JP2022538073A - 核酸のランダム化された構成標的化組込み - Google Patents

核酸のランダム化された構成標的化組込み Download PDF

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Abstract

本開示の主題は、組換えタンパク質、例えばモノクローナル抗体、並びにそれに由来する組成物、例えば二重特異性抗体、及び他の複雑なフォーマットのタンパク質、例えば膜タンパク質複合体、及び他の発現困難な分子を発現することができる宿主細胞を生成及び同定するための「ランダム化された構成標的化組込み」（本明細書では「ランダム化された鎖標的化組込み」とも呼ばれる）（ＲＣＴＩ）戦略に関する。【選択図】図１Ａ－１Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年６月２６日に出願された米国仮出願第６２／８６６，８９３号及び２０２０年３月１９日に出願された米国仮出願第６２／９９１，７０８号の優先権を主張し、これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、各々の優先権が主張される。
本開示の主題は、組換えタンパク質、例えばモノクローナル抗体、並びにそれに由来する組成物、例えば二重特異性抗体、及び他の複雑なフォーマットのタンパク質、例えば膜タンパク質複合体、及び他の発現困難な分子を発現することができる宿主細胞を生成及び同定するための「ランダム化された構成標的化組込み」（本明細書では「ランダム化された鎖標的化組込み」とも呼ばれる）（ＲＣＴＩ）戦略に関する。
配列表
本明細書は、配列表（２０２０年６月２６日に「００Ｂ２０６＿０９２６＿ＳＬ．ｔｘｔ」という名称の．ｔｘｔファイルとして電子的に提出）を参照する。００Ｂ２０６＿０９２６＿ＳＬ．ｔｘｔファイルは２０２０年６月２４日に作成されたものであり、サイズは１，２９６，７７７バイトである。配列表の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
細胞生物学及び免疫学の急速な進歩により、癌、心血管疾患及び代謝疾患を含む様々な疾患のための新規治療用組換えタンパク質、例えばモノクローナル抗体、二重特異性抗体及び複雑なフォーマットのタンパク質を開発する需要が高まっている。これらのバイオ医薬品候補は、一般に、目的のタンパク質を発現することができる市販の細胞株によって製造される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、近年、治療用モノクローナル抗体又は二重特異性抗体並びにより複雑なフォーマットのタンパク質を生産するように広く適合されている。
市販の細胞株を開発するための従来の戦略は、一般に、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をランダムに又は特定の（「標的化された」）位置に組み込み、続いてそのポリペプチドを生産する細胞株を選択及び単離することを目的とした反復努力を含む。しかしながら、これらの手法は、それら自体の特有の欠点を有する。ランダム組込み法は、発現を目的とする導入遺伝子の異なる組成及び比率を有する異なるクローンを得る可能性を提供するが、望ましい発現レベル、製品品質属性、及び生産培養性能を示す細胞株を単離するためにトランスフェクション後に数百又は数千のクローンをスクリーニングすることは、時間がかかり、資源集約的である。さらに、様々な導入遺伝子の最適な比率を有するクローン（単数又は複数）が存在しないか、不安定性又は十分な数のクローンをスクリーニングすることができないために単離されない可能性がある。さらに、多重鎖ポリペプチド、例えばモノクローナル抗体を生産する場合、そのようなポリペプチドをコードする核酸の数及び配置に対処するためのさらなるスクリーニングが必要とされ得る。ランダム組込み法を使用する場合、ゲノムに導入されたすべての導入遺伝子の数及び位置並びにそれらの配置を決定することは困難であり、これは、導入遺伝子の配置／コピー数と所望の産物属性との間の合理的な相関を作成する上で重要なステップである。
対照的に、導入遺伝子（単数又は複数）がゲノム内の所定の特定の位置に挿入されている場合、標的化組込み手法は、各特定の導入遺伝子の配置及びコピー数に対するより多くの制御を提供することができる。しかしながら、そのような標的化組込み手法は、異なる導入遺伝子のランダムな組み合わせ及び比率を生成する可能性を最小限に抑えるように設計されている。したがって、導入遺伝子の設計された配置及びコピー数が偶然に準最適である場合、同様に、得られるクローンのすべてが準最適な製品品質及び／又は力価を有するであろう。標的化組込み手法を使用して複雑な分子又は発現困難な分子を発現させる機会を増加させるために、複数の異なる導入遺伝子配置及びコピー数構成が個別に試験され、その結果、細胞株開発（ＣＬＤ）作業量及びリソース要件が増加する。したがって、当技術分野では、従来の方法論に匹敵する発現レベル、製品品質属性、及び生産培養性能を示す細胞株を生成しながら、資源を節約する新しい細胞株開発戦略が必要とされている。
本開示の主題は、組換えタンパク質、例えばモノクローナル抗体、並びにそれに由来する組成物、例えば二重特異性抗体、及び他の複雑なフォーマットのタンパク質、例えば膜タンパク質複合体、及び他の発現困難な分子を発現することができる宿主細胞を生成及び同定するための「ランダム化された構成標的化組込み」（本明細書では「ランダム化された鎖標的化組込み」とも呼ばれる）（ＲＣＴＩ）戦略に関する。本開示に記載されるＲＣＴＩ法は、より少ないリソースを使用しながら、標準的な細胞株開発方法よりも多くはないとしても同じ数のベクター構成をスクリーニングするために使用することができる。本開示に記載のＲＣＴＩ法を使用することによって、より少ない個々のクローンも同様にスクリーニングすることができる。
特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの目的の配列（ＳＯＩ）を発現する標的化組込み（ＴＩ）宿主細胞のライブラリを生成及びハイスループット・スクリーニングする方法であって、ａ）１つ又は複数のＳＯＩを発現する複数のＴＩ宿主細胞を含むＴＩ宿主細胞のライブラリを：ｉ）複数のＴＩ宿主細胞を提供すること；ｉｉ）上記複数のＴＩ宿主細胞を、１つ又は複数のＳＯＩを含む複数のベクターと接触させること；ｉｉｉ）上記１つ又は複数のＳＯＩを上記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入すること；によって生成することと、ｂ）上記ライブラリを単一クローンに分離することと、ｃ）特定の細胞又は産物属性について上記クローンをスクリーニングすることとを含む方法を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、複数の外因性ヌクレオチドＳＯＩを含むＴＩ宿主細胞のライブラリを生成する方法であって、ａ）複数のＴＩ宿主細胞を提供することと、ｂ）上記複数のＴＩ宿主細胞を、１つ又は複数のＳＯＩを含む複数のベクターと接触させることと、ｃ）上記１つ又は複数のＳＯＩを上記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入することとを含む方法を提供する。特定の実施形態では、複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの１つ又は複数の遺伝子座に組み込まれた１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含み、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する少なくとも２つのリコンビナーゼ認識配列（ＲＲＳ）を含む。特定の実施形態では、ベクターは、ａ）組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の少なくとも２つのＲＲＳと一致する少なくとも２つのＲＲＳ；及び、ｂ）１つ又は複数の外因性ＳＯＩ、及び上記ＲＲＳに隣接する少なくとも１つの第２の選択マーカーを含む。
本開示の主題はまた、目的の配列の発現を促進するための、宿主細胞への１つ又は複数の外来性核酸のＲＣＴＩのための方法を提供する。特定の実施形態では、そのような方法は、リコンビナーゼ媒介性組込み又は遺伝子編集媒介性組込みによる宿主細胞への１つ又は複数の外来性核酸の標的化組込みを含む。特定の実施形態では、そのような方法は、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内に組み込まれた１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含む細胞に関し、遺伝子座は、配列番号１～１２から選択される配列と少なくとも約９０％相同であるヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、本開示は、１つ又は複数のＳＯＩを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法であって、ａ）複数のＴＩ宿主細胞を提供することと、ｂ）上記複数のＴＩ宿主細胞を、１つ又は複数のＳＯＩを含む複数のベクターと接触させることと、ｃ）上記１つ又は複数のＳＯＩを上記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入することと、ｄ）上記１つ又は複数のＳＯＩを発現するＴＩ宿主細胞を選択することとを含む方法を提供する。特定の実施形態では、複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの１つ又は複数の遺伝子座に組み込まれた１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含み、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する少なくとも２つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、ベクターは、ａ）組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の少なくとも２つのＲＲＳと一致する少なくとも２つのＲＲＳ；及び、ｂ）１つ又は複数の外因性ＳＯＩ、及び上記ＲＲＳに隣接する少なくとも１つの第２の選択マーカーを含む。特定の実施形態では、該方法は、上記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ以上に、ＲＲＳを認識する１つ以上のリコンビナーゼ又はリコンビナーゼをコードする核酸を導入することと、ｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、目的の配列を発現するＴＩ宿主細胞を単離することとを含む。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１及び第２のＲＲＳと、第１及び第２のＲＲＳの間に位置する第３のＲＲＳとを含み、すべてのＲＲＳは異種特異性であり；上記複数のベクターは、ｉ．組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１及び第３のＲＲＳと一致し少なくとも１つの第１の外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１のベクター；ｉｉ．組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２及び第３のＲＲＳと一致し少なくとも１つの第２の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２のベクターを含み、第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、目的の第１及び第２の配列を発現するＴＩ宿主細胞が単離される。
特定の実施形態では、本開示は、ＳＯＩを発現する方法であって、ａ）複数のＴＩ宿主細胞を提供することと、ｂ）上記複数のＴＩ宿主細胞を、１つ又は複数のＳＯＩを含む複数のベクターと接触させることと、ｃ）上記１つ又は複数のＳＯＩを上記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入することと、ｄ）目的の配列を発現するＴＩ宿主細胞を選択することと、ｅ）目的の配列を発現させるのに適した条件下でｄ）の細胞を培養することとを含む方法を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、ＳＯＩを発現する方法であって、ａ）各ＴＩ宿主細胞が、ＴＩ宿主細胞のゲノムの１つ又は複数の遺伝子座に組み込まれた１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含み、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する少なくとも２つのＲＲＳを含む、複数のＴＩ宿主細胞を提供することと、ｂ）上記複数のＴＩ宿主細胞を、ａ．組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の少なくとも２つのＲＲＳと一致する少なくとも２つのＲＲＳ；及びｂ．１つ又は複数の外因性ＳＯＩと、上記ＲＲＳに隣接する少なくとも１つの第２の選択マーカーを含む複数のベクターと接触させることと、ｃ）ＲＲＳを認識する１つ又は複数のリコンビナーゼ又はリコンビナーゼをコードする核酸を導入することと、ｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、目的の配列を発現するＴＩ宿主細胞を単離することと、ｅ）目的の配列を発現させるのに適した条件下でｄ）の細胞を培養し、そこから目的の配列の産物を回収することとを含む方法を提供する。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１及び第２のＲＲＳと、第１及び第２のＲＲＳの間に位置する第３のＲＲＳとを含み、すべてのＲＲＳは異種特異性であり；上記複数のベクターは、ｉ．組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１及び第３のＲＲＳと一致し少なくとも１つの第１の外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１のベクター；ｉｉ．組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２及び第３のＲＲＳと一致し少なくとも１つの第２の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２のベクターを含み、第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、目的の第１及び第２の配列を発現するＴＩ宿主細胞が単離される。
上記の特定の実施形態では、１つ又は複数のＳＯＩは、リコンビナーゼ媒介性組込みによって複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入される。上記の特定の実施形態では、１つ又は複数のＳＯＩは、遺伝子編集媒介組込みによって複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入される。
上記の特定の実施形態では、１つ又は複数のＳＯＩは、１つ又は複数の調節可能なプロモーターに作用可能に連結されている。上記の特定の実施形態では、１つ以上の調節可能なプロモーターは、ＳＶ４０及びＣＭＶプロモーターからなる群から選択される。
上記の特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である。上記の特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である。上記の特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞 ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞。
上記の特定の実施形態では、ＳＯＩは、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする。上記の特定の実施形態では、ＳＯＩは、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）又はＦｃ融合タンパク質をコードする。
上記の特定の実施形態では、特定の細胞属性は、細胞増殖、細胞力価、比生産性、体積生産性、クローン安定性から選択される。上記の特定の実施形態では、特定の産物属性は、グリコシル化のレベル、電荷分散のレベル、ミスマッチの減少、タンパク質／ペプチド凝集の減少、タンパク質配列不均一性から選択される。
上記の特定の実施形態では、１つ又は複数のＳＯＩは、複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数の細胞に、以下から選択される配列と少なくとも約９０％相同である１つ又は複数の遺伝子座において導入される。配列番号１～１２；ＮＷ＿００６８７４０４７．１；ＮＷ＿００６８８４５９２．１；ＮＷ＿００６８８１２９６．１；ＮＷ＿００３６１６４１２．１；ＮＷ＿００３６１５０６３．１；ＮＷ＿００６８８２９３６．１；及びＮＷ＿００３６１５４１１．１。
上記の特定の実施形態では、少なくとも１つの目的の配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の目的の配列を含む。
図１Ａ～１Ｂは、例示的な標的化組込み（ＴＩ）細胞株開発（ＣＬＤ）ワークフローを示す概略図である。 図２Ａ～２Ｂは、標準ＴＩと「ランダム化された構成標的化組込み」（本明細書では「ランダム化された鎖標的化組込み」とも呼ばれる）（ＲＣＴＩ）ワークフローの比較を例示する概略図である。 図３Ａ～３Ｂは、生産培養で評価されたクローンの力価及びＨＭＷＳ（％）の分布、並びに同定された構成を示す。 図４は、標準的なＴＩ ＣＬＤアプローチとＲＣＴＩアプローチとの間で同等の他の製品品質属性を示す。 図５は、標準的なＣＬＤアプローチとＲＣＴＩアプローチとの間で同等の製品品質属性を示す。 図６Ａ～６Ｃは、ＲＣＴＩ法が、クローン性能を維持しながらタイムラインの柔軟性を改善することを示す。 図７Ａ～７Ｂは、力価が分子Ｙについて標準的なＣＬＤアプローチとＲＣＴＩアプローチとの間で同等であるが、ＲＣＴＩアプローチからのクローンの特異的生産性は標準的なＣＬＤのものよりも高いことを示す。 図８Ａ～８Ｇは、分子Ｙについて標準的なＣＬＤアプローチとＲＣＴＩアプローチとの間で同等の製品品質属性を示す。 図９Ａ～９Ｂは、力価が分子Ｚについて標準的なＣＬＤアプローチとＲＣＴＩアプローチとの間で同等であるが、ＲＣＴＩアプローチからのクローンの特異的生産性は標準的なＣＬＤのものよりも高いことを示す。 図１０Ａ～１０Ｆは、分子Ｚについて標準的なＣＬＤアプローチとＲＣＴＩアプローチとの間で同等の製品品質属性を示す。 図１１Ａ～１１Ｃは、本開示の方法によって発現される例示的な分子を示す概略図である。
特定の実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞、遺伝子構築物（例えば、ベクター）、組成物、及び方法は、従来の方法論に匹敵する発現レベル、製品品質属性、及び生産培養性能を示す宿主細胞のより効率的な（例えば、より少ない時間及び／又はリソース集中）同定のための「ランダム化された構成標的化組込み」（本明細書では「ランダム化された鎖標的化組込み」とも呼ばれる）（ＲＣＴＩ）戦略の開発及び／又は使用に使用することができる。
開示を明確にする目的で、かつ限定を目的とせずに、詳細な説明を以下のサブセクションに分ける。
１．定義
２．宿主細胞の調製及びスクリーニング戦略
３．外因性ヌクレオチド配列
４．宿主細胞
５．標的化組込み
６．産物
１．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本分野の当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、本明細書におけるいかなる定義をも含む本出願が優先する。好ましい方法及び材料は以下に記載されているが、本明細書に記載されているものと類似又は同等の方法及び材料は、現在開示されている主題の実施又は試験に使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。加えて、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」「有する（ｈａｓ）」、「することができる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、及びこれらの変形は、更なる作用又は構造物の可能性を排除しない、オープンエンドの移行句、用語、又は単語であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本開示はまた、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態又は要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
本明細書における数値範囲の列挙のために、同じ程度の精度でその間に介在する各数字が明示的に企図される。例えば、６～９の範囲では、６及び９に加えて数値７及び８が企図され、６．０～７．０の範囲では、番号６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明示的に企図される。
本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容され得る誤差範囲を意味し、これは、その値がどのように測定又は決定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存することになる。例えば、「約」とは、当該技術分野での慣習に従い、３又は３を超える標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、更により好ましくは１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。
