30℃摇床240rpm培养过夜。第二天分别吸取每管克隆菌液500μL接种两支各含有4.5mL新鲜YPDA培养基的试管，一支用蓝光照射，一支用锡箔纸包裹为黑暗对照，30℃度摇床240rpm培养至细菌生长到OD600＝0.8-1.0时(对数生长期)，各取500μL菌液移入1.5mL离心管中，4000rpm离心5min去除上清，用1mL PBS重悬细胞；再如此用PBS洗涤一次，用PBS重悬至OD600＝0.5左右(为使后面的荧光测定更准确)。光照与黑暗对照各取3份，每份100μL酵母菌PBS悬液加入96孔黑板，置Biotek公司的多功能酶标仪中测定EYFP荧光值，激发光波长485nm，荧光发射波长为528nm，计算平均值。

(十二)酵母菌表达的活性β-半乳糖苷酶(LacZ)的检测

本发明中使用的AH109酿酒酵母细胞是Clontech公司的一种专门用于酵母双杂交系统的商业化菌株，其基因组中整合了含有LacZ报告基因的靶转录单元，它的表达也是受Gal4转录因子的调节，因此可以使用AH109细胞本身的LacZ为报告基因来检测本发明的重组光敏转录因子。

原理：β-半乳糖苷酶能裂解无色的化合物O-硝基苯-β-D-半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactoside，ONPG)产生半乳糖和一种黄色产物O-硝基苯，后者在420nm处有一个最大吸收值，通过测定OD420nm值可反映活性LacZ的水平。

用于检测的溶液：

Z缓冲液：1L去离子水中溶解16.1g Na₂HPO ₄·7H₂O、5.5g NaH₂PO ₄·H ₂O、0.75g KCl、0.246g MgSO₄·7H₂O，pH 7.0

含β-巯基乙醇的Z缓冲液：100mL Z缓冲液中加入0.27mL β-巯基乙醇原液ONPG反应液：用Z缓冲液溶解的4mg/mL ONPG

反应终止液：1M NaCO₃

检测步骤：

从转化酵母菌板上分别挑取相应的单克隆接种含5mL新鲜SC培养基的试管，黑暗中30℃摇床240rpm培养过夜。第二天分别吸取每管克隆菌液500μL接种两支各含有4.5mL新鲜YPDA培养基的试管，一支用蓝光照射，一支用锡箔纸包裹为黑暗对照，30℃度摇床240rpm培养至细菌生长到OD600＝0.6-1.0左右时(对数生长期)，取样准确测定其OD600值。然后分别取黑暗和光照培养的1.5mL菌液移入2.0mL离心管，10000rpm离心5min。弃去上清，加入1mL Z缓冲液重悬细菌，再10000rpm离心5min，弃去上清，用100μL Z缓冲液重悬细菌。将重悬菌液放-80℃冷冻10min，然后置37℃水浴30-60s使其融化。如此冻-融循环5次裂解酵母细胞释放LacZ酶。在裂解菌液中加入含β-巯基乙醇的700μL Z缓冲液，再加入160μL ONPG反应液。混匀后置30℃反应约2h生成黄色产物后，加入400μL反应终止液；混匀后12000rpm离心5min。吸取200μL上清加入96孔板中，测定420nm吸光值，每个样品各设置2孔。以100μL Z缓冲液代替100μL菌体悬浮液为空白对照。

按照以下公式计算活性β-半乳糖苷酶(LacZ)相对水平：

活性LacZ相对水平＝1,000×OD 420/(t×OD 600)

公式中t＝反应时间(h)，OD 600＝样品在600nm处的吸光值。

实施例1：分别构建含有以VP16或p65或KRAB为第三多肽的本发明重组光敏转录因子基因的哺乳动物细胞表达载体

本实施例构建的质粒示意图见图4。以PCR法，采用以下引物P1、P2扩增商品化购得的pBIND质粒(Promega公司)中的Gal4(其DNA结合结构域中的一段，1-65位氨基酸)基因；采用以下引物P3、P4扩增pACT质粒(Promega公司)中VP16转录激活结构域基因。VIVID是链孢酶中的基因，用Trizol试剂盒(购自Invitrogen公司)提取链孢酶的全基因组后，用以下引物P5、P6扩增其中的VIVID基因。所得VIVID基因带有两个内含子序列，采用以下引物P7、P8和P9、P10，以反向PCR扩增除去该内含子序列，得到cDNA序列(见序列21)。反向PCR的方法详见图3。通过重叠PCR法将这三个Gal4、VIVID-36和VP16基因连接在一起(重叠PCR结果见图8)，然后通过Eco47III和BsrGI双酶切连接入pEGFP-N1质粒载体(Clontech公司)中，得到的哺乳动物细胞表达质粒命名为pGAVV(WT)，其包含重组光敏转录因子Gal4-VIVID-VP16融合蛋白基因(融合蛋白简写为GAVV(WT)，其核酸和氨基酸序列为序列3和序列4)，其中VIVID为去除了1-36位氨基酸的截短体，后面的实施例的所有融合蛋白中的VIVID均为截短体VIVID-36，将不再说明。重叠PCR方法构建时，Gal4与VIVID之间有一个BglII酶切位点，VIVID与VP16之间有一个EcoRI酶切位点。

扩增Gal4基因的引物为：

上游引物(P 1)：5’-CTTTTGGATCCAAGCGCTATGAAGCTACTGTCTTCTATC GAACA-3’

下游引物(P2)：5’-AGATCTGGTGGCGATGGATCTTTCCAGTCTTTCTAGCCTTGATTC-3’

扩增VP16基因的引物为：

上游引物(P3)：5’-CAGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTGAATTCCCGGGGATCTCGAC-3’

下游引物(P4)：5’-AGAAATTCGAATGTACATGGCGATCCCGGACCC-3’

扩增VIVID基因的引物为：

上游引物(P5)：5’-AGATCCATCGCCACCAGATCTCATACGCTCTACGCTCCCG-3’

下游引物(P6)：5’-TCTGGAACATCGTATGGGTACTGCAGTTCCGTTTCGCACTGGAAAC-3’

去除VIVID内含子序列的2组引物分别为：

去除内含子1：

上游引物(P7)5’-CAATACCACTATGACCCTCGAACCGCGCCC-3’

下游引物(P8)：5’-CTGATACGCCTCAACCTCCCATGGGTTCAT-3’

去除内含子2：

上游引物(P9)5’-ATTCAGATTATGAACAGGCCAAACCCCC-3’

下游引物(P10)：5’-CAGATAGCCCATAATGTCATAACCGCCG-3’

为构建以p65转录激活结构域为第三多肽的重组光敏转录因子基因，先用Trizol试剂(Invitrogen公司)按照说明书的方法提取HEK293细胞中总mRNA，用ImpromII逆转录酶(Promega公司)将该mRNA逆转录成cDNA，再用引物P11和P12扩增NF-κB p65基因中p65AD(PCR结果见图9)，然后用EcoRI和BsrGI双酶切上面构建的pGAVV(WT)质粒，将其中的VP16基因替换成p65AD基因，构建含有融合蛋白Gal4-VIVID-p65重组基因的(融合蛋白简写为GAVP(WT)，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列31和32)哺乳动物细胞质粒命名为pGAVP(WT)，WT是野生型意思。

扩增p65基因的引物为：

上游引物(P11)：5’-GAATTCCAGTACCTGCCAGATACAG-3’

下游引物(P12)：5’-TGTACATTAGGAGCTGATCTGACTCAGCAG-3’

为构建以KRAB为第三多肽的重组光敏转录因子融合蛋白Gal4-VIVID-KRAB，请上海捷瑞公司全基因人工合成KRAB基因核苷酸序列，两端各带有EcoRI和BsrGI酶切位点。用此二酶双酶切以下实施例2构建的pGAVP(C71V)质粒，直接将其中的p65AD基因替换成KRAB基因。构建含有融合蛋白-Gal4-VIVID-KRAB(C71V)简写为GAVK(C71V)，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列57和58，含该重组融合蛋白基因的质粒命名为pGAVK(C71V)。

构建完成以上质粒后，均经测序鉴定插入的序列完全正确，用转染级质粒抽提试剂盒提取质粒，用于后续转染实验。

实施例2：分别构建含有以VIVID突变体或AsLOV2或AuLOV为第二多肽的重组光敏转录因子基因的哺乳动物细胞表达载体

本实施例构建的质粒示意图见图4。用反向PCR法对VIVID基因进行定点突变。采用以下三对引物：P13和P14；P15和P16；P17和P18，以实施例1构建的pGAVP(WT)为模板用反向PCR的方法，构建VIVID中分别引入C71V或Y50W或N56K三种点突变的重组Gal4-VIVID-p65融合蛋白基因，所得哺乳动物细胞表达质粒分别命名为pGAVP(C71V)、pGAVP(Y50W)和pGAVP(N56K)质粒[缩写GAVP＝Gal4的DNA结合结构域-VIVID(缺失1-36位氨基酸和含有点突变)-p65转录激活结构域]。构建时所用的引物序列分别为：

pGAVP(C71V)：上游引物(P13)：5’-GTTGCTCTGATTCTGTGCG-3’

下游引物(P14)：5’-TGACGTGTCAACAGGTCCC-3’

pGAVP(Y50W)：上游引物(P15)：5’-GCTGATTCAGATTATGAACAGGC-3’

下游引物(P16)：5’-CAGCCCATAATGTCATAACCGC-3’

pGAVP(N56K)：上游引物(P17)：5’-GAGGCCAAACCCCCAAGTAG-3’

