CN109868286B - 一种慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，所述慢病毒载体包括基因元件组成的基因片段，所述基因元件按以下顺序顺次连接：TMEM119启动子、iCre基因、Cx3cr1启动子、loxP位点、DsRed基因和EGFP基因。本发明的慢病毒可以特异性活体标记小胶质细胞，准确地实时区分小胶质细胞与其他细胞，在研究小胶质细胞的发育、行为和功能等方面具有重要意义。

Description

一种慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用，尤其涉及一种特异性活体标记小胶质细胞的慢病毒及其制备方法和应用。

背景技术

小胶质细胞(microglia)是中枢神经系统最小的神经胶质细胞，分布于整个中枢神经系统，约占胶质细胞总数的5％-10％。作为常驻中枢神经系统的免疫效应细胞，小胶质细胞隶属于单核吞噬细胞族，被认为是中枢神经系统的主要免疫效应器。小胶质细胞及其介导的神经炎症在中枢神经系统的损伤及疾病的转归过程中起着非常重要的作用，参与诸如HIV脑病、帕金森病、阿尔兹海默病和多发性硬化等人神经系统紊乱疾病。

Cre重组酶是一种来源于P1噬菌体的位点特异性络氨酸重组酶，属于λ整合酶超家族，由一个五价物[Arg-Lys-(His/Lys)-Arg-(His/Trp)]协助催化DNA重组过程中DNA链的断裂和重连，cre插入内含子后形成icre。loxP位点是一段总长度为34bp的反向重复DNA序列，Cre重组酶介导两个loxP位点之间的重组，而且，两个loxP位点的方向和位置可以造成重组后的三种结果：删除、翻转或整合。由于Cre-loxP系统不需要任何辅助因子，经逐步改造后被广泛应用于真核细胞，目前已经在细胞发育追踪、基因敲除、基因条件表达等领域发挥了显著作用。

GFP是一种来源于Aequorea victoria水母的蛋白质，可在蓝色波长光线的激发下发出绿色荧光，EGFP是GFP的突变系，在488nm光源激发下，其发光强度是GFP的35倍。DsRed是一种来源于Discosomasp珊瑚虫、与GFP同源的红色荧光蛋白，可在绿色波长光线的激发下发出红色荧光。

跨膜蛋白119(Tmem119)是一种细胞表面跨膜蛋白，可作为人或小鼠的小胶质细胞特异性高表达标志物。Cx3c趋化因子受体1(Cx3cr1)是一种位于细胞表面的受体蛋白，存在于NK细胞、单核细胞、T细胞等免疫细胞表面。

目前，区分或标记小胶质细胞的主要方法包括形态学观察、特征性蛋白免疫组织化学染色和单启动子荧光蛋白标记，然而这些方法特异性较差，无法准确地区分小胶质细胞与中枢神经系统的其他细胞，且标记过程中需要处死小鼠，无法在活体状态下进行特异性标记。

在现有的特异性标记小胶质细胞的技术中，Tmem119标志物免疫组织化学染色法(M.L.Bennett et al.New tools for studying microglia in the mouse and humanCNS.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A,113,E1738-E1746(2016))使用Tmem119抗体(Tmem119-antibody)特异性结合小胶质细胞表面的Tmem119蛋白，实现了在体外针对小胶质细胞的特异性标记。然而，该方法需要处死小鼠后完成取脑、固定脱水、冰冻切片和免疫组织化学染色的复杂操作，无法实现活体标记、检测和追踪。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种慢病毒系统及其制备方法和应用，所述慢病毒可以特异性活体标记小胶质细胞，准确地实时区分小胶质细胞与其他细胞，在研究小胶质细胞的发育、行为和功能等方面具有重要意义。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包括基因元件组成的基因片段，所述基因元件按以下顺序顺次连接：TMEM119启动子、iCre基因、Cx3cr1启动子、loxP位点、DsRed基因和EGFP基因。

