JP2022538073A - 核酸のランダム化された構成標的化組込み - Google Patents
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Abstract
本開示の主題は、組換えタンパク質、例えばモノクローナル抗体、並びにそれに由来する組成物、例えば二重特異性抗体、及び他の複雑なフォーマットのタンパク質、例えば膜タンパク質複合体、及び他の発現困難な分子を発現することができる宿主細胞を生成及び同定するための「ランダム化された構成標的化組込み」(本明細書では「ランダム化された鎖標的化組込み」とも呼ばれる)(RCTI)戦略に関する。【選択図】図1A-1B
Description
本出願は、2019年6月26日に出願された米国仮出願第62/866,893号及び2020年3月19日に出願された米国仮出願第62/991,708号の優先権を主張し、これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、各々の優先権が主張される。
本開示の主題は、組換えタンパク質、例えばモノクローナル抗体、並びにそれに由来する組成物、例えば二重特異性抗体、及び他の複雑なフォーマットのタンパク質、例えば膜タンパク質複合体、及び他の発現困難な分子を発現することができる宿主細胞を生成及び同定するための「ランダム化された構成標的化組込み」(本明細書では「ランダム化された鎖標的化組込み」とも呼ばれる)(RCTI)戦略に関する。
配列表
本明細書は、配列表(2020年6月26日に「00B206_0926_SL.txt」という名称の.txtファイルとして電子的に提出)を参照する。00B206_0926_SL.txtファイルは2020年6月24日に作成されたものであり、サイズは1,296,777バイトである。配列表の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書は、配列表(2020年6月26日に「00B206_0926_SL.txt」という名称の.txtファイルとして電子的に提出)を参照する。00B206_0926_SL.txtファイルは2020年6月24日に作成されたものであり、サイズは1,296,777バイトである。配列表の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
細胞生物学及び免疫学の急速な進歩により、癌、心血管疾患及び代謝疾患を含む様々な疾患のための新規治療用組換えタンパク質、例えばモノクローナル抗体、二重特異性抗体及び複雑なフォーマットのタンパク質を開発する需要が高まっている。これらのバイオ医薬品候補は、一般に、目的のタンパク質を発現することができる市販の細胞株によって製造される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、近年、治療用モノクローナル抗体又は二重特異性抗体並びにより複雑なフォーマットのタンパク質を生産するように広く適合されている。
市販の細胞株を開発するための従来の戦略は、一般に、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をランダムに又は特定の(「標的化された」)位置に組み込み、続いてそのポリペプチドを生産する細胞株を選択及び単離することを目的とした反復努力を含む。しかしながら、これらの手法は、それら自体の特有の欠点を有する。ランダム組込み法は、発現を目的とする導入遺伝子の異なる組成及び比率を有する異なるクローンを得る可能性を提供するが、望ましい発現レベル、製品品質属性、及び生産培養性能を示す細胞株を単離するためにトランスフェクション後に数百又は数千のクローンをスクリーニングすることは、時間がかかり、資源集約的である。さらに、様々な導入遺伝子の最適な比率を有するクローン(単数又は複数)が存在しないか、不安定性又は十分な数のクローンをスクリーニングすることができないために単離されない可能性がある。さらに、多重鎖ポリペプチド、例えばモノクローナル抗体を生産する場合、そのようなポリペプチドをコードする核酸の数及び配置に対処するためのさらなるスクリーニングが必要とされ得る。ランダム組込み法を使用する場合、ゲノムに導入されたすべての導入遺伝子の数及び位置並びにそれらの配置を決定することは困難であり、これは、導入遺伝子の配置/コピー数と所望の産物属性との間の合理的な相関を作成する上で重要なステップである。
対照的に、導入遺伝子(単数又は複数)がゲノム内の所定の特定の位置に挿入されている場合、標的化組込み手法は、各特定の導入遺伝子の配置及びコピー数に対するより多くの制御を提供することができる。しかしながら、そのような標的化組込み手法は、異なる導入遺伝子のランダムな組み合わせ及び比率を生成する可能性を最小限に抑えるように設計されている。したがって、導入遺伝子の設計された配置及びコピー数が偶然に準最適である場合、同様に、得られるクローンのすべてが準最適な製品品質及び/又は力価を有するであろう。標的化組込み手法を使用して複雑な分子又は発現困難な分子を発現させる機会を増加させるために、複数の異なる導入遺伝子配置及びコピー数構成が個別に試験され、その結果、細胞株開発(CLD)作業量及びリソース要件が増加する。したがって、当技術分野では、従来の方法論に匹敵する発現レベル、製品品質属性、及び生産培養性能を示す細胞株を生成しながら、資源を節約する新しい細胞株開発戦略が必要とされている。
本開示の主題は、組換えタンパク質、例えばモノクローナル抗体、並びにそれに由来する組成物、例えば二重特異性抗体、及び他の複雑なフォーマットのタンパク質、例えば膜タンパク質複合体、及び他の発現困難な分子を発現することができる宿主細胞を生成及び同定するための「ランダム化された構成標的化組込み」(本明細書では「ランダム化された鎖標的化組込み」とも呼ばれる)(RCTI)戦略に関する。本開示に記載されるRCTI法は、より少ないリソースを使用しながら、標準的な細胞株開発方法よりも多くはないとしても同じ数のベクター構成をスクリーニングするために使用することができる。本開示に記載のRCTI法を使用することによって、より少ない個々のクローンも同様にスクリーニングすることができる。
特定の実施形態では、本開示は、少なくとも1つの目的の配列(SOI)を発現する標的化組込み(TI)宿主細胞のライブラリを生成及びハイスループット・スクリーニングする方法であって、a)1つ又は複数のSOIを発現する複数のTI宿主細胞を含むTI宿主細胞のライブラリを:i)複数のTI宿主細胞を提供すること;ii)上記複数のTI宿主細胞を、1つ又は複数のSOIを含む複数のベクターと接触させること;iii)上記1つ又は複数のSOIを上記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入すること;によって生成することと、b)上記ライブラリを単一クローンに分離することと、c)特定の細胞又は産物属性について上記クローンをスクリーニングすることとを含む方法を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、複数の外因性ヌクレオチドSOIを含むTI宿主細胞のライブラリを生成する方法であって、a)複数のTI宿主細胞を提供することと、b)上記複数のTI宿主細胞を、1つ又は複数のSOIを含む複数のベクターと接触させることと、c)上記1つ又は複数のSOIを上記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入することとを含む方法を提供する。特定の実施形態では、複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数は、TI宿主細胞のゲノムの1つ又は複数の遺伝子座に組み込まれた1つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含み、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する少なくとも2つのリコンビナーゼ認識配列(RRS)を含む。特定の実施形態では、ベクターは、a)組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の少なくとも2つのRRSと一致する少なくとも2つのRRS;及び、b)1つ又は複数の外因性SOI、及び上記RRSに隣接する少なくとも1つの第2の選択マーカーを含む。
本開示の主題はまた、目的の配列の発現を促進するための、宿主細胞への1つ又は複数の外来性核酸のRCTIのための方法を提供する。特定の実施形態では、そのような方法は、リコンビナーゼ媒介性組込み又は遺伝子編集媒介性組込みによる宿主細胞への1つ又は複数の外来性核酸の標的化組込みを含む。特定の実施形態では、そのような方法は、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内に組み込まれた1つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含む細胞に関し、遺伝子座は、配列番号1~12から選択される配列と少なくとも約90%相同であるヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、本開示は、1つ又は複数のSOIを発現するTI宿主細胞を調製する方法であって、a)複数のTI宿主細胞を提供することと、b)上記複数のTI宿主細胞を、1つ又は複数のSOIを含む複数のベクターと接触させることと、c)上記1つ又は複数のSOIを上記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入することと、d)上記1つ又は複数のSOIを発現するTI宿主細胞を選択することとを含む方法を提供する。特定の実施形態では、複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数は、TI宿主細胞のゲノムの1つ又は複数の遺伝子座に組み込まれた1つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含み、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する少なくとも2つのRRSを含む。特定の実施形態では、ベクターは、a)組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の少なくとも2つのRRSと一致する少なくとも2つのRRS;及び、b)1つ又は複数の外因性SOI、及び上記RRSに隣接する少なくとも1つの第2の選択マーカーを含む。特定の実施形態では、該方法は、上記複数のTI宿主細胞のうちの1つ以上に、RRSを認識する1つ以上のリコンビナーゼ又はリコンビナーゼをコードする核酸を導入することと、d)第2の選択マーカーを発現するTI細胞を選択し、それにより、目的の配列を発現するTI宿主細胞を単離することとを含む。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1及び第2のRRSと、第1及び第2のRRSの間に位置する第3のRRSとを含み、すべてのRRSは異種特異性であり;上記複数のベクターは、i.組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第1及び第3のRRSと一致し少なくとも1つの第1の外因性SOI及び少なくとも1つの第2の選択マーカーに隣接する2つのRRSを含む第1のベクター;ii.組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第2及び第3のRRSと一致し少なくとも1つの第2の外因性SOIに隣接する2つのRRSを含む第2のベクターを含み、第2の選択マーカーを発現するTI細胞を選択し、それにより、目的の第1及び第2の配列を発現するTI宿主細胞が単離される。
特定の実施形態では、本開示は、SOIを発現する方法であって、a)複数のTI宿主細胞を提供することと、b)上記複数のTI宿主細胞を、1つ又は複数のSOIを含む複数のベクターと接触させることと、c)上記1つ又は複数のSOIを上記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入することと、d)目的の配列を発現するTI宿主細胞を選択することと、e)目的の配列を発現させるのに適した条件下でd)の細胞を培養することとを含む方法を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、SOIを発現する方法であって、a)各TI宿主細胞が、TI宿主細胞のゲノムの1つ又は複数の遺伝子座に組み込まれた1つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含み、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する少なくとも2つのRRSを含む、複数のTI宿主細胞を提供することと、b)上記複数のTI宿主細胞を、a.組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の少なくとも2つのRRSと一致する少なくとも2つのRRS;及びb.1つ又は複数の外因性SOIと、上記RRSに隣接する少なくとも1つの第2の選択マーカーを含む複数のベクターと接触させることと、c)RRSを認識する1つ又は複数のリコンビナーゼ又はリコンビナーゼをコードする核酸を導入することと、d)第2の選択マーカーを発現するTI細胞を選択し、それにより、目的の配列を発現するTI宿主細胞を単離することと、e)目的の配列を発現させるのに適した条件下でd)の細胞を培養し、そこから目的の配列の産物を回収することとを含む方法を提供する。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1及び第2のRRSと、第1及び第2のRRSの間に位置する第3のRRSとを含み、すべてのRRSは異種特異性であり;上記複数のベクターは、i.組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第1及び第3のRRSと一致し少なくとも1つの第1の外因性SOI及び少なくとも1つの第2の選択マーカーに隣接する2つのRRSを含む第1のベクター;ii.組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第2及び第3のRRSと一致し少なくとも1つの第2の外因性SOIに隣接する2つのRRSを含む第2のベクターを含み、第2の選択マーカーを発現するTI細胞を選択し、それにより、目的の第1及び第2の配列を発現するTI宿主細胞が単離される。
上記の特定の実施形態では、1つ又は複数のSOIは、リコンビナーゼ媒介性組込みによって複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入される。上記の特定の実施形態では、1つ又は複数のSOIは、遺伝子編集媒介組込みによって複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入される。
上記の特定の実施形態では、1つ又は複数のSOIは、1つ又は複数の調節可能なプロモーターに作用可能に連結されている。上記の特定の実施形態では、1つ以上の調節可能なプロモーターは、SV40及びCMVプロモーターからなる群から選択される。
上記の特定の実施形態では、TI宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である。上記の特定の実施形態では、TI宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である。上記の特定の実施形態では、TI宿主細胞 CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞、又はCHO K1M宿主細胞。
上記の特定の実施形態では、SOIは、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする。上記の特定の実施形態では、SOIは、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Fv断片(scFv)又はFc融合タンパク質をコードする。
上記の特定の実施形態では、特定の細胞属性は、細胞増殖、細胞力価、比生産性、体積生産性、クローン安定性から選択される。上記の特定の実施形態では、特定の産物属性は、グリコシル化のレベル、電荷分散のレベル、ミスマッチの減少、タンパク質/ペプチド凝集の減少、タンパク質配列不均一性から選択される。
上記の特定の実施形態では、1つ又は複数のSOIは、複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数の細胞に、以下から選択される配列と少なくとも約90%相同である1つ又は複数の遺伝子座において導入される。配列番号1~12;NW_006874047.1;NW_006884592.1;NW_006881296.1;NW_003616412.1;NW_003615063.1;NW_006882936.1;及びNW_003615411.1。
上記の特定の実施形態では、少なくとも1つの目的の配列は、2、3、4、5、6、7、8、9、10個の目的の配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞、遺伝子構築物(例えば、ベクター)、組成物、及び方法は、従来の方法論に匹敵する発現レベル、製品品質属性、及び生産培養性能を示す宿主細胞のより効率的な(例えば、より少ない時間及び/又はリソース集中)同定のための「ランダム化された構成標的化組込み」(本明細書では「ランダム化された鎖標的化組込み」とも呼ばれる)(RCTI)戦略の開発及び/又は使用に使用することができる。
開示を明確にする目的で、かつ限定を目的とせずに、詳細な説明を以下のサブセクションに分ける。
1.定義
2.宿主細胞の調製及びスクリーニング戦略
3.外因性ヌクレオチド配列
4.宿主細胞
5.標的化組込み
6.産物
1.定義
2.宿主細胞の調製及びスクリーニング戦略
3.外因性ヌクレオチド配列
4.宿主細胞
5.標的化組込み
6.産物
1.定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本分野の当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、本明細書におけるいかなる定義をも含む本出願が優先する。好ましい方法及び材料は以下に記載されているが、本明細書に記載されているものと類似又は同等の方法及び材料は、現在開示されている主題の実施又は試験に使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。加えて、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本分野の当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、本明細書におけるいかなる定義をも含む本出願が優先する。好ましい方法及び材料は以下に記載されているが、本明細書に記載されているものと類似又は同等の方法及び材料は、現在開示されている主題の実施又は試験に使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。加えて、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
本明細書で使用される場合、「含む(comprise(s))」「含む(include(s))」、「有する(having)」「有する(has)」、「することができる(can)」、「含有する(contain(s))」、及びこれらの変形は、更なる作用又は構造物の可能性を排除しない、オープンエンドの移行句、用語、又は単語であることが意図される。単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本開示はまた、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態又は要素「を含む(comprising)」、「からなる(consisting of)」、及び「から本質的になる(consisting essentially of)」他の実施形態も企図する。
本明細書における数値範囲の列挙のために、同じ程度の精度でその間に介在する各数字が明示的に企図される。例えば、6~9の範囲では、6及び9に加えて数値7及び8が企図され、6.0~7.0の範囲では、番号6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、及び7.0が明示的に企図される。
本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容され得る誤差範囲を意味し、これは、その値がどのように測定又は決定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存することになる。例えば、「約」とは、当該技術分野での慣習に従い、3又は3を超える標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の20%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%まで、更により好ましくは1%までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の1桁以内、好ましくは5倍以内、より好ましくは2倍以内を意味し得る。
本明細書で使用される場合、「選択マーカー」という用語は、対応する選択剤の存在下で、ある遺伝子を保持する細胞が特異的に選択されるか、又は特異的に排除されることを可能にする該遺伝子を表す。例えば、限定ではないが、選択マーカーは、選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、遺伝子の存在下で積極的に選択されることを可能にすることができ、形質転換されていない宿主細胞は、該選択的培養条件下で増殖又は生存することができない。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、又は二機能性であってよい。ポジティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞の選択が可能になり得るのに対し、ネガティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞を選択的に排除することが可能になり得る。選択マーカーは、宿主細胞において薬物に対する耐性を付与することができるか、又は代謝若しくは異化の欠陥を補うことができる。原核細胞においては、とりわけ、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、又はクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を使用することができる。真核細胞において選択マーカーとして有用な耐性遺伝子としては、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ(APH)(例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HYG)、ネオマイシン、及びG418 APH)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、チミジンキナーゼ(TK)、グルタミン合成酵素(GS)、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素(インドール)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(ヒスチジノールD))の遺伝子、並びにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。さらなるマーカー遺伝子は、国際公開第92/08796号及び国際公開第94/28143号に記載されている。
選択マーカーは、対応する選択剤の存在下での選択を容易にするだけでなく、通常は細胞中に存在しない分子、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、強化型GFP(eGFP)、合成GFP、黄色蛍光タンパク質(YFP)、強化型YFP(eYFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed-monomer、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean、及びT-Sapphireをコードする遺伝子を代わりに提供し得る。そのような遺伝子を保有する細胞は、例えば、コードされたポリペプチドによって放射される蛍光の検出によって、この遺伝子を保有しない細胞と区別され得る。