下游引物(P18)：5’-TTCATAATCTGAATCAGATAGCCC-3’

另外，先构建单点突变体GAVP(C71V)，经测序鉴定序列正确后，再在其基础上用同样方法进行N56K突变，构建了含双突变的pGAVP(N56K+C71V)质粒。重组GAVP(C71V)、GAVP(N56K)、GAVP(N56K+C71V)、GAVP(Y50W)融合蛋白的编码核酸序列分别为序列33、35、37、39，氨基酸序列分别为序列34、36、38、40。

为构建向光素1的LOV2结构域(简写为AsLOV2，其cDNA由美国德克萨斯大学西南医学中心达拉斯校区Gardner实验室慷慨馈赠)，采用引物P19、P20通过PCR扩增AsLOV2基因(PCR结果见图10)，然后用BglII和EcoRI双酶切实施例1构建的pGAVP(WT)质粒，将其中的VIVID基因替换成AsLOV2基因。构建的含重组Gal4-AsLOV2-p65融合蛋白基因的质粒命名为pGALP(该融合蛋白简写为GALP，其编码核酸和氨基酸序列见序列43和序列44)。

扩增AsLOV2基因的引物为：

上游引物(P19)：5’-CTTTAGATCTTTCTTGGCTACTACACTTGAAC-3’

下游引物(P20)：5’-CTTTGAATTCACCTGATCCGCCACCAAGTTCTTTTGCCGCCTC-3’

为构建金色素(Aureochrome)的LOV结构域(简写为AuLOV，其cDNA由日本滋贺县立命馆大学Hironao Kataoka实验室慷慨馈赠)，采用引物P21、P22通过PCR扩增AuLOV基因(PCR结果见图11)，然后用BglII和EcoRI双酶切实施例1构建的pGAVP(WT)质粒，将其中的VIVID基因替换成AuLOV基因。构建的含重组Gal4-AuLOV-p65融合蛋白基因的质粒命名为pGAAP(该融合蛋白简写为GAAP，其编码核酸和氨基酸序列见序列序列47和序列48)。

扩增AuLOV基因的引物为：

上游引物(P21)：5’-CTTTAGATCTCAGAATTTTGTGATAACTGAT-3’

下游引物(P22)：5’-CTTTGAATTCCACTAGCAACTTGGCGTAATC-3’

构建完成以上质粒后，均经测序鉴定插入的序列完全正确，用转染级质粒抽提试剂盒提取质粒，用于后续转染实验。

实施例3：构建含有以不同接头肽连接第一与第二多肽的重组光敏转录因子基因的哺乳动物细胞表达载体

本实施例构建的质粒示意图见图4。在实施例2构建的pGAVP(WT)基础上，对第一与第二多肽之间的接头肽进行更改。以pGAVP(WT)为模板，采用引物P25-P28通过反向PCR法，在第一多肽与第二多肽之间引入不同的接头肽。得到的哺乳动物细胞表达质粒分别命名为pGAVP(WT)-9、pGAVP(WT)-11、pGAVP(WT)-12。相应的重组GAVP(WT)-9、GAVP(WT)-11、GAVP(WT)-12融合蛋白的编码核酸序列分别为序列59、61、63，氨基酸序列分别为序列60、62、64。所用引物的序列如下：

pGAVP(WT)-9

上游引物(P23)：5’-AGATCCATCGCCACCAGATCTCATACGCTCTACGCTCCCG-3’

下游引物(P24)：5’-CTTCCAGTCTTTCTAGCCTTGATTC-3’

pGAVP(WT)-11

上游引物(P25)：5’-AGATCCATCGCCACCAGATCTCATACGCTCTACGCTCCCG-3’

下游引物(P26)：5’-GGATCCTCCACCACCTTCCAGTCTTTCTAGCCTTGATTC-3’

pGAVP(WT)-12

上游引物(P27)：5’-TCATGAACCACAGATCTCATACGCTCTACGCTCCCGGCG-3’

下游引物(P28)：5’-CTTTCTGTTTCAGGTCGTTTTCCAGTCTTTCTAGCCTTG-3’

构建完成以上质粒后，均经测序鉴定插入的序列完全正确，用转染级质粒抽提试剂盒提取质粒，用于后续转染实验。

实施例4：含有靶转录单元(其中的目的基因不同)的哺乳动物细胞表达载体的构建

本实施例构建的质粒示意图见图5。为构建含Gluc目的基因的靶转录单元，用以下所列引物通过PCR分别扩增商品化购得的pG5luc载体中的5×UAS_G-TATA核苷酸序列(TATA是腺病毒主要晚期启动子的简写)和商品化购得的pGluc-basic载体中的Gluc目的基因，通过重叠PCR相连接，再用NruI和BamHI酶将pcDNA3.1(+)-hygro载体中的组成型CMV启动子切除保留其余骨架，然后通过同源重组连接法将上述重叠PCR产物连接入该载体中，得到pU5Gluc质粒，其含有由5×UAS_G-TATA-Gluc目的基因序列组成的完整靶转录单元，该靶转录单元的整个序列为序列89。

如下分别构建含Fluc基因、绿色荧光蛋白hrGFP基因或含红色荧光蛋白mCherry基因的靶转录单元：

上面得到的pU5Gluc质粒中Gluc目的基因两端分别带有HindIII和BamHI酶切位点。用HindIII和BamHI双酶切商品化购得的pG5luc质粒中的Fluc基因，同时用这两种酶双酶切pU5Gluc质粒，将其中的Gluc基因替换成Fluc基因，得到pG5Fluc质粒，其含有以Fluc目的基因的完整靶转录单元5×UAS_G-TATA-Fluc。

用类似方法，采用引物P29、P30通过PCR扩增的pIRES-hrGFP质粒(Stratagene公司)中的绿色荧光蛋白hrGFP基因；另采用引物P31、P32通过PCR扩增人工合成的红色荧光蛋白mCherry基因，得到pU5hrGFP和pU5mCherry质粒，它们分别含有携带hrGFP和mCherry基因的靶转录单元5×UAS_G-TATA-hrGFP和5×UAS_G-TATA-mCherry。以Fluc或hrGFP或mCherry目的基因的靶转录单元的序列分别为序列86、87、88。

扩增hrGFP：

上游引物(P29)：5’-CTTAAGCTTGCCACCATGGTGAGCAAGCAGATCCTG-3’

下游引物(P30)：5’-CAAGGATCC TTACACCCACTCGTGCAGGC-3’

扩增mcherry：

上游引物(P31)：5’-CTTAAGCTTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’

下游引物(P32)：5’-CAAGGATCCCTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’

为构建含猿空泡病毒40(SV40)启动子的靶转录单元，采用引物P33、P34通过PCR扩增pTRIPZ质粒(Openbiosystem公司)中的SV40启动子，用KpnI单酶切pG5luc质粒，然后用同源重组连接法将SV40启动子插入pG5luc质粒中，得到反应元件上游含有SV40启动子的靶转录单元的质粒，命名为pSU5Fluc，该靶转录单元序列见序列90。

上游引物(P33)：5’-TCGATAGGTACCCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGT-3’

下游引物(P34)：5’-TCCGTCTAGAAACTCGGTACCAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGC-3’

构建完成以上质粒后，均经测序鉴定插入的序列完全正确，用转染级质粒抽提试剂盒提取质粒，用于后续转染实验。

实施例5：分别构建含有以Gal4、LexA、cI、TetR和Gcn4为第一多肽的重组光敏转录因子基因的酿酒酵母菌表达载体

本实施例构建的质粒示意图见图6。为构建含有以Gal4为第一多肽的的重组光敏转录因子Gal4-VIVID-Gal4 AD(N56K+C71V)融合蛋白基因的质粒载体，在酵母双杂交pGADT7质粒(Clontech公司)的基础上，采用引物P35、P36通过PCR扩增pGADT7去除其本身的多克隆位点(MCS区)和Gal4AD序列。采用引物P37、P38通过PCR扩增实施例2构建的pGAVP(N56K+C71V)载体中的Gal4-VIVID(N56K+C71V)基因片段，用同源重组连接技术将该Gal4-VIVID(N56K+C71V)片段插入到扩增得到的线性化pGADT7载体中，得到pGAD-GV(N56K+C71V)质粒。该质粒为中间质粒，可用于构建含有加入第三多肽(如Gal4AD)的重组光敏转录因子基因的酵母表达质粒。

同源重组实验中，去除pGADT7本身多克隆位点(MCS区)和Gal4AD序列所用引物的为：

上游引物(P35)：5’-AGGATCCTGAGCTCGAGCTGCAGATGAATC-3’

下游引物(P36)：5’-CATCTTTGCAAAGCTTGGAGTTGATTG-3’

扩增Gal4-VIVID(N56K+C71V)所用的引物为：

上游引物(P37)：5’-AGCTTTGCAAAGATG AAGCTACTGTCTTC-3’

下游引物(P38)：5’-CGAGCTCAGGATCCTTCCGTTTCGCACTGG-3’

用以下引物P39、P40(含两种不同长度接头肽的编码核苷酸序列)、P41通过PCR扩增pGADT7质粒(Clontech公司)中的GalAD基因得到含两种不同长度接头肽的Gal4 AD序列，用BamHI和XhoI对其进行双酶切连接入同样经此二酶酶切的pGAD-GV(N56K+C71V)质粒中。分别得到含有由两种不同长度接头肽(L1与L2)连接的重组Gal4-VIVID-Gal4AD-L1(N56K+C71V)和Gal4-VIVID-Gal4 AD-L2(N56K+C71V)融合蛋白基因的表达质粒pGAD-GVG-L1(N56K+C71V)和pGAD-GVG-L2(N56K+C71V)质粒。这两种融合蛋白的编码核酸序列为序列97和99，氨基酸序列为序列98和100。

