TW202115252A - 核酸之隨機化組態靶向整合 - Google Patents

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Abstract

本揭示之主題涉及“隨機化組態靶向整合 (Randomized Configuration Targeted Integration)” (本文也稱為“隨機化鏈靶向整合 (Randomized Chain Targeted Integration)”) (RCTI) 策略，用於生成和鑑定宿主細胞，該等宿主細胞能夠表現重組蛋白 (例如單殖株抗體) 及由彼之衍生的組成物 (例如雙特異性抗體)、及其他複雜型式之蛋白 (例如膜蛋白複體物)、及其他難以表現的分子。

Description

核酸之隨機化組態靶向整合
本揭示之主題涉及“隨機化組態靶向整合 (Randomized Configuration Targeted Integration)” (本文也稱為“隨機化鏈靶向整合 (Randomized Chain Targeted Integration)”) (RCTI) 策略，用於生成和鑑定宿主細胞，該等宿主細胞能夠表現重組蛋白 (例如單株抗體) 及由彼之衍生的組成物 (例如雙特異性抗體)、及其他複合體型式蛋白質 (例如膜蛋白複合體)、及其他難以表現的分子。 [序列表]
本說明書參照序列表 (2020年6月24日以檔案名“00B206_0926_SL.txt”電子呈送)。00B208_0926_SL.txt 檔案於2020年6月24日產生且大小為1,296,777位元組。序列表的全部內容在此以引用方式併入
由於細胞生物學及免疫學之快速發展，對開發用於多種疾病 (包括癌症、心血管疾病、及代謝疾病) 之新穎治療性重組蛋白 (例如單株抗體、雙特異性抗體、及複合體形式蛋白質) 之需求日益增加。該等生物醫藥候選物通常由能夠表現所關注蛋白質之商業細胞株來製造。舉例而言，近年來，中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞已廣泛適用於製造單株抗體或雙特異性抗體以及更多複合體形式蛋白質。
用於開發商業細胞株之習用策略通常涉及不斷致力進行關於將編碼所關注多肽之核苷酸序列之 (隨機或特定 (“靶向”)位置) 整合，之後選擇且分離產生該多肽之細胞株。然而，此方法具有若干缺點。首先，雖然隨機整合方法提供獲得具有不同組成及比例的所意欲表現轉殖基因的不同殖株之可能性，但在轉染後篩選數百、甚至數千個殖株以分離展現所欲表現水平、產物品質屬性、及製造培養物效能的細胞株，是耗時且資源密集。此外，由於不穩定或未能篩選足夠數量的殖株，具有各種轉殖基因最佳比例的殖株有可能不存在或無法分離出來。此外，當生產多鏈多肽 (例如單株抗體) 時，可能需要進一步篩選以解決編碼這種多肽的核酸之數量和排列。在使用隨機整合方法時，很難確定引入基因體的所有轉殖基因的數量和位置及其排列方式，這是在轉殖基因排列/拷貝數與所欲產物屬性之間進行合理關聯的重要步驟。
相比之下，靶向整合方法可對各特定轉殖基因的排列和拷貝數提供更多的控制，因為轉殖基因是插入到基因體內預定的特定位置。然而，這種靶向整合方法是設計以最小化產生不同轉殖基因的隨機組合及比例的可能性。因此，如果設計的轉殖排列和拷貝數恰好是次最佳的，則所有衍生的殖株同樣會有次最佳的產物品質及/或效價。為了增加使用靶向整合方法表現複雜或難以表現的分子的機會，對多種不同的轉殖基因排列及拷貝數組態單獨測試，從而增加細胞株開發 (CLD) 的工作量和資源需求。因此，本技術領域需要新的細胞株開發策略，該策略在節省資源的同時，產生的細胞株表現出與習知方法相媲美的表現水平、產物品質屬性、及製造培養物效能。
本揭示之主題涉及“隨機化組態靶向整合” (本文也稱為“隨機化鏈靶向整合”) (RCTI) 策略，用於產生和鑑定宿主細胞，該等宿主細胞能夠表現重組蛋白 (例如單株抗體) 及由彼之衍生的組成物 (例如雙特異性抗體)、及其他複合體型式蛋白質 (例如膜蛋白複合體)、及其他難以表現的分子。在本揭露中所述的RCTI方法可用於篩選與標準細胞株開發方法相同數量 (如果不是更多) 的載體組態，同時使用較少的資源。藉由使用在本揭露中所述的RCTI方法，也可篩選較少個別殖株。
在某些實施例中，本揭露提供一種用於產生及高通量篩選表現至少一個所關注序列 (SOI) 的靶向整合 (TI) 宿主細胞庫之方法，其包含：a) 藉由下列產生 TI 宿主細胞庫，其中該庫包含複數個 TI 宿主細胞，其表現一個或多個 SOI：i) 提供複數個 TI 宿主細胞；ii)將複數個 TI 宿主細胞與複數個載體接觸，其中該等載體包含一個或多個 SOI；iii)將該一個或多個 SOI 引入一個或多個該複數個 TI 宿主細胞；b) 將該庫分離成單一殖株；以及 c) 針對特定細胞屬性或特定產物屬性來篩選該等殖株。
在某些實施例中，本揭露提供一種產生 TI 宿主細胞庫之方法，該等宿主細胞包含複數個外源性核苷酸 SOI，該方法包含：a) 提供複數個 TI 宿主細胞；b) 將該複數個 TI 宿主細胞與複數個載體接觸，其中該等載體包含一個或多個 SOI；c)將該一個或多個 SOI 引入一個或多個該複數個 TI 宿主細胞。在某些實施例中，該複數個 TI 宿主細胞的一者或多者包含一個或多個外源性核苷酸序列，其整合在該等 TI 宿主細胞的基因體之一個或多個基因座，且該外源性核苷酸序列包含至少兩個重組酶辨識序列 (RRS)，其位在至少一個第一選擇標記之側翼。在某些實施例中，該等載體包含：a) 至少兩個 RRS，其匹配已整合之外源性核苷酸上的至少兩個 RRS；以及 b) 一個或多個外源 SOI 及至少一個第二選擇標記，其側翼為該等RRS。
本揭示之主題亦提供用於將一或多種外源性核酸 RCTI 至宿主細胞中以促進所關注序列的表現之方法。在某些實施例中，此等方法包含經由重組酶介導之整合或經由基因編輯介導之整合將一或多種外源性核酸靶向整合至宿主細胞中。在某些實施例中，此等方法涉及一種細胞，其包含一個或多個外源性核苷酸序列，其整合在該 TI 宿主細胞的基因體之基因座內，其中該基因座包含與選自 SEQ ID NO: 1-12 之序列至少約 90% 同源的核苷酸序列。
在某些實施例中，本揭露提供一種製備表現一個或多個 SOI 的 TI 宿主細胞之方法，其包含：a) 提供複數個 TI 宿主細胞；b) 將該複數個 TI 宿主細胞與複數個載體接觸，其中該等載體包含一個或多個 SOI；c) 將該一個或多個 SOI 引入一個或多個該複數個 TI 宿主細胞；以及 d) 選擇表現該一個或多個 SOI 之該等 TI 宿主細胞。在某些實施例中，該複數個 TI 宿主細胞的一者或多者包含一個或多個外源性核苷酸序列，其整合在該等 TI 宿主細胞的基因體之一個或多個基因座，且其中該外源性核苷酸序列包含至少兩個 RRS，其位在至少一個第一選擇標記之側翼。在某些實施例中，該等載體包含：  a. 至少兩個 RRS，其匹配已整合之外源性核苷酸上的至少兩個 RRS；以及 b. 一個或多個外源 SOI 及至少一個第二選擇標記，其側翼為該等 RRS。在某些實施例中，該方法包含將一或多種重組酶或編碼重組酶之核酸引入該複數個 TI 宿主細胞之一者或多者，其中該一或多種重組酶辨識該等 RRS；以及 d) 選擇表現該第二選擇標記之 TI 細胞，藉此分離出表現所關注序列之 TI 宿主細胞。在某些實施例中，該外源核苷酸序列包含位在至少一個第一選擇標記側翼之第一 RRS 及第二 RRS，及位在介於該第一 RRS 與該第二 RRS 之間之第三 RRS，且所有 RRS 都是異種特異的 (heterospecific)；以及該複數個載體包含：i. 第一載體，其包含兩個 RRS，其與整合外源核苷酸序列上的第一 RRS 及第三 RRS 匹配，且位於至少一個第一外源 SOI 及至少一個第二選擇標記側翼；ii. 第二載體，其包含兩個 RRS，其與整合外源核苷酸序列上的第二 RRS 及第三 RRS 匹配，且位於至少一個第二外源 SOI 側翼；以及選擇表現該第二選擇標記之 TI 細胞，藉此分離出表現該第一及第二所關注序列之 TI 宿主細胞。
在某些實施例中，本揭露提供一種表現 SOI 之方法，其包含：a) 提供複數個 TI 宿主細胞；b) 將該複數個 TI 宿主細胞與複數個載體接觸，其中該等載體包含一個或多個 SOI；c) 將該等一個或多個 SOI 引入一個或多個該複數個 TI 宿主細胞；以及 d) 選擇表現該所關注序列之 TI 宿主細胞；e) 在適合於表現來自 d) 中之細胞的該所關注序列之條件下培養 d) 中之細胞。
在某些實施例中，本揭露提供一種表現 SOI 之方法，其包含：a) 提供複數個 TI 宿主細胞，其中各 TI 宿主細胞包含一個或多個外源性核苷酸序列，其整合在該等 TI 宿主細胞的基因體之一個或多個基因座，且其中該外源性核苷酸序列包含至少兩個 RRS，其位在至少一個第一選擇標記之側翼；b) 將該複數個 TI 宿主細胞與複數個載體接觸，其中該等載體包含：a. 至少兩個 RRS，其匹配已整合之外源性核苷酸上的至少兩個 RRS；以及 b. 一個或多個外源 SOI 及至少一個第二選擇標記，其側翼為該等 RRS；c) 將一或多種重組酶或編碼重組酶之核酸引入，其中該一或多種重組酶辨識該等 RRS；d) 選擇表現該第二選擇標記之 TI 細胞，藉此分離出表現所關注序列之 TI 宿主細胞；以及 e) 在適合於表現來自 d) 中之細胞的該所關注序列之條件下培養 d) 中之細胞，且回收來自 d) 中之細胞的該所關注序列之產物。在某些實施例中，該外源核苷酸序列包含位在至少一個第一選擇標記側翼之第一 RRS 及第二 RRS，及位在介於該第一 RRS 與該第二 RRS 之間之第三 RRS，且所有 RRS 都是異種特異的 (heterospecific)；以及該複數個載體包含：i. 第一載體，其包含兩個 RRS，其與整合外源核苷酸序列上的第一 RRS 及第三 RRS 匹配，且位於至少一個第一外源 SOI 及至少一個第二選擇標記側翼；ii. 第二載體，其包含兩個 RRS，其與整合外源核苷酸序列上的第二 RRS 及第三 RRS 匹配，且位於至少一個第二外源 SOI 側翼；以及選擇表現該第二選擇標記之 TI 細胞，藉此分離出表現該第一及第二所關注序列之 TI 宿主細胞。
在某些實施例中，該一個或多個 SOI 是藉由重組酶介導之整合來引入一個或多個該複數個 TI 宿主細胞。在某些實施例中，該一個或多個 SOI 是藉由基因編輯介導之整合來引入一個或多個該複數個 TI 宿主細胞。
在某些實施例中，該一個或多個 SOI 是可操作地連接至一個或多個可調控之啟動子。在某些實施例中，該一個或多個可調控之啟動子是選自由 SV40 及 CMV 啟動子所組成之群組。
在某些上述實施例中，該等 TI 宿主細胞是哺乳動物宿主細胞。在某些上述實施例中，該等 TI 宿主細胞是倉鼠宿主細胞、人宿主細胞、大鼠宿主細胞、或小鼠宿主細胞。在某些上述實施例中，該等 TI 宿主細胞是 CHO 宿主細胞、CHO K1 宿主細胞、CHO K1SV 宿主細胞、DG44 宿主細胞、DUKXB-11 宿主細胞、CHOK1S 宿主細胞、或 CHO K1M 宿主細胞。
在某些上述實施例中，該 SOI 編碼多重次單元蛋白之多肽次單元或其片段。在某些上述實施例中，該 SOI 編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈 Fv 片段 (scFv)、或 Fc 融合蛋白。
在某些上述實施例中，該特定細胞屬性是選自：細胞生長、細胞效價 (cell titer)、單位生產力 (specific productivity)、體積生產力、殖株穩定性。在某些上述實施例中，該特定產物屬性是選自：醣基化水平、電荷變異水平、錯配減少、蛋白/胜肽聚集減少、蛋白質序列異質性。
在某些上述實施例中，該一個或多個 SOI 是引入一個或多個該複數個 TI 宿主細胞的一個或多個基因座，該等基因座是與選自下列之序列至少約 90% 同源性：SEQ ID Nos. 1-12；NW_006874047.1；NW_006884592.1；NW_006881296.1；NW_003616412.1；NW_003615063.1；NW_006882936.1；及 NW_003615411.1。
在某些上述實施例中，該至少一個所關注序列包含 2、3、4、5、6、7、8、9、10 個所關注序列。
[相關申請案之交互參照]
本申請案主張2019年6月26日所申請之美國臨時申請案第62/866,893號及2020年3月19日所申請之美國臨時申請案第62/991,708號之優先權，彼等之各者內容是以引用方式全部併入本文中，並主張彼等之各者優先權。
在某些實施例中，本文所述之宿主細胞、基因構築體 (例如，載體)、組成物、及方法可用於開發及/或使用“隨機化組態靶向整合” (本文也稱為“隨機化鏈靶向整合”) (RCTI) 策略，以供有效率 (例如較少時間及/或資源密集) 鑑定表現出與習知方法相媲美的表現水平、產物品質屬性、及製造培養物效能之宿主細胞。
為了使本揭露明確之目的而非限制之目的，詳細描述分為以下子部分： 1.定義 2.宿主細胞製備 & 篩選策略 3.外源性核苷酸序列 4.宿主細胞 5.靶向整合 6.產物 1. 定義
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與熟習本技術領域者所通常理解之含義相同之含義。倘若出現衝突，則以本文件 (包括定義) 為準。下文闡述較佳方法及材料，惟可使用與本文所述之方法及材料類似或等效之彼等方法及材料來實踐或測試本揭示之主題。本文所提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻均以全文引用的方式併入。本文所揭示之材料、方法及實例僅為說明性且不意欲具有限制性。
如本文所用，術語「包含」、「包括」、「具有 (having、has)」、「可」、「含有」及其變體意欲為不排除其他行為或結構之可能性之開放式連接詞 (open-ended transitional phrase)、術語、或字。除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一 (a、an)」及「該 (the)」包括複數個提及物。本揭露亦涵蓋「包含」本文所呈現之實施例或元件、「由其組成」及「基本上由其組成」之本文所呈現之實施例或元件，無論是否明確陳述。
對於本文中引用之數值範圍，明確考慮到它們之間具有相同精確度的各個中間數字。例如，對於 6-9 的範圍，除 6 和 9 以外，明確考慮到數字 7 和 8；對於 6.0-7.0 的範圍，明確考慮到數字 6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9 和 7.0。
如本文所用，術語「約」或「大約」係指特定值處於本發明所屬技術領域中具有通常知識者所確定之可接受的誤差範圍內，其部分地取決於如何測量或確定該值，即 ，取決於測量系統的局限性。 例如，按照本發明所屬技術領域中的實務，「約」意指 3 倍或 3 倍以上的標準偏差。可替代地，「約」意指給定值的至多 20%、最佳至多 10%、更佳至多 5% 並且更佳至多 1% 的範圍。 可替代地，特別是關於生物系統或過程，該術語意指數值的一個數量級內，最佳地在數值的 5 倍以內，並且更佳地在數值的 2 倍以內。
如本文所用，術語「選擇標記」可以是一種基因，其允許攜帶該基因的細胞在相應的選擇劑的存在下被特異性地選擇或排除。例如，但並非限制性地，選擇標記可允許在存在該基因的情況下，陽性篩選用選擇標記基因轉化的宿主細胞；未轉化的宿主細胞將不能在選擇條件下生長或存活。選擇標記可為陽性、陰性或雙功能選擇標記。陽性選擇標記可選擇帶有標記的細胞，而陰性選擇標記則可以選擇性排除帶有標記的細胞。選擇標記可導致藥物抗性或補償宿主細胞中之代謝或分解代謝缺陷。在原核細胞中，可使用導致對氨芐青黴素、四環素、卡那黴素或氯黴素抗性的基因。在真核細胞中用作選擇標記的抗性基因包括但不限於胺基糖苷磷酸轉移酶 (APH) (例如，潮黴素磷酸轉移酶 (HYG)、新黴素和 G418 APH)、二氫葉酸還原酶 (DHFR)、胸苷激酶 (TK)、谷胺酰胺合成酶 (GS)、天冬酰胺合成酶、色胺酸合成酶 (吲哚)、組胺醇脫氫酶 (組胺醇 D) 以及編碼對嘌呤黴素、殺稻瘟素、博萊黴素、腐草黴素、氯黴素、Zeocin 和黴酚酸的抗性的基因。更多標記基因描述於 WO 92/08796 和 WO 94/28143 中。
除在相應選擇劑存在下促進選擇之外，選擇標記還可提供編碼細胞中通常不存在的分子的基因，例如 綠色螢光蛋白 (GFP)、增強型 GFP (eGFP)、合成 GFP、黃色螢光蛋白 (YFP)、增強型 YFP (eYFP)、藍綠色螢光蛋白 (CFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed 單體、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPemCFPm、Cerulean 和 T-Sapphire。可透過檢測編碼多肽發出的螢光來區分含有該基因的細胞與不含該基因的細胞。
如本文所用，術語「可操作地連接」係指兩個或更多個組分的並置，其中組分處於使其能夠以預期方式起作用的關係。例如，如果啟動子及/或增強子起到調節編碼序列轉錄的作用，則該啟動子及/或該增強子與編碼序列可操作地連接。在某些實施例中，「可操作地連接」的 DNA 序列在一條染色體上是連續且相鄰的。在某些實施例中，例如，當需要連接兩個蛋白質編碼區 (例如分泌前導區和多肽) 時，序列是連續、相鄰的，並且在同一讀框中。在某些實施例中，可操作連接的啟動子位於編碼序列的上游，並且可以與其相鄰。在某些實施例中，例如，關於調節編碼序列之表現的增強子序列，兩種組分儘管不相鄰，但是可操作地連接。如果增強子增加了編碼序列的轉錄，則該增強子可操作地連接至該編碼序列。可操作地連接的增強子可位於編碼序列的上游、內部或下游，並且可位於距編碼序列的啟動子相當遠的距離。可操作地連接可透過本發明所屬技術領域中已知的重組方法來完成，例如，使用 PCR 方法及/或在方便的限制位點處連接。如果不存在方便的限制位點，則可以按照常規做法使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。如果內部核醣體進入位點 (IRES) 允許以 5' 末端獨立的方式在內部位置啟動 ORF 的翻譯，則認為其與開放讀框 (ORF) 可操作地連接。
