BR112020012591A2

BR112020012591A2 - células hospedeiras de integração direcionada (ti), células hospedeiras ti, métodos para preparar uma célula hospedeira ti, métodos para expressar um polipeptídeo de interesse e vetores

Info

Publication number: BR112020012591A2
Application number: BR112020012591-1A
Authority: BR
Inventors: Chi Kin Domingos Ng; Yongping Guo Crawford; Amy Shen; Meixia Zhou; Bradley R. Snedecor; Shanhram Misaghi; Albert Eric Gao
Original assignee: Genentech, Inc.
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2020-11-24
Also published as: EP3728309A2; KR20200103765A; IL275462A; WO2019126634A3; JP2022070949A; US20210002669A1; CA3083579A1; SG11202005109SA; JP2021507697A; CN111886244A; AU2018392728A1; MX2020006117A; TW201932600A; WO2019126634A2

Abstract

O objeto aqui divulgado refere-se a células hospedeiras de integração direcionada (TI) adequadas para a expressão de proteínas recombinantes, bem como a métodos de produção e utilização das referidas células hospedeiras TI.

Description

“CÉLULAS HOSPEDEIRAS DE INTEGRAÇÃO DIRECIONADA (TI), CÉLULAS HOSPEDEIRAS TI, MÉTODOS PARA PREPARAR UMA CÉLULA HOSPEDEIRA TI, MÉTODOS PARA EXPRESSAR UM POLIPEPTÍDEO DE INTERESSE E VETORES” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S.

Nº 62/609.806, depositado em 22 de dezembro de 2017, e Pedido Provisório U.S. Nº 62/711.272, depositado em 27 de julho de 2018, cujas divulgações são, cada uma, incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.

CAMPO DA TÉCNICA

[002] O objeto aqui divulgado refere-se a células hospedeiras de integração direcionada (TI) adequadas para a expressão de proteínas recombinantes, bem como a métodos de produção e utilização das referidas células hospedeiras TI.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[003] O presente relatório descritivo faz referência a uma Listagem de Sequência (enviada por via eletrônica como um arquivo .txt chamado “00B2060779SEQ.txt” em 21 de dezembro de 2018). O arquivo 00B2060779SEQ.txt foi gerado em 20 de dezembro de 2018 e possui 1.251.240 bytes de tamanho. A totalidade do conteúdo da Listagem de Sequência está incorporada neste documento por referência.

FUNDAMENTOS

[004] Devido ao rápido avanço na biologia e imunologia celular, tem havido uma demanda crescente para desenvolver novas proteínas recombinantes terapêuticas para uma variedade de doenças, incluindo câncer, doenças cardiovasculares e doenças metabólicas. Esses candidatos biofarmacêuticos são comumente fabricados por linhas celulares comerciais capazes de expressar as proteínas de interesse. Por exemplo, as células do ovário de hamster chinês (CHO) foram amplamente adaptadas para produzir anticorpos monoclonais.

[005] A estratégia convencional para o desenvolvimento de uma linhagem celular comercial envolve a integração aleatória de uma sequência nucleotídica que codifica o polipeptídeo de interesse seguida pela seleção e isolamento de linhagens celulares que produzem o polipeptídeo de interesse.

Essa abordagem, no entanto, tem várias desvantagens. Primeiro, essa integração não é apenas um evento raro, mas, dada a aleatoriedade de onde a sequência nucleotídica se integra, esses eventos raros podem resultar em uma variedade de fenótipos de expressão gênica e crescimento celular. Essa variação, conhecida como "variação do efeito de posição", se origina, pelo menos em parte, das redes reguladoras de genes complexas presentes nos genomas das células eucarióticas e na acessibilidade de certos loci genômicos para integração e expressão gênica. Segundo, as estratégias de integração aleatória geralmente não oferecem controle sobre o número de cópias de genes integradas ao genoma da célula hospedeira. De fato, os métodos de amplificação de genes são frequentemente usados para obter células de alta produção. Essa amplificação genética, no entanto, pode levar a fenótipos celulares indesejados, como crescimento celular instável e/ou expressão do produto. Terceiro, devido à heterogeneidade dos loci de integração inerentes ao processo de integração aleatória, é demorado e trabalhoso peneirar milhares de clones após a transfecção para isolar linhagens celulares, demonstrando um nível desejável de expressão dos polipeptídeos de interesse. Mesmo após o isolamento dessas linhagens celulares, a expressão estável do polipeptídeo de interesse não é garantida e pode ser necessária triagem adicional para obter uma linhagem celular comercial estável. Finalmente, os polipeptídeos produzidos a partir de linhagens celulares integradas aleatoriamente exibem um alto grau de variação de sequência, o que pode ser, em parte, devido à mutagenicidade dos agentes seletivos usados para selecionar um alto nível de expressão de polipeptídeos de interesse.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] O objeto aqui divulgado refere-se a células hospedeiras de integração direcionada (TI) adequadas para a expressão de proteínas recombinantes. O objeto aqui divulgado não apenas fornece sítios de célula hospedeira TI que têm alta produtividade, ele fornece também um novo método de introdução de várias sequências de interesse em um único locus de TI em uma célula hospedeira por troca de cassete mediada por recombinase (RMCE).

As vantagens do método de RMCE incluem aumento da produtividade e flexibilidade para coexpressar vários polipeptídeos em razões variáveis do mesmo locus de TI. Por exemplo, mas não a título de limitação, as estratégias de RMCE divulgadas neste documento permitem a inserção de uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais sequências (por exemplo, cadeia pesada de anticorpo (HC) ou cadeia leve (LC)) para o locus de TI. Com a capacidade de direcionar oito ou mais sequências simultaneamente, a RMCE de dois plasmídeos permite a modulação das razões de cadeias HC e LC de mAb para melhorar a produtividade, expressão de moléculas complexas com várias cadeias e direcionamento de transgenes, genes endógenos ou RNAi com o anticorpo para modificar as vias celulares.

[007] Em certas modalidades, uma célula hospedeira de TI compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um locus de integração dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs: 1- 7. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica imediatamente a 5' da sequência nucleotídica exógena integrada é selecionada do grupo que consiste em sequências pelo menos cerca de 90% homólogas aos nucleotídeos 41190-45269 de NW_006874047.1, nucleotídeos 63590-207911 de

NW_006884592.1, nucleotídeos 253831-491909 de NW_006881296.1, nucleotídeos 69303-79768 de NW_003616412.1, nucleotídeos 293481-315265 de NW_003615063.1, nucleotídeos 2650443-2662054 de NW_006882936.1 e nucleotídeos 82214-97705 de NW_003615411.1. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica imediatamente 3' da sequência nucleotídica exógena integrada é selecionada do grupo que consiste em sequências pelo menos cerca de 90% homólogas aos nucleotídeos 45270-45490 de NW_006874047.1, nucleotídeos 207912-792374 de NW_006884592.1, nucleotídeos 491910- 667813 de NW_006881296.1, nucleotídeos 79769-100059 de NW_003616412.1, nucleotídeos 315266-362442 de NW_003615063.1, nucleotídeos 2662055-2701768 de NW_006882936.1 ou nucleotídeos 97706- 105117 de NW_003615411.1. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada está operacionalmente ligada a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs: 1-7.

[008] Em certas modalidades, uma célula hospedeira TI compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um locus de integração dentro de um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062 (SEQ ID NO: 1), LOC100768845 (SEQ ID NO: 2), ITPR2 (SEQ ID NO: 3), ERE67000.1 (SEQ ID NO: 4), UBAP2 (SEQ ID NO: 5), MTMR2 (SEQ ID NO: 6), XP_003512331.2 (SEQ ID NO: 7) e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um locus de integração operacionalmente ligado a um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062 (SEQ ID NO.

1), LOC100768845 (SEQ ID NO. 2), ITPR2 (SEQ ID NO. 3), ERE67000.1 (SEQ ID NO. 4), UBAP2 (SEQ ID NO. 5), MTMR2 (SEQ ID NO. 6), XP_003512331.2 (SEQ ID NO. 7) e sequências pelo menos cerca 90% homólogas a ele. Em certas modalidades, o nucleotídeo exógeno integrado está operacionalmente ligado a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs: 1-7. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio de integração imediatamente adjacente a toda ou parte de uma sequência selecionada do grupo que consiste em sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs: 1-7.

[009] Em certas modalidades, uma célula hospedeira TI é uma célula hospedeira de mamífero. Em certas modalidades, uma célula hospedeira TI é uma célula hospedeira de hamster, uma célula hospedeira humana, uma célula hospedeira de rato ou uma célula hospedeira de camundongo. Em certas modalidades, uma célula hospedeira TI é uma célula hospedeira de ovário de hamster chinês (CHO), uma célula hospedeira CHO K1, uma célula hospedeira CHO K1SV, uma célula hospedeira DG44, uma célula hospedeira DUKXB-11, uma célula hospedeira CHOK1S ou uma Célula hospedeira CHO K1M.

[0010] Em certas modalidades, uma célula hospedeira TI compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma ou mais sequência de reconhecimento de recombinação (RRS). Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena compreende pelo menos duas RRSs. A RRS pode ser reconhecida por uma recombinase, por exemplo, uma recombinase Cre, uma recombinase FLP, uma integrase Bxb1 ou uma integrase φC31. A RRS pode ser selecionada do grupo que consiste em uma sequência LoxP, uma sequência LoxP L3, uma sequência LoxP 2L, uma sequência LoxFas, uma sequência Lox511, uma sequência Lox2272, uma sequência Lox2372, uma sequência Lox5171, uma sequência Loxm2, uma sequência Lox71, uma sequência Lox66, uma sequência FRT, uma sequência Bxb1 attP, uma sequência Bxb1 attB, uma sequência φC31 attP e uma sequência φC31 attB.

[0011] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira e uma segunda RRS, e pelo menos um marcador de seleção localizado entre a primeira e a segunda RRS.

Em certas modalidades,

a sequência nucleotídica exógena compreende adicionalmente uma terceira

RRS, em que a terceira RRS está localizada entre a primeira e a segunda RRS,

e a terceira RRS é diferente da primeira ou da segunda RRS.

Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira e uma segunda RRS, e pelo menos um primeiro marcador de seleção localizado entre a primeira e a segunda RRS.

Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena compreende adicionalmente um segundo marcador de seleção, e o primeiro e o segundo marcadores de seleção são diferentes.

Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena pode compreender adicionalmente um terceiro marcador de seleção e um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES), em que o IRES está operacionalmente ligado ao terceiro marcador de seleção.

O terceiro marcador de seleção pode ser diferente do primeiro ou do segundo marcador de seleção.

Os marcadores de seleção podem ser selecionados do grupo que consiste em uma fosfotransferase de aminoglicosídeo (APH) (por exemplo, fosfotransferase de higromicina (HYG),

neomicina e G418 APH), diidrofolato redutase (DHFR), timidina quinase (TK),

glutamina sintetase (GS), asparagina sintetase, triptofano sintetase (indol),

histidinol desidrogenase (histidinol D) e genes que codificam resistência à puromicina, blasticidina, bleomicina, fleomicina, cloranfenicol, zeocina e ácido micofenólico.

O marcador de seleção pode também ser selecionado do grupo que consiste em um marcador de proteína verde fluorescente (GFP), um marcador de GFP melhorada (eGFP), um marcador de GFP sintética, uma proteína fluorescente amarela (YFP), um marcador de YFP melhorada (eYFP),

um marcador de proteína fluorescente azul (CFP), um marcador mPlum, um marcador mCherry, um marcador tdTomato, um marcador mStrawberry, um marcador J-red, um marcador de monômero DsRed, um marcador mOrange, um marcador mKO, um marcador mCitrine, um marcador Venus, um marcador YPet, um marcador Emerald6, um marcador CyPet, um marcador mCFPm, um marcador Cerulean e um marcador T-Sapphire. Em algumas modalidades, o marcador de seleção é selecionado do grupo que consiste em um marcador de proteína fluorescente verde (GFP), um marcador de GFP aprimorado (eGFP), um marcador de GFP sintético.

[0012] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena compreende pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma sequência exógena de interesse (SOI). Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira e uma segunda RRS, e pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena localizados entre a primeira e a segunda RRS. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira, segunda e terceira RRS, pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena localizada entre a primeira e a terceira RRS e pelo menos uma SOI exógena localizada entre a terceira e a segunda RRS. A sequência de interesse pode codificar qualquer polipeptídeo de interesse, incluindo, sem limitação, os exemplos listados neste documento. As SOIs podem ser iguais ou diferentes, por exemplo, as SOIs podem incluir sequências de codificação para as duas cadeias de um anticorpo. No caso em que dois ou mais polipeptídeos diferentes são expressos, a sequência de interesse pode incluir os dois polipeptídeos em várias razões, por exemplo, quando oito sequências de codificação codificam dois polipeptídeos diferentes, incluindo, mas não limitado a, 1:7, 2:6 etc. As SOIs podem codificar um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

[0013] O objeto aqui divulgado também fornece métodos para a integração direcionada de um ácido nucleico em uma célula hospedeira para facilitar a expressão de um polipeptídeo de interesse. Em certas modalidades,

esses métodos compreendem a integração direcionada de um ácido nucleico exógeno em uma célula hospedeira via recombinação mediada por recombinase. Em certas modalidades, esses métodos se relacionam a uma célula compreendendo uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2 e sequências pelo menos cerca de 90% homóloga a ele. Em certas modalidades, esses métodos se referem a uma célula compreendendo uma sequência nucleotídica exógena integrada dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus compreende uma sequência nucleotídica que é pelo menos cerca de 90% homóloga a uma sequência selecionada de SEQ ID NOS: 1-7.

[0014] Em certas modalidades, um método para preparar uma célula hospedeira TI que expressa um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira TI, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende duas RRSs, flanqueando pelo menos um primeiro marcador de seleção; b) introduzir na célula fornecida em a) um vetor que compreende duas RRSs correspondentes às duas RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs; e d) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para isolar assim uma célula hospedeira TI que expressa o polipeptídeo.

[0015] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece um método para preparar uma célula hospedeira TI que expressa um primeiro e um segundo polipeptídeo de interesse (em que o primeiro e o segundo polipeptídeos podem ser iguais ou diferentes) compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI compreendendo uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira e uma segunda RRS flanqueando pelo menos um primeiro marcador de seleção, e uma terceira RRS localizada entre a primeira e a segunda RRS, em que a primeira, a segunda e a terceira RRS localizadas entre a primeira RRS e a segunda RRS, em que a primeira, segunda e terceira RRSs são heteroespecíficas, isto é, a primeira, segunda e terceira não são RRSs correspondentes e, portanto, quaisquer duas da primeira, segunda e terceira RRSs não reagiriam para recombinação mediada por recombinase; b) introduzir na célula fornecida em a) um primeiro vetor compreendendo duas RRSs correspondentes à primeira e a terceira RRS na sequência nucleotídica exógena integral e flanquear pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir a célula fornecida em a) em um segundo vetor compreendendo duas RRSs correspondentes à segunda e terceira RRS na sequência nucleotídica exógena integrada e flanquear pelo menos uma segunda SOI exógena; d) introduzir uma ou mais recombinases, em que uma ou mais recombinases reconhecem as RRSs; e) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para, portanto, isolar uma célula TI que expressa o primeiro e o segundo polipeptídeos de interesse.

[0016] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece um método para expressar um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira que compreende pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um marcador de seleção flanqueado por duas RRSs integradas dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 1-7; e b) cultivar a célula em a) sob condições adequadas para expressar a SOI e recuperar um polipeptídeo de interesse a partir disso.

[0017] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece um método para expressar um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira que compreende pelo menos duas SOIs exógenas e pelo menos um marcador de seleção integrado dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre SEQ ID Nos 1-7, em que pelo menos uma SOI exógena e um marcador de seleção são flanqueados por uma primeira e uma terceira RRSs e pelo menos uma SOI exógena é flanqueada por uma segunda e a terceira RRSs; e b) cultivar a célula em a) sob condições adequadas para expressar a SOI e recuperar um polipeptídeo de interesse a partir disso.

[0018] O objeto aqui divulgado também fornece composições e métodos para produzir polipeptídeos de interesse através do uso de células hospedeiras TI. Essas composições e métodos incluem, mas não estão limitados a, polinucleotídeos e vetores, facilitando a integração de uma sequência nucleotídica exógena em uma célula hospedeira TI, bem como composições e células hospedeiras TI compreendendo sequências nucleotídicas exógenas e métodos de utilização destes. Em certas modalidades, um vetor pode compreender sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a uma sequência selecionada das SEQ ID Nos. 1-7 que flanqueiam uma fita de DNA, em que a fita de DNA compreende pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena flanqueada por dois RRSs. O vetor pode ser selecionado do grupo que consiste em um vetor adenoviral, um vetor de vírus adeno-associado, um vetor lentiviral, um vetor retroviral, um vetor de fago de integração, um vetor não viral, um transposon e/ou vetor de transposase, um substrato de integrase e um plasmídeo.

[0019] Em certas modalidades, os métodos da presente divulgação compreendem a integração direcionada de um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo de interesse em uma célula hospedeira por meio de recombinação homóloga, reparo direcionado por homologia (HDR) e/ou junção de extremidade não homóloga (NHEJ) Em certas modalidades, esses métodos envolvem a integração de um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo de interesse em uma célula em um sítio dentro de um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062 (SEQ ID NO.

1), LOC100768845 (SEQ ID NO. 2), ITPR2 (SEQ ID NO. 3), ERE67000.1 (SEQ ID NO. 4), UBAP2 (SEQ ID NO. 5), MTMR2 (SEQ ID NO. 6), XP_003512331.2 (SEQ ID NO. 7) e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas às mesmas.

Em certas modalidades, esses métodos envolvem a integração de um ácido nucleico exógeno que codifica um polipeptídeo de interesse em uma célula em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos cerca de 90% homóloga a uma sequência selecionada de SEQ ID NON. 1-7.

[0020] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece um método para preparar uma célula hospedeira TI que expressa um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira que compreende um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs 1-7; b) introduzir um vetor na célula hospedeira, em que o vetor compreende sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID NOs. 1-7 que flanqueiam um cassete de DNA, em que o cassete de DNA compreende pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena flanqueada por duas RRSs; e c) selecionar para o marcador de seleção isolar uma célula hospedeira TI com a SOI integrada no locus do genoma e expressar o polipeptídeo de interesse. Em certas modalidades, esses métodos envolvem o uso de uma nuclease exógena para promover a integração direcionada. A nuclease exógena pode ser selecionada do grupo que consiste em uma nuclease dedo de zinco (ZFN), um dímero de ZFN, uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma proteína de fusão com domínio de efetor TAL, uma endonuclease de DNA guiada por RNA, uma meganuclease manipulada e uma endonuclease (Cas) associada a repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR).

[0021] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece um método para preparar uma célula hospedeira TI que expressa um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um ou mais loci do genoma da célula hospedeira TI, em que o um ou mais loci são pelo menos cerca de 90% homólogos a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID No. 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma ou mais RRSs; b) introduzir na célula fornecida em a) um vetor que compreende uma ou mais RRSs correspondentes a uma ou mais RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e que flanqueia pelo menos uma SOI exógena operacionalmente ligado a um promotor regulável; c) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs; e d) selecionar células TI que expressam a SOI exógena de interesse na presença de um indutor para isolar assim uma célula hospedeira TI que expressa o polipeptídeo de interesse.

[0022] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece um método para expressar um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira que compreende pelo menos uma SOI exógena flanqueada por duas RRSs e operacionalmente ligada um promotor regulável integrado dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homóloga a uma sequência selecionada dentre SEQ ID Nos. 1-7; e b) cultivar a célula sob condições adequadas para expressar a SOI e recuperar um polipeptídeo de interesse a partir disso.

[0023] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece um método para preparar uma célula hospedeira TI que expressa um primeiro e um segundo polipeptídeo de interesse (em que o primeiro e o segundo polipeptídeos podem ser iguais ou diferentes) compreendendo: a) fornecer uma célula hospedeira TI compreendendo uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs: 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira e uma segunda RRS, e uma terceira RRS localizada entre a primeira e a segunda RRS, em que a primeira, a segunda e a terceira RRS localizadas entre a primeira RRS e a segunda RRS, em que a primeira, segunda e terceira RRSs são heteroespecíficas, isto é, a primeira, segunda e terceira RRSs não são RRSs correspondentes e, portanto, quaisquer duas da primeira, segunda e terceira RRSs não reagiriam para recombinação mediada por recombinase; b) introduzir na célula fornecida em a) um primeiro vetor compreendendo duas RRSs correspondentes à primeira e à terceira RRS na sequência nucleotídica exógena integral e flanquear pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um promotor regulável; c) introduzir a célula fornecida em a) em um segundo vetor compreendendo duas RRSs correspondentes à segunda e terceira RRS na sequência nucleotídica exógena integrada e flanquear pelo menos uma segunda SOI exógena operacionalmente ligada a um promotor regulável; d) introduzir uma ou mais recombinases, ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais recombinases, em que uma ou mais recombinases reconhecem as

RRSs; e) selecionar células TI que expressam a segunda SOI exógena na presença de um indutor para, portanto, isolar uma célula TI que expressa o primeiro e o segundo polipeptídeos de interesse.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0024] A Figura 1 é um diagrama que mostra um esboço das etapas de triagem em todo o genoma para identificar loci de CHO de TI que permitem a expressão estável e alta de anticorpos.

[0025] As Figuras 2A e 2B representam dois esquemas de dupla seleção que foram utilizados para gerar a população que expressa o anticorpo alvo. Os hosts de TI gerados por transposase são mostrados na Figura 2A e os hosts de TI gerados por integração aleatória são mostrados na Figura 2B.

[0026] A Figura 3 mostra a produtividade dos principais clones gerados por dois hosts de TI específicos.

[0027] A Figura 4 representa uma estratégia de RMCE de dois plasmídeos envolvendo o uso de três sítios de RRS para realizar duas RMCEs independentes simultaneamente. Um vetor (frente) compreende a RRS1, uma primeira SOI e um promotor (P) seguido por um códon de início (ATG) e RRS3.

O outro vetor (voltar) compreende a RRS3 fundida com a sequência de codificação de um marcador sem o códon inicial (ATG), uma SOI 2 e a RRS2.

Somente quando os dois plasmídeos são direcionados corretamente, o cassete de expressão completa do marcador de seleção será montado, tornando assim as células resistentes à seleção.

[0028] A Figura 5 mostra os resultados do uso de RMCE de vetor único ou de dois vetores em conexão com a expressão dos Anticorpos D, E, F, G e J. Análises de FACS, PCR genômico e cópia de gene foram avaliadas para confirmar que ambos os cassetes de plasmídeos foram direcionados corretamente para o sítio de TI. Em RMCEs de dois plasmídeos, mais cópias totais de HC e LC foram direcionadas para o sítio de TI, em comparação com a

RMCE de plasmídeo único.

[0029] A Figura 6 mostra os títulos de seis moléculas.

[0030] A Figura 7 mostra os resultados do uso de RMCE de dois vetores para expressar formatos complexos de mAb. Duas moléculas biespecíficas, cada uma exigindo quatro cadeias diferentes (dois HCs e duas LCs), foram analisadas quanto à produção e% de formação biespecífica. Nos dois casos, foram desenvolvidas linhagens celulares exibindo >1,5 g /L com >80% de conteúdo biespecífico.

[0031] A Figura 8 representa os títulos do dia 14 de quatro moléculas biespecíficas

[0032] As Figuras 9 A e B representam a geração de linhagens celulares que expressam mAb-I ou mAb-II no sistema RTI. Os resultados histológicos para o desenvolvimento da linhagem celular estão representados na Figura 9A e um esquema de um processo de desenvolvimento da linhagem celular RTI (CLD) está representado na Figura 9B.

[0033] As Figuras 10 A a C representam o título e os resultados de produtividade específicos das linhagens celulares que expressam mAb-I ou mAb-II. O título do final da produção é representado na Figura 10A, o IVCC do final da produção é representado na Figura 10B e a produtividade específica do final da produção é representada na Figura 10C.

[0034] As Figuras 11 A e B representam os níveis de expressão de mRNA de HC e LC de linhagens celulares que expressam mAb-I e mAb-II.

Os níveis de expressão do mRNA de HC estão representados na Figura 11A e os níveis de expressão do mRNA de HL estão representados na Figura 11B.

[0035] As Figuras 12 A a D representam os níveis intracelulares de moléculas de HC, HL e BiP em linhagens celulares que expressam mAb-I ou mAb-II. Um esquema dos efeitos da cicloheximida e Dox em um sistema de ITR é representado na Figura 12A. Os níveis intracelulares de HC, LC e BiP, bem como os níveis de HC e LC nos sobrenadantes de linhagens celulares que expressam mAb-A ou mAb-B estão representados na Figura 12B. Os níveis intracelulares de HC, LC e BiP de linhagens celulares que expressam mAb-I ou mAb-II após tratamento durante a noite com CHX estão representados na Figura 12C. Os níveis intracelulares de HC, LC e BiP de linhagens celulares que expressam mAb-I ou mAb-II após a remoção da doxiciclina do meio de cultura estão representados na Figura 12D.

[0036] As Figuras 13 A a D representam a correlação entre o acúmulo intracelular da expressão de BiP e LC de mAb-I. O título final da produção é representado na Figura 13A e o acúmulo de HC, LC e BiP é representado na Figura 13B. Uma representação esquemática das experiências de troca de cadeia é mostrada na Figura 13C. Os níveis intracelulares de HC, LC e BiP de pools de RTI que expressam mAb-I, mAb-II ou versões trocadas em cadeia dessas moléculas estão representados na Figura 13D.

[0037] As Figuras 14 A C representam a contribuição de mAb-A HC e HL para a expressão de pool desta molécula. O título do final da produção é representado na Figura 14A, o IVCC do final da produção é representado na Figura 13B e a produtividade específica do final da produção é representada na Figura 14C.

[0038] As Figuras 15 A a B representam regiões CDR de LC e HC que podem contribuir para uma expressão fraca. Uma representação esquemática das subunidades de mAb-I e mAb-II LC está representada na Figura 15A. Uma representação esquemática das regiões de mAb-I e mAb-II HC está representada na Figura 15B.

[0039] As Figuras 16 A a C representam os resultados do uso de mutações pontuais na região constante de HC em conexão com a expressão de HCA. O título final da produção de várias trocas de cadeia entre as subunidades mAb-I e mAb-II HC e LC está representado na Figura 16A. Os níveis intracelulares de HC, LC e BiP de vários conjuntos de RTI estão representados na Figura 16B. Um esquema da utilização do sistema de RTI como uma ferramenta de diagnóstico para expressão de baixa proteína está representado na Figura 16C.

[0040] A Figura 17 mostra a produção usando dois processos diferentes de cultura de células.

[0041] As Figuras 18 A a D representam o título e os resultados de produtividade específicos para pools RMCE de três mAbs. O título do dia 14 para conjuntos de RMCE de três mAbs comparando as configurações HL e HLL está representado na Figura 18A. O dia 14 de produtividade específica (Qp) para conjuntos de RMCE de três mAbs comparando as configurações HL e HLL está representado na Figura 18B. O título do dia 14 para os clones gerados a partir dos conjuntos da Figura 18A está representado na Figura 18C. O dia 14 Qp para clones gerados a partir dos conjuntos da Figura 18A são representados na Figura 18D. Para as Figuras 18C e D, seis clones por configuração foram testados.

[0042] As Figuras 19 A a F representam o título, Qp e crescimento (como expresso pela integral da concentração celular viável, IVCC), expressão de mRNA e expressão de proteínas para conjuntos RMCE de mAb Y comparando três configurações plasmídicas diferentes. O título do dia 14, Qp e crescimento (como expresso pela integral da concentração celular viável, IVCC) estão representados nas Figuras 19 A, B e C, respectivamente. Cada barra representa dados de um único agrupamento. Expressão do mRNA do trem de semente e expressão da proteína do anticorpo intracelular dos agrupamentos em 19A. A expressão de mRNA para cadeia pesada e leve foi normalizada para a configuração HLL-HL; em cada barra, a média de quatro repetições técnicas (barras de erro são desvio padrão). A expressão do mRNA para cadeias pesada e leve foi normalizada para a configuração HLL-HL. A expressão intracelular de proteínas das cadeias pesada e leve de todos os conjuntos quantificados a partir de transferências Western e normalizados para a configuração HLL-HL, está representada na Figura 19E; cada barra é a média de três repetições técnicas (as barras de erro são o desvio padrão). Uma imagem de western blot representativa dos dados mostrados na Figura 19E é representada na Figura 19F.

[0043] As Figuras 20 A a F representam o título, Qp e crescimento (como expresso pela integral da concentração celular viável, IVCC) para monoclones que expressam mAb Y ou mAb III gerados a partir de conjuntos de RMCE com três configurações diferentes. O título do dia 14 para os monoclones que expressam o mAb Y está representado na Figura 20A. Qp do dia 14 para monoclones que expressam mAb Y está representado na Figura 20B. IVCC do dia 14 para clones que expressam mAb Y está representado na Figura 20C. O título do dia 14 para os monoclones que expressam o mAb III está representado na Figura 20D. Qp do dia 14 para monoclones que expressam mAb III está representado na Figura 20E. IVCC do dia 14 para clones que expressam mAb III está representado na Figura 20F.

[0044] As Figuras 21 A a D representam níveis de expressão, título e Qp de conjuntos RMCE de várias configurações. Um esquema dos plasmídeos de uma cadeia pesada e uma cadeia leve transfectados para avaliar o efeito da posição do plasmídeo na expressão da cadeia está representado na Figura 21A.

O anticorpo pesado (abreviado como H) e a cadeia leve (abreviada como L) foram expressos no mesmo plasmídeo ou divididos entre os plasmídeos da frente e de trás. Os sítios L3, Loxfas e 2L são anotados, assim como o gene de resistência à pac puromicina no plasmídeo anterior. A expressão de mRNA do trem de semente da cadeia pesada e leve de conjuntos com configurações de DNA descritas na Figura 21A estão representadas na Figura 23B. O título do dia 14 para os conjuntos RMCE das várias configurações está representado na Figura 21C. Qp do dia 14 das várias configurações está representado na Figura

21D. O número de cópias de DNA de cadeia pesada e leve para os conjuntos é mostrado na Figura 21E.

[0045] As Figuras 22 A a D mostram que o efeito da razão de HC:LC na porcentagem de mAbs de espécies de alto peso molecular (HMWS) é independente do sítio de TI. O título do dia 14 para o anticorpo S nas células hospedeiras 7 está representado na Figura 22A. A porcentagem de espécies de alto peso molecular (HMWS) do anticorpo S está nas células hospedeiras 7 é mostrada na Figura 22B. O título do dia 14 para o anticorpo S nas células hospedeiras 4 está representado na Figura 22C. A porcentagem de espécies de alto peso molecular (HMWS) do anticorpo S está nas células hospedeiras 4 é mostrada na Figura 22D.

[0046] As Figuras 23 A e B mostram o efeito da razão HC: LC na produtividade e nas espécies de alto peso molecular (HMWS) do anticorpo IV. O título do dia 14 para o anticorpo IV nas células hospedeiras 4 está representado na Figura 23A. A porcentagem de espécies de alto peso molecular (HMWS) do anticorpo IV está nas células hospedeiras 4 é mostrada na Figura 23D.

[0047] As Figuras 24 A e B representam o efeito da razão de HC: LC na produtividade e nas espécies de alto peso molecular (HMWS) do anticorpo VI em células hospedeiras TI de dois sítios. O título do dia 14 para o anticorpo VI em células hospedeiras TI de dois sítios está representado na Figura 24A. A porcentagem de espécies de alto peso molecular (HMWS) do anticorpo VI em células hospedeiras de dois sítios é mostrada na Figura 24B.

[0048] A Figura 25 representa 2 clones com títulos de 8,4 e 8,7 g/L com 7,4% e 5,6% de agregados, respectivamente.

[0049] A Figura 26 representa o título do dia 14 do anticorpo Z em diferentes linhagens celulares de integração direcionadas reguladas.

[0050] A Figura 27 mostra a produtividade específica do anticorpo Z em diferentes linhagens de celulares de integração direcionadas reguladas.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0051] Em certas modalidades, as células hospedeiras, construtos genéticos (por exemplo, vetores), composições e métodos descritos neste documento podem ser empregados no desenvolvimento e/ou uso de uma célula hospedeira de integração direcionada (TI). Em certas modalidades, essas células hospedeiras TI compreendem uma sequência nucleotídica exógena integrada dentro de um gene específico ou um locus específico do genoma da célula hospedeira.

[0052] Para fins de clareza da divulgação e não a título limitativo, a descrição detalhada é dividida nas seguintes subseções:

1. Definições

2. Sítios de Integração

3. Sequências Nucleotídicas Exógenas

4. Células Hospedeiras

5. Integração Direcionada

6. Preparação e Uso de Células Hospedeiras TI

7. Produtos

8. Modalidades Não Limitativas Exemplificativas

1. Definições

[0053] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado compreendido comumente por versados na técnica. Em caso de conflito, o presente documento, incluindo as definições, irá prevalecer. Métodos e materiais preferidos são descritos a seguir, embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou no teste do objeto aqui divulgado. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas por referência em suas totalidades. Os materiais, métodos e exemplos descritos neste documento são ilustrativos apenas e não se destinam a ser um fator limitante.

[0054] Os termos "compreende(m)", "inclui(em)", "ter", "tem", "pode", "contém(êm)", e as variantes destes, conforme usado neste documento, destinam-se a ser frases de transição em aberto, termos ou palavras que não excluem a possibilidade de atos ou estruturas adicionais. As formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referências no plural, a menos que o contexto dite claramente o contrário. A presente divulgação também contempla outras modalidades "compreendendo", "consistindo em" e "consistindo essencialmente em" modalidades ou elementos apresentados neste documento, se explicitamente estabelecido ou não.

[0055] Para a recitação das faixas numéricas neste documento, cada número interveniente entre os mesmos, com o mesmo grau de precisão, é contemplado explicitamente. Por exemplo, para a faixa de 6-9, os números 7 e 8 são contemplados além de 6 e 9, e para a escala 6,0-7,0, os números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, e 7,0 são contemplados explicitamente.

[0056] O termo "cerca de" significa dentro de um intervalo de erro aceitável para o valor particular conforme determinado por um versado na técnica, o qual dependerá em parte de como o valor é medido ou determinado, isto é, as limitações do sistema de medição. Por exemplo, "cerca de" pode significar dentro de 3 ou mais de 3 desvio padrão, pela prática na técnica.

Alternativamente, "cerca de" pode significar uma faixa de até 20%, preferencialmente até 10%, mais preferencialmente até 5%, e ainda mais preferencialmente até 1% de um dado valor. Alternativamente, particularmente a respeito dos sistemas ou processos biológicos, o termo pode significar dentro de uma ordem de magnitude, preferencialmente dentro de 5 vezes, e mais preferencialmente dentro de 2 vezes um valor.

[0057] Conforme usado neste documento, o termo "marcador de seleção" pode ser um gene que permite que as células portadoras do gene sejam especificamente selecionadas a favor ou contra, na presença de um agente de seleção correspondente. Por exemplo, mas não a título limitativo, um marcador de seleção pode permitir que a célula hospedeira transformada com o gene do marcador de seleção seja selecionada positivamente na presença do gene; uma célula hospedeira não transformada não seria capaz de crescer ou sobreviver sob condições seletivas. Os marcadores de seleção podem ser positivos, negativos ou bifuncionais. Os marcadores de seleção positivos podem permitir a seleção de células portadoras do marcador, enquanto os marcadores de seleção negativos podem permitir que células portadoras do marcador sejam seletivamente eliminadas. Um marcador de seleção pode conferir resistência a um medicamento ou compensar um defeito metabólico ou catabólico na célula hospedeira. Em células procarióticas, entre outros, podem ser usados genes que conferem resistência contra ampicilina, tetraciclina, canamicina ou cloranfenicol.

Os genes de resistência úteis como marcadores de seleção em células eucarióticas incluem, mas não estão limitados a, genes para fosfotransferase aminoglicosídeo (APH) (por exemplo, higromicina fosfotransferase (HYG), neomicina e G418 APH), diidrofolato redutase (DHFR), timidina quinase (TK), glutamina sintetase (GS), asparagina sintetase, triptofano sintetase (indol), histidinol desidrogenase (histidinol D) e genes que codificam resistência à puromicina, blasticidina, bleomicina, fleomicina, cloranfenicol, zeocina e ácido micofenólico. Outros genes marcadores são descritos nos documentos WO 92/08796 e WO 94/28143.

[0058] Além de facilitar uma seleção na presença de um agente de seleção correspondente, um marcador de seleção pode, alternativamente, fornecer um gene que codifica uma molécula normalmente não presente na célula, por exemplo, proteína verde fluorescente (GFP), GFP aprimorada (eGFP), GFP sintético, amarelo proteína fluorescente (YFP), YFP aprimorado

(eYFP), proteína fluorescente ciana (CFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-vermelho, monômero DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, mCFPm, Cerulean e T-Sapphire. As células que abrigam esse gene podem ser distinguidas das células que não abrigam esse gene, por exemplo, pela detecção da fluorescência emitida pelo polipeptídeo codificado.

[0059] Conforme usado neste documento, o termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma justaposição de dois ou mais componentes, em que os componentes estão em uma relação que lhes permite funcionar da maneira pretendida. Por exemplo, um promotor e/ou um potenciador está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se o promotor e/ou potenciador age para modular a transcrição da sequência de codificação. Em certas modalidades, as sequências de DNA que estão "operacionalmente ligadas" são contíguas e adjacentes a um único cromossomo.

Em certas modalidades, por exemplo, quando é necessário unir duas regiões codificadoras de proteínas, como um líder secretor e um polipeptídeo, as sequências são contíguas, adjacentes e no mesmo quadro de leitura. Em certas modalidades, um promotor operacionalmente ligado está localizado a montante da sequência de codificação e pode ser adjacente a ele. Em certas modalidades, por exemplo, no que diz respeito às sequências intensificadoras que modulam a expressão de uma sequência de codificação, os dois componentes podem ser operacionalmente ligados, embora não adjacentes. Um intensificador está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se o intensificador aumenta a transcrição da sequência de codificação. Os melhoradores operacionalmente ligados podem estar localizados a montante, dentro ou a jusante das sequências de codificação e podem estar localizados a uma distância considerável do promotor da sequência de codificação. A ligação operacional pode ser realizada por métodos recombinantes conhecidos na técnica, por exemplo, usando a metodologia de PCR e/ou por ligação em sítios de restrição convenientes. Se esses sítios convenientes não existirem, os adaptadores ou ligantes de oligonucleotídeos sintéticos podem ser usados de acordo com a prática convencional. Um sítio de entrada ribossômico interno (IRES) está operacionalmente ligado a um quadro de leitura aberto (ORF) se permitir o início da tradução do ORF em um local interno de maneira independente da extremidade 5'.

