JP7410983B2 - Cre mRNAを使用した標的指向性組込みによるタンパク質発現細胞の作製のための方法 - Google Patents

Cre mRNAを使用した標的指向性組込みによるタンパク質発現細胞の作製のための方法 Download PDF

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Description

本発明は、細胞株作製およびポリペプチド生産の分野に関する。より正確には、哺乳動物細胞のゲノムへ組み込まれている発現カセットをもたらす、CreリコンビナーゼmRNAを使用するカセット交換反応に媒介されたリコンビナーゼによって得られた組換え哺乳動物細胞が、本明細書において報告される。
例えば抗体などの、分泌されるグリコシル化されたポリペプチドは、通常、安定発現または一過性発現のいずれかとして真核細胞において組換え発現されることにより生産される。
目的の外因性ポリペプチドを発現する組換え細胞を作製するための1つの戦略は、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のランダムな組込みとそれに続く分泌工程および単離工程を含む。しかしながら、この手法にはいくつかの欠点がある。第一に、細胞それ自体のゲノム中へのヌクレオチド配列の機能的組込みは、珍しい事象であるだけでなく、ヌクレオチド配列が組み込まれる場所についてのランダム性を考慮に入れると、これらの珍しい事象の結果、遺伝子発現および細胞増殖に様々な表現型が生じる。「位置効果変異」として公知のこのような変異は、真核細胞ゲノムに存在する複雑な遺伝子制御ネットワークならびに組込みおよび遺伝子発現のための特定のゲノム遺伝子座に対する接近容易性に、少なくともある程度は起因する。第二に、一般に、ランダム組込み戦略は、細胞のゲノム中に組み込まれたヌクレオチド配列コピーの数をコントロールしない。実際に、高産生細胞を得るために遺伝子増幅法がしばしば使用される。しかし、このような遺伝子増幅は、例えば不安定な細胞増殖および/または生産物発現などの望ましくない細胞表現型を招く可能性もある。第三に、ランダム組込みプロセスにつきものの組込み遺伝子座不均一性が原因となって、目的のポリペプチドについて望ましい発現レベルを示している組換え細胞を単離するためにトランスフェクション後に何千個もの細胞をスクリーニングすることには、時間がかかり、大きな労働力を要する。そのような細胞を単離した後でさえ、目的のポリペプチドの安定な発現は保証されておらず、安定な市販用生産細胞を得るには、さらなるスクリーニングが必要とされる場合がある。第四に、ランダム組込みによって得られた細胞から生産されるポリペプチドは、高度の配列差異を示し、これは、高レベルのポリペプチド発現を選択するために使用される選択剤の変異原性にいくらか起因する可能性がある。最後に、生産しようとするポリペプチドの複雑性が高いほど、すなわち、目的のポリペプチドを細胞内で形成するのに必要とされる種々のポリペプチドまたはポリペプチド鎖の数が多いほど、互いに異なるポリペプチドまたはポリペプチド鎖の発現比率をコントロールすることが、より重要になる。発現比率のコントロールは、目的のポリペプチドの効率的な発現、正確な組立て、および高い発現収率での成功裡な分泌を可能にするために必要とされる。
リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)による標的指向性組込みは、真核生物宿主ゲノムのあらかじめ定められた部位に特異的かつ効率的に外来DNAを導くための方法である(Turanら、J.Mol.Biol.407(2011)193~221(非特許文献1))。
WO2006/007850(特許文献1)では、抗RhD組換えポリクローナル抗体および個々の宿主細胞のゲノム中への部位特異的組込みを用いる製造方法が開示されている。
Crawford,Y.ら(Biotechnol.Prog.29(2013)1307~1315(非特許文献2))は、phiC31インテグラーゼ技術とCRE-Lox技術を組み合わせて用いて、標的指向性細胞株開発のために信頼のおける宿主を限定的なゲノムスクリーニングによって迅速に同定したことを報告した。
WO2013/006142(特許文献2)では、そのゲノム中にドナーカセットを安定的に組み入れた、遺伝的に変更された真核細胞のほぼ均質な集団を開示しており、ドナーカセットは、ターゲティング核酸部位および選択マーカータンパク質コード配列を含む単離された核酸断片に作動可能に連結された強力なポリアデニル化部位を含み、単離された核酸断片は、第1の組換え部位および第2の異なる組換え部位に挟まれている。
WO2018/162517(特許文献3)では、i)発現カセット配列およびii)様々な発現ベクター間での発現カセットの分布に応じて、発現収率および生産物の質に大きな差異が認められたことが開示されている。
Tadauchi,T.らは、抗体の発現を困難にするものを体系的に調査するために、調節された標的指向性組込み細胞株発生アプローチを利用することを開示している(Biotechnol.Prog.35(2019)No.2,1-11(非特許文献3))。
WO2017/184831(特許文献4)は、真核細胞における組換えタンパク質の部位特異的組込みおよび発現、特に、発現増強遺伝子座を使用することによる、真核細胞、特にチャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)細胞株における二重特異性抗体を含む抗体の発現を改善するための方法を開示しているとされる。この文献におけるデータは匿名化された方法で提示されているため、実際に行われたことを結論付けることはできない。Creリコンビナーゼが使用されたとき、それは追加のプラスミドにコトランスフェクトされたが、このプラスミドの組成や起源については説明されていない。
Gurumurthy,C.B.およびKent Lloyd,K.C.は、生物医学研究のためのマウスモデルを開示した(Dis.Mod.Mech.12(2019)(非特許文献4))。彼らは、胚性幹細胞における相同組換えによる従来の遺伝子ターゲティングが、接合子における対立遺伝子特異的操作を可能にするより洗練された方法にどのように取って代わったかについて論じている。
Bahr,S.らは、チャイニーズハムスター卵巣細胞における標的指向性組込みを使用したプラットフォーム発現システムの発生を開示した(proceedings of Cell Culture Engineering XVI,2018(非特許文献5))。
WO2006/007850 WO2013/006142 WO2018/162517 WO2017/184831
Turanら、J.Mol.Biol.407(2011)193~221 Crawford,Y.ら、Biotechnol.Prog.29(2013)1307~1315 Tadauchi,T.ら、Biotechnol.Prog.35(2019)No.2,1-11 Gurumurthy,C.B.およびKent Lloyd,K.C.、Dis.Mod.Mech.12(2019) Bahr,S.ら、proceedings of Cell Culture Engineering XVI,2018