本明細書において使用される場合、用語「作動能可能に連結された」は、目的の様式でそれらが機能することを可能にする関係にある、2つ以上の成分の近接した配置を意味する。例えば、プロモーター及び/又はエンハンサーがコード配列の転写を調節する役割を果たす場合、そのプロモーター及び/又はエンハンサーはコード配列に作動能可能に連結されている。特定の実施形態において、「作動能可能に連結されて」いるDNA配列は、単一の染色体上で近接し、隣り合っている。特定の実施形態において、例えば、1つの分泌リーダー及び1つのポリペプチドなど2つのタンパク質のコード化領域をつなげる必要がある場合、これらの配列は近接し、隣り合い、かつ同じ読み枠に存在する。特定の実施形態において、作動能可能に連結されたプロモーターは、コード配列の上流に位置しており、かつコード配列の隣に存在してよい。特定の実施形態において、例えば、コード配列の発現を調節するエンハンサー配列に関して、2つの成分は、隣り合ってはいないが、作動能可能に連結されてよい。エンハンサーがコード配列の転写を増大させる場合、エンハンサーはコード配列に作動能可能に連結されている。作用可能に連結されエンハンサーは、コード配列の上流、配列内、又は下流に位置し得、コード配列のプロモーターから相当な距離を置いて位置し得る。作動能可能な連結は、当該技術分野で公知の組換え法によって、例えば、PCR方法を用いて、かつ/又は好都合な制限部位でのライゲーションによって、達成することができる。好都合な制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを従来の手法に従って使用することができる。配列内リボソーム進入部位(IRES)は、5’末端に非依存的にオープンリーディングフレーム(ORF)の内部位置で翻訳を開始することを可能にする場合、ORFに作動能可能に連結されている。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、転写及び/又は翻訳を指す。特定の実施形態では、所望の産物の転写レベルは、存在する対応するmRNAの量に基づいて決定され得る。例えば、目的の配列から転写されたmRNAは、PCR又はノーザンハイブリダイゼーションによって定量され得る。特定の実施形態では、目的の配列によってコードされるタンパク質は、様々な方法によって、例えば、ELISAによって、タンパク質の生物活性についてアッセイすることによって、又はそのような活性に依存しないアッセイ、例えば、タンパク質を認識してそれに結合する抗体を使用するウェスタンブロッティング若しくはラジオイムノアッセイなどを用いることによって定量され得る。
「目的の配列」という用語は、ポリペプチド配列(又は、ある特定の場合において、ポリペプチド配列をコードする核酸)を指すために本明細書で使用され、ポリペプチド配列の発現が目的である。そのようなポリペプチド配列は、特定の実施形態では、マルチサブユニットのタンパク質複合体のサブユニットを含むことができる。特定の実施形態では、そのようなポリペプチド配列は、そのようなサブユニットの断片を含むことができる。そのようなポリペプチド配列は、特定の実施形態では、抗体配列、例えば抗体重鎖又は軽鎖配列を含むことができる。特定の実施形態では、そのようなポリペプチド配列は、そのような抗体配列の断片を含むことができる。
本明細書において「抗体」という用語は、最も広義に使用され、抗体が所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、半抗体、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない様々な抗体構造を包含する。
本明細書で使用される場合、「標準抗体」及び「標準モノクローナル抗体」は、単一の結合特異性を有する抗体又は抗体断片である。特定の実施形態では、標準抗体の単一の結合特異性は、重鎖配列又はそのフラグメントと、軽鎖配列又はそのフラグメントとのペアリングの結果である。
本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」又は「BsAb」は、2つの異なるエピトープ、例えば2つの異なる抗原上の2つの異なるエピトープ又は単一抗原上の2つの異なるエピトープに同時に結合することができる抗体である。BsAbは、第1の親抗体の結合特異性を有するBsAbの1つの「アーム」(すなわち、1対のVH及びVL)及び第2の親抗体の結合特異性を有するBsAbの第2の「アーム」をもたらす2つの異なる親モノクローナル抗体の対になった可変重(VH)及び軽(VL)ドメインを含むものを含む多数の異なる構造を包含する。BsAbは多重特異性抗体のサブセットであり、多重特異性抗体は少なくとも2つの結合特異性(すなわち、BsAb)を含むが、三重特異性抗体並びにより多数の特異性を有する抗体も含む。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2;ダイアボディ;線状抗体;一本鎖抗体分子(例えば、scFv);及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体と抗原との結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン(それぞれVH及びVL)は、概して、類似の構造を有しており、各ドメインは、4つの保存されたフレームワーク領域(FR)と、3つの超可変領域(HVR)とを含む。例えば、Kindt et al.,Kuby Immunology,第6版 W.H.Freeman and Co.,第91頁(2007)を参照。単一のVH又はVLドメインは、抗原結合特異性を付与するために充分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体のVH又はVLドメインを使用して単離され、それぞれ、相補的VL又はVHドメインのライブラリをスクリーニングしてもよい。例えば、Portolanoら、J.Immunol.150:880-887(1993);Clarksonら、Nature 352:624-628(1991)を参照のこと。
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、核酸分子に連結されている別の核酸を増殖し得る核酸分子を意味する。この用語には、自己複製する核酸構造としてのベクターだけでなく、ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも含まれる。特定の実施形態では、ベクターは、それらが作用可能に連結している核酸の発現を誘導する。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「相同配列」という用語は、配列のアラインメントによって判定されたとき、有意に配列類似性を共有する配列を指す。例えば、2つの配列は、約50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、又は99.9%相同であり得る。アラインメントは、BLAST、FASTA、HMMEなどを含むがこれらに限定されないアルゴリズム及びコンピュータプログラムによって実行され、配列を比較し、要素、例えば配列の長さ、配列の同一性及び類似性、並びに配列のミスマッチ及びギャップの存在及び長さなどに基づいて、一致の統計的有意性を算出する。相同配列は、DNA配列及びタンパク質配列の両方を指し得る。
本明細書で使用される場合、「隣接する」という用語は、第1のヌクレオチド配列が、第2のヌクレオチド配列の5’若しくは3’末端、又は両端のいずれかに位置することを指す。隣接ヌクレオチド配列は、第2のヌクレオチド配列の隣に存在するか、又はそれから所定の距離の位置にあってよい。隣接ヌクレオチド配列の長さには特に制限はない。例えば、隣接配列は、数塩基対又は数千塩基対であってよい。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、ヌクレオチド配列が宿主細胞に由来せず、従来のDNA送達方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、又は形質転換法によって宿主細胞に導入されるものを示す。「内因性」という用語は、ヌクレオチド配列が宿主細胞に由来することを指す。「外因性」ヌクレオチド配列は、塩基組成の点で同一である「内因性」対応物を有し得るが、「外因性」配列は、例えば、組換えDNA技術によって宿主細胞中に導入され得る。
本明細書中で用いられる「組込み部位」は、外因性ヌクレオチド配列が挿入される、宿主細胞ゲノム内の核酸配列を含む。特定の実施形態では、組込み部位は、宿主細胞ゲノム上の2つの隣接するヌクレオチド間に存在する。特定の実施形態において、組込み部位は、ヌクレオチド配列のストレッチを含む。特定の実施形態では、組込み部位は、TI宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内に位置する。特定の実施形態では、組込み部位は、TI宿主細胞の内因性遺伝子内に存在する。
本明細書で使用される場合、「TI宿主細胞」という用語は、目的の配列の発現に使用するためのゲノム遺伝子座又は遺伝子座、すなわち組込み部位(単数又は複数)を含む細胞を指す。特定の実施形態では、TI宿主細胞へのSOIの組込みは、2つ以上のRRSを含むもう1つの組込み部位における外因性ヌクレオチド配列の存在によって促進される。特定の実施形態では、TI宿主細胞へのSOIの組込みは、1つ又は複数の組込み部位でTI宿主細胞ゲノムを編集することができるゲノム編集システムによって促進される。
2.宿主細胞の調製及びスクリーニング戦略
標準的なCLD戦略は、一般に、目的の配列(単数又は複数)をコードする1つ又は複数の特異的外因性核酸による複数回の宿主細胞トランスフェクションを含む。図1Aに例示されるように、そのような外因性核酸、例えば、抗体の重鎖及び軽鎖コード配列を含むプラスミドの調製の後に、例えば、リコンビナーゼ媒介性カセット交換「RMCE」によるトランスフェクションが、標的化組込みの状況において行われる。組込み戦略(例えば、ランダム又は標的化された組込み)にかかわらず、トランスフェクトされた宿主細胞のプールをその後、選択及び単一細胞クローニング(SCC)の前に回収する。次いで、より詳細な生産性及び製品品質アッセイ、例えば高分子量種含有量(「HMWS(%)」)、サイズ変動、酸性変動、及びグリコシル化変動のために、例えば均一時間分解蛍光(「HTRF」)力価アッセイを介して、複数回のクローン分析を使用してクローンの数を絞り込む。
標準的なCLD戦略は、一般に、目的の配列(単数又は複数)をコードする1つ又は複数の特異的外因性核酸による複数回の宿主細胞トランスフェクションを含む。図1Aに例示されるように、そのような外因性核酸、例えば、抗体の重鎖及び軽鎖コード配列を含むプラスミドの調製の後に、例えば、リコンビナーゼ媒介性カセット交換「RMCE」によるトランスフェクションが、標的化組込みの状況において行われる。組込み戦略(例えば、ランダム又は標的化された組込み)にかかわらず、トランスフェクトされた宿主細胞のプールをその後、選択及び単一細胞クローニング(SCC)の前に回収する。次いで、より詳細な生産性及び製品品質アッセイ、例えば高分子量種含有量(「HMWS(%)」)、サイズ変動、酸性変動、及びグリコシル化変動のために、例えば均一時間分解蛍光(「HTRF」)力価アッセイを介して、複数回のクローン分析を使用してクローンの数を絞り込む。
図2Aは、複数のCLDサイクルを使用して、望ましい発現レベル、製品品質属性、及び生産培養性能を示す細胞を同定する、標準的な標的化組込みに基づくCLD戦略を示す。この例では、トランスフェクトされた細胞の各プールは、複数の宿主細胞を、目的の配列をコードする2つの外因性核酸の特定の組み合わせと接触させることによって調製される。図2Aは、第1の「フロント」プラスミド及び第2の「バック」プラスミドからの目的の配列の宿主ゲノム内の特定の遺伝子座への標的化組込みを含む戦略を示しているが(2ベクターRCME戦略の一般的な説明については、以下のセクション5.1を参照)、標的化組込みの手法は、単一の目的の配列又は2つよりも多くの目的の配列の組込みを含み得ることを理解されたい。さらに、標的化組込み戦略は、本明細書中に概説されるように、図2A及び2Bに例示されるようなリコンビナーゼ媒介性のSOIの組込みだけでなく、SOIの組込みのための他の遺伝子座特異的な戦略、例えば、SOIの遺伝子編集媒介性の組込みも使用することができる。しかしながら、上記のように、標的化組込みアプローチの明確な特徴は、ゲノム内の特定の配列、すなわち導入遺伝子の固定された構成における特定の配列の組込みをもたらすように設計されていることである。この設計特徴に照らして、図2Aに概説されるように、目的の配列のコピー数及び配置における十分な数のバリエーションがアッセイされることを確実にするために、複数サイクルのCLDを実施することが必要である。
図2Aに示される標準的な資源集約的マルチサイクル標的化組込みCLD戦略とは対照的に、本出願の主題は、「ランダム化された構成標的化組込み」(本明細書では「ランダム化された鎖標的化組込み」とも呼ばれる)(RCTI)戦略に関し、これは、目的の配列のコピー数及び配置のバリエーションの単一サイクルアッセイを可能にするが、標的化組込みの遺伝子座特異的組込みの利益を保持する。図2Bに概説されるように、目的の配列をコードする関連する外因性核酸のすべてを、単一のトランスフェクションプールの作製によって評価することができる。目的の配列をコードする関連する外因性核酸の完全な相補体を複数の宿主細胞と組み合わせることによって、単一のトランスフェクションプールが作製され、そこから望ましい発現レベル、製品品質属性、及び生産培養性能を示すクローンを同定することができる。
例示的な図2Bは、宿主細胞ゲノム内の特定の遺伝子座に存在する外因性ヌクレオチド配列のフロントカセット又はバックカセットに組み込まれる3つの「フロント」及び3つの「バック」プラスミド(それぞれが1つ又は複数の目的の配列を含んでいる)を使用する実施形態を示しているが(そのような「2ベクターRMCE」戦略の完全な説明については、以下のセクション5.1を参照)、本開示の主題は、そのような標的化組込み戦略に関する多種多様なバリエーションを包含することを理解されたい。例えば、フロントカセットを含む第1のプラスミド及びバックカセットを含む第2のプラスミドを使用するのではなく、本開示は、単一カセットの組込みを含む方法も包含する。さらに、本開示はまた、宿主細胞ゲノム中の特定の遺伝子座に存在する単一の外因性ヌクレオチド配列への3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれを超えるカセットの組込みを含む方法を包含する。さらに、各カセットは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれ以上の個々の目的の配列を含むことができるだけでなく、各宿主ゲノムは、目的の配列を含むカセットが組み込まれ得る宿主細胞ゲノム中の特定の遺伝子座に存在する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれ以上の外因性ヌクレオチド配列を含むことができる。したがって、例示的な図2Bは、3つのフロントカセット及び3つのバックカセットを使用して、9個の可能な目的の配列の導入遺伝子構成を生成することができる戦略を示しているが、本開示は、宿主ゲノム内の2つ以上の遺伝子座を含む、より少ない導入遺伝子構成及びより多い導入遺伝子構成の両方を生成するための戦略を包含する。
本明細書に概説されているRCTI戦略を使用することにより、限定はしないが、コスト及び時間の節約、労働の節約、並びに自動化のボトルネックの緩和を含む、資源の大幅な節約をもたらすことができる。図3~5に示すように、このような資源の節約は、標準的なCLD戦略と比較して、観察される望ましい発現レベル、製品品質属性、又は生産培養性能の分布に悪影響を及ぼさない。
RCTIアプローチはまた、図6A~6Cに示すように、初期、中期、又は完全な回収段階での単一細胞クローニングを可能にする。標準的なCLD戦略は、一般に、単一細胞クローニングに関与する前に完全なトランスフェクションプールの回収(例えば、>90%の細胞生存率)を待つことを含むので、RCTI戦略の使用は、クローン性能(高力価及び所望の製品品質を有するクローンの%)又は不均一性(ベクター構成、力価及び製品品質の範囲)に影響を及ぼすことなく、大幅な時間節約をもたらすことができる。
特定の実施形態では、本開示は、少なくとも1つのSOIを発現するTI宿主細胞のライブラリをスクリーニングするハイスループットのRCTIに基づく方法に関する。特定の実施形態では、本方法は、TI宿主細胞のライブラリの生成を含み、該ライブラリは、1つ又は複数のSOIを発現する複数のTI宿主細胞を含み、ライブラリを単一クローンに分離し、特定の細胞及び/又は特定の産物属性についてクローンをスクリーニングすることによって生成される。特定の実施形態では、TI宿主細胞のライブラリの生成は、複数のTI宿主細胞を提供する工程、複数のTI宿主細胞を、1つ又は複数のSOIを含む複数のベクターと接触させる工程、及び、複数のTI宿主細胞の1つ又は複数に1つ又は複数のSOIを導入する工程を含む。
特定の実施形態では、目的の配列は、リコンビナーゼ媒介性組込みによって本開示の宿主細胞に導入され得る。特定の実施形態では、目的の配列は、遺伝子編集媒介性組込みによって本開示の宿主細胞に導入され得る。
特定の実施形態では、本開示のスクリーニング方法は、細胞増殖、細胞力価、比生産性、体積生産性、クローン安定性のいずれかであり得るがこれらに限定されない細胞属性についての細胞のスクリーニングを含み得る。これらの細胞属性のスクリーニングは、当技術分野で公知の任意の技術を用いて行うことができる。
特定の実施形態では、本開示のスクリーニング方法は、グリコシル化のレベル、電荷分散のレベル、ミスマッチの減少、タンパク質/ペプチド凝集の減少、タンパク質配列不均一性のいずれかであり得るがこれらに限定されない産物属性について細胞をスクリーニングすることを含み得る。これらの産物属性のスクリーニングは、これらに限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)、cDNA配列決定、ペプチドマッピング、CE-SDS又はSDS-PAGE、HPLC、CEに基づくグリカンアッセイ、IEF、及びイオン交換クロマトグラフィなどの当技術分野で公知の任意の技術を用いて行うことができる。
特定の実施形態では、本開示は、複数の外因性ヌクレオチドSOIを含むTI宿主細胞のライブラリを生成するRCTIに基づく方法であって、複数のTI宿主細胞を、1つ又は複数のSOIを有するベクターと接触させることと、1つ又は複数のSOIをTI宿主細胞に導入することと、1つ又は複数のSOIを発現するTI細胞を選択するステップとを含む方法を提供する。特定の実施形態では、本開示の方法によって生成されたTI宿主細胞は、TI宿主細胞のゲノムの1つ又は複数の遺伝子座に組み込まれた1つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含む。一定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、1つ又は複数の選択マーカーに隣接し得る少なくとも2つのRRSを含み得る。
特定の実施形態では、ベクターは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性などの形質転換宿主細胞を選択するための表現型形質を提供するための1つ又は複数の選択マーカー遺伝子を含み得る。特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核細胞、又は酵母細胞などの下等真核細胞であり得るか、又は宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞であり得る。特定の実施形態では、ライブラリは、限定されないが、ポリペプチド配列などの特定の目的の配列についてスクリーニングされ得る。一定の実施形態では、得られたライブラリを、表現型アッセイにおいて目的のポリペプチドに対する活性を示すクローンについてスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、ライブラリは、当技術分野で公知の手順によって、特定のタンパク質、例えば酵素の活性についてスクリーニングすることができる。
特定の実施形態では、本開示は、目的の配列を発現する宿主細胞を選択するRCTIに基づく方法であって、複数のTI宿主細胞を提供することと、複数のTI宿主細胞を、1つ又は複数のSOI及び少なくとも1つのマーカーを含む複数のベクターと接触させることと、1つ又は複数のSOIを、複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入することと、選択マーカーを発現するTI宿主細胞を選択し、それにより、目的の配列を発現するTI宿主細胞を単離することとを含む方法に関する。特定の実施形態では、SOIは、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードすることができる。特定の実施形態では、SOIは、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Fv断片(scFv)又はFc融合タンパク質をコードすることができる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれる遺伝子座は、配列番号1~7から選択される配列と少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、又は少なくとも約99.9%相同である。
特定の実施形態では、1つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列は、以下から選択される配列に対して少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、又は少なくとも約99.9%の相同性を有する1つ又は複数の遺伝子座に組み込まれ得る。配列番号1~12;NW_006874047.1;NW_006884592.1;NW_006881296.1;NW_003616412.1;NW_003615063.1;NW_006882936.1;及びNW_003615411.1。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれる遺伝子座は、本開示の配列番号8~11に対応する米国特許第9816110号の配列番号1~4、又は本開示の配列番号12に対応する国際出願第PCT/US2017/028555号の配列番号1から選択される配列に少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、又は少なくとも約99.9%相同である。特定の実施形態では、1つ又は複数の目的の配列は、リコンビナーゼ媒介性組込みによって本開示の宿主細胞に導入され得る。特定の実施形態では、1つ又は複数の目的の配列は、遺伝子編集媒介性組込みによって本開示の宿主細胞に導入され得る。
特定の実施形態では、本開示に記載される目的の配列を発現する宿主細胞を選択するRCTIに基づく方法で使用されるTI宿主細胞はそれぞれ、TI宿主細胞のゲノムの1つ又は複数の遺伝子座に組み込まれた1つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を有することができる。一定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する少なくとも2つのRRSを含み得る。特定の実施形態では、宿主細胞を選択するRCTIに基づく方法で用いられるベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の少なくとも2つのRRSと一致する少なくとも2つのRRSと、1つ又は複数の外因性SOI、及びこれらのRRSに隣接する少なくとも1つの第2の選択マーカーとを含む。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1のRRS及び第2のRRSと、第1のRRS及び第2のRRSの間に位置する第3のRRSとを含み、すべてのRRSは異種特異性であってよい。特定の実施形態では、複数のベクターは、第1のベクター及び第2のベクターを含むことができる。特定の実施形態では、第1のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第1及び第3のRRSと一致し、少なくとも1つの第1の外因性SOI及び少なくとも1つの第2の選択マーカーに隣接する2つのRRSを含むことができ、第2のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第2及び第3のRRSと一致し、少なくとも1つの第2の外因性SOIに隣接する2つのRRSを含むことができる。特定の実施形態では、複数のベクターは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、又はそれよりも多くのベクターを含むことができる。