如本文所用，術語「表現」係指轉錄及/或翻譯。在某些實施例中，所需產物的轉錄水平可根據存在的相應 mRNA 的量來確定。例如，可透過 PCR 或 Northern 雜交對由所關注序列轉錄的 mRNA 進行定量。在某些實施例中，由所關注序列編碼的蛋白質可藉由多種方法定量，例如藉由 ELISA、藉由測定蛋白質的生物學活性、或藉由使用辨識並結合蛋白質的抗體採用獨立於此等活性之測定 (如西方墨點法或放射免疫測定) 來定量。
本文所用之術語「所關注序列」係指多肽序列 (或在某些情況下，係指編碼多肽序列的核酸)，其中該多肽序列的表現是所關注的。在某些實施例中，此等多肽序列可包含多次單元蛋白複合物的次單元。在某些實施例中，此等多肽序列可包含此等次單元的片段。在某些實施例中，此等多肽序列可包含抗體序列，例如抗體重鏈或輕鏈序列。在某些實施例中，此等多肽序列可包含此等抗體序列的片段。
術語「抗體」在本文中以最廣義使用，並且包括各種抗體結構，其中包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體 (例如 ，雙特異性抗體)、半抗體及抗體片段，只要它們表現出所需的抗原結合活性即可。
如本文所用，「標準抗體」和「標准單株抗體」是具有單一結合特異性的抗體或抗體片段。在某些實施例中，標準抗體之單一結合特異性是重鏈序列或其片段與輕鏈序列或其片段配對的結果。
如本文所用，「雙特異性抗體」或「BsAb」是可以同時結合兩個不同抗原決定基的抗體，例如兩個不同抗原上的兩個不同抗原決定基或單個抗原上的兩個不同抗原決定基。BsAbs 包括許多不同的結構，包括那些包含兩個不同的親代單株抗體的變異重鏈 (VH ) 和輕鏈 (VL ) 結構域的配對結構，從而導致 BsAb 的一個「臂」 (即，一對 VH 和 VL L) 具有第一親代抗體的結合特異性，並且 BsAb 的第二「臂」具有第二親代抗體的結合特異性。BsAbs 是多特異性抗體之子集，其中多特異性抗體具有至少兩種結合特異性 (即 BsAbs)，但也包括三重特異性抗體以及具有更多重特異性的抗體。
如本文所用，術語「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含完整抗體的一部分，與該完整抗體所結合之抗原結合。抗體片段的實例包括但不限於 Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab’)2 ；雙體；線性抗體；單鏈抗體分子 (例如 ，scFv)；及由抗體片段形成的多特異性抗體。
如本文所用，術語「變異區域區」或「變異結構域」係指參與抗體與抗原之結合的抗體重鏈或輕鏈的結構域。天然抗體之重鏈和輕鏈的變異結構域 (分別為 VH 和 VL ) 通常具有相似的結構，其中每個結構域包含四個保守框架區 (FR) 和三個超變異區 (HVR)。參見例如 Kindt 等人，Kuby Immunology，第 6 版，W.H. Freeman and Co.，第 91 頁 (2007)。單個 VH 或 VL 結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，可使用 VH 或 VL 域將結合特定抗原之抗體與結合該抗原之抗體分離，以分別篩選互補 VL 或 VH 域之文庫。參見例如 Portolano 等人，J. Immunol. 150: 880-887 (1993)；Clarkson 等人，Nature 352: 624-628 (1991)。
如本文所用，術語「載體」係指一種核酸分子，其能夠傳送與其連接之另一種核酸。該術語包括作為自我複制核酸結構之載體以及摻入已引入該宿主細胞的基因組中的載體。在某些實施例中，載體指導與其可操作地連接之核酸的表現。此等載體在本文中稱為「表現載體」。
如本文所用，術語「同源性序列」係指具有透過序列比對確定的顯著序列相似性之序列。例如，兩個序列可具有約 50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、或 99.9% 的同源性。比對是藉由算法和計算機程式 (包括但不限於 BLAST、FASTA 及 HMME) 執行，這些算法和計算機程式可比較序列並根據諸如序列長度、序列標識和相似性以及存在性等因素計算匹配的統計顯著性以及序列不匹配和空位的長度。同源性序列既可以指 DNA 序列，也可以指蛋白質序列。
如本文所用，術語「側翼」係指位於第二核苷酸序列的 5' 或 3' 末端或兩端之第一核苷酸序列。側翼核苷酸序列可與第二核苷酸序列相鄰或相距給定之距離。側翼核苷酸序列之長度無具體限制。例如，側翼序列可包含幾個鹼基對或幾千個鹼基對。
如本文所用，術語「外源」表示核苷酸序列並非來源於宿主細胞，而是透過傳統的 DNA 遞送方法，例如透過轉染、電穿孔或轉化方法引入宿主細胞中。術語「內源」係指核苷酸序列來源於宿主細胞。「外源」核苷酸序列可具有在鹼基組成上相同的「內源」對應物，但是其中「外源」序列透過例如重組 DNA 技術被引入宿主細胞中。
如本文所用，「整合位點」包括在宿主細胞基因組內插入外源核苷酸序列的核酸序列。在某些實施例中，整合位點在宿主細胞基因組的兩個相鄰核苷酸之間。在某些實施例中，整合位點包含一段核苷酸序列。在某些實施例中，整合位點位於 TI 宿主細胞基因組的特定基因座內。在某些實施例中，整合位點在 TI 宿主細胞的內源基因內。
如本文所用，術語「TI 宿主細胞」係指包含用於表現所關注序列的一個或多個基因座即整合位點的細胞。在某些實施例中，在包含兩個或更多個 RRS 的一個或多個整合位點的外源核苷酸序列有利於將 SOI 整合到 TI 宿主細胞中。在某些實施例中，能夠在一個或多個整合位點編輯 TI 宿主細胞基因組的基因組編輯系統有利於將 SOI 整合到 TI 宿主細胞中。 2. 宿主細胞製備 & 篩選策略
標準 CLD 策略通常涉及透過編碼所關注的一個或多個序列的一個或多個特定的外源核酸進行多輪宿主細胞轉染。如圖 1A 所示，製備此等外源核酸，例如包含抗體重鏈和輕鏈編碼序列的質粒，然後在靶向整合的背景下透過例如重組酶介導的盒式交換「RMCE」進行轉染。無論整合策略如何 (例如，隨機或靶向整合)，均可在選擇和單細胞株 (SCC) 之前恢復轉染的宿主細胞庫。然後，透過均勻時間分辨螢光 (「HTRF」) 滴定度測定法進行多輪殖株分析，以縮小殖株的數量，從而進行更詳細的生產率和產物質量測定，例如高分子量種類含量 (「% HMWS」)、大小變化、酸性變化和糖基化變化。
圖 2A 展示了基於標準靶向整合的 CLD 策略，其中採用多個 CLD 循環來識別具有所需的表現水平、產物質量屬性和生產培養性能的細胞。在該實例中，透過使多個宿主細胞與編碼所關注序列的兩種外源核酸的特定組合接觸來製備每個轉染細胞庫。儘管圖 2A 展示了一種策略，其中涉及將所關注序列從第一個「前」質粒和第二個「後」質粒插入到宿主基因組的特定基因座中 (有關雙載體 RCME 策略的一般說明，請參見下文第 5.1 節)，應當理解，靶向整合方法可能涉及單個所關注序列或兩個以上的所關注序列的整合。此外，如本文所概述之靶向整合策略不僅可以採用重組酶介導的 SOI 整合，如圖 2A 和 2B 所示，而且可以採用其他基因座特異性策略整合 SOI，例如基因編輯介導的 SOI 整合。但是，如上所述，靶向整合方法的一種限定特徵是它們被設計成導致特定序列以特定排列方式整合，即基因組內固定構型的轉基因。根據該設計特徵，如圖 2A 所概述，有必要執行多個 CLD 循環，以確保測定數量足夠多的所關注序列的拷貝數和排列方式。
與圖 2A 所示的標準資源密集型多循環靶向整合 CLD 策略相比，本專利申請之主題涉及「隨機化配置整合」(在本文中也稱為「隨機鏈整合」) (RCTI) 策略，該策略允許單週期分析所關注序列的拷貝數和排列的變異，但保留靶向整合的基因座特異性整合優勢。如圖 2B 所示，可透過產生單個轉染池來評估編碼所關注序列的所有相關的外源核酸。透過將編碼所關注序列的相關外源核酸的完整互補序列與多個宿主細胞相結合，可創建單個轉染池，從中可以識別表現出所需的表達水平、產物質量屬性和生產培養性能的殖株。
儘管例示性圖 2B 示出採用三個「前」和三個「後」質粒 (各自包含一個或多個所關注序列) 的實施例，其中質粒被整合到存在於宿主細胞基因組的特定基因座的外源核苷酸序列的前或後盒中 (關於此等「雙載體RMCE」策略的完整說明，參見下文第 5.1 節)，但是應當理解，本公開的主題涵蓋此等靶向整合策略各種變異。例如，除使用包括前盒的第一質粒和包括後盒的第二質粒外，本公開還涵蓋涉及單盒整合的方法。另外，本公開還包括涉及將三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個盒整合到存在於宿主細胞基因組的特定基因座的單個外源核苷酸序列中的方法。而且，每個盒不僅可包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個單獨所關注序列，而且每個宿主基因組可包含存在於宿主細胞基因組中的特定基因座的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個外源核苷酸序列，可將包含所關注序列的盒整合到所述序列中。因此，儘管例示性圖 2B 示出了可以使用三個前盒和三個後盒來產生九個可能的所關注序列轉基因構型的策略，但是本公開涵蓋用於產生更少和更多的轉基因構型的策略，包括在宿主基因組中的一個以上的位點產生這些構型。
採用本文所概述之 RCTI 策略可顯著節省資源，包括但不限於節省成本和時間、節省人工以及緩解自動化瓶頸。如圖 3-5 所示，與標準 CLD 策略相比，此等資源節省不會對期望的表達水平的分佈、產物質量屬性或觀察到的生產培養性能產生不利影響。
如圖 6A-6C 所示，RCTI 方法還允許在早期、中期或完全恢復階段進行單細胞選殖。由於標準 CLD 策略通常涉及在進行單細胞選殖之前等待完整的轉染池恢復 (例如，＞90% 的細胞生存力)，因此採用 RCTI 策略可節省大量時間，而不影響殖株的性能 (具有高滴定度和所需產物質量的殖株的百分比) 或異質性 (載體構型、滴定度和產物質量的範圍)。
在某些實施例中，本公開涉及篩選表現至少一種 SOI 的 TI 宿主細胞文庫的基於 RCTI 的高通量方法。在某些實施例中，該方法包括生成 TI 宿主細胞文庫，其中所述文庫包含表現一個或多個 SOI 的多個 TI 宿主細胞，該方法包括以下步驟：將文庫分為單個殖株，並篩殖株中的特定細胞及/或特定產物屬性。在某些實施例中，生成 TI 宿主細胞文庫包括以下步驟：提供多個 TI 宿主細胞，將複數個 TI 宿主細胞與複數個載體接觸，其中該等載體包含一個或多個 SOI，以及將一個或多個 SOI 引入複數個TI 宿主細胞中的一個或多個中。
在某些實施例中，可透過重組酶介導的整合將所關注序列引入本公開的宿主細胞中。在某些實施例中，可透過基因編輯介導的整合將所關注序列引入本公開的宿主細胞中。
在某些實施例中，本公開的篩選方法可包括篩選細胞中的細胞屬性，這些屬性可以是但不限於細胞生長、細胞滴定度、比生產率、體積生產率、殖株穩定性。這些細胞屬性的篩選可藉由本發明所屬技術領域中已知的任何技術來進行。
在某些實施例中，本公開的篩選方法可包括篩選細胞的產物屬性，這些產物屬性可以是但不限於醣基化水平、電荷變異水平、減少的失配、減少蛋白質/肽聚集、蛋白質序列異質性。可以用本發明所屬技術領域中已知的任何技術篩選這些產物屬性，這些技術例如但不限於體積排阻色譜 (SEC)、cDNA 測序、肽圖分析、CE-SDS 或 SDS-PAGE、HPLC、基於 CE 的多聚醣分析、IEF 及離子交換色譜。
在某些實施例中，本公開提供了一種基於 RCTI 的方法，該方法用於生成包含複數個外源核苷酸 SOI 的 TI 宿主細胞庫，包含使複數個 TI 宿主細胞與具有一個或多個 SOI 的載體接觸，將一個或多個 SOI 引入 TI 宿主細胞中，然後選擇表現一種或多種 SOI 的 TI 細胞。在某些實施例中，藉由本公開之方法生成的 TI 宿主細胞將包含整合在 TI 宿主細胞的基因組的一個或多個基因座的一個或多個外源核苷酸序列。在某些實施例中，外源核苷酸序列可包含可為一個或多個選擇標記的側翼的至少兩個 RRS。
在某些實施例中，載體可包含一個或多個選擇性標記基因，以提供表型特徵，用於選擇轉化的宿主細胞，例如用於真核細胞培養基的二氫葉酸還原酶或新黴素抗性。在某些實施例中，宿主細胞可為高等真核細胞，例如哺乳動物細胞，也可以是較低等的真核細胞，例如酵母細胞，或者宿主細胞可為原核細胞，例如細菌細胞。在某些實施例中，可篩選文庫中特定的所關注序列，例如但不限於多肽序列。在某些實施例中，可篩選所得文庫中的殖株，其在表型分析中表現出對所關注多肽的活性。在某些實施例中，可透過本發明所屬技術領域中已知的方法篩選文庫中特定蛋白質 (例如酶) 的活性。
在某些實施例中，本公開涉及一種選擇表現所關注序列的宿主細胞的基於 RCTI 之方法，其包含：提供複數個 TI 宿主細胞；將該複數個 TI 宿主細胞與複數個載體接觸，其中該等載體包含一個或多個 SOI 及至少一個標記；將該等一個或多個 SOI 引入一個或多個該複數個 TI 宿主細胞；以及選擇表現該選擇標記之 TI 宿主細胞，從而分離表現所關注序列之 TI 宿主細胞。在某些實施例中，SOI 可編碼多重次單元蛋白之多肽次單元或其片段。在某些實施例中，SOI 可編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈 Fv 片段 (scFv)、或 Fc 融合蛋白。在某些實施例中，外源核苷酸整合到其中的基因座與選自 SEQ ID No 1-7 的序列具有至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 的同源性。
在某些實施例中，該等一個或多個外源核苷酸序列可整合到一個或多個基因座，其與選自以下項的序列具有至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 的同源性：SEQ ID Nos. 1-12；NW_006874047.1；NW_006884592.1；NW_006881296.1；NW_003616412.1；NW_003615063.1；NW_006882936.1；及 NW_003615411.1。
在某些實施例中，外源核苷酸整合到其中的基因座與選自以下項的序列具有至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 的同源性：美國專利號 9816110 之序列 SEQ ID NO: 1-4，對應於本公開之 SEQ ID NO: 8-11；或國際專利申請號 PCT/US2017/028555 之序列 SEQ ID NO: 1，對應於本公開之 SEQ ID NO: 12。在某些實施例中，可透過重組酶介導的整合將一個或多個所關注序列引入本公開的宿主細胞中。在某些實施例中，可透過基因編輯介導的整合將一個或多個所關注序列引入本公開的宿主細胞中。
在某些實施例中，本公開所述之選擇表現所關注序列的宿主細胞的基於 RCTI 之方法中所用的 TI 宿主細胞可各自具有整合到 TI 宿主細胞的基因組的一個或多個基因座的一個或多個外源核苷酸序列。在某些實施例中，外源核苷酸序列可包含至少兩個 RRS，其處於至少一個第一選擇標記的側翼。在某些實施例中，用於選擇宿主細胞的基於 RCTI 之方法中的載體可包含：至少兩個 RRS，其匹配已整合之外源核苷酸上的至少兩個 RRS；以及一個或多個外源 SOI 及至少一個第二選擇標記，其側翼為這些 RRS。在某些實施例中，外源核苷酸序列可包含位在至少一個第一選擇標記側翼之第一 RRS 及第二 RRS，及位在介於該第一 RRS 與該第二 RRS 之間之第三 RRS，且所有 RRS 都是異種特異的。在某些實施例中，複數個載體可包含第一及第二載體。在某些實施例中，第一載體可包含：兩個 RRS，它們與整合的外源核苷酸序列上的第一和第三 RRS 匹配並位於至少一個第一外源 SOI 之側翼，以及至少一個第二選擇標記；並且第二載體可包含：兩個 RRS，它們與整合的外源核苷酸序列上的第二和第三 RRS 匹配並位於至少一個第二外源 SOI 之側翼，以及至少一個第二外源 SOI。在某些實施例中，複數個載體可包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 個或更多個載體。
在某些實施例中，所關注序列包含多次單元蛋白複合物的一個或多個次單元的序列。在某些實施例中，此等多肽序列可包含此等次單元序列的片段。在某些實施例中，所關注序列可包含此等次單元序列之組合。例如，但並非限制性地，此等組合可包含第一次單元序列中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個及/或第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多次單元序列的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個序列。此外，在某些實施例中，此等組合可包含第一次單元序列中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個明顯變異，及/或第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多次單元序列的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個明顯變異。
