CN116096907A - 核酸的靶向整合 - Google Patents

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Abstract

本公开的主题涉及适合于表达重组蛋白的靶向整合(TI)宿主细胞，其中那些TI宿主细胞已经过超转染，使得外源核酸编码随机整合(RI)到其基因组中，并且涉及产生和使用超转染的TI宿主细胞的方法。

Description

核酸的靶向整合
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年6月24日提交的美国临时专利申请序列号63/043,409的优先权，该美国临时专利申请的内容全文以引用方式并入。
序列表
本说明书参考序列表(2021年6月23日以电子形式提交的名为“00B206_1099SL”的.TXT文件)。00B206_1099SL文件于2021年6月15日生成，且大小为1,251,200字节。该序列表的全部内容据此以引用方式并入本文。
技术领域
本公开的主题涉及适合于表达重组蛋白的靶向整合(TI)宿主细胞，其中那些TI宿主细胞已经过超转染，使得外源核酸编码随机整合(RI)到其基因组中，并且涉及产生和使用超转染的TI宿主细胞的方法。
背景技术
由于细胞生物学和免疫学的飞速发展，针对各种疾病(包括癌症、心血管疾病和代谢疾病)开发新型治疗性重组蛋白的需求不断增加。这些候选生物药物通常通过能够表达目的蛋白质的商业化细胞系进行生产。例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞已广泛用于生产单克隆抗体。
开发商业化细胞系的常规策略涉及随机整合编码目的多肽的核苷酸序列，然后选择并分离产生目的多肽的细胞系。然而，这种方法具有若干缺点。首先，此类整合不仅是罕见的事件，而且鉴于核苷酸序列整合的随机性，这些罕见的事件可能导致多种基因表达和细胞生长表型。此类变化称为“位置效应变化”，至少部分地源于真核细胞基因组中存在的复杂基因调控网络以及用于整合和基因表达的某些基因组基因座的可及性。其次，随机整合策略通常无法提供对整合在宿主细胞基因组中的基因拷贝数的控制。事实上，通常采用基因扩增方法来获得高产量细胞。但是，此类基因扩增可能导致不需要的细胞表型，诸如不稳定的细胞生长和/或产物表达。第三，由于随机整合过程中固有的整合基因座异质性，在转染后筛选数千个克隆以分离表现出期望的感兴趣多肽表达水平的细胞系既耗时又费力。即使在分离出此类细胞系后，也不能保证目的多肽的稳定表达，并且可能需要进行进一步筛选以获得稳定的商业化细胞系。最后，由随机整合的细胞系产生的多肽表现出高度的序列变化，这可能部分是由于用于选择表达水平高的目的多肽的选择剂的致突变性。
发明内容
本公开的主题至少部分地涉及适合表达重组蛋白的靶向整合(TI)宿主细胞，其中TI宿主细胞已经过超转染，使得外源核酸编码随机整合(RI)到其基因组中，以及产生和使用所述超转染的TI宿主细胞的方法。本公开的主题不仅提供了具有高产量的宿主细胞TI位点，而且提供了以下新方法，其通过重组酶介导的盒交换(RMCE)将多个目的序列引入宿主细胞中的单个TI基因座中，并且如本文所概述，通过使细胞经过超转染，使得外源核酸编码随机整合(RI)到TI宿主细胞基因组中以实现目的序列的表达增加。
在某些实施例中，本公开提供了一种能够表达目的多肽的宿主细胞，该宿主细胞包含：a)侧接有两个重组识别序列(RRS)的编码第一目的多肽的靶向整合的外源核酸目的序列(SOI)和第一选择标志物，其中靶向整合的外源SOI整合在所述宿主细胞的所述基因组的靶向基因座内；以及b)编码第二目的多肽的随机整合的外源核酸SOI和第二选择标志物，其中随机整合的SOI至少一次整合在宿主细胞的基因组中，并且其中靶向整合的外源核酸SOI组成型或诱导型表达，并且随机整合的外源核酸SOI组成型或诱导型表达。在某些实施例中，其中第一目的多肽和第二目的多肽可为相同的。在某些实施例中，第一选择标志物和第二选择标志物可相同。在某些实施例中，宿主细胞可包含一至十个随机整合的外源核酸SOI。在某些实施例中，靶向基因座可与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源。在某些实施例中，本公开的宿主细胞可进一步包含整合在所述宿主细胞的所述基因组的靶向基因座内的编码第二目的多肽的第二靶向整合的外源核酸SOI和第二选择标志物，其中第一靶向整合的外源核酸SOI和第一选择标志物可侧接有第一RRS和第三RRS，并且第二靶向外源SOI和第二选择标志物可侧接有第二RRS和第三RRS。在某些实施例中，目的多肽可选自由以下项组成的组：单链抗体、抗体轻链、抗体重链、单链Fv片段(scFv)和Fc融合蛋白。在某些实施例中，宿主细胞可为哺乳动物宿主细胞。在某些实施例中，宿主细胞可为仓鼠宿主细胞、人宿主细胞、大鼠宿主细胞或小鼠宿主细胞。在某些实施例中，宿主细胞可为CHO宿主细胞、CHO K1宿主细胞、CHO K1SV宿主细胞、DG44宿主细胞、DUKXB-11宿主细胞、CHOK1S宿主细胞或CHO K1M宿主细胞。在某些实施例中，SOI与选择标志物的靶向整合可由外源核酸酶促进。在某些实施例中，外源核酸酶可选自由以下项组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚体、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、TAL效应物结构域融合蛋白、RNA引导的DNA核酸内切酶、经工程化改造的大范围核酸酶和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)核酸内切酶。在某些实施例中，靶向整合的外源核酸SOI组成型表达。在某些实施例中，靶向整合的外源核酸SOI诱导型表达。在某些实施例中，随机整合的外源核酸SOI组成型或诱导型表达。
本公开的主题还提供了表达目的多肽的方法。在某些实施例中，本公开提供了一种表达目的多肽的方法，该方法包括：a)提供宿主细胞，该宿主细胞包含整合在宿主细胞的基因组的靶向基因座处的外源核苷酸序列，其中该外源核苷酸序列包含侧接第一选择标志物的两个RRS；b)向(a)中提供的细胞中引入核酸，该核酸包含两个RRS，这两个RRS与整合的外源核苷酸序列的两个RRS相匹配并且侧接编码第一目的多肽的第一外源SOI和第二选择标志物；c)引入重组酶或编码重组酶的核酸，其中该重组酶识别RRS；d)选择表达第二选择标志物的细胞；e)通过随机整合，将编码第二目的多肽的第二外源SOI和第三选择标志物引入宿主细胞的基因组中；f)其中整合在宿主细胞的基因组的靶向基因座处的外源核苷酸序列组成型或诱导型表达，并且第二外源SOI组成型或诱导型表达；g)选择表达第三选择标志物的细胞；以及h)在足以表达第一目的多肽和第二目的多肽的条件下培养宿主细胞。在某些实施例中，此类方法可进一步包括从宿主细胞培养物中回收第一目的多肽和第二目的多肽。在某些实施例中，第一目的多肽和第二目的多肽可为相同的。在某些实施例中，靶向基因座可与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源。在某些实施例中，第一目的多肽和第二目的多肽可选自由以下项组成的组：单链抗体、抗体轻链、抗体重链、单链Fv片段(scFv)和Fc融合蛋白。在某些实施例中，宿主细胞可为哺乳动物宿主细胞。在某些实施例中，宿主细胞可为仓鼠宿主细胞、人宿主细胞、大鼠宿主细胞或小鼠宿主细胞。在某些实施例中，宿主细胞可为CHO宿主细胞、CHO K1宿主细胞、CHO K1SV宿主细胞、DG44宿主细胞、DUKXB-11宿主细胞、CHOK1S宿主细胞或CHO K1M宿主细胞。在某些实施例中，SOI中的任一者的靶向整合可由外源核酸酶促进。在某些实施例中，外源核酸酶可选自由以下项组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚体、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、TAL效应物结构域融合蛋白、RNA引导的DNA核酸内切酶、经工程化改造的大范围核酸酶和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)核酸内切酶。在某些实施例中，SOI的表达可由可调型启动子控制。在某些实施例中，可调型启动子可选自由SV40和CMV启动子组成的组。在某些实施例中，整合在宿主细胞的基因组的靶向基因座处的外源核苷酸序列组成型表达。在某些实施例中，整合在宿主细胞的基因组的靶向基因座处的外源核苷酸序列诱导型表达。在某些实施例中，第二外源SOI组成型表达。在某些实施例中，第二外源SOI诱导型表达。
附图说明
图1A和1B描绘了超转染表达构建体和三种不同的超转染方法的概述。
图2A-2C描绘了组成型
Figure GDA0004161491990000041
组成型(Const
Figure GDA0004161491990000042
Const)超转染过程概述和组合的超转染组成型
Figure GDA0004161491990000043
组成型微型池的池滴度生产率。
图3A-3F描绘了组成型
Figure GDA0004161491990000044
组成型池过程以获得高滴度超转染克隆的单细胞克隆，滴度、比生产率(Qp)、生长、重链和轻链DNA拷贝数和mRNA水平结果。
图4A和4B描述了诱导型
Figure GDA0004161491990000051
组成型(Ind
Figure GDA0004161491990000052
Const)超转染过程概述和超转染诱导型
Figure GDA0004161491990000053
组成型池与非超转亲本宿主相比的池滴度。
图5A-5F描绘了诱导型
Figure GDA0004161491990000054
组成型超转染池筛选过程的单细胞克隆，滴度、比生产率(Qp)、生长以及重链和轻链DNA拷贝数结果。
图6A-6F描绘了用于鉴定顶级组成型
Figure GDA0004161491990000055
诱导型(Const
Figure GDA0004161491990000056
Ind)微型池的超转染筛选步骤，滴度、比生产率(Qp)、生长以及重链和轻链mRNA水平结果。
具体实施方式
在某些实施例中，本文所述的宿主细胞、基因构建体(例如，载体)、组合物和方法可用于开发和/或使用靶向整合(TI)宿主细胞。在某些实施例中，此类TI宿主细胞包含整合在宿主细胞的基因组的特定基因或特定基因座内的外源核苷酸序列。
为了清晰起见而不是为了限制，详细描述分为以下小节：
1.定义
2.整合位点
3.外源核苷酸序列
4.宿主细胞
5.靶向整合
6.TI宿主细胞的制备和使用
7.产物
8.示例性非限制性实施例
1.定义
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。如有歧义，以本专利说明书(包括定义)为准。下面描述了优选方法和材料，尽管与本文描述的那些方法或材料相似或等同的方法和材料可以用于实践或测试当前公开的主题。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均全文以引用方式并入。本文公开的材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在限制。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“有”、“可以”、“含有”及其变体旨在作为开放式过渡短语、术语或词语，并不排除另外的行为或结构的可能性。除非另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”及“该/所述”包括复数个指代物。本公开还考虑了无论是否明确提出地“包括”本文中呈现的实施例或元件、“由其组成”和“基本上由其组成”的其他实施例。
为了列举本文的数值范围，明确考虑了它们之间具有相同精确度的每个中间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9外，还考虑了数字7和8；并且对于6.0-7.0的范围，明确考虑了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、和7.0。
如本文所用，术语“约”或“大致”是指在如本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，所述可接受误差范围将部分地取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，按照本领域中的实践，“约”可以意谓3个或多于3个标准偏差。另选地，“约”可以表示给定值的至多20％，优选地至多10％，更优选地至多5％，并且更优选地至多1％的范围。另选地，特别是关于生物系统或过程，该术语可以意指在某一值的某一数量级内，优选地在5倍以内，更优选地在2倍以内。
如本文所用，术语“选择标志物”可以是一种基因，其允许在相应的选择剂的存在下特异性选择或排除携带该基因的细胞。例如，但不作为限制，选择标志物可允许在该基因的存在下阳性选择经选择标志物基因转染的宿主细胞；未转化的宿主细胞将不能在该选择条件下生长或存活。选择标志物可以是正的、负的或双功能的。正选择标志物可以允许选择携带该标记的细胞，而负选择标志物可以允许选择性地消除携带该标记的细胞。选择标志物可以赋予对药物的抗性，或者补偿宿主细胞中的代谢或分解代谢缺陷。在原核细胞中，可以使用赋予对氨苄青霉素、四环素、卡那霉素或氯霉素的抗性的基因，以及其他基因。可用作真核细胞中的选择标志物的抗性基因包括但不限于针对氨基糖苷磷酸转移酶(APH)(例如，潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素和G418 APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(吲哚)、组氨醇脱氢酶(组氨醇D)的基因，以及编码对嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸的抗性的基因。另外的标记基因描述于WO 92/08796和WO 94/28143中。
除有助于在存在相应选择剂的情况下进行选择以外，选择标志物可替代地提供编码通常不存在于细胞中的分子的基因，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强的GFP(eGFP)、合成的GFP、黄色荧光蛋白(YFP)、增强的YFP(eYFP)、青色荧光蛋白(CFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed单体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean和T-Sapphire。可通过例如检测编码的多肽所发出的荧光，来区分携带此类基因的细胞与不携带该基因的细胞。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指两种或更多种组分的并置，其中这些组分的关系允许它们以预期的方式发挥作用。例如，如果启动子和/或增强子用于调节编码序列的转录，则该启动子和/或增强子可操作地连接至编码序列。在某些实施例中，“可操作地连接”的DNA序列在单个染色体上相连并且相邻。在某些实施例中，例如，当必须接合两个蛋白质编码区(诸如分泌前导区和多肽)时，这些序列是相连、相邻的，并且在同一阅读框中。在某些实施例中，可操作地连接的启动子位于编码序列上游并且可以与该编码序列相邻。在某些实施例中，例如，关于调节编码序列表达的增强子序列，这两种组分能够可操作地连接，但并不相邻。如果增强子增加了编码序列的转录，则该增强子可操作地连接至编码序列。可操作连接的增强子可位于编码序列的上游、内部或下游，并且可位于与编码序列的启动子距离相当远的位置。可操作的连接可以通过本领域中已知的重组方法(例如使用PCR方法和/或通过在方便的限制性位点处连接)来完成。如果不存在方便的限制性位点，则可以根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。如果内部核糖体进入位点(IRES)允许在内部位置处以独立于5'端的方式启动ORF的翻译，则IRES可操作地连接至开放阅读框(ORF)。
如本文所用，术语“表达”是指转录和/或翻译。在某些实施例中，可以基于存在的相应mRNA的量来确定所需产物的转录水平。例如，可以通过PCR或RNA印迹杂交对从目的序列转录的mRNA进行定量。在某些实施例中，由目的序列编码的蛋白可以通过多种方法定量，例如，通过ELISA，通过测定蛋白的生物学活性，或通过使用识别和结合蛋白的抗体，采用与此活性无关的测定，如蛋白印迹法或放射免疫测定法。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、半抗体和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用，术语“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包括完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，请参见Holliger和Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136(2005)。
如本文所用，术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用，术语“重链”是指免疫球蛋白重链。
如本文所用，术语“轻链”是指免疫球蛋白轻链。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量形式存在)之外，包括该群体的单个抗体具有同一性和/或结合相同表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“多特异性抗体”是对至少两个不同位点(即，不同抗原上的不同表位或相同抗原上的不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些方面，多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。可以将多特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv和scFab)；单结构域抗体(dAb)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，请参见Holliger和Hudson,NatureBiotechnology23:1126-1136(2005)。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在该抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体全套库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些方面，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR对应于非人抗体的CDR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如，非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量形式存在)之外，包括该群体的单个抗体具有同一性和/或结合相同表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
术语“治疗性抗体”是指用于治疗疾病的抗体。治疗性抗体可具有各种作用机制。治疗性抗体可结合并且中和与抗原相关联的靶标的正常功能。例如，阻断癌细胞存活所需的蛋白质活性的单克隆抗体导致细胞死亡。另一种治疗性单克隆抗体可结合并且激活与抗原相关联的靶标的正常功能。例如，单克隆抗体可结合至细胞上的蛋白质并且触发细胞凋亡信号。另一种单克隆抗体可结合至仅在病变组织上表达的靶抗原；将毒性有效载荷(有效试剂)，诸如化疗剂或放射性试剂，与单克隆抗体缀合，可形成用于将毒性有效载荷特异性递送至病变组织，减少对健康组织的伤害。治疗性抗体的“生物学功能片段”将表现出归因于完整抗体的生物学功能的至少一种(如果不是部分或全部)，该功能包括至少与靶抗原特异性结合。
术语“诊断抗体”是指用作疾病诊断试剂的抗体。诊断抗体可结合至与特定疾病特异性相关联或在其中表现出增加的表达的靶抗原。诊断抗体可用于例如检测来自患者的生物样品中的靶标，或用于对患者的疾病部位诸如肿瘤进行诊断成像。诊断抗体的“生物学功能片段”将表现出归因于完整抗体的生物学功能的至少一种(如果不是部分或全部)，该功能包括至少与靶抗原特异性结合。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。
术语“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸包含碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸酯基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以产生体内抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，在线发表于2017年6月12日，doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。
“分离的”核酸是指已从其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有核酸分子的细胞中，但该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
如本文所用，术语“载体”是指能够载运与其相连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。在某些实施例中，载体指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，术语“同源序列”是指共享显著的序列相似性的序列，如通过序列比对所确定的。例如，两个序列可以是50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.9％同源的。比对是通过算法和计算机程序(包括但不限于BLAST、FASTA和HMME)执行的，其可以比较序列并基于因素诸如序列长度、序列同一性和相似性以及序列不匹配和缺口的存在与长度来计算匹配的统计显著性。同源序列可以是指DNA和蛋白序列两者。
如本文所用，术语“侧接”是指第一核苷酸序列位于第二核苷酸序列的5'端或3'端或这两端处。侧接核苷酸序列可以与第二核苷酸序列相邻或相距限定的距离。侧接核苷酸序列的长度无具体限制。例如，侧接序列可以具有几个碱基对或几千个碱基对。在某些实施例中，侧接核苷酸序列的长度可为约至少15个碱基对、至少20个碱基对、至少30个碱基对、至少40个碱基对、至少50个碱基对、至少75个碱基对、至少100个碱基对、至少150个碱基对、至少200个碱基对、至少300个碱基对、至少400个碱基对、至少500个碱基对、至少1,000个碱基对、至少1,500个碱基对、至少2,000个碱基对、至少3,000个碱基对、至少4,000个碱基对、至少5,000个碱基对、至少6,000个碱基对、至少7,000个碱基对、至少8,000个碱基对、至少9,000个碱基对、至少10,000个碱基对。
如本文所用，术语“外源”是指核苷酸序列并非来源于宿主细胞，而是通过传统的DNA递送方法(例如，通过转染、电穿孔、转化方法)引入宿主细胞中。术语“内源”是指来源于宿主细胞的核苷酸序列。“外源”核苷酸序列可具有碱基组成相同的“内源”对应物，其中“外源”序列通过(例如)重组DNA技术被引入宿主细胞中。
2.整合位点
本公开的主题提供了适合靶向整合外源核苷酸序列的宿主细胞。在某些实施例中，宿主细胞包含整合在宿主细胞(即TI宿主细胞)的基因组上的整合位点处的外源核苷酸序列。
“整合位点”包含宿主细胞基因组内的核酸序列，向其中插入外源核苷酸序列。在某些实施例中，整合位点在宿主细胞基因组上的两个相邻核苷酸之间。在某些实施例中，整合位点包括一段核苷酸，可向其中任意核苷酸之间插入外源核苷酸序列。在某些实施例中，整合位点位于特定的TI宿主细胞的基因组的基因座内。在某些实施例中，整合位点在TI宿主细胞的内源基因内。
在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在TI宿主细胞的基因组的特定基因座内的位点。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合于其中的基因座与选自SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.7的序列至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源。
在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在TI宿主细胞的基因组的特定基因座内的位点。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合于其中的基因座与以下序列至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源，这些序列选自Contig NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1。
在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在位于选自以下核苷酸的位置的整合位点处，这些核苷酸为SEQ ID NO.1中编号如下的核苷酸：1-1,000bp；1,000-2,000bp；2,000-3,000bp；3,000-4,000bp；和4,000-4,301bp。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在位于选自以下核苷酸的位置的整合位点处，这些核苷酸为SEQ ID NO.2中编号如下的核苷酸：1-100,000bp；100,000-200,000bp；200,000-300,000bp；300,000-400,000bp；400,000-500,000bp；500,000-600,000bp；600,000-700,000bp；和700,000-728785bp。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在位于选自以下核苷酸的位置的整合位点处，这些核苷酸为SEQ IDNO.3中编号如下的核苷酸：1-100,000bp；100,000-200,000bp；200,000-300,000bp；300,000-400,000bp；和400,000-413,983bp。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在位于选自以下核苷酸的位置的整合位点处，这些核苷酸为SEQ ID NO.4中编号如下的核苷酸：1-10,000bp；10,000-20,000bp；20,000-30,000bp；和30,000-30,757bp。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在位于选自以下核苷酸的位置的整合位点处，这些核苷酸为SEQ ID NO.5中编号如下的核苷酸：1-10,000bp；10,000-20,000bp；20,000-30,000bp；30,000-40,000bp；40,000-50,000bp；50,000-60,000bp；和60,000-68,962bp。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在位于选自以下核苷酸的位置的整合位点处，这些核苷酸为SEQ ID NO.6中编号如下的核苷酸：1-10,000bp；10,000-20,000bp；20,000-30,000bp；30,000-40,000bp；40,000-50,000bp；和50,000-51,326bp。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在位于选自以下核苷酸的位置的整合位点处，这些核苷酸为SEQ ID NO.7中编号如下的核苷酸：1-10,000bp；10,000-20,000bp；和20,000-22,904bp。