本明細書で使用される場合、「選択マーカー」という用語は、対応する選択剤の存在下で、ある遺伝子を保持する細胞が特異的に選択されるか、又は特異的に排除されることを可能にする該遺伝子を表す。例えば、限定ではないが、選択マーカーは、選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、遺伝子の存在下で積極的に選択されることを可能にすることができ、形質転換されていない宿主細胞は、該選択的培養条件下で増殖又は生存することができない。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、又は二機能性であってよい。ポジティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞の選択が可能になり得るのに対し、ネガティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞を選択的に排除することが可能になり得る。選択マーカーは、宿主細胞において薬物に対する耐性を付与することができるか、又は代謝若しくは異化の欠陥を補うことができる。原核細胞においては、とりわけ、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、又はクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を使用することができる。真核細胞において選択マーカーとして有用な耐性遺伝子としては、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ））の遺伝子、並びにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。さらなるマーカー遺伝子は、国際公開第９２／０８７９６号及び国際公開第９４／２８１４３号に記載されている。
選択マーカーは、対応する選択剤の存在下での選択を容易にするだけでなく、通常は細胞中に存在しない分子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅをコードする遺伝子を代わりに提供し得る。そのような遺伝子を保有する細胞は、例えば、コードされたポリペプチドによって放射される蛍光の検出によって、この遺伝子を保有しない細胞と区別され得る。
本明細書において使用される場合、用語「作動能可能に連結された」は、目的の様式でそれらが機能することを可能にする関係にある、２つ以上の成分の近接した配置を意味する。例えば、プロモーター及び／又はエンハンサーがコード配列の転写を調節する役割を果たす場合、そのプロモーター及び／又はエンハンサーはコード配列に作動能可能に連結されている。特定の実施形態において、「作動能可能に連結されて」いるＤＮＡ配列は、単一の染色体上で近接し、隣り合っている。特定の実施形態において、例えば、１つの分泌リーダー及び１つのポリペプチドなど２つのタンパク質のコード化領域をつなげる必要がある場合、これらの配列は近接し、隣り合い、かつ同じ読み枠に存在する。特定の実施形態において、作動能可能に連結されたプロモーターは、コード配列の上流に位置しており、かつコード配列の隣に存在してよい。特定の実施形態において、例えば、コード配列の発現を調節するエンハンサー配列に関して、２つの成分は、隣り合ってはいないが、作動能可能に連結されてよい。エンハンサーがコード配列の転写を増大させる場合、エンハンサーはコード配列に作動能可能に連結されている。作用可能に連結されエンハンサーは、コード配列の上流、配列内、又は下流に位置し得、コード配列のプロモーターから相当な距離を置いて位置し得る。作動能可能な連結は、当該技術分野で公知の組換え法によって、例えば、ＰＣＲ方法を用いて、かつ／又は好都合な制限部位でのライゲーションによって、達成することができる。好都合な制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを従来の手法に従って使用することができる。配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、５’末端に非依存的にオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の内部位置で翻訳を開始することを可能にする場合、ＯＲＦに作動能可能に連結されている。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、転写及び／又は翻訳を指す。特定の実施形態では、所望の産物の転写レベルは、存在する対応するｍＲＮＡの量に基づいて決定され得る。例えば、目的の配列から転写されたｍＲＮＡは、ＰＣＲ又はノーザンハイブリダイゼーションによって定量され得る。特定の実施形態では、目的の配列によってコードされるタンパク質は、様々な方法によって、例えば、ＥＬＩＳＡによって、タンパク質の生物活性についてアッセイすることによって、又はそのような活性に依存しないアッセイ、例えば、タンパク質を認識してそれに結合する抗体を使用するウェスタンブロッティング若しくはラジオイムノアッセイなどを用いることによって定量され得る。
「目的の配列」という用語は、ポリペプチド配列（又は、ある特定の場合において、ポリペプチド配列をコードする核酸）を指すために本明細書で使用され、ポリペプチド配列の発現が目的である。そのようなポリペプチド配列は、特定の実施形態では、マルチサブユニットのタンパク質複合体のサブユニットを含むことができる。特定の実施形態では、そのようなポリペプチド配列は、そのようなサブユニットの断片を含むことができる。そのようなポリペプチド配列は、特定の実施形態では、抗体配列、例えば抗体重鎖又は軽鎖配列を含むことができる。特定の実施形態では、そのようなポリペプチド配列は、そのような抗体配列の断片を含むことができる。
本明細書において「抗体」という用語は、最も広義に使用され、抗体が所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、半抗体、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない様々な抗体構造を包含する。
本明細書で使用される場合、「標準抗体」及び「標準モノクローナル抗体」は、単一の結合特異性を有する抗体又は抗体断片である。特定の実施形態では、標準抗体の単一の結合特異性は、重鎖配列又はそのフラグメントと、軽鎖配列又はそのフラグメントとのペアリングの結果である。
本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」又は「ＢｓＡｂ」は、２つの異なるエピトープ、例えば２つの異なる抗原上の２つの異なるエピトープ又は単一抗原上の２つの異なるエピトープに同時に結合することができる抗体である。ＢｓＡｂは、第１の親抗体の結合特異性を有するＢｓＡｂの１つの「アーム」（すなわち、１対のＶＨ及びＶＬ）及び第２の親抗体の結合特異性を有するＢｓＡｂの第２の「アーム」をもたらす２つの異なる親モノクローナル抗体の対になった可変重（ＶＨ）及び軽（ＶＬ）ドメインを含むものを含む多数の異なる構造を包含する。ＢｓＡｂは多重特異性抗体のサブセットであり、多重特異性抗体は少なくとも２つの結合特異性（すなわち、ＢｓＡｂ）を含むが、三重特異性抗体並びにより多数の特異性を有する抗体も含む。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体と抗原との結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、概して、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版 Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，第９１頁（２００７）を参照。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために充分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体のＶＨ又はＶＬドメインを使用して単離され、それぞれ、相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリをスクリーニングしてもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照のこと。
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、核酸分子に連結されている別の核酸を増殖し得る核酸分子を意味する。この用語には、自己複製する核酸構造としてのベクターだけでなく、ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも含まれる。特定の実施形態では、ベクターは、それらが作用可能に連結している核酸の発現を誘導する。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「相同配列」という用語は、配列のアラインメントによって判定されたとき、有意に配列類似性を共有する配列を指す。例えば、２つの配列は、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は９９．９％相同であり得る。アラインメントは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＨＭＭＥなどを含むがこれらに限定されないアルゴリズム及びコンピュータプログラムによって実行され、配列を比較し、要素、例えば配列の長さ、配列の同一性及び類似性、並びに配列のミスマッチ及びギャップの存在及び長さなどに基づいて、一致の統計的有意性を算出する。相同配列は、ＤＮＡ配列及びタンパク質配列の両方を指し得る。
本明細書で使用される場合、「隣接する」という用語は、第１のヌクレオチド配列が、第２のヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端、又は両端のいずれかに位置することを指す。隣接ヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列の隣に存在するか、又はそれから所定の距離の位置にあってよい。隣接ヌクレオチド配列の長さには特に制限はない。例えば、隣接配列は、数塩基対又は数千塩基対であってよい。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、ヌクレオチド配列が宿主細胞に由来せず、従来のＤＮＡ送達方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、又は形質転換法によって宿主細胞に導入されるものを示す。「内因性」という用語は、ヌクレオチド配列が宿主細胞に由来することを指す。「外因性」ヌクレオチド配列は、塩基組成の点で同一である「内因性」対応物を有し得るが、「外因性」配列は、例えば、組換えＤＮＡ技術によって宿主細胞中に導入され得る。
本明細書中で用いられる「組込み部位」は、外因性ヌクレオチド配列が挿入される、宿主細胞ゲノム内の核酸配列を含む。特定の実施形態では、組込み部位は、宿主細胞ゲノム上の２つの隣接するヌクレオチド間に存在する。特定の実施形態において、組込み部位は、ヌクレオチド配列のストレッチを含む。特定の実施形態では、組込み部位は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内に位置する。特定の実施形態では、組込み部位は、ＴＩ宿主細胞の内因性遺伝子内に存在する。
本明細書で使用される場合、「ＴＩ宿主細胞」という用語は、目的の配列の発現に使用するためのゲノム遺伝子座又は遺伝子座、すなわち組込み部位（単数又は複数）を含む細胞を指す。特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞へのＳＯＩの組込みは、２つ以上のＲＲＳを含むもう１つの組込み部位における外因性ヌクレオチド配列の存在によって促進される。特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞へのＳＯＩの組込みは、１つ又は複数の組込み部位でＴＩ宿主細胞ゲノムを編集することができるゲノム編集システムによって促進される。
２．宿主細胞の調製及びスクリーニング戦略
標準的なＣＬＤ戦略は、一般に、目的の配列（単数又は複数）をコードする１つ又は複数の特異的外因性核酸による複数回の宿主細胞トランスフェクションを含む。図１Ａに例示されるように、そのような外因性核酸、例えば、抗体の重鎖及び軽鎖コード配列を含むプラスミドの調製の後に、例えば、リコンビナーゼ媒介性カセット交換「ＲＭＣＥ」によるトランスフェクションが、標的化組込みの状況において行われる。組込み戦略（例えば、ランダム又は標的化された組込み）にかかわらず、トランスフェクトされた宿主細胞のプールをその後、選択及び単一細胞クローニング（ＳＣＣ）の前に回収する。次いで、より詳細な生産性及び製品品質アッセイ、例えば高分子量種含有量（「ＨＭＷＳ（％）」）、サイズ変動、酸性変動、及びグリコシル化変動のために、例えば均一時間分解蛍光（「ＨＴＲＦ」）力価アッセイを介して、複数回のクローン分析を使用してクローンの数を絞り込む。
図２Ａは、複数のＣＬＤサイクルを使用して、望ましい発現レベル、製品品質属性、及び生産培養性能を示す細胞を同定する、標準的な標的化組込みに基づくＣＬＤ戦略を示す。この例では、トランスフェクトされた細胞の各プールは、複数の宿主細胞を、目的の配列をコードする２つの外因性核酸の特定の組み合わせと接触させることによって調製される。図２Ａは、第１の「フロント」プラスミド及び第２の「バック」プラスミドからの目的の配列の宿主ゲノム内の特定の遺伝子座への標的化組込みを含む戦略を示しているが（２ベクターＲＣＭＥ戦略の一般的な説明については、以下のセクション５．１を参照）、標的化組込みの手法は、単一の目的の配列又は２つよりも多くの目的の配列の組込みを含み得ることを理解されたい。さらに、標的化組込み戦略は、本明細書中に概説されるように、図２Ａ及び２Ｂに例示されるようなリコンビナーゼ媒介性のＳＯＩの組込みだけでなく、ＳＯＩの組込みのための他の遺伝子座特異的な戦略、例えば、ＳＯＩの遺伝子編集媒介性の組込みも使用することができる。しかしながら、上記のように、標的化組込みアプローチの明確な特徴は、ゲノム内の特定の配列、すなわち導入遺伝子の固定された構成における特定の配列の組込みをもたらすように設計されていることである。この設計特徴に照らして、図２Ａに概説されるように、目的の配列のコピー数及び配置における十分な数のバリエーションがアッセイされることを確実にするために、複数サイクルのＣＬＤを実施することが必要である。
図２Ａに示される標準的な資源集約的マルチサイクル標的化組込みＣＬＤ戦略とは対照的に、本出願の主題は、「ランダム化された構成標的化組込み」（本明細書では「ランダム化された鎖標的化組込み」とも呼ばれる）（ＲＣＴＩ）戦略に関し、これは、目的の配列のコピー数及び配置のバリエーションの単一サイクルアッセイを可能にするが、標的化組込みの遺伝子座特異的組込みの利益を保持する。図２Ｂに概説されるように、目的の配列をコードする関連する外因性核酸のすべてを、単一のトランスフェクションプールの作製によって評価することができる。目的の配列をコードする関連する外因性核酸の完全な相補体を複数の宿主細胞と組み合わせることによって、単一のトランスフェクションプールが作製され、そこから望ましい発現レベル、製品品質属性、及び生産培養性能を示すクローンを同定することができる。
例示的な図２Ｂは、宿主細胞ゲノム内の特定の遺伝子座に存在する外因性ヌクレオチド配列のフロントカセット又はバックカセットに組み込まれる３つの「フロント」及び３つの「バック」プラスミド（それぞれが１つ又は複数の目的の配列を含んでいる）を使用する実施形態を示しているが（そのような「２ベクターＲＭＣＥ」戦略の完全な説明については、以下のセクション５．１を参照）、本開示の主題は、そのような標的化組込み戦略に関する多種多様なバリエーションを包含することを理解されたい。例えば、フロントカセットを含む第１のプラスミド及びバックカセットを含む第２のプラスミドを使用するのではなく、本開示は、単一カセットの組込みを含む方法も包含する。さらに、本開示はまた、宿主細胞ゲノム中の特定の遺伝子座に存在する単一の外因性ヌクレオチド配列への３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるカセットの組込みを含む方法を包含する。さらに、各カセットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の個々の目的の配列を含むことができるだけでなく、各宿主ゲノムは、目的の配列を含むカセットが組み込まれ得る宿主細胞ゲノム中の特定の遺伝子座に存在する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の外因性ヌクレオチド配列を含むことができる。したがって、例示的な図２Ｂは、３つのフロントカセット及び３つのバックカセットを使用して、９個の可能な目的の配列の導入遺伝子構成を生成することができる戦略を示しているが、本開示は、宿主ゲノム内の２つ以上の遺伝子座を含む、より少ない導入遺伝子構成及びより多い導入遺伝子構成の両方を生成するための戦略を包含する。
本明細書に概説されているＲＣＴＩ戦略を使用することにより、限定はしないが、コスト及び時間の節約、労働の節約、並びに自動化のボトルネックの緩和を含む、資源の大幅な節約をもたらすことができる。図３～５に示すように、このような資源の節約は、標準的なＣＬＤ戦略と比較して、観察される望ましい発現レベル、製品品質属性、又は生産培養性能の分布に悪影響を及ぼさない。
ＲＣＴＩアプローチはまた、図６Ａ～６Ｃに示すように、初期、中期、又は完全な回収段階での単一細胞クローニングを可能にする。標準的なＣＬＤ戦略は、一般に、単一細胞クローニングに関与する前に完全なトランスフェクションプールの回収（例えば、＞９０％の細胞生存率）を待つことを含むので、ＲＣＴＩ戦略の使用は、クローン性能（高力価及び所望の製品品質を有するクローンの％）又は不均一性（ベクター構成、力価及び製品品質の範囲）に影響を及ぼすことなく、大幅な時間節約をもたらすことができる。
特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＳＯＩを発現するＴＩ宿主細胞のライブラリをスクリーニングするハイスループットのＲＣＴＩに基づく方法に関する。特定の実施形態では、本方法は、ＴＩ宿主細胞のライブラリの生成を含み、該ライブラリは、１つ又は複数のＳＯＩを発現する複数のＴＩ宿主細胞を含み、ライブラリを単一クローンに分離し、特定の細胞及び／又は特定の産物属性についてクローンをスクリーニングすることによって生成される。特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞のライブラリの生成は、複数のＴＩ宿主細胞を提供する工程、複数のＴＩ宿主細胞を、１つ又は複数のＳＯＩを含む複数のベクターと接触させる工程、及び、複数のＴＩ宿主細胞の１つ又は複数に１つ又は複数のＳＯＩを導入する工程を含む。
特定の実施形態では、目的の配列は、リコンビナーゼ媒介性組込みによって本開示の宿主細胞に導入され得る。特定の実施形態では、目的の配列は、遺伝子編集媒介性組込みによって本開示の宿主細胞に導入され得る。
特定の実施形態では、本開示のスクリーニング方法は、細胞増殖、細胞力価、比生産性、体積生産性、クローン安定性のいずれかであり得るがこれらに限定されない細胞属性についての細胞のスクリーニングを含み得る。これらの細胞属性のスクリーニングは、当技術分野で公知の任意の技術を用いて行うことができる。
特定の実施形態では、本開示のスクリーニング方法は、グリコシル化のレベル、電荷分散のレベル、ミスマッチの減少、タンパク質／ペプチド凝集の減少、タンパク質配列不均一性のいずれかであり得るがこれらに限定されない産物属性について細胞をスクリーニングすることを含み得る。これらの産物属性のスクリーニングは、これらに限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、ｃＤＮＡ配列決定、ペプチドマッピング、ＣＥ－ＳＤＳ又はＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＣＥに基づくグリカンアッセイ、ＩＥＦ、及びイオン交換クロマトグラフィなどの当技術分野で公知の任意の技術を用いて行うことができる。
特定の実施形態では、本開示は、複数の外因性ヌクレオチドＳＯＩを含むＴＩ宿主細胞のライブラリを生成するＲＣＴＩに基づく方法であって、複数のＴＩ宿主細胞を、１つ又は複数のＳＯＩを有するベクターと接触させることと、１つ又は複数のＳＯＩをＴＩ宿主細胞に導入することと、１つ又は複数のＳＯＩを発現するＴＩ細胞を選択するステップとを含む方法を提供する。特定の実施形態では、本開示の方法によって生成されたＴＩ宿主細胞は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの１つ又は複数の遺伝子座に組み込まれた１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含む。一定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、１つ又は複数の選択マーカーに隣接し得る少なくとも２つのＲＲＳを含み得る。
特定の実施形態では、ベクターは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性などの形質転換宿主細胞を選択するための表現型形質を提供するための１つ又は複数の選択マーカー遺伝子を含み得る。特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核細胞、又は酵母細胞などの下等真核細胞であり得るか、又は宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞であり得る。特定の実施形態では、ライブラリは、限定されないが、ポリペプチド配列などの特定の目的の配列についてスクリーニングされ得る。一定の実施形態では、得られたライブラリを、表現型アッセイにおいて目的のポリペプチドに対する活性を示すクローンについてスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、ライブラリは、当技術分野で公知の手順によって、特定のタンパク質、例えば酵素の活性についてスクリーニングすることができる。
