KR20240117146A - 다중 벡터 재조합효소 매개 카세트 교환 - Google Patents
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Abstract
본원 발명은 재조합 단백질, 예를 들면 단일클론 항체뿐만 아니라 이로부터 유래된 조성물, 예를 들면 이중특이적 5 항체 및 기타 복합 형태 단백질, 예를 들면 막 단백질 복합체 및 기타 발현하기 어려운 분자를 발현하는 숙주 세포의 생산을 위한 관심 서열의 표적화된 통합을 달성하기 위한 다중 벡터 재조합효소 매개 카세트 교환 접근법에 관한 것이다.
Description
관련된 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 12월 22일에 제출된 미국 가출원 일련 번호 63/292,869에 우선권을 주장하고, 이것의 개시는 본원에 온전히 참고로 포함된다.
서열 목록
WIPO 표준 ST.26의 규칙을 따르는 서열 목록은 본원에 참고로 포함된다. 상기 서열 목록은 XML로 인코딩된 ASCII 형식의 EFS-Web을 통해 전자 문서로 제출되었다. 2022년 12월 21일에 작성된 상기 전자 문서는 제목이 "00B206_1310_ST26.xml"이며, 크기가 983,880 바이트이다.
기술 분야
본원 발명은 재조합 단백질, 예를 들면 단일클론 항체뿐만 아니라 이로부터 유래된 조성물, 예를 들면 이중특이적 항체 및 기타 복합 형태 단백질, 예를 들면 막 단백질 복합체 및 기타 발현하기 어려운 분자를 발현하는 숙주 세포의 생산을 위한 관심 서열의 표적화된 통합을 달성하기 위한 다중 벡터 재조합효소 매개 카세트 교환 접근법을 이용한 세포주 개발에 관한 것이다.
배경
세포생물학 및 면역학에서 급속한 진전으로 인해, 암, 심혈관 질환 및 대사 질환을 포함한 다양한 질환에 대한 신규한 치료적 재조합 단백질, 예를 들면, 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 및 복합 형식 단백질의 개발에 대한 요구가 증가하고 있다. 이들 생물약제학적 후보는 통상적으로 관심 있는 단백질을 발현할 수 있는 상업적인 세포주에 의해 제조된다. 예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포가 최근에 치료용 단일클론 또는 이중특이적 항체뿐만 아니라 더 복잡한 형식의 단백질을 생산하는 데 널리 적응되어 왔다.
상업용 세포주를 개발하기 위한 전통적인 전략은 일반적으로 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 무작위로 또는 특정("표적") 위치에 통합한 후 해당 폴리펩티드를 생산하는 세포주를 선택하고 단리하는 반복적인 노력을 필요로 한다. 그러나, 자원을 보존할 뿐만 아니라 기존 방법론에 비해 개선된 발현 수준, 제품 품질 특성 및 생산 배양 성능을 나타내는 세포주를 생성하는 새로운 세포주 개발 전략이 해당 분야에 필요하다.
발명의 요약
본원 발명은 재조합 단백질, 예를 들면 단일클론 항체뿐만 아니라 이로부터 유래된 조성물, 예를 들면 이중특이적 항체 및 기타 복합 형태 단백질, 예를 들면 막 단백질 복합체 및 기타 발현하기 어려운 분자를 발현하는 숙주 세포의 생산을 위한 관심 서열의 표적화된 통합을 달성하기 위한 다중 벡터 재조합효소 매개 카세트 교환(다중 벡터 RMCE) 접근법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 본원 발명은 다음 서열: a) NW_006874047.1의 뉴클레오티드 41190-45269의 전부 또는 일부, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 63590-207911의 전부 또는 일부, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 253831-491909의 전부 또는 일부, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 69303-79768의 전부 또는 일부, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 293481-315265의 전부 또는 일부, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2650443-2662054의 전부 또는 일부, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오티드 82214-97705의 전부 또는 일부와 적어도 약 90% 상동성인 서열; 또는 b) NW_006874047.1의 뉴클레오티드 45270-45490의 전부 또는 일부, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 207912-792374의 전부 또는 일부, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 491910-667813의 전부 또는 일부, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 79769-100059의 전부 또는 일부, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 315266-362442의 전부 또는 일부, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2662055-2701768의 전부 또는 일부, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오티드 97706-105117의 전부 또는 일부와 적어도 약 90% 상동성인 서열 내에 있는 통합 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하고: 여기서 외인성 뉴클레오티드 서열은 4개 이상의 부적합성 재조합 인식 서열(RRS)을 포함하는 것인 TI 숙주 세포에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, RRS는 LoxP 서열, LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox5 l l 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5 l7l 서열, Loxm2 서열, Lox7l 서열, Lox66 서열, FRT 서열, Bxbl attP 서열, Bxbl attB 서열, φC31 attP 서열, 및 φC31 attB 서열로 구성된 군에서 선택된다. 특정 실시형태에서, RRS는 Cre 재조합효소, FLP 재조합효소, Bxbl 인테그라아제 및 φC31 인테그라아제로 구성된 군에서 선택된 재조합효소에 의해 인식된다. 특정 실시형태에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 5' 최말단 RRS와 3' 방향으로 그 다음 RRS 사이에 위치하는 선택 마커를 포함한다. 특정 실시형태에서, 선택 마커는 아미노글리코시드 인산전달효소(APH), 히그로마이신 인산전달효소(HYG), 네오마이신, G418(APH), 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나아제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티디놀 탈수소효소(히스티디놀 D), 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 미코페놀산으로 구성된 군에서 선택된다. 특정 실시형태에서, 세포는 두 번째 선택 마커를 포함하고, 여기서 첫 번째 선택 마커와 두 번째 선택 마커는 서로 다르다. 특정 실시형태에서, 두 번째 선택 마커는 아미노글리코시드 인산전달효소(APH), 히그로마이신 인산전달효소(HYG), 네오마이신, G418(APH), 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나아제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티디놀 탈수소효소(히스티디놀 D), 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 미코페놀산으로 구성된 군에서 선택된다. 특정 실시형태에서, 세포는 세 번째 선택 마커 및 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함하고, 여기서 IRES는 세 번째 선택 마커에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시형태에서, 세 번째 선택 마커는 첫 번째 또는 두 번째 선택 마커와 상이하다. 특정 실시형태에서, 세 번째 선택 마커는 녹색 형광 단백질(GFP) 마커, 강화된 GFP(eGFP) 마커, 합성 GFP 마커, 황색 형광 단백질(YFP) 마커, 강화된 YFP(eYFP) 마커, 청록색 형광 단백질(CFP) 마커, mPlum 마커, mCherry 마커, tdTomato 마커, mStrawberry 마커, J-red 마커, DsRed-단량체 마커, mOrange 마커, mKO 마커, mCitrine 마커, Venus 마커, YPet 마커, Emerald6 마커, CyPet 마커, mCFPm 마커, Cerulean 마커 및 T-Sapphire 마커로 구성된 군에서 선택된다. 특정 실시형태에서, TI 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다. 특정 실시형태에서, TI 숙주 세포는 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포이다. 특정 실시형태에서, TI 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포, 또는 CHO K1M 숙주 세포이다.
특정 실시형태에서, 본원 발명은 다음 단계를 포함하는, SOI를 발현하는 TI 숙주 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다: a) 다음 서열: (A) NW_006874047.1의 뉴클레오티드 41190-45269의 전부 또는 일부, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 63590-207911의 전부 또는 일부, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 253831-491909의 전부 또는 일부, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 69303-79768의 전부 또는 일부, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 293481-315265의 전부 또는 일부, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2650443-2662054의 전부 또는 일부, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오티드 82214-97705의 전부 또는 일부와 적어도 약 90% 상동성인 서열; 또는 (B) NW_006874047.1의 뉴클레오티드 45270-45490의 전부 또는 일부, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 207912-792374의 전부 또는 일부, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 491910-667813의 전부 또는 일부, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 79769-100059의 전부 또는 일부, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 315266-362442의 전부 또는 일부, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2662055-2701768의 전부 또는 일부, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오티드 97706-105117의 전부 또는 일부와 적어도 약 90% 상동성인 서열 내에 있는 통합 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계이며; 외인성 뉴클레오티드 서열은 4개 이상의 부적합성 RRS를 포함하는 것인 단계; b) a)에 제공된 세포에 적어도 3개의 벡터를 도입하고, 각 벡터는 (A) 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상에서 순차적으로 배향된 2개의 RRS와 정합하는 2개의 RRS; 및 (B) 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 두 번째 선택 마커에 측접하는 RRS의 각 쌍을 포함하는 것인 단계; c) 재조합효소 또는 재조합효소를 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계이며, 재조합효소는 RRS를 인식하는 것인 단계; 및 d) 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, SOI를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리하는 단계. 특정 실시형태에서, 재조합효소는 Cre 재조합효소, FLP 재조합효소, Bxbl 인테그라아제, 및 φC31 인테그라아제에서 선택된다. 특정 실시형태에서, SOI는 단일 사슬 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단일 사슬 Fv 단편(scFv), 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, TI 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다. 특정 실시형태에서, TI 숙주 세포는 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포이다. 특정 실시형태에서, TI 숙주 세포는 CHO 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포, 또는 CHO K1M 숙주 세포이다. 특정 실시형태에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 통합 파지 벡터, 비바이러스 벡터, 트랜스포존 및/또는 유전자전위효소 벡터, 인테그라아제 기질 및 플라스미드로 구성된 군에서 선택된다.
특정 실시형태에서, 본원 발명은 다음 단계를 포함하는, SOI를 발현하기 위한 방법에 관한 것이다: a) 다음 서열: (A) NW_006874047.1의 뉴클레오티드 41190-45269의 전부 또는 일부, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 63590-207911의 전부 또는 일부, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 253831-491909의 전부 또는 일부, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 69303-79768의 전부 또는 일부, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 293481-315265의 전부 또는 일부, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2650443-2662054의 전부 또는 일부, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오티드 82214-97705의 전부 또는 일부와 적어도 약 90% 상동성인 서열; 또는 (B) NW_006874047.1의 뉴클레오티드 45270-45490의 전부 또는 일부, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 207912-792374의 전부 또는 일부, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 491910-667813의 전부 또는 일부, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 79769-100059의 전부 또는 일부, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 315266-362442의 전부 또는 일부, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2662055-2701768의 전부 또는 일부, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오티드 97706-105117의 전부 또는 일부와 적어도 약 90% 상동성인 서열 내에 있는 통합 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계이며; 외인성 뉴클레오티드 서열은 4개 이상의 부적합성 RRS를 포함하는 것인 단계; b) a)에 제공된 세포에 적어도 3개의 벡터를 도입하고, 각 벡터는 (A) 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상에서 순차적으로 배향된 2개의 RRS와 정합하는 2개의 RRS; 및 (B) 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 두 번째 선택 마커에 측접하는 RRS의 각 쌍을 포함하는 것인 단계; c) 재조합효소 또는 재조합효소를 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계이며, 재조합효소는 RRS를 인식하는 것인 단계; d) 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, SOI를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리하는 단계; 및 e) SOI를 발현하는 데 적합한 조건하에서 d)의 세포를 배양하고 이로부터 발현된 단백질을 회수하는 단계. 특정 실시형태에서, 재조합효소는 Cre 재조합효소, FLP 재조합효소, Bxbl 인테그라아제 및 φC31 인테그라아제에서 선택된다. 특정 실시형태에서, SOI는 단일 사슬 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단일 사슬 Fv 단편(scFv), 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, TI 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다. 특정 실시형태에서, TI 숙주 세포는 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포이다. 특정 실시형태에서, TI 숙주 세포는 CHO 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포, 또는 CHO K1M 숙주 세포이다. 특정 실시형태에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 통합 파지 벡터, 비바이러스 벡터, 트랜스포존 및/또는 유전자전위효소 벡터, 인테그라아제 기질 및 플라스미드로 구성된 군에서 선택된다.
특정 실시형태에서, 본원 발명은 다음 단계를 포함하는, 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 포유동물 세포를 생산하기 위한 방법에 관한 것이다: a) 포유동물 세포 게놈의 미리 결정된 유전자좌에서 혼입된 적어도 단일의 외인성 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 제공하는 단계이며, 각 외인성 핵산은 4개 이상의 부적합성 RRS를 포함하는 것인 단계; b) a)의 재조합 포유동물 세포에 적어도 3개의 벡터를 도입하고, 각 벡터는 포유동물 세포 게놈의 미리 결정된 유전자좌에서 혼입된 외인성 핵산에 포함된 부적합성 RRS 중 2개와 정합하는 한 쌍의 부적합성 RRS를 포함하고, 각 쌍의 부적합성 RRS는 하나 이상의 SOI에 측접하며, 상기 SOI는 항체 및/또는 하나 이상의 선택 마커를 인코딩하는 것인 단계; c) SOI 및/또는 선택 마커를 포함하는 적어도 3개의 벡터의 도입과 동시에 또는 순차적으로 하나 이상의 재조합효소를 도입하는 단계; 및 d) SOI 및/또는 선택 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 선택하고, 이로써 항체를 인코딩하는 핵산 SOI를 포함하는 재조합 포유동물 세포를 생산하는 단계. 특정 실시형태에서, 외인성 핵산은 다음 유전자좌: (A) NW_006874047.1의 뉴클레오티드 41190-45269의 전부 또는 일부, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 63590-207911의 전부 또는 일부, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 253831-491909의 전부 또는 일부, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 69303-79768의 전부 또는 일부, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 293481-315265의 전부 또는 일부, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2650443-2662054의 전부 또는 일부, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오티드 82214-97705의 전부 또는 일부와 적어도 약 90% 상동성인 유전자좌; 또는 (B) NW_006874047.1의 뉴클레오티드 45270-45490의 전부 또는 일부, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 207912-792374의 전부 또는 일부, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 491910-667813의 전부 또는 일부, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 79769-100059의 전부 또는 일부, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 315266-362442의 전부 또는 일부, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2662055-2701768의 전부 또는 일부, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오티드 97706-105117의 전부 또는 일부와 적어도 약 90% 상동성인 유전자좌에서 혼입된다. 특정 실시형태에서, 재조합효소는 Cre 재조합효소, FLP 재조합효소, Bxbl 인테그라아제 및 φC31 인테그라아제에서 선택된다. 특정 실시형태에서, SOI는 단일 사슬 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단일 사슬 Fv 단편(scFv), 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 포유동물 세포는 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포이다. 특정 실시형태에서, 포유동물 세포는 CHO 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포, 또는 CHO K1M 숙주 세포이다. 특정 실시형태에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 통합 파지 벡터, 비바이러스 벡터, 트랜스포존 및/또는 유전자전위효소 벡터, 인테그라아제 기질 및 플라스미드로 구성된 군에서 선택된다.