在某些实施例中，紧邻整合的外源序列的5'端的核苷酸序列选自由以下项组成的组：NW_006874047.1的核苷酸41190-45269、NW_006884592.1的核苷酸63590-207911、NW_006881296.1的核苷酸253831-491909、NW_003616412.1的核苷酸69303-79768、NW_003615063.1的核苷酸293481-315265、NW_006882936.1的核苷酸2650443-2662054或NW_003615411.1的核苷酸82214-97705以及与其至少50％同源的序列。在某些实施例中，紧邻整合的外源序列的5'端的核苷酸序列与以下核苷酸至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源：NW_006874047.1的核苷酸41190-45269、NW_006884592.1的核苷酸63590-207911、NW_006881296.1的核苷酸253831-491909、NW_003616412.1的核苷酸69303-79768、NW_003615063.1的核苷酸293481-315265、NW_006882936.1的核苷酸2650443-2662054或NW_003615411.1的核苷酸82214-97705。
在某些实施例中，紧邻整合的外源序列的3'端的核苷酸序列选自由以下项组成的组：NW_006874047.1的核苷酸45270-45490、NW_006884592.1的核苷酸207912-792374、NW_006881296.1的核苷酸491910-667813、NW_003616412.1的核苷酸79769-100059、NW_003615063.1的核苷酸315266-362442、NW_006882936.1的核苷酸2662055-2701768或NW_003615411.1的核苷酸97706-105117以及与其至少50％同源的序列。在某些实施例中，紧邻整合的外源序列的3'端的核苷酸序列与以下核苷酸至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源：NW_006874047.1的核苷酸45270-45490、NW_006884592.1的核苷酸207912-792374、NW_006881296.1的核苷酸491910-667813、NW_003616412.1的核苷酸79769-100059、NW_003615063.1的核苷酸315266-362442、NW_006882936.1的核苷酸2662055-2701768或NW_003615411.1的核苷酸97706-105117。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列可操作地连接至以下核苷酸序列，该核苷酸序列选自由SEQ ID.NO.1至SEQ ID NO.7以及与其至少50％同源的序列组成的组。在某些实施例中，可操作地连接至外源核苷酸序列的核苷酸序列与选自SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.7的序列至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含至少一个SOI。在某些实施例中，可操作地连接的核苷酸序列提高SOI相比于随机整合的SOI的表达水平。在某些实施例中，整合的外源SOI的表达水平比随机整合的SOI高约20％、30％、40％、50％、100％、2倍、3倍、5倍或10倍。
在某些实施例中，整合的外源序列在5'端侧接有选自由以下项组成的组的核苷酸序列：NW_006874047.1的核苷酸41190-45269、NW_006884592.1的核苷酸63590-207911、NW_006881296.1的核苷酸253831-491909、NW_003616412.1的核苷酸69303-79768、NW_003615063.1的核苷酸293481-315265、NW_006882936.1的核苷酸2650443-2662054和NW_003615411.1的核苷酸82214-97705以及与其至少50％同源的序列，并且在3'端侧接有选自由以下项组成的组的核苷酸序列：NW_006874047.1的核苷酸45270-45490、NW_006884592.1的核苷酸207912-792374、NW_006881296.1的核苷酸491910-667813、NW_003616412.1的核苷酸79769-100059、NW_003615063.1的核苷酸315266-362442、NW_006882936.1的核苷酸2662055-2701768和NW_003615411.1的核苷酸97706-105117以及与其至少50％同源的序列。在某些实施例中，侧接整合的外源核苷酸序列的5'端的核苷酸序列与以下核苷酸至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源：NW_006874047.1的核苷酸41190-45269、NW_006884592.1的核苷酸63590-207911、NW_006881296.1的核苷酸253831-491909、NW_003616412.1的核苷酸69303-79768、NW_003615063.1的核苷酸293481-315265、NW_006882936.1的核苷酸2650443-2662054和NW_003615411.1的核苷酸82214-97705，并且侧接整合的外源核苷酸序列的3'端的核苷酸序列与以下项至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源：SEQ ID NO.NW_006874047.1的核苷酸45270-45490、NW_006884592.1的核苷酸207912-792374、NW_006881296.1的核苷酸491910-667813、NW_003616412.1的核苷酸79769-100059、NW_003615063.1的核苷酸315266-362442、NW_006882936.1的核苷酸2662055-2701768和NW_003615411.1的核苷酸97706-105117。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸整合在紧邻选自由以下项组成的组的序列的全部或一部分的基因座中：与SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源的序列。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列与选自由以下项组成的组的核苷酸序列相邻：与SEQ ID.NO.1至SEQ ID NO.7以及与其至少50％同源的序列。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列的距离在约100bp、约200bp、约500bp、约1kb以内：SEQID.NO.1至SEQ ID NO.7以及与其至少50％同源的序列。在某些实施例中，与外源核苷酸序列相邻的核苷酸序列与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源。
在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在与选自以下核苷酸的位置相邻的整合位点处，这些核苷酸为SEQ ID NO.1中编号如下的核苷酸：1-1,000bp；1,000-2,000bp；2,000-3,000bp；3,000-4,000bp；和4,000-4,301bp。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在与选自以下核苷酸的位置相邻的整合位点处，这些核苷酸为SEQ ID NO.2中编号如下的核苷酸：1-100,000bp；100,000-200,000bp；200,000-300,000bp；300,000-400,000bp；400,000-500,000bp；500,000-600,000bp；600,000-700,000bp；和700,000-728785bp。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在与选自以下核苷酸的位置相邻的整合位点处，这些核苷酸为SEQID NO.3中编号如下的核苷酸：1-100,000bp；100,000-200,000bp；200,000-300,000bp；300,000-400,000bp；和400,000-413,983bp。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在与选自以下核苷酸的位置相邻的整合位点处，这些核苷酸为SEQ ID NO.4中编号如下的核苷酸：1-10,000bp；10,000-20,000bp；20,000-30,000bp；和30,000-30,757bp。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在与选自以下核苷酸的位置相邻的整合位点处，这些核苷酸为SEQ IDNO.5中编号如下的核苷酸：1-10,000bp；10,000-20,000bp；20,000-30,000bp；30,000-40,000bp；40,000-50,000bp；50,000-60,000bp；和60,000-68,962bp。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在与选自以下核苷酸的位置相邻的整合位点处，这些核苷酸为SEQ ID NO.6中编号如下的核苷酸：1-10,000bp；10,000-20,000bp；20,000-30,000bp；30,000-40,000bp；40,000-50,000bp；和50,000-51,326bp。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在与选自以下核苷酸的位置相邻的整合位点处，这些核苷酸为SEQ ID NO.7中编号如下的核苷酸：1-10,000bp；10,000-20,000bp；和20,000-22,904bp。
在某些实施例中，包含外源核苷酸序列的整合位点的基因座不编码开放阅读框(ORF)。在某些实施例中，包含外源核苷酸序列的整合位点的基因座包括顺式作用元件，例如启动子和增强子。在某些实施例中，包含外源核苷酸序列的整合位点的基因座不含任何顺式作用元件，例如增强基因表达的启动子和增强子。
在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在内源基因内的整合位点处，该内源基因选自由以下项组成的组：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2。内源LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2基因包括LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2基因的野生型和所有同源序列。在某些实施例中，LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2基因的同源序列可与野生型LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2基因至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源。在某些实施例中，LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2基因为野生型哺乳动物LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2基因。在某些实施例中，LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2基因为野生型人LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2基因。在某些实施例中，LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2基因为野生型仓鼠LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2基因。
在某些实施例中，整合位点可操作地连接至内源基因，该内源基因选自由以下项组成的组：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及其至少约90％同源的序列。在某些实施例中，整合位点侧接有内源基因，该内源基因选自由以下项组成的组：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2及其至少约90％同源的序列。
表1提供了示例性TI宿主细胞整合位点：
表1-TI宿主细胞整合位点
Figure GDA0004161491990000191
在某些实施例中，整合位点和/或侧接该整合位点的核苷酸序列可通过实验鉴定。在某些实施例中，可通过全基因组筛选方法来鉴定整合位点和/或侧接该整合位点的核苷酸序列以分离出宿主细胞，该宿主细胞在期望的水平上表达的由整合在一个或多个外源核苷酸序列中的一个或多个SOI编码的目的多肽，其中将外源序列本身整合在宿主细胞的基因组中的一个或多个基因座中。在某些实施例中，可通过基于转座酶的盒整合事件之后的全基因组筛选方法来鉴定整合位点和/或侧接该整合位点的核苷酸序列。在某些实施例中，可通过强力随机整合筛选来鉴定整合位点和/或侧接该整合位点的核苷酸序列。在某些实施例中，可通过常规测序方法诸如靶基因座扩增(TLA)及随后的新一代测序(NGS)和全基因组NGS来确定整合位点和/或侧接该整合位点的核苷酸序列。在某些实施例中，可通过常规细胞生物学方法诸如荧光原位杂交(FISH)分析来确定染色体上整合位点的位置。
在某些实施例中，TI宿主细胞包含：第一外源核苷酸序列，其整合在TI宿主细胞的基因组中的特定第一基因座内的第一整合位点；以及第二外源核苷酸序列，其整合在基因组中的特定第二基因座内的第二整合位点。在某些实施例中，TI宿主细胞包含整合在TI宿主细胞的基因组中的多个整合位点的多个外源核苷酸序列。
在某些实施例中，TI本公开的宿主细胞包含至少两个不同的外源核苷酸序列，例如包含至少一个RRS的外源核苷酸序列。在某些实施例中，在引入一个或多个SOI时，可靶向两个或更多个外源核苷酸序列。在某些实施例中，SOI相同。在某些实施例中，SOI不同。在某些实施例中，包含第一外源核苷酸序列的亲本TI宿主细胞可包含第二外源核苷酸序列，该第二外源核苷酸序列的整合位点不同于第一外源核苷酸序列的整合位点处。
在某些实施例中，整合位点与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源。在某些实施例中，整合位点可为相同的染色体。在某些实施例中，整合位点在同一染色体内彼此相距1-1,000个核苷酸、1,000-100,000个核苷酸、100,000-1,000,000个核苷酸或更多。在某些实施例中，整合位点在不同染色体上。在某些实施例中，在一个整合位点包含外源核苷酸序列的TI宿主细胞可用于在相同或不同整合位点插入至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或更多外源核苷酸序列。
在某些实施例中，可单独评估每个位点的至少两个整合位点发生重组酶介导的盒交换(RMCE)的可行性。在某些实施例中，可同时评估至少两个整合位点发生RMCE的可行性。可通过本领域中已知的方法(例如，测量多肽滴度或多肽特异性产生)来评估多个位点发生RMCE的可行性。在某些实施例中，可通过本领域中已知的方法(例如，通过评估表达一个或多个SOI的TI宿主细胞的培养物的滴度和/或比生产力)来进行该评估。示例性培养策略包括但不限于分批进料摇瓶培养和生物反应器分批进料培养。可通过本领域中已知的方法(例如但不限于ELISA、FACS、荧光微孔分析技术(FMAT)、蛋白A亲和色谱、蛋白质印迹分析)来评估表达目的多肽的TI宿主细胞的滴度和比生产力。
3.外源核苷酸序列
外源核苷酸序列是一种并非来源于宿主细胞，但是可通过传统的DNA递送方法(例如，通过转染、电穿孔、转化方法)引入宿主细胞中的核苷酸序列。在某些实施例中，外源核苷酸序列为目的序列(SOI)，例如编码目的多肽的核苷酸序列。但是，在某些实施例中，在本公开的上下文中采用的外源核苷酸序列包含有助于引入额外的核酸序列(例如SOI)的元件，例如一个或多个重组识别序列(RRS)和一种或多种选择标志物。在某些实施例中，有助于引入额外的核酸序列的外源核苷酸序列在本文中称为“着陆垫”。因此，在某些实施例中，TI宿主细胞可包含：(1)外源核苷酸序列，其包括一个或多个SOI，例如通过外源位点特异性核酸酶介导的(例如，CRISPR/Cas9介导的)靶向整合在宿主细胞基因组的特定基因座中的SOI；(2)外源核苷酸序列，其包括一个或多个着陆垫；或(3)外源核苷酸序列，其包括其中已整合一个或多个SOI的一个或多个着陆垫。
在某些实施例中，TI宿主细胞包含整合在TI宿主细胞的基因组中的一个或多个整合位点的至少一个外源核苷酸序列。在某些实施例中，外源核苷酸序列整合在特定的TI宿主细胞的基因组的基因座内的一个或多个整合位点。例如，但不作为限制，至少一个外源核酸序列可整合在一个或多个基因座，该一个或多个基因座与选自SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.7的序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％的同源性。
3.1着陆垫
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含一个或多个重组识别序列(RRS)，其中所述RRS可以由重组酶识别。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含至少两个RRS。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含两个RRS，并且这两个RRS相同。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含两个RRS，并且这两个RRS具有异种特异性，即并非由同一重组酶识别。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含三个RRS，其中第三RRS位于第一RRS与第二RRS之间。在某些实施例中，第一RRS与第二RRS相同，并且第三RRS不同于第一RRS或第二RRS。在某些实施例中，所有三个RRS是异种特异性的。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含四个、五个、六个、七个或八个RRS。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含多个RRS。在某些实施例中，所述多个(两个或多更多个)RRS相同。在某些实施例中，所述两个或更多个RRS具有异种特异性。在某些实施例中，每个RRS可由不同的重组酶识别。在某些实施例中，全部RRS中的子集具有同种特异性，即由相同的重组酶识别，并且全部RRS中的子集异种特异性，即并非由相同的重组酶识别。在某些实施例中，一个或多个RRS可选自由以下项组成的组：LoxP序列、LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、φC31 attP序列和φC31attB序列。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含至少一个选择标志物。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含一个RRS和至少一种选择标志物。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含第一RRS和第二RRS以及至少一种选择标志物。在某些实施例中，选择标志物位于第一RRS与第二RRS之间。在某些实施例中，两个RRS侧接至少一种选择标志物，即，第一RRS位于该选择标志物的5'上游并且第二RRS位于该选择标志物的3'下游。在某些实施例中，第一RRS与该选择标志物的5'端相邻，并且第二RRS与该选择标志物的3'端相邻。
在某些实施例中，选择标志物位于第一RRS与第二RRS之间，并且这两个侧翼RRS相同。在某些实施例中，侧接选择标志物的两个RRS均为LoxP序列。在某些实施例中，侧接选择标志物的两个RRS均为FRT序列。在某些实施例中，选择标志物位于第一RRS与第二RRS之间，并且这两个侧翼RRS具有异种特异性。在某些实施例中，第一侧翼RRS为LoxP L3序列，并且第二侧翼RRS为LoxP 2L序列。在某些实施例中，LoxP L3序列位于该选择标志物的5'，并且LoxP 2L序列位于该选择标志物的3'。在某些实施例中，第一侧接RRS为野生型FRT序列，并且第二侧接RRS为突变体FRT序列。在某些实施例中，第一侧接RRS为Bxb1 attP序列，并且第二侧接RRS为Bxb1 attB序列。在某些实施例中，第一侧接RRS为φC31 attP序列，并且第二侧接RRS为φC31 attB序列。在某些实施例中，这两个RRS以相同的取向定位。在某些实施例中，这两个RRS均处于正向取向或反向取向。在某些实施例中，这两个RRS以相反的取向定位。
在某些实施例中，选择标志物可为氨基糖苷磷酸转移酶(APH)(例如，潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素和G418 APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(吲哚)、组氨醇脱氢酶(组氨醇D)以及编码产生对嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin或霉酚酸的抗性的基因。在某些实施例中，选择标志物可为GFP、eGFP、合成的GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed单体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean或T-Sapphire标志物。在某些实施例中，选择标志物可为融合构建体，其包含至少两种选择标志物。在某些实施例中，编码选择标志物或选择标志物的片段的基因可融合至编码不同选择标志物或其片段的基因。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含侧接有两个RRS的两种选择标志物，其中第一选择标志物不同于第二选择标志物。在某些实施例中，两个选择标志物均选自由以下项组成的组：谷氨酰胺合成酶选择标志物、胸苷激酶选择标志物、HYG选择标志物和嘌呤霉素抗性选择标志物。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含胸苷激酶选择标志物和HYG选择标志物。在某些实施例中，第一选择标志物选自由以下项组成的组：氨基糖苷磷酸转移酶(APH)(例如，潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素和G418 APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(吲哚)、组氨醇脱氢酶(组氨醇D)以及编码产生对嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin或霉酚酸的抗性的基因，并且第二选择标志物选自由以下项组成的组：GFP、eGFP、合成的GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed单体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean和T-Sapphire标志物。在某些实施例中，第一选择标志物为谷氨酰胺合成酶选择标志物，并且第二选择标志物为GFP标志物。在某些实施例中，侧接两个选择标志物的两个RRS相同。在某些实施例中，侧接两个选择标志物的两个RRS是不同的。
在某些实施例中，选择标志物可操作地连接至启动子序列。在某些实施例中，选择标志物可操作地连接至SV40启动子。在某些实施例中，选择标志物可操作地连接至巨细胞病毒(CMV)启动子。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含至少一种选择标志物和IRES，其中该IRES可操作地连接至选择标志物。在某些实施例中，可操作地连接至IRES的选择标志物选自由以下项组成的组：GFP、eGFP、合成的GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed单体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean和T-Sapphire标志物。在某些实施例中，可操作地连接至IRES的选择标志物为GFP标志物。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含侧接有两个RRS的IRES和两种选择标志物，其中该IRES可操作地连接至第二选择标志物。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含侧接有两个RRS的IRES和三种选择标志物，其中该IRES可操作地连接至第三选择标志物。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含侧接有两个RRS的IRES和三种选择标志物，其中该IRES可操作地连接至第三选择标志物。在某些实施例中，第三选择标志物不同于第一选择标志物或第二选择标志物。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含可操作地连接至启动子的第一选择标志物以及可操作地连接至IRES的第二选择标志物。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含可操作地连接至SV40启动子的谷氨酰胺合成酶选择标志物以及可操作地连接至IRES的GFP选择标志物。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含可操作地连接至CMV启动子的胸苷激酶选择标志物和HYG选择标志物以及可操作地连接至IRES的GFP选择标志物。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含三个RRS。在某些实施例中，第三RRS位于第一RRS与第二RRS之间。在某些实施例中，所有三个RRS均相同。在某些实施例中，第一RRS与第二RRS相同，并且第三RRS不同于第一RRS或第二RRS。在某些实施例中，所有三个RRS是异种特异性的。
3.2目的序列(SOI)
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含至少一个外源SOI。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含至少一种选择标志物和至少一个外源SOI。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含至少一种选择标志物、至少一个外源SOI和至少一个RRS。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或更多的SOI。在某些实施例中，SOI相同。在某些实施例中，SOI不同。