本发明中，所述慢病毒载体主要用于在活体状态下特异性标记小胶质细胞，将包含所述慢病毒载体的慢病毒转入中枢神经系统后，只有小胶质细胞表达绿色荧光蛋白，中枢神经系统的其他细胞不表达荧光蛋白，血液循环系统来源的巨噬细胞表达红色荧光蛋白。因此，通过检测绿色荧光信号，可以在活体状态下特异性检测和追踪小胶质细胞。

优选地，所述慢病毒载体的基因片段的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供了一种慢病毒，所述慢病毒包括如第一方面所述的慢病毒载体。

优选地，所述慢病毒转入小胶质细胞中，TMEM119启动子阳性，启动iCre基因表达，loxP位点重组，Cx3cr1启动子阳性，启动EGFP基因表达，小胶质细胞被标记绿色荧光。

优选地，所述慢病毒转入血液循环系统来源的巨噬细胞中，TMEM119启动子阴性，不启动iCre基因表达，loxP位点不重组，Cx3cr1启动子阳性，启动DsRed基因表达，巨噬细胞被标记红色荧光。

优选地，所述慢病毒转入不包括小胶质细胞的中枢神经系统的细胞中，TMEM119启动子阴性，不启动iCre基因表达，loxP位点不重组，Cx3cr1启动子阴性，不启动DsRed基因表达，细胞无荧光。

第三方面，本发明提供了一种制备如第二方面所述慢病毒的方法，包括如下步骤：

(1)构建如第一方面所述的慢病毒载体；

(2)将步骤(1)所述的慢病毒载体转入感受态细胞中，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；

(3)将筛选后的慢病毒载体包装得到所述慢病毒。

优选地，步骤(1)所述构建的方法为将SEQ ID NO.1的基因片段插入慢病毒包装质粒plenti-MP26782的NotI和XmaI的酶切位点之间。

作为优选技术方案，本发明提供了一种制备如第二方面所述慢病毒的方法，包括如下步骤：

(1)将SEQ ID NO.1的基因片段和慢病毒包装质粒plenti-MP26782分别采用NotI和XmaI限制性内切酶双酶切，得到的酶切产物采用T4DNA聚合酶连接为慢病毒载体；

(2)将步骤(1)所述慢病毒载体转入感受态细胞中，培养后挑取单克隆细胞采用NotI/XmaI限制性核酸内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，筛选慢病毒载体；

(3)将筛选后的慢病毒载体包装得到所述慢病毒。

第四方面，本发明提供了一种检测试剂，所述检测试剂包含如第二方面所述的慢病毒。

第五方面，本发明提供了一种如第四方面所述的检测试剂用于特异性活体标记小胶质细胞。

第六方面，本发明提供了一种如第五方面所述的小胶质细胞用于实时观测小胶质细胞的发育、行为或功能中的任意一种或至少两种的组合。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)将本发明的慢病毒注入需要标记的中枢神经系统位点，只有小胶质细胞表达绿色荧光蛋白，实现了活体状态下对小胶质细胞的特异性标记、检测和追踪，可用于实时观测小胶质细胞发育、行为或功能；

(2)本发明的方法操作简便，无需使用抗体，降低了实验成本和因抗体质量问题带来的风险。

附图说明

图1为特异性活体标记小胶质细胞的慢病毒基因元件的构成示意图；

图2为慢病毒载体的构建流程图，其中，promoter-启动子，mCherry-红色荧光蛋白，origin-起始位点，terminator-终止子；

图3(A)为慢病毒在小胶质细胞中进行绿色荧光标记的原理图，图3(B)为慢病毒在血液循环系统的巨噬细胞中进行红色荧光标记的原理图，图3(C)为慢病毒在中枢神经系统的其他细胞中不进行荧光标记的原理图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1慢病毒载体的构建

慢病毒载体的基因元件组成的基因片段的示意图如图1所示，核酸序列如SEQ IDNO.1所示：

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所述SEQ ID NO.1通过人工合成得到。

将合成的SEQ ID NO.1与慢病毒包装质粒plenti-MP26782分别用NotI/XmaI核酸内切酶处理，酶切产物用T4DNA聚合酶连接，得到所需的慢病毒载体。