扩增两种不同长度接头肽Gal4AD的上游引物序列分别为：

接头肽L1(P39)：5’-CCCGGATCCGGTGGAGGTGGCTCCAATTTTAATCAAAGTGG-3’

接头肽L2(P40)：5’-CCCGGATCCGGCGGTGGTGGATCAGGTGGAGGTGGCTCCAAT-3’

下游引物均为(P41)：5’-GGGCTCGAGTTACTCTTTTTTTGGGTTTGGTG-3’

采用引物P42、P43对pGADT7载体进行PCR扩增，得到的线性化质粒片段中缺失了PADH1启动子序列，利用引物P44和P45从pZF1/2-FRET质粒(由美国麦迪逊城市的威斯康星大学的David J.Eide实验室慷慨赠送)上扩增PMA1启动子基因片段，再利用同源重组连接技术将PMA1启动子基因片段连接到线性化的pGADT7载体上，经改造后的载体命名为pGPMA，该载体有着启动能力更强的PMA1启动子，它可提高转录因子融合蛋白的表达量。在此pGPMA载体基础上构建以下质粒：先用P46和P47引物通过PCR扩增此载体，之后采用构建上述pGAD-GV(N56K+C71V)质粒相同的方法，用同源重组连接技术将Gal4-VIVID(N56K+C71V)基因片段插入到该pGPMA载体中，得到含重组Gal4-VIVID(N56K+C71V)融合蛋白基因的pGPMA-GV(N56K+C71V)中间质粒，以便构建后面的酵母表达质粒。

为观察含有不同接头肽的该重组光敏转录因子在实验中的效果，以便筛选出效果较好的接头肽进行之后的实验，采用含6种不同长度接头肽编码核苷酸序列的引物P48-P54，通过PCR扩增pGAD-GV(N56K+C71V)质粒中的Gal4AD序列，用BamHI和XhoI双酶切扩增序列使之与同样经此二酶切的pGPMA-GV(N56K+C71V)质粒相连接，分别得到含六种不同长度接头肽(L1、L2、L3、L4、L5或L6))的重组Gal4-VIVID-Gal4AD-Ln(N56K+C71V)融合蛋白基因的质粒载体，分别命名为：

pGPMA-GVG-L1(N56K+C71V)

pGPMA-GVG-L2(N56K+C71V)

pGPMA-GVG-L3(N56K+C71V)

pGPMA-GVG-L4(N56K+C71V)

pGPMA-GVG-L5(N56K+C71V)

pGPMA-GVG-L6(N56K+C71V)

各融合蛋白的编码核苷酸序列分别为序列97、99、101、103、105和107；氨基酸序列分别为序列98、100、102、104、106和108。

扩增pGADT7载体使其线性化的引物为：

上游引物(P42)：5’-AGCTTTGCAAAGATGGCCATGGAGGCCAGTGA-3’

下游引物(P43)：5’-CATGCAAGCAACGAAGCATCTGTGCTTCATTTTG-3’

扩增PMA1启动子基因片段的引物为：

上游引物(P44)：5’-TTCGTTGCTTGCATGGCCAAGCTTCCTGAAAC-3’

下游引物(P45)：5’-CATCTTTGCAAAGCTGCTGGGGTATATTTTTTTTC-3’

扩增pGPMA载体使其线性化的引物为：

上游引物(P46)：5’-AGGATCCTGAGCTCGAGCTGCAGATGAATC-3’

下游引物(P47)：5’-CATCTTTGCAAAGCTGCTGGGGT-3’

扩增Gal4AD所用的含6种不同长度接头肽编码核苷酸序列的上游引物不同，它们的序列如下：

接头肽L1-(P48)：5’-CCCGGATCCGGTGGAGGTGGCTCCAATTTTAATCAAAGTGG-3’

接头肽L2-(P49)：5’-CCCGGATCCGGCGGTGGTGGATCAGGTGGAGGTGGCTCCAAT-3’

接头肽L3-(P50)：5’-CCCGGATCCGGTGGATCAGGTGGAGG-3’

接头肽L4-(P51)：5’-CCCGGATCCGGAAGCGGCGGTGGTGGATCAGG-3’

接头肽L5-(P52)：5’-CCCGGATCCGGTGGCGGCGGAAGCGGCGGTGGTG-3’

接关肽L6-(P53)：5’-CCCGGATCCGGCGGAGGTGGGGGCTCCGGTGGCGGCGGAAG-3’

下游引物均为(P54)：5’-GGGCTCGAGTTACTCTTTTTTTGGGTTTGGTG-3’

为构建以LexA为第一多肽的重组光敏转录因子NLS-LexA-VIVID-Gal4AD(N56K+C71V)(简写为NLVG(N56K+C71V))融合蛋白基因的表达载体，用以下引物P55和P56从大肠杆菌BL21(DE3)基因组中扩增LexA(1-87)基因片段(PCR结果见图12)，利用引物P57和P58从实施例2构建的pGAVP(N56K+C71V)载体中扩增VIVID(N56K+C71V)基因片段，再利用重叠PCR将LexA(1-87)和VIVID(N56K+C71V)连接起来得到LexA-VIVID(N56K+C71V)基因片段。用引物P59和P60通过PCR扩增pGADT7质粒(Clontech公司)中的SV40核定位信号肽(NLS)基因片段，再用重叠PCR法将LexA-VIVID(N56K+C71V)基因片段与NLS基因片段相连，得到NLS-LexA-VIVID(N56K+C71V)基因片段。用引物P61和P62扩增本实施例构建的pGPMA-GVG-L2(N56K+C71V)载体，用EcoRI和BamHI双酶切得到的线性化载体，使之与同样经此二酶酶切的NLS-LexA-VIVID(N56K+C71V)片段相连，得到pGPMA-NLVG(N56K+C71V)表达载体，该载体含有重组NLVG(N56K+C71V)融合蛋白基因，该融合蛋白的编码核酸序列和氨基酸序列分别见序列7和8。

扩增LexA(1-87)基因片段的引物为：

上游引物(P55)：5’-GGTGGCTCTGGAGGCATGAAAGCGTTAACGGCCAGGC-3’

下游引物(P56)：5’-AGATCTCGGTTCACCGGCAGCCACACG-3’

扩增VIVID(N56K+C71V)基因片段的引物为：

上游引物(P57)：5’-GGTGAACCGAGATCTCATACGCTCTACGCTCCC-3’

下游引物(P58)：5’-CGAGCTCAGGATCCTTCCGTTTCGCACTGG-3’

扩增NLS基因片段的引物为：

上游引物(P59)：5’-CCCGAATTCTGCAAAGATGGATAAAGCGGAATTAATTCC-3’

下游引物(P60)：5’-GCCTCCAGAGCCACCACCGGCGGCGGTACCC-3’

扩增pGPMA-GVG-L2(N56K+C71V)质粒使其线性化的引物为：

上游引物(P61)：5’-CCCGGATCCGGCGGTGGTGGATCAGG-3’

下游引物(P62)：5’-CCCGAATTCGCTGGGGTATATTTTTTTTC-3’

为在酿酒酵母细胞内表达以LacI为第一多肽的重组光敏转录因子NLS--LacI-VIVID-Gal4 AD(N56K+C71V)(简写为NLcVG(N56K+C71V))，需要构建相应的酿酒酵母菌表达载体。用以下引物P63和P64通过PCR扩增商品化pCDFDuet1载体(Novagen公司)中LacI的DNA结合结构域(1-62位氨基酸)基因片段(PCR结果见图13)，另用引物P65和P66通过PCR扩增商品化pGADT7载体中的NLS基因片段，再用重叠PCR法将LacI基因片段与NLS基因片段相连，用EcoRI和BglII双酶切得到的NLS-LacI基因片段使之相连入同样经此二酶酶切的本实施例构建的pGPMA-NLVG(N56K+C71V)载体中。得到的表达载体命名为pGPMA-NLcVG(N56K+C71V)，该质粒含有重组光敏转录因子NLcVG(N56K+C71V)融合蛋白基因，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列11和12。

扩增LacI的DNA结合结构域基因片段的引物为：

上游引物(P 63)：5’-GGCTCTGGAGGCATGAAACCAGTAACGTTATAC-3’

下游引物(P64)：5’-CCCAGATCTCAACGACTGTTTGCCCGCC-3’

扩增NLS基因片段的引物为：

上游引物(P65)：5’-CCCGAATTCATGGATAAAGCGGAATTAATTCC-3’

下游引物(P66)：5’-CCTCCAGAGCCACCGAACCGGCGGCGGTACCC-3’

为构建cI为第一多肽的重组光敏转录因子NLS-cI-VIVID-Gal4 AD(N56K+C71V)融合蛋白基因的质粒载体，用以下引物P67和P68通过PCR扩增由上海捷瑞生物有限公司全基因合成的cI的DNA结合结构域(1-102位氨基酸)基因片段(PCR结果见图14)。另用引物P69和P70通过PCR扩增商品化pGADT7质粒中的NLS基因片段，再用重叠PCR法将cI基因片段与NLS基因片段相连。用EcoRI和BglII双酶切得到的NLS-cI基因片段使之相连入同样经此二酶酶切的本实施例构建的pGPMA-NLVG(N56K+C71V)载体中，得到的表达载体命名为pGPMA-NCVG(N56K+C71V)，该载体含有重组光敏转录因子NCVG(N56K+C71V)融合蛋白基因，该转录因子的编码核酸和氨基酸序列分别为序列19和20。