在某些实施例中，SOI编码单链抗体或其片段。在某些实施例中，SOI编码抗体重链序列或其片段。在某些实施例中，SOI编码抗体轻链序列或其片段。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含编码抗体重链序列或其片段的SOI以及抗体轻链序列或其片段的SOI。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含编码第一抗体重链序列或其片段的SOI、编码第二抗体重链序列或其片段的SOI以及编码抗体轻链序列或其片段的SOI。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含编码第一抗体重链序列或其片段的SOI、编码第二抗体重链序列或其片段的SOI、编码第一抗体轻链序列或其片段SOI以及编码抗体轻链序列或其片段的第二SOI。在某些实施例中，可选择编码重链和轻链序列的SOI的数量，以实现期望的重链和轻链多肽的表达水平，例如，实现期望的双特异性抗体产量。在某些实施例中，单独的SOI编码重链和轻链序列可例如在整合位点整合在单个外源核酸序列中、在单个整合位点整合在多个外源核酸序列中或在TI宿主细胞内的不同整合位点整合在多个外源核酸序列中。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含至少一种选择标志物、至少一个外源SOI和一个RRS。在某些实施例中，RRS与至少一种选择标志物或至少一个外源SOI相邻。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含至少一种选择标志物、至少一个外源SOI和两个RRS。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含位于第一RRS与第二RRS之间的至少一种选择标志物和至少一个外源SOI。在某些实施例中，侧接选择标志物和外源SOI的两个RRS相同。在某些实施例中，侧接选择标志物和外源SOI的两个RRS不同。在某些实施例中，第一侧翼RRS为LoxP L3序列，并且第二侧翼RRS为LoxP 2L序列。在某些实施例中，L3 LoxP序列位于选择标志物和外源SOI的5'端，并且LoxP 2L序列位于选择标志物和外源SOI的3'端。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含三个RRS和两个外源SOI，并且第三RRS位于第一RRS与第二RRS之间。在某些实施例中，第一SOI位于第一RRS与第三RRS之间，并且第二SOI位于第三RRS与第二RRS之间。在某些实施例中，第一SOI与第二SOI不同。在某些实施例中，第一RRS与第二RRS相同，并且第三RRS不同于第一RRS或第二RRS。在某些实施例中，所有三个RRS是异种特异性的。在某些实施例中，第一RRS为LoxP L3位点，第二RRS为LoxP 2L位点，并且第三RRS为LoxFas位点。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含三个RRS、一个外源SOI和一种选择标志物。在某些实施例中，SOI位于第一RRS与第三RRS之间，并且选择标志物位于第三RRS与第二RRS之间。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含三个RRS、两个外源SOI和一种选择标志物。在某些实施例中，第一SOI和选择标志物位于第一RRS与第三RRS之间，并且第二SOI位于第三RRS与第二RRS之间。
在某些实施例中，外源SOI编码目的多肽。此类目的多肽可选自下组，该组包括但不限于以下项：抗体、酶、细胞因子、生长因子、激素、病毒蛋白质、细菌蛋白质、疫苗蛋白质或具有治疗功能的蛋白质。在某些实施例中，外源SOI编码抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，外源SOI编码单链抗体、抗体轻链、抗体重链、单链Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。在某些实施例中，外源SOI(或SOI)编码标准抗体。在某些实施例中，外源SOI(或SOI)编码半抗体，该半抗体例如但不限于本公开的抗体B、Q、T和mAb I。在某些实施例中，外源SOI(或SOI)编码复合抗体。在某些实施例中，复合抗体可为双特异性抗体，该双特异性抗体例如但不限于本公开的双特异性分子A、双特异性分子B、双特异性分子C或双特异性分子D。在某些实施例中，外源SOI可操作地连接至至少一种顺式作用元件，例如启动子或增强子。在某些实施例中，外源SOI可操作地连接至CMV启动子。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含两个RRS和位于这两个RRS之间的至少两个外源SOI。在某些实施例中，编码抗体的一条重链和一条轻链的SOI位于两个RRS之间。在某些实施例中，编码抗体的一条重链和两条轻链的SOI位于两个RRS之间。在某些实施例中，编码抗体的重链和轻链的拷贝的不同组合的SOI位于两个RRS之间。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含三个RRS和至少两个外源SOI，并且第三RRS位于第一RRS与第二RRS之间。在某些实施例中，至少一个SOI位于第一RRS与第三RRS之间，并且至少一个SOI位于第三RRS与第二RRS之间。在某些实施例中，第一RRS与第二RRS相同，并且第三RRS不同于第一RRS或第二RRS。在某些实施例中，所有三个RRS是异种特异性的。在某些实施例中，编码第一抗体的一条重链和一条轻链的SOI位于第一RRS与第三RRS之间，并且编码第二抗体的一条重链和一条轻链的SOI位于第三RRS与第二RRS之间。在某些实施例中，编码第一抗体的一条重链和两条轻链的SOI位于第一RRS与第三RRS之间，并且编码第二抗体的一条重链和一条轻链的SOI位于第三RRS与第二RRS之间。在某些实施例中，编码第一抗体的一条重链和三条轻链的SOI位于第一RRS与第三RRS之间，并且编码第一抗体的一条轻链以及第二抗体的一条重链和一条轻链的SOI位于第三RRS与第二RRS之间。在某些实施例中，编码第一抗体的一条重链和一条轻链的SOI位于第一RRS与第三RRS之间，并且编码第一抗体的两条轻链以及第二抗体的一条重链和一条轻链的SOI位于第三RRS与第二RRS之间。在某些实施例中，编码多个抗体的重链和轻链的拷贝的不同组合的SOI位于第一RRS与第三RRS之间并且位于第三RRS与第二RRS之间。
在某些实施例中，选择SOI的数量以提高表达滴度和/或表达SOI的宿主细胞的比生产力。例如，但不作为限制，结合二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个SOI可获得更高的滴度和/或比生产力。
在抗体表达的上下文中，包括额外的重链或轻链编码SOI可获得更高的滴度和/或比生产力。例如，但不作为限制，将拷贝数从一条重链和一条轻链(HL)增加至一条重链和两条轻链编码序列(HLL)时，可实现更高的滴度和/或比生产力。类似地，如以下实例所概述，将HLL(三个SOI)增加至HLL-HL(五个SOI)或HLL-HLL(六个)时，可提供更高的滴度和/或比生产力。此外，将拷贝数增加至HLL-HL(五个SOI)或HLL-HLHL(七个SOI)时，可提供更高的滴度和/或比生产力。重链和轻链SOI拷贝数的更多选项包括但不限于：HHL；HHL-H；HLL-H；HHL-HH；HHL-HL；HHL-LL；HLL-HH；HLL-HL；HLL-LL；HHL-HHL；HHL-HHH；HHL-HLL；HHK-LLL；HLL-HHL；HLL-HHH；HLL-LLL；HHL-HHHL；HHL-HHHH；HHL-HHLL；HHL-HLLL；HHL-LLLL；HLL-HHHL；HLL-HHHH；HLL-HLLL；和HLL-LLLL。在某些实施例中，包含额外的拷贝发生在单个基因组基因座处，而在某些实施例中，SOI拷贝可整合在两个或更多个基因座处，例如，多个拷贝可整合在单个基因座处并且一个或多个拷贝整合在一个或多个额外的基因座处。
在某些实施例中，选择SOI的位置(例如，一个SOI相对于另一个SOI位于3'端还是5'端)以提高滴度和/或表达SOI的宿主细胞的比生产力。例如，但不作为限制，在抗体产生的上下文中，重链和轻链SOI的整合位置可导致更高的滴度和/或比生产力。在某些实施例中，尽管SOI拷贝数没有变化，重链和轻链SOI的相对位置可影响滴度和比生产率。
4.宿主细胞
本公开的主题提供了适合靶向整合核苷酸序列并且表达目的多肽的宿主细胞。在某些实施例中，宿主细胞包含内源基因，该内源基因选自由以下项组成的组：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2以及与其至少50％同源的序列，或包含宿主细胞的基因组的基因座，其中基因座包含选自下组的核苷酸序列，该组由重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分以及SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7以及与其至少50％同源的序列组成。
在某些实施例中，宿主细胞为真核宿主细胞。在某些实施例中，宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。在某些实施例中，宿主细胞为仓鼠宿主细胞、人宿主细胞、大鼠宿主细胞或小鼠宿主细胞。在某些实施例中，宿主细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞、CHO K1宿主细胞、CHO K1SV宿主细胞、DG44宿主细胞、DUKXB-11宿主细胞、CHOK1S宿主细胞或CHO K1M宿主细胞。
在某些实施例中，宿主细胞选自由以下项组成的组：由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如在Graham等人，J.Gen Virol.36:59(1977)中所述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)；TRI细胞(如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述)；MRC 5细胞；FS4细胞；Y0细胞；NS0细胞；Sp2/0细胞；以及PER.
Figure GDA0004161491990000291
细胞。
在某些实施例中，宿主细胞为细胞系。在某些实施例中，宿主细胞为已经培养某些代数的细胞系。在某些实施例中，宿主细胞为原代细胞。
在某些实施例中，如果在10、20、30、50、100、200或300代中，目的多肽的表达水平保持在某些水平、提高或降低20％以下，则该目的多肽的表达稳定。在某些实施例中，如果培养物可在不经任何选择的情况下得以保持，则该目的多肽的表达稳定。在某些实施例中，如果目的基因的多肽产物达到约1g/L、约2g/L、约3g/L、约4g/L、约5g/L、约10g/L、约12g/L、约14g/L或约16g/L，则目的多肽的表达水平高。
本公开的主题还涉及产生目的多肽的方法。在某些实施例中，此类方法包括：a)提供宿主细胞，该宿主细胞包含整合在宿主细胞的基因组的基因座内的侧接有两个RRS的至少一个外源SOI和至少一种选择标志物，其中该基因座与选自以下的序列至少约90％同源：重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分以及SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.7；以及b)在适合表达SOI的条件下培养a)中的细胞，并且从中回收目的多肽。在某些实施例中，此类方法包括：a)提供宿主细胞，该宿主细胞包含整合在宿主细胞的基因组的基因座内的至少两个外源SOI和至少一种选择标志物，其中基因座与选自以下的序列至少约90％同源：重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分以及SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7，其中至少一个外源SOI和一种选择标志物侧接有第一RRS和第三RRS并且至少一个外源SOI侧接有第二RRS和第三RRS；以及b)在适合表达SOI的条件下培养a)中的细胞，并且从中回收目的多肽。在某些实施例中，此类方法包括：a)提供宿主细胞，该宿主细胞包含整合在内源基因内的侧接有两个RRS的至少一个外源SOI和至少一种选择标志物，该内源基因选自由以下项组成的组：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2以及与其至少约90％同源的序列；以及b)在适合表达SOI的条件下培养a)中的细胞，并且从中回收目的多肽。在某些实施例中，此类方法包括：a)提供宿主细胞，该宿主细胞包含整合在内源基因内的至少两个外源SOI和至少一种选择标志物，该内源基因选自由以下项组成的组：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2以及与其至少约90％同源的序列，其中至少一个外源SOI和一种选择标志物侧接有第一RRS和第三RRS并且至少一个外源SOI侧接有第二RRS和第三RRS；以及b)在适合表达SOI的条件下培养a)中的细胞，并且从中回收目的多肽。
在某些实施例中，产生目的多肽并且将其分泌到细胞培养基中。在某些实施例中，表达目的多肽并且使其保留在宿主细胞内。在某些实施例中，表达目的多肽，将其插入并且并保留在宿主细胞膜中。
可利用常规的细胞生物学方法将目的外源核苷酸或载体引入宿主细胞中，这些细胞生物学方法包括但不限于转染、转导、电穿孔或注射。在某些实施例中，利用基于化学的转染方法将目的外源核苷酸或载体引入宿主细胞中，这些基于化学的转染方法包括基于脂质的转染方法、基于磷酸钙的转染方法、基于阳离子聚合物的转染方法或基于纳米颗粒的转染方法。在某些实施例中，利用病毒介导的转导将目的外源核苷酸或载体引入宿主细胞中，这些方法包括但不限于慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒介导的转导。在某些实施例中，通过基因枪介导的注射将目的外源核苷酸或载体引入宿主细胞中。在某些实施例中，使用本文所述的方法将DNA和RNA分子均引入宿主细胞中。
5.靶向整合
靶向整合允许将外源核苷酸序列整合在宿主细胞基因组的一个或多个预定位点。在某些实施例中，靶向整合由识别一个或多个RRS的重组酶介导。在某些实施例中，靶向整合由同源重组介导。在某些实施例中，靶向整合由外源位点特异性核酸酶以及随后的HDR和/或NHEJ介导。
在某些实施例中，靶向整合可与随机整合组合。在某些实施例中，靶向整合可在随机整合之后。在某些实施例中，随机整合可由本领域中已知的任何方法或系统介导。在某些实施例中，随机整合由MaxCyte
Figure GDA0004161491990000311
电穿孔系统介导。
5.1.通过重组酶介导的重组的靶向整合
“重组识别序列”(RRS)是由重组酶识别的核苷酸序列，对于重组酶介导的重组事件是必需的并且足以引发此类重组事件。RRS可以用于限定核苷酸序列中将发生重组事件的位置。
在某些实施例中，RRS选自由以下项组成的组：LoxP序列、LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、φC31 attP序列和φC31 attB序列。
在某些实施例中，RRS可以由Cre重组酶识别。在某些实施例中，RRS可以由FLP重组酶识别。在某些实施例中，RRS可以由Bxb1整合酶识别。在某些实施例中，RRS可以由φC31整合酶识别。
在某些实施例中，当RRS是LoxP位点时，宿主细胞需要Cre重组酶以执行重组。在某些实施例中，当RRS是FRT位点时，宿主细胞需要FLP重组酶以执行重组。在某些实施例中，当RRS是Bxb1 attP或Bxb1 attB位点时，宿主细胞需要Bxb1整合酶以执行重组。在某些实施例中，当RRS是φC31 attP或φC31attB位点时，宿主细胞需要φC31整合酶以执行重组。可使用包含酶的编码序列的表达载体将重组酶引入宿主细胞中。
Cre-LoxP位点特异性重组系统已广泛用于许多生物实验系统中。Cre为38kDa位点特异性DNA重组酶，其识别34bp LoxP序列。Cre来源于噬菌体P1并且属于酪氨酸家族位点特异性重组酶。Cre重组酶可以介导LoxP序列之间的分子内重组和分子间重组。LoxP序列由侧接有两个13bp反向重复序列的8bp非回文核心区构成。Cre重组酶与13bp重复序列结合，从而介导8bp核心区内的重组。Cre-LoxP介导的重组以高效率发生，并且无需任何其他宿主因子。如果两个LoxP序列以相同的取向被置于同一核苷酸序列中，则Cre介导的重组将切除位于两个LoxP序列之间的DNA序列，成为共价闭环。如果两个LoxP序列以相反的位置被置于同一核苷酸序列中，则Cre介导的重组将反转位于这两个序列之间的DNA序列的取向。LoxP序列也可置于不同的染色体上，以促进不同染色体之间的重组。如果两个LoxP序列在两个不同的DNA分子上，并且如果一个DNA分子为环状分子，则Cre介导的重组将导致环状DNA序列的整合。
在某些实施例中，LoxP序列为野生型LoxP序列。在某些实施例中，LoxP序列为突变体LoxP序列。已开发突变体LoxP序列，用于提高Cre介导的整合或替换的效率。在某些实施例中，突变体LoxP序列选自由以下项组成的组：LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列和Lox66序列。例如，Lox71序列在左侧的13bp重复序列中有5bp发生突变。Lox66序列在右侧的13bp重复序列中有5bp发生突变。野生型LoxP序列和突变体LoxP序列均可以介导Cre依赖性重组。
FLP-FRT位点特异性重组系统类似于Cre-Lox系统。其涉及翻转酶(FLP)重组酶，该重组酶来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2μm质粒。FLP也属于酪氨酸家族位点特异性重组酶。FRT序列为34bp序列，由各自侧接有8bp间隔区的两个13bp的回文序列组成。FLP结合至13bp回文序列，并且介导8bp间隔区内的DNA断裂、交换和连接。与Cre重组酶类似，两个FRT序列的位置和取向决定了FLP介导的重组结果。在某些实施例中，FRT序列为野生型FRT序列。在某些实施例中，FRT序列为突变体FRT序列。野生型和突变体FRT序列均可介导依赖于FLP的重组。在某些实施例中，FRT序列融合至反应性受体结构域序列，诸如但不限于他莫昔芬反应性受体结构域序列。
Bxb1和φC31属于丝氨酸重组酶家族。它们均来源于噬菌体，并且由这些噬菌体用来建立溶原性，以促进噬菌体基因组位点特异性整合在细菌基因组中。这些整合酶催化称为attP和attB序列的短(40-60bp)DNA底物之间的位点特异性重组事件，这些序列最初分别是位于噬菌体DNA和细菌DNA上的附着位点。重组后形成两个新序列，分别称为attL和attR序列，其各自包含来自attP和attB的半个序列。重组也可发生在attL与attR序列之间，将整合的噬菌体从细菌DNA中切除。两种整合酶均可在不借助任何额外的宿主因子的情况下催化重组。在不存在任何辅助因子的情况下，这些整合酶以超过80％的效率介导attP与attB之间的单向重组。由于可由这些整合酶识别的短DNA序列以及单向重组，这些重组系统已作为广泛使用的Cre-LoxP和FRT-FLP系统的补充开发出来，用于基因工程用途。
术语“匹配RRS”和“同源RRS”表示两个RRS之间发生了重组。在某些实施例中，两个匹配RRS是相同的。在某些实施例中，两个RRS均为野生型LoxP序列。在某些实施例中，两个RRS均为突变体LoxP序列。在某些实施例中，两个RRS均为野生型FRT序列。在某些实施例中，两个RRS均为突变体FRT序列。在某些实施例中，两个匹配RRS为不同的序列，但是可以由同一重组酶识别。在某些实施例中，第一匹配RRS为Bxb1 attP序列，并且第二匹配RRS为Bxb1attB序列。在某些实施例中，第一匹配RRS为φC31 attB序列，并且第二匹配RRS为φC31attB序列。
在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列包含两个RRS，并且载体包含两个RRS，这两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的两个RRS相匹配，即整合的外源核苷酸序列上的第一RRS与载体上的第一RRS相匹配，并且整合的外源核苷酸序列上的第二RRS与载体上的第二RRS相匹配。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列上的第一RRS和载体上的第一RRS与整合的外源核苷酸序列上的第二RRS和载体上的第二RRS相同。此类“单载体RMCE”策略的一个非限制性实例显示于图2A中。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列上的第一RRS和载体上的第一RRS不同于整合的外源核苷酸序列上的第二RRS和载体上的第二RRS。在某些实施例中，整合的外源核苷酸序列上的第一RRS和载体上的第一RRS均为LoxP L3序列，并且整合的外源核苷酸序列上的第二RRS和载体上的第二RRS均为LoxP 2L序列。
在某些实施例中，采用“双载体RMCE”策略。例如，但不作为限制，整合的外源核苷酸序列可以包含三个RRS，例如以下排布：其中第三RRS(“RRS3”)存在于第一RRS(“RRS1”)与第二RRS(“RRS2”)之间，而第一载体包含与该整合的外源核苷酸序列上的第一RRS和第三RRS相匹配的两个RRS，并且第二载体包含与该整合的外源核苷酸序列上的第三RRS和第二RRS相匹配的两个RRS。双载体RMCE策略的一个示例在图4中展示。在此类实例中，RRS1、RRS2和RRS3具有异种特异性，例如它们彼此不发生交叉反应。在一些实施例中，一个载体(前)包含RRS1、第一SOI和启动子以及随后的起始密码子和RRS3(依此顺序)。另一个载体(后)包含融合至不含起始密码子(ATG)的标志物的编码序列的RRS3以及SOI 2和RRS2(依此顺序)。可在RRS3位点与选择标志物序列之间插入额外的核苷酸，以确保融合蛋白发生框架翻译。在一些实施例中，第一SOI编码抗体。在一些实施例中，抗体为单链抗体、抗体轻链、抗体重链、单链Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。在一些实施例中，第二SOI编码抗体。在一些实施例中，抗体为单链抗体、抗体轻链、抗体重链、单链Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。在某些实施例中，由第一SOI和第二SOI对编码抗体，以形成多特异性(例如)双特异性抗体。
此类双载体RMCE策略允许通过在每对RRS之间结合适当数量的SOI，引入八个或更多个SOI。
单载体RMCE和双载体RMCE都允许将一种或多种供体DNA分子单向整合在宿主细胞基因组的预定位点中，并且精确交换存在于供体DNA上的DNA盒与整合位点所在的宿主基因组上的DNA盒。DNA盒的特征在于侧接至少一种选择标志物的两个异种特异性RRS(尽管在某些双载体RMCE实例中，可使用如本文所概述的“分开的选择标志物”)和/或至少一个外源SOI。RMCE涉及靶标基因组基因座内的两个异种特异性RRS与供体DNA分子之间的双重组交叉事件，这些事件由重组酶催化。RMCE设计用于将SOI或选择标志物的拷贝引入宿主细胞基因组的预定基因座中。与仅涉及一次交叉事件的重组不同，RMCE可实现为使得原核载体序列不被引入宿主细胞基因组中，从而减少和/或防止不必要的触发宿主免疫或防御机制。RMCE方法可通过多个DNA盒重复。
在某些实施例中，通过一次交换重组事件实现靶向整合，其中将一个外源核苷酸序列整合在宿主细胞基因组的预定位点中，该外源核苷酸序列包含与至少一个外源SOI或至少一种选择标志物相邻的一个RRS。在某些实施例中，通过一次RMCE实现靶向整合，其中将DNA盒整合在宿主细胞基因组的预定位点中，该DNA盒包含侧接有两个异种特异性RRS的至少一个外源SOI或至少一种选择标志物。在某些实施例中，通过两次RMCE实现靶向整合，其中将两个不同的DNA盒整合在宿主细胞基因组的预定位点中，这两个DNA盒各自包含侧接有两个异种特异性RRS的至少一个外源SOI或至少一种选择标志物。在某些实施例中，通过多次RMCE实现靶向整合，其中将来自多个载体的DNA盒全部整合在宿主细胞基因组的预定位点中，这些DNA盒各自包含侧接有两个异种特异性RRS的至少一个外源SOI或至少一种选择标志物。在某些实施例中，选择标志物可部分地在第一载体上编码，并且部分地在第二载体上编码，使得两次RMCE的整合允许表达选择标志物。这种系统的一个示例呈现于图4中。
在某些实施例中，通过重组酶介导的重组的靶向整合导致选择标志物或一个或多个外源SOI整合在包含来自原核载体的序列的宿主细胞基因组的一个或多个预定整合位点中。在某些实施例中，通过重组酶介导的重组的靶向整合导致选择标志物或一个或多个外源SOI整合在不含来自原核载体的序列的宿主细胞基因组的一个或多个预定整合位点中。
5.2通过同源重组、HDR或NHEJ进行靶向整合
本公开的主题还涉及由同源重组或由外源位点特异性核酸酶以及随后的HDR或NHEJ介导的靶向整合。
同源重组为共享广泛的序列同源性的DNA分子之间的重组。它可用于引导双链DNA断裂的无错误修复，并且在减数分裂过程中产生配子的序列变化。由于同源重组涉及两个同源DNA分子之间的遗传信息交换，因此它不会改变染色体上基因的整体排列。在同源重组过程中，在双链DNA(dsDNA)中形成缺口或断裂，随后通过单链DNA末端引入同源dsDNA分子，发生同源序列配对、分支移位以形成Holliday连接体，并且最终分离Holliday连接体。
双链断裂(DSB)是最严重的DNA损伤形式，并且此类DNA损伤的修复对于维持所有生物体的基因组完整性至关重要。存在两种主要的DSB修复途径。第一种修复途径是同源介导的修复(HDR)途径，并且同源重组是最常见的HDR形式。由于HDR需要细胞中存在同源DNA，因此该修复途径通常在细胞周期的S和G2期活跃，其中新复制的姊妹染色单体可用作同源模板。HDR也是修复DNA复制过程中折叠的复制叉的主要修复途径。HDR被视为是一种相对无差错的修复途径。第二种DSB修复途径是非同源末端连接(NHEJ)。NHEJ是在无需同源DNA模板的情况下将断裂DNA的末端连接在一起的修复途径。
外源位点特异性核酸酶以及随后的HDR可促进靶向整合。这是由于通过在特定的目标基因组位点引入DSB可以提高同源重组的频率。在某些实施例中，外源核酸酶可选自由以下项组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚体、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、TAL效应物结构域融合蛋白、RNA引导的DNA核酸内切酶、经工程化改造的大范围核酸酶和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)核酸内切酶。
CRISPR/Cas和TALEN系统是两种基因组编辑工具，可提供最佳的构建简便性和高效率。CRISPR/Cas被鉴定为细菌对抗入侵噬菌体的免疫防御机制。Cas是一种核酸酶，当由合成引导RNA(gRNA)引导时，能够与细胞中的特定核苷酸序列相关联并且编辑该核苷酸序列中或周围的DNA，例如通过形成单链断裂、DSB和/或点突变中的一种或多种来实现。TALEN是一种经工程化改造的位点特异性核酸酶，由TALE(类转录激活因子效应物核酸酶)的DNA结合结构域和限制性核酸内切酶FokI的催化结构域组成。通过改变存在于DNA结合结构域的单体的高度可变的残基区的氨基酸，可创建靶向各种核苷酸序列的人工TALEN。随后DNA结合结构域将核酸酶引向靶序列并且形成DSB。
通过同源重组或HDR的靶向整合涉及在整合位点存在同源序列。在某些实施例中，同源序列存在于载体上。在某些实施例中，同源序列存在于多核苷酸上。
