JP7446342B2 - 所定の構成の複数の発現カセットの標的化組込みによって三価の抗体を発現する細胞を生成するための方法 - Google Patents
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Description
例えば抗体等の、分泌されグリコシル化されるポリペプチドは、通常、安定発現または一過性発現のいずれかとして真核細胞において組換え発現されることにより産生される。
a)第1の抗原にそれぞれ特異的に結合する第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメント、
b)第2の抗原に特異的に結合し、CH1ドメインとCLドメインが互いに置換されている、1つのドメイン交換Fabフラグメント、
c)第1の重鎖Fc領域のポリペプチドと第2の重鎖Fc領域ポリペプチドを含む、1つのFc領域
を含み、
第1のFabフラグメントのCH1ドメインのC末端は、重鎖Fc領域ポリペプチドの1つのN末端に接続しており、ドメイン交換FabフラグメントのCLドメインのC末端は、他の重鎖Fc領域ポリペプチドのN末端に接続しており、
第2のFabフラグメントのCH1ドメインのC末端は、第1のFabフラグメントのVHドメインのN末端またはドメイン交換FabフラグメントのVHドメインのN末端に接続されており、
第1の抗原または第2の抗原は、ヒトCD3である。
a)第1の抗原にそれぞれ特異的に結合する第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメント、
b)第2の抗原に特異的に結合し、VHドメインとVLドメインが互いに置換されている、1つのドメイン交換Fabフラグメント、
c)第1の重鎖Fc領域のポリペプチドと第2の重鎖Fc領域ポリペプチドを含む、1つのFc領域
を含み、
第1のFabフラグメントのCH1ドメインのC末端は、重鎖Fc領域ポリペプチドの1つのN末端に接続しており、ドメイン交換FabフラグメントのCH1ドメインのC末端は、他の重鎖Fc領域ポリペプチドのN末端に接続しており、
第2のFabフラグメントのCH1ドメインのC末端は、第1のFabフラグメントのVHドメインのN末端またはドメイン交換FabフラグメントのVLドメインのN末端に接続されており、
第1の抗原または第2の抗原は、ヒトCD3である。
a)任意で三価の抗体(例えば、TCB)の発現に適した条件下で、三価の抗体(例えば、TCB)をコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程、および
b)細胞または培養培地から三価の抗体(例えば、TCB)を回収する工程
を含み、
三価の抗体(例えば、TCB)をコードするデオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノム中に安定に組み込まれ、かつ5’から3’の方向に、
1)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-任意に、第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
2)
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
ここで、第1~第3の発現カセットは一方向に配列されており、第4~第6の発現カセットは、第1~第3の発現カセットとは一方向および逆方向に配列されている、
または
3)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第1の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
のいずれかを含む、方法である。
-第1の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、第1の軽鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第2の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第1の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の重鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
-第2の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の軽鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは第2の結合部位を形成する。
-第1の重鎖は、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、第2の重鎖可変ドメイン、CLドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第2の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第1の軽鎖が、N末端からC末端に、第1の軽鎖可変ドメインおよびCH1ドメインを含み、
-第2の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の軽鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは第2の結合部位を形成する。
1)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-任意に、第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
2)
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
ここで、第1~第3の発現カセットは一方向に配列されており、第4~第6の発現カセットは、第1~第3の発現カセットとは一方向および逆方向に配列されている、
または
3)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第1の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
のいずれかを含む、三価の抗体(例えば、TCB)をコードするデオキシリボ核酸である。
-第1の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、第1の軽鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第2の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第1の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の重鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
-第2の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の軽鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは第2の結合部位を形成する。
-第1の重鎖は、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、第2の重鎖可変ドメイン、CLドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第2の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第1の軽鎖が、N末端からC末端に、第1の軽鎖可変ドメインおよびCH1ドメインを含み、
-第2の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の軽鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは第2の結合部位を形成する。
1)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-任意に、第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
2)
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
ここで、第1~第3の発現カセットは一方向に配列されており、第4~第6の発現カセットは、第1~第3の発現カセットとは一方向および逆方向に配列されている、
または
3)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第1の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
のいずれかを含む、デオキシリボ核酸の、哺乳動物細胞における三価の抗体(例えば、TCB)の発現のための使用である。
-第1の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、第1の軽鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第2の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第1の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の重鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
-第2の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の軽鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは第2の結合部位を形成する。
-第1の重鎖は、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、第2の重鎖可変ドメイン、CLドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第2の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第1の軽鎖が、N末端からC末端に、第1の軽鎖可変ドメインおよびCH1ドメインを含み、
-第2の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の軽鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは第2の結合部位を形成する。
三価の抗体(例えば、TCB)をコードするデオキシリボ核酸は、5’から3’の方向に、
1)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-任意に、第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