扩增cI的DNA结合结构域基因片段的引物为：

上游引物(P67)：5’-GGTGGCTCTGGAGGCATGTCTACCAAGAAGAAAC-3’

下游引物(P68)：5’-CCCAGATCTATATTCTGACCTCAAAGACG-3’

扩增NLS基因片段引物为：

上游引物(P 69)：5’-CCCGAATTCTGCAAAGATGGATAAAGCGGAATTAATTCC-3’

下游引物(P70)：5’-GCCTCCAGAGCCACCACCGGCGGCGGTACCC-3’

为了构建含重组光敏转录因子NLS-TetR-VIVID-Gal4 AD(N56K+C71V)(简写为NTVG(N56K+C71V))融合蛋白基因的质粒载体，用以下引物P71和P72通过PCR扩增由上海捷瑞生物有限公司全基因合成的TetR的DNA结合结构域基因片段(1-63位氨基酸)基因片段(PCR结果见图15)。另用引物P73和P74通过PCR扩增商品化pGADT7质粒中的NLS基因片段，用重叠PCR法将TetR基因片段与NLS基因片段相连。用EcoRI和BglII双酶切得到的NLS-TetR基因片段后使之相连入经同样双酶切的本实施例构建的pGPMA-NLVG(N56K+C71V)载体中，得到的表达载体命名为pGPMA-NTVG(N56K+C71V)，该载体含有重组光敏转录因子NLS-TetR-VIVID-Gal4AD(N56K+C71V)融合蛋白基因，该融合蛋白简写为NTVG(N56K+C71V)，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列15和16。

扩增TetR的DNA结合结构域基因片段的引物为：

上游引物(P 71)：5’-GGTGGCTCTGGAGGCATGTCTAGGCTAGATAAG-3’

下游引物(P72)：5’-CCCAGATCTGGTGCCGTGTCTATCCAGCATCTC-3’

扩增NLS基因片段引物为：

上游引物(P73)：5’-CCCGAATTCTGCAAAGATGGATAAAGCGGAATTAATTCC-3’

下游引物(P74)：5’-GCCTCCAGAGCCACCACCGGCGGCGGTACCC-3’

构建完成以上质粒后，均经测序鉴定插入的序列完全正确，用转染级质粒抽提试剂盒提取质粒，用于后续酵母菌转化实验。

实施例6：分别构建含有以VIVID突变体和AsLOV2为第二多肽的重组光敏转录因子基因的酿酒酵母菌表达载体。

本实施例构建的质粒示意图见图6。为构建含有以VIVID突变体为第二多肽的重组光敏转录因子融合蛋白基因的表达载体，用BglII和BamHI双酶切实施例5构建的pGPMA-GVG-L2(N56K+C71V)载体，去除其中的VIVID(N56K+C71V)基因片段，然后分别以实施例3构建的pGAVP(WT)、pGAVP(C71V)、pGAVP(Y50W)为模板，用以下引物对P75和P76通过PCR扩增其中的VIVID(WT)、VIVID(C71V)、VIVID(Y50W)基因片段，使之相连入切除了VIVID(N56K+C71V)基因片段的pGPMA-GVG-L2(N56K+C71V)载体中，分别得到pGPMA-GVG(WT)、pGPMA-GVG(C71V)和pGPMA-GVG(Y50W)表达载体，它们分别包含重组的Gal4-VIVID-Gal4AD(WT)(简写为GVG(WT))、Gal4-VIVID-Gal4AD(C71V)(简写为GVG(C71V))和Gal4-VIVID-Gal4AD(Y50W)(简写为GVG(Y50W))融合蛋白基因，它们的编码核酸序列分别为序列113、115、117，氨基酸序列分别为序列114、116、118。

扩增VIVID基因片段或其突变体基因片段所用的引物序列为：

上游引物(P75)：5’-GGGAGATCTCATACGCTCTACGCTCCCG-3’

下游引物(P76)：5’-CGAGCTCAGGATCCTTCCGTTTCGCACTGG-3’

为构建含有以AsLOV2为第二多肽的重组光敏转录因子Gal4-AsLOV2-Gal4AD(简写为GLG)融合蛋白基因的表达载体，用BglII和BamHI双酶切实施例5构建的pGPMA-GVG-L2(N56K+C71V)载体，去除其中的VIVID(N56K+C71V)基因片段，然后以实施例2构建的pGALP为模板，用以下引物对P77和P78通过PCR扩增其中的AsLOV2基因片段，使之相连入切除了VIVID(N56K+C71V)基因片段的pGPMA-GVG-L2(N56K+C71V)载体中，得到的表达载体命名为pGPMA-GLG，该载体含有重组光敏转录因子GLG融合蛋白基因，该融合蛋白的编码核酸和氨基酸序列分别为序列119和120。

用于扩增AsLOV2基因的引物为：

上游引物(P77)：5’-CCCAGATCTTTCTTGGCTACTACACTT-3’

下游引物(P78)：5’-CCCGGATCCAAGTTCTTTTGCCGCCTC-3’

构建完成以上质粒后，均经测序鉴定插入的序列完全正确，用转染级质粒抽提试剂盒提取质粒，用于后续酵母菌转化实验。

实施例7：含有以VP16或Gcn4为第三多肽的重组光敏转录因子基因的酿酒酵母表达载体的构建

本实施例构建的质粒示意图见图6。为构建含有以VP16为第三多肽的重组光敏转录因子Gal4-VIVID-VP16(N56K+C71V)(简写为GVVP(N56K+C71V))融合蛋白基因的表达载体，利用引物P79和P80通过PCR扩增实施例2构建的pGAVV(WT)载体中的VIVID-VP16(N56K+C71V)基因片段，用BglII和XhoI对其双酶切后使之连接入同样经此二酶酶切的实施例5构建的pGPMA-GVG-L2(N56K+C71V)载体中。得到的表达载体命名为pGPMA-GVVP(N56K+C71V)，它含有重组光敏转录因子GVVP(N56K+C71V)融合蛋白基因，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列109和110。

扩增VIVID-VP16(N56K+C71V)基因片段的引物为：

上游引物(P79)：5’-GGGAGATCTCATACGCTCTACGCTCCCG-3’

下游引物(P80)：5’-GGGCTCGAGTGGCGATCCCGGACCCGGG-3’

为构建含有以Gcn4为第三多肽的重组光敏转录因子Gal4-VIVID-Gcn4(N56K+C71V)(简写为GVGc(N56K+C71V))融合蛋白基因的表达载体，用引物P81和P82通过PCR扩增酿酒酵母菌BY4741基因组中Gcn4的转录激活结构域基因片段(PCR结果见图16)，另用引物P83和P84通过PCR扩增实施例5构建的pGPMA-GVG-L2(N56K+C71V)载体，得到的线性化载体片段两端含有EcoRI和XhoI酶切位点，用EcoRI和XhoI双酶切后使之与同样经此二酶酶切的Gcn4的转录激活结构域基因片段相连。得到的表达载体命名为pMPMA-GVGc(N56K+C71V)，它含有重组GVGc(N56K+C71V)融合蛋白基因，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列111和112。

扩增Gcn4的转录激活结构域基因片段的引物为：

上游引物(P81)：5’-CCCGAATTCATGTCCGAATATCAGCCAAGT-3’

下游引物(P82)：5’-GGGCTCGAGTTAGGATTCAATTGCCTTATC-3’

扩增pGPMA-GVG-L2(N56K+C71V)质粒使其线性化的引物为：

上游引物(P83)：5’-AGGATCCTGAGCTCGAGCTGCAGATGAATC-3’

下游引物(P84)：5’-CCCGAATTCGGAGCCACCTCCACCTGATCCAC-3’

构建完成以上质粒后，均经测序鉴定插入的序列完全正确，用转染级质粒抽提试剂盒提取质粒，用于后续转染实验。

实施例8：分别构建含有Gal4、LexA、cI、TetR和Gcn4相对应反应元件的靶转录单元的酿酒酵母表达载体

本实施例构建的质粒示意图见图7。为了检测以Gal4为第一多肽的本发明重组光敏转录因子对EYFP荧光蛋白基因转录的调控效果，构建了含Gal4相对应反应元件和荧光蛋白基因的靶转录单元的酿酒酵母菌表达载体。用引物P85和P86通过PCR扩增pYES2.1 TOPO质粒(Invitrogen公司)，得到的线性化质粒载体骨架含有BamHI和EcoRI酶切位点。用引物P87和P88通过PCR扩增pZF1/2-FRET质粒(由美国Madison城市的Wisconsin大学的David J.Eide实验室慷慨赠送)中的EYFP基因片段，经BamHI和EcoRI双酶切后使之相连入经同样双酶切的pYES2.1 TOPO线性化质粒中，得到含5×UAS_G-Gal1-EYFP基因的靶转录单元的酿酒酵母菌表达载体pYE-EYFP，其核苷酸序列为序列121。

扩增pYES2.1TOPO质粒使其线性化所用引物的序列为：

上游引物(P85)：5’-CCCGAATTCAGGGCGAGCTTCGAGGTCACC-3’

下游引物(P86)：5’-CCCGGATCCGGGCGAGCTTAATATTCCCTATAG-3’

扩增荧光蛋白EYFP基因所用的引物序列为：，

EYFP上游引物(P87)：5’-CCCGGATCCAAAAAAATGGTGAGTAAAGGAG-3’

EYFP下游引物(P88)：5’-GGGGAATTCTTATTTGTATAGTTCATC-3’