在某些实施例中，用于外源核苷酸序列靶向整合在宿主细胞中的载体包含侧接至少一种选择标志物的与以下同源的核苷酸序列：包含重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的内源序列，或选自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2组成的组的基因，或选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列。在某些实施例中，用于外源核苷酸序列靶向整合在宿主细胞中的载体包含侧接至少一种选择标志物和至少一个外源SOI的与以下同源的核苷酸序列：包含重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的内源序列，或选自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2组成的组的基因，或选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列。在某些实施例中，用于外源核苷酸序列靶向整合在宿主细胞中的载体包含侧接DNA盒的与选自以下的序列至少50％同源的核苷酸序列：重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分以及SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7，其中该DNA盒包含侧接有两个RRS的至少一种选择标志物和至少一个外源SOI。在某些实施例中，用于外源核苷酸序列靶向整合在宿主细胞中的载体包含侧接DNA盒的与以下至少50％同源的核苷酸序列：重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的内源序列，或选自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2组成的组的基因，其中该DNA盒包含侧接有两个RRS的至少一种选择标志物和至少一个外源SOI。在某些实施例中，载体核苷酸序列与以下至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源：重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的内源序列，或选自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2组成的组的基因，或选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列。在某些实施例中，载体选自由以下项组成的组：腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、整合噬菌体载体、非病毒载体、转座子和/或转座酶载体、整合酶底物和质粒。
在某些实施例中，用于外源核苷酸序列靶向整合在宿主细胞中的多核苷酸包含侧接至少一种选择标志物的与以下同源的核苷酸序列：重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的内源序列，或选自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2组成的组的基因，或选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列。在某些实施例中，用于外源核苷酸序列靶向整合在宿主细胞中的多核苷酸包含侧接至少一种选择标志物和至少一个外源SOI的与以下同源的核苷酸序列：重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的内源序列，或选自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2组成的组的基因，或选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列。在某些实施例中，用于将外源核苷酸序列靶向整合在宿主细胞中的多核苷酸包含与选自侧接DNA盒的SEQID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少50％同源的核苷酸序列，其中DNA盒包含侧接有两个RRS的至少一种选择标志物和至少一个外源SOI。在某些实施例中，用于外源核苷酸序列靶向整合在宿主细胞中的多核苷酸包含侧接DNA盒的与以下至少50％同源的核苷酸序列：重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的内源序列或选自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2组成的组的基因，其中该DNA盒包含侧接有两个RRS的至少一种选择标志物和至少一个外源SOI。在某些实施例中，侧翼核苷酸序列与以下至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约99.9％同源：重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的内源核酸，或选自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2和XP_003512331.2组成的组的基因，或选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列。
在某些实施例中，在没有任何辅助因素的情况下进行同源重组。在某些实施例中，存在能够整合的载体以促进同源重组。在某些实施例中，整合载体选自由以下项组成的组：腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体和整合噬菌体载体。
5.3可调型靶向整合
在许多情况下，蛋白质表达水平并非最佳，主要是因为编码蛋白质难以表达。难以表达的蛋白质的表达水平低可能具有多种难以鉴定的原因。一种可能是宿主细胞中表达的蛋白质的毒性。在此类情况下，可使用可调型表达系统来表达有毒蛋白质，其中编码蛋白质的目的序列处于诱导型启动子的控制下。在这些系统中，仅当调控因子(例如小分子，诸如但不限于四环素或其类似物、强力霉素(DOX))添加至培养基中时，难以表达的蛋白质的表达才得到促进。调控有毒蛋白质的表达可减轻毒性作用，使培养物在生产之前实现所需的细胞生长。某些实施例中，可调型靶向整合(RTI)系统包含整合在特定基因座(例如，包含一个或多个RRS的外源核酸序列)中的SOI，并且在可操作地与之连接的可调型启动子的存在下转录。在某些实施例中，RTI系统可用于确定难以表达的分子(诸如但不限于抗体)的蛋白质表达水平低的根本原因。在某些实施例中，选择性关闭RTI系统中SOI表达的能力可用于将SOI的表达与观察到的不利影响联系起来。
在某些实施例中，为最大程度减小难以表达的分子的根本原因分析过程中的转录和细胞系变异性影响，可使用可调型靶向整合(RTI)系统。例如，但不作为限制，可通过将调控因子(例如强力霉素)加入培养基中来触发TI宿主中SOI的表达。在某些实施例中，RTI载体利用由四环素调控的启动子来表达SOI，该SOI以整合在例如包含RRS的外源核酸序列中，该外源核酸序列本身整合在宿主细胞基因组的整合位点中，从而实现SOI的可调型表达。
在某些实施例中，本公开中所述的RTI系统与对照细胞系相比，可用于成功确定SOI(例如治疗性抗体)的蛋白质表达水平低的潜在原因。在某些实施例中，一旦确认RTI细胞系中SOI(例如治疗性抗体)的相对表达更低，则可以利用蛋白质翻译抑制剂处理(例如Dox和放线菌酮)来评估SOI的细胞内累积和分泌水平。
5.4可调型系统
本公开的主题还涉及用于TI中的可调型系统。例如，但不作为限制，此类调控可基于基因开关，用于通过转录抑制因子或激活因子与组成型或最小启动子的可调型偶联来阻断或激活mRNA合成。在某些非限制性实施例中，可通过结合阻遏蛋白来实现阻遏，例如，其中蛋白质在空间上阻断转录起始，或通过转录沉默子主动阻遏转录。在某些非限制性实施例中，哺乳动物或无病毒增强子的最小启动子的激活可通过与激活结构域的可调型偶联来实现。
在某些实施例中，转录抑制因子或激活因子的条件偶联可通过使用变构蛋白来实现，这些变构蛋白结合启动子以响应于外部刺激。在某些实施例中，转录抑制因子或激活因子的条件偶联可通过使用从螯合蛋白质中释放的细胞内受体来实现，由此可结合靶启动子。在某些实施例中，转录抑制因子或激活因子的条件偶联可通过使用化学诱导的二聚体来实现。
在某些实施例中，用于本公开的TI系统中的变构蛋白可以是响应于抗生素、细菌群体感应信使、分解代谢物或培养参数(诸如温度，例如冷或热)来调节转录活性的蛋白质。在某些实施例中，此类RTI系统可基于分解代谢物，例如，其中控制用于替代碳源的分解代谢基因的细菌抑制因子已转移至哺乳动物细胞。在某些实施例中，对靶启动子的抑制可通过抑制因子CymR的cumate反应结合来实现。在某些实施例中，基于分解代谢物的系统可依赖于融合至单纯疱疹VP16反式激活域的原核抑制因子HdnoR的6-羟基烟碱反应结合激活嵌合启动子。
在某些实施例中，TI系统可以是一种基于群体感应的表达系统，其来源于原核生物，通过群体感应分子管理群体内和群体间联络。这些群体感应分子与靶细胞中的受体结合，调节受体与同源启动子的亲和力，从而启动特定的调节子开关。在某些实施例中，群体感应分子可以是N-(3-氧代-辛酰基)-高丝氨酸内酯，在存在该群体感应分子的情况下，TraR-p65融合蛋白激活融合至TraR特定的操纵基因序列的最小启动子的表达。在某些实施例中，群体感应分子可以是基于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)ScbR抑制因子的系统中的丁内酯SCB1(外消旋2-(1'-羟基-6-甲基庚基)-3-(羟甲基)-丁内酯)，该抑制因子在SCB1不存在的情况下与其同源操纵基因OScbR结合。在某些实施例中，群体感应分子可为RTI系统中使用的高丝氨酸衍生的诱导物，其中铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)群体感应抑制因子RhlR和LasR融合至SV40 T抗原核定位序列和单纯疱疹VP16结构域，并且可激活包含特定操纵基因序列(las box)的启动子。
在某些实施例中，调节本公开的RTI系统中使用的变构蛋白的诱导分子可为但不限于cumate、异丙基-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)、大环内酯、6-羟基烟碱、强力霉素、链阳菌素、NADH、四环素。
在某些实施例中，本公开的RTI系统中使用的细胞内受体可为细胞质或细胞核受体。在某些实施例中，本公开的RTI系统可使用小分子从螯合和抑制蛋白质中释放转录因子。在某些实施例中，本公开的RTI系统依赖类固醇调节，其中激素受体与天然或人工转录因子融合，该转录因子可由细胞溶质中的HSP90释放，迁移到细胞核中并激活所选的启动子。在某些实施例中，可使用由合成类固醇类似物调节的突变体受体，以免内源类固醇激素发生串扰。在某些实施例中，受体可为对4-羟基他莫昔芬产生反应的雌激素受体变体或由RU486诱导的孕激素受体突变体。在某些实施例中，基于人细胞核过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的核受体衍生的罗格列酮反应性转录开关可用于本公开的RTI系统中。在某些实施例中，类固醇反应受体的一种变体可以是RheoSwitch，其基于融合至Gal4DNA结合结构域和VP16反式激活剂的经改性的云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)蜕皮激素受体和小鼠维甲酸X受体(RXR)。在合成蜕皮激素的存在下，RheoSwitch变体可结合并且激活融合至Gal4反应元件的几个重复序列的最小启动子。
在某些实施例中，本文所公开的RTI系统可利用DNA结合蛋白和转录激活剂的化学诱导的二聚化来激活与同源操纵基因融合的最小核心启动子。在某些实施例中，本文所公开的RTI系统可利用由雷帕霉素调控的FKBP与FRB的二聚化。在该系统中，FRB与p65反式激活剂融合，并且FKBP与针对特定同源操纵基因位点的锌指结构域融合，这些位点位于经工程化改造的最小白介素-12启动子的上游。在某些实施例中，FKBP可经过突变。在某些实施例中，本文所公开的RTI系统可利用细菌促旋酶B亚基(GyrB)，其中GyrB在抗生素香豆霉素存在下发生二聚化并且与新生霉素解离。
在某些实施例中，本公开的RTI系统可用于可调型siRNA表达。在某些实施例中，可调型siRNA表达系统可以是四环素、大环内酯或关闭型和开启型QuoRex系统。在某些实施例中，RTI系统可利用爪蟾末端寡嘧啶元件(TOP)，其通过在5'非翻译区形成发夹结构来阻断翻译起始。
在某些实施例中，本公开中描述的RTI系统可利用气相受控的表达，例如乙醛诱导的调节(AIR)系统。AIR系统可采用用构巢曲霉(Aspergillus nidulans)AlcR转录因子，其在无毒浓度的气态或液态乙醛存在下，特异性激活由AlcR特异性操纵基因组装的PAIR启动子。
在某些实施例中，本公开的RTI系统可利用Tet-On或Tet-Off系统。在此类系统中，一个或多个SOI的表达可由四环素或其类似物强力霉素调控。
在某些实施例中，本公开的RTI系统可利用PIP-on或PIP-off系统。在此类系统中，SOI的表达可由例如原始霉素、四环素和/或红霉素调控。
6.TI宿主细胞的制备和使用
本公开的主题涉及将外源核苷酸序列靶向整合在宿主细胞中的方法。在某些实施例中，这些方法涉及将外源核苷酸序列整合在宿主细胞中，以产生适合随后靶向整合SOI的宿主细胞。在某些实施例中，所述方法包括重组酶介导的重组。在某些实施例中，所述方法涉及同源重组、HDR和/或NHEJ。
在某些实施例中，本公开的主题涉及用于将外源核苷酸序列靶向整合在宿主细胞中并且与将外源核苷酸序列随机整合在宿主细胞中相结合的方法。在某些实施例中，这些方法涉及将外源核苷酸序列靶向整合在宿主细胞中以产生适合随后靶向整合SOI的宿主细胞，并且与随机整合相同或不同SOI相结合。在某些实施例中，所述方法包括重组酶介导的重组。在某些实施例中，所述方法涉及同源重组、HDR和/或NHEJ。
6.1使用重组酶介导的重组制备TI宿主细胞
在某些实施例中，本公开提供了用于制备TI宿主细胞以表达目的多肽的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，其中基因座与SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7至少约90％同源，其中外源核苷酸序列包含侧接至少一种第一选择标志物的两个RRS；b)向a)中提供的细胞中引入载体，该载体包含两个RRS，这两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的两个RRS相匹配并且侧接至少一个外源SOI和至少一种第二选择标志物；c)引入重组酶，其中该重组酶识别RRS；以及d)选择表达第二选择标志物的TI细胞，从而分离表达目的多肽的TI宿主细胞。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备TI宿主细胞以表达目的多肽的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在内源基因内的位点的外源核苷酸序列，该内源基因选自由以下项组成的组：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2以及与其至少约90％同源的序列，其中外源核苷酸序列包含侧接至少一种第一选择标志物的两个RRS；b)向a)中提供的细胞中引入载体，该载体包含两个RRS，这两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的两个RRS相匹配并且侧接至少一个外源SOI和至少一种第二选择标志物；c)引入重组酶，其中该重组酶识别RRS；以及d)选择表达第二选择标志物的TI细胞，从而分离表达目的多肽的TI宿主细胞。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备TI宿主细胞以表达目的多肽的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在TI宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，其中基因座与SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7至少约90％同源，其中外源核苷酸序列包含第一DNA盒，该第一DNA盒包含侧接至少一种第一选择标志物的两个异种特异性RRS；b)向a)中提供的细胞中引入包含第二DNA盒的载体，该第二DNA盒包含两个异种特异性RRS，这两个异种特异性RRS与整合的外源核苷酸序列上的两个RRS相匹配并且侧接至少一个外源SOI和至少一种第二选择标志物；c)引入重组酶，其中该重组酶识别RRS并且执行一次RMCE；以及d)选择表达第二选择标志物的TI细胞，从而分离表达目的多肽的TI宿主细胞。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备TI宿主细胞以表达目的多肽的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在以下内源序列内的位点的外源核苷酸序列:重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分，或选自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2组成的组的基因以及与其至少约90％同源的序列，其中外源核苷酸序列包含第一DNA盒，该第一DNA盒包含侧接至少一种第一选择标志物的两个异种特异性RRS；b)向a)中提供的细胞中引入包含第二DNA盒的载体，该第二DNA盒包含两个异种特异性RRS，这两个异种特异性RRS与整合的外源核苷酸序列上的两个RRS相匹配并且侧接至少一个外源SOI和至少一种第二选择标志物；c)引入重组酶，其中该重组酶识别RRS并且执行一次RMCE；以及d)选择表达第二选择标志物的TI细胞，从而分离表达目的多肽的TI宿主细胞。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备TI宿主细胞以表达第一目的多肽和第二目的多肽(其中第一多肽和第二多肽可相同或不同)的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，其中基因座与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7至少约90％同源，其中外源核苷酸序列包含侧接至少一种第一选择标志物的第一RRS和第二RRS以及位于第一RRS与第二RRS之间的第三RRS，并且所有RRS均具有异种特异性；b)向a)中提供的细胞中引入第一载体，该第一载体包含两个RRS，这两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的第一RRS和第三RRS相匹配并且侧接至少一个第一外源SOI和至少一种第二选择标志物；c)向a)中提供的细胞中引入第二载体，该第二载体包含两个RRS，这两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的第二RRS和第三RRS相匹配并且侧接至少一个第二外源SOI；d)引入一种或多种重组酶，其中该一种或多种重组酶识别RRS；以及e)选择表达第二选择标志物的TI细胞，从而分离表达第一目的多肽和第二目的多肽的TI宿主细胞。在某些实施例中，与第一载体上具有整个选择标志物相反，第一载体包含启动子序列，该启动子序列可操作地连接至上游侧接有第一SOI并且下游侧接有RRS的密码子ATG；并且第二载体包含选择标志物，该选择标志物缺少上游侧接有RRS并且下游侧接有第二SOI的ATG转录起始密码子。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备TI宿主细胞以表达第一目的多肽和第二目的多肽(其中第一多肽和第二多肽可相同或不同)的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在以下内源序列内的位点的外源核苷酸序列:重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分，或选自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2组成的组的基因以及与其至少约90％同源的序列，其中外源核苷酸序列包含侧接至少一种第一选择标志物的第一RRS和第二RRS以及位于第一RRS与第二RRS之间的第三RRS，并且所有RRS均具有异种特异性；b)向a)中提供的细胞中引入第一载体，该第一载体包含两个RRS，这两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的第一RRS和第三RRS相匹配并且侧接至少一个第一外源SOI和至少一种第二选择标志物；c)向a)中提供的细胞中引入第二载体，该第二载体包含两个RRS，这两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的第二RRS和第三RRS相匹配并且侧接至少一个第二外源SOI；d)引入一种或多种重组酶，其中该一种或多种重组酶识别RRS；以及e)选择表达第二选择标志物的TI细胞，从而分离表达第一目的多肽和第二目的多肽的TI宿主细胞。在某些实施例中，与第一载体上具有整个选择标志物相反，第一载体包含启动子序列，该启动子序列可操作地连接至上游侧接有第一SOI并且下游侧接有RRS的密码子ATG；并且第二载体包含选择标志物，该选择标志物缺少上游侧接有RRS并且下游侧接有第二SOI的ATG转录起始密码子。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备TI宿主细胞以表达第一目的多肽和第二目的多肽(其中第一多肽和第二多肽可相同或不同)的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，其中基因座与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7至少约90％同源，其中外源核苷酸序列包含第一DNA盒，该第一DNA盒包含侧接至少一种第一选择标志物的第一RRS和第二RRS以及位于第一RRS与第二RRS之间的第三RRS，并且所有三个RRS均具有异种特异性；b)向a)中提供的细胞中引入包含第二DNA盒的第一载体，其中该第二DNA盒包含两个异种特异性RRS，这两个异种特异性RRS与第一DNA盒的第一RRS和第三RRS相匹配并且侧接至少一个第一外源SOI和至少一种第二选择标志物；c)向a)中提供的细胞中引入包含第三DNA盒的第二载体，其中该第三DNA盒包含两个异种特异性RRS，这两个异种特异性RRS与第一DNA盒的第二RRS和第三RRS相匹配并且侧接至少一个第二外源SOI；d)引入一种或多种重组酶，其中该一种或多种重组酶识别RRS并且执行两次RMCE；以及e)选择表达第二选择标志物的TI细胞，从而分离表达第一目的多肽和第二目的多肽的TI宿主细胞。在某些实施例中，与第一载体上具有整个选择标志物相反，第一载体包含启动子序列，该启动子序列可操作地连接至上游侧接有第一SOI并且下游侧接有RRS的密码子ATG；并且第二载体包含选择标志物，该选择标志物缺少上游侧接有RRS并且下游侧接有第二SOI的ATG转录起始密码子。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备TI宿主细胞以表达第一目的多肽和第二目的多肽(其中第一多肽和第二多肽可相同或不同)的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在以下内源序列内的位点的外源核苷酸序列:重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分，或选自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2组成的组的基因以及与其至少约90％同源的序列，其中外源核苷酸序列包含第一DNA盒，该第一DNA盒包含侧接至少一种第一选择标志物的第一RRS和第二RRS以及位于第一RRS与第二RRS之间的第三RRS，并且所有三个RRS均具有异种特异性；b)向a)中提供的细胞中引入包含第二DNA盒的第一载体，其中该第二DNA盒包含两个异种特异性RRS，这两个异种特异性RRS与第一DNA盒的第一RRS和第三RRS相匹配并且侧接至少一个第一外源SOI和至少一种第二选择标志物；c)向a)中提供的细胞中引入包含第三DNA盒的第二载体，其中该第三DNA盒包含两个异种特异性RRS，这两个异种特异性RRS与第一DNA盒的第二RRS和第三RRS相匹配并且侧接至少一个第二外源SOI；d)引入一种或多种重组酶，其中该一种或多种重组酶识别RRS并且执行两次RMCE；以及e)选择表达第二选择标志物的TI细胞，从而分离表达第一目的多肽和第二目的多肽的TI宿主细胞。在某些实施例中，与第一载体上具有整个选择标志物相反，第一载体包含启动子序列，该启动子序列可操作地连接至上游侧接有第一SOI并且下游侧接有RRS的密码子ATG；并且第二载体包含选择标志物，该选择标志物缺少上游侧接有RRS并且下游侧接有第二SOI的ATG转录起始密码子。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备TI宿主细胞以表达目的多肽的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，其中基因座与选自重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分序列的序列或与SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7至少约90％同源，其中外源核苷酸序列包含与至少一种第一选择标志物相邻的一个RRS；b)向a)中提供的细胞中引入载体，该载体包含一个RRS，该RRS与整合的外源核苷酸序列上的RRS相匹配并且侧接至少一个外源SOI和至少一种第二选择标志物；c)引入重组酶，其中该重组酶识别RRS；以及d)选择表达第二选择标志物的TI细胞，从而分离表达目的多肽的TI宿主细胞。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备TI宿主细胞以表达目的多肽的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在以下内源序列内的位点的外源核苷酸序列:重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分，或选自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2组成的组的基因以及与其至少约90％同源的序列，其中外源核苷酸序列包含与至少一种第一选择标志物相邻的一个RRS；b)向a)中提供的细胞中引入载体，该载体包含一个RRS，该RRS与整合的外源核苷酸序列上的RRS相匹配并且侧接至少一个外源SOI和至少一种第二选择标志物；c)引入重组酶，其中该重组酶识别RRS；以及d)选择表达第二选择标志物的TI细胞，从而分离表达目的多肽的TI宿主细胞。