特定の実施形態では、本開示は、目的の配列を発現する宿主細胞を選択するＲＣＴＩに基づく方法であって、複数のＴＩ宿主細胞を提供することと、複数のＴＩ宿主細胞を、１つ又は複数のＳＯＩ及び少なくとも１つのマーカーを含む複数のベクターと接触させることと、１つ又は複数のＳＯＩを、複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入することと、選択マーカーを発現するＴＩ宿主細胞を選択し、それにより、目的の配列を発現するＴＩ宿主細胞を単離することとを含む方法に関する。特定の実施形態では、ＳＯＩは、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードすることができる。特定の実施形態では、ＳＯＩは、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）又はＦｃ融合タンパク質をコードすることができる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれる遺伝子座は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
特定の実施形態では、１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列は、以下から選択される配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％の相同性を有する１つ又は複数の遺伝子座に組み込まれ得る。配列番号１～１２；ＮＷ＿００６８７４０４７．１；ＮＷ＿００６８８４５９２．１；ＮＷ＿００６８８１２９６．１；ＮＷ＿００３６１６４１２．１；ＮＷ＿００３６１５０６３．１；ＮＷ＿００６８８２９３６．１；及びＮＷ＿００３６１５４１１．１。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれる遺伝子座は、本開示の配列番号８～１１に対応する米国特許第９８１６１１０号の配列番号１～４、又は本開示の配列番号１２に対応する国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２８５５５号の配列番号１から選択される配列に少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。特定の実施形態では、１つ又は複数の目的の配列は、リコンビナーゼ媒介性組込みによって本開示の宿主細胞に導入され得る。特定の実施形態では、１つ又は複数の目的の配列は、遺伝子編集媒介性組込みによって本開示の宿主細胞に導入され得る。
特定の実施形態では、本開示に記載される目的の配列を発現する宿主細胞を選択するＲＣＴＩに基づく方法で使用されるＴＩ宿主細胞はそれぞれ、ＴＩ宿主細胞のゲノムの１つ又は複数の遺伝子座に組み込まれた１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を有することができる。一定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する少なくとも２つのＲＲＳを含み得る。特定の実施形態では、宿主細胞を選択するＲＣＴＩに基づく方法で用いられるベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の少なくとも２つのＲＲＳと一致する少なくとも２つのＲＲＳと、１つ又は複数の外因性ＳＯＩ、及びこれらのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの第２の選択マーカーとを含む。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳ及び第２のＲＲＳと、第１のＲＲＳ及び第２のＲＲＳの間に位置する第３のＲＲＳとを含み、すべてのＲＲＳは異種特異性であってよい。特定の実施形態では、複数のベクターは、第１のベクター及び第２のベクターを含むことができる。特定の実施形態では、第１のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１及び第３のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１の外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むことができ、第２のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２及び第３のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含むことができる。特定の実施形態では、複数のベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれよりも多くのベクターを含むことができる。
特定の実施形態では、目的の配列は、マルチサブユニットタンパク質複合体の１つ又は複数のサブユニットの配列を含む。特定の実施形態では、そのようなポリペプチド配列は、そのようなサブユニット配列の断片を含むことができる。特定の実施形態では、目的の配列は、そのようなサブユニット配列の組み合わせを含むことができる。例えば、限定するものではないが、そのような組み合わせは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個若しくはそれよりも多くの第１のサブユニット配列、及び／又は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個若しくはそれよりも多くの配列の第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０若しくはそれ以上のサブユニット配列を含むことができる。さらに、特定の実施形態では、そのような組み合わせは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個若しくはそれよりも多くの異なるバリエーションの第１のサブユニット配列、及び／又は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個若しくはそれよりも多くの異なるバリエーションの第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０若しくはそれよりも多くのサブユニット配列を含むことができる。
特定の実施形態では、複数の目的の配列は、１つ若しくは複数の抗体重鎖配列（「Ｈ」）及び／又は１つ若しくは複数の抗体軽鎖配列（「Ｌ」）を含む。本明細書で使用される場合、そのような「Ｈ」及び「Ｌ」配列は、完全長重鎖又は軽鎖配列、並びに可変領域断片及び相補性決定領域断片を含むがこれらに限定されない重鎖又は軽鎖断片であり得る。特定の実施形態では、目的の配列は、そのようなＨ及びＬ配列の組み合わせを含むことができる。例えば、限定するものではないが、そのような組み合わせは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれよりも多くのＨ配列及び／又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれよりも多くのＬ配列を含むことができる。さらに、特定の実施形態では、そのような組み合わせは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれよりも多くの同一又は異なる別個のＨ’配列、並びに／あるいは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれよりも多くの同一又は異なる別個のＬ’配列を含むことができる。例えばＨ’’、Ｈ’’’、Ｌ’’、及びＬ’’’のような、１～１０個（又はそれよりも多く）のさらなるＨ及びＬ配列の包含も、本開示の主題に含まれる。例示的な実施形態は、限定されないが、以下のような様々な異なるＨ及び様々な異なるＬ配列の任意の組み合わせを含む配列を含む：ＨＬ；ＬＨ；Ｈ’Ｌ；ＬＨ’；Ｈ’Ｌ’；Ｌ’Ｈ’；ＨＬＬ；ＨＨＬ；ＬＬＨ；ＬＨＨ；Ｈ’ＬＬ；Ｈ’ＨＬ；Ｌ’ＨＨ；Ｌ’ＬＨ；Ｈ’Ｈ’Ｌ；ＬＨ’Ｈ’；ＨＬＬＬ；ＬＬＬＨ；ＨＬＨＬ；ＬＨＬＨ；Ｈ’ＬＬＬ；Ｌ’ＬＬＨ；Ｈ’ＬＨＬ；Ｌ’ＨＬＨなど。
特定の実施形態では、本開示は、ＳＯＩを発現する方法であって、複数のＴＩ宿主細胞を提供することと、上記複数のＴＩ宿主細胞を、１つ又は複数のＳＯＩ及び少なくとも１つのマーカーを含む複数のベクターと接触させることと、上記１つ又は複数のＳＯＩを上記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入することと、目的の配列を発現するＴＩ細胞を選択することと、目的の配列を発現させるのに適した条件下で細胞を培養して、そこから目的の配列を回収することとを含む方法に関する。
特定の実施形態では、トランスフェクトされた宿主細胞は、マルチサブユニットタンパク質複合体の１つ又は複数のサブユニットの配列を含む１つ又は複数の目的の配列を含む。特定の実施形態では、そのようなポリペプチド配列は、そのようなサブユニット配列の断片を含むことができる。特定の実施形態では、目的の配列は、そのようなサブユニット配列の組み合わせを含むことができる。例えば、限定するものではないが、そのような組み合わせは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個若しくはそれよりも多くの第１のサブユニット配列、及び／又は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個若しくはそれよりも多くの配列の第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０若しくはそれ以上のサブユニット配列を含むことができる。さらに、特定の実施形態では、そのような組み合わせは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個若しくはそれよりも多くの同一又は異なる別個のバリエーションの第１のサブユニット配列、及び／又は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個若しくはそれよりも多くの同一又は異なる別個のバリエーションの第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０若しくはそれよりも多くのサブユニット配列を含むことができる。
特定の実施形態では、トランスフェクトされた宿主細胞は、Ｈ及びＬ配列の組み合わせを含み得る１つ又は複数の目的の配列を含む。例えば、限定するものではないが、そのような組み合わせは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれよりも多くのＨ配列及び／又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれよりも多くのＬ配列を含むことができる。さらに、特定の実施形態では、そのような組み合わせは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれよりも多くの別個のＨ’配列、並びに／あるいは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれよりも多くの別個のＬ’配列を含むことができる。例えばＨ’’、Ｈ’’’、Ｌ’’、及びＬ’’’のような、１～１０個（又はそれよりも多く）のさらなるＨ及びＬ配列の包含も、本開示の主題に含まれる。例示的な実施形態は、限定されないが、以下のような様々な異なるＨ及び様々な異なるＬ配列の任意の組み合わせを含む配列を含む：ＨＬ；ＬＨ；Ｈ’Ｌ；ＬＨ’；Ｈ’Ｌ’；Ｌ’Ｈ’；ＨＬＬ；ＨＨＬ；ＬＬＨ；ＬＨＨ；Ｈ’ＬＬ；Ｈ’ＨＬ；Ｌ’ＨＨ；Ｌ’ＬＨ；Ｈ’Ｈ’Ｌ；ＬＨ’Ｈ’；ＨＬＬＬ；ＬＬＬＨ；ＨＬＨＬ；ＬＨＬＨ；Ｈ’ＬＬＬ；Ｌ’ＬＬＨ；Ｈ’ＬＨＬ；Ｌ’ＨＬＨなど。
３．外因性ヌクレオチド配列
本開示の主題は、外因性ヌクレオチド配列の組込みに適した宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、例えば１つ又は複数のリコンビナーゼ認識配列を含むことによって、組込み部位として働く。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、目的の配列をコードする。したがって、特定の実施形態では、宿主細胞は、１つ又は複数の目的の配列をコードする１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みを促進する１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、宿主細胞のゲノム上の組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、ＴＩ宿主細胞と呼ばれる。次いで、１つ又は複数の目的の配列をコードする外因性ヌクレオチド配列をＴＩ宿主細胞に導入し、組込みを組込み部位に標的化することができる。以下に概説されるように、ＴＩ宿主細胞は、１つ又は複数の目的の配列をコードする外因性ヌクレオチド配列の組込みを促進するエレメント、例えばリコンビナーゼ認識配列を含む外因性ヌクレオチド配列の存在によって定義される複数の組込み部位を含み得る。
特定の実施形態では、組込み部位及び／又はその組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、実験的に同定され得る。特定の実施形態では、組込み部位及び／又は組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、１つ以上の外因性ヌクレオチド配列に組み込まれた１つ又は複数のＳＯＩによってコードされる目的のポリペプチドを望ましいレベルで発現する宿主細胞を単離するためのゲノムワイドスクリーニング手法によって同定することができ、外因性配列はそれ自体、宿主細胞のゲノム内の１つ以上の遺伝子座に組み込まれる。特定の実施形態では、組込み部位及び／又は組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、トランスポザーゼに基づくカセット組込み事象後のゲノムワイドスクリーニング手法によって同定され得る。特定の実施形態では、組込み部位及び／又は組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、ブルートフォースランダム組込みスクリーニングによって同定され得る。特定の実施形態では、組込み部位及び／又は組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、標的化遺伝子座増幅（ＴＬＡ）、それに続く次世代シーケンシング（ＮＧＳ）及び全ゲノムＮＧＳなどの従来のシーケンシングアプローチによって決定され得る。特定の実施形態では、染色体上の組込み部位の位置は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析などの従来の細胞生物学的アプローチによって決定され得る。
特定の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞のゲノム内の特定の第１の遺伝子座内の第１組込み部位に組み込まれた第１の外因性ヌクレオチド配列と、ゲノム内の特定の第２の遺伝子座内の第２の組込み部位に組み込まれた第２の外因性ヌクレオチド配列とを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞のゲノム中の複数の組込み部位で組み込まれた複数の外因性ヌクレオチド配列を含む。
３．１ リコンビナーゼ認識配列を含む外因性配列
特定の実施形態において、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、１つ又は複数のリコンビナーゼ認識配列（ＲＲＳ）を含み、該ＲＲＳはリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は２つのＲＲＳを含み、２つのＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は２つのＲＲＳを含み、２つのＲＲＳは異なっている。特定の実施形態において、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳを含み、第３のＲＳＳは第１と第２のＲＲＳの間に位置している。特定の実施形態において、第１及び第２のＲＲＳは同じであり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳとも第２のＲＲＳとも異なる。特定の実施形態では、３つのＲＲＳすべてが異なる。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、複数のＲＲＳを含む。特定の実施形態では、複数の２つ以上のＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、２つ以上のＲＲＳは異なっている。特定の実施形態では、ＲＲＳの総数のサブセットは同じであり、ＲＲＳの総数のサブセットは異なる。特定の実施形態では、ＲＲＳ又は複数のＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択され得る。
特定の実施形態において、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、１つのＲＲＳ及び少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１のＲＲＳ及び第２のＲＲＳ、並びに少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態において、選択マーカーは、第１と第２のＲＲＳの間に位置している。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、少なくとも１つの選択マーカーに隣接し、すなわち、第１のＲＲＳは、選択マーカーの５’上流に位置し、第２のＲＲＳは、選択マーカーの３’下流に位置する。特定の実施形態では、第１のＲＲＳは選択マーカーの５’末端に隣接し、第２のＲＲＳは、選択マーカーの３’末端に隣接する。
特定の実施形態では、選択マーカーは、第１と第２のＲＲＳとの間に位置し、２つの隣接するＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳ、いずれもＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳはいずれもＦＲＴ配列である。特定の実施形態において、選択マーカーは第１と第２のＲＲＳの間に位置しており、かつこれら２つの隣接ＲＲＳは互いに異なる。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、ＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。特定の実施形態において、ＬｏｘＰ Ｌ３配列は選択マーカーの５’に位置しており、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列は選択マーカーの３’に位置している。特定の実施形態において、第１の隣接ＲＲＳは野生型ＦＲＴ配列であり、第２の隣接ＲＲＳは変異ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態において、第１の隣接ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態において、２つのＲＲＳは、同じ向きに位置づけられている。特定の実施形態において、２つのＲＲＳは、両方が順方向又は逆方向である。特定の実施形態において、２つのＲＲＳは、反対の向きに位置づけられている。
特定の実施形態では、選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、並びにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、又はマイコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子であり得る。特定の実施形態では、選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－モノマー、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、又はＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーであり得る。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳに隣接する２つの選択マーカーを含み、第１の選択マーカーは、第２の選択マーカーとは異なる。特定の実施形態では、２つの選択マーカーは両方とも、グルタミンシンテターゼ選択マーカー、チミジンキナーゼ選択マーカー、ＨＹＧ選択マーカー、及びピューロマイシン耐性選択マーカーからなる群から選択される。特定の実施形態において、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、チミジンキナーゼ選択マーカー及びＨＹＧ選択マーカーを含む。特定の実施形態では、第１の選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、並びにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びマイコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され、第２の選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅからなる群から選択される。特定の実施形態では、第１の選択マーカーは、グルタミンシンテターゼ選択マーカーであり、第２の選択マーカーは、ＧＦＰマーカーである。特定の実施形態では、両方の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは同一である。特定の実施形態において、両方の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは、互いに異なる。