異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を作製するための方法および前記組換え哺乳動物細胞を用いて異種ポリペプチドを生産するための方法が、本明細書において報告される。
本発明は、少なくとも部分的に、例えばCreリコンビナーゼDNA(Cre DNA)の代わりにCreリコンビナーゼmRNA(Cre mRNA)が使用される場合に、標的指向性組込みによって得られるクローンの数を改善することができるという知見に基づいている。より詳細には、選択期間後にCre mRNA作製組換え細胞プールにおけるクローンの絶対数が、CREプラスミド作製組換え細胞プールにおけるよりも大きいことが発見された。よって、例えばプラスミドをコードするCreリコンビナーゼ(Creプラスミド)の代わりにCre mRNAを使用することにより、クローン数および異質性が増加した組換え細胞プールを得ることができる。この理論に拘束されることなく、それにより、高力価で良好な製品品質を有する組換え細胞クローンを発見する可能性が高まると想定される。さらに、Creプラスミド作製細胞プールと比較して、Cre mRNA作製プールからの組換え細胞クローンの数の増加は安定していることが発見された。
リコンビナーゼ反応のために導入されたCre mRNAは、単離されたCre mRNAであり、本発明の方法におけるCreリコンビナーゼの唯一の供給源であることを指摘する必要がある。
本発明の1つの独立した態様は、ポリペプチドを生産するための方法であって、
a)ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞を、任意でポリペプチドの発現に適した条件下で、培養する工程と、
b)細胞または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含み、
ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸が、mRNAを使用したCreリコンビナーゼ媒介カセット交換により、哺乳動物細胞のゲノムに安定して組み込まれる、
方法である。
本発明の別の独立した態様は、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、
a)哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1の組換え認識配列および第2の組換え認識配列、ならびに第1の組換え認識配列と第2の組換え認識配列の間に位置する第3の組換え認識配列を含み、組換え認識配列がすべて異なる、哺乳動物細胞を提供する工程;
b)a)で提供された細胞に、3つの異なる組換え認識配列および1から8つの発現カセットを含む2つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程であって、
第1のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
- 第1の組換え認識配列と、
- 1つまたは複数の発現カセットと、
- 1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの5’末端部分と、
- 第3の組換え認識配列の第1のコピーと、
を含み、かつ、
第2のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
- 第3の組換え認識配列の第2のコピーと、
- 1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの3’末端部分と、
- 1つまたは複数の発現カセットと、
- 第2の組換え認識配列と、
を含み、
第1のデオキシリボ核酸および第2のデオキシリボ核酸の第1~第3の組換え認識配列が、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列の第1~第3の組換え認識配列と一致しており、
1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの5’末端部分および3’末端部分が、まとまると、1つの第2の選択マーカーの機能的発現カセットを形成する、
2つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程;
c)CreリコンビナーゼmRNAを
i)b)の第1および第2のデオキシリボ核酸と同時に、または
ii)その後で逐次的に
のいずれかで導入する工程であって、
Creリコンビナーゼが、第1および第2のデオキシリボ核酸の組換え認識配列を認識する(かつ、任意で、リコンビナーゼが、2のリコンビナーゼ媒介カセット交換を行う)、
CreリコンビナーゼmRNAを導入する工程;ならびに
d)第2の選択マーカーを発現しポリペプチドを分泌する細胞を選択する工程
を含み、それによって、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞が生産される、
方法である。
本発明の別の態様は、組換え哺乳動物細胞の数を増加させるためのCreリコンビナーゼmRNAの使用であって、前記細胞が、標的指向性組込みにより前記細胞のゲノム中の単一の部位に安定して組み込まれた目的の(異種)ポリペプチドをコードする(異種および/またはトランスジェニック)デオキシリボ核酸(の厳密に一つのコピー)を含む、使用である。一実施態様では、組換え細胞はまた、培養培地中での培養時に、目的のポリペプチドを培養培地中に分泌する。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、哺乳動物細胞および/または導入されたCreリコンビナーゼmRNAは、デオキシリボ核酸をコードするCreリコンビナーゼを含まない。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、CreリコンビナーゼmRNAは、単離されたCreリコンビナーゼmRNAである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、Cre mRNAは、配列番号12のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、Cre mRNAは、配列番号12のアミノ酸配列を含み、NもしくはC末端または両方に核局在化配列をさらに含むポリペプチドをコードする。一実施態様では、Cre mRNAは、配列番号12のアミノ酸配列を含み、NもしくはC末端または互いに独立して両方に1から5の核局在化配列をさらに含むポリペプチドをコードする。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、Cre mRNAは、配列番号13のヌクレオチド配列またはそのコドン使用最適化バリアントを含む。本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、配列番号13のヌクレオチド配列またはそのコドン使用最適化バリアントは、5’もしくは3’末端または両方に核局在化配列をコードするさらなる核酸をさらに含む。すべての態様の一実施態様では、Cre mRNAは、配列番号13のヌクレオチド配列またはそのコドン使用最適化バリアントを含み、5’もしくは3’末端または互いに独立して両方に核局在化配列をコードする1から5の核酸をさらに含む。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、デオキシリボ核酸の厳密に1つのコピーが、単一の部位または遺伝子座で、哺乳動物細胞のゲノム内に安定して組み込まれる。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、1から8つの発現カセットを含む。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、少なくとも4つの発現カセットを含み、ここで、