本公开的主题还涉及产生目的多肽的方法，这些方法包括：a)提供如本文所述的TI宿主细胞；b)在适合表达SOI的条件下培养a)中的TI宿主细胞，并且从中回收目的多肽。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备适合随后靶向整合的TI宿主细胞的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，其中基因座与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源，其中外源核苷酸序列包含侧接至少一个外源SOI和至少一种第一选择标志物的两个RRS；b)向a)中提供的细胞中引入载体，该载体包含两个RRS，这两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的两个RRS相匹配并且侧接至少一种第二选择标志物；c)引入重组酶，其中该重组酶识别RRS；以及d)选择表达第二选择标志物的TI细胞，从而分离适合随后靶向整合的TI宿主细胞。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备适合随后靶向整合的TI宿主细胞的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在以下内源序列内的位点的外源核苷酸序列:重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分，或选自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2组成的组的基因以及与其至少约90％同源的序列，其中外源核苷酸序列包含侧接至少一个外源SOI和至少一种第一选择标志物的两个RRS；b)向a)中提供的细胞中引入载体，该载体包含两个RRS，这两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的两个RRS相匹配并且侧接至少一种第二选择标志物；c)引入重组酶，其中该重组酶识别RRS；以及d)选择表达第二选择标志物的TI细胞，从而分离适合随后靶向整合的TI宿主细胞。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备适合随后靶向整合的TI宿主细胞的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，其中基因座与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源，其中外源核苷酸序列包含侧接至少一个外源SOI和至少一种第一选择标志物的第一RRS和第二RRS；b)向a)中提供的细胞中引入载体，该载体包含三个RRS，其中载体的第一RRS与整合的外源核苷酸序列上的第一RRS相匹配，载体的第二RRS与整合的外源核苷酸序列上的第二RRS相匹配，并且至少一种第二选择标志物位于第一RRS与第二RRS之间；c)引入重组酶，其中该重组酶识别载体和整合的外源核苷酸序列两者上的第一RRS和第二RRS；以及d)选择表达第二选择标志物的TI宿主细胞，从而分离适合随后靶向整合的TI宿主细胞。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备适合随后靶向整合的TI宿主细胞的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在以下内源序列内的位点的外源核苷酸序列:重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分，或选自由LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2组成的组的基因以及与其至少约90％同源的序列，其中外源核苷酸序列包含侧接至少一个外源SOI和至少一种第一选择标志物的第一RRS和第二RRS；b)向a)中提供的细胞中引入载体，该载体包含三个RRS，其中载体的第一RRS与整合的外源核苷酸序列上的第一RRS相匹配，载体的第二RRS与整合的外源核苷酸序列上的第二RRS相匹配，并且至少一种第二选择标志物位于第一RRS与第二RRS之间；c)引入重组酶，其中该重组酶识别载体和整合的外源核苷酸序列两者上的第一RRS和第二RRS；以及d)选择表达第二选择标志物的TI宿主细胞，从而分离适合随后靶向整合的TI宿主细胞。
6.2使用同源重组、HDR或NHEJ靶向修饰宿主细胞的方法
在某些实施例中，本公开提供了用于制备TI宿主细胞以表达目的多肽的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含宿主细胞的基因组的基因座，其中该基因座与SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7至少约90％同源；b)将载体引入TI宿主细胞中，其中该载体包含与选自侧接DNA盒的SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少50％同源的核苷酸序列，其中DNA盒包含至少一种选择标志物和至少一个外源SOI；以及c)针对选择标志物进行选择以分离TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在基因组的基因座内的SOI，并且表达目的多肽。在某些实施例中，载体的DNA盒进一步包含侧接有两个RRS的至少一种选择标志物和至少一个外源SOI。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备TI宿主细胞以表达目的多肽的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含宿主细胞的基因组的基因座，其中该基因座与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源；b)将多核苷酸引入TI宿主细胞中，其中该多核苷酸包含与选自侧接DNA盒的SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少50％同源的核苷酸序列，其中DNA盒包含至少一种选择标志物和至少一个外源SOI；以及c)针对选择标志物进行选择以分离TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在基因组的基因座内的SOI，并且表达目的多肽。在某些实施例中，载体的DNA盒进一步包含侧接有两个RRS的至少一种选择标志物和至少一个外源SOI。
在某些实施例中，通过整合载体促进同源重组。在某些实施例中，载体选自由以下项组成的组：腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、整合噬菌体载体、非病毒载体、转座子和/或转座酶载体、整合酶底物和质粒。在某些实施例中，转座子可为PiggyBac(PB)转座子系统。
在某些实施例中，通过外源核酸酶促进整合。在某些实施例中，外源核酸酶选自由以下项组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚体、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、TAL效应物结构域融合蛋白、RNA引导的DNA核酸内切酶、经工程化改造的大范围核酸酶和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)核酸内切酶。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备适合随后靶向整合的TI宿主细胞的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含宿主细胞的基因组的基因座，其中该基因座与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源；b)将载体引入TI宿主细胞中，其中该载体包含侧接DNA盒的与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少50％同源的核苷酸序列，其中DNA盒包含侧接有两个RRS的至少一种选择标志物；c)针对选择标志物进行选择，以分离适合随后靶向整合的TI宿主细胞。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备适合随后靶向整合的TI宿主细胞的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含宿主细胞的基因组的基因座，其中该基因座与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源；b)将多核苷酸引入TI宿主细胞中，其中该多核苷酸包含侧接DNA盒的与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少50％同源的核苷酸序列，其中DNA盒包含侧接有两个RRS的至少一种选择标志物；c)针对选择标志物进行选择，以分离适合随后靶向整合的TI宿主细胞。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备适合随后靶向整合的TI宿主细胞的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含宿主细胞的基因组的基因座，其中该基因座与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源；b)将载体引入宿主细胞中，其中该载体包含侧接DNA盒的与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少50％同源的核苷酸序列，其中DNA盒包含三个RRS，其中第三RRS和至少一种选择标志物位于第一RRS与第二RRS之间；以及c)针对选择标志物进行选择，以分离适合随后靶向整合的TI宿主细胞。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备适合随后靶向整合的TI宿主细胞的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含宿主细胞的基因组的基因座，其中该基因座与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源；b)将多核苷酸引入宿主细胞中，其中该多核苷酸包含侧接DNA盒的与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少50％同源的核苷酸序列，其中DNA盒包含三个RRS，其中第三RRS和至少一种选择标志物位于第一RRS与第二RRS之间；以及c)针对选择标志物进行选择，以分离适合随后靶向整合的TI宿主细胞。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备表达至少一种目的多肽的TI宿主细胞的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在TI宿主细胞的基因组中的一个或多个基因座内的位点的至少一个外源核苷酸序列，其中该一个或多个基因座与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源，其中所述至少一个外源核苷酸序列包含侧接至少一种第一选择标志物的两个RRS；b)向a)中提供的细胞中引入载体，该载体包含两个RRS，这两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的两个RRS相匹配并且侧接至少一个外源SOI和至少一种第二选择标志物；c)引入重组酶或编码重组酶的核酸，其中该重组酶识别RRS；以及选择表达第二选择标志物的TI细胞，从而分离表达所述至少一种目的多肽的TI宿主细胞。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备表达至少一种第一目的多肽和第二目的多肽(其中第一多肽和第二多肽可相同或不同)的TI宿主细胞的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在宿主细胞的基因组的一个或多个基因座内的位点的至少一个外源核苷酸序列，其中一个或多个基因座与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源，其中外源核苷酸序列包含侧接至少一种第一选择标志物的第一RRS和第二RRS以及位于第一RRS与第二RRS之间的第三RRS，并且所有RRS均具有异种特异性；b)向a)中提供的细胞中引入第一载体，该第一载体包含两个RRS，这两个RRS与至少一个整合的外源核苷酸序列上的第一RRS和第三RRS相匹配并且侧接至少一个第一外源SOI和至少一种第二选择标志物；c)向a)中提供的细胞中引入第二载体，该第二载体包含两个RRS，这两个RRS与至少一个整合的外源核苷酸序列上的第二RRS和第三RRS相匹配并且侧接至少一个第二外源SOI；d)引入一种或多种重组酶或编码一种或多种重组酶的一种或多种核酸，其中该一种或多种重组酶识别RRS；以及e)选择表达第二选择标志物的TI细胞，从而分离表达至少一种第一目的多肽和第二目的多肽的TI宿主细胞。在某些实施例中，与第一载体上具有整个选择标志物相反，第一载体包含启动子序列，该启动子序列可操作地连接至上游侧接有第一SOI并且下游侧接有RRS的密码子ATG；并且第二载体包含选择标志物，该选择标志物缺少上游侧接有RRS并且下游侧接有第二SOI的ATG转录起始密码子。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备表达目的多肽的TI宿主细胞的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在TI宿主细胞的基因组的一个或多个基因座内的位点的至少一个外源核苷酸序列，其中该一个或多个基因座与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源，其中外源核苷酸序列包含一个或多个RRS；b)向a)中提供的细胞中引入载体，该载体包含一个或多个RRS，该一个或多个RRS与整合的外源核苷酸序列上的一个或多个RRS相匹配并且侧接可操作地连接至可调型启动子的至少一个外源SOI；c)引入重组酶或编码重组酶的核酸，其中该重组酶识别RRS；以及d)选择在诱导物的存在下表达外源SOI的TI细胞，从而分离表达目的多肽的TI宿主细胞。
在某些实施例中，本公开提供了用于表达目的多肽的方法，这些方法包括：a)提供宿主细胞，该宿主细胞包含整合在宿主细胞的基因组的基因座内的侧接有两个RRS的至少一个外源SOI以及可调型启动子，其中该基因座与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源；以及b)在适合表达SOI的条件下培养细胞，并且从中回收目的多肽。
在某些实施例中，本公开提供了用于制备表达第一目的多肽和第二目的多肽(其中第一多肽和第二多肽可相同或不同)的TI宿主细胞的方法，这些方法包括：a)提供TI宿主细胞，该TI宿主细胞包含整合在宿主细胞的基因组的基因座内的位点的外源核苷酸序列，其中基因座与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源，其中外源核苷酸序列包含第一RRS、第二RRS以及位于第一RRS与第二RRS之间的第三RRS，并且所有RRS均具有异种特异性；b)向a)中提供的细胞中引入第一载体，该第一载体包含两个RRS，这两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的第一RRS和第三RRS相匹配并且侧接可操作地连接至可调型启动子的至少一个第一外源SOI；c)向a)中提供的细胞中引入第二载体，该第二载体包含两个RRS，这两个RRS与整合的外源核苷酸序列上的第二RRS和第三RRS相匹配并且侧接可操作地连接至可调型启动子的至少一个第二SOI；d)引入一种或多种重组酶或编码一种或多种重组酶的一种或多种核酸，其中该一种或多种重组酶识别RRS；以及e)选择在诱导物的存在下表达第一外源SOI和第二外源SOI的TI细胞，从而分离表达目的多肽的TI宿主细胞。在某些实施例中，与第一载体上具有整个选择标志物相反，第一载体包含启动子序列，该启动子序列可操作地连接至上游侧接有第一SOI并且下游侧接有RRS的密码子ATG；并且第二载体包含选择标志物，该选择标志物缺少上游侧接有RRS并且下游侧接有第二SOI的ATG转录起始密码子。
7.产物
本公开的宿主细胞可用于表达任何目的分子(例如，目的多肽)。在某些实施例中，本公开的宿主细胞可用于表达多肽(例如，哺乳动物多肽)。此类多肽的非限制性实例包括激素、受体、融合蛋白、调节因子、生长因子、补体系统因子、酶、凝血因子、抗凝血因子、激酶、细胞因子、CD蛋白、白介素、治疗性蛋白质、诊断蛋白质和抗体。在一些实施例中，抗体为单克隆抗体。在一些实施例中，抗体为治疗性抗体。在一些实施例中，抗体为诊断性抗体。在一些实施例中，抗体为人抗体。在一些实施例中，抗体为人源化抗体。
在某些实施例中，本文定义中涵盖的多肽的实例包括哺乳动物多肽，诸如，例如，肾素；生长激素，包括人类生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；卵泡刺激素；降钙素；促黄体素；胰高血糖素；瘦素；凝血因子诸如VIIIC因子、IX因子、组织因子和维勒布兰德氏(von Willebrands)因子；抗凝血因子诸如蛋白C；心钠素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活剂，诸如尿激酶或人类尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；蛙皮素(bombesin)；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；肿瘤坏死因子受体诸如死亡受体5和CD120；TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)；B细胞成熟抗原(BCMA)；B淋巴细胞刺激因子(BLyS)；增殖诱导配体(APRIL)；脑啡肽酶；RANTES(调节正常表达和分泌的T细胞活化)；人类巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白诸如人类血清白蛋白；缪勒管(Muellerian)抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，诸如β-内酰胺酶、脱氧核糖核酸酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；激活素；血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)；血管内皮生长因子家族蛋白(例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和P1GF)；血小板衍生生长因子(PDGF)家族蛋白(例如，PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D及其二聚体)；成纤维细胞生长因子(FGF)家族诸如aFGF、bFGF、FGF4和FGF9；表皮生长因子(EGF)；激素或生长因子的受体诸如VEGF受体(例如，VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)，表皮生长因子(EGF)受体(例如，ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4受体)，血小板衍生生长因子(PDGF)受体(例如，PDGFR-α和PDGFR-β)，和成纤维细胞生长因子受体；TIE配体(血管生成素、ANGPT1、ANGPT2)；血管生成素受体诸如TIE1和TIE2；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子诸如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-5或神经营养蛋白-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子诸如NGF-b；转化生长因子(TGF)诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白诸如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；趋化因子诸如CXCL12和CXCR4；干扰素诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF、GM-CSF和G-CSF；细胞因子诸如白介素(IL)，例如，IL-1至IL-10；中期因子；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原诸如，例如，AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；寻址蛋白；调节蛋白；整合素诸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肝配蛋白；Bv8；δ样配体4(DLL4)；Del-1；BMP9；BMP10；卵泡抑素；肝细胞生长因子(HGF)/散射因子(SF)；Alk1；Robo4；ESM1；串珠素；EGF样结构域7(EGFL7)；CTGF及其家族成员；血小板反应蛋白诸如血小板反应蛋白1和血小板反应蛋白2；胶原蛋白诸如胶原蛋白IV和胶原蛋白XVIII；神经纤毛蛋白诸如NRP1和NRP2；多效生长因子(PTN)；颗粒蛋白原；多育曲菌素；Notch蛋白诸如Notch1和Notch4；导蛋白诸如Sema3A、Sema3C和Sema3F；肿瘤相关抗原诸如CA125(卵巢癌抗原)；免疫粘附素；以上列出的任何多肽以及抗体(包括抗体片段)的片段和/或变体与一个或多个蛋白(包括例如以上列出的任何蛋白)结合。
在某些实施例中，目的多肽为双特异性抗体、三特异性抗体或多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。多特异性抗体的各种分子形式是在本领域中已知的并且包括在本文中(参见例如Spiess等人，Mol Immunol 67(2015)95-106)。本文还包括的一种特定类型的多特异性抗体是这样的双特异性抗体，该双特异性抗体设计用于同时结合靶细胞(例如，肿瘤细胞)上的表面抗原和T细胞受体(TCR)复合物的活化不变组分(诸如CD3)，以用于再靶向T细胞以杀伤靶细胞。双特异性抗体形式的其他实例包括但不限于所谓的“BiTE”(双特异性T细胞接合子)分子，其中两个scFv分子通过柔性接头融合(参见例如，WO2004/106381、WO2005/061547、WO2007/042261，以及WO2008/119567；Nagorsen和
Figure GDA0004161491990000581
Exp Cell Res317,1255-1260(2011))；双体抗体(Holliger等人，Prot Eng 9,299-305(1996))及其衍生物，诸如串联双体抗体(“TandAb”；Kipriyanov等人，J Mol Biol 293,41-56(1999))；“DART”(双重亲和力再靶向)分子，其基于双体抗体形式但特征是具有用于实现额外稳定化的C-末端二硫桥(Johnson等人，J Mol Biol 399,436-449(2010))，以及所谓的三功能抗体(triomab)，其是全杂交小鼠/大鼠IgG分子(综述于Seimetz等人，Cancer Treat Rev 36,458-467(2010)中)。本文所包含的特定的T细胞双特异性抗体形式描述于以下文献中：WO2013/026833；WO 2013/026839；WO 2016/020309；Bacac等人，Oncoimmunology 5(8)(2016)e1203498。
在某些实施例中，本公开的宿主细胞可用于表达分子伴侣、蛋白质修饰酶、shRNA、gRNA或其他蛋白质或肽，同时组成型或可调地表达目的治疗性蛋白质或分子。
在一些实施例中，由本公开的宿主细胞表达的多肽可结合至任何蛋白质或与其发生相互作用，这些蛋白质包括但不限于选自由以下项组成的组的细胞因子、细胞因子相关蛋白质和细胞因子受体：8MPI、8MP2、8MP38(GDFIO)、8MP4、8MP6、8MP8、CSFI(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(αFGF)、FGF2(βFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF1 0、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFN81、IFNG、IFNWI、FEL1、FEL1(EPSELON)、FEL1(ZETA)、IL 1A、IL 1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL 11、IL 12A、IL 12B、IL 13、IL 14、IL 15、IL 16、IL 17、IL 17B、IL 18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBb3、LTA(TNF-β)、LTB、TNF(TNF-α)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、HGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL 11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(瘦素)、PTN和THPO.k。