특정 실시형태에서, 본원 발명은 다음 단계를 포함하는, 하나 이상의 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 포유동물 세포를 생산하기 위한 방법에 관한 것이다: a) 포유동물 세포 게놈의 미리 결정된 유전자좌에서 혼입된 적어도 2개의 외인성 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 제공하는 단계이며, 각 외인성 핵산은 4개 이상의 부적합성 RRS를 포함하고, 외인성 핵산은 동일하거나 상이한 RRS를 포함할 수 있는 것인 단계, b) a)의 재조합 포유동물 세포에 적어도 3개의 벡터를 도입하고, 각 벡터는 포유동물 세포 게놈의 미리 결정된 유전자좌에서 혼입된 외인성 핵산 중 하나 또는 둘 모두에 포함된 부적합성 RRS 중 2개와 정합하는 한 쌍의 부적합성 RRS를 포함하고, 각 쌍의 부적합성 RRS는 하나 이상의 SOI에 측접하며, 상기 SOI는 항체 및/또는 하나 이상의 선택 마커를 인코딩하는 것인 단계; c) SOI 및/또는 선택 마커를 포함하는 적어도 3개의 벡터의 도입과 동시에 또는 순차적으로 하나 이상의 재조합효소를 도입하는 단계; 및 d) SOI 및/또는 선택 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 선택하고,
이로써 항체를 인코딩하는 핵산 SOI를 포함하는 재조합 포유동물 세포를 생산하는 단계. 특정 실시형태에서, 외인성 핵산은 다음 유전자좌: (A) NW_006874047.1의 뉴클레오티드 41190-45269의 전부 또는 일부, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 63590-207911의 전부 또는 일부, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 253831-491909의 전부 또는 일부, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 69303-79768의 전부 또는 일부, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 293481-315265의 전부 또는 일부, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2650443-2662054의 전부 또는 일부, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오티드 82214-97705의 전부 또는 일부와 적어도 약 90% 상동성인 유전자좌; 또는 (B) NW_006874047.1의 뉴클레오티드 45270-45490의 전부 또는 일부, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 207912-792374의 전부 또는 일부, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 491910-667813의 전부 또는 일부, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 79769-100059의 전부 또는 일부, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 315266-362442의 전부 또는 일부, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2662055-2701768의 전부 또는 일부, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오티드 97706-105117의 전부 또는 일부와 적어도 약 90% 상동성인 유전자좌에서 선택된 별개의 유전자좌에서 혼입된다. 특정 실시형태에서, 재조합효소는 Cre 재조합효소, FLP 재조합효소, Bxbl 인테그라아제 및 φC31 인테그라아제에서 선택된다. 특정 실시형태에서, SOI는 단일 사슬 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단일 사슬 Fv 단편(scFv), 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 포유동물 세포는 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포이다. 특정 실시형태에서, 포유동물 세포는 CHO 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포, 또는 CHO K1M 숙주 세포이다. 특정 실시형태에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 통합 파지 벡터, 비바이러스 벡터, 트랜스포존 및/또는 유전자전위효소 벡터, 인테그라아제 기질 및 플라스미드로 구성된 군에서 선택된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본원 발명의 예시적인 다중 벡터 RMCE 전략을 도시한다.
도 2는 본원 발명의 예시적인 다중 벡터 RMCE 전략을 도시한다.
도 3은 본원 발명의 예시적인 다중 벡터 RMCE 전략을 도시한다.
도 4는 본원 발명의 예시적인 다중 벡터 RMCE 전략을 도시한다.
도 5는 본원 발명의 예시적인 다중 벡터 RMCE 전략을 도시한다.
도 6은 3-벡터 RMCE와 비교하여 2-벡터 RMCE로 변형된 CHO 세포의 사본수 결과를 도시한다. CHO 클론의 유전자 사본수는 예상과 유사하며, 여기서 2-벡터 RMCE 클론의 경우 2 HC 및 4 LC가 예상되었고 3-벡터 RMCE 클론의 경우 3 HC 및 6 LC가 예상되었다.
도 7은 본원 발명의 예시적인 다중 벡터 RMCE 전략을 도시한다.
도 8a-8b는 2-플라스미드 기반 RMCE와 2-부위 다중 벡터 플라스미드(이 경우 3개의 플라스미드) 기반 RMCE를 이용하는 TI 형질감염 풀의 생산성 비교를 보여준다. 역가(막대)와 Qp(점)는 모두 mAb A의 2-부위 다중 벡터 플라스미드 기반 TI 풀(도 8a)과 mAb B의 TI 풀(도 8b)에 대해 더 높다.
도 9a-9b는 역가(도 9a)와 Qp(도 9b)를 포함하여 mAb C, mAb D 및 mAb E의 다양한 TI 풀에 대해 평가된 특정 CLD 매개변수를 그래프로 보여준다.
도 10a-10c는 Ambr15® 배양물에서 각각 8개의 mAb C 클론에 대해 관찰된 역가(도 10a) 및 이들 mAb C 8개 클론 각각에 대해 관찰된 Qp(도 10b)를 그래프로 도해할 뿐만 아니라 평균 mAb C 클론 역가와 mAb C 클론 Qp의 비교(도 10c)를 제공한다.
도 11a-11c는 Ambr15® 배양물에서 각각 8개의 mAb D 클론에 대해 관찰된 역가(도 11a) 및 이들 mAb D 8개 클론 각각에 대해 관찰된 Qp(도 11b)를 그래프로 도해할 뿐만 아니라 평균 mAb D 클론 역가와 mAb D 클론 Qp의 비교(도 11c)를 제공한다.
도 12a-1b는 2개의 벡터 접근법과 다중 벡터 접근법 각각에 대해 2개의 특정 클론(클론 A 및 클론 B)에 대한 역가(도 12a)와 Qp(도 12b)를 비교한다.
도 1은 본원 발명의 예시적인 다중 벡터 RMCE 전략을 도시한다.
도 2는 본원 발명의 예시적인 다중 벡터 RMCE 전략을 도시한다.
도 3은 본원 발명의 예시적인 다중 벡터 RMCE 전략을 도시한다.
도 4는 본원 발명의 예시적인 다중 벡터 RMCE 전략을 도시한다.
도 5는 본원 발명의 예시적인 다중 벡터 RMCE 전략을 도시한다.
도 6은 3-벡터 RMCE와 비교하여 2-벡터 RMCE로 변형된 CHO 세포의 사본수 결과를 도시한다. CHO 클론의 유전자 사본수는 예상과 유사하며, 여기서 2-벡터 RMCE 클론의 경우 2 HC 및 4 LC가 예상되었고 3-벡터 RMCE 클론의 경우 3 HC 및 6 LC가 예상되었다.
도 7은 본원 발명의 예시적인 다중 벡터 RMCE 전략을 도시한다.
도 8a-8b는 2-플라스미드 기반 RMCE와 2-부위 다중 벡터 플라스미드(이 경우 3개의 플라스미드) 기반 RMCE를 이용하는 TI 형질감염 풀의 생산성 비교를 보여준다. 역가(막대)와 Qp(점)는 모두 mAb A의 2-부위 다중 벡터 플라스미드 기반 TI 풀(도 8a)과 mAb B의 TI 풀(도 8b)에 대해 더 높다.
도 9a-9b는 역가(도 9a)와 Qp(도 9b)를 포함하여 mAb C, mAb D 및 mAb E의 다양한 TI 풀에 대해 평가된 특정 CLD 매개변수를 그래프로 보여준다.
도 10a-10c는 Ambr15® 배양물에서 각각 8개의 mAb C 클론에 대해 관찰된 역가(도 10a) 및 이들 mAb C 8개 클론 각각에 대해 관찰된 Qp(도 10b)를 그래프로 도해할 뿐만 아니라 평균 mAb C 클론 역가와 mAb C 클론 Qp의 비교(도 10c)를 제공한다.
도 11a-11c는 Ambr15® 배양물에서 각각 8개의 mAb D 클론에 대해 관찰된 역가(도 11a) 및 이들 mAb D 8개 클론 각각에 대해 관찰된 Qp(도 11b)를 그래프로 도해할 뿐만 아니라 평균 mAb D 클론 역가와 mAb D 클론 Qp의 비교(도 11c)를 제공한다.
도 12a-1b는 2개의 벡터 접근법과 다중 벡터 접근법 각각에 대해 2개의 특정 클론(클론 A 및 클론 B)에 대한 역가(도 12a)와 Qp(도 12b)를 비교한다.
상세한 설명
본원 발명은 재조합 단백질, 예를 들면 단일클론 항체뿐만 아니라 이로부터 유래된 조성물, 예를 들면 이중특이적 항체 및 기타 복합 형태 단백질, 예를 들면 막 단백질 복합체 및 기타 발현하기 어려운 분자를 발현하는 숙주 세포의 생산을 위한 관심 서열의 표적화된 통합을 달성하기 위한 다중 벡터 RMCE 접근법에 관한 것이다.
본원 발명은 기존의 표적화 통합 기반 접근법에 비해 특별한 이점을 제공한다. 예를 들어, 플라스미드와 같은 3개의 벡터가 동시에 통합되면 역가 개선, 제품 품질 개선, 세포 적합성 증가 등을 위해 적어도 15개 유전자(5개 사슬/공여자 플라스미드)가 단일 TI 부위에 동시에 도입될 수 있다. 마찬가지로, 4개의 플라스미드가 동시에 통합되면 역가 개선, 제품 품질 개선, 세포 적합성 증가 등을 위해 적어도 20개 유전자(5개 사슬/공여자 플라스미드)가 그러할 수 있다.
본원에 기재된 다중 벡터 RMCE 접근법은 또한 간소화된 벡터, 예를 들면 플라스미드 작제를 허용한다. 특정 실시형태에서, 이러한 작제는 단일 통합 부위에 최대 9개의 사슬을 갖는 mAb 및 1-세포 복합체 형식 모두에 대한 1 단계 6 방향 결찰로 간소화될 수 있다. 유사하게, 본원에 기재된 다중 벡터 RMCE 접근법은 또한 4개 또는 5개 또는 그 초과의 독특한 유전자를 함유하는 복잡한 이중특이적 및 삼중특이적 항체가 동시에 숙주 게놈에 통합되어 높은 역가 및 높은 제품 품질의 생성물을 발현하는 세포주를 생성하는 것을 허용한다. 이에 더하여, 3개 벡터 RMCE를 이용하면 유전자 요법 제품을 만드는 데 필요한 모든 유전자를 포함하는 고유한 플라스미드를 동시에 숙주 게놈에 통합할 수 있다. 마지막으로 Crispr/Cas 또는 아연 핑커 또는 TALEN 또는 무작위 통합을 통해 추가의 고유 RSS 부위를 추가할 수 있으며, 이러한 고유 RSS 부위가 Cre 및 Flp 이외의 재조합효소(예: φC31 통합효소 및 Bxb1 등)에 해당하는 경우 이는 하나 이상의 착지 패드에 추가 유전자의 동시 통합을 촉진할 것이다.
제한 없이 개시의 명확성을 위해, 상세한 설명은 다음의 하위섹션으로 나눠진다:
1. 정의
2. 외인성 뉴클레오티드 서열
3. 숙주 세포
4. 표적화 통합
5. 생성물
1. 정의
달리 정의되지 않으면, 본원에 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우에, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 비록 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법과 재료가 본원에 개시된 요부의 실시 또는 시험에 이용될 수 있지만, 바람직한 방법과 재료가 아래에 기술되어 있다. 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 온전히 참고로 포함된다. 본원에 개시된 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시일 뿐이며 제한하려는 의도는 아니다.
본원에 이용된 용어 "포함하다", "내포하다", "갖는", "갖다" "할 수 있다", "함유하다", 그리고 이들의 변이체는 추가적인 행위나 구조의 가능성을 배제하지 않는 개방형 이행 문구, 용어 또는 단어인 것으로 의도된다. 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 달리 명시하지 않으면 복수 대상을 포함한다. 본원 발명은 또한 명시적으로 기재되었는지 여부에 관계없이 본원에 제시된 실시형태 또는 요소를 "포함하는", "이들로 구성되는" 및 "이들로 본질적으로 구성되는" 다른 실시형태를 고려한다.
본원에서 숫자 범위를 기술하기 위해, 동일한 정밀도로 그 사이에 각 개재성 숫자가 명시적으로 고려된다. 예를 들어, 6-9 범위의 경우 6과 9 이외에 숫자 7과 8이 고려되고, 6.0-7.0 범위의 경우 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명시적으로 고려된다.
본원에 이용된 용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 상기 값이 어떻게 측정되거나 결정되는지, 다시 말하면, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 당해 분야의 관례에 따라, 3 이내 또는 3보다 큰 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 소정의 값의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 더 바람직하게는 최대 5%, 더 바람직하게는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 상기 용어는 값의 1 크기 자릿수 이내, 바람직하게는 5배 이내, 더 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다.
본원에 이용된 용어 "선택 마커"는 유전자를 보유하는 세포가 상응하는 선택 작용제의 존재에서, 위하여 또는 대항하여 특이적으로 선택되도록 허용하는 유전자일 수 있다. 예를 들어, 그러나 제한 없이, 선택 마커는 선택 마커 유전자로 형질전환된 숙주 세포가 유전자의 존재하에 양성으로 선택되도록 허용할 수 있다; 형질전환되지 않은 숙주 세포는 선택 조건하에 성장하거나 생존할 수 없을 것이다. 선택 마커는 양성, 음성 또는 이중기능성일 수 있다. 양성 선택 마커는 이러한 마커를 보유하는 세포에 대한 선택을 허용할 수 있고, 반면 음성 선택 마커는 이러한 마커를 보유하는 세포가 선택적으로 제거되도록 허용할 수 있다. 선택 마커는 약물에 대한 내성을 부여하거나 숙주 세포에서 대사 또는 이화 결함을 보완할 수 있다. 원핵 세포에서, 그 중에서도 특히, 암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신 또는 클로람페니콜에 대한 내성을 부여하는 유전자가 이용될 수 있다. 진핵 세포에서 선택 마커로서 유용한 내성 유전자에는 아미노글리코시드 인산전달효소(APH)(예를 들면, 히그로마이신 인산전달효소(HYG), 네오마이신 및 G418(APH), 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나아제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티디놀 탈수소효소(히스티디놀 D)에 대한 유전자, 그리고 푸로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 마이코페놀산에 대한 내성을 인코딩하는 유전자가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 추가 마커 유전자는 WO 92/08796 및 WO 94/28143에 기술되어 있다.
상응하는 선택 작용제의 존재하에 선택을 용이하게 하는 것 외에도, 선택 마커는 대안적으로, 세포 내에 정상적으로는 존재하지 않는 분자, 예를 들면, 녹색 형광 단백질(GFP), 강화된 GFP(eGFP), 합성 GFP, 황색 형광 단백질(YFP), 강화된 YFP(eYFP), 청록색 형광 단백질(CFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, DsRed-단량체, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, mCFPm, Cerulean 및 T-Sapphire를 인코딩하는 유전자를 제공한다. 이러한 유전자를 보유하는 세포는, 예를 들면 인코딩된 폴리펩티드에 의해 방출되는 형광을 검출함으로써 이 유전자를 보유하지 않는 세포와 구별될 수 있다.
본원에 이용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 구성요소가 병치된 것을 의미하며, 여기서 이들 구성요소는 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서가 코딩 서열의 전사를 조절하는 역할을 하는 경우 프로모터 및/또는 인핸서는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시형태에서, "작동가능하게 연결"되는 DNA 서열은 단일 염색체 상에서 연속하고 인접한다. 특정 실시형태에서, 예를 들면 분비 리더 및 폴리펩티드와 같은 두 개의 단백질 인코딩 영역을 연결하는 것이 필요한 경우, 이들 서열은 연속하고, 인접하고, 동일한 해독틀 내에 있다. 특정 실시형태에서, 작동가능하게 연결된 프로모터는 코딩 서열의 상류에 위치하며 이것에 인접할 수 있다. 특정 실시형태에서, 예를 들면 코딩 서열의 발현을 조절하는 인핸서 서열과 관련하여, 이들 두 구성요소는 비록 인접하지는 않지만 작동가능하게 연결될 수 있다. 인핸서가 코딩 서열의 전사를 증가시키는 경우 인핸서는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 인핸서는 코딩 서열의 상류, 이들 내에, 또는 이들의 하류에 위치할 수 있으며, 코딩 서열의 프로모터로부터 상당한 거리를 두고 위치할 수 있다. 작동가능한 연결은 당해 분야에 알려진 재조합 방법에 의해, 예를 들면, PCR 방법을 이용하여 및/또는 편의한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성될 수 있다. 편의한 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 기존 관례에 따라 이용할 수 있다. 내부 리보솜 진입 부위(IRES)는 5' 말단 독립적 방식으로 내부 위치에서 ORF 번역의 개시를 허용하는 경우 개방 해독틀(ORF)에 작동가능하게 연결된다.