2)
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
ここで、第1~第3の発現カセットは一方向に配列されており、第4~第6の発現カセットは、第1~第3の発現カセットとは一方向および逆方向に配列されている、
または
3)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第1の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
のいずれかを含む。
-第1の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、第1の軽鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第2の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第1の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の重鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
-第2の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の軽鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは第2の結合部位を形成する。
-第1の重鎖は、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、第2の重鎖可変ドメイン、CLドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第2の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第1の軽鎖が、N末端からC末端に、第1の軽鎖可変ドメインおよびCH1ドメインを含み、
-第2の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の軽鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは第2の結合部位を形成する。
-第1の(最も5’の)発現カセットに対して5’に位置する第1の組換え認識配列、
-第6の(最も3’)発現カセットに対して3’に位置する第2の組換え認識配列、および
-第1の組換え認識配列と第2の組換え認識配列との間、かつ
-発現カセットのうちの2つの間
に位置する第3の組換え認識配列
をさらに含み、
組換え認識配列は全て異なっている。
-第1のデオキシリボ核酸は、5’から3’の方向に、
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
を含み、
かつ
-第2のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
を含む。
-第1の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、第1の軽鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第2の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第1の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の重鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
-第2の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の軽鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは第2の結合部位を形成する。
-第1の重鎖は、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、第2の重鎖可変ドメイン、CLドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第2の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第1の軽鎖が、N末端からC末端に、第1の軽鎖可変ドメインおよびCH1ドメインを含み、
-第2の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の軽鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは第2の結合部位を形成する。
i)5’、または
ii)3’、または
iii)部分的に5’および部分的に3’
のいずれかに位置している。
三価の抗体(例えば、TCB)をコードするデオキシリボ核酸は、次のエレメント、
第1、第2および第3の組換え認識配列、
第1の選択マーカーおよび第2の選択マーカー、ならびに
第1~第6の発現カセット、
を含み、5’から3’の方向に、エレメントの配列は、
RRS1-第1のEC-第2のEC-第3のEC-RRS3-SM1-第4のEC-第5のEC-第6のEC-RRS2
であり、
RRS=組換え認識配列、
EC=発現カセット、
SM=選択マーカーである。
a)哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1および第2の組換え認識配列、ならびに第1と第2の組換え認識配列の間に位置する第3の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なっている、哺乳動物細胞を提供する工程、
b)a)で提供された細胞に、3つの異なる組換え認識配列および6つの発現カセットを含む2つのデオキシリボ核酸を含む組成物を導入する工程であって、
第1のデオキシリボ核酸は、5’から3’の方向に、
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの5’末端部分、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
を含み、
かつ
第2のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの3’末端部分、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
を含み、
第1および第2のデオキシリボ核酸の第1~第3の組換え認識配列が、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の第1~第3の組換え認識配列と一致しており、
の1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの5’末端部分および3’末端部分が、一緒になって、の1つの第2の選択マーカーの機能的な発現カセットを形成する、組成物を導入する工程、
c)
i)b)の第1のデオキシリボ核酸および第2のデオキシリボ核酸と同時に、または
ii)その後に逐次的に、
1つまたは複数のリコンビナーゼを導入する工程であって、
1つまたは複数のリコンビナーゼが、第1および第2のデオキシリボ核酸の組換え認識配列を認識する(かつ、場合によっては、1つまたは複数のリコンビナーゼが、2つのリコンビナーゼ媒介カセット交換を行う)、1つまたは複数のリコンビナーゼを導入する工程
ならびに
d)第2の選択マーカーを発現し、三価の抗体(例えば、TCB)を分泌する細胞を選択する工程
を含み、
それにより、三価の抗体(例えば、TCB)をコードするデオキシリボ核酸を含み、三価の抗体(例えば、TCB)を分泌する組換え哺乳動物細胞を作製する、方法である。
-第1の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、第1の軽鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第2の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第1の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の重鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
-第2の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の軽鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは第2の結合部位を形成する。
-第1の重鎖は、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、第2の重鎖可変ドメイン、CLドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第2の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第1の軽鎖が、N末端からC末端に、第1の軽鎖可変ドメインおよびCH1ドメインを含み、
-第2の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の軽鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは第2の結合部位を形成する。
i)第1の発現カセットは、5’から3’の方向に、プロモータ、第1の重鎖をコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに任意に、ターミネータ配列を含み、
ii)第2の発現カセットは、5’から3’の方向に、プロモータ、第1の軽鎖をコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに任意に、ターミネータ配列を含み、
iii)第3の発現カセットは、5’から3’の方向に、プロモータ、第1の軽鎖をコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに任意に、ターミネータ配列を含み、
iv)第4の発現カセットは、5’から3’の方向に、プロモータ、第2の重鎖をコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに任意に、ターミネータ配列を含み、
v)第5の発現カセットは、5’から3’の方向に、プロモータ、第2の軽鎖をコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに任意に、ターミネータ配列を含み、
vi)第6の発現カセットは、5’から3’の方向に、プロモータ、第2の軽鎖をコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに任意に、ターミネータ配列を含み、