在一些实施例中，由本公开的宿主细胞表达的多肽可结合至选自由以下项组成的组的细胞因子、细胞因子受体或细胞因子相关蛋白质或与其发生相互作用：CCLI(1-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-Iα)、CCL4(MIP-Iβ)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL 13(MCP-4)、CCL 15(MIP-Iδ)、CCL 16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL 18(PARC)、CCL 19(MDP-3b)、CCL20(MIP-3α)、CCL21(SLC/exodus-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCLI(GROI)、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL 10(IP 10)、CXCL 11(1-TAC)、CXCL 12(SDFI)、CXCL 13、CXCL 14、CXCL 16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL 1(SCYDI)、SCYEI、XCLI(淋巴细胞趋化因子)、XCL2(SCM-Iβ)、BLRI(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCRI(CKRI/HM145)、CCR2(mcp-IRB IRA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBII)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Rα)、IL8RB(IL8Rβ)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HDF1、HDF1α、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2和VHL。在一些实施例中，由本公开的宿主细胞表达的多肽可与以下结合或相互作用：0772P(CA125、MUC16)(即，卵巢癌抗原),ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；ADORA2A；聚集蛋白聚糖；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；β淀粉样蛋白；ANGPTL；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；ASLG659；ASPHD1(含天冬氨酸β-羟化酶结构域1；LOC253982)；AZGP1(锌-a-糖蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF-R(B细胞激活因子受体、BLyS受体3,BR3；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLRI(MDR15)；BMP1；BMP2；BMP3B(GDF10)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B(骨形态发生蛋白受体IB型)；BMPR2；BPAG1(网蛋白)；BRCA1；短蛋白聚糖；C19orf10(IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2(D6/JAB61)；CCL1(1-309)；CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子)；CCL13(MCP-4)；CCL15(MIP1δ)；CCL16(HCC-4)；CCL17(TARC)；CCL18(PARC)；CCL19(MIP-3β)；CCL2(MCP-1)；MCAF；CCL20(MIP-3α)；CCL21(MTP-2)；SLC；exodus-2；CCL22(MDC/STC-1)；CCL23(MPIF-1)；CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)；CCL25(TECK)；CCL26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)；CCL27(CTACK/ILC)；CCL28；CCL3(MTP-Iα)；CCL4(MDP-Iβ)；CCL5(RANTES)；CCL7(MCP-3)；CCL8(mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1(CKRI/HM145)；CCR2(mcp-IRβ/RA)；CCR3(CKR/CMKBR3)；CCR4；CCR5(CMKBR5/ChemR13)；CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)；CCR7(CKBR7/EBI1)；CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9(GPR-9-6)；CCRL1(VSHK1)；CCRL2(L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD22(B细胞受体CD22-B同种型)；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD52；CD69；CD72；CD74；CD79A(CD79α，免疫球蛋白相关α，一种B细胞特异性蛋白)；CD79B；CDS；CD80；CD81；CD83；CD86；CDH1(上皮钙黏素)；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A(p21/WAF1/Cip1)；CDKN1B(p27/Kip1)；CDKN1C；CDKN2A(P16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；几丁质酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7(密封蛋白-7)；CLL-1(CLEC12A、MICL和DCAL2)；CLN3；CLU(簇集素)；CMKLR1；CMKOR1(RDC1)；CNR1；COL 18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；补体因子D；CR2；CRP；CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌衍生生长因子)；CSFI(M-CSF)；CSF2(GM-CSF)；CSF3(GCSF)；CTLA4；CTNNB1(b-连环蛋白)；CTSB(组织蛋白酶B)；CX3CL1(SCYDI)；CX3CR1(V28)；CXCL1(GRO1)；CXCL10(IP-10)；CXCL11(I-TAC/IP-9)；CXCL12(SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2(GRO2)；CXCL3(GRO3)；CXCL5(ENA-78/LIX)；CXCL6(GCP-2)；CXCL9(MIG)；CXCR3(GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1，一种G蛋白偶联受体)；CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DNCLI；DPP4；E16(LAT1、SLC7A5)；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EphB2R；EPO；ERBB2(Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；ETBR(内皮素B型受体)；F3(TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FcRH1(Fc受体样蛋白1)；FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)、SPAP1B、SPAP1C)；FGF；FGF1(αFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2(bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3(int-2)；FGF4(HST)；FGF5；FGF6(HST-2)；FGF7(KGF)；FGF8；FGF9；FGFR；FGFR3；FIGF(VEGFD)；FELl(EPSILON)；FILl(ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRTI(纤连蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1(FRA-1)；FY(DARC)；GABRP(GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GDNF-Ra1(GDNF家族受体α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-ALPHA-1)；GEDA；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNASI；GNRHI；GPR2(CCR10)；GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；GPR31；GPR44；GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；GPR81(FKSG80)；GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；GRCCIO(C10)；GRP；GSN(凝溶胶蛋白)；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HOP1；组胺和组胺受体；HLA-A；HLA-DOB(MHC II类分子的β亚基(Ia抗原)；HLA-DRA；HM74；HMOXI；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；1D2；IFN-a；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNγ；DFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-l；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；ILIF10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2、ILIRN；IL2；IL20；IL20Rα；IL21 R；IL22；IL-22c；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST(糖蛋白130)；流感A；流感B；EL7；EL7R；EL8；IL8RA；DL8RB；IL8RB；DL9；DL9R；DLK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAK1；IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2)；ERAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6(a6整合素)；ITGAV；ITGB3；ITGB4(b4整合素)；α4β7和αEβ7整合素异二聚体；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5(GC Box BP)；KLF6；KLKIO；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19(角蛋白19)；KRT2A；KHTHB6(头发特异性H型角蛋白)；LAMAS；LEP(瘦素)；LGR5(富含亮氨酸的含重复G蛋白偶联受体5；GPR49、GPR67)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA(TNF-b)；LTB；LTB4R(GPR16)；LTB4R2；LTBR；LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸的重复(LRR)家族的I型膜蛋白)；Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物，基因座E；Ly67、RIG-E、SCA-2、TSA-1)；Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物，基因座G6D；Ly6-D、MEGT1)；LY6K(淋巴细胞抗原6复合物，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；MACMARCKS；MAG或OMgp；MAP2K7(c-Jun)；MDK；MDP；MIB1；中期因子；MEF；MIP-2；MKI67；(Ki-67)；MMP2；MMP9；MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核细胞增强因子、间皮素)；MS4A1；MSG783(RNF124、假设蛋白FLJ20315)；MSMB；MT3(金属硫因-111)；MTSS1；MUC1(黏蛋白)；MYC；MY088；Napi3b(也称为NaPi2b)(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶质载体家族34(磷酸钠)成员2、II型钠依赖性磷酸盐转运蛋白3b)；NCA；NCK2；神经蛋白聚糖；NFKB1；NFKB2；NGFB(NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66(Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1(NM23A)；NOX5；NPPB；NR0B1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR112；NR113；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZI；OPRD1；OX40；P2RX7；P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5)；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PD-L1；PD-L2；PD-1；POGFA；POGFB；PECAM1；PF4(CXCL4)；PGF；PGR；phosphacan；PIAS2；PIK3CG；PLAU(uPA)；PLG；PLXDC1；PMEL17(银同源物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；PPBP(CXCL7)；PPID；PRI；PRKCQ；PRKDI；PRL；PROC；PROK2；PSAP；PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA2700050C12基因)；PTAFR；PTEN；PTGS2(COX-2)；PTN；RAC2(p21 Rac2)；RARB；RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；RGSI；RGS13；RGS3；RNF110(ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2(亲脂素B)；SCGB2A1(mammaglobin2)；SCGB2A2(mammaglobin 1)；SCYEI(内皮单核细胞激活细胞因子)；SDF2；Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、Semaphorin 5b Hlog,sema结构域,七次血小板应答蛋白重复(1型和1型样),跨膜结构域(TM)和短胞质结构域、(semaphorin)5B)；SERPINA1；SERPINA3；SERP1NB5(maspin)；SERPINE1(PAI-1)；SERPDMF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPPI；SPRR1B(Sprl)；ST6GAL1；STABI；STAT6；STEAP(前列腺的六次跨膜抗原)；STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因1、前列腺癌相关蛋白1、前列腺的六次跨膜上皮抗原2、六次跨膜前列腺蛋白)；TB4R2；TBX21；TCPIO；TOGFI；TEK；TENB2(假设跨膜蛋白聚糖)；TGFA；TGFBI；TGFB1II；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBRI；TGFBR2；TGFBR3；THIL；THBSI(血小板应答蛋白-1)；THBS2；THBS4；THPO；TIE(Tie-1)；TMP3；组织因子；TLR1；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TLR10；TMEFF1(具有EGF样和两个卵泡抑制素样结构域的跨膜蛋白1；Tomoregulin-1)；TMEM46(shisa同源物2)；TNF；TNF-a；TNFAEP2(B94)；TNFAIP3；TNFRSFIIA；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6(Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10(TRAIL)；TNFSF11(TRANCE)；TNFSF12(AP03L)；TNFSF13(April)；TNFSF13B；TNFSF14(HVEM-L)；TNFSF15(VEGI)；TNFSF18；TNFSF4(OX40配体)；TNFSF5(CD40配体)；TNFSF6(FasL)；TNFSF7(CD27配体)；TNFSFS(CD30配体)；TNFSF9(4-1BB配体)；TOLLIP；Toll样受体；TOP2A(拓扑异构酶Ea)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TMEM118(环指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道，超家族M，成员4)；TRPC6；TSLP；TWEAK；酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；tyrosinase；SHEP3)；VEGF；VEGFB；VEGFC；多能蛋白聚糖；VHL C5；VLA-4；XCL1(淋巴细胞趋化因子)；XCL2(SCM-1b)；XCRI(GPR5/CCXCRI)；YY1；和/或ZFPM2。
在某些实施例中，根据本文所公开的方法产生的抗体(或双特异性抗体)的靶分子包括CD蛋白质，诸如CD3、CD4、CDS、CD16、CD19、CD20、CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/爱泼斯坦-巴尔病毒受体)或Hs.73792)；CD33；CD34；CD64；CD72(B细胞分化抗原CD72、Lyb-2)；CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫球蛋白相关β)、B29)；ErbB受体家族的CD200成员，诸如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，诸如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7整合素和αv/β3整合素，包括其α亚基或β亚基(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子，诸如VEGF-A、VEGF-C；组织因子(TF)；α干扰素(αIFN)；TNFα、白介素，诸如IL-1β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IL 17AF、IL-1S、IL-13Rα1、IL13Rα2、IL-4R、IL-5R、IL-9R、IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；RANKL、RANK、RSV F蛋白、蛋白C等。在某些实施例中，本文提供的方法可用于产生抗体(或多特异性抗体，诸如双特异性抗体)，该抗体特异性结合至补体蛋白C5(例如，特异性结合至人C5的抗C5激动剂抗体。
在某些实施例中，本文所提供的方法可用于产生抗体(或多特异性抗体，诸如双特异性抗体)，该抗体特异性结合至乙型流感病毒血凝素，即“fluB”(例如，体外和/或体内结合来自Yamagata谱系的乙型流感病毒的血凝素、结合来自Victoria谱系的乙型流感病毒的血凝素或结合来自Yamagata谱系、Victoria谱系和祖先谱系的乙型流感病毒的血凝素的抗体)。WO 2015/148806中描述了有关抗FluB抗体的进一步细节，其全文以引用方式并入本文。
在某些实施例中，根据本文所提供的方法产生的抗体(或双特异性抗体)结合低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-1或LRP-8或转铁蛋白受体以及选自由以下项组成的组的至少一种靶标：β-分泌酶(BACE1或BACE2)、α-分泌酶、γ-分泌酶、τ-分泌酶、淀粉样前体蛋白(APP)、死亡受体6(DR6)、淀粉样蛋白β、α-突触核蛋白、帕金蛋白、亨廷顿蛋白、p75 NTR、CD40和半胱天冬酶-6。
在某些实施例中，根据本文所提供的方法产生的抗体为抗CD40的人IgG2抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体为RG7876。
在某些实施例中，根据本文所提供的方法产生的多肽为靶向免疫细胞因子。在某些实施例中，靶向免疫细胞因子为CEA-IL2v免疫细胞因子。在某些实施例中，CEA-IL2v免疫细胞因子为RG7813。在某些实施例中，靶向免疫细胞因子为FAP-IL2v免疫细胞因子。在某些实施例中，FAP-IL2v免疫细胞因子为RG7461。
在某些实施例中，根据本文所提供的方法产生的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)结合CEA以及至少一种另外的靶分子。在某些实施例中，根据本文所提供的方法产生的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)结合肿瘤靶向细胞因子以及至少一种另外的靶分子。在某些实施例中，根据本文所提供的方法产生的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)融合至IL2v(即，白介素2变体)并且结合基于IL1的免疫细胞因子以及至少一种另外的靶分子。在某些实施例中，根据本文所提供的方法产生的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)为T细胞双特异性抗体(即，双特异性T细胞接合子或BiTE)。
在某些实施例中，根据本文所提供的方法产生的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)结合至选自以下项的至少两种靶分子：IL-1α和IL-1β、IL-12和IL-1S；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-5和IL-4；IL-13和IL-1β；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MEF；IL-13和TGF-～；IL-13和LHR激动剂；IL-12和TWEAK、IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAMS、IL-13和PED2、IL17A和IL17F、CEA和CD3、CD3和CD19、CD138和CD20；CD138和CD40；CD19和CD20；CD20和CD3；CD3S和CD13S；CD3S和CD20；CD3S和CD40；CD40和CD20；CD-S和IL-6；CD20和BR3、TNFα和TGF-β、TNFα和IL-1β；TNFα和IL-2、TNFα和IL-3、TNFα和IL-4、TNFα和IL-5、TNFα和IL6、TNFα和IL8、TNFα和IL-9、TNFα和IL-10、TNFα和IL-11、TNFα和IL-12、TNFα和IL-13、TNFα和IL-14、TNFα和IL-15、TNFα和IL-16、TNFα和IL-17、TNFα和IL-18、TNFα和IL-19、TNFα和IL-20、TNFα和IL-23、TNFα和IFNα、TNFα和CD4、TNFα和VEGF、TNFα和MIF、TNFα和ICAM-1、TNFα和PGE4、TNFα和PEG2、TNFα和RANK配体、TNFα和Te38、TNFα和BAFF、TNFα和CD22、TNFα和CTLA-4、TNFα和GP130、TNF a和IL-12p40、VEGF和血管生成素、VEGF和HER2、VEGF-A和HER2、VEGF-A和PDGF、HER1和HER2、VEGFA和ANG2、VEGF-A和VEGF-C、VEGF-C和VEGF-D、HER2和DR5、VEGF和IL-8、VEGF和MET、VEGFR和MET受体、EGFR和MET、VEGFR和EGFR、HER2和CD64、HER2和CD3、HER2和CD16、HER2和HER3；EGFR(HER1)和HER2、EGFR和HER3、EGFR和HER4、IL-14和IL-13、IL-13和CD40L、IL4和CD40L、TNFR1和IL-1R、TNFR1和IL-6R和TNFR1和IL-18R、EpCAM和CD3、MAPG和CD28、EGFR和CD64、CSPGs和RGM A；CTLA-4和BTN02；IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；MAG和RGM A；NgR和RGM A；NogoA和RGM A；OMGp和RGMA；POL-l和CTLA-4；以及RGM A和RGM B。
在某些实施例中，多特异性抗体(诸如双特异性抗体)为抗CEA/抗CD3双特异性抗体。在某些实施例中，抗CEA/抗CD3双特异性抗体为RG7802。WO 2014/121712中提供了有关抗CEA/抗CD3双特异性抗体的进一步细节，其全文以引用方式并入本文。
在某些实施例中，多特异性抗体(诸如双特异性抗体)为抗VEGF/抗血管生成素双特异性抗体。在某些实施例中，抗VEGF/抗血管生成素双特异性抗体为Crossmab。在某些实施例中，抗VEGF/抗血管生成素双特异性抗体为RG7716。
在某些实施例中，多特异性抗体(诸如双特异性抗体)为抗Ang2/抗VEGF双特异性抗体。在某些实施例中，抗Ang2/抗VEGF双特异性抗体为RG7221。在某些实施例中，抗Ang2/抗VEGF双特异性抗体为CAS编号1448221-05-3。
根据本公开所述的宿主细胞可以表达许多其他抗体和/或其他蛋白质，并且以上列表并非意在限制。
本公开的宿主细胞可用于以生产规模生产目的分子。治疗性蛋白质或其他蛋白质的“制造规模”生产利用范围为约400L至约80,000L的细胞培养物，具体取决于生产的蛋白质以及需求。通常，此类制造规模生产利用约400L至约25,000L的细胞培养物。在该范围内，可利用诸如4,000L、约6,000L、约8,000L、约10,000L、约12,000L、约14,000L或约16,000L的特定细胞培养物。
在某些实施例中，目的多肽为双特异性抗体、三特异性抗体或多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
本公开的宿主细胞可用于相比于当前的细胞培养方法中使用的非TI细胞相比在更短的时间内生产大量目的分子。在某些实施例中，本公开的宿主细胞可用于相比于当前的细胞培养方法中使用的非TI细胞改善目的分子的质量。在某些实施例中，本公开的宿主细胞可通过预防可能引起细胞应激和克隆随时间推移的不稳定的产物所导致的慢性毒性来增强种子系列的稳定性。在某些实施例中，本公开的宿主细胞可用于优化急性毒性产物的表达。
在某些实施例中，本公开的宿主细胞(TI系统)可用于细胞培养工艺优化和/或工艺开发。
在某些实施例中，本公开的宿主细胞可用于相比于常规细胞培养方法中使用的非TI细胞，将目的分子的生产加快约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周或约10周。在某些实施例中，本公开的宿主细胞可用于相比于常规细胞培养方法中使用的非TI细胞，将目的分子的收获加快约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周或约10周。
在某些实施例中，与常规细胞培养方法中使用的非TI细胞相比，本实施例的宿主细胞可用于降低目的分子的聚集水平。
在某些实施例中，本公开的宿主细胞可用于相对于随机整合宿主细胞实现一种或多种目的多肽的更高水平的表达。例如，但不作为限制，本公开的宿主细胞可实现滴度为至少3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L、5g/L、5.5g/L、6g/L、6.5g/L、7g/L、7.5g/L、8g/L、8.5g/L、9g/L、9.5g/L、10g/L、10.5g/L、11g/L或更高的标准抗体和半抗体的表达，并且实现滴度为至少1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L、5g/L、5.5g/L、6g/L或更高的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)的表达。在某些实施例中，本公开的宿主细胞相对于随机整合宿主细胞可实现更高的双特异性含量。例如，但不作为限制，本公开的宿主细胞可实现至少80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或更高的双特异性含量。
在某些实施例中，本公开的宿主细胞可用于治疗性分子的选定亚基的组成型表达以及同一治疗性分子的其他不同亚基的可调型表达。在某些实施例中，治疗性分子可为融合蛋白。在某些实施例中，本公开的宿主细胞可用于了解各种抗体亚基在完全组装的抗体分子的表达和分泌中的作用和影响。
在某些实施例中，本公开的宿主细胞可用作研究工具。在某些实施例中，本公开的宿主细胞可用作诊断工具，以查明各种细胞中问题分子的蛋白表达水平低的根本原因。在某些实施例中，本公开的宿主细胞可用于将观察到的现象或细胞行为与细胞中的转基因表达直接联系起来。本公开的宿主细胞也可用于证明观察到的行为在细胞中是否可逆。在某些实施例中，可利用本公开的宿主细胞来鉴定并且缓解与细胞中转基因转录和表达有关的问题。