본원에 이용된 용어 "발현"은 전사 및/또는 번역을 의미한다. 특정 실시형태에서, 원하는 생성물의 전사 수준은 존재하는 상응하는 mRNA의 양에 기초하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 관심 서열로부터 전사된 mRNA는 PCR 또는 노던 혼성화에 의해 정량화될 수 있다. 특정 실시형태에서, 관심 서열에 의해 인코딩된 단백질은 다양한 방법에 의해, 예를 들면 ELISA에 의해, 단백질의 생물학적 활성을 검정하거나, 또는 단백질을 인식하고 결합하는 항체를 이용하는 웨스턴 블롯팅 또는 방사면역분석과 같은 활성과 무관한 분석법을 이용하여 정량화될 수 있다.
용어 "관심 서열"은 폴리펩티드 서열(또는 특정 경우에는 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 핵산)을 지칭하기 위해 본원에서 이용되며, 여기서 폴리펩티드 서열의 발현이 관심 대상이다. 이러한 폴리펩티드 서열은 특정 실시형태에서 다중아단위 단백질 복합체의 아단위를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 폴리펩티드 서열은 이러한 아단위의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 폴리펩티드 서열은 특정 실시형태에서 항체 서열, 예를 들면 항체 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 폴리펩티드 서열은 이러한 항체 서열의 단편을 포함할 수 있다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 이용되며, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체), 절반 항체 및 항체 단편(이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한)을 포함하지만 이들에 국한되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
본원에 이용된 "표준 항체" 및 "표준 단일클론 항체"는 단일 결합 특이성을 갖는 항체 또는 항체 단편이다. 특정 실시형태에서, 표준 항체의 단일 결합 특이성은 중쇄 서열 또는 이의 단편과 경쇄 서열 또는 이의 단편의 대합의 결과이다.
본원에 이용된 "이중특이적 항체" 또는 "BsAb"는 2개의 별개의 에피토프, 예를 들면 2개의 별개의 항원 상의 2개의 별개의 에피토프 또는 단일 항원 상의 2개의 별개의 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 항체이다. BsAb는 첫 번째 부모 항체의 결합 특이성을 갖는 BsAb의 하나의 "팔"(즉, 하나의 대합된 VH 및 VL)과 두 번째 부모 항체의 결합 특이성을 갖는 BsAb의 두 번째 "팔"을 생성하는, 두 개의 서로 다른 부모 단일클론 항체의 대합된 가변 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 구조를 비롯한 수많은 별개의 구조를 포괄한다. BsAb는 다중특이적 항체의 부분집합이며, 여기서 다중특이적 항체는 적어도 2개의 결합 특이성(즉, BsAb)을 포함하지만 삼중특이적 항체뿐만 아니라 더 높은 수의 특이성을 갖는 항체도 포함한다.
본원에 이용된 용어 "항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는, 온전한 항체 이외의 분자를 의미한다. 항체 단편의 예에는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자(예를 들면, scFv); 그리고 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본원에 이용된 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체와 항원의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. 선천적 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각, VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다. 참조: 예를 들면, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007). 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원 결합 특이성을 부여하는 데 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각, 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 참조: 예를 들면, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
본원에 이용된 용어 "벡터"는 자신이 연결된 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 상기 용어에는 자기 복제 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입된 벡터가 포함된다. 특정 실시형태에서 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 주도한다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
본원에 이용된 용어 "상동성 서열"은 서열 정렬에 의해 결정된 바와 같이 유의미한 서열 유사성을 공유하는 서열을 의미한다. 예를 들어, 두 서열은 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 99.9% 상동성일 수 있다. 정렬은 BLAST, FASTA 및 HMME를 포함하지만 이들에 국한되지 않는 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램에 의해 수행되며, 이는 서열을 비교하고 서열 길이, 서열 동일성 및 유사성, 서열 부정합 및 갭의 존재와 길이와 같은 요인을 기반으로 정합의 통계적 유의성을 계산한다. 상동성 서열은 DNA 서열과 단백질 서열 모두를 의미할 수 있다.
본원에 이용된 용어 "측접"은 첫 번째 뉴클레오티드 서열이 두 번째 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 중 어느 한쪽, 또는 양쪽 말단에 위치한다는 것을 의미한다. 측접 뉴클레오티드 서열은 두 번째 뉴클레오티드 서열에 인접하거나 두 번째 뉴클레오티드 서열로부터 정의된 거리에 있을 수 있다. 측접 뉴클레오티드 서열의 길이에는 특별한 제한이 없다. 예를 들어, 측접 서열은 몇 개의 염기쌍 또는 수천 개의 염기쌍일 수 있다.
본원에 이용된 용어 "외인성"은 뉴클레오티드 서열이 숙주 세포로부터 유래되지 않고 전통적인 DNA 전달 방법에 의해, 예를 들면 형질감염, 전기천공 또는 형질전환 방법에 의해 숙주 세포 내로 도입된다는 것을 의미한다. 용어 "내인성"은 뉴클레오티드 서열이 숙주 세포로부터 유래된다는 것을 의미한다. "외인성" 뉴클레오티드 서열은 염기 조성이 동일하지만 "외인성" 서열이 예를 들면 재조합 DNA 기술을 통해 숙주 세포 내로 도입되는 "내인성" 대응물을 가질 수 있다.
본원에 이용된 바와 같이, "통합 부위"는 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입되는 숙주 세포 게놈 내의 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 통합 부위는 숙주 세포 게놈 상의 2개의 인접한 뉴클레오티드 사이에 있다. 특정 실시형태에서, 통합 부위는 일련의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 통합 부위는 TI 숙주 세포 게놈의 특정 유전자좌 내에 위치한다. 특정 실시형태에서, 통합 부위는 TI 숙주 세포의 내인성 유전자 내에 있다.
본원에 이용된 바와 같이, "재조합효소 인식 서열"(RRS)은 재조합효소에 의해 인식되는 뉴클레오티드 서열이며, 재조합효소 매개 재조합 사건에 필요하고 충분하다. RRS는 뉴클레오티드 서열에서 재조합 사건이 일어날 위치를 정의하는 데 이용될 수 있다. 본원에 이용된 "부적합성" RRS는 별개의 재조합효소에 의해 인식되는 RRS이다.
본원에 이용된 용어 "TI 숙주 세포"는 관심 서열을 발현하는 데 이용하기 위한 게놈 유전자좌 또는 유전자좌들, 즉 통합 부위(들)를 포함하는 세포를 의미한다. 특정 실시형태에서, TI 숙주 세포로의 SOI의 통합은 4개 이상의 RRS, 예를 들면 4개 이상의 부적합성 RRS를 포함하는 하나 이상의 통합 부위에 외인성 뉴클레오티드 서열의 존재에 의해 촉진된다.
2. 외인성 뉴클레오티드 서열
본원 발명은 외인성 뉴클레오티드 서열의 통합에 적합한 숙주 세포를 제공한다. 특정 실시형태에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 예를 들면 4개 이상의 재조합효소 인식 서열을 포함함으로써 다중 벡터(즉, 3개 이상의 벡터) RMCE 전략에 이용하기 위한 통합 부위 역할을 한다. 특정 실시형태에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 4개 이상의 부적합성 재조합효소 인식 서열을 포함하는 다중 벡터 RMCE 전략에 이용하기 위한 통합 부위 역할을 한다. 특정 실시형태에서 외인성 뉴클레오티드 서열은 관심 서열을 코딩한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 하나 이상의 관심 서열을 코딩하는 하나 이상의 외인성 뉴클레오티드 서열의 표적화 통합을 촉진할 하나 이상의 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포의 게놈 상의 통합 부위에 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포는 TI 숙주 세포로 지칭된다. 그 다음, 하나 이상의 관심 서열을 코딩하는 외인성 뉴클레오티드 서열이 TI 숙주 세포 내로 도입될 수 있고 통합이 통합 부위로 표적화될 수 있다. 아래에 개설된 바와 같이, TI 숙주 세포는 하나 이상의 관심 서열을 코딩하는 외인성 뉴클레오티드 서열의 통합을 촉진하는 요소, 예를 들면 재조합효소 인식 서열을 포함하는 외인성 뉴클레오티드 서열의 존재에 의해 정의되는 다중 통합 부위를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 통합 부위 및/또는 통합 부위에 측접하는 뉴클레오티드 서열은 실험적으로 확인될 수 있다. 특정 실시형태에서, 통합 부위 및/또는 통합 부위에 측접하는 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 외인성 뉴클레오티드 서열(여기서 외인성 서열은 그 자체로 숙주 세포 게놈 내에 하나 이상의 유전자좌에 통합됨)에 통합된 하나 이상의 SOI에 의해 인코딩된 관심 폴리펩티드를 바람직한 수준으로 발현하는 숙주 세포를 단리하기 위한 게놈 전체 스크리닝 접근법에 의해 확인될 수 있다. 특정 실시형태에서, 통합 부위 및/또는 통합 부위에 측접하는 뉴클레오티드 서열은 유전자전위효소 기반 카세트 통합 사건 후 게놈 전체 스크리닝 접근법에 의해 확인될 수 있다. 특정 실시형태에서, 통합 부위 및/또는 통합 부위에 측접하는 뉴클레오티드 서열은 무차별 무작위 통합 스크리닝에 의해 식별될 수 있다. 특정 실시형태에서, 통합 부위 및/또는 통합 부위에 측접하는 뉴클레오티드 서열은 표적 유전자좌 증폭(TLA)에 이어 차세대 서열분석(NGS) 및 전체 게놈 NGS와 같은 통상적인 염기서열분석 접근법에 의해 결정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 염색체 상의 통합 부위의 위치는 형광 현장 혼성화(FISH) 분석과 같은 통상적인 세포 생물학 접근법에 의해 결정될 수 있다.
특정 실시형태에서, 숙주 세포는 숙주 세포 게놈의 특정한 첫 번째 유전자좌 내의 첫 번째 통합 부위에 통합된 첫 번째 외인성 뉴클레오티드 서열 및 숙주 세포 게놈의 특정한 두 번째 유전자좌 내의 두 번째 통합 부위에 통합된 두 번째 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 숙주 세포 게놈의 다중 통합 부위에 통합된 다중 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
2.1 4개 이상의 RRS를 포함하는 외인성 서열
특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 4개 이상의 RRS를 포함하며, 여기서 RRS는 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 4개 이상의 부적합성 RRS를 포함한다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개 또는 그 초과의 RRS를 포함한다. 특정 실시형태에서, RRS 또는 RRS들은 LoxP 서열, LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, Lox66 서열, FRT 서열, Bxb1 attP 서열, Bxb1 attB 서열, φC31 attP 서열, 그리고 φC31 attB 서열로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 선택 마커를 포함한다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 4개의 RRS 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함한다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 4개의 부적합성 RRS 및 적어도 하나의 선택 마커를 포함한다. 특정 실시형태에서, 선택 마커는 첫 번째 RRS와 두 번째 RRS 사이에 위치한다. 특정 실시형태에서, 4개의 RRS 중 2개는 적어도 하나의 선택 마커에 측접한다, 즉 첫 번째 RRS는 선택 마커의 5' 상류에 위치하고 두 번째 RRS는 3' 하류에 위치한다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 RRS는 선택 마커의 5' 말단에 인접하고 두 번째 RRS는 선택 마커의 3' 말단에 인접한다.
특정 실시형태에서, 선택 마커는 첫 번째와 두 번째 RRS 사이에 위치하며 이들 2개의 측접 RRS는 상이하다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 측접 RRS는 LoxP L3 서열이고 두 번째 측접 RRS는 LoxP 2L 서열이다. 특정 실시형태에서, LoxP L3 서열은 선택 마커의 5'에 위치하고 LoxP 2L 서열은 선택 마커의 3'에 위치한다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 측접 RRS는 야생형 FRT 서열이고 두 번째 측접 RRS는 돌연변이체 FRT 서열이다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 측접 RRS는 Bxb1 attP 서열이고 두 번째 측접 RRS는 Bxb1 attB 서열이다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 측접 RRS는 φC31 attP 서열이고 두 번째 측접 RRS는 φC31 attB 서열이다. 특정 실시형태에서, 2개의 RRS는 동일한 방향으로 배치된다. 특정 실시형태에서, 2개의 RRS는 둘 모두 정방향 또는 역방향이다. 특정 실시형태에서, 2개의 RRS는 반대 방향으로 배치된다.
특정 실시형태에서, 선택 마커는 아미노글리코시드 인산전달효소(APH)(예를 들면, 히그로마이신 인산전달효소(HYG), 네오마이신 및 G418(APH), 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나아제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티디놀 탈수소효소(히스티디놀 D), 그리고 푸로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 또는 미코페놀산에 대한 내성을 인코딩하는 유전자일 수 있다. 특정 실시형태에서, 선택 마커는 GFP, eGFP, 합성 GFP, YFP, eYFP, CFP, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, DsRed-단량체, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, mCFPm, Cerulean 또는 T-Sapphire 마커일 수 있다.
특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 4개 이상의 RRS 중 적어도 2개와 측접하는 2개의 선택 마커를 포함하며, 여기서 첫 번째 선택 마커는 두 번째 선택 마커와 상이하다. 특정 실시형태에서, 2개의 선택 마커는 둘 모두 글루타민 합성효소 선택 마커, 티미딘 키나아제 선택 마커, HYG 선택 마커 및 푸로마이신 내성 선택 마커로 구성된 군에서 선택된다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 티미딘 키나아제 선택 마커 및 HYG 선택 마커를 포함한다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 선택 마커는 아미노글리코시드 인산전달효소(APH)(예를 들면, 히그로마이신 인산전달효소(HYG), 네오마이신 및 G418(APH), 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나아제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티디놀 탈수소효소(히스티디놀 D), 그리고 푸로마이신, 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 마이코페놀산에 대한 내성을 인코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되고, 두 번째 선택 마커는 GFP, eGFP, 합성 GFP, YFP, eYFP, CFP, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, DsRed-단량체, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, mCFPm, Cerulean 및 T-Sapphire 마커로 구성된 군에서 선택된다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 선택 마커는 글루타민 합성효소 선택 마커이고 두 번째 선택 마커는 GFP 마커이다. 특정 실시형태에서, 양쪽 선택 마커에 측접하는 2개의 RRS는 동일하다. 특정 실시형태에서, 양쪽 선택 마커에 측접하는 2개의 RRS는 상이하다.
특정 실시형태에서, 선택 마커는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시형태에서, 선택 마커는 SV40 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시형태에서, 선택 마커는 거대세포바이러스(Cytomegalovirus)(CMV) 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 선택 마커 및 IRES를 포함하며, 여기서 IRES는 선택 마커에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시형태에서, IRES에 작동가능하게 연결된 선택 마커는 GFP, eGFP, 합성 GFP, YFP, eYFP, CFP, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-red, DsRed-단량체, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, mCFPm, Cerulean 및 T-Sapphire 마커로 구성된 군에서 선택된다. 특정 실시형태에서, IRES에 작동가능하게 연결된 선택 마커는 GFP 마커이다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 IRES 및 4개 이상의 RRS 중 적어도 2개와 측접하는 2개의 선택 마커를 포함하며, 여기서 IRES는 두 번째 선택 마커에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 IRES 및 적어도 4개의 RRS 중 적어도 2개와 측접하는 3개의 선택 마커를 포함하며, 여기서 IRES는 세 번째 선택 마커에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 IRES 및 적어도 4개의 RRS 중 적어도 2개와 측접하는 3개의 선택 마커를 포함하며, 여기서 IRES는 세 번째 선택 마커에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시형태에서, 세 번째 선택 마커는 첫 번째 또는 두 번째 선택 마커와 상이하다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된 첫 번째 선택 마커 및 IRES에 작동가능하게 연결된 두 번째 선택 마커를 포함한다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 SV40 프로모터에 작동가능하게 연결된 글루타민 합성효소 선택 마커 및 IRES에 작동가능하게 연결된 GFP 선택 마커를 포함한다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 CMV 프로모터에 작동가능하게 연결된 티미딘 키나아제 선택 마커 및 HYG 선택 마커 및 IRES에 작동가능하게 연결된 GFP 선택 마커를 포함한다.