[0060] Conforme usado neste documento, o termo "expressão" refere-se à transcrição e/ou tradução. Em certas modalidades, o nível de transcrição de um produto desejado pode ser determinado com base na quantidade de mRNA correspondente que está presente. Por exemplo, o mRNA transcrito de uma sequência de interesse pode ser quantificado por PCR ou por hibridação Northern. Em certas modalidades, a proteína codificada por uma sequência de interesse pode ser quantificada por vários métodos, por exemplo, por ELISA, analisando a atividade biológica da proteína ou empregando ensaios independentes desta atividade, como transferência por teste Western blot ou radioimunoensaio, usando anticorpos que reconhecem e se ligam à proteína.

[0061] O termo "anticorpo" é usado neste documento no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpo, incluindo mas não limitado a anticorpos monoclonais, Anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), meio anticorpos e fragmentos de anticorpos, contanto que eles exibam a atividade desejada da ligação ao antígeno.

[0062] Conforme usado neste documento, o termo "fragmento de anticorpo" se refere a uma molécula diferente de um anticorpo intacto compreendendo uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab’)2; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv); e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, consulte Holliger e Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1136 (2005).

[0063] Conforme usado neste documento, o termo "região variável" ou "domínio variável" se refere ao domínio de uma cadeia pesada ou leve do anticorpo que esteja envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente tem estruturas similares, com cada domínio compreendendo quatro regiões de estrutura conservadas (FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Vide, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6ª ed., W.H. Freeman e Co., página 91 (2007).) Um único domínio V H ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno específico podem ser isolados usando um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para triagem de uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

[0064] Conforme usado neste documento, o termo "cadeia pesada" refere-se a uma cadeia pesada de imunoglobulina.

[0065] Conforme usado neste documento, o termo "cadeia leve" refere-se a uma cadeia leve de imunoglobulina.

[0066] A "classe" de um anticorpo se refere ao tipo de domínio constante ou região constante possuída por sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados , , ,  e , respectivamente.

[0067] O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado neste documento, se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou originados durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, essas variantes geralmente estando presentes em quantidades menores. Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, as quais tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante em um antígeno. Portanto, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como exigente de produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não se limitando ao método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição de fago e métodos que utilizam animais transgênicos contendo todos ou parte dos loci de imunoglobulina humana. Esses métodos e outros métodos exemplares para produzir anticorpos monoclonais são descritos neste documento.

[0068] "Anticorpos multiespecíficos" são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois sítios diferentes, ou seja, epítopos diferentes em antígenos diferentes ou epítopos diferentes no mesmo antígeno. Em certos aspectos, o anticorpo multiespecífico possui três ou mais especificidades de ligação. Os anticorpos multiespecíficos podem ser preparados como anticorpos completos ou fragmentos de anticorpos.

[0069] Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo intacto" e "anticorpo inteiro" são usados intercambiavelmente neste documento para se referir a um anticorpo com uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativo ou com cadeias pesadas contendo uma região Fc, conforme definido neste documento.

[0070] Um "fragmento de anticorpo" se refere a uma molécula diferente de um anticorpo intacto compreendendo uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a Fv, Fab, Fab', Fab’- SH, F(ab')2; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv e scFab); anticorpos de domínio único (dAbs) e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, consulte Holliger e Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1136 (2005).

[0071] O termo anticorpo "quimérico" diz respeito a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie específica, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.

[0072] Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde a de um anticorpo produzido por um ser humano ou uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpo humano ou outras sequências codificadoras de anticorpo humano. Essa definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antígeno não humano.

[0073] O anticorpo "humanizado" diz respeito a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos de CDRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas. Em certos aspectos, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e normalmente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as CDRs correspondem àquelas de um anticorpo não-humano, e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano.

Um anticorpo humanizado pode compreender opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante do anticorpo derivado de um anticorpo humano.

Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não- humano, se refere a um anticorpo que foi submetido à humanização. O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado neste documento, se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou originados durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, essas variantes geralmente estando presentes em quantidades menores. Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, as quais tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante em um antígeno. Portanto, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como exigente de produção do anticorpo por qualquer método específico.

[0074] O termo "anticorpo terapêutico" refere-se a um anticorpo que é utilizado no tratamento da doença. Um anticorpo terapêutico pode ter vários mecanismos de ação. Um anticorpo terapêutico pode ligar e neutralizar a função normal de um alvo associado a um antígeno. Por exemplo, um anticorpo monoclonal que bloqueia a atividade da proteína necessária para a sobrevivência de uma célula cancerosa causa a morte da célula. Outro anticorpo monoclonal terapêutico pode ligar e ativar a função normal de um alvo associado a um antígeno. Por exemplo, um anticorpo monoclonal pode se ligar a uma proteína em uma célula e desencadear um sinal de apoptose. Ainda outro anticorpo monoclonal pode ligar-se a um antígeno alvo expresso apenas no tecido doente; a conjugação de uma carga útil tóxica (agente efetivo), tal como um agente quimioterápico ou radioativo, ao anticorpo monoclonal pode criar um agente para a entrega específica da carga útil tóxica ao tecido doente, reduzindo o dano ao tecido saudável. Um "fragmento biologicamente funcional" de um anticorpo terapêutico exibirá pelo menos uma, senão algumas, ou todas as funções biológicas atribuídas ao anticorpo intacto, a função compreendendo, pelo menos, ligação específica ao antígeno alvo.

[0075] O termo "anticorpo de diagnóstico" refere-se a um anticorpo que é usado como um reagente de diagnóstico para uma doença. O anticorpo de diagnóstico pode se ligar a um antígeno alvo que está especificamente associado a, ou mostra expressão aumentada em uma doença específica. O anticorpo de diagnóstico pode ser usado, por exemplo, para detectar um alvo em uma amostra biológica de um paciente, ou em imagens de diagnóstico de locais de doenças, como tumores, em um paciente. Um "fragmento biologicamente funcional" de um anticorpo diagnóstico exibirá pelo menos uma, senão algumas, ou todas as funções biológicas atribuídas ao anticorpo intacto, a função compreendendo, pelo menos, ligação específica ao antígeno alvo.

[0076] Os termos "célula hospedeira", "linhagem celular hospedeira" e "cultura celular hospedeira" são usados intercambiavelmente e se referem às células nas quais um ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie dessas células. As células hospedeiras incluem "transformantes" e "células transformadas", que incluem a célula primária transformada e a progênie derivada da mesma sem referência ao número de passagens. A descendência pode não ser completamente idêntica em teor de ácido nucleico a uma célula parental, mas pode conter mutações. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica, conforme triada ou selecionada na célula originalmente transformada está incluída neste documento.

[0077] O termo "molécula de ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" inclui qualquer composto e/ou substância que compreende um polímero de nucleotídeos. Cada nucleotídeo é composto de uma base, especificamente uma base de purina ou pirimidina (por exemplo, citosina (C), guanina (G), adenina (A), timina (T) ou uracil (U)), açúcar (por exemplo desoxirribose ou ribose) e um grupo fosfato. Frequentemente, a molécula de ácido nucleico é descrita pela sequência de bases, em que as referidas bases representam a estrutura primária (estrutura linear) de uma molécula de ácido nucleico. A sequência de bases é tipicamente representada de 5' a 3'. Neste documento, o termo molécula de ácido nucleico abrange ácido desoxirribonucleico (DNA), incluindo, por exemplo, DNA complementar (cDNA) e DNA genômico, ácido ribonucleico (RNA), em particular RNA mensageiro (mRNA), formas sintéticas de DNA ou RNA e polímeros mistos compreendendo duas ou mais dessas moléculas. A molécula de ácido nucleico pode ser linear ou circular. Além disso, o termo molécula de ácido nucleico inclui ambas as fitas, sense, antisense, bem como formas de fita simples e dupla. Além disso, a molécula de ácido nucleico aqui descrita pode conter nucleotídeos de ocorrência natural ou não natural. Exemplos de nucleotídeos que não ocorrem naturalmente incluem bases nucleotídicas modificadas com açúcares derivados ou ligações de esqueleto de fosfato ou resíduos quimicamente modificados. As moléculas de ácido nucleico também abrangem moléculas de DNA e RNA que são adequadas como vetor para expressão direta de um anticorpo da invenção in vitro e/ou in vivo, por exemplo, em um hospedeiro ou paciente. Estes vetores de DNA (por exemplo, cDNA) ou RNA (por exemplo, mRNA), podem não ser modificados ou modificados. Por exemplo, o mRNA pode ser quimicamente modificado para aprimorar a estabilidade do vetor de RNA e/ou expressão da molécula codificada, para que o mRNA possa ser injetado em um sujeito para gerar o anticorpo in vivo (ver, por exemplo, Stadler et al., Nature Medicine 2017, publicado on-line em 12 de junho de 2017, doi: 10.1038/nm.4356 ou EP 2 101 823 B1).

[0078] Um ácido nucleico "isolado" se refere a uma molécula de ácido nucleico que foi separada de um componente de seu ambiente natural. Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que geralmente compreendem a molécula de ácido nucleico, porém a molécula de ácido nucleico está presente extracromossomicamente ou em um local cromossômico diferente de seu local cromossômico natural.

[0079] Conforme usado neste documento, o termo "vetor" se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual está ligado. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico de autorreplicação, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. Em certas modalidades, os vetores direcionam a expressão de ácidos nucleicos aos quais eles estão operacionalmente ligados. Estes vetores são referidos neste documento como "vetores de expressão".

[0080] Conforme usado neste documento, o termo "sequências homólogas" refere-se a sequências que compartilham uma similaridade significativa de sequência, conforme determinado por um alinhamento das sequências. Por exemplo, duas sequências podem ser homólogas de cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 99,9%. O alinhamento é realizado por algoritmos e programas de computador, incluindo, mas não se limitando a, BLAST, FASTA e HMME, que comparam sequências e calculam a significância estatística das correspondências com base em fatores como comprimento, identificação e semelhança, e presença e comprimento das incompatibilidades e lacunas da sequência. As sequências homólogas podem se referir a sequências de DNA e proteínas.

[0081] Conforme usado neste documento, o termo "flanqueamento" refere-se a que uma primeira sequência de nucleotídeos está localizada na extremidade 5' ou 3' ou em ambas as extremidades de uma segunda sequência nucleotídica. A sequência nucleotídica flanqueadora pode ser adjacente ou a uma distância definida da segunda sequência nucleotídica.

Não existe um limite específico para o comprimento de uma sequência nucleotídica flanqueadora. Por exemplo, uma sequência flanqueadora pode ser alguns pares de bases ou alguns milhares de pares de bases. Em certas modalidades, o comprimento de uma sequência nucleotídica flanqueadora pode ser de pelo menos 15 pares de bases, pelo menos 20 pares de bases, pelo menos 30 pares de bases, pelo menos 40 pares de bases, pelo menos 50 pares de bases, pelo menos 75 pares de bases, pelo menos 100 pares de bases, pelo menos 150 pares de bases, pelo menos 200 pares de bases, pelo menos 300 pares de bases, pelo menos 400 pares de bases, pelo menos 500 pares de bases, pelo menos 1.000 pares de bases, pelo menos 1.500 pares de bases, pelo menos 2.000 pares de bases, pelo menos 3.000 pares de bases, pelo menos 4.000 pares de bases, pelo menos 5.000 pares de bases, pelo menos

6.000 pares de bases, pelo menos 7.000 pares de bases, pelo menos 8.000 pares de bases, pelo menos 9.000 pares de bases, pelo menos 10.000 bases pares.

[0082] Conforme usado neste documento, o termo "exógeno" indica que uma sequência nucleotídica não se origina de uma célula hospedeira e é introduzida em uma célula hospedeira pelos métodos tradicionais de distribuição de DNA, por exemplo, por métodos de transfecção, eletroporação ou transformação. O termo "endógeno" refere-se ao fato de que uma sequência nucleotídica se origina de uma célula hospedeira. Uma sequência nucleotídica "exógena" pode ter uma contraparte "endógena" que é idêntica nas composições de base, mas onde a sequência "exógena" é introduzida na célula hospedeira,

por exemplo, via tecnologia de DNA recombinante.

2. Sítios de Integração

[0083] O objeto aqui divulgado fornece uma célula hospedeira adequada para integração direcionada de sequências nucleotídicas exógenas.

Em certas modalidades, a célula hospedeira compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio de integração no genoma da célula hospedeira, isto é, uma célula hospedeira TI.

[0084] Um "sítio de integração" compreende uma sequência de ácido nucleico dentro de um genoma de célula hospedeira no qual uma sequência nucleotídica exógena é inserida. Em certas modalidades, um sítio de integração está entre dois nucleotídeos adjacentes no genoma da célula hospedeira. Em certas modalidades, um sítio de integração inclui um trecho de nucleotídeos entre qualquer um dos quais uma sequência nucleotídica exógena pode ser inserida. Em certas modalidades, o sítio de integração está localizado dentro de um locus específico do genoma da célula hospedeira TI. Em certas modalidades, o sítio de integração está dentro de um gene endógeno da célula hospedeira TI.

[0085] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio dentro de um locus específico do genoma de uma célula hospedeira TI. Em certas modalidades, o locus no qual a sequência nucleotídica exógena está integrada é de pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,9% homólogas a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs: 1-

7.

[0086] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio dentro de um locus específico do genoma de uma célula hospedeira TI. Em certas modalidades, o locus no qual a sequência nucleotídica exógena está integrada é de pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,9% homóloga a uma sequência selecionada de Contigs NW_006874047.1, NW_ 006884592.1, NW_ 006881296.1, NW_ 003616412.1, NW_ 003615063.1, NW_ 006882936.1 e NW_ 003615411.1.

[0087] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio de integração localizado dentro de uma posição selecionada de nucleotídeos numerados de 1-1.000 bp; 1.000-2.000 bp; 2.000-

3.000 bp; 3.000-4.000 bp; e 4.000-4.301 bp da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio de integração localizado dentro de uma posição selecionada dentre nucleotídeos numerados de 1-100.000 bp; 100.000-200.000 bp; 200.000-300.000 bp;

300.000-400.000 bp; 400.000-500.000 bp; 500.000-600.000 bp; 600.000-

700.000 bp; e 700.000-728785 bp da SEQ ID NO: 2. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio de integração localizado dentro de uma posição selecionada de nucleotídeos numerados de 1-100.000 bp; 100.000-200.000 bp; 200.000-300.000 bp; 300.000-400.000 bp; e 400.000-

413.983 da SEQ ID NO: 3. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio de integração localizado dentro de uma posição selecionada de nucleotídeos numerados de 1-10.000 bp; 10.000-20.000 bp;

20.000-30.000 bp; e 30.000-30.757 bp da SEQ ID NO: 4. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio de integração localizado dentro de uma posição selecionada de nucleotídeos numerados de 1-10.000 bp; 10.000-20.000 bp; 20.000-30.000 bp; 30.000-40.000 bp; 40.000-50.000 bp; 50.000-60.000 bp; e 60.000-68.962 bp da SEQ ID NO: 5. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio de integração localizado dentro de uma posição selecionada de nucleotídeos numerados de 1-10.000 bp; 10.000-20.000 bp; 20.000-30.000 bp;

30.000-40.000 bp; 40.000-50.000 bp; e 50.000-51.326 bp da SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio de integração localizado dentro de uma posição selecionada de nucleotídeos numerados de 1-10.000 bp; 10.000-20.000 bp; e 20.000-22.904 bp da SEQ ID NO: 7.

[0088] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica imediatamente a 5' da sequência nucleotídica exógena integrada é selecionada do grupo que consiste em nucleotídeos 41190-45269 de NW_006874047.1, nucleotídeos 63590-207911 de NW_006884592.1, nucleotídeos 253831-491909 de NW_006881296.1, nucleotídeos 69303-79768 de NW_003616412.1, nucleotídeos 293481-315265 de NW_003615063.1, nucleotídeos 2650443- 2662054 de NW_006882936.1 ou nucleotídeos 82214-97705 de NW_003615411.1 e sequências pelo menos 50% homólogas a estes. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica imediatamente a 5' da sequência exógena integrada é pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,9% homólogas aos nucleotídeos 41190-45269 de NW_006874047.1, nucleotídeos 63590-207911 de NW_006884592.1, nucleotídeos 253831-491909 de NW_006881296.1, nucleotídeos 69303-79768 de NW_003616412.1, nucleotídeos 293481-315265 de NW_003615063.1, nucleotídeos 2650443- 2662054 de NW_006882936.1 ou nucleotídeos 82214-97705 de NW_003615411.1.

[0089] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica imediatamente 3' da sequência nucleotídica exógena integrada é selecionada do grupo que consiste em nucleotídeos 45270-45490 de NW_006874047.1, nucleotídeos 207912-792374 de NW_006884592.1, nucleotídeos 491910-

667813 de NW_006881296.1, nucleotídeos 79769-100059 de NW_003616412.1, nucleotídeos 315266-362442 de NW_003615063.1, nucleotídeos 2662055-2701768 de NW_006882936.1, ou nucleotídeos 97706- 105117 de NW_003615411.1 e sequências pelo menos 50% homóloga a estes.

Em certas modalidades, a sequência nucleotídica imediatamente a 3' da sequência exógena integrada é de pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,9% homólogas aos nucleotídeos 45270-45490 de NW_006874047.1, nucleotídeos 207912-792374 de NW_006884592.1, nucleotídeos 491910-667813 de NW_006881296.1, nucleotídeos 79769-100059 de NW_003616412.1, nucleotídeos 315266-362442 de NW_003615063.1, nucleotídeos 2662055-2701768 de NW_006882936.1, ou nucleotídeos 97706- 105117 de NW_003615411.1.

[0090] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada está operacionalmente ligada a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-7 e sequências pelo menos 50% homólogas a estas. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica operacionalmente ligada à sequência nucleotídica exógena é pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,9% homóloga a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs: 1-7. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende pelo menos uma SOI. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica operacionalmente ligada aumenta o nível de expressão da SOI em comparação com uma SOI aleatoriamente integrada. Em certas modalidades, a SOI exógena integrada é expressa em cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou 10 vezes mais do que uma

SOI aleatoriamente integrada.

[0091] Em certas modalidades, a sequência exógena integrada é flanqueada a 5’ por uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em nucleotídeos 41190-45269 de NW_006874047.1, nucleotídeos 63590-207911 de NW_006884592.1, nucleotídeos 253831-491909 de NW_006881296.1, nucleotídeos 69303-79768 de NW_003616412.1, nucleotídeos 293481-315265 de NW_003615063.1, nucleotídeos 2650443- 2662054 de NW_006882936.1 e nucleotídeos 82214-97705 de NW_003615411.1.e sequências pelo menos 50% homólogas a estes, e é flanqueada a 3’ por uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em nucleotídeos 45270-45490 de NW_006874047.1, nucleotídeos 207912-792374 de NW_006884592.1, nucleotídeos 491910-667813 de NW_006881296.1, nucleotídeos 79769-100059 de NW_003616412.1, nucleotídeos 315266-362442 de NW_003615063.1, nucleotídeos 2662055- 2701768 de NW_006882936.1 e nucleotídeos 97706-105117 de NW_003615411.1 e sequências pelo menos 50% homólogas a estes. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica flanqueadora a 5' da sequência nucleotídica exógena integrada é pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, ou pelo menos cerca de 99,9% homóloga aos nucleotídeos 41190-45269 de NW_006874047.1, nucleotídeos 63590-207911 de NW_006884592.1, nucleotídeos 253831-491909 de NW_006881296.1, nucleotídeos 69303-79768 de NW_003616412.1, nucleotídeos 293481-315265 de NW_003615063.1, nucleotídeos 2650443- 2662054 de NW_006882936.1 e nucleotídeos 82214-97705 de NW_003615411.1 e a sequência nucleotídica flanqueadora a 3' da sequência nucleotídica exógena integrada é pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, ou pelo menos cerca de 99,9% homóloga aos nucleotídeos 45270-45490 de NW_006874047.1, nucleotídeos 207912-792374 de NW_006884592.1, nucleotídeos 491910- 667813 de NW_006881296.1, nucleotídeos 79769-100059 de NW_003616412.1, nucleotídeos 315266-362442 de NW_003615063.1, nucleotídeos 2662055-2701768 de NW_006882936.1 e nucleotídeos 97706- 105117 de NW_003615411.1 das SEQ ID NOs:.

[0092] Em certas modalidades, o nucleotídeo exógeno integrado é integrado em um locus imediatamente adjacente a toda ou uma porção de uma sequência selecionada do grupo que consiste em sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs: 1-7.

[0093] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada está adjacente a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-7 e sequências pelo menos 50% homólogas a estas. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada está dentro de cerca de 100 bp, cerca de 200 bp, cerca de 500 bp, distância de cerca de 1 kb de uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-7 e sequências pelo menos 50% homólogas a estas. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica adjacente ligada à sequência nucleotídica exógena é pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,9% homóloga a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs: 1-7.

[0094] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio de integração adjacente a uma posição selecionada de nucleotídeos numerados de 1-1.000 bp; 1.000-2.000 bp; 2.000-3.000 bp; 3.000-

4.000 bp; e 4.000-4.301 bp da SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio de integração adjacente a uma posição selecionada dentre nucleotídeos numerados de 1-100.000 bp;

100.000-200.000 bp; 200.000-300.000 bp; 300.000-400.000 bp; 400.000-

500.000 bp; 500.000-600.000 bp; 600.000-700.000 bp; e 700.000-728785 bp da SEQ ID NO: 2. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio de integração adjacente a uma posição selecionada de nucleotídeos numerados de 1-100.000 bp; 100.000-200.000 bp; 200.000-

300.000 bp; 300.000-400.000 bp; e 400.000-413.983 da SEQ ID NO: 3. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio de integração adjacente a uma posição selecionada de nucleotídeos numerados de 1-10.000 bp; 10.000-20.000 bp; 20.000-30.000 bp; e 30.000-30.757 bp da SEQ ID NO: 4. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio de integração localizado adjacente a uma posição selecionada de nucleotídeos numerados de 1-10.000 bp; 10.000-20.000 bp;

20.000-30.000 bp; 30.000-40.000 bp; 40.000-50.000 bp; 50.000-60.000 bp; e

60.000-68.962 bp da SEQ ID NO: 5. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio de integração adjacente a uma posição selecionada de nucleotídeos numerados de 1-10.000 bp; 10.000-20.000 bp; 20.000-30.000 bp; 30.000-40.000 bp; 40.000-50.000 bp; e 50.000-51.326 bp da SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio de integração adjacente a uma posição selecionada de nucleotídeos numerados de 1-10.000 bp; 10.000-20.000 bp; e 20.000-22.904 bp da SEQ ID NO: 7.

[0095] Em certas modalidades, o locus compreendendo o sítio de integração da sequência nucleotídica exógena não codifica uma estrutura de leitura aberta (ORF). Em certas modalidades, o locus compreendendo o sítio de integração da sequência nucleotídica exógena inclui elementos de ação cis, por exemplo, promotores e potenciadores. Em certas modalidades, o locus compreendendo o sítio de integração da sequência nucleotídica exógena está livre de quaisquer elementos de ação cis, por exemplo, promotores e intensificadores, que melhoram a expressão gênica.

[0096] Em certas modalidades, uma sequência nucleotídica exógena é integrada em um sítio de integração dentro de um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2. Os genes endógenos LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2 incluem o tipo selvagem e todas as sequências homólogas dos genes LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2. Em certas modalidades, as sequências homólogas dos genes LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2 podem ser pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, ou pelo menos cerca de 99,9% homólogas aos genes LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2 do tipo selvagem. Em certas modalidades, os genes LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2 são genes LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2 de mamíferos do tipo selvagem. Em certas modalidades, os genes LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2 são genes LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2 humanos do tipo selvagem. Em certas modalidades, os genes LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2 são genes LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2 de hamster do tipo selvagem.

[0097] Em certas modalidades, o sítio de integração está operacionalmente ligado a um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2 e pelo menos cerca de 90% de sequências homólogas destes. Em certas modalidades, o sítio de integração é flanqueado por um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2 e pelo menos cerca de 90% de sequências homólogas destes.

[0098] A Tabela 1 fornece sítios de integração de células hospedeiras TI exemplificativos: Tabela 1 - Sítios de integração de célula hospedeira TI Hospedeira Contígua Tamanho Sítio de Gene (SEQ ID NO) da integração Contígua (bp) (kb) 1 NW_006874047.1 727 45269 LOC107977062 (SEQ ID NO: 1) 2 NW_006884592.1 931 207911 LOC100768845 (SEQ ID NO: 2) 3 NW_006881296.1 1016 491909 ITPR2 (SEQ ID NO: 3) 4 NW_003616412.1 127 79768 ERE67000.1 (SEQ ID NO: 4) 5 NW_003615063.1 372 315265 UBAP2 (SEQ ID NO: 5) 6 NW_006882936.1 3042 2662054 MTMR2 (SEQ ID NO: 6) 7 NW_003615411.1 277 97706 XP_003512331.2 (SEQ ID NO: 7)

[0099] Em certas modalidades, um sítio de integração e/ou as sequências nucleotídicas que flanqueiam o sítio de integração podem ser identificados experimentalmente. Em certas modalidades, um sítio de integração e/ou as sequências nucleotídicas que flanqueiam o sítio de integração podem ser identificados por abordagens de triagem em todo o genoma para isolar células hospedeiras que expressam, em um nível desejável, um polipeptídeo de interesse codificado por uma ou mais SOIs integradas uma ou mais sequências nucleotídicas exógenas, onde as sequências exógenas são elas próprias integradas em um ou mais loci no genoma da célula hospedeira. Em certas modalidades, um sítio de integração e/ou as sequências nucleotídicas que flanqueiam um sítio de integração podem ser identificados por abordagens de triagem em todo o genoma após o evento de integração de cassetes baseado em transposase. Em certas modalidades, um sítio de integração e/ou as sequências nucleotídicas que flanqueiam um sítio de integração podem ser identificados por triagem de integração aleatória de força bruta. Em certas modalidades, um sítio de integração e/ou as sequências nucleotídicas flanqueadoras de um sítio de integração podem ser determinados por abordagens de sequenciamento convencionais, como amplificação do locus alvo (TLA), seguida por sequenciamento de próxima geração (NGS) e NGS de genoma inteiro. Em certas modalidades, a localização de um sítio de integração em um cromossomo pode ser determinada por abordagens convencionais de biologia celular, como análise de hibridização por fluorescência in situ (FISH).

[00100] Em certas modalidades, uma célula hospedeira TI compreende uma primeira sequência nucleotídica exógena integrada em um primeiro sítio de integração dentro de um primeiro locus específico no genoma da célula hospedeira TI e uma segunda sequência nucleotídica exógena integrada em um segundo sítio de integração dentro de um segundo locus específico no genoma. Em certas modalidades, uma célula hospedeira TI compreende várias sequências nucleotídicas exógenas integradas em vários sítios de integração no genoma da célula hospedeira TI.

[00101] Em certas modalidades, as células hospedeiras TI da presente divulgação compreendem pelo menos duas sequências nucleotídicas exógenas distintas, por exemplo, sequências nucleotídicas exógenas compreendendo pelo menos uma RRS. Em certas modalidades, duas ou mais sequências nucleotídicas exógenas podem ser direcionadas para a introdução de uma ou mais SOIs. Em certas modalidades, as SOIs são as mesmas. Em certas modalidades, as SOIs são distintas. Em certas modalidades, uma célula hospedeira TI parental compreendendo uma primeira sequência nucleotídica exógena pode compreender uma segunda sequência nucleotídica exógena em um sítio de integração que é diferente do sítio de integração da primeira sequência nucleotídica exógena.

[00102] Em certas modalidades, o sítio de integração é de pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%, ou pelo menos cerca de 99,9% homólogas a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs: 1-7. Em certas modalidades, os sítios de integração podem estar no mesmo cromossomo. Em certas modalidades, os sítios de integração estão localizados dentro de 1-1.000 nucleotídeos, 1.000-

100.000 nucleotídeos, 100.000-1.000.000 nucleotídeos ou mais um do outro no mesmo cromossomo. Em certas modalidades, os sítios de integração estão em cromossomos diferentes. Em certas modalidades, uma célula hospedeira TI compreendendo uma sequência nucleotídica exógena em um sítio de integração pode ser usada para a inserção de pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos 7, pelo menos 8 ou mais sequências nucleotídicas exógenas no mesmo ou em sítios de integração diferentes.

[00103] Em certas modalidades, a viabilidade da troca de cassetes mediada por recombinase (RMCE) de pelo menos dois sítios de integração pode ser avaliada para cada sítio individualmente. Em certas modalidades, a viabilidade de RMCE pelo menos dois sítios de integração pode ser avaliada simultaneamente. A viabilidade de RMCE em vários sítios pode ser avaliada por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, medindo o título do polipeptídeo ou a produção específica do polipeptídeo. Em certas modalidades, a avaliação pode ser realizada por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, avaliando o título e/ou a produtividade específica de uma cultura da célula hospedeira TI que expressa a(s) SOI(s). Estratégias de cultura exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, culturas de balões de agitação de lote alimentado e culturas de lote alimentado com biorreator. O título e a produtividade específica das células hospedeiras TI que expressam um polipeptídeo de interesse podem ser avaliados por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, mas não limitados a, ELISA, FACS, Tecnologia de Ensaio de Microvolume Fluorométrico (FMAT), cromatografia de afinidade por proteína A, análise de Western blot.

3. Sequências Nucleotídicas Exógenas

[00104] Uma sequência nucleotídica exógena é uma sequência nucleotídica que não se origina de uma célula hospedeira, mas pode ser introduzida em uma célula hospedeira pelos métodos tradicionais de distribuição de DNA, por exemplo, por métodos de transfecção, eletroporação ou transformação. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é uma sequência de interesse (SOI), por exemplo, uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo de interesse. Em certas modalidades, no entanto, as sequências nucleotídicas exógenas empregadas no contexto da presente divulgação compreendem elementos, por exemplo, uma ou mais sequências de reconhecimento de recombinação (RRs) e um ou mais marcadores de seleção, que facilitam a introdução de sequências adicionais de ácidos nucleicos, por exemplo, SOIs. Em certas modalidades, as sequências nucleotídicas exógenas que facilitam a introdução de sequências adicionais de ácido nucleico são referidas neste documento como "landing pads". Em conformidade, em certas modalidades, uma célula hospedeira TI pode compreender: (1) uma sequência nucleotídica exógena que inclui uma ou mais SOIs, por exemplo, uma SOI incorporada em um locus específico em um genoma da célula hospedeira por meio de uma integração direcionada mediada por nuclease específica do sítio exógena (por exemplo, CRISPR/mediada por Cas9); (2) uma sequência nucleotídica exógena que inclui uma ou mais landing pads; ou (3) uma sequência nucleotídica exógena que inclui uma ou mais landing pads nas quais uma ou mais SOIs foram incorporadas.

[00105] Em certas modalidades, uma célula hospedeira TI compreende pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada em um ou mais sítios de integração no genoma da célula hospedeira TI. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena é integrada em um ou mais sítios de integração dentro de um locus específico do genoma da célula hospedeira TI. Por exemplo, mas não a título limitativo, pelo menos uma sequência de ácido nucleico exógena pode ser integrada em um ou mais sítios com pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, a pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,9% homólogas a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs: 1-7.

3.1 Landing Pads

[00106] Em certas modalidades, uma sequência nucleotídica exógena integrada compreende uma ou mais sequência de reconhecimento de recombinação (RRS), em que a RRS pode ser reconhecida por uma recombinase. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende pelo menos duas RRSs. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende duas RRSs e as duas RRSs são as mesmas. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende duas RRSs e as duas RRSs são heteroespecíficas, isto é, não são reconhecidas pela mesma recombinase. Em certas modalidades, uma sequência nucleotídica exógena integrada compreende três RRSs, em que a terceira RRS está localizada entre a primeira e a segunda RRS. Em certas modalidades, a primeira e a segunda RRS são as mesmas, e a terceira RRS é diferente da primeira ou da segunda RRS. Em certas modalidades, todas as três RRSs são heteroespecíficas. Em certas modalidades, uma sequência nucleotídica exógena integrada compreende quatro, cinco, seis, sete ou oito RRSs. Em certas modalidades, uma sequência nucleotídica exógena integrada compreende várias RRSs. Em certas modalidades, as várias duas ou mais RRS são as mesmas. Em certas modalidades, duas ou mais RRSs são heteroespecíficas. Em certas modalidades, cada RRS pode ser reconhecida por uma recombinase distinta.

Em certas modalidades, o subconjunto do número total de RRSs é homoespecífico, isto é, reconhecido pela mesma recombinase, e um subconjunto do número total de RRSs é heteroespecífico, ou seja, não é reconhecido pela mesma recombinase. Em certas modalidades, a RRS ou as RRSs podem ser selecionadas do grupo que consiste em uma sequência LoxP, uma sequência LoxP L3, uma sequência LoxP 2L, uma sequência LoxFas, uma sequência Lox511, uma sequência Lox2272, uma sequência Lox2372, uma sequência Lox5171, uma sequência Loxm2, uma sequência Lox71, uma sequência Lox66, uma sequência FRT, uma sequência Bxb1 attP, uma sequência Bxb1 attB, uma sequência φC31 attP e uma sequência φC31 attB.

[00107] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende pelo menos um marcador de seleção. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende uma RRS e pelo menos um marcador de seleção. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende uma primeira e uma segunda RRS, e pelo menos um marcador de seleção. Em certas modalidades, um marcador de seleção está localizado entre a primeira e a segunda RRS. Em certas modalidades, duas RRSs flanqueiam pelo menos um marcador de seleção, ou seja, uma primeira RRS está localizada 5' a montante e uma segunda RRS está localizada 3' a jusante do marcador de seleção. Em certas modalidades, uma primeira RRS está adjacente à extremidade 5' do marcador de seleção e uma segunda RRS está adjacente à extremidade 3' do marcador de seleção.

[00108] Em certas modalidades, um marcador de seleção está localizado entre uma primeira e uma segunda RRS e as duas RRSs flanqueadoras são as mesmas. Em certas modalidades, as duas RRSs que flanqueiam o marcador de seleção são ambas sequências LoxP. Em certas modalidades, as duas RRSs que flanqueiam o marcador de seleção são ambas sequências FRT. Em certas modalidades, um marcador de seleção está localizado entre uma primeira e uma segunda RRS e as duas RRSs flanqueadoras são as heteroespecíficas. Em certas modalidades, a primeira RRS flanqueadora é uma sequência LoxP L3 e a segunda RRS flanqueadora é uma sequência LoxP 2L. Em certas modalidades, uma sequência LoxP L3 está localizada 5' do marcador de seleção e uma sequência LoxP 2L está localizada 3' do marcador de seleção. Em certas modalidades, a primeira RRS flanqueadora é uma sequência FRT do tipo selvagem e a segunda RRS flanqueadora é uma sequência FRT mutante. Em certas modalidades, a primeira RRS flanqueadora é uma sequência Bxb1 attP e a segunda RRS flanqueadora é uma sequência Bxb1 attB. Em certas modalidades, a primeira RRS flanqueadora é uma sequência φC31 attP e a segunda RRS flanqueadora é uma sequência φC31 attB. Em certas modalidades, as duas RRSs estão posicionadas na mesma orientação. Em certas modalidades, as duas RRSs estão na orientação direta ou reversa. Em certas modalidades, as duas RRSs estão posicionadas em orientações opostas.

[00109] Em certas modalidades, um marcador de seleção pode ser uma fosfotransferase de aminoglicosídeo (APH) (por exemplo, fosfotransferase de higromicina (HYG), neomicina e G418 APH), diidrofolato redutase (DHFR), timidina quinase (TK), glutamina sintetase (GS), asparagina sintetase, triptofano sintetase (indol), histidinol desidrogenase (histidinol D) e genes que codificam resistência à puromicina, blasticidina, bleomicina, fleomicina, cloranfenicol, zeocina ou ácido micofenólico. Em certas modalidades, um marcador de seleção pode ser um GFP, um eGFP, um GFP sintético, um YFP, um eYFP, um CFP, um mPlum, um mCherry, um tdTomato, um mStrawberry, um vermelho J, um monômero DsRed, um marcador mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, mCFPm, Cerulean ou T-Sapphire. Em certas modalidades, o marcador de seleção pode ser uma construto de fusão compreendendo pelo menos dois marcadores de seleção. Em certas modalidades, o gene que codifica um marcador de seleção ou um fragmento do marcador de seleção pode ser fundido ao gene que codifica um marcador de seleção diferente ou um fragmento deste.

[00110] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende dois marcadores de seleção flanqueados por duas RRSs, em que um primeiro marcador de seleção é diferente de um segundo marcador de seleção. Em certas modalidades, os dois marcadores de seleção são ambos selecionados do grupo que consiste em um marcador de seleção de glutamina sintetase, um marcador de seleção de timidina quinase, um marcador de seleção de HYG e um marcador de seleção de resistência à puromicina. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende um marcador de seleção de timidina quinase e um marcador de seleção de HYG.

Em certas modalidades, o primeiro marcador de seleção é selecionado do grupo que consiste em uma fosfotransferase de aminoglicosídeo (APH) (por exemplo, fosfotransferase de higromicina (HYG), neomicina e G418 APH), diidrofolato redutase (DHFR), timidina quinase (TK), glutamina sintetase (GS), asparagina sintetase, triptofano sintetase (indol), histidinol desidrogenase (histidinol D) e genes que codificam resistência à puromicina, blasticidina, bleomicina, fleomicina, cloromfenicol, zeocina e ácido micofenólico e o segundo marcador de seleção é selecionado do grupo que consiste em um GFP, um eGFP, um GFP sintético, um YFP, um eYFP, um CFP, um mPlum, um mCherry, um tdTomato, um mStrawberry, um J-red, um monômero DsRed, um mOrange, um mKO, um mCitrine, um Venus, um YPet, um Emerald, um CyPet, um mCFPm, um Cerulean e um T-Sapphire. Em certas modalidades, o primeiro marcador de seleção é um marcador de seleção de glutamina sintetase e o segundo marcador de seleção é um marcador de GFP. Em certas modalidades, as duas RRSs que flanqueiam os dois marcadores de seleção são as mesmas. Em certas modalidades, as duas RRSs que flanqueiam os dois marcadores de seleção são diferentes.

[00111] Em certas modalidades, o marcador de seleção está operacionalmente ligado a uma sequência promotora. Em certas modalidades, o marcador de seleção está operacionalmente ligado a um promotor de SV40.

Em certas modalidades, o marcador de seleção está operacionalmente ligado a um promotor de Citomegalovírus (CMV).

[00112] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende pelo menos um marcador de seleção e um IRES, em que o IRES está operacionalmente ligado ao marcador de seleção. Em certas modalidades, o marcador de seleção operacionalmente ligado ao IRES é selecionado do grupo que consiste em um GFP, um eGFP, um GFP sintético, um YFP, um eYFP, um CFP, um mPlum, um mCherry, um tdTomato, um mStrawberry, um vermelho J, um monômero DsRed, um marcador mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, mCFPm, Cerulean e um T- Sapphire. Em certas modalidades, o marcador de seleção operacionalmente ligado ao IRES é um marcador de GFP. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende um IRES e dois marcadores de seleção flanqueados por duas RRSs, em que o IRES está operacionalmente ligado ao segundo marcador de seleção. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende um IRES e três marcadores de seleção flanqueados por duas RRSs, em que o IRES está operacionalmente ligado ao terceiro marcador de seleção. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende um IRES e três marcadores de seleção flanqueados por duas RRSs, em que o IRES está operacionalmente ligado ao terceiro marcador de seleção. Em certas modalidades, o terceiro marcador de seleção é diferente do primeiro ou do segundo marcador de seleção. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende um primeiro marcador de seleção operacionalmente ligado a um promotor e um segundo marcador de seleção operacionalmente ligado a um IRES. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende um marcador de seleção de glutamina sintetase operacionalmente ligado a um promotor SV40 e um marcador de seleção de GFP operacionalmente ligado a um IRES. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende um marcador de seleção de timidina quinase e um marcador de seleção de HYG operacionalmente ligado a um promotor de CMV e um marcador de seleção de GFP operacionalmente ligado a um IRES.