特定の実施形態では、目的の配列は、マルチサブユニットタンパク質複合体の1つ又は複数のサブユニットの配列を含む。特定の実施形態では、そのようなポリペプチド配列は、そのようなサブユニット配列の断片を含むことができる。特定の実施形態では、目的の配列は、そのようなサブユニット配列の組み合わせを含むことができる。例えば、限定するものではないが、そのような組み合わせは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個若しくはそれよりも多くの第1のサブユニット配列、及び/又は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個若しくはそれよりも多くの配列の第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10若しくはそれ以上のサブユニット配列を含むことができる。さらに、特定の実施形態では、そのような組み合わせは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個若しくはそれよりも多くの異なるバリエーションの第1のサブユニット配列、及び/又は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個若しくはそれよりも多くの異なるバリエーションの第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10若しくはそれよりも多くのサブユニット配列を含むことができる。
特定の実施形態では、複数の目的の配列は、1つ若しくは複数の抗体重鎖配列(「H」)及び/又は1つ若しくは複数の抗体軽鎖配列(「L」)を含む。本明細書で使用される場合、そのような「H」及び「L」配列は、完全長重鎖又は軽鎖配列、並びに可変領域断片及び相補性決定領域断片を含むがこれらに限定されない重鎖又は軽鎖断片であり得る。特定の実施形態では、目的の配列は、そのようなH及びL配列の組み合わせを含むことができる。例えば、限定するものではないが、そのような組み合わせは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれよりも多くのH配列及び/又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれよりも多くのL配列を含むことができる。さらに、特定の実施形態では、そのような組み合わせは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、又はそれよりも多くの同一又は異なる別個のH’配列、並びに/あるいは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、又はそれよりも多くの同一又は異なる別個のL’配列を含むことができる。例えばH’’、H’’’、L’’、及びL’’’のような、1~10個(又はそれよりも多く)のさらなるH及びL配列の包含も、本開示の主題に含まれる。例示的な実施形態は、限定されないが、以下のような様々な異なるH及び様々な異なるL配列の任意の組み合わせを含む配列を含む:HL;LH;H’L;LH’;H’L’;L’H’;HLL;HHL;LLH;LHH;H’LL;H’HL;L’HH;L’LH;H’H’L;LH’H’;HLLL;LLLH;HLHL;LHLH;H’LLL;L’LLH;H’LHL;L’HLHなど。
特定の実施形態では、本開示は、SOIを発現する方法であって、複数のTI宿主細胞を提供することと、上記複数のTI宿主細胞を、1つ又は複数のSOI及び少なくとも1つのマーカーを含む複数のベクターと接触させることと、上記1つ又は複数のSOIを上記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入することと、目的の配列を発現するTI細胞を選択することと、目的の配列を発現させるのに適した条件下で細胞を培養して、そこから目的の配列を回収することとを含む方法に関する。
特定の実施形態では、トランスフェクトされた宿主細胞は、マルチサブユニットタンパク質複合体の1つ又は複数のサブユニットの配列を含む1つ又は複数の目的の配列を含む。特定の実施形態では、そのようなポリペプチド配列は、そのようなサブユニット配列の断片を含むことができる。特定の実施形態では、目的の配列は、そのようなサブユニット配列の組み合わせを含むことができる。例えば、限定するものではないが、そのような組み合わせは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個若しくはそれよりも多くの第1のサブユニット配列、及び/又は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個若しくはそれよりも多くの配列の第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10若しくはそれ以上のサブユニット配列を含むことができる。さらに、特定の実施形態では、そのような組み合わせは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個若しくはそれよりも多くの同一又は異なる別個のバリエーションの第1のサブユニット配列、及び/又は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個若しくはそれよりも多くの同一又は異なる別個のバリエーションの第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10若しくはそれよりも多くのサブユニット配列を含むことができる。
特定の実施形態では、トランスフェクトされた宿主細胞は、H及びL配列の組み合わせを含み得る1つ又は複数の目的の配列を含む。例えば、限定するものではないが、そのような組み合わせは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれよりも多くのH配列及び/又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれよりも多くのL配列を含むことができる。さらに、特定の実施形態では、そのような組み合わせは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、又はそれよりも多くの別個のH’配列、並びに/あるいは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、又はそれよりも多くの別個のL’配列を含むことができる。例えばH’’、H’’’、L’’、及びL’’’のような、1~10個(又はそれよりも多く)のさらなるH及びL配列の包含も、本開示の主題に含まれる。例示的な実施形態は、限定されないが、以下のような様々な異なるH及び様々な異なるL配列の任意の組み合わせを含む配列を含む:HL;LH;H’L;LH’;H’L’;L’H’;HLL;HHL;LLH;LHH;H’LL;H’HL;L’HH;L’LH;H’H’L;LH’H’;HLLL;LLLH;HLHL;LHLH;H’LLL;L’LLH;H’LHL;L’HLHなど。
3.外因性ヌクレオチド配列
本開示の主題は、外因性ヌクレオチド配列の組込みに適した宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、例えば1つ又は複数のリコンビナーゼ認識配列を含むことによって、組込み部位として働く。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、目的の配列をコードする。したがって、特定の実施形態では、宿主細胞は、1つ又は複数の目的の配列をコードする1つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みを促進する1つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、宿主細胞のゲノム上の組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、TI宿主細胞と呼ばれる。次いで、1つ又は複数の目的の配列をコードする外因性ヌクレオチド配列をTI宿主細胞に導入し、組込みを組込み部位に標的化することができる。以下に概説されるように、TI宿主細胞は、1つ又は複数の目的の配列をコードする外因性ヌクレオチド配列の組込みを促進するエレメント、例えばリコンビナーゼ認識配列を含む外因性ヌクレオチド配列の存在によって定義される複数の組込み部位を含み得る。
本開示の主題は、外因性ヌクレオチド配列の組込みに適した宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、例えば1つ又は複数のリコンビナーゼ認識配列を含むことによって、組込み部位として働く。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、目的の配列をコードする。したがって、特定の実施形態では、宿主細胞は、1つ又は複数の目的の配列をコードする1つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みを促進する1つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、宿主細胞のゲノム上の組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、TI宿主細胞と呼ばれる。次いで、1つ又は複数の目的の配列をコードする外因性ヌクレオチド配列をTI宿主細胞に導入し、組込みを組込み部位に標的化することができる。以下に概説されるように、TI宿主細胞は、1つ又は複数の目的の配列をコードする外因性ヌクレオチド配列の組込みを促進するエレメント、例えばリコンビナーゼ認識配列を含む外因性ヌクレオチド配列の存在によって定義される複数の組込み部位を含み得る。
特定の実施形態では、組込み部位及び/又はその組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、実験的に同定され得る。特定の実施形態では、組込み部位及び/又は組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、1つ以上の外因性ヌクレオチド配列に組み込まれた1つ又は複数のSOIによってコードされる目的のポリペプチドを望ましいレベルで発現する宿主細胞を単離するためのゲノムワイドスクリーニング手法によって同定することができ、外因性配列はそれ自体、宿主細胞のゲノム内の1つ以上の遺伝子座に組み込まれる。特定の実施形態では、組込み部位及び/又は組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、トランスポザーゼに基づくカセット組込み事象後のゲノムワイドスクリーニング手法によって同定され得る。特定の実施形態では、組込み部位及び/又は組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、ブルートフォースランダム組込みスクリーニングによって同定され得る。特定の実施形態では、組込み部位及び/又は組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、標的化遺伝子座増幅(TLA)、それに続く次世代シーケンシング(NGS)及び全ゲノムNGSなどの従来のシーケンシングアプローチによって決定され得る。特定の実施形態では、染色体上の組込み部位の位置は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)分析などの従来の細胞生物学的アプローチによって決定され得る。
特定の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞のゲノム内の特定の第1の遺伝子座内の第1組込み部位に組み込まれた第1の外因性ヌクレオチド配列と、ゲノム内の特定の第2の遺伝子座内の第2の組込み部位に組み込まれた第2の外因性ヌクレオチド配列とを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞のゲノム中の複数の組込み部位で組み込まれた複数の外因性ヌクレオチド配列を含む。
3.1 リコンビナーゼ認識配列を含む外因性配列
特定の実施形態において、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、1つ又は複数のリコンビナーゼ認識配列(RRS)を含み、該RRSはリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも2つのRRSを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は2つのRRSを含み、2つのRRSは同一である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は2つのRRSを含み、2つのRRSは異なっている。特定の実施形態において、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、3つのRRSを含み、第3のRSSは第1と第2のRRSの間に位置している。特定の実施形態において、第1及び第2のRRSは同じであり、第3のRRSは、第1のRRSとも第2のRRSとも異なる。特定の実施形態では、3つのRRSすべてが異なる。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、4つ、5つ、6つ、7つ、又は8つのRRSを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、複数のRRSを含む。特定の実施形態では、複数の2つ以上のRRSは同一である。特定の実施形態では、2つ以上のRRSは異なっている。特定の実施形態では、RRSの総数のサブセットは同じであり、RRSの総数のサブセットは異なる。特定の実施形態では、RRS又は複数のRRSは、LoxP配列、LoxP L3配列、LoxP 2L配列、LoxFas配列、Lox511配列、Lox2272配列、Lox2372配列、Lox5171配列、Loxm2配列、Lox71配列、Lox66配列、FRT配列、Bxb1 attP配列、Bxb1 attB配列、φC31 attP配列、及びφC31 attB配列からなる群から選択され得る。
特定の実施形態において、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、1つ又は複数のリコンビナーゼ認識配列(RRS)を含み、該RRSはリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも2つのRRSを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は2つのRRSを含み、2つのRRSは同一である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は2つのRRSを含み、2つのRRSは異なっている。特定の実施形態において、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、3つのRRSを含み、第3のRSSは第1と第2のRRSの間に位置している。特定の実施形態において、第1及び第2のRRSは同じであり、第3のRRSは、第1のRRSとも第2のRRSとも異なる。特定の実施形態では、3つのRRSすべてが異なる。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、4つ、5つ、6つ、7つ、又は8つのRRSを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、複数のRRSを含む。特定の実施形態では、複数の2つ以上のRRSは同一である。特定の実施形態では、2つ以上のRRSは異なっている。特定の実施形態では、RRSの総数のサブセットは同じであり、RRSの総数のサブセットは異なる。特定の実施形態では、RRS又は複数のRRSは、LoxP配列、LoxP L3配列、LoxP 2L配列、LoxFas配列、Lox511配列、Lox2272配列、Lox2372配列、Lox5171配列、Loxm2配列、Lox71配列、Lox66配列、FRT配列、Bxb1 attP配列、Bxb1 attB配列、φC31 attP配列、及びφC31 attB配列からなる群から選択され得る。
特定の実施形態において、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、1つのRRS及び少なくとも1つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第1のRRS及び第2のRRS、並びに少なくとも1つの選択マーカーを含む。特定の実施形態において、選択マーカーは、第1と第2のRRSの間に位置している。特定の実施形態では、2つのRRSは、少なくとも1つの選択マーカーに隣接し、すなわち、第1のRRSは、選択マーカーの5’上流に位置し、第2のRRSは、選択マーカーの3’下流に位置する。特定の実施形態では、第1のRRSは選択マーカーの5’末端に隣接し、第2のRRSは、選択マーカーの3’末端に隣接する。
特定の実施形態では、選択マーカーは、第1と第2のRRSとの間に位置し、2つの隣接するRRSは同一である。特定の実施形態では、選択マーカーに隣接する2つのRRS、いずれもLoxP配列である。特定の実施形態では、選択マーカーに隣接する2つのRRSはいずれもFRT配列である。特定の実施形態において、選択マーカーは第1と第2のRRSの間に位置しており、かつこれら2つの隣接RRSは互いに異なる。特定の実施形態では、第1の隣接するRRSは、LoxP L3配列であり、第2の隣接するRRSは、LoxP 2L配列である。特定の実施形態において、LoxP L3配列は選択マーカーの5’に位置しており、LoxP 2L配列は選択マーカーの3’に位置している。特定の実施形態において、第1の隣接RRSは野生型FRT配列であり、第2の隣接RRSは変異FRT配列である。特定の実施形態では、第1の隣接するRRSは、Bxb1 attP配列であり、第2の隣接するRRSは、Bxb1 attB配列である。特定の実施形態において、第1の隣接RRSはφC31 attP配列であり、第2の隣接RRSはφC31 attB配列である。特定の実施形態において、2つのRRSは、同じ向きに位置づけられている。特定の実施形態において、2つのRRSは、両方が順方向又は逆方向である。特定の実施形態において、2つのRRSは、反対の向きに位置づけられている。
特定の実施形態では、選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(APH)(例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HYG)、ネオマイシン及びG418 APH)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、チミジンキナーゼ(TK)、グルタミンシンテターゼ(GS)、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ(インドール)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(ヒスチジノールD)、並びにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、又はマイコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子であり得る。特定の実施形態では、選択マーカーは、GFP、eGFP、合成GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed-モノマー、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean、又はT-Sapphireマーカーであり得る。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、2つのRRSに隣接する2つの選択マーカーを含み、第1の選択マーカーは、第2の選択マーカーとは異なる。特定の実施形態では、2つの選択マーカーは両方とも、グルタミンシンテターゼ選択マーカー、チミジンキナーゼ選択マーカー、HYG選択マーカー、及びピューロマイシン耐性選択マーカーからなる群から選択される。特定の実施形態において、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、チミジンキナーゼ選択マーカー及びHYG選択マーカーを含む。特定の実施形態では、第1の選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(APH)(例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HYG)、ネオマイシン及びG418 APH)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、チミジンキナーゼ(TK)、グルタミンシンテターゼ(GS)、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ(インドール)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(ヒスチジノールD)、並びにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びマイコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され、第2の選択マーカーは、GFP、eGFP、合成GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed-monomer、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean、及びT-Sapphireからなる群から選択される。特定の実施形態では、第1の選択マーカーは、グルタミンシンテターゼ選択マーカーであり、第2の選択マーカーは、GFPマーカーである。特定の実施形態では、両方の選択マーカーに隣接する2つのRRSは同一である。特定の実施形態において、両方の選択マーカーに隣接する2つのRRSは、互いに異なる。
特定の実施形態において、選択マーカーは、プロモーター配列に作動能可能に連結されている。特定の実施形態において、選択マーカーは、SV40プロモーターに作動能可能に連結されている。特定の実施形態では、選択マーカーは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターに作用可能に連結されている。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの選択マーカー及びIRESを含み、IRESは選択マーカーに作用可能に連結されている。特定の実施形態では、IRESに作用可能に連結された選択マーカーは、GFP、eGFP、合成GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed-モノマー、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean、及びT-Sapphireマーカーからなる群から選択される。特定の実施形態では、IRESに作用可能に連結される選択マーカーは、GFPマーカーである。目的特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、2つのRRSに隣接するIRES及び2つの選択マーカーを含み、そのIRESは第2の選択マーカーに機能的に連結される。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、2つのRRSに隣接するIRES及び3つの選択マーカーを含み、IRESは第3の選択マーカーに作用可能に連結されている。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、2つのRRSに隣接するIRES及び3つの選択マーカーを含み、IRESは第3の選択マーカーに作用可能に連結されている。特定の実施形態では、第3の選択マーカーは、第1又は第2の選択マーカーとは異なる。ある特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、プロモーターに作用可能に連結された第1の選択マーカー及びIRESに作用可能に連結された第2の選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、SV40プロモーターに作用可能に連結されたグルタミンシンテターゼ選択マーカー及びIRESに作用可能に連結されたGFP選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、CMVプロモーターに作用可能に連結されたチミジンキナーゼ選択マーカー及びHYG選択マーカー並びにIRESに作用可能に連結されたGFP選択マーカーを含む。