- 第1の組換え認識配列は、最も5’側(すなわち、第1)の発現カセットに対して5’側に位置しており、
- 第2の組換え認識配列は、最も3’側の発現カセット(すなわち、最後の発現カセット)に対して3’側に位置しており、
- 第3の組換え認識配列は、
- 第1の組換え認識配列と第2の組換え認識配列との間、かつ
- 発現カセットのうちの2つの間
に位置しており、
組換え認識配列はすべて異なる。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、第3の組換え認識配列は、第2の発現カセットと第3の発現カセットとの間、または第3の発現カセットと第4の発現カセットとの間、または第4の発現カセットと第5の発現カセットとの間に位置している。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含む。
本発明のすべての態様および実施態様の一実施態様では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含み、当該選択マーカーをコードする発現カセットは、第3の組換え認識配列の5’側に一部が、3’側に一部が位置しており、前記発現カセットの、5’側に位置する部分は、プロモーターおよび開始コドンを含み、前記発現カセットの、3’側に位置する部分は、開始コドンのないコード配列およびポリAシグナルを含み、開始コドンはコード配列に作動可能に連結される。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、選択マーカーをコードする発現カセットは、第3の組換え認識配列に対して、
i)5’側、または
ii)3’側、または
iii)一部が5’側、一部が3’側
のいずれかに位置している。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、選択マーカーをコードする発現カセットの、5’側に位置する部分は、開始コドンに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、プロモーター配列は、上流側で、それぞれ、第2、第3、または第4の発現カセットと隣接し(すなわち、第2、第3、または第4の発現カセットに対して下流の位置にあり)、開始コドンは、下流側で第3の組換え認識配列と隣接し(すなわち、第3の組換え認識配列に対して上流の位置にあり);かつ、選択マーカーをコードする発現カセットの、3’側に位置する部分は、開始コドンを欠く選択マーカーをコードする核酸を含み、上流側で第3の組換え認識配列と隣接し、下流側で第3、第4、または第5の発現カセットと隣接している。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、開始コドンは転写開始コドンである。一実施態様では、開始コドンはATGである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、第1のデオキシリボ核酸は第1のベクターに組み込まれ、第2のデオキシリボ核酸は第2のベクターに組み込まれる。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、発現カセットのそれぞれは、5’から3’の方向に、プロモーターと、コード配列と、ポリアデニル化シグナル配列と、任意で、それに続くターミネーター配列とを含む。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、プロモーターは、イントロンAを有するまたは有しないヒトCMVプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列はbGHポリA部位であり、ターミネーターはhGTターミネーターである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、プロモーターは、イントロンAを有するヒトCMVプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列はbGHポリアデニル化シグナル配列であり、かつターミネーターはhGTターミネーターであり;ただし例外として選択マーカーの発現カセットでは、プロモーターがSV40プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列がSV40ポリアデニル化シグナル配列であり、かつターミネーターが存在しない。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、哺乳動物細胞はCHO細胞である。一実施態様において、CHO細胞はCHO-K1細胞である。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、二価の単一特異性抗体、二価の二重特異性抗体、少なくとも1つのドメイン交換を含む二価の二重特異性抗体、および少なくとも1つのドメイン交換を含む三価の二重特異性抗体からなるポリペプチドの群より選択される。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ四量体ポリペプチドであって、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、第1の軽鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第1の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第2の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第2の重鎖可変ドメインとCLドメインとを含む、第1の軽鎖、および
- N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含む、第2の軽鎖
を含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第2の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ四量体ポリペプチドであって、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、第2の重鎖可変ドメインと、CLドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第1の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第2の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の軽鎖可変ドメインとCH1ドメインとを含む、第1の軽鎖、および