[00113] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende pelo menos três RRSs. Em certas modalidades, a terceira RRS está localizada entre a primeira e a segunda RRS. Em certas modalidades, todas as três RRSs são as mesmas. Em certas modalidades, a primeira e a segunda RRS são as mesmas, e a terceira RRS é diferente da primeira ou da segunda RRS. Em certas modalidades, todas as três RRSs são heteroespecíficas.

3.2 Sequências de Interesse (SOIs)

[00114] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende pelo menos uma SOI exógena. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende pelo menos um marcador de seleção, pelo menos uma SOI exógena e pelo menos uma RRS.

Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito ou mais SOIs. Em certas modalidades, as SOIs são as mesmas. Em certas modalidades, as SOIs são diferentes.

[00115] Em certas modalidades, a SOI codifica um anticorpo de cadeia única ou fragmento deste. Em certas modalidades, a SOI codifica uma sequência de cadeia pesada de anticorpo ou fragmento desta. Em certas modalidades, a SOI codifica uma sequência de cadeia leve de anticorpo ou fragmento desta. Em certas modalidades, uma sequência nucleotídica exógena integrada compreende uma SOI que codifica uma sequência de cadeia pesada de anticorpo ou fragmento desta e uma SOI que codifica uma sequência de cadeia leve de anticorpo ou um fragmento desta. Em certas modalidades, uma sequência nucleotídica exógena integrada compreende uma SOI que codifica uma primeira sequência de cadeia pesada de anticorpo ou fragmento desta, uma SOI que codifica uma segunda sequência de cadeia pesada de anticorpo ou fragmento desta e uma SOI que codifica uma sequência de cadeia leve de anticorpo ou fragmento desta. Em certas modalidades, uma sequência nucleotídica exógena integrada compreende uma SOI que codifica uma primeira sequência de cadeia pesada de anticorpo ou fragmento desta, uma SOI que codifica uma segunda sequência de cadeia pesada de anticorpo ou fragmento desta, uma SOI que codifica uma primeira sequência de cadeia leve de anticorpo ou fragmento desta e uma segunda SOI que codifica uma sequência de cadeia leve de anticorpo ou fragmento desta. Em certas modalidades, o número de SOIs que codificam para sequências de cadeia pesada e leve pode ser selecionada para atingir um nível de expressão desejado dos polipeptídeos de cadeia pesada e leve, por exemplo, para atingir uma quantidade desejada de produção de anticorpo biespecífico. Em certas modalidades, as SOIs individuais que codificam sequências de cadeia pesada e leve podem ser integradas, por exemplo, em uma única sequência de ácido nucleico exógeno presente em um único sítio de integração, em várias sequências de ácido nucleico exógenas presentes em um único sítio de integração ou em várias sequências de ácido nucleico exógenas integradas em sítios de integração distintos na célula hospedeira TI.

[00116] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende pelo menos um marcador de seleção, pelo menos uma SOI exógena e uma RRS. Em certas modalidades, a RRS está localizada adjacente a pelo menos um marcador de seleção ou pelo menos uma SOI exógena. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende pelo menos um marcador de seleção, pelo menos uma SOI exógena e duas RRSs. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena localizados entre a primeira e a segunda RRS. Em certas modalidades, as duas RRSs que flanqueiam o marcador de seleção e a SOI exógena são as mesmas. Em certas modalidades, as duas RRSs que flanqueiam o marcador de seleção e a SOI exógena são diferentes. Em certas modalidades, a primeira RRS flanqueadora é uma sequência LoxP L3 e a segunda RRS flanqueadora é uma sequência LoxP 2L. Em certas modalidades, uma sequência L3 LoxP está localizada 5' do marcador de seleção e da SOI exógena, e uma sequência LoxP 2L está localizada 3' do marcador de seleção da SOI exógena.

[00117] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende três RRSs e duas SOIs exógenas, e a terceira RRS está localizada entre a primeira e a segunda RRS. Em certas modalidades, a primeira SOI está localizada entre a primeira e a terceira RRS, e a segunda SOI está localizada entre a terceira e a segunda RRS. Em certas modalidades, a primeira e a segunda SOI são diferentes. Em certas modalidades, a primeira e a segunda RRS são as mesmas, e a terceira RRS é diferente da primeira ou da segunda RRS. Em certas modalidades, todas as três RRSs são heteroespecíficas. Em certas modalidades, a primeira RRS é um sítio LoxP L3, a segunda RRS é um sítio LoxP 2L e a terceira RRS é um sítio LoxFas. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende três RRSs, uma SOI exógena e um marcador de seleção. Em certas modalidades, a SOI está localizada entre a primeira e a terceira RRS, e o marcador de seleção está localizado entre a terceira e a segunda RRS. Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende três RRSs, duas SOIs exógenas e um marcador de seleção. Em certas modalidades, a primeira SOI e o marcador de seleção estão localizados entre a primeira e a terceira RRS, e a segunda SOI está localizada entre a terceira e a segunda RRS.

[00118] Em certas modalidades, a SOI exógena codifica um polipeptídeo de interesse. Estes polipeptídeos de interesse podem ser selecionados do grupo, incluindo, mas não limitado a, um anticorpo, uma enzima, uma citocina, um fator de crescimento, um hormônio, uma proteína viral, uma proteína bacteriana, uma proteína de vacina ou uma proteína com função terapêutica. Em certas modalidades, a SOI exógena codifica um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste. Em certas modalidades, a SOI exógena codifica um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc. Em certas modalidades, a SOI exógena (ou SOIs) codifica um anticorpo padrão. Em certas modalidades, a SOI exógena (ou SOIs) codifica um meio-anticorpo, por exemplo, mas não limitado a, anticorpos B, Q, T e mAb I da presente divulgação. Em certas modalidades, a SOI exógena (ou SOIs) codifica um anticorpo complexo. Em certas modalidades, o anticorpo complexo pode ser um anticorpo biespecífico, por exemplo, mas não limitado a, Molécula Biespecífica A, Molécula Biespecífica B, Molécula Biespecífica C ou Molécula Biespecífica D da presente divulgação. Em certas modalidades, a SOI exógena está operacionalmente ligada a pelo menos um elemento de ação cis, por exemplo, um promotor ou um intensificador. Em certas modalidades, a SOI exógena está operacionalmente ligada a um promotor de CMV.

[00119] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende duas RRSs e pelo menos duas SOIs exógenas localizadas entre as duas RRSs. Em certas modalidades, SOIs que codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo estão localizadas entre as duas RRSs. Em certas modalidades, SOIs que codificam uma cadeia pesada e duas cadeias leves de um anticorpo estão localizadas entre as duas RRSs. Em certas modalidades, SOIs que codificam combinações diferentes de cópias de cadeia pesada e de cadeia leve de um anticorpo estão localizadas entre as duas RRSs.

[00120] Em certas modalidades, a sequência nucleotídica exógena integrada compreende três RRSs e pelo menos duas SOIs exógenas, e a terceira RRS está localizada entre a primeira e a segunda RRS. Em certas modalidades, pelo menos uma SOI está localizada entre a primeira e a terceira RRS, e pelo menos uma SOI está localizada entre a terceira e a segunda RRS. Em certas modalidades, a primeira e a segunda RRS são as mesmas, e a terceira RRS é diferente da primeira ou da segunda RRS. Em certas modalidades, todas as três RRSs são heteroespecíficas. Em certas modalidades, as SOIs que codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um primeiro anticorpo estão localizadas entre a primeira e a terceira RRS, e SOIs que codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um segundo anticorpo estão localizados entre a terceira e a segunda RRS. Em certas modalidades, as SOIs que codificam uma cadeia pesada e duas cadeias leves de um primeiro anticorpo estão localizadas entre a primeira e a terceira RRS, e SOIs que codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um segundo anticorpo estão localizadas entre a terceira RRS e a segunda RRS. Em certas modalidades, as SOIs que codificam uma cadeia pesada e três cadeias leves de um primeiro anticorpo estão localizadas entre a primeira e a terceira RRS, e SOIs que codificam uma cadeia leve do primeiro anticorpo e uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um segundo anticorpo estão localizadas entre a terceira RRS e a segunda RRS. Em certas modalidades, as SOIs que codificam uma cadeia pesada e três cadeias leves de um primeiro anticorpo estão localizadas entre a primeira e a terceira RRS, e SOIs que codificam duas cadeias leves do primeiro anticorpo e uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um segundo anticorpo estão localizadas entre a terceira RRS e a segunda RRS. Em certas modalidades, as SOIs que codificam diferentes combinações de cópias de cadeias pesadas e cadeias leves de vários anticorpos estão localizadas entre a primeira e a terceira RRS e entre a terceira e a segunda RRS.

[00121] Em certas modalidades, o número de SOIs é selecionado para aumentar o título e/ou a produtividade específica das células hospedeiras que expressam as SOIs. Por exemplo, mas não como limitação, a incorporação de duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais SOIs pode resultar em aumento do título e/ou produtividade específica.

[00122] No contexto da expressão de anticorpos, a inclusão de uma SOI adicional que codifica cadeias leves ou pesadas pode resultar em um título aumentado e/ou produtividade específica. Por exemplo, mas não como limitação, ao aumentar o número de cópias de uma cadeia pesada e uma cadeia leve (HL) para uma cadeia pesada e duas sequências de codificação da cadeia leve (HLL), um aumento no título e/ou produtividade específica pode ser alcançado. Da mesma forma, conforme descrito nos exemplos abaixo, o aumento de HLL (três SOIs) para HLL-HL (cinco SOIs) ou HLL-HLL (seis SOIs) pode fornecer um aumento no título e/ou produtividade específica. Além disso, aumentar o número de cópias para HLL-HL (cinco SOIs) ou HLL-HLHL (sete SOIs) pode fornecer um aumento no título e/ou produtividade específica. Opções adicionais para números de cópias de SOI de cadeia pesada e leve incluem, mas não estão limitadas a HHL; HHL-H; HLL-H; HHL-HH; HHL-HL; HHL-LL; HLL-HH; HLL-HL; HLL-LL; HHL-HHL; HHL-HHH; HHL-HLL; HHK-LLL; HLL-HHL; HLL- HHH; HLL-LLL; HHL-HHHL; HHL-HHHH; HHL-HHLL; HHL-HLLL; HHL-LLLL; HLL-HHHL; HLL-HHHH; HLL-HLLL; e HLL-LLLL. Em certas modalidades, a inclusão de cópias adicionais ocorre em um único locus genômico, enquanto em certas modalidades as cópias de SOI podem ser integradas em dois ou mais loci, por exemplo, várias cópias podem ser integradas em um único locus e uma ou mais cópias integradas em um ou mais loci adicionais.

[00123] Em certas modalidades, a posição das SOIs, por exemplo, se uma SOI está localizada 3' ou 5' em relação a outra SOI, é selecionada para aumentar o título e/ou a produtividade específica das células hospedeiras que expressam as SOIs. Por exemplo, mas não como limitação, no contexto da produção de anticorpos, a posição integrada das SOIs das cadeias pesada e leve pode resultar em aumento do título e/ou produtividade específica. Conforme descrito nas Figuras 23A-D e nos exemplos apresentados abaixo, a posição relativa das SOIs de cadeia pesada e leve pode impactar o título e a produtividade específica, apesar de nenhuma alteração no número de cópias da SOI.

4. Células Hospedeiras

[00124] O objeto aqui divulgado também fornece uma célula hospedeira adequada para integração direcionada de sequências nucleotídicas e expressão de polipeptídeos de interesse. Em certas modalidades, uma célula hospedeira compreende um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2 e sequências pelo menos 50% homólogas a ele ou um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus compreende uma sequência nucleotídica que é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-7 e sequências pelo menos 50% homólogas a esta.

[00125] Em certas modalidades, uma célula hospedeira é uma célula hospedeira eucariótica. Em certas modalidades, uma célula hospedeira é uma célula hospedeira de mamífero. Em certas modalidades, uma célula hospedeira é uma célula hospedeira de hamster, uma célula hospedeira humana, uma célula hospedeira de rato ou uma célula hospedeira de camundongo. Em certas modalidades, uma célula hospedeira é uma célula hospedeira de ovário de hamster chinês (CHO), uma célula hospedeira CHO K1, uma célula hospedeira CHO K1SV, uma célula hospedeira DG44, uma célula hospedeira DUKXB-11, uma célula hospedeira CHOK1S ou uma Célula hospedeira CHO K1M.

[00126] Em certas modalidades, uma célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste na linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7), linhagem renal embrionária humana (células 293 ou 293, conforme descrito, por exemplo, em Graham et al., J. Gen Virol.

36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK), células de Sertoli de camundongo (células TM4, conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol.

Reprod. 23: 243-251 (1980)), células renais de macaco (CV1), células renais de macaco verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical humano (HELA), células renais caninas (MDCK; células hepáticas de ratos búfalos (BRL 3A)), células pulmonares humanas (W138), células hepáticas humanas (Hep G2), tumor mamário de camundongo (MMT 060562), células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather et al., Annals NY Acad. Sci. 383: 44-68 (1982), células MRC 5, células FS4, células Y0, células NS0, células Sp2/0 e células PER.C6®.

[00127] Em certas modalidades, uma célula hospedeira é uma linhagem celular. Em certas modalidades, uma célula hospedeira é uma linhagem celular que foi cultivada por um certo número de gerações. Em certas modalidades, uma célula hospedeira é uma célula primária.

[00128] Em certas modalidades, a expressão de um polipeptídeo de interesse é estável se o nível de expressão for mantido em certos níveis, aumentar ou diminuir menos de 20%, ao longo de 10, 20, 30, 50, 100, 200 ou 300 gerações. Em certas modalidades, a expressão de um polipeptídeo de interesse é estável se a cultura puder ser mantida sem nenhuma seleção. Em certas modalidades, a expressão de um polipeptídeo de interesse é alta se o produto polipeptídico do gene de interesse atingir cerca de 1 g/L, cerca de 2 g/L, cerca de 3 g/L, cerca de 4 g/L, cerca de 5 g/L, cerca de 10 g/L, cerca de 12 g/L, cerca de 14 g/L ou cerca de 16g/L.

[00129] O objeto aqui divulgado também se refere a um método para produzir um polipeptídeo de interesse. Em certas modalidades, tal método compreende: a) fornecer uma célula hospedeira que compreende pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um marcador de seleção flanqueado por duas RRSs integradas dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 1-7; e b) cultivar a célula em a) sob condições adequadas para expressar a SOI e recuperar um polipeptídeo de interesse a partir disso. Em certas modalidades, tal método compreende: a) fornecer uma célula hospedeira que compreende pelo menos duas SOIs exógenas e pelo menos um marcador de seleção integrado dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre SEQ ID Nos 1-7, em que pelo menos uma SOI exógena e um marcador de seleção são flanqueados por uma primeira e uma terceira RRSs e pelo menos uma SOI exógena é flanqueada por uma segunda e a terceira RRSs; e b) cultivar a célula em a) sob condições adequadas para expressar a SOI e recuperar um polipeptídeo de interesse a partir disso. Em certas modalidades, tal método compreende: a) fornecer uma célula hospedeira que compreende pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um marcador de seleção flanqueado por duas

RRSs integradas dentro de um gene exógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, e pelo menos cerca de 90% de sequências homólogas dos mesmos; e b) cultivar a célula em a) sob condições adequadas para expressar a SOI e recuperar um polipeptídeo de interesse a partir disso. Em certas modalidades, tal método compreende: a) fornecer uma célula hospedeira que compreende pelo menos duas SOIs exógenas e pelo menos um marcador de seleção integrados dentro de um gene exógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, e sequências de pelo menos cerca de 90% homólogas aos mesmos, em que pelo menos uma SOI exógena e um marcador de seleção é flanqueado por uma primeira e uma terceira RRS e pelo menos uma SOI exógena é flanqueada por uma segunda e a terceira RRS; e b) cultivar a célula em a) sob condições adequadas para expressar a SOI e recuperar um polipeptídeo de interesse a partir disso.

[00130] Em certas modalidades, o polipeptídeo de interesse é produzido e secretado para o meio de cultura de células. Em certas modalidades, o polipeptídeo de interesse é expresso e retido dentro da célula hospedeira. Em certas modalidades, o polipeptídeo de interesse é expresso, inserido e retido na membrana da célula hospedeira.

[00131] Os nucleotídeos exógenos de interesse ou vetores podem ser introduzidos em uma célula hospedeira por métodos convencionais de biologia celular, incluindo, entre outros, transfecção, transdução, eletroporação ou injeção. Em certas modalidades, os nucleotídeos exógenos de interesse ou vetores são introduzidos em uma célula hospedeira por métodos de transfecção com base química compreendendo o método de transfecção com base em lipídios, método de transfecção com base em fosfato de cálcio, método de transfecção com base em polímero catiônico ou transfecção com base em nanopartículas. Em certas modalidades, nucleotídeos exógenos de interesse são introduzidos em uma célula hospedeira por transdução mediada por vírus, incluindo, mas não se limitando a, lentivírus, retrovírus, adenovírus ou transdução mediada por vírus adeno-associado. Em certas modalidades, nucleotídeos exógenos de interesse ou vetores são introduzidos em uma célula hospedeira por injeção mediada por biobalística. Em certas modalidades, ambas as moléculas de DNA e RNA são introduzidas em uma célula hospedeira usando métodos descritos neste documento.

5. Integração Direcionada

[00132] Uma integração direcionada permite que sequências nucleotídicas exógenas sejam integradas em um ou mais sítios predeterminados de um genoma da célula hospedeira. Em certas modalidades, a integração direcionada é mediada por uma recombinase que reconhece uma ou mais RRSs.

Em certas modalidades, a integração direcionada é mediada por recombinação homóloga. Em certas modalidades, a integração direcionada é mediada por uma nuclease específica de sítio exógeno seguida por HDR e/ou NHEJ.

5.1 Integração direcionada via recombinação mediada por recombinase

[00133] Uma "sequência de reconhecimento de recombinação" (RRS) é uma sequência nucleotídica reconhecida por uma recombinase e é necessária e suficiente para eventos de recombinação mediados por recombinase. Uma RRS pode ser usada para definir a posição em que um evento de recombinação ocorrerá em uma sequência nucleotídica.

[00134] Em certas modalidades, uma RRS pode ser selecionada do grupo que consiste em uma sequência LoxP, uma sequência LoxP L3, uma sequência LoxP 2L, uma sequência LoxFas, uma sequência Lox511, uma sequência Lox2272, uma sequência Lox2372, uma sequência Lox5171, uma sequência Loxm2, uma sequência Lox71, uma sequência Lox66, uma sequência

FRT, uma sequência Bxb1 attP, uma sequência Bxb1 attB, uma sequência φC31 attP e uma sequência φC31 attB.

[00135] Em certas modalidades, uma RRS pode ser reconhecida por uma recombinase Cre. Em certas modalidades, uma RRS pode ser reconhecida por uma recombinase FLP. Em certas modalidades, uma RRS pode ser reconhecida por uma integrase Bxb1. Em certas modalidades, uma RRS pode ser reconhecida por uma integrase φC31.

[00136] Em certas modalidades, quando a RRS é um sítio LoxP, a célula hospedeira requer que a recombinase Cre realize a recombinação. Em certas modalidades, quando a RRS é um sítio FRT, a célula hospedeira requer que a recombinase FLP realize a recombinação. Em certas modalidades, quando a RRS é um sítio Bxb1 attP ou Bxb1 attB, a célula hospedeira requer que a integrase Bxb1 realize a recombinação. Em certas modalidades, quando a RRS é um sítio φC31 attP ou φC31attB, a célula hospedeira requer que a integrase φC31 realize a recombinação. As recombinases podem ser introduzidas em uma célula hospedeira usando um vetor de expressão compreendendo sequências de codificação das enzimas.

[00137] O sistema de recombinação específica do sítio Cre-LoxP tem sido amplamente usado em muitos sistemas experimentais biológicos. O Cre é uma recombinase de DNA específica do sítio de 38 kDa que reconhece sequências LoxP de 34 bp. O Cre é derivado da bacteriofase P1 e pertence à recombinase específica do sítio da família de tirosina. A recombinase Cre pode mediar a recombinação intra e intermolecular entre as sequências LoxP. A sequência LoxP é composta por uma região de núcleo não palindrômica de 8 bp flanqueada por duas repetições invertidas de 13 bp. A recombinase Cre se liga se à repetição de 13 bp, mediando assim a recombinação na região de núcleo de 8 bp. A recombinação mediada por Cre-LoxP ocorre com alta eficiência e não requer nenhum outro fator hospedeiro. Se duas sequências LoxP forem colocadas na mesma orientação na mesma sequência nucleotídica, a recombinação mediada por Cre consumirá sequências de DNA localizadas entre as duas sequências LoxP como um círculo fechado covalentemente. Se duas sequências LoxP forem colocadas em uma posição invertida na mesma sequência nucleotídica, a recombinação mediada por Cre inverterá a orientação das sequências de DNA localizadas entre as duas sequências. As sequências LoxP também podem ser colocadas em diferentes cromossomos para facilitar a recombinação entre diferentes cromossomos. Se duas sequências LoxP estiverem em duas moléculas de DNA diferentes e se uma molécula de DNA for circular, a recombinação mediada por Cre resultará na integração da sequência de DNA circular.

[00138] Em certas modalidades, uma sequência LoxP é uma sequência LoxP do tipo selvagem. Em certas modalidades, uma sequência LoxP é uma sequência LoxP mutante. As sequências LoxP mutantes foram desenvolvidas para aumentar a eficiência da integração ou substituição mediada por Cre. Em certas modalidades, uma sequência LoxP mutante é selecionada do grupo que consiste em uma sequência LoxP L3, uma sequência LoxP 2L, uma sequência LoxFas, uma sequência Lox511, uma sequência Lox2272, uma sequência Lox2372, uma sequência Lox5171, uma sequência Loxm2, uma sequência Lox71, e uma sequência Lox66. Por exemplo, a sequência Lox71 tem 5 bp mutados na repetição esquerda de 13 bp. A sequência Lox66 tem 5 bp mutados na repetição direita de 13 bp. As sequências LoxP do tipo selvagem e mutante podem mediar a recombinação dependente de Cre.

[00139] O sistema de recombinação específica do sítio FLP-FRT é semelhante ao sistema Cre-Lox. Isso envolve a recombinase flippase (FLP), que é derivada do plasmídeo de 2 µm da levedura Saccharomyces cerevisiae. FLP também pertence à recombinase específica do sítio da família de tirosina. A sequência FRT é uma sequência de 34 bp que consiste em duas sequências palindrômicas de 13 bp, cada uma flanqueando um espaçador de 8 bp. A FLP se liga às sequências palindrômicas de 13 bp e media a quebra, troca e ligação do DNA no espaçador de 8 bp. Semelhante à recombinase Cre, a posição e orientação das duas sequências FRT determinam o resultado da recombinação mediada por FLP. Em certas modalidades, uma sequência FRT é uma sequência FRT do tipo selvagem. Em certas modalidades, uma sequência FRT é uma sequência FRT mutante. As sequências FRT do tipo selvagem e mutante podem mediar a recombinação dependente de FLP. Em certas modalidades, uma sequência FRT é fundida com uma sequência de domínio receptor responsivo, tal como, mas não limitado a, uma sequência de domínio receptor responsivo a tamoxifeno.

[00140] Bxb1 e φC31 pertencem à família serina recombinase.

Ambas são derivadas de bacteriófagos e são usadas por esses bacteriófagos para estabelecer lisogenia para facilitar a integração específica do sítio do genoma do fago no genoma bacteriano. Estas integrases catalisam eventos de recombinação específicos do sítio entre substratos de DNA curtos (40-60 bp) denominados sequências attP e attB que são originalmente sítios de ligação localizados no DNA do fago e no DNA bacteriano, respectivamente. Após a recombinação, são formadas duas novas sequências, denominadas sequências attL e attR e cada uma contém meias sequências derivadas de attP e attB.

Também pode ocorrer recombinação entre sequências attL e attR para extrair o fago integrado do DNA bacteriano. Ambas as integrases podem catalisar a recombinação sem o auxílio de fatores hospedeiros adicionais. Na ausência de fatores acessórios, essas integrase mediam a recombinação unidirecional entre attP e attB com eficiência superior a 80%. Devido às curtas sequências de DNA que podem ser reconhecidas por essas integrase e a recombinação unidirecional, esses sistemas de recombinação foram desenvolvidos como um complemento aos sistemas Cre-LoxP e FRT-FLP amplamente usados para fins de engenharia genética.

[00141] Os termos “RRSs correspondentes” e “RRSs homoespecíficos” indicam que ocorre uma recombinação entre duas RRSs. Em certas modalidades, as duas RRSs correspondentes são as mesmas. Em certas modalidades, ambas as RRSs são sequências LoxP do tipo selvagem. Em certas modalidades, ambas as RRSs são sequências LoxP mutantes. Em certas modalidades, ambas as RRSs são sequências FRT do tipo selvagem. Em certas modalidades, ambas as RRSs são sequências FRT mutantes. Em certas modalidades, as duas RRSs correspondentes são sequências diferentes, mas podem ser reconhecidas pela mesma recombinase. Em certas modalidades, a primeira RRS correspondente é uma sequência Bxb1 attP e a segunda RRS correspondente é uma sequência Bxb1 attB. Em certas modalidades, a primeira RRS correspondente é uma sequência φC31 attB e a segunda RRS correspondente é uma sequência φC31 attB.

[00142] Em certas modalidades, uma sequência nucleotídica exógena integrada compreende duas RRSs e um vetor compreende duas RRSs correspondentes às duas RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada, ou seja, a primeira RRS na sequência nucleotídica exógena integrada corresponde à primeira RRS no vetor e a segunda RRS na sequência nucleotídica exógena integrada corresponde à segunda RRS no vetor. Em certas modalidades, a primeira RRS na sequência nucleotídica exógena integrada e a primeira RRS no vetor são as mesmas que a segunda RRS na sequência nucleotídica exógena integrada e a segunda RRS no vetor. Um exemplo não limitativo dessa estratégia de “RMCE de vetor único” é apresentado na Figura 2A. Em certas modalidades, a primeira RRS na sequência nucleotídica exógena integrada e a primeira RRS no vetor são diferentes da segunda RRS na sequência nucleotídica exógena integrada e a segunda RRS no vetor. Em certas modalidades, a primeira RRS na sequência nucleotídica exógena integrada e a primeira RRS no vetor são ambas as sequências LoxP L3, e a segunda RRS na sequência nucleotídica exógena integrada e a segunda RRS no vetor são ambas as sequências LoxP 2L.

[00143] Em certas modalidades, uma estratégia de "RMCE de dois vetores" é empregada. Por exemplo, mas não como limitação, uma sequência nucleotídica exógena integrada pode compreender três RRSs, por exemplo, um arranjo em que a terceira RRS ("RRS3") está presente entre a primeira RRS ("RRS1") e a segunda RRS ("RRS2"), enquanto um primeiro vetor compreende duas RRSs correspondentes à primeira e terceira RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e um segundo vetor compreende duas RRSs correspondentes à terceira e segunda RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada. Um exemplo de uma estratégia de RMCE de dois vetores é ilustrado na Figura 4. Nesse exemplo, RRS1, RRS2 e RRS3 são heteroespecíficas, por exemplo, elas não apresentam reação cruzada entre si. Em algumas modalidades, um vetor (frontal) compreende a RRS1, uma primeira SOI e um promotor seguido por um códon de iniciação e RRS3 (nesta ordem). O outro vetor (traseiro) compreende a RRS3 fundida com a sequência de codificação de um marcador sem o códon de iniciação (ATG), uma SOI 2 e a RRS2 (nesta ordem). Nucleotídeos adicionais podem ser inseridos entre o sítio de RRS3 e a sequência do marcador de seleção para garantir a tradução na estrutura para proteína de fusão. Em algumas modalidades, a primeira SOI codifica um anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc. Em algumas modalidades, a segunda SOI codifica um anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc. Em certas modalidades, os anticorpos codificados pela primeira e segunda SOIs emparelham para formar um anticorpo multiespecífico, por exemplo, biespecífico.

[00144] Tais estratégias de RMCE de dois vetores permitem a introdução de oito ou mais SOIs, incorporando o número apropriado de SOIs entre cada par de RRSs.

[00145] Tanto a RMCE de vetor único quanto de dois vetores permite a integração unidirecional de uma ou mais moléculas de DNA doador em um sítio predeterminado de um genoma da célula hospedeira e a troca precisa de um cassete de DNA presente no DNA doador com um cassete de DNA no genoma hospedeiro em que o sítio de integração reside. Os cassetes de DNA são caracterizados por duas RRSs heteroespecíficas que flanqueiam pelo menos um marcador de seleção (embora em certos exemplos de RMCE de dois vetores um "marcador de seleção dividido" possa ser usado conforme descrito neste documento) e/ou pelo menos uma SOI exógena. A RMCE envolve eventos cruzados de recombinação dupla, catalisados por uma recombinase, entre as duas RRSs heteroespecíficas dentro do locus genômico alvo e a molécula de DNA doador. A RMCE foi projetada para introduzir uma cópia da SOI ou marcador de seleção no locus predeterminado de um genoma da célula hospedeira. Ao contrário da recombinação que envolve apenas um evento cruzado, a RMCE pode ser implementada de modo que as sequências de vetor procariótico não sejam introduzidas no genoma da célula hospedeira, reduzindo e/ou impedindo o desencadeamento indesejado dos mecanismos imunológicos ou de defesa do hospedeiro. O procedimento de RMCE pode ser repetido com vários cassetes de DNA.

[00146] Em certas modalidades, a integração direcionada é alcançada por um evento de recombinação cruzada, em que uma sequência nucleotídica exógena compreendendo uma RRS adjacente a pelo menos uma SOI exógena ou pelo menos um marcador de seleção é integrado a um sítio predeterminado de um genoma da célula hospedeira. Em certas modalidades, a integração direcionada é alcançada por uma RMCE, em que um cassete de DNA compreendendo pelo menos uma SOI exógena ou pelo menos um marcador de seleção flanqueado por duas RRSs heteroespecíficas é integrado em um sítio predeterminado de um genoma da célula hospedeira. Em certas modalidades, a integração direcionada é alcançada por duas RMCEs, em que dois cassetes de DNA diferentes, cada um compreendendo pelo menos uma SOI exógena ou pelo menos um marcador de seleção flanqueado por duas RRSs heteroespecíficas, são ambos integrados em um sítio predeterminado de um genoma da célula hospedeira. Em certas modalidades, a integração direcionada é alcançada por múltiplas RMCEs, em que os cassetes de DNA de múltiplos vetores, cada um compreendendo pelo menos uma SOI exógena ou pelo menos um marcador de seleção flanqueado por duas RRSs heteroespecíficas, são integrados em um sítio predeterminado de um genoma da célula hospedeira. Em certas modalidades, o marcador de seleção pode ser parcialmente codificado no primeiro vetor e parcialmente codificado no segundo vetor, de modo que a integração de ambas as RMCEs permita a expressão do marcador de seleção.

Um exemplo de um tal sistema é apresentado na Figura 4.

[00147] Em certas modalidades, a integração direcionada via recombinação mediada por recombinase leva a um marcador de seleção ou a uma ou mais SOIs exógenas integradas em um ou mais sítios de integração predeterminados de um genoma da célula hospedeira, juntamente com sequências de um vetor procariótico. Em certas modalidades, a integração direcionada via recombinação mediada por recombinase leva ao marcador de seleção ou uma ou mais SOIs exógenas integradas em um ou mais sítios de integração predeterminados de um genoma da célula hospedeira livre de sequências de um vetor procariótico.

5.2 Integração direcionada via recombinação homóloga, HDR ou NHEJ

[00148] O objeto aqui divulgado também se refere à integração direcionada mediada por recombinação homóloga ou por uma nuclease específica do sítio exógeno seguida por HDR ou NHEJ.

[00149] A recombinação homóloga é uma recombinação entre moléculas de DNA que compartilham extensa homologia de sequência. Isso pode ser usado para direcionar o reparo sem erros de quebras de DNA de fita dupla e gera variação de sequência nos gametas durante a meiose. Como a recombinação homóloga envolve a troca de informações genéticas entre duas moléculas de DNA homólogas, ela não altera o arranjo geral dos genes em um cromossomo. Durante a recombinação homóloga, um corte ou quebra se forma no DNA de fita dupla (dsDNA), seguido pela invasão de uma molécula de dsDNA homóloga por uma extremidade de DNA de fita simples, emparelhamento de sequências homólogas, migração de ramificação para formar uma junção Holliday e resolução final da junção Holliday.

[00150] A quebra de fita dupla (DSB) é a forma mais grave de dano ao DNA e o reparo desse dano ao DNA é essencial para a manutenção da integridade do genoma em todos os organismos. Existem duas principais vias de reparo para reparar DSBs. A primeira via de reparo é a via de reparo direcionado à homologia (HDR) e a recombinação homóloga é a forma mais comum de HDR.

Como o HDR exige a presença de DNA homólogo presente na célula, essa via de reparo é normalmente ativa na fase S e G2 do ciclo celular, em que as cromátides irmãs recém-replicadas estão disponíveis como modelos homólogos.

O HDR também é uma principal via de reparo para reparar os garfos de replicação recolhidos durante a replicação do DNA. O HDR é considerado uma via de reparo relativamente sem erros. A segunda via de reparo para DSBs é a junção da extremidade não homóloga (NHEJ). NHEJ é uma via de reparo em que as extremidades de um DNA quebrado são ligadas entre si sem a necessidade de um modelo de DNA homólogo.

[00151] A integração direcionada pode ser facilitada por nucleases específicas de sítios exógenos seguidas por HDR. Isto é devido ao fato de que a frequência da recombinação homóloga pode ser aumentada através da introdução de um DSB em um sítio genômico alvo específico. Em certas modalidades, uma nuclease exógena pode ser selecionada do grupo que consiste em uma nuclease dedo de zinco (ZFN), um dímero de ZFN, uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma proteína de fusão com domínio de efetor TAL, uma endonuclease de DNA guiada por RNA, uma meganuclease manipulada e uma endonuclease (Cas) associada a repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR).

[00152] Os sistemas CRISPR/Cas e TALEN são duas ferramentas de edição de genoma que oferecem a melhor facilidade de construção e alta eficiência. O CRISPR/Cas foi identificado como um mecanismo de defesa imunológica de bactérias contra bacteriófagos invasores. Cas é uma nuclease que, quando guiada por um RNA guia sintético (gRNA), é capaz de se associar a uma sequência nucleotídica específica em uma célula e editar o DNA na mesma ou em torno dessa sequência nucleotídica, por exemplo, criando um ou mais de uma quebra de cadeia única, um DSB e/ou uma mutação de ponto.

TALEN é uma nuclease específica do sítio manipulada, composta pelo domínio de ligação ao DNA do TALE (efetores do tipo ativador da transcrição) e pelo domínio catalítico da endonuclease de restrição FokI. Alterando os aminoácidos presentes na região de resíduo altamente variável dos monômeros do domínio de ligação ao DNA, diferentes TALENs artificiais podem ser criados para atingir várias sequências nucleotídicas. O domínio de ligação ao DNA subsequentemente direciona a nuclease para as sequências alvo e cria um DSB.

[00153] A integração direcionada via recombinação homóloga ou HDR envolve a presença de sequências homólogas no sítio de integração. Em certas modalidades, as sequências homólogas estão presentes em um vetor.

Em certas modalidades, as sequências homólogas estão presentes em um polinucleotídeo.

[00154] Em certas modalidades, um vetor para integração direcionada de sequências nucleotídicas exógenas em uma célula hospedeira compreende sequências nucleotídicas homólogas a um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2, ou a uma sequência selecionada a partir das SEQ ID Nos. 1-7, flanqueando pelo menos um marcador de seleção. Em certas modalidades, um vetor para integração direcionada de sequências nucleotídicas exógenas em uma célula hospedeira compreende sequências nucleotídicas homólogas a um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2, ou a uma sequência selecionada a partir das SEQ ID Nos. 1-7, flanqueando pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena. Em certas modalidades, um vetor para integração direcionada de sequências nucleotídicas em uma célula hospedeira compreende sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a uma sequência selecionada das SEQ ID Nos. 1-7 que flanqueiam um cassete de DNA, em que o cassete de DNA compreende pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena flanqueada por duas RRSs. Em certas modalidades, um vetor para integração direcionada de sequências nucleotídicas exógenas em uma célula hospedeira compreende sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2 flanqueando um cassete de DNA, em que o cassete de DNA compreende pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena flanqueada por duas RRSs. Em certas modalidades, as sequências nucleotídicas vetoriais são pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,9% homólogas a um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2 ou a uma sequência selecionada das SEQ ID Nos. 1-7. Em certas modalidades, o vetor é selecionado do grupo que consiste em um vetor adenoviral, um vetor de vírus adeno-associado, um vetor lentiviral, um vetor retroviral, um vetor de fago de integração, um vetor não viral, um transposon e/ou vetor de transposase, um substrato de integrase e um plasmídeo.

[00155] Em certas modalidades, um polinucleotídeo para integração direcionada de sequências nucleotídicas exógenas em uma célula hospedeira compreende sequências nucleotídicas homólogas a um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2, ou a uma sequência selecionada a partir das SEQ ID Nos. 1-7, flanqueando pelo menos um marcador de seleção. Em certas modalidades, um polinucleotídeo para integração direcionada de sequências nucleotídicas exógenas em uma célula hospedeira compreende sequências nucleotídicas homólogas a um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2, ou a uma sequência selecionada a partir das SEQ ID Nos. 1-7, flanqueando pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena. Em certas modalidades, um polinucleotídeo para integração direcionada de sequências nucleotídicas em uma célula hospedeira compreende sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a uma sequência selecionada das SEQ ID Nos. 1- 7 que flanqueiam um cassete de DNA, em que o cassete de DNA compreende pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena flanqueada por duas RRSs. Em certas modalidades, um polinucleotídeo para integração direcionada de sequências nucleotídicas exógenas em uma célula hospedeira compreende sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2 flanqueando um cassete de DNA, em que o cassete de DNA compreende pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena flanqueada por duas RRSs. Em certas modalidades, as sequências nucleotídicas flanqueadoras são pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,9% homólogas a um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e XP_003512331.2 ou a uma sequência selecionada das SEQ ID Nos. 1-7.

[00156] Em certas modalidades, a recombinação homóloga é realizada sem nenhum fator acessório. Em certas modalidades, a recombinação homóloga é facilitada pela presença de vetores que são capazes de integração.