为了检测靶转录单元中含有不同个数Gal4反应元件对重组光敏转录因子调节EYFP基因转录的效果有无差异，构建了含有不同个数Gal4反应元件的靶转录单元的酿酒酵母菌表达质粒。在本实施例构建的pYE-EYFP载体中，靶转录单元中含有5个Gal4反应元件，即5×UAS_G。分别采用以下引物P89-P92通过PCR扩增，得到靶转录单元中分别缺失了1个、2个和4个Gal4识别/结合位点的三个pYE-EYFP表达载体，分别命名为pYE-EYFP(1×UAS_G)、pYE-EYFP(3×UAS_G)和pYE-EYFP(4×UAS_G)，它们分别含有1×UAS_G-Gal1-EYFP、3×UAS_G-Gal1-EYFP或4×UAS_G-Gal1-EYFP靶转录单元，各靶转录单元的核酸序列分别为序列122、123和124。扩增所用上游引物不同，下游引物相同，引物序列如下：

通用下游引物(P89)：5’-TACTAGTGGATCATCCCCACGCGCC-3’

上游引物1(P90)：5’-AGCGGGTGACAGCCCTCCGAAGGAAGAC-3’

上游引物2(P91)：5’-ACGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTCG-3’

上游引物3(P92)：5’-GAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCAC-3’

为检验以LexA为第一多肽的本发明重组光敏转录因子对EYFP荧光蛋白基因转录的调控效果，构建了含有LexA相对应反应元件的靶转录单元的酿酒酵母菌表达载体。采用以下引物对P93和P94通过PCR扩增本实施例构建的pYE-EYFP质粒，目的是去除pYE-EYFP质粒中的5×UAS_G序列，得到的线性化质粒片段两端含有XhoI和HindIII酶切位点，用XhoI和HindIII双酶切扩增的片段，然后将产生的DNA片段与以下双引物退火相连，得到含EYFP基因的表达载体命名为pYEL4-EYFP，它含有4×LexA UAS-Gal1-EYFP的靶转录单元，其核苷酸序列为序列125。

扩增pYE-EYFP载体使其线性化所用引物为：

上游引物(P93)：5’-CCCAAGCTTTAATGCGATTAGTTTTTTAG-3’

下游引物(P94)：5’-TAGGCTCGAGCCCACGCGCCCTGTAGCGC-3’

退火双引物为：

上游引物(P95)：5’-TCGAGGGCGTTCGTCCTCACTGTATGATCATACAGTCTGTATATATATACAGTACTGTATGATCATACAGGTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTACTGTATATATATACAGTAACAATAAAGATTCA-3’

下游引物(P96)：5’-AGCTTGAATCTTTATTGTTACTGTATATATATACAGTAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACCTGTATGATCATACAGTACTGTATATATATACAGACTGTATGATCATACAGTGAGGACGAACGCCC-3’

为了检测以LacI为第一多肽的本发明光诱导转录因子对EYFP荧光蛋白基因转录的调节效果，构建了含有LacI反应元件的靶转录单元的酿酒酵母表达载体。对本实施例中构建的pYEL4-EYFP载体进行XhoI和HindIII双酶切，然后与以下双引物P95和P96退火得到的基因片段相连，得到的含EYFP报告基因的表达载体命名为pYELc4-EYFP，它含有4×LacI UAS-Gal1-EYFP靶转录单元，其核酸序列为序列126。

退火双引物为：

上游引物(P97)：5’-TCGAG AATTGTGAGCGGATAACAATTGTAATTGTGAGCGGATAACAA TTATTTGAATTGTGAGCGGATAACAATTGTAATTGTGAGCGGATAACAATTA-3’

下游引物(P98)：5’-AGCTTAATTGTTATCCGCTCACAATTACAATTGTTATCCGCTCACAATTCA AATAATTGTTATCCGCTCACAATTACAATTGTTATCCGCTCACAATTC-3’

为了检测以cI为第一多肽的本发明重组光敏转录因子对EYFP荧光蛋白基因转录的调控效果，构建了含有cI相对应反应元件的靶转录单元的酿酒酵母菌表达载体。用XhoI和HindIII双酶切本实施例构建的pYEL4-EYFP质粒，然后与以下双引物退火得到的基因片段相连，得到含EYFP报告基因的质粒命名为pYEP_R-EYFP，它含有P_RUAS-Gal1-EYFP靶转录单元，其核苷酸序列为序列127。

退火双引物为：

上游引物(P99)：5’-TCGAGTAAATCTATCACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGA-3’

下游引物(P 100)：5’-AGCTTCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAATAGTCAACACGCACGGTGTTAGATATTTATCCCTTGCGGTGATAGATTTAC-3’

为了检测以TetR为第一多肽的本发明重组光敏转录因子对EYFP荧光蛋白基因转录的调控效果，构建了含有TetR相对应反应元件的靶转录单元的酿酒酵母菌表达载体。用XhoI和HindIII双酶切本实施例构建的pYEL4-EYFP载体，然后使得到的基因片段与以下双引物P99和P100退火相连，得到含EYFP基因的表达载体命名为pYET4-EYFP，它含有4×TetR UAS-Gal1-EYFP靶转录单元，其核苷酸序列为序列128。

退火双引物为：

上游引物(P101)：5’-TCGAG CCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTCCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTCCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTCCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTA-3’

下游引物(P102)：5’-AGCTTACTTTTCTCTATCACTGATAGGGAGTGGACTTTTCTCTATCACTGATAGGGAGTGGACTTTTCTCTATCACTGATAGGGAGTGGACTTTTCTCTATCACTGATAGGGAGTGGC-3’

实施例9：重组光敏转录因子在哺乳动物细胞中对目的基因表达的调节

以Fluc为报告基因测试了实施例构建的以VIVID及其突变体为第二多肽的重组光敏转录因子在光刺激后对目的基因表达的调节。转染前，将HEK293细胞以相同密度传代接种2块48孔板，16h后细胞汇合度达到90-95％时用实施例4构建的pU5Fluc和实施例2构建的pGAVV(WT)、或pGAVP(WT)、或pGAVP(C71V)、或pGAVP(Y50W)、或pGAVP(N56K)、或pGAVP(C71V+N56K)、或pEGFP-N1(购自Clontech公司)分别共同转染HEK293细胞，2块48孔板操作相同。然后一块板包裹锡箔纸后放入黑暗培养箱中避光培养，另一块板转染后6h，开始光照培养，光源为前面提到的蓝色LED，每30s光照1s，22h后每孔加入70μL细胞裂解液，按上面Fluc蛋白的检测方法，测定活性Fluc水平。其中，与pU5Fluc共转染的pEGFP-N1的细胞孔为不含重组转录因子只有靶转录单元的对照。结果显示，没有重组光敏转录因子的细胞孔不论黑暗还是光照，测得的相对发光强度都很低，与没有转染的细胞孔相近。表达以上几种重组光敏转录因子的细胞光照后Fluc表达量都高于黑暗细胞，表明光照后这些重组光敏转录因子可调节目的基因在细胞中的表达水平。具体显示，光照表达GAVP(WT)的细胞目的基因表达水平为黑暗细胞的13倍；光照表达GAVP(WT)的细胞Fluc表达水平比光照表达GAVV(WT)的细胞Fluc表达水平高几十倍，说明以p65AD为第三多肽的重组GAVP(WT)转录因子具有更强的转录激活能力(图17)。第二多肽为几种VIVID突变体的重组光敏转录因子GAVP(C71V)、GAVP(N56K)、GAVP(Y50W)、GAVP(N56K+C71V)导致的诱导表达倍数均不同程度高于VIVID无突变的野生型重组光敏转录因子GAVP(WT)，其中GAVP(N56K+C71V)双突变重组光敏转录因子导致的诱导表达倍数最高，可高达约200倍(图18)。以上几种以VIVID或其突变体为第二多肽的光敏转录因子，光照后均可使目的基因的表达水平上调。

以上实验用的宿主细胞都是HEK293细胞，换成其它细胞是否也能达到相似效果？本实施例又进行了这种实验。以Fluc为例，用质粒pGAVP(N56K+C71V)和质粒pU5Fluc分别共转染NIH3T3细胞或COS-7细胞。用与本实施例第一段所述相同的方法进行细胞培养、转染、光照诱导、细胞处理和表达的活性Fluc检测。结果显示，在NIH3T3细胞或COS-7细胞中，表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)的细胞，光照细胞Fluc表达水平高于黑暗细胞，即光照使表达GAVP(N56K+C71V)的细胞目的基因的表达水平上调(图19-20)。表明本发明的系统可应用于多种哺乳动物细胞。

为检验第一多肽与第二多肽之间含有不同接头肽的重组光敏转录因子光照后对目的基因表达的调节，以Fluc报告基因为例，取质粒pU5Fluc和实施例2构建的pGAVP(WT)-9或pGAVP(WT)-11或pGAVP(WT)-12共同转染HEK293细胞，用与本实施例第一段所述相同的方法进行细胞培养、转染、光照诱导、细胞处理及活性Fluc测定。结果显示，重组光敏转录因子GAVP(WT)-9、GAVP(WT)-11、GAVP(WT)-12光照后均可使细胞中的Fluc表达水平上调，但表达水平上调的倍数各不相同，其中GAVP(WT)-12的诱导表达倍数最高。(图21)。