(vii)選択マーカーをコードする発現カセットは、5’から3’の方向に、プロモータ、選択マーカーをコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに任意に、ターミネータ配列を含む。
-第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントであって、第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントの各結合部位が第2の抗原に特異的に結合する、第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメント、
-第3のFabフラグメントであって、第3のFabフラグメントの結合部位が第1の抗原に特異的に結合し、可変軽鎖ドメイン(VL)と可変重鎖ドメイン(VH)とが互いに置換されるようにドメインクロスオーバーを含む、第3のFabフラグメント、
-Fc領域であって、第1のFc領域のポリペプチドと第2のFc領域のポリペプチドとを含む、Fc領域
を含み、
第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントは、それぞれ、重鎖フラグメントおよび完全長軽鎖を含み、
第1のFabフラグメントの重鎖フラグメントのC末端は、第1のFc領域ポリペプチドのN末端に融合されており、
第2のFabフラグメントの重鎖フラグメントのC末端が、第3のFabフラグメントの可変軽鎖ドメインのN末端に融合されており、第3のFabフラグメントの重鎖定常ドメイン1のC末端が、第2のFc領域ポリペプチドのN末端に融合されている。
[本発明1001]
三価の抗体を作製するための方法であって、
a)前記三価の抗体をコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程、および
b)前記細胞または培養培地から前記三価の抗体を回収する工程
を含み、
前記三価の抗体をコードする前記デオキシリボ核酸が、前記哺乳動物細胞のゲノム中に安定的に組み込まれ、かつ5’から3’の方向に、
(1)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(2)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(3)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(4)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(5)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット
または
(6)
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
のいずれかを含む、方法。
[本発明1002]
三価の抗体をコードするデオキシリボ核酸であって、5’から3’の方向に、
(1)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(2)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(3)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(4)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(5)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット
または
(6)
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
のいずれかを含む、デオキシリボ核酸。
[本発明1003]
5’から3’の方向に、
(1)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(2)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(3)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(4)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(5)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット
または
(6)
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
のいずれかを含むデオキシリボ核酸の、哺乳動物細胞における三価の抗体の発現のための使用。
[本発明1004]
組換え哺乳動物細胞であって、前記細胞のゲノムに組み込まれた三価の抗体をコードするデオキシリボ核酸を含み、前記三価の抗体をコードする前記デオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
(1)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(2)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(3)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(4)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(5)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット
または
(6)
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
のいずれかを含む、組換え哺乳動物細胞。
[本発明1005]
3つの異なる組換え認識配列および5~7つの発現カセットを順に含む、2つのデオキシリボ核酸を含む組成物であって、
-第1のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(1)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(2)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(3)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(4)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(5)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(6)
-第1の組換え認識配列、
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
のいずれかを含み、
かつ、
-第2のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(1)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(2)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(3)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(4)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(5)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または(6)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
のいずれかを含む、組成物。
[本発明1006]
三価の抗体をコードするデオキシリボ核酸を含みかつ前記三価の抗体を分泌する組換え哺乳動物細胞を作製するための方法であって、以下の工程:
a)哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む前記哺乳動物細胞を提供する工程であって、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1の組換え認識配列および第2の組換え認識配列、ならびに前記第1の組換え認識配列と前記第2の組換え認識配列との間に位置する第3の組換え認識配列を含み、かつ前記組換え認識配列が全て異なっている、哺乳動物細胞を提供する工程、
b)a)で提供された前記細胞に、3つの異なる組換え認識配列および5~7つの発現カセットを含む2つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程であって、
-第1のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
(1)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(2)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(3)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(4)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(5)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(6)
-第1の組換え認識配列、
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
のいずれかを含み、
かつ、
-第2のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(1)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(2)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(3)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(4)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(5)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(6)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
のいずれかを含み、
前記第1のデオキシリボ核酸および前記第2のデオキシリボ核酸の前記第1の組換え認識配列~前記第3の組換え認識配列は、組み込まれた前記外因性ヌクレオチド配列の前記第1の組換え認識配列~前記第3の組換え認識配列と一致しており、
1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの5’末端部分および3’末端部分が、一緒になる場合、前記1つの第2の選択マーカーの機能的発現カセットを形成する、組成物を導入する工程、