Em certas modalidades, um vetor de integração é selecionado do grupo que consiste em um vetor de vírus adeno-associado, um vetor lentiviral, um vetor retroviral e um vetor de fago de integração.

5.3 Integração Direcionada Regulada

[00157] Existem muitos casos em que os níveis de expressão de proteínas não são ideais principalmente porque as proteínas codificadas são difíceis de expressar. O baixo nível de expressão de proteínas difíceis de expressar pode ter causas diversas e difíceis de identificar. Uma possibilidade é a toxicidade das proteínas expressas nas células hospedeiras. Nesses casos, um sistema de expressão regulado pode ser usado para expressar proteínas tóxicas, onde as sequências de interesse que codificam as proteínas estão sob o controle de um promotor induzível. Nesses sistemas, a expressão das proteínas difíceis de expressar é solicitada apenas quando um regulador, por exemplo, molécula pequena, tal como, sem limitação, tetraciclina ou seu análogo doxiciclina (DOX), é adicionado à cultura. A regulação da expressão de proteínas tóxicas pode aliviar os efeitos tóxicos, permitindo que as culturas atinjam o crescimento celular desejado antes da produção. Em certas modalidades, um sistema de integração de alvo regulado (RTI) compreende uma SOI que é integrada a um locus específico, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico exógena compreendendo uma ou mais RRSs e é transcrita sob um promotor regulado operacionalmente ligado ao mesmo. Em certas modalidades, um sistema RTI pode ser usado para determinar as causas subjacentes da baixa expressão de proteína para uma molécula difícil de expressar, tal como, mas não limitado a, um anticorpo. Em certas modalidades, a capacidade de desativar seletivamente a expressão de uma SOI em um sistema RTI pode ser usada para vincular a expressão de uma SOI a um efeito adverso observado.

[00158] Em certas modalidades, para minimizar os efeitos da variabilidade da transcrição e da linhagem celular durante a análise da principal causa de moléculas difíceis de expressar, um sistema de integração de alvo regulado (RTI) pode ser usado. Por exemplo, mas sem limitação, a expressão da SOI em um hospedeiro de TI pode ser desencadeada pela adição à cultura de um regulador, por exemplo, doxiciclina. Em certas modalidades, o vetor RTI utiliza um promotor regulado pela tetraciclina para expressar a SOI, que pode ser integrada a, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico exógena compreendendo uma RRS, que é por si só integrada a um sítio de integração no genoma da célula hospedeira, permitindo a expressão regulada da SOI.

[00159] Em certas modalidades, o sistema RTI descrito na presente divulgação pode ser usado para determinar com êxito as causas subjacentes da baixa expressão de proteína de uma SOI, por exemplo, um anticorpo terapêutico, em comparação com a linhagem de células de controle.

Em certas modalidades, uma vez que a expressão relativa mais baixa de uma SOI, por exemplo, um anticorpo terapêutico, em uma linhagem celular RTI é confirmada, os níveis de acumulação e secreção intracelular da SOI podem ser avaliados alavancando os tratamentos inibidores da tradução de proteínas, por exemplo, Dox e cicloheximida.

5.4 Sistemas regulados

[00160] O objeto aqui divulgado também se refere a sistemas regulados para uso em TI. Por exemplo, mas sem limitação, essa regulação pode ser baseada em trocas de genes para bloquear ou ativar a síntese de mRNA por acoplamento regulado de repressores ou ativadores de transcricionais a promotores constitutivos ou mínimos. Em certas modalidades não limitativas, a repressão pode ser alcançada ligando as proteínas repressoras, por exemplo, onde as proteínas bloqueiam estericamente a iniciação transcricional, ou reprimindo ativamente a transcrição através de silenciadores transcricionais. Em certas modalidades não limitativas, a ativação de promotores mínimos sem intensificador de mamíferos ou virais pode ser alcançada pelo acoplamento regulado a um domínio de ativação.

[00161] Em certas modalidades, o acoplamento condicional de repressores ou ativadores transcricionais pode ser alcançado usando proteínas alostéricas que se ligam aos promotores em resposta a estímulos externos. Em certas modalidades, o acoplamento condicional de repressores ou ativadores transcricionais pode ser alcançado usando receptores intracelulares que são liberados a partir de proteínas sequestrantes e, portanto, podem se ligar a promotores alvo. Em certas modalidades, o acoplamento condicional de repressores ou ativadores transcricionais pode ser alcançado usando dimerizadores induzidos quimicamente.

[00162] Em certas modalidades, as proteínas alostéricas usadas nos sistemas de TI da presente divulgação podem ser proteínas que modulam a atividade transcricional em resposta a antibióticos, mensageiros bacterianos com detecção de quorum, catabolitos ou aos parâmetros de cultivo, como temperatura, por exemplo, frio ou calor. Em certas modalidades, esses sistemas de RTI podem ser baseados em catabolito, por exemplo, onde um repressor bacteriano que controla genes catabólicos para fontes alternativas de carbono foi transferido para células de mamíferos. Em certas modalidades, a repressão do promotor alvo pode ser alcançada pela ligação responsiva ao cumate do repressor CymR. Em certas modalidades, o sistema à base de catabolito pode depender da ativação de promotores quiméricos pela ligação responsiva à 6- hidroxinicotina do repressor procariótico HdnoR, fundido ao domínio de transativação de Herpes simples VP16.

[00163] Em certas modalidades, o sistema de TI pode ser um sistema de expressão baseado em sensor de quorum originado de procariontes que gerenciam a comunicação intra e interpopulacional por moléculas de detecção de quorum. Essas moléculas de detecção de quorum se ligam aos receptores nas células alvo, modulam a afinidade dos receptores aos promotores cognatos, levando ao início de trocas específicas de regulon. Em certas modalidades, a molécula de detecção de quorum pode ser a lactona de N-(3- oxo-octanoil)-homoserina na presença da qual a proteína de fusão TraR-p65 ativa a expressão de um promotor mínimo fundido à sequência do operador específico de TraR. Em certas modalidades, a molécula de detecção de quorum pode ser a butirolactona SCB1 (2-(1'-hidroxi-6-metil-heptil)-3-(hidroximetil)- butanolídeo racêmico) em um sistema baseado no repressor Streptomyces coelicolor A3(2) ScbR que liga seu operador cognato OScbR na ausência do SCB1. Em certas modalidades, a molécula de detecção de quorum pode ser indutores derivados de homoserina usados em um sistema de RTI em que os repressores de detecção de quorum de Pseudomonas aeruginosa RhlR e LasR são fundidos à sequência de localização nuclear do antígeno T SV40 e ao domínio Herpes simples VP16 e podem ativar promotores contendo sequências específicas de operadores (caixas las).

[00164] Em certas modalidades, as moléculas indutoras que modulam as proteínas alostéricas usadas nos sistemas de RTI da presente divulgação podem ser, mas não estão limitadas a, cumate, isopropil-β-D- galactopiranosídeo (IPTG), macrolídeos, 6-hidroxinicotina, doxiciclina, estreptograminas, NADH, tetraciclina.

[00165] Em certas modalidades, os receptores intracelulares usados nos sistemas de RTI da presente divulgação podem ser receptores citoplasmáticos ou nucleares. Em certas modalidades, os sistemas de RTI da presente divulgação podem utilizar a liberação de fatores de transcrição de sequestrar e inibir proteínas usando moléculas pequenas. Em certas modalidades, os sistemas de RTI da presente divulgação podem depender da regulação de esteroides, em que um receptor hormonal é fundido a um fator de transcrição natural ou artificial que pode ser liberado do HSP90 no citosol, migrar para o núcleo e ativar promotores selecionados. Em certas modalidades, podem ser utilizados receptores mutantes que são regulados por análogos de esteroides sintéticos, a fim de evitar interferência por hormônios esteroides endógenos. Em certas modalidades, os receptores podem ser uma variante do receptor de estrogênio responsiva ao 4-hidroxitamoxifeno ou um mutante do receptor de progesterona induzível por RU486. Em certas modalidades, a troca de transcrição responsiva à rosiglitazona derivada do receptor nuclear com base no receptor γ ativado por proliferador de peroxissomo nuclear humano (PPARγ) pode ser usada nos sistemas de RTI da presente divulgação. Em certas modalidades, uma variante de receptores responsivos a esteroides pode ser o RheoSwitch, que é baseado em um receptor de ecdisona Choristoneura fumiferana modificado e no receptor X de retinoide de camundongo (RXR)

fundido ao domínio de ligação ao DNA Gal4 e ao trans-ativador VP16. Na presença de ecdisona sintética, a variante RheoSwitch pode se ligar e ativar um promotor mínimo fundido a várias repetições do elemento de resposta Gal4.

[00166] Em certas modalidades, os sistemas de RTI divulgados neste documento podem utilizar a dimerização induzida quimicamente de uma proteína de ligação ao DNA e um ativador transcricional para a ativação de um promotor mínimo de núcleo fundido com um operador cognato. Em certas modalidades, os sistemas de RTI divulgados neste documento podem utilizar a dimerização regulada por rapamicina de FKBP com FRB. Neste sistema, o FRB é fundido ao trans-ativador p65 e o FKBP é fundido a um domínio de dedo de zinco específico para sítios de operadores cognatos colocados a montante de um promotor mínimo de interleucina-12 manipulado. Em certas modalidades, o FKBP pode ser mutado. Em certas modalidades, os sistemas de RTI divulgados neste documento podem utilizar a subunidade bacteriana da girase B (GyrB), em que GyrB dimeriza na presença do antibiótico coumermicina e se dissocia com novobiocina.

[00167] Em certas modalidades, os sistemas de RTI da presente divulgação podem ser utilizados para a expressão de siRNA regulado. Em certas modalidades, o sistema de expressão de siRNA regulado pode ser uma tetraciclina, um macrolídeo ou um sistema QuoRex do tipo OFF e ON. Em certas modalidades, o sistema de RTI pode utilizar um elemento de oligopirimidina terminal Xenopus (TOP), que bloqueia a iniciação da tradução, formando estruturas de hairpin na região não traduzida 5'.

[00168] Em certas modalidades, os sistemas de RTI descritos na presente divulgação podem utilizar expressão controlada em fase gasosa, por exemplo, o sistema de regulação induzida por acetaldeído (AIR). O sistema AIR pode empregar o fator de transcrição AlcR Aspergillus nidulans, que ativa especificamente o promotor PAIR montado por operadores específicos de AlcR fundidos ao promotor mínimo de citomegalovírus humano na presença de acetaldeído gasoso ou líquido em concentrações não tóxicas.

[00169] Em certas modalidades, os sistemas de RTI da presente divulgação podem utilizar um sistema Tet-On ou Tet-Off. Em tais sistemas, a expressão de uma ou mais SOIs pode ser regulada pela tetraciclina ou seu análogo, doxiciclina.

[00170] Em certas modalidades, o sistema de RTI da presente divulgação pode utilizar um sistema PIP-on ou PIP-off. Em tais sistemas, a expressão de SOIs pode ser regulada por, por exemplo, pristinamicina, tetraciclina e/ou eritromicina.

6. Preparação e Uso de Células Hospedeiras TI

[00171] O objeto aqui divulgado refere-se a métodos para a integração direcionada de sequências nucleotídicas exógenas em uma célula hospedeira. Em certas modalidades, os métodos referem-se à integração de uma sequência nucleotídica exógena em uma célula hospedeira para produzir uma célula hospedeira adequada para subsequente integração direcionada de uma SOI. Em certas modalidades, os referidos métodos compreendem recombinação mediada por recombinase. Em certas modalidades, os referidos métodos envolvem recombinação homóloga, HDR e/ou NHEJ.

6.1 Preparação de células hospedeiras TI usando recombinação mediada por recombinase

[00172] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI para expressar um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo às SEQ ID Nos. 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende duas RRSs, flanqueando pelo menos um primeiro marcador de seleção; b) introduzir na célula fornecida em a) um vetor que compreende duas RRSs correspondentes às duas RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs; e d) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para isolar assim uma célula hospedeira TI que expressa o polipeptídeo.

[00173] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI para expressar um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, e pelo menos cerca de 90% de sequências homólogas dos mesmos, em que a sequência nucleotídica exógena compreende duas RRSs, flanqueando pelo menos um primeiro marcador de seleção; b) introduzir na célula fornecida em a) um vetor que compreende duas RRSs correspondentes às duas RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs; e d) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para isolar assim uma célula hospedeira TI que expressa o polipeptídeo.

[00174] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI para expressar um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira TI, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo às SEQ ID Nos. 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende um primeiro cassete de DNA compreendendo duas RRSs heteroespecíficas, flanqueando pelo menos um primeiro marcador de seleção; b) introduzir na célula fornecida em a) um vetor que compreende um segundo cassete de DNA compreendendo duas RRSs heteroespecíficas correspondentes às duas RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs e realiza um RMCE; e d) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para isolar assim uma célula hospedeira TI que expressa o polipeptídeo.

[00175] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI para expressar um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, e pelo menos cerca de 90% de sequências homólogas dos mesmos, em que a sequência nucleotídica exógena compreende um primeiro cassete de DNA compreendendo duas RRSs heteroespecíficas, flanqueando pelo menos um primeiro marcador de seleção; b) introduzir na célula fornecida em a) um vetor que compreende um segundo cassete de DNA compreendendo duas RRSs heteroespecíficas correspondentes às duas RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs e realiza um RMCE; e d) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para isolar assim uma célula hospedeira TI que expressa o polipeptídeo.

[00176] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI para expressar um primeiro e um segundo polipeptídeo de interesse (em que o primeiro e o segundo polipeptídeos podem ser iguais ou diferentes) que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo às SEQ ID Nos. 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira e uma segunda RRSs que flanqueiam pelo menos um primeiro marcador de seleção e uma terceira RRS localizada entre a primeira e a segunda RRSs, e todas as RRSs são heteroespecíficas; b) introduzir na célula fornecida em a) um primeiro vetor que compreende duas RRSs correspondentes à primeira e à terceira RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e que flanqueia pelo menos uma primeira SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir na célula fornecida em a) um segundo vetor que compreende duas RRSs correspondentes à segunda e à terceira RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e que flanqueia pelo menos uma segunda SOI exógena; d) introduzir uma ou mais recombinases, em que a uma ou mais recombinases reconhecem as RRSs; e e) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para, assim, isolar uma célula hospedeira TI que expressa o primeiro e o segundo polipeptídeos de interesse. Em certas modalidades, em vez de ter todo o marcador de seleção no primeiro vetor, o primeiro vetor compreende uma sequência promotora operacionalmente ligada ao códon ATG posicionado flanqueado a montante pela primeira SOI e a jusante por uma RRS; e o segundo vetor compreende um marcador de seleção sem um códon de iniciação da transcrição ATG flanqueado a montante por uma RRS e a jusante pela segunda SOI.

[00177] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece um métodos para preparar células hospedeiras TI para expressar um primeiro e um segundo polipeptídeo de interesse (em que o primeiro e o segundo polipeptídeos podem ser iguais ou diferentes) que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI compreendendo uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um gene exógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, e pelo menos cerca de 90% de sequências homólogas dos mesmos, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira e uma segunda RRS flanqueando pelo menos um primeiro marcador de seleção, e uma terceira RRS localizada entre a primeira e a segunda RRS, e todas as RRSs são heteroespecíficas; b) introduzir na célula fornecida em a) um primeiro vetor compreendendo duas RRSs correspondentes à primeira e a terceira RRS na sequência nucleotídica exógena integral e flanquear pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir a célula fornecida em a) em um segundo vetor compreendendo duas RRSs correspondentes à segunda e terceira RRS na sequência nucleotídica exógena integrada e flanquear pelo menos uma segunda SOI exógena; d) introduzir uma ou mais recombinases, em que uma ou mais recombinases reconhecem as RRSs; e e) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para, portanto, isolar uma célula TI que expressa o primeiro e o segundo polipeptídeos de interesse. Em certas modalidades, em vez de ter todo o marcador de seleção no primeiro vetor, o primeiro vetor compreende uma sequência promotora operacionalmente ligada ao códon ATG posicionado flanqueado a montante pela primeira SOI e a jusante por uma RRS; e o segundo vetor compreende um marcador de seleção sem um códon de iniciação da transcrição ATG flanqueado a montante por uma RRS e a jusante pela segunda

SOI.

[00178] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI para expressar um primeiro e um segundo polipeptídeo de interesse (em que o primeiro e o segundo polipeptídeos podem ser iguais ou diferentes) que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo às SEQ ID Nos. 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende um primeiro cassete de DNA que compreende uma primeira e uma segunda RRSs que flanqueiam pelo menos um primeiro marcador de seleção e uma terceira RRS localizada entre a primeira e a segunda RRSs, e todas as três RRSs são heteroespecíficas; b) introduzir na célula fornecida em a) um primeiro vetor que compreende um segundo cassete de DNA, em que o segundo cassete de DNA compreende duas RRSs heteroespecíficas correspondentes à primeira e à terceira RRSs do primeiro cassete de DNA e que flanqueia pelo menos uma primeira SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir na célula fornecida em a) um segundo vetor que compreende duas RRSs correspondentes à segunda e à terceira RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e que flanqueia pelo menos uma segunda SOI exógena; d) introduzir uma ou mais recombinases, em que a uma ou mais recombinases reconhecem as RRSs e realiza dois RMCEs; e e) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para, assim, isolar uma célula hospedeira TI que expressa o primeiro e o segundo polipeptídeos de interesse. Em certas modalidades, em vez de ter todo o marcador de seleção no primeiro vetor, o primeiro vetor compreende uma sequência promotora operacionalmente ligada ao códon ATG posicionado flanqueado a montante pela primeira SOI e a jusante por uma RRS; e o segundo vetor compreende um marcador de seleção sem um códon de iniciação da transcrição ATG flanqueado a montante por uma RRS e a jusante pela segunda SOI.

[00179] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI para expressar um primeiro e um segundo polipeptídeo de interesse (em que o primeiro e o segundo polipeptídeos podem ser iguais ou diferentes) que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI compreendendo uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um gene exógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas aos mesmos, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira e uma segunda RRS flanqueando pelo menos um primeiro marcador de seleção e uma terceira RRS localizada entre a primeira e a segunda RRSs, e todas as três RRSs são heteroespecíficas; b) introduzir na célula fornecida em a) um primeiro vetor que compreende um segundo cassete de DNA, em que o segundo cassete de DNA compreende duas RRSs heteroespecíficas correspondentes à primeira e à terceira RRSs do primeiro cassete de DNA e que flanqueia pelo menos uma primeira SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir na célula fornecida em a) um segundo vetor que compreende um terceiro cassete de DNA, em que o terceiro cassete de DNA compreende duas RRSs correspondentes à segunda e à terceira RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e que flanqueia pelo menos uma segunda SOI exógena; d) introduzir uma ou mais recombinases, em que a uma ou mais recombinases reconhecem as RRSs e realiza dois RMCEs; e e) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para, assim, isolar uma célula hospedeira TI que expressa o primeiro e o segundo polipeptídeos de interesse. Em certas modalidades, em vez de ter todo o marcador de seleção no primeiro vetor, o primeiro vetor compreende uma sequência promotora operacionalmente ligada ao códon ATG posicionado flanqueado a montante pela primeira SOI e a jusante por uma RRS; e o segundo vetor compreende um marcador de seleção sem um códon de iniciação da transcrição ATG flanqueado a montante por uma RRS e a jusante pela segunda SOI.

[00180] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI para expressar um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID Nos.

1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma RRS adjacente a pelo menos um primeiro marcador de seleção; b) introduzir na célula fornecida em a) um vetor que compreende uma RRS correspondente à RRS na sequência nucleotídica exógena integrada e adjacente a pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs; e d) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para isolar assim uma célula hospedeira TI que expressa o polipeptídeo.

[00181] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI para expressar um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas aos mesmos, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma RRS adjacente a pelo menos um primeiro marcador de seleção; b) introduzir na célula fornecida em a) um vetor que compreende uma RRS correspondente à RRS na sequência nucleotídica exógena integrada e adjacente a pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs; e d) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para isolar assim uma célula hospedeira TI que expressa o polipeptídeo.

[00182] O objeto aqui divulgado também se refere a métodos de produção de um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI descrita neste documento; b) cultivar a célula hospedeira TI em a) sob condições adequadas para expressar a SOI e recuperar um polipeptídeo de interesse a partir da mesma.

[00183] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI adequadas para subsequente integração direcionada que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID Nos. 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende duas RRSs, flanqueando pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um primeiro marcador de seleção; b) introduzir na célula fornecida em a) um vetor que compreende duas RRSs correspondentes às duas RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs; e d) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para isolar assim uma célula hospedeira TI adequada para subsequente integração direcionada.

[00184] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI adequadas para subsequente integração direcionada que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas aos mesmos, em que a sequência nucleotídica exógena compreende duas RRSs, flanqueando pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um primeiro marcador de seleção; b) introduzir na célula fornecida em a) um vetor que compreende duas RRSs correspondentes às duas RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs; e d) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para isolar assim uma célula hospedeira TI adequada para subsequente integração direcionada.

[00185] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI adequadas para subsequente integração direcionada que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID Nos. 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira e uma segunda RRS, flanqueando pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um primeiro marcador de seleção; b) introduzir na célula fornecida em a) um vetor que compreende três RRSs, em que a primeira RRS do vetor corresponde à primeira RRS na sequência nucleotídica exógena integrada, a segunda RRS do vetor corresponde à segunda RRS na sequência nucleotídica exógena integrada, e pelo menos um segundo marcador de seleção localizado entre a primeira e a segunda RRS; c) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece a primeira e a segunda RRS tanto no vetor quanto na sequência nucleotídica exógena integrada; e d) selecionar células hospedeiras TI que expressam o segundo marcador de seleção para isolar assim uma célula hospedeira TI adequada para subsequente integração direcionada.

[00186] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI adequadas para subsequente integração direcionada que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas aos mesmos, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira e uma segunda RRS, flanqueando pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um primeiro marcador de seleção; b) introduzir na célula fornecida em a) um vetor que compreende três RRSs, em que a primeira RRS do vetor corresponde à primeira RRS na sequência nucleotídica exógena integrada, a segunda RRS do vetor corresponde à segunda RRS na sequência nucleotídica exógena integrada, e pelo menos um segundo marcador de seleção localizado entre a primeira e a segunda RRS; c) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece a primeira e a segunda RRS tanto no vetor quanto na sequência nucleotídica exógena integrada; e d) selecionar células hospedeiras TI que expressam o segundo marcador de seleção para isolar assim uma célula hospedeira TI adequada para subsequente integração direcionada.

6.2 Métodos para modificação direcionada de uma célula hospedeira usando recombinação homóloga, HDR ou NHEJ

[00187] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI para expressar um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo às SEQ ID Nos. 1-7; b) introduzir um vetor na célula hospedeira TI, em que o vetor compreende sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID Nos. 1- 7 que flanqueiam um cassete de DNA, em que o cassete de DNA compreende pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena; c) selecionar para o marcador de seleção para isolar uma célula hospedeira TI com a SOI integrada no locus do genoma e expressar o polipeptídeo de interesse.

Em certas modalidades, o cassete de DNA do vetor compreende ainda pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena flanqueada por duas RRSs.

[00188] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI para expressar um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID Nos. 1-7; b) introduzir um polinucleotídeo na célula hospedeira, em que o polinucleotídeo compreende sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID Nos. 1-7 que flanqueiam um cassete de DNA, em que o cassete de DNA compreende pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena; c) selecionar para o marcador de seleção para isolar uma célula hospedeira TI com a SOI integrada no locus do genoma e expressar o polipeptídeo de interesse. Em certas modalidades, o cassete de DNA do vetor compreende ainda pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena flanqueada por duas RRSs.

[00189] Em certas modalidades, a recombinação homóloga é facilitada por um vetor de integração. Em certas modalidades, um vetor é selecionado do grupo que consiste em um vetor adenoviral, um vetor de vírus adeno-associado, um vetor lentiviral, um vetor retroviral, um vetor de fago de integração, um vetor não viral, um transposon e/ou vetor de transposase, um substrato de integrase e um plasmídeo. Em certas modalidades, o transposon pode ser um sistema de transposon PiggyBac (PB).

[00190] Em certas modalidades, a integração é promovida por uma nuclease exógena. Em certas modalidades, a nuclease exógena é selecionada do grupo que consiste em uma nuclease dedo de zinco (ZFN), um dímero de ZFN, uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma proteína de fusão com domínio de efetor TAL, uma endonuclease de DNA guiada por RNA, uma meganuclease manipulada e uma endonuclease (Cas) associada a repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR).

[00191] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI adequadas para subsequente integração direcionada que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID Nos. 1-7; b) introduzir um vetor na célula hospedeira TI, em que o vetor compreende sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID Nos. 1-7 que flanqueiam um cassete de DNA, em que o cassete de DNA compreende pelo menos um marcador de seleção flanqueado por duas RRSs; c) selecionar para o marcador de seleção para isolar uma célula hospedeira TI adequada para subsequente integração direcionada.

[00192] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI adequadas para subsequente integração direcionada que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID Nos. 1-7; b) introduzir um polinucleotídeo na célula hospedeira TI, em que o polinucleotídeo compreende sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID Nos. 1-7 que flanqueiam um cassete de DNA, em que o cassete de DNA compreende pelo menos um marcador de seleção flanqueado por duas RRSs; c) selecionar para o marcador de seleção para isolar uma célula hospedeira TI adequada para subsequente integração direcionada.

[00193] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI adequadas para subsequente integração direcionada que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID Nos. 1-7; b) introduzir um vetor na célula hospedeira, em que o vetor compreende sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID Nos. 1-7 que flanqueiam um cassete de DNA, em que o cassete de DNA compreende três RRSs, em que a terceira RRS e pelo menos um marcador de seleção está localizado entre a primeira e a segunda RRS; e c) selecionar para o marcador de seleção para isolar uma célula hospedeira TI adequada para subsequente integração direcionada.

[00194] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar células hospedeiras TI adequadas para subsequente integração direcionada que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID Nos. 1-7; b) introduzir um polinucleotídeo na célula hospedeira, em que o polinucleotídeo compreende sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID Nos. 1-7 que flanqueiam um cassete de DNA, em que o cassete de DNA compreende três RRSs, em que a terceira RRS e pelo menos um marcador de seleção está localizado entre a primeira e a segunda RRS; e c) selecionar para o marcador de seleção para isolar uma célula hospedeira TI adequada para subsequente integração direcionada.

[00195] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar uma célula hospedeira TI que expressa pelo menos um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um ou mais loci do genoma da célula hospedeira TI, em que os um ou mais loci são pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre SEQ ID No. 1-7, em que a pelo menos uma sequência nucleotídica exógena compreende duas RRSs, flanqueando pelo menos um primeiro marcador de seleção; b) introduzir na célula fornecida em a) um vetor que compreende duas RRSs correspondentes às duas RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs; e selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para isolar assim uma célula hospedeira TI que expressa o pelo menos um polipeptídeo de interesse.

[00196] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar uma célula hospedeira TI que expressa pelo menos um primeiro e segundo polipeptídeos de interesse (em que o primeiro e o segundo polipeptídeos podem ser iguais ou diferentes) que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um ou mais loci do genoma da célula hospedeira, em que um ou mais loci são pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre SEQ ID Nos. 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira e uma segunda RRSs que flanqueiam pelo menos um primeiro marcador de seleção e uma terceira RRS localizada entre a primeira e a segunda RRSs, e todas as RRSs são heteroespecíficas; b) introduzir na célula fornecida em a) um primeiro vetor que compreende duas RRSs correspondentes à primeira e à terceira RRSs na pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada e que flanqueia pelo menos uma primeira SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir na célula fornecida em a) um segundo vetor que compreende duas RRSs correspondentes à segunda e à terceira RRSs na pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada e que flanqueia pelo menos uma segunda SOI exógena; d) introduzir uma ou mais recombinases, ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais recombinases, em que a uma ou mais recombinases reconhecem as RRSs; e e) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para, assim, isolar uma célula hospedeira TI que expressa os pelo menos um primeiro e segundo polipeptídeos de interesse. Em certas modalidades, em vez de ter todo o marcador de seleção no primeiro vetor, o primeiro vetor compreende uma sequência promotora operacionalmente ligada ao códon ATG posicionado flanqueado a montante pela primeira SOI e a jusante por uma RRS; e o segundo vetor compreende um marcador de seleção sem um códon de iniciação da transcrição ATG flanqueado a montante por uma RRS e a jusante pela segunda SOI.

[00197] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar uma célula hospedeira TI que expressa um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um ou mais loci do genoma da célula hospedeira TI, em que o um ou mais loci são pelo menos cerca de 90% homólogos a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID Nos. 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma ou mais RRSs; b) introduzir na célula fornecida em a) um vetor que compreende uma ou mais RRSs correspondentes a uma ou mais RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e que flanqueia pelo menos uma SOI exógena operacionalmente ligado a um promotor regulável; c) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs; e d) selecionar células TI que expressam a SOI exógena de interesse na presença de um indutor para isolar assim uma célula hospedeira TI que expressa o polipeptídeo de interesse.

[00198] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para expressar um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira que compreende pelo menos uma SOI exógena flanqueada por duas RRSs e um promotor regulável integrado dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homóloga a uma sequência selecionada dentre SEQ ID Nos. 1-7; e b) cultivar a célula sob condições adequadas para expressar a SOI e recuperar um polipeptídeo de interesse a partir disso.

[00199] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para preparar uma célula hospedeira TI que expressa um primeiro e segundo polipeptídeos de interesse (em que o primeiro e o segundo polipeptídeos podem ser iguais ou diferentes) que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre SEQ ID Nos. 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira, segunda RRSs e uma terceira RRS localizada entre a primeira e a segunda RRSs, e todas as RRSs são heteroespecíficas; b) introduzir na célula fornecida em a) um primeiro vetor que compreende duas RRSs correspondentes à primeira e à terceira RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e que flanqueia pelo menos uma primeira SOI exógena operacionalmente ligada a um promotor regulável; c) introduzir na célula fornecida em a) um segundo vetor que compreende duas RRSs correspondentes à segunda e à terceira RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e que flanqueia pelo menos uma segunda SOI operacionalmente ligada a um promotor regulável; d) introduzir uma ou mais recombinases, ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais recombinases, em que a uma ou mais recombinases reconhecem as RRSs; e e) selecionar células TI que expressam pelo menos a primeira e a segunda SOIs exógenas na presença de um indutor para, assim, isolar uma célula hospedeira TI que expressa os polipeptídeos de interesse. Em certas modalidades, em vez de ter todo o marcador de seleção no primeiro vetor, o primeiro vetor compreende uma sequência promotora operacionalmente ligada ao códon ATG posicionado flanqueado a montante pela primeira SOI e a jusante por uma RRS; e o segundo vetor compreende um marcador de seleção sem um códon de iniciação da transcrição ATG flanqueado a montante por uma RRS e a jusante pela segunda SOI.

7. Produtos

[00200] As células hospedeiras da presente divulgação podem ser usadas para a expressão de qualquer molécula de interesse, por exemplo, um polipeptídeo de interesse. Em certas modalidades, as células hospedeiras da presente divulgação podem ser usadas para a expressão de polipeptídeos, por exemplo, polipeptídeos de mamíferos. Exemplos não limitativos de tais polipeptídeos incluem hormônios, receptores, proteínas de fusão, fatores reguladores, fatores de crescimento, fatores do sistema de complemento, enzimas, fatores de coagulação, fatores anticoagulação, quinases, citocinas, proteínas CD, interleucinas, proteínas terapêuticas, proteínas de diagnóstico e anticorpos. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo terapêutico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo de diagnóstico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado.

[00201] Em certas modalidades, exemplos de polipeptídeos englobados na definição deste documento incluem polipeptídeos de mamíferos, tal como, por exemplo, renina; um hormônio de crescimento, incluindo o hormônio de crescimento humano e o hormônio de crescimento bovino; fator de liberação de hormônio de crescimento; hormônio da paratireoide; hormônio estimulante da tireoide; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadeia A de insulina; cadeia B de insulina; proinsulina; hormônio folículo-estimulante; calcitonina; hormônio luteinizante; glucagon; leptina; fatores de coagulação, como fator VIIIC, fator IX, fator tecidual e fator de von Willebrands; fatores anticoagulantes, como a proteína C; fator natriurético atrial; surfactante pulmonar; um ativador de plasminogênio, tal como uroquinase ou urina humana, ou um ativador de plasminogênio semelhante a um tecido (t-PA); bombesina; trombina; fator de crescimento hematopoiético; fator de necrose tumoral alfa e beta; um receptor de fator de necrose tumoral, tal como o receptor de morte 5 e CD120; ligante indutor de apoptose relacionado com TNF (TRAIL); antígeno de maturação de células B (BCMA); estimulador de linfócitos B (BLyS); um ligante indutor de proliferação (APRIL); encefalinase; RANTES (regulado na ativação normalmente expressa e secretada pelas células T); proteína inflamatória de macrófagos humanos (MIP-1-alfa); uma albumina de soro, tal como albumina de soro humano; substância inibidora do muelleriano; cadeia A de relaxina; cadeia B de relaxina; prorelaxina; peptídeo associado à gonadotropina de camundongo; uma proteína microbiana, tal como beta-lactamase; DNase; IgE; um antígeno associado a linfócitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inibina; ativina;

fator de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas (PD-ECGF);

proteína da família do fator de crescimento endotelial vascular (por exemplo,

VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e P1GF); uma proteína da família do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) (por exemplo, PDGF-A, PDGF-B,

PDGF-C, PDGF-D e dímeros das mesmas); família do fator de crescimento de fibroblastos (FGF), tais como aFGF, bFGF, FGF4 e FGF9; fator de crescimento epidérmico (EGF); receptores para hormônios ou fatores de crescimento, como um receptor(es) de VEGF (por exemplo, VEGFR1, VEGFR2 e VEGFR3),

receptor(es) do fator de crescimento epidérmico (EGF) (por exemplo, receptor de ErbB1, ErbB2, ErbB3 e ErbB4), receptor(es) do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) (por exemplo, PDGFR-α e PDGFR-β) e receptor(es) do fator de crescimento de fibroblastos; ligantes de TIE (Angiopoietinas, ANGPT1,

ANGPT2); receptor de Angiopoietina tal como TIE1 e TIE2; proteína A ou D;

fatores reumatoides; um fator neurotrófico, como fator neurotrófico derivado do osso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5 ou NT-6), ou um fator de crescimento nervoso tal como NGF-b; fator de crescimento transformante (TGF), tal como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-β1, TGF-β2,

TGF-β3, TGF-β4, ou TGF-β5; fator de crescimento semelhante a insulina I e II

(IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (IGFBPs); proteínas CD tais como CD3, CD4,

CD8, CD19 e CD20; eritropoietina; fatores osteoindutivos; imunotoxinas; uma proteína morfogenética óssea (BMP); uma quimiocina tal como CXCL12 e CXCR4; um interferon tal como interferon-alfa, -beta e -gama; fatores estimuladores de colônias (CSFs), por exemplo, M-CSF, GM-CSF, e G-CSF;

uma citocina tal como interleucinas (ILs), por exemplo, IL-1 a IL-10; midkine; superóxido dismutase; receptores de células T; proteínas de superfície de membrana; fator de aceleração de decaimento; antígeno viral tal como, por exemplo, uma porção do envelope do vírus da AIDS; proteínas transportadoras; receptores de endereçamento; adressinas; proteínas regulatórias; integrinas tal como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, uma ICAM, VLA-4 e VCAM; efrinas; Bv8; ligante semelhante a Delta 4 (DLL4); Del-1; BMP9; BMP10; Follistatin; fator de crescimento do Hepatótico (HGF)/fator de dispersão (SF); Alk1; Robo4; ESM1; Perlecam; domínio semelhante a EGF, múltiplo 7 (EGFL7); CTGF e membros de sua família; trombospondinas tais como trombospondina1 e trombospondina2; colágenos tais como colágeno IV e colágeno XVIII; neuropilinas tais como NRP1 e NRP2; Pleiotrofina (PTN); Progranulina; Proliferina; proteínas Notch tais como Notch1 e Notch4; semaforinas tais como Sema3A, Sema3C, e Sema3F; um antígeno associado com tumor tal como CA125 (antígeno do câncer de ovário); imunoadesinas; e fragmentos e/ou variantes de qualquer um dos polipeptídeos listados acima bem como anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpos, ligando-se a uma ou mais proteínas, incluindo, por exemplo, qualquer uma das proteínas listadas acima.

[00202] Em certas modalidades, o polipeptídeo de interesse é um polipeptídeo biespecífico, triespecífico ou multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Vários formatos moleculares para anticorpos multiespecíficos são conhecidos na técnica e estão incluídos neste documento (ver, por exemplo, Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106). Um tipo específico de anticorpos multiespecíficos, também incluídos neste documento, são anticorpos biespecíficos projetados para se ligarem simultaneamente a um antígeno de superfície em uma célula alvo, por exemplo, uma célula tumoral e a um componente ativador e invariante do complexo receptor de células T (TCR), tal como CD3, para redirecionar as células T para matar as células alvo. Outros exemplos de formatos de anticorpos biespecíficos incluem, mas não estão limitados a, moléculas chamadas "BiTE" (acoplador biespecífico ativador de células T) em que duas moléculas de scFv são fundidas por um ligante flexível (ver, por exemplo, WO 2004/106381, WO 2005/061547, WO 2007/042261, e WO 2008/119567, Nagorsen e Bäuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)); diacorpos (Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) e derivados dos mesmos, tais como diacorpos em tandem ("TandAb"; Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41- 56 (1999)); Moléculas "DART" (redirecionamento de dupla afinidade) que são baseadas no formato de diacorpo, mas apresentam uma ponte dissulfeto C- terminal para estabilização adicional (Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 (2010)) e os chamados triomabs, que são moléculas de IgG híbridas inteiras de camundongo/rato (revisadas em Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)). Formatos específicos de anticorpos biespecíficos para células T incluídos neste documento são descritos nos documentos WO 2013/026833, WO 2013/026839, WO 2016/020309; Bacac et al., Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498.

[00203] Em certas modalidades, as células hospedeiras da presente divulgação podem ser usadas para a expressão de chaperonas, enzimas modificadoras de proteínas, shRNA, gRNA ou outras proteínas ou peptídeos, enquanto expressam uma proteína ou molécula terapêutica de interesse constitutivamente ou regulada.

[00204] Em algumas modalidades, o polipeptídeo expresso pelas células hospedeiras da presente divulgação pode se ligar a, ou interagir com qualquer proteína, incluindo, sem limitação, citocinas, proteínas relacionadas a citocinas e receptores de citocinas selecionados do grupo que consiste em 8MPI, 8MP2, 8MP38 (GDFIO), 8MP4, 8MP6, 8MP8, CSFI (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGF1 (αFGF), FGF2 (βFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF1 0, FGF11, FGF12, FGF12B,

FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFN81, IFNG, IFNWI, FEL1, FEL1 (EPSELON), FEL1 (ZETA), IL 1A, IL 1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL1 0, IL 11, IL 12A, IL 12B, IL 13, IL 14, IL 15, IL 16, IL 17, IL 17B, IL 18, IL 19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBb3, LTA (TNF-β), LTB, TNF (TNF-α), TNFSF4 (ligante OX40), TNFSF5 (ligante CD40), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 ligante), TNFSF8 (ligante CD30), TNFSF9 (ligante 4-1 BB), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (Abril), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, IL1R1, IL1R2, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, IL10RA, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP (leptina), PTN e THPO.k.