特定の実施形態において、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、3つのRRSを含む。特定の実施形態において、第3のRRSは、第1と第2のRRSの間に位置している。特定の実施形態では、3つのRRS全てが同一である。特定の実施形態において、第1及び第2のRRSは同じであり、第3のRRSは、第1のRRSとも第2のRRSとも異なる。特定の実施形態では、3つのRRSすべてが異なる。
特定の実施形態では、組込み部位として働く外因性ヌクレオチド配列は、TI宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の部位に存在する。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれる遺伝子座は、配列番号1~7から選択される配列と少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、又は少なくとも約99.9%相同である。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれる遺伝子座は、本開示の配列番号8~11に対応する米国特許第9816110号の配列番号1~4、又は本開示の配列番号12に対応する国際出願第PCT/US 2017/028555号の配列番号1から選択される配列に少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、又は少なくとも約99.9%相同である。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、TI宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれる遺伝子座は、Contigs NW_006874047.1、NW_006884592.1、NW_006881296.1、NW_003616412.1、NW_003615063.1、NW_006882936.1、及びNW_003615411.1から選択される配列と少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、又は少なくとも約99.9%相同である。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号1の番号が付された1~1,000bp、1,000~2,000bp、2,000~3,000bp、3,000~4,000bp、及び4,000~4,301bpとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号2の番号が付された1~100,000bp、100,000~200,000bp、200,000~300,000bp、300,000~400,000bp、400,000~500,000bp、500,000~600,000bp、600,000~700,000bp、及び700,000~728785bpとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号3の番号が付された1~100,000bp、100,000~200,000bp、200,000~300,000bp、300,000~400,000bp、及び400,000~413,983となるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号4の番号が付された1~10,000bp、10,000~20,000bp、20,000~30,000bp、及び30,000~30,757bpとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号5の番号が付された1~10,000bp、10,000~20,000bp、20,000~30,000bp、30,000~40,000bp、40,000~50,000bp、50,000~60,000bp、及び60,000~68,962bpとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号6の番号が付された1~10,000bp、10,000~20,000bp、20,000~30,000bp、30,000~40,000bp、40,000~50,000bp、及び50,000~51,326bpとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号7の番号が付された1~10,000bp、10,000~20,000bp、及び20,000~22,904bpとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。
特定の実施形態では、組込み外因性配列のすぐ5’側のヌクレオチド配列は、NW_006874047.1のヌクレオチド41190-45269、NW_006884592.1のヌクレオチド63590-207911、NW_006881296.1のヌクレオチド253831-491909、NW_003616412.1のヌクレオチド69303-79768、NW_003615063.1のヌクレオチド293481-315265、NW_006882936.1のヌクレオチド2650443-2662054、又はNW_003615411.1のヌクレオチド82214-97705及びそれらと少なくとも50%相同の配列からなる群から選択される。特定の実施形態では、組込み外因性配列のすぐ5’側のヌクレオチド配列は、NW_006874047.1のヌクレオチド41190-45269、NW_006884592.1のヌクレオチド63590-207911、NW_006881296.1のヌクレオチド253831-491909、NW_003616412.1のヌクレオチド69303-79768、NW_003615063.1のヌクレオチド293481-315265、NW_006882936.1のヌクレオチド2650443-2662054、又はNW_003615411.1のヌクレオチド82214-97705と少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、又は少なくとも約99.9%相同である。
特定の実施形態では、組込み外因性配列のすぐ3’側のヌクレオチド配列は、NW_006874047.1のヌクレオチド45270-45490、NW_006884592.1のヌクレオチド207912-792374、NW_006881296.1のヌクレオチド491910-667813、NW_003616412.1のヌクレオチド79769-100059、NW_003615063.1のヌクレオチド315266-362442、NW_006882936.1のヌクレオチド2662055-2701768、又はNW_003615411.1のヌクレオチド97706-105117及びそれらと少なくとも50%相同の配列からなる群から選択される。特定の実施形態では、組込み外因性配列のすぐ3’側のヌクレオチド配列は、NW_006874047.1のヌクレオチド45270-45490、NW_006884592.1のヌクレオチド207912-792374、NW_006881296.1のヌクレオチド491910-667813、NW_003616412.1のヌクレオチド79769-100059、NW_003615063.1のヌクレオチド315266-362442、NW_006882936.1のヌクレオチド2662055-2701768、又はNW_003615411.1のヌクレオチド97706-105117と少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、又は少なくとも約99.9%相同である。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、配列番号1~7及びそれと少なくとも50%相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に作用可能に連結される。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列に作用可能に連結されたヌクレオチド配列は、配列番号1~7から選択される配列と少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、又は少なくとも約99.9%相同である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つのSOIを含む。特定の実施形態では、作用可能に連結されたヌクレオチド配列は、ランダム組込みSOIと比較して、SOIの発現レベルを増加させる。特定の実施形態では、組み込まれた外因性SOIは、ランダム組込みSOIよりも約20%、30%、40%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、又は10倍高く発現される。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性配列は、NW_006874047.1のヌクレオチド41190-45269、NW_006884592.1のヌクレオチド63590-207911、NW_006881296.1のヌクレオチド253831-491909、NW_003616412.1のヌクレオチド69303-79768、NW_003615063.1のヌクレオチド293481-315265、NW_006882936.1のヌクレオチド2650443-2662054、及びNW_003615411.1のヌクレオチド82214-97705並びにそれらと少なくとも50%相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の5’側に隣接し、NW_006874047.1のヌクレオチド45270-45490、NW_006884592.1のヌクレオチド207912-792374、NW_006881296.1のヌクレオチド491910-667813、NW_003616412.1のヌクレオチド79769-100059、NW_003615063.1のヌクレオチド315266-362442、NW_006882936.1のヌクレオチド2662055-2701768、及びNW_003615411.1のヌクレオチド97706-105117並びにそれらと少なくとも50%相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の3’側に隣接する。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の5’側に隣接するヌクレオチド配列は、NW_006874047.1のヌクレオチド41190-45269、NW_006884592.1のヌクレオチド63590-207911、NW_006881296.1のヌクレオチド253831-491909、NW_003616412.1のヌクレオチド69303-79768、NW_003615063.1のヌクレオチド293481-315265、NW_006882936.1のヌクレオチド2650443-2662054、及びNW_003615411.1のヌクレオチド82214-97705と少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、又は少なくとも約99.9%相同であり、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の3’側に隣接するヌクレオチド配列は、配列番号NW_006874047.1のヌクレオチド45270-45490、NW_006884592.1のヌクレオチド207912-792374、NW_006881296.1のヌクレオチド491910-667813、NW_003616412.1のヌクレオチド79769-100059、NW_003615063.1のヌクレオチド315266-362442、NW_006882936.1のヌクレオチド2662055-2701768、及びNW_003615411.1のヌクレオチド97706-105117と少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、又は少なくとも約99.9%相同である。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチドは、配列番号1~7から選択される配列と少なくとも約90%相同の配列からなる群から選択される配列の全部又は一部にすぐ隣接する遺伝子座に組み込まれる。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、配列番号1~7及びそれと少なくとも50%相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に隣接する。ある特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、配列番号1~7及びそれと少なくとも50%相同の配列からなる群から選択される配列から約100bp、約200bp、約500bp、約1kb以内の距離にある。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列は、配列番号1~7から選択される配列と少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、又は少なくとも約99.9%相同である。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号1の番号が付与された1~1,000bp、1,000~2,000bp、2,000~3,000bp、3,000~4,000bp、及び4,000~4,301bpとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号2の番号が付与された1~100,000bp、100,000~200,000bp、200,000~300,000bp、300,000~400,000bp、400,000~500,000bp、500,000~600,000bp、600,000~700,000bp、及び700,000~728785bpとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号3の番号が付与された1~100,000bp、100,000~200,000bp、200,000~300,000bp、300,000~400,000bp、及び400,000~413,983となるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号4の番号が付与された1~10,000bp、10,000~20,000bp、20,000~30,000bp、及び30,000~30,757bpとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号5の番号が付与された1~10,000bp、10,000~20,000bp、20,000~30,000bp、30,000~40,000bp、40,000~50,000bp、50,000~60,000bp、及び60,000~68,962bpとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号6の番号が付与された1~10,000bp、10,000~20,000bp、20,000~30,000bp、30,000~40,000bp、40,000~50,000bp、及び50,000~51,326bpとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号7の番号が付与された1~10,000bp、10,000~20,000bp、及び20,000~22,904bpとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列の組込み部位を含む遺伝子座は、オープンリーディングフレーム(ORF)をコードしない。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列の組込み部位を含む遺伝子座は、シス作用性エレメント、例えば、プロモーター及びエンハンサーを含む。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列の組込み部位を含む遺伝子座は、遺伝子発現を増強する任意のシス作用性エレメント、例えばプロモーター及びエンハンサーを含まない。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及びXP_003512331.2からなる群から選択される内因性遺伝子内における組込み部位に組み込まれる。内因性LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及びXP_003512331.2遺伝子には、LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2及びXP_003512331.2遺伝子の野生型及び全ての相同配列が含まれる。特定の実施形態では、LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及びXP_003512331.2遺伝子の相同配列は、野生型LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及びXP_003512331.2遺伝子と少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、又は少なくとも約99.9%相同であり得る。ある特定の実施形態では、LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及びXP_003512331.2遺伝子は、野生型哺乳動物LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及びXP_003512331.2遺伝子である。特定の実施形態では、LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及びXP_003512331.2遺伝子は、野生型ヒトLOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及びXP_003512331.2遺伝子である。特定の実施形態では、LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及びXP_003512331.2遺伝子は、野生型ハムスターLOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、及びXP_003512331.2遺伝子である。
特定の実施形態では、組込み部位は、LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2、及びそれらの少なくとも約90%相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子に作用可能に連結される。特定の実施形態では、組込み部位は、LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2、及びそれらの少なくとも約90%相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子に隣接する。
3.2 目的の配列を含む外因性ヌクレオチド配列
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの外因性SOIを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの選択マーカー及び少なくとも1つの外因性SOIを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの選択マーカー、少なくとも1つの外因性SOI、及び少なくとも1つのRRSを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、又はそれを超えるSOIを含む。特定の実施形態では、SOIは同一である。特定の実施形態では、SOIは異なる。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの外因性SOIを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの選択マーカー及び少なくとも1つの外因性SOIを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの選択マーカー、少なくとも1つの外因性SOI、及び少なくとも1つのRRSを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、又はそれを超えるSOIを含む。特定の実施形態では、SOIは同一である。特定の実施形態では、SOIは異なる。
上記のように、特定の実施形態では、SOIは、マルチサブユニットタンパク質複合体の1つ又は複数のサブユニットをコードする。特定の実施形態では、そのようなポリペプチド配列は、そのようなサブユニット配列の断片を含むことができる。特定の実施形態では、目的の配列は、そのようなサブユニット配列の組み合わせを含むことができる。例えば、限定するものではないが、そのような組み合わせは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個若しくはそれよりも多くの第1のサブユニット配列、及び/又は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個若しくはそれよりも多くの配列の第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10若しくはそれ以上のサブユニット配列を含むことができる。さらに、特定の実施形態では、そのような組み合わせは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個若しくはそれよりも多くの異なるバリエーションの第1のサブユニット配列、及び/又は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個若しくはそれよりも多くの異なるバリエーションの第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10若しくはそれよりも多くのサブユニット配列を含むことができる。
