TW202342755A

TW202342755A - 多載體重組酶介導的匣式交換

Info

Publication number: TW202342755A
Application number: TW111149508A
Authority: TW
Inventors: 志勤多明哥黃; 艾咪申; 加文克里斯蒂安巴納德
Original assignee: 美商建南德克公司
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2022-12-22
Publication date: 2023-11-01
Also published as: WO2023122246A1

Abstract

本所揭示之主題涉及多載體重組酶介導的匣式交換方法，以達成用於生成宿主細胞的所關注序列之靶向整合，該等宿主細胞表現重組蛋白例如單株抗體及由彼等衍生的組成物例如雙特異性抗體、及其他複雜型式之蛋白質例如膜蛋白複合體、及其他難以表現的分子。

Description

多載體重組酶介導的匣式交換

本所揭示之主題涉及採用多載體重組酶介導的匣式交換方法之細胞株開發，以達成用於生成宿主細胞的所關注序列之靶向整合，該等宿主細胞表現重組蛋白例如單株抗體及由彼等衍生的組成物例如雙特異性抗體、及其他複雜型式之蛋白質例如膜蛋白複合體、及其他難以表現的分子。

由於細胞生物學及免疫學之快速發展，對開發用於多種疾病 (包括癌症、心血管疾病、及代謝疾病) 之新穎治療性重組蛋白 (例如單株抗體、雙特異性抗體、及複合體形式蛋白質) 之需求日益增加。該等生物醫藥候選物通常由能夠表現所關注蛋白質之商業細胞株來製造。舉例而言，近年來，中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞已廣泛適用於製造單株抗體或雙特異性抗體以及更多複合體形式蛋白質。

用於開發商業細胞株之習用策略通常涉及不斷致力進行關於將編碼所關注多肽之核苷酸序列之 (隨機或特定 (“靶向”)位置) 整合，之後選擇且分離產生該多肽之細胞株。然而，本技術領域需要新的細胞株開發策略，該策略不僅節省資源，而且產生的細胞株表現出相對於習知方法改善的表現水平、產物品質屬性、及製造培養物效能。

本所揭示之主題涉及多載體重組酶介導的匣式交換 (多載體 RMCE) 方法，以達成用於生成宿主細胞的所關注序列之靶向整合，該等宿主細胞表現重組蛋白例如單株抗體及由彼等衍生的組成物例如雙特異性抗體、及其他複雜型式之蛋白質例如膜蛋白複合體、及其他難以表現的分子。

在某些實施例中，本揭示涉及包含整合在如下序列內的整合位點處的外源性核苷酸序列的 TI 宿主細胞：a) 與 NW_006874047.1 之核苷酸 41190 至 45269 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 63590 至 207911 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 253831 至 491909 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 69303 至 79768 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 293481 至 315265 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2650443 至 2662054 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 82214 至 97705 的全部或部分至少約 90% 同源；或 b) 與 NW_006874047.1 之核苷酸 45270 至 45490 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 207912 至 792374 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 491910 至 667813 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 79769 至 100059 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 315266 至 362442 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2662055 至 2701768 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 97706 至 105117 的全部或部分至少約 90% 同源；且其中該外源性核苷酸序列包含四個或更多個不相容的重組識別序列 (RRS)。在某些實施例中，RRS 選自由以下所組成之群組：LoxP 序列、LoxP L3 序列、LoxP 2L 序列、LoxFas 序列、Lox5 l l 序列、Lox2272 序列、Lox2372 序列、Lox5 l7l 序列、Loxm2 序列、Lox7l 序列、Lox66 序列、FRT 序列、Bxb1 attP 序列、Bxb1 attB 序列、φC31 attP 序列及 φC31 attB 序列。在某些實施例中，RRS 藉由選自由以下所組成之群組的重組酶識別：Cre 重組酶、FLP 重組酶、Bxb1 整合酶及 φC31 整合酶。在某些實施例中，外源性核苷酸序列包含位於最 5' 的 RRS 與在 3' 方向的下一個 RRS 之間的選擇標記。在某些實施例中，該選擇標記係選自由以下所組成之群組：胺基糖苷磷酸轉移酶 (APH)、潮黴素磷酸轉移酶 (HYG)、新黴素 (neomycin)、G418 APH)、二氫葉酸還原酶 (DHFR)、胸苷激酶 (TK)、麩醯胺合成酶 (GS)、天冬醯胺合成酶、色胺酸合成酶 (吲哚)、組胺醇脫氫酶 (組胺醇 D)、殺稻瘟菌素 (blasticidin)、博萊黴素 (bleomycin)、腐草黴素 (phleomycin)、氯黴素 (chloramphenicol)、吉歐黴素 (Zeocin) 及黴酚酸 (mycophenolic acid)。在某些實施例中，該等細胞包含第二選擇標記，其中該第一選擇標記與該第二選擇標記不同。在某些實施例中，該第二選擇標記係選自由以下所組成之群組：胺基糖苷磷酸轉移酶 (APH)、潮黴素磷酸轉移酶 (HYG)、新黴素、G418 APH)、二氫葉酸還原酶 (DHFR)、胸苷激酶 (TK)、麩醯胺合成酶 (GS)、天冬醯胺合成酶、色胺酸合成酶 (吲哚)、組胺醇脫氫酶 (組胺醇 D)、殺稻瘟菌素、博萊黴素、腐草黴素、氯黴素、吉歐黴素及黴酚酸。在某些實施例中，該等細胞包含第三選擇標記和內部核醣體進入位點 (IRES)，其中 IRES 可操作地連接至第三選擇標記。在某些實施例中，第三選擇標記不同於第一選擇標記或第二選擇標記。在某些實施例中，該第三選擇標記係選自由以下所組成之群組：綠色螢光蛋白 (GFP) 標記、增強型 GFP (eGFP) 標記、合成 GFP 標記、黃色螢光蛋白 (YFP) 標記、增強型 YFP (eYFP) 標記、藍綠色螢光蛋白 (CFP) 標記、mPlum 標記、mCherry 標記、tdTomato 標記、mStrawberry 標記、J-red 標記、DsRed-單體標記、mOrange 標記、mKO 標記、mCitrine 標記、Venus 標記、YPet 標記、Emerald6 標記、CyPet 標記、mCFPm 標記、Cerulean 標記及 T-Sapphire 標記。在某些實施例中，TI 宿主細胞為哺乳動物宿主細胞. 在某些實施例中，TI 宿主細胞為倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞、或小鼠宿主細胞。在某些實施例中，TI 宿主細胞為中國倉鼠卵巢 (CHO) 宿主細胞、CHO K1 宿主細胞、CHO K1SV 宿主細胞、DG44 宿主細胞、DUKXB-11 宿主細胞、CHOK1S 宿主細胞或 CHO K1M 宿主細胞。

在某些實施例中，本揭示涉及製備表現 SOI 的 TI 宿主細胞的方法，其包含：a) 提供 TI 宿主細胞，該 TI 宿主細胞包含整合在如下序列內的整合位點處的外源性核苷酸序列：(A) 與 NW_006874047.1 之核苷酸 41190 至 45269 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 63590 至 207911 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 253831 至 491909 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 69303 至 79768 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 293481 至 315265 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2650443 至 2662054 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 82214 至 97705 的全部或部分至少約 90% 同源；或 (B) 與 NW_006874047.1 之核苷酸 45270 至 45490 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 207912 至 792374 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 491910 至 667813 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 79769 至 100059 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 315266 至 362442 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2662055 至 2701768 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 97706 至 105117 的全部或部分至少約 90% 同源；且其中該外源性核苷酸序列包含四個或更多個不相容的 RRS；b) 將至少三個載體引入 a) 中所提供的該細胞中，各載體包含：(A) 兩個 RRS，其匹配經整合外源性核苷酸序列上之兩個依序定向的 RRS；以及 (B) 各對 RRS，其側接於至少一個外源性 SOI 及至少一個第二選擇標記；c) 引入重組酶或編碼重組酶的核酸，其中該等重組酶識別該等 RRS；以及 d) 選擇表現該等選擇標記之 TI 細胞，從而分離表現該等 SOI 的 TI 宿主細胞。在某些實施例中，該等重組酶係選自 Cre 重組酶、FLP 重組酶、Bxb1 整合酶及 φC31 整合酶。在某些實施例中，SOI 編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈 Fv 片段 (scFv)、或 Fc 融合蛋白。在某些實施例中，TI 宿主細胞為哺乳動物宿主細胞.在某些實施例中，TI 宿主細胞為倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞、或小鼠宿主細胞。在某些實施例中，TI 宿主細胞為 CHO 宿主細胞、CHO K1 宿主細胞、CHO K1SV 宿主細胞、DG44 宿主細胞、DUKXB-11 宿主細胞、CHOK1S 宿主細胞、或 CHO K1M 宿主細胞。在某些實施例中，載體係選自由以下所組成之群組：腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、整合噬菌體載體、非病毒載體、轉位子及/或轉位酶載體、整合酶受質及質體。

在某些實施例中，本揭示涉及表現 SOI 的方法，其包含：a) 提供 TI 宿主細胞，該 TI 宿主細胞包含整合在如下序列內的整合位點處的外源性核苷酸序列：(A) 與 NW_006874047.1 之核苷酸 41190 至 45269 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 63590 至 207911 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 253831 至 491909 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 69303 至 79768 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 293481 至 315265 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2650443 至 2662054 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 82214 至 97705 的全部或部分至少約 90% 同源；或 (B) 與 NW_006874047.1 之核苷酸 45270 至 45490 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 207912 至 792374 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 491910 至 667813 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 79769 至 100059 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 315266 至 362442 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2662055 至 2701768 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 97706 至 105117 的全部或部分至少約 90% 同源；且其中該外源性核苷酸序列包含四個或更多個不相容的 RRS；b) 將至少三個載體引入 a) 中所提供的該細胞中，各載體包含：(A) 兩個 RRS，其匹配經整合外源性核苷酸序列上之兩個依序定向的 RRS；以及 (B) 各對 RRS，其側接於至少一個外源性 SOI 及至少一個第二選擇標記；c) 引入重組酶或編碼重組酶的核酸，其中該等重組酶識別該等 RRS；d) 選擇表現該等選擇標記之 TI 細胞，從而分離表現該等 SOI 的 TI 宿主細胞；以及 e) 在適合於表現該等 SOI 之條件下培養 d) 中的該細胞且從中回收表現的蛋白質。在某些實施例中，該等重組酶係選自 Cre 重組酶、FLP 重組酶、Bxb1 整合酶及 φC31 整合酶。在某些實施例中，SOI 編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈 Fv 片段 (scFv)、或 Fc 融合蛋白。在某些實施例中，TI 宿主細胞為哺乳動物宿主細胞.在某些實施例中，TI 宿主細胞為倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞、或小鼠宿主細胞。在某些實施例中，TI 宿主細胞為 CHO 宿主細胞、CHO K1 宿主細胞、CHO K1SV 宿主細胞、DG44 宿主細胞、DUKXB-11 宿主細胞、CHOK1S 宿主細胞、或 CHO K1M 宿主細胞。在某些實施例中，載體係選自由以下所組成之群組：腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、整合噬菌體載體、非病毒載體、轉位子及/或轉位酶載體、整合酶受質及質體。

在某些實施例中，本揭示涉及產生包含編碼抗體的核酸之重組哺乳動物細胞之方法，其包含：a) 提供至少包含含有四個或更多個不相容的 RRS 的單一外源性核酸的哺乳動物細胞，該單一外源性核酸插入在該哺乳動物細胞之基因體的預定基因座處；b) 將至少三個載體引入 a) 之重組哺乳動物細胞中，各載體包含一對不相容的 RRS，該對不相容的 RRS 匹配包含在該外源性核酸中的該等不相容的 RRS 中的兩者，該外源性核酸插入在該哺乳動物細胞之基因體的預定基因座處且各對不相容的 RRS 側接於一個或多個 SOI，其中該等 SOI 編碼抗體；c) 與引入包含該等 SOI 及/或選擇標記的該至少三個載體一起同時或依序引入一種或多種重組酶；以及 d) 選擇表現該等 SOI 及/或選擇標記中之一者或多者的細胞，從而產生包含編碼該抗體之核酸 SOI 的重組哺乳動物細胞。在某些實施例中，外源性核酸插入在如下基因座處：(A) 與 NW_006874047.1 之核苷酸 41190 至 45269 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 63590 至 207911 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 253831 至 491909 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 69303 至 79768 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 293481 至 315265 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2650443 至 2662054 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 82214 至 97705 的全部或部分至少約 90% 同源；或 (B) 與 NW_006874047.1 之核苷酸 45270 至 45490 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 207912 至 792374 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 491910 至 667813 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 79769 至 100059 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 315266 至 362442 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2662055 至 2701768 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 97706 至 105117 的全部或部分至少約 90% 同源。在某些實施例中，該等重組酶係選自 Cre 重組酶、FLP 重組酶、Bxb1 整合酶及 φC31 整合酶。在某些實施例中，SOI 編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈 Fv 片段 (scFv)、或 Fc 融合蛋白。在某些實施例中，哺乳動物細胞為倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞、或小鼠宿主細胞。在某些實施例中，該哺乳動物細胞為 CHO 宿主細胞、CHO K1 宿主細胞、CHO K1SV 宿主細胞、DG44 宿主細胞、DUKXB-11 宿主細胞、CHOK1S 宿主細胞或 CHO K1M 宿主細胞。在某些實施例中，該等載體係選自由以下所組成之群組：腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、整合噬菌體載體、非病毒載體、轉位子及/或轉位酶載體、整合酶受質及質體。