[00205] Em algumas modalidades, o polipeptídeo expresso pelas células hospedeiras da presente divulgação pode se ligar a, ou interagir com, uma quimiocina, receptor de quimiocina ou uma proteína relacionada à quimiocina selecionada do grupo que consiste em CCLI (1-309), CCL2 (MCP - 1/MCAF), CCL3 (MIP-Iα), CCL4 (MIP-Iβ), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCL11 (eotaxina), CCL 13 (MCP-4), CCL 15 (MIP-Iδ), CCL 16 (HCC-4), CCL 17 (TARC), CCL 18 (PARC), CCL 19 (MDP-3b), CCL20 (MIP-3α), CCL21 (SLC/exodus-2), CCL22 (MDC/STC-1), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF- 2/eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaxina-3), CCL27 (CTACK/ILC), CCL28, CXCLI (GROI), CXCL2 (GR02), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL 10 (IP 10), CXCL 11 (1-TAC), CXCL 12 (SDFI), CXCL 13, CXCL 14, CXCL 16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL 1 (SCYDI), SCYEI, XCLI (linfotactina), XCL2 (SCM-Iβ), BLRI (MDR15), CCBP2

(D6/JAB61), CCRI (CKRI/HM145), CCR2 (mcp-IRB IRA), CCR3

(CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-

L3/STRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBII), CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR- L1),

CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), XCR1 (GPR5/CCXCR1),

CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCR10), GPR31,

GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6

(TYMSTR/STRL33/Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Rα), IL8RB (IL8Rβ), LTB4R

(GPR16), TCP10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6,

CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5, C5R1, CSF3, GRCC10 (C10), EPO, FY

(DARC), GDF5, HDF1, HDF1α, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2,

TLR4, TREM1, TREM2, e VHL.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo expresso pelas células hospedeiras da presente divulgação pode se ligar a, ou interagir com, 0772P (CA125, MUC16) (ou seja, antígeno do câncer de ovário),

ABCF1; ACVR1; ACVR1B; ACVR2; ACVR2B; ACVRL1; ADORA2A; Aggrecan;

AGR2; AICDA; AIF1; AIG1; AKAP1; AKAP2; AMH; AMHR2; beta amiloide;

ANGPTL; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOC1; AR;

ASLG659; ASPHD1 (domínio da aspartato beta-hidroxilase contendo 1;

LOC253982); AZGP1 (zinc-a-glicoproteína); B7.1; B7.2; BAD; BAFF-R (receptor do fator de ativação de célula B, BLyS receptor 3, BR3; BAG1; BAI1; BCL2;

BCL6; BDNF; BLNK; BLRI (MDR15); BMP1; BMP2; BMP3B (GDF10); BMP4;

BMP6; BMP8; BMPR1A; BMPR1B (receptor de proteína morfogenética óssea tipo IB); BMPR2; BPAG1 (plectina); BRCA1; Brevican; C19orf10 (IL27w); C3;

C4A; C5; C5R1; CANT1; CASP1; CASP4; CAV1; CCBP2 (D6/JAB61); CCL1 (1-

309); CCL11 (eotaxina); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP1δ); CCL16 (HCC-4);

CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3β); CCL2 (MCP-1); MCAF;

CCL20 (MIP-3α); CCL21 (MTP-2); SLC; exodus-2; CCL22 (MDC/STC-1); CCL23 (MPIF-1); CCL24 (MPIF-2/eotaxina-2); CCL25 (TECK); CCL26 (eotaxina-3);

CCL27 (CTACK/ILC); CCL28; CCL3 (MTP-Iα); CCL4 (MDP-Iβ); CCL5(RANTES);

CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNA1; CCNA2; CCND1; CCNE1; CCNE2;

CCR1 (CKRI /HM145); CCR2 (mcp-IRβ/RA);CCR3 (CKR/CMKBR3); CCR4;

CCR5 (CMKBR5/ChemR13); CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6); CCR7

(CKBR7/EBI1); CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-L1); CCR9 (GPR-9-6); CCRL1

(VSHK1); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CD1C; CD20; CD200; CD22

(isoforma do receptor CD22-B das células B); CD24; CD28; CD3; CD37; CD38;

CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72;

CD74; CD79A (CD79α, alfa associado à imunoglobulina, uma proteína específica de células B); CD79B; CDS; CD80; CD81; CD83; CD86; CDH1 (E-

caderina); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7;

CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKN1A

(p21/WAF1/Cip1); CDKN1B (p27/Kip1); CDKN1C; CDKN2A (P16INK4a);

CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CER1; CHGA; CHGB; Quitinase;

CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7;

CKLFSF8; CLDN3;CLDN7 (claudin-7); CLL-1 (CLEC12A, MICL, e DCAL2);

CLN3; CLU (clusterina); CMKLR1; CMKOR1 (RDC1); CNR1; COL 18A1;

COL1A1; COL4A3; COL6A1; fator D do complemento; CR2; CRP; CRIPTO (CR,

CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma); CSFI (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA4;

CTNNB1 (b-catenina); CTSB (catepsina B); CX3CL1 (SCYDI); CX3CR1 (V28);

CXCL1 (GRO1); CXCL10 (IP-10); CXCL11 (I-TAC/IP-9); CXCL12 (SDF1);

CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-

78/LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4;

CXCR5 (receptor 1 do linfoma de Burkitt, um receptor acoplado à proteína G);

CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo); CYB5; CYC1; CYSLTR1; DAB2IP; DES;

DKFZp451J0118; DNCLI; DPP4; E16 (LAT1, SLC7A5); E2F1; ECGF1; EDG1; EFNA1; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3;

EPHB4; EphB2R; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESR1; ESR2; ETBR

(receptor tipo B de endotelina); F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCER1A; FCER2;

FCGR3A; FcRH1 (proteína tipo receptor Fc 1); FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A

(proteína de âncora 1a do domínio SH2 contendo fosfatase), SPAP1B,

SPAP1C); FGF; FGF1 (αFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13;

FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22;

FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8;

FGF9; FGFR; FGFR3; FIGF (VEGFD); FELl (EPSILON); FILl (ZETA); FLJ12584;

FLJ25530; FLRTI (fibronectina); FLT1; FOS; FOSL1 (FRA-1); FY (DARC);

GABRP (GABAa); GAGEB1; GAGEC1; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5;

GDNF-Ra1 (receptor da família GDNF alfa 1; GFRA1; GDNFR; GDNFRA;

RETL1; TRNR1; RET1L; GDNFR-alfa1; GFR-ALFA-1); GEDA; GFI1; GGT1; GM-

CSF; GNASI; GNRHI; GPR2 (CCR10); GPR19 (receptor 19 acoplado à proteína

G; Mm.4787); GPR31; GPR44; GPR54 (KISS1 receptor; KISS1R; GPR54;

HOT7T175; AXOR12); GPR81 (FKSG80); GPR172A (receptor 172A acoplado à proteína G; GPCR41; FLJ11856; D15Ertd747e);GRCCIO (C10); GRP; GSN

(Gelsolina); GSTP1; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF;

HIF1A; HOP1; histamina e receptores de histamina; HLA-A; HLA-DOB (molécula de MHC classe II subunidade Beta (antígeno Ia); HLA-DRA; HM74; HMOXI;

HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; 1D2; IFN-a; IFNA1; IFNA2; IFNA4; IFNA5;

IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFNgama; DFNW1; IGBP1; IGF1; IGF1R; IGF2; IGFBP2;

IGFBP3; IGFBP6; IL-l; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B;

IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17;

IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; IL1A; IL1B; ILIF10;

IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HY1; IL1R1; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1;

IL1RAPL2; IL1RL1; IL1RL2, ILIRN; IL2; IL20; IL20Rα; IL21 R; IL22; IL-22c;

IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (glicoproteína

130); influenza A; influenza B; EL7; EL7R; EL8; IL8RA; DL8RB; IL8RB; DL9;

DL9R; DLK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAK1; IRTA2 (transferência de receptores de superfamília de imunoglobulina associada 2); ERAK2; ITGA1;

ITGA2; ITGA3; ITGA6 (a6 integrina); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b4 integrina);

heterodímeros de integrina α4β7 e αEβ7; JAG1; JAK1; JAK3; JUN; K6HF; KAI1;

KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLKIO; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15;

KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (Queratina 19); KRT2A;

KHTHB6 (queratina específica de cabelo tipo H); LAMAS; LEP (leptina); LGR5

(receptor 5 acoplado à proteína G contendo repetições ricas em leucina; GPR49,

GPR67); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTB4R (GPR16);

LTB4R2; LTBR; LY64 (antígeno do linfócito 64 (RP105), família da proteína de membrana tipo I da família de repetição rica em leucina (LRR)); Ly6E (complexo de antígeno de linfócito 6, locus E; Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-1); Ly6G6D

(complexo de antígeno de linfócito 6, locus G6D; Ly6-D, MEGT1); LY6K

(complexo de antígeno de linfócito 6, locus K; LY6K; HSJ001348; FLJ35226);

MACMARCKS; MAG ou OMgp; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MDP; MIB1; midkine;

MEF; MIP-2; MKI67; (Ki-67); MMP2; MMP9; MPF (MPF, MSLN, SMR, fator potenciador de megacariócitos, mesotelina); MS4A1; MSG783 (RNF124,

proteína hipotética FLJ20315);MSMB; MT3 (metalotionectina-111); MTSS1;

MUC1 (mucina); MYC; MY088; Napi3b (também conhecido como NaPi2b)

(NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, família 34 do carreador de soluto (fosfato de sódio),

membro 2, transportador de fosfato dependente de sódio 3b tipo II); NCA; NCK2;

neurocano; NFKB1; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR- Nogo66

(Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NME1 (NM23A); NOX5; NPPB; NR0B1; NR0B2;

NR1D1; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR112; NR113; NR2C1; NR2C2;

NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2;

NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRP1; NRP2; NT5E; NTN4; ODZI; OPRD1; OX40; P2RX7; P2X5 (canal iônico 5 direcionado por ligante P2X de receptor purinérgico); PAP; PART1; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PD-L1; PD-L2; PD-1;

POGFA; POGFB; PECAM1; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; fosfacano; PIAS2;

PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDC1; PMEL17 (homólogo da prata; SILV;

D12S53E; PMEL17; SI; SIL); PPBP (CXCL7); PPID; PRI; PRKCQ; PRKDI; PRL;

PROC; PROK2; PSAP; PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, gene RIKEN cDNA 2700050C12); PTAFR; PTEN; PTGS2

(COX-2); PTN; RAC2 (p21 Rac2); RARB; RET (proto-oncogene ret; MEN2A;

HSCR1; MEN2B; MTC1; PTC; CDHF12; Hs.168114; RET51; RET-ELE1); RGSI;

RGS13; RGS3; RNF110 (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2 (lipofilina B);

SCGB2A1 (mammaglobina2); SCGB2A2 (mammaglobina 1); SCYEI (citocina ativadora de monócito endotelial); SDF2; Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445,

Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, domínio sema, sete repetições de trombospondina (tipo 1 e tipo 1), domínio transmembranar (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforina) 5B); SERPINA1; SERPINA3;

SERP1NB5 (maspina); SERPINE1(PAI-1); SERPDMF1; SHBG; SLA2; SLC2A2;

SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPI; SPRR1B (Sprl); ST6GAL1; STABI; STAT6;

STEAP (antígeno epitelial de seis transmembranas da próstata); STEAP2

(HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene associado ao câncer de próstata 1, proteína 1 associada ao câncer de próstata, antígenos epiteliais de seis transmembranas da próstata 2, proteínas prostáticas de seis transmembranas); TB4R2; TBX21; TCPIO; TOGFI; TEK; TENB2 (proteoglicano de transmembrana putativo); TGFA; TGFBI; TGFB1II; TGFB2; TGFB3; TGFBI;

TGFBRI; TGFBR2; TGFBR3; THIL; THBSI (trombospondina-1); THBS2; THBS4;

THPO; TIE (Tie-1); TMP3; fator tecidual; TLR1; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6;

TLR7; TLR8; TLR9; TLR10; TMEFF1 (proteína transmembranar com o tipo EGF e dois domínios semelhantes a folistatina 1; Tomorregulina-1); TMEM46

(homólogo de shisa 2); TNF; TNF-a; TNFAEP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSFIIA; TNFRSF1A; TNFRSF1B; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7;

TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSF10 (TRAIL); TNFSF11 (TRANCE); TNFSF12

(AP03L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (ligante OX40); TNFSF5 (ligante CD40); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (ligante CD27); TNFSFS (ligante CD30); TNFSF9 (ligante 4-1 BB); TOLLIP; receptores de pedágio; TOP2A (topoisomerase Ea); TP53; TPM1; TPM2; TRADD; TMEM118 (proteína do dedo anelar, transmembrana 2; RNFT2; FLJ14627); TRAF1; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREM1; TREM2; TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal catiônico potencial transiente do receptor, subfamília M, membro 4); TRPC6; TSLP; TWEAK; Tirosinase (TYR; OCAIA; OCA1A; Tirosinase; SHEP3); VEGF; VEGFB; VEGFC; versican; VHL C5; VLA-4; XCL1 (linfotactina); XCL2 (SCM-1b); XCRI(GPR5/CCXCRI); YY1; e ZFPM2.

[00206] Em certas modalidades, moléculas alvo para anticorpos (ou anticorpos biespecíficos) produzidos de acordo com os métodos divulgados neste documento incluem proteínas CD tais como CD3, CD4, CDS, CD16, CD19, CD20, CD21 (CR2 (Receptor de complemento 2) ou C3DR (receptor do vírus C3d/Epstein Barr) ou Hs.73792); CD33; CD34; CD64; CD72 (antígeno de diferenciação da célula-B CD72, Lyb-2); CD79b (CD79B, CD79β, IGb (beta associado à imunoglobulina), B29); CD200 membros da família de receptores ErbB como EGF do receptor, receptor HER2, HER3 ou HER4; moléculas de adesão celular como LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, integrina alfa4/beta7 e integrina alfav/beta3 incluindo subunidades alfa ou beta dos mesmos (por exemplo, anticorpos anti-CD11a, anti-CD18 ou anti-CD11b); fatores de crescimento tais como VEGF-A, VEGF-C; fator tecidual (TF); interferon alfa (alfaIFN); TNFalfa, uma interleucina, tais como beta IL-1, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-13, IL 17 AF, IL-1S, IL-13R alfa1, alfa2 IL13R, IL-4R, IL-5R, IL-9R, IgE; antígenos do grupo sanguíneo; receptor flt2/flk3; receptor de obesidade (OB); receptor mpl; CTLA-4; RANKL, RANK, proteína RSV F, proteína C, etc. Em certas modalidades, os métodos fornecidos neste documento podem ser usados para produzir um anticorpo (ou um anticorpo multiespecífico, tal como um anticorpo biespecífico) que se liga especificamente à proteína C5 do complemento (por exemplo, um anticorpo agonista anti-C5 que se liga especificamente ao C5 humano).

[00207] Em certas modalidades, os métodos fornecidos neste documento podem ser usados para produzir um anticorpo (ou um anticorpo multiespecífico, tal como um anticorpo biespecífico) que se liga especificamente à hemaglutinina B do vírus influenza, ou seja, “fluB” (por exemplo, um anticorpo que liga hemaglutinina da linhagem Yamagata do vírus influenza B, liga hemaglutinina da linhagem Victoria do vírus influenza B, liga hemaglutinina de linhagens ancestrais do vírus influenza B, ou liga hemaglutinina da linhagem Yamagata, linhagem Victoria e linhagens ancestrais do vírus influenza B, em in vitro e/ou in vivo). Mais detalhes relativos aos anticorpos anti-FluB estão descritos no documento WO 2015/148806, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[00208] Em certas modalidades, um anticorpo (ou anticorpo biespecífico) produzido de acordo com um método aqui proporcionado liga a proteína relacionada com receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP) -1 ou LRP-8 ou receptor de transferrina e pelo menos um alvo selecionado do grupo constituído por beta-secretase (BACE1 ou BACE2), alfa-secretase, gama- secretase, tau-secretase, proteína precursora de amiloide (APP), receptor de morte 6 (DR6), peptídeo beta-amiloide, alfa-sinucleina, Parkina, Huntingtin, p75 NTR, CD40 e caspase-6.

[00209] Em certas modalidades, o anticorpo produzido de acordo com um método fornecido neste documento é um anticorpo IgG2 humano contra CD40. Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD40 é RG7876.

[00210] Em certas modalidades, o polipeptídeo produzido de acordo com um método fornecido neste documento é uma imunocitocina alvo.

Em certas modalidades, a imunocitocina alvo é uma imunocitocina CEA-IL2v.

Em certas modalidades, a imunocitocina CEA-IL2v é RG7813. Em certas modalidades, a imunocitocina alvo é uma imunocitocina FAP-IL2v. Em certas modalidades, a imunocitocina FAP-IL2v é RG7461.

[00211] Em certas modalidades, um anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico) produzido de acordo com um método fornecido neste documento liga o CEA e pelo menos uma molécula alvo adicional. Em certas modalidades, um anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico) produzido de acordo com um método fornecido neste documento liga uma citocina alvo ao tumor e pelo menos uma molécula alvo adicional. Em certas modalidades, um anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico) produzido de acordo com um método fornecido neste documento é fundido com IL2v (ou seja, uma variante de interleucina 2) e liga uma imunocitocina baseada em IL1 e pelo menos uma molécula alvo adicional. Em certas modalidades, um anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico) produzido de acordo com um método fornecido neste documento é um anticorpo biespecífico de células T (ou seja, um promotor biespecífico de células T ou BiTE).

[00212] Em certas modalidades, um anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico) produzido de acordo com um método fornecido neste documento se liga a pelo menos duas moléculas alvo selecionadas dentre: IL-1 alfa e IL- 1 beta, IL-12 e IL-1S; IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-5 e IL-4; IL-13 e IL-1beta; IL-13 e IL- 25; IL-13 e TARC; IL-13 e MDC; IL-13 e MEF; IL-13 e TGF-~; agonista IL-13 e LHR; IL-12 e TWEAK, IL-13 e CL25; IL-13 e SPRR2a; IL-13 e SPRR2b; IL-13 e ADAMS, IL-13 e PED2, IL17A e IL17F, CEA e CD3, CD3 e CD19, CD138 e CD20; CD138 e CD40; CD19 e CD20; CD20 e CD3; CD3S e CD13S; CD3S e CD20; CD3S e CD40; CD40 e CD20; CD-S e IL- 6; CD20 e BR3, TNF alfa e TGF-beta, TNF alfa e IL-1 beta; TNF alfa e IL-2, TNF alfa e IL-3, TNF alfa e IL-4, TNF alfa e IL-5, TNF alfa e IL6, TNF alfa e IL8, TNF alfa e IL-9, TNF alfa e IL-10, TNF alfa e IL-11, TNF alfa e IL-12, TNF alfa e IL-13, TNF alfa e IL-14, TNF alfa e IL-15, TNF alfa e IL-16, TNF alfa e IL-17, TNF alfa e IL-18, TNF alfa e IL-19, TNF alfa e IL-20, TNF alfa e IL-23, TNF alfa e IFN alfa, TNF alfa e CD4, TNF alfa e VEGF, TNF alfa e MIF, TNF alfa e ICAM-1, TNF alfa e PGE4, TNF alfa e PEG2, TNF alfa e ligante RANK, TNF alfa e Te38, TNF alfa e BAFF, TNF alfa e CD22, TNF alfa e CTLA-4, TNF alfa e GP130, TNF a e IL- 12p40, VEGF e Angiopoietina, VEGF e HER2, VEGF-A e HER2, VEGF-A e PDGF, HER1 e HER2, VEGFA e ANG2, VEGF-A e VEGF-C, VEGF-C e VEGF- D, HER2 e DR5, VEGF e IL-8, VEGF e MET, VEGFR e receptor MET, EGFR e MET, VEGFR e EGFR, HER2 e CD64, HER2 e CD3, HER2 e CD16, HER2 e HER3; EGFR (HER1) e HER2, EGFR e HER3, EGFR e HER4, IL-14 e IL-13, IL- 13 e CD40L, IL4 e CD40L, TNFR1 e IL-1 R, TNFR1 e IL-6R e TNFR1 e IL-18R, EpCAM e CD3, MAPG e CD28, EGFR e CD64, CSPGs e RGM A; CTLA-4 e BTN02; IGF1 e IGF2; IGF1/2 e Erb2B; MAG e RGM A; NgR e RGM A; NogoA e RGM A; OMGp e RGM A; POL-l e CTLA-4; e RGM A e RGM B.

[00213] Em certas modalidades, o anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico) é um anticorpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3.

Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 é RG7802.

Mais detalhes relativos a anticorpos biespecíficos anti-CEA/anti-CD3 são fornecidos em WO 2014/121712, que é incorporado a este documento por referência na sua totalidade.

[00214] Em certas modalidades, o anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico) é um anticorpo biespecífico anti- VEGF/antiangiopoietina. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico anti- VEGF/anticorpo biespecífico antiangiopoietina é um Crossmab. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico anti-VEGF/anti-angiopoietina é RG7716.

[00215] Em certas modalidades, o anticorpo multiespecífico (tal como um anticorpo biespecífico) é um anticorpo biespecífico anti-Ang2/anti- VEGF. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico anti-Ang2/anti-VEGF é RG7221. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico anti-Ang2/anti-VEGF é o Número CAS 1448221-05-3.

[00216] Muitos outros anticorpos e/ou outras proteínas podem ser expressas pelas células hospedeira de acordo com a presente divulgação, e as listas acima não pretendem ser limitativas.

[00217] As células hospedeiras da presente divulgação podem ser empregadas na produção de uma molécula de interesse em escala de fabricação. A produção em escala industrial de proteínas terapêuticas, ou outras proteínas, utiliza culturas de células que variam de cerca de 400 L a cerca de

80.000 L, dependendo da proteína produzida e da necessidade. Normalmente, essa produção em escala de fabricação utiliza tamanhos de cultura de células de cerca de 400 L a cerca de 25.000 L. Dentro desse intervalo, tamanhos específicos de cultura de células, como 4.000 L, cerca de 6.000 L, cerca de

8.000, cerca de 10.000, cerca de 12.000 L, cerca de 14.000 L, ou cerca de 16.000 L podem ser utilizados.

[00218] As células hospedeiras da presente divulgação podem ser empregadas na produção de grandes quantidades de uma molécula de interesse em um período de tempo mais curto em comparação com células não TI usadas nos métodos atuais de cultura de células. Em certas modalidades, as células hospedeiras da presente divulgação podem ser empregadas para melhorar a qualidade da molécula de interesse em comparação com células não TI utilizadas nos métodos atuais de cultura de células. Em certas modalidades, as células hospedeiras da presente divulgação podem ser usadas para melhorar a estabilidade do trem de sementes, impedindo a toxicidade crônica que pode ser causada por produtos que podem causar estresse celular e instabilidade clonal ao longo do tempo. Em certas modalidades, as células hospedeiras da presente divulgação podem ser usadas para a expressão ideal de produtos agudamente tóxicos.

[00219] Em certas modalidades, as células hospedeiras, os sistemas de TI da presente divulgação, podem ser usados para otimização do processo e/ou desenvolvimento de processo de cultura de células.

[00220] Em certas modalidades, as células hospedeiras da presente divulgação podem ser usadas para acelerar a produção de uma molécula de interesse em cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 7 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 9 semanas ou cerca de 10 semanas em comparação com células não TI usadas nos métodos convencionais de cultura de células. Em certas modalidades, as células hospedeiras da presente divulgação podem ser usadas para acelerar a colheita de uma molécula de interesse em cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 7 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 9 semanas ou cerca de 10 semanas em comparação com células não TI usadas nos métodos convencionais de cultura de células.

[00221] Em certas modalidades, as células hospedeiras da presente modalidade podem ser empregadas para reduzir os níveis agregados de uma molécula de interesse em comparação com células não TI usadas nos métodos convencionais de cultura de células.

[00222] Em certas modalidades, as células hospedeiras da presente divulgação podem ser usadas para obter expressão aumentada de um polipeptídeo (ou polipeptídeos) de interesse em relação a uma célula hospedeira aleatoriamente integrada. Por exemplo, mas não a título limitativo, as células hospedeiras da presente divulgação podem alcançar a expressão de anticorpos padrão e meios anticorpos em títulos de pelo menos 3g/L, 3,5g/L, 4g/L, 4,5g/L,

5g/L, 5,5g/L, 6g/L, 6,5g/L, 7g/L, 7,5g/L, 8g/L, 8,5g/L, 9g/L, 9,5g/L, 10g/L, 10,5g/L, 11g/L ou mais, e expressão de anticorpos multiespecíficos, por exemplo, anticorpos biespecíficos, de pelo menos 1,5g/L, 2g/L, 2,5g/L, 3g/L, 3,5g/L, 4g/L, 4,5g/L, 5g/L, 5,5g/L, 6g/L ou mais. Em certas modalidades, as células hospedeiras da presente divulgação podem alcançar um teor biespecífico aumentado em relação às células hospedeiras de integração aleatória. Por exemplo, mas não a título limitativo, as células hospedeiras da presente divulgação podem atingir um teor biespecífico de pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% ou mais.

[00223] Em certas modalidades, as células hospedeiras da presente divulgação podem ser usadas para a expressão constitutiva de subunidades selecionadas de uma molécula terapêutica e a expressão regulada de outras subunidades diferentes da mesma molécula terapêutica. Em certas modalidades, a molécula terapêutica pode ser uma proteína de fusão. Em certas modalidades, as células hospedeiras da presente divulgação podem ser usadas para entender os papéis e efeitos de cada subunidade de anticorpo na expressão e secreção de moléculas de anticorpo totalmente montadas.

[00224] Em certas modalidades, as células hospedeiras da presente divulgação podem ser usadas como uma ferramenta de investigação.

Em certas modalidades, as células hospedeiras da presente divulgação podem ser usadas como uma ferramenta de diagnóstico para mapear as causas da baixa expressão de proteínas para moléculas problemáticas em várias células.

Em certas modalidades, as células hospedeiras da presente divulgação podem ser usadas para vincular diretamente um fenômeno observado ou comportamento celular à expressão do transgene nas células. A célula hospedeira da presente divulgação também pode ser usada para demonstrar se um comportamento observado é reversível ou não nas células. Em certas modalidades, as células hospedeiras da presente divulgação podem ser exploradas para identificar e mitigar problemas com relação à transcrição e expressão de transgene(s) e células.

[00225] Em certas modalidades, as células hospedeiras da presente divulgação podem ser usadas para trocar subunidades de transgene, tais como, mas sem limitação, subunidades de HC e LC de um anticorpo, de uma molécula difícil de expressar com a molécula média no sistema de TI para identificar a(s) subunidade(s) problemática(s). Em certas modalidades, a análise de sequência de aminoácidos pode então ser usada para restringir e focar nos resíduos ou regiões de aminoácidos que podem ser responsáveis pela baixa expressão de proteína.

8. Modalidades Não Limitativas Exemplificativas A. Uma célula hospedeira de integração direcionada (TI) que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio de integração dentro de um locus específico do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1-7.

A1. A célula hospedeira TI, de acordo com A, em que a sequência nucleotídica imediatamente a 5' da sequência nucleotídica exógena integrada é selecionada do grupo que consiste em sequências pelo menos cerca de 90% homólogas aos nucleotídeos 41190-45269 de NW_006874047.1, nucleotídeos 63590-207911 de NW_006884592.1, nucleotídeos 253831-491909 de NW_006881296.1, nucleotídeos 69303-79768 de NW_003616412.1, nucleotídeos 293481-315265 de NW_003615063.1, nucleotídeos 2650443- 2662054 de NW_006882936.1, ou nucleotídeos 82214-97705 de NW_003615411.1.

A2. A célula hospedeira TI, de acordo com A, em que a sequência nucleotídica imediatamente a 5' da sequência nucleotídica exógena integrada é selecionada do grupo que consiste em sequências a pelo menos 15 pares de bases, pelo menos 20 pares de bases, pelo menos 30 pares de bases, pelo menos 40 pares de bases, pelo menos 50 pares de bases, pelo menos 75 pares de bases, pelo menos 100 pares de bases, pelo menos 150 pares de bases, pelo menos 200 pares de bases, pelo menos 300 pares de bases, pelo menos 400 pares de bases, pelo menos 500 bases pares, pelo menos 1.000 pares de bases, pelo menos 1.500 pares de bases, pelo menos 2.000 pares de bases, pelo menos 3.000 pares de bases do nucleotídeo 45269 de NW_006874047.1, nucleotídeo 207911 de NW_006884592.1, nucleotídeo 491909 de NW_006881296.1, nucleotídeo 79768 de NW_003616412.1, nucleotídeo 315265 de NW_003615063.1, nucleotídeo 2662054 de NW_006882936.1 ou nucleotídeo 97705 de NW_003615411.1.

A3 A célula hospedeira TI, de acordo com A, em que a sequência nucleotídica imediatamente a 3' da sequência nucleotídica exógena integrada é selecionada do grupo que consiste em sequências pelo menos cerca de 90% homólogas aos nucleotídeos 45270-45490 de NW_006874047.1, nucleotídeos 207912- 792374 de NW_006884592.1, nucleotídeos 491910-667813 de NW_006881296.1, nucleotídeos 79769-100059 de NW_003616412.1, nucleotídeos 315266-362442 de NW_003615063.1, nucleotídeos 2662055- 2701768 de NW_006882936.1, ou nucleotídeos 97706-105117 de NW_003615411.1.

A4. A célula hospedeira TI, de acordo com A, em que a sequência nucleotídica imediatamente a 3' da sequência nucleotídica exógena integrada é selecionada do grupo que consiste em sequências a pelo menos 15 pares de bases, pelo menos 20 pares de bases, pelo menos 30 pares de bases, pelo menos 40 pares de bases, pelo menos 50 pares de bases, pelo menos 75 pares de bases, pelo menos 100 pares de bases, pelo menos 150 pares de bases, pelo menos 200 pares de bases, pelo menos 300 pares de bases, pelo menos 400 pares de bases, pelo menos 500 bases pares, pelo menos 1.000 pares de bases,

pelo menos 1.500 pares de bases, pelo menos 2.000 pares de bases, pelo menos 3.000 pares de bases do nucleotídeo 45270 de NW_006874047.1, nucleotídeo 207912 de NW_006884592.1, nucleotídeo 491910 de NW_006881296.1, nucleotídeo 79769 de NW_003616412.1, nucleotídeo 315266 de NW_003615063.1, nucleotídeo 2662055 de NW_006882936.1 ou nucleotídeo 97706 de NW_003615411.1.

A5. A célula hospedeira TI, de acordo com qualquer uma dentre A- A4, em que a sequência nucleotídica exógena integrada está operacionalmente ligada a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a uma sequência selecionada das SEQ ID Nos. 1-7.

A6. Uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio de integração em um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a eles.

A7. Uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio de integração operacionalmente ligado a um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a eles.

A8. Uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio de integração imediatamente adjacente a toda ou parte de uma sequência selecionada do grupo que consiste em sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1- 7. A9. A célula hospedeira TI, de acordo com qualquer uma dentre A- A8, em que a célula hospedeira TI é uma célula hospedeira de mamífero.

A10. A célula hospedeira TI, de acordo com A9, em que a célula hospedeira TI é uma célula hospedeira de hamster, uma célula hospedeira humana, uma célula hospedeira de rato ou uma célula hospedeira de camundongo.

A11. A célula hospedeira TI, de acordo com A9 ou A10, em que a célula hospedeira TI é uma célula hospedeira de ovário de hamster chinês (CHO), uma célula hospedeira CHO K1, uma célula hospedeira CHO K1SV, uma célula hospedeira DG44, uma célula hospedeira DUKXB-11, uma célula hospedeira CHOK1S ou uma célula hospedeira CHO K1M.

A12. A célula hospedeira TI, de acordo com qualquer uma dentre A-A11, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma ou mais sequências de reconhecimento de recombinação (RRSs), em que a RRS pode ser reconhecida por uma recombinase.

A13. A célula hospedeira TI, de acordo com A12, em que a sequência nucleotídica exógena compreende pelo menos duas RRSs.

A14. A célula hospedeira TI, de acordo com A12 ou A13, em que a recombinase é uma Cre recombinase ou uma recombinase FLP.

A15. A célula hospedeira TI, de acordo com A12 ou A13, em que a recombinase é uma integrase Bxb1 ou uma integrase φC31.

A16. A célula hospedeira TI, de acordo com qualquer uma dentre A12-A15, em que a RRS é selecionada do grupo que consiste em uma sequência LoxP, uma sequência LoxP L3, uma sequência LoxP 2L, uma sequência LoxFas, uma sequência Lox511, uma sequência Lox2272, uma sequência Lox2372, uma sequência Lox5171, uma sequência Loxm2, uma sequência Lox71, uma sequência Lox66, uma sequência FRT, uma sequência Bxb1 attP, uma sequência Bxb1 attB, uma sequência φC31 attP e uma sequência φC31 attB. A17. A célula hospedeira TI, de acordo com qualquer uma dentre A13-A16, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira e uma segunda RRS e pelo menos um marcador de seleção localizado entre a primeira e a segunda RRS.

A18. A célula hospedeira TI, de acordo com A17, compreendendo um primeiro marcador de seleção, em que o primeiro marcador de seleção é selecionado do grupo que consiste em aminoglicosídeo fosfotransferase (APH), higromicina fosfotransferase (HYG), neomicina, G418 APH), di-hidrofolato redutase (DHFR), timidina quinase (TK), glutamina sintetase (GS), asparagina sintetase, triptofano sintetase (indol), histidinol desidrogenase (histidinol D), blasticidina, bleomicina, fleomicina, cloranfenicol, Zeocina e ácido micofenólico.

A19. A célula hospedeira TI, de acordo com A17 ou A18, compreendendo ainda um segundo marcador de seleção, em que o primeiro e o segundo marcador de seleção são diferentes.

A20. A célula hospedeira TI, de acordo com A19, em que o segundo marcador de seleção é selecionado do grupo que consiste em aminoglicosídeo fosfotransferase (APH), higromicina fosfotransferase (HYG), neomicina, G418 APH), di-hidrofolato redutase (DHFR), timidina quinase (TK), glutamina sintetase (GS), asparagina sintetase, triptofano sintetase (indol), histidinol desidrogenase (histidinol D), blasticidina, bleomicina, fleomicina, cloranfenicol, Zeocina e ácido micofenólico.

A21. A célula hospedeira TI, de acordo com A19 ou A20, compreendendo ainda um terceiro marcador de seleção e um sítio interno de entrada do ribossomo (IRES), em que o IRES está operacionalmente ligado ao terceiro marcador de seleção.

A22. A célula hospedeira TI, de acordo com A21, em que o terceiro marcador de seleção é diferente do primeiro ou do segundo marcador de seleção. A23. A célula hospedeira TI, de acordo com A21 ou A22, em que o terceiro marcador de seleção é selecionado do grupo que consiste em um marcador de proteína verde fluorescente (GFP), um marcador de GFP melhorada (eGFP), um marcador de GFP sintética, uma proteína fluorescente amarela (YFP), um marcador de YFP melhorada (eYFP), um marcador de proteína fluorescente azul (CFP), um marcador mPlum, um marcador mCherry, um marcador tdTomato, um marcador mStrawberry, um marcador J-red, um marcador de monômero DsRed, um marcador mOrange, um marcador mKO, um marcador mCitrine, um marcador Venus, um marcador YPet, um marcador Emerald6, um marcador CyPet, um marcador mCFPm, um marcador Cerulean e um marcador T-Sapphire.

A24. A célula hospedeira TI, de acordo com qualquer uma dentre A17-A23, compreendendo ainda uma terceira RRS, em que a terceira RRS está localizada entre a primeira e a segunda RRS, e a terceira RRS é heteroespecífica em relação à primeira ou à segunda RRS.

A25. A célula hospedeira TI, de acordo com qualquer uma dentre A12-A24, em que a sequência nucleotídica exógena compreende pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma sequência exógena de interesse (SOI).

A26. A célula hospedeira TI, de acordo com qualquer uma dentre A12-A25, em que a sequência nucleotídica exógena compreende ainda pelo menos uma SOI exógena.

A27. A célula hospedeira TI, de acordo com A26, em que a SOI exógena está localizada entre a primeira e a segunda RRS.

A28. A célula hospedeira TI, de acordo com A26 ou A27, em que a SOI codifica um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc. A29. A célula hospedeira TI, de acordo com qualquer uma dentre A24-A28, em que a sequência nucleotídica exógena compreende ainda pelo menos uma SOI exógena localizada entre a primeira e a terceira RRS e pelo menos uma SOI exógena localizada entre a terceira e a segunda RRS.

A30. A célula hospedeira TI, de acordo com A29, em que a SOI codifica um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

A31. A célula hospedeira TI, de acordo com A26, em que a SOI codifica um anticorpo expresso em um nível mais alto em comparação com uma célula hospedeira integrada aleatoriamente.

A32. A célula hospedeira TI, de acordo com A31, em que o anticorpo é um anticorpo padrão ou meio-anticorpo expresso em um título de pelo menos 3g/L, 3,5g/L, 4g/L, 4,5g/L, 5g/L, 5,5g/L, 6g/L, 6,5g/L, 7g/L, 7,5g/L, 8g/L, 8,5g/L, 9g/L, 9,5g/L, 10g/L, 10,5g/L, 11g/L ou mais, A33. A célula hospedeira TI de A31, em que o anticorpo é um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico, expresso em um título de pelo menos 1,5g/L, 2g/L, 2,5g/L, 3g/L, 3,5g/L, 4g/L, 4,5g/L, 5g/L, 5,5g/L, 6g/L.

A34. A célula hospedeira TI, de acordo com A31, em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico e o teor biespecífico é aumentado em comparação com uma célula hospedeira de integração aleatória.

A35. A célula hospedeira TI, de acordo com A1, em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico, e o teor biespecífico é de pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% ou mais.

B. Um método para preparar uma célula hospedeira TI que expressa um polipeptídeo de interesse que compreende: fornecer uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira TI, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre SEQ ID Nº 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende duas RRSs, flanqueando pelo menos um primeiro marcador de seleção; introduzir na célula fornecida em a) um vetor que compreende duas RRSs correspondentes às duas RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs; e selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para isolar assim uma célula hospedeira TI que expressa o polipeptídeo.

B1. O método, de acordo com B, em que a recombinase é Cre recombinase ou uma recombinase FLP.

B2. O método, de acordo com B, em que a recombinase é uma integrase Bxb1 ou uma integrase φC31.

B3. O método, de acordo com qualquer uma dentre B-B2, em que a SOI codifica um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

B4. O método, de acordo com qualquer uma dentre B-B3, em que a célula hospedeira TI é uma célula hospedeira de mamífero.