在某些實施例中，複數個所關注序列包含一個或多個重鏈序列 (「H」) 及/或一個或多個抗體輕鏈序列 (「L」)。如本文所用，此等「H」和「L」序列可以是全長重鏈或輕鏈序列以及重鏈或輕鏈片段，包括但不限於變異區片段和互補決定區片段。在某些實施例中，所關注序列可包含此等 H 及 L 序列之組合。例如，但並非限制性地，此等組合可包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個 H 序列及一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個 L 序列。此外，某些實施例中，此等組合可包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個相同或不同的明顯 H’ 序列及/或一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個相同或不同的明顯 L’ 序列。本發明所公開之主題還包括一至十個 (或更多) 附加的 H 及 L 序列，例如 H’’、H’’’、L’’ 及 L’’’。例示性實施例包括但不限於包含各種不同的 H 序列及各種不同的 L 序列的任何組合的序列，例如：HL；LH；H’L；LH’；H’L’；L’H’；HLL；HHL；LLH；LHH；H’LL；H’HL；L’HH；L’LH；H’H’L；LH’H’；HLLL；LLLH；HLHL；LHLH；H’LLL；L’LLH；H’LHL；L’HLH；等。
在某些實施例中，本公開涉及一種表現 SOI 之方法，其包含：提供複數個 TI 宿主細胞；將該複數個 TI 宿主細胞與複數個載體接觸，其中該等載體包含一個或多個 SOI 及至少一個標記；將該等一個或多個 SOI 引入一個或多個該複數個 TI 宿主細胞；選擇表現該所關注序列之 TI 細胞；以及在適合於表現所關注序列之條件下培養細胞並從中回收所關注序列。
在某些實施例中，轉染的宿主細胞將包含一個或多個所關注序列，其中所關注序列包含多次單元蛋白複合物的一個或多個次單元之序列。在某些實施例中，此等多肽序列可包含此等次單元序列的片段。在某些實施例中，所關注序列可包含此等次單元序列之組合。例如，但並非限制性地，此等組合可包含第一次單元序列中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個及/或第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多次單元序列的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個序列。此外，在某些實施例中，此等組合可包含第一次單元序列中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個相同或不同的明顯變異，及/或第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多次單元序列的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個相同或不同的明顯變異。
在某些實施例中，轉染的宿主細胞將包含一個或多個所關注序列，其中所關注序列包含 H 及 L 序列之組合。例如，但並非限制性地，此等組合可包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個 H 序列及一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個 L 序列。此外，某些實施例中，此等組合可包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個明顯的 H’ 序列及/或一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個明顯的 L’ 序列。本發明所公開之主題還包括一至十個 (或更多) 附加的 H 及 L 序列，例如 H’’、H’’’、L’’ 及 L’’’。例示性實施例包括但不限於包含各種不同的 H 序列及各種不同的 L 序列的任何組合的序列，例如：HL；LH；H’L；LH’；H’L’；L’H’；HLL；HHL；LLH；LHH；H’LL；H’HL；L’HH；L’LH；H’H’L；LH’H’；HLLL；LLLH；HLHL；LHLH；H’LLL；L’LLH；H’LHL；L’HLH；等。 3. 外源性核苷酸序列
本發明所公開之主題提供了適合整合外源核苷酸序列之宿主細胞。在某些實施例中，外源核苷酸序列用作整合為點，例如透過包含一個或多個重組酶識別序列來實現。在某些實施例中，外源核苷酸序列編碼所關注序列。因此，在某些實施例中，宿主細胞將包含一個或多個外源核苷酸序列，該序列將有利於編碼一個或多個所關注序列的一個或多個外源核苷酸序列的靶向整合。在某些實施例中，包含整合在宿主細胞基因組的整合位點上的外源核苷酸序列的宿主細胞被稱為 TI 宿主細胞。然後可以將編碼一個或多個所關注序列之外源核苷酸序列引入 TI 宿主細胞中，並將整合靶向到整合位點。如下文所概述，TI 宿主細胞可包含多個整合位點，這些整合位點由存在的外源核苷酸序列定義，該外源核苷酸序列包含有助於整合編碼一個或多個所關注序列的外源核苷酸序列的元素 (例如重組酶辨識序列)。
在某些實施例中，整合位點及/或位於整合位點側翼的核苷酸序列可透過實驗進行識別。在某些實施例中，可透過全基因組篩選方法來識別整合位點及/或位於整合位點側翼之核苷酸序列，以分離以期望的水平表現由整合到一個或多個外源核苷酸序列的一個或多個 SOI 編碼之所關注多肽，其中外源序列本身被整合到宿主細胞基因組中的一個或多個基因座中。在某些實施例中，在基於轉位酶的盒整合事件後，可透過全基因組篩選方法識別整合位點及/或位於整合位點側翼之核苷酸序列。在某些實施例中，藉由蠻力隨機整合篩選來識別整合位點及/或位於整合位點側翼之核苷酸序列。在某些實施例中，整合位點及/或位於整合位點側翼之核苷酸序列可透過常規的測序方法確定，例如靶基因座擴增 (TLA)，然後是新一代測序 (NGS) 及全基因組 NGS。在某些實施例中，整合位點在染色體上的位置可藉由常規的細胞生物學方法如螢光原位雜交 (FISH) 分析來確定。
在某些實施例中，宿主細胞包含整合在宿主細胞基因組中特定第一基因座內的第一整合位點的第一外源核苷酸序列及整合在宿主細胞基因組中特定第二基因座內的第二整合位點的第二外源核苷酸序列。在某些實施例中，宿主細胞包含多個整合在宿主細胞基因組中的多個整合位點的多個外源核苷酸序列。3.1 包含重組酶識別序列之外源序列
在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含一個或多個重組酶辨識序列 (RRS)，其中 RRS 可由重組酶進行辨識。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少兩個 RRS。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含兩個 RRS，並且這兩個 RRS 相同。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含兩個 RRS，並且這兩個 RRS 不同。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含三個 RRS，其中第三 RRS 位於第一 RRS 和第二 RRS 之間。在某些實施例中，第一 RRS 和第二 RRS 相同，並且第三 RRS 不同於第一或第二 RRS。在某些實施例中，所有三個 RRS 均不同。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含四個、五個、六個、七個或八個 RRS。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含多個 RRS。在某些實施例中，所述兩個或更多個 RRS 相同。在某些實施例中，所述兩個或更多個 RRS 不同。在某些實施例中，RRS 總數之子集相同，或 RRS 總數之子集不同。在某些實施例中，一個或多個 RRS 可選自由以下序列所組成之群組：LoxP 序列、LoxP L3 序列、LoxP 2L 序列、LoxFas 序列、Lox511 序列、Lox2272 序列、Lox2372 序列、Lox5171 序列、Loxm2 序列、Lox71 序列、Lox66 序列、FRT 序列、Bxb1 attP 序列、Bxb1 attB 序列、φC31 attP 序列及 φC31 attB 序列。
在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含一個 RRS 及至少一個選擇標記。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含第一 RRS 和第二 RRS 及至少一個選擇標記。在某些實施例中，選擇標記位於第一 RRS 和第二 RRS 之間。在某些實施例中，兩個 RRS 位於至少一個選擇標記之側翼，即第一 RRS 位於 5’ 上游，並且第二 RRS 位於選擇標記的 3’ 下游。在某些實施例中，第一 RRS 與選擇標記之 5’ 端相鄰，並且第二 RRS 與選擇標記之 3’ 端相鄰。
在某些實施例中，選擇標記位於第一 RRS 和第二 RRS 之間，並且這兩個側翼 RRS 相同。在某些實施例中，位於選擇標記之側翼的兩個 RRS 均為 LoxP 序列。在某些實施例中，位於選擇標記之側翼的兩個 RRS 均為 FRT 序列。在某些實施例中，選擇標記位於第一 RRS 和第二 RRS 之間，並且這兩個側翼 RRS 不同。在某些實施例中，第一側翼 RRS 為 LoxP L3 序列，並且第二側翼 RRS 為 LoxP 2L 序列。在某些實施例中，LoxP L3 序列位於選擇標記之 5’ 端，並且 LoxP 2L 序列位於選擇標記之 3’ 端。在某些實施例中，第一側翼 RRS 為野生型 FRT 序列，並且第二側翼 RRS 為突變型 FRT 序列。在某些實施例中，第一側翼 RRS 為 Bxb1 attP 序列，並且第二側翼 RRS 為 Bxb1 attB 序列。在某些實施例中，第一側翼 RRS 為 φC31 attP 序列，並且第二側翼 RRS 為 φC31 attB 序列。在某些實施例中，兩個 RRS 處於相同的方向。在某些實施例中，兩個 RRS 均處於正向或反向。在某些實施例中，兩個 RRS 處於相反的方向。
在某些實施例中，選擇標記可為胺基糖苷磷酸轉移酶 (APH) (例如，潮黴素磷酸轉移酶 (HYG)、新黴素和 G418 APH)、二氫葉酸還原酶 (DHFR)、胸苷激酶 (TK)、谷胺酰胺合成酶 (GS)、天冬酰胺合成酶、色胺酸合成酶 (吲哚)、組胺醇脫氫酶 (組胺醇 D) 以及編碼對嘌呤黴素、殺稻瘟素、博萊黴素、腐草黴素、氯黴素、Zeocin 或黴酚酸的抗性的基因。在某些實施例中，選擇標記可為 GFP、eGFP、合成 GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed 單體、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean、或 T-Sapphire 標記。
在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含兩個選擇標記，兩個 RRS 處於其側翼，其中第一選擇標記不同於第二選擇標記。在某些實施例中，兩個選擇標記均選自由以下項所組成之群組：谷胺酰胺合成酶選擇標記、胸苷激酶選擇標記、HYG 選擇標記及嘌呤黴素抗性選擇標記。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含胸苷激酶選擇標記及 HYG 選擇標記。在某些實施例中，第一選擇標記選自由以下各者所組成之群組：胺基糖苷磷酸轉移酶 (APH) (例如，潮黴素磷酸轉移酶 (HYG)、新黴素和 G418 APH)、二氫葉酸還原酶 (DHFR)、胸苷激酶 (TK)、谷胺酰胺合成酶 (GS)、天冬酰胺合成酶、色胺酸合成酶 (吲哚)、組胺醇脫氫酶 (組胺醇 D) 以及編碼對嘌呤黴素、殺稻瘟素、博萊黴素、腐草黴素、氯黴素、Zeocin 或黴酚酸的抗性的基因，並且第二選擇標記選自由以下各者所組成之群組：GFP、eGFP、合成 GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed 單體、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean、或 T-Sapphire 標記。在某些實施例中，第一選擇標記為谷胺酰胺合成酶選擇標記，並且第二選擇標記為 GFP 標記。在某些實施例中，處於兩個選擇標記之側翼的這兩個 RRS 相同。在某些實施例中，處於兩個選擇標記之側翼的這兩個 RRS 不同。
在某些實施例中，選擇標記可操作地連接至啟動子序列。在某些實施例中，選擇標記可操作地連接至 SV40 啟動子。在某些實施例中，選擇標記可操作地連接至鉅細胞病毒 (CMV) 啟動子。
在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記及 IRES，其中 IRES 可操作地連接至選擇標記。在某些實施例中，可操作地連接至 IRES 的選擇標記選自由以下各者所組成之群組：GFP、eGFP、合成 GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed 單體、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean、或 T-Sapphire 標記。在某些實施例中，可操作地連接至 IRES 的選擇標記為 GFP 標記。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含 IRES 以及側翼帶有兩個 RRS 的兩個選擇標記，其中 IRES 可操作地連接至第二選擇標記。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含 IRES 以及側翼帶有兩個 RRS 的三個選擇標記，其中 IRES 可操作地連接至第三選擇標記。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含 IRES 以及側翼帶有兩個 RRS 的三個選擇標記，其中 IRES 可操作地連接至第三選擇標記。在某些實施例中，第三選擇標記不同於第一選擇標記或第二選擇標記。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含可操作地連接至啟動子的第一選擇標記及可操作地連接至 IRES 的第二選擇標記。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含可操作地連接至 SV40 啟動子的谷胺酰胺合成酶選擇標記及可操作地連接至 IRES 的 GFP 選擇標記。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含可操作地連接至 CMV 啟動子的胸苷激酶選擇標記和 HYG 選擇標記以及可操作地連接至 IRES 的 GFP 選擇標記。
在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含三個 RRS。在某些實施例中，該第三 RRS 位於第一 RRS 和第二 RRS 之間。在某些實施例中，所有三個 RRS 均相同。在某些實施例中，第一 RRS 和第二 RRS 相同，並且第三 RRS 不同於第一或第二 RRS。在某些實施例中，所有三個 RRS 均不同。
在某些實施例中，用作整合位點的外源核苷酸序列將存在於 TI 宿主細胞的基因組的特定基因座內的位點。在某些實施例中，外源核苷酸整合到其中的基因座與選自 SEQ ID No 1-7 的序列的至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 同源。在某些實施例中，外源核苷酸整合到其中的基因座與選自以下項的序列具有至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 的同源性：美國專利號 9816110 之序列 SEQ ID NO: 1-4，對應於本公開之 SEQ ID NO: 8-11；或國際專利申請號 PCT/US2017/028555 之序列 SEQ ID NO: 1，對應於本公開之 SEQ ID NO: 12。
在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在 TI 宿主細胞的基因組特定基因座的位點。在某些實施例中，外源核苷酸整合到其中的基因座與選自以下序列的至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 同源：Contigs NW_006874047.1、NW_ 006884592.1、NW_ 006881296.1、NW_ 003616412.1、NW_ 003615063.1、NW_ 006882936.1、及 NW_ 003615411.1。