在某些實施例中，本揭示涉及產生包含編碼一種或多種抗體的核酸之重組哺乳動物細胞之方法，其包含：a) 提供包含至少兩個外源性核酸的哺乳動物細胞，該至少兩個外源性核酸插入在該哺乳動物細胞之基因體的預定基因座處，各外源性核酸包含四個或更多個不相容的 RRS，其中該等外源性核酸可包含相同或不同的 RRS；b) 將至少三個載體引入 a) 之重組哺乳動物細胞中，各載體包含一對不相容的 RRS，該對不相容的 RRS 匹配包含在該等外源性核酸中的一者或兩者中的該等不相容的 RRS 中的兩者，該等外源性核酸插入在該哺乳動物細胞之基因體的預定基因座處且各對不相容的 RRS 側接於一個或多個 SOI，其中該等 SOI 編碼抗體；c) 與引入包含該等 SOI 及/或選擇標記的該至少三個載體一起同時或依序引入一種或多種重組酶；以及 d) 選擇表現該等 SOI 及/或選擇標記中之一者或多者的細胞，從而產生包含編碼該抗體之核酸 SOI 的重組哺乳動物細胞。

在某些實施例中，外源性核酸插入在選自如下基因座的不同基因座處：(A) 與 NW_006874047.1 之核苷酸 41190 至 45269 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 63590 至 207911 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 253831 至 491909 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 69303 至 79768 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 293481 至 315265 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2650443 至 2662054 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 82214 至 97705 的全部或部分至少約 90% 同源；或 (B) 與 NW_006874047.1 之核苷酸 45270 至 45490 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 207912 至 792374 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 491910 至 667813 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 79769 至 100059 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 315266 至 362442 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2662055 至 2701768 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 97706 至 105117 的全部或部分至少約 90% 同源。在某些實施例中，該等重組酶係選自 Cre 重組酶、FLP 重組酶、Bxb1 整合酶及 φC31 整合酶。在某些實施例中，SOI 編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈 Fv 片段 (scFv)、或 Fc 融合蛋白。在某些實施例中，哺乳動物細胞為倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞、或小鼠宿主細胞。在某些實施例中，該哺乳動物細胞為 CHO 宿主細胞、CHO K1 宿主細胞、CHO K1SV 宿主細胞、DG44 宿主細胞、DUKXB-11 宿主細胞、CHOK1S 宿主細胞或 CHO K1M 宿主細胞。在某些實施例中，該等載體係選自由以下所組成之群組：腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、整合噬菌體載體、非病毒載體、轉位子及/或轉位酶載體、整合酶受質及質體。

相關申請的交叉引用

本案主張 2021 年 12 月 22 日申請的美國臨時申請序號 63/292,869 的優先權，各揭示內容據此以全文引用之方式併入。

本所揭示之主題涉及多載體 RMCE 方法，以達成用於生成宿主細胞的所關注序列之靶向整合，該等宿主細胞表現重組蛋白例如單株抗體及由彼等衍生的組成物例如雙特異性抗體、及其他複雜型式之蛋白質例如膜蛋白複合體、及其他難以表現的分子。

本所揭示之主題提供相對於習知基於目標整合的方法的特定益處。例如，若同時整合三個載體，例如質體，則可在單個 TI 位點同時引入至少 15 個基因 (5 條鏈/供體質體)，以改善效價、改善產品質量、增加細胞適應性等。類似地，若同時整合 4 個質體，則至少 20 個基因（5 條鏈/供體質體），以改善效價、改善產品質量、增加細胞適應性等。

本文所述的多載體 RMCE 方法還允許構建簡化的載體，例如質體。在某些實施例中，對於單個整合位點處具有多達 9 條鏈的 mAb 及 1 細胞複合物形式，此種構建可以藉由 1 步 6 路連接來簡化。類似地，本文所述的多載體 RMCE 方法還允許將包含 4 或 5 個或更多個獨特基因的複雜雙特異性及三特異性抗體同時整合到宿主基因體中，以產生表現高效價及高產物品質產物的細胞株。此外，三載體 RMCE 允許將包含製造基因療法產品所需之所有基因的獨特質體同時整合至宿主基因體中。最後，可經由 Crispr/Cas 或鋅指或 TALEN 或隨機整合添加額外的獨特的 RSS 位點，且若該些獨特的 RSS 位點對應於除 Cre 及 Flp 以外的重組酶（例如 φC31 整合酶及 Bxb1 等），此將有助於同時將額外的基因整合至一個或多個著陸墊中。

為了使本揭示明確之目的而非限制之目的，詳細描述分為以下子部分： 1.定義 2.外源性核苷酸序列 3.宿主細胞 4.靶向整合 5.產物 1. 定義

除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與熟習本技術領域者所通常理解之含義相同之含義。倘若出現衝突，則以本文件 (包括定義) 為準。下文闡述較佳方法及材料，惟可使用與本文所述之方法及材料類似或等效之彼等方法及材料來實踐或測試本所揭示之主題。本文所提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻均以全文引用的方式併入。本文所揭示之材料、方法及實例僅為說明性且不意欲具有限制性。

如本文所用，術語「包含」、「包括」、「具有 (having、has)」、「可」、「含有」及其變體意欲為不排除其他行為或結構之可能性之開放式連接詞 (open-ended transitional phrase)、術語、或字。除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一 (a、an)」及「該 (the)」包括複數個提及物。本揭示亦涵蓋「包含」本文所呈現之實施例或元件、「由其組成」及「基本上由其組成」之本文所呈現之實施例或元件，無論是否明確陳述。

對於本文中引用之數值範圍，明確考慮到它們之間具有相同精確度的各個中間數字。例如，對於 6-9 的範圍，除 6 和 9 以外，明確考慮到數字 7 和 8；對於 6.0-7.0 的範圍，明確考慮到數字 6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9 和 7.0。

如本文所用，術語「約」或「大約」係指特定值處於本發明所屬技術領域中具有通常知識者所確定之可接受的誤差範圍內，其部分地取決於如何測量或確定該值，即，取決於測量系統的局限性。例如，按照本發明所屬技術領域中的實務，「約」意指 3 倍或 3 倍以上的標準偏差。可替代地，「約」意指給定值的至多 20%、最佳至多 10%、更佳至多 5% 並且更佳至多 1% 的範圍。可替代地，特別是關於生物系統或過程，該術語意指數值的一個數量級內，最佳地在數值的 5 倍以內，並且更佳地在數值的 2 倍以內。

如本文所用，術語「選擇標記」可以是一種基因，其允許攜帶該基因的細胞在相應的選擇劑的存在下被特異性地選擇或排除。例如，但並非限制性地，選擇標記可允許在存在該基因的情況下，陽性篩選用選擇標記基因轉化的宿主細胞；未轉化的宿主細胞將不能在選擇條件下生長或存活。選擇標記可為陽性、陰性或雙功能選擇標記。陽性選擇標記可選擇帶有標記的細胞，而陰性選擇標記則可以選擇性排除帶有標記的細胞。選擇標記可導致藥物抗性或補償宿主細胞中之代謝或分解代謝缺陷。在原核細胞中，可使用導致對氨芐青黴素、四環素、卡那黴素或氯黴素抗性的基因。在真核細胞中用作選擇標記的抗性基因包括但不限於胺基糖苷磷酸轉移酶 (APH) (例如，潮黴素磷酸轉移酶 (HYG)、新黴素和 G418 APH)、二氫葉酸還原酶 (DHFR)、胸苷激酶 (TK)、谷胺酰胺合成酶 (GS)、天冬酰胺合成酶、色胺酸合成酶 (吲哚)、組胺醇脫氫酶 (組胺醇 D) 以及編碼對嘌呤黴素、殺稻瘟素、博萊黴素、腐草黴素、氯黴素、Zeocin 和黴酚酸的抗性的基因。更多標記基因描述於 WO 92/08796 和 WO 94/28143 中。

除在相應選擇劑存在下促進選擇之外，選擇標記還可提供編碼細胞中通常不存在的分子的基因，例如綠色螢光蛋白 (GFP)、增強型 GFP (eGFP)、合成 GFP、黃色螢光蛋白 (YFP)、增強型 YFP (eYFP)、藍綠色螢光蛋白 (CFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed 單體、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean 和 T-Sapphire。可透過檢測編碼多肽發出的螢光來區分含有該基因的細胞與不含該基因的細胞。

如本文所用，術語「可操作地連接」係指兩個或更多個組分的並置，其中組分處於使其能夠以預期方式起作用的關係。例如，如果啟動子及/或增強子起到調節編碼序列轉錄的作用，則該啟動子及/或該增強子與編碼序列可操作地連接。在某些實施例中，「可操作地連接」的 DNA 序列在一條染色體上是連續且相鄰的。在某些實施例中，例如，當需要連接兩個蛋白質編碼區 (例如分泌前導區和多肽) 時，序列是連續、相鄰的，並且在同一讀框中。在某些實施例中，可操作連接的啟動子位於編碼序列的上游，並且可以與其相鄰。在某些實施例中，例如，關於調節編碼序列之表現的增強子序列，兩種組分儘管不相鄰，但是可操作地連接。如果增強子增加了編碼序列的轉錄，則該增強子可操作地連接至該編碼序列。可操作地連接的增強子可位於編碼序列的上游、內部或下游，並且可位於距編碼序列的啟動子相當遠的距離。可操作地連接可透過本發明所屬技術領域中已知的重組方法來完成，例如，使用 PCR 方法及/或在方便的限制位點處連接。如果不存在方便的限制位點，則可以按照常規做法使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。如果內部核醣體進入位點 (IRES) 允許以 5' 末端獨立的方式在內部位置啟動 ORF 的翻譯，則認為其與開放讀框 (ORF) 可操作地連接。

如本文所用，術語「表現」係指轉錄及/或翻譯。在某些實施例中，所需產物的轉錄水平可根據存在的相應 mRNA 的量來確定。例如，可透過 PCR 或 Northern 雜交對由所關注序列轉錄的 mRNA 進行定量。在某些實施例中，由所關注序列編碼的蛋白質可藉由多種方法定量，例如藉由 ELISA、藉由測定蛋白質的生物學活性、或藉由使用辨識並結合蛋白質的抗體採用獨立於此等活性之測定 (如西方墨點法或放射免疫測定) 來定量。

本文所用之術語「所關注序列」係指多肽序列 (或在某些情況下，係指編碼多肽序列的核酸)，其中該多肽序列的表現是所關注的。在某些實施例中，此等多肽序列可包含多次單元蛋白複合物的次單元。在某些實施例中，此等多肽序列可包含此等次單元的片段。在某些實施例中，此等多肽序列可包含抗體序列，例如抗體重鏈或輕鏈序列。在某些實施例中，此等多肽序列可包含此等抗體序列的片段。

術語「抗體」在本文中以最廣義使用，並且包括各種抗體結構，其中包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體 ( 例如，雙特異性抗體)、半抗體及抗體片段，只要它們表現出所需的抗原結合活性即可。

如本文所用，「標準抗體」和「標准單株抗體」是具有單一結合特異性的抗體或抗體片段。在某些實施例中，標準抗體之單一結合特異性是重鏈序列或其片段與輕鏈序列或其片段配對的結果。

如本文所用，「雙特異性抗體」或「BsAb」是可以同時結合兩個不同抗原決定基的抗體，例如兩個不同抗原上的兩個不同抗原決定基或單個抗原上的兩個不同抗原決定基。BsAbs 包括許多不同的結構，包括那些包含兩個不同的親代單株抗體的變異重鏈 (V _H) 和輕鏈 (V _L) 結構域的配對結構，從而導致 BsAb 的一個「臂」 (即，一對 V _H和 V _LL) 具有第一親代抗體的結合特異性，並且 BsAb 的第二「臂」具有第二親代抗體的結合特異性。BsAbs 是多特異性抗體之子集，其中多特異性抗體具有至少兩種結合特異性 (即 BsAbs)，但也包括三重特異性抗體以及具有更多重特異性的抗體。

如本文所用，術語「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含完整抗體的一部分，與該完整抗體所結合之抗原結合。抗體片段的實例包括但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab') ₂；雙體；線性抗體；單鏈抗體分子 ( 例如，scFv)；及由抗體片段形成的多特異性抗體。

如本文所用，術語「變異區域區」或「變異結構域」係指參與抗體與抗原之結合的抗體重鏈或輕鏈的結構域。天然抗體之重鏈和輕鏈的變異結構域 (分別為 V _H和 V _L) 通常具有相似的結構，其中每個結構域包含四個保守框架區 (FR) 和三個超變異區 (HVR)。參見例如 Kindt 等人，Kuby Immunology，第 6 版，W.H. Freeman and Co.，第 91 頁 (2007)。單個 V _H或 V _L結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，可使用 V _H或 V _L域將結合特定抗原之抗體與結合該抗原之抗體分離，以分別篩選互補 V _L或 V _H域之文庫。參見例如 Portolano 等人，J. Immunol. 150: 880-887 (1993)；Clarkson 等人，Nature 352: 624-628 (1991)。

如本文所用，術語「載體」係指一種核酸分子，其能夠傳送與其連接之另一種核酸。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體以及併入已引入該宿主細胞的基因體中的載體。在某些實施例中，載體指導與其可操作地連接之核酸的表現。該等載體在本文中稱為「表現載體」。