特定の実施形態では、SOIは、一本鎖抗体又はその断片をコードする。特定の実施形態では、SOIは、抗体重鎖配列又はその断片をコードする。特定の実施形態では、SOIは、抗体軽鎖配列又はその断片をコードする。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、抗体重鎖配列又はその断片をコードするSOI、及び抗体軽鎖配列又はその断片をコードするSOIを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第1の抗体重鎖配列又はその断片をコードするSOI、第2の抗体重鎖配列又はその断片をコードするSOI、及び抗体軽鎖配列又はその断片をコードするSOIを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第1の抗体重鎖配列又はその断片をコードするSOI、第2の抗体重鎖配列又はその断片をコードするSOI、第1の抗体軽鎖配列又はその断片をコードするSOI、及び抗体軽鎖配列又はその断片をコードする第2のSOIを含む。特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖配列をコードするSOIの数は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの所望の発現レベルを達成するように、例えば所望の量の二重特異性抗体生産を達成するように選択することができる。特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖配列をコードする個々のSOIは、例えば、単一の組込み部位に存在する単一の外因性核酸配列に、単一の組込み部位に存在する複数の外因性核酸配列に、又はTI宿主細胞内の異なる組込み部位に組み込まれた複数の外因性核酸配列に組み込まれ得る。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの選択マーカー、少なくとも1つの外因性SOI及び1つのRRSを含む。特定の実施形態では、RRSは、少なくとも1つの選択マーカー又は少なくとも1つの外因性SOIに隣接して位置する。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの選択マーカー、少なくとも1つの外因性SOI、及び2つのRRSを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第1と第2のRRSとの間に位置する少なくとも1つの選択マーカー及び少なくとも1つの外因性SOIを含む。特定の実施形態では、選択マーカー及び外因性SOIに隣接する2つのRRSは同一である。特定の実施形態では、選択マーカー及び外因性SOIに隣接する2つのRRSは異なる。特定の実施形態では、第1の隣接するRRSは、LoxP L3配列であり、第2の隣接するRRSは、LoxP 2L配列である。特定の実施形態では、LoxP L3配列は、選択マーカーの5’に位置し、LoxP 2L配列は、選択マーカー及び外因性SOIの3’に位置する。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、3つのRRS及び2つの外因性SOIを含み、第3のRRSは、第1と第2のRRSとの間に位置する。特定の実施形態では、第1のSOIは、第1と第3のRRSとの間に位置し、第2のSOIは、第3と第2のRRSとの間に位置する。特定の実施形態では、第1と第2のSOIは異なる。特定の実施形態において、第1及び第2のRRSは同じであり、第3のRRSは、第1のRRSとも第2のRRSとも異なる。特定の実施形態では、3つのRRSすべてが異なる。特定の実施形態では、第1のRRSはLoxP L3部位であり、第2のRRSはLoxP 2L部位であり、第3のRRSはLoxFas部位である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、3つのRRS、1つの外因性SOI、及び1つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、SOIは、第1のRRSと第3との間に位置し、選択マーカーは、第3と第2のRRSとの間に位置する。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、3つのRRS、2つの外因性SOI、及び1つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、第1のSOI及び選択マーカーは、第1と第3のRRSとの間に位置し、第2のSOIは、第3と第2のRRSとの間に位置する。
特定の実施形態では、外因性SOIは、抗体、酵素、サイトカイン、成長因子、ホルモン、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、ワクチンタンパク質、又は治療機能を有するタンパク質を含むがこれらに限定されない目的のポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、外因性SOIは、抗体又はその抗原結合断片をコードする。特定の実施形態では、外因性SOIは、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Fv断片(scFv)又はFc融合タンパク質をコードする。特定の実施形態では、外因性SOIは、少なくとも1つのシス作用性エレメント、例えば、プロモーター又はエンハンサーに作用可能に連結される。特定の実施形態では、外因性SOIは、CMVプロモーターに作用可能に連結される。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、2つのRRSと、2つのRRSの間に位置する少なくとも2つの外因性SOIとを含む。特定の実施形態では、抗体の1本の重鎖及び1本の軽鎖をコードするSOIは、2つのRRSの間に位置する。特定の実施形態では、抗体の1本の重鎖及び2本の軽鎖をコードするSOIは、2つのRRSの間に位置する。特定の実施形態では、抗体の重鎖及び軽鎖のコピーの異なる組み合わせをコードするSOIは、2つのRRSの間に位置する。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、3つのRRS及び少なくとも2つの外因性SOIを含み、第3のRRSは、第1と第2のRRSとの間に位置する。特定の実施形態では、少なくとも1つのSOIは、第1と第3のRRSとの間に位置し、少なくとも1つのSOIは、第3と第2のRRSとの間に位置する。特定の実施形態において、第1及び第2のRRSは同じであり、第3のRRSは、第1のRRSとも第2のRRSとも異なる。特定の実施形態では、3つのRRSすべてが異なる。特定の実施形態では、第1の抗体の1本の重鎖及び1本の軽鎖をコードするSOIは、第1と第3のRRSとの間に位置し、第2の抗体の1本の重鎖及び1本の軽鎖をコードするSOIは、第3と第2のRRSとの間に位置する。特定の実施形態では、第1の抗体の1本の重鎖及び2本の軽鎖をコードするSOIは、第1と第3のRRSとの間に位置し、第2の抗体の1本の重鎖及び1本の軽鎖をコードするSOIは、第3のRRSと第2のRRSとの間に位置する。特定の実施形態では、第1の抗体の1本の重鎖及び3本の軽鎖をコードするSOIは、第1と第3のRRSとの間に位置し、第1の抗体の1本の軽鎖、並びに第2の抗体の1本の重鎖及び1本の軽鎖をコードするSOIは、第3のRRSと第2のRRSとの間に位置する。特定の実施形態では、第1の抗体の1本の重鎖及び3本の軽鎖をコードするSOIは、第1と第3のRRSとの間に位置し、第1の抗体の2本の軽鎖、並びに第2の抗体の1本の重鎖及び1本の軽鎖をコードするSOIは、第3のRRSと第2のRRSとの間に位置する。特定の実施形態では、複数の抗体の重鎖及び軽鎖のコピーの異なる組み合わせをコードするSOIは、第1と第3のRRSとの間、並びに第3と第2のRRSとの間に位置する。
4.宿主細胞
特定の実施形態では、宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞、又はCHO K1M宿主細胞である。
特定の実施形態では、宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞、又はCHO K1M宿主細胞である。
特定の実施形態では、宿主細胞は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7)、ヒト胎児腎臓株(例えば、Grahamら,J.Gen Virol.36:59(1977)に記載されるような293又は293細胞)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK)、マウスセルトリ細胞(例えば、Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)に記載されるようなTM4細胞)、サル腎臓細胞(CV1)、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76)、ヒト子宮頸癌腫細胞(HELA)、イヌ腎臓細胞(MDCK)、バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝臓細胞(Hep G2)、マウス乳房腫瘍(MMT060562)、例えば、Matherら,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)に記載されるような、TRI細胞、MRC5細胞、FS4細胞、Y0細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、及びPER.C6(登録商標)細胞からなる群から選択される。
特定の実施形態では、宿主細胞は細胞株である。特定の実施形態では、宿主細胞は、ある特定の世代数にわたって培養された細胞株である。特定の実施形態では、宿主細胞は、初代細胞である。
特定の実施形態では、目的のポリペプチドの発現は、発現レベルが特定のレベルに維持され、10、20、30、50、100、200又は300世代にわたって20%未満で増加し、又は減少する場合に安定である。特定の実施形態では、培養物を選択せずに維持することができる場合、目的のポリペプチドの発現は安定である。特定の実施形態では、目的の遺伝子のポリペプチド産物が約1g/L、約2g/L、約3g/L、約4g/L、約5g/L、約10g/L、約12g/L、約14g/L又は約16g/Lに達する場合、目的のポリペプチドの発現が高い。
特定の実施形態では、目的のポリペプチドが生産され、細胞培養培地中に分泌される。特定の実施形態では、目的のポリペプチドは宿主細胞内で発現し、保持される。特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、宿主細胞膜で発現され、挿入され、保持される。
目的の外因性ヌクレオチド又はベクターは、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション又は注入を含むが、これらに限定されない従来の細胞生物学的方法によって宿主細胞に導入され得る。特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチド又はベクターは、脂質ベースのトランスフェクション法、リン酸カルシウムベースのトランスフェクション法、カチオン性ポリマーベースのトランスフェクション法、又はナノ粒子ベースのトランスフェクションを含む化学ベースのトランスフェクション法によって宿主細胞に導入される。特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチドは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス媒介形質導入を含むがこれらに限定されないウイルス媒介形質導入によって、宿主細胞に導入される。特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチド又はベクターは、遺伝子銃媒介注入によって宿主細胞に導入される。特定の実施形態では、DNA分子及びRNA分子が、いずれも本明細書中に記載される方法を使用して宿主細胞に導入される。
5.標的化組込み
標的化組込み手法は、外因性ヌクレオチド配列が宿主細胞ゲノムの1つ以上の所定の部位に組み込まれることを可能にする。特定の実施形態では、標的化組込みは、1つ以上のRRSを認識するリコンビナーゼによって媒介される。特定の実施形態において、標的化組込みは、相同組換えによって媒介される。特定の実施形態では、標的化組込みは、外因性部位特異的ヌクレアーゼ、続いてHDR及び/又はNHEJによって媒介される。
標的化組込み手法は、外因性ヌクレオチド配列が宿主細胞ゲノムの1つ以上の所定の部位に組み込まれることを可能にする。特定の実施形態では、標的化組込みは、1つ以上のRRSを認識するリコンビナーゼによって媒介される。特定の実施形態において、標的化組込みは、相同組換えによって媒介される。特定の実施形態では、標的化組込みは、外因性部位特異的ヌクレアーゼ、続いてHDR及び/又はNHEJによって媒介される。
5.1.リコンビナーゼ媒介性組換えによる標的化組込み
「リコンビナーゼ認識配列」(RRS)は、リコンビナーゼによって認識され、リコンビナーゼ媒介性組換え事象のために必要かつ十分である、ヌクレオチド配列である。RRSを用いて、組換え事象が起こると考えられるヌクレオチド配列中の位置を定めることができる。
「リコンビナーゼ認識配列」(RRS)は、リコンビナーゼによって認識され、リコンビナーゼ媒介性組換え事象のために必要かつ十分である、ヌクレオチド配列である。RRSを用いて、組換え事象が起こると考えられるヌクレオチド配列中の位置を定めることができる。
特定の実施形態において、RRSは、LoxP配列、LoxP L3配列、LoxP 2L配列、LoxFas配列、Lox511配列、Lox2272配列、Lox2372配列、Lox5171配列、Loxm2配列、Lox71配列、Lox66配列、FRT配列、Bxb1 attP配列、Bxb1 attB配列、φC31 attP配列、及びφC31 attB配列からなる群から選択される。
特定の実施形態において、RRSは、Creリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、RRSは、FLPリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、RRSは、Bxb1インテグラーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、RRSは、φC31インテグラーゼによって認識され得る。
RRSがLoxP部位である場合の特定の実施形態では、宿主細胞は、組換えを実施するためにCreリコンビナーゼを必要とする。RRSがFRT部位である場合の特定の実施形態では、宿主細胞は、組換えを実施するためにFLPリコンビナーゼを必要とする。RRSがBxb1 attP又はBxb1 attB部位である場合の特定の実施形態では、宿主細胞は、組換えを実施するためにBxb1インテグラーゼを必要とする。RRSがφC31 attP又はφC31 attB部位である場合の特定の実施形態では、宿主細胞は、組換えを実施するためにφC31インテグラーゼを必要とする。リコンビナーゼを、該酵素のコード配列を含む発現ベクターを使用して、宿主細胞に導入することができる。
Cre-LoxP部位特異的組換え系は、多くの生物学的実験系において広く使用されている。Creは、34bpのLoxP配列を認識する、38kDaの部位特異的DNAリコンビナーゼである。CreはバクテリオファージP1に由来し、チロシンファミリーの部位特異的リコンビナーゼに属する。Creリコンビナーゼは、LoxP配列間の分子内組換えと分子間組換えの両方を媒介することができる。LoxP配列は、2つの13bpの逆方向反復に挟まれた8bpの非パリンドロームコア領域で構成されている。Creリコンビナーゼは13bpの反復に結合し、それによって8bpのコア領域内での組換えを媒介する。Cre-LoxPの媒介による組換えは、高効率で起こり、いかなる他の宿主因子も必要としない。2つのLoxP配列が同じヌクレオチド配列上に同じ向きで配置されている場合、Creの媒介による組換えは、それら2つのLoxP配列の間に位置するDNA配列を、共有結合的に閉じた環として切除する。2つのLoxP配列が同じヌクレオチド配列上に逆向きの位置で配置されている場合、Creの媒介による組換えは、それら2つの配列の間に位置するDNA配列の向きを逆にする。LoxP配列を異なる染色体上に配置して、異なる染色体間の組換えを促進することもできる。2つのLoxP配列が2つの異なるDNA分子上に存在する場合、かつ一方のDNA分子が環状である場合、Creの媒介による組換えの結果、環状DNA配列の組込みが生じる。
特定の実施形態において、LoxP配列は、野生型LoxP配列である。特定の実施形態において、LoxP配列は、変異LoxP配列である。変異LoxP配列は、Creの媒介による組込み又は置換の効率を高めるために開発された。特定の実施形態において、変異LoxP配列は、LoxP L3配列、LoxP 2L配列、LoxFas配列、Lox511配列、Lox2272配列、Lox2372配列、Lox5171配列、Loxm2配列、Lox71配列、及びLox66配列からなる群から選択される。例えば、Lox71配列は、左の13bp反復中で5bpが変異している。Lox66配列は、右の13bp反復中で5bpが変異している。野生型LoxP配列も変異LoxP配列も、Creに依存した組換えを媒介することができる。
FLP-FRT部位特異的組換えシステムは、Cre-Loxシステムに類似している。それは、酵母Saccharomyces cerevisiaeの2μmプラスミドに由来するフリッパーゼ(FLP)リコンビナーゼを含む。FLPはまた、チロシンファミリー部位特異的リコンビナーゼに属する。FRT配列は、各々が8bpのスペーサーに隣接する13bpの2つの回文配列からなる34bpの配列である。FLPは、13bpの回文配列に結合し、8bpスペーサー内のDNA切断、交換及びライゲーションを媒介する。Creリコンビナーゼと同様に、2つのFRT配列の位置及び配向によって、FLP媒介性組換えの結果が決定される。特定の実施形態では、FRT配列は、野生型FRT配列である。特定の実施形態では、FRT配列は、変異体FRT配列である。野生型及び変異体のFRT配列は、いずれもFLP依存性組換えを媒介し得る。特定の実施形態では、FRT配列は、限定されないが、タモキシフェン応答性受容体ドメイン配列などの応答性受容体ドメイン配列に融合される。
Bxb1及びφC31はセリンリコンビナーゼファミリーに属する。それらはいずれもバクテリオファージに由来し、溶原性を確立して細菌ゲノムへのファージゲノムの部位特異的組込みを促進するためにこれらのバクテリオファージによって使用される。これらのインテグラーゼは、attP及びattB配列と呼ばれる短い(40~60bp)DNA基質間の部位特異的組換え事象を触媒し、その配列は、それぞれファージDNA及び細菌DNA上に位置する元々の付着部位である。組換え後、2つの新しい配列が形成され、これらはattL配列及びattR配列と呼ばれ、各々がattP及びattBに由来する半分の配列を含む。組換えはまた、attL配列とattR配列との間で起こり、組み込まれたファージを細菌DNAから切り出し得る。両方のインテグラーゼは、さらなる宿主因子の助けを借りずに組換えを触媒し得る。補助因子が全く存在しない場合、これらのインテグラーゼは、attPとattBとの間の一方向性の組換えを80%の効率で媒介する。これらのインテグラーゼによって認識され得る短いDNA配列及び一方向性組換えのために、これらの組換えシステムは、遺伝目的のために広く使用されているCre-LoxP系及びFRT-FLP系の補完物として開発された。
用語「一致RRS」とは、2つのRRS間で組換えが起こることを示す。特定の実施形態において、2つの一致RRSは、同じである。特定の実施形態において、どちらのRRSも、野生型LoxP配列である。特定の実施形態において、どちらのRRSも、変異LoxP配列である。特定の実施形態において、どちらのRRSも、野生型FRT配列である。特定の実施形態において、どちらのRRSも、変異FRT配列である。特定の実施形態において、2つの一致RRSは、互いに異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、第1の一致RRSは、Bxb1 attP配列であり、第2の一致RRSは、Bxb1 attB配列である。特定の実施形態では、第1の一致するRRSは、φC31attB配列であり、第2の一致するRRSは、φC31 attB配列である。
特定の実施形態では、「単一ベクターRMCE」戦略が使用される。例えば、特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は2つのRRSを含み、ベクターは、組込まれた外因性ヌクレオチド配列上の2つのRRSと一致する2つのRRSを含む、すなわち、組込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第1のRRSが、ベクター上の第1のRRSと一致し、組込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第2のRRSが、ベクター上の第2のRRSと一致する。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第1のRRS及びベクター上の第1のRRSは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第2のRRS及びベクター上の第2のRRSと同一である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第1のRRS及びベクター上の第1のRRSは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第2のRRS及びベクター上の第2のRRSとは異なる。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第1のRRS及びベクター上の第1のRRSは、いずれもLoxP L3配列であり、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第2のRRS及びベクター上の第2のRRSは、いずれもLoxP 2L配列である。
特定の実施形態では、「2ベクターRMCE」戦略が使用される。例えば、限定されるわけではないが、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、3つのRRS、例えば、第3のRRS(「RRS3」)が第1のRRS(「RRS1」)と第2のRRS(「RRS2」)の間に存在する並びを含むことができ、第1のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第1のRRS及び第3のRRSと一致する2つのRRSを含み、第2のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第3のRRS及び第2のRRSと一致する2つのRRSを含む。このような2ベクターRMCE戦略では、RRSの各対間に適切な数のSOIを組み込むことにより、10個のSOIの導入が可能になる。
単一ベクター及び2ベクターRMCEはいずれも、1つ以上のドナーDNA分子を宿主細胞ゲノムの所定の部位に一方向に組み込み、ドナーDNA上に存在するDNAカセットを、組込み部位が存在する宿主ゲノム上のDNAカセットとの正確な交換を可能にする。DNAカセットは、少なくとも1つの選択マーカー(ただし、特定の2ベクターRMCEの例では、本明細書で概説するように「分割選択マーカー」を使用できる)、及び/又は少なくとも1つの外因性SOIに隣接する2つの異種特異的RRSを特徴とする。RMCEは、二重組換え乗換え事象を伴い、この事象は、リコンビナーゼによって触媒され、標的ゲノム遺伝子座内の2つの異種特異的RRSとドナーDNA分子の間で起こる。RMCEは、SOI又は選択マーカーのコピーを宿主細胞ゲノムの所定の遺伝子座に導入するように設計されている。たった1回のクロスオーバーイベントを伴う組換えとは異なり、RMCEは、原核生物のベクター配列が宿主細胞のゲノムに導入されないように実行できるため、宿主の免疫又は防御機構の望ましくないトリガーを低減及び/又は防止する。RMCE手順は、複数のDNAカセットを用いて繰り返すことができ、例えば、図2Bでは、RMCE手順を用いて3つの別個の「フロント」カセット及び3つの別個の「バック」カセットの導入を容易にする。しかしながら、上記のように、RMCE(及び他の組込み戦略)を使用して、わずか1つのカセット及び10個以上ものカセットを導入することができる。
特定の実施形態では、標的化組込みは、少なくとも1つの外因性SOI又は少なくとも1つの選択マーカーに隣接する1つのRRSを含む1つの外因性ヌクレオチド配列が宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込まれる1つの交差組換え事象によって達成される。特定の実施形態では、標的化組込みは、1回のRMCEによって達成され、2つの異種特異的RRSに隣接する少なくとも外因性SOI又は少なくとも1つの選択マーカーを含むDNAカセットが、宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、標的化組込みは、2回のRMCEによって達成され、2つの異種特異的RRSに隣接する少なくとも外因性SOI又は少なくとも1つの選択マーカーをそれぞれ含む、2つの異なるDNAカセットがいずれも、宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、標的化組込みは、複数回のRMCEによって達成され、2つの異種特異的RRSに隣接する少なくとも1つの外因性SOI又は少なくとも1つの選択マーカーをそれぞれ含む、複数のベクター由来のDNAカセットが、宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、選択マーカーは、両方のRMCEの組込みが選択マーカーの発現を可能にするように、第1のベクター上で部分的にコードされ、第2のベクター上で部分的にコードされ得る。