특정 실시형태에서 통합 부위로 역할을 하는 외인성 뉴클레오티드 서열은 TI 숙주 세포 게놈의 특정 유전자좌 내의 부위에 존재할 것이다. 예시적인 TI 숙주 세포 및 이들의 이용을 위한 전략은 미국 특허 출원 공개 번호 US20210002669에 상세하게 설명되어 있으며, 그 내용은 온전히 참고로 포함된다.
표적화 통합을 이용하는 특정 실시형태에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 TI 숙주 세포 게놈의 특정 유전자좌 내의 부위에 통합된다. 특정 실시형태에서, 외인성 뉴클레오티드 서열이 통합되는 유전자좌는 콘틱 NW_006874047.1, NW_ 006884592.1, NW_ 006881296.1, NW_ 003616412.1, NW_ 003615063.1, NW_ 006882936.1, 및 NW_ 003615411.1에서 선택되는 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성이다.
특정 실시형태에서, 통합된 외인성 서열의 5' 바로 옆에 있는 뉴클레오티드 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오티드 41190-45269, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 63590-207911, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 253831-491909, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 69303-79768, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 293481-315265, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2650443-2662054, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오티드 82214-97705, 그리고 이들과 적어도 50% 상동성인 서열로 구성된 군에서 선택된다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 서열의 5' 바로 옆에 있는 뉴클레오티드 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오티드 41190-45269, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 63590-207911, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 253831-491909, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 69303-79768, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 293481-315265, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2650443-2662054, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오티드 82214-97705와 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성이다.
특정 실시형태에서, 통합된 외인성 서열의 3' 바로 옆에 있는 뉴클레오티드 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오티드 45270-45490, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 207912-792374, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 491910-667813, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 79769-100059, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 315266-362442, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2662055-2701768, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오티드 97706-105117, 그리고 이들과 적어도 50% 상동성인 서열로 구성된 군에서 선택된다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 서열의 3' 바로 옆에 있는 뉴클레오티드 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오티드 45270-45490, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 207912-792374, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 491910-667813, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 79769-100059, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 315266-362442, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2662055-2701768, 또는 NW_003615411.1의 뉴클레오티드 97706-105117과 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성이다.
특정 실시형태에서, 통합된 외인성 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오티드 41190-45269, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 63590-207911, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 253831-491909, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 69303-79768, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 293481-315265, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2650443-2662054, NW_003615411.1의 뉴클레오티드 82214-97705, 그리고 이들과 적어도 50% 상동성인 서열로 구성된 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열과 5'에서 측접된다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오티드 45270-45490, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 207912-792374, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 491910-667813, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 79769-100059, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 315266-362442, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2662055-2701768, NW_003615411.1의 뉴클레오티드 97706-105117, 그리고 이들과 적어도 50% 상동성인 서열로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열과 3'에서 측접된다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열의 5'에서 측접하는 뉴클레오티드 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오티드 41190-45269, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 63590-207911, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 253831-491909, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 69303-79768, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 293481-315265, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2650443-2662054, 및 NW_003615411.1의 뉴클레오티드 82214-97705와 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성이다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열의 3'에서 측접하는 뉴클레오티드 서열은 NW_006874047.1의 뉴클레오티드 45270-45490, NW_006884592.1의 뉴클레오티드 207912-792374, NW_006881296.1의 뉴클레오티드 491910-667813, NW_003616412.1의 뉴클레오티드 79769-100059, NW_003615063.1의 뉴클레오티드 315266-362442, NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2662055-2701768, 및 NW_003615411.1의 뉴클레오티드 97706-105117과 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성이다.
특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 콘틱 NW_006874047.1, NW_ 006884592.1, NW_ 006881296.1, NW_ 003616412.1, NW_ 003615063.1, NW_ 006882936.1, NW_ 003615411.1, 그리고 이들과 적어도 50% 상동성인 서열로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시형태에서, 외인성 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열은 콘틱 NW_006874047.1, NW_ 006884592.1, NW_ 006881296.1, NW_ 003616412.1, NW_ 003615063.1, NW_ 006882936.1, 및 NW_ 003615411.1에서 선택되는 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9% 상동성이다.
특정 실시형태에서, 관심 있는 생성물을 인코딩하는 핵산은 유전자전위효소 기반 통합을 이용하여 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 유전자전위효소 기반 통합 기술은 예를 들면, Trubitsyna et al., Nucleic Acids Res. 45(10):e89 (2017), Li et al., PNAS 110(25):E2279-E2287 (2013) 및 WO 2004/009792에 개시되어 있으며, 이들은 본원에 온전히 참고로 포함된다.
표 1은 예시적인 TI 숙주 세포 통합 부위를 제공한다:
표 1 - TI 숙주 세포 통합 부위
2.2 SOI를 포함하는 외인성 뉴클레오티드 서열
특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함한다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 선택 마커 및 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함한다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 선택 마커, 적어도 하나의 외인성 SOI, 및 적어도 하나의 RRS를 포함한다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 또는 그 초과의 SOI를 포함한다. 특정 실시형태에서 SOI는 동일하다. 특정 실시형태에서, SOI는 상이하다.
위에서 언급한 바와 같이, 특정 실시형태에서 SOI는 다중아단위 단백질 복합체의 하나 이상의 아단위를 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 이러한 폴리펩티드 서열은 이러한 아단위 서열의 단편을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 관심 서열은 이러한 아단위 서열의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 그러나 제한 없이, 이러한 조합은 첫 번째 아단위 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 서열 및/또는 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째, 여섯 번째, 일곱 번째, 여덟 번째, 아홉 번째, 열 번째 또는 그 초과의 아단위 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 서열을 포함할 수 있다. 또한, 특정 실시형태에서, 이러한 조합은 첫 번째 아단위 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 별개의 변이 및/또는 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째, 여섯 번째, 일곱 번째, 여덟 번째, 아홉 번째, 열 번째 또는 그 초과의 아단위 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 별개의 변이를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서 SOI는 단일 사슬 항체 또는 이의 단편을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, SOI는 항체 중쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, SOI는 항체 경쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 항체 중쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 SOI 및 항체 경쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 SOI를 포함한다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 첫 번째 항체 중쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 SOI, 두 번째 항체 중쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 SOI, 및 항체 경쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 SOI를 포함한다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 첫 번째 항체 중쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 SOI, 두 번째 항체 중쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 SOI, 첫 번째 항체 경쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 SOI 및 항체 경쇄 서열 또는 이의 단편을 인코딩하는 두 번째 SOI를 포함한다. 특정 실시형태에서, 중쇄 및 경쇄 서열을 인코딩하는 SOI의 수는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 원하는 발현 수준을 달성하기 위해, 예를 들면 원하는 양의 이중특이적 항체 생산을 달성하기 위해 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, 중쇄 및 경쇄 서열을 인코딩하는 개별 SOI는, 예를 들면 단일 통합 부위에 존재하는 단일 외인성 핵산 서열로, 단일 통합 부위에 존재하는 다중 외인성 핵산 서열로, 또는 TI 숙주 세포 내 별개의 통합 부위에 통합된 다중 외인성 핵산 서열로 통합될 수 있다.
특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 선택 마커, 적어도 하나의 외인성 SOI 및 하나의 RRS를 포함한다. 특정 실시형태에서, RRS는 적어도 하나의 선택 마커 또는 적어도 하나의 외인성 SOI에 인접하게 위치한다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 선택 마커, 적어도 하나의 외인성 SOI, 및 2개의 RRS를 포함한다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 선택 마커 및 첫 번째 RRS와 두 번째 RRS 사이에 위치하는 적어도 하나의 외인성 SOI를 포함한다. 특정 실시형태에서, 선택 마커 및 외인성 SOI에 측접하는 2개의 RRS는 동일하다. 특정 실시형태에서, 선택 마커 및 외인성 SOI에 측접하는 2개의 RRS는 상이하다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 측접 RRS는 LoxP L3 서열이고, 두 번째 측접 RRS는 LoxP 2L 서열이다. 특정 실시형태에서, L3 LoxP 서열은 선택 마커 및 외인성 SOI의 5'에 위치하고, LoxP 2L 서열은 선택 마커 및 외인성 SOI의 3'에 위치한다.
특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 3개의 RRS 및 2개의 외인성 SOI를 포함하고, 세 번째 RRS는 첫 번째 RRS와 두 번째 RRS 사이에 위치한다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 SOI는 첫 번째 RRS와 세 번째 RRS 사이에 위치하고, 두 번째 SOI는 세 번째 RRS와 두 번째 RRS 사이에 위치한다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 SOI와 두 번째 SOI는 상이하다. 특정 실시형태에서, 첫 번째와 두 번째 RRS는 동일하고, 세 번째 RRS는 첫 번째 또는 두 번째 RRS와 상이하다. 특정 실시형태에서, 3개의 RRS 모두 상이하다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 RRS는 LoxP L3 부위이고, 두 번째 RRS는 LoxP 2L 부위이고, 세 번째 RRS는 LoxFas 부위이다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 3개의 RRS, 1개의 외인성 SOI, 및 1개의 선택 마커를 포함한다. 특정 실시형태에서, SOI는 첫 번째 RRS와 세 번째 RRS 사이에 위치하고, 선택 마커는 세 번째 RRS와 두 번째 RRS 사이에 위치한다. 특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 3개의 RRS, 2개의 외인성 SOI, 및 1개의 선택 마커를 포함한다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 SOI 및 선택 마커는 첫 번째 RRS와 세 번째 RRS 사이에 위치하고, 두 번째 SOI는 세 번째 RRS와 두 번째 RRS 사이에 위치한다.
특정 실시형태에서, 외인성 SOI는 항체, 효소, 사이토킨, 성장 인자, 호르몬, 바이러스 단백질, 세균 단백질, 백신 단백질 또는 치료 기능이 있는 단백질을 포함하지만 이들에 국한되지 않는 관심 폴리펩티드를 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 외인성 SOI는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 외인성 SOI는 단일 사슬 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단일 사슬 Fv 단편(scFv), 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 외인성 SOI는 적어도 하나의 시스-작용 요소, 예를 들면 프로모터 또는 인핸서에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시형태에서, 외인성 SOI는 CMV 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 2개의 RRS 및 2개의 RRS 사이에 위치하는 적어도 2개의 외인성 SOI를 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 2개의 RRS 사이에 위치한다. 특정 실시형태에서, 항체의 1개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 2개의 RRS 사이에 위치한다. 특정 실시형태에서, 항체의 중쇄 및 경쇄 사본의 상이한 조합을 인코딩하는 SOI는 2개의 RRS 사이에 위치한다.
특정 실시형태에서, 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열은 3개의 RRS 및 적어도 2개의 외인성 SOI를 포함하고, 세 번째 RRS는 첫 번째 RRS와 두 번째 RRS 사이에 위치한다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 SOI는 첫 번째 RRS와 세 번째 RRS 사이에 위치하고, 적어도 하나의 SOI는 세 번째 RRS와 두 번째 RRS 사이에 위치한다. 특정 실시형태에서, 첫 번째와 두 번째 RRS는 동일하고, 세 번째 RRS는 첫 번째 또는 두 번째 RRS와 상이하다. 특정 실시형태에서, 3개의 RRS 모두 상이하다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 항체의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 첫 번째 RRS와 세 번째 RRS 사이에 위치하고, 두 번째 항체의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 세 번째 RRS와 두 번째 RRS 사이에 위치한다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 항체의 1개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 첫 번째 RRS와 세 번째 RRS 사이에 위치하고, 두 번째 항체의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 세 번째 RRS와 두 번째 RRS 사이에 위치한다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 항체의 1개의 중쇄 및 3개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 첫 번째 RRS와 세 번째 RRS 사이에 위치하고, 첫 번째 항체의 1개의 경쇄 및 두 번째 항체의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 세 번째 RRS와 두 번째 RRS 사이에 위치한다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 항체의 1개의 중쇄 및 3개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 첫 번째 RRS와 세 번째 RRS 사이에 위치하고, 첫 번째 항체의 2개의 경쇄 및 두 번째 항체의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 인코딩하는 SOI는 세 번째 RRS와 두 번째 RRS 사이에 위치한다. 특정 실시형태에서, 다중 항체의 중쇄 및 경쇄 사본의 상이한 조합을 인코딩하는 SOI는 첫 번째 RRS와 세 번째 RRS 사이, 그리고 세 번째 RRS와 두 번째 RRS 사이에 위치한다.
3. 숙주 세포
특정 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵 숙주 세포이다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포이다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포, 또는 CHO K1M 숙주 세포이다.
특정 실시형태에서, 숙주 세포는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7), 인간 배아 신장 세포주(예를 들면 Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)에 설명된 바와 같은 293 또는 293 세포), 아기 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들면 Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)에 설명된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 경부 암종 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유방 종양(MMT 060562), TRI 세포(예를 들면 Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에 설명된 바와 같음), MRC 5 세포, FS4 세포, Y0 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, 및 PER.C6® 세포로 구성된 군에서 선택된다.
특정 실시형태에서, 숙주 세포는 세포주이다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 일정수의 세대 동안 배양된 세포주이다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 일차 세포이다.
특정 실시형태에서, 관심 폴리펩티드의 발현은 발현 수준이 10, 20, 30, 50, 100, 200, 또는 300 세대에 걸쳐 일정한 수준으로 유지되거나, 20% 미만으로 증가하거나 감소하면 안정적이다. 특정 실시형태에서, 관심 폴리펩티드의 발현은 배양물이 어떤 선택도 없이 유지될 수 있으면 안정적이다. 특정 실시형태에서, 관심 폴리펩티드의 발현은 관심 유전자의 폴리펩티드 생성물이 약 1 g/L, 약 2 g/L, 약 3 g/L, 약 4 g/L, 약 5 g/L, 약 10 g/L, 약 12g/L, 약 14 g/L, 또는 약 16g/L에 도달하는 경우 높다.
특정 실시형태에서, 관심 폴리펩티드는 생산되어 세포 배양 배지로 분비된다. 특정 실시형태에서, 관심 폴리펩티드는 숙주 세포 내에서 발현되고 유지된다. 특정 실시형태에서, 관심 폴리펩티드는 숙주 세포막에서 발현되고, 삽입되고, 유지된다.
관심 있는 외인성 뉴클레오티드 또는 벡터는 형질감염, 형질도입, 전기천공, 또는 주입을 포함하지만 이들에 국한되지 않는 전통적인 세포 생물학 방법에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 실시형태에서, 관심 있는 외인성 뉴클레오티드 또는 벡터는 지질 기반 형질감염 방법, 인산칼슘 기반 형질감염 방법, 양이온성 중합체 기반 형질감염 방법, 또는 나노입자 기반 형질감염을 포함하는 화학 기반 형질감염 방법에 의해 숙주 세포 내로 도입된다. 특정 실시형태에서, 관심 있는 외인성 뉴클레오티드는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노 관련 바이러스 매개 형질도입을 포함하지만 이들에 국한되지 않는 바이러스 매개 형질도입에 의해 숙주 세포 내로 도입된다. 특정 실시형태에서, 관심 있는 외인성 뉴클레오티드 또는 벡터는 유전자 총 매개 주입을 통해 숙주 세포 내로 도입된다. 특정 실시형태에서, DNA와 RNA 분자 둘 모두 본원에 기재된 방법을 이용하여 숙주 세포 내로 도입된다.