- N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含む、第2の軽鎖
を含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第2の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ四量体ポリペプチドであって、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第1の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の軽鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第2の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第2の重鎖可変ドメインとCLドメインとを含む、第1の軽鎖、および
- N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含む、第2の軽鎖
を含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第2の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ四量体ポリペプチドであって、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第1の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CLドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第2の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の軽鎖可変ドメインとCH1ドメインとを含む、第1の軽鎖、および
- N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含む、第2の軽鎖
を含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第2の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ多量体ポリペプチドであって、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインと、第1の軽鎖可変ドメインとを含む、第1の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインと、第2の重鎖可変ドメインとを含む、第2の重鎖、および
- N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含む、第1の軽鎖
を含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第2の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ四量体ポリペプチドであって、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインと、ペプチドリンカーと、第2の重鎖可変ドメインと、CLドメインとを含む、第1の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第2の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の軽鎖可変ドメインとCH1ドメインとを含む、第1の軽鎖、および
- N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含む、第2の軽鎖
を含み、
第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第1の結合部位を形成し、第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第2の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは治療用抗体である。好ましい実施態様において、治療用抗体は、二重特異性(治療用)抗体である。一態様において、二重特異性(治療用)抗体はTCBである。
すべての態様および実施態様の一実施態様では、ポリペプチドは、二重特異性(治療用)抗体(TCB)であって、
- 第1および第2のFab断片であって、第1および第2のFab断片の各結合部位が第2の抗原に特異的に結合する、第1および第2のFab断片と、
- 第3のFab断片であって、第3のFab断片の結合部位が第1の抗原に特異的に結合し、可変軽鎖ドメイン(VL)と可変重鎖ドメイン(VH)とが互いに置き換えられるようにドメインクロスオーバーを含む、第3のFab断片と、
- 第1のFc領域ポリペプチドおよび第2のFc領域ポリペプチドを含む、Fc領域と
を含み、
第1および第2のFab断片がそれぞれ、重鎖断片および完全長軽鎖を含み、
第1のFab断片の重鎖断片のC末端が、第1のFc領域ポリペプチドのN末端に融合しており、
第2のFab断片の重鎖断片のC末端が、第3のFab断片の可変軽鎖ドメインのN末端に融合し、第3のFab断片の重鎖定常ドメイン1のC末端が、第2のFc領域ポリペプチドのN末端に融合している、
二重特異性(治療用)抗体(TCB)である。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、抗CD3/CD20二重特異性抗体である。一態様において、抗CD3/CD20二重特異性抗体はTCBであり、CD20は第2の抗原である。特定の実施態様では、抗CD3/CD20抗体はRG6026である。
本発明のデオキシリボ核酸の個々の発現カセットは、逐次的に配置される。1つの発現カセットの終わりとその後の次の発現カセットの開始との間の距離は、ほんの数ヌクレオチドであり、これはクローニング手順に必要であった、すなわちクローニング手順の結果であった。
[本発明1001]
ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつ前記ポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、
a)前記哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1および第2の組換え認識配列、ならびに前記第1の組換え認識配列と前記第2の組換え認識配列の間に位置する第3の組換え認識配列を含み、前記組換え認識配列がすべて異なり、前記哺乳動物細胞が、DNAをコードするCreリコンビナーゼを含まない、哺乳動物細胞を提供する工程;
b)a)で提供された細胞に、3つの異なる組換え認識配列および1から8つの発現カセットを含む2つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程であって、