在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在整合位點，該整合位點位於選自 SEQ ID No. 1 的數量為 1-1,000 bp；1,000-2,000 bp；2,000-3,000 bp；3,000-4,000 bp；及 4,000-4,301 bp 的核苷酸處。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在整合位點，該整合位點位於選自 SEQ ID No. 2 的數量為 1-100,000 bp；100,000-200,000 bp；200,000-300,000 bp；300,000-400,000 bp；400,000-500,000 bp；500,000-600,000 bp；600,000-700,000 bp；及 700,000-728785 bp 的核苷酸處。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在整合位點，該整合位點位於選自 SEQ ID No. 3 的數量為 1-100,000 bp；100,000-200,000 bp；200,000-300,000 bp；300,000-400,000 bp；及 400,000-413,983 bp 的核苷酸處。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在整合位點，該整合位點位於選自 SEQ ID No. 4 的數量為 1-10,000 bp；10,000-20,000 bp；20,000-30,000 bp；及 30,000-30,757 bp 的核苷酸處。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在整合位點，該整合位點位於選自 SEQ ID No. 5 的數量為 1-10,000 bp；10,000-20,000 bp；20,000-30,000 bp；30,000-40,000 bp；40,000-50,000 bp；50,000-60,000 bp；及 60,000-68,962 bp 的核苷酸處。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在整合位點，該整合位點位於選自 SEQ ID No. 6 的數量為 1-10,000 bp；10,000-20,000 bp；20,000-30,000 bp；30,000-40,000 bp；40,000-50,000 bp；及 50,000-51,326 bp 的核苷酸處。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在整合位點，該整合位點位於選自 SEQ ID No. 7 的數量為 1-10,000 bp；10,000-20,000 bp；及 20,000-22,904 bp 的核苷酸處。
在某些實施例中，緊鄰整合之外源序列 5’ 端的核苷酸序列選自由以下各者所組成之群組：NW_006874047.1 的核苷酸 41190-45269、NW_006884592.1 的核苷酸 63590-207911、NW_006881296.1 的核苷酸 253831-491909、NW_003616412.1 的核苷酸 69303-79768、NW_003615063.1 的核苷酸 293481-315265、NW_006882936.1 的核苷酸 2650443-2662054、或 NW_003615411.1 的核苷酸 82214-97705，並且該序列與其具有至少 50% 的同源性。在某些實施例中，緊鄰整合之外源序列 5’ 端的核苷酸序列與 NW_006874047.1 的核苷酸 41190-45269、NW_006884592.1 的核苷酸 63590-207911、NW_006881296.1 的核苷酸 253831-491909、NW_003616412.1 的核苷酸 69303-79768、NW_003615063.1 的核苷酸 293481-315265、NW_006882936.1 的核苷酸 2650443-2662054、或 NW_003615411.1 的核苷酸 82214-97705 具有至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 的同源性。
在某些實施例中，緊鄰整合之外源序列 3’ 端的核苷酸序列選自由以下各者所組成之群組：NW_006874047.1 的核苷酸 45270-45490、NW_006884592.1 的核苷酸 207912-792374、NW_006881296.1 的核苷酸 491910-667813、NW_003616412.1 的核苷酸 79769-100059、NW_003615063.1 的核苷酸 315266-362442、NW_006882936.1 的核苷酸 2662055-2701768、或 NW_003615411.1 的核苷酸 97706-105117，並且該序列與其具有至少 50% 的同源性。在某些實施例中，緊鄰整合之外源序列 3’ 端的核苷酸序列與 NW_006874047.1 的核苷酸 45270-45490、NW_006884592.1 的核苷酸 207912-792374、NW_006881296.1 的核苷酸 491910-667813、NW_003616412.1 的核苷酸 79769-100059、NW_003615063.1 的核苷酸 315266-362442、NW_006882936.1 的核苷酸 2662055-2701768、或 NW_003615411.1 的核苷酸 97706-105117 具有至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 的同源性。
在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列可操作地連接至選自由 SEQ ID. No. 1-7 所組成之群組的核苷酸序列，並且該序列與其具有至少 50% 的同源性。在某些實施例中，可操作地連接至外源核苷酸序列的核苷酸序列與選自 SEQ ID. No. 1-7 的序列具有至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 的同源性。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個 SOI。在某些實施例中，與隨機整合的 SOI 相比，可操作地連接的核苷酸序列增加了 SOI 的表現水平。在某些實施例中，整合之外源 SOI 比隨機整合的 SOI 的表現高約 20%、30%、40%、50%、100%、2 倍、3 倍、5 倍或 10 倍。
在某些實施例中，整合之外源序列以選自由以下各者所組成之群組的核苷酸序列作為 5’ 端的側翼：NW_006874047.1 的核苷酸 41190-45269、NW_006884592.1 的核苷酸 63590-207911、NW_006881296.1 的核苷酸 253831-491909、NW_003616412.1 的核苷酸 69303-79768、NW_003615063.1 的核苷酸 293481-315265、NW_006882936.1 的核苷酸 2650443-2662054、及 NW_003615411.1 的核苷酸 82214-97705，並且該序列與其具有至少 50% 的同源性；並且以選自由以下各者所組成之群組的核苷酸序列作為 3’ 端的側翼：NW_006874047.1 的核苷酸 45270-45490、NW_006884592.1 的核苷酸 207912-792374、NW_006881296.1 的核苷酸 491910-667813、NW_003616412.1 的核苷酸 79769-100059、NW_003615063.1 的核苷酸 315266-362442、NW_006882936.1 的核苷酸 2662055-2701768、及 NW_003615411.1 的核苷酸 97706-105117，並且該序列與其具有至少 50% 的同源性。在某些實施例中，作為整合之外源核苷酸序列的 5’ 端之側翼的核苷酸序列與 NW_006874047.1 的核苷酸 41190-45269、NW_006884592.1 的核苷酸 63590-207911、NW_006881296.1 的核苷酸 253831-491909、NW_003616412.1 的核苷酸 69303-79768、NW_003615063.1 的核苷酸 293481-315265、NW_006882936.1 的核苷酸 2650443-2662054、及 NW_003615411.1 的核苷酸 82214-97705 具有至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 的同源性，並且作作為整合之外源核苷酸序列的 3’ 端之側翼的核苷酸序列與 NW_006874047.1 的核苷酸 45270-45490、NW_006884592.1 的核苷酸 207912-792374、NW_006881296.1 的核苷酸 491910-667813、NW_003616412.1 的核苷酸 79769-100059、NW_003615063.1 的核苷酸 315266-362442、NW_006882936.1 的核苷酸 2662055-2701768、及 NW_003615411.1 的核苷酸 97706-105117 具有至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 的同源性。
在某些實施例中，整合之外源核苷酸整合至緊鄰選自由以下序列所組成之群組的序列之全部或一部分的基因座中：該序列與選自 SEQ ID No. 1-7 的序列具有至少約 90% 的同源性。
在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列鄰近選自由 SEQ ID. No. 1-7 所組成之群組的核苷酸序列，並且該序列與其具有至少 50% 的同源性。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列與選自由 SEQ ID. No. 1-7 所組成之群組的序列相距約 100 bp、約 200 bp、約 500 bp、約 1 kb，並且該序列與其具有至少 50% 的同源性。在某些實施例中，鄰近外源核苷酸序列的核苷酸序列與選自 SEQ ID. No. 1-7 的序列具有至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 的同源性。
在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在整合位點，該整合位點鄰近選自 SEQ ID No. 1 的數量為 1-1,000 bp；1,000-2,000 bp；2,000-3,000 bp；3,000-4,000 bp；及 4,000-4,301 bp 的核苷酸。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在整合位點，該整合位點鄰近選自 SEQ ID No. 2 的數量為 1-100,000 bp；100,000-200,000 bp；200,000-300,000 bp；300,000-400,000 bp；400,000-500,000 bp；500,000-600,000 bp；600,000-700,000 bp；及 700,000-728785 bp 的核苷酸。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在整合位點，該整合位點鄰近選自 SEQ ID No. 3 的數量為 1-100,000 bp；100,000-200,000 bp；200,000-300,000 bp；300,000-400,000 bp；及 400,000-413,983 bp 的核苷酸。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在整合位點，該整合位點鄰近選自 SEQ ID No. 4 的數量為 1-10,000 bp；10,000-20,000 bp；20,000-30,000 bp；及 30,000-30,757 bp 的核苷酸。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在整合位點，該整合位點鄰近選自 SEQ ID No. 5 的數量為 1-10,000 bp；10,000-20,000 bp；20,000-30,000 bp；30,000-40,000 bp；40,000-50,000 bp；50,000-60,000 bp；及 60,000-68,962 bp 的核苷酸。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在整合位點，該整合位點鄰近選自 SEQ ID No. 6 的數量為 1-10,000 bp；10,000-20,000 bp；20,000-30,000 bp；30,000-40,000 bp；40,000-50,000 bp；及 50,000-51,326 bp 的核苷酸。在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在整合位點，該整合位點鄰近選自 SEQ ID No. 7 的數量為 1-10,000 bp；10,000-20,000 bp；及 20,000-22,904 bp 的核苷酸。
在某些實施例中，包含外源核苷酸序列之整合位點的基因座不編碼開讀框 (ORF)。在某些實施例中，構成外源核苷酸序列之整合位點的基因座包括順式作用元件，例如啟動子和增強子。在某些實施例中，構成外源核苷酸序列之整合位點的基因座不含任何增強基因表現之順式作用元件，例如啟動子和增強子。
在某些實施例中，外源核苷酸序列整合在外源基因內的整合位點處，該外源基因選自由 LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及 XP_003512331.2 所組成之群組。內生 LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及 XP_003512331.2 基因包括 LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及 XP_003512331.2 基因的野生型和所有同源性序列。在某些實施例中，LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及 XP_003512331.2 基因的同源性序列可與野生型 LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及 XP_003512331.2 基因具有至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 的同源性。在某些實施例中，LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及 XP_003512331.2 基因為野生型哺乳動物 LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及 XP_003512331.2 基因。在某些實施例中，LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及 XP_003512331.2 基因為野生型人 LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及 XP_003512331.2 基因。在某些實施例中，LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及 XP_003512331.2 基因為野生型倉鼠 LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及 XP_003512331.2 基因。
在某些實施例中，整合位點可操作地連接至選自由 LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2 所組成之群組的內生基因，並且具有至少約 90% 的同源性序列。在某些實施例中，整合位點以選自由 LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2 所組成之群組的內生基因作為側翼，並且具有至少約 90% 的同源性序列。
表 1 提供了例示性 TI 宿主細胞整合位點：表 1 - TI 宿主細胞整合位點
宿主 Contig Contig 大小 (kb) 整合位點 (bp) 基因 (SEQ ID 編號 )
1 NW_006874047.1 727 45269 LOC107977062 (SEQ ID No. 1)
2 NW_006884592.1 931 207911 LOC100768845 (SEQ ID No. 2)
3 NW_006881296.1 1016 491909 ITPR2 (SEQ ID No. 3)
4 NW_003616412.1 127 79768 ERE67000.1 (SEQ ID No. 4)
5 NW_003615063.1 372 315265 UBAP2 (SEQ ID No. 5)
6 NW_006882936.1 3042 2662054 MTMR2 (SEQ ID No. 6)
7 NW_003615411.1 277 97706 XP_003512331.2 (SEQ ID No. 7)
3.2 包含所關注序列的外源核苷酸序列
在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個外源 SOI。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記及至少一個外源 SOI。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記、至少一個外源 SOI、及至少一個 RRS。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個或更多 SOI。在某些實施例中，SOI 相同。在某些實施例中，SOI 不同。