B5. O método, de acordo com B4, em que a célula hospedeira TI é uma célula hospedeira de hamster, uma célula hospedeira humana, uma célula hospedeira de rato ou uma célula hospedeira de camundongo.

B6. O método, de acordo com B4 ou B5, em que a célula hospedeira TI é uma célula hospedeira CHO, uma célula hospedeira CHO K1, uma célula hospedeira CHO K1SV, uma célula hospedeira DG44, uma célula hospedeira DUKXB-11, uma célula hospedeira CHOK1S, ou uma célula hospedeira CHO K1M.

C. Um método para expressar um polipeptídeo de interesse que compreende: fornecer uma célula hospedeira TI que compreende pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um marcador de seleção em que a pelo menos uma SOI exógena e o pelo menos um marcador de seleção são flanqueados por duas RRSs integrados dentro de um locus do genoma da célula hospedeira TI, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs. 1-7; e cultivar a célula em a) sob condições adequadas para expressar o polipeptídeo de interesse e recuperar um polipeptídeo de interesse a partir disso.

C1. O método, de acordo com C, em que pelo menos uma SOI exógena codifica um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

D. Um método para preparar uma célula hospedeira TI que expressa pelo menos um primeiro e segundo polipeptídeos de interesse que compreende: fornecer uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs. 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira e uma segunda RRSs que flanqueiam pelo menos um primeiro marcador de seleção e uma terceira RRS localizada entre a primeira e a segunda RRSs, e todas as RRSs são heteroespecíficas; introduzir na célula fornecida em a) um primeiro vetor que compreende duas RRSs correspondentes à primeira e à terceira RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e que flanqueia pelo menos uma primeira SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; introduzir na célula fornecida em a) um segundo vetor que compreende duas RRSs correspondentes à segunda e à terceira RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e que flanqueia pelo menos uma segunda SOI exógena;

introduzir uma ou mais recombinases, ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais recombinases, em que a uma ou mais recombinases reconhecem as RRSs; e selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para, assim, isolar uma célula hospedeira TI que expressa o primeiro e o segundo polipeptídeos de interesse.

D1. O método, de acordo com D, em que a recombinase é Cre recombinase ou uma recombinase FLP.

D2. O método, de acordo com D, em que a recombinase é uma integrase Bxb1 ou uma integrase φC31.

D3. O método, de acordo com D, em que: o primeiro vetor compreende ainda uma sequência promotora operacionalmente ligada ao códon ATG posicionado flanqueado a montante pela primeira SOI e a jusante por uma RRS; e o segundo vetor compreende ainda um marcador de seleção sem um códon de iniciação da transcrição ATG flanqueado a montante por uma RRS e a jusante pela segunda SOI.

D4. O método, de acordo com qualquer uma dentre D-D3, em que a primeira SOI codifica um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

D5. O método, de acordo com qualquer uma dentre D-D3, em que a segunda SOI codifica um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

D6. O método, de acordo com qualquer uma dentre C ou D-D5, em que a célula hospedeira TI é uma célula hospedeira de mamífero.

D7. O método, de acordo com D6, em que a célula hospedeira TI é uma célula hospedeira de hamster, uma célula hospedeira humana, uma célula hospedeira de rato ou uma célula hospedeira de camundongo.

D8. O método, de acordo com D7, em que a célula hospedeira TI é uma célula hospedeira CHO, uma célula hospedeira CHO K1, uma célula hospedeira CHO K1SV, uma célula hospedeira DG44, uma célula hospedeira DUKXB-11, uma célula hospedeira CHOK1S, ou uma célula hospedeira CHO K1M.

E. Um método para expressar um polipeptídeo de interesse que compreende: fornecer uma célula hospedeira que compreende pelo menos duas SOIs exógenas e pelo menos um marcador de seleção integrado dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs 1-7, em que pelo menos uma SOI exógena e um marcador de seleção são flanqueados por uma primeira e uma terceira RRSs e pelo menos uma SOI exógena é flanqueada por uma segunda e a terceira RRSs; e cultivar a célula em a) sob condições adequadas para expressar o polipeptídeo de interesse e recuperar um polipeptídeo de interesse a partir disso.

E1. O método, de acordo com E, em que a primeira SOI codifica um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

E2. O método, de acordo com E ou E1, em que a segunda SOI codifica um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

E3. O método, de acordo com qualquer uma dentre E-E2, em que a célula hospedeira TI é uma célula hospedeira de mamífero.

E4. O método, de acordo com E3, em que a célula hospedeira TI é uma célula hospedeira de hamster, uma célula hospedeira humana, uma célula hospedeira de rato ou uma célula hospedeira de camundongo.

E5. O método, de acordo com E4, em que a célula hospedeira TI é uma célula hospedeira CHO, uma célula hospedeira CHO K1, uma célula hospedeira CHO K1SV, uma célula hospedeira DG44, uma célula hospedeira DUKXB-11, uma célula hospedeira CHOK1S, ou uma célula hospedeira CHO K1M.

F. Um vetor compreendendo duas sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a a) duas sequências de referência selecionadas de qualquer porção da SEQ ID NO. 1; b) duas sequências de referência selecionadas de qualquer porção da SEQ ID NO. 2; c) duas sequências de referência selecionadas de qualquer porção da SEQ ID NO. 3; d) duas sequências de referência selecionadas de qualquer porção da SEQ ID NO. 4; e) duas sequências de referência selecionadas de qualquer porção da SEQ ID NO 5; f) duas sequências de referência selecionadas de qualquer porção da SEQ ID NO. 6; ou g) duas sequências de referência selecionadas de qualquer porção da SEQ ID NO. 7, em que as referidas sequências flanqueiam um cassete de DNA, em que o cassete de DNA compreende pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena flanqueada por duas RRSs.

F1. O vetor, de acordo com F, em que o vetor compreende duas sequências nucleotídicas pelo menos 60% homólogas às duas sequências de referência. F2. O vetor, de acordo com F, em que o vetor compreende duas sequências nucleotídicas pelo menos 70% homólogas às duas sequências de referência.

F3. O vetor, de acordo com F, em que o vetor compreende duas sequências nucleotídicas pelo menos 80% homólogas às duas sequências de referência.

F4. O vetor, de acordo com F, em que o vetor compreende duas sequências nucleotídicas pelo menos 90% homólogas às duas sequências de referência.

F5. O vetor, de acordo com F, em que o vetor compreende duas sequências nucleotídicas pelo menos 95% homólogas às duas sequências de referência.

F6. O vetor, de acordo com F, em que o vetor compreende duas sequências nucleotídicas pelo menos 99% homólogas às duas sequências de referência.

F7. O vetor, de acordo com qualquer uma dentre F-F6, em que o vetor é selecionado do grupo que consiste em um vetor adenoviral, um vetor de vírus adeno-associado, um vetor lentiviral, um vetor retroviral, um vetor de fago de integração, um vetor não viral, um transposon e/ou vetor de transposase, um substrato de integrase e um plasmídeo.

F8. O vetor, de acordo com qualquer uma dentre F-F7, em que a SOI codifica um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

G. Um método para preparar uma célula hospedeira TI que expressa um polipeptídeo de interesse que compreende: fornecer uma célula hospedeira que compreende um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs 1-7; introduzir um vetor na célula hospedeira, em que o vetor compreende sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID NOs. 1-7 que flanqueiam um cassete de DNA, em que o cassete de DNA compreende pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena flanqueada por duas RRSs; e selecionar para o marcador de seleção para isolar uma célula hospedeira TI com a SOI integrada no locus do genoma e expressar o polipeptídeo de interesse.

G1. O método, de acordo com G, em que o vetor é selecionado do grupo que consiste em um vetor adenoviral, um vetor de vírus adeno-associado, um vetor lentiviral, um vetor retroviral, um vetor de fago de integração, um vetor não viral, um transposon e/ou vetor de transposase, um substrato de integrase e um plasmídeo.

G2. O método, de acordo com G ou G1, em que pelo menos uma SOI codifica um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

G3. O método, de acordo com qualquer uma dentre G-G2, em que a célula hospedeira TI é uma célula hospedeira de mamífero.

G4. O método, de acordo com G3, em que a célula hospedeira TI é uma célula hospedeira de hamster, uma célula hospedeira humana, uma célula hospedeira de rato ou uma célula hospedeira de camundongo.

G5. O método, de acordo com G3 ou G4, em que a célula hospedeira TI é uma célula hospedeira CHO, uma célula hospedeira CHO K1, uma célula hospedeira CHO K1SV, uma célula hospedeira DG44, uma célula hospedeira DUKXB-11, uma célula hospedeira CHOK1S, ou uma célula hospedeira CHO K1M.

G6. O método, de acordo com qualquer uma dentre G1-G5, em que a integração do ácido nucleico compreendendo a pelo menos uma SOI e o marcador de seleção é promovida por uma nuclease exógena.

G7. O método, de acordo com G6, em que a nuclease exógena é selecionada do grupo que consiste em uma nuclease dedo de zinco (ZFN), um dímero de ZFN, uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma proteína de fusão com domínio de efetor TAL, uma endonuclease de DNA guiada por RNA, uma meganuclease manipulada e uma endonuclease (Cas) associada a repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR).

G8. O método, de acordo com G, em que o polipeptídeo de interesse é um anticorpo multiespecífico.

G9. O método, de acordo com G8, em que o anticorpo multiespecífico é um anticorpo biespecífico.

H. Uma célula hospedeira TI que compreende pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio de integração dentro de um ou mais loci específicos do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada de SEQ ID NOs 1-7.

H1. Uma célula hospedeira TI que compreende pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada em um ou mais sítios de integração dentro de um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2 e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a estes.

H2. A célula hospedeira TI, de acordo com qualquer uma dentre H- H1, em que a pelo menos uma sequência nucleotídica exógena compreende uma ou mais sequências de reconhecimento de recombinação (RRSs), em que a RRS pode ser reconhecida por uma recombinase.

H3. A célula hospedeira TI, de acordo com H2, em que a pelo menos uma sequência nucleotídica exógena compreende ainda pelo menos uma SOI exógena.

H4. A célula hospedeira TI, de acordo com qualquer uma dentre

H-H3, em que a célula hospedeira compreende pelo menos uma sequência nucleotídica exógena em um primeiro locus do genoma da célula hospedeira e pelo menos uma sequência nucleotídica exógena em um ou mais locus secundário do genoma da célula hospedeira.

H5. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 1, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção de SEQ ID NO.

2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6 ou SEQ ID NO.

7.

H5.1. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 1, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

2.

H5.2. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 1, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

3.

H5.3 A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 1, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

4.

H5.4. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 1, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

5.

H5.5. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 1, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

6.

H5.6. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 1, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

7.

H6. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 2, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção de SEQ ID NO.

1, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6 ou SEQ ID NO.

7.

H6.1. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 2, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

1.

H6.2. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 2, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

3.

H6.3. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 2, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

4.

H6.4. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 2, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

5.

H6.5. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 2, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

6.

H6.6. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 2, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

7.

H7. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 3, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção de SEQ ID NO.

1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6 ou SEQ ID NO.

7. H7.1. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 3, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

1.

H7.2. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 3, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

2.

H7.3. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 3, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

4.

H7.4. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 3, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

5.

H7.5. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 3, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

6.

H7.6. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 3, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

7.

H8. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 4, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção de SEQ ID NO.

1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6 ou SEQ ID NO.

7.

H8.1. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 4, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

1.

H8.2. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 4, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

2.

H8.3. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 4, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

3.

H8.4. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 4, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

5. H8.5. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 4, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

6.

H8.6. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 4, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

7.

H9. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 5, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção de SEQ ID NO.

1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 ou SEQ ID NO.

7.

H9.1. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 5, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

1.

H9.2. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 5, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

2.

H9.3. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 5, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

3.

H9.4. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 5, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

4.

H9.5. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 5, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

6.

H9.6. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 5, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

7.

H10. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 6, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção de SEQ ID NO.

1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 ou SEQ ID NO.

7.

H10.1. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 6, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 1.

H10.2 A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 6, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

2.

H10.3 A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 6, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO.

3.

H10.4. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 6, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 4.

H10.5. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 6, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 5.

H10.6. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 6, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 7.

H11. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 7, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção de SEQ ID NO.

1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 ou SEQ ID NO.

6.

H11.1. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 7, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 1.

H11.2. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 7, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 2.

H11.3. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 7, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 3.

H11.4. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 7, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 4.

H11.5. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 7, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 5.

H11.6. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus compreende uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 7, e o locus secundário compreende pelo menos uma sequência pelo menos 90% homóloga a toda ou a uma porção da SEQ ID NO. 6.

H12. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus é um sítio de integração dentro de um gene LOC107977062, e o locus secundário é um sítio de integração dentro de um gene selecionado do seguinte grupo: LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2 e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a estes.

H13. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus é um sítio de integração dentro de um gene LOC100768845, e o locus secundário é um sítio de integração dentro de um gene selecionado do seguinte grupo: LOC107977062, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2 e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a estes.

H14. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus é um sítio de integração dentro de um gene ITPR2, e o locus secundário é um sítio de integração dentro de um gene selecionado do seguinte grupo: LOC107977062, LOC100768845, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2 e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a estes.

H15. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus é um sítio de integração dentro de um gene ERE67000.1, e o locus secundário é um sítio de integração dentro de um gene selecionado do seguinte grupo: LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2 e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a estes.

H16. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus é um sítio de integração dentro de um gene UBAP2, e o locus secundário é um sítio de integração dentro de um gene selecionado do seguinte grupo: LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, MTMR2,

XP_003512331.2 e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a estes.

H17. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus é um sítio de integração dentro de um gene MTMR2, e o locus secundário é um sítio de integração dentro de um gene selecionado do seguinte grupo: LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, XP_003512331.2 e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a estes.

H18. A célula hospedeira TI, de acordo com H4, em que o primeiro locus é um sítio de integração dentro de um gene XP_003512331.2, e o locus secundário é um sítio de integração dentro de um gene selecionado do seguinte grupo: LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2 e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a estes.

H19. A célula hospedeira TI, de acordo com H4-H18, em que a pelo menos uma sequência nucleotídica exógena incorporada no primeiro locus compreende um promotor regulável.

H20. A célula hospedeira TI, de acordo com H4-H18, em que a pelo menos uma sequência nucleotídica exógena incorporada no locus secundário compreende um promotor regulável.

H21. A célula hospedeira TI, de acordo com H4-H18, em que a pelo menos uma sequência nucleotídica exógena incorporada no primeiro locus e a pelo menos uma sequência nucleotídica incorporada no locus secundário compreendem um promotor regulável.

J. Um método para preparar uma célula hospedeira TI que expressa pelo menos um polipeptídeo de interesse que compreende: fornecer uma célula hospedeira TI que compreende pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um ou mais loci do genoma da célula hospedeira TI, em que os um ou mais loci são pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO. 1-7, em que a pelo menos uma sequência nucleotídica exógena compreende duas

RRSs, flanqueando pelo menos um primeiro marcador de seleção; introduzir na célula fornecida em a) um vetor que compreende duas RRSs correspondentes às duas RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs; e selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para isolar assim uma célula hospedeira TI que expressa o pelo menos um polipeptídeo de interesse.

J1. Um método para preparar uma célula hospedeira TI que expressa pelo menos um primeiro e segundo polipeptídeos de interesse que compreende: fornecer uma célula hospedeira TI que compreende pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um ou mais loci do genoma da célula hospedeira, em que um ou mais loci são pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs. 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira e uma segunda RRSs que flanqueiam pelo menos um primeiro marcador de seleção e uma terceira RRS localizada entre a primeira e a segunda RRSs, e todas as RRSs são heteroespecíficas; introduzir na célula fornecida em a) um primeiro vetor que compreende duas RRSs correspondentes à primeira e à terceira RRSs na pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada e que flanqueia pelo menos uma primeira SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; introduzir na célula fornecida em a) um segundo vetor que compreende duas RRSs correspondentes à segunda e à terceira RRSs na pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada e que flanqueia pelo menos uma segunda SOI exógena; introduzir uma ou mais recombinases, ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais recombinases, em que a uma ou mais recombinases reconhecem as RRSs; e selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para, assim, isolar uma célula hospedeira TI que expressa os pelo menos um primeiro e segundo polipeptídeos de interesse.

J2. Um método para preparar uma célula hospedeira TI que expressa um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um ou mais loci do genoma da célula hospedeira TI, em que o um ou mais loci são pelo menos cerca de 90% homólogos a uma sequência selecionada dentre as SEQ ID NO. 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma ou mais RRSs; b) introduzir na célula fornecida em a) um vetor que compreende uma ou mais RRSs correspondentes a uma ou mais RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e que flanqueia pelo menos uma SOI exógena e operacionalmente ligado a pelo menos um promotor regulável; c) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs; e d) selecionar células TI que expressam o polipeptídeo exógeno de interesse na presença de um indutor para isolar assim uma célula hospedeira TI que expressa o polipeptídeo de interesse.

J3. Um método para expressar um polipeptídeo de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira que compreende pelo menos uma SOI exógena flanqueada por duas RRSs e um promotor regulável integrado dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homóloga a uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs. 1-7; e b) cultivar a célula sob condições adequadas para expressar a SOI e recuperar um polipeptídeo de interesse a partir disso.

J4. Um método para preparar uma célula hospedeira TI que expressa um primeiro e segundo polipeptídeos de interesse que compreende: a) fornecer uma célula hospedeira TI que compreende uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada dentre SEQ ID NOs. 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira, segunda RRSs e uma terceira RRS localizada entre a primeira e a segunda RRSs, e todas as RRSs são heteroespecíficas; b) introduzir na célula fornecida em a) um primeiro vetor que compreende duas RRSs correspondentes à primeira e à terceira RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e que flanqueia pelo menos uma primeira SOI exógena operacionalmente ligada a um promotor regulável; c) introduzir na célula fornecida em a) um segundo vetor que compreende duas RRSs correspondentes à segunda e à terceira RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e que flanqueia pelo menos uma segunda SOI exógena operacionalmente ligada a um promotor regulável; d) introduzir uma ou mais recombinases, ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais recombinases, em que a uma ou mais recombinases reconhecem as RRSs; e e) selecionar células TI que expressam o primeiro e o segundo polipeptídeos exógenos de interesse na presença de um indutor para, assim, isolar uma célula hospedeira TI que expressa o primeiro e o segundo polipeptídeos de interesse.

J5. O método, de acordo com qualquer uma das reivindicações J, J2, e J3, em que a integração de um ácido nucleico compreendendo pelo menos uma SOI é promovida por uma nuclease exógena.

J6. O método, de acordo com a reivindicação J1 ou J4, em que a primeira SOI codifica um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc; e a segunda SOI codifica um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc. J7. O método, de acordo com J5, em que a nuclease exógena é selecionada do grupo que consiste em uma nuclease dedo de zinco (ZFN), um dímero de ZFN, uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma proteína de fusão com domínio de efetor TAL, uma endonuclease de DNA guiada por RNA, uma meganuclease manipulada e uma endonuclease (Cas) associada a repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR).

J8. O método, de acordo com qualquer uma das reivindicações J- J4, em que o promotor regulável é selecionado do grupo que consiste nos promotores SV40 e CMV.

J9. O método, de acordo com qualquer uma das reivindicações J2 e J4, em que: o primeiro vetor compreende ainda uma sequência promotora operacionalmente ligada ao códon ATG posicionado flanqueado a montante pela primeira SOI e a jusante por uma RRS; e o segundo vetor compreende ainda um marcador de seleção sem um códon de iniciação da transcrição ATG flanqueado a montante por uma RRS e a jusante pela segunda SOI.

K. Um vetor compreendendo duas sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a a) duas sequências de referência selecionadas de qualquer porção da SEQ ID NO. 1; b) duas sequências de referência selecionadas de qualquer porção da SEQ ID NO. 2; c) duas sequências de referência selecionadas de qualquer porção da SEQ ID NO. 3; d) duas sequências de referência selecionadas de qualquer porção da SEQ ID NO. 4; e) duas sequências de referência selecionadas de qualquer porção da SEQ ID NO 5; f) duas sequências de referência selecionadas de qualquer porção da SEQ ID NO. 6; ou g) duas sequências de referência selecionadas de qualquer porção da SEQ ID NO. 7, em que as duas sequências nucleotídicas flanqueiam um cassete de DNA, em que o cassete de DNA compreende pelo menos uma SOI exógena operacionalmente ligada a um promotor regulável e flanqueada por duas RRSs.

K1. O vetor, de acordo com K, em que o vetor compreende duas sequências nucleotídicas pelo menos 60% homólogas às duas sequências de referência.

K2. O vetor, de acordo com K, em que o vetor compreende duas sequências nucleotídicas pelo menos 70% homólogas às duas sequências de referência.

K3. O vetor, de acordo com K, em que o vetor compreende duas sequências nucleotídicas pelo menos 80% homólogas às duas sequências de referência.

K4. O vetor, de acordo com K, em que o vetor compreende duas sequências nucleotídicas pelo menos 90% homólogas às duas sequências de referência.

K5. O vetor, de acordo com K, em que o vetor compreende duas sequências nucleotídicas pelo menos 95% homólogas às duas sequências de referência.

K6. O vetor, de acordo com K, em que o vetor compreende duas sequências nucleotídicas pelo menos 99% homólogas às duas sequências de referência.

K7. O vetor, de acordo com qualquer uma dentre K-K6, em que o vetor é selecionado do grupo que consiste em um vetor adenoviral, um vetor de vírus adeno-associado, um vetor lentiviral, um vetor retroviral, um vetor de fago de integração, um vetor não viral, um transposon e/ou vetor de transposase, um substrato de integrase e um plasmídeo.

K8. O vetor, de acordo com qualquer uma dentre K-K7, em que a SOI codifica um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

EXEMPLOS

[00226] Os exemplos a seguir são meramente ilustrativos do objeto aqui divulgado e não devem ser considerados como limitações de qualquer maneira.

Exemplo 1: Descobrindo sítios de integração direcionados altamente produtivos para células hospedeiras CHO para desenvolvimento de linhagem celular clínica e comercial

[00227] Este Exemplo descreve os métodos para identificar loci de integração direcionados no genoma de CHO com alta produtividade. O desenvolvimento de linhagem celular (CLD) convencional baseia-se na integração aleatória (RI) do plasmídeo portador da sequência de interesse (SOI).

Esse processo é imprevisível e exige muito trabalho. Como tal, é necessário um grande esforço para identificar os clones de RI de alta produção. Diferentemente do CLD de RI convencional, o CLD de integração direcionada (TI) introduz o transgene em um "hot-spot" predeterminado no genoma de CHO com um número de cópias definido (geralmente 1-2 cópias). Dado o baixo número de cópias e o sítio de integração pré-testado, as linhagens celulares de TI devem ter melhor estabilidade em comparação às linhagens de RI. Além disso, como o marcador seletivo é usado apenas para selecionar células com TI adequada e não para selecionar células com um alto nível de expressão transgênica, um marcador menos mutagênico pode ser aplicado para minimizar a chance de variantes de sequência (SVs), que é em parte devido à mutagenicidade dos agentes seletivos, como metotrexato (MTX) ou metionina sulfoximina (MSX).

[00228] A Figura 1 é um diagrama que mostra um esboço das etapas de triagem em todo o genoma para identificar loci de CHO de TI que permitem a expressão estável e alta de anticorpos. Para triar sequências transcricionalmente ativas no genoma de CHO, foram utilizadas duas abordagens para introduzir um cassete de anticorpo, expressando o anticorpo A ou o anticorpo B, e em que as sequências de anticorpos foram flanqueadas por RRS1 e RRS2 no genoma de CHO. Uma abordagem foi o método de integração aleatória convencional, e a outra foi uma integração baseada em transposase que exigiu cotransfecção de um plasmídeo que expressa transposase e o plasmídeo anticorpo. Os transfectantes 15k-20k foram triados para cada um dos métodos. Com base em um ensaio ELISA de IgG intacto e em uma análise de cópia gênica, um total de ~300 clones com alto título de anticorpo e baixos números de cópias gênicas HC foram expandidos para avaliação de processo descontínuo alimentado em frascos de agitação. 40 clones, representando 40 sítios de integração altamente transcricionalmente ativos potencialmente diferentes identificados pelos dois métodos com atributos de título e qualidade do produto aceitáveis, foram então selecionados para a troca de landing pad de GFP para gerar hospedeiros TI.

[00229] Para substituir o cassete de anticorpo nos loci transcricionalmente ativos, uma landing pad que codificava um gene GFP e marcadores de seleção apropriados, flanqueados pelas mesmas RRS1 e RRS2, foi construída para RMCE. Para iniciar a RMCE, a recombinase e a landing pad de GFP foram cotransfectadas em cada um dos 40 clones superiores. Dois marcadores de seleção foram usados para enriquecer os eventos de integração direcionados. Uma RMCE bem sucedida deve levar a landing pad de GFP a ser direcionada ao locus transcricionalmente ativo e substituir o cassete de anticorpo, resultando em ganho de expressão de GFP e perda da expressão de anticorpo. A mudança no fenótipo de GFP-/mAB+ para GFP+/mAb- deve ser facilmente detectável usando análise FACS. O enriquecimento de GFP+/mAb-

foi detectado em 14 dos 40 agrupamentos de RMCE usando análise FACS. Para isolar candidatos a hospedeiros TI individuais, cada um desses 14 agrupamentos de RMCE foi então clonado em célula única. Um total de 90 candidatos a hospedeiros TI potenciais dos 14 agrupamentos foram selecionados com base na FACS e na confirmação de PCR genômica de que o cassete de anticorpo original foi removido e substituído pela landing pad de GFP nos sítios de integração de interesse. Posteriormente, alguns desses hospedeiros candidatos foram avaliados quanto à sua capacidade e eficiência de RMCE usando um anticorpo C de teste flanqueado pelas mesmas RRS1 e RRS2. Dois esquemas de seleção dupla foram utilizados para gerar a população que expressa anticorpos direcionada (Figura 2A e 2B), dependendo de com qual método o locus transcricionalmente ativo foi identificado. As configurações das landing pads foram ligeiramente diferentes para os dois métodos de triagem. Com base na eficiência da RMCE, bem como na produtividade de anticorpos dos agrupamentos de transfecção de TI, foram selecionados sete hospedeiros finais, representando sete sítios de integração únicos nos hospedeiros CHOK1M para alta expressão de anticorpos.

[00230] Esses sete hospedeiros foram analisados por Ampliação de locus Direcionado/Sequenciação de Próxima Geração (TLA/NGS) para identificar as sequências genômicas de CHO que flanqueiam os sítios de integração, fornecendo assim as possíveis sequências genéticas nas quais os sítios de integração de interesse residem.

Tabela 2 - Sítios de integração de célula hospedeira de TI Hospedeiro Contig Tamanho da Sítio de Gene (SEQ ID Contig (kb) integração (bp) NO.) 1 NW_006874047.1 727 45269 LOC107977062 (SEQ ID NO. 1)

Hospedeiro Contig Tamanho da Sítio de Gene (SEQ ID Contig (kb) integração (bp) NO.) 2 NW_006884592.1 931 207911 LOC100768845 (SEQ ID NO. 2) 3 NW_006881296.1 1016 491909 ITPR2 (SEQ ID NO. 3) 4 NW_003616412.1 127 79768 ERE67000.1 (SEQ ID NO. 4) 5 NW_003615063.1 372 315265 UBAP2 (SEQ ID NO. 5) 6 NW_006882936.1 3042 2662054 MTMR2 (SEQ ID NO. 6) 7 NW_003615411.1 277 97706 XP_003512331.2 (SEQ ID NO. 7)

[00231] Com base nos sítios de integração, as sequências de flanqueamento 5' podem incluir: nucleotídeos 41190-45269 de NW_006874047.1, nucleotídeos 63590-207911 de NW_006884592.1, nucleotídeos 253831-491909 de NW_006881296.1, nucleotídeos 69303-79768 de NW_003616412.1, nucleotídeos 293481-315265 de NW_003615063.1, nucleotídeos 2650443-2662054 de NW_006882936.1 e nucleotídeos 82214- 97705 de NW_003615411.1.

[00232] Com base nos sítios de integração, as sequências de flanqueamento 3' podem incluir: nucleotídeos 45270-45490 de NW_006874047.1, nucleotídeos 207912-792374 de NW_006884592.1, nucleotídeos 491910-667813 de NW_006881296.1, nucleotídeos 79769-100059 de NW_003616412.1, nucleotídeos 315266-362442 de NW_003615063.1, nucleotídeos 2662055-2701768 de NW_006882936.1 e nucleotídeos 97706- 105117 de NW_003615411.1.

[00233] Para dois dos hospedeiros, os hospedeiros 4 e 7, análises posteriores indicaram que uma única landing pad GFP foi inserida no genoma do hospedeiro CHO. Nenhuma sequência de anticorpos foi encontrada nesses dois hospedeiros, indicando a remoção completa dos cassetes de anticorpos iniciais utilizados para identificar os loci transcricionalmente ativos. Além disso, o sequenciamento de todo o genoma foi realizado internamente para o DNA genômico isolado desses dois hospedeiros de TI. Não foram detectadas sequências específicas de anticorpos nesses dois hospedeiros de TI, enquanto que a sequência de GFP (da landing pad) foi prontamente detectada. Mais de 63x de cobertura genômica foi alcançada para os hospedeiros de TI. Para fornecer garantia adicional da ausência do anticorpo A e B nos hospedeiros de TI, várias amostras de HCCF das linhagens celulares de TI que expressam anticorpos que não os anticorpos A e B foram avaliadas usando o estudo de LC- MS. Os dados de LC-MS foram analisados usando uma abordagem semelhante à análise de variante de sequência por LC-MS/MS, que tem a capacidade de detectar peptídeos variantes em nível > 0,5%. Não foram detectados peptídeos de anticorpo A ou B em todas as amostras colhidas das linhagens celulares de TI. Finalmente, uma análise de hibridação fluorescente in situ (FISH) também foi realizada por Chrombios para determinar a localização cromossômica da landing pad de GFP no genoma desses dois hospedeiros de TI.

[00234] Estes dois hospedeiros de TI bem caracterizados foram ainda avaliados quanto à sua robustez de RMCE no desenvolvimento clínico de linhagem celular com um total de 16 anticorpos padrão diferentes. A Figura 3 mostra a produtividade dos principais clones gerados por esses hospedeiros de TI. Historicamente, a produtividade média de linhagens celulares geradas por integração aleatória era de ~3g/L. Na maioria dos casos testados, as linhas celulares de TI apresentaram produtividade comparável ou melhor do que a de clones de RI, em média.

[00235] Esperava-se que as linhagens celulares de TI tivessem melhor estabilidade e menos SV do que as linhagens celulares de RI devido ao menor número de cópias gênicas de anticorpos. Para estabilidade de clone, a produção descontínua alimentada mensal foi configurada mensalmente por 4 meses para monitorar a produtividade. A Tabela 3 mostrou que apenas 10% das linhagens celulares de TI geradas por um dos hospedeiros de TI tiveram mais de 20% de queda de título 120 dias após PSB. Historicamente, 60% das linhagens celulares de RI teriam quedas de título semelhantes. Isto sugere fortemente que o sítio de integração identificado é altamente adequado para a expressão estável de anticorpos. As linhagens celulares de TI também foram submetidas à análise de variante de sequência baseada em NAT. Houve uma frequência significativamente menor de SV >5% nas linhagens celulares de TI quando comparadas com as linhagens celulares de RI (4% v.s. 15%, Tabela 3).

Tabela 3 Vantagens de TI v.s. RI

CARACTERÍSTICAS Cópia# Dependente de clone Baixo Estabilidade de Clone ~60% de clones ~10% de clones (>20% de queda de título após 120 dias do PBS) Variantes de Sequência (SVs) ~15% de clones ~4% de clones Exemplo 2: Estratégia de RMCE de dois plasmídeos

[00236] Para enfrentar o desafio de alcançar uma expressão de alto título para anticorpos padrão e expressar formatos complexos de múltiplas cadeias, uma estratégia de RMCE de dois plasmídeos inovadora foi desenvolvida. O método de RMCE de dois plasmídeos permite que 8 ou mais cadeias sejam direcionadas para um sítio de TI ao mesmo tempo. Essa abordagem não apenas aumenta a flexibilidade da modulação da proporção de cadeia de HC e LC de anticorpo para melhorar a produtividade, mas também permite que moléculas complexas com cadeia múltipla, além de transgenes de direcionamento, genes endógenos ou RNAi com o anticorpo, modifiquem as vias celulares.

[00237] A estratégia de RMCE de dois plasmídeos envolve o uso de três sítios de RRS para realizar dois RMCEs independentes simultaneamente (Figura 4). Portanto, a landing pad de GFP nos hospedeiros de TI descritos acima foi substituída para incluir um terceiro sítio de RRS (RRS3) que não apresentava atividade cruzada com os sítios de RRS1 ou RRS2. Os dois plasmídeos de expressão a serem direcionados requerem os mesmos sítios de RRS de flanqueamento para direcionamento eficiente, um plasmídeo de expressão (anterior) flanqueado por RRS1 e RRS3 e outro (posterior) por RRS3 e RRS2. Como se espera que a eficiência de RMCE de dois plasmídeos seja baixa, um esquema de seleção rigoroso é útil para enriquecer os raros eventos específicos de RMCE. São necessários pelo menos dois marcadores de seleção na RMCE de dois plasmídeos. Em certas modalidades, três marcadores de seleção são empregados, os quais um cassete de expressão de marcador de seleção dividiu em duas partes (ver, por exemplo, Figura 4). Em certas modalidades envolvendo um cassete de expressão de marcador de seleção dividido, o plasmídeo anterior conteria o promotor seguido por um códon de início e a sequência de RRS3. O plasmídeo posterior teria a sequência de RRS3 fundida ao N-terminal da região de codificação do marcador de seleção menos o início da ATG. Pode ser necessário inserir nucleotídeos adicionais entre o sítio de RRS3 e a sequência do marcador de seleção para garantir a tradução na estrutura para proteína de fusão. Somente quando os dois plasmídeos são direcionados corretamente o cassete de expressão completa do marcador de seleção seria montado, tornando assim as células resistentes à seleção. A Figura

4 é o diagrama esquemático que mostra a estratégia de RMCE de dois plasmídeos. Obviamente, a RMCE de plasmídeo único ainda pode ser realizada usando RRS1 e RRS2, se necessário.

[00238] Para testar a robustez da abordagem de RMCE de dois plasmídeos, a landing pad de GFP original foi substituída pela nova landing pad de GFP com três sítios de RRS usando um hospedeiro de TI identificado anteriormente, o Hospedeiro 4. Observou-se um queda de viabilidade mais severa e maior tempo de recuperação para a RMCE de dois plasmídeos em comparação com a RMCE de plasmídeo único, consistente com a eficiência de RMCE inicial menor para a RMCE de dois plasmídeos. Uma vez recuperados os agrupamentos, a FACS, a PCR genômica e a análise de cópias gênicas foram avaliadas para confirmar que ambos os cassetes de plasmídeo foram direcionados corretamente ao sítio de TI. No total, cinco anticorpos padrão (Q, R, S, T e U) foram testados quanto à produtividade usando RMCE de plasmídeo único e RMCE de dois plasmídeos (Figura 5). Em RMCEs de dois plasmídeos, mais cópias totais de HC e LC foram direcionadas para o sítio de TI em comparação com a RMCE de plasmídeo único. Em todos os cinco casos, as produtividades dos agrupamentos de transfecção de TI de dois plasmídeos foram consistentemente mais altas, um aumento de até 200% em comparação com as produtividades dos agrupamentos de plasmídeo único. O aumento do título na RMCE de dois plasmídeos foi atribuído principalmente à produtividade específica, que viu seu nível melhorar em até 300% em comparação ao da RMCE de plasmídeo único.

[00239] Os hospedeiros de TI bem caracterizados, por exemplo, o Hospedeiro 4, foram avaliados em uma landing pad de cultura de células diferente quanto à sua capacidade de obter altos títulos de 5 anticorpos diferentes. A Figura 6 mostra a produtividade desses anticorpos por esses hospedeiros de TI. Uma produtividade superior a 10 g/L foi alcançada no Dia 14 e superior a 12 g/L no Dia 16 para a maioria dos anticorpos.

[00240] Para avaliar o uso de RMCE de dois plasmídeos para expressar formatos de mAb complexos, foram testadas duas moléculas biespecíficas que exigiam que quatro cadeias diferentes (duas HCs e duas LCs) fossem expressas na mesma célula para montagem biespecífica. Ao permitir que dois plasmídeos de expressão separados sejam direcionados simultaneamente, a configuração de plasmídeo das diferentes cadeias pode ser manipulada para atingir proporções de cadeia ideais para expressão equilibrada. Em ambos os casos, foram desenvolvidas linhagens celulares derivadas do Hospedeiro 4 com >1,5 g/L com teor biespecífico >80% (Figura 7) usando RMCE de dois plasmídeos.

[00241] Também foi avaliado o título do dia 14 de quatro moléculas biespecíficas que exigiu que quatro cadeias diferentes (duas HCs e duas LCs) fossem expressas na mesma célula para montagem biespecífica. Todas as linhagens celulares, que foram derivadas do Hospedeiro 4, foram desenvolvidas tendo título >1,5 g/L (Figura 8) com teor biespecífico >80% usando RMCE de dois plasmídeos.

Exemplo 3: Análise de expressão e crescimento de linhagens celulares de RTI que expressam moléculas de anticorpo mAb-I (difícil de expressar) vs.

mAb-II (expressão média)

[00242] Uma molécula difícil de expressar é definida como tal quando, após várias tentativas de CLD, todas as linhagens celulares geradas atingem títulos abaixo do que normalmente é esperado de um processo de landing pad CLD padrão. Para um anticorpo difícil de expressar previamente identificado (mAb-I), por exemplo, mais de 120 linhagens celulares de 4 tentativas separadas de CLD foram avaliadas nas culturas de produção descontínua alimentada. No entanto, as linhagens celulares mais altas que expressam mAb-I poderiam atingir apenas 50% do título típico quando comparadas a uma molécula de anticorpo média (mAb-II), para a qual apenas 24 linhagens celulares foram triadas (Figura 9A tabela). Infelizmente, é muito difícil rastrear a(s) causa(s) subjacente(s) que pode(m) tornar uma molécula difícil de expressar em um sistema de integração aleatória, principalmente devido às diferenças nos números de cópias transgênicas e nos sítios de integração gênica entre diferentes linhagens celulares.

[00243] Para identificar o fator (ou fatores) subjacente que tornou o mAb-I difícil de expressar, foi iniciado CLD para moléculas de mAb-I e mAb-II usando um sistema de RTI. Construtos de HC e LC foram clonados em um vetor de expressão sob o controle do promotor de CMV-TO induzível e esses vetores foram transfectados em um hospedeiro de TI, a fim de aumentar a possibilidade de isolar linhagens celulares com níveis semelhantes de transcrição de transgene. O diagrama esquemático geral da abordagem de CLD de RTI para mAb-I e mAb-II está representado na Figura 9B. As linhagens celulares transfectadas foram sujeitas a seleção usando duas condições separadas, sob as quais as linhagens celulares foram 1) derivadas na presença de Dox (Induzidas) ou 2) na ausência de Dox (Não Induzidas), durante todo o processo de CLD. As linhagens celulares derivadas na ausência de Dox foram apenas temporariamente induzidas para serem classificadas com base no título do cultivo celular ou durante os ensaios de produção quando indicado. Isso permitiu a avaliação do papel da expressão do anticorpo (pressão de expressão) durante o processo de seleção (Figura 9B).