在某些实施例中，本公开的宿主细胞可用于交换难以表达的分子的转基因亚基(诸如但不限于抗体的HC和LC亚基)与TI系统中普通分子的转基因亚基，以鉴定存在问题的一种或多种亚基。在某些实施例中，然后可以使用氨基酸序列分析来缩小和关注可能导致低蛋白质表达的氨基酸残基或区域。在某些实施例中，可以使用本公开的宿主细胞表达目的多肽，所述目的多肽包含：a)侧接有两个重组识别序列(RRS)的编码第一目的多肽的靶向整合的外源核酸目的序列(SOI)和第一选择标志物，其中靶向整合的外源SOI整合在所述宿主细胞的基因组的靶向基因座内；b)编码第二目的多肽的随机整合的外源核酸SOI和第二选择标志物，其中随机整合的SOI至少一次整合在所述宿主细胞的基因组中；c)其中所述靶向整合的外源核酸SOI组成型或诱导型表达，并且所述随机整合的外源核酸SOI组成型或诱导型表达。在某些实施例中，靶向整合的外源核酸SOI组成型表达。在某些实施例中，靶向整合的外源核酸SOI诱导型表达。在某些实施例中，随机整合的外源核酸SOI组成型表达。在某些实施例中，靶向整合的外源核酸SOI诱导型表达，并且随机整合的外源核酸SOI组成型表达。在某些实施例中，靶向整合的外源核酸SOI组成型表达，并且随机整合的外源核酸SOI组成型表达。在某些实施例中，靶向整合的外源核酸SOI组成型表达，并且随机整合的外源核酸SOI诱导型表达。
在某些实施例中，本公开提供了一种表达目的多肽的方法，该方法包括：a)提供宿主细胞，该宿主细胞包含整合在宿主细胞的基因组的靶向基因座处的外源核苷酸序列，其中该外源核苷酸序列包含侧接第一选择标志物的两个RRS；b)向(a)中提供的细胞中引入核酸，该核酸包含两个RRS，这两个RRS与整合的外源核苷酸序列的两个RRS相匹配并且侧接编码第一目的多肽的第一外源SOI和第二选择标志物；c)引入重组酶或编码重组酶的核酸，其中该重组酶识别RRS；d)选择表达第二选择标志物的细胞；e)通过随机整合，将编码第二目的多肽的第二外源SOI和第三选择标志物引入宿主细胞的基因组中；f)其中整合在宿主细胞的基因组的靶向基因座处的外源核苷酸序列组成型或诱导型表达，并且第二外源SOI组成型或诱导型表达；g)选择表达第三选择标志物的细胞；以及h)在足以表达第一目的多肽和第二目的多肽的条件下培养宿主细胞。在某些实施例中，整合在宿主细胞的基因组的靶向基因座处的外源核苷酸序列组成型表达。在某些实施例中，整合在宿主细胞的基因组的靶向基因座处的外源核苷酸序列诱导型表达。在某些实施例中，第二外源SOI组成型表达。在某些实施例中，第二外源SOI诱导型表达。在某些实施例中，整合在宿主细胞的基因组的靶向基因座处的外源核苷酸序列诱导型表达，并且第二外源SOI组成型表达。在某些实施例中，整合在宿主细胞的基因组的靶向基因座处的外源核苷酸序列组成型表达，并且第二外源SOI组成型表达。在某些实施例中，整合在宿主细胞的基因组的靶向基因座处的外源核苷酸序列组成型表达，并且第二外源SOI诱导型表达。
8.示例性非限制性实施例
A.一种能够表达目的多肽的宿主细胞，该宿主细胞包含：a)侧接有两个重组识别序列(RRS)的编码第一目的多肽的靶向整合的外源核酸目的序列(SOI)和第一选择标志物，其中靶向整合的外源SOI整合在宿主细胞的所述基因组的靶向基因座内；b)编码第二目的多肽的随机整合的外源核酸SOI和第二选择标志物，其中随机整合的SOI至少一次整合在宿主细胞的基因组中；以及c)其中靶向整合的外源核酸SOI组成型或诱导型表达，并且随机整合的外源核酸SOI组成型或诱导型表达。
A1.根据A所述的宿主细胞，其中第一目的多肽和第二目的多肽相同。
A2.根据A所述的宿主细胞，其中第一选择标志物和第二选择标志物相同。
A3.根据A所述的宿主细胞，包含一至十个随机整合的外源核酸SOI。
A4.根据权利要求A所述的宿主细胞，其中靶向基因座与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源。
A4.1.根据A4所述的宿主细胞，其中靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的序列。
A4.2.根据A4所述的宿主细胞，其中靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的序列。
A4.3.根据A4所述的宿主细胞，其中靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的序列。
A4.4.根据A4所述的宿主细胞，其中靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的序列。
A4.5.根据A4所述的宿主细胞，其中靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的序列。
A4.6.根据A4所述的宿主细胞，其中靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的序列。
A4.7.根据A4所述的宿主细胞，其中靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的序列。
A5.根据A-A4中任一项所述的宿主细胞，其中宿主细胞包含：至少一个第一靶向整合的外源核酸SOI，其整合在宿主细胞的基因组的靶向基因座内；以及至少一个第二靶向整合的外源核酸SOI，其编码整合在宿主细胞的基因组的一个或多个第二基因座内的第二目的多肽SOI。
A6.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与以下序列的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7。
A6.1.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A6.2.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A6.3.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A6.4.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A6.5.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A6.6.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A7.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与以下序列的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7。
A7.1.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A7.2.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A7.3.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A7.4.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A7.5.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A7.6.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A8.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与以下序列的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7。
A8.1.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A8.2.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A8.3.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A8.4.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A8.5.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A8.6.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A9.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与以下序列的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7。
A9.1.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A9.2.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A9.3.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A9.4.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A9.5.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A9.6.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A10.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与以下序列的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列：SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7。
A10.1.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A10.2.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A10.3.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A10.4.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A10.5.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A10.6.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A11.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与以下序列的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列：SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7。
A11.1.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A11.2.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A11.3.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A11.4.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A11.5.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A11.6.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A12.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与以下序列的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列：SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6。
A12.1.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A12.2.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A12.3.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A12.4.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A12.5.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A12.6.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
A13.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为LOC107977062基因内的整合位点，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为选自下组的基因内的整合位点：LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2以及与其至少约90％同源的序列。
A14.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为LOC100768845基因内的整合位点，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为选自下组的基因内的整合位点：LOC107977062、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2以及与其至少约90％同源的序列。
A15.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为ITPR2基因内的整合位点，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为选自下组的基因内的整合位点：LOC107977062、LOC100768845、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2以及与其至少约90％同源的序列。
A16.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为ERE67000.1基因内的整合位点，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为选自下组的基因内的整合位点：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2以及与其至少约90％同源的序列。
A17.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为UBAP2基因内的整合位点，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为选自下组的基因内的整合位点：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、MTMR2、XP_003512331.2以及与其至少约90％同源的序列。
A18.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为MTMR2基因内的整合位点，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为选自下组的基因内的整合位点：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、XP_003512331.2以及与其至少约90％同源的序列。
A19.根据A5所述的宿主细胞，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为XP_003512331.2基因内的整合位点，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为选自下组的基因内的整合位点：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2以及与其至少约90％同源的序列。
A20.根据A-A19中任一项所述的宿主细胞，其中目的多肽选自由以下项组成的组：单链抗体、抗体轻链、抗体重链、单链Fv片段(scFv)和Fc融合蛋白。
A21.根据A-A19中任一项所述的宿主细胞，其中宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。
A22.根据A21所述的宿主细胞，其中宿主细胞为仓鼠宿主细胞、人宿主细胞、大鼠宿主细胞或小鼠宿主细胞。
A23.根据A22所述的宿主细胞，其中宿主细胞为CHO宿主细胞、CHO K1宿主细胞、CHO K1SV宿主细胞、DG44宿主细胞、DUKXB-11宿主细胞、CHOK1S宿主细胞或CHO K1M宿主细胞。
A24.根据A-A20中任一项所述的宿主细胞，其中SOI与选择标志物的所述靶向整合由外源核酸酶促进。
A25.根据A24所述的宿主细胞，其中外源核酸酶选自由以下项组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚体、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、TAL效应物结构域融合蛋白、RNA引导的DNA核酸内切酶、经工程化改造的大范围核酸酶和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)核酸内切酶。
B.一种表达目的多肽的方法，该方法包括：a)提供宿主细胞，该宿主细胞包含整合在宿主细胞的基因组的靶向基因座处的外源核苷酸序列，其中该外源核苷酸序列包含侧接第一选择标志物的两个RRS；b)向(a)中提供的细胞中引入核酸，该核酸包含两个RRS，这两个RRS与整合的外源核苷酸序列的两个RRS相匹配并且侧接编码第一目的多肽的第一外源SOI和第二选择标志物；c)引入重组酶或编码重组酶的核酸，其中该重组酶识别RRS；d)选择表达第二选择标志物的细胞；e)通过随机整合，将编码第二目的多肽的第二外源SOI和第三选择标志物引入宿主细胞的基因组中；f)其中整合在宿主细胞的基因组的靶向基因座处的外源核苷酸序列组成型或诱导型表达，并且第二外源SOI组成型或诱导型表达；g)选择表达第三选择标志物的细胞；以及h)在足以表达第一目的多肽和第二目的多肽的条件下培养宿主细胞。
B1.根据B所述的方法，进一步包括从宿主细胞培养物中回收第一目的多肽和第二目的多肽。
B2.根据B所述的方法，其中第一目的多肽和第二目的多肽相同。
B3.根据B所述的方法，其中靶向基因座与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源。
B3.1.根据B3所述的方法，其中靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的序列。
B3.2.根据B3所述的方法，其中靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的序列。
B3.3.根据B3所述的方法，其中靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的序列。
B3.4.根据B3所述的方法，其中靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的序列。
B3.5.根据B3所述的方法，其中靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的序列。
B3.6.根据B3所述的方法，其中靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的序列。
B3.7.根据B3所述的方法，其中靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的序列。
B4.根据B-B3中任一项所述的宿主细胞，其中宿主细胞包含：至少一个第一靶向整合的外源核酸SOI，其整合在宿主细胞的基因组的靶向基因座内；以及至少一个第二靶向整合的外源核酸SOI，其编码整合在宿主细胞的基因组的一个或多个第二基因座内的第二目的多肽SOI。
B5.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与以下序列的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7。
B5.1.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B5.2.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B5.3.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B5.4.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B5.5.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B5.6.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B6.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与以下序列的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7。
B6.1.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B6.2.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B6.3.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。K7.4.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQID NO.5的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B6.5.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B6.6.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B7.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与以下序列的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7。
B7.1.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B7.2.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B7.3.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B7.4.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B7.5.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B7.6.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B8.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与以下序列的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7。
B8.1.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B8.2.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B8.3.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B8.4.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B8.5.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B8.6.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B9.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与以下序列的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7。
B9.1.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B9.2.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B9.3.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B9.4.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B9.5.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B9.6.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B10.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与以下序列的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7。
B10.1.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B10.2.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B10.3.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B10.4.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B10.5.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B10.6.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B11.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与以下序列的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6。
B11.1.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.1的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B11.2.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.2的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B11.3.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.3的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B11.4.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.4的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B11.5.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.5的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B11.6.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.7的全部或一部分至少90％同源的序列，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座包含与SEQ ID NO.6的全部或一部分至少90％同源的至少一个序列。