特定の実施形態では、リコンビナーゼ媒介性組換えを介した標的化組込みは、原核生物ベクターに由来し、宿主細胞ゲノムの1つ以上の所定の組込み部位に組み込まれる、選択マーカー又は1つ以上の外因性SOIをもたらす。特定の実施形態では、リコンビナーゼ媒介性組換えを介した標的化組込みは、原核生物ベクターからの配列を含まない宿主細胞ゲノムの1つ以上の所定の組込み部位に組み込まれる、選択マーカー又は1つ以上の外因性SOIをもたらす。
5.2 相同組換え、HDR又はNHEJを介した標的化組込み
本開示の主題はまた、相同組換えによって、又は外因性部位特異的ヌクレアーゼとそれに続くHDR若しくはNHEJによって媒介される標的化組込みに関する。特定の実施形態では、そのような組込みは、本明細書では「遺伝子編集媒介性組込み」と呼ばれる。
本開示の主題はまた、相同組換えによって、又は外因性部位特異的ヌクレアーゼとそれに続くHDR若しくはNHEJによって媒介される標的化組込みに関する。特定の実施形態では、そのような組込みは、本明細書では「遺伝子編集媒介性組込み」と呼ばれる。
相同組換えは、広範な配列相同性を共有するDNA分子間の組換えである。それは、二本鎖DNA切断のエラーのない修復を誘導するために使用することができ、減数分裂中に配偶子の配列多様性を生成する。相同組換えは、2つの相同DNA分子間の遺伝情報の交換を伴うので、染色体上の遺伝子の全体的な配置を変化させるわけではない。相同組換えの間、ニック又は切断が二本鎖DNA(dsDNA)に形成され、続いて一本鎖DNA末端による相同dsDNA分子の侵入、相同配列の対形成、ホリディジャンクションを形成するための分岐移動、及び最終的なホリディ接合部の分離が起こる。
二本鎖切断(DSB)は、DNA損傷の最も深刻な形態であり、そのようなDNA損傷の修復は、全ての生物におけるゲノム完全性の維持に不可欠である。DSBを修復するためには2つの主な修復経路がある。第1の修復経路は相同組換え修復(HDR)経路であり、相同組換えはHDRの最も一般的な形態である。HDRは細胞内に存在する相同DNAの存在を必要とするので、この修復経路は通常、細胞周期のS期及びG2期において活性であり、新しく複製された姉妹染色分体が相同鋳型として利用可能である。HDRはまた、DNA複製中に崩壊した複製フォークを修復するための主要な修復経路である。HDRは、比較的エラーのない修復経路と考えられている。DSBの第2の修復経路は、非相同末端結合(NHEJ)である。NHEJは、相同DNA鋳型を必要とせずに、切断されたDNAの末端が一緒に連結される修復経路である。
標的化組込みは、外因性部位特異的ヌクレアーゼ、例えば遺伝子編集ヌクレアーゼに続いてHDRによって促進され得る。これは、特定の標的ゲノム部位にDSBを導入することにより、相同組換えの頻度を高めることができるためである。特定の実施形態では、外因性ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、ZFN二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、TALエフェクタードメイン融合タンパク質、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、及びクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し(CRISPR)関連(Cas)エンドヌクレアーゼからなる群から選択され得る。
CRISPR/Cas及びTALENシステムは、最も容易な構築及び高効率を提供する2つのゲノム編集ツールである。CRISPR/Casは、侵入バクテリオファージに対する細菌の免疫防御機構として同定された。Casは、合成ガイドRNA(gRNA)によって誘導されると、細胞内の特定のヌクレオチド配列と会合し、例えば一本鎖切断、DSB、及び/又は点突然変異の1つ又は複数を行なうことによって、そのヌクレオチド配列内又はその周囲のDNAを編集し得るヌクレアーゼである。TALENは、操作された部位特異的ヌクレアーゼであり、TALE(転写活性化因子様エフェクター)のDNA結合ドメイン及び制限エンドヌクレアーゼFokIの触媒ドメインから構成される。DNA結合ドメインのモノマーの高度可変残基領域に存在するアミノ酸を変化させることによって、様々なヌクレオチド配列を標的とする異なる人工TALENを作製することができる。DNA結合ドメインはその後、ヌクレアーゼを標的配列に指向させ、DSBを作成する。
相同組換え又はHDRによる標的化組込みは、組込み部位に対する相同配列の存在を含む。特定の実施形態では、相同配列は、ベクター上に存在する。特定の実施形態では、相同配列は、ポリヌクレオチド上に存在する。
特定の実施形態では、相同組換えは、補助因子を何ら用いることとなく実施される。特定の実施形態では、相同組換えは、組込み可能なベクターの存在によって促進される。特定の実施形態では、組込みベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター及び組込みファージベクターからなる群から選択される。
5.3 調節されたシステム
本開示の主題はまた、「ランダム化された構成の制御された標的化組込み」(本明細書では「ランダム化された鎖の制御された標的化組込み」とも呼ばれる)(「RCRTI」)として知られる、RCTIで使用するための制御されたシステムに関する。例えば、主にコードされるタンパク質が発現しにくいために、タンパク質発現レベルが最適ではない場合が多い。発現困難なタンパク質の発現レベルが低いのは、原因が多様であり、原因を特定するのが困難であり得る。1つの可能性は、宿主細胞中で発現するタンパク質の毒性である。そのような場合、調節された発現系を使用して、タンパク質をコードする目的の配列が誘導性プロモーターの制御下にある毒性タンパク質を発現させることができる。これらの系では、発現困難なタンパク質の発現は、制御因子、例えば、限定されないが、テトラサイクリン又はその類似体、ドキシサイクリン(DOX)などの小分子が培養物に添加された場合にのみ促進される。毒性タンパク質の発現を調節することにより、毒性作用を軽減することができ、培養物が生産前に所望の細胞増殖を達成することを可能にする。特定の実施形態では、「ランダム化された構成の制御された標的化組込み」(本明細書では「ランダム化された鎖の制御された標的組込み」とも呼ばれる)(RCRTI)システムは、特定の遺伝子座、例えば1つ又は複数のRRSを含む外因性核酸配列に組み込まれ、それに作用可能に連結された制御プロモーター下で転写されるSOIを含む。特定の実施形態では、RCRTIシステムを使用して、限定されないが、抗体などの発現困難分子の低タンパク質発現の根本原因を決定することができる。特定の実施形態では、RCRTIシステムにおけるSOIの発現を選択的に停止する能力を使用して、SOIの発現を観察された有害作用に結び付けることができる。
本開示の主題はまた、「ランダム化された構成の制御された標的化組込み」(本明細書では「ランダム化された鎖の制御された標的化組込み」とも呼ばれる)(「RCRTI」)として知られる、RCTIで使用するための制御されたシステムに関する。例えば、主にコードされるタンパク質が発現しにくいために、タンパク質発現レベルが最適ではない場合が多い。発現困難なタンパク質の発現レベルが低いのは、原因が多様であり、原因を特定するのが困難であり得る。1つの可能性は、宿主細胞中で発現するタンパク質の毒性である。そのような場合、調節された発現系を使用して、タンパク質をコードする目的の配列が誘導性プロモーターの制御下にある毒性タンパク質を発現させることができる。これらの系では、発現困難なタンパク質の発現は、制御因子、例えば、限定されないが、テトラサイクリン又はその類似体、ドキシサイクリン(DOX)などの小分子が培養物に添加された場合にのみ促進される。毒性タンパク質の発現を調節することにより、毒性作用を軽減することができ、培養物が生産前に所望の細胞増殖を達成することを可能にする。特定の実施形態では、「ランダム化された構成の制御された標的化組込み」(本明細書では「ランダム化された鎖の制御された標的組込み」とも呼ばれる)(RCRTI)システムは、特定の遺伝子座、例えば1つ又は複数のRRSを含む外因性核酸配列に組み込まれ、それに作用可能に連結された制御プロモーター下で転写されるSOIを含む。特定の実施形態では、RCRTIシステムを使用して、限定されないが、抗体などの発現困難分子の低タンパク質発現の根本原因を決定することができる。特定の実施形態では、RCRTIシステムにおけるSOIの発現を選択的に停止する能力を使用して、SOIの発現を観察された有害作用に結び付けることができる。
特定の実施形態では、発現困難分子の根本原因分析中の転写及び細胞株変動の影響を最小限に抑えるために、「ランダム化された構成の制御された標的組込み」(本明細書では「ランダム化された鎖の制御された標的組込み」とも呼ばれる)(RCRTI)システムを使用することができる。例えば、限定するものではないが、TI宿主におけるSOIの発現は、調節因子、例えばドキシサイクリンの培養物への添加によって誘導され得る。特定の実施形態では、RCRTIベクターは、テトラサイクリン調節プロモーターを利用してSOIを発現し、これは、例えば、RRSを含む外因性核酸配列に組み込むことができ、RRS自体は宿主細胞のゲノム内の組込み部位に組み込まれ、SOIの調節された発現を可能にする。
特定の実施形態では、本開示に記載されるRCRTIシステムを使用して、対照細胞株と比較して、SOI、例えば治療用抗体の低タンパク質発現の根本原因が首尾よく決定され得る。特定の実施形態では、RCRTI細胞株におけるSOI、例えば治療用抗体の発現が相対的に低いことが確認されると、タンパク質翻訳阻害剤処理、例えばDox及びシクロヘキシミドを活用することによって、SOIの細胞内蓄積及び分泌レベルが評価され得る。
例えば、限定するものではないが、そのような調節は、転写抑制因子又は活性化因子と構成的又は最小プロモーターとの調節されたカップリングによってmRNA合成を遮断又は活性化するための遺伝子スイッチに基づき得る。特定の非限定的な実施形態では、抑制は、例えば、タンパク質が転写開始を立体的にブロックするリプレッサータンパク質に結合することによって、又は転写サイレンサーを介して転写を能動的に抑制することによって達成され得る。特定の非限定的な実施形態では、哺乳動物又はウイルスのエンハンサーレス最小プロモーターの活性化は、活性化ドメインへの調節されたカップリングによって達成され得る。
特定の実施形態では、転写抑制因子又は転写活性化因子の条件的カップリングは、外部刺激に応答してプロモーターに結合するアロステリックタンパク質を使用することによって達成され得る特定の実施形態では、転写抑制因子又は転写活性化因子の条件付きカップリングは、隔離タンパク質から放出されることで、標的プロモーターに結合し得る細胞内受容体を使用することによって達成され得る。特定の実施形態では、転写抑制因子又は転写活性化因子の条件付きカップリングは、化学的に誘導された二量体化剤を使用することによって達成され得る。
特定の実施形態では、本開示のTI系で使用されるアロステリックタンパク質は、抗生物質、細菌クオラムセンシングメッセンジャー、異化産物、又は温度、例えば低温若しくは熱などの培養パラメータに応答して転写活性を調節するタンパク質であり得る。特定の実施形態では、そのようなRCRTIシステムは、例えば、代替炭素源の異化遺伝子を抑制する細菌抑制因子が哺乳動物細胞に移入されている異化産物に基づくものであり得る。特定の実施形態では、標的プロモーターの抑制は、リプレッサーCymRのクマート(cumate)応答性結合によって達成され得る。ある特定の実施形態では、異化産物に基づくシステムは、単純ヘルペスVP16転写活性化ドメインに融合した、原核生物リプレッサーHdnoRの6-ヒドロキシニコチン応答性結合によるキメラプロモーターの活性化に依存し得る。
特定の実施形態では、TIシステムは、クオラムセンシング分子による集団内及び集団間のコミュニケーションを管理する原核生物に由来するクオラムセンシングベースの発現系であり得る。これらのクオラムセンシング分子は、標的細胞中の受容体に結合し、同族プロモーターに対する受容体の親和性を調節し、特異的レギュロンスイッチの開始をもたらす。特定の実施形態では、クオラムセンシング分子は、N-(3-オキソ-オクタノイル)-ホモセリンラクトンであり得、その存在下で、TraR-p65融合タンパク質が、TraR特異的オペレータ配列に融合した最小プロモーターからの発現を活性化する。特定の実施形態では、クオラムセンシング分子は、ストレプトマイセス・セリカラーA3(2)SCB1の非存在下でその同族オペレータOScbRに結合するScbRリプレッサーに基づく系におけるブチロラクトンSCB1(ラセミ体2-(1’-ヒドロキシ-6-メチルヘプチル)-3-(ヒドロキシメチル)ブタノリド)であり得る。特定の実施形態では、クオラムセンシング分子は、RTIシステムで使用されるホモセリン由来誘導因子であり得、緑膿菌クオラムセンシング抑制因子RhlR及びLasRがSV40 T抗原核局在化配列及び単純ヘルペスVP16ドメインに融合され、特定のオペレータ配列(lasボックス)を含むプロモーターを活性化し得る。
特定の実施形態では、本開示のRCRTIシステムで使用されるアロステリックタンパク質を調節する誘導分子は、クマート、イソプロピル-β-D-ガラクトピラノシド(IPTG)、マクロライド、6-ヒドロキシニコチン、ドキシサイクリン、ストレプトグラミン、NADH、テトラサイクリンであり得るが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本開示のRCRTIシステムで使用される細胞内受容体は、細胞質又は核受容体であり得る。特定の実施形態では、本開示のRCRTIシステムは、小分子を使用することにより、タンパク質の捕捉及び阻害からの転写因子の放出を利用し得る。特定の実施形態では、本開示のRCRTIシステムは、ステロイド調節に依存し得、ホルモン受容体は、サイトゾルにおいてHSP90から放出され得る天然又は人工の転写因子に融合され、核内に移動し、選択されたプロモーターを活性化する。特定の実施形態では、内因性ステロイドホルモンによるクロストークを回避するために、合成ステロイド類似体によって調節される変異体受容体を使用し得る。特定の実施形態では、受容体は、4-ヒドロキシタモキシフェンに応答性のエストロゲン受容体バリアント又はRU486によって誘導可能なプロゲステロン受容体変異体であり得る。特定の実施形態では、ヒト核ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)に基づく核受容体由来ロシグリタゾン応答性転写スイッチが、本開示のRCRTIシステムで使用され得る。特定の実施形態では、ステロイド応答性受容体のバリアントは、RheoSwitchであり得、改変されたChoristoneura fumiferanaエクジソン受容体及びGal4 DNA結合ドメイン及びVP16トランス活性化因子に融合されたマウスレチノイドX受容体(RXR)に基づく。合成エクジソンの存在下では、RheoSwitchバリアントは、Gal4応答エレメントのいくつかの反復配列に融合した最小プロモーターに結合し、これを活性化し得る。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるRCRTIシステムは、同族オペレータと融合した最小コアプロモータの活性化のために、DNA結合タンパク質の化学的に誘導された二量体化及び転写活性化因子を利用し得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるRCRTIシステムは、FRBとFKBPのラパマイシン調節二量体化を利用し得る。この系では、FRBはp65トランス活性化因子に融合され、FKBPは、操作された最小インターロイキン-12プロモーターの上流に配置される同族オペレータ部位に特異的なジンクフィンガードメインに融合される。特定の実施形態では、該FKBPは変異され得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるRCRTIシステムは、細菌ジャイレースBサブユニット(GyrB)を利用し得、GyrBは抗生物質クーママイシンの存在下で二量体化し、ノボビオシンで解離する。
特定の実施形態では、本開示のRCRTIシステムは、調節されたsiRNA発現のために使用され得る。特定の実施形態では、調節されたsiRNA発現システムは、テトラサイクリン、マクロライド、又はOFF型及びON型QuoRex系であり得る。特定の実施形態では、RTIシステムは、5’非翻訳領域にヘアピン構造を形成することによって翻訳開始をブロックするXenopus末端オリゴピリミジン要素(TOP)を利用し得る。
特定の実施形態では、本開示に記載されるRCRTIシステムは、気相制御発現、例えばアセトアルデヒド誘導調節(AIR)システムを利用し得る。AIRシステムは、Aspergillus nidulansのAlcR転写因子を使用し得、非毒性濃度の気体又は液体のアセトアルデヒドの存在下で、最小ヒトサイトメガロウイルスのプロモーターに融合したAlcR特異的なオペレータから組み立てられたPAIRプロモーターを特異的に活性化する。
特定の実施形態では、本開示のRCRTIシステムは、Tet-On又はTet-Offシステムを利用し得る。そのようなシステムでは、1つ以上のSOIの発現は、テトラサイクリン又はその類似体であるドキシサイクリンによって調節され得る。
特定の実施形態では、本開示のRCRTIシステムは、PIPオン又はPIPオフシステムを利用し得る。そのようなシステムでは、SOIの発現は、例えば、プリスチナマイシン、テトラサイクリン及び/又はエリスロマイシンによって調節され得る。
6.産物
本開示の宿主細胞は、任意の目的の分子の発現のために使用され得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、ポリペプチド、例えば哺乳動物のポリペプチドの発現のために使用され得る。このようなポリペプチドの非限定的な例としては、ホルモン、受容体、融合タンパク質、調節因子、成長因子、補体系因子、酵素、凝固因子、抗凝固因子、キナーゼ、サイトカイン、CDタンパク質、インターロイキン、治療用タンパク質、診断用タンパク質、及び抗体が挙げられる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を、構成的に又は調節して、目的の治療用タンパク質又は分子を発現させながら、シャペロン、タンパク質修飾酵素、shRNA、gRNA又は他のタンパク質若しくはペプチド発現のために使用し得る。
本開示の宿主細胞は、任意の目的の分子の発現のために使用され得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、ポリペプチド、例えば哺乳動物のポリペプチドの発現のために使用され得る。このようなポリペプチドの非限定的な例としては、ホルモン、受容体、融合タンパク質、調節因子、成長因子、補体系因子、酵素、凝固因子、抗凝固因子、キナーゼ、サイトカイン、CDタンパク質、インターロイキン、治療用タンパク質、診断用タンパク質、及び抗体が挙げられる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を、構成的に又は調節して、目的の治療用タンパク質又は分子を発現させながら、シャペロン、タンパク質修飾酵素、shRNA、gRNA又は他のタンパク質若しくはペプチド発現のために使用し得る。
特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、二重特異性、三重特異性又は多重特異性ポリペプチド、例えば二重特異性抗体である。
本開示の宿主細胞は、従来の細胞培養法で使用されている細胞、例えば非TI細胞と比較して、より短い時間枠で、目的の分子を、大量に生産するのに用いることができる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、従来の細胞培養法で使用される細胞、例えば非TI細胞と比較して、目的の分子の品質を改善するために用いられ得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、細胞ストレス及びクローン不安定性を経時的に引き起こし得る産物によって引き起こされ得る慢性毒性を防止することによってシードトレイン安定性を高めるために使用され得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、急性毒性産物の最適発現に使用され得る。
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞及びシステムは、細胞培養プロセスの最適化及び/又はプロセス開発に使用され得る。
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を、治療分子の選択されたサブユニットの構成的発現及び同じ治療分子の他の異なるサブユニットの調節された発現のために使用し得る。特定の実施形態では、治療分子は、融合タンパク質であり得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を使用して、完全に組み立てられた抗体分子の発現及び分泌における各抗体サブユニットの役割及び効果を理解し得る。
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、調査ツールとして使用され得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、様々な細胞における問題のある分子の低タンパク質発現の根本原因を突き止めるための診断ツールとして使用され得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を使用して、観察された現象又は細胞挙動を細胞における導入遺伝子発現に直接結び付け得る。本開示の宿主細胞はまた、観察された挙動が細胞において可逆的であるか否かを実証するために使用され得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を利用して、細胞における導入遺伝子の転写及び発現に関する問題を同定及び緩和し得る。
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、発現困難な分子の導入遺伝子サブユニット、例えば、これらに限定されないが、抗体のHC及びLCサブユニットなどを、システム中の平均分子のものと交換して、問題となるサブユニットを同定するために使用され得る。特定の実施形態では、次いで、アミノ酸配列分析を使用して、低タンパク質発現に関与し得るアミノ酸残基又は領域を絞り、それに焦点を合わせ得る。
材料及び方法
細胞培養
CHO-K1株(Crawford Y.ら、Biotechnol Prog 2013,29,1307-1315)由来の宿主細胞株への抗体をコードするカセットの標的化組込みによって、安定した細胞株の発達を行った。細胞を、125mL振盪フラスコ中150rpmで、又は50mLチューブスピンバイオリアクタ中225rpmで、37℃及び5% CO2の独自の培地で培養した。培養細胞を4×105細胞/mLの播種密度で3~4日ごとに継代した。
細胞培養
CHO-K1株(Crawford Y.ら、Biotechnol Prog 2013,29,1307-1315)由来の宿主細胞株への抗体をコードするカセットの標的化組込みによって、安定した細胞株の発達を行った。細胞を、125mL振盪フラスコ中150rpmで、又は50mLチューブスピンバイオリアクタ中225rpmで、37℃及び5% CO2の独自の培地で培養した。培養細胞を4×105細胞/mLの播種密度で3~4日ごとに継代した。
分子Xを発現するRCTIクローンのベクター構成を決定するためのPCR反応
DNeasy Blood and Tissueキット(cat#69506、Qiagen)を用いて2×106細胞からゲノムDNAを抽出し、LongAmp Taqマスターミックス(カタログ番号M 0287、New England Biolabs)を用いてPCRを行った。熱サイクリングのパラメータ:94℃で3分間、40×(94℃で30秒、60℃で1分間、及び65℃で9.75分間)及び65℃で20分間。PCR産物の診断上の消化物を、New England Biolabs製の酵素を用いて行った。PCRには以下のプライマーを使用した:フォワードプライマー:GGTTCTCCTTGACCAATACCTCGTAAG;リバースプライマー:GCGGGACTATGGTTGCTGACTAAT.