如上所述，在某些實施例中，SOI 編碼多次單元蛋白複合物中的一個或多個次單元。在某些實施例中，此等多肽序列可包含此等次單元序列的片段。在某些實施例中，所關注序列可包含此等次單元序列之組合。例如，但並非限制性地，此等組合可包含第一次單元序列中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個及/或第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多次單元序列的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個序列。此外，在某些實施例中，此等組合可包含第一次單元序列中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個明顯變異，及/或第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多次單元序列的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個明顯變異。
在某些實施例中，SOI 編碼單鏈抗體或其片段。在某些實施例中，SOI 編碼抗體重鏈序列或其片段。在某些實施例中，SOI 編碼抗體輕鏈序列或其片段。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含編碼抗體重鏈序列或其片段的 SOI 及編碼抗體輕鏈序列或其片段的 SOI。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含編碼第一抗體重鏈序列或其片段的 SOI、編碼第二抗體重鏈序列或其片段的 SOI 及編碼抗體輕鏈序列或其片段的 SOI。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含編碼第一抗體重鏈序列或其片段的 SOI、編碼第二抗體重鏈序列或其片段的 SOI、編碼抗體第一輕鏈序列或其片段的 SOI 及編碼抗體輕鏈序列或其片段的第二 SOI。在某些實施例中，可選擇編碼重鏈和輕鏈序列的 SOI 的數目，以實現所需的重鏈和輕鏈多肽的表現水平，例如，以實現所需量的雙特異性抗體產生。在某些實施例中，可以將編碼重鏈和輕鏈序列的單個 SOI 整合到，例如，存在於單個整合位點之單個外源核酸序列、存在於單個整合位點之多個外源核酸序列、或 TI 宿主細胞內整合在不同整合位點的多個外源核酸序列。
在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記、至少一個外源 SOI、及一個 RRS。在某些實施例中，RRS 鄰近至少一個選擇標記或至少一個外源 SOI。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記、至少一個外源 SOI、及兩個 RRS。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記及至少一個外源 SOI (位於第一RRS 和第二 RRS 之間)。在某些實施例中，處於兩個選擇標記之側翼的這兩個 RRS 與外源 SOI 相同。在某些實施例中，處於兩個選擇標記之側翼的這兩個 RRS 與外源 SOI 不同。在某些實施例中，第一側翼 RRS 為 LoxP L3 序列，並且第二側翼 RRS 為 LoxP 2L 序列。在某些實施例中，L3 LoxP 序列位於選擇標記及外源 SOI 之 5’ 端，並且 LoxP 2L 序列位於選擇標記及外源 SOI 之 3’ 端。
在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含三個 RRS 及兩個外源 SOI，並且第三 RRS 位於第一 RRS 和第二 RRS 之間。在某些實施例中，第一 SOI 位於第一 RRS 和第三 RRS 之間，並且第二 SOI 位於第三 RRS 和第三 RRS 之間。在某些實施例中，第一 SOI 和第二SOI 不同。在某些實施例中，第一 RRS 和第二 RRS 相同，並且第三 RRS 不同於第一或第二 RRS。在某些實施例中，所有三個 RRS 均不同。在某些實施例中，第一 RRS 為 LoxP L3 位點，第二 RRS 為 LoxP 2L 位點，第三 RRS 為 LoxFas 位點。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含三個 RRS、一個外源 SOI 及一個選擇標記。在某些實施例中，該 SOI 位於第一 RRS 和第三 RRS 之間，並且選擇標記位於第三 RRS 和第三 RRS 之間。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含三個 RRS、兩個外源 SOI 及一個選擇標記。在某些實施例中，第一 SOI 及選擇標記位於第一 RRS 和第三 RRS 之間，並且第二 SOI 位於第三 RRS 和第三 RRS 之間。
在某些實施例中，外源 SOI 編碼所關注多肽，包括但不限於抗體、酶、細胞因子、生長因子、激素、病毒蛋白、細菌蛋白、疫苗蛋白、或具有治療功能之蛋白。在某些實施例中，外源 SOI 編碼抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，外源 SOI 編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈 Fv 片段 (scFv)、或 Fc 融合蛋白。在某些實施例中，外源 SOI 可操作地連接至至少一個順式作用元件，例如啟動子或增強子。在某些實施例中，外源 SOI 可操作地連接至 CMV 啟動子。
在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含兩個 RRS 和位於這兩個 RRS 之間的至少兩個外源 SOI。在某些實施例中，編碼抗體的一條重鏈和一條輕鏈的 SOI 位於兩個 RRS 之間。在某些實施例中，編碼抗體的一條重鏈和兩條輕鏈的 SOI 位於兩個 RRS 之間。在某些實施例中，編碼抗體的重鏈和輕鏈之拷貝的不同組合的 SOI 位於兩個 RRS 之間。
在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含三個 RRS 及至少兩個外源 SOI，並且第三 RRS 位於第一 RRS 和第二 RRS 之間。在某些實施例中，至少一個 SOI 位於第一 RRS 和第三 RRS 之間，並且至少一個 SOI 位於第三 RRS 和第三 RRS 之間。在某些實施例中，第一 RRS 和第二 RRS 相同，並且第三 RRS 不同於第一或第二 RRS。在某些實施例中，所有三個 RRS 均不同。在某些實施例中，編碼第一抗體之一條重鏈和一條輕鏈的 SOI 位於第一 RRS 和第三 RRS 之間，並且編碼第二抗體之一條重鏈和一條輕鏈的 SOI 位於第三 RRS 和第二 RRS 之間。在某些實施例中，編碼第一抗體之一條重鏈和兩條輕鏈的 SOI 位於第一 RRS 和第三 RRS 之間，並且編碼第二抗體之一條重鏈和一條輕鏈的 SOI 位於第三 RRS 和第二 RRS 之間。在某些實施例中，編碼第一抗體之一條重鏈和三條輕鏈的 SOI 位於第一 RRS 和第三 RRS 之間，並且編碼第一抗體之一條輕鏈及第二抗體之一條重鏈和一條輕鏈的 SOI 位於第三 RRS 和第二 RRS 之間。在某些實施例中，編碼第一抗體之一條重鏈和三條輕鏈的 SOI 位於第一 RRS 和第三 RRS 之間，並且編碼第一抗體之兩條輕鏈及第二抗體之一條重鏈和一條輕鏈的 SOI 位於第三 RRS 和第二 RRS 之間。在某些實施例中，編碼多個抗體的重鏈和輕鏈拷貝的不同組合的 SOI 位於第一 RRS 和第三 RRS 之間以及第三 RRS 和第二 RRS 之間。 4. 宿主細胞
在某些實施例中，宿主細胞為真核宿主細胞.  在某些實施例中，宿主細胞為哺乳動物宿主細胞.  在某些實施例中，宿主細胞為倉鼠宿主細胞、人宿主細胞、大鼠宿主細胞、或小鼠宿主細胞。在某些實施例中，宿主細胞為中國倉鼠卵巢 (CHO) 宿主細胞、CHO K1 宿主細胞、CHO K1SV 宿主細胞、DG44 宿主細胞、DUKXB-11 宿主細胞、CHOK1S 宿主細胞、或 CHO K1M 宿主細胞。
在某些實施例中，宿主細胞選自由以下各者所組成之群組：由 SV40 (COS-7) 轉化的猴腎 CV1 系；人胚胎腎系 (如 Graham 等人，J. Gen Virol. 36: 59 (1977) 中所述之 293 或 293 細胞)；幼地鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (如 Mather，Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980) 中所述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞 (MMT 060562)；TRI 細胞 (如 Mather 等人，Annals N.Y.Acad. Sci. 383:44-68 (1982) 所述)、MRC 5 細胞、FS4 細胞、Y0 細胞、NS0 細胞、Sp2/0 細胞、及 PER.C6® 細胞。
在某些實施例中，宿主細胞是細胞株。在某些實施例中，宿主細胞是已經培養了多代的細胞株。在某些實施例中，宿主細胞是原代細胞。
在某些實施例中，如果在 10、20、30、50、100、200 或 300 代內將表現水平維持在一定水平，增加或減少小於 20%，則認為所關注多肽的表現是穩定的。在某些實施例中，如果無需進行任何選擇即可維持培養，則所關注多肽的表現將是穩定的。在某些實施例中，如果所關注基因的多肽產物達到約 1 g/L、約 2 g/L、約 3 g/L、約 4 g/L、約 5 g/L、約 10 g/L、約 12g/L、約 14 g/L、或約 16 g/L，則表明所關注多肽之表現水平高。
在某些實施例中，產生所關注多肽並將其分泌到細胞培養基中。在某些實施例中，所關注多肽得到表現並保留在宿主細胞內。在某些實施例中，所關注多肽得到表現，被插入並保留在宿主細胞膜內。
可利用常規細胞生物學方法將所關注外源核苷酸或載體引入宿主細胞中，這些方法包括但不限於轉染、轉導、電穿孔或註射。在某些實施例中，利用基於化學的轉染方法將所關注外源核苷酸或載體引入宿主細胞中，這些方法包括基於脂質的轉染方法、基於磷酸鈣的轉染方法、基於陽離子聚合物的轉染方法或奈米顆粒的轉染。在某些實施例中，利用病毒介導的轉導方法將所關注外源核苷酸引入宿主細胞中，該方法包括但不限於慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒或腺相關病毒介導的轉導。在某些實施例中，利用基因槍介導之注射將所關注外源核苷酸引入宿主細胞中。在某些實施例中，使用本文所述之方法將 DNA 和 RNA 分子均引入宿主細胞中。 5. 靶向整合
靶向整合方法可以將外源核苷酸序列整合到宿主細胞基因組的一個或多個預定位點。在某些實施例中，靶向整合由辨識一個或多個 RRS 的重組酶介導。在某些實施例中，靶向整合由同源重組介導。在某些實施例中，靶向整合由外源位點特異性核酸酶介導，然後是 HDR 及/或 NHEJ 介導。 5.1. 藉由重組酶介導的重組進行靶向整合
「重組酶辨識序列」 (RRS) 是由重組酶辨識的核苷酸序列，並且對於重組酶介導的重組事件是必要和充分的。RRS 可用於定義核苷酸序列中發生重組事件的位置。
在某些實施例中，RRS 選自由以下序列所組成之群組：LoxP 序列、LoxP L3 序列、LoxP 2L 序列、LoxFas 序列、Lox511 序列、Lox2272 序列、Lox2372 序列、Lox5171 序列、Loxm2 序列、Lox71 序列、Lox66 序列、FRT 序列、Bxb1 attP 序列、Bxb1 attB 序列、φC31 attP 序列及 φC31 attB 序列。
在某些實施例中，RRS 可由 Cre 重組酶辨識。在某些實施例中，RRS 可由 FLP 重組酶辨識。在某些實施例中，RRS 可由 Bxb1 整合酶辨識。在某些實施例中，RRS 可由 φC31 整合酶辨識。
在某些實施例中，當 RRS 為 LoxP 位點時，宿主細胞需要 Cre 重組酶進行重組。在某些實施例中，當 RRS 為 FRT 位點時，宿主細胞需要 FLP 重組酶進行重組。在某些實施例中，當 RRS 為 Bxb1 attP 或 Bxb1 attB 位點時，宿主細胞需要 Bxb1 整合酶進行重組。在某些實施例中，當 RRS 為 φC31 attP 或 a φC31attB 位點時，宿主細胞需要 φC31 整合酶進行重組。可使用包含酶的編碼序列的表現載體將重組酶引入宿主細胞中。
Cre-LoxP 位點特異性重組體系已廣泛用於許多生物學實驗系統中。Cre 是一種 38 kDa 位點特異性 DNA 重組酶，可識別 34 bp LoxP 序列。Cre 來源於噬菌體 P1，並且屬於酪胺酸家族位點特異性重組酶。Cre 重組酶可以介導 LoxP 序列之間的分子內和分子間重組。LoxP 序列由 8 bp 非回文核心區和兩個 13 bp 的反向重複序列組成。Cre 重組酶與 13 bp 重複序列結合，從而介導 8 bp 核心區內的重組。Cre-LoxP 介導的重組高效發生，且無需任何其他宿主因子。如果將兩個 LoxP 序列以相同的方向置於同一核苷酸序列上，則 Cre 介導的重組將切除位於兩個 LoxP 序列之間的 DNA 序列，使其成為共價閉合環。如果兩個 LoxP 序列位於同一核苷酸序列的反向位置，則 Cre 介導的重組將顛倒位於兩個序列之間的 DNA 序列的方向。還可以將 LoxP 序列置於不同的染色體上，以促進不同染色體之間的重組。如果兩個 LoxP 序列位於兩個不同 DNA 分子上，並且一個 DNA 分子是環狀分子，則 Cre 介導的重組將導致環狀 DNA 序列的整合。
在某些實施例中，LoxP 序列為野生型 LoxP 序列。在某些實施例中，LoxP 序列為突變型 LoxP 序列。已開發出突變型 LoxP 序列以提高 Cre 所介導之整合或置換的效率。在某些實施例中，突變型 LoxP 序列選自由以下序列所組成之群組：LoxP L3 序列、LoxP 2L 序列、LoxFas 序列、Lox511 序列、Lox2272 序列、Lox2372 序列、Lox5171 序列、Loxm2 序列、Lox71 序列、及 Lox66 序列。例如，Lox71 序列在左側 13 bp 重複序列中具有 5 bp 的突變。Lox66 序列在右側 13 bp 重複序列中具有 5 bp 的突變。野生型和突變型 LoxP 序列均可介導 Cre 依賴性重組。
FLP-FRT 位點特異性重組體系類似於 Cre-Lox 體系。其中涉及內翻轉酶 (FLP) 重組酶，該酶來源於釀酒酵母的 2 µm 質粒。FLP 也屬於酪胺酸家族位點特異性重組酶。FRT 序列是一種 34 bp 序列，由兩個回文序列組成，每個回文序列的側翼為 8 bp，且間隔區為 13 bp。FLP 與 13 bp 回文序列結合，並在 8 bp 的間隔區內介導 DNA 斷裂、交換和連接。與 Cre 重組酶類似，兩個 FRT 序列的位置和方向決定了 FLP 介導的重組的結果。在某些實施例中，FRT 序列為野生型 FRT 序列。在某些實施例中，FRT 序列為突變型 FRT 序列。野生型和突變型 FRT 序列均可介導 FLP 依賴性重組。在某些實施例中，FRT 序列與響應性受體結構域序列諸如但不限於他莫昔芬響應性受體結構域序列融合。
Bxb1 和 φC31 屬於絲胺酸重組酶家族。它們均來源於噬菌體，並由這些噬菌體用於確定溶原性，以促進噬菌體基因組到細菌基因組的位點特異性整合。這些整合物催化短 (40-60 bp) DNA 基質 (稱為attP 和attB 序列) 之間的位點特異性重組事件，這些基質最初分別位於噬菌體 DNA 和細菌 DNA 上。重組後，形成兩個新序列，分別稱為attL 和attR 序列，並且每個序列包含來源於attP 和attB 的一半序列。重組也可能發生在attL 和attR 序列之間，以將整合之噬菌體從細菌 DNA 中切除。兩種整合酶均可催化重組，而無需任何其他宿主因子的輔助。在不存在任何輔助因子的情況下，這些整合酶介導attP 和attB 之間的單向重組效率超過 80%。由於可由這些整合酶識別之短 DNA 序列及單向重組，因此將這些重組系統開發為對廣泛用於基因工程目的之 Cre-LoxP 和 FRT-FLP 系統的補充。
術語「匹配 RRS」表示兩個 RRS 之間發生重組。在某些實施例中，兩個匹配 RRS 相同。在某些實施例中，兩個 RRS 均為野生型 LoxP 序列。在某些實施例中，兩個 RRS 均為突變型 LoxP 序列。在某些實施例中，兩個 RRS 均為野生型 FRT 序列。在某些實施例中，兩個 RRS 均為突變型 FRT 序列。在某些實施例中，兩個匹配 RRS 為不同序列，但是可藉由相同的重組酶進行辨識。在某些實施例中，第一匹配 RRS 是 Bxb1attP 序列，並且第二匹配 RRS 是 Bxb1attB 序列。在某些實施例中，第一匹配 RRS 是 φC31attB 序列，並且第二匹配 RRS 是 φC31attB 序列。
在某些實施例中，採用「單載體 RMCE」策略。例如，在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含兩個 RRS，並且載體包含兩個 RRS，這兩個 RRS 匹配整合之外源核苷酸序列上的兩個 RRS，即整合之外源核苷酸序列上的第一 RRS 匹配載體上之第一 RRS，並且整合之外源核苷酸序列上的第二 RRS 匹配載體上之第二 RRS。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列上的第一 RRS 及載體上之第一 RRS 與整合之外源核苷酸序列上的第二 RRS 及載體上之第二 RRS 相同。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列上的第一 RRS 及載體上之第一 RRS 與整合之外源核苷酸序列上的第二 RRS 及載體上之第二 RRS 不同。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列上的第一 RRS 及載體上之第一 RRS 均為 LoxP L3 序列，並且整合之外源核苷酸序列上的第二 RRS 及載體上之第二 RRS 均為 LoxP 2L 序列。