实施例2慢病毒载体的验证和慢病毒制备

如图2所示为慢病毒载体构建流程图，具体步骤为：

(1)从-80℃冰箱中取出TOP10感受态细菌(每管50-100μL)，在冰水浴中解冻；

(2)待感受态细菌解冻后，在超净台中取出不超过感受态细菌的体积1/10的慢病毒载体加入细菌中，轻轻吹打混匀；

(3)将慢病毒载体与感受态细菌的混合物冰浴30分钟，在42℃水浴中热激90秒后，立即移入冰水浴中保持5分钟；

(4)取一个无菌的1.5mL离心管，加入500μL无抗生素的LB培养液，将冰浴后的混合物移入离心管中，轻轻吹打混匀；

(5)37℃下在摇床中以200rpm培养1小时；

(6)在培养结束前5-10分钟，取含有10％抗生素的LB培养液，均匀涂布在LB琼脂糖培养板上，晾干待用；

(7)培养1小时后，2000g离心菌液，吸出400-500μL培养液上清，用枪头轻轻吹打余下的培养液，菌体悬浮后均匀涂布在步骤6的培养板上；

(8)在37℃恒温培养箱中培养12-16小时，待平板上长出大小合适、外观饱满的菌落后，挑取4-6个单克隆进行培养；

(9)将挑取的单克隆菌体进行培养后，按照“天根质粒小量中提试剂盒”的实验方法提取质粒，将提取的慢病毒载体用NotI/XmaI核酸内切酶酶切2小时，进行DNA电泳，从中筛选出正确的慢病毒载体；

(10)将筛选出的慢病毒载体进行慢病毒包装，得到所需的慢病毒。

实施例3

将制备的慢病毒注射入小鼠中枢神经系统，小胶质细胞表达绿色荧光蛋白，血液循环系统来源的巨噬细胞表达红色荧光蛋白，中枢神经系统的其他细胞不表达任何荧光蛋白。具体为：

当慢病毒侵染小胶质细胞后，如图3(A)所示，TMEM119启动子阳性，启动iCre基因表达，loxP位点重组，Cx3cr1启动子阳性，启动EGFP基因表达，小胶质细胞被标记绿色荧光；

当慢病毒侵染血液循环系统来源的巨噬细胞后，如图3(B)所示，TMEM119启动子阴性，不启动iCre基因表达，loxP位点不重组，Cx3cr1启动子阳性，启动DsRed基因表达，巨噬细胞被标记红色荧光；

当慢病毒侵染中枢神经系统的其他细胞后，如图3(C)所示，TMEM119启动子阴性，不启动iCre基因表达，loxP位点不重组，Cx3cr1启动子阴性，不启动DsRed基因表达，细胞无荧光。

综上所述，本发明的慢病毒载体可用于特异性活体标记小胶质细胞，将本发明的慢病毒注入需要标记的中枢神经系统位点，只有小胶质细胞表达绿色荧光蛋白，通过检测绿色荧光，可以实时观测小胶质细胞发育、行为或功能；本发明的方法操作简便，无需使用抗体，降低了实验成本和因抗体质量问题带来的风险。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 中国科学院深圳先进技术研究院

<120> 一种慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用

<130> 2017

<141> 2017-12-05

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5893

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

agtgtcaggg tgtgtcagcc atttactgaa acaaacaagt gaatgagtga gtgaatgaat 60

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agacctgact tgtgtgctgc tggactccga ggctacagac tgccatctca ctaggaataa 3900