[00244] Os ensaios de produção foram realizados usando duas linhagens celulares de mAb-I e mAb-II representativas, derivadas do Hospedeiro 7, dos braços do trem de sementes "Induzidos" e "Não Induzidos" na presença ou ausência de doxiciclina. Este último foi usado para avaliar o vazamento do promotor e os níveis de produção basal de anticorpos na ausência de indução.

Foi observada uma regulação bastante rígida de expressão de anticorpos na ausência de doxiciclina, sugerindo que o sistema de expressão regulada funcionou efetivamente nessas linhagens celulares (Figura 10A e 10C). Os perfis de crescimento (Figura 10B) de todas as linhagens celulares na presença ou ausência de doxiciclina foram comparáveis, embora na ausência de perfis de crescimento de doxiciclina parecessem um pouco melhores. As linhagens celulares que foram derivadas em condições de trem de sementes "Induzidas" ou "Não induzidas" exibiram títulos relativamente comparáveis e produtividades específicas durante a produção (Figura 10A e 10C, compare as linhagens celulares 1&2 a 3&4 para mAb-I ou mAb-II), indicando que a expressão de anticorpos consecutiva durante a seleção não desempenhou um papel significativo no isolamento de linhagens celulares de alto título (Figura 10). Além disso, semelhante às tentativas de CLD de RI, o título e a produtividade específica das linhagens celulares de mAb-I RTI ainda eram 50% mais baixos do que as linhagens celulares de mAb-II RTI (Figura 10A e 10C). Esta observação descartou a toxicidade crônica como culpada pela baixa expressão de mAb-I, uma vez que as culturas de RTI de mAb-I “Induzidas” e “Não Induzidas” apresentaram similarmente títulos mais baixos em comparação com as linhagens celulares de controle de mAb-II.

Exemplo 4: A menor expressão de anticorpos em linhagens celulares de mAb-I não se deveu à menor transcrição

[00245] Para analisar a expressão de anticorpos menor observada nas linhagens celulares que expressam mAb-I, foram realizados experimentos qRT-PCR para medir os níveis de mRNA de HC e LC de anticorpo nas linhagens celulares de RTI que expressam mAb-I ou mAb-II, sob condições induzidas e não induzidas por doxiciclina. Na ausência de Dox, as linhagens celulares de mAb-I ou mAb-II expressaram pouco ou nenhum mRNA de HC ou LC, indicando uma regulação transcricional relativamente rígida pelo promotor induzível (Figura 11). Na presença de Dox, os níveis de transcrição de HC e LC de anticorpo para linhagens celulares que expressam mAb-I foram comparáveis ou mais maiores que aqueles das linhagens celulares que expressam mAb-II (Figura 11A e 11B).

Estes resultados confirmaram que um nível reduzido de transcrição de transgene não era o motivo da baixa expressão de anticorpos nas linhagens celulares que expressam mAb-I. Além disso, a ausência ou presença de doxiciclina nas culturas de trens de sementes durante o processo de CLD não teve impacto nas taxas de transcrição de transgene, uma vez que as linhagens celulares isoladas sob condições "Induzidas" ou "Não Induzidas" apresentaram níveis comparáveis de mRNA de HC ou LC (Figuras 11A e 11B).

Exemplo 5: A indução da expressão de mAb-I resultou no acúmulo reversível de BiP intracelular e degradação retardada de HC de anticorpo

[00246] Para identificar os fatores subjacentes que afetam a expressão de mAb-I, a indução de Dox juntamente com o tratamento e remoção de ciclo-heximida (CHX) foi usada para investigar a secreção, o dobramento e a degradação de anticorpos. Para esses experimentos, as culturas "Induzidas" foram tratadas com CHX para interromper a síntese de proteínas e, após 5 horas, as células foram lavadas e ressuspensas em meios contendo apenas Dox (sem CHX) para retomar a síntese de proteínas (Figura 12A). HC ou LC não foram detectadas nos sobrenadantes dessas culturas por aproximadamente 60 minutos após a remoção do CHX, e um aumento gradual na secreção de anticorpos só foi detectado após 120 minutos e a taxas semelhantes (Figura 12B, painéis superiores). Isto sugeriu que a secreção de moléculas de anticorpo adequadamente dobradas e montadas eram comparáveis entre as linhagens celulares de mAb-I e mAb-II após a remoção do CHX. Os níveis intracelulares de LC de anticorpo também foram razoavelmente comparáveis entre as linhagens celulares que expressam mAb-I e mAb-II (Figura 12B, painéis de LC). No entanto, foram detectados níveis significativamente mais altos de HC de anticorpo intracelular nas linhagens celulares que expressam mAb-I em comparação com as linhagens que expressam mAb-II, mesmo após 5 horas de tratamento com CHX (Figura 12B, painéis de HC). Isto implicou um atraso ou problema na degradação e eliminação do HC de anticorpo desdobrado ou mal dobrado nas linhagens celulares que expressam mAb-I. Curiosamente, níveis muito altos de BiP intracelular no mAb-I foram detectados em relação às linhagens celulares de mAb-II antes e após o tratamento com CHX (Figura 12B, painéis inferiores, BiP). BiP como uma chaperona tem sido utilizada na resposta a proteínas desdobradas (UPR), bem como no dobramento de HC ou LC de anticorpos, e sua presença na cultura do cultivo celular pode ser um indicador do estresse celular associado a ER.

[00247] Para investigar melhor a correlação entre a expressão de mAb-I e o acúmulo intracelular de BiP, culturas de cultivo celular "induzidas" foram tratadas com ou sem CHX durante a noite em meios contendo doxiciclina e os níveis intracelulares de HC, LC e BiP nessas amostras foram avaliados. Na ausência de tratamento com CHX, os níveis basais de moléculas de HC de anticorpo intracelular foram mais altos no mAb-I em relação às linhagens celulares de mAb-II, enquanto os níveis de LC intracelular foram comparáveis entre todos os conjuntos de amostras. Os níveis de BiP, por outro lado, foram consideravelmente mais altos no mAb-I em relação às linhagens celulares que expressam mAb-II (Figura 12C, amostras de -CHX). O tratamento noturno dessas culturas com CHX resultou em uma redução nos níveis de HC e LC em todas as linhagens celulares, juntamente com uma redução simultânea nos níveis de BiP, especificamente nas linhagens celulares que expressam mAb-I (Figura 12C, amostras de +CHX). Isso estava de acordo com as descobertas anteriores (Figura 12B). Uma vez que a ciclo-heximida inibe a síntese de todas as proteínas eucarióticas indiscriminadamente, os níveis mais altos de BiP nas linhagens celulares de mAb-I não puderam ser diretamente ligados ao acúmulo de subunidades de HC ou LC de anticorpo. No entanto, o sistema de expressão regulada ofereceu a capacidade de testar diretamente a ligação entre BiP intracelular e níveis de HC ou LC de anticorpo. Para esse fim, a doxiciclina foi removida dos meios por 6 dias para desativar especificamente a expressão de anticorpos sem afetar a expressão de outras proteínas endógenas e os níveis intracelulares de HC, LC e BiP foram monitorados. Foi observada uma ligação direta e específica entre a expressão de anticorpos (HC e LC) e o acúmulo de BiP intracelular para linhagens celulares de mAb-I, enquanto a expressão de mAb-II não mostrou efeitos nos níveis intracelulares de BiP (Figura 12D).

Exemplo 6: Embora a expressão de LC de mAb-I tenha desencadeado o acúmulo intracelular de BiP, o HC de mAb-I também contribuiu distintamente para a baixa expressão desse anticorpo

[00248] Para determinar se a LC de mAb-I desempenhou um papel na acumulação de BiP intracelular, foi gerada um construto que expressou o HC de mAb-I sob um promotor regulado enquanto a LC foi expressa constitutivamente. Este construto, juntamente com os construtos que expressam HC/LC regulada de mAb-I ou mAb-II (controles), foram transfectados nas células CHO e dois agrupamentos separados de cada transfecção foram separados. Os títulos de agrupamento foram avaliados na cultura de produção (Figura 13A), enquanto as culturas de cultivo celular foram avaliadas por análise de Western blot (Figura 13B) na presença e ausência de doxiciclina. Durante o ensaio de produção, cada agrupamento foi induzido com Dox ou permaneceu não induzido.

Agrupamentos não induzidos expressaram poucos anticorpos durante a produção, indicativo de uma regulação de expressão rígida (Figura 13A, -Dox).

A análise de culturas induzidas por Dox durante a produção revelou que os agrupamentos de expressão de mAb-I regulado-HC/constitutivo-LC derivados de culturas de cultura celular "Não induzido" tinham títulos consideravelmente mais baixos em relação aos pools de mAb-I HC /LC regulados e Pools de mAb-I HC /LC constitutivo que foram "induzidos" durante o cultivo celular (Figura 13A). A análise por Western blot de culturas "Não Induzidas" mostrou que, sob todas as condições, a HC de anticorpo foi expressa apenas quando Dox foi adicionada aos meios. Além disso, a expressão constitutiva de LC de mAb-I apenas, sem a HC de mAb-I, desencadeou o acúmulo de BiP intracelular (Figura 13B). Estes resultados implicaram uma conexão direta entre a expressão de subunidade de LC de mAb-I e o acúmulo da BiP intracelular. Quando expressas constitutivamente na ausência de HC, as moléculas de LC de mAb-I provavelmente formam agregados desdobrados no ER que interagem com a chaperona de BiP, desencadeando um aumento nos níveis intracelulares de BiP nessas células. A expressão de HC de mAb-I durante a fase de produção poderia ter sobrecarregado ainda mais essas células, aumentando a demanda por BiP intracelular para acomodar o dobramento de moléculas de HC e LC, resultando em montagem, dobramento e eficiência de secreção de anticorpos ineficiente (Figura 13A).

[00249] Embora essas descobertas apontem para uma conexão entre a expressão de LC de mAb-I e o estresse de ER celular, como indicado pelo acúmulo de BiP intracelular, é necessário estabelecer uma conexão direta entre a expressão de LC de mAb-I e baixos títulos de linhagens celulares de mAb-I. Para esse fim, foram geradas moléculas de anticorpo em que as cadeias pesada e leve de mAb-I e mAb-II foram trocadas para gerar combinações de anticorpos HCILCI, HCIILCII, HCILCII e HCIILCI. O construto HCILCII expressou um anticorpo com HC de mAb-I e LC de mAb-II, enquanto o construto HCIILCI expressou um anticorpo com HC de mAb-II e LC de mAb-I. A expressão de HC e LC de anticorpo para todos esses construtos estava sob o controle do promotor de CMV-TO no sistema de vetores de RTI (Figura 13C). Estes construtos foram então transfectados em nossas células hospedeiras CHO de TI e dois agrupamentos de RTI separados, para cada construto, foram gerados, e a expressão de mAb-I, ou mAb-II, ou as versões híbridas desses anticorpos foram testadas. Como observado anteriormente (Figura 13B), foi observada uma correlação clara e direta entre a expressão de LC de mAb-I e o acúmulo de BiP intracelular (Figura 13D, blots de LC e BiP). Curiosamente, a BiP intracelular também foi acumulada de uma maneira menos intensa, mas ainda perceptível, em agrupamentos que expressam o anticorpo híbrido de HCILCII em comparação com HCIILCII, sugerindo alguns níveis de estresse de ER nesses agrupamentos, provavelmente devido à expressão de HCI (Figura 13D, compare níveis de BiP de exposição longa em amostras de HCIILCII e HCILCI). Desativar a expressão de anticorpos por meio da remoção de Dox resultou na redução dos níveis intracelulares de BiP em todos os agrupamentos de RTI, exceto no agrupamento de mAb-II (HCBLCB), em que os níveis iniciais de HC e BiP intracelulares foram consideravelmente mais baixos mesmo antes da remoção da Dox (Figura 13D, compare os níveis de HC e BiP no Dia 0 em agrupamentos de HCIILCII com outros agrupamentos).

[00250] Para avaliar o papel do HC e LC de mAb-I na expressão de anticorpos geral, os agrupamentos de HCILCI, HCIILCII, HCILCII e HCIILCI RTI foram avaliados em ensaios de produção. Na ausência de doxiciclina, todos os agrupamentos de RTI expressaram poucos anticorpos, exibindo uma regulação rígida da expressão de anticorpos (Figura 14A, -Dox). As taxas de crescimento para todos os agrupamentos de RTI foram semelhantes, com as culturas induzidas apresentando taxas de crescimento ligeiramente mais baixas em relação às culturas não induzidas (Figura 14B). Como observado anteriormente, os agrupamentos de RTI de mAb-I e mAb-II apresentaram o título mais baixo e o título mais alto e produtividades específicas, respectivamente (Figuras 14A e 14C). Curiosamente, os agrupamentos de RTI de HCIILCI e HCILCII exibiram títulos e produtividades específicas maiores que HCILCI, mas menores que agrupamentos de RTI de HCIILCII (Figuras 14A e 14C). Estes resultados indicaram que as subunidades HC e LC de mAb-I contribuíram individualmente para a menor expressão deste anticorpo em relação ao mAb-II. Contrariamente às nossas expectativas, os agrupamentos de RTI híbridos que expressaram a subunidade LCI apresentaram títulos e produtividades específicos ligeiramente mais altos em comparação com os agrupamentos que expressam a subunidade HCI (Figuras 14A e 14C). Isto indicou que a HC de mAb-I desempenhou um papel ligeiramente mais significativo na expressão menor deste anticorpo em relação à subunidade LC. Foi o uso da abordagem de troca de cadeia de anticorpos em combinação com o sistema de RTI que revelou os efeitos negativos associados à expressão da subunidade HC de mAb-I, mesmo quando um indicador claro de estresse biológico (como acúmulo intracelular de BiP) não pôde ser identificado.

Exemplo 7: Diferenças na sequência de aminoácidos entre as subunidades HC e LC de mAb-I e mAb-II

[00251] Para avaliar se certos resíduos de aminoácidos podem contribuir para a expressão problemática de HC e LC de mAb-I, as sequências de aminoácidos de LC (Figura 15A) e subunidades de HC (Figura 15B) de mAb- I e mAb-II foram alinhadas. A composição de aminoácidos para todas as regiões CDR de moléculas de HC e LC de mAb-I e mAb-II foram diferentes entre si, pois foram desenvolvidas para atingir antígenos diferentes. Na subunidade LC, não há diferenças na sequência de aminoácidos entre as moléculas de mAb-I e mAb- II para o restante da variável e todas as regiões constantes. O segmento de CDR1 de LCI é 6 aminoácidos mais longo que LCII, enquanto o segmento de CDR3 de LCII é um aminoácido mais longo que LCI (Figura 15A). Quanto à subunidade HC de anticorpo, excluindo os segmentos de CDR, as demais regiões variáveis e constantes de HCI e HCII são idênticas, com exceção de 4 resíduos de aminoácidos (Figura 15B). Duas dessas alterações de aminoácidos foram bastante conservadoras (T->S e L->A) e, portanto, é improvável que contribuam para a baixa expressão de HCI. A alteração N->G em HCI impede a glicosilação de HC de anticorpo. Portanto, os efeitos das diferenças de aminoácidos N->G e Y->V entre HCII e HCI na expressão de HCI foram investigados. Duas mutações pontuais foram geradas, alterando os resíduos de aminoácidos G e V de HCI para N e Y, respectivamente (mutante duplo de HCA ou HCIdm). A HCIdm foi usada junto com LCI e LCII para gerar agrupamentos de RTI, e a expressão de anticorpos nesses agrupamentos foi avaliada em culturas de produção (Figura 16A). Os resultados mostraram que a coexpressão de HCIdm junto com LCI aumentou a expressão de anticorpos para os níveis observados para HCIILCII, sugerindo que essas mutações podem restaurar os baixos níveis de expressão de anticorpos de HCA (Figura 16A). Curiosamente, quando coexpresso com LCII, HCIdm alcançou títulos ainda mais altos que os de HCIILCII, sugerindo que HCIdm é superior em expressão e dobragem em comparação com HCII (Figura 16A). Como observado anteriormente, HCILCI apresentou o título mais baixo, enquanto HCILCII exibiu um perfil de expressão de anticorpos intermediário (Figura 16A). A análise de Western blot revelou que a expressão de LCI ainda estava associada ao aumento do acúmulo intracelular de BiP, mesmo quando coexpressa com HCIdm (Figura 16B). A Figura 16C mostra um roteiro de diagnóstico de como o sistema de RTI pode ser usado para examinar e identificar a fonte do problema em linhagens celulares que expressam moléculas difíceis de expressar.

Exemplo 8: Geração de célula hospedeira de TI contendo duas landing pads distintas e independentes.

[00252] O hospedeiro 8 é um hospedeiro de integração direcionada (TI) que contém duas landing pads distintas e independentes, que podem ser direcionadas para a expressão de genes de anticorpo individualmente ou simultaneamente. A linhagem celular precursora do Hospedeiro 8 é o Hospedeiro 7 (ver a Tabela 2), que contém uma única landing pad. Uma segunda landing pad foi inserida no Hospedeiro 8 no local genômico em que a landing pad está localizada no hospedeiro de TI Hospedeiro 4 (ver a Tabela 2). Essa inserção foi realizada pelo knock-in baseado em CRISPR/Cas9 de uma nova landing pad no local do sítio de TI do Hospedeiro 4 dentro do hospedeiro de TI Hospedeiro 7.

[00253] Para conseguir isso, a região genômica do sítio de TI do Hospedeiro 4 foi caracterizada dentro do Hospedeiro 4 de TI e do Hospedeiro 7 de TI. Com base nessas informações, um RNA guia foi construído para atingir essa região genômica específica para facilitar o knock-in baseado em CRISPR/Cas9. Separadamente, um plasmídeo doador contendo uma landing pad recém-criada foi gerado para ser introduzido por knock-in neste local e construído em conjunto com braços de homologia correspondentes à região genômica a montante e a jusante do sítio de knock-in direcionado para facilitar o knock-in, e genes adicionais para permitir a triagem de clones de knock-in. A cotransfecção de um plasmídeo contendo genes para o gRNA e Cas9 e do plasmídeo doador foram realizadas para facilitar o knock-in baseado em CRISPR/Cas9 da nova landing pad.

[00254] Após a seleção e a triagem de clones que foram submetidos a knock-in baseado em CRISPR/Cas9, o Hospedeiro 8 foi finalmente identificado e passou por uma avaliação mais aprofundada. A landing pad existente do Hospedeiro 7 foi determinada como sendo intacta, e a nova landing pad introduzida por knock-in no sítio do Hospedeiro 4 também foi confirmada como estando presente, intacta e no local correto.

[00255] A viabilidade da troca de cassete mediada por recombinase (RMCE) em ambos os sítios foi então avaliada para cada sítio individualmente, e depois simultaneamente. Os clones foram gerados pelo RMCE apenas na landing pad do Hospedeiro 7, apenas na landing pad do Hospedeiro 4 e em ambos os locais simultaneamente, e depois avaliados em uma avaliação de frasco de agitação por processo descontínuo alimentado de 14 dias. O título e a produtividade específica dos clones que expressam anticorpos em ambos os sítios simultaneamente foram maiores em comparação com a expressão em cada sítio individualmente. Uma avaliação adicional foi realizada em um processo diferente de cultura de células, a landing pad de cultura de células B, para mostrar um aumento adicional de título para todos os clones em comparação com a landing pad de cultura de células A (Figura 17). O título de 14 dias médio para o sítio do Hospedeiro 4 foi de 3,0 g/L, para o sítio do Hospedeiro 7 foi de 1,9 g/L, e para ambos os sítios simultaneamente foi de 3,9 g/L na cultura de células da landing pad A.

[00256] Por fim, o Hospedeiro 8 de TI foi criado a partir do Hospedeiro 7 de TI pela adição de uma segunda landing pad localizada no local genômico da landing pad do Hospedeiro 4 de TI. Investigações adicionais confirmam o knock-in da landing pad e a viabilidade da RMCE em landing pads existentes e novas. Além disso, a avaliação dos clones gerados a partir do Hospedeiro 8 em cada sítio individualmente e em ambos os sítios simultaneamente mostram a produtividade da expressão de anticorpos. A expressão de genes de anticorpos em ambos os sítios simultaneamente, versus cada sítio individual, tem um efeito de produtividade aditivo que é visto tanto na landing pad de cultura de células A quanto na landing pad de cultura de células B (Figura 17).

Métodos

[00257] Configurações de Construto de DNA de Plasmídeo de Anticorpo: Para construir construtos de anticorpo de plasmídeo único, os fragmentos de HC e LC de anticorpo foram clonados em uma estrutura principal de vetor contendo as sequências L3 e 2L, bem como um marcador selecionável de puromicina N-acetil-transferase (pac). Para construir construtos de anticorpo de dois plasmídeos, os fragmentos de HC e LC de anticorpo foram clonados em uma estrutura principal de vetor anterior contendo sequências L3 e LoxFAS e um vetor posterior contendo sequências LoxFAS e 2L e um marcador selecionável de pac. O plasmídeo de Cre recombinase pOG231 (Wong ET et al., Nucleic Acids Res 2005, 33, (17), e147; O'Gorman S et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1997, 94, (26), 14602-7, o conteúdo de cada um destes está incorporado neste documento por referência) foi usado para todos os processos de RMCE.

[00258] Cultura de células: As células CHO foram cultivadas em um meio proprietário baseado em DMEM/F12 em balões de agitação de 125 mL agitando a 150 rpm, 37 °C e 5% de CO2. Células foram passadas a uma densidade celular de 3x105 células/mL a cada 3-4 dias.

[00259] Desenvolvimento da Linhagem Celular Estável de RMCE: Os plasmídeos de expressão foram transfectados em hospedeiros de TI por eletroporação MaxCyte STX® (MaxCyte, Gaithersburg, MD). Os agrupamentos de transfecção de RMCE foram então selecionados com puromicina e 1-(2’- desoxi-2’-fluoro-1-beta-D-arabinofuranosil-5-iodo)uracil (FIAU) (Moravek). Após a seleção do agrupamento, foi realizada uma clonagem de célula única (SCC) para gerar linhagens celulares de TI para posterior avaliação.

[00260] Ensaio de Produção Descontínua Alimentada: As culturas de produção descontínua alimentada foram realizadas em frascos de agitação ou vasos ambr15 (Sartorius Stedim) com meio de produção quimicamente definido proprietário. As células foram semeadas a 1x106 células/ml no dia 0, com uma mudança de temperatura de 37 °C para 35 °C no dia 3. As culturas receberam meio de alimentação proprietário nos dias 3, 7 e 10. A contagem de células viáveis (VCC) e a viabilidade percentual das células na cultura foram medidas nos dias 0, 3, 7, 10 e 14 usando um instrumento Vi-Cell™ XR (Beckman Coulter). As concentrações de glicose e lactato foram medidas nos dias 7, 10 e 14 usando um Bioprofile 400 Analyzer (Nova Biomedical). Os títulos do dia 14 foram determinados utilizando cromatografia de afinidade de proteína A com detecção por UV.

[00261] Determinação do número de cópias de genes por PCR em gotas: Ensaios de PCR em gotas foram realizados usando ddPCR™ Supermix kit (Bio-Rad). Cada reação de ddPCR contendo ddPCR Master mix, 900nM de primer forward, 900nM de primer reverse, 250uM de sonda, enzima de restrição HaeIII de 3 unidades e DNA de amostra. Após incubação em temperatura ambiente por 10 min, as gotículas foram geradas com o Gerador Automático de Gotículas (Bio-Rad). As condições de ciclagem térmica de PCR foram 10 minutos a 95 °C, seguidas de 40 ciclos de 94 °C por 30 segundos e 60 °C por 1 minuto, depois 98 °C por 10 minutos para desativar a enzima. Após as reações de PCR, as gotículas foram lidas no leitor de gotículas QX200TM (Bio-Rad). Os dados foram coletados e analisados usando o Quantasoftware. Os números de cópias de genes de HC e LC foram normalizados com base no número de cópias definido dos genes de referência Bax, Albumina, Hprt e b-microglobulina. Os primers utilizados neste estudo foram projetados usando o Primer Express v3.0 (Life Technologies). As sequências dos primers estão listadas na Tabela 4.

Tabela 4. Sequências de primers para PCR em gotas. Primers Sequência Cadeia Pesada - Primer Forward TCA AGG ACT ACT TCC CCG AAC C Cadeia Pesada - Primer Reverse TAG AGT CCT GAG GAC TGT AGG ACA GC Cadeia Pesada - Sonda VIC-ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GC-TAMRA Cadeia Leve - Primer forward GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC T Cadeia Leve - Primer Reverse GCA CAC AAC AGA AGC AGT TCC A Cadeia Leve - Sonda VIC-CCC GCC ATC TGA TGA GCA GTT GAA-TAMRA Bax - Primer Forward ACA CTG GAC TTC CTC CGA GA Bax - Primer Reverse GCA TTA GGA AGT TTG AGA ACC A Bax - Sonda FAM-CCC AGC CAC CCT GGT CTT GG-TAMRA Albumina - Primer Forward TTC GTG ACA GCT ATG GTG AAC TG Albumina - Primer Reverse GGT CAT CCT TGT GTT TCA GGA AA FAM- CTG TGC AAA ACA AGA ACC CGA AAG AAA CC- Albumina - Sonda

TAMRA Hprt - Primer Forward AAA GGA CAT AAT TGA CAC TGG TAA A Hprt - Primer Reverse CAA TTG CTT ATT GCT CCC AA

Hprt - Sonda FAM-CTG CTT TCC CTG GTC AAG CGG-TAMRA β-microglobulina - Primer

CTT CCT GAA CTG CTA TGT GTC TCA A Forward β-microglobulina - Primer

CCA TCT TCT TTC CAT TCT TCA ACA Reverse β-microglobulina -Sonda VIC- TTC ATC CCC CCC AAA TTG AAA TCG A-BHQ1

[00262] Análise de PCR (qRT-PCR ou Taqman) em Tempo Real Quantitativa: Amostras de RNA de culturas de cultivo celular foram purificadas usando o Qiagen RNeasy plus mini kit de acordo com as instruções do fabricante. Os ensaios de TaqMan RT-PCR foram realizados usando o TaqMan One® Step RT-PCR Master mix kit (Life Technologies). Cada reação de RT- TaqMan PCR continha RT-PCR Master mix, transcriptase reversa, 300nM de primer forward, 300nM de primer reverse, 100nM de sonda e 10 ng de amostra de RNA purificado. As condições de ciclagem térmica foram 30 min a 48 °C e 10 min a 95 °C, seguidas de 40 ciclos de 95 °C por 15 segundos e 60 °C por 1 min.

Todas as reações foram processadas no 7900 HT Fast Real Time PCR System (Life Technologies). Os dados foram analisados usando o software SDS v2.4 (Life Technologies) após a amplificação de TaqMan RT-PCR. Os níveis de expressão relativa de HC e LC foram determinados com base no método de análise delta Ct. O nível de expressão de um gene de manutenção, ciclofilina, foi usado como gene de referência para normalizar diferentes amostras de RNA em cada reação. Os primers utilizados neste estudo foram projetados usando o Primer Express v3.0 (Life Technologies). As sequências de primers estão listadas na Tabela 5.

Tabela 5. Sequências de primers para PCR em Tempo Real Quantitativa Primers Sequência Cadeia Pesada - Primer Forward TCA AGG ACT ACT TCC CCG AAC C Cadeia Pesada - Primer Reverse TAG AGT CCT GAG GAC TGT AGG ACA GC Cadeia Pesada - Sonda FAM-ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GC-TAMRA Cadeia Leve - Primer Forward TGA CGC TGA GCA AAG CAG AC Cadeia Leve - Primer Reverse CAG GCC CTG ATG GGT GAC

FAM-ACG AGA AAC ACA AAG TCT ACG CCT GCG A- Cadeia Leve - Sonda

TAMRA Ciclofilina de Hamster - Primer

GCG TTT CGG GTC CAG GA Forward Ciclofilina de Hamster - Primer

GAG TTG CCC ACA GTC GGA A Reverse FAM-TGG CAA AAC CAG CAA GAA GAT CAC CA- Ciclofilina de Hamster - Sonda

TAMRA

[00263] Análise de Western Blot: Os grânulos de células de culturas de cultivo celular foram lavados com PBS e ressuspensos em tampão de lise de NP-40 com o coquetel de inibidores de protease mini-cOmplete™ (Roche). Os lisados celulares foram centrifugados a 13000 RPM por 10 minutos e os sobrenadantes foram coletados. A concentração de proteína para cada lisado foi determinada usando o Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific). Concentrações iguais de proteína de cada lisado foram misturadas com tampão SDS-PAGE e NuPage Sample Reducing Agent (Invitrogen) antes de serem desnaturadas por calor por 5 minutos a 95 °C. Os lisados foram então carregados em géis Bis-Tris a 4-12% pré-fabricados de NuPage (Invitrogen) e submetidos a eletroforese. A proteína foi transferida para membranas de nitrocelulose usando o sistema iBlot (Invitrogen). As membranas foram bloqueadas durante 1 hora em temperatura ambiente usando solução de 5% leite desnatado em solução salina tris-tamponada contendo 0,1% de Tween 20 (TBS-T). Após o bloqueio, membranas foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente usando anticorpos primários específicos e depois lavadas 3 vezes por 10 minutos com TBS-T. O anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano silvestre foi adicionado por 1 hora em temperatura ambiente, seguido por 3 lavagens de 15 minutos com TBS-T. As membranas foram desenvolvidas usando o reagente de detecção Amersham ECL ou o reagente de detecção Amersham ECL Prime (GE Life Sciences). O Image Lab

5.1 (Biorad) foi utilizado para quantificação do sinal de banda. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: IgG-HRP anti-humano de cabra a 1:3000 (MP

Biomedicals) e actina anti-β de camundongo a 1:2500 (Sigma Alrdich). O seguinte anticorpo secundário foi utilizado: anti-camundongo de ovelha a 1:10000 (GE Healthcare UK).

Exemplo 9: A adição de uma cadeia leve extra à configuração de DNA de plasmídeo com uma cadeia pesada e uma cadeia leve melhora o título de anticorpos e a produtividade específica.

[00264] Para examinar o efeito do número de cópias de anticorpos na produtividade no hospedeiro de TI, foram gerados agrupamentos de RMCE transfectando um único plasmídeo contendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve (configuração HL) ou uma cadeia pesada e duas cadeias leves (configuração HLL). Após a seleção, recuperação e verificação do RMCE por citometria de fluxo, a produtividade dos agrupamentos foi avaliada em um ensaio de produção descontínua alimentada de 14 dias. Para três anticorpos separados (mAb-Q, mAb-S e mAb-T), foi observado um aumento de aproximadamente duas vezes no título para os agrupamentos HLL em comparação com os agrupamentos HL, impulsionado em grande parte por um aumento de 1,5 – 2,5 vezes em produtividade (Figura 18A e 18B). Clones de célula única adicionais foram gerados a partir dos agrupamentos transfectados usando diluição limitante e confirmaram que o título e a produtividade específica também são mais altos nos clones derivados da configuração HLL do que aqueles da configuração HL (Figura 18C, 18D).

Exemplo 10: A transfecção com até sete cadeias de anticorpos em agrupamentos de RMCE aumenta a produtividade e o título específicos de anticorpos.

[00265] O efeito de aumentar o número da cadeia de anticorpos na expressão do anticorpo foi avaliado. A configuração de plasmídeo único HLL foi comparada às configurações de plasmídeo duplo HLL-HL ou HLL-HLL para cinco anticorpos.

[00266] As configurações HLL-HL (cinco cadeias), HLL-HLL (seis cadeias) e HLL-HLHL (sete cadeias) para mAb Y foram comparadas. O título e a Qp de agrupamentos de RMCE em produção geralmente aumentaram das configurações HLL-HL para HLL-HLL e HLL-HLHL (Figura 19A, 19B), enquanto o crescimento (representado como parte a integrante da contagem viável de células, IVCC) entre os diferentes agrupamentos foi relativamente equivalente (Figura 19C). Observando a expressão do mRNA do anticorpo do cultivo celular nesses agrupamentos, um aumento no mRNA de cadeia leve passando de HLL- HL para HLL-HLL e HLL-HLHL, bem como um aumento do mRNA de cadeia pesada no agrupamento de HLL-HLHL em comparação com HLL-HL e agrupamentos de HLL-HLL foram observados (Figura 19D). Os níveis de proteína intracelular de cadeia pesada e de cadeia leve desses agrupamentos de RMCE também foram medidos usando western blot. Os níveis intracelulares de proteína da cadeia leve se aproximaram do observado para o mRNA de cadeia leve, com aumentos das configurações de cinco a seis e sete cadeias (Figuras 19E, 19F).

Exemplo 11: Clones de célula única com a configuração HLL-HLHL de sete cadeias têm título elevado e produtividade específica em dois anticorpos testados.

[00267] Para avaliar se o alto título e a produtividade da configuração de sete cadeias HLL-HLHL são mantidos após a clonagem de célula única, foram gerados monoclones de célula única dos agrupamentos de RMCE HLL-HL, HLL-HLL e HLL-HLHL de mAb Y. Estes monoclones foram então avaliados em um ensaio de produção descontínua alimentada de 14 dias.

Observando os 6 principais clones de cada configuração, verificou-se que o título e a Qp aumentaram ligeiramente da configuração HLL-HL para HLL-HLL e HLL- HLHL (Figura 20A, 20B), pois o crescimento permaneceu semelhante (Figura 20C).

[00268] Para confirmar que a configuração HLL-HLHL resulta em um alto título de monoclone, um mAb diferente, mAb III foi usado para gerar clones de célula única, derivados do Hospedeiro 4, a partir de agrupamentos de RMCE de HLL-HL (cinco cadeias) e HLL-HLHL (sete cadeias). Após avaliação em um ensaio de produção descontínua alimentada de 14 dias, foi observada uma clara vantagem de título dos clones HLL-HLHL sobre os clones HLL-HL (Figura 20D), maior que a observada no mAb U. O aumento do título parecia ser impulsionado principalmente pela Qp mais alta dos clones HLL-HLHL (Figura 20E), com pouca diferença média no IVCC entre as duas configurações (Figura 20F).

Exemplo 12: A posição da cadeia de anticorpos em um plasmídeo transfectado afeta sua produtividade.

[00269] O efeito da posição ou disposição da cadeia pesada e da cadeia leve nos plasmídeos transfectados na expressão do anticorpo também foi avaliado. Para fazer isso, os agrupamentos de RMCE foram gerados com plasmídeos contendo várias configurações diferentes de uma cadeia pesada e uma cadeia leve do mAb Z. Como os hospedeiros de TI da presente divulgação suportam a integração de dois plasmídeos diferentes no mesmo sítio de integração, o efeito da posição quando a cadeia pesada e a cadeia leve são expressas a partir do mesmo plasmídeo, bem como quando são separadas em plasmídeos anteriores ou posteriores, foi examinado (Figura 21A).

[00270] Após a geração dos agrupamentos de RMCE, o nível de expressão de mRNA da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo Z em culturas de cultivo celular foi medido. A expressão de mRNA da cadeia pesada diminuiu quando foi precedida pela cadeia leve, com a configuração de LH nos plasmídeos anteriores e posteriores tendo menor expressão de mRNA da cadeia pesada do que a configuração HL. No entanto, o efeito da posição na cadeia leve foi dependente de a partir de qual plasmídeo foi expresso: no plasmídeo anterior,

a expressão de mRNA da cadeia leve aumentou na configuração LH vs. HL, mas o oposto foi verdadeiro no plasmídeo posterior. Também foi observado que, enquanto um cassete de cadeia leve isolado no plasmídeo frontal expressava um alto nível de mRNA da cadeia leve, um único cassete de cadeia leve no plasmídeo posterior apresentava os níveis mais baixos de mRNA da cadeia leve de qualquer configuração (Figura 21B). Em geral, foram observados níveis mais baixos de expressão de mRNA para cadeia pesada e leve no plasmídeo posterior em comparação com o plasmídeo anterior.

[00271] Um ensaio de produção descontínua alimentada desses diferentes agrupamentos de RMCE produziu uma gama de títulos e produtividades específicas semelhantes à tendência na expressão de mRNA de anticorpos (Figura 21C, 21D). A configuração LH-no mAb apresentou Qp e título mais altos que o HL-no mAb, enquanto os agrupamento com menor nível de expressão de LC mRNA – H-L e sem mAb-LH – também apresentaram Qp e título mais baixos.

[00272] Para confirmar que as diferenças observadas no mRNA e na produtividade de anticorpos são devidas à posição da cadeia de anticorpos e não à variação no número absoluto de cópias, foi utilizado o PCR digital em gotas para medir o número de cópias das cadeias pesada e leve dos agrupamentos.

Como esperado, todos os agrupamentos tinham aproximadamente uma cópia de DNA de cadeia pesada e uma de cadeia leve (Figura 21E).

Exemplo 13: Efeito da razão HC para LC na % de espécies de alto peso molecular em mAbs.

[00273] O efeito da razão HC:LC de anticorpos na produtividade e em espécies de alto peso molecular (HMWS), tais como agregados, foi avaliado.

Além disso, o efeito no sítio de TI foi avaliado usando células com diferentes sítios de TI. Para fazer isso, os agrupamentos de RMCE foram gerados transfectando um único plasmídeo contendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve (configuração HL) ou uma cadeia pesada e duas cadeias leves (configuração HLL) nos locais do Hospedeiro 4 de TI ou Hospedeiro 7 de TI. A produtividade dos agrupamentos foi avaliada em um ensaio de produção descontínua alimentada de 14 dias (Figuras 22A e 22B). A %HMWS foi avaliada (Figuras 22B e 22D) mostrando que o efeito da razão HC:LC é independente do sítio de integração.

[00274] O efeito do aumento da cópia de LC e do anticorpo na produtividade e nas espécies de alto peso molecular (HMWS) foi avaliado em conexão com o mAb IV. Para fazer isso, os agrupamentos de RMCE foram gerados transfectando um único plasmídeo contendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve (configuração HL), uma cadeia pesada e duas cadeias leves (configuração HLL), duas cadeias pesadas e três cadeias leves (configuração HLL-HL), duas cadeias pesadas e quatro cadeias leves (configuração HLL-HLL), duas cadeias pesadas e cinco cadeias leves (configuração HLL-HLLL), três cadeias pesadas e 6 cadeias leves (configuração HLLL-HLLHL) ou três cadeias pesadas e 7 cadeias leves (configuração HLLL-HLLHLL) no local do sítio do Hospedeiro 4 ou no local do sítio dos hospedeiros 4 e 7 (Figuras 23 e 24).