c)
i)b)の前記第1のデオキシリボ核酸および前記第2のデオキシリボ核酸と同時に、または
ii)その後に逐次的に
のいずれかで、1つまたは複数のリコンビナーゼを導入する工程であって、
前記1つまたは複数のリコンビナーゼが、前記第1のデオキシリボ核酸および前記第2のデオキシリボ核酸の前記組換え認識配列を認識する(かつ、場合によっては、前記1つまたは複数のリコンビナーゼが、2リコンビナーゼ媒介カセット交換を行う)、1つまたは複数のリコンビナーゼを導入する工程、
ならびに、
d)前記第2の選択マーカーを発現しかつ前記三価の抗体を分泌する細胞を選択する工程
を含み、
それにより、前記三価の抗体をコードするデオキシリボ核酸を含みかつ前記三価の抗体を分泌する組換え哺乳動物細胞を作製する、方法。
[本発明1007]
前記第1の重鎖がCH3ドメイン中に変異T366W(ナンバリングはKabatに従う)を含み、前記第2の重鎖がCH3ドメイン中に変異T366S、L368A、およびY407V(ナンバリングはKabatに従う)を含むか、またはその逆である、本発明1001から1006のいずれかの、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
[本発明1008]
前記重鎖の一方が変異S354Cをさらに含み、それぞれの他方の重鎖が変異Y349C(ナンバリングはKabatに従う)を含む、本発明1007の、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
[本発明1009]
前記第1の重鎖が、追加のドメイン交換Fab断片を含む伸長重鎖である、本発明1001から1008のいずれかの、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
[本発明1010]
前記第1の軽鎖が、ドメイン交換軽鎖VH-VLまたはCH1-CLである、本発明1001から1009のいずれかの、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
[本発明1011]
-前記第1の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、第1の軽鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-前記第2の重鎖が、N末端からC末端に、前記第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-前記第1の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の重鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
-前記第2の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の軽鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
前記第1の重鎖可変ドメインおよび前記第2の軽鎖可変ドメインが第1の結合部位を形成し、前記第2の重鎖可変ドメインおよび前記第1の軽鎖可変ドメインが第2の結合部位を形成する、
本発明1001から1010のいずれかの、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
[本発明1012]
前記デオキシリボ核酸が単一の部位または遺伝子座で前記哺乳動物細胞のゲノムに安定的に組み込まれている、本発明1001、1003、1004および1006から1011のいずれかの、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
[本発明1013]
前記三価の抗体をコードする前記デオキシリボ核酸が、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含み、前記選択マーカーをコードする前記発現カセットが、前記第3の組換え認識配列に対して部分的に5’および部分的に3’に位置し、前記発現カセットの前記5’に位置する部分が、プロモータおよび開始コドンを含み、前記発現カセットの前記3’に位置する部分が、開始コドンのないコード配列およびポリAシグナルを含み、前記開始コドンが、前記コード配列に作用可能に連結されている、本発明1001から1005および1007から1012のいずれかの、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
[本発明1014]
前記プロモータがSV40プロモータであり、ポリアデニル化シグナル配列がSV40ポリアデニル化シグナル配列であり、ターミネータが存在しない、前記選択マーカーの前記発現カセットを除いて、
前記プロモータが、イントロンAを含むヒトCMVプロモータであり、ポリアデニル化シグナル配列が、bGHポリアデニル化シグナル配列であり、ターミネータが、hGTターミネータである、
本発明1001から1005および1007から1013のいずれかの、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
[本発明1015]
前記哺乳動物細胞がCHO細胞である、本発明1001、1003、1004および1006から1014のいずれかの、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
[本発明1016]
5’から3’の方向の構成が第1の発現カセットとして前記第1の重鎖をコードする発現カセットを有する場合、全てのカセットが一方向に配列されている、本発明1001から1015のいずれかの、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
[本発明1017]
5’から3’方向の構成が、前記第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、前記第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、前記第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、前記第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、前記第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセットである場合、前記第1の発現カセット~前記第3の発現カセットが一方向に配置され、前記第4の発現カセット~前記第6の発現カセットが一方向に配置され、それにより、前記第1の発現カセット~前記第3の発現カセットが、前記第4の発現カセット~前記第6の発現カセットの反対方向に配置されている、本発明1001から1015のいずれかの、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
本発明は、異なるポリペプチドを含む複合分子、すなわちヘテロ多量体である、三価の抗体(例えば、TCB)の発現のために、所定かつ特定の発現カセット構成を使用すると、CHO細胞等の哺乳動物細胞において三価の抗体(例えば、TCB)の効率的な発現および生産がもたらされるという知見に、少なくとも部分的に基づいている。
本発明を実施するための有用な方法および技術は、例えば、Ausubel,F.M.(ed.),Current Protocols in Molecular Biology,Volumes I to III(1997);Glover,N.D.,and Hames,B.D.,ed.,DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I and II(1985),Oxford University Press;Freshney,R.I.(ed.),Animal Cell Culture-a practical approach,IRL Press Limited(1986);Watson,J.D.,et al.,Recombinant DNA,Second Edition,CHSL Press(1992);Winnacker,E.L.,From Genes to Clones;N.Y.,VCH Publishers(1987);Celis,J.,ed.,Cell Biology,Second Edition,Academic Press(1998);Freshney,R.I.,Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,second edition,Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)に記載されている。
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)に示されている。
(a)アミノ酸残基26~32(L1)、50~52(L2)、91~96(L3)、26~32(H1)、53~55(H2)、および96~101(H3)に生じる超可変ループ(Chothia,C.and Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)、
(b)アミノ酸残基24~34(L1)、50~56(L2)、89~97(L3)、31~35b(H1)、50~65(H2)、および95~102(H3)に生じるCDR(Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)、
(c)アミノ酸残基27c~36(L1)、46~55(L2)、89~96(L3)、30~35b(H1)、47~58(H2)、および93~101(H3)に生じる抗原接触(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))、ならびに
(d)アミノ酸残基46~56(L2)、47~56(L2)、48~56(L2)、49~56(L2)、26~35(H1)、26~35b(H1)、49~65(H2)、93~102(H3)、および94~102(H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
通常、例えば治療用ポリペプチドのような目的のポリペプチドの組換え大量生産のためには、前記ポリペプチドを安定に発現し分泌する細胞が必要とされる。この細胞は、「組換え細胞」または「組換え生産細胞」と呼ばれ、このような細胞を作製するために使用される方法は「細胞株開発」と呼ばれる。細胞株開発方法の第1の工程において、例えばCHO細胞などの適切な宿主細胞に、前記目的のポリペプチドの発現に適した核酸配列をトランスフェクトする。第2の工程において、目的のポリペプチドを安定に発現する細胞を、目的のポリペプチドをコードする核酸と共にコトランスフェクトしておいた選択マーカーの共発現に基づいて選択する。