在某些實施例中，採用「雙載體 RMCE」策略。例如，但並非限制性地，整合之外源核苷酸序列可包含三個 RRS，例如其排列方式為第三 RRS (「RRS3」) 存在於第一RRS (「RRS1」) 和第二RRS (「RRS2」) 之間，而第一載體包含兩個 RRS，這兩個 RRS 匹配整合之外源核苷酸序列上的第一 RRS 和第三 RRS，並且第二載體包含兩個 RRS，這兩個 RRS 匹配整合之外源核苷酸序列上的第三 RRS 和第二 RRS。藉由在每對 RRS 之間整合適當數量之 SOI，這兩種載體 RMCE 策略均允許引入十個或更多個 SOI。
單載體和兩載體 RMCE 均允許將一個或多個供體 DNA 分子單向整合到宿主細胞基因組的預定位點中，並使供體 DNA 上存在的 DNA 盒與整合位點所在之宿主基因組上的 DNA 盒精確交換。DNA 盒之特徵在於，位於至少一個選擇標記側翼之兩個異種特異 RRS (儘管在某些雙載體 RMCE 實例中，可使用如本文所概述之「分離選擇標記」) 及/或至少一個外源 SOI。RMCE 參與靶基因組基因座內兩個異種特異 RRS 與供體 DNA 分子之間的重組酶催化的雙重重組交換事件。RMCE 旨在將 SOI 或選擇標記的拷貝引入宿主細胞基因組的預定位點。與僅涉及一個交換事件的重組不同，RMCE 可實施為使得不將原核載體序列引入宿主細胞基因組中，從而減少及/或防止不希望之宿主免疫或防禦機制觸發。可使用多個 DNA 盒重複執行 RMCE 程序，例如，在圖 2B 中，採用 RMCE 程序方便地引入三個不同的「前」盒和三個不同的「後」盒。但是，如上所述，可以採用 RMCE (和其他整合策略) 來引入少至一個盒以及多達十個或更多個盒。
在某些實施例中，藉由一次交換重組事件實現靶向整合，其中將包含與至少一個外源 SOI 或至少一個選擇標記相鄰的一個 RRS 的一個外源核苷酸序列整合到宿主細胞基因組的預定位點。在某些實施例中，藉由一次 RMCE 實現靶向整合，其中將包含至少一個外源 SOI 或至少一個選擇標記 (以兩個異種特異 RRS 為側翼) 的 DNA 盒整合到宿主細胞基因組的預定位點。在某些實施例中，靶向整合藉由兩次 RMCE 實現，其中將兩個不同的各自包含至少一個外源 SOI 或至少一個選擇標記 (以兩個異種特異 RRS 為側翼) 的 DNA 盒整合到宿主細胞基因組的預定位點。在某些實施例中，靶向整合藉由多次 RMCE 實現，其中將來自多個載體的 DNA 盒，其各自包含至少一個外源 SOI 或至少一個選擇標記 (以兩個異種特異 RRS 為側翼)，整合到宿主細胞基因組的預定位點。在某些實施例中，選擇標記可部分地編碼在第一載體上，並且部分地編碼在第二載體上，使得兩次 RMCE 的整合均允許表現選擇標記。
在某些實施例中，藉由重組酶介導的重組實現的靶向整合導致選擇標記或一個或多個外源 SOI 與來自原核載體的序列一起整合到宿主細胞基因組的一個或多個預定整合位點。在某些實施例中，藉由重組酶介導的重組實現的靶向整合導致選擇標記或一個或多個外源 SOI 整合到宿主細胞基因組的一個或多個預定整合位點，而不包含來自原核載體的序列。 5.2 藉由同源重組 (HDR 或 NHEJ) 進行靶向整合
本發明所公開之主題還涉及藉由同源重組或藉由外源位點特異性核酸酶以及 HDR 或 NHEJ 介導的靶向整合。在某些實施例中，此等整合在本文中稱為「基因編輯介導之整合」。
同源重組是具有廣泛序列同源性的 DNA 分子之間的重組。它可用於引導雙股 DNA 斷裂的無錯誤修復，並在減數分裂過程中在配子中產生序列變異。由於同源重組涉及兩個同源 DNA 分子之間的遺傳訊息交換，因此不改變基因在染色體上的整體排列。在同源重組過程中，雙股 DNA (dsDNA) 形成缺口或斷裂，然後單鏈 DNA 末端侵入同源 dsDNA 分子，同源序列發生配對，分支遷移以形成哈勒戴連結，並最終分離哈勒戴連結。
雙股斷裂 (DSB) 是最嚴重的 DNA 損傷形式，此等 DNA 損傷的修復對於維持所有生物體的基因組完整性至關重要。修復 DSB 的途徑主要有兩種。第一種修復途徑是同源性定向修復 (HDR) 途徑，並且同源重組是 HDR 中最常用的形式。由於 HDR 需要細胞中存在同源 DNA，因此該修復途徑通常用於細胞週期的 S 和 G2 期，其中新復制的姐妹染色分體可作為同源模板。HDR 也是修復 DNA 複製過程中折疊的複制叉的主要修復途徑。HDR 被視為一種相對無錯誤的修復途徑。針對 DSB 的第二修復途徑是非同源性末端鏈接 (NHEJ)。NHEJ 作為一種修復途徑，其中將斷裂 DNA 之末端連接在一起而無需同源 DNA 模板。
外源位點特異性核酸酶，例如基因編輯核酸酶，然後是 HDR，可促進靶向整合。這是因為可透過在特定靶基因組位點引入 DSB 來增加同源重組的頻率。在某些實施例中，外源核酸酶可選自由以下各者所組成之群組：鋅指核酸酶 (ZFN)、ZFN 二聚體、轉錄激活因子樣效應核酸酶 (TALEN)、TAL 效應子域融合蛋白、RNA 引導之 DNA 內切核酸酶、工程化大範圍核酸酶以及常間回文重複序列叢集 (CRISPR) 關聯 (Cas) 內切核酸酶。
CRISPR/Cas 和 TALEN 系統是兩種基因組編輯工具，可提供最佳的構建簡便性和高效率。CRISPR/Cas 被認為是細菌對入侵噬菌體的免疫防禦機制。Cas 是一種核酸酶，當由合成導向 RNA (gRNA) 引導時，能夠與細胞中之特定核苷酸序列相關聯，並且藉由例如形成單股斷裂、DSB 及/或點突變中之一種或多種來編輯核苷酸序列內或周圍之 DNA。TALEN 是一種工程化位點特異性核酸酶，由 TALE的DNA結合結構域 (轉錄激活因子樣效應物) 和限制性內切核酸酶 FokI 的催化結構域構成。藉由改變 DNA 結合域單體的高度可變的殘基區域中存在的胺基酸，可形成不同的人工 TALEN，以靶向各種核苷酸序列。DNA 結合域隨後將核酸酶引導至靶序列，並形成 DSB。
藉由同源重組或 HDR 進行的靶向整合涉及使同源性序列存在於整合位點。在某些實施例中，同源序列存在於載體上。在某些實施例中，同源序列存在於多核苷酸上。
在某些實施例中，同源重組在不含任何輔助因子的情況下進行。在某些實施例中，由於能夠整合之載體的存在而促進同源重組。在某些實施例中，整合載體選自由以下各者所組成之群組：腺相關病毒載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體及噬菌體整合載體。 5.3 調控系統
本發明所公開之主題還涉及在 RCTI (稱為 「隨機配置調控靶向整合」，在本文中也稱為「隨機鏈調控靶向整合」(「RCRTI」)) 中使用的調控系統。例如，在許多情況下，蛋白質表達水平並非最佳，主要是由於編碼蛋白難以表現。難以表現之蛋白質的低表現水平可能具有不同的難以確定之原因。一種可能是宿主細胞中表現的蛋白質的毒性。在此等情況下，可使用調控表現系統來表現有毒蛋白質，其中編碼蛋白質的所關注序列在誘導型啟動子的控制下。在這些系統中，僅當將調節劑諸如但不限於四環素或其類似物強力黴素 (DOX) 等小分子加入培養基時，才引起難以表現之蛋白質的表現。調節有毒蛋白質之表現可減輕其毒性作用，使培養物在生產前達到所需的細胞生長。在某些實施例中，「隨機配置調控靶向整合」 (在本文中也稱為「隨機鏈調控靶向整合」) (RCRTI) 系統包含整合到特定基因座 (例如包含一個或多個 RRS 的外源核酸序列) 的 SOI，並在與之可操作連接的調控啟動子下轉錄。在某些實施例中，RCRTI 系統可用於確定難於表現之分子 (例如但不限於抗體) 蛋白質表現水平低的根本原因。在某些實施例中，可透過選擇性關閉 RCRTI 系統中 SOI 的表現的能力將 SOI 的表現與觀察到的不良反應聯繫起來。
在某些實施例中，為了在難以表現之分子的根本原因分析過程中最小化轉錄和細胞株變異性的影響，可使用「隨機配置調控靶向整合」 (在本文中也稱為「隨機鏈調控靶向整合」) (RCRTI) 系統。例如，但並非限制性地，可透過添加調節劑例如多西環素來觸發 TI 宿主中 SOI 之表現。在某些實施例中，RCRTI 載體利用四環素調節的啟動子表現 SOI，該 SOI 可整合到例如包含 RRS 的外源核酸序列中，而 RRS 本身可整合到宿主的整合位點中細胞的基因組，實現 SOI 的調控表現。
在某些實施例中，與對照細胞株相比，本公開中描述的 RCRTI 系統可用於成功確定 SOI 例如治療性抗體的低蛋白表現水平之根本原因。在某些實施例中，一旦SOI(例如治療性抗體)在 RCRTI 細胞株中的較低相對表現水平被確認，便可利用蛋白質翻譯抑製劑治療 (例如，Dox 及放線菌酮) 來評估 SOI 的細胞內積累和分泌水平。
例如，但並非限制性地，此等調控可基於透過調節轉錄抑制因子或激活因子與組成或最小啟動子的偶聯來阻斷或激活 mRNA 合成的基因開關。在某些非限制性實施例中，可透過結合抑制蛋白來實現抑制，例如，該蛋白在空間上阻斷轉錄起始，或透過抑制轉錄沉默子主動抑制轉錄。在某些非限制性實施例中，哺乳動物或無病毒增強子的最小啟動子的激活可透過與激活結構域的調節偶聯來實現。
在某些實施例中，轉錄抑制因子或激活因子的條件偶聯可透過使用變構蛋白來實現，該變構蛋白能結合啟動子以響應於外部刺激。在某些實施例中，轉錄抑制因子或激活因子的條件偶聯可透過使用從螯合蛋白釋放的細胞內受體來實現，從而能夠結合靶啟動子。在某些實施例中，轉錄抑制因子或激活因子的條件偶聯可透過使用化學誘導的二聚體來實現。
在某些實施例中，本公開之 TI 系統中所用的變構蛋白可為響應於抗生素、細菌群體感應信使、分解代謝物或培養參數諸如溫度 (冷或熱) 而調節轉錄活性的蛋白。在某些實施例中，此等 RCRTI 系統可基於分解代謝物，例如，將控制其他碳源分解代謝基因的細菌抑制因子轉移到哺乳動物細胞中。在某些實施例中，可透過抑制因子 CymR 的累積應答結合來抑制靶啟動子。在某些實施例中，基於分解代謝物的系統可透過與單純皰疹病毒 VP16 反式激活域融合的原核生物制因子 HdnoR 的 6-羥基菸鹼反應性結合，依賴於嵌合啟動子的激活。
在某些實施例中，TI 系統可為基於群體感應的表現系統，該系統來源於原核生物，該原核生物透過群體感應分子來管理群體內和群體間交流。這些群體感應分子與靶細胞中的受體結合，調節受體與同源啟動子的親和性，從而引發特定調控開關之啟動。在某些實施例中，群體感應分子可為 N-(3-氧代-辛酰基)-高絲胺酸內酯，在存在該分子的情況下，TraR-p65 融合蛋白激活融合到 TraR 特異性操縱基因序列的最小啟動子的表現。在某些實施例中，在基於天藍色鏈黴菌 A3(2) ScbR 抑制因子 (在不存在 SCB1 的情況下結合其同源操縱子 OScbR) 的系統中，群體感應分子可以為丁內酯 SCB1 (外消旋 2-(1'-羥基-6-甲基庚基)-3-(羥甲基)-丁醇化物)。在某些實施例中，群體感應分子可以為 RTI 系統中所用之高絲胺酸衍生誘導劑，其中銅綠假單胞菌群體感應抑制因子 RhlR 和 LasR 與 SV40 T 抗原核定位序列和單純皰疹 VP16 結構域融合並可激活包含特定操縱基因序列的啟動子 (las 框)。
在某些實施例中，調節本公開之 RCRTI 系統中所用的變構蛋白的誘導分子可以為但不限於 cumate、異丙基-β-D-吡喃半乳糖苷 (IPTG)、大環內酯類、6-羥菸鹼、強力黴素、鏈黴菌素、NADH、四環素。
在某些實施例中，本公開之 RCRTI 系統中所用的細胞內受體可以為細胞質或核受體。在某些實施例中，本公開之 RCRTI 系統可利用透過小分子從螯合和抑制蛋白質中釋放出轉錄因子。在某些實施例中，本公開之 RCRTI 系統可依賴類固醇調節，其中激素受體與天然或人工轉錄因子融合，該天然或人工轉錄因子可從 HSP90 在細胞質中釋放出來，遷移至細胞核中並激活選定的啟動子。在某些實施例中，可使用由合成類固醇類似物調節的突變型受體，以免內生類固醇激素引起串擾。在某些實施例中，受體可以是對 4-羥基他莫昔芬有反應之雌激素受體變體或 RU486 可誘導的孕激素突變受體。在某些實施例中，基於人核過氧化物酶體增殖物激活受體 γ(PPARγ) 的核受體衍生的羅格列酮響應轉錄開關可用於本發明之 RCRTI 系統中。在某些實施例中，RheoSwitch 可為類固醇反應性受體的變體，其基於修飾後的云杉色卷蛾蛻皮激素受體及融合至 Gal4 DNA 結合域和 VP16 反式激活劑的小鼠類視色素 X 受體 (RXR)。在存在合成蛻皮激素的情況下，RheoSwitch 變體可結合並激活與 Gal4 反應元件的多個重複序列融合的最小啟動子。
在某些實施例中，本文所公開之 RCRTI 系統可利用化學誘導的 DNA 結合蛋白和轉錄激活劑的二聚作用來激活與同源操縱子融合之最小核心啟動子。在某些實施例中，本文所公開之 RCRTI 系統可利用雷帕黴素調節的 FRBP 與 FRB 的二聚作用。在該系統中，FRB 與 p65 反式激活劑融合，並且 FKBP 與鋅指結構域融合，該鋅指結構域特異於工程化最小白介素 12 啟動子上游的同源操縱子位點。在某些實施例中，FKBP 可發生突變。某些實施例中，本文所公開之 RCRTI 系統可利用細菌促旋酶 B 次單元 (GyrB)，其中在存在抗生素考默黴素的情況下 GyrB 發生二聚並與新生物素解離。
在某些實施例中，本公開之 RCRTI 系統可用於受調控之 siRNA 表現。在某些實施例中，受調控之 siRNA 表現系統可以是四環素、大環內酯、或 OFF 和 ON 型 QuoRex 系統。在某些實施例中，RTI 系統可利用Xenopus 末端低聚嘧啶元件 (TOP)，該元件透過在 5' 非翻譯區形成髮夾結構來阻止翻譯啟動。
在某些實施例中，本公開所述之 RCRTI 系統可利用氣相控製表現例如乙醛誘導的調控 (AIR) 系統。AIR 系統可採用構巢曲霉的 AlcR 轉錄因子，在無毒濃度的氣態或液態乙醛存在下，特異性激活由 AlcR 特異性操縱基因組裝的 PAIR 啟動子，這些操縱基因融合至最小的人類鉅細胞病毒啟動子。
在某些實施例中，本公開之 RCRTI 系統可利用 Tet-On 或 Tet-Off 系統。在此等系統中，一種或多種 SOI 之表現可由四環素或其類似物強力黴素進行調節。
在某些實施例中，本公開之 RCRTI 系統可利用 PIP-on 或 PIP-off 系統。在此等系統中，SOI 之表現可由例如原始黴素、四環素及/或紅黴素進行調節。 6. 產物
本公開之宿主細胞可用於表現任何所關注分子。在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於表現多肽，例如哺乳動物多肽。此等多肽之非限制性實例包括激素、受體、融合蛋白、調節因子、生長因子、補體系統因子、酶、凝血因子、抗凝血因子、激酶、細胞因子、CD 蛋白、白介素、治療性蛋白質、診斷性蛋白質及抗體。在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於表現伴侶蛋白、蛋白質修飾酶、shRNA、gRNA 或其他蛋白質或肽，同時組成性或調控地表現所關注之治療性蛋白質或分子。
在某些實施例中，所關注多肽是雙特異性、三特異性或多特異性多肽，例如雙特異性抗體。
與常規細胞培養方法中所用之細胞例如非 TI 細胞相比，本公開之宿主細胞可在較短的時間內用於產生大量所關注之分子。在某些實施例中，與常規細胞培養方法中所用之細胞例如非 TI 細胞相比，本公開之宿主細胞可用於提高所關注分子的質量。在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於透過預防慢性毒性來增強種子序列的穩定性，該慢性毒性可由引起細胞應激和殖株隨時間推移的不穩定性的產物而引起。在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於實現急性毒性產物的最佳表現。
在某些實施例中，本公開之宿主細胞和系統可用於細胞培養過程的優化及/或流程開發。
在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於治療性分子之所選次單元的組成性表達以及同一治療性分子的其他不同次單元的調控表現。在某些實施例中，治療性分子可為融合蛋白。在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於理解每個抗體次單元在完全組裝的抗體分子的表現及分泌中的作用和效應。
在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用作研究工具。在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用作診斷工具，以針對各種細胞中存在問題的分子找出低蛋白表現水平的根本原因。在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於將觀察到的現像或細胞行為與細胞中的轉基因表現直接聯係起來。本公開之宿主細胞還可用於證明觀察到的行為在細胞中是否可逆。在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於識別和緩解有關轉基因在細胞中轉錄和表達的問題。
在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於交換難以表現之分子的轉基因次單元，例如但不限於抗體之 HC 和 LC 次單元與系統中的平均分子分子相結合，以識別有問題的次單元。在某些實施例中，然後可使用胺基酸序列分析來縮小範圍並集中於可能導致低蛋白表現水平的胺基酸殘基或區域。實例 材料與方法 細胞培養基