如本文所用，術語「同源性序列」係指具有透過序列比對確定的顯著序列相似性之序列。例如，兩個序列可具有約 50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、或 99.9% 的同源性。比對是藉由算法和計算機程式 (包括但不限於 BLAST、FASTA 及 HMME) 執行，這些算法和計算機程式可比較序列並根據諸如序列長度、序列標識和相似性以及存在性等因素計算匹配的統計顯著性以及序列不匹配和空位的長度。同源性序列既可以指 DNA 序列，也可以指蛋白質序列。

如本文所用，術語「側翼」係指位於第二核苷酸序列的 5' 或 3' 末端或兩端之第一核苷酸序列。側翼核苷酸序列可與第二核苷酸序列相鄰或相距給定之距離。側翼核苷酸序列之長度無具體限制。例如，側翼序列可包含幾個鹼基對或幾千個鹼基對。

如本文所用，術語「外源」表示核苷酸序列並非來源於宿主細胞，而是透過傳統的 DNA 遞送方法，例如透過轉染、電穿孔或轉化方法引入宿主細胞中。術語「內源」係指核苷酸序列來源於宿主細胞。「外源」核苷酸序列可具有在鹼基組成上相同的「內源」對應物，但是其中「外源」序列透過例如重組 DNA 技術被引入宿主細胞中。

如本文所用，「整合位點」包括在宿主細胞基因組內插入外源核苷酸序列的核酸序列。在某些實施例中，整合位點在宿主細胞基因組的兩個相鄰核苷酸之間。在某些實施例中，整合位點包含一段核苷酸序列。在某些實施例中，整合位點位於 TI 宿主細胞基因組的特定基因座內。在某些實施例中，整合位點在 TI 宿主細胞的內源基因內。

如本文所使用，「重組酶識別序列」 (RRS) 是由重組酶識別的核苷酸序列，並且對於重組酶介導的重組事件是必要及充分的。RRS 可用於定義核苷酸序列中發生重組事件的位置。如本文所用，「不相容的」 RRS 係被不同重組酶識別的 RRS。

如本文所用，術語「TI 宿主細胞」係指包含用於表現所關注序列的一個或多個基因座即整合位點的細胞。在某些實施例中，在包含四個或更多個 RRS (例如，四個或更多個不相容的 RRS)的一個多個整合位點處的外源性核苷酸序列的存在有利於將 SOI 整合至 TI 宿主細胞中。 2. 外源性核苷酸序列

本所揭示之主題提供了適合整合外源核苷酸序列之宿主細胞。在某些實施例中，外源性核苷酸序列充當用於多載體 (即三個或更多個載體) RMCE 策略的整合位點，例如藉由包含四個或更多個重組酶識別序列。在某些實施例中，外源性核苷酸序列充當用於包含四個或更多個不相容的重組酶識別序列的多載體 RMCE 策略的整合位點。在某些實施例中，外源核苷酸序列編碼所關注序列。因此，在某些實施例中，宿主細胞將包含一個或多個外源核苷酸序列，該序列將有利於編碼一個或多個所關注序列的一個或多個外源核苷酸序列的靶向整合。在某些實施例中，包含整合在宿主細胞基因組的整合位點上的外源核苷酸序列的宿主細胞被稱為 TI 宿主細胞。然後可以將編碼一個或多個所關注序列之外源核苷酸序列引入 TI 宿主細胞中，並將整合靶向到整合位點。如下文所概述，TI 宿主細胞可包含多個整合位點，這些整合位點由存在的外源核苷酸序列定義，該外源核苷酸序列包含有助於整合編碼一個或多個所關注序列的外源核苷酸序列的元素 (例如重組酶辨識序列)。

在某些實施例中，整合位點及/或位於整合位點側翼的核苷酸序列可透過實驗進行識別。在某些實施例中，可透過全基因組篩選方法來識別整合位點及/或位於整合位點側翼之核苷酸序列，以分離以期望的水平表現由整合到一個或多個外源核苷酸序列的一個或多個 SOI 編碼之所關注多肽，其中外源序列本身被整合到宿主細胞基因組中的一個或多個基因座中。在某些實施例中，在基於轉位酶的匣式整合事件後，可透過全基因組篩選方法識別整合位點及/或位於整合位點側翼之核苷酸序列。在某些實施例中，藉由蠻力隨機整合篩選來識別整合位點及/或位於整合位點側翼之核苷酸序列。在某些實施例中，整合位點及/或位於整合位點側翼之核苷酸序列可透過常規的測序方法確定，例如靶基因座擴增 (TLA)，然後是新一代測序 (NGS) 及全基因組 NGS。在某些實施例中，整合位點在染色體上的位置可藉由常規的細胞生物學方法如螢光原位雜交 (FISH) 分析來確定。

在某些實施例中，宿主細胞包含整合在宿主細胞基因組中特定第一基因座內的第一整合位點的第一外源核苷酸序列及整合在宿主細胞基因組中特定第二基因座內的第二整合位點的第二外源核苷酸序列。在某些實施例中，宿主細胞包含多個整合在宿主細胞基因組中的多個整合位點的多個外源核苷酸序列。 2.1 包含四個或更多個 RRS 的外源性序列

在某些實施例中，經整合外源性核苷酸序列包含四個或更多個 RRS，其中 RRS 可由重組酶進行辨識。在某些實施例中，經整合外源性核苷酸序列包含四個或更多個不相容的 RRS。在某些實施例中，經整合外源性核苷酸序列包含四個、五個、六個、七個或八個或更多個 RRS。在某些實施例中，一個或多個 RRS 可選自由以下序列所組成之群組：LoxP 序列、LoxP L3 序列、LoxP 2L 序列、LoxFas 序列、Lox511 序列、Lox2272 序列、Lox2372 序列、Lox5171 序列、Loxm2 序列、Lox71 序列、Lox66 序列、FRT 序列、Bxb1 attP 序列、Bxb1 attB 序列、φC31 attP 序列及 φC31 attB 序列。

在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記。在某些實施例中，經整合外源性核苷酸序列包含至少四個 RRS 及至少一個選擇標記。在某些實施例中，經整合外源性核苷酸序列包含四個不相容的 RRS 及至少一個選擇標記。在某些實施例中，選擇標記位於第一 RRS 與第二 RRS 之間。在某些實施例中，四個 RRS 中之兩個 RRS 位於至少一個選擇標記之側翼，即第一 RRS 位於 5' 上游，並且第二 RRS 位於選擇標記的 3' 下游。在某些實施例中，第一 RRS 與選擇標記之 5' 端相鄰，並且第二 RRS 與選擇標記之 3' 端相鄰。

在某些實施例中，選擇標記位於第一 RRS 和第二 RRS 之間，並且這兩個側翼 RRS 不同。在某些實施例中，第一側翼 RRS 為 LoxP L3 序列，並且第二側翼 RRS 為 LoxP 2L 序列。在某些實施例中，LoxP L3 序列位於選擇標記之 5' 端，並且 LoxP 2L 序列位於選擇標記之 3' 端。在某些實施例中，第一側翼 RRS 為野生型 FRT 序列，並且第二側翼 RRS 為突變型 FRT 序列。在某些實施例中，第一側翼 RRS 為 Bxb1 attP 序列，並且第二側翼 RRS 為 Bxb1 attB 序列。在某些實施例中，第一側翼 RRS 為 φC31 attP 序列，並且第二側翼 RRS 為 φC31 attB 序列。在某些實施例中，兩個 RRS 處於相同的方向。在某些實施例中，兩個 RRS 均處於正向或反向。在某些實施例中，兩個 RRS 處於相反的方向。

在某些實施例中，選擇標記可為胺基糖苷磷酸轉移酶 (APH) (例如，潮黴素磷酸轉移酶 (HYG)、新黴素和 G418 APH)、二氫葉酸還原酶 (DHFR)、胸苷激酶 (TK)、谷胺酰胺合成酶 (GS)、天冬酰胺合成酶、色胺酸合成酶 (吲哚)、組胺醇脫氫酶 (組胺醇 D) 以及編碼對嘌呤黴素、殺稻瘟素、博萊黴素、腐草黴素、氯黴素、Zeocin 或黴酚酸的抗性的基因。在某些實施例中，選擇標記可為 GFP、eGFP、合成 GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed 單體、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean、或 T-Sapphire 標記。

在某些實施例中，經整合外源性核苷酸序列包含兩個選擇標記，該兩個 RRS 處於該四個或更多個 RRS 中之至少兩者的側翼，其中第一選擇標記不同於第二選擇標記。在某些實施例中，兩個選擇標記均選自由以下項所組成之群組：谷胺酰胺合成酶選擇標記、胸苷激酶選擇標記、HYG 選擇標記及嘌呤黴素抗性選擇標記。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含胸苷激酶選擇標記及 HYG 選擇標記。在某些實施例中，第一選擇標記選自由以下各者所組成之群組：胺基糖苷磷酸轉移酶 (APH) (例如，潮黴素磷酸轉移酶 (HYG)、新黴素和 G418 APH)、二氫葉酸還原酶 (DHFR)、胸苷激酶 (TK)、谷胺酰胺合成酶 (GS)、天冬酰胺合成酶、色胺酸合成酶 (吲哚)、組胺醇脫氫酶 (組胺醇 D) 以及編碼對嘌呤黴素、殺稻瘟素、博萊黴素、腐草黴素、氯黴素、Zeocin 或黴酚酸的抗性的基因，並且第二選擇標記選自由以下各者所組成之群組：GFP、eGFP、合成 GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed 單體、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean、或 T-Sapphire 標記。在某些實施例中，第一選擇標記為谷胺酰胺合成酶選擇標記，並且第二選擇標記為 GFP 標記。在某些實施例中，處於兩個選擇標記之側翼的這兩個 RRS 相同。在某些實施例中，處於兩個選擇標記之側翼的這兩個 RRS 不同。

在某些實施例中，選擇標記可操作地連接至啟動子序列。在某些實施例中，選擇標記可操作地連接至 SV40 啟動子。在某些實施例中，選擇標記可操作地連接至鉅細胞病毒 (CMV) 啟動子。

在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記及 IRES，其中 IRES 可操作地連接至選擇標記。在某些實施例中，可操作地連接至 IRES 的選擇標記選自由以下各者所組成之群組：GFP、eGFP、合成 GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed 單體、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean、或 T-Sapphire 標記。在某些實施例中，可操作地連接至 IRES 的選擇標記為 GFP 標記。在某些實施例中，經整合外源性核苷酸序列包含 IRES 以及側翼帶有四個或更多個 RRS 中的至少兩者的兩個選擇標記，其中 IRES 可操作地連接至第二選擇標記。在某些實施例中，經整合外源性核苷酸序列包含 IRES 以及側翼帶有該至少四個 RRS 中的至少兩者的三個選擇標記，其中 IRES 可操作地連接至第三選擇標記。在某些實施例中，經整合外源性核苷酸序列包含 IRES 以及側翼帶有該至少四個 RRS 中的至少兩者的三個選擇標記，其中 IRES 可操作地連接至第三選擇標記。在某些實施例中，第三選擇標記不同於第一選擇標記或第二選擇標記。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含可操作地連接至啟動子的第一選擇標記及可操作地連接至 IRES 的第二選擇標記。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含可操作地連接至 SV40 啟動子的谷胺酰胺合成酶選擇標記及可操作地連接至 IRES 的 GFP 選擇標記。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含可操作地連接至 CMV 啟動子的胸苷激酶選擇標記和 HYG 選擇標記以及可操作地連接至 IRES 的 GFP 選擇標記。

在某些實施例中，用作整合位點的外源核苷酸序列將存在於 TI 宿主細胞的基因組的特定基因座內的位點。例示性 TI 宿主細胞及其使用策略詳細描述於美國專利申請公開號 US20210002669 中有詳細描述，該專利申請的內容全文以引用方式併入本文。

在採用靶向整合之某些實施例中，外源性核苷酸序列整合在 TI 宿主細胞之基因體的特定基因座內的位點處。在某些實施例中，外源性核苷酸整合至其中的基因座與選自以下序列的至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 同源：重疊群 NW_006874047.1、NW_ 006884592.1、NW_ 006881296.1、NW_ 003616412.1、NW_ 003615063.1、NW_ 006882936.1、及 NW_ 003615411.1。

在某些實施例中，緊鄰整合之外源序列 5' 端的核苷酸序列選自由以下各者所組成之群組：NW_006874047.1 的核苷酸 41190-45269、NW_006884592.1 的核苷酸 63590-207911、NW_006881296.1 的核苷酸 253831-491909、NW_003616412.1 的核苷酸 69303-79768、NW_003615063.1 的核苷酸 293481-315265、NW_006882936.1 的核苷酸 2650443-2662054、或 NW_003615411.1 的核苷酸 82214-97705，並且該序列與其具有至少 50% 的同源性。在某些實施例中，緊鄰整合之外源序列 5' 端的核苷酸序列與 NW_006874047.1 的核苷酸 41190-45269、NW_006884592.1 的核苷酸 63590-207911、NW_006881296.1 的核苷酸 253831-491909、NW_003616412.1 的核苷酸 69303-79768、NW_003615063.1 的核苷酸 293481-315265、NW_006882936.1 的核苷酸 2650443-2662054、或 NW_003615411.1 的核苷酸 82214-97705 具有至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 的同源。