第1のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
- 第1の組換え認識配列と、
- 1つまたは複数の発現カセットと、
- 1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの5’末端部分と、
- 第3の組換え認識配列の第1のコピーと、
を含み、かつ、
第2のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
- 前記第3の組換え認識配列の第2のコピーと、
- 前記1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの3’末端部分と、
- 1つまたは複数の発現カセットと、
- 第2の組換え認識配列と、
を含み、
前記第1および第2のデオキシリボ核酸の前記第1~第3の組換え認識配列が、組み込まれている前記外因性ヌクレオチド配列の前記第1~第3の組換え認識配列と一致しており、
前記1つの第2の選択マーカーをコードする前記発現カセットの5’末端部分および3’末端部分が、まとまると、前記1つの第2の選択マーカーの機能的発現カセットを形成し、
前記デオキシリボ核酸が、DNAをコードするCreリコンビナーゼを含まない、
2つのデオキシリボ核酸の組成物を細胞に導入する工程;
c)CreリコンビナーゼmRNAを、Creリコンビナーゼの唯一の供給源として
i)b)の前記第1および第2のデオキシリボ核酸と同時に、または
ii)その後で逐次的に
のいずれかで導入する工程であって、
前記Creリコンビナーゼが、前記第1および第2のデオキシリボ核酸の前記組換え認識配列を認識する(かつ、任意で、前記1つまたは複数のリコンビナーゼが、2つのリコンビナーゼ媒介カセット交換を行う)、
CreリコンビナーゼmRNAを導入する工程;ならびに、
d)前記第2の選択マーカーを発現しかつ前記ポリペプチドを分泌する細胞を選択する工程
を含み、それによって、前記ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつ前記ポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞が生産される、方法。
[本発明1002]
前記Cre mRNAが、配列番号12のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記Cre mRNAが、配列番号13のヌクレオチド配列またはそのコドン使用最適化バリアントを含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記デオキシリボ核酸の厳密に1つのコピーが、単一の部位または遺伝子座で、前記哺乳動物細胞のゲノム内に安定して組み込まれる、本発明1001から1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記ポリペプチドをコードする前記デオキシリボ核酸が、少なくとも4つの発現カセットを含み、ここで、
- 第1の組換え認識配列が、最も5’側の(すなわち、第1の)発現カセットの5’側に位置しており、
- 第2の組換え認識配列が、最も3’側の発現カセットの3’側に位置しており、
- 第3の組換え認識配列が、
- 前記第1の組換え認識配列と前記第2の組換え認識配列との間、かつ
- 前記発現カセットのうちの2つの間
に位置しており、
前記組換え認識配列がすべて異なる、
本発明1001から1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記ポリペプチドをコードする前記デオキシリボ核酸が、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含む、本発明1001から1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記ポリペプチドをコードする前記デオキシリボ核酸が、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含み、前記選択マーカーをコードする前記発現カセットは、前記第3の組換え認識配列の5’側に一部が、3’側に一部が位置しており、前記発現カセットの、前記5’側に位置する部分が、プロモーターおよび開始コドンを含み、前記発現カセットの、前記3’側に位置する部分が、開始コドンのないコード配列およびポリAシグナルを含み、前記開始コドンが、前記コード配列に作動可能に連結される、本発明1001から1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
Cre mRNAと第1および第2のベクターの混合物との間の重量比が、1:3から2:1の範囲にある、本発明1001から1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
Cre mRNAと第1および第2のベクターの混合物との間の重量比が、約1:5である、本発明1001から1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記発現カセットのそれぞれが、5’から3’の方向に、プロモーターと、コード配列と、ポリアデニル化シグナル配列と、任意で続いてターミネーター配列とを含み、前記プロモーターが、イントロンAを有するヒトCMVプロモーターであり、前記ポリアデニル化シグナル配列がbGHポリアデニル化シグナル配列であり、かつ前記ターミネーターがhGTターミネーターであり、ただし例外として前記選択マーカーの前記発現カセットでは、前記プロモーターがSV40プロモーターであり、前記ポリアデニル化シグナル配列がSV40ポリアデニル化シグナル配列であり、かつ前記ターミネーターが存在しない、本発明1001から1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記哺乳動物細胞がCHO細胞である、本発明1001から1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記ポリペプチドが、第1の抗体重鎖と、第2の抗体重鎖と、第1の抗体軽鎖と、第2の抗体軽鎖とを含むヘテロ四量体であり、前記デオキシリボ核酸が、4つの発現カセットを含み、
- 前記第1の重鎖が、N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、第1の軽鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含み、
- 前記第2の重鎖が、N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含み、
- 前記第1の軽鎖が、N末端からC末端に向けて、第2の重鎖可変ドメインとCLドメインとを含み、
- 前記第2の軽鎖が、N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含み、
前記第1の重鎖可変ドメインおよび前記第2の軽鎖可変ドメインが、第1の結合部位を形成し、前記第2の重鎖可変ドメインおよび前記第1の軽鎖可変ドメインが、第2の結合部位を形成する、