特定の実施形態において、選択マーカーは、プロモーター配列に作動能可能に連結されている。特定の実施形態において、選択マーカーは、ＳＶ４０プロモーターに作動能可能に連結されている。特定の実施形態では、選択マーカーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに作用可能に連結されている。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー及びＩＲＥＳを含み、ＩＲＥＳは選択マーカーに作用可能に連結されている。特定の実施形態では、ＩＲＥＳに作用可能に連結された選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－モノマー、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーからなる群から選択される。特定の実施形態では、ＩＲＥＳに作用可能に連結される選択マーカーは、ＧＦＰマーカーである。目的特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳに隣接するＩＲＥＳ及び２つの選択マーカーを含み、そのＩＲＥＳは第２の選択マーカーに機能的に連結される。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳに隣接するＩＲＥＳ及び３つの選択マーカーを含み、ＩＲＥＳは第３の選択マーカーに作用可能に連結されている。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳに隣接するＩＲＥＳ及び３つの選択マーカーを含み、ＩＲＥＳは第３の選択マーカーに作用可能に連結されている。特定の実施形態では、第３の選択マーカーは、第１又は第２の選択マーカーとは異なる。ある特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、プロモーターに作用可能に連結された第１の選択マーカー及びＩＲＥＳに作用可能に連結された第２の選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、ＳＶ４０プロモーターに作用可能に連結されたグルタミンシンテターゼ選択マーカー及びＩＲＥＳに作用可能に連結されたＧＦＰ選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターに作用可能に連結されたチミジンキナーゼ選択マーカー及びＨＹＧ選択マーカー並びにＩＲＥＳに作用可能に連結されたＧＦＰ選択マーカーを含む。
特定の実施形態において、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳを含む。特定の実施形態において、第３のＲＲＳは、第１と第２のＲＲＳの間に位置している。特定の実施形態では、３つのＲＲＳ全てが同一である。特定の実施形態において、第１及び第２のＲＲＳは同じであり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳとも第２のＲＲＳとも異なる。特定の実施形態では、３つのＲＲＳすべてが異なる。
特定の実施形態では、組込み部位として働く外因性ヌクレオチド配列は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の部位に存在する。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれる遺伝子座は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれる遺伝子座は、本開示の配列番号８～１１に対応する米国特許第９８１６１１０号の配列番号１～４、又は本開示の配列番号１２に対応する国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ ２０１７／０２８５５５号の配列番号１から選択される配列に少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれる遺伝子座は、Ｃｏｎｔｉｇｓ ＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１の番号が付された１～１，０００ｂｐ、１，０００～２，０００ｂｐ、２，０００～３，０００ｂｐ、３，０００～４，０００ｂｐ、及び４，０００～４，３０１ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号２の番号が付された１～１００，０００ｂｐ、１００，０００～２００，０００ｂｐ、２００，０００～３００，０００ｂｐ、３００，０００～４００，０００ｂｐ、４００，０００～５００，０００ｂｐ、５００，０００～６００，０００ｂｐ、６００，０００～７００，０００ｂｐ、及び７００，０００～７２８７８５ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号３の番号が付された１～１００，０００ｂｐ、１００，０００～２００，０００ｂｐ、２００，０００～３００，０００ｂｐ、３００，０００～４００，０００ｂｐ、及び４００，０００～４１３，９８３となるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号４の番号が付された１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、及び３０，０００～３０，７５７ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号５の番号が付された１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、３０，０００～４０，０００ｂｐ、４０，０００～５０，０００ｂｐ、５０，０００～６０，０００ｂｐ、及び６０，０００～６８，９６２ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号６の番号が付された１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、３０，０００～４０，０００ｂｐ、４０，０００～５０，０００ｂｐ、及び５０，０００～５１，３２６ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号７の番号が付された１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、及び２０，０００～２２，９０４ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。
特定の実施形態では、組込み外因性配列のすぐ５’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５及びそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択される。特定の実施形態では、組込み外因性配列のすぐ５’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
特定の実施形態では、組込み外因性配列のすぐ３’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７及びそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択される。特定の実施形態では、組込み外因性配列のすぐ３’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１～７及びそれと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に作用可能に連結される。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列に作用可能に連結されたヌクレオチド配列は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＳＯＩを含む。特定の実施形態では、作用可能に連結されたヌクレオチド配列は、ランダム組込みＳＯＩと比較して、ＳＯＩの発現レベルを増加させる。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ＳＯＩは、ランダム組込みＳＯＩよりも約２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２倍、３倍、５倍、又は１０倍高く発現される。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５並びにそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の５’側に隣接し、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７並びにそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の３’側に隣接する。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の５’側に隣接するヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同であり、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の３’側に隣接するヌクレオチド配列は、配列番号ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチドは、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される配列の全部又は一部にすぐ隣接する遺伝子座に組み込まれる。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１～７及びそれと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に隣接する。ある特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１～７及びそれと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択される配列から約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約５００ｂｐ、約１ｋｂ以内の距離にある。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１の番号が付与された１～１，０００ｂｐ、１，０００～２，０００ｂｐ、２，０００～３，０００ｂｐ、３，０００～４，０００ｂｐ、及び４，０００～４，３０１ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号２の番号が付与された１～１００，０００ｂｐ、１００，０００～２００，０００ｂｐ、２００，０００～３００，０００ｂｐ、３００，０００～４００，０００ｂｐ、４００，０００～５００，０００ｂｐ、５００，０００～６００，０００ｂｐ、６００，０００～７００，０００ｂｐ、及び７００，０００～７２８７８５ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号３の番号が付与された１～１００，０００ｂｐ、１００，０００～２００，０００ｂｐ、２００，０００～３００，０００ｂｐ、３００，０００～４００，０００ｂｐ、及び４００，０００～４１３，９８３となるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号４の番号が付与された１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、及び３０，０００～３０，７５７ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号５の番号が付与された１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、３０，０００～４０，０００ｂｐ、４０，０００～５０，０００ｂｐ、５０，０００～６０，０００ｂｐ、及び６０，０００～６８，９６２ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号６の番号が付与された１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、３０，０００～４０，０００ｂｐ、４０，０００～５０，０００ｂｐ、及び５０，０００～５１，３２６ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号７の番号が付与された１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、及び２０，０００～２２，９０４ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列の組込み部位を含む遺伝子座は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードしない。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列の組込み部位を含む遺伝子座は、シス作用性エレメント、例えば、プロモーター及びエンハンサーを含む。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列の組込み部位を含む遺伝子座は、遺伝子発現を増強する任意のシス作用性エレメント、例えばプロモーター及びエンハンサーを含まない。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子内における組込み部位に組み込まれる。内因性ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子には、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子の野生型及び全ての相同配列が含まれる。特定の実施形態では、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子の相同配列は、野生型ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同であり得る。ある特定の実施形態では、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子は、野生型哺乳動物ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子である。特定の実施形態では、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子は、野生型ヒトＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子である。特定の実施形態では、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子は、野生型ハムスターＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子である。
特定の実施形態では、組込み部位は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらの少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子に作用可能に連結される。特定の実施形態では、組込み部位は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらの少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子に隣接する。
表１は、例示的なＴＩ宿主細胞組込み部位を提供する。
Figure 2022538073000002
３．２ 目的の配列を含む外因性ヌクレオチド配列
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ、及び少なくとも１つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又はそれを超えるＳＯＩを含む。特定の実施形態では、ＳＯＩは同一である。特定の実施形態では、ＳＯＩは異なる。
上記のように、特定の実施形態では、ＳＯＩは、マルチサブユニットタンパク質複合体の１つ又は複数のサブユニットをコードする。特定の実施形態では、そのようなポリペプチド配列は、そのようなサブユニット配列の断片を含むことができる。特定の実施形態では、目的の配列は、そのようなサブユニット配列の組み合わせを含むことができる。例えば、限定するものではないが、そのような組み合わせは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個若しくはそれよりも多くの第１のサブユニット配列、及び／又は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個若しくはそれよりも多くの配列の第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０若しくはそれ以上のサブユニット配列を含むことができる。さらに、特定の実施形態では、そのような組み合わせは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個若しくはそれよりも多くの異なるバリエーションの第１のサブユニット配列、及び／又は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個若しくはそれよりも多くの異なるバリエーションの第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０若しくはそれよりも多くのサブユニット配列を含むことができる。
特定の実施形態では、ＳＯＩは、一本鎖抗体又はその断片をコードする。特定の実施形態では、ＳＯＩは、抗体重鎖配列又はその断片をコードする。特定の実施形態では、ＳＯＩは、抗体軽鎖配列又はその断片をコードする。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、抗体重鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩ、及び抗体軽鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１の抗体重鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩ、第２の抗体重鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩ、及び抗体軽鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１の抗体重鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩ、第２の抗体重鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩ、第１の抗体軽鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩ、及び抗体軽鎖配列又はその断片をコードする第２のＳＯＩを含む。特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖配列をコードするＳＯＩの数は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの所望の発現レベルを達成するように、例えば所望の量の二重特異性抗体生産を達成するように選択することができる。特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖配列をコードする個々のＳＯＩは、例えば、単一の組込み部位に存在する単一の外因性核酸配列に、単一の組込み部位に存在する複数の外因性核酸配列に、又はＴＩ宿主細胞内の異なる組込み部位に組み込まれた複数の外因性核酸配列に組み込まれ得る。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び１つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、ＲＲＳは、少なくとも１つの選択マーカー又は少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接して位置する。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ、及び２つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１と第２のＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。特定の実施形態では、選択マーカー及び外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、選択マーカー及び外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳは異なる。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、ＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。特定の実施形態では、ＬｏｘＰ Ｌ３配列は、選択マーカーの５’に位置し、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列は、選択マーカー及び外因性ＳＯＩの３’に位置する。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ及び２つの外因性ＳＯＩを含み、第３のＲＲＳは、第１と第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１のＳＯＩは、第１と第３のＲＲＳとの間に位置し、第２のＳＯＩは、第３と第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１と第２のＳＯＩは異なる。特定の実施形態において、第１及び第２のＲＲＳは同じであり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳとも第２のＲＲＳとも異なる。特定の実施形態では、３つのＲＲＳすべてが異なる。特定の実施形態では、第１のＲＲＳはＬｏｘＰ Ｌ３部位であり、第２のＲＲＳはＬｏｘＰ ２Ｌ部位であり、第３のＲＲＳはＬｏｘＦａｓ部位である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ、１つの外因性ＳＯＩ、及び１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、ＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３との間に位置し、選択マーカーは、第３と第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ、２つの外因性ＳＯＩ、及び１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、第１のＳＯＩ及び選択マーカーは、第１と第３のＲＲＳとの間に位置し、第２のＳＯＩは、第３と第２のＲＲＳとの間に位置する。