B12.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为LOC107977062基因内的整合位点，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为选自下组的基因内的整合位点：LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2以及与其至少约90％同源的序列。
B13.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为LOC100768845基因内的整合位点，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为选自下组的基因内的整合位点：LOC107977062、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2以及与其至少约90％同源的序列。
B14.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为ITPR2基因内的整合位点，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为选自下组的基因内的整合位点：LOC107977062、LOC100768845、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2以及与其至少约90％同源的序列。
B15.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为ERE67000.1基因内的整合位点，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为选自下组的基因内的整合位点：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2以及与其至少约90％同源的序列。
B16.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为UBAP2基因内的整合位点，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为选自下组的基因内的整合位点：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、MTMR2、XP_003512331.2以及与其至少约90％同源的序列。
B17.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为MTMR2基因内的整合位点，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为选自下组的基因内的整合位点：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、XP_003512331.2以及与其至少约90％同源的序列。
B18.根据B4所述的方法，其中第一靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为XP_003512331.2基因内的整合位点，并且第二靶向整合的外源核酸SOI的靶向基因座为选自下组的基因内的整合位点：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2以及与其至少约90％同源的序列。
B19.根据权利要求B-B18中任一项所述的方法，其中第一目的多肽和第二目的多肽选自由以下项组成的组：单链抗体、抗体轻链、抗体重链、单链Fv片段(scFv)和Fc融合蛋白。
B20.根据B-B19中任一项所述的方法，其中宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。
B21.根据L20所述的方法，其中宿主细胞为仓鼠宿主细胞、人宿主细胞、大鼠宿主细胞或小鼠宿主细胞。
B22.根据L21所述的方法，其中宿主细胞为CHO宿主细胞、CHO K1宿主细胞、CHOK1SV宿主细胞、DG44宿主细胞、DUKXB-11宿主细胞、CHOK1S宿主细胞或CHO K1M宿主细胞。
B23.根据B-B22中任一项所述的方法，其中SOI中的任一者的靶向整合由外源核酸酶促进。
B24.根据B23所述的方法，其中所述外源核酸酶选自由以下项组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚体、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、TAL效应物结构域融合蛋白、RNA引导的DNA核酸内切酶、经工程化改造的大范围核酸酶和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)核酸内切酶。
B25.根据B-B24中任一项所述的方法，其中SOI的表达由可调型启动子控制。
B26.根据B25所述的方法，其中可调型启动子选自由SV40和CMV启动子组成的组。
实例
以下实例仅是对当前公开的主题的说明，不应以任何方式视为限制。
材料和方法
mAb X超转染载体构建：通过将mAb X的重链和轻链基因在巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下克隆到指导GS表达的选择的专有的基因泰克抗体表达载体中，产生组成型抗体表达构建体。通过修饰上述构建体以用CMV四环素-操作子(CMV-TO)启动子替换巨细胞病毒(CMV)启动子来产生载体构建体。此外，还将猴病毒40(SV40)启动子下的TetR构建体克隆到载体骨架中以产生载体构建体。随后将mAb X的重链和轻链基因克隆到CMV-TO启动子的3'端，以产生诱导型抗体表达载体(图1A)。
细胞培养：分泌重组单克隆抗体mAb-X的细胞系来源于使用嘌呤霉素选择标志物的TI CHO-K1宿主。稳定的组成型和稳定的诱导型mAb-X TI细胞系均在专有的基于DMEM/F12的无血清培养基中培养，该培养基包含嘌呤霉素(Puro)作为选择剂。所有培养物均在37℃和5％CO2下孵育，并以150rpm摇动。每2-4天以4x105个细胞/mL的接种密度对细胞进行传代。mAb-X的这些稳定的组成型和稳定的诱导型细胞系在下文中将被称为亲本细胞系。
稳定池和微型池超转染生成：将MaxCyte STX转染系统用于转染过程。对于稳定的超转染池生成，用Maxcyte转染亲代宿主，并将细胞分到两个烧瓶中，并在使用甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)选择培养基的悬浮培养中选择2-3周。对于稳定的超转染微型池生成，转染亲本宿主并将细胞以每孔1250个细胞铺板在384孔板中，并在MSX选择培养基中选择2-3周。挑选具有大于25％汇合度的微型池并扩大到96孔板。
池和微型池筛选
通过进行分批进料生产测定来筛选回收的池，以选择最佳池来进行单细胞克隆(SCC)。通过收集微型池的上清液评估滴度并提交用于HTRF(均相时间分辨荧光)测定来筛选微型池。将微型池按滴度排序，并选择顶级微型池。下面描述了用于三种超转染方法的每个微型池筛选过程：
组成型->组成型
通过HTRF筛选了1056个微型池，并缩小到顶级的48个微型池。微型池#1-24组合以产生池1，并且微型池#25-48组合以产生池2。然后在分批进料生产试验中进一步评估池1和池2。
诱导型->组成型
没有产生微型池，在超转染和MSX选择后只产生了两个池。将回收的池进一步培养用于分批进料生产试验。
组成型->诱导型
通过HTRF筛选了176个微型池，并缩小到顶级的4个微型池。在分批进料生产试验中评估了所有4个微型池。
单细胞克隆
通过将池以1个细胞/孔铺板到384孔板中对池进行单细胞克隆(SCC)，该板填充有具有专有内部补充物的基于DMEM/F12的选择性培养基。3周后，分析每个条件的克隆回收率。具有超过25％汇合度的克隆表征为回收的克隆。将克隆挑选到96孔板中，并通过基于滴度的克隆的多轮筛选进行筛选，最终缩小到顶级8个单细胞克隆。组成型->组成型和诱导型->组成型超转染方法都筛选了352个单细胞克隆并缩小到顶级8个克隆。对于组成型->诱导型超转染方法，未进行SCC。
分批进料生产试验：
在为期14天的生产试验中，评估了诸如生长、活力和滴度的参数。在生产的第0天，将细胞以3x106个细胞/mL接种在专有的无血清生产培养基中，然后在第3天将温度转变为35℃。在第3、7和10天，向培养物中添加具有或不具有多西环素的专有的进料。收集并分析收获的细胞培养液(HCCF)。第14天的滴度使用具有UV检测的蛋白A亲和色谱确定。使用Vi-CELL XR自动细胞活力分析仪(Beckman Coulter)监测活力百分比和活细胞计数。
通过数字微滴PCR的基因拷贝数
使用ddPCRTM Supermix探针(无dUTP)试剂盒(Bio-Rad)进行数字液滴PCR测定。每个ddPCR反应包含ddPCR预混液、900nM正向引物、900nM反向引物、250μM探针、3个单位的HaeIII限制性内切酶和样品DNA。在室温下孵育10min后，使用自动微滴发生器(Bio-Rad)生成微滴。PCR热循环条件为：在95℃保持10min，然后在94℃保持30秒并在60℃保持1min并且循环40次，然后在98℃保持10min以使酶失活。PCR反应后，在QX200TM微滴分析仪(Bio-Rad)上读取微滴。使用Quantasoft软件采集并且分析数据。基于作为参比基因的Bax和白蛋白的确定的拷贝数，对HC和LC基因拷贝数进行归一化。本研究中使用的引物是使用PrimerExpress软件v3.0(Life Technologies)设计的。引物序列列于下表中：
本研究中使用的引物是使用Primer Express软件v3.0(Life Technologies)设计的。引物序列列于下表中。
引物 序列
重链
正向引物 TCA AGG ACT ACT TCC CCG AAC C
反向引物 TAG AGT CCT GAG GAC TGT AGG ACA GC
探针 VIC-ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GC-TAMRA
轻链
正向引物 GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC T
反向引物 GCA CAC AAC AGA AGC AGT TCC A
探针 VIC-CCC GCC ATC TGA TGA GCA GTT GAA-TAMRA
Bax
正向引物 ACA CTG GAC TTC CTC CGA GA
反向引物 GCA TTA GGA AGT TTG AGA ACC A
探针 FAM-CCC AGC CAC CCT GGT CTT GG-TAMRA
白蛋白
正向引物 TTC GTG ACA GCT ATG GTG AAC TG
反向引物 GGT CAT CCT TGT GTT TCA GGA AA
探针 FAM-CTG TGC AAA ACA AGA ACC CGA AAG AAA CC-TAMRA
定量实时PCR
使用RNeasy Mini Kit根据制造商的方案(Cat#74104，Qiagen，USA)分离从细胞中提取的总RNA，并用DNA酶(Cat#79254，无RNA酶DNA酶试剂盒，Qiagen，USA)处理以去除任何残留的DNA。使用通用qRT-PCR预混液根据制造商的说明(Cat#4392938，Thermo FisherScientific，Vilnius，Lithuania)进行qRT-PCR，并将抗体重链和轻链的mRNA水平相对于管家基因白蛋白的mRNA水平进行归一化。
用于RT-PCR的引物和探针序列如下：
HC-2正向引物：TCAAGGACTACTTCCCCGAACC。
HC-2反向引物：TAGAGTCCTGAGGACTGTAGGACAGC。
HC探针：FAM-ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGC-TAMRA。
LC-2正向引物：TGACGCTGAGCAAAGCAGAC。
LC-2反向引物：CAGGCCCTGATGGGTGAC。
LC探针：FAM-ACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGA-TAMRA。
白蛋白正向引物：TTC GTG ACA GCT ATG GTG AAC TG。
白蛋白反向引物：GGT CAT CCT TGT GTT TCA GGA AA.
白蛋白探针FAM-CTG TGC AAA ACA AGA ACC CGA AAG AAA CC-TAMRA。
实施例1：超转染表达构建体的概述
两种表达构建体用于mAb X的超转染。组成型载体用于产生mAb X的稳定的组成型随机整合细胞系，诱导型载体用于产生mAb X的稳定的诱导型随机整合细胞系(图1A)。使用了三种不同版本的超转染方法。版本1(组成型
Figure GDA0004161491990000941
组成型)使用组成型mAb X载体对组成型表达mAb X的宿主进行超转染。版本2(诱导型
Figure GDA0004161491990000942
组成型)使用诱导型mAb X载体对组成型表达mAb X的宿主进行超转染。版本3(组成型
Figure GDA0004161491990000943
诱导型)使用组成型mAb X载体对诱导型表达mAbX的宿主进行超转染(图1B)。
实例2：组成型→组成型超转染
在组成型
Figure GDA0004161491990000945
组成型超转染方法中进行如材料和方法部分所述的从转染到稳定池生产的筛选步骤，以鉴定顶级微型池(图2A)。评估了从HTRF滴度筛选中鉴定的顶级48个组成型
Figure GDA0004161491990000946
组成型微型池的微型池生产率。然后将微型池组合成两个池并在生产试验中进行评估。微型池1-24组合成池1，并且微型池25-48组合成池2(图2B)。将组合的超转染组成型
Figure GDA0004161491990000951
组成型微型池(池-1和池-2)与非超转染的亲本宿主进行比较(图2C)。
使用如材料和方法部分所述的单细胞克隆和筛选步骤来鉴定mAb X的顶级稳定组成型
Figure GDA0004161491990000952
组成型单细胞克隆(图3A)。评估了顶级8个组成型
Figure GDA0004161491990000953
组成型超转染mAb X克隆和非超转染亲本宿主的第14天滴度(图3B)、第14天比生产率(Qp)(图3C)和第14天生长(由活细胞浓度积分表示，IVCC)(图3D)。评估了顶级8个组成型
Figure GDA0004161491990000954
组成型超转染克隆和亲本宿主的重链和轻链DNA拷贝数(图3E)以及顶级8个组成型
Figure GDA0004161491990000955
组成型超转染克隆和亲本宿主的重链和轻链mRNA水平(图3F)。
实例3：诱导型→组成型超转染
如材料和方法部分中所述通过超转染和利用MSX的选择产生了两个诱导型
Figure GDA0004161491990000956
组成型稳定池(图4A)。评估了超转染的诱导型
Figure GDA0004161491990000957
组成型池与非超转染亲本宿主相比的池滴度。对两个超转染池的未诱导(无Dox)和诱导(加Dox)的生产滴度进行了评估(图4B)。这些池随后用于单细胞克隆。
如材料和方法部分中所述鉴定了mAb X的顶级8个稳定的诱导型
Figure GDA0004161491990000958
组成型单细胞克隆(图5A)。评估了诱导(加Dox)和未诱导(无Dox)条件下顶级8个克隆的筛选滴度(通过HTRF)(图5A)。在诱导条件下，与未诱导条件相比，克隆具有更高的滴度。评估了诱导(加Dox)和未诱导(无Dox)条件下顶级8个诱导型
Figure GDA0004161491990000959
组成型超转染mAb X克隆以及非超转染的亲本宿主的第14天滴度(图5C)、第14天Qp(图5D)和第14天IVCC(图5E)。评估了顶级8个诱导型
Figure GDA00041614919900009510
组成型超转染克隆和亲本宿主的重链和轻链DNA拷贝数(图5F)。转录阻遏物表达的逐渐减少可能导致在一些克隆中诱导后滴度仅适度增加。然而，我们相信转录阻遏物表达的逐渐减少使得与亲本细胞系相比具有显著更高的组成型滴度的超转染细胞系得以分离，因为这些细胞系可以逐渐适应超转染后触发的更高表达需求。
实例4：组成型
Figure GDA00041614919900009511
诱导型超转染
进行如材料和方法部分所述的筛选步骤以鉴定顶级组成型→诱导型微型池(图6A)。评估了诱导(加Dox)和非诱导(无Dox)条件下顶级4个微型池的筛选滴度(通过HTRF)(图6B)。与未诱导条件相比，诱导条件下的滴度显著更高。评估了诱导(加Dox)和未诱导(无Dox)条件下顶级4个组成型→诱导型超转染mAb X微型池以及非超转染的亲本宿主的第14天滴度(图6C)、第14天Qp(图6D)和第14天IVCC(图6E)。评估了顶级4个组成型→诱导型超转染微型池(诱导)和亲本宿主的重链和轻链mRNA水平(图6F)。
除了所描绘和要求保护的各种实施例之外，所公开的主题还涉及具有本文所公开和要求保护的特征的其他组合的其他实施例。这样，本文所呈现的特定特征可以在所公开的主题的范围内以其他方式彼此组合，使得所公开的主题包括本文所公开的特征的任何合适的组合。出于图示和描述的目的，已经呈现了所公开主题的具体实施例的前文描述。其并不旨在穷举或将所公开的主题限制为所公开的那些实施例。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离所公开主题的精神或范围的情况下，可以对所公开主题的组成和方法进行各种修改和变化。因此，其意图为，所公开的主题包括在所附权利要求及其等同内容的范围内的修改和变化。
本文引用了各种出版物、专利和专利申请，其内容通过引用整体合并于本文。

Claims (40)

1.一种能够表达目的多肽的宿主细胞，其包含：
a)侧接有两个重组识别序列(RRS)的编码第一目的多肽的靶向整合的外源核酸目的序列(SOI)和第一选择标志物，其中靶向整合的外源SOI整合在所述宿主细胞的基因组的靶向基因座内；
b)编码第二目的多肽的随机整合的外源核酸SOI和第二选择标志物，其中随机整合的SOI至少一次整合在所述宿主细胞的基因组中；并且
c)其中所述靶向整合的外源核酸SOI组成型或诱导型表达，并且所述随机整合的外源核酸SOI组成型或诱导型表达。
2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述第一目的多肽和所述第二目的多肽相同。
3.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述第一选择标志物和所述第二选择标志物相同。
4.根据权利要求1所述的宿主细胞，其包含一至十个随机整合的外源核酸SOI。
5.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述靶向基因座与重叠群NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQID NO.1至SEQ ID NO.7的序列至少约90％同源。
6.根据权利要求1所述的宿主细胞，其进一步包含整合在所述宿主细胞的基因组的靶向基因座内的编码第二目的多肽的第二靶向整合的外源核酸SOI和第二选择标志物，其中所述第一靶向整合的外源核酸SOI和所述第一选择标志物侧接有第一RRS和第三RRS，并且第二靶向外源SOI和所述第二选择标志物侧接有第二RRS和所述第三RRS。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的宿主细胞，其中所述目的多肽选自由以下项组成的组：单链抗体、抗体轻链、抗体重链、单链Fv片段(scFv)和Fc融合蛋白。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为仓鼠宿主细胞、人宿主细胞、大鼠宿主细胞或小鼠宿主细胞。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为CHO宿主细胞、CHO K1宿主细胞、CHO K1SV宿主细胞、DG44宿主细胞、DUKXB-11宿主细胞、CHOK1S宿主细胞或CHO K1M宿主细胞。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的宿主细胞，其中所述SOI与选择标志物的所述靶向整合由外源核酸酶促进。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中所述外源核酸酶选自由以下项组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚体、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、TAL效应物结构域融合蛋白、RNA引导的DNA核酸内切酶、经工程化改造的大范围核酸酶和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)核酸内切酶。
13.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述靶向整合的外源核酸SOI组成型表达。
14.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述靶向整合的外源核酸SOI诱导型表达。
15.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述随机整合的外源核酸SOI组成型表达。
16.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述随机整合的外源核酸SOI诱导型表达。
17.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述靶向整合的外源核酸SOI诱导型表达，并且所述随机整合的外源核酸SOI组成型表达。
18.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述靶向整合的外源核酸SOI诱导型表达，并且所述随机整合的外源核酸SOI诱导型表达。
19.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述靶向整合的外源核酸SOI组成型表达，并且所述随机整合的外源核酸SOI组成型表达。
20.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中靶向整合的外源核酸SOI组成型表达，并且所述随机整合的外源核酸SOI诱导型表达。
21.一种表达目的多肽的方法，其包括：
a)提供宿主细胞，所述宿主细胞包含整合在所述宿主细胞的基因组的靶向基因座处的外源核苷酸序列，其中所述外源核苷酸序列包含侧接第一选择标志物的两个RRS；
b)向(a)中提供的所述细胞中引入核酸，所述核酸包含两个RRS，所述两个RRS与整合的外源核苷酸序列的所述两个RRS相匹配并且侧接编码第一目的多肽的第一外源SOI和第二选择标志物；
c)引入重组酶或编码重组酶的核酸，其中所述重组酶识别所述RRS；
d)选择表达所述第二选择标志物的细胞；
e)通过随机整合，将编码第二目的多肽的第二外源SOI和第三选择标志物引入所述宿主细胞的基因组中；
f)其中整合在所述宿主细胞的基因组的靶向基因座处的所述外源核苷酸序列组成型或诱导型表达，并且所述第二外源SOI组成型或诱导型表达；
g)选择表达所述第三选择标志物的细胞；以及
h)在足以表达所述第一目的多肽和所述第二目的多肽的条件下培养所述宿主细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括从宿主细胞培养物中回收所述第一目的多肽和所述第二目的多肽。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一目的多肽和所述第二目的多肽相同。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述靶向基因座与重叠群
NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1和
NW_003615411.1之一的重叠群序列的一部分的序列或与选自SEQID NO.1至SEQ IDNO.7的序列至少约90％同源。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述第一目的多肽和所述第二目的多肽选自由以下项组成的组：单链抗体、抗体轻链、抗体重链、单链Fv片段(scFv)和Fc融合蛋白。
26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述宿主细胞为仓鼠宿主细胞、人宿主细胞、大鼠宿主细胞或小鼠宿主细胞。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述宿主细胞为CHO宿主细胞、CHO K1宿主细胞、CHO K1SV宿主细胞、DG44宿主细胞、DUKXB-11宿主细胞、CHOK1S宿主细胞或CHO K1M宿主细胞。
29.根据权利要求21至28中任一项所述的方法，其中所述SOI中的任一者的所述靶向整合由外源核酸酶促进。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述外源核酸酶选自由以下项组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚体、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、TAL效应物结构域融合蛋白、RNA引导的DNA核酸内切酶、经工程化改造的大范围核酸酶和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)核酸内切酶。
31.根据权利要求21至30中任一项所述的方法，其中所述SOI的表达由可调型启动子控制。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述可调型启动子选自由SV40和CMV启动子组成的组。
33.根据权利要求21所述的方法，其中整合在所述宿主细胞的基因组的靶向基因座处的所述外源核苷酸序列组成型表达。
34.根据权利要求21所述的方法，其中整合在所述宿主细胞的基因组的靶向基因座处的所述外源核苷酸序列诱导型表达。
35.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二外源SOI组成型表达。
36.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二外源SOI诱导型表达。
37.根据权利要求21所述的方法，其中整合在所述宿主细胞的基因组的靶向基因座处的所述外源核苷酸序列诱导型表达，并且所述第二外源SOI组成型表达。
38.根据权利要求21所述的方法，其中整合在所述宿主细胞的基因组的靶向基因座处的所述外源核苷酸序列诱导型表达，并且所述第二外源SOI诱导型表达。
39.根据权利要求21所述的方法，其中整合在所述宿主细胞的基因组的靶向基因座处的所述外源核苷酸序列组成型表达，并且所述第二外源SOI组成型表达。
40.根据权利要求21所述的方法，其中整合在所述宿主细胞的基因组的靶向基因座处的外源核苷酸序列组成型表达，并且所述第二外源SOI诱导型表达。
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