4. 표적화 통합
표적화 통합 접근법은 외인성 뉴클레오티드 서열이 숙주 세포 게놈의 하나 이상의 미리 결정된 부위에 통합되도록 허용한다. 특정 실시형태에서, 표적화 통합은 하나 이상의 RRS를 인식하는 재조합효소에 의해 매개된다. 특정 실시형태에서, 표적화 통합은 상동성 재조합에 의해 매개된다.
4.1. 다중 벡터 RMCE를 통한 표적화 통합
다중 벡터 RMCE는 하나 이상의 공여자 DNA 분자(들)를 숙주 세포 게놈의 미리 결정된 부위에 단방향으로 통합하고 공여자 DNA에 존재하는 DNA 카세트를 통합 부위가 있는 숙주 게놈의 DNA 카세트와 정확하게 교환할 수 있도록 한다. DNA 카세트는 4개의 이종특이적 RRS를 특징으로 하며, 적어도 2개가 적어도 하나의 선택 마커(특정 RMCE 예에서는 "분할 선택 마커"가 이용될 수 있음)와 적어도 하나의 외인성 SOI에 측접한다. RMCE는 표적 게놈 유전자좌 내에 2개의 이종특이적 RRS와 공여자 DNA 분자 사이에서 재조합효소에 의해 촉매되는 이중 재조합 교차 사건을 포함한다. RMCE는 SOI 또는 선택 마커의 사본을 미리 결정된 숙주 세포 게놈 유전자좌에 도입하도록 설계된다. 단지 하나의 교차 사건만을 수반하는 재조합과 달리, RMCE는 원핵 벡터 서열이 숙주 세포의 게놈 내로 도입되지 않고, 따라서 숙주 면역 또는 방어 기전의 원치 않는 촉발을 감소시키고 및/또는 예방하도록 실행될 수 있다. RMCE 절차는 여러 DNA 카세트로 반복될 수 있다. 예를 들어, RMCE 절차를 이용하여 여러 개의 개별 "전면" 카세트와 여러 개의 개별 "후면" 카세트를 쉽게 도입할 수 있다. 그러나 위에서 언급한 바와 같이, RMCE(및 기타 통합 전략)를 이용하여 적게는 1개의 카세트부터 많게는 10개 이상의 카세트를 숙주 세포 게놈의 미리 결정된 단일 부위에 도입할 수 있다. 예를 들어, 도 1-5에 개설된 바와 같이 3개의 벡터 모두 다중 벡터 RMCE 접근법에서 이용되어 3개 이상의 SOI를 단일 유전자좌에 도입할 수 있다. 특정 실시형태에서, 다중-RMCE를 이용하여 적게는 1개의 카세트부터 많게는 10개 이상의 카세트를 동시에 또는 순차적으로 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 그 초과의 별개 유전자좌에 도입할 수 있다.
특정 실시형태에서, RRS는 LoxP 서열, LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, Lox66 서열, FRT 서열, Bxb1 attP 서열, Bxb1 attB 서열, φC31 attP 서열, 그리고 φC31 attB 서열로 구성된 군에서 선택된다.
특정 실시형태에서, RRS는 Cre 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정 실시형태에서, RRS는 FLP 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정 실시형태에서, RRS는 Bxb1 인테그라아제에 의해 인식될 수 있다. 특정 실시형태에서, RRS는 φC31 인테그라아제에 의해 인식될 수 있다.
RRS가 LoxP 부위인 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 재조합을 수행하기 위해 Cre 재조합효소를 필요로 한다. RRS가 FRT 부위인 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 재조합을 수행하기 위해 FLP 재조합효소를 필요로 한다. RRS가 Bxb1 attP 또는 Bxb1 attB 부위인 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 재조합을 수행하기 위해 Bxb1 인테그라아제를 필요로 한다. RRS가 φC31 attP 또는 φC31attB 부위인 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 재조합을 수행하기 위해 φC31 인테그라아제를 필요로 한다. 이들 재조합효소는 이들 효소의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 이용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
Cre-LoxP 부위 특이적 재조합 시스템은 많은 생물학적 실험 시스템에서 폭넓게 이용되었다. Cre는 34 bp LoxP 서열을 인식하는 38-kDa 부위 특이적 DNA 재조합효소이다. Cre는 박테리오파지 P1로부터 유래되고 티로신 패밀리 부위 특이적 재조합효소에 속한다. Cre 재조합효소는 LoxP 서열 사이에 분자내와 분자간 재조합 둘 모두를 매개할 수 있다. LoxP 서열은 2개의 13 bp 역 반복과 측접된 8 bp 비회문형 코어 영역으로 구성된다. Cre 재조합효소는 13 bp 반복에 결합하고, 그것에 의하여 8 bp 코어 영역 내에서 재조합을 매개한다. Cre-LoxP 매개 재조합은 높은 효율로 발생하며 어떤 다른 숙주 인자도 필요로 하지 않는다. 2개의 LoxP 서열이 동일한 뉴클레오티드 서열 상에서 동일한 방향으로 배치되면, Cre 매개 재조합은 이들 2개의 LoxP 서열 사이에 위치된 DNA 서열을, 공유적으로 닫힌 원으로서 절제할 것이다. 2개의 LoxP 서열이 동일한 뉴클레오티드 서열 상에서 반전된 위치로 배치되면, Cre 매개 재조합은 이들 두 서열 사이에 위치된 DNA 서열의 방향을 반전시킬 것이다. LoxP 서열은 또한 서로 다른 염색체 사이의 재조합을 촉진하기 위해 서로 다른 염색체에 배치될 수 있다. 2개의 LoxP 서열이 2개의 서로 다른 DNA 분자 상에 있고 하나의 DNA 분자가 원형이면, Cre 매개 재조합은 원형 DNA 서열의 통합을 유발할 것이다.
특정 실시형태에서, LoxP 서열은 야생형 LoxP 서열이다. 특정 실시형태에서, LoxP 서열은 돌연변이 LoxP 서열이다. 돌연변이 LoxP 서열은 Cre 매개 통합 또는 대체의 효율을 증가시키기 위해 개발되었다. 특정 실시형태에서, 돌연변이 LoxP 서열은 LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox511 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5171 서열, Loxm2 서열, Lox71 서열, 그리고 Lox66 서열로 구성된 군에서 선택된다. 예를 들어, Lox71 서열은 왼쪽 13 bp 반복에서 5 bp가 돌연변이된다. Lox66 서열은 오른쪽 13 bp 반복에서 5 bp가 돌연변이된다. 야생형과 돌연변이 LoxP 서열 둘 모두 Cre 의존성 재조합을 매개할 수 있다.
FLP-FRT 부위 특이적 재조합 시스템은 Cre-Lox 시스템과 유사하다. 여기에는 효모 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)의 2 μm 플라스미드에서 파생된 풀립파아제(FLP) 재조합효소가 포함된다. FLP는 또한 티로신 패밀리 부위 특이적 재조합효소에 속한다. FRT 서열은, 각각 8 bp 스페이서에 측접하는 13 bp의 두 개의 회문 서열로 구성되는 34 bp 서열이다. FLP는 13 bp 회문 서열에 결합하고 8 bp 스페이서 내에서 DNA 절단, 교환 및 결찰을 매개한다. Cre 재조합효소와 유사하게 두 FRT 서열의 위치와 방향이 FLP 매개 재조합의 결과를 결정한다. 특정 실시형태에서, FRT 서열은 야생형 FRT 서열이다. 특정 실시형태에서, FRT 서열은 돌연변이 FRT 서열이다. 야생형과 돌연변이 FRT 서열 둘 모두 FLP 의존성 재조합을 매개할 수 있다. 특정 실시형태에서, FRT 서열은 반응성 수용체 도메인 서열 예컨대 그러나 제한 없이 타목시펜 반응성 수용체 도메인 서열에 융합된다.
Bxb1 및 φC31은 세린 재조합효소 패밀리에 속한다. 이들은 둘 모두 박테리오파지로부터 유래하며 이러한 박테리오파지에 의해 파지 게놈의 세균 게놈으로의 부위 특이적 통합을 촉진하는 용원성을 확립하는 데 이용된다. 이들 인테그라아제는 각각 원래 파지 DNA 및 세균 DNA에 위치한 부착 부위인 attP 및 attB 서열로 불리는 짧은(40-60 bp) DNA 기질 사이의 부위 특이적 재조합 사건을 촉매한다. 재조합 후, attL 및 attR 서열로 명명되는 두 개의 새로운 서열이 형성되고, 각각은 attP 및 attB로부터 유래된 절반 서열을 포함한다. 세균 DNA로부터 통합된 파지를 제거하기 위해 attL과 attR 서열 사이에 재조합이 일어날 수도 있다. 두 인테그라아제는 추가적인 숙주 인자의 도움 없이 재조합을 촉진할 수 있다. 보조 인자가 없는 경우 이들 인테그라아제는 attP와 attB 사이의 단방향 재조합을 80% 초과의 효율로 매개한다. 이러한 인테그라아제와 단방향 재조합에 의해 인식될 수 있는 짧은 DNA 서열로 인해 이러한 재조합 시스템은 유전공학 목적으로 널리 이용되는 Cre-LoxP 및 FRT-FLP 시스템에 대한 보완제로 개발되었다.
용어 "정합 RRS"는 재조합이 2개의 RRS 사이에 일어난다는 것을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 2개의 정합 RRS는 동일하다. 특정 실시형태에서, 두 RRS 모두 야생형 LoxP 서열이다. 특정 실시형태에서, 두 RRS 모두 돌연변이 LoxP 서열이다. 특정 실시형태에서, 두 RRS 모두 야생형 FRT 서열이다. 특정 실시형태에서, 두 RRS 모두 돌연변이 FRT 서열이다. 특정 실시형태에서, 2개의 정합 RRS는 서로 다른 서열이지만 동일한 재조합효소에 의해 인식될 수 있다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 정합 RRS는 Bxb1 attP 서열이고 두 번째 정합 RRS는 Bxb1 attB 서열이다. 특정 실시형태에서, 첫 번째 정합 RRS는 φC31 attB 서열이고 두 번째 정합 RRS는 φC31 attB 서열이다.
특정 실시형태에서, 표적화 통합은 다중 RMCE에 의해 달성되며, 여기서 각각 2개의 이종특이적 RRS와 측접하는 적어도 외인성 SOI 또는 적어도 하나의 선택 마커를 포함하는 다중 벡터로부터의 DNA 카세트는 모두 숙주 세포 게놈의 미리 결정된 부위에 통합된다. 특정 실시형태에서, 선택 마커는 다중 RMCE의 통합이 선택 마커의 발현을 허용하도록 첫 번째 벡터에서 부분적으로 인코딩되고 두 번째, 세 번째 또는 후속 벡터에서 부분적으로 인코딩될 수 있다.
특정 실시형태에서, 재조합효소 매개 재조합을 통한 표적화 통합은 원핵생물 벡터로부터의 서열과 함께 숙주 세포 게놈의 하나 이상의 미리 결정된 통합 부위에 통합된 선택 마커 또는 하나 이상의 외인성 SOI를 유도한다. 특정 실시형태에서, 재조합효소 매개 재조합을 통한 표적화 통합은 원핵생물 벡터로부터의 서열 없이 숙주 세포 게놈의 하나 이상의 미리 결정된 통합 부위에 통합된 선택 마커 또는 하나 이상의 외인성 SOI를 유도한다. 다중 벡터 RMCE의 특정 실시형태에서, 선택 마커 및 2개의 SOI는 첫 번째 유전자좌에 혼입될 수 있는 반면, 추가 섹션 마커 및 추가 SOI는 두 번째 유전자좌에 혼입될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 본원에 기재된 방법은 복수의 유전자좌에 복수의 SOI의 혼입을 제공하며, 여기서 각 유전자좌는 하나 이상의 SOI에 대한 혼입 부위일 수 있다.
특정 실시형태에서 관심 서열은 다중아단위 단백질 복합체의 하나 이상의 아단위의 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 폴리펩티드 서열은 이러한 아단위 서열의 단편을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 관심 서열은 이러한 아단위 서열의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 그러나 제한 없이, 이러한 조합은 첫 번째 아단위 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 서열 및/또는 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째, 여섯 번째, 일곱 번째, 여덟 번째, 아홉 번째, 열 번째 또는 그 초과의 아단위 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 서열을 포함할 수 있다. 또한, 특정 실시형태에서, 이러한 조합은 첫 번째 아단위 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 별개의 변이 및/또는 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째, 여섯 번째, 일곱 번째, 여덟 번째, 아홉 번째, 열 번째 또는 그 초과의 아단위 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 별개의 변이를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 복수의 관심 서열은 하나 이상의 항체 중쇄 서열("H") 및/또는 하나 이상의 항체 경쇄 서열("L")을 포함한다. 본원에 이용된 바와 같이, 이러한 "H" 및 "L" 서열은 가변 영역 단편 및 상보적 결정 영역 단편을 포함하지만 이들에 국한되지 않는 중쇄 또는 경쇄 단편뿐만 아니라 전장 중쇄 또는 경쇄 서열일 수 있다. 특정 실시형태에서, 관심 서열은 이러한 H 및 L 서열의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 그러나 제한 없이, 이러한 조합은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 H 서열 및/또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 L 서열을 포함할 수 있다. 더욱이, 특정 실시형태에서, 이러한 조합은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 동일하거나 상이한 별개의 H' 서열 및/또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 동일하거나 상이한 별개의 L' 서열을 포함할 수 있다. 1개 내지 10개(또는 그 초과)의 추가적인 H 및 L 서열, 예를 들면 H'', H''', L'' 및 L'''의 포함도 본원 발명에 포함된다. 예시적인 실시형태에는 다양한 별개의 H 및 다양한 별개의 L 서열의 임의의 조합, 예를 들면: HL; LH; H'L; LH'; H'L'; L'H'; HLL; HHL; LLH; LHH; H'LL; H'HL; L'HH; L'LH; H'H'L; LH'H'; HLLL; LLLH; HLHL; LHLH; H'LLL; L'LLH; H'LHL; L'HLH; 등을 포함하는 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 본원 발명은 복수의 TI 숙주 세포를 제공하는 단계; 복수의 TI 숙주 세포를 하나 이상의 SOI 및 적어도 하나의 마커를 포함하는 복수의 벡터와 접촉시키는 단계; 하나 이상의 SOI를 복수의 TI 숙주 세포 중 하나 이상에 도입하는 단계; 관심 서열을 발현하는 TI 세포를 선택하는 단계; 및 관심 서열을 발현하는 데 적합한 조건하에 세포를 배양하고 그로부터 관심 서열을 회수하는 단계를 포함하는, SOI를 발현하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 형질감염된 숙주 세포는 하나 이상의 관심 서열을 포함할 것이며, 여기서 관심 서열은 다중아단위 단백질 복합체의 하나 이상의 아단위의 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 폴리펩티드 서열은 이러한 아단위 서열의 단편을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 관심 서열은 이러한 아단위 서열의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 그러나 제한 없이, 이러한 조합은 첫 번째 아단위 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 서열 및/또는 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째, 여섯 번째, 일곱 번째, 여덟 번째, 아홉 번째, 열 번째 또는 그 초과의 아단위 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 서열을 포함할 수 있다. 더욱이, 특정 실시형태에서, 이러한 조합은 첫 번째 아단위 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 동일하거나 상이한 별개의 변이 및/또는 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째, 여섯 번째, 일곱 번째, 여덟 번째, 아홉 번째, 열 번째 또는 그 초과의 아단위 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 동일하거나 상이한 별개의 변이를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 형질감염된 숙주 세포는 하나 이상의 관심 서열을 포함할 것이며, 여기서 관심 서열은 H 및 L 서열의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 그러나 제한 없이, 이러한 조합은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 H 서열 및/또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 L 서열을 포함할 수 있다. 더욱이, 특정 실시형태에서, 이러한 조합은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 별개의 H' 서열 및/또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 초과의 별개의 L' 서열을 포함할 수 있다. 1개 내지 10개(또는 그 초과)의 추가적인 H 및 L 서열, 예를 들면 H'', H''', L'' 및 L'''의 포함도 본원 발명에 포함된다. 예시적인 실시형태에는 다양한 별개의 H 및 다양한 별개의 L 서열의 임의의 조합, 예를 들면 HL; LH; H'L; LH'; H'L'; L'H'; HLL; HHL; LLH; LHH; H'LL; H'HL; L'HH; L'LH; H'H'L; LH'H'; HLLL; LLLH; HLHL; LHLH; H'LLL; L'LLH; H'LHL; L'HLH; 등을 포함하는 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
4.2 조절된 시스템
본원 발명은 또한 TI 숙주 세포의 생성을 위한 다중 벡터 RMCE에 이용하기 위한 조절된 시스템에 관한 것이다. 예를 들어, 주로 인코딩된 단백질이 발현되기 어렵기 때문에 단백질 발현 수준이 최적이 아닌 경우가 많다. 발현되기 어려운 단백질의 낮은 발현 수준은 다양하고 원인 파악이 어려울 수 있다. 한 가지 가능성은 숙주 세포에서 발현된 단백질의 독성이다. 이러한 경우, 조절된 발현 시스템을 이용하여, 단백질을 인코딩하는 관심 서열이 유도성 프로모터의 제어하에 있는 독성 단백질을 발현할 수 있다. 이들 시스템에서, 발현되기 어려운 단백질의 발현은 조절인자, 예를 들면 테트라사이클린 또는 이의 유사체인 독시사이클린(DOX)과 같은 소분자가 배양물에 첨가되는 경우에만 촉발된다. 독성 단백질의 발현을 조절하면 독성 효과를 완화할 수 있어, 배양물이 생산 전에 원하는 세포 성장을 달성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원 발명에 따라 제조된 TI 발현 시스템은, 특정 유전자좌, 예를 들면 하나 이상의 RRS를 포함하는 외인성 핵산 서열에 통합되고 이에 작동가능하게 연결된 조절된 프로모터 하에 전사되는 SOI를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원 발명에 따라 제조된 TI 발현 시스템은 발현되기 어려운 분자, 예를 들면 항체에 대한 낮은 단백질 발현의 근본 원인을 결정하는 데 이용될 수 있다. 특정 실시형태에서, TI 시스템에서 SOI의 발현을 선택적으로 끄는 능력을 이용하여 SOI의 발현을 관찰된 역효과에 연결할 수 있다.