特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、抗体、酵素、サイトカイン、成長因子、ホルモン、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、ワクチンタンパク質、又は治療機能を有するタンパク質を含むがこれらに限定されない目的のポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、抗体又はその抗原結合断片をコードする。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）又はＦｃ融合タンパク質をコードする。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、少なくとも１つのシス作用性エレメント、例えば、プロモーター又はエンハンサーに作用可能に連結される。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、ＣＭＶプロモーターに作用可能に連結される。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳと、２つのＲＲＳの間に位置する少なくとも２つの外因性ＳＯＩとを含む。特定の実施形態では、抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、２つのＲＲＳの間に位置する。特定の実施形態では、抗体の１本の重鎖及び２本の軽鎖をコードするＳＯＩは、２つのＲＲＳの間に位置する。特定の実施形態では、抗体の重鎖及び軽鎖のコピーの異なる組み合わせをコードするＳＯＩは、２つのＲＲＳの間に位置する。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ及び少なくとも２つの外因性ＳＯＩを含み、第３のＲＲＳは、第１と第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＯＩは、第１と第３のＲＲＳとの間に位置し、少なくとも１つのＳＯＩは、第３と第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態において、第１及び第２のＲＲＳは同じであり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳとも第２のＲＲＳとも異なる。特定の実施形態では、３つのＲＲＳすべてが異なる。特定の実施形態では、第１の抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第１と第３のＲＲＳとの間に位置し、第２の抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第３と第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１の抗体の１本の重鎖及び２本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第１と第３のＲＲＳとの間に位置し、第２の抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１の抗体の１本の重鎖及び３本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第１と第３のＲＲＳとの間に位置し、第１の抗体の１本の軽鎖、並びに第２の抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１の抗体の１本の重鎖及び３本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第１と第３のＲＲＳとの間に位置し、第１の抗体の２本の軽鎖、並びに第２の抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、複数の抗体の重鎖及び軽鎖のコピーの異なる組み合わせをコードするＳＯＩは、第１と第３のＲＲＳとの間、並びに第３と第２のＲＲＳとの間に位置する。
４．宿主細胞
特定の実施形態では、宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である。
特定の実施形態では、宿主細胞は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されるような２９３又は２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒら，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるような、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、Ｙ０細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、及びＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞からなる群から選択される。
特定の実施形態では、宿主細胞は細胞株である。特定の実施形態では、宿主細胞は、ある特定の世代数にわたって培養された細胞株である。特定の実施形態では、宿主細胞は、初代細胞である。
特定の実施形態では、目的のポリペプチドの発現は、発現レベルが特定のレベルに維持され、１０、２０、３０、５０、１００、２００又は３００世代にわたって２０％未満で増加し、又は減少する場合に安定である。特定の実施形態では、培養物を選択せずに維持することができる場合、目的のポリペプチドの発現は安定である。特定の実施形態では、目的の遺伝子のポリペプチド産物が約１ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１２ｇ／Ｌ、約１４ｇ／Ｌ又は約１６ｇ／Ｌに達する場合、目的のポリペプチドの発現が高い。
特定の実施形態では、目的のポリペプチドが生産され、細胞培養培地中に分泌される。特定の実施形態では、目的のポリペプチドは宿主細胞内で発現し、保持される。特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、宿主細胞膜で発現され、挿入され、保持される。
目的の外因性ヌクレオチド又はベクターは、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション又は注入を含むが、これらに限定されない従来の細胞生物学的方法によって宿主細胞に導入され得る。特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチド又はベクターは、脂質ベースのトランスフェクション法、リン酸カルシウムベースのトランスフェクション法、カチオン性ポリマーベースのトランスフェクション法、又はナノ粒子ベースのトランスフェクションを含む化学ベースのトランスフェクション法によって宿主細胞に導入される。特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチドは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス媒介形質導入を含むがこれらに限定されないウイルス媒介形質導入によって、宿主細胞に導入される。特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチド又はベクターは、遺伝子銃媒介注入によって宿主細胞に導入される。特定の実施形態では、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子が、いずれも本明細書中に記載される方法を使用して宿主細胞に導入される。
５．標的化組込み
標的化組込み手法は、外因性ヌクレオチド配列が宿主細胞ゲノムの１つ以上の所定の部位に組み込まれることを可能にする。特定の実施形態では、標的化組込みは、１つ以上のＲＲＳを認識するリコンビナーゼによって媒介される。特定の実施形態において、標的化組込みは、相同組換えによって媒介される。特定の実施形態では、標的化組込みは、外因性部位特異的ヌクレアーゼ、続いてＨＤＲ及び／又はＮＨＥＪによって媒介される。
５．１．リコンビナーゼ媒介性組換えによる標的化組込み
「リコンビナーゼ認識配列」（ＲＲＳ）は、リコンビナーゼによって認識され、リコンビナーゼ媒介性組換え事象のために必要かつ十分である、ヌクレオチド配列である。ＲＲＳを用いて、組換え事象が起こると考えられるヌクレオチド配列中の位置を定めることができる。
特定の実施形態において、ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択される。
特定の実施形態において、ＲＲＳは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、ＲＲＳは、ＦＬＰリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、ＲＲＳは、Ｂｘｂ１インテグラーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、φＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。
ＲＲＳがＬｏｘＰ部位である場合の特定の実施形態では、宿主細胞は、組換えを実施するためにＣｒｅリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＦＲＴ部位である場合の特定の実施形態では、宿主細胞は、組換えを実施するためにＦＬＰリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＢｘｂ１ ａｔｔＰ又はＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位である場合の特定の実施形態では、宿主細胞は、組換えを実施するためにＢｘｂ１インテグラーゼを必要とする。ＲＲＳがφＣ３１ ａｔｔＰ又はφＣ３１ ａｔｔＢ部位である場合の特定の実施形態では、宿主細胞は、組換えを実施するためにφＣ３１インテグラーゼを必要とする。リコンビナーゼを、該酵素のコード配列を含む発現ベクターを使用して、宿主細胞に導入することができる。
Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ部位特異的組換え系は、多くの生物学的実験系において広く使用されている。Ｃｒｅは、３４ｂｐのＬｏｘＰ配列を認識する、３８ｋＤａの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼである。ＣｒｅはバクテリオファージＰ１に由来し、チロシンファミリーの部位特異的リコンビナーゼに属する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＬｏｘＰ配列間の分子内組換えと分子間組換えの両方を媒介することができる。ＬｏｘＰ配列は、２つの１３ｂｐの逆方向反復に挟まれた８ｂｐの非パリンドロームコア領域で構成されている。Ｃｒｅリコンビナーゼは１３ｂｐの反復に結合し、それによって８ｂｐのコア領域内での組換えを媒介する。Ｃｒｅ－ＬｏｘＰの媒介による組換えは、高効率で起こり、いかなる他の宿主因子も必要としない。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上に同じ向きで配置されている場合、Ｃｒｅの媒介による組換えは、それら２つのＬｏｘＰ配列の間に位置するＤＮＡ配列を、共有結合的に閉じた環として切除する。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上に逆向きの位置で配置されている場合、Ｃｒｅの媒介による組換えは、それら２つの配列の間に位置するＤＮＡ配列の向きを逆にする。ＬｏｘＰ配列を異なる染色体上に配置して、異なる染色体間の組換えを促進することもできる。２つのＬｏｘＰ配列が２つの異なるＤＮＡ分子上に存在する場合、かつ一方のＤＮＡ分子が環状である場合、Ｃｒｅの媒介による組換えの結果、環状ＤＮＡ配列の組込みが生じる。
特定の実施形態において、ＬｏｘＰ配列は、野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態において、ＬｏｘＰ配列は、変異ＬｏｘＰ配列である。変異ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅの媒介による組込み又は置換の効率を高めるために開発された。特定の実施形態において、変異ＬｏｘＰ配列は、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、及びＬｏｘ６６配列からなる群から選択される。例えば、Ｌｏｘ７１配列は、左の１３ｂｐ反復中で５ｂｐが変異している。Ｌｏｘ６６配列は、右の１３ｂｐ反復中で５ｂｐが変異している。野生型ＬｏｘＰ配列も変異ＬｏｘＰ配列も、Ｃｒｅに依存した組換えを媒介することができる。
ＦＬＰ－ＦＲＴ部位特異的組換えシステムは、Ｃｒｅ－Ｌｏｘシステムに類似している。それは、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２μｍプラスミドに由来するフリッパーゼ（ＦＬＰ）リコンビナーゼを含む。ＦＬＰはまた、チロシンファミリー部位特異的リコンビナーゼに属する。ＦＲＴ配列は、各々が８ｂｐのスペーサーに隣接する１３ｂｐの２つの回文配列からなる３４ｂｐの配列である。ＦＬＰは、１３ｂｐの回文配列に結合し、８ｂｐスペーサー内のＤＮＡ切断、交換及びライゲーションを媒介する。Ｃｒｅリコンビナーゼと同様に、２つのＦＲＴ配列の位置及び配向によって、ＦＬＰ媒介性組換えの結果が決定される。特定の実施形態では、ＦＲＴ配列は、野生型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、ＦＲＴ配列は、変異体ＦＲＴ配列である。野生型及び変異体のＦＲＴ配列は、いずれもＦＬＰ依存性組換えを媒介し得る。特定の実施形態では、ＦＲＴ配列は、限定されないが、タモキシフェン応答性受容体ドメイン配列などの応答性受容体ドメイン配列に融合される。
Ｂｘｂ１及びφＣ３１はセリンリコンビナーゼファミリーに属する。それらはいずれもバクテリオファージに由来し、溶原性を確立して細菌ゲノムへのファージゲノムの部位特異的組込みを促進するためにこれらのバクテリオファージによって使用される。これらのインテグラーゼは、ａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列と呼ばれる短い（４０～６０ｂｐ）ＤＮＡ基質間の部位特異的組換え事象を触媒し、その配列は、それぞれファージＤＮＡ及び細菌ＤＮＡ上に位置する元々の付着部位である。組換え後、２つの新しい配列が形成され、これらはａｔｔＬ配列及びａｔｔＲ配列と呼ばれ、各々がａｔｔＰ及びａｔｔＢに由来する半分の配列を含む。組換えはまた、ａｔｔＬ配列とａｔｔＲ配列との間で起こり、組み込まれたファージを細菌ＤＮＡから切り出し得る。両方のインテグラーゼは、さらなる宿主因子の助けを借りずに組換えを触媒し得る。補助因子が全く存在しない場合、これらのインテグラーゼは、ａｔｔＰとａｔｔＢとの間の一方向性の組換えを８０％の効率で媒介する。これらのインテグラーゼによって認識され得る短いＤＮＡ配列及び一方向性組換えのために、これらの組換えシステムは、遺伝目的のために広く使用されているＣｒｅ－ＬｏｘＰ系及びＦＲＴ－ＦＬＰ系の補完物として開発された。
用語「一致ＲＲＳ」とは、２つのＲＲＳ間で組換えが起こることを示す。特定の実施形態において、２つの一致ＲＲＳは、同じである。特定の実施形態において、どちらのＲＲＳも、野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態において、どちらのＲＲＳも、変異ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態において、どちらのＲＲＳも、野生型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態において、どちらのＲＲＳも、変異ＦＲＴ配列である。特定の実施形態において、２つの一致ＲＲＳは、互いに異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、第１の一致ＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の一致ＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、第１の一致するＲＲＳは、φＣ３１ａｔｔＢ配列であり、第２の一致するＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＢ配列である。
特定の実施形態では、「単一ベクターＲＭＣＥ」戦略が使用される。例えば、特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は２つのＲＲＳを含み、ベクターは、組込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含む、すなわち、組込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳが、ベクター上の第１のＲＲＳと一致し、組込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳが、ベクター上の第２のＲＲＳと一致する。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳ及びベクター上の第１のＲＲＳは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳ及びベクター上の第２のＲＲＳと同一である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳ及びベクター上の第１のＲＲＳは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳ及びベクター上の第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳ及びベクター上の第１のＲＲＳは、いずれもＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳ及びベクター上の第２のＲＲＳは、いずれもＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。
特定の実施形態では、「２ベクターＲＭＣＥ」戦略が使用される。例えば、限定されるわけではないが、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ、例えば、第３のＲＲＳ（「ＲＲＳ３」）が第１のＲＲＳ（「ＲＲＳ１」）と第２のＲＲＳ（「ＲＲＳ２」）の間に存在する並びを含むことができ、第１のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳ及び第３のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含み、第２のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第３のＲＲＳ及び第２のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含む。このような２ベクターＲＭＣＥ戦略では、ＲＲＳの各対間に適切な数のＳＯＩを組み込むことにより、１０個のＳＯＩの導入が可能になる。