三価の抗体(例えば、TCB)を発現する組換え哺乳動物細胞が、本明細書において報告されている。三価の抗体(例えば、TCB)は、前記哺乳動物細胞によって天然には発現されないヘテロ多量体ポリペプチドである。より具体的には、三価の抗体(例えば、TCB)は、4つのポリペプチド、第1の軽鎖および第2の軽鎖ならびに第1の重鎖および第2の重鎖からなるヘテロ二量体タンパク質である。三価の抗体(例えば、TCB)の発現を達成するために、特定かつ所定の配列中に複数の異なる発現カセットを含む組換え核酸が、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれている。
MP=主生成物、eff.力価=有効力価=主生成物の%を乗算した力価
本発明による1つの独立した態様は、三価の抗体を作製するための方法であって、
a)三価抗体をコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程、および
b)細胞または培養培地から三価抗体を回収する工程
を含み、
三価抗体をコードするデオキシリボ核酸が、哺乳動物細胞のゲノム中に安定に組み込まれ、かつ5’から3’の方向に、
(1)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(2)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(3)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(4)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(5)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット
または
(6)
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
のいずれかを含む。
(1)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(2)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(3)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(4)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(5)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット
または
(6)
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
のいずれかを含む。
(1)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(2)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(3)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(4)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(5)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット
または
(6)
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
のいずれかを含むデオキシリボ核酸の、哺乳動物細胞における三価の抗体の発現のための使用である。
三価の抗体をコードするデオキシリボ核酸は、5’から3’の方向に、
(1)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(2)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(3)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(4)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(5)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット
または
(6)
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
のいずれかを含む。
-第1のデオキシリボ核酸は、5’から3’の方向に、
(1)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(2)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(3)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(4)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(5)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(6)
-第1の組換え認識配列、
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
のいずれかを含み、
かつ
-第2のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
(1)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(2)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(3)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(4)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(5)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(6)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
のいずれかを含む。
a)哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1および第2の組換え認識配列、ならびに第1と第2の組換え認識配列の間に位置する第3の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なっている、哺乳動物細胞を提供する工程、
b)a)で提供された細胞に、3個の異なる組換え認識配列および5~7個の発現カセットを含む2つのデオキシリボ核酸を含む組成物を導入する工程であって、
-第1のデオキシリボ核酸は、5’から3’の方向に、
(1)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(2)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(3)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(4)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(5)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
または
(6)
-第1の組換え認識配列、
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
のいずれかを含み、
かつ
-第2のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
(1)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(2)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(3)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(4)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(5)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
または
(6)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
のいずれかを含み、
第1および第2のデオキシリボ核酸の第1~第3の組換え認識配列が、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の第1~第3の組換え認識配列と一致しており、
の1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの5’末端部分および3’末端部分が、一緒になって、の1つの第2の選択マーカーの機能的な発現カセットを形成する、組成物を導入する工程、
c)
i)b)の第1および第2のデオキシリボ核酸と同時に、
または
ii)その後に逐次的に、
1つまたは複数のリコンビナーゼを導入する工程であって、
1つまたは複数のリコンビナーゼが、第1および第2のデオキシリボ核酸の組換え認識配列を認識する(かつ、場合によっては、1つまたは複数のリコンビナーゼが、2つのリコンビナーゼ媒介カセット交換を行う)、1つまたは複数のリコンビナーゼを導入する工程
ならびに
d)第2の選択マーカーを発現し、三価抗体を分泌する細胞を選択する工程
を含み、
それにより、三価の抗体をコードするデオキシリボ核酸を含み、三価の抗体を分泌する組換え哺乳動物細胞を作製する、方法である。
-第1の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、第1の軽鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第2の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第1の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の重鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
-第2の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の軽鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは第2の結合部位を形成する。
-第1の重鎖は、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、第2の重鎖可変ドメイン、CLドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第2の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-第1の軽鎖が、N末端からC末端に、第1の軽鎖可変ドメインおよびCH1ドメインを含み、