本発明1001から1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記ポリペプチドが、第1の抗体重鎖と、第2の抗体重鎖と、第1の抗体軽鎖と、第2の抗体軽鎖とを含むヘテロ四量体であり、前記デオキシリボ核酸が、4つの発現カセットを含み、
- 前記第1の重鎖が、N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含み、
- 前記第2の重鎖が、N末端からC末端に向けて、第1の軽鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含み、
- 前記第1の軽鎖が、N末端からC末端に向けて、第2の重鎖可変ドメインとCLドメインとを含み、
- 前記第2の軽鎖が、N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含み、
前記第1の重鎖可変ドメインおよび前記第2の軽鎖可変ドメインが、第1の結合部位を形成し、前記第2の重鎖可変ドメインおよび前記第1の軽鎖可変ドメインが、第2の結合部位を形成する、
本発明1001から1011のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記ポリペプチドが、第1の抗体重鎖と、第2の抗体重鎖と、第1の抗体軽鎖と、第2の抗体軽鎖とを含むヘテロ四量体であり、前記デオキシリボ核酸が、4つの発現カセットを含み、
- 前記第1の重鎖が、N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインと、ペプチドリンカーと、第2の重鎖可変ドメインと、CLドメインとを含み、
- 前記第2の重鎖が、N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含み、
- 前記第1の軽鎖が、N末端からC末端に向けて、第1の軽鎖可変ドメインとCH1ドメインとを含み、
- 前記第2の軽鎖が、N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含み、
前記第2の重鎖可変ドメインおよび前記第1の軽鎖可変ドメインが、第1の結合部位を形成し、前記第1の重鎖可変ドメインおよび前記第2の軽鎖可変ドメインが、第2の結合部位を形成する、
本発明1001から1011のいずれかの方法。
[本発明1015]
第1のリコンビナーゼ認識配列がL3であり、第2のリコンビナーゼ認識配列が2Lであり、第3のリコンビナーゼ認識配列がLoxFasである、本発明1001から1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
組換え哺乳動物細胞の数を増加させるためのCreリコンビナーゼmRNAの使用であって、前記細胞が、標的指向性組込みによって前記細胞のゲノム内の単一の部位に安定して組み込まれた目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードするデオキシリボ核酸を含む、使用。
[本発明1017]
前記組換え細胞がさらに、培養培地中での培養時に、前記目的のポリペプチドを前記培養培地中に分泌する、本発明1016の使用。
発明の態様の詳細な説明
異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を作製するための方法および前記組換え哺乳動物細胞を用いて異種ポリペプチドを生産するための方法が、本明細書において報告される。
本発明は、少なくとも部分的に、例えばCre DNA(Creプラスミド)を用いる場合と比較してCreリコンビナーゼCre mRNAが唯一の供給源として使用される場合に、標的指向性組込みによって得られるクローンの数を改善することができるという知見に基づいている。より詳細には、選択期間後にCRE mRNA作製組換え細胞プールにおけるクローンの絶対数が、CREプラスミド作製組換え細胞プールにおけるよりも大きいことが発見された(実施例6、ならびに図2、3、および4を参照のこと)。よって、CREプラスミドの代わりにCRE mRNAを使用することにより、より大きなサイズと異質性を有する組換え細胞プールが生産される。この理論に拘束されることなく、それにより、高力価で良好な製品品質を有する組換え細胞クローンを同定する可能性が高まると想定される。さらに、CREプラスミド作製細胞プールと比較して、CRE mRNA作製プールからの組換え細胞クローンの数の増加は安定している。
I.定義
本発明を実行するための有用な方法および技術は、例えば、Ausubel,F.M.(ed.),Current Protocols in Molecular Biology,Volumes I to III(1997);Glover,N.D.,and Hames,B.D.,ed.,DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I and II(1985),Oxford University Press;Freshney,R.I.(ed.),Animal Cell Culture - a practical approach,IRL Press Limited(1986);Watson,J.D.,et al.,Recombinant DNA,Second Edition,CHSL Press(1992);Winnacker,E.L.,From Genes to Clones;N.Y.,VCH Publishers(1987);Celis,J.,ed.,Cell Biology,Second Edition,Academic Press(1998);Freshney,R.I.,Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,second edition,Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)に記載されている。
組換えDNA技術の使用は、核酸の誘導体生成を可能にする。このような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失または挿入によって、個々のまたはいくつかのヌクレオチド位置で修飾することができる。修飾または誘導体化は、例えば、部位特異的変異誘発によって行うことができる。このような修飾は、当業者によって容易に行うことができる(例えば、Sambrook,J.,ら,Molecular Cloning:A laboratory manual(1999)Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA、Hames,B.D.,and Higgins,S.G.,Nucleic acid hybridization - a practical approach(1985)IRL Press,Oxford,England)。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形を含む。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のこのような細胞および当業者に公知のその均等物などを含む。同様に、「a」(または「an」)、「1つまたはより多く」および「少なくとも1つ」という用語は、本明細書では相互交換可能に使用することができる。また、「含む(comprising)」、「含む(including)」、および「有する」という用語は、相互交換可能に使用することができることにも留意されたい。