単一ベクター及び２ベクターＲＭＣＥはいずれも、１つ以上のドナーＤＮＡ分子を宿主細胞ゲノムの所定の部位に一方向に組み込み、ドナーＤＮＡ上に存在するＤＮＡカセットを、組込み部位が存在する宿主ゲノム上のＤＮＡカセットとの正確な交換を可能にする。ＤＮＡカセットは、少なくとも１つの選択マーカー（ただし、特定の２ベクターＲＭＣＥの例では、本明細書で概説するように「分割選択マーカー」を使用できる）、及び／又は少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを特徴とする。ＲＭＣＥは、二重組換え乗換え事象を伴い、この事象は、リコンビナーゼによって触媒され、標的ゲノム遺伝子座内の２つの異種特異的ＲＲＳとドナーＤＮＡ分子の間で起こる。ＲＭＣＥは、ＳＯＩ又は選択マーカーのコピーを宿主細胞ゲノムの所定の遺伝子座に導入するように設計されている。たった１回のクロスオーバーイベントを伴う組換えとは異なり、ＲＭＣＥは、原核生物のベクター配列が宿主細胞のゲノムに導入されないように実行できるため、宿主の免疫又は防御機構の望ましくないトリガーを低減及び／又は防止する。ＲＭＣＥ手順は、複数のＤＮＡカセットを用いて繰り返すことができ、例えば、図２Ｂでは、ＲＭＣＥ手順を用いて３つの別個の「フロント」カセット及び３つの別個の「バック」カセットの導入を容易にする。しかしながら、上記のように、ＲＭＣＥ（及び他の組込み戦略）を使用して、わずか１つのカセット及び１０個以上ものカセットを導入することができる。
特定の実施形態では、標的化組込みは、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ又は少なくとも１つの選択マーカーに隣接する１つのＲＲＳを含む１つの外因性ヌクレオチド配列が宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込まれる１つの交差組換え事象によって達成される。特定の実施形態では、標的化組込みは、１回のＲＭＣＥによって達成され、２つの異種特異的ＲＲＳに隣接する少なくとも外因性ＳＯＩ又は少なくとも１つの選択マーカーを含むＤＮＡカセットが、宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、標的化組込みは、２回のＲＭＣＥによって達成され、２つの異種特異的ＲＲＳに隣接する少なくとも外因性ＳＯＩ又は少なくとも１つの選択マーカーをそれぞれ含む、２つの異なるＤＮＡカセットがいずれも、宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、標的化組込みは、複数回のＲＭＣＥによって達成され、２つの異種特異的ＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩ又は少なくとも１つの選択マーカーをそれぞれ含む、複数のベクター由来のＤＮＡカセットが、宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、選択マーカーは、両方のＲＭＣＥの組込みが選択マーカーの発現を可能にするように、第１のベクター上で部分的にコードされ、第２のベクター上で部分的にコードされ得る。
特定の実施形態では、リコンビナーゼ媒介性組換えを介した標的化組込みは、原核生物ベクターに由来し、宿主細胞ゲノムの１つ以上の所定の組込み部位に組み込まれる、選択マーカー又は１つ以上の外因性ＳＯＩをもたらす。特定の実施形態では、リコンビナーゼ媒介性組換えを介した標的化組込みは、原核生物ベクターからの配列を含まない宿主細胞ゲノムの１つ以上の所定の組込み部位に組み込まれる、選択マーカー又は１つ以上の外因性ＳＯＩをもたらす。
５．２ 相同組換え、ＨＤＲ又はＮＨＥＪを介した標的化組込み
本開示の主題はまた、相同組換えによって、又は外因性部位特異的ヌクレアーゼとそれに続くＨＤＲ若しくはＮＨＥＪによって媒介される標的化組込みに関する。特定の実施形態では、そのような組込みは、本明細書では「遺伝子編集媒介性組込み」と呼ばれる。
相同組換えは、広範な配列相同性を共有するＤＮＡ分子間の組換えである。それは、二本鎖ＤＮＡ切断のエラーのない修復を誘導するために使用することができ、減数分裂中に配偶子の配列多様性を生成する。相同組換えは、２つの相同ＤＮＡ分子間の遺伝情報の交換を伴うので、染色体上の遺伝子の全体的な配置を変化させるわけではない。相同組換えの間、ニック又は切断が二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に形成され、続いて一本鎖ＤＮＡ末端による相同ｄｓＤＮＡ分子の侵入、相同配列の対形成、ホリディジャンクションを形成するための分岐移動、及び最終的なホリディ接合部の分離が起こる。
二本鎖切断（ＤＳＢ）は、ＤＮＡ損傷の最も深刻な形態であり、そのようなＤＮＡ損傷の修復は、全ての生物におけるゲノム完全性の維持に不可欠である。ＤＳＢを修復するためには２つの主な修復経路がある。第１の修復経路は相同組換え修復（ＨＤＲ）経路であり、相同組換えはＨＤＲの最も一般的な形態である。ＨＤＲは細胞内に存在する相同ＤＮＡの存在を必要とするので、この修復経路は通常、細胞周期のＳ期及びＧ２期において活性であり、新しく複製された姉妹染色分体が相同鋳型として利用可能である。ＨＤＲはまた、ＤＮＡ複製中に崩壊した複製フォークを修復するための主要な修復経路である。ＨＤＲは、比較的エラーのない修復経路と考えられている。ＤＳＢの第２の修復経路は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）である。ＮＨＥＪは、相同ＤＮＡ鋳型を必要とせずに、切断されたＤＮＡの末端が一緒に連結される修復経路である。
標的化組込みは、外因性部位特異的ヌクレアーゼ、例えば遺伝子編集ヌクレアーゼに続いてＨＤＲによって促進され得る。これは、特定の標的ゲノム部位にＤＳＢを導入することにより、相同組換えの頻度を高めることができるためである。特定の実施形態では、外因性ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、及びクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択され得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ及びＴＡＬＥＮシステムは、最も容易な構築及び高効率を提供する２つのゲノム編集ツールである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、侵入バクテリオファージに対する細菌の免疫防御機構として同定された。Ｃａｓは、合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって誘導されると、細胞内の特定のヌクレオチド配列と会合し、例えば一本鎖切断、ＤＳＢ、及び／又は点突然変異の１つ又は複数を行なうことによって、そのヌクレオチド配列内又はその周囲のＤＮＡを編集し得るヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮは、操作された部位特異的ヌクレアーゼであり、ＴＡＬＥ（転写活性化因子様エフェクター）のＤＮＡ結合ドメイン及び制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインから構成される。ＤＮＡ結合ドメインのモノマーの高度可変残基領域に存在するアミノ酸を変化させることによって、様々なヌクレオチド配列を標的とする異なる人工ＴＡＬＥＮを作製することができる。ＤＮＡ結合ドメインはその後、ヌクレアーゼを標的配列に指向させ、ＤＳＢを作成する。
相同組換え又はＨＤＲによる標的化組込みは、組込み部位に対する相同配列の存在を含む。特定の実施形態では、相同配列は、ベクター上に存在する。特定の実施形態では、相同配列は、ポリヌクレオチド上に存在する。
特定の実施形態では、相同組換えは、補助因子を何ら用いることとなく実施される。特定の実施形態では、相同組換えは、組込み可能なベクターの存在によって促進される。特定の実施形態では、組込みベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター及び組込みファージベクターからなる群から選択される。
５．３ 調節されたシステム
本開示の主題はまた、「ランダム化された構成の制御された標的化組込み」（本明細書では「ランダム化された鎖の制御された標的化組込み」とも呼ばれる）（「ＲＣＲＴＩ」）として知られる、ＲＣＴＩで使用するための制御されたシステムに関する。例えば、主にコードされるタンパク質が発現しにくいために、タンパク質発現レベルが最適ではない場合が多い。発現困難なタンパク質の発現レベルが低いのは、原因が多様であり、原因を特定するのが困難であり得る。１つの可能性は、宿主細胞中で発現するタンパク質の毒性である。そのような場合、調節された発現系を使用して、タンパク質をコードする目的の配列が誘導性プロモーターの制御下にある毒性タンパク質を発現させることができる。これらの系では、発現困難なタンパク質の発現は、制御因子、例えば、限定されないが、テトラサイクリン又はその類似体、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）などの小分子が培養物に添加された場合にのみ促進される。毒性タンパク質の発現を調節することにより、毒性作用を軽減することができ、培養物が生産前に所望の細胞増殖を達成することを可能にする。特定の実施形態では、「ランダム化された構成の制御された標的化組込み」（本明細書では「ランダム化された鎖の制御された標的組込み」とも呼ばれる）（ＲＣＲＴＩ）システムは、特定の遺伝子座、例えば１つ又は複数のＲＲＳを含む外因性核酸配列に組み込まれ、それに作用可能に連結された制御プロモーター下で転写されるＳＯＩを含む。特定の実施形態では、ＲＣＲＴＩシステムを使用して、限定されないが、抗体などの発現困難分子の低タンパク質発現の根本原因を決定することができる。特定の実施形態では、ＲＣＲＴＩシステムにおけるＳＯＩの発現を選択的に停止する能力を使用して、ＳＯＩの発現を観察された有害作用に結び付けることができる。
特定の実施形態では、発現困難分子の根本原因分析中の転写及び細胞株変動の影響を最小限に抑えるために、「ランダム化された構成の制御された標的組込み」（本明細書では「ランダム化された鎖の制御された標的組込み」とも呼ばれる）（ＲＣＲＴＩ）システムを使用することができる。例えば、限定するものではないが、ＴＩ宿主におけるＳＯＩの発現は、調節因子、例えばドキシサイクリンの培養物への添加によって誘導され得る。特定の実施形態では、ＲＣＲＴＩベクターは、テトラサイクリン調節プロモーターを利用してＳＯＩを発現し、これは、例えば、ＲＲＳを含む外因性核酸配列に組み込むことができ、ＲＲＳ自体は宿主細胞のゲノム内の組込み部位に組み込まれ、ＳＯＩの調節された発現を可能にする。
特定の実施形態では、本開示に記載されるＲＣＲＴＩシステムを使用して、対照細胞株と比較して、ＳＯＩ、例えば治療用抗体の低タンパク質発現の根本原因が首尾よく決定され得る。特定の実施形態では、ＲＣＲＴＩ細胞株におけるＳＯＩ、例えば治療用抗体の発現が相対的に低いことが確認されると、タンパク質翻訳阻害剤処理、例えばＤｏｘ及びシクロヘキシミドを活用することによって、ＳＯＩの細胞内蓄積及び分泌レベルが評価され得る。
例えば、限定するものではないが、そのような調節は、転写抑制因子又は活性化因子と構成的又は最小プロモーターとの調節されたカップリングによってｍＲＮＡ合成を遮断又は活性化するための遺伝子スイッチに基づき得る。特定の非限定的な実施形態では、抑制は、例えば、タンパク質が転写開始を立体的にブロックするリプレッサータンパク質に結合することによって、又は転写サイレンサーを介して転写を能動的に抑制することによって達成され得る。特定の非限定的な実施形態では、哺乳動物又はウイルスのエンハンサーレス最小プロモーターの活性化は、活性化ドメインへの調節されたカップリングによって達成され得る。
特定の実施形態では、転写抑制因子又は転写活性化因子の条件的カップリングは、外部刺激に応答してプロモーターに結合するアロステリックタンパク質を使用することによって達成され得る特定の実施形態では、転写抑制因子又は転写活性化因子の条件付きカップリングは、隔離タンパク質から放出されることで、標的プロモーターに結合し得る細胞内受容体を使用することによって達成され得る。特定の実施形態では、転写抑制因子又は転写活性化因子の条件付きカップリングは、化学的に誘導された二量体化剤を使用することによって達成され得る。
特定の実施形態では、本開示のＴＩ系で使用されるアロステリックタンパク質は、抗生物質、細菌クオラムセンシングメッセンジャー、異化産物、又は温度、例えば低温若しくは熱などの培養パラメータに応答して転写活性を調節するタンパク質であり得る。特定の実施形態では、そのようなＲＣＲＴＩシステムは、例えば、代替炭素源の異化遺伝子を抑制する細菌抑制因子が哺乳動物細胞に移入されている異化産物に基づくものであり得る。特定の実施形態では、標的プロモーターの抑制は、リプレッサーＣｙｍＲのクマート（ｃｕｍａｔｅ）応答性結合によって達成され得る。ある特定の実施形態では、異化産物に基づくシステムは、単純ヘルペスＶＰ１６転写活性化ドメインに融合した、原核生物リプレッサーＨｄｎｏＲの６－ヒドロキシニコチン応答性結合によるキメラプロモーターの活性化に依存し得る。
特定の実施形態では、ＴＩシステムは、クオラムセンシング分子による集団内及び集団間のコミュニケーションを管理する原核生物に由来するクオラムセンシングベースの発現系であり得る。これらのクオラムセンシング分子は、標的細胞中の受容体に結合し、同族プロモーターに対する受容体の親和性を調節し、特異的レギュロンスイッチの開始をもたらす。特定の実施形態では、クオラムセンシング分子は、Ｎ－（３－オキソ－オクタノイル）－ホモセリンラクトンであり得、その存在下で、ＴｒａＲ－ｐ６５融合タンパク質が、ＴｒａＲ特異的オペレータ配列に融合した最小プロモーターからの発現を活性化する。特定の実施形態では、クオラムセンシング分子は、ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）ＳＣＢ１の非存在下でその同族オペレータＯＳｃｂＲに結合するＳｃｂＲリプレッサーに基づく系におけるブチロラクトンＳＣＢ１（ラセミ体２－（１’－ヒドロキシ－６－メチルヘプチル）－３－（ヒドロキシメチル）ブタノリド）であり得る。特定の実施形態では、クオラムセンシング分子は、ＲＴＩシステムで使用されるホモセリン由来誘導因子であり得、緑膿菌クオラムセンシング抑制因子ＲｈｌＲ及びＬａｓＲがＳＶ４０ Ｔ抗原核局在化配列及び単純ヘルペスＶＰ１６ドメインに融合され、特定のオペレータ配列（ｌａｓボックス）を含むプロモーターを活性化し得る。
特定の実施形態では、本開示のＲＣＲＴＩシステムで使用されるアロステリックタンパク質を調節する誘導分子は、クマート、イソプロピル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、マクロライド、６－ヒドロキシニコチン、ドキシサイクリン、ストレプトグラミン、ＮＡＤＨ、テトラサイクリンであり得るが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本開示のＲＣＲＴＩシステムで使用される細胞内受容体は、細胞質又は核受容体であり得る。特定の実施形態では、本開示のＲＣＲＴＩシステムは、小分子を使用することにより、タンパク質の捕捉及び阻害からの転写因子の放出を利用し得る。特定の実施形態では、本開示のＲＣＲＴＩシステムは、ステロイド調節に依存し得、ホルモン受容体は、サイトゾルにおいてＨＳＰ９０から放出され得る天然又は人工の転写因子に融合され、核内に移動し、選択されたプロモーターを活性化する。特定の実施形態では、内因性ステロイドホルモンによるクロストークを回避するために、合成ステロイド類似体によって調節される変異体受容体を使用し得る。特定の実施形態では、受容体は、４－ヒドロキシタモキシフェンに応答性のエストロゲン受容体バリアント又はＲＵ４８６によって誘導可能なプロゲステロン受容体変異体であり得る。特定の実施形態では、ヒト核ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）に基づく核受容体由来ロシグリタゾン応答性転写スイッチが、本開示のＲＣＲＴＩシステムで使用され得る。特定の実施形態では、ステロイド応答性受容体のバリアントは、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈであり得、改変されたＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａエクジソン受容体及びＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン及びＶＰ１６トランス活性化因子に融合されたマウスレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）に基づく。合成エクジソンの存在下では、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈバリアントは、Ｇａｌ４応答エレメントのいくつかの反復配列に融合した最小プロモーターに結合し、これを活性化し得る。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるＲＣＲＴＩシステムは、同族オペレータと融合した最小コアプロモータの活性化のために、ＤＮＡ結合タンパク質の化学的に誘導された二量体化及び転写活性化因子を利用し得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるＲＣＲＴＩシステムは、ＦＲＢとＦＫＢＰのラパマイシン調節二量体化を利用し得る。この系では、ＦＲＢはｐ６５トランス活性化因子に融合され、ＦＫＢＰは、操作された最小インターロイキン－１２プロモーターの上流に配置される同族オペレータ部位に特異的なジンクフィンガードメインに融合される。特定の実施形態では、該ＦＫＢＰは変異され得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるＲＣＲＴＩシステムは、細菌ジャイレースＢサブユニット（ＧｙｒＢ）を利用し得、ＧｙｒＢは抗生物質クーママイシンの存在下で二量体化し、ノボビオシンで解離する。
特定の実施形態では、本開示のＲＣＲＴＩシステムは、調節されたｓｉＲＮＡ発現のために使用され得る。特定の実施形態では、調節されたｓｉＲＮＡ発現システムは、テトラサイクリン、マクロライド、又はＯＦＦ型及びＯＮ型ＱｕｏＲｅｘ系であり得る。特定の実施形態では、ＲＴＩシステムは、５’非翻訳領域にヘアピン構造を形成することによって翻訳開始をブロックするＸｅｎｏｐｕｓ末端オリゴピリミジン要素（ＴＯＰ）を利用し得る。
特定の実施形態では、本開示に記載されるＲＣＲＴＩシステムは、気相制御発現、例えばアセトアルデヒド誘導調節（ＡＩＲ）システムを利用し得る。ＡＩＲシステムは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのＡｌｃＲ転写因子を使用し得、非毒性濃度の気体又は液体のアセトアルデヒドの存在下で、最小ヒトサイトメガロウイルスのプロモーターに融合したＡｌｃＲ特異的なオペレータから組み立てられたＰＡＩＲプロモーターを特異的に活性化する。
特定の実施形態では、本開示のＲＣＲＴＩシステムは、Ｔｅｔ－Ｏｎ又はＴｅｔ－Ｏｆｆシステムを利用し得る。そのようなシステムでは、１つ以上のＳＯＩの発現は、テトラサイクリン又はその類似体であるドキシサイクリンによって調節され得る。
特定の実施形態では、本開示のＲＣＲＴＩシステムは、ＰＩＰオン又はＰＩＰオフシステムを利用し得る。そのようなシステムでは、ＳＯＩの発現は、例えば、プリスチナマイシン、テトラサイクリン及び／又はエリスロマイシンによって調節され得る。
６．産物
本開示の宿主細胞は、任意の目的の分子の発現のために使用され得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、ポリペプチド、例えば哺乳動物のポリペプチドの発現のために使用され得る。このようなポリペプチドの非限定的な例としては、ホルモン、受容体、融合タンパク質、調節因子、成長因子、補体系因子、酵素、凝固因子、抗凝固因子、キナーゼ、サイトカイン、ＣＤタンパク質、インターロイキン、治療用タンパク質、診断用タンパク質、及び抗体が挙げられる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を、構成的に又は調節して、目的の治療用タンパク質又は分子を発現させながら、シャペロン、タンパク質修飾酵素、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ又は他のタンパク質若しくはペプチド発現のために使用し得る。
特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、二重特異性、三重特異性又は多重特異性ポリペプチド、例えば二重特異性抗体である。
本開示の宿主細胞は、従来の細胞培養法で使用されている細胞、例えば非ＴＩ細胞と比較して、より短い時間枠で、目的の分子を、大量に生産するのに用いることができる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、従来の細胞培養法で使用される細胞、例えば非ＴＩ細胞と比較して、目的の分子の品質を改善するために用いられ得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、細胞ストレス及びクローン不安定性を経時的に引き起こし得る産物によって引き起こされ得る慢性毒性を防止することによってシードトレイン安定性を高めるために使用され得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、急性毒性産物の最適発現に使用され得る。
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞及びシステムは、細胞培養プロセスの最適化及び／又はプロセス開発に使用され得る。
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を、治療分子の選択されたサブユニットの構成的発現及び同じ治療分子の他の異なるサブユニットの調節された発現のために使用し得る。特定の実施形態では、治療分子は、融合タンパク質であり得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を使用して、完全に組み立てられた抗体分子の発現及び分泌における各抗体サブユニットの役割及び効果を理解し得る。