-第2の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の軽鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインは第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインは第2の結合部位を形成する。
抗体鎖についての各発現カセットは、5’から3’の方向に、プロモータ、抗体鎖をコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに任意に、ターミネータ配列を含み、かつ
選択マーカーをコードする各発現カセットは、5’から3’の方向に、プロモータ、選択マーカーをコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに任意に、ターミネータ配列を含む。
-第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントであって、第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントの各結合部位が第2の抗原に特異的に結合する、第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメント、
-第3のFabフラグメントであって、第3のFabフラグメントの結合部位が第1の抗原に特異的に結合し、可変軽鎖ドメイン(VL)と可変重鎖ドメイン(VH)とが互いに置換されるようにドメインクロスオーバーを含む、第3のFabフラグメント、
-Fc領域であって、第1のFc領域のポリペプチドと第2のFc領域のポリペプチドとを含む、Fc領域
を含み、
第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントは、それぞれ、重鎖フラグメントおよび完全長軽鎖を含み、
第1のFabフラグメントの重鎖フラグメントのC末端は、第1のFc領域ポリペプチドのN末端に融合されており、
第2のFabフラグメントの重鎖フラグメントのC末端が、第3のFabフラグメントの可変軽鎖ドメインのN末端に融合されており、第3のFabフラグメントの重鎖定常ドメイン1のC末端が、第2のFc領域ポリペプチドのN末端に融合されている。
標的化組込みにより、哺乳動物細胞ゲノムのあらかじめ定められた部位に外因性ヌクレオチド配列が組み込まれることが可能になる。特定の実施形態では、標的化組込みは、1つまたは複数の組換え認識配列(RRS)を認識するリコンビナーゼによって媒介される。特定の実施形態では、標的化組込みは、相同組換えによって媒介される。
前述したような、外因性核酸(「ランディング部位」)を含む、TIに適した任意の公知または今後得られる哺乳動物細胞を、本発明において使用することができる。
上記に概説した「単一ベクターRMCE」のほかに、2つの核酸を同時に標的化組込みするために、新規な「2ベクターRMCE」を実施することができる。
配列番号01 L3リコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号02 2Lリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号03:LoxFasリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号04~06:ヒトCMVプロモータの例示的バリアント
配列番号07:例示的なSV40ポリアデニル化シグナル配列
配列番号08:例示的なbGHポリアデニル化シグナル配列
配列番号09:例示的なhGTターミネータ配列
配列番号10:例示的なSV40プロモータ配列
配列番号11:例示的なGFP核酸配列
一般的技術
1)組換えDNA技術
標準的な方法を使用して、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y,(1989)に記載されているようにDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書に従って使用した。
DNA配列決定は、SequiServe GmbH(Vaterstetten、Germany)で実施した。
EMBOSS(European Molecular Biology Open Software Suite)ソフトウェアパッケージおよびInvitrogenのVector NTIバージョン11.5を、配列の作成、マッピング、解析、アノテーション、および図示のために使用した。
所望の遺伝子セグメントを、Geneart GmbH(レーゲンスブルク、ドイツ)での化学合成によって調製した。合成した遺伝子フラグメントを増殖/増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングした。サブクローン化された遺伝子フラグメントのDNA配列は、DNAシークエンシングによって確認された。あるいは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、またはPCRによって短い合成DNAフラグメントを組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドを、Metabion GmbH(Planegg-Martinsried、ドイツ)によって調製した。
特に明記しない限り、全ての市販の化学物質、抗体およびキットを製造業者のプロトコルに従って提供されるように使用した。
TI CHO宿主細胞を、湿度85%および5%CO2の加湿インキュベータ内で37℃で培養した。それらを、300μg/mlハイグロマイシンBおよび4μg/mlの第2の選択マーカーを含有する専売のDMEM/F12ベースの培地で培養した。細胞を、総体積30mlで0.3×10E6細胞/mlの濃度で3または4日ごとに分割した。培養のために、125mlの非バッフル三角三角振盪フラスコを使用した。細胞を5cmの振盪振幅で150rpmで振盪した。Cedex HiRes Cell Counter(Roche)を用いて細胞数を決定した。細胞を60日齢に達するまで培養した。
一般
R部位を用いたクローニングは、以下の断片にある配列に等しい目的の遺伝子(SOI)の隣のDNA配列に依存する。同様に、フラグメントの構築は、等しい配列の重複およびその後のDNAリガーゼによる構築されたDNA中のニックの密封によって可能である。したがって、単一遺伝子、特に正しいR部位を含む予備ベクターのクローニングが必要である。これらの予備ベクターのクローニングに成功した後、R部位に隣接する目的の遺伝子を、R部位のすぐ隣で切断する酵素による制限消化によって切り出す。最後のステップは、1つのステップにおける全てのDNAフラグメントの組立てである。より詳細には、5’-エキソヌクレアーゼは、重複領域(R部位)の5’末端を除去する。その後、R部位のアニーリングを行うことができ、DNAポリメラーゼが3’末端を伸長させて配列中のギャップを埋める。最後に、DNAリガーゼはヌクレオチド間にニックを密封する。エキソヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼおよびリガーゼのような異なる酵素を含有するアセンブリマスターミックスの添加、およびその後の反応混合物の50°Cでのインキュベーションは、単一フラグメントの単一プラスミドへのアセンブリをもたらす。その後、コンピテント大腸菌細胞をプラスミドで形質転換する。
(表)ライゲーション反応混合物
アセンブリのために、各末端にR部位を有する全てのDNAフラグメントを氷上で一緒にピペットで移した。4つを超えるフラグメントがアセンブリされているとき、製造業者によって推奨されるように、全てのフラグメントの等モル比(0.05ng)を使用した。反応混合物の半分は、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mixによって具現化された。全反応体積は40μlであり、PCR清浄水での充填によって到達した。以下の表に、例示的なピペッティング方式を示す。
(表)アセンブリ反応混合物
形質転換のために、10個のベータコンピテント大腸菌細胞を氷上で解凍した。その後、2μlのプラスミドDNAを細胞懸濁液中に直接ピペッティングした。チューブを弾き、氷上に30分間置いた。その後、細胞を42℃の温かいサーマルブロックに入れ、正確に30秒間ヒートショックを与えた。その後すぐに、細胞を氷上で2分間冷却した。950μlのNEB10ベータ増殖培地を細胞懸濁液に添加した。細胞を振盪下、37℃で1時間インキュベートした。次いで、50~100μlを予熱した(37℃)LB-Amp寒天プレート上にピペットで取り、使い捨てスパチュラで広げた。混合物を、37℃で一晩撹拌した。アンピシリンに対する耐性遺伝子を有するプラスミドの組込みに成功した細菌のみが、このプレート上で増殖することができる。翌日、単一コロニーを採取し、その後のプラスミド調製のためにLB-Amp培地で培養した。
大腸菌の培養は、1ml/Lの100mg/mlアンピシリンを添加したルリア・ベルターニ(Luria Bertani)を略したLB培地で行い、0.1mg/mlのアンピシリン濃度を得た。異なるプラスミド調製量について、以下の量を単一細菌コロニーで接種した。
(表)大腸菌培養体積
ミニプレップの場合、50μlの細菌懸濁液を1ml深ウェルプレートに移した。その後、細菌細胞をプレート内で3000rpm、4℃で5分間遠心分離した。上清を除去し、細菌ペレットを含むプレートをEpMotionに入れた。約90分間実行し、溶出したプラスミドDNAをさらなる使用のためにEpMotionから除去することができた。
DNA溶液の体積を2.5倍体積のエタノール100%と混合した。混合物を、-20℃で10分間撹拌した。次いで、DNAを14,000rpm、4℃で30分間遠心分離した。上清を慎重に除去し、ペレットを70%エタノールで洗浄した。次いで、チューブを14,000rpm、4℃で5分間遠心分離した。上清をピペッティングすることによって慎重に除去し、ペレットを乾燥させた。エタノールを蒸発させた際に、適切な量のエンドトキシンを含まない水を添加した。DNAを4℃で一晩水に再溶解する時間を与えた。少量のアリコートを取り、Nanodrop装置を用いてDNA濃度を測定した。
プラスミド作製
発現カセット比率
上記の前駆体ポリペプチドの発現には、以下の機能的要素を含む転写ユニットを使用した。
-イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサーおよびプロモータ、
-ヒト重鎖免疫グロブリン5’非翻訳領域(5’UTR)、
-マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
-それぞれの前駆体ポリペプチドをコードする核酸、
-ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)、および
-任意で、ヒトガストリン終結因子(hGT)。
-大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18からの複製起点、および