「約」という用語は、その後に続く数値の±20%の範囲を表す。一実施態様において、約という用語は、その後に続く数値の±10%の範囲を表す。一実施態様において、約という用語は、その後に続く数値の±5%の範囲を表す。
「Creリコンビナーゼ」という用語は、LoxP部位間のトポイソメラーゼI様のメカニズムを使用して部位特異的なリコンビナーゼを触媒するチロシンリコンビナーゼを表す。酵素の分子量は約38kDaであり、酵素は343のアミノ酸残基からなる。酵素はインテグラーゼファミリーのメンバーである。Creリコンビナーゼは、アミノ酸配列:
MSNLLTVHQN LPALPVDATS DEVRKNLMDM FRDRQAFSEH TWKMLLSVCR SWAAWCKLNN RKWFPAEPED VRDYLLYLQA RGLAVKTIQQ HLGQLNMLHR RSGLPRPSDS NAVSLVMRRI RKENVDAGER AKQALAFERT DFDQVRSLME NSDRCQDIRN LAFLGIAYNT LLRIAEIARI RVKDISRTDG GRMLIHIGRT KTLVSTAGVE KALSLGVTKL VERWISVSGV ADDPNNYLFC RVRKNGVAAP SATSQLSTRA LEGIFEATHR LIYGAKDDSG QRYLAWSGHS ARVGAARDMA RAGVSIPEIM QAGGWTNVNI VMNYIRNLDS ETGAMVRLLE DGD
(配列番号12)
を有し、
Cre mRNAは、配列:
AUGAGCAACC UGCUGACCGU GCACCAGAAC CUGCCCGCCC UGCCCGUGGA CGCCACCAGC GACGAGGUGA GGAAGAACCU GAUGGACAUG UUCAGGGACA GGCAGGCCUU CAGCGAGCAC ACCUGGAAGA UGCUGCUGAG CGUGUGCAGG AGCUGGGCCG CCUGGUGCAA GCUGAACAAC AGGAAGUGGU UCCCCGCCGA GCCCGAGGAC GUGAGGGACU ACCUGCUGUA CCUGCAGGCC AGGGGCCUGG CCGUGAAGAC CAUCCAGCAG CACCUGGGCC AGCUGAACAU GCUGCACAGG AGGAGCGGCC UGCCCAGGCC CAGCGACAGC AACGCCGUGA GCCUGGUGAU GAGGAGGAUC AGGAAGGAGA ACGUGGACGC CGGCGAGAGG GCCAAGCAGG CCCUGGCCUU CGAGAGGACC GACUUCGACC AGGUGAGGAG CCUGAUGGAG AACAGCGACA GGUGCCAGGA CAUCAGGAAC CUGGCCUUCC UGGGCAUCGC CUACAACACC CUGCUGAGGA UCGCCGAGAU CGCCAGGAUC AGGGUGAAGG ACAUCAGCAG GACCGACGGC GGCAGGAUGC UGAUCCACAU CGGCAGGACC AAGACCCUGG UGAGCACCGC CGGCGUGGAG AAGGCCCUGA GCCUGGGCGU GACCAAGCUG GUGGAGAGGU GGAUCAGCGU GAGCGGCGUG GCCGACGACC CCAACAACUA CCUGUUCUGC AGGGUGAGGA AGAACGGCGU GGCCGCCCCC AGCGCCACCA GCCAGCUGAG CACCAGGGCC CUGGAGGGCA UCUUCGAGGC CACCCACAGG CUGAUCUACG GCGCCAAGGA CGACAGCGGC CAGAGGUACC UGGCCUGGAG CGGCCACAGC GCCAGGGUGG GCGCCGCCAG GGACAUGGCC AGGGCCGGCG UGAGCAUCCC CGAGAUCAUG CAGGCCGGCG GCUGGACCAA CGUGAACAUC GUGAUGAACU ACAUCAGGAA CCUGGACAGC GAGACCGGCG CCAUGGUGAG GCUGCUGGAG GACGGCGAC
(配列番号13)
またはそのコドン最適化バリアントを含む。
「含む(comprising)」という用語は、「からなる(consisting of)」という用語も包含する。
用語「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」は、そのような細胞の子孫を含めて、1つまたは複数の外因性核酸が導入され、かつその後の遺伝子修飾のための開始点になることが目的とされる細胞を、包含する。したがって、用語「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」は、哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む細胞を包含し、この外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する、少なくとも1つの第1の組換え認識配列および少なくとも1つの第2の組換え認識配列(これらのリコンビナーゼ認識配列は異なる)を含む。一実施態様では、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞は、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む細胞であり、この外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1の組換え認識配列および第2の組換え認識配列、ならびに第1の組換え認識配列と第2の組換え認識配列の間に位置する第3の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列はすべて異なる。
「核局在化配列」という用語は、本明細書で使用される場合、正に帯電したアミノ酸残基アルギニンまたは/およびリジンの複数のコピーを含むアミノ酸配列を表す。前記配列を含むポリペプチドは、細胞核への移入のために細胞によって同定される。例示的な核局在化配列は、PKKKRKV(配列番号25;SV40ラージT抗原)、KR[PAATKKAGQA]KKKK(配列番号26、SV40核質)、MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN(配列番号27;シノラブディス・エレガンスEGL-13)、PAAKRVKLD(配列番号28、ヒトc-myc)、KLKIKRPVK(配列番号29、E.coli terminus utilization substance protein)である。他の核局在化配列は、当業者によって容易に同定され得る。