DNeasy Blood and Tissueキット(cat#69506、Qiagen)を用いて2×106細胞からゲノムDNAを抽出し、LongAmp Taqマスターミックス(カタログ番号M 0287、New England Biolabs)を用いてPCRを行った。熱サイクリングのパラメータ:94℃で3分間、40×(94℃で30秒、60℃で1分間、及び65℃で9.75分間)及び65℃で20分間。PCR産物の診断上の消化物を、New England Biolabs製の酵素を用いて行った。PCRには以下のプライマーを使用した:フォワードプライマー:GGTTCTCCTTGACCAATACCTCGTAAG;リバースプライマー:GCGGGACTATGGTTGCTGACTAAT.
振盪フラスコ流加及びAmbrTMバイオリアクタ生成アッセイ
モノクローナル抗体A(「mAb A」)及び分子Zを発現するクローンの供給バッチ評価を、14日間の製造プロセスにおいて、独自の化学的に定義された培地を使用して振盪フラスコ中で行った。細胞を0日目に1×106細胞/mLで播種し、培養物を3日目に37℃から35℃までに温度シフトさせて、化学的に定義された成分の独自のブレンドからなるボーラス・フィードを3、7、及び10日目に添加した。生存率及び生細胞数をVi-Cell XR(Beckman Coulter)により測定し、乳酸及びグルコースレベルを、Nova BioProfile 400(Nova Biomedical)を使用してアッセイした。
モノクローナル抗体A(「mAb A」)及び分子Zを発現するクローンの供給バッチ評価を、14日間の製造プロセスにおいて、独自の化学的に定義された培地を使用して振盪フラスコ中で行った。細胞を0日目に1×106細胞/mLで播種し、培養物を3日目に37℃から35℃までに温度シフトさせて、化学的に定義された成分の独自のブレンドからなるボーラス・フィードを3、7、及び10日目に添加した。生存率及び生細胞数をVi-Cell XR(Beckman Coulter)により測定し、乳酸及びグルコースレベルを、Nova BioProfile 400(Nova Biomedical)を使用してアッセイした。
分子Yを発現するクローンの評価のために、以下の修正を加えて、記載されているように(Hsu,W.T.ら、Cytotechnology 2012,64,667-678)、ambrTMシステム(Sartorius)で14日間の生産培養を行った:接種株を振盪フラスコに1×106細胞/mLで37℃及び150rpmで4日間播種した。生産培養物を2×106細胞/mLで接種し、最初に36℃に維持し、続いて6日目に35℃に温度シフトさせた。化学的に定義された成分の独自のブレンドからなるボーラス・フィードを3、6、8、及び10日目に添加した。生存率及び細胞数をBioProfile Flex 2(Nova Biomedical)で測定した。pH、pO2、pCO2、グルコース、乳酸及び他の代謝産物をBioProfile Flex 2(Nova Biomedical)又はABL90 Flex(Radiometer)のいずれかでアッセイした。
力価及び製品品質の分析アッセイ
UV検出を伴うタンパク質A親和性クロマトグラフィを使用して、力価を測定した。サイズ及び電荷変種を、それぞれプロテインA PhyTip精製(PhyNexus)、引き続いてサイズ排除クロマトグラフィ及びイメージング・キャピラリー等電点電気泳動(icIEF)によって測定した。フィチウム精製試料をカルボキシペプチダーゼBで処理した後、icIEFによる分析を行った。分子Yについては、液体クロマトグラフィ質量分析(LC-MS)を使用して、記載されているように(Williams,A.J.ら、Ind Eng Chem Res 2017,56,1713-1722)、正しく組み立てられたヘテロ二量体、ホモ二量体、半抗体及び軽鎖ミスペア種の相対量を定量した。
UV検出を伴うタンパク質A親和性クロマトグラフィを使用して、力価を測定した。サイズ及び電荷変種を、それぞれプロテインA PhyTip精製(PhyNexus)、引き続いてサイズ排除クロマトグラフィ及びイメージング・キャピラリー等電点電気泳動(icIEF)によって測定した。フィチウム精製試料をカルボキシペプチダーゼBで処理した後、icIEFによる分析を行った。分子Yについては、液体クロマトグラフィ質量分析(LC-MS)を使用して、記載されているように(Williams,A.J.ら、Ind Eng Chem Res 2017,56,1713-1722)、正しく組み立てられたヘテロ二量体、ホモ二量体、半抗体及び軽鎖ミスペア種の相対量を定量した。
現在のトランスフェクション(TFX)戦略とRCTIのためのTFX戦略との比較
モノクローナル抗体A(「mAb A」)(図11A)を生産する安定な細胞株を、「ランダム化された構成標的化組込み」(本明細書では「ランダム化された鎖標的化組込み」とも呼ばれる)アプローチを使用して作製した。このアプローチでは、それぞれがmAb A重鎖又は軽鎖配列リピートの3つの可能な組み合わせのうちの1つを含む3つの「フロント」及び3つの「バック」発現ベクターのライブラリを使用して宿主細胞をトランスフェクトした。本実施例で使用される場合、「フロント」及び「バック」発現ベクターへの言及は、目的の外因性配列の2ベクターRCMEに基づく導入の文脈における上流(フロント)及び下流(バック)カセット部位を指す。2ベクターRCMEに基づく戦略に関するさらなる詳細については、例えば、上記のセクション5.1を参照されたい。上位のクローンは3.4~4.7g/Lの力価を生産し、力価、生産性、細胞培養性能、製品品質及びフローサイトメトリー集団不均一性に基づいて選択した。
モノクローナル抗体A(「mAb A」)(図11A)を生産する安定な細胞株を、「ランダム化された構成標的化組込み」(本明細書では「ランダム化された鎖標的化組込み」とも呼ばれる)アプローチを使用して作製した。このアプローチでは、それぞれがmAb A重鎖又は軽鎖配列リピートの3つの可能な組み合わせのうちの1つを含む3つの「フロント」及び3つの「バック」発現ベクターのライブラリを使用して宿主細胞をトランスフェクトした。本実施例で使用される場合、「フロント」及び「バック」発現ベクターへの言及は、目的の外因性配列の2ベクターRCMEに基づく導入の文脈における上流(フロント)及び下流(バック)カセット部位を指す。2ベクターRCMEに基づく戦略に関するさらなる詳細については、例えば、上記のセクション5.1を参照されたい。上位のクローンは3.4~4.7g/Lの力価を生産し、力価、生産性、細胞培養性能、製品品質及びフローサイトメトリー集団不均一性に基づいて選択した。
mAb Aに対する以前の細胞株開発(CLD)の努力と比較して、本明細書中に記載のRCTI CLD法は、より少ないCLDサイクルでより少ないクローンをスクリーニングしながらも、標準的なCLD法によって生産されたクローンと同等の力価、製品品質、及び生産培養性能を有するクローンを生産した。
mAb Aに対する以前のCLDの取り組みでは、独立した標準的なCLD法のワークフローにおけるフロントベクター及びバックベクターの個々の組み合わせが試験されている(図2Aを参照)。フロントベクター及びバックベクターの構成の合計で7つの組み合わせをトランスフェクトし、プール生産によって評価した。これらの7つのベクターの組み合わせのうち、4つを、SCC及びプール生産力価に基づくクローン評価のために進めた。したがって、4つの独立したCLDサイクルを3つの追加の部分的CLDサイクルと共に実施し、3つの追加のベクターの組み合わせをトランスフェクトし、プール生産によって評価した。
比較すると、RCTI CLD法について単一のCLDサイクルが実行された。表1は、各方法について評価されたクローンの数を要約し、図2A及び2Bは、mAb Aクローン評価のためのRCTI及び標準的なCLDワークフローの比較を示す。
表1.標準的なCLD対RCTI CLDに関するスクリーニングされたクローンの概要
表1.標準的なCLD対RCTI CLDに関するスクリーニングされたクローンの概要
RCTI CLD法については、3段階の回収でのトランスフェクトされたプールに対応する3つの実験アームを評価した:(i)初期(トランスフェクション後5日目、選択培地に選別)、(ii)中期(選択後に約35%の生存率まで回収されたクローン)、又は(iii)完全(選択後に>90%の生存率まで回収されたクローン)(図6A参照)。RCTI CLD法を標準的なCLD法と比較する目的で、標準的なCLDが90%超の生存率のプールについてSCCを指定しているので、第3のアームからのクローン(選択後に90%超の生存率まで回収されたクローン)のみをこのセクションで考察する。標準的なCLD法及びRCTI法の両方について、1つのCLDサイクルは、トランスフェクションからクローン生産培養評価までの全プロセスとして定義される。
以前のmAb A CLDの努力では、最も力価の高いクローンの大部分が、高い凝集体、すなわち10~15%を超えるHMWS(%)も示した。したがって、標準的なCLD法とRCTI法とによって生産されたクローンを比較する際に、上位のRCTI CLDクローンの選択において、力価及びHMWS(%)の両方を考慮した。標準的なCLD法によって生産されたクローンについて、HMWS(%)の分布は、いくつかの構成についてフロントベクターとバックベクター構成でおおよそクラスター化した(図3B)。例えば、C-2構成を有するクローン(図3A)は一般に、より低いHMWS(%)を生産したが、B-2構成を有するクローン(図3A)は、より高いHMWS(%)を生産した。
RCTIクローンについて、力価及びHMWS(%)の範囲は、標準的なCLDクローンによって生産されたものと同等であったが(図3B)、スクリーニングされたクローンははるかに少なかった。RCTI法は、フロント及びバックDNAベクターのランダムライブラリのトランスフェクションを含むので、長距離PCRを使用して、生産培養で評価されたクローンのフロントベクター構造を決定した。24個のクローンのうち3個は確定的でない長距離PCR結果を有したが、標準的なCLDクローンと比較した場合、残りのクローンはフロントベクター構成及びHMWS(%)プロファイルに関して同様にクラスター化した。Cフロントベクター構成を有するクローンの大部分は、B構造を有するクローンよりも低いHMWS(%)を示し、Aフロント構造を有するクローンはHMWS(%)の範囲に及んだ。HMWS(%)レベルはフロントベクター構成のみと直接相関するので、ここではバックベクター構成の決定は必要ではなかった。また、RCTIクローンの最も高い14日目の力価は、標準的なCLDクローンのものと同等であった(≧4.5g/L)。B-2構成(図3A)又はA-1構成(図3A)のみが標準的なCLDアプローチで試験された場合、高力価と低凝集体の組み合わせを有するクローンは、あったとしてもほとんど得られなかったことに留意されたい。
増殖、生産性、及び他の製品品質属性も、標準的なCLD法とRCTI CLD法との間で同等であった。図5は、両方のCLD法について生産培養で評価した全てのクローンにわたる様々な属性の分布をまとめたものである。同様に、RCTI CLD法による上位のクローンは、標準的なCLD法によって生産された上位のクローンと同等に生産培養で行われた。標準的なCLD法で試験した構成のうち、A-2及びC-2構成のみが、低い凝集体(HMWS(%)≦15.4%)を生成する一方で高力価(≧3.6g/L)を与えた。RCTIアプローチから得られたクローンは、標準的なCLDアプローチで得られたものと同様の凝集及び力価範囲を有する。RCTIアプローチによる代表的な高生産クローンは表2のC構成であるように見える一方で、図3Bに示すように、構成Aによる高力価及び低凝集クローンも見られたが、それらは最高生産クローンの中にはランク付けされなかった。表2は、標準的及びRCTI CLDアプローチによる上位のクローンの力価、増殖及び製品品質の属性を比較する。
表2.標準的なCLD及びRCTI CLDを使用して生産された上位のmAb Aクローンの比較
表2.標準的なCLD及びRCTI CLDを使用して生産された上位のmAb Aクローンの比較
標準的なCLD法を使用したmAb Aに対する以前のCLD努力と比較して、RCTI法はいくつかの利点を提供する。第1に、単一のRCTI CLDサイクルを使用して、より少ないリソースを使用しながら、標準的なCLDサイクルよりも多くないにしても同じ数のベクター構成をスクリーニングすることができる。mAb Aについて、標準的なCLD法は、9つの可能なベクター構成の組み合わせのうち7つをスクリーニングするために4+のCLDサイクルを必要としたが、RCTI法は、1回のCLDサイクルで9つの組み合わせすべてをスクリーニングした。より少ない個々のクローンも同様にスクリーニングすることができる。mAb Aの全ての標準的なCLDサイクルにわたって、合計4,224個のクローンをSCCから採取し、生産培養中のスクリーニングのために120個のクローンに絞り込んだ。比較すると、RCTIアプローチのためにSCCから合計704個のクローンを採取し、生産培養で24個のクローンをスクリーニングした。CLDサイクル及びスクリーニングするクローン数が減少するため、RCTI法は、手作業の削減と、SCC、イメージング、及びヒットピッキングを実行するための自動化リソースの負担の両方を含む、CLDの労働要件の低減を可能にする。最後に、必要なCLDサイクル及びスクリーニングされたクローン数が減少したにもかかわらず、RCTI法は、標準的なCLD方法と同等の力価、細胞培養性能及び製品品質の分布を有するクローンを生産した。両方の方法から生産された上位のクローンも同等であった。
二重特異性抗体の発現に対するRCTI CLDの評価
RCTIアプローチを、臨床的要求が高く、したがってクローンのスクリーニングプロセス中に高力価細胞株の単離を必要とする疾患適応症について、二重特異性抗体(「分子Y」)の発現を評価した。単一の宿主における二重特異性抗体の発現は、共通又はミスマッチの軽鎖種を有するホモ二量体及びヘテロ二量体重鎖などの望ましくない副産物の集合をもたらし得る(Dillon M.ら、mAbs 2017,9,213-230;Carter,P.J.,Experimental cell research 2011,317,1261-1269)。したがって、二重特異性抗体クローン評価中の重要な工程は、高い総力価を有するだけでなく、標的二重特異性抗体から精製することが困難な副生成物(単数又は複数)が最低レベルである高い有効力価(所望の二重特異性抗体種)を有するクローンの単離である。分子Y(図11B)については、精製するのが最も困難な副生成物は、共通の軽鎖種を有するヘテロ二量体重鎖(本明細書では「共通LC BsAb」と呼ばれる)であった。したがって、標準的なTI CLDプロセス中、4つの異なるベクター構成を並行したCLD試行で使用し、SCC前のプール生産評価中、質量分析を使用して共通LC BsAb及び有効力価レベルを測定した。最低レベルの共通LC BsAbを有するプールをSCCについて選択し、次いで、最高力価及び最低レベルの共通LC BsAbを有する上位62個のクローンを標準的なTI CLDアプローチについての生産アッセイ(図7A、正方形)で評価した。
RCTIアプローチを、臨床的要求が高く、したがってクローンのスクリーニングプロセス中に高力価細胞株の単離を必要とする疾患適応症について、二重特異性抗体(「分子Y」)の発現を評価した。単一の宿主における二重特異性抗体の発現は、共通又はミスマッチの軽鎖種を有するホモ二量体及びヘテロ二量体重鎖などの望ましくない副産物の集合をもたらし得る(Dillon M.ら、mAbs 2017,9,213-230;Carter,P.J.,Experimental cell research 2011,317,1261-1269)。したがって、二重特異性抗体クローン評価中の重要な工程は、高い総力価を有するだけでなく、標的二重特異性抗体から精製することが困難な副生成物(単数又は複数)が最低レベルである高い有効力価(所望の二重特異性抗体種)を有するクローンの単離である。分子Y(図11B)については、精製するのが最も困難な副生成物は、共通の軽鎖種を有するヘテロ二量体重鎖(本明細書では「共通LC BsAb」と呼ばれる)であった。したがって、標準的なTI CLDプロセス中、4つの異なるベクター構成を並行したCLD試行で使用し、SCC前のプール生産評価中、質量分析を使用して共通LC BsAb及び有効力価レベルを測定した。最低レベルの共通LC BsAbを有するプールをSCCについて選択し、次いで、最高力価及び最低レベルの共通LC BsAbを有する上位62個のクローンを標準的なTI CLDアプローチについての生産アッセイ(図7A、正方形)で評価した。
本発明者らは、RCTI CLDアプローチにおいて、回収されたプールが依然としてベクター構成の不均一性を維持することを以前に確立したので(図6B及び図6C)、分子YのRCTI CLDについては、4つのベクター構成すべてを使用してTI宿主をトランスフェクトし、SCCは完全なプール回収後にのみ実施した。さらに、初期スクリーニング工程中に、急速燃焼質量分析を使用して、それらの有効力価のみに基づいてクローンをランク付けした。このプロセスの間、共通LC BsAb又は他の個々の副産物のレベルはクローン選択のために考慮されなかった。次いで、これらの基準に基づいて、上位36個のRCTIクローンを生産アッセイ(図7A、丸)で評価した。生産アッセイでは半分の数のクローンしか評価していないにもかかわらず、RCTI CLDアプローチから、標準的なTI CLDクローンと比較して、比較的高い合計(約6g/L)及び有効(4~5.5g/L)力価を有するクローンを単離することができた(図7A)。さらに、RCTIクローンは、標準的なTIクローンと比較して、全体的に良好な特異的生産性(図7B)、良好な生存率(図8A)及びわずかに低い増殖(図8B)プロファイルを有した。プロセス最適化により培養増殖を改善することがより容易であるので、分子Yを発現するRCTIクローンは、それらの標準的なTIクローン対応物よりもさらに高い総力価及び有効力価を有する可能性がある。RCTIクローンはまた、非常に低い(約5%以下)、共通LC BsAb副産物を有し、これは標準的なTIクローンで観察されたものとほぼ同じくらい低い(図8C)。しかしながら、標準的なTIクローンは、生産培養における評価の前にこの形質についてスクリーニングされたため、全体的により低い共通LC BsAb副産物を有すると予想される。RCTIクローンの製品品質は、それらの標準的なTI対応物と比較して同等又はより良好であった。分子Yを発現するRCTIクローンはまた、標準的なTIクローンと比較して、相対的に低い凝集体(図8D)、より低い酸性種(%)(図8E)、及びより高い主な種(%)(図8F)を有し、これらはすべてより望ましい製品品質パラメータである。塩基性種の%レベルは、いずれのアプローチから単離されたクローン間でも比較的同等であった(図8G)。
複合キメラ抗体/リガンド分子の発現についてのRCTI CLDの評価
様々な疾患適応症のための多くの今後の治療用分子は、もはや単なる従来の抗体ではなく、むしろより複雑な構造を有し、したがって発現がより困難である。標準的なTIアプローチにおける1つのそのような複雑な分子(「分子Z」)の発現は、6つの異なるベクター構成を使用し、続いて、高い有効力価を有するクローンを得るために生産培養物中の96個の異なるクローンをスクリーニングする、並行したCLD努力を必要とした。(図9A、四角)。したがって、Fc融合リガンドと複合体化した半抗体を含む分子Z(図11C)は、発現するのが困難な分子と考えられ、本発明者らは、RCTI CLDアプローチを使用してその発現を試験することにした。TI宿主細胞をトランスフェクトして単一のプールにおいてそれらを選択した後にSCCを行なうための6つすべての異なるベクター構成の混合物を使用して、生産アッセイにおけるわずか23個のRCTIクローンの評価は、標準的なTI CLDアプローチによって単離された上位のクローンと同等の力価及び製品品質を有するクローンの単離をもたらした(図9A)。RCTIクローンは、標準的なTIクローンと比較して、より高い全体的な比生産性(図9B)、同等の生存率(図10A)、わずかに低い増殖(図10B)、及びより低い全体的な凝集体%(図10C)を有していた。著しく高い比生産性を有するため(約2倍高い、図9B)、RCTIクローンは、細胞増殖がプロセス最適化によってさらに増加する場合、潜在的にさらにより高い有効力価を達成することができる。最後に、RCTIクローンは、標準的なTIクローンと同等の酸性%(図10D)、主%(図10E)及び塩基性%(図10F)、電荷変種を有していた。全体として、これらのデータは、RCTIアプローチを使用して、標準的なTIアプローチと同等の力価及び製品品質属性を有するクローンを単離することができるが、リソース及び労力が著しく少ないという考えを裏付けている。
様々な疾患適応症のための多くの今後の治療用分子は、もはや単なる従来の抗体ではなく、むしろより複雑な構造を有し、したがって発現がより困難である。標準的なTIアプローチにおける1つのそのような複雑な分子(「分子Z」)の発現は、6つの異なるベクター構成を使用し、続いて、高い有効力価を有するクローンを得るために生産培養物中の96個の異なるクローンをスクリーニングする、並行したCLD努力を必要とした。(図9A、四角)。したがって、Fc融合リガンドと複合体化した半抗体を含む分子Z(図11C)は、発現するのが困難な分子と考えられ、本発明者らは、RCTI CLDアプローチを使用してその発現を試験することにした。TI宿主細胞をトランスフェクトして単一のプールにおいてそれらを選択した後にSCCを行なうための6つすべての異なるベクター構成の混合物を使用して、生産アッセイにおけるわずか23個のRCTIクローンの評価は、標準的なTI CLDアプローチによって単離された上位のクローンと同等の力価及び製品品質を有するクローンの単離をもたらした(図9A)。RCTIクローンは、標準的なTIクローンと比較して、より高い全体的な比生産性(図9B)、同等の生存率(図10A)、わずかに低い増殖(図10B)、及びより低い全体的な凝集体%(図10C)を有していた。著しく高い比生産性を有するため(約2倍高い、図9B)、RCTIクローンは、細胞増殖がプロセス最適化によってさらに増加する場合、潜在的にさらにより高い有効力価を達成することができる。最後に、RCTIクローンは、標準的なTIクローンと同等の酸性%(図10D)、主%(図10E)及び塩基性%(図10F)、電荷変種を有していた。全体として、これらのデータは、RCTIアプローチを使用して、標準的なTIアプローチと同等の力価及び製品品質属性を有するクローンを単離することができるが、リソース及び労力が著しく少ないという考えを裏付けている。
前述の実施例は、本明細書にて開示する主題を単に示すものであり、いかなる方法においても、限定するものとみなされるべきではない。
描写され、特許請求される様々な実施形態に加えて、本開示の主題は、本明細書に開示され、特許請求される特徴の他の組合せを有する他の実施形態も対象とする。したがって、本明細書に提示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組合せを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組合せられても良い。本開示の主題の特定の実施形態の前述の説明は、例証及び説明目的のために提示されている。包括的であるようにも本開示の主題を開示される実施形態に限定するようにも意図されていない。
本開示の主題の趣旨又は範囲から逸脱することなく、本開示の主題の組成物及び方法に様々な修正及び変形を加えることができることは、当業者には明らかである。したがって、本開示の主題が添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内の修正及び変形を含むよう意図されている。