在某些實施例中，緊鄰整合之外源序列 3' 端的核苷酸序列選自由以下各者所組成之群組：NW_006874047.1 的核苷酸 45270-45490、NW_006884592.1 的核苷酸 207912-792374、NW_006881296.1 的核苷酸 491910-667813、NW_003616412.1 的核苷酸 79769-100059、NW_003615063.1 的核苷酸 315266-362442、NW_006882936.1 的核苷酸 2662055-2701768、或 NW_003615411.1 的核苷酸 97706-105117，並且該序列與其具有至少 50% 的同源性。在某些實施例中，緊鄰整合之外源序列 3' 端的核苷酸序列與 NW_006874047.1 的核苷酸 45270-45490、NW_006884592.1 的核苷酸 207912-792374、NW_006881296.1 的核苷酸 491910-667813、NW_003616412.1 的核苷酸 79769-100059、NW_003615063.1 的核苷酸 315266-362442、NW_006882936.1 的核苷酸 2662055-2701768、或 NW_003615411.1 的核苷酸 97706-105117 具有至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99%、或至少約 99.9% 的同源。

在某些實施例中，經整合外源性序列在 5' 端側接有選自由以下所組成之群組的核苷酸序列：NW_006874047.1 的核苷酸 41190-45269、NW_006884592.1 的核苷酸 63590-207911、NW_006881296.1 的核苷酸 253831-491909、NW_003616412.1 的核苷酸 69303-79768、NW_003615063.1 的核苷酸 293481-315265、NW_006882936.1 的核苷酸 2650443-2662054 及 NW_003615411.1. 的核苷酸 82214-97705 以及與其至少 50% 同源的序列。在某些實施例中，經整合外源性序列在 3' 端側接有選自由以下所組成之群組的核苷酸序列：NW_006874047.1 的核苷酸 45270-45490、NW_006884592.1 的核苷酸 207912-792374、NW_006881296.1 的核苷酸 491910-667813、NW_003616412.1 的核苷酸 79769-100059、NW_003615063.1 的核苷酸 315266-362442、NW_006882936.1 的核苷酸 2662055-2701768 及 NW_003615411.1 的核苷酸 97706-105117 以及與其至少 50% 同源的序列。在某些實施例中，側接於整合入外源核苷酸序列的 5' 端的核苷酸序列與 NW_006874047.1 的核苷酸 41190-45269、NW_006884592.1 的核苷酸 63590-207911、NW_006881296.1 的核苷酸 253831-491909、NW_003616412.1 的核苷酸 69303-79768、NW_003615063.1 的核苷酸 293481-315265、NW_006882936.1 的核苷酸 2650443-2662054 及 NW_003615411.1 的核苷酸 82214-97705 至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99% 或至少約 99.9% 同源。在某些實施例中，側接於整合入外源核苷酸序列的 3' 端的核苷酸序列與 NW_006874047.1 的核苷酸 45270-45490、NW_006884592.1 的核苷酸 207912-792374、NW_006881296.1 的核苷酸 491910-667813、NW_003616412.1 的核苷酸 79769-100059、NW_003615063.1 的核苷酸 315266-362442、NW_006882936.1 的核苷酸 2662055-2701768 及 NW_003615411.1 的核苷酸 97706-105117 至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99% 或至少約 99.9% 同源。

在某些實施例中，整合入外源核苷酸序列可操作地連接至選自由以下所組成之群組的核苷酸序列片段重疊群 NW_006874047.1、NW_ 006884592.1、NW_ 006881296.1、NW_ 003616412.1、NW_ 003615063.1、NW_ 006882936.1 及 NW_ 003615411.1 以及與其至少 50% 同源的序列。在某些實施例中，可操作地連接至外源核苷酸序列之核苷酸序列與選自片段重疊群 NW_006874047.1、NW_ 006884592.1、NW_ 006881296.1、NW_ 003616412.1、NW_ 003615063.1、NW_ 006882936.1 及 NW_ 003615411.1 的序列至少約 50%、至少約 60%、至少約 70%、至少約 80%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 99% 或至少約 99.9% 同源。

在某些實施例中，可使用基於轉座酶之整合將編碼目標產物之核酸整合入宿主細胞基因體中。基於轉座酶之整合技術揭示於例如以下文獻中：Trubitsyna 等人，Nucleic Acids Res. 45(10):e89 (2017)；Li 等人，PNAS 110(25):E2279-E2287 (2013)；及 WO 2004/009792，其全部內容以引用方式併入本文中。

表 1 提供了例示性 TI 宿主細胞整合位點：表 1 - TI 宿主細胞整合位點

宿主	重疊群	重疊群大小 (kb)	整合位點 (bp)	基因 (SEQ ID 編號 )
1	NW_006874047.1	727	45269	LOC107977062 (SEQ ID No. 1)
2	NW_006884592.1	931	207911	LOC100768845 (SEQ ID No. 2)
3	NW_006881296.1	1016	491909	ITPR2 (SEQ ID No. 3)
4	NW_003616412.1	127	79768	ERE67000.1 (SEQ ID No. 4)
5	NW_003615063.1	372	315265	UBAP2 (SEQ ID No. 5)
6	NW_006882936.1	3042	2662054	MTMR2 (SEQ ID No. 6)
7	NW_003615411.1	277	97706	XP_003512331.2 (SEQ ID No. 7)

2.2 包含 SOI 的外源性核苷酸序列

在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個外源 SOI。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記及至少一個外源 SOI。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記、至少一個外源 SOI、及至少一個 RRS。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個或更多 SOI。在某些實施例中，SOI 相同。在某些實施例中，SOI 不同。

如上所述，在某些實施例中，SOI 編碼多次單元蛋白複合物中的一個或多個次單元。在某些實施例中，此等多肽序列可包含此等次單元序列的片段。在某些實施例中，所關注序列可包含此等次單元序列之組合。例如，但並非限制性地，此等組合可包含第一次單元序列中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個及/或第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多次單元序列的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個序列。此外，在某些實施例中，此等組合可包含第一次單元序列中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個明顯變異，及/或第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多次單元序列的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個明顯變異。

在某些實施例中，SOI 編碼單鏈抗體或其片段。在某些實施例中，SOI 編碼抗體重鏈序列或其片段。在某些實施例中，SOI 編碼抗體輕鏈序列或其片段。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含編碼抗體重鏈序列或其片段的 SOI 及編碼抗體輕鏈序列或其片段的 SOI。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含編碼第一抗體重鏈序列或其片段的 SOI、編碼第二抗體重鏈序列或其片段的 SOI 及編碼抗體輕鏈序列或其片段的 SOI。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含編碼第一抗體重鏈序列或其片段的 SOI、編碼第二抗體重鏈序列或其片段的 SOI、編碼抗體第一輕鏈序列或其片段的 SOI 及編碼抗體輕鏈序列或其片段的第二 SOI。在某些實施例中，可選擇編碼重鏈和輕鏈序列的 SOI 的數目，以實現所需的重鏈和輕鏈多肽的表現水平，例如，以實現所需量的雙特異性抗體產生。在某些實施例中，可以將編碼重鏈和輕鏈序列的單個 SOI 整合到，例如，存在於單個整合位點之單個外源核酸序列、存在於單個整合位點之多個外源核酸序列、或 TI 宿主細胞內整合在不同整合位點的多個外源核酸序列。

在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記、至少一個外源 SOI、及一個 RRS。在某些實施例中，RRS 鄰近至少一個選擇標記或至少一個外源 SOI。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記、至少一個外源 SOI、及兩個 RRS。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含至少一個選擇標記及至少一個外源 SOI (位於第一RRS 和第二 RRS 之間)。在某些實施例中，處於兩個選擇標記之側翼的這兩個 RRS 與外源 SOI 相同。在某些實施例中，處於兩個選擇標記之側翼的這兩個 RRS 與外源 SOI 不同。在某些實施例中，第一側翼 RRS 為 LoxP L3 序列，並且第二側翼 RRS 為 LoxP 2L 序列。在某些實施例中，L3 LoxP 序列位於選擇標記及外源 SOI 之 5' 端，並且 LoxP 2L 序列位於選擇標記及外源 SOI 之 3' 端。

在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含三個 RRS 及兩個外源 SOI，並且第三 RRS 位於第一 RRS 和第二 RRS 之間。在某些實施例中，第一 SOI 位於第一 RRS 和第三 RRS 之間，並且第二 SOI 位於第三 RRS 和第三 RRS 之間。在某些實施例中，第一 SOI 和第二SOI 不同。在某些實施例中，第一 RRS 和第二 RRS 相同，並且第三 RRS 不同於第一或第二 RRS。在某些實施例中，所有三個 RRS 均不同。在某些實施例中，第一 RRS 為 LoxP L3 位點，第二 RRS 為 LoxP 2L 位點，第三 RRS 為 LoxFas 位點。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含三個 RRS、一個外源 SOI 及一個選擇標記。在某些實施例中，該 SOI 位於第一 RRS 和第三 RRS 之間，並且選擇標記位於第三 RRS 和第三 RRS 之間。在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含三個 RRS、兩個外源 SOI 及一個選擇標記。在某些實施例中，第一 SOI 及選擇標記位於第一 RRS 和第三 RRS 之間，並且第二 SOI 位於第三 RRS 和第三 RRS 之間。

在某些實施例中，外源 SOI 編碼所關注多肽，包括但不限於抗體、酶、細胞因子、生長因子、激素、病毒蛋白、細菌蛋白、疫苗蛋白、或具有治療功能之蛋白。在某些實施例中，外源 SOI 編碼抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，外源 SOI 編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈 Fv 片段 (scFv)、或 Fc 融合蛋白。在某些實施例中，外源 SOI 可操作地連接至至少一個順式作用元件，例如啟動子或增強子。在某些實施例中，外源 SOI 可操作地連接至 CMV 啟動子。

在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含兩個 RRS 和位於這兩個 RRS 之間的至少兩個外源 SOI。在某些實施例中，編碼抗體的一條重鏈和一條輕鏈的 SOI 位於兩個 RRS 之間。在某些實施例中，編碼抗體的一條重鏈和兩條輕鏈的 SOI 位於兩個 RRS 之間。在某些實施例中，編碼抗體的重鏈和輕鏈之拷貝的不同組合的 SOI 位於兩個 RRS 之間。

在某些實施例中，整合之外源核苷酸序列包含三個 RRS 及至少兩個外源 SOI，並且第三 RRS 位於第一 RRS 和第二 RRS 之間。在某些實施例中，至少一個 SOI 位於第一 RRS 和第三 RRS 之間，並且至少一個 SOI 位於第三 RRS 和第三 RRS 之間。在某些實施例中，第一 RRS 和第二 RRS 相同，並且第三 RRS 不同於第一或第二 RRS。在某些實施例中，所有三個 RRS 均不同。在某些實施例中，編碼第一抗體之一條重鏈和一條輕鏈的 SOI 位於第一 RRS 和第三 RRS 之間，並且編碼第二抗體之一條重鏈和一條輕鏈的 SOI 位於第三 RRS 和第二 RRS 之間。在某些實施例中，編碼第一抗體之一條重鏈和兩條輕鏈的 SOI 位於第一 RRS 和第三 RRS 之間，並且編碼第二抗體之一條重鏈和一條輕鏈的 SOI 位於第三 RRS 和第二 RRS 之間。在某些實施例中，編碼第一抗體之一條重鏈和三條輕鏈的 SOI 位於第一 RRS 和第三 RRS 之間，並且編碼第一抗體之一條輕鏈及第二抗體之一條重鏈和一條輕鏈的 SOI 位於第三 RRS 和第二 RRS 之間。在某些實施例中，編碼第一抗體之一條重鏈和三條輕鏈的 SOI 位於第一 RRS 和第三 RRS 之間，並且編碼第一抗體之兩條輕鏈及第二抗體之一條重鏈和一條輕鏈的 SOI 位於第三 RRS 和第二 RRS 之間。在某些實施例中，編碼多個抗體的重鏈和輕鏈拷貝的不同組合的 SOI 位於第一 RRS 和第三 RRS 之間以及第三 RRS 和第二 RRS 之間。 3. 宿主細胞

在某些實施例中，宿主細胞為真核宿主細胞. 在某些實施例中，宿主細胞為哺乳動物宿主細胞. 在某些實施例中，宿主細胞為倉鼠宿主細胞、人宿主細胞、大鼠宿主細胞、或小鼠宿主細胞。在某些實施例中，宿主細胞為中國倉鼠卵巢 (CHO) 宿主細胞、CHO K1 宿主細胞、CHO K1SV 宿主細胞、DG44 宿主細胞、DUKXB-11 宿主細胞、CHOK1S 宿主細胞、或 CHO K1M 宿主細胞。

在某些實施例中，宿主細胞選自由以下各者所組成之群組：由 SV40 (COS-7) 轉化的猴腎 CV1 系；人胚胎腎系 (如 Graham 等人， J. Gen Virol.36: 59 (1977) 中所述之 293 或 293 細胞)；幼地鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (如 Mather， Biol. Reprod.23: 243-251 (1980) 中所述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞 (MMT 060562)；TRI 細胞 (如 Mather 等人， Annals N.Y.Acad. Sci.383:44-68 (1982) 所述)、MRC 5 細胞、FS4 細胞、Y0 細胞、NS0 細胞、Sp2/0 細胞、及 PER.C6® 細胞。