특정 실시형태에서, 발현되기 어려운 분자의 근본 원인 분석 동안 전사 및 세포주 가변성 효과를 최소화하기 위해 TI 시스템이 이용될 수 있다. 예를 들어, 그러나 제한 없이, TI 숙주에서 SOI의 발현은 조절제(예: 독시사이클린)을 배양물에 첨가함으로써 촉발될 수 있다. 특정 실시형태에서, TI 벡터는 테트라사이클린 조절 프로모터를 활용하여 SOI를 발현하는데, 이는 예를 들면 RRS를 포함하는 외인성 핵산 서열에 통합될 수 있으며, 이는 그 자체가 숙주 세포 게놈의 통합 부위에 통합되어 SOI의 조절된 발현을 허용한다.
특정 실시형태에서, 본원 발명에 기술된 TI 시스템은 대조 세포주와 비교하여 SOI, 예를 들면 치료 항체의 낮은 단백질 발현의 근본적인 원인(들)을 성공적으로 결정하는 데 이용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 일단 TI 세포주에서 SOI, 예를 들면 치료 항체의 더 낮은 상대적 발현이 확인되면, SOI의 세포내 축적 및 분비 수준은 단백질 번역 억제제 처리, 예를 들면 Dox 및 시클로헥시미드를 레버리징하여 평가될 수 있다.
예를 들어, 그러나 제한 없이, 이러한 조절은 구성적 또는 최소 프로모터에 대한 전사 억제인자 또는 활성인자의 조절된 커플링에 의해 mRNA 합성을 차단하거나 활성화하기 위한 유전자 스위치에 기초할 수 있다. 특정한 무제한적 실시형태에서, 억제는 억제 단백질에 결합함으로써(예를 들면 단백질이 전사 개시를 입체적으로 차단하는 경우에), 또는 전사 사일런서를 통해 전사를 적극적으로 억제함으로써 달성될 수 있다. 특정한 무제한적 실시형태에서, 포유동물 또는 바이러스 인핸서가 없는 최소 프로모터의 활성화는 활성화 도메인에 대한 조절된 커플링에 의해 달성될 수 있다.
특정 실시형태에서, 전사 억제인자 또는 활성인자의 조건부 커플링은 외부 자극에 반응하여 프로모터에 결합하는 알로스테릭 단백질을 이용함으로써 달성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 전사 억제인자 또는 활성인자의 조건부 커플링은 격리 단백질로부터 방출되어 표적 프로모터에 결합할 수 있는 세포내 수용체를 이용함으로써 달성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 전사 억제인자 또는 활성인자의 조건부 커플링은 화학적으로 유도된 이량체화제를 이용함으로써 달성될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원 발명의 TI 시스템에 이용되는 알로스테릭 단백질은 항생제, 세균 쿼럼 감지 메신저, 분해대사산물, 또는 배양 매개변수, 예를 들면 온도, 예를 들면 추위 또는 열에 반응하여 전사 활성을 조절하는 단백질일 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 TI 시스템은 예를 들면 대체 탄소원에 대한 이화 유전자를 제어하는 세균 억제인자가 포유동물 세포로 전달된 경우에 분해대사산물에 기반할 수 있다. 특정 실시형태에서, 표적 프로모터의 억제는 억제인자 CymR의 큐메이트 반응성 결합에 의해 달성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 분해대사산물 기반 시스템은 단순 포진 VP16 전사활성화 도메인에 융합된 원핵생물 억제인자 HdnoR의 6-히드록시니코틴 반응성 결합에 의한 키메라 프로모터의 활성화에 의존할 수 있다.
특정 실시형태에서 TI 시스템은 쿼럼 감지 분자에 의해 집단 내 및 집단 간 통신을 관리하는 원핵생물로부터 유래된 쿼럼 감지 기반 발현 시스템일 수 있다. 이러한 쿼럼 감지 분자는 표적 세포의 수용체에 결합하고 동족 프로모터에 대한 수용체의 친화성을 조절하여 특정 레귤론 스위치가 시작되도록 한다. 특정 실시형태에서, 쿼럼 감지 분자는 N-(3-옥소-옥타노일)-호모세린 락톤일 수 있으며, 이의 존재 시 TraR-p65 융합 단백질은 TraR 특이적 오퍼레이터 서열에 융합된 최소 프로모터로부터 발현을 활성화한다. 특정 실시형태에서, 쿼럼 감지 분자는 SCB1이 없을 때 동족 오퍼레이터인 OScbR에 결합하는 스트렙토미세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor) A3(2) ScbR 억제인자를 기반으로 하는 시스템에서 부티로락톤 SCB1(라세미 2-(1'-히드록시-6-메틸헵틸)-3-(히드록시메틸)-부타놀리드)일 수 있다. 특정 실시형태에서, 쿼럼 감지 분자는 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 쿼럼 감지 억제인자 RhlR 및 LasR이 SV40 T 항원 핵 국소화 서열 및 단순 포진 VP16 도메인에 융합되어 특정 오퍼레이터 서열(las 박스)을 포함하는 프로모터를 활성화할 수 있는 TI 시스템에 이용되는 호모세린 유래 유도인자일 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원 발명의 TI 시스템에 이용되는 알로스테릭 단백질을 조절하는 유도 분자는 큐메이트, 이소프로필-β-D-갈락토피라노시드(IPTG), 마크로라이드, 6-히드록시니코틴, 독시사이클린, 스트렙토그라민, NADH, 테트라사이클린일 수 있지만 이들에 국한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 본원 발명의 TI 시스템에 이용되는 세포내 수용체는 세포질 또는 핵 수용체일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원 발명의 TI 시스템은 소분자를 이용하여 단백질을 격리하고 억제하는 것으로부터 전사 인자의 방출을 활용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원 발명의 TI 시스템은 스테로이드 조절에 의존할 수 있으며, 여기서 호르몬 수용체는 세포질에서 HSP90으로부터 방출될 수 있는 천연 또는 인공 전사 인자에 융합되고, 핵으로 이동하며, 선택된 프로모터를 활성화한다. 특정 실시형태에서, 내인성 스테로이드 호르몬에 의한 누화를 피하기 위해 합성 스테로이드 유사체에 의해 조절되는 돌연변이 수용체가 이용될 수 있다. 특정 실시형태에서 수용체는 4-히드록시타목시펜에 반응하는 에스트로겐 수용체 변이체 또는 RU486에 의해 유도될 수 있는 프로게스테론-수용체 돌연변이체일 수 있다. 특정 실시형태에서, 인간 핵 퍼옥시솜 증식인자 활성화 수용체 γ(PPARγ)에 기초한 핵 수용체 유래 로시글리타존 반응성 전사 스위치가 본원 발명의 TI 시스템에 이용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 스테로이드 반응성 수용체의 변이체는 변형된 코리스토네우라 푸미페라나(Choristoneura fumiferana) 엑디손 수용체 및 Gal4 DNA 결합 도메인과 VP16 트랜스 활성인자에 융합된 마우스 레티노이드 X 수용체(RXR)를 기반으로 하는 RheoSwitch일 수 있다. 합성 엑디손이 있는 경우 RheoSwitch 변이체는 Gal4 반응 요소의 여러 반복에 융합된 최소 프로모터에 결합하여 이를 활성화할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 개시된 TI 시스템은 동족 오퍼레이터와 융합된 최소 코어 프로모터의 활성화를 위해 DNA 결합 단백질과 전사 활성인자의 화학적으로 유도된 이량체화를 활용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 개시된 TI 시스템은 FRB와 FKBP의 라파마이신 조절 이량체화를 활용할 수 있다. 이 시스템에서 FRB는 p65 트랜스-활성인자에 융합되고 FKBP는 조작된 최소 인터류킨-12 프로모터의 상류에 위치한 동족 오퍼레이터 부위에 특이적인 아연 핑거 도메인에 융합된다. 특정 실시형태에서, FKBP는 돌연변이될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 개시된 TI 시스템은 세균 자이라아제 B 아단위(GyrB)를 활용할 수 있으며, 여기서 GyrB는 항생제 쿠메르마이신의 존재하에 이량체화되고 노보비오신으로 해리된다.
특정 실시형태에서, 본원 발명의 TI 시스템은 조절된 siRNA 발현을 위해 이용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조절된 siRNA 발현 시스템은 테트라사이클린, 마크로라이드, 또는 OFF- 및 ON-형 QuoRex 시스템일 수 있다. 특정 실시형태에서, TI 시스템은 5' 비번역 영역에 헤어핀 구조를 형성함으로써 번역 개시를 차단하는 손톱개구리속(Xenopus) 말단 올리고피리미딘 요소(TOP)를 활용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원 발명에 기술된 TI 시스템은 기체상 제어 발현, 예를 들면 아세트알데히드 유도 조절(AIR) 시스템을 활용할 수 있다. AIR 시스템은 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) AlcR 전사 인자를 이용할 수 있으며, 이는 비독성 농도의 기체 또는 액체 아세트알데히드의 존재하에 최소 인간 거대세포바이러스 프로모터에 융합된 AlcR 특이적 오퍼레이터로부터 조립된 PAIR 프로모터를 특이적으로 활성화한다.
특정 실시형태에서, 본원 발명의 TI 시스템은 Tet-On 또는 Tet-Off 시스템을 활용할 수 있다. 이러한 시스템에서 하나 이상의 SOI의 발현은 테트라사이클린 또는 이의 유사체인 독시사이클린에 의해 조절될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원 발명의 TI 시스템은 PIP-on 또는 PIP-off 시스템을 활용할 수 있다. 이러한 시스템에서 SOI의 발현은 예를 들면 프리스티나마이신, 테트라사이클린 및/또는 에리트로마이신에 의해 조절될 수 있다.
5. 생성물
본원 발명의 숙주 세포는 관심 있는 임의의 분자의 발현을 위해 이용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원 발명의 숙주 세포는 폴리펩티드, 예를 들면 포유동물 폴리펩티드의 발현을 위해 이용될 수 있다. 이러한 폴리펩티드의 무제한적 예에는 호르몬, 수용체, 융합 단백질, 조절 인자, 성장 인자, 보체계 인자, 효소, 응고 인자, 항응고 인자, 키나아제, 사이토킨, CD 단백질, 인터류킨, 치료용 단백질, 진단용 단백질 및 항체가 포함된다. 특정 실시형태에서, 본원 발명의 숙주 세포는 치료용 단백질 또는 관심 분자를 구성적으로 또는 조절적으로 발현하면서 샤페론, 단백질 변형 효소, shRNA, gRNA 또는 기타 단백질 또는 펩티드의 발현을 위해 이용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 관심 폴리펩티드는 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 폴리펩티드, 예를 들면 이중특이적 항체이다.
본원 발명의 숙주 세포는 통상적인 세포 배양 방법에 이용되는 세포, 예를 들면 비-TI 세포와 비교하여 더 짧은 기간에 다량의 관심 분자의 생산을 위해 이용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원 발명의 숙주 세포는 통상적인 세포 배양 방법에 이용되는 세포, 예를 들면 비-TI 세포와 비교하여 관심 분자의 개선된 품질을 위해 이용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원 발명의 숙주 세포는 시간이 지남에 따라 세포 스트레스 및 클론 불안정성을 유발할 수 있는 생성물에 의해 유발될 수 있는 만성 독성을 예방함으로써 시드 트레인 안정성을 향상시키는 데 이용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원 발명의 숙주 세포는 급성 독성 생성물의 최적 발현을 위해 이용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원 발명의 숙주 세포 및 시스템은 세포 배양 공정 최적화 및/또는 공정 개발을 위해 이용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원 발명의 숙주 세포는 치료 분자의 선택된 아단위의 구성적 발현 및 동일한 치료 분자의 다른, 상이한 아단위의 조절된 발현을 위해 이용될 수 있다. 특정 실시형태에서 치료 분자는 융합 단백질일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원 발명의 숙주 세포는 완전히 조립된 항체 분자의 발현 및 분비에서 각 항체 아단위의 역할 및 효과를 이해하는 데 이용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원 발명의 숙주 세포는 조사 도구로서 이용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원 발명의 숙주 세포는 다양한 세포에서 문제가 있는 분자에 대한 낮은 단백질 발현의 근본 원인을 파악하기 위한 진단 도구로서 이용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원 발명의 숙주 세포는 관찰된 현상 또는 세포 거동을 세포에서의 이식유전자 발현에 직접적으로 연결시키는 데 이용될 수 있다. 본원 발명의 숙주 세포는 또한 관찰된 거동이 세포에서 가역적인지 여부를 입증하는 데 이용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원 발명의 숙주 세포는 세포에서 이식유전자(들) 전사 및 발현과 관련된 문제를 확인하고 완화하는 데 활용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원 발명의 숙주 세포는 발현되기 어려운 분자인 항체의 HC 및 LC 아단위와 같은 이식유전자 아단위를 시스템에서의 평균 분자의 아단위와 교환하여 문제가 있는 아단위(들)를 식별하는 데 이용될 수 있다. 그런 다음, 특정 실시형태에서, 아미노산 서열 분석을 이용하여 낮은 단백질 발현의 원인이 될 수 있는 아미노산 잔기 또는 영역을 좁히고 집중할 수 있다.