藉由將編碼抗體的盒靶向整合至來源於 CHO-K1 細胞株之宿主細胞株中來執行穩定的細胞株開發 (Crawford Y. 等人，Biotechnol Prog 2013，29，1307-1315)。將細胞置於 125 mL 搖瓶中 (轉速為 150 rpm) 或 50 mL 管式生物反應器中 (轉速為 225 rpm)，在專有培養基中於 37ºC 和 5% CO2 下進行培養。每 3-4 天以 4 × 105 個細胞/mL 的接種密度傳代培養的細胞。藉由 PCR 反應確定表現 RCTI 殖株的分子 X 的載體構型
使用 DNeasy 血液和組織試劑盒 (目錄號 69506，Qiagen) 從 2 × 106 個細胞中提取基因組 DNA，並使用 LongAmp Taq 預混液 (目錄號 M0287，New England Biolabs) 進行 PCR 測定。熱循環參數：在 94ºC 下持續 3 分鐘，40 X (在 94ºC 下持續 30 秒，在 60ºC 下持續 1 分鐘，並在 65ºC 下持續 9.75 分鐘)，及在 65ºC 下持續 20 分鐘。使用來自 New England Biolabs 的酶對 PCR 產物進行診斷消化。使用以下引體進行 PCR 測定：正向引體：GGTTCTCCTTGACCAATACCTCGTAAG；逆向引體：GCGGGACTATGGTTGCTGACTAAT。搖瓶分批補料及 AmbrTM 生物反應器生產測定
在搖瓶中使用專有的化學組成確定的培養基在 14 天的生產過程中，對單株抗體A (「mAb A」)和表現 Molecule-Z 的殖株進行分批補料評估。在第 0 天以 1 × 106 個細胞/mL 接種細胞，在第 3 天將培養物的溫度由 37ºC 改為 35ºC，並在第 3、7 和 10 天添加由專有的化學組成確定的混合物組成的大劑量進料。用 Vi-Cell XR (Beckman Coulter) 測量活力和活細胞計數，並使用 Nova BioProfile 400 (Nova Biomedical) 測定乳酸和葡萄糖水平。
為評估表現 Molecule-Y 的殖株，在 ambrTM 系統 (Sartorius) 中進行 14 天的生產培養，如 Hsu, W. T. 等人所述 (Cytotechnology 2012，64，667-678)，進行以下修改：在搖瓶中於 37°C 和 150 rpm 下以 1 × 106 個細胞/mL 的密度接種 4 天。將生產培養物以 2 × 106 個細胞/mL 的密度接種，最初保持在 36ºC，然後在第 6 天將溫度改為 35ºC。在第 3、6、8 和 10 天添加由專有的化學組成確定的混合物組成的大劑量進料。在 BioProfile Flex2 (Nova Biomedical) 上測量活力和細胞計數。在 BioProfile Flex2 (Nova Biomedical) 或 ABL90 Flex (Radiometer) 上測定 pH、pO2、pCO2、葡萄糖、乳酸鹽及其他代謝物。滴定量和產物質量的分析測定
使用 protein-A 親和色譜和 UV 檢測測定滴定量。大小和電荷變異分別藉由 protein A PhyTip 純化 (PhyNexus)、體積排阻色譜和成像毛細管等電聚焦 (icIEF) 進行測量。經 icIEF 分析之前，用羧肽酶 B 處理經過 Phytip 純化的樣本。對於 Molecule-Y，使用液相色譜-質譜 (LC-MS) 來定量分析正確組裝的異二聚體、同二聚體、半抗體和輕鏈錯配物種的相對量，如 Williams, A. J. 等人所述 (Ind Eng Chem Res 2017，56，1713-1722)。當前轉染 (TFX) 策略與 RCTI 的 TFX 策略的比較
使用「隨機化構型靶向整合」 (本文也稱為「隨機化鏈靶向整合」) 方法產生穩定細胞株，該穩定細胞株生成單株抗體 A (「mAb A」) (圖 11A)。在該方法中，使用三個「前」和三個「後」表現載體的文庫轉染宿主細胞，每個表現載體包含 mAb A 重鏈或輕鏈序列重複序列的三種可能的組合之一。如本實例中所用，對「前」和「後」表現載體的引用是指在基於兩個載體 RCME 的外源所關注序列引入的背景下的上游 (前) 和下游 (後) 盒位點。有關兩種基於 RCME 的策略的更多細節，請參見例如上文第 5.1 節。頂級殖株的滴定度為 3.4–4.7 g/L，並根據滴定度、生產率、細胞培養性能、產物質量和流式細胞儀群體異質性進行選擇。
與之前針對 mAb A 的細胞株開發 (CLD) 所做的工作相比，本文所述之 RCTI CLD 方法生產的殖株的滴定度、產物質量和生產培養性能與標準 CLD 方法生產的殖株相當，同時以更少的 CLD 循環篩選更少的殖株。
先前針對 mAb A 的 CLD 工作已在獨立的標準 CLD 方法工作流程中測試了前後載體的單獨組合 (見圖 2A)。總共轉染了 7 種前後載體構型組合，並透過池生產對其進行評估。在這 7 種載體組合中，將 4 種向前推進至基於池生產滴定度進行 SCC 和殖株評估。因此，執行四次獨立的 CLD 循環以及三個附加的部分 CLD 循環，其中轉染三個附加的載體組合並透過池生產對其進行評估。
相比之下，RCTI CLD 方法僅執行一次 CLD 循環。表 1 總結了針對各種方法評估的殖株的數量，圖 2A 和 2B 示出用於 mAb A 殖株評估的 RCTI 和標準 CLD 工作流程的比較。表 1. 針對標準方法和 RCTI CLD 篩選的殖株總結
   標準 CLD RCTI CLD
執行的 CLD 循環次數 4+a 1
從 SCC 中挑選的殖株 4,224 704
在生產測定中評估的殖株 120 24
a 對於標準 CLD 方法，同時執行四次獨立的 CLD 循環以及三個附加的部分 CLD 循環，其中轉染三個附加的載體組合並透過池生產對其進行評估。
對於 RCTI CLD 方法，對三個實驗組進行評估，它們分別對應於三個回收階段的轉染池：(i) 早期 (轉染後第 5 天，歸入選擇培養基中)，(ii) 中間 (選擇後，殖株恢復大約 35% 的生存力)，或 (iii) 完全 (選擇後，殖株恢復 ＞ 90% 的生存力) (見圖 6A)。為比較 RCTI CLD 方法與標準 CLD 方法，本節僅討論來自第三組的殖株 (選擇後，殖株恢復 ＞ 90% 的生存力)，因為標準 CLD 規定池的 SCC 生存力 ＞ 90%。對於標準 CLD 方法和 RCTI 方法，一次 CLD 循環被定義為從轉染到殖株生產培養評估的整個過程。
對於之前的 mAb A CLD 工作，大部分具有最高滴定度的殖株也表現出高聚集度，即 HMWS 高於 10-15%。因此，在比較標準 CLD 方法和 RCTI 方法生產的選殖時，在選擇頂部 RCTI CLD 殖株時同時考慮到效價和 % HMWS。對於透過標準 CLD 方法生產的殖株，某些構型的 % HMWS 分佈與前後載體構型大致成簇 (圖 3B)。例如，具有 C-2 構型之殖株 (圖 3A) 通常產生較低的 % HMWS，而具有 B-2 構型之殖株 (圖 3A) 產生較高的 % HMWS。
對於 RCTI 殖株，滴定度和 % HMWS 的範圍與標準 CLD 殖株產生的滴定度範圍相當 (圖 3B)，儘管篩選的殖株要少得多。由於 RCTI 方法涉及轉染前後 DNA 載體的隨機文庫，因此使用長程 PCR 來確定生產培養中評估的殖株的前載體構型。儘管 24 個殖株中的 3 個的長程 PCR 結果不確定，但與標準 CLD 殖株相比，其餘殖株在前載體構型和 % HMWS 分佈方面相似。具有 C 前載體構型的大多數殖株表現出的 % HMWS 低於具有 B 構型的殖株，而具有 A 前構型的殖株涵蓋 % HMWS 之範圍。此處不必後載體構型，因為 % HMWS 的水平僅與前載體構型直接相關。RCTI 殖株的第 14 天最高滴定度也與標準 CLD 殖株 (≥ 4.5 g/L) 相當。需注意，如果僅以標準 CLD 方法測試了 B-2 (圖 3A) 或 A-1 (圖 3A) 構型，則可以獲得具有高滴定度和低聚集體的組合的少數殖株 (如有)。
標準 CLD 和 RCTI CLD 方法之間的增長、生產率及其他產物質量屬性也相當。圖 5 總結了兩種 CLD 方法在生產培養基中評估的所有殖株中各種屬性的分佈。同樣地，由 RCTI CLD 方法產生的頂級殖株在生產培養基中的表現與透過標準 CLD 方法產生的頂級殖株相當。在標準 CLD 方法中測試的構型中，僅 A-2 和 C-2 構型具有高滴定度 (≥ 3.6 g/L)，而產生的聚集度較低 (% HMWS ≤ 15.4%)。透過 RCTI 方法獲得的殖株具有與標準 CLD 方法相似的聚集度和滴定度範圍。儘管由 RCTI 方法得到的代表性高產殖株似乎在表 2 中呈 C 構型，如圖 3B 所示，但也觀察到來自構型 A 的高滴定度和低聚集度的殖株，儘管它們未排入產量最高的殖株中。表 2 比較了根據標準方法和 RCTI CLD 方法得到的頂級殖株的滴定度、生長和產物質量屬性。表 2. 使用標準 CLD 和 RCTI CLD 生產的頂級 mAb A 殖株的比較
構型 D14 效價 (g/L) D14 IVCC HMWS (%) Acidics (%) Man5 (%) D14 生存力 (%)
標準 CLD 方法殖株
A-2 4.5 994 15.4 33.7 0.9 96.2
A-2 4.2 939 14.1 32.0 0.6 96.0
A-2 3.9 1007 5.7 30.7 0.4 96.3
A-2 3.9 1386 7.4 29.8 0.4 97.7
A-2 3.6 1302 6.8 31.3 0.5 96.1
C-2 4.0 1262 7.1 34.6 0.7 93.2
RCTI CLD 方法殖株a
C 4.0 1782.4 10.9 29.6 0.4 94.4
C 4.0 1595.8 8.6 35.0 0.4 93.1
C 4.7 1875.0 11.4 34.7 0.5 93.8
C 3.4 1463.1 5.9 31.6 0.3 91.7
a 對於 RCTI 殖株，在該比較中僅考慮來自第三實驗組 (庫選擇後，回收率高於 90% 的 SCC) 的頂級殖株。
與之前 mAb A 的 CLD 工作 (使用標準 CLD 方法) 相比，RCTI 方法具有許多優勢。首先，單個 RCTI CLD 循環可用於篩選與標準 CLD 循環相比具有相同數量 (如果不多) 的載體構型，同時使用較少的資源。對於 mAb A，標準 CLD 方法需要 4 次以上的 CLD 循環來篩選 9 種可能的載體構型組合中的 7 種，而 RCTI 方法在一次 CLD 循環中即可篩選全部 9 種組合。也可以篩選較少的單個殖株。在針對 mAb A 的所有標準 CLD 循環中，從 SCC 中總共挑選了 4,224 個殖株，並縮小為 120 個殖株以在生產培養基中進行篩選。相比之下，在 RCTI 方法中，從 SCC 中總共選擇了 704 個種殖株進行，並在生產培養基中篩選了 24 個殖株。由於減少了 CLD 循環並減少了要篩選之殖株的數量，RCTI 方法能夠減少 CLD 的人工需求，包括減少人工成本和執行 SCC、成像及匹配結果挑選的自動化資源負擔。最後，儘管減少了所需的 CLD 循環及篩選的殖株數量，但透過 RCTI 方法產生的殖株的滴定度、細胞培養基性能和產物質量與標準 CLD 方法相當。透過兩種方法產生的頂級殖株也相當。RCTI CLD 表現雙特異性抗體的評估
評估了 RCTI 方法對具有高臨床需求的疾病適應症的雙特異性抗體 (「Molecule-Y」) 之表現，因此需要在殖株篩選過程中分離出高滴定度細胞株。雙特異性抗體在單個宿主中的表現可導致不想要的副產物的組裝，例如具有常見或錯配輕鏈物的同二聚體和異二聚體 (Dillon M. 等人，mAbs 2017，9，213-230；Carter, P. J.，Experimental cell research 2011，317，1261-1269)。因此，雙特異性抗體殖株評估中的關鍵步驟是分離殖株，其不僅具有較高的總滴定度，而且具有高效滴定度 (所需的雙特異性抗體)，並且副產物的水平最低，難以從靶標雙特異性抗體中純化出來。對於 Molecule-Y (圖 11B)，要純化的最具挑戰性的副產物是具有常見輕鏈 (本文稱為「常見 LC BsAb」) 的異二聚體重鏈。因此，在標準 TI CLD 過程中，嘗試並行 CLD 時使用四種不同的載體構型，並且在 SCC 之前進行池生產評估期間，使用質譜法測量常見 LC BsAb 及有效滴定度水平。針對 SLC 選擇含量最低的常見 LC BsAb 池，然後在針對標準 TI CLD 方法的生產測定中 (圖 7A，正方形) 評估中具有最高滴定度和最低 LC-BsAb 的 62 個殖株。
由於之前已經確定，在 RCTI CLD 方法中，回收的池仍保持載體構型異質性 (圖 6B 和圖 6C)，對於 Molecule-Y 的 RCTI CLD，所有四個載體構型均用於轉染 TI 宿主，並且僅在完全池回收後才進行 SCC。此外，在早期篩選步驟中，僅根據透過快速火焰質譜法獲得的有效滴定度對殖株進行排名。在此過程中，在殖株選擇中不考慮常見 LC BsAb 或其他單個副產物的水平。基於這些標準，然後在生產測定中評估了頂級 36 個 RCTI 殖株 (圖 7A，圓圈)。儘管在生產測定中僅評估了一半殖株，但相對於標準 TI CLD 殖株，RCTI CLD 方法殖株的總滴定度 (約 6 g/L) 和有效滴定度 (4-5.5 g/L) 可以分離出 CLD 殖株 (圖 7A)。此外，與標準 TI 殖株相比，RCTI 殖株總體上具有更出色的比生產率 (圖 7B)、更高的生存力 (圖 8A) 及略低的生長 (圖 8B) 特徵。由於透過流程優化可以更輕鬆地改善培養生長，因此，表現 Molecule-Y 的 RCTI 殖株的滴定度可能高於標準 TI 殖株對應物。RCTI 殖株還具有非常低的 (約 5% 或更少) 常見 LC BsAb 副產物，大約與標準 TI 殖株所觀察到的結果一樣低 (圖 8C)。但是，預計標準 TI 殖株具有總體上較低的常見 LC BsAb 副產物，因為在生產培養基中進行評估之前已經篩選出這一特質。RCTI 殖株的產物質量與標準 TI 同類產品相當或更出色。相對於標準 TI 殖株，表現 Molecule-Y 的 RCTI 殖株也具有相對較低的聚集都 (圖 8D)、較低的酸性物種 (圖 8E) 和較高的 % 主要物種 (圖 8F)，這些是更理想的產物質量參數。在從這兩種方法分離出的殖株之間，% 鹼性物種的水平相當 (圖 8G)。RCTI CLD 對複合嵌合抗體 / 配體分子表現之評估
許多即將出現的用於各種疾病適應症的治療性分子不再僅僅是常規抗體，而是具有更複雜的結構，因此更難以表現。在標準 TI 方法中表現一種此等複雜分子 (「Molecule-Z」)，需要使用六種不同的載體構型進行並行 CLD，然後在生產培養基中篩選 96 種不同的殖株，以獲得具有高效滴定度之殖株。(圖 9A，正方形)。因此，包含與 Fc 融合的配體複合的半抗體的 Molecule-Z (圖 11C) 被視是難以表現的分子，並且我們決定使用 RCTI CLD 方法測試其表現。使用所有六種不同載體構型的混合物轉染 TI 宿主細胞，並在一個池中選擇它們，然後進行 SCC 篩選，在生產測定中僅評估 23 種 RCTI 殖株，可分離出與透過標準 TI CLD 方法分離的頂級殖株具有相當的滴定度和產物質量的殖株 (圖 9A)。與標準 TI 殖株相比，RCTI 殖株具有更高的總體比生產率 (圖 9B)、可比的生存力 (圖 10A)、略低的生長速度 (圖 10B) 和較低的總體聚集度 (圖 10C)。由於具有較高的比生產率 (約高 2 倍，圖 9B)，如果藉由流程優化進一步提高細胞的生長，RCTI 殖株可實現更高的有效滴定度。最後，RCTI 殖株與標準 TI 殖株具有相當的酸性電荷變異體 (圖 10D)、% 主電荷變異體 (圖 10E) 和 % 鹼性電荷變異體 (圖 10F)。總而言之，這些數據支持以下觀點：RCTI 方法可用於分離殖株並與標準 TI 方法具有相當的滴定度和產物質量屬性，但是所需的資源和工作量大大減少。*        *        *        *
前述實例僅僅是對本文所公開之主題的說明，不應被視為以任何方式進行限制。
除所描繪和要求保護的各種實施例之外，本文所公開之主題還涉及具有本文所公開和要求保護的特徵的其他組合的其他實施例。因此，本文所呈現之特定特徵可在本文所公開之主題範圍內以其他方式彼此組合，使得本文所公開之主題包括本文所公開之特徵的任何合適的組合。出於說明和描述的目的，已經提供了本文所公開之主題的特定實施例的前述描述。其並非旨在窮舉或將本文所公開之主題限制為所公開的那些實施例。
對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者所顯而易見的是，在不脫離本文所公開之主題的精神或範圍的情況下，可以對本文所公開之主題的組成和方法進行各種修改和變型。因此，本文所公開之主題旨在包括在所附申請專利範圍及其等同形式的範圍內的修改和變型。
本文引用了各種出版物、專利和專利申請，這些文獻以引用方式整體併入本文。
圖1A至1B是示意圖，其繪示例示性靶向整合(TI)細胞株開發(CLD)工作流程。 圖2A至2B是示意圖，其繪示標準TI及“隨機化組態靶向整合”(本文也稱為“隨機化鏈靶向整合”)(RCTI)工作流程之比較。 圖3A至3B描述針對在生產培養中所評價的殖株之效價及HMWS%的分佈以及所鑑定的組態。 圖4顯示標準TICLD及RCTI方法之間的其他產物品質屬性為相當。 圖5描繪標準CLD與RCTI方法之間的產物品質屬性為相當。 圖6A至6C繪示RCTI方法在保持殖株效能的同時，提供經改善的時間線彈性。 圖7A至7B描繪針對分子-Y的標準CLD與RCTI方法之間的效價是相當的，但是RCTI方法的殖株的單位生產力高於標準CLD。 圖8A至8G描繪針對分子-Y的標準CLD與RCTI方法之間的產物品質屬性為相當。 圖9A至9B描繪針對分子-Z的標準CLD與RCTI方法之間的效價是相當的，但是RCTI方法的殖株的單位生產力高於標準CLD。 圖10A至10F描繪針對分子-Z標準CLD及RCTI方法之間的產物品質屬性為相當。 圖11A至11C是示意圖，其繪示藉由本揭露之方法所表現的例示性分子。