在某些實施例中，宿主細胞是細胞株。在某些實施例中，宿主細胞是已經培養了多代的細胞株。在某些實施例中，宿主細胞是原代細胞。

在某些實施例中，如果在 10、20、30、50、100、200 或 300 代內將表現水平維持在一定水平，增加或減少小於 20%，則認為所關注多肽的表現是穩定的。在某些實施例中，如果無需進行任何選擇即可維持培養，則所關注多肽的表現將是穩定的。在某些實施例中，如果所關注基因的多肽產物達到約 1 g/L、約 2 g/L、約 3 g/L、約 4 g/L、約 5 g/L、約 10 g/L、約 12 g/L、約 14 g/L、或約 16 g/L，則表明所關注多肽之表現水平高。

在某些實施例中，產生所關注多肽並將其分泌到細胞培養基中。在某些實施例中，所關注多肽得到表現並保留在宿主細胞內。在某些實施例中，所關注多肽得到表現，被插入並保留在宿主細胞膜內。

可利用常規細胞生物學方法將所關注外源核苷酸或載體引入宿主細胞中，這些方法包括但不限於轉染、轉導、電穿孔或註射。在某些實施例中，利用基於化學的轉染方法將所關注外源核苷酸或載體引入宿主細胞中，這些方法包括基於脂質的轉染方法、基於磷酸鈣的轉染方法、基於陽離子聚合物的轉染方法或奈米顆粒的轉染。在某些實施例中，利用病毒介導的轉導方法將所關注外源核苷酸引入宿主細胞中，該方法包括但不限於慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒或腺相關病毒介導的轉導。在某些實施例中，利用基因槍介導之注射將所關注外源核苷酸引入宿主細胞中。在某些實施例中，使用本文所述之方法將 DNA 和 RNA 分子均引入宿主細胞中。 4. 靶向整合

靶向整合方法可以將外源核苷酸序列整合到宿主細胞基因組的一個或多個預定位點。在某些實施例中，靶向整合由辨識一個或多個 RRS 的重組酶介導。在某些實施例中，靶向整合由同源重組介導。 4.1. 經由多載體 RMCE 進行靶向整合

多載體 RMCE 允許將一個或多個供體 DNA 分子單向整合至宿主細胞基因體的預定位點中，並使供體 DNA 上存在的 DNA 匣與整合位點所在之宿主基因體上的 DNA 匣式精確交換。DNA 匣之特徵在於，其中至少兩個位於至少一個選擇標記側翼之四個異種特異 RRS (儘管在某些 RMCE 實例中，可使用「分離選擇標記」) 及至少一個外源性 SOI。RMCE 參與靶基因組基因座內兩個異種特異 RRS 與供體 DNA 分子之間的重組酶催化的雙重重組交換事件。RMCE 旨在將 SOI 或選擇標記的拷貝引入宿主細胞基因組的預定位點。與僅涉及一個交換事件的重組不同，RMCE 可實施為使得不將原核載體序列引入宿主細胞基因組中，從而減少及/或防止不希望之宿主免疫或防禦機制觸發。可使用多個 DNA 匣重複 RMCE 程序。例如，可以採用 RMCE 程序來促進引入多個不同的「前」匣及多個不同的「後」匣。但是，如上所述，可以採用 RMCE (及其他整合策略) 將少至一個匣以及多達十個或更多個匣引入宿主基因體之單一預定位點中。例如，如圖 1 至圖 5 中所概述的，所有三個載體皆可用於多載體 RMCE 方法，以將三個或更多個 SOI 引入單一基因座中。在某些實施例中，多 RMCE 可用於將少至一個匣及多達十個或更多個匣同時或依序引入兩個、三個、四個、五個、六個、七個或更多個不同的基因座中。

在某些實施例中，RRS 選自由以下序列所組成之群組：LoxP 序列、LoxP L3 序列、LoxP 2L 序列、LoxFas 序列、Lox511 序列、Lox2272 序列、Lox2372 序列、Lox5171 序列、Loxm2 序列、Lox71 序列、Lox66 序列、FRT 序列、Bxb1 attP 序列、Bxb1 attB 序列、φC31 attP 序列及 φC31 attB 序列。

在某些實施例中，RRS 可由 Cre 重組酶辨識。在某些實施例中，RRS 可由 FLP 重組酶辨識。在某些實施例中，RRS 可由 Bxb1 整合酶辨識。在某些實施例中，RRS 可由 φC31 整合酶辨識。

在某些實施例中，當 RRS 為 LoxP 位點時，宿主細胞需要 Cre 重組酶進行重組。在某些實施例中，當 RRS 為 FRT 位點時，宿主細胞需要 FLP 重組酶進行重組。在某些實施例中，當 RRS 為 Bxb1 attP 或 Bxb1 attB 位點時，宿主細胞需要 Bxb1 整合酶進行重組。在某些實施例中，當 RRS 為 φC31 attP 或 a φC31attB 位點時，宿主細胞需要 φC31 整合酶進行重組。可使用包含酶的編碼序列的表現載體將重組酶引入宿主細胞中。

Cre-LoxP 位點特異性重組體系已廣泛用於許多生物學實驗系統中。Cre 是一種 38 kDa 位點特異性 DNA 重組酶，可識別 34 bp LoxP 序列。Cre 來源於噬菌體 P1，並且屬於酪胺酸家族位點特異性重組酶。Cre 重組酶可以介導 LoxP 序列之間的分子內和分子間重組。LoxP 序列由 8 bp 非回文核心區和兩個 13 bp 的反向重複序列組成。Cre 重組酶與 13 bp 重複序列結合，從而介導 8 bp 核心區內的重組。Cre-LoxP 介導的重組高效發生，且無需任何其他宿主因子。如果將兩個 LoxP 序列以相同的方向置於同一核苷酸序列上，則 Cre 介導的重組將切除位於兩個 LoxP 序列之間的 DNA 序列，使其成為共價閉合環。如果兩個 LoxP 序列位於同一核苷酸序列的反向位置，則 Cre 介導的重組將顛倒位於兩個序列之間的 DNA 序列的方向。還可以將 LoxP 序列置於不同的染色體上，以促進不同染色體之間的重組。如果兩個 LoxP 序列位於兩個不同 DNA 分子上，並且一個 DNA 分子是環狀分子，則 Cre 介導的重組將導致環狀 DNA 序列的整合。

在某些實施例中，LoxP 序列為野生型 LoxP 序列。在某些實施例中，LoxP 序列為突變型 LoxP 序列。已開發出突變型 LoxP 序列以提高 Cre 所介導之整合或置換的效率。在某些實施例中，突變型 LoxP 序列選自由以下序列所組成之群組：LoxP L3 序列、LoxP 2L 序列、LoxFas 序列、Lox511 序列、Lox2272 序列、Lox2372 序列、Lox5171 序列、Loxm2 序列、Lox71 序列、及 Lox66 序列。例如，Lox71 序列在左側 13 bp 重複序列中具有 5 bp 的突變。Lox66 序列在右側 13 bp 重複序列中具有 5 bp 的突變。野生型和突變型 LoxP 序列均可介導 Cre 依賴性重組。

FLP-FRT 位點特異性重組體系類似於 Cre-Lox 體系。其中涉及內翻轉酶 (FLP) 重組酶，該酶來源於 釀酒酵母的 2 µm 質粒。FLP 也屬於酪胺酸家族位點特異性重組酶。FRT 序列是一種 34 bp 序列，由兩個回文序列組成，每個回文序列的側翼為 8 bp，且間隔區為 13 bp。FLP 與 13 bp 回文序列結合，並在 8 bp 的間隔區內介導 DNA 斷裂、交換和連接。與 Cre 重組酶類似，兩個 FRT 序列的位置和方向決定了 FLP 介導的重組的結果。在某些實施例中，FRT 序列為野生型 FRT 序列。在某些實施例中，FRT 序列為突變型 FRT 序列。野生型和突變型 FRT 序列均可介導 FLP 依賴性重組。在某些實施例中，FRT 序列與響應性受體結構域序列諸如但不限於他莫昔芬響應性受體結構域序列融合。

Bxb1 和 φC31 屬於絲胺酸重組酶家族。它們均來源於噬菌體，並由這些噬菌體用於確定溶原性，以促進噬菌體基因組到細菌基因組的位點特異性整合。這些整合物催化短 (40-60 bp) DNA 基質 (稱為 attP和 attB序列) 之間的位點特異性重組事件，這些基質最初分別位於噬菌體 DNA 和細菌 DNA 上。重組後，形成兩個新序列，分別稱為 attL和 attR序列，並且每個序列包含來源於 attP和 attB的一半序列。重組也可能發生在 attL和 attR序列之間，以將整合之噬菌體從細菌 DNA 中切除。兩種整合酶均可催化重組，而無需任何其他宿主因子的輔助。在不存在任何輔助因子的情況下，這些整合酶介導 attP和 attB之間的單向重組效率超過 80%。由於可由這些整合酶識別之短 DNA 序列及單向重組，因此將這些重組系統開發為對廣泛用於基因工程目的之 Cre-LoxP 和 FRT-FLP 系統的補充。

術語「匹配 RRS」表示兩個 RRS 之間發生重組。在某些實施例中，兩個匹配 RRS 相同。在某些實施例中，兩個 RRS 均為野生型 LoxP 序列。在某些實施例中，兩個 RRS 均為突變型 LoxP 序列。在某些實施例中，兩個 RRS 均為野生型 FRT 序列。在某些實施例中，兩個 RRS 均為突變型 FRT 序列。在某些實施例中，兩個匹配 RRS 為不同序列，但是可藉由相同的重組酶進行辨識。在某些實施例中，第一匹配 RRS 是 Bxb1 attP序列，並且第二匹配 RRS 是 Bxb1 attB序列。在某些實施例中，第一匹配 RRS 是 φC31 attB序列，並且第二匹配 RRS 是 φC31 attB序列。

在某些實施例中，靶向整合藉由多次 RMCE 實現，其中將來自多個載體的 DNA 匣，其各自包含至少一個外源 SOI 或至少一個選擇標記 (以兩個異種特異 RRS 為側翼)，整合到宿主細胞基因組的預定位點。在某些實施例中，選擇標記可部分地編碼在第一載體上，並且部分地編碼在第二、第三、或後續載體上，使得多次 RMCE 的整合均允許表現選擇標記。

在某些實施例中，藉由重組酶介導的重組實現的靶向整合導致選擇標記或一個或多個外源 SOI 與來自原核載體的序列一起整合到宿主細胞基因組的一個或多個預定整合位點。在某些實施例中，藉由重組酶介導的重組實現的靶向整合導致選擇標記或一個或多個外源 SOI 整合到宿主細胞基因組的一個或多個預定整合位點，而不包含來自原核載體的序列。在多載體 RMCE 的某些實施例中，選擇標記及兩個 SOI 可插入至第一基因座中，而額外的區段標記及額外 SOI 插入第二基因座中。此外，或可替代地，本文所描述之方法提供將複數個 SOI 插入在複數個基因座處，其中各基因座可為一個或多個 SOI 的插入位點。

在某些實施例中，所關注序列包含多次單元蛋白複合物的一個或多個次單元的序列。在某些實施例中，此等多肽序列可包含此等次單元序列的片段。在某些實施例中，所關注序列可包含此等次單元序列之組合。例如，但並非限制性地，此等組合可包含第一次單元序列中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個及/或第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多次單元序列的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個序列。此外，在某些實施例中，此等組合可包含第一次單元序列中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個明顯變異，及/或第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多次單元序列的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個明顯變異。

在某些實施例中，複數個所關注序列包含一個或多個重鏈序列 (「H」) 及/或一個或多個抗體輕鏈序列 (「L」)。如本文所用，此等「H」和「L」序列可以是全長重鏈或輕鏈序列以及重鏈或輕鏈片段，包括但不限於變異區片段和互補決定區片段。在某些實施例中，所關注序列可包含此等 H 及 L 序列之組合。例如，但並非限制性地，此等組合可包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個 H 序列及一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個 L 序列。此外，某些實施例中，此等組合可包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個相同或不同的明顯 H' 序列及/或一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個相同或不同的明顯 L' 序列。本所揭示之主題還包括一至十個 (或更多) 附加的 H 及 L 序列，例如 H''、H'''、L'' 及 L'''。例示性實施例包括但不限於包含各種不同的 H 序列及各種不同的 L 序列的任何組合的序列，例如：HL；LH；H'L；LH'；H'L'；L'H'；HLL；HHL；LLH；LHH；H'LL；H'HL；L'HH；L'LH；H'H'L；LH'H'；HLLL；LLLH；HLHL；LHLH；H'LLL；L'LLH；H'LHL；L'HLH；等。

在某些實施例中，本公開涉及一種表現 SOI 之方法，其包含：提供複數個 TI 宿主細胞；將該複數個 TI 宿主細胞與複數個載體接觸，其中該等載體包含一個或多個 SOI 及至少一個標記；將該等一個或多個 SOI 引入一個或多個該複數個 TI 宿主細胞；選擇表現該所關注序列之 TI 細胞；以及在適合於表現所關注序列之條件下培養細胞並從中回收所關注序列。

在某些實施例中，轉染的宿主細胞將包含一個或多個所關注序列，其中所關注序列包含多次單元蛋白複合物的一個或多個次單元之序列。在某些實施例中，此等多肽序列可包含此等次單元序列的片段。在某些實施例中，所關注序列可包含此等次單元序列之組合。例如，但並非限制性地，此等組合可包含第一次單元序列中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個及/或第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多次單元序列的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個序列。此外，在某些實施例中，此等組合可包含第一次單元序列中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個相同或不同的明顯變異，及/或第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多次單元序列的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個相同或不同的明顯變異。