为检验以AsLOV2为第二多肽的重组光敏转录因子在哺乳动物细胞中对目的基因表达的调节，以Fluc报告基因为例，检测了实施例2构建的重组光敏转录因子Gal4-AsLOV2-p65(简写为GALP)在光照下对基因表达的调节作用。用质粒pU5Fluc和实施例2构建的应为pGALP质粒共转染HEK293细胞，用与本实施例第一段所述相同的方法进行细胞培养、光照诱导、细胞处理及活性Fluc测定。结果显示，光照组细胞的Fluc表达水平低于黑暗组细胞，约为黑暗组细胞的一半。表明重组GALP转录因子光照后可使细胞中目的基因的表达量下调(图22)。

为检验以AuLOV为第二多肽的重组光敏转录因子在哺乳动物细胞中对目的基因表达的调节，以Fluc报告基因为例，检测了实施例2构建的重组光敏转录因子Gal4-AuLOV-p65(简写为GAAP)在光照下对基因表达的阻遏作用。用质粒pU5Fluc和实施例2构建的pGAAP质粒共转染HEK293细胞，用与本实施例第一段所述相同的方法进行细胞培养、光照诱导、细胞处理及活性Fluc测定。结果显示，光照细胞的Fluc表达水平高于黑暗细胞。表明重组GAAP转录因子光照后可使细胞中的目的基因的表达量上调(图23)。

为检验以KRAB为第三多肽的重组光敏转录因子在哺乳动物细胞中对目的基因表达的调节，以Fluc报告基因为例，检测了实施例2构建的重组光敏转录因子GAVK(C71V)在光照下对基因表达的影响。用实施例4构建的质粒pSU5Fluc和实施例1构建的pGAVK(C71V)质粒共转染HEK293细胞，用与本实施例第一段所述相同的方法进行细胞培养、光照诱导、细胞处理及活性Fluc测定。结果显示，重组光敏转录因子GAVK(C71V)光照后可使细胞中的Fluc的表达水平下调(图24)。

实施例10：转染后稳定表达的重组光敏转录因子对目的基因表达的调节

为构建稳定表达重组光敏转录因子GAVP(C71V)的细胞株，按照前面所述方法在24孔板中用实施例2构建的pGAVP(C71V)质粒转染HEK293细胞，转染48h取HEK293传代接种100mm直径培养皿。24h后更换为含G418 600μg/mL的培养基，每两天换一次，3周后挑选存活的单细胞克隆，得到10个单克隆细胞株。将各单克隆细胞传代接种48孔板，用实施例4构建的pU5Fluc转染来鉴定细胞是否表达该重组光敏转录因子，如果表达，则光照细胞可表达Fluc蛋白。光照诱导、细胞处理及活性Fluc测定与实施例10相同。结果显示，10个克隆细胞中，克隆2、4、5、6、9细胞表达了该重组光敏转录因子，其中克隆2细胞光照后Fluc的表达水平最高，诱导表达倍数与瞬时转染该转录因子的细胞相近，约30倍。表明整合于细胞基因组中的稳定表达的重组光敏转录因子基因，光照后可调节目的基因的表达水平(图25)。

实施例11：重组光敏转录因子在酿酒酵母细胞中对目的基因表达的调节

为检验重组光敏转录因子GVG-L2(N56K+C71V)在酿酒酵母菌细胞中对目的基因表达的调节，以EYFP报告基因为例，检测了实施例5构建的该重组光敏转录因子在光照下对基因表达的影响。用实施例5构建的pGPMA-GVG-L2(N56K+C71V)质粒和实施例8构建的pYE-EYFP质粒共转化AH109细胞，另用pGPMA空载体与pYE-EYFP共转化AH109细胞作为对照。测定光照与黑暗培养细胞的EYFP相对荧光强度差异，检测方法如前面具体实施方式的(十一)所述。结果显示，光照表达重组光敏转录因子GVG-L2(N56K+C71V)的AH109细胞有效导致目的基因EYFP表达水平上调(图26)。

为检验重组光敏转录因子GVVP(N56K+C71V)在酿酒酵母细胞中对目的基因表达的调节，以EYFP报告基因为例，检测了实施例7构建的该重组光敏转录因子在光照下对基因表达的影响。用实施例7构建的pGPMA-GVVP(N56K+C71V)质粒和实施例8构建的pYE-EYFP质粒共转化AH109细胞，另用pGPMA空载体与pYE-EYFP共转化AH109细胞作为对照。测定光照与黑暗培养细胞的EYFP相对荧光强度差异，检测方法如前面具体实施方式的(十一)所述。结果显示，光照表达重组光敏转录因子GVVP(N56K+C71V)的AH109细胞有效导致目的基因EYFP表达水平升高(图27)。

为检验重组光敏转录因子GVGc(N56K+C71V)在酿酒酵母细胞中对目的基因表达的调节，以LacZ报告基因为例，检测了实施例7构建的该重组光敏转录因子在光照下对基因表达的影响。用实施例7构建的pGPMA-GVGc(N56K+C71V)质粒转化AH109细胞，另用pGPMA空载体转化AH109细胞作为对照。测定光照与黑暗培养细胞表达的活性LacZ水平差异，检测方法如前面具体实施方式的第十二条所述。结果显示，光照表达重组光敏转录因子GVGc(N56K+C71V)的AH109细胞有效导致LacZ表达水平升高，诱导表达倍数约为10(图28)。

为了检验含有不同接头肽的重组光敏转录因子GVG(N56K+C17V)在酵母细胞中对目的基因表达的调节，用实施例5构建的以下6种质粒：pGPMA-GVG-L1(N56K+C71V)；pGPMA-GVG-L2(N56K+C71V)；pGPMA-GVG-L3(N56K+C71V)；pGPMA-GVG-L4(N56K+C71V)；pGPMA-GVG-L5(N56K+C71V)；pGPMA-GVG-L6(N56K+C71V)分别转化AH109细胞，以pGPMA空载体作为对照。测定光照与黑暗培养细胞的活性LacZ表达水平差异，检测方法如前面具体实施方式(十二)所述。结果显示，光照表达含有不同接头肽的重组光敏转录因子GVG(N56K+C17V)的AH109细胞能调节其LacZ的表达水平，不同接头肽的该重组光敏转录因子在光照后导致的LacZ表达水平不同，其中含接头肽L1、L3和L6的该重组光敏转录因子导致的LacZ表达水平较高，即含接头肽L1、L3和L6的该重组光敏转录因子光照后的转录激活能力最强(图29)。

为检验重组光敏转录因子Gal4-VIVID-Gal4AD在酿酒酵母细胞中表达量不同时对目的基因表达的调节，用实施例5构建的pGAD-GVG-L1(N56K+C71V)或pGAD-GVG-L2(N56K+C71V)或pGPMA-GVG-L1(N56K+C71V)或pGPMA-GVG-L2(N56K+C71V)表达载体分别与实施例8构建的pYE-EYFP载体共转化AH109细胞，检测光照和黑暗培养细胞的EYFP相对荧光强度差异，并互相比较。EYFP相对荧光强度的检测方法如前面具体实施方式的(十一)所述。PMA1启动子的启动能力较Gal1启动子的活性强，因而PMA1启动的重组光敏转录因子Gal4-VIVID-Gal4AD融合蛋白在AH109细胞中的含量更高。结果显示，重组光敏转录因子Gal4-VIVID-Gal4AD融合蛋白在AH109细胞中的含量越高，相同条件下细胞中目的基因EYFP的表达量越高(图30)。

为检验含有VIVID突变体的重组光敏转录因子Gal4-VIVID-Gal4AD对酿酒酵母细胞中目的基因表达的调节，分别用实施例6构建的pGPMA-GVG(WT)或pGPMA-GVG(C71V)或pGPMA-GVG(Y50W)种质粒与实施例8构建的pYE-EYFP载体共转化AH109细胞，另用pGPMA空载体和pYE-EYFP载体转化AH109细胞作为对照。检测光照与黑暗培养细胞的EYFP相对荧光强度差异，检测方法如前面具体实施方式的(十一)所述。结果显示，光照表达含有不同VIVID突变体的重组光敏转录因子Gal4-VIVID-Gal4AD的AH109细胞均导致的目的基因EYFP的表达量上调(图31)。

为检验重组光敏转录因子GLG在酿酒酵母细胞中对目的基因表达的调节，以LacZ报告基因为例，检测了实施例6构建的该重组光敏转录因子在光照下对基因表达的阻遏作用。用实施例6构建的pGPMA-GLG质粒转化AH109细胞，另用pGPMA空载体转化AH109细胞作为对照。测定光照与黑暗培养细胞活性LacZ表达水平的差异，检测方法如前面具体实施方式的(十二)所述。结果显示，光照表达重组光敏转录因子GLG的AH109细胞导致目的基因LacZ的表达量下调，诱导表达倍数约为0.8(图32)。

为检验靶转录单元中含有不同个数Gal4反应元件时重组光敏转录因子对EYFP基因转录的调节效果有何差异，分别用实施例8构建的pYE-EYFP(1×UAS_G)或pYE-EYFP(3×UAS_G)或pYE-EYFP(4×UAS_G)或pYE-EYFP质粒与实施例5构建的pGPMA-GVG(N56K+C71V)载体共转化BY4741细胞，检测光照与黑暗培养细胞的EYFP相对荧光强度差异，检测方法如前面具体实施方式的(十一)所述。结果显示，随着Gal4反应的减少，相同条件下细胞内目的蛋白EYFP的表达量也随之降低，但诱导表达倍数几乎不变(图33)。