실시예
실시예 1: 2개 벡터 RMCE와 다중 벡터 RMCE의 비교
본 실시예에서, 다중 벡터 RMCE(본 실시예에서는 3개 벡터 RMCE)가 2개 벡터 RMCE와 비교하여 이용될 때 다양한 CLD 매개변수의 차이가 식별된다.
플라스미드 작제
2개 벡터 기반 RMCE의 경우 전면 및 후면 항체 표적화 벡터를 작제했다. 항체의 HC 및 LC cDNA를 L3, 프로모터 및 개시 코돈(ATG), 이어서 LoxFAS 서열을 포함하는 전면 벡터 백본, 그리고 LoxFAS, 개시 코돈이 결여된 Pac 및 2L 서열을 포함하는 후면 벡터 백본에 클로닝했다. Cre 재조합효소 플라스미드(pOG231)가 모든 RMCE 공정에 이용되었다.
3개 벡터 기반 RMCE의 경우 3개의 항체 표적화 벡터(플라스미드 1, 2 및 3)를 작제했다. 플라스미드 1은 위에서 설명한 2개 벡터 기반 RMCE에서 전면 벡터와 동일하다. 플라스미드 2 백본에는 LoxFAS, 개시 코돈이 결여된 Pac, CMV 프로모터 및 Frt3 서열이 포함되어 있다. 플라스미드3 백본에는 Frt3, NeoR 및 Frt 서열이 포함되어 있다. FlpO 재조합효소의 코딩 서열은 마우스 코돈 최적화된 서열을 기반으로 합성되었다. 상기 서열은 CMV 프로모터에 의해 구동되고 폴리아데닐화 서열을 함유하는 독점 발현 벡터에 클로닝되었다.
형질감염 및 RMCE
2개 벡터 기반 RMCE의 경우, HC 및 LC와 pOG231을 포함하는 전면 및 후면 항체 표적화 벡터를 Maxcyte STX(Maxcyte, Gaithersburg, MD)를 이용하여 전기천공법으로 TI 숙주 세포에 형질감염시킨다.
3개 벡터 기반 RMCE의 경우, HC 및 LC, pOG231, FlpO 발현 플라스미드를 포함하는 플라스미드 1, 2, 3 항체 표적화 벡터를 Maxcyte STX(Maxcyte, Gaithersburg, MD)를 이용하여 전기천공법으로 TI 숙주 세포에 형질감염시킨다.
형질감염 48시간 후, 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 그런 다음 펠렛을 독점 DMEM/F12 기반 배지 포함 선택에 재현탁하고 형질감염 풀이 회복될 때까지 37℃ 및 5% CO2에서 배양했다.
RMCE 풀의 유가식 진탕 플라스크 평가
유가식 생산 배양은 1일 차, 3일 차, 4일 차에 볼루스 공급물과 함께 독점적인 화학적으로 정의된 배지가 있는 진탕 플라스크에서 수행되었다. 실행 전반에 걸쳐 온도는 35℃로 유지되었다. 7일 차 역가는 UV 검출과 함께 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 결정되었다. Vi-Cell XR 기기(Beckman Coulter)를 이용하여 생존 퍼센트 및 생존 세포 수를 결정했다.
디지털 액적 PCR(ddPCR)에 의한 사본수 분석
1x106개 세포 펠릿으로부터의 게놈 DNA를 MagNA Pure 96 DNA 및 Viral NA Small Volume Kit(Roche Molecular Systems, 카탈로그 번호 06543588001)를 이용하여 MagNA Pure 96 기기(Roche, Molecular Systems)로 정제했다. 중국 햄스터 Bcl-2 관련 X 단백질(Bax) 및 알부민(Alb)의 사본수는 각각 HC 및 LC의 유전자 사본 결정을 위한 기준으로 이용되었다. ddPCR 반응물은 QX200 ddPCR 시스템(Bio-Rad, 카탈로그 번호 186-3010)의 매뉴얼에 따라 준비되었다. 간략히 말하면, ddPCR 반응물은 HEX로 표지화된 HC 또는 LC 프로브 및 반응당 20μl의 FAM으로 표지화된 Bax 또는 Alb 프로브를 이용하여 설정되었다. 그런 다음 샘플을 QX200 액적 발생기에 넣고 유전자 증폭기에서 PCR을 위해 액적을 96웰 평판으로 옮기고 액적을 판독했다. 순환 조건은 다음과 같다: 95℃에서 10분, 94℃에서 30초 및 60℃에서 1분의 40회 주기, 그 뒤에 효소 비활성화를 위해 98℃에서 10분. 본 연구에 이용된 프라이머와 프로브는 primer express v3.0(Life Technologies)을 이용하여 설계되었다.
디지털 액적 역전사효소 PCR에 의한 mRNA 발현
1x106개 세포 펠렛으로부터의 총 RNA를 MagNA Pure 96 Cellular RNA Large Volume Kit(Roche Molecular Systems, 카탈로그 번호 05467535001)를 이용하여 MagNA Pure 96 기기(Roche, Molecular Systems)로 정제하고 Nanodrop 2000 분광광도계(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 ND-2000)를 이용하여 정량화했다. One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes(Bio-Rad, 카탈로그 번호 1864022)를 이용하여 ddRT-PCR을 수행하는 데 약 20-40pg의 RNA가 이용되었다. IgG 중쇄 및 경쇄에 대한 프라이머와 프로브는 유전자 사본 분석에 이용된 것들과 동일했다. Bio-Rad QX200 ddPCR 시스템(Bio-Rad, 카탈로그 번호 186-3010)을 이용하여 액적 생성, 열 순환 및 액적 판독을 실행했다. 열 순환 조건은 50℃에서 1시간, 95℃에서 10분, 95℃에서 30초와 58℃에서 1분의 40회 주기, 그 뒤에 효소 비활성화를 위해 98℃에서 10분이었다. 결과 농도는 총 RNA 20pg당 사본으로 정규화되었다.
표 2. 다중 벡터 RMCE(본 실시예에서는 3개 벡터 RMCE)를 2개 벡터 RMCE와 비교하여 이용할 때 다양한 CLD 매개변수의 차이가 식별된다.
실시예 2: 2개 벡터 RMCE와 다중 벡터 RMCE의 Ambr
®
250 비교
본 실시예에서는 Ambr® 250 시스템(TAP Biosystem)에서 배양된 항체를 발현하는 세포주 간에 유전자 사본수와 mRNA 발현을 비교하는데, 한 세포주는 2-플라스미드 RMCE 접근법을 이용하여 준비되고 두 번째 세포주는 다중 벡터 RMCE 접근법을 이용하여 준비된다. 2-플라스미드 접근법에서, 각각의 플라스미드는 중쇄 코딩 서열의 1개 사본 및 경쇄 코딩 서열의 2개 사본을 포함한다("HLL-HLL"). 다중 벡터 접근법에서, 각각의 플라스미드는 유사하게 중쇄 코딩 서열의 1개 사본 및 경쇄 코딩 서열의 2개 사본을 포함한다. 그러나 다중 벡터 RMCE에 세 번째 플라스미드의 존재를 고려하면 이 접근법은 "HLL-HLL-HLL" 구성을 야기한다.
12개의 클론이 Ambr® 250 시스템(TAP Biosystem)에서 평가된다. Ambr® 250 시스템은 제조업체가 권장한 대로 본 실시예에서 이용되는 일회용 250mL 미니 생물반응기를 이용하는 높은 처리량의 자동화 접근법이다. 간략히 말하면, 3천만 개의 세포를 pH 7.15의 화학적으로 정의된 독점 생산 배지에 파종하고, 배양 온도를 처음 48시간 동안 37℃로 유지한다. 그런 다음 나머지 배양 기간 동안 배양 온도를 35℃로 변경한다. 14일 유가식 배양에서 1일 차, 3일 차, 6일 차, 9일 차 및 12일 차에 5번의 볼루스 공급을 이용한다. 세포 생존력 및 생존 세포 수는 BioProfile Flex2(Nova Biomedical)를 이용하여 트리판 블루 염료 배제로 모니터링된다.
실시예 3: 2개 벡터 RMCE와 2개 부위 다중 벡터 RMCE의 비교
본 실시예에서, 다중 벡터 RMCE(본 실시예에서는 3개 벡터 RMCE, 여기서 2개의 벡터가 첫 번째 부위에 통합되고 세 번째 벡터가 두 번째 부위에 통합됨)를 2개 벡터 RMCE와 비교하여 이용할 때 다양한 CLD 매개변수의 차이가 식별된다. 항체 발현 구조물은 도 7에 도시된 것을 제외하고, 실시예 1에 설명된 대로 제조되었다. 간략히 말하면, "G" 부위의 녹색 형광 단백질(GFP) 랜딩 패드는 위에서 설명한 처음 2개의 플라스미드의 혼입을 위해 예시된 대로 이용되고, 관련 도면에서 "B" 부위의 청색 형광 단백질(BFP) 랜딩 패드는 Frt 및 Frt3 재조합효소 부위와 측접하는 제오신 내성 유전자(ZeoR) 및 (BFP)로 구성된다. 프로모터가 없는 Neo는 Frt 부위의 하류에 배치된다. "B" 부위에 대한 항체 표적화 벡터에는 SAT 유전자, 그리고 HC 및 LC cDNA, 이어서 프로모터(이들 모두 Frt3 및 Frt와 측접함)의 다양한 사본을 인코딩하는 mAb 발현 카세트가 포함되어 있다.
도 8a-8b는 2개 플라스미드 기반 RMCE와 2개 부위 다중 벡터 플라스미드(이 경우 3개 플라스미드) 기반 RMCE를 이용하는 TI 형질감염 풀의 생산성 비교를 도시한다. 역가(막대)와 Qp(점) 둘 모두 mAb A의 2개 부위 다중 벡터 플라스미드 기반 TI 풀(도 8a)과 mAb B의 TI 풀(도 8b)의 경우에 더 높다.
실시예 4: 2개 벡터 RMCE와 다중 벡터 RMCE의 비교
본 실시예에서는 mAb C, mAb D 및 mAb E의 2개 벡터 및 다중 벡터 RMCE(이 경우 3개 플라스미드 RMCE) 진탕 플라스크 배양액을 위에서 설명한 대로 준비하고 7일 동안 배양했다. 7일 배양이 완료되면 표 3에 보고된 바와 같이 mAb C, mAb D 및 mAb E의 다양한 TI 풀에 대해 특정 CLD 매개변수가 평가되었다. 이러한 결과는 또한 도 9a(역가)와 도 9b(Qp)에 그래프로 도시된다.
표 3.
실시예 5: 2개 벡터 RMCE와 다중 벡터 RMCE의 Ambr15
®
비교
본 실시예에서 mAb C 또는 mAb D를 발현하는 세포주는 위에서 설명한 대로 2개 벡터 또는 다중 벡터 RMCE(이 경우 3개 플라스미드 RMCE)를 이용하여 준비되었다. mAb C 및 mAb D 각각의 개별 클론(각 항체에 대해 2개 벡터 RMCE 및 다중 벡터 RMCE 각각 4개)의 Ambr15 ® 배양(TAP Biosystem)을 수행했으며 다중 벡터 RMCE 클론은 표 4에 보고된 바와 같이 2개 벡터 RMCE 클론에 비해 더 높은 평균 역가 및 더 높은 평균 Qp를 나타냈다.
표 4.
도 10a는 8개의 mAb C 클론 각각에 대해 관찰된 역가를 그래프로 나타내는 반면, 도 10b는 이들 mAb C 8개 클론 각각에 대해 관찰된 Qp를 그래프로 나타낸다. 도 10c는 평균 mAb C 클론 역가와 mAb C 클론 Qp를 비교한다. 유사하게, 도 11a는 8개의 mAb D 클론 각각에 대해 관찰된 역가를 그래프로 나타내는 반면, 도 11b는 이들 8개의 mAb D 클론 각각에 대해 관찰된 Qp를 그래프로 나타낸다. 도 11c는 평균 mAb D 클론 역가와 평균 mAb D 클론 Qp를 비교한다. 대조적으로, 도 12a-12b는 2개 벡터 및 다중 벡터 접근법 각각에 대해 2개의 특정 클론(클론 A 및 클론 B)에 대한 역가(도 12a) 및 Qp(도 12b)를 비교한다. 도 12a-12b에 그래프로 제시된 데이터는 아래 표 5에도 제시되어 있다.
표 5.
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선행 실시예는 본원에 개시된 요부를 단지 예시하며, 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다.
묘사되고 청구된 다양한 실시형태에 더하여, 개시된 요부는 본원에 개시되고 청구된 특질의 다른 조합을 갖는 다른 실시형태에 또한 관계한다. 따라서, 본원에 제시된 특정 특질은 개시된 요부가 본원에 개시된 특질의 임의의 적합한 조합을 포함하도록, 개시된 요부의 범위 내에서 다른 방식으로 서로 조합될 수 있다. 개시된 요부의 특정한 실시형태에 관한 전술한 설명은 예시 및 설명의 목적으로 제시되었다. 이것은 완전하거나 개시된 요부를 개시된 실시형태로만 한정하려는 의도는 아니다.
다양한 변형과 변이가 개시된 요부의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서, 개시된 요부의 조성물과 방법에서 만들어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 개시된 요부는 첨부된 청구항의 범위 안에 있는 변형과 변이 및 이들의 등가물을 포함하는 것으로 의도된다.
다양한 간행물, 특허 및 특허 출원이 본원에 인용되는데, 이들의 내용은 본원에 온전히 참고로 포함된다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (41)
- 표적화 통합(TI) 숙주 세포이며,
다음 서열 내에 있는 통합 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하고:
a) NW_006874047.1의 뉴클레오티드 41190-45269의 전부 또는 일부,
NW_006884592.1의 뉴클레오티드 63590-207911의 전부 또는 일부,
NW_006881296.1의 뉴클레오티드 253831-491909의 전부 또는 일부,
NW_003616412.1의 뉴클레오티드 69303-79768의 전부 또는 일부,
NW_003615063.1의 뉴클레오티드 293481-315265의 전부 또는 일부,
NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2650443-2662054의 전부 또는 일부, 또는
NW_003615411.1의 뉴클레오티드 82214-97705의 전부 또는 일부
와 적어도 약 90% 상동성인 서열, 또는
b) NW_006874047.1의 뉴클레오티드 45270-45490의 전부 또는 일부,
NW_006884592.1의 뉴클레오티드 207912-792374의 전부 또는 일부,
NW_006881296.1의 뉴클레오티드 491910-667813의 전부 또는 일부,
NW_003616412.1의 뉴클레오티드 79769-100059의 전부 또는 일부,
NW_003615063.1의 뉴클레오티드 315266-362442의 전부 또는 일부,
NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2662055-2701768의 전부 또는 일부, 또는
NW_003615411.1의 뉴클레오티드 97706-105117의 전부 또는 일부
와 적어도 약 90% 상동성인 서열,
여기서 외인성 뉴클레오티드 서열은 4개 이상의 부적합성 재조합 인식 서열(RRS)을 포함하는 것인 TI 숙주 세포. - 제1항에 있어서, RRS는 LoxP 서열, LoxP L3 서열, LoxP 2L 서열, LoxFas 서열, Lox5 ll 서열, Lox2272 서열, Lox2372 서열, Lox5 l7l 서열, Loxm2 서열, Lox7l 서열, Lox66 서열, FRT 서열, Bxbl attP 서열, Bxbl attB 서열, φC31 attP 서열 및 φC31 attB 서열로 구성된 군에서 선택되는 것인 TI 숙주 세포.