在某些實施例中，轉染的宿主細胞將包含一個或多個所關注序列，其中所關注序列包含 H 及 L 序列之組合。例如，但並非限制性地，此等組合可包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個 H 序列及一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個 L 序列。此外，某些實施例中，此等組合可包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個明顯的 H' 序列及/或一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個明顯的 L' 序列。本所揭示之主題還包括一至十個 (或更多) 附加的 H 及 L 序列，例如 H''、H'''、L'' 及 L'''。例示性實施例包括但不限於包含各種不同的 H 序列及各種不同的 L 序列的任何組合的序列，例如：HL；LH；H'L；LH'；H'L'；L'H'；HLL；HHL；LLH；LHH；H'LL；H'HL；L'HH；L'LH；H'H'L；LH'H'；HLLL；LLLH；HLHL；LHLH；H'LLL；L'LLH；H'LHL；L'HLH；等。 4.2 調控系統

本所揭示之主題還涉及在多載體 RMCE 中使用以產生 TI 宿主細胞之調控系統。例如，在許多情況下，蛋白質表達水平並非最佳，主要是由於編碼蛋白難以表現。難以表現之蛋白質的低表現水平可能具有不同的難以確定之原因。一種可能是宿主細胞中表現的蛋白質的毒性。在此等情況下，可使用調控表現系統來表現有毒蛋白質，其中編碼蛋白質的所關注序列在誘導型啟動子的控制下。在這些系統中，僅當將調節劑諸如但不限於四環素或其類似物強力黴素 (DOX) 等小分子加入培養基時，才引起難以表現之蛋白質的表現。調節有毒蛋白質之表現可減輕其毒性作用，使培養物在生產前達成所需的細胞生長。在某些實施例中，根據本揭示製備之 TI 表現系統包含整合至特定基因座 (例如包含一個或多個 RRS 的外源性核酸序列) 中且在與之可操作連接之調控啟動子下轉錄的 SOI。在某些實施例中，根據本揭示製備之 TI 表現系統可用於確定難於表現之分子 (例如但不限於抗體) 蛋白質表現水平低的根本原因。在某些實施例中，可透過選擇性關閉 TI 系統中 SOI 的表現的能力將 SOI 的表現與觀察到的不良反應聯繫起來。

在某些實施例中，為最小化難以表現之分子的根本原因分析期間之轉錄及細胞株可變性效應，可使用 TI 系統。例如，但並非限制性地，可透過添加調節劑例如多西環素來觸發 TI 宿主中 SOI 之表現。在某些實施例中，TI 載體利用四環素調節的啟動子表現 SOI，該 SOI 可整合到例如包含 RRS 的外源核酸序列中，而 RRS 本身可整合至宿主的整合位點中細胞的基因體，實現 SOI 的調控表現。

在某些實施例中，與對照細胞株相比，本揭示中所描述的 TI 系統可用於成功確定 SOI 例如治療性抗體的低蛋白表現水平之根本原因。在某些實施例中，一旦 SOI (例如治療性抗體)在 TI 細胞株中的較低相對表現被確認，便可利用蛋白質轉譯抑製劑治療 (例如，Dox 及放線菌酮) 來評估 SOI 的細胞內積累及分泌水平。

例如，但並非限制性地，此等調控可基於透過調節轉錄抑制因子或激活因子與組成或最小啟動子的偶聯來阻斷或激活 mRNA 合成的基因開關。在某些非限制性實施例中，可透過結合抑制蛋白來實現抑制，例如，該蛋白在空間上阻斷轉錄起始，或透過抑制轉錄沉默子主動抑制轉錄。在某些非限制性實施例中，哺乳動物或無病毒增強子的最小啟動子的激活可透過與激活結構域的調節偶聯來實現。

在某些實施例中，轉錄抑制因子或激活因子的條件偶聯可透過使用變構蛋白來實現，該變構蛋白能結合啟動子以響應於外部刺激。在某些實施例中，轉錄抑制因子或激活因子的條件偶聯可透過使用從螯合蛋白釋放的細胞內受體來實現，從而能夠結合靶啟動子。在某些實施例中，轉錄抑制因子或激活因子的條件偶聯可透過使用化學誘導的二聚體來實現。

在某些實施例中，本公開之 TI 系統中所用的變構蛋白可為響應於抗生素、細菌群體感應信使、分解代謝物或培養參數諸如溫度 ( 例如冷或熱) 而調節轉錄活性的蛋白。在某些實施例中，此等 TI 系統可基於分解代謝物，例如，將控制其他碳源分解代謝基因的細菌抑制因子轉移至哺乳動物細胞中。在某些實施例中，可透過抑制因子 CymR 的累積應答結合來抑制靶啟動子。在某些實施例中，基於分解代謝物的系統可透過與單純皰疹病毒 VP16 反式激活域融合的原核生物制因子 HdnoR 的 6-羥基菸鹼反應性結合，依賴於嵌合啟動子的激活。

在某些實施例中，TI 系統可為基於群體感應的表現系統，該系統來源於原核生物，該原核生物透過群體感應分子來管理群體內和群體間交流。這些群體感應分子與靶細胞中的受體結合，調節受體與同源啟動子的親和性，從而引發特定調控開關之啟動。在某些實施例中，群體感應分子可為 N-(3-氧代-辛酰基)-高絲胺酸內酯，在存在該分子的情況下，TraR-p65 融合蛋白激活融合到 TraR 特異性操縱基因序列的最小啟動子的表現。在某些實施例中，在基於 天藍色鏈黴菌A3(2) ScbR 抑制因子 (在不存在 SCB1 的情況下結合其同源操縱子 OScbR) 的系統中，群體感應分子可以為丁內酯 SCB1 (外消旋 2-(1'-羥基-6-甲基庚基)-3-(羥甲基)-丁醇化物)。在某些實施例中，群體感應分子可以為 TI 系統中所用之高絲胺酸衍生誘導劑，其中 銅綠假單胞菌群體感應抑制因子 RhlR 及 LasR 與 SV40 T 抗原核定位序列及單純皰疹 VP16 結構域融合並可激活包含特定操縱基因序列的啟動子 (las 框)。

在某些實施例中，調節本揭示之 TI 系統中所用的變構蛋白的誘導分子可以為但不限於 cumate、異丙基-β-D-吡喃半乳糖苷 (IPTG)、大環內酯類、6-羥菸鹼、強力黴素、鏈黴菌素、NADH、四環素。

在某些實施例中，本揭示之 TI 系統中所用的細胞內受體可以為細胞質或核受體。在某些實施例中，本揭示之 TI 系統可利用透過小分子從螯合及抑制蛋白質中釋放出轉錄因子。在某些實施例中，本揭示之 TI 系統可依賴類固醇調節，其中激素受體與天然或人工轉錄因子融合，該天然或人工轉錄因子可從細胞質中的 HSP90 釋放出來，遷移至細胞核中並激活選定的啟動子。在某些實施例中，可使用由合成類固醇類似物調節的突變型受體，以免內生類固醇激素引起串擾。在某些實施例中，受體可以是對 4-羥基他莫昔芬有反應之雌激素受體變體或 RU486 可誘導的孕激素突變受體。在某些實施例中，基於人核過氧化物酶體增殖物激活受體 γ(PPARγ) 的核受體衍生的羅格列酮響應轉錄開關可用於本揭示之 TI 系統中。在某些實施例中，RheoSwitch 可為類固醇反應性受體的變體，其基於修飾後的 云杉色卷蛾蛻皮激素受體及融合至 Gal4 DNA 結合域和 VP16 反式激活劑的小鼠類視色素 X 受體 (RXR)。在存在合成蛻皮激素的情況下，RheoSwitch 變體可結合並激活與 Gal4 反應元件的多個重複序列融合的最小啟動子。

在某些實施例中，本文所揭示之 TI 系統可利用化學誘導的 DNA 結合蛋白及轉錄激活劑的二聚作用來激活與同源操縱子融合之最小核心啟動子。在某些實施例中，本文所揭示之 TI 系統可利用雷帕黴素調節的 FKBP 與 FRB 的二聚作用。在該系統中，FRB 與 p65 反式激活劑融合，並且 FKBP 與鋅指結構域融合，該鋅指結構域特異於工程化最小白介素 12 啟動子上游的同源操縱子位點。在某些實施例中，FKBP 可發生突變。在某些實施例中，本文所揭示之 TI 系統可利用細菌促旋酶 B 次單元 (GyrB)，其中在存在抗生素考默黴素的情況下 GyrB 發生二聚並與新生物素解離。

在某些實施例中，本揭示之 TI 系統可用於受調控之 siRNA 表現。在某些實施例中，受調控之 siRNA 表現系統可以是四環素、大環內酯、或 OFF 和 ON 型 QuoRex 系統。在某些實施例中，TI 系統可利用 Xenopus 末端低聚嘧啶元件 (TOP)，該元件透過在 5' 非翻譯區形成髮夾結構來阻止翻譯啟動。

在某些實施例中，本揭示所述之 TI 系統可利用氣相控製表現例如乙醛誘導的調控 (AIR) 系統。AIR 系統可採用 構巢曲霉的 AlcR 轉錄因子，在無毒濃度的氣態或液態乙醛存在下，特異性激活由 AlcR 特異性操縱基因組裝的 PAIR 啟動子，這些操縱基因融合至最小的人類鉅細胞病毒啟動子。

在某些實施例中，本揭示之 TI 系統可利用 Tet-On 或 Tet-Off 系統。在此等系統中，一種或多種 SOI 之表現可由四環素或其類似物強力黴素進行調節。

在某些實施例中，本揭示之 TI 系統可利用 PIP-on 或 PIP-off 系統。在此等系統中，SOI 之表現可由例如原始黴素、四環素及/或紅黴素進行調節。 5. 產物

本公開之宿主細胞可用於表現任何所關注分子。在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於表現多肽，例如哺乳動物多肽。此等多肽之非限制性實例包括激素、受體、融合蛋白、調節因子、生長因子、補體系統因子、酶、凝血因子、抗凝血因子、激酶、細胞因子、CD 蛋白、白介素、治療性蛋白質、診斷性蛋白質及抗體。在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於表現伴侶蛋白、蛋白質修飾酶、shRNA、gRNA 或其他蛋白質或肽，同時組成性或調控地表現所關注之治療性蛋白質或分子。

在某些實施例中，所關注多肽是雙特異性、三特異性或多特異性多肽，例如雙特異性抗體。

與常規細胞培養方法中所用之細胞例如非 TI 細胞相比，本公開之宿主細胞可在較短的時間內用於產生大量所關注之分子。在某些實施例中，與常規細胞培養方法中所用之細胞例如非 TI 細胞相比，本公開之宿主細胞可用於提高所關注分子的質量。在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於透過預防慢性毒性來增強種子序列的穩定性，該慢性毒性可由引起細胞應激和殖株隨時間推移的不穩定性的產物而引起。在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於實現急性毒性產物的最佳表現。

在某些實施例中，本公開之宿主細胞和系統可用於細胞培養過程的優化及/或流程開發。

在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於治療性分子之所選次單元的組成性表達以及同一治療性分子的其他不同次單元的調控表現。在某些實施例中，治療性分子可為融合蛋白。在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於理解每個抗體次單元在完全組裝的抗體分子的表現及分泌中的作用和效應。

在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用作研究工具。在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用作診斷工具，以針對各種細胞中存在問題的分子找出低蛋白表現水平的根本原因。在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於將觀察到的現像或細胞行為與細胞中的轉基因表現直接聯係起來。本公開之宿主細胞還可用於證明觀察到的行為在細胞中是否可逆。在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於識別和緩解有關轉基因在細胞中轉錄和表達的問題。

在某些實施例中，本公開之宿主細胞可用於交換難以表現之分子的轉基因次單元，例如但不限於抗體之 HC 和 LC 次單元與系統中的平均分子分子相結合，以識別有問題的次單元。在某些實施例中，然後可使用胺基酸序列分析來縮小範圍並集中於可能導致低蛋白表現水平的胺基酸殘基或區域。實例實例 1 ：二載體 RMCE 與多載體 RMCE 的比較

在本實例中，相較於二載體 RMCE，當採用多載體 RMCE (在該實例中，為三個載體 RMCE) 時，識別各種 CLD 參數的差異。 質體構築

對於基於二載體的 RMCE，構築了前抗體靶向載體及後抗體靶向載體。將抗體的 HC 及 LC cDNA 選殖至包含 L3、啟動子及起始密碼子 (ATG) 之前載體主鏈，隨後為 LoxFAS 序列，以及包含 LoxFAS、缺少起始密碼子的 Pac 及 2L 序列之後載體主鏈中。Cre 重組酶質體 (pOG231) 用於所有 RMCE 過程。

對於基於三載體的 RMCE，構築了三個抗體靶向載體 (質體 1、2 及 3)。質體 1 與上述基於二載體的 RMCE 中的前載體相同。質體 2 主鏈包含 LoxFAS、缺少起始密碼子的 Pac、CMV 啟動子及 Frt3 序列。質體 3 主鏈包含 Frt3、NeoR 及 Frt 序列。FlpO 重組酶的編碼序列係基於小鼠密碼子優化序列合成。該序列被選殖至由 CMV 啟動子驅動並包含聚腺苷酸化序列之專有表現載體中。 轉染及 RMCE