为检验重组光敏转录因子NLVG(N56K+C71V)、NLcVG(N56K+C71V)、NCVG(N56K+C71V)和NTVG(N56K+C71V)在酿酒酵母细胞中对目的基因表达的调节，分别用实施例5构建的pGPMA-NLVG(N56K+C71V)或pGPMA-NLcVG(N56K+C71V)或pGPMA-NCVG(N56K+C71V)或pGPMA-NTVG(N56K+C71V)质粒与实施例8构建的相对应的pYEL4-EYFP、pYELc4-EYFP、pYEP_R-EYFP、pYET4-EYFP载体共转化AH109细胞，检测光照与黑暗培养细胞的EYFP相对荧光强度差异，检测方法如前面具体实施方式的(十一)所述。结果显示，这四种重组光敏转录因子在光照后均导致目的蛋白EYFP的表达量上调，其中NLVG(N56K+C71V)的诱导表达倍数最高(图34)。

实施例12.光照表达重组光敏转录因子细胞调节目的基因表达的特点

为检验重组光敏转录因子调节目的基因表达的时间动力学和可逆性，用实施例2构建的质粒pGAVP(N56K+C71V)和实施例4构建的质粒pU5Gluc共同转染HEK293细胞，将细胞分为3份，相同诱导条件的细胞样品，以相同方法培养和转染。二份细胞转染后10h开始光照，每30s光照1s，其中一份细胞光照15h后避光培养作为可逆组样品；第三份放置黑暗中作为黑暗组样品。在不同的预定时间在红光灯下操作裂解细胞各取5-20μL上清液作活性Gluc水平测定，以测得的各时间点Gluc表达水平平均值作图，其中横坐标为光照时间，即0小时为光照诱导开始的时刻。结果显示，对于光照组，光照表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)的细胞开始光照后目的基因Gluc表达水平迅速升高。光照3h后，诱导表达倍数达到30倍，且Gluc的表达水平随光照时间的延长继续升高，12h时诱导表达倍数超过100倍；对于可逆组(光照-黑暗)，光照15h停止光照，Gluc表达水平逐渐减少至不再表达(图35)。表明本发明的重组光敏转录因子所导致目的基因表达随着时间延长而增加，且具有可逆性，去除光照后目的基因不再表达。

为检验重组光敏转录因子在不同光照量下对目的基因表达的调节作用，以Fluc为例，用实施例3构建的质粒pGAVP(N56K+C71V)和质粒pU5Fluc共转染HEK293细胞，将细胞分为2份，相同诱导条件的细胞样品有3个重复，一份于转染后6h开始光照，每30s光照1s，光照时用中性灰度片使不同孔光照强度递减2倍(用日本和光公司光度计测定光照强度)。22h后如上面所述处理细胞制备裂解上清液作活性Fluc水平测定。结果显示重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)导致的Fluc表达水平升高取决于光照强度。图中降低0倍为没有用灰度片而直接光照的细胞，其Fluc的表达水平最高，而用灰度片使光强递减2、4、8倍等的细胞Fluc表达水平依次降低。表明本发明重组光敏转录因子导致目的基因的表达水平取决于光照强度(图36)。

为检验重组光敏转录因子在不同光照频率下对目的基因表达的调节作用，用质粒pGAVP(N56K+C71V)和质粒pU5Fluc共转染HEK293细胞，分成三份，相同诱导条件的细胞样品有3个重复。转染后6h开始分别光照，用连接光源的数字时间继电器定时开关控制光照频率和总量。三份细胞放在不同的培养箱中，采用相同的光照总时间不同的光照频率，一份细胞每30s光照1s，第二份细胞每60s光照1s，第三份细胞每120s光照1s。22h后如上面所述处理细胞制备裂解上清液作活性Fluc水平测定。结果显示，每30s光照1s的细胞Fluc表达量最高，而每120s光照1s的细胞Fluc表达量最低，即光照强度相同时光照总量越高，重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)导致的Fluc的表达水平越高(图37)。

为直接观察重组光敏转录因子对目的基因表达的调节，以mCherry和hrGFP报告基因为例，用pGAVP(N56K+C71V)与pU5mCherry或与pU5hrGFP共转染HEK293细胞后10h开始光照，每10min光照20s。24h后用尼康公司Ti系列倒置荧光显微镜对细胞拍照。结果见图38，报告基因为mCherry，上图为相差图像，下图为荧光图像。显示光照前后细胞的生长状态相同，光照后有荧光蛋白mCherry表达的细胞增多，其荧光强度远高于背景，有荧光蛋白表达的细胞约占总数的50％以上。图39中以hrGFP为报告基因，上图为相差图像，下图为荧光图像。结果与以mCherry为报告基因的实验组类似。为了更加直接的观察重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)对荧光蛋白表达量的调节，将上述细胞呈像后的样品用280μl细胞裂解液进行裂解后，用DC蛋白定量试剂盒对每个样品进行定量后，等质量(10μg)上样于15％非还原聚丙烯酰胺凝胶上，20mA电泳2h后用Kodak公司的活体成像仪进行拍照(mCherry激发光波长为550nm，发射光波长为600nm；hrGFP激发光波长为480nm，发射光波长为535nm)，4×4binning，曝光时间5min。非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法见J E.科林根等著，李慎涛等译《精编蛋白质科学实验指南》，303-307页。

结果如图40，图中“+”表示“是”，亦即使用此条件或加入这种真核表达载体，“-”表示否。可见，只含有靶转录单元而不含有转录因子表达载体无论光照与否都没有荧光蛋白表达，而当靶转录单元和转录因子GAVP(N56K+C71V)共同存在时，光照样品的荧光蛋白(mCherry或hrGFP)的表达量远高于黑暗组，黑暗组的条件几乎看不到，进一步证明了重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)具有非诱导状态下基因表达量低，诱导后转录激活能力强的特点。

为了用RT-PCR(反转录PCR)的方法在RNA水平上检测转录因子对待转录核酸转录的调节，用实施例2构建的pGAVP(N56K+C71V)和实施例4构建的pU5Fluc在24孔板中共转染HEK293细胞，细胞培养、转染、诱导方法同实施例9。然后用Tiangen公司的RNA抽提试剂盒提取这些样品的总RNA，所有步骤按照说明书的方法进行操作。用常规方法定量后，每个RNA样品取0.5μg用ImpromII逆转录酶按操作说明反转录成cDNA。设计引物P103、P104用于RT-PCR检测Fluc的RNA水平，设计引物P105、P106用于RT-PCR检测Actin的RNA水平。其中Actin为细胞中的看家基因，其表达量几乎不受外界条件的干扰，在RT-PCR中作为等上样量的参照基因。RT-PCR的扩增方法与普通PCR相同，即用Taq DNA聚合酶以1kb/min的速度进行扩增，在这里共扩增28个循环。结果见图41，当单独转染靶转录单元或光敏转录因子的真核表达载体时，检测不到目的基因Fluc的RNA的表达；当共转染靶转录单元和光敏转录因子的真核表达载体时，光照组有一条很亮的条带，而黑暗组有一条隐约可见的条带，由此可见，光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)光照后可激活目的基因的转录，光照与黑暗样品的RNA水平差异显著。

RT-PCR鉴定Fluc的引物：

上游引物(P103)：5’-GAGATACGCCCTGGTTCCTG-3’

下游引物(P104)：5’-CGAAATGCCCATACTGTTGAG-3’

RT-PCR鉴定Actin的引物：

上游引物(P105)：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’

下游引物(P106)：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’

实施例13.细胞中重组光敏转录因子在空间上对目的基因表达的调节

一方面，利用中性灰度片为光模具改变光照强度研究重组光敏转录因子在空间上对目的基因表达的调节。以mCherry报告基因为例，用pU5mCherry质粒和pGAVP(N56K+C71V)质粒共转染96方孔培养板中的HEK293细胞后10h开始光照，每10min光照20s，不同孔下面放有不同的中性灰度片，使细胞受到的光照强度不同。24h后去除培养基，用Kodak公司的活体成像仪进行拍照(激发光波长为550nm，发射光波长为600nm)，4×4binning，曝光时间5min。结果显示，未用灰度片的孔细胞mCherry表达水平最高荧光最亮，而随着所用灰度片使光强降低倍数的提高，光照细胞的mCherry表达量降低荧光减弱(图42)。

另一方面，利用打印的投影片为光模具给表达荧光蛋白的细胞“拍照”，显示本发明的系统可利用光照在空间上调控基因的表达。以黑色背景、白色字的打印图案“ECUST”为例，光度计测量显示黑色背景的透光率低于透明位置的三十分之一。此外，图案中还包含一个灰度条。在20mm的玻璃底培养皿(NEST公司)中培养和转染细胞，用pU5mCherry质粒与pGAVP(N56K+C71V)质粒共转染HEK293细胞后10h开始光照，每30s光照1s，光照开始前将大小合适的打印图案粘贴在培养皿下方。光照24h后去除培养基，用Kodak公司活体成像仪拍照(激发光波长为550nm，发射光波长为600nm)，4×4binning，曝光时间5min。光照表达重组光敏转录因子GAVP(N56K+C71V)的细胞导致上调其mCherry表达水平。实施例9和11的结果显示其GAVP(N56K+C71V)诱导表达倍数较高而且依赖于于光照强度，因此投影片不同透光量位置目的基因的表达量不同，预计打印图案与荧光图像一致。结果显示，左侧为粘贴有打印的投影片的培养皿的照片，右侧的内侧圆圈为对应的细胞荧光图像，二者几乎一致，即细胞呈现荧光“ECUST”英文字母图像及下方有灰度条图案。给细胞“拍照”(图43)显示本发明系统能在空间上调节目的基因的表达。