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、調査ツールとして使用され得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、様々な細胞における問題のある分子の低タンパク質発現の根本原因を突き止めるための診断ツールとして使用され得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を使用して、観察された現象又は細胞挙動を細胞における導入遺伝子発現に直接結び付け得る。本開示の宿主細胞はまた、観察された挙動が細胞において可逆的であるか否かを実証するために使用され得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を利用して、細胞における導入遺伝子の転写及び発現に関する問題を同定及び緩和し得る。
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、発現困難な分子の導入遺伝子サブユニット、例えば、これらに限定されないが、抗体のＨＣ及びＬＣサブユニットなどを、システム中の平均分子のものと交換して、問題となるサブユニットを同定するために使用され得る。特定の実施形態では、次いで、アミノ酸配列分析を使用して、低タンパク質発現に関与し得るアミノ酸残基又は領域を絞り、それに焦点を合わせ得る。
材料及び方法
細胞培養
ＣＨＯ－Ｋ１株（Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ｙ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ２０１３，２９，１３０７－１３１５）由来の宿主細胞株への抗体をコードするカセットの標的化組込みによって、安定した細胞株の発達を行った。細胞を、１２５ｍＬ振盪フラスコ中１５０ｒｐｍで、又は５０ｍＬチューブスピンバイオリアクタ中２２５ｒｐｍで、３７℃及び５％ ＣＯ２の独自の培地で培養した。培養細胞を４×１０５細胞／ｍＬの播種密度で３～４日ごとに継代した。
分子Ｘを発現するＲＣＴＩクローンのベクター構成を決定するためのＰＣＲ反応
ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅキット（ｃａｔ＃６９５０６、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて２×１０６細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑマスターミックス（カタログ番号Ｍ ０２８７、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてＰＣＲを行った。熱サイクリングのパラメータ：９４℃で３分間、４０×（９４℃で３０秒、６０℃で１分間、及び６５℃で９．７５分間）及び６５℃で２０分間。ＰＣＲ産物の診断上の消化物を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製の酵素を用いて行った。ＰＣＲには以下のプライマーを使用した：フォワードプライマー：ＧＧＴＴＣＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＡＴＡＣＣＴＣＧＴＡＡＧ；リバースプライマー：ＧＣＧＧＧＡＣＴＡＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴ．
振盪フラスコ流加及びＡｍｂｒＴＭバイオリアクタ生成アッセイ
モノクローナル抗体Ａ（「ｍＡｂ Ａ」）及び分子Ｚを発現するクローンの供給バッチ評価を、１４日間の製造プロセスにおいて、独自の化学的に定義された培地を使用して振盪フラスコ中で行った。細胞を０日目に１×１０６細胞／ｍＬで播種し、培養物を３日目に３７℃から３５℃までに温度シフトさせて、化学的に定義された成分の独自のブレンドからなるボーラス・フィードを３、７、及び１０日目に添加した。生存率及び生細胞数をＶｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により測定し、乳酸及びグルコースレベルを、Ｎｏｖａ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ４００（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用してアッセイした。
分子Ｙを発現するクローンの評価のために、以下の修正を加えて、記載されているように（Ｈｓｕ，Ｗ．Ｔ．ら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１２，６４，６６７－６７８）、ａｍｂｒＴＭシステム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で１４日間の生産培養を行った：接種株を振盪フラスコに１×１０６細胞／ｍＬで３７℃及び１５０ｒｐｍで４日間播種した。生産培養物を２×１０６細胞／ｍＬで接種し、最初に３６℃に維持し、続いて６日目に３５℃に温度シフトさせた。化学的に定義された成分の独自のブレンドからなるボーラス・フィードを３、６、８、及び１０日目に添加した。生存率及び細胞数をＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ Ｆｌｅｘ ２（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）で測定した。ｐＨ、ｐＯ２、ｐＣＯ２、グルコース、乳酸及び他の代謝産物をＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ Ｆｌｅｘ ２（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）又はＡＢＬ９０ Ｆｌｅｘ（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ）のいずれかでアッセイした。
力価及び製品品質の分析アッセイ
ＵＶ検出を伴うタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィを使用して、力価を測定した。サイズ及び電荷変種を、それぞれプロテインＡ ＰｈｙＴｉｐ精製（ＰｈｙＮｅｘｕｓ）、引き続いてサイズ排除クロマトグラフィ及びイメージング・キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）によって測定した。フィチウム精製試料をカルボキシペプチダーゼＢで処理した後、ｉｃＩＥＦによる分析を行った。分子Ｙについては、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を使用して、記載されているように（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ａ．Ｊ．ら、Ｉｎｄ Ｅｎｇ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ ２０１７，５６，１７１３－１７２２）、正しく組み立てられたヘテロ二量体、ホモ二量体、半抗体及び軽鎖ミスペア種の相対量を定量した。
現在のトランスフェクション（ＴＦＸ）戦略とＲＣＴＩのためのＴＦＸ戦略との比較
モノクローナル抗体Ａ（「ｍＡｂ Ａ」）（図１１Ａ）を生産する安定な細胞株を、「ランダム化された構成標的化組込み」（本明細書では「ランダム化された鎖標的化組込み」とも呼ばれる）アプローチを使用して作製した。このアプローチでは、それぞれがｍＡｂ Ａ重鎖又は軽鎖配列リピートの３つの可能な組み合わせのうちの１つを含む３つの「フロント」及び３つの「バック」発現ベクターのライブラリを使用して宿主細胞をトランスフェクトした。本実施例で使用される場合、「フロント」及び「バック」発現ベクターへの言及は、目的の外因性配列の２ベクターＲＣＭＥに基づく導入の文脈における上流（フロント）及び下流（バック）カセット部位を指す。２ベクターＲＣＭＥに基づく戦略に関するさらなる詳細については、例えば、上記のセクション５．１を参照されたい。上位のクローンは３．４～４．７ｇ／Ｌの力価を生産し、力価、生産性、細胞培養性能、製品品質及びフローサイトメトリー集団不均一性に基づいて選択した。
ｍＡｂ Ａに対する以前の細胞株開発（ＣＬＤ）の努力と比較して、本明細書中に記載のＲＣＴＩ ＣＬＤ法は、より少ないＣＬＤサイクルでより少ないクローンをスクリーニングしながらも、標準的なＣＬＤ法によって生産されたクローンと同等の力価、製品品質、及び生産培養性能を有するクローンを生産した。
ｍＡｂ Ａに対する以前のＣＬＤの取り組みでは、独立した標準的なＣＬＤ法のワークフローにおけるフロントベクター及びバックベクターの個々の組み合わせが試験されている（図２Ａを参照）。フロントベクター及びバックベクターの構成の合計で７つの組み合わせをトランスフェクトし、プール生産によって評価した。これらの７つのベクターの組み合わせのうち、４つを、ＳＣＣ及びプール生産力価に基づくクローン評価のために進めた。したがって、４つの独立したＣＬＤサイクルを３つの追加の部分的ＣＬＤサイクルと共に実施し、３つの追加のベクターの組み合わせをトランスフェクトし、プール生産によって評価した。
比較すると、ＲＣＴＩ ＣＬＤ法について単一のＣＬＤサイクルが実行された。表１は、各方法について評価されたクローンの数を要約し、図２Ａ及び２Ｂは、ｍＡｂ Ａクローン評価のためのＲＣＴＩ及び標準的なＣＬＤワークフローの比較を示す。
表１．標準的なＣＬＤ対ＲＣＴＩ ＣＬＤに関するスクリーニングされたクローンの概要
Figure 2022538073000003
ＲＣＴＩ ＣＬＤ法については、３段階の回収でのトランスフェクトされたプールに対応する３つの実験アームを評価した：（ｉ）初期（トランスフェクション後５日目、選択培地に選別）、（ｉｉ）中期（選択後に約３５％の生存率まで回収されたクローン）、又は（ｉｉｉ）完全（選択後に＞９０％の生存率まで回収されたクローン）（図６Ａ参照）。ＲＣＴＩ ＣＬＤ法を標準的なＣＬＤ法と比較する目的で、標準的なＣＬＤが９０％超の生存率のプールについてＳＣＣを指定しているので、第３のアームからのクローン（選択後に９０％超の生存率まで回収されたクローン）のみをこのセクションで考察する。標準的なＣＬＤ法及びＲＣＴＩ法の両方について、１つのＣＬＤサイクルは、トランスフェクションからクローン生産培養評価までの全プロセスとして定義される。
以前のｍＡｂ Ａ ＣＬＤの努力では、最も力価の高いクローンの大部分が、高い凝集体、すなわち１０～１５％を超えるＨＭＷＳ（％）も示した。したがって、標準的なＣＬＤ法とＲＣＴＩ法とによって生産されたクローンを比較する際に、上位のＲＣＴＩ ＣＬＤクローンの選択において、力価及びＨＭＷＳ（％）の両方を考慮した。標準的なＣＬＤ法によって生産されたクローンについて、ＨＭＷＳ（％）の分布は、いくつかの構成についてフロントベクターとバックベクター構成でおおよそクラスター化した（図３Ｂ）。例えば、Ｃ－２構成を有するクローン（図３Ａ）は一般に、より低いＨＭＷＳ（％）を生産したが、Ｂ－２構成を有するクローン（図３Ａ）は、より高いＨＭＷＳ（％）を生産した。
ＲＣＴＩクローンについて、力価及びＨＭＷＳ（％）の範囲は、標準的なＣＬＤクローンによって生産されたものと同等であったが（図３Ｂ）、スクリーニングされたクローンははるかに少なかった。ＲＣＴＩ法は、フロント及びバックＤＮＡベクターのランダムライブラリのトランスフェクションを含むので、長距離ＰＣＲを使用して、生産培養で評価されたクローンのフロントベクター構造を決定した。２４個のクローンのうち３個は確定的でない長距離ＰＣＲ結果を有したが、標準的なＣＬＤクローンと比較した場合、残りのクローンはフロントベクター構成及びＨＭＷＳ（％）プロファイルに関して同様にクラスター化した。Ｃフロントベクター構成を有するクローンの大部分は、Ｂ構造を有するクローンよりも低いＨＭＷＳ（％）を示し、Ａフロント構造を有するクローンはＨＭＷＳ（％）の範囲に及んだ。ＨＭＷＳ（％）レベルはフロントベクター構成のみと直接相関するので、ここではバックベクター構成の決定は必要ではなかった。また、ＲＣＴＩクローンの最も高い１４日目の力価は、標準的なＣＬＤクローンのものと同等であった（≧４．５ｇ／Ｌ）。Ｂ－２構成（図３Ａ）又はＡ－１構成（図３Ａ）のみが標準的なＣＬＤアプローチで試験された場合、高力価と低凝集体の組み合わせを有するクローンは、あったとしてもほとんど得られなかったことに留意されたい。
増殖、生産性、及び他の製品品質属性も、標準的なＣＬＤ法とＲＣＴＩ ＣＬＤ法との間で同等であった。図５は、両方のＣＬＤ法について生産培養で評価した全てのクローンにわたる様々な属性の分布をまとめたものである。同様に、ＲＣＴＩ ＣＬＤ法による上位のクローンは、標準的なＣＬＤ法によって生産された上位のクローンと同等に生産培養で行われた。標準的なＣＬＤ法で試験した構成のうち、Ａ－２及びＣ－２構成のみが、低い凝集体（ＨＭＷＳ（％）≦１５．４％）を生成する一方で高力価（≧３．６ｇ／Ｌ）を与えた。ＲＣＴＩアプローチから得られたクローンは、標準的なＣＬＤアプローチで得られたものと同様の凝集及び力価範囲を有する。ＲＣＴＩアプローチによる代表的な高生産クローンは表２のＣ構成であるように見える一方で、図３Ｂに示すように、構成Ａによる高力価及び低凝集クローンも見られたが、それらは最高生産クローンの中にはランク付けされなかった。表２は、標準的及びＲＣＴＩ ＣＬＤアプローチによる上位のクローンの力価、増殖及び製品品質の属性を比較する。
表２．標準的なＣＬＤ及びＲＣＴＩ ＣＬＤを使用して生産された上位のｍＡｂ Ａクローンの比較
Figure 2022538073000004
標準的なＣＬＤ法を使用したｍＡｂ Ａに対する以前のＣＬＤ努力と比較して、ＲＣＴＩ法はいくつかの利点を提供する。第１に、単一のＲＣＴＩ ＣＬＤサイクルを使用して、より少ないリソースを使用しながら、標準的なＣＬＤサイクルよりも多くないにしても同じ数のベクター構成をスクリーニングすることができる。ｍＡｂ Ａについて、標準的なＣＬＤ法は、９つの可能なベクター構成の組み合わせのうち７つをスクリーニングするために４＋のＣＬＤサイクルを必要としたが、ＲＣＴＩ法は、１回のＣＬＤサイクルで９つの組み合わせすべてをスクリーニングした。より少ない個々のクローンも同様にスクリーニングすることができる。ｍＡｂ Ａの全ての標準的なＣＬＤサイクルにわたって、合計４，２２４個のクローンをＳＣＣから採取し、生産培養中のスクリーニングのために１２０個のクローンに絞り込んだ。比較すると、ＲＣＴＩアプローチのためにＳＣＣから合計７０４個のクローンを採取し、生産培養で２４個のクローンをスクリーニングした。ＣＬＤサイクル及びスクリーニングするクローン数が減少するため、ＲＣＴＩ法は、手作業の削減と、ＳＣＣ、イメージング、及びヒットピッキングを実行するための自動化リソースの負担の両方を含む、ＣＬＤの労働要件の低減を可能にする。最後に、必要なＣＬＤサイクル及びスクリーニングされたクローン数が減少したにもかかわらず、ＲＣＴＩ法は、標準的なＣＬＤ方法と同等の力価、細胞培養性能及び製品品質の分布を有するクローンを生産した。両方の方法から生産された上位のクローンも同等であった。
二重特異性抗体の発現に対するＲＣＴＩ ＣＬＤの評価
ＲＣＴＩアプローチを、臨床的要求が高く、したがってクローンのスクリーニングプロセス中に高力価細胞株の単離を必要とする疾患適応症について、二重特異性抗体（「分子Ｙ」）の発現を評価した。単一の宿主における二重特異性抗体の発現は、共通又はミスマッチの軽鎖種を有するホモ二量体及びヘテロ二量体重鎖などの望ましくない副産物の集合をもたらし得る（Ｄｉｌｌｏｎ Ｍ．ら、ｍＡｂｓ ２０１７，９，２１３－２３０；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｊ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１１，３１７，１２６１－１２６９）。したがって、二重特異性抗体クローン評価中の重要な工程は、高い総力価を有するだけでなく、標的二重特異性抗体から精製することが困難な副生成物（単数又は複数）が最低レベルである高い有効力価（所望の二重特異性抗体種）を有するクローンの単離である。分子Ｙ（図１１Ｂ）については、精製するのが最も困難な副生成物は、共通の軽鎖種を有するヘテロ二量体重鎖（本明細書では「共通ＬＣ ＢｓＡｂ」と呼ばれる）であった。したがって、標準的なＴＩ ＣＬＤプロセス中、４つの異なるベクター構成を並行したＣＬＤ試行で使用し、ＳＣＣ前のプール生産評価中、質量分析を使用して共通ＬＣ ＢｓＡｂ及び有効力価レベルを測定した。最低レベルの共通ＬＣ ＢｓＡｂを有するプールをＳＣＣについて選択し、次いで、最高力価及び最低レベルの共通ＬＣ ＢｓＡｂを有する上位６２個のクローンを標準的なＴＩ ＣＬＤアプローチについての生産アッセイ（図７Ａ、正方形）で評価した。
本発明者らは、ＲＣＴＩ ＣＬＤアプローチにおいて、回収されたプールが依然としてベクター構成の不均一性を維持することを以前に確立したので（図６Ｂ及び図６Ｃ）、分子ＹのＲＣＴＩ ＣＬＤについては、４つのベクター構成すべてを使用してＴＩ宿主をトランスフェクトし、ＳＣＣは完全なプール回収後にのみ実施した。さらに、初期スクリーニング工程中に、急速燃焼質量分析を使用して、それらの有効力価のみに基づいてクローンをランク付けした。このプロセスの間、共通ＬＣ ＢｓＡｂ又は他の個々の副産物のレベルはクローン選択のために考慮されなかった。次いで、これらの基準に基づいて、上位３６個のＲＣＴＩクローンを生産アッセイ（図７Ａ、丸）で評価した。生産アッセイでは半分の数のクローンしか評価していないにもかかわらず、ＲＣＴＩ ＣＬＤアプローチから、標準的なＴＩ ＣＬＤクローンと比較して、比較的高い合計（約６ｇ／Ｌ）及び有効（４～５．５ｇ／Ｌ）力価を有するクローンを単離することができた（図７Ａ）。さらに、ＲＣＴＩクローンは、標準的なＴＩクローンと比較して、全体的に良好な特異的生産性（図７Ｂ）、良好な生存率（図８Ａ）及びわずかに低い増殖（図８Ｂ）プロファイルを有した。プロセス最適化により培養増殖を改善することがより容易であるので、分子Ｙを発現するＲＣＴＩクローンは、それらの標準的なＴＩクローン対応物よりもさらに高い総力価及び有効力価を有する可能性がある。ＲＣＴＩクローンはまた、非常に低い（約５％以下）、共通ＬＣ ＢｓＡｂ副産物を有し、これは標準的なＴＩクローンで観察されたものとほぼ同じくらい低い（図８Ｃ）。しかしながら、標準的なＴＩクローンは、生産培養における評価の前にこの形質についてスクリーニングされたため、全体的により低い共通ＬＣ ＢｓＡｂ副産物を有すると予想される。ＲＣＴＩクローンの製品品質は、それらの標準的なＴＩ対応物と比較して同等又はより良好であった。分子Ｙを発現するＲＣＴＩクローンはまた、標準的なＴＩクローンと比較して、相対的に低い凝集体（図８Ｄ）、より低い酸性種（％）（図８Ｅ）、及びより高い主な種（％）（図８Ｆ）を有し、これらはすべてより望ましい製品品質パラメータである。塩基性種の％レベルは、いずれのアプローチから単離されたクローン間でも比較的同等であった（図８Ｇ）。
複合キメラ抗体／リガンド分子の発現についてのＲＣＴＩ ＣＬＤの評価
様々な疾患適応症のための多くの今後の治療用分子は、もはや単なる従来の抗体ではなく、むしろより複雑な構造を有し、したがって発現がより困難である。標準的なＴＩアプローチにおける１つのそのような複雑な分子（「分子Ｚ」）の発現は、６つの異なるベクター構成を使用し、続いて、高い有効力価を有するクローンを得るために生産培養物中の９６個の異なるクローンをスクリーニングする、並行したＣＬＤ努力を必要とした。（図９Ａ、四角）。したがって、Ｆｃ融合リガンドと複合体化した半抗体を含む分子Ｚ（図１１Ｃ）は、発現するのが困難な分子と考えられ、本発明者らは、ＲＣＴＩ ＣＬＤアプローチを使用してその発現を試験することにした。ＴＩ宿主細胞をトランスフェクトして単一のプールにおいてそれらを選択した後にＳＣＣを行なうための６つすべての異なるベクター構成の混合物を使用して、生産アッセイにおけるわずか２３個のＲＣＴＩクローンの評価は、標準的なＴＩ ＣＬＤアプローチによって単離された上位のクローンと同等の力価及び製品品質を有するクローンの単離をもたらした（図９Ａ）。ＲＣＴＩクローンは、標準的なＴＩクローンと比較して、より高い全体的な比生産性（図９Ｂ）、同等の生存率（図１０Ａ）、わずかに低い増殖（図１０Ｂ）、及びより低い全体的な凝集体％（図１０Ｃ）を有していた。著しく高い比生産性を有するため（約２倍高い、図９Ｂ）、ＲＣＴＩクローンは、細胞増殖がプロセス最適化によってさらに増加する場合、潜在的にさらにより高い有効力価を達成することができる。最後に、ＲＣＴＩクローンは、標準的なＴＩクローンと同等の酸性％（図１０Ｄ）、主％（図１０Ｅ）及び塩基性％（図１０Ｆ）、電荷変種を有していた。全体として、これらのデータは、ＲＣＴＩアプローチを使用して、標準的なＴＩアプローチと同等の力価及び製品品質属性を有するクローンを単離することができるが、リソース及び労力が著しく少ないという考えを裏付けている。
前述の実施例は、本明細書にて開示する主題を単に示すものであり、いかなる方法においても、限定するものとみなされるべきではない。
描写され、特許請求される様々な実施形態に加えて、本開示の主題は、本明細書に開示され、特許請求される特徴の他の組合せを有する他の実施形態も対象とする。したがって、本明細書に提示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組合せを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組合せられても良い。本開示の主題の特定の実施形態の前述の説明は、例証及び説明目的のために提示されている。包括的であるようにも本開示の主題を開示される実施形態に限定するようにも意図されていない。
本開示の主題の趣旨又は範囲から逸脱することなく、本開示の主題の組成物及び方法に様々な修正及び変形を加えることができることは、当業者には明らかである。したがって、本開示の主題が添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内の修正及び変形を含むよう意図されている。