對於基於二載體的 RMCE藉由，使用 Maxcyte STX (Maxcyte, Gaithersburg, MD) 電穿孔將包含 HC 及 LC 的前抗體靶向載體及後抗體靶向載體以及 pOG231 轉染至 TI 宿主細胞中。

對於基於三載體的 RMCE，藉由使用 Maxcyte STX (Maxcyte, Gaithersburg, MD) 電穿孔將包含 HC 及 LC 的質體 1、2、3 抗體靶向載體以及 pOG231 及 FlpO 表現質體轉染至 TI 宿主細胞中。

轉染後 48 小時，藉由離心沉澱細胞。然後將沉澱重懸於包含選擇的基於專有 DMEM/F12 的培養基中，並在 37℃ 及 5% CO ₂條件下培養，直至轉染庫恢復。 RMCE 庫的補料分批搖瓶評估

在第 1、3 及 4 天，在具有專有化學成分確定的培養基以及推注補料的搖瓶中進行補料分批生產培養。整個運行過程中溫度保持在 35℃。使用 protein-A 親和力層析和 UV 檢測確定第 7 天的力價。使用 Vi-Cell XR 儀器 (Beckman Coulter) 確定生存力百分比及活細胞計數。 藉由數位液滴 PCR (ddPCR) 進行拷貝數分析

使用 MagNA Pure 96 DNA 及 Viral NA Small Volume Kit (Roche Molecular Systems，目錄號 06543588001)，藉由 MagNA Pure 96 儀器 (Roche, Molecular Systems) 純化來自 1x10 ⁶個細胞沉澱的基因體 DNA。中國倉鼠 Bcl-2 相關 X 蛋白 (Bax) 及白蛋白 (Alb) 的拷貝數分別用作確定 HC 及 LC 基因拷貝的參考。按照 QX200 ddPCR system (Bio-Rad，目錄號 186-3010) 的手冊準備 ddPCR 反應。簡言之，ddPCR 反應係用 HEX 標記的 HC 或 LC 探針以及 FAM 標記的 Bax 或 Alb 探針建立的，每次反應 20 µl。然後將樣品放入 QX200 液滴產生器中，並將液滴轉移至 96 孔板中，在熱循環儀中進行 PCR，然後進行液滴讀數。循環條件如下：在 95℃ 下 10 分鐘，在 94℃ 下 30 秒及在 60℃ 下 1 分鐘的 40 個循環，然後在 98℃ 下 10 分鐘，以使酶失活。使用 primer express v3.0 (Life Technologies) 來設計此研究中所用之引物及探針。 藉由數位液滴逆轉錄酶 PCR 表現 mRNA

使用 MagNA Pure 96 Cellular RNA 大體積套組 (Roche Molecular Systems，目錄號 05467535001)，藉由 MagNA Pure 96 儀器 (Roche, Molecular Systems) 純化來自 1x10 ⁶個細胞沉澱的總 RNA，並使用 Nanodrop 2000 分光光度計 (Thermo Fisher Scientific，目錄號 ND-2000) 量化。使用 One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes (Bio-Rad, Cat. No. 1864022)，大約 20-40pg 的 RNA 用於執行 ddRT-PCR。IgG 重鏈及輕鏈的引物及探針與用於基因拷貝分析的引物及探針相同。使用 Bio-Rad QX200 ddPCR 系統 (Bio-Rad, Cat. No. 186-3010) 執行液滴產生、熱循環及液滴讀數。熱循環條件為在 50℃ 下 1 小時，在 95℃ 下 10 分鐘，然後在 95℃ 下 30 秒及在 58℃ 下 1 分鐘的 40 個循環，然後是在 98℃ 下 10 分鐘以使酶失活。將所得濃度歸一化為每 20pg 總 RNA 的拷貝數。表 2.相較於二載體 RMCE，當採用多載體 RMCE (在該實例中，為三個載體 RMCE) 時，識別各種 CLD 參數的差異。實例 2 ：二載體 RMCE 與多載體 RMCE 的 Ambr ^®250 比較

在本實例中，比較了在 Ambr ^®250 系統 (TAP Biosystem) 中培養的表現抗體的細胞株之間的基因拷貝數及 mRNA 表現，但其中一個細胞株係使用二質體 RMCE 方法製備，而第二個細胞株係使用多載體 RMCE 方法製備。在二質體方法中，各質體包含一個重鏈編碼序列拷貝及兩個輕鏈編碼序列拷貝 (「HLL-HLL」)。在多載體方法中，各質體類似地包含一個重鏈編碼序列拷貝及兩個輕鏈編碼序列拷貝。然而，鑑於多載體 RMCE 中存在第三質體，該方法導致「HLL-HLL-HLL」組態。

在 Ambr ^®250 系統 (TAP Biosystem) 中評估了十二個殖株。Ambr ^®250 系統係高通量自動化方法，其採用一次性 250 mL 微型生物反應器，製造商推薦在本實例中使用該等生物反應器。簡言之，將三千萬個細胞接種至 pH 值為 7.15 之專有化學成分確定的生產培養基中，且培養溫度在最初的 48 小時內保持在 37℃。然後將培養物溫度轉變為 35℃ 以用於剩餘的培養。為期 14 天的補料分批培養在第 1、3、6、9 及 12 天採用五次推注補料。使用 BioProfile Flex2 (Nova Biomedical) 藉由台盼藍染料排斥監測細胞生存力及活細胞計數。實例 3 ：二載體 RMCE 與二位點多載體 RMCE 的比較

在本實例中，相較於二載體 RMCE，當採用多載體 RMCE (在本示例中，為三載體 RMCE，其中兩個載體整合在第一位點處，且第三載體整合在第二位點處) 時，識別各種 CLD 參數的差異。除圖 7 所示外，抗體表現構築體如實例 1 所概述進行製備。簡言之，雖然「G」位點處的綠色螢光蛋白 (GFP) 著陸墊如所示用於如上文及相關圖中所述插入前兩個質體，但「B」位點處的藍色螢光蛋白 (BFP) 著陸墊由 zeocin 抗性基因 (ZeoR) 及 (BFP) 組成，其以 Frt 及 Frt3 重組酶位點為側翼。將無啟動子的 Neo 放置在 Frt 位點的下游。「B」位點的抗體靶向載體包含 SAT 基因以及編碼各種 HC 及 LC cDNA 拷貝的 mAb 表現匣，然後係啟動子，所有皆以 Frt3 及 Frt 為側翼。

圖 8A 至圖 8B 描繪了使用基於雙質體的 RMCE 及基於 2 位點多載體質體 (在此種情況下，三質體) 的 RMCE 的 TI 轉染庫的生產力比較。對於基於 2 位點多載體質體的 mAb A TI 庫（圖 8A）及 mAb B TI 庫（圖 8b），效價（條）及 Qp（點）都更高。實例 4 ：二載體 RMCE 與多載體 RMCE 的比較

在此實例中，如上文所述製備 mAb C、mAb D 及 mAb E 的二載體及多載體 RMCE (在此種情況下為三質體 RMCE) 搖瓶培養物並培養七天。在為期七天的培養完成後，評估了 mAb C、mAb D 及 mAb E 的各種 TI 庫的某些 CLD 參數，如表 3 中所報告。該等結果亦以圖形方式描繪在圖 9A (效價) 及圖 9B (Qp) 中。表 3. 實例 5 ：二載體 RMCE 與多載體 RMCE 的 Ambr15 ^® 比較

在此實例中，使用如上所概述的二載體或多載體 RMCE (在此種情況下為三質體 RMCE) 製備表現 mAb C 或 mAb D 的細胞株。分別進行了 mAb C 及 mAb D 的個體殖株的 Ambr15 ^® 培養 (TAP Biosystem) (對於每種抗體，二載體 RMCE 及多載體 RMCE 各四個)，且多載體 RMCE 殖株相對於二載體 RMCE 殖株表現出更高的平均效價及更高的平均 Qp，如表 4 所報告。表 4.

圖 10A 以圖形方式說明了對於八個 mAb C 殖株中的各者觀察到的效價，而圖 10B 以圖形方式說明了針對彼等 mAb C 八個殖株中的各者觀察到的 Qp。圖 10C 比較了平均 mAb C 殖株效價及 mAb C 殖株 Qp。類似地，圖 11A 以圖形方式說明了對於八個 mAb D 殖株中的各者觀察到的效價，而圖 11B 以圖形方式說明了針對彼等 mAb D 八個殖株中的各者觀察到的 Qp。圖 11C 比較了平均 mAb D 殖株效價及平均 mAb D 殖株 Qp。相比之下，圖 12A 至圖 12B 比較了二載體方法及多載體方法中各者的兩個特定殖株 (殖株 A 及殖株 B) 的效價 (圖 12A) 及 Qp (圖 12B)。圖 12A 至圖 12B 中以圖形方式呈現的資料亦呈現在下表 5 中。表 5. * * * *

前述實例僅僅是對本所揭示之主題的說明，不應被視為以任何方式進行限制。

除所描繪和要求保護的各種實施例之外，本文所揭示之主題還涉及具有本文所揭示和要求保護的特徵的其他組合的其他實施例。因此，本文所呈現之特定特徵可在本文所揭示之標的範圍內以其他方式彼此組合，使得本文所揭示之主題包括本文所揭示之特徵的任何合適的組合。出於說明和描述的目的，已經提供了本文所揭示之主題的特定實施例的前述描述。其並非旨在窮舉或將本文所揭示之標的限制為所揭示的那些實施例。

對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者所顯而易見的是，在不脫離本文所揭示之主題的精神或範圍的情況下，可以對本文所公開之主題的組成和方法進行各種修改和變型。因此，本文所揭示之主題旨在包括在所附申請專利範圍及其等同形式的範圍內的修改和變型。

本文引用了各種出版物、專利和專利申請，這些文獻以引用方式整體併入本文。

圖 1描繪了本揭示之例示性多載體 RMCE 策略。圖 2描繪了本揭示之例示性多載體 RMCE 策略。圖 3描繪了本揭示之例示性多載體 RMCE 策略。圖 4描繪了本揭示之例示性多載體 RMCE 策略。圖 5描繪了本揭示之例示性多載體 RMCE 策略。圖 6描繪了相較於三載體 RMCE，藉由二載體 RMCE 修飾的 CHO 細胞的拷貝數結果。CHO 殖株的基因拷貝數與預期相似，其中 2 HC 及 4 LC 預計用於二載體 RMCE 殖株，且 3 HC 及 6 LC 預計用於三載體 RMCE 殖株。圖 7描繪了本揭示之例示性多載體 RMCE 策略。圖 8A 至圖 8B描繪了使用基於雙質體的 RMCE 及基於 2 位點多載體質體 (在此種情況下，三質體) 的 RMCE 的 TI 轉染庫的生產力比較。對於基於 2 位點多載體質體的 mAb A TI 庫（圖 8A）及 mAb B TI 庫（圖 8b），效價（條）及 Qp（點）都更高。圖 9A 至圖 9B以圖形方式描繪了針對 mAb C、mAb D 及 mAb E 的各種 TI 庫評估的某些 CLD 參數，包括效價（圖 9A）及 Qp（圖 9B）。圖 10A 至圖 10C以圖形方式說明了在 Ambr15 ^®培養物中觀察到的每八個 mAb C 殖株的效價（圖 10A）及觀察到的每八個 mAb C 殖株的 Qp（圖 10B），並且提供了平均 mAb C 殖株效價及 mAb C 殖株 Qp 的比較（圖 10C）。圖 11A 至圖 11C以圖形方式說明了在 Ambr15 ^®培養物中觀察到的每八個 mAb D 殖株的效價（圖 11A）及觀察到的每八個 mAb D 殖株的 Qp（圖 11B），並且提供了平均 mAb D 殖株效價及 mAb D 殖株 Qp 的比較（圖 11C）。圖 12A 至圖 1B分別比較了二載體方法及多載體方法的兩個特定殖株 (殖株 A 和殖株 B) 的效價（圖 12A）及 Qp（圖 12B）。