ataatatcca tccaccccca ggtctgccaa cccacagccc cctgtaaacc ttaggtctca 3960

gtaattccta ggtcagccac cacacagtct ccagcaatcc ccaggtctgc cacccaacag 4020

tccccagtag tccccagcag tccccagcaa tctccaggtt tgccccagtc tcaagtcccc 4080

tagatttgaa atgcaggctc tcttgcggtc agctggttcc cagcctggag cgttgagccc 4140

gttgagcttg cttgtcacag catctaaaga tagggtacca cacaggaaac cagatgctat 4200

tggctaactt cgaaaataaa gatgccctca tagagaggga agcacttgcc tctggtggag 4260

tctgcgtgag actgggtgag tgactggcac ttcctgcaga agttcccttc ccatctgctc 4320

aggacctcac caataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact 4380

gcataacttc gtatagcata cattatacga agttatgcca ccatggtgag caagggcgag 4440

gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 4500

aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 4560

ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc 4620

tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 4680

tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 4740

tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 4800

aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 4860

aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 4920

aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 4980

acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc 5040

gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 5100

gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aaataacttc gtatagcata 5160

cattatacga agttatgcca ccatggtgag caagggcgag gaggataaca tggccatcat 5220

caaggagttc atgcgcttca aggtgcacat ggagggctcc gtgaacggcc acgagttcga 5280

gatcgagggc gagggcgagg gccgccccta cgagggcacc cagaccgcca agctgaaggt 5340

gaccaagggt ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tcccctcagt tcatgtacgg 5400

ctccaaggcc tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacttgaagc tgtccttccc 5460

cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg tgaccgtgac 5520

ccaggactcc tccctgcagg acggcgagtt catctacaag gtgaagctgc gcggcaccaa 5580

cttcccctcc gacggccccg taatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg cctcctccga 5640

gcggatgtac cccgaggacg gcgccctgaa gggcgagatc aagcagaggc tgaagctgaa 5700

ggacggcggc cactacgacg ctgaggtcaa gaccacctac aaggccaaga agcccgtgca 5760

gctgcccggc gcctacaacg tcaacatcaa gttggacatc acctcccaca acgaggacta 5820

caccatcgtg gaacagtacg aacgcgccga gggccgccac tccaccggcg gcatggacga 5880

gctgtacaag taa 5893

Claims (12)

1.一种慢病毒载体，其特征在于，包括基因元件组成的基因片段，所述基因元件按以下顺序顺次连接：TMEM119启动子、iCre基因、Cx3cr1启动子、loxP位点、DsRed基因和EGFP基因。

2.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体的基因片段的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒包括如权利要求1或2所述的慢病毒载体。

4.根据权利要求3所述的慢病毒，其特征在于，所述慢病毒转入小胶质细胞中，TMEM119启动子阳性，启动iCre基因表达，loxP位点重组，Cx3cr1启动子阳性，启动EGFP基因表达，小胶质细胞被标记绿色荧光。

5.根据权利要求3所述的慢病毒，其特征在于，所述慢病毒转入血液循环系统来源的巨噬细胞中，TMEM119启动子阴性，不启动iCre基因表达，loxP位点不重组，Cx3cr1启动子阳性，启动DsRed基因表达，巨噬细胞被标记红色荧光。

6.根据权利要求3所述的慢病毒，其特征在于，所述慢病毒转入不包括小胶质细胞的中枢神经系统的细胞中，TMEM119启动子阴性，不启动iCre基因表达，loxP位点不重组，Cx3cr1启动子阴性，不启动DsRed基因表达，细胞无荧光。

7.一种制备如权利要求3-6中任一项所述慢病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建如权利要求1或2所述的慢病毒载体；

(2)将步骤(1)所述的慢病毒载体转入感受态细胞中，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；

(3)将筛选后的慢病毒载体包装得到所述慢病毒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述构建的方法为将SEQ ID NO.1的基因片段插入慢病毒包装质粒plenti-MP26782的NotI和XmaI的酶切位点之间。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将SEQ ID NO.1的基因片段和慢病毒包装质粒plenti-MP26782分别采用NotI和XmaI限制性内切酶双酶切，得到的酶切产物采用T4 DNA聚合酶连接为慢病毒载体；

(2)将步骤(1)所述慢病毒载体转入感受态细胞中，培养后挑取单克隆细胞采用NotI/XmaI限制性核酸内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，筛选慢病毒载体；

(3)将筛选后的慢病毒载体包装得到所述慢病毒。

10.一种检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包含如权利要求3-6中任一项所述的慢病毒。

11.一种如权利要求10所述的检测试剂在特异性活体标记小胶质细胞中的应用。

12.一种特异性活体标记小胶质细胞，其特征在于，所述小胶质细胞为经过权利要求10所述检测试剂处理得到，所述小胶质细胞用于实时观测小胶质细胞的发育、行为或功能中的任意一种或至少两种的组合。

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