-大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子を含む。
2プラスミド抗体構築物を構築するために、抗体HCおよびLCフラグメントを、L3およびLoxFAS配列を含む前方ベクター骨格、ならびにLoxFASおよび2L配列ならびにpac選択可能マーカーを含む後方ベクターにクローニングした。CreリコンビナーゼプラスミドpOG231(Wong,E.T.,et al.,Nucleic Acids Res 2005,33,(17),e147;O’Gorman S et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997,94,(26),14602-7)を全てのRMCEプロセスに使用した。
培養、トランスフェクション、選択、および単一細胞クローニング
TI宿主を、150rpmの一定の撹拌速度、標準的な加湿条件下(95%rH、37℃、および5%CO2)で、使い捨て125mlベントシェイクフラスコ内で、専用のDMEM/F12ベースの培地中で増殖させた。3~4日ごとに、細胞を、3×10E5細胞/mlの濃度の有効濃度の選択マーカー1および選択マーカー2を含有する化学的に定義された培地に播種した。培養物の密度と生存率を、Cedex HiRes細胞カウンタ(F.Hoffmann-La Roche Ltd、Basel、Switzerland)で測定した。
FACSスクリーニング
FACS解析を実施して、トランスフェクション効率およびトランスフェクションのRMCE効率を調べた。トランスフェクトされたアプローチの4×10E5細胞を遠心分離し(1200rpm、4分)、1mL PBSで2回洗浄した。PBSを用いる洗浄工程の後、沈殿物を400μLのPBSに再懸濁し、FACSチューブ(セルストレーナーキャップ付きのFalcon(登録商標)丸底チューブ、Corning)に移した。FACS Canto IIを用いて測定を実施し、ソフトウェアFlowJoを用いてデータを解析した。
フィードバッチ培養
フィードバッチ産生培養は、独自の化学限定培地を含む振盪フラスコまたはAmbr15容器(Sartorius Stedim)で実施した。細胞を0日目に1×10E6細胞/mLで播種し、3日目に温度を変化させた。3、7、および10日目に、培養物に独自のフィード培地を加えた。Vi-Cell(商標)XR装置(Beckman Coulter)を使用して、0、3、7、10、および14日目に、培養物中の細胞の生存細胞数(VCC)および生存率割合を測定した。Bioprofile 400 Analyzer(Nova Biomedical)を使用して、7、10および14日目にグルコース濃度および乳酸濃度を測定した。フィードバッチ開始後14日目に、遠心分離(10分、1000rpmおよび10分、4000rpm)によって上清を採取し、濾過(0.22μm)によって清澄化した。UV検出を伴うタンパク質A親和性クロマトグラフィーを使用して、14日目の力価を測定した。
ベクター設計の効果
TI宿主における生産性に対する発現カセット構成の影響を調べるために、RMCEプールを、TCBフォーマットの三価の抗体の異なる数および構成の個々の鎖を含む、2つのプラスミド(前方および後方ベクター)をトランスフェクトすることによって、作製した。フローサイトメトリーによるRMCEの選択、回収および検証の後、プールの生産性を14日間の流加産生アッセイで評価した。特定のベクター構成について、参照プールと比較して力価の増加が観察された。
Claims (17)
- 三価の抗体を作製するための方法であって、
a)前記三価の抗体をコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程、および
b)前記細胞または培養培地から前記三価の抗体を回収する工程
を含み、
前記三価の抗体をコードする前記デオキシリボ核酸が、前記哺乳動物細胞のゲノム中に安定的に組み込まれ、かつ5’から3’の方向に、
(1)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(2)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(4)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(5)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット
または
(6)
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
のいずれかを含む、方法。 - 三価の抗体をコードするデオキシリボ核酸であって、5’から3’の方向に、
(1)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(2)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(4)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(5)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット
または
(6)
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
のいずれかを含む、デオキシリボ核酸。 - 5’から3’の方向に、
(1)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(2)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(4)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(5)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット
または
(6)
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
のいずれかを含むデオキシリボ核酸の、哺乳動物細胞における三価の抗体の発現のための使用。 - 組換え哺乳動物細胞であって、前記細胞のゲノムに組み込まれた三価の抗体をコードするデオキシリボ核酸を含み、前記三価の抗体をコードする前記デオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
(1)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット
または
(2)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(4)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
または
(5)
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、
-前記第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット
または
(6)
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット
のいずれかを含む、組換え哺乳動物細胞。 - 3つの異なる組換え認識配列および5~7つの発現カセットを順に含む、2つのデオキシリボ核酸を含む組成物であって、
-第1のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(1)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
を含み、かつ
-第2のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(1)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
を含むか、
または
-第1のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(2)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
を含み、かつ
-第2のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(2)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
を含むか、
または
-第1のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(4)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
を含み、かつ
-第2のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(4)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
を含むか、
または
-第1のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(5)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
を含み、かつ
-第2のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(5)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
を含むか、
または
-第1のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(6)
-第1の組換え認識配列、
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
を含み、かつ
-第2のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(6)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
を含む、
前記組成物。 - 三価の抗体をコードするデオキシリボ核酸を含みかつ前記三価の抗体を分泌する組換え哺乳動物細胞を作製するための方法であって、以下の工程:
a)哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む前記哺乳動物細胞を提供する工程であって、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1の組換え認識配列および第2の組換え認識配列、ならびに前記第1の組換え認識配列と前記第2の組換え認識配列との間に位置する第3の組換え認識配列を含み、かつ前記組換え認識配列が全て異なっている、哺乳動物細胞を提供する工程、
b)a)で提供された前記細胞に、3つの異なる組換え認識配列および5~7つの発現カセットを含む2つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程であって、