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Claims

一種靶向整合 (TI) 宿主細胞，其包含整合在如下序列內的整合位點處的外源性核苷酸序列： a) 與 NW_006874047.1 之核苷酸 41190 至 45269 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 63590 至 207911 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 253831 至 491909 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 69303 至 79768 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 293481 至 315265 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2650443 至 2662054 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 82214 至 97705 的全部或部分至少約 90% 同源；或 b) 與 NW_006874047.1 之核苷酸 45270 至 45490 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 207912 至 792374 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 491910 至 667813 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 79769 至 100059 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 315266 至 362442 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2662055 至 2701768 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 97706 至 105117 的全部或部分至少約 90% 同源；且其中該外源性核苷酸序列包含四個或更多個不相容的重組識別序列 (RRS)。
如請求項 1 之 TI 宿主細胞，其中該等 RRS 係選自由以下所組成之群組：LoxP 序列、LoxP L3 序列、LoxP 2L 序列、LoxFas 序列、Lox511 序列、Lox2272 序列、Lox2372 序列、Lox5171 序列、Loxm2 序列、Lox71 序列、Lox66 序列、FRT 序列、Bxb1 attP 序列、Bxb1 attB 序列、φC31 attP 序列及 φC31 attB 序列。
如請求項 1 之 TI 宿主細胞，其中該等 RRS 藉由選自由以下所組成之群組的重組酶識別：Cre 重組酶、FLP 重組酶、Bxb1 整合酶及 φC31 整合酶。
如請求項 1 至 3 中任一項之 TI 宿主細胞，其中該外源性核苷酸序列包含位於最 5' 的 RRS (the 5'-most RRS) 與在 3' 方向的下一個 RRS 之間的選擇標記。
如請求項 4 之 TI 宿主細胞，其中該選擇標記係選自由以下所組成之群組：胺基糖苷磷酸轉移酶 (APH)、潮黴素磷酸轉移酶 (HYG)、新黴素 (neomycin)、G418 APH)、二氫葉酸還原酶 (DHFR)、胸苷激酶 (TK)、麩醯胺合成酶 (GS)、天冬醯胺合成酶、色胺酸合成酶 (吲哚)、組胺醇脫氫酶 (組胺醇 D)、殺稻瘟菌素 (blasticidin)、博萊黴素 (bleomycin)、腐草黴素 (phleomycin)、氯黴素 (chloramphenicol)、吉歐黴素 (Zeocin) 及黴酚酸 (mycophenolic acid)。
如請求項 5 之 TI 宿主細胞，其進一步包含第二選擇標記，其中該第一選擇標記與該第二選擇標記不同。
如請求項 6 之 TI 宿主細胞，其中該第二選擇標記係選自由以下所組成之群組：胺基糖苷磷酸轉移酶 (APH)、潮黴素磷酸轉移酶 (HYG)、新黴素、G418 APH)、二氫葉酸還原酶 (DHFR)、胸苷激酶 (TK)、麩醯胺合成酶 (GS)、天冬醯胺合成酶、色胺酸合成酶 (吲哚)、組胺醇脫氫酶 (組胺醇 D)、殺稻瘟菌素、博萊黴素、腐草黴素、氯黴素、吉歐黴素及黴酚酸。
如請求項 6 之 TI 宿主細胞，其進一步包含第三選擇標記及內部核醣體進入位點 (IRES)，其中該 IRES 與第三選擇標記可操作地連接。
如請求項 8 之 TI 宿主細胞，其中該第三選擇標記不同於該第一選擇標記或該第二選擇標記。
如請求項 9 之 TI 宿主細胞，其中該第三選擇標記係選自由以下所組成之群組：綠色螢光蛋白 (GFP) 標記、增強型 GFP (eGFP) 標記、合成 GFP 標記、黃色螢光蛋白 (YFP) 標記、增強型 YFP (eYFP) 標記、藍綠色螢光蛋白 (CFP) 標記、mPlum 標記、mCherry 標記、tdTomato 標記、mStrawberry 標記、J-red 標記、DsRed-單體標記、mOrange 標記、mKO 標記、mCitrine 標記、Venus 標記、YPet 標記、Emerald6 標記、CyPet 標記、mCFPm 標記、Cerulean 標記及 T-Sapphire 標記。
如請求項 1 至 10 中任一項之 TI 宿主細胞，其中該 TI 宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。
如請求項 11 之 TI 宿主細胞，其中該 TI 宿主細胞為倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
如請求項 11 或 12 之 TI 宿主細胞，其中該 TI 宿主細胞為中國倉鼠卵巢 (CHO) 宿主細胞、CHO K1 宿主細胞、CHO K1SV 宿主細胞、DG44 宿主細胞、DUKXB-11 宿主細胞、CHOK1S 宿主細胞或 CHO K1M 宿主細胞。
一種製備表現所關注序列 (SOI) 的 TI 宿主細胞之方法，其包含： a) 提供 TI 宿主細胞，該 TI 宿主細胞包含整合在如下序列內的整合位點處的外源性核苷酸序列： a. 與 NW_006874047.1 之核苷酸 41190 至 45269 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 63590 至 207911 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 253831 至 491909 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 69303 至 79768 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 293481 至 315265 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2650443 至 2662054 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 82214 至 97705 的全部或部分至少約 90% 同源；或 b. 與 NW_006874047.1 之核苷酸 45270 至 45490 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 207912 至 792374 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 491910 至 667813 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 79769 至 100059 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 315266 至 362442 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2662055 至 2701768 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 97706 至 105117 的全部或部分至少約 90% 同源；且其中該外源性核苷酸序列包含四個或更多個不相容的 RRS； b) 將至少三個載體引入 a) 中所提供的該細胞中，各載體包含： a. 兩個 RRS，其匹配經整合外源性核苷酸序列上之兩個依序定向的 RRS；以及 b. 各對 RRS，其側接於至少一個外源性 SOI 及至少一個第二選擇標記； c) 引入重組酶或編碼重組酶的核酸，其中該等重組酶識別該等 RRS；以及 d) 選擇表現該等選擇標記之 TI 細胞，從而分離表現該等 SOI 的 TI 宿主細胞。
如請求項 14 之方法，其中該等重組酶係選自 Cre 重組酶、FLP 重組酶、Bxb1 整合酶及 φC31 整合酶。
如請求項 14 至 15 中任一項之方法，其中該等 SOI 編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈 Fv 片段 (scFv) 或 Fc 融合蛋白。
如請求項 14 至 16 中任一項之方法，其中該 TI 宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。
如請求項 17 之方法，其中該 TI 宿主細胞為倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
如請求項 17 或 18 之方法，其中該 TI 宿主細胞為 CHO 宿主細胞、CHO K1 宿主細胞、CHO K1SV 宿主細胞、DG44 宿主細胞、DUKXB-11 宿主細胞、CHOK1S 宿主細胞或 CHO K1M 宿主細胞。
如請求項 14 至 19 中任一項之方法，其中該載體係選自由以下所組成之群組：腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、整合噬菌體載體、非病毒載體、轉位子及/或轉位酶載體、整合酶受質及質體。
一種表現 SOI 之方法，其包含： a) 提供 TI 宿主細胞，該 TI 宿主細胞包含整合在如下序列內的整合位點處的外源性核苷酸序列： a. 與 NW_006874047.1 之核苷酸 41190 至 45269 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 63590 至 207911 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 253831 至 491909 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 69303 至 79768 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 293481 至 315265 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2650443 至 2662054 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 82214 至 97705 的全部或部分至少約 90% 同源；或 b. 與 NW_006874047.1 之核苷酸 45270 至 45490 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 207912 至 792374 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 491910 至 667813 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 79769 至 100059 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 315266 至 362442 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2662055 至 2701768 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 97706 至 105117 的全部或部分至少約 90% 同源；且其中該外源性核苷酸序列包含四個或更多個不相容的 RRS； b) 將至少三個載體引入 a) 中所提供的該細胞中，各載體包含： a. 兩個 RRS，其匹配經整合外源性核苷酸序列上之兩個依序定向的 RRS；以及 b. 各對 RRS，其側接於至少一個外源性 SOI 及至少一個第二選擇標記； c) 引入重組酶或編碼重組酶的核酸，其中該等重組酶識別該等 RRS； d) 選擇表現該等選擇標記之 TI 細胞，從而分離表現該等 SOI 的 TI 宿主細胞；以及 e) 在適合於表現該等 SOI 之條件下培養 d) 中的該細胞且從中回收表現的蛋白質。
如請求項 21 之方法，其中該等重組酶係選自 Cre 重組酶、FLP 重組酶、Bxb1 整合酶及 φC31 整合酶。
如請求項 21 至 22 中任一項之方法，其中該等 SOI 編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈 Fv 片段 (scFv) 或 Fc 融合蛋白。
如請求項 21 至 23 中任一項之方法，其中該 TI 宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。
如請求項 24 之方法，其中該 TI 宿主細胞為倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
如請求項 24 或 25 之方法，其中該 TI 宿主細胞為 CHO 宿主細胞、CHO K1 宿主細胞、CHO K1SV 宿主細胞、DG44 宿主細胞、DUKXB-11 宿主細胞、CHOK1S 宿主細胞或 CHO K1M 宿主細胞。
如請求項 21 至 26 中任一項之方法，其中該載體係選自由以下所組成之群組：腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、整合噬菌體載體、非病毒載體、轉位子及/或轉位酶載體、整合酶受質及質體。
一種產生包含編碼抗體的核酸之重組哺乳動物細胞之方法，其包含： a) 提供至少包含含有四個或更多個不相容的 RRS 的單一外源性核酸的哺乳動物細胞，該單一外源性核酸插入在該哺乳動物細胞之基因體的預定基因座處； b) 將至少三個載體引入 a) 之重組哺乳動物細胞中，各載體包含一對不相容的 RRS，該對不相容的 RRS 匹配包含在該外源性核酸中的兩個不相容的 RRS，該外源性核酸插入在該哺乳動物細胞之基因體的預定基因座處且各對不相容的 RRS 側接於一個或多個 SOI 及/或一個或多個選擇標記，其中該等 SOI 編碼抗體； c) 與引入包含該等 SOI 及/或選擇標記的該至少三個載體一起同時或依序引入一種或多種重組酶；以及 d) 選擇表現該等 SOI 及/或選擇標記中之一者或多者的細胞，從而產生包含編碼該抗體之核酸 SOI 的重組哺乳動物細胞。
如請求項 28 之方法，其中該外源性核酸插入在如下基因座處： a. 與 NW_006874047.1 之核苷酸 41190 至 45269 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 63590 至 207911 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 253831 至 491909 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 69303 至 79768 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 293481 至 315265 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2650443 至 2662054 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 82214 至 97705 的全部或部分至少約 90% 同源；或 b. 與 NW_006874047.1 之核苷酸 45270 至 45490 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 207912 至 792374 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 491910 至 667813 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 79769 至 100059 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 315266 至 362442 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2662055 至 2701768 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 97706 至 105117 的全部或部分至少約 90% 同源。
如請求項 28 至 29 之方法，其中該等重組酶係選自 Cre 重組酶、FLP 重組酶、Bxb1 整合酶及 φC31 整合酶。
如請求項 28 至 30 中任一項之方法，其中該等 SOI 編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈 Fv 片段 (scFv) 或 Fc 融合蛋白。
如請求項 28 之方法，其中該哺乳動物細胞為倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
如請求項 32 之方法，其中該哺乳動物細胞為 CHO 宿主細胞、CHO K1 宿主細胞、CHO K1SV 宿主細胞、DG44 宿主細胞、DUKXB-11 宿主細胞、CHOK1S 宿主細胞或 CHO K1M 宿主細胞。
如請求項 28 至 33 中任一項之方法，其中該等載體係選自由以下所組成之群組：腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、整合噬菌體載體、非病毒載體、轉位子及/或轉位酶載體、整合酶受質及質體。
一種產生包含編碼一種或多種抗體的核酸之重組哺乳動物細胞之方法，其包含： a) 提供包含至少兩個外源性核酸的哺乳動物細胞，該至少兩個外源性核酸插入在該哺乳動物細胞之基因體的預定基因座處，各外源性核酸包含四個或更多個不相容的 RRS，其中該等外源性核酸可包含相同或不同的 RRS； b) 將至少三個載體引入 a) 之重組哺乳動物細胞中，各載體包含一對不相容的 RRS，該對不相容的 RRS 匹配包含在該等外源性核酸中之一者或兩者中的兩個不相容的 RRS，該等外源性核酸插入在該哺乳動物細胞之基因體的預定基因座處且各對不相容的 RRS 側接於一個或多個 SOI 及/或一個或多個選擇標記，其中該等 SOI 編碼抗體； c) 與引入包含該等 SOI 及/或選擇標記的該至少三個載體一起同時或依序引入一種或多種重組酶；以及 d) 選擇表現該等 SOI 及/或選擇標記中之一者或多者的細胞，從而產生包含編碼該抗體之核酸 SOI 的重組哺乳動物細胞。
如請求項 35 之方法，其中該等外源性核酸插入在選自如下基因座的不同基因座處： a. 與 NW_006874047.1 之核苷酸 41190 至 45269 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 63590 至 207911 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 253831 至 491909 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 69303 至 79768 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 293481 至 315265 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2650443 至 2662054 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 82214 至 97705 的全部或部分至少約 90% 同源；或 b. 與 NW_006874047.1 之核苷酸 45270 至 45490 的全部或部分、NW_006884592.1 之核苷酸 207912 至 792374 的全部或部分、NW_006881296.1 之核苷酸 491910 至 667813 的全部或部分、NW_003616412.1 之核苷酸 79769 至 100059 的全部或部分、NW_003615063.1 之核苷酸 315266 至 362442 的全部或部分、NW_006882936.1 之核苷酸 2662055 至 2701768 的全部或部分、或 NW_003615411.1 之核苷酸 97706 至 105117 的全部或部分至少約 90% 同源。
如請求項 35 至 36 之方法，其中該等重組酶係選自 Cre 重組酶、FLP 重組酶、Bxb1 整合酶及 φC31 整合酶。
如請求項 35 至 37 中任一項之方法，其中該等 SOI 編碼單鏈抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈 Fv 片段 (scFv) 或 Fc 融合蛋白。
如請求項 35 之方法，其中該哺乳動物細胞為倉鼠宿主細胞、人類宿主細胞、大鼠宿主細胞或小鼠宿主細胞。
如請求項 39 之方法，其中該哺乳動物細胞為 CHO 宿主細胞、CHO K1 宿主細胞、CHO K1SV 宿主細胞、DG44 宿主細胞、DUKXB-11 宿主細胞、CHOK1S 宿主細胞或 CHO K1M 宿主細胞。
如請求項 35 至 40 中任一項之方法，其中該等載體係選自由以下所組成之群組：腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、整合噬菌體載體、非病毒載體、轉位子及/或轉位酶載體、整合酶受質及質體。