- 제1항에 있어서, RRS는 Cre 재조합효소, FLP 재조합효소, Bxbl 인테그라아제 및 φC31 인테그라아제로 구성된 군에서 선택된 재조합효소에 의해 인식되는 것인 TI 숙주 세포.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 5' 최말단 RRS와 3' 방향으로 그 다음 RRS 사이에 위치하는 선택 마커를 포함하는 것인 TI 숙주 세포.
- 제4항에 있어서, 선택 마커는 아미노글리코시드 인산전달효소(APH), 히그로마이신 인산전달효소(HYG), 네오마이신, G418(APH), 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나아제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티디놀 탈수소효소(히스티디놀 D), 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 미코페놀산으로 구성된 군에서 선택되는 것인 TI 숙주 세포.
- 제5항에 있어서, 두 번째 선택 마커를 추가로 포함하고, 여기서 첫 번째 선택 마커와 두 번째 선택 마커는 서로 다른 것인 TI 숙주 세포.
- 제6항에 있어서, 두 번째 선택 마커는 아미노글리코시드 인산전달효소(APH), 히그로마이신 인산전달효소(HYG), 네오마이신, G418(APH), 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR), 티미딘 키나아제(TK), 글루타민 합성효소(GS), 아스파라긴 합성효소, 트립토판 합성효소(인돌), 히스티디놀 탈수소효소(히스티디놀 D), 블라스티시딘, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 미코페놀산으로 구성된 군에서 선택되는 것인 TI 숙주 세포.
- 제6항에 있어서, 세 번째 선택 마커 및 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함하고, 여기서 IRES는 세 번째 선택 마커에 작동가능하게 연결되는 것인 TI 숙주 세포.
- 제8항에 있어서, 세 번째 선택 마커는 첫 번째 또는 두 번째 선택 마커와 다른 것인 TI 숙주 세포.
- 제9항에 있어서, 세 번째 선택 마커는 녹색 형광 단백질(GFP) 마커, 강화된 GFP(eGFP) 마커, 합성 GFP 마커, 황색 형광 단백질(YFP) 마커, 강화된 YFP(eYFP) 마커, 청록색 형광 단백질(CFP) 마커, mPlum 마커, mCherry 마커, tdTomato 마커, mStrawberry 마커, J-red 마커, DsRed-단량체 마커, mOrange 마커, mKO 마커, mCitrine 마커, Venus 마커, YPet 마커, Emerald6 마커, CyPet 마커, mCFPm 마커, Cerulean 마커 및 T-Sapphire 마커로 구성된 군에서 선택되는 것인 TI 숙주 세포.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, TI 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포인 TI 숙주 세포.
- 제11항에 있어서, TI 숙주 세포는 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포인 TI 숙주 세포.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, TI 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포, 또는 CHO K1M 숙주 세포인 TI 숙주 세포.
- 관심 서열(SOI)을 발현하는 TI 숙주 세포를 제조하는 방법이며,
a) 다음 서열 내에 있는 통합 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계이며:
a. NW_006874047.1의 뉴클레오티드 41190-45269의 전부 또는 일부,
NW_006884592.1의 뉴클레오티드 63590-207911의 전부 또는 일부,
NW_006881296.1의 뉴클레오티드 253831-491909의 전부 또는 일부,
NW_003616412.1의 뉴클레오티드 69303-79768의 전부 또는 일부,
NW_003615063.1의 뉴클레오티드 293481-315265의 전부 또는 일부,
NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2650443-2662054의 전부 또는 일부, 또는
NW_003615411.1의 뉴클레오티드 82214-97705의 전부 또는 일부
와 적어도 약 90% 상동성인 서열, 또는
b. NW_006874047.1의 뉴클레오티드 45270-45490의 전부 또는 일부,
NW_006884592.1의 뉴클레오티드 207912-792374의 전부 또는 일부,
NW_006881296.1의 뉴클레오티드 491910-667813의 전부 또는 일부,
NW_003616412.1의 뉴클레오티드 79769-100059의 전부 또는 일부,
NW_003615063.1의 뉴클레오티드 315266-362442의 전부 또는 일부,
NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2662055-2701768의 전부 또는 일부, 또는
NW_003615411.1의 뉴클레오티드 97706-105117의 전부 또는 일부
와 적어도 약 90% 상동성인 서열,
외인성 뉴클레오티드 서열은 4개 이상의 부적합성 RRS를 포함하는 것인 단계,
b) 상기 a)에 제공된 세포에 적어도 3개의 벡터를 도입하고,
각 벡터는
a. 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상에서 순차적으로 배향된 2개의 RRS와 정합하는 2개의 RRS, 및
b. 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 두 번째 선택 마커에 측접하는 RRS의 각 쌍
을 포함하는 것인 단계,
c) 재조합효소 또는 재조합효소를 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계이며,
재조합효소는 RRS를 인식하는 것인 단계, 및
d) 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, SOI를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리하는 단계
를 포함하는 방법. - 제14항에 있어서, 재조합효소는 Cre 재조합효소, FLP 재조합효소, Bxbl 인테그라아제 및 φC31 인테그라아제에서 선택되는 것인 방법.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, SOI는 단일 사슬 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단일 사슬 Fv 단편(scFv), 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 것인 방법.
- 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, TI 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포인 방법.
- 제17항에 있어서, TI 숙주 세포는 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포인 방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, TI 숙주 세포는 CHO 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포, 또는 CHO K1M 숙주 세포인 방법.
- 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 통합 파지 벡터, 비바이러스 벡터, 트랜스포존 및/또는 유전자전위효소 벡터, 인테그라아제 기질 및 플라스미드로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
- SOI를 발현하기 위한 방법이며,
a) 다음 서열 내에 있는 통합 부위에서 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 TI 숙주 세포를 제공하는 단계이며:
a. NW_006874047.1의 뉴클레오티드 41190-45269의 전부 또는 일부,
NW_006884592.1의 뉴클레오티드 63590-207911의 전부 또는 일부,
NW_006881296.1의 뉴클레오티드 253831-491909의 전부 또는 일부,
NW_003616412.1의 뉴클레오티드 69303-79768의 전부 또는 일부,
NW_003615063.1의 뉴클레오티드 293481-315265의 전부 또는 일부,
NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2650443-2662054의 전부 또는 일부, 또는
NW_003615411.1의 뉴클레오티드 82214-97705의 전부 또는 일부
와 적어도 약 90% 상동성인 서열, 또는
b. NW_006874047.1의 뉴클레오티드 45270-45490의 전부 또는 일부,
NW_006884592.1의 뉴클레오티드 207912-792374의 전부 또는 일부,
NW_006881296.1의 뉴클레오티드 491910-667813의 전부 또는 일부,
NW_003616412.1의 뉴클레오티드 79769-100059의 전부 또는 일부,
NW_003615063.1의 뉴클레오티드 315266-362442의 전부 또는 일부,
NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2662055-2701768의 전부 또는 일부, 또는
NW_003615411.1의 뉴클레오티드 97706-105117의 전부 또는 일부
와 적어도 약 90% 상동성인 서열,
외인성 뉴클레오티드 서열은 4개 이상의 부적합성 RRS를 포함하는 것인 단계,
b) 상기 a)에 제공된 세포에 적어도 3개의 벡터를 도입하고,
각 벡터는
a. 통합된 외인성 뉴클레오티드 서열 상에서 순차적으로 배향된 2개의 RRS와 정합하는 2개의 RRS, 및
b. 적어도 하나의 외인성 SOI 및 적어도 하나의 두 번째 선택 마커에 측접하는 RRS의 각 쌍
을 포함하는 것인 단계,
c) 재조합효소 또는 재조합효소를 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계이며,
재조합효소는 RRS를 인식하는 것인 단계,
d) 선택 마커를 발현하는 TI 세포를 선택함으로써, SOI를 발현하는 TI 숙주 세포를 단리하는 단계, 및
e) SOI를 발현하는 데 적합한 조건하에서 상기 d)의 세포를 배양하고 이로부터 발현된 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는 방법. - 제21항에 있어서, 재조합효소는 Cre 재조합효소, FLP 재조합효소, Bxbl 인테그라아제 및 φC31 인테그라아제에서 선택되는 것인 방법.
- 제21항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, SOI는 단일 사슬 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단일 사슬 Fv 단편(scFv), 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 것인 방법.
- 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, TI 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포인 방법.
- 제24항에 있어서, TI 숙주 세포는 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포인 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, TI 숙주 세포는 CHO 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포, 또는 CHO K1M 숙주 세포인 방법.
- 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 통합 파지 벡터, 비바이러스 벡터, 트랜스포존 및/또는 유전자전위효소 벡터, 인테그라아제 기질 및 플라스미드로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
- 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 포유동물 세포를 생산하기 위한 방법이며,
a) 포유동물 세포 게놈의 미리 결정된 유전자좌에서 혼입된 적어도 단일의 외인성 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 제공하는 단계이며,
각 외인성 핵산은 4개 이상의 부적합성 RRS를 포함하는 것인 단계,
b) 상기 a)의 재조합 포유동물 세포에 적어도 3개의 벡터를 도입하고,
각 벡터는 포유동물 세포 게놈의 미리 결정된 유전자좌에서 혼입된 외인성 핵산에 포함된 부적합성 RRS 중 2개와 정합하는 한 쌍의 부적합성 RRS를 포함하고,
각 쌍의 부적합성 RRS는 하나 이상의 SOI에 측접하며, 상기 SOI는 항체 및/또는 하나 이상의 선택 마커를 인코딩하는 것인 단계,
c) SOI 및/또는 선택 마커를 포함하는 적어도 3개의 벡터의 도입과 동시에 또는 순차적으로 하나 이상의 재조합효소를 도입하는 단계, 및
d) SOI 및/또는 선택 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 선택하고,
이로써 항체를 인코딩하는 핵산 SOI를 포함하는 재조합 포유동물 세포를 생산하는 단계
를 포함하는 방법. - 제28항에 있어서, 외인성 핵산은 다음 유전자좌에서 혼입되는 것인 방법:
a. NW_006874047.1의 뉴클레오티드 41190-45269의 전부 또는 일부,
NW_006884592.1의 뉴클레오티드 63590-207911의 전부 또는 일부,
NW_006881296.1의 뉴클레오티드 253831-491909의 전부 또는 일부,
NW_003616412.1의 뉴클레오티드 69303-79768의 전부 또는 일부,
NW_003615063.1의 뉴클레오티드 293481-315265의 전부 또는 일부,
NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2650443-2662054의 전부 또는 일부, 또는
NW_003615411.1의 뉴클레오티드 82214-97705의 전부 또는 일부
와 적어도 약 90% 상동성인 유전자좌, 또는
b. NW_006874047.1의 뉴클레오티드 45270-45490의 전부 또는 일부,
NW_006884592.1의 뉴클레오티드 207912-792374의 전부 또는 일부,
NW_006881296.1의 뉴클레오티드 491910-667813의 전부 또는 일부,
NW_003616412.1의 뉴클레오티드 79769-100059의 전부 또는 일부,
NW_003615063.1의 뉴클레오티드 315266-362442의 전부 또는 일부,
NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2662055-2701768의 전부 또는 일부, 또는
NW_003615411.1의 뉴클레오티드 97706-105117의 전부 또는 일부
와 적어도 약 90% 상동성인 유전자좌. - 제28항 또는 제29항에 있어서, 재조합효소는 Cre 재조합효소, FLP 재조합효소, Bxbl 인테그라아제 및 φC31 인테그라아제에서 선택되는 것인 방법.
- 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, SOI는 단일 사슬 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단일 사슬 Fv 단편(scFv), 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 포유동물 세포는 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포인 방법.
- 제32항에 있어서, 포유동물 세포는 CHO 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포, 또는 CHO K1M 숙주 세포인 방법.
- 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 통합 파지 벡터, 비바이러스 벡터, 트랜스포존 및/또는 유전자전위효소 벡터, 인테그라아제 기질 및 플라스미드로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
- 하나 이상의 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 포유동물 세포를 생산하기 위한 방법이며,
a) 포유동물 세포 게놈의 미리 결정된 유전자좌에서 혼입된 적어도 2개의 외인성 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 제공하는 단계이며,
각 외인성 핵산은 4개 이상의 부적합성 RRS를 포함하고,
외인성 핵산은 동일하거나 상이한 RRS를 포함할 수 있는 것인 단계,
b) 상기 a)의 재조합 포유동물 세포에 적어도 3개의 벡터를 도입하고,
각 벡터는 포유동물 세포 게놈의 미리 결정된 유전자좌에서 혼입된 외인성 핵산 중 하나 또는 둘 모두에 포함된 부적합성 RRS 중 2개와 정합하는 한 쌍의 부적합성 RRS를 포함하고,
각 쌍의 부적합성 RRS는 하나 이상의 SOI에 측접하며, 상기 SOI는 항체 및/또는 하나 이상의 선택 마커를 인코딩하는 것인 단계,
c) SOI 및/또는 선택 마커를 포함하는 적어도 3개의 벡터의 도입과 동시에 또는 순차적으로 하나 이상의 재조합효소를 도입하는 단계, 및
d) SOI 및/또는 선택 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 선택하고,
이로써 항체를 인코딩하는 핵산 SOI를 포함하는 재조합 포유동물 세포를 생산하는 단계
를 포함하는 방법. - 제35항에 있어서, 외인성 핵산은 다음 유전자좌에서 선택된 별개의 유전자좌에서 혼입되는 것인 방법:
a. NW_006874047.1의 뉴클레오티드 41190-45269의 전부 또는 일부,
NW_006884592.1의 뉴클레오티드 63590-207911의 전부 또는 일부,
NW_006881296.1의 뉴클레오티드 253831-491909의 전부 또는 일부,
NW_003616412.1의 뉴클레오티드 69303-79768의 전부 또는 일부,
NW_003615063.1의 뉴클레오티드 293481-315265의 전부 또는 일부,
NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2650443-2662054의 전부 또는 일부, 또는
NW_003615411.1의 뉴클레오티드 82214-97705의 전부 또는 일부
와 적어도 약 90% 상동성인 유전자좌, 또는
b. NW_006874047.1의 뉴클레오티드 45270-45490의 전부 또는 일부,
NW_006884592.1의 뉴클레오티드 207912-792374의 전부 또는 일부,
NW_006881296.1의 뉴클레오티드 491910-667813의 전부 또는 일부,
NW_003616412.1의 뉴클레오티드 79769-100059의 전부 또는 일부,
NW_003615063.1의 뉴클레오티드 315266-362442의 전부 또는 일부,
NW_006882936.1의 뉴클레오티드 2662055-2701768의 전부 또는 일부, 또는
NW_003615411.1의 뉴클레오티드 97706-105117의 전부 또는 일부
와 적어도 약 90% 상동성인 유전자좌. - 제35항 또는 제36항에 있어서, 재조합효소는 Cre 재조합효소, FLP 재조합효소, Bxbl 인테그라아제 및 φC31 인테그라아제에서 선택되는 것인 방법.
- 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, SOI는 단일 사슬 항체, 항체 경쇄, 항체 중쇄, 단일 사슬 Fv 단편(scFv), 또는 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 것인 방법.
- 제35항에 있어서, 포유동물 세포는 햄스터 숙주 세포, 인간 숙주 세포, 래트 숙주 세포 또는 마우스 숙주 세포인 방법.
- 제39항에 있어서, 포유동물 세포는 CHO 숙주 세포, CHO K1 숙주 세포, CHO K1SV 숙주 세포, DG44 숙주 세포, DUKXB-11 숙주 세포, CHOK1S 숙주 세포, 또는 CHO K1M 숙주 세포인 방법.
- 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 통합 파지 벡터, 비바이러스 벡터, 트랜스포존 및/또는 유전자전위효소 벡터, 인테그라아제 기질 및 플라스미드로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
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