[00275] Através de vários ensaios de avaliação de título e produção, vários clones foram identificados e avaliados em uma avaliação de produção ambr15 com um processo de produção específico. A partir dessa avaliação, os 10 principais clones, identificados pelo desempenho da cultura de células, título e atributos de qualidade do produto (incluindo agregação percentual), foram escolhidos para serem depositados em bancos para posterior avaliação. Por fim, foram geradas linhagens celulares de integração de 2 sítios que expressam o mAb-VI com título elevado, menor agregação percentual e qualidade de produção comparável às linhagens celulares do mAb-VI geradas anteriormente. A Figura 25 mostra os 2 clones superiores com títulos de 8,4 e 8,7 g/L com 7,4% e 5,6% de agregados, respectivamente.

Exemplo 14: Integração direcionada regulamentada: Avaliação de clones.

[00276] Nesta experiência, a expressão do anticorpo Z, em um derivado regulado do Hospedeiro 4, foi avaliada após a integração direcionada regulada de uma sequência que codifica o anticorpo. O sistema empregado para a regulação da expressão do anticorpo Z é composto por 3 componentes principais: 1) promotores regulados que incluem sequências tet-operon em tandem antes de uma sequência sinal, 2) sequências codificadoras de proteínas promotora e Tet-repressor e 3) um indutor, como doxiciclina, para permitir a expressão do anticorpo Z.

[00277] Após confirmação de que a integração direcionada da sequência que codifica o anticorpo Z, a avaliação do clone foi realizada em um processo de frasco de agitação A de alimentação de 10% (do volume total) nos dias 3, 7 e 10. Foi realizado um ensaio de cultura de produção para avaliar os clones. Todos os clones foram inoculados com uma densidade celular de 3 x 10 6 células/mL no dia 0. Nos dias 3, 7 e 10, foi adicionada doxiciclina a 1 µg/mL a todas as 36 culturas para induzir a expressão do anticorpo Z.

[00278] Os títulos finais e a produtividade específica (Qp) são mostrados nas Figuras 26 e 27, respectivamente. O Fluido de Cultura de Células Colhido (HCCF) do dia 14 foi submetido à análise de título. Os títulos variaram de 1 a 3,68 g/L (excluído o clone 7). A seleção de clones para o banco foi classificada primeiro por título e a seleção final foi baseada no desempenho da cultura de células, incluindo Qp e outros parâmetros. Os clones selecionados para o banco produziram títulos variando de 2,69 a 3,68 g/L.

[00279] Além das várias modalidades representadas e reivindicadas, o assunto divulgado também é direcionado para outras modalidades com outras combinações das características divulgadas e reivindicadas neste documento. Como tal, os recursos particulares apresentados neste documento podem ser combinados entre si de outras maneiras no escopo do assunto divulgado, de modo que o assunto divulgado inclua qualquer combinação adequada dos recursos divulgados neste documento. A descrição anterior de modalidades específicas do objeto divulgado foi apresentada para fins de ilustração e descrição. Esta não se destina a ser exaustiva ou a limitar o assunto divulgado para as modalidades divulgadas.

[00280] Será evidente para aqueles versados na técnica que várias modificações e variações podem ser feitas nas composições e métodos do assunto divulgado sem se afastar do espírito ou escopo do assunto divulgado.

Portanto, pretende-se que a presente divulgação inclua as modificações e variações que estejam no escopo das reivindicações em anexo e seus equivalentes.

[00281] Várias publicações, patentes e pedidos de patente são citados neste documento, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. CÉLULA HOSPEDEIRA DE INTEGRAÇÃO DIRECIONADA (TI) caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio de integração dentro de um locus específico do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1-7.

2. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela sequência nucleotídica imediatamente a 5' da sequência nucleotídica exógena integrada ser selecionada do grupo que consiste em sequências pelo menos cerca de 90% homólogas aos nucleotídeos 41190- 45269 de NW_006874047.1, nucleotídeos 63590-207911 de NW_006884592.1, nucleotídeos 253831-491909 de NW_006881296.1, nucleotídeos 69303-79768 de NW_003616412.1, nucleotídeos 293481-315265 de NW_003615063.1, nucleotídeos 2650443-2662054 de NW_006882936.1, ou nucleotídeos 82214- 97705 de NW_003615411.1.

3. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela sequência nucleotídica imediatamente a 5' da sequência nucleotídica exógena integrada ser selecionada do grupo que consiste em sequências a pelo menos 15 pares de bases, pelo menos 20 pares de bases, pelo menos 30 pares de bases, pelo menos 40 pares de bases, pelo menos 50 pares de bases, pelo menos 75 pares de bases, pelo menos 100 pares de bases, pelo menos 150 pares de bases, pelo menos 200 pares de bases, pelo menos 300 pares de bases, pelo menos 400 pares de bases, pelo menos 500 bases pares, pelo menos 1.000 pares de bases, pelo menos 1.500 pares de bases, pelo menos 2.000 pares de bases, pelo menos 3.000 pares de bases do nucleotídeo 45269 de NW_006874047.1, nucleotídeo 207911 de NW_006884592.1, nucleotídeo 491909 de NW_006881296.1, nucleotídeo 79768 de NW_003616412.1, nucleotídeo 315265 de NW_003615063.1, nucleotídeo

2662054 de NW_006882936.1 ou nucleotídeo 97705 de NW_003615411.1.

4. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela sequência nucleotídica imediatamente a 3' da sequência nucleotídica exógena integrada ser selecionada do grupo que consiste em sequências pelo menos cerca de 90% homólogas aos nucleotídeos 45270- 45490 de NW_006874047.1, nucleotídeos 207912- 792374 de NW_006884592.1, nucleotídeos 491910-667813 de NW_006881296.1, nucleotídeos 79769-100059 de NW_003616412.1, nucleotídeos 315266-362442 de NW_003615063.1, nucleotídeos 2662055-2701768 de NW_006882936.1, ou nucleotídeos 97706-105117 de NW_003615411.1.

5. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela sequência nucleotídica imediatamente a 3' da sequência nucleotídica exógena integrada ser selecionada do grupo que consiste em sequências a pelo menos 15 pares de bases, pelo menos 20 pares de bases, pelo menos 30 pares de bases, pelo menos 40 pares de bases, pelo menos 50 pares de bases, pelo menos 75 pares de bases, pelo menos 100 pares de bases, pelo menos 150 pares de bases, pelo menos 200 pares de bases, pelo menos 300 pares de bases, pelo menos 400 pares de bases, pelo menos 500 bases pares, pelo menos 1.000 pares de bases, pelo menos 1.500 pares de bases, pelo menos 2.000 pares de bases, pelo menos 3.000 pares de bases do nucleotídeo 45270 de NW_006874047.1, nucleotídeo 207912 de NW_006884592.1, nucleotídeo 491910 de NW_006881296.1, nucleotídeo 79769 de NW_003616412.1, nucleotídeo 315266 de NW_003615063.1, nucleotídeo 2662055 de NW_006882936.1 ou nucleotídeo 97706 de NW_003615411.1.

6. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pela sequência nucleotídica exógena integrada estar operacionalmente ligada a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em sequências pelo menos cerca de 90%

homólogas a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1-7.

7. CÉLULA HOSPEDEIRA DE INTEGRAÇÃO DIRECIONADA (TI) caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio de integração dentro de um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2 e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a eles.

8. CÉLULA HOSPEDEIRA TI caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio de integração operacionalmente ligado a um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a eles.

9. CÉLULA HOSPEDEIRA TI caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio de integração imediatamente adjacente a toda ou parte de uma sequência selecionada do grupo que consiste em sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1- 7.

10. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pela célula hospedeira TI ser uma célula hospedeira de mamífero.

11. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pela célula hospedeira TI ser uma célula hospedeira de hamster, uma célula hospedeira humana, uma célula hospedeira de rato ou uma célula hospedeira de camundongo.

12. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pela célula hospedeira TI ser uma célula hospedeira de ovário de hamster chinês (CHO), uma célula hospedeira CHO K1, uma célula hospedeira CHO K1SV, uma célula hospedeira DG44, uma célula hospedeira DUKXB-11, uma célula hospedeira CHOK1S ou uma célula hospedeira CHO K1M.

13. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pela sequência nucleotídica exógena compreender uma ou mais sequências de reconhecimento de recombinação (RRSs), em que a RRS pode ser reconhecida por uma recombinase.

14. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pela sequência nucleotídica exógena compreender pelo menos duas RRSs.

15. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizada pela recombinase ser uma Cre recombinase ou uma recombinase FLP.

16. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizada pela recombinase ser uma integrase Bxb1 ou uma integrase φC31.

17. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizada pela RRS ser selecionada do grupo que consiste em uma sequência LoxP, uma sequência LoxP L3, uma sequência LoxP 2L, uma sequência LoxFas, uma sequência Lox511, uma sequência Lox2272, uma sequência Lox2372, uma sequência Lox5171, uma sequência Loxm2, uma sequência Lox71, uma sequência Lox66, uma sequência FRT, uma sequência Bxb1 attP, uma sequência Bxb1 attB, uma sequência φC31 attP e uma sequência φC31 attB.

18. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizada pela sequência nucleotídica exógena compreender uma primeira e uma segunda RRS e pelo menos um marcador de seleção localizado entre a primeira e a segunda RRS.

19. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por compreender um primeiro marcador de seleção, em que o primeiro marcador de seleção é selecionado do grupo que consiste em aminoglicosídeo fosfotransferase (APH), higromicina fosfotransferase (HYG), neomicina, G418 APH), dihidrofolato redutase (DHFR), timidina quinase (TK), glutamina sintetase (GS), asparagina sintetase, triptofano sintetase (indol), histidinol desidrogenase (histidinol D), blasticidina, bleomicina, fleomicina, cloranfenicol, Zeocina e ácido micofenólico.

20. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada por compreender ainda um segundo marcador de seleção, em que o primeiro e o segundo marcador de seleção são diferentes.

21. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo segundo marcador de seleção ser selecionado do grupo que consiste em aminoglicosídeo fosfotransferase (APH), higromicina fosfotransferase (HYG), neomicina, G418 APH), dihidrofolato redutase (DHFR), timidina quinase (TK), glutamina sintetase (GS), asparagina sintetase, triptofano sintetase (indol), histidinol desidrogenase (histidinol D), blasticidina, bleomicina, fleomicina, cloranfenicol, Zeocina e ácido micofenólico.

22. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizada por compreender ainda um terceiro marcador de seleção e um sítio interno de entrada do ribossomo (IRES), em que o IRES está operacionalmente ligado ao terceiro marcador de seleção.

23. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo terceiro marcador de seleção ser diferente do primeiro ou do segundo marcador de seleção.

24. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizada pelo terceiro marcador de seleção ser selecionado do grupo que consiste em um marcador de proteína verde fluorescente (GFP), um marcador de GFP melhorada (eGFP), um marcador de GFP sintética, uma proteína fluorescente amarela (YFP), um marcador de YFP melhorada (eYFP), um marcador de proteína fluorescente azul (CFP), um marcador mPlum, um marcador mCherry, um marcador tdTomato, um marcador mStrawberry, um marcador J-red, um marcador de monômero DsRed, um marcador mOrange, um marcador mKO, um marcador mCitrine, um marcador Venus, um marcador YPet, um marcador Emerald6, um marcador CyPet, um marcador mCFPm, um marcador Cerulean e um marcador T-Sapphire.

25. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 24, caracterizada por compreender ainda uma terceira RRS, em que a terceira RRS está localizada entre a primeira e a segunda RRS, e a terceira RRS é heteroespecífica em relação à primeira ou à segunda RRS.

26. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 25, caracterizada pela sequência nucleotídica exógena compreender pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma sequência exógena de interesse (SOI).

27. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 26, caracterizada pela sequência nucleotídica exógena compreender ainda pelo menos uma SOI exógena.

28. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pela SOI exógena estar localizada entre a primeira e a segunda RRS.

29. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizada pela SOI codificar um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

30. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 29, caracterizada pela sequência nucleotídica exógena compreender ainda pelo menos uma SOI exógena localizada entre a primeira e a terceira RRS e pelo menos uma SOI exógena localizada entre a terceira e a segunda RRS.

31. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pela SOI codificar um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

32. MÉTODO PARA PREPARAR UMA CÉLULA HOSPEDEIRA TI que expressa um polipeptídeo de interesse, caracterizado por compreender: a) fornecer uma célula hospedeira TI compreendendo uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira TI, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada das SEQ ID NO. 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende duas RRSs, flanqueando pelo menos um primeiro marcador de seleção; b) introduzir, na célula fornecida em a), um vetor compreendendo duas RRSs correspondentes às duas RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs; e d) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para, desse modo, isolar uma célula hospedeira TI que expressa o polipeptídeo.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pela recombinase ser uma Cre recombinase ou uma recombinase FLP.

34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pela recombinase ser uma integrase Bxb1 ou uma integrase φC31.

35. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 34, caracterizado pela SOI codificar um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

36. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32- 35, caracterizado pela célula hospedeira TI ser uma célula hospedeira de mamífero.

37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pela célula hospedeira TI ser uma célula hospedeira de hamster, uma célula hospedeira humana, uma célula hospedeira de rato ou uma célula hospedeira de camundongo.

38. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36 ou 37, caracterizado pela célula hospedeira TI ser uma célula hospedeira CHO, uma célula hospedeira CHO K1, uma célula hospedeira CHO K1SV, uma célula hospedeira DG44, uma célula hospedeira DUKXB-11, uma célula hospedeira CHOK1S, ou uma célula hospedeira CHO K1M.

39. MÉTODO PARA EXPRESSAR UM POLIPEPTÍDEO DE INTERESSE, caracterizado por compreender: a) fornecer uma célula hospedeira TI compreendendo pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um marcador de seleção, em que a pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um marcador de seleção sejam flanqueados por duas RRSs integradas dentro de um locus do genoma da célula hospedeira TI, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1-7; e b) cultivar a célula em a) sob condições adequadas para expressar o polipeptídeo de interesse e recuperar um polipeptídeo de interesse a partir disto.

40. MÉTODO PARA PREPARAR UMA CÉLULA HOSPEDEIRA TI que expressa pelo menos um primeiro e segundo polipeptídeo de interesse, caracterizado por compreender: a) fornecer uma célula hospedeira TI compreendendo uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira e uma segunda RRS flanqueando pelo menos um primeiro marcador de seleção, e uma terceira RRS localizada entre a primeira e a segunda RRS, e todas as RRSs são heteroespecíficas; b) introduzir, na célula fornecida em a), um primeiro vetor compreendendo duas RRSs correspondentes à primeira e à terceira RRS na sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos uma primeira SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir, na célula fornecida em a), um segundo vetor compreendendo duas RRSs correspondentes à segunda e à terceira RRS na sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos uma segunda SOI exógena; d) introduzir uma ou mais recombinases, ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais recombinases, em que a uma ou mais recombinases reconhecem as RRSs; e e) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para isolar, desse modo, uma célula hospedeira TI que expressa o primeiro e o segundo polipeptídeo de interesse.

41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pela recombinase ser uma Cre recombinase ou uma recombinase FLP.

42. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pela recombinase ser uma integrase Bxb1 ou uma integrase φC31.

43. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo primeiro vetor compreender ainda uma sequência promotora operacionalmente ligada ao códon ATG posicionado flanqueado a montante pela primeira SOI e a jusante por uma RRS; e o segundo vetor compreende ainda um marcador de seleção sem um códon de iniciação da transcrição ATG flanqueado a montante por uma RRS e a jusante pela segunda SOI.

44. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada por pelo menos uma SOI codificar um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

45. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 43, caracterizado pela primeira SOI codificar um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

46. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 43, caracterizado pela segunda SOI codificar um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

47. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 46, caracterizado pela célula hospedeira TI ser uma célula hospedeira de mamífero.

48. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pela célula hospedeira TI ser uma célula hospedeira de hamster, uma célula hospedeira humana, uma célula hospedeira de rato ou uma célula hospedeira de camundongo.

49. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pela célula hospedeira TI ser uma célula hospedeira CHO, uma célula hospedeira CHO K1, uma célula hospedeira CHO K1SV, uma célula hospedeira

DG44, uma célula hospedeira DUKXB-11, uma célula hospedeira CHOK1S, ou uma célula hospedeira CHO K1M.

50. MÉTODO PARA EXPRESSAR UM POLIPEPTÍDEO DE INTERESSE, caracterizado por compreender: a) fornecer uma célula hospedeira compreendendo pelo menos duas SOIs exógenas e pelo menos um marcador de seleção integrado dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs 1- 7, em que pelo menos uma SOI exógena e um marcador de seleção são flanqueados por uma primeira e uma terceira RRS e pelo menos uma SOI exógena é flanqueada por uma segunda e terceira RRS; e b) cultivar a célula em a) sob condições adequadas para expressar o polipeptídeo de interesse e recuperar um polipeptídeo de interesse a partir disto.

51. VETOR caracterizado por compreender duas sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a a. duas sequências de referência selecionadas de qualquer parte da SEQ ID NO. 1; b. duas sequências de referência selecionadas de qualquer parte da SEQ ID NO. 2; c. duas sequências de referência selecionadas de qualquer parte da SEQ ID NO. 3; d. duas sequências de referência selecionadas de qualquer parte da SEQ ID NO. 4; e. duas sequências de referência selecionadas de qualquer parte da SEQ ID NO. 5; f. duas sequências de referência selecionadas de qualquer parte da SEQ ID NO. 6; ou g. duas sequências de referência selecionadas de qualquer parte da SEQ ID NO. 7, em que as referidas sequências flanqueiam um cassete de DNA, e em que o cassete de DNA compreende pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena flanqueada por duas RRSs.

52. VETOR, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo vetor ser selecionado do grupo que consiste em um vetor adenoviral, um vetor de vírus adeno-associado, um vetor lentiviral, um vetor retroviral, um vetor de fago de integração, um vetor não viral, um transposon e/ou vetor de transposase, um substrato de integrase e um plasmídeo.

53. VETOR, de acordo com a reivindicação 51 ou 52, caracterizado pela SOI codificar um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

54. MÉTODO PARA PREPARAR UMA CÉLULA HOSPEDEIRA TI que expressa um polipeptídeo de interesse, caracterizado por compreender: a) fornecer uma célula hospedeira compreendendo um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1-7; b) introduzir um vetor na célula hospedeira, em que o vetor compreende sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1-7 que flanqueiam um cassete de DNA, em que o cassete de DNA compreende pelo menos um marcador de seleção e pelo menos uma SOI exógena flanqueada por duas RRSs; e c) selecionar o marcador de seleção para isolar uma célula hospedeira TI com a SOI integrada no locus do genoma e expressar o polipeptídeo de interesse.

55. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo vetor ser selecionado do grupo que consiste em um vetor adenoviral, um vetor de vírus adeno-associado, um vetor lentiviral, um vetor retroviral, um vetor de fago de integração, um vetor não viral, um transposon e/ou vetor de transposase, um substrato de integrase e um plasmídeo.

56. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 54 ou 55, caracterizada por pelo menos uma SOI codificar um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

57. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 56, caracterizado pela célula hospedeira TI ser uma célula hospedeira de mamífero.

58. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pela célula hospedeira TI ser uma célula hospedeira de hamster, uma célula hospedeira humana, uma célula hospedeira de rato ou uma célula hospedeira de camundongo.

59. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 57 ou 58, caracterizado pela célula hospedeira TI ser uma célula hospedeira CHO, uma célula hospedeira CHO K1, uma célula hospedeira CHO K1SV, uma célula hospedeira DG44, uma célula hospedeira DUKXB-11, uma célula hospedeira CHOK1S, ou uma célula hospedeira CHO K1M.

60. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 57, caracterizado pela integração do ácido nucleico compreendendo a pelo menos uma SOI e o marcador de seleção é promovida por uma nuclease exógena.

61. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pela nuclease exógena ser selecionada do grupo que consiste em uma nuclease dedo de zinco (ZFN), um dímero de ZFN, uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma proteína de fusão com domínio de efetor TAL, uma endonuclease de DNA guiada por RNA, uma meganuclease manipulada e uma endonuclease (Cas) associada a repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR).

62. CÉLULA HOSPEDEIRA TI caracterizada por compreender pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio de integração dentro de um ou mais loci específicos do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada de SEQ ID NOs 1-7.

63. CÉLULA HOSPEDEIRA TI caracterizada por compreender pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada em um ou mais sítios de integração dentro de um gene endógeno selecionado do grupo que consiste em LOC107977062, LOC100768845, ITPR2, ERE67000.1, UBAP2, MTMR2, XP_003512331.2, e sequências pelo menos cerca de 90% homólogas a eles.

64. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 63, caracterizada por pelo menos uma sequência nucleotídica exógena compreender uma ou mais sequências de reconhecimento de recombinação (RRSs), em que a RRS pode ser reconhecida por uma recombinase.

65. CÉLULA HOSPEDEIRA TI, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada por pelo menos uma sequência nucleotídica exógena compreende ainda pelo menos uma SOI exógena.

66. MÉTODO PARA PREPARAR UMA CÉLULA HOSPEDEIRA TI que expressa pelo menos um polipeptídeo de interesse, caracterizado por compreender: e) fornecer uma célula hospedeira TI compreendendo pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um ou mais loci do genoma da célula hospedeira TI, em que o um ou mais loci são pelo menos cerca de 90% homólogos a uma sequência selecionada das SEQ ID NO.

1-7, em que a pelo menos uma sequência nucleotídica exógena compreende duas RRSs, flanqueando pelo menos um primeiro marcador de seleção; f) introduzir, na célula fornecida em a), um vetor compreendendo duas RRSs correspondentes às duas RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos uma SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; g) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs; e selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para isolar, desse modo, uma célula hospedeira TI que expressa o pelo menos um polipeptídeo de interesse.

67. MÉTODO PARA PREPARAR UMA CÉLULA HOSPEDEIRA TI que expressa pelo menos um primeiro e segundo polipeptídeo de interesse, caracterizado por compreender: a) fornecer uma célula hospedeira TI compreendendo pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um ou mais loci do genoma da célula hospedeira, em que um ou mais loci são pelo menos cerca de 90% homólogos a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs.

1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira e uma segunda RRS flanqueando pelo menos um primeiro marcador de seleção, e uma terceira RRS localizada entre a primeira e a segunda RRS, e todas as RRSs são heteroespecíficas; b) introduzir, na célula fornecida em a), um primeiro vetor compreendendo duas RRSs correspondentes à primeira e à terceira RRS na pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos uma primeira SOI exógena e pelo menos um segundo marcador de seleção; c) introduzir, na célula fornecida em a), um segundo vetor compreendendo duas RRSs correspondentes à segunda e à terceira RRS na pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos uma segunda SOI exógena; d) introduzir uma ou mais recombinases, ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais recombinases, em que a uma ou mais recombinases reconhecem as RRSs; e e) selecionar células TI que expressam o segundo marcador de seleção para isolar, desse modo, uma célula hospedeira TI que expressa os pelo menos primeiro e segundo polipeptídeos de interesse.

68. MÉTODO PARA PREPARAR UMA CÉLULA HOSPEDEIRA TI que expressa um polipeptídeo de interesse, caracterizado por compreender: a) fornecer uma célula hospedeira TI compreendendo pelo menos uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um ou mais loci do genoma da célula hospedeira TI, em que o um ou mais loci são pelo menos cerca de 90% homólogos a uma sequência selecionada das SEQ ID NO.

1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma ou mais RRSs; b) introduzir, na célula fornecida em a), um vetor compreendendo uma ou mais RRSs correspondentes a uma ou mais RRSs na sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos uma SOI exógena e operacionalmente ligada a pelo menos um promotor regulável; c) introduzir uma recombinase ou um ácido nucleico que codifica uma recombinase, em que a recombinase reconhece as RRSs; e d) selecionar células TI que expressam o polipeptídeo exógeno de interesse na presença de um indutor para isolar, desse modo, uma célula hospedeira TI que expressa o polipeptídeo de interesse.

69. MÉTODO PARA EXPRESSAR UM POLIPEPTÍDEO DE INTERESSE, caracterizado por compreender: a) fornecer uma célula hospedeira compreendendo pelo menos uma SOI exógena flanqueada por duas RRSs e um promotor regulável integrado dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs.

1-7; e b) cultivar a célula sob condições adequadas para expressar a SOI e recuperar um polipeptídeo de interesse a partir dela.

70. MÉTODO PARA PREPARAR UMA CÉLULA HOSPEDEIRA TI que expressa um primeiro e segundo polipeptídeo de interesse, caracterizado por compreender: a) fornecer uma célula hospedeira TI compreendendo uma sequência nucleotídica exógena integrada em um sítio dentro de um locus do genoma da célula hospedeira, em que o locus é pelo menos cerca de 90% homólogo a uma sequência selecionada das SEQ ID NOs. 1-7, em que a sequência nucleotídica exógena compreende uma primeira, uma segunda RRS e uma terceira RRS localizada entre a primeira e a segunda RRS, e todas as RRSs são heteroespecíficas; b) introduzir, na célula fornecida em a), um primeiro vetor compreendendo duas RRSs correspondentes à primeira e à terceira RRS na sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos uma primeira SOI exógena operacionalmente ligada a um promotor regulável; c) introduzir, na célula fornecida em a), um segundo vetor compreendendo duas RRSs correspondentes à segunda e à terceira RRS na sequência nucleotídica exógena integrada e flanqueando pelo menos uma segunda SOI exógena operacionalmente ligada a um promotor regulável; d) introduzir uma ou mais recombinases, ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais recombinases, em que a uma ou mais recombinases reconhecem as RRSs; e e) selecionar células TI que expressam o primeiro e segundo polipeptídeos exógenos de interesse na presença de um indutor para isolar, desse modo, uma célula hospedeira TI que expressa o primeiro e segundo polipeptídeos de interesse.

71. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66, 68 e 69, caracterizado pela integração de um ácido nucleico compreendendo pelo menos uma SOI ser promovida por uma nuclease exógena.

72. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 67 ou 70, caracterizado pela primeira SOI codificar um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc; e a segunda SOI codifica um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

73. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pela nuclease exógena ser selecionada do grupo que consiste em uma nuclease dedo de zinco (ZFN), um dímero de ZFN, uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma proteína de fusão com domínio de efetor TAL, uma endonuclease de DNA guiada por RNA, uma meganuclease manipulada e uma endonuclease (Cas) associada a repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR).

74. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 70, caracterizado pelo promotor regulável ser selecionado do grupo que consiste nos promotores SV40 e CMV.

75. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 e 70, caracterizado pelo: a. o primeiro vetor compreende ainda uma sequência promotora operacionalmente ligada ao códon ATG posicionado flanqueado a montante pela primeira SOI e a jusante por uma RRS; e b. o segundo vetor compreende ainda um marcador de seleção sem um códon de iniciação da transcrição ATG flanqueado a montante por uma RRS e a jusante pela segunda SOI.

76. VETOR caracterizado por compreender duas sequências nucleotídicas pelo menos 50% homólogas a duas sequências selecionadas de qualquer parte das SEQ ID NOs. 1-7, a. duas sequências de referência selecionadas de qualquer parte da SEQ ID NO. 1; b. duas sequências de referência selecionadas de qualquer parte da SEQ ID NO. 2; c. duas sequências de referência selecionadas de qualquer parte da SEQ ID NO. 3; d. duas sequências de referência selecionadas de qualquer parte da SEQ ID NO. 4; e. duas sequências de referência selecionadas de qualquer parte da SEQ ID NO. 5; f. duas sequências de referência selecionadas de qualquer parte da SEQ ID NO. 6; ou g. duas sequências de referência selecionadas de qualquer parte da SEQ ID NO. 7, em que as referidas sequências flanqueiam um cassete de DNA, e em que o cassete de DNA compreende pelo menos uma SOI exógena operacionalmente ligada a um promotor regulável e flanqueada por duas RRSs.

77. VETOR, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pela SOI codificar um anticorpo de cadeia única, uma cadeia leve de anticorpo, uma cadeia pesada de anticorpo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou uma proteína de fusão Fc.

Figura 1

Introduzir cassetes de RMCE que expressam anticorpos em hospedeiro CHO através de integração baseada em transposase ou aleatória

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 201/244 Identificou clones com poucas cópias gênicas de anticorpos e alta produtividade

RMCE com uma plataforma de GFP

Clonagem de célula única em 384 placas de poços 1/42

Recuperou SCC

Triou para células de GFP+/mAb-

7 hospedeiros de TI

Figura 2. RMCE de plasmídeo único A) Hospedeiros de TI gerados por transponase Marcador Marcador Selecionável 1 Selecionável 2

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 202/244 Marcador Selecionável 3

Marcador Marcador Selecionável 3 Selecionável 2 2/42

B) Hospedeiros de TI gerados por integração aleatória

Marcador Marcador Selecionável 4 Selecionável 2

Marcador Selecionável 3

Marcador Marcador Selecionável 4 Selecionável 2

P = promotor

Figura 3

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 203/244 Títulos do dia 14 em meios de plataforma e condição de processo sem qualquer otimização

Título (g/L) 3/42

RI vs TI dentro da Molécula

Figura 4. RMCE de dois plasmídeos

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 204/244 Marcador Marcador Selecionável 1 Selecionável 2

Marcador Selecionável 1 (-ATG) 4/42

RRS3-Marcador Marcador Selecionável 3 Selecionável 2

P = promotor

Figura 5.

Qp de Agrupamento Relativa Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 205/244 RMCE de plasmídeo único RMCE de dois plasmídeos Qp em relação ao cassete de sinal Anticorpo Anticorpo Anticorpo Anticorpo Anticorpo 5/42 Título de Agrupamento Relativo RMCE de plasmídeo único RMCE de dois plasmídeos Anticorpo Anticorpo Anticorpo Anticorpo Anticorpo Títulação em relação ao cassete de sinal

Figura 6.

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 206/244 Título (g/L) 6/42 Dia 14 Dia 16 Limite Dia 14 Dia 16 Limite Dia 14 Dia 16 Limite Dia 14 Dia 16 Limite Dia 14 Dia 16 Limite Dia 14 Dia 16 Limite Clones de TI

Figura 7.

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 207/244 Molécula Biespecífica A Molécula Biespecífica B 7/42 Biespecífica (%) Biespecífica (%)

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 208/244 Figura 8.

Título de produção (g/L) do balão de agitação do Dia 14 Título do Dia 14 de Moléculas Biespecíficas 8/42

Figura 9A.

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 209/244 # de desenvolvimentos Linhagens Molécula Títulos observados de linhagem celular celulares triadas mAb-I (Molécula Abaixo de 50% da difícil de expressar) 4 tentativas faixa típica mAb-II (Molécula de Faixa típica expressão média) 1 tentativas (>2g/L) 9/42

Figura 9B.

Vetor com promotor de CMV-TO induzível Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 210/244 Tet-repressor Promotor de CMV-TO Vetores de mAb-I ou Cadeia Pesada mAb-II transfectados no hospedeiro de Cadeia Leve Integração Direcionado “Induzidos” “Não Induzidos” +Seleção +Seleção 10/42 Agrupamentos Agrupamentos “Não “Induzidos” Induzidos” Escolha e expanda Escolha e expanda linhagens celulares linhagens celulares superiores superiores Ensaio de produção com ou sem Dox

Figura 10. Título final de produção

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 211/244 Título relativo Isolamento de Isolamento de Isolamento de Isolamento de linhagem celular linhagem celular linhagem celular linhagem celular “Não Induzido” “Induzido” “Não Induzido” “Induzido”

IVCC final de produção 11/42

Isolamento de Isolamento de Isolamento de Isolamento de linhagem celular linhagem celular linhagem celular linhagem celular “Induzido”

Crescimento relativo (célula 1E8-d/L) “Não Induzido” “Não Induzido” “Induzido”

Figura 10 (continuação).

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 212/244 Produtividade específica do final da produção 12/42 Qp relativa (pg/célula-dia) Isolamento de Isolamento de Isolamento de Isolamento de linhagem celular linhagem celular linhagem celular linhagem celular “Não Induzido” “Não Induzido” “Não Induzido” “Não Induzido”

Figura 11. Níveis relativos de mRNA de HC

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 213/244 Isolamento de Isolamento de Isolamento de Isolamento de linhagem celular linhagem celular linhagem celular linhagem celular “Não Induzido” “Induzido” “Não Induzido” “Induzido” 13/42

Níveis relativos de mRNA de LC

Isolamento de Isolamento de Isolamento de Isolamento de linhagem celular linhagem celular linhagem celular linhagem celular “Não Induzido” “Induzido” “Não Induzido” “Induzido”

Figura 12. Indução de dox e efeitos do tratamento de CHX em sistema induzível

Transcrição Tradução

Dobra &

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 214/244 secreção

CHX foi removida após 5 horas de tratamento de CHX

Linhagem celular 3a Linhagem celular 4a Linhagem celular 3b Linhagem celular 4b CHX removida Tempo (min): 14/42 de Sup

(exposição longa)

(exposição longa) Lisato Direto

(exposição longa)

Actina

Figura 12 (continuação).

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 215/244 Linhagem Linhagem Linhagem Linhagem Linhagem Linhagem Linhagem Linhagem celular 3a celular 4a celular 3b celular 4b celular 3a celular 4a celular 3b celular 4b (Dias) 15/42 Actina Actina

Figura 13.

Isolamento “Não induzido” Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 216/244 HC/LC HC regulada regulada LC constitutiva Título do fim da produção Agrupamento: Título Relativo 16/42 Isolamento Isolamento Isolamento Isolamento “Não Induzido” “Não Induzido” “Não Induzido” “Induzido” HC/LC regulada HC regulada/LC constitutiva Actina

Figura 13 (continuação). Diagrama esquemático de construtos de mAb com troca de cadeia

Promotor de CMV-TO

Cadeia Pesada

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 217/244 Cadeia Leve 17/42

Experimento de remoção de dox

Agrup. 1 Agrup. 2 Agrup. 1 Agrup. 2 Agrup. 1 Agrup. 2 Agrup. 1 Agrup. 2

(Dias)

(exposição longa)

Actina

Figura 14. Título do fim da produção

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 218/244 Título relativo Agrup. 1 Agrup. 2 Agrup. 1 Agrup. 2 Agrup. 1 Agrup. 2 Agrup. 1 Agrup. 2 18/42

IVCC do fim da produção

Agrup. 1 Agrup. 2 Agrup. 1 Agrup. 2 Agrup. 1 Agrup. 2 Agrup. 1 Agrup. 2 Crescimento relativo (células1E8-d/L)

Figura 14 (continuação).

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 219/244 Produtividade específica do fim da produção 19/42 Qp relativa (pg/célula-dia) Agrup. 1 Agrup. 2 Agrup. 1 Agrup. 2 Agrup. 1 Agrup. 2 Agrup. 1 Agrup. 2

Figura 15.

Leve Variável Leve Constante 6 aa mais longo em CDR1 Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 220/244 1 aa mais longo em CDR3 20/42 Pesada Variável Pesada Constante Aglicolisada aa hidrofóbico Glicolisada aa aromático + polar

Figura 16.

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 221/244 Título de final da produção 21/42 Título Relativo Agrupamento: Actina dm = mutante duplo, e

Figura 16 (continuação).

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 222/244 Alcançar títulos esperados. Clones com títulos Causa principal é toxicidade de esperados Anticorpo produto imediata ou crônica.

candidato Todos os clones possuem para CLD títulos abaixo da faixa esperada Gerar agrupamentos ou clones de RTI Monitorar Transcrição baixa é níveis de resolvida ao mudar o Todos os clones transcrição possuem títulos abaixo vetor ou o promotor 22/42 da faixa esperada.

Monitorar tradução, Se a secreção e eliminação transcrição é do anticorpo. normal Usar a abordagem de Monitorar Confirmar se o estresse troca de cadeia para estresse é reversível ou não identificar a reprojetar celular. (remoção de Dox) subunidades problemáticas

Figura 17.

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 223/244 Título D14 (g/L) Sítio de Hospedeiro de RMCE Plataforma A Plataforma B 23/42 Sítio de Hospedeiro de RMCE Plataforma A Plataforma B

Figura 17 (continuação).

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 224/244 24/42 IVCC (10^8 célula-d/L) Sítio de Hospedeiro de RMCE Plataforma A Plataforma B

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 225/244 Figura 18.

Título (g/L) Título (g/L) Qp (pg/célula-d) Qp (pg/célula-d) 25/42

Qp (pg/célula-d) IVCC (10^8 célula/d-L) Título Figura 19.

Título (g/L)

Figura 19 (continuação).

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 227/244 Expressão relativa de mRNA Expressão relativa de proteína Expressão relativa mudança de dobra 27/42 Actina

Qp (pg/célula-d)

IVCC (10^8 célula/d-L) Título

Título (g/L) Figura 20.

Qp (pg/célula-d) IVCC (10^8 célula/d-L) Título Figura 20 (continuação).

Título (g/L)

Figura Figura 21.

Cassete anterior Cassete posterior Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 230/244 30/42 Expressão relativa de mRNA Nível de expressão relativa número de cópia de DNA Qp (pg/célula-d) Título número de cópia Figura 21 (continuação).

título (g/L)

Figura 22.

Título de mAb S (sítio do Hospedeiro 7) Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 232/244 Título do Dia 14 (g/L) 32/42 Configuração de plasmídeo Razão HC:LC:

Figura 22 (continuação).

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 233/244 % HMWS de mAb S (sítio do Hospedeiro 7) 33/42 Configuração de plasmídeo Razão HC:LC:

Figura 22 (continuação).

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 234/244 Título de mAb S (sítio do Hospedeiro 4) Título do Dia 14 (g/L) 34/42 Configuração de plasmídeo Razão HC:LC:

Figura 22 (continuação).

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 235/244 %HMWS de mAb S (sítio do Hospedeiro 4) 35/42 Configuração de plasmídeo Razão HC:LC:

Figura 23.

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 236/244 Título de mAb IV (sítio do Hospedeiro 4) Título do Dia 14 (g/L) 36/42 Agrup. de HLL-HL Agrup. de HLL-HLL Agrup. de HLL-HLLL Configuração de plasmídeo Razão HC:LC:

Figura 23 (continuação).

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 237/244 % HMWS de mAb IV (sítio do Hospedeiro 4) 37/42 Agrup. de HLL-HL Agrup. de HLL-HLL Agrup. de HLL-HLLL Configuração de plasmídeo Razão HC:LC:

Figura 24.

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 238/244 Título de mAb IV (sítio do Hospedeiro 8) Título do Dia 14 (g/L) 38/42 Agrup. de HLLL-HLLHL Agrup. de HLLL-HLLHLL Configuração de plasmídeo Razão HC:LC:

Figura 24 (continuação).

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 239/244 % HMWS de mAb VI (sítio do Hospedeiro 8) 39/42 Agrup. de HLLL-HLLHL Agrup. de HLLL-HLLHLL Configuração de plasmídeo Razão HC:LC:

Hospedeiro 8

Título D14 (g/L)

Título D14 (g/L) Figura 25.

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 241/244 Título (g/L) Figura 26.

Y:43 - Título do Dia 14 Agrupamento 1 Agrupamento 2 Agrupamento 3 Agrupamento 4 nSB precursor 41/42

Petição 870200102426, de 14/08/2020, pág. 242/244 Qp (pg/célula-d) Figura 27.

Qp do Dia 14 Agrupamento 1 Agrupamento 2 Agrupamento 3 Agrupamento 4 PSB precursor 42/42