实施例14：重组光可控DNA结合蛋白的光谱特点和DNA识别/结合的分析

为分析本发明重组光敏融合蛋白的光谱特点和DNA结合性能，需采用纯化的该蛋白。采用以下引物P107和P108通过PCR扩增实施例2构建pGAVP(WT)质粒中的Gal4-VIVID(WT)基因片段，通过NdeI和XhoI酶切位点连接入pET28a原核表达载体中。所得质粒命名为pET28a-GAV(WT)，相应的重组融合蛋白为GAV(WT)，其N端带有His-尾，可用镍离子亲和层析柱纯化。

上游引物(P107)：5’-CTTTCATATGATGAAGCTACTGTCTTCTATCGAAC-3’

下游引物(P108)：5’-CTTTCTCGAGTTATTCCGTTTCGCACTGGAAACCCATG-3’

用pET28a-GAV(WT)转化JM109感受态细胞，挑选阳性克隆细胞培养表达此蛋白(带有His-尾)，然后用通用公司(GE Healthcare)的1mL镍(Ni²⁺)柱，得到纯化的重组光敏GAV(WT)融合蛋白，再用通用公司(GE Healthcare)的5mL Hitrap Desalting脱盐柱进行脱盐，样品最终保存在20mM Hepes，150mM NaCl，20μM ZnCl₂，10％甘油，pH7.5中。用常规蛋白质测定方法定量后，置4℃避光保存。另取样用SDS-PAGE鉴定蛋白的纯度大约为90％(图44)。

为测定其光谱性质，先将该蛋白4℃放置30h以上使其恢复至黑暗状态。在微弱的红光(光强＜0.05W/cm²)下操作，先取40μL加到384孔不吸收紫外光的透明板各孔中，用Synergy2多功能酶标仪测定GAV(WT)蛋白的300nm至700nm吸收光谱，读出值为黑暗时重组光敏转录因子融合蛋白GAV(WT)的吸收光谱。然后用蓝光460-470nm，0.4W/cm²)照射样品5min后，再测定GAV(WT)蛋白的300nm至700nm吸收光谱，读出值为光照后GAV(WT)的吸收光谱。文献报道，野生型VIVID-36黑暗时有428nm、450nm和478nm三个吸收峰，还有一个390nm吸收峰[Zoltowski，B.D.等，Science 316(5827)，1054-1057(2007)]。结果显示GAV(WT)融合蛋白的光谱性质与VIVID-36类似，表明重组GAV(WT)融合蛋白保留了野生型VIVID-36的光谱性质(图45)。

用凝胶迁移实验(EMSA)测定重组GAV(WT)融合蛋白的DNA识别/结合状况。参照相关文献，将纯化的该蛋白4℃放置30h以上使其恢复至单体状态。将以下二条DNA探针(其中含有GAV识别的反应元件基序)：

正义链(P105)：5’-TCTTCGGAGGGCTGTCACCCGAATATA-3’，

反义链(P106)：5’-ACCGGAGGACAGTCCTCCGG-3’，

稀释至10μM，各取10μL混合后加入PCR仪中，95℃变性5min，然后以每min降1℃的速度降至25℃，退火形成双链探针。在微弱红光下如下操作：将GAV(WT)蛋白用缓冲液RnB(20mM Hepes 7.5，50mM NaCl，100μg/mLBSA)逐倍稀释，每次稀释2倍。然后将探针和各GAV(WT)稀释液分别混合，加入终浓度5％的Ficol，探针终浓度为125μM。将混合好的样品分为两等份，室温下，一份避光，另外一份用蓝光(460-470nm，0.4W/cm²)照射30min。然后将二份样品分别加入2块6％聚丙烯酰胺凝胶上(0.5×Tris-硼酸缓冲液)，4℃以100V电压电泳30-50min，避光样品电泳时仍避光，光照样品电泳时用相同光照。电泳后凝胶用Gelred染料染色5min。图46为检测结果，GAV(WT)与探针结合的分子较大电泳时迁移慢位于上方条带，不结合的探针分子小迁移快位于下方条带。左图显示，黑暗时GAV(WT)只有高浓度才结合探针，右图显示所有浓度的GAV(WT)光照后都能结合探针。表明该重组GAV(WT)融合蛋白与DNA探针的结合受光调控。

应该理解，本文各实施例或实验材料方法中所写的成分用量、反应条件等数字均为大约数值。因此，除非文中特别注明，本说明书中的数字均为近似值，可根据实际情况略作改变而获得类似结果。

除本文专门定义外，本文所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所理解的含意相同。可采用与本文所述相似或相等的方法及材料实施本发明获得相同或相似的结果，但文中所述的是较佳的实施方法与材料作为示范。

在本文提及的所有文献都在本申请中引用作为参考。在阅读了本申请书内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但这些改动和修改仍属于本申请所附权利要求书所限定的范围内。

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Claims (20)

1.一种光可控基因表达系统，包括：a)重组光敏转录因子编码基因，所述重组光敏转录因子包括作为DNA结合结构域的第一多肽、作为光敏结构域的第二多肽和作为转录调节结构域的第三多肽，所述第一多肽选自螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、锌指基序或锌簇DNA结合结构域、亮氨酸拉链DNA结合结构域、翼状螺旋DNA结合结构域、翼状螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、螺旋-环-螺旋DNA结合结构域、高迁移率族DNA结合结构域、B3DNA结合结构域，所述第二多肽选自光照前后二聚化性质发生变化的含LOV结构域的光敏结构域VIVID、AsLOV2和AuLOV；b)靶转录单元，包括被所述第一多肽识别/结合的至少一个反应元件、被第三多肽调节的启动子和待转录核酸序列。

2.如权利要求1所述的光可控基因表达系统，其中所述第一多肽、第二多肽和第三多肽之间可操作性连接，和/或其中反应元件、启动子和待转录核酸序列之间可操作性连接。

3.如权利要求1所述的光可控基因表达系统，其中所述第一多肽选自酵母Gal4DNA结合结构域、大肠杆菌LexA DNA结合结构域、Lac阻遏蛋白LacI的DNA结合结构域、λ噬菌体cI阻遏蛋白的DNA结合结构域和四环素组合蛋白TetR的DNA结合结构域。

4.如权利要求1所述的光可控基因表达系统，其中所述第二多肽选自粗糙链孢霉菌的VIVID的LOV2结构域、燕麦光敏色素1基因的LOV2结构域AsLOV2和无隔藻金色素蛋白1的LOV结构域AuLOV。

5.如权利要求1所述的光可控基因表达系统，其中所述第三多肽选自富含酸性氨基酸的转录激活结构域、富含脯氨酸的转录激活结构域、富含丝氨酸/苏氨酸的转录激活结构域和富含谷氨酰胺的转录激活结构域，Kruppel相关盒转录阻遏结构域。

6.如权利要求5所述的光可控基因表达系统，其中所述第三多肽选自单纯疱疹病毒颗粒蛋白VP16转录激活结构域、酵母Gal4转录激活结构域、NF-κB p65亚基转录激活结构域、酵母通用控制蛋白4的转录激活结构域和锌指蛋白354A的Kruppel相关盒转录阻遏结构域。

7.如权利要求1所述的光可控基因表达系统，其中还包含促进所述重组光敏转录因子向细胞核运输的核定位信号肽第四多肽，所述第四多肽与第一、第二、第三多肽直接或通过接头肽相连。

8.如权利要求1所述的光可控基因表达系统，其中所述反应元件为可被所述第一多肽特异性识别和结合的DNA基序。

9.如权利要求8所述的光可控基因表达系统，其中所述反应元件选自Gal4结合元件、LexA结合元件、TetR结合元件、LacI结合元件和cI结合元件。

10.如权利要求1所述的光可控基因表达系统，其中所述启动子选自腺病毒晚期启动子、巨细胞病毒CMV最小启动子、酵母Gal1基因的启动子和SV40启动子。

11.如权利要求1所述的光可控基因表达系统，其中所述第一多肽和第二多肽构成一种光可控DNA结合蛋白。

12.含有权利要求1-11之一所述光可控基因表达系统的真核表达载体。

13.如权利要求12所述的真核表达载体，所述表达载体含有所述重组光敏转录因子编码基因，和/或所述靶转录单元，其中所述靶转录单元包括被所述第一多肽识别/结合的至少一个反应元件、被第三多肽调节的启动子和待转录核酸序列。

14.如权利要求12所述的真核表达载体，其中所述重组光敏转录因子的氨基酸序列选自序列4、8、12、16、20、32、34、36、38、40、44、48、58、60、62、64、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120。

15.用权利要求1-11之一所述光可控基因表达系统在宿主细胞中调控基因表达的方法，包括步骤：

a)将所述光可控基因表达系统构建在真核质粒表达载体中；

b)引入含被调控基因的真核宿主细胞；和

c)光照诱导所述宿主细胞，使所述宿主细胞中的被调控的核苷酸进行表达。

16.如权利要求15所述的调控基因表达的方法，其中还包括光源的选择和照射方法的选择，所述光源包括LED灯、荧光灯、激光和白炽灯，所述照射方法是持续的光照或不连续的光照。

17.如权利要求16所述的调控基因表达的方法，包括用光扫描、投影、光模具在空间上控制不同位置的细胞的基因表达水平。

18.如权利要求16所述的调控基因表达的方法，所述方法还包括用打印的投影胶片、中性灰度片在空间上控制不同位置的细胞的基因表达水平。

19.一种试剂盒，装有权利要求12所述真核表达载体或/和转染了含有所述重组光敏转录因子的真核表达载体的哺乳动物细胞，及相应的说明书。

20.如权利要求19所述的试剂盒，其中还装有含反应元件-启动子但待转录核酸序列空缺的靶转录单元的真核表达载体。