様々な刊行物、特許、及び特許出願が本明細書に引用されており、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
Claims (74)
- 少なくとも1つの目的の配列(SOI)を発現する標的化組込み(TI)宿主細胞のライブラリを生成及びハイスループット・スクリーニングするための方法であって、
a)1つ又は複数のSOIを発現する複数のTI宿主細胞を含むTI宿主細胞の前記ライブラリを、
i)複数のTI宿主細胞を提供すること、
ii)前記複数のTI宿主細胞を、1つ又は複数のSOIを含む複数のベクターと接触させること、
iii)前記1つ又は複数のSOIを前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入すること、によって生成することと、
b)前記ライブラリを単一クローンに分離することと、
c)特定の細胞又は産物属性について前記クローンをスクリーニングすることと、を含む、方法。 - 前記1つ又は複数のSOIが、リコンビナーゼ媒介性組込みによって前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入される、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のSOIが、遺伝子編集媒介性組込みによって前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入される、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のSOIが、1つ又は複数の調節可能なプロモーターに作用可能に連結されている、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の調節可能なプロモーターが、SV40及びCMVプロモーターからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項6に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が、CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞、又はCHO K1M宿主細胞である、請求項7に記載の方法。
- 前記SOIが、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする、請求項1に記載の方法。
- 前記SOIが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Fv断片(scFv)、又はFc融合タンパク質をコードする、請求項1に記載の方法。
- 前記特定の細胞属性が、細胞増殖、細胞力価、比生産性、体積生産性、クローン安定性から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記特定の産物属性が、グリコシル化のレベル、電荷分散のレベル、ミスマッチの減少、タンパク質/ペプチド凝集の減少、タンパク質配列不均一性から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のSOIが、前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に、以下:配列番号1~12;NW_006874047.1;NW_006884592.1;NW_006881296.1;NW_003616412.1;NW_003615063.1;NW_006882936.1;及びNW_003615411.1から選択される配列と少なくとも約90%相同の1つ又は複数の遺伝子座において導入される、請求項1に記載の方法。
- 複数の外因性ヌクレオチドSOIを含むTI宿主細胞のライブラリを生成する方法であって、
a)複数のTI宿主細胞を提供することと、
b)前記複数のTI宿主細胞を、1つ又は複数のSOIを含む複数のベクターと接触させることと、
c)前記1つ又は複数のSOIを前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入することとを含む方法。 - 前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数が、前記TI宿主細胞のゲノムの1つ又は複数の遺伝子座に組み込まれた1つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含み、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する少なくとも2つのRRSを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記ベクターが、
a)前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記少なくとも2つのRRSと一致する少なくとも2つのRRSと、
b)1つ又は複数の外因性SOIと、前記RRSに隣接する少なくとも1つの第2の選択マーカーと、を含む、請求項14に記載の方法。 - 前記1つ又は複数のSOIが、リコンビナーゼ媒介性組込みによって前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入される、請求項16に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のSOIが、遺伝子編集媒介性組込みによって前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入される、請求項14に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のSOIが、1つ又は複数の調節可能なプロモーターに作用可能に連結されている、請求項14に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の調節可能なプロモーターが、SV40及びCMVプロモーターからなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記SOIが、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする、請求項14に記載の方法。
- 前記SOIが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Fv断片(scFv)、又はFc融合タンパク質をコードする、請求項14に記載の方法。
- (a)の前記1つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列が、以下:配列番号1~12;NW_006874047.1;NW_006884592.1;NW_006881296.1;NW_003616412.1;NW_003615063.1;NW_006882936.1;及びNW_003615411.1から選択される配列と少なくとも約90%相同の1つ又は複数の遺伝子座において組み込まれる、請求項14に記載の方法。
- 少なくとも1つの目的の配列が、2、3、4、5、6、7、8、9、10個の目的の配列を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項14に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項25に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が、CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞、又はCHO K1M宿主細胞である、請求項26に記載の方法。
- 1つ又は複数のSOIを発現するTI宿主細胞を調製する方法であって、
a)複数のTI宿主細胞を提供することと、
b)前記複数のTI宿主細胞を、1つ又は複数のSOIを含む複数のベクターと接触させることと、
c)前記1つ又は複数のSOIを前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入することと、
d)前記1つ又は複数のSOIを発現するTI宿主細胞を選択することとを含む方法。 - 前記1つ又は複数のSOIが、リコンビナーゼ媒介性組込みによって前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入される、請求項28に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のSOIが、遺伝子編集媒介性組込みによって前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入される、請求項28に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のSOIが、1つ又は複数の調節可能なプロモーターに作用可能に連結されている、請求項28に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の調節可能なプロモーターが、SV40及びCMVプロモーターからなる群から選択される、請求項31に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項28に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項33に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が、CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞、又はCHO K1M宿主細胞である、請求項34に記載の方法。
- 前記SOIが、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする、請求項28に記載の方法。
- 前記SOIが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Fv断片(scFv)、又はFc融合タンパク質をコードする、請求項28に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のSOIが、前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に、以下:配列番号1~12;NW_006874047.1;NW_006884592.1;NW_006881296.1;NW_003616412.1;NW_003615063.1;NW_006882936.1;及びNW_003615411.1から選択される配列と少なくとも約90%相同の1つ又は複数の遺伝子座において導入される、請求項28に記載の方法。
- 前記SOIが、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする、請求項28に記載の方法。
- 前記SOIが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Fv断片(scFv)、又はFc融合タンパク質、及びそれらの断片をコードする、請求項28に記載の方法。
- 請求項28に記載の方法であって、
a)前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数が、前記TI宿主細胞のゲノムの1つ又は複数の遺伝子座に組み込まれた1つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含み、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する少なくとも2つのRRSを含み、
b)前記ベクターは、
a.前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記少なくとも2つのRRSと一致する少なくとも2つのRRSと、
b.1つ又は複数の外因性SOIと、前記RRSに隣接する少なくとも1つの第2の選択マーカーとを含み、
c)前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に、前記RRSを認識する1つ又は複数のリコンビナーゼ又はリコンビナーゼをコードする核酸を導入し、
d)前記第2の選択マーカーを発現するTI細胞を選択して、それにより、目的の配列を発現するTI宿主細胞を単離する、方法。 - 前記SOIが、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする、請求項41に記載の方法。
- 前記SOIが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Fv断片(scFv)、又はFc融合タンパク質、及びそれらの断片をコードする、請求項41に記載の方法。
- (a)の前記1つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列が、以下:配列番号1~12;NW_006874047.1;NW_006884592.1;NW_006881296.1;NW_003616412.1;NW_003615063.1;NW_006882936.1;及びNW_003615411.1から選択される配列と少なくとも約90%相同の1つ又は複数の遺伝子座において組み込まれる、請求項41に記載の方法。
- 請求項41に記載の方法であって、
a.前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1のRRS及び第2のRRSと、前記第1のRRS及び前記第2のRRSの間に位置する第3のRRSとを含み、すべての前記RRSが異種特異性であり、
b.前記複数のベクターが、
i.前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第1のRRS及び前記第3のRRSと一致し、少なくとも1つの第1の外因性SOI及び少なくとも1つの第2の選択マーカーに隣接する2つのRRSを含む第1のベクターと、
ii.前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第2のRRS及び前記第3のRRSと一致し、少なくとも1つの第2の外因性SOIに隣接する2つのRRSを含む第2のベクターとを含み、
c.前記第2の選択マーカーを発現するTI細胞を選択して、それにより、第1及び第2の目的の配列を発現するTI宿主細胞を単離する、方法。 - 少なくとも1つの目的の配列を含む前記ベクターが、2、3、4、5、6、7、8、9、10個の目的の配列を含む、請求項28、41、及び45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項28、41、及び45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項47に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が、CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞、又はCHO K1M宿主細胞である、請求項48に記載の方法。
- SOIを発現させる方法であって、
a)複数のTI宿主細胞を提供することと、
b)前記複数のTI宿主細胞を、1つ又は複数のSOIを含む複数のベクターと接触させることと、
c)前記1つ又は複数のSOIを前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入することと、
d)目的の配列を発現するTI宿主細胞を選択することと、
e)前記目的の配列を発現させるのに適した条件下でd)の細胞を培養することとを含む、方法。 - 前記1つ又は複数のSOIが、リコンビナーゼ媒介性組込みによって前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入される、請求項50に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のSOIが、遺伝子編集媒介性組込みによって前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に導入される、請求項50に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のSOIが、1つ又は複数の調節可能なプロモーターに作用可能に連結されている、請求項50に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の調節可能なプロモーターが、SV40及びCMVプロモーターからなる群から選択される、請求項53に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項50に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項55に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が、CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞、又はCHO K1M宿主細胞である、請求項56に記載の方法。
- 前記SOIが、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする、請求項50に記載の方法。
- 前記SOIが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Fv断片(scFv)、又はFc融合タンパク質をコードする、請求項50に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のSOIが、前記複数のTI宿主細胞のうちの1つ又は複数に、以下:配列番号1~12;NW_006874047.1;NW_006884592.1;NW_006881296.1;NW_003616412.1;NW_003615063.1;NW_006882936.1;及びNW_003615411.1から選択される配列と少なくとも約90%相同の1つ又は複数の遺伝子座において導入される、請求項50に記載の方法。
- 少なくとも1つの目的の配列が、2、3、4、5、6、7、8、9、10個の目的の配列を含む、請求項50に記載の方法。
- SOIを発現させる方法であって、
a)複数のTI宿主細胞を提供することであって、各TI宿主細胞が、前記TI宿主細胞のゲノムの1つ又は複数の遺伝子座に組み込まれた1つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含み、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する少なくとも2つのRRSを含む、複数のTI宿主細胞を提供することと、
b)前記複数のTI宿主細胞を、以下:
a.前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記少なくとも2つのRRSと一致する少なくとも2つのRRSと、
b.1つ又は複数の外因性SOIと、前記RRSに隣接する少なくとも1つの第2の選択マーカーとを含む複数のベクターと接触させることと、
c)前記RRSを認識する1つ又は複数のリコンビナーゼ又はリコンビナーゼをコードする核酸を導入することと、
d)前記第2の選択マーカーを発現するTI細胞を選択して、それにより、目的の配列を発現するTI宿主細胞を単離することと、
e)前記目的の配列を発現させるのに適した条件下でd)の細胞を培養して、そこから前記目的の配列の産物を回収することとを含む、方法。 - 前記SOIが、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする、請求項62に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のSOIが、1つ又は複数の調節可能なプロモーターに作用可能に連結されている、請求項62に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の調節可能なプロモーターが、SV40及びCMVプロモーターからなる群から選択される、請求項64に記載の方法。
- 前記SOIが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Fv断片(scFv)、又はFc融合タンパク質、及びそれらの断片をコードする、請求項62に記載の方法。
- (a)の前記1つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列が、以下:配列番号1~12;NW_006874047.1;NW_006884592.1;NW_006881296.1;NW_003616412.1;NW_003615063.1;NW_006882936.1;及びNW_003615411.1から選択される配列と少なくとも約90%相同の1つ又は複数の遺伝子座において組み込まれる、請求項62に記載の方法。
- 請求項62に記載の方法であって、
a.前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1のRRS及び第2のRRSと、前記第1のRRS及び前記第2のRRSの間に位置する第3のRRSとを含み、すべての前記RRSが異種特異性であり、
b.前記複数のベクターが、
i.前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第1のRRS及び前記第3のRRSと一致し、少なくとも1つの第1の外因性SOI及び少なくとも1つの第2の選択マーカーに隣接する2つのRRSを含む第1のベクターと、
ii.前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第2のRRS及び前記第3のRRSと一致し、少なくとも1つの第2の外因性SOIに隣接する2つのRRSを含む第2のベクターとを含み、
c.前記第2の選択マーカーを発現するTI細胞を選択して、それにより、第1及び第2の目的の配列を発現するTI宿主細胞を単離する、方法。 - 前記少なくとも1つの目的の配列が、2、3、4、5、6、7、8、9、10個の目的の配列を含む、請求項62又は68に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの第1のSOI及び前記少なくとも1つの第2のSOIが、1つ又は複数の調節可能なプロモーターに作用可能に連結されている、請求項62に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の調節可能なプロモーターが、SV40及びCMVプロモーターからなる群から選択される、請求項70に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項62又は68に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項72に記載の方法。
- 前記TI宿主細胞が、CHO宿主細胞、CHO K1宿主細胞、CHO K1SV宿主細胞、DG44宿主細胞、DUKXB-11宿主細胞、CHOK1S宿主細胞、又はCHO K1M宿主細胞である、請求項73に記載の方法。
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