-第1のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
(1)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
を含み、かつ
-第2のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(1)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
を含むか、
または
-第1のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
(2)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
を含み、かつ
-第2のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(2)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
を含むか、
または
-第1のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
(4)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
を含み、かつ
-第2のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(4)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第1の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
を含むか、
または
-第1のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
(5)
-第1の組換え認識配列、
-第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、
-第2の重鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第4の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
を含み、かつ
-第2のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(5)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第5の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第7の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
を含むか、
または
-第1のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
(6)
-第1の組換え認識配列、
-第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、
-前記第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、
-第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、および
-第3の組換え認識配列の第1のコピー
を含み、かつ
-第2のデオキシリボ核酸が5’から3’の方向に、
(6)
-第3の組換え認識配列の第2のコピー、
-第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、
-第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、
-前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセット、および
-第2の組換え認識配列
を含み、
前記第1のデオキシリボ核酸および前記第2のデオキシリボ核酸の前記第1の組換え認識配列~前記第3の組換え認識配列は、組み込まれた前記外因性ヌクレオチド配列の前記第1の組換え認識配列~前記第3の組換え認識配列と一致しており、
1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの5’末端部分および3’末端部分が、一緒になる場合、前記1つの第2の選択マーカーの機能的発現カセットを形成する、組成物を導入する工程、
c)
i)b)の前記第1のデオキシリボ核酸および前記第2のデオキシリボ核酸と同時に、または
ii)その後に逐次的に
のいずれかで、1つまたは複数のリコンビナーゼを導入する工程であって、
前記1つまたは複数のリコンビナーゼが、前記第1のデオキシリボ核酸および前記第2のデオキシリボ核酸の前記組換え認識配列を認識する(かつ、場合によっては、前記1つまたは複数のリコンビナーゼが、2リコンビナーゼ媒介カセット交換を行う)、1つまたは複数のリコンビナーゼを導入する工程、
ならびに、
d)前記第2の選択マーカーを発現しかつ前記三価の抗体を分泌する細胞を選択する工程
を含み、
それにより、前記三価の抗体をコードするデオキシリボ核酸を含みかつ前記三価の抗体を分泌する組換え哺乳動物細胞を作製する、方法。 - 前記第1の重鎖がCH3ドメイン中に変異T366W(ナンバリングはKabatに従う)を含み、前記第2の重鎖がCH3ドメイン中に変異T366S、L368A、およびY407V(ナンバリングはKabatに従う)を含むか、またはその逆である、請求項1から6のいずれか一項に記載の、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
- 前記重鎖の一方が変異S354Cをさらに含み、それぞれの他方の重鎖が変異Y349C(ナンバリングはKabatに従う)を含む、請求項7に記載の、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
- 前記第1の重鎖が、追加のドメイン交換Fab断片を含む伸長重鎖である、請求項1から8のいずれか一項に記載の、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
- 前記第1の軽鎖が、ドメイン交換軽鎖VH-VLまたはCH1-CLである、請求項1から9のいずれか一項に記載の、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
- -前記第1の重鎖が、N末端からC末端に、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、第1の軽鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-前記第2の重鎖が、N末端からC末端に、前記第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含み、
-前記第1の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の重鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
-前記第2の軽鎖が、N末端からC末端に、第2の軽鎖可変ドメインおよびCLドメインを含み、
前記第1の重鎖可変ドメインおよび前記第2の軽鎖可変ドメインが第1の結合部位を形成し、前記第2の重鎖可変ドメインおよび前記第1の軽鎖可変ドメインが第2の結合部位を形成する、
請求項1から10のいずれか一項に記載の、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。 - 前記デオキシリボ核酸が単一の部位または遺伝子座で前記哺乳動物細胞のゲノムに安定的に組み込まれている、請求項1、3、4および6から11のいずれか一項に記載の、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
- 前記三価の抗体をコードする前記デオキシリボ核酸が、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含み、前記選択マーカーをコードする前記発現カセットが、前記第3の組換え認識配列に対して部分的に5’および部分的に3’に位置し、
前記発現カセットの前記5’に位置する部分が、プロモータおよび開始コドンを含み、前記発現カセットの前記3’に位置する部分が、開始コドンのないコード配列およびポリAシグナルを含み、前記開始コドンが、前記コード配列に作用可能に連結されている、請求項6に記載の組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。 - 前記プロモータがSV40プロモータであり、ポリアデニル化シグナル配列がSV40ポリアデニル化シグナル配列であり、ターミネータが存在しない、前記選択マーカーの前記発現カセットを除いて、
前記プロモータが、イントロンAを含むヒトCMVプロモータであり、ポリアデニル化シグナル配列が、bGHポリアデニル化シグナル配列であり、ターミネータが、hGTターミネータである、
請求項13に記載の組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。 - 前記哺乳動物細胞がCHO細胞である、請求項1、3、4および6から14のいずれか一項に記載の、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
- 5’から3’の方向の構成が第1の発現カセットとして前記第1の重鎖をコードする発現カセットを有する場合、全てのカセットが一方向に配列されている、請求項1から15のいずれか一項に記載の、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
- 5’から3’方向の構成が、前記第1の軽鎖をコードする第1の発現カセット、前記第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、前記第1の重鎖をコードする第3の発現カセット、前記第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、前記第2の軽鎖をコードする第5の発現カセット、前記第2の軽鎖をコードする第6の発現カセットである場合、前記第1の発現カセット~前記第3の発現カセットが一方向に配置され、前記第4の発現カセット~前記第6の発現カセットが一方向に配置され、それにより、前記第1の発現カセット~前記第3の発現カセットが、前記第4の発現カセット~前記第6の発現カセットの反対方向に配置されている、請求項1から15のいずれか一項に記載の、三価の抗体を作製するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を作製するための方法。
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