様々な刊行物、特許、及び特許出願が本明細書に引用されており、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (74)

  1. 少なくとも１つの目的の配列（ＳＯＩ）を発現する標的化組込み（ＴＩ）宿主細胞のライブラリを生成及びハイスループット・スクリーニングするための方法であって、
    ａ）１つ又は複数のＳＯＩを発現する複数のＴＩ宿主細胞を含むＴＩ宿主細胞の前記ライブラリを、
    ｉ）複数のＴＩ宿主細胞を提供すること、
    ｉｉ）前記複数のＴＩ宿主細胞を、１つ又は複数のＳＯＩを含む複数のベクターと接触させること、
    ｉｉｉ）前記１つ又は複数のＳＯＩを前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入すること、によって生成することと、
    ｂ）前記ライブラリを単一クローンに分離することと、
    ｃ）特定の細胞又は産物属性について前記クローンをスクリーニングすることと、を含む、方法。
  2. 前記１つ又は複数のＳＯＩが、リコンビナーゼ媒介性組込みによって前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記１つ又は複数のＳＯＩが、遺伝子編集媒介性組込みによって前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記１つ又は複数のＳＯＩが、１つ又は複数の調節可能なプロモーターに作用可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
  5. 前記１つ又は複数の調節可能なプロモーターが、ＳＶ４０及びＣＭＶプロモーターからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ＴＩ宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ＳＯＩが、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする、請求項１に記載の方法。
  10. 前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
  11. 前記特定の細胞属性が、細胞増殖、細胞力価、比生産性、体積生産性、クローン安定性から選択される、請求項１に記載の方法。
  12. 前記特定の産物属性が、グリコシル化のレベル、電荷分散のレベル、ミスマッチの減少、タンパク質／ペプチド凝集の減少、タンパク質配列不均一性から選択される、請求項１に記載の方法。
  13. 前記１つ又は複数のＳＯＩが、前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に、以下：配列番号１～１２；ＮＷ＿００６８７４０４７．１；ＮＷ＿００６８８４５９２．１；ＮＷ＿００６８８１２９６．１；ＮＷ＿００３６１６４１２．１；ＮＷ＿００３６１５０６３．１；ＮＷ＿００６８８２９３６．１；及びＮＷ＿００３６１５４１１．１から選択される配列と少なくとも約９０％相同の１つ又は複数の遺伝子座において導入される、請求項１に記載の方法。
  14. 複数の外因性ヌクレオチドＳＯＩを含むＴＩ宿主細胞のライブラリを生成する方法であって、
    ａ）複数のＴＩ宿主細胞を提供することと、
    ｂ）前記複数のＴＩ宿主細胞を、１つ又は複数のＳＯＩを含む複数のベクターと接触させることと、
    ｃ）前記１つ又は複数のＳＯＩを前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入することとを含む方法。
  15. 前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数が、前記ＴＩ宿主細胞のゲノムの１つ又は複数の遺伝子座に組み込まれた１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含み、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する少なくとも２つのＲＲＳを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ベクターが、
    ａ）前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記少なくとも２つのＲＲＳと一致する少なくとも２つのＲＲＳと、
    ｂ）１つ又は複数の外因性ＳＯＩと、前記ＲＲＳに隣接する少なくとも１つの第２の選択マーカーと、を含む、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記１つ又は複数のＳＯＩが、リコンビナーゼ媒介性組込みによって前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記１つ又は複数のＳＯＩが、遺伝子編集媒介性組込みによって前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入される、請求項１４に記載の方法。
  19. 前記１つ又は複数のＳＯＩが、１つ又は複数の調節可能なプロモーターに作用可能に連結されている、請求項１４に記載の方法。
  20. 前記１つ又は複数の調節可能なプロモーターが、ＳＶ４０及びＣＭＶプロモーターからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ＳＯＩが、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする、請求項１４に記載の方法。
  22. 前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項１４に記載の方法。
  23. （ａ）の前記１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列が、以下：配列番号１～１２；ＮＷ＿００６８７４０４７．１；ＮＷ＿００６８８４５９２．１；ＮＷ＿００６８８１２９６．１；ＮＷ＿００３６１６４１２．１；ＮＷ＿００３６１５０６３．１；ＮＷ＿００６８８２９３６．１；及びＮＷ＿００３６１５４１１．１から選択される配列と少なくとも約９０％相同の１つ又は複数の遺伝子座において組み込まれる、請求項１４に記載の方法。
  24. 少なくとも１つの目的の配列が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の目的の配列を含む、請求項１４に記載の方法。
  25. 前記ＴＩ宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項１４に記載の方法。
  26. 前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項２６に記載の方法。
  28. １つ又は複数のＳＯＩを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法であって、
    ａ）複数のＴＩ宿主細胞を提供することと、
    ｂ）前記複数のＴＩ宿主細胞を、１つ又は複数のＳＯＩを含む複数のベクターと接触させることと、
    ｃ）前記１つ又は複数のＳＯＩを前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入することと、
    ｄ）前記１つ又は複数のＳＯＩを発現するＴＩ宿主細胞を選択することとを含む方法。
  29. 前記１つ又は複数のＳＯＩが、リコンビナーゼ媒介性組込みによって前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入される、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記１つ又は複数のＳＯＩが、遺伝子編集媒介性組込みによって前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入される、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記１つ又は複数のＳＯＩが、１つ又は複数の調節可能なプロモーターに作用可能に連結されている、請求項２８に記載の方法。
  32. 前記１つ又は複数の調節可能なプロモーターが、ＳＶ４０及びＣＭＶプロモーターからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記ＴＩ宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項２８に記載の方法。
  34. 前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記ＳＯＩが、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする、請求項２８に記載の方法。
  37. 前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項２８に記載の方法。
  38. 前記１つ又は複数のＳＯＩが、前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に、以下：配列番号１～１２；ＮＷ＿００６８７４０４７．１；ＮＷ＿００６８８４５９２．１；ＮＷ＿００６８８１２９６．１；ＮＷ＿００３６１６４１２．１；ＮＷ＿００３６１５０６３．１；ＮＷ＿００６８８２９３６．１；及びＮＷ＿００３６１５４１１．１から選択される配列と少なくとも約９０％相同の１つ又は複数の遺伝子座において導入される、請求項２８に記載の方法。
  39. 前記ＳＯＩが、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする、請求項２８に記載の方法。
  40. 前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質、及びそれらの断片をコードする、請求項２８に記載の方法。
  41. 請求項２８に記載の方法であって、
    ａ）前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数が、前記ＴＩ宿主細胞のゲノムの１つ又は複数の遺伝子座に組み込まれた１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含み、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する少なくとも２つのＲＲＳを含み、
    ｂ）前記ベクターは、
    ａ．前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記少なくとも２つのＲＲＳと一致する少なくとも２つのＲＲＳと、
    ｂ．１つ又は複数の外因性ＳＯＩと、前記ＲＲＳに隣接する少なくとも１つの第２の選択マーカーとを含み、
    ｃ）前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に、前記ＲＲＳを認識する１つ又は複数のリコンビナーゼ又はリコンビナーゼをコードする核酸を導入し、
    ｄ）前記第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択して、それにより、目的の配列を発現するＴＩ宿主細胞を単離する、方法。
  42. 前記ＳＯＩが、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質、及びそれらの断片をコードする、請求項４１に記載の方法。
  44. （ａ）の前記１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列が、以下：配列番号１～１２；ＮＷ＿００６８７４０４７．１；ＮＷ＿００６８８４５９２．１；ＮＷ＿００６８８１２９６．１；ＮＷ＿００３６１６４１２．１；ＮＷ＿００３６１５０６３．１；ＮＷ＿００６８８２９３６．１；及びＮＷ＿００３６１５４１１．１から選択される配列と少なくとも約９０％相同の１つ又は複数の遺伝子座において組み込まれる、請求項４１に記載の方法。
  45. 請求項４１に記載の方法であって、
    ａ．前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳ及び第２のＲＲＳと、前記第１のＲＲＳ及び前記第２のＲＲＳの間に位置する第３のＲＲＳとを含み、すべての前記ＲＲＳが異種特異性であり、
    ｂ．前記複数のベクターが、
    ｉ．前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第１のＲＲＳ及び前記第３のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１の外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１のベクターと、
    ｉｉ．前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第２のＲＲＳ及び前記第３のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２のベクターとを含み、
    ｃ．前記第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択して、それにより、第１及び第２の目的の配列を発現するＴＩ宿主細胞を単離する、方法。
  46. 少なくとも１つの目的の配列を含む前記ベクターが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の目的の配列を含む、請求項２８、４１、及び４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記ＴＩ宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項２８、４１、及び４５のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項４８に記載の方法。
  50. ＳＯＩを発現させる方法であって、
    ａ）複数のＴＩ宿主細胞を提供することと、
    ｂ）前記複数のＴＩ宿主細胞を、１つ又は複数のＳＯＩを含む複数のベクターと接触させることと、
    ｃ）前記１つ又は複数のＳＯＩを前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入することと、
    ｄ）目的の配列を発現するＴＩ宿主細胞を選択することと、
    ｅ）前記目的の配列を発現させるのに適した条件下でｄ）の細胞を培養することとを含む、方法。
  51. 前記１つ又は複数のＳＯＩが、リコンビナーゼ媒介性組込みによって前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入される、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記１つ又は複数のＳＯＩが、遺伝子編集媒介性組込みによって前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に導入される、請求項５０に記載の方法。
  53. 前記１つ又は複数のＳＯＩが、１つ又は複数の調節可能なプロモーターに作用可能に連結されている、請求項５０に記載の方法。
  54. 前記１つ又は複数の調節可能なプロモーターが、ＳＶ４０及びＣＭＶプロモーターからなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記ＴＩ宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項５０に記載の方法。
  56. 前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ＳＯＩが、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする、請求項５０に記載の方法。
  59. 前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項５０に記載の方法。
  60. 前記１つ又は複数のＳＯＩが、前記複数のＴＩ宿主細胞のうちの１つ又は複数に、以下：配列番号１～１２；ＮＷ＿００６８７４０４７．１；ＮＷ＿００６８８４５９２．１；ＮＷ＿００６８８１２９６．１；ＮＷ＿００３６１６４１２．１；ＮＷ＿００３６１５０６３．１；ＮＷ＿００６８８２９３６．１；及びＮＷ＿００３６１５４１１．１から選択される配列と少なくとも約９０％相同の１つ又は複数の遺伝子座において導入される、請求項５０に記載の方法。
  61. 少なくとも１つの目的の配列が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の目的の配列を含む、請求項５０に記載の方法。
  62. ＳＯＩを発現させる方法であって、
    ａ）複数のＴＩ宿主細胞を提供することであって、各ＴＩ宿主細胞が、前記ＴＩ宿主細胞のゲノムの１つ又は複数の遺伝子座に組み込まれた１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列を含み、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する少なくとも２つのＲＲＳを含む、複数のＴＩ宿主細胞を提供することと、
    ｂ）前記複数のＴＩ宿主細胞を、以下：
    ａ．前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記少なくとも２つのＲＲＳと一致する少なくとも２つのＲＲＳと、
    ｂ．１つ又は複数の外因性ＳＯＩと、前記ＲＲＳに隣接する少なくとも１つの第２の選択マーカーとを含む複数のベクターと接触させることと、
    ｃ）前記ＲＲＳを認識する１つ又は複数のリコンビナーゼ又はリコンビナーゼをコードする核酸を導入することと、
    ｄ）前記第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択して、それにより、目的の配列を発現するＴＩ宿主細胞を単離することと、
    ｅ）前記目的の配列を発現させるのに適した条件下でｄ）の細胞を培養して、そこから前記目的の配列の産物を回収することとを含む、方法。
  63. 前記ＳＯＩが、マルチサブユニットタンパク質のポリペプチドサブユニット又はその断片をコードする、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記１つ又は複数のＳＯＩが、１つ又は複数の調節可能なプロモーターに作用可能に連結されている、請求項６２に記載の方法。
  65. 前記１つ又は複数の調節可能なプロモーターが、ＳＶ４０及びＣＭＶプロモーターからなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質、及びそれらの断片をコードする、請求項６２に記載の方法。
  67. （ａ）の前記１つ又は複数の外因性ヌクレオチド配列が、以下：配列番号１～１２；ＮＷ＿００６８７４０４７．１；ＮＷ＿００６８８４５９２．１；ＮＷ＿００６８８１２９６．１；ＮＷ＿００３６１６４１２．１；ＮＷ＿００３６１５０６３．１；ＮＷ＿００６８８２９３６．１；及びＮＷ＿００３６１５４１１．１から選択される配列と少なくとも約９０％相同の１つ又は複数の遺伝子座において組み込まれる、請求項６２に記載の方法。
  68. 請求項６２に記載の方法であって、
    ａ．前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳ及び第２のＲＲＳと、前記第１のＲＲＳ及び前記第２のＲＲＳの間に位置する第３のＲＲＳとを含み、すべての前記ＲＲＳが異種特異性であり、
    ｂ．前記複数のベクターが、
    ｉ．前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第１のＲＲＳ及び前記第３のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１の外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１のベクターと、
    ｉｉ．前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第２のＲＲＳ及び前記第３のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２のベクターとを含み、
    ｃ．前記第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択して、それにより、第１及び第２の目的の配列を発現するＴＩ宿主細胞を単離する、方法。
  69. 前記少なくとも１つの目的の配列が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の目的の配列を含む、請求項６２又は６８に記載の方法。
  70. 前記少なくとも１つの第１のＳＯＩ及び前記少なくとも１つの第２のＳＯＩが、１つ又は複数の調節可能なプロモーターに作用可能に連結されている、請求項６２に記載の方法。
  71. 前記１つ又は複数の調節可能なプロモーターが、ＳＶ４０及びＣＭＶプロモーターからなる群から選択される、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記ＴＩ宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項６２又は６８に記載の方法。
  73. 前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項７３に記載の方法。
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