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Claims (74)

  1. 一種用於生成及高通量篩選表現至少一個所關注序列(SOI)的靶向整合(TI)宿主細胞庫之方法，其包含： a) 藉由下列步驟生成TI宿主細胞庫，其中，該庫包含表現一個或多個 SOI的複數個TI宿主細胞，該複數個TI宿主細胞： i)    提供複數個TI宿主細胞； ii)   將複數個TI宿主細胞與複數個載體接觸，其中該等載體包含一個或多個SOI； iii)  將該一個或多個SOI引入一個或多個該複數個TI宿主細胞中； b) 將該庫分離成單一殖株；以及 c) 針對特定細胞屬性或特定產物屬性篩選該等殖株。
  2. 如請求項1之方法，其中，藉由重組酶介導之整合將該一個或多個SOI引入一個或多個該複數個TI宿主細胞中。
  3. 如請求項1之方法，其中，藉由基因編輯介導之整合將該一個或多個SOI引入一個或多個該複數個TI宿主細胞中。
  4. 如請求項1之方法，其中，該一個或多個SOI可操作地連接至一個或多個可調控之啟動子。
  5. 如請求項4之方法，其中，該一個或多個可調控之啟動子選自由SV40及CMV啟動子所組成之群組。
  6. 如請求項1之方法，其中，該等TI宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。
  7. 如請求項6之方法，其中，該等TI宿主細胞為倉鼠宿主細胞、人宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
  8. 如請求項7之方法，其中，該等TI宿主細胞為CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞或CHO K1M宿主細胞。
  9. 如請求項1之方法，其中，該SOI編碼多重次單元蛋白(multisubuint protein)之多肽次單元或其片段。
  10. 如請求項1之方法，其中，該SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段 (scFv) 或Fc融合蛋白。
  11. 如請求項1之方法，其中，該特定細胞屬性選自：細胞生長、細胞效價、單位生產力、體積生產力、殖株穩定性。
  12. 如請求項1之方法，其中，該特定產物屬性選自：醣基化水平、電荷變異水平、錯配減少、蛋白質/胜肽聚集減少、蛋白質序列異質性。
  13. 如請求項1之方法，其中，將該一個或多個SOI引入至一個或多個該複數個TI宿主細胞中之一個或多個基因座，該一個或多個基因座與選自下列之序列至少約90%同源：SEQ ID Nos. 1-12；NW_006874047.1；NW_006884592.1；NW_006881296.1；NW_003616412.1；NW_003615063.1；NW_006882936.1及NW_003615411.1。
  14. 一種生成包含複數個外源性核苷酸SOI之TI 宿主細胞庫之方法，該方法包含： a)  提供複數個TI宿主細胞； b) 將複數個TI宿主細胞與複數個載體接觸，其中該等載體包含一個或多個SOI； c)  將該一個或多個SOI引入一個或多個該複數個TI宿主細胞。
  15. 如請求項14之方法，其中，一個或多個該複數個TI宿主細胞包含整合在該等TI宿主細胞的基因體之一個或多個基因座上之一個或多個外源性核苷酸序列，且其中，該外源性核苷酸序列包含至少兩個重組酶辨識序列(RRS)，其位在至少一個第一選擇標記之側翼。
  16. 如請求項14之方法，其中，該等載體包含： a)  至少兩個 RRS，其匹配已整合之外源性核苷酸上的至少兩個RRS；及 b) 一個或多個外源SOI及至少一個第二選擇標記，其位於該等RRS之側翼。
  17. 如請求項16之方法，其中，藉由重組酶介導之整合將該一個或多個SOI引入一個或多個該複數個TI宿主細胞中。
  18. 如請求項14之方法，其中，藉由基因編輯介導之整合將該一個或多個SOI引入一個或多個該複數個TI宿主細胞中。
  19. 如請求項14之方法，其中，該一個或多個SOI可操作地連接至一個或多個可調控之啟動子。
  20. 如請求項19之方法，其中，該一個或多個可調控之啟動子選自由SV40及CMV啟動子所組成之群組。
  21. 如請求項14之方法，其中，該SOI編碼多重次單元蛋白之多肽次單元或其片段。
  22. 如請求項14之方法，其中，該SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
  23. 如請求項14之方法，其中，(a)的該一個或多個外源性核苷酸整合在一個或多個基因座上，該基因座與選自下列之序列至少約90%同源：SEQ ID Nos. 1-12；NW_006874047.1；NW_006884592.1；NW_006881296.1；NW_003616412.1；NW_003615063.1；NW_006882936.1及NW_003615411.1。
  24. 如請求項14之方法，其中，至少一個所關注序列包含2、3、4、5、6、7、8、9、10個所關注序列。
  25. 如請求項14之方法，其中，該等TI宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。
  26. 如請求項25之方法，其中，該等TI宿主細胞為倉鼠宿主細胞、人宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
  27. 如請求項26之方法，其中，該等TI宿主細胞為CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞或CHO K1M宿主細胞。
  28. 一種製備表現一個或多個SOI的TI宿主細胞之方法，其包含： a)  提供複數個TI宿主細胞； b) 將該複數個TI宿主細胞與複數個載體接觸，其中該等載體包含一個或多個SOI； c)  將該一個或多個SOI引入一個或多個該複數個TI宿主細胞中；以及 d) 選擇表現該一個或多個SOI之TI宿主細胞。
  29. 如請求項28之方法，其中，藉由重組酶介導之整合將該一個或多個SOI引入一個或多個該複數個TI宿主細胞中。
  30. 如請求項28之方法，其中，藉由基因編輯介導之整合將該一個或多個SOI引入一個或多個該複數個TI宿主細胞中。
  31. 如請求項28之方法，其中，該一個或多個SOI可操作地連接至一個或多個可調控之啟動子。
  32. 如請求項31之方法，其中，該一個或多個可調控之啟動子選自由SV40及CMV啟動子所組成之群組。
  33. 如請求項28之方法，其中，該TI宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。
  34. 如請求項33之方法，其中，該TI宿主細胞為倉鼠宿主細胞、人宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
  35. 如請求項34之方法，其中，該TI宿主細胞為CHO 宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞或CHO K1M宿主細胞。
  36. 如請求項28之方法，其中，該SOI編碼多重次單元蛋白之多肽次單元或其片段。
  37. 如請求項28之方法，其中，該SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
  38. 如請求項28之方法，其中，將該一個或多個SOI引入至一個或多個該複數個TI宿主細胞中之一個或多個基因座，該一個或多個基因座與選自下列之序列至少約90%同源：SEQ ID Nos. 1-12；NW_006874047.1；NW_006884592.1；NW_006881296.1；NW_003616412.1；NW_003615063.1；NW_006882936.1及NW_003615411.1。
  39. 如請求項28之方法，其中，該SOI編碼多重次單元蛋白之多肽次單元或其片段。
  40. 如請求項28之方法，其中，該SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白，及其片段。
  41. 如請求項28之方法，其中： a)  一個或多個該複數個TI宿主細胞包含一個或多個外源性核苷酸序列，其整合在該等TI宿主細胞的基因體之一個或多個基因座上，且其中該外源性核苷酸序列包含至少兩個RRS，其位在至少一個第一選擇標記之側翼； b) 該等載體包含： a.   至少兩個RRS，其匹配已整合之外源性核苷酸上的至少兩個RRS；以及 b.   一個或多個外源SOI及至少一個第二選擇標記，其側翼為該等RRS； c)  將一或多個重組酶或編碼重組酶之核酸引入一個或多個該複數個TI宿主細胞中，其中該一或多個重組酶辨識該等RRS；以及 d) 選擇表現該第二選擇標記之TI細胞，藉此分離出表現該所關注序列之TI宿主細胞。
  42. 如請求項41之方法，其中，該SOI編碼多重次單元蛋白之多肽次單元或其片段。
  43. 如請求項41之方法，其中該SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)、或Fc融合蛋白，及其片段。
  44. 如請求項41之方法，其中，(a)的該一個或多個外源性核苷酸整合在一個或多個基因座上，該基因座與選自下列之序列至少約90%同源：SEQ ID Nos. 1-12；NW_006874047.1；NW_006884592.1；NW_006881296.1；NW_003616412.1；NW_003615063.1；NW_006882936.1及NW_003615411.1。
  45. 如請求項41之方法，其中： a.  該外源性核苷酸序列包含位在至少一個第一選擇標記之側翼之第一RRS及第二RRS，及位在介於該第一RRS與該第二RRS之間之第三RRS，且所有RRS都是異種特異(heterospecific)的；以及 b.  該複數個載體包含： i.    第一載體，其包含兩個RRS，其與整合的外源核苷酸序列上的第一RRS及第三RRS匹配，且位於至少一個第一外源SOI及至少一個第二選擇標記側翼； ii.   第二載體，其包含兩個RRS，其與整合的外源核苷酸序列上的第二RRS及第三RRS匹配，且位於至少一個第二外源SOI側翼； c.  選擇表現該第二選擇標記之TI細胞，藉此分離出表現該第一及第二所關注序列之TI宿主細胞。
  46. 如請求項28、41及45中任一項之方法，其中，該包含至少一個所關注序列之載體包含2、3、4、5、6、7、8、9、10個所關注序列。
  47. 如請求項28、41及45中任一項之方法，其中，該TI宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。
  48. 如請求項47之方法，其中，該TI宿主細胞為倉鼠宿主細胞、人宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
  49. 如請求項48之方法，其中，該TI宿主細胞為CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞或CHO K1M宿主細胞。
  50. 一種表現SOI之方法，其包含： a) 提供複數個TI宿主細胞； b) 將該複數個TI宿主細胞與複數個載體接觸，其中，該等載體包含一個或多個SOI； c) 將該一個或多個SOI引入一個或多個該複數個TI宿主細胞中；以及 d) 選擇表現該所關注序列之TI宿主細胞； e) 在適合於表現來自d)中之細胞的該所關注序列之條件下培養該細胞。
  51. 如請求項50之方法，其中，藉由重組酶介導之整合將該一個或多個SOI引入一個或多個該複數個TI宿主細胞中。
  52. 如請求項50之方法，其中，藉由基因編輯介導之整合將該一個或多個SOI引入一個或多個該複數個TI宿主細胞中。
  53. 如請求項50之方法，其中，該一個或多個SOI可操作地連接至一個或多個可調控之啟動子。
  54. 如請求項53之方法，其中，該一個或多個可調控之啟動子選自由SV40及CMV啟動子所組成之群組。
  55. 如請求項50之方法，其中，該TI宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。
  56. 如請求項55之方法，其中，該TI宿主細胞為倉鼠宿主細胞、人宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
  57. 如請求項56之方法，其中，該TI宿主細胞為CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞或CHO K1M宿主細胞。
  58. 如請求項50之方法，其中，該SOI編碼多重次單元蛋白之多肽次單元或其片段。
  59. 如請求項50之方法，其中，該SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
  60. 如請求項50之方法，其中，將該一個或多個SOI引入至一個或多個該複數個TI宿主細胞中之一個或多個基因座，該一個或多個基因座與選自下列之序列至少約90%同源：SEQ ID Nos. 1-12；NW_006874047.1；NW_006884592.1；NW_006881296.1；NW_003616412.1；NW_003615063.1；NW_006882936.1及NW_003615411.1。
  61. 如請求項50之方法，其中，至少一個所關注序列包含2、3、4、5、6、7、8、9、10個所關注序列。
  62. 一種表現SOI之方法，其包含： a)  提供複數個TI宿主細胞，其中各TI宿主細胞包含一個或多個外源性核苷酸序列，該一個或多個外源性核苷酸序列整合在該等TI宿主細胞的基因體之一個或多個基因座上，且其中該外源性核苷酸序列包含至少兩個RRS，其位在至少一個第一選擇標記之側翼； b) 將該複數個TI宿主細胞與複數個載體接觸，其中，該等載體包含： a.   至少兩個RRS，其匹配已整合之外源性核苷酸上的至少兩個RRS；以及 b.   一個或多個外源SOI及至少一個第二選擇標記，該等至少一個第二選擇標記之側翼為所述RRS； c)  引入一或多個重組酶或編碼重組酶之核酸，其中，該一或多個重組酶辨識該等RRS； d) 選擇表現該第二選擇標記之TI細胞，藉此分離出表現該所關注序列之TI宿主細胞；以及 e)  在適合於表現來自d)中之細胞的該所關注序列之條件下培養該細胞，且回收來自該所關注序列之產物。
  63. 如請求項62之方法，其中，該SOI編碼多重次單元蛋白之多肽次單元或其片段。
  64. 如請求項62之方法，其中，該一個或多個SOI可操作地連接至一個或多個可調控之啟動子。
  65. 如請求項64之方法，其中，該一個或多個可調控之啟動子選自由SV40及CMV啟動子所組成之群組。
  66. 如請求項62之方法，其中該SOI編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈Fv片段(scFv)、或Fc融合蛋白，及其片段。
  67. 如請求項62之方法，其中，(a)的該一個或多個外源性核苷酸整合在一個或多個基因座上，該基因座與選自下列之序列至少約90%同源：SEQ ID Nos. 1-12；NW_006874047.1；NW_006884592.1；NW_006881296.1；NW_003616412.1；NW_003615063.1；NW_006882936.1及NW_003615411.1。
  68. 如請求項62之方法，其中： a.  該外源核苷酸序列包含位在至少一個第一選擇標記側翼之第一RRS及第二RRS，及位在介於該第一RRS與該第二RRS之間之第三RRS，且所有RRS都是異種特異的；以及 b.  該複數個載體包含： i.    第一載體，其包含兩個RRS，該等兩個RRS與整合的外源核苷酸序列上的該第一RRS及該第三RRS匹配，且位於至少一個第一外源SOI及至少一個第二選擇標記的側翼； ii.   第二載體，其包含兩個RRS，該等兩個RRS與整合的外源核苷酸序列上的該第二RRS及該第三RRS匹配，且位於至少一個第二外源SOI的側翼； c.  選擇表現該第二選擇標記之TI細胞，藉此分離出表現該第一及第二所關注序列之TI宿主細胞。
  69. 如請求項62或68之方法，其中，該至少一個所關注序列包含2、3、4、5、6、7、8、9、10個所關注序列。
  70. 如請求項62之方法，其中，該至少一個第一SOI及該至少一個第二SOI可操作地連接至一個或多個可調控之啟動子。
  71. 如請求項70之方法，其中，該一個或多個可調控之啟動子選自由SV40及CMV啟動子所組成之群組。
  72. 如請求項62或68之方法，其中，該TI宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。
  73. 如請求項72之方法，其中，該TI宿主細胞為倉鼠宿主細胞、人宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
  74. 如請求項73之方法，其中，該TI宿主細胞為CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞或CHO K1M宿主細胞。
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