本明細書において使用される場合、「組換え細胞」という用語は、最終的な遺伝子修飾後の細胞、例えば、目的のポリペプチドを発現し、前記目的のポリペプチドの任意の規模での生産のために使用できる細胞などを表す。例えば、リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)に供され、それによって目的のポリペプチドのコード配列が宿主細胞のゲノム中に導入された「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」は、「組換え細胞」である。この細胞は、さらなるRMCE反応を実施することが依然としてできるが、そうすることは目的ではない。
「LoxP部位」という用語は、末端の二つのパリンドローム13bp配列(それぞれ、ATAACTTCGTATA(配列番号14)およびTATACGAAGTTAT(配列番号15)と、中央の8bpコア(対称ではない)スペーサー配列とからなる長さが34bpのヌクレオチド配列を表す。コアスペーサー配列は、LoxP部位の配向を決定する。互いに関するLoxP部位の相対的な配向および位置に応じて、介在するDNAは、切除されるか(LoxP部位は同じ方向に配向されている)か、または反転される(LoxP部位は反対方向に配向されている)。「フロックス」という用語は、二つのLoxP部位間に位置するDNA配列を表す。二つのフロックス配列、つまり、ゲノム中の標的フロックス配列およびドナー核酸中のフロックス配列が存在する場合、両方の配列は互いに交換することができる。これは、「リコンビナーゼ媒介カセット交換」と呼ばれる。
例示的なLoxP部位を以下の表に示す。
Figure 0007410983000001
「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」および「組換え細胞」はどちらも、「形質転換細胞」である。この用語は、継代の回数に関わらず、初代形質転換細胞も、それに由来する子孫も含む。後代は、例えば、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよいが、変異を含有していてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有している変異子孫は、包含される。
「単離された」組成物は、自然環境の構成成分から分離されたものである。いくつかの実施態様では、組成物は、例えば、電気泳動(例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリー電気泳動、CE-SDS)またはクロマトグラフィー(例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、またはイオン交換もしくは逆相HPLC)によって、95%または99%超の純度と決定されるまで精製される。例えば抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman,S.et al.,J.Chrom.B 848(2007)79-87を参照のこと。
「単離された」核酸は、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常核酸分子を含有する細胞内に含有される核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外、または天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「単離された」ポリヌクレオチドまたは抗体は、自然環境の構成成分から分離された、ポリペプチド分子または抗体分子を指す。
用語「組込み部位」は、外因性ヌクレオチド配列が挿入される、細胞ゲノム内の核酸配列を意味する。特定の実施態様において、組込み部位は、細胞ゲノム中の隣り合う2つのヌクレオチドの間にある。特定の実施態様では、組込み部位は、ヌクレオチド配列のストレッチを含む。特定の実施態様において、組込み部位は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内に位置している。特定の実施態様において、組込み部位は、哺乳動物細胞の内因性遺伝子内にある。
相互交換可能に使用することができる「ベクター」または「プラスミド」という用語は、本明細書で使用される場合、連結された別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクターと、ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターとを含む。ある種のベクターは、作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。
「結合する」という用語は、その標的への結合部位の結合を表す。例えば、それぞれの抗原への、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインを含む抗体結合部位の結合である。この結合は、例えば、BIAcore(登録商標)アッセイ(GE Healthcare、Uppsala、Sweden)を使用して測定することができる。すなわち、「(抗原への)結合」という用語は、インビトロアッセイにおいて、抗原への抗体の結合を表す。一実施態様では、結合は、抗体が表面に結合しており、かつ抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴(SPR)により測定される結合アッセイにおいて決定される。結合とは、例えば、10-8M以下、いくつかの実施態様において10-13~10-8M、いくつかの実施態様において10-13~10-9Mの結合親和性(K)を意味する。用語「結合する」は、用語「特異的に結合する」も含む。
例えば、BIAcore(登録商標)アッセイの1つの可能な実施態様では、抗原を表面に結合させ、抗体の結合、すなわちその結合部位が、表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定される。結合の親和性は、用語k(会合定数:複合体を形成するための会合の速度定数)、k(解離定数、複合体の解離のための速度定数)、およびK(k/k)によって定義される。あるいは、SPRセンサーグラムの結合シグナルを、共鳴シグナルの高さおよび解離挙動に関して、参照の応答シグナルと直接比較することができる。
「結合部位」という用語は、標的への結合特異性を示す任意のタンパク質性エンティティを表す。これは、例えば、受容体、受容体リガンド、アンチカリン、アフィボディ、抗体などであり得る。よって、本明細書で使用される場合の「結合部位」という用語は、第2のポリペプチドに特異的に結合することができるかまたは第2のポリペプチドにより特異的に結合され得るポリペプチドを表す。
本明細書で使用される場合、「選択マーカー」という用語は、対応する選択剤の存在下で、ある遺伝子を保持する細胞が特異的に選択されるか、または特異的に排除されることを可能にする遺伝子を表す。例えば、限定ではないが、選択マーカーは、選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、それぞれの選択剤の存在下で積極的に選択されることを可能にすることができ(選択的培養条件)、形質転換されていない宿主細胞は、選択的培養条件下で増殖または生存することができない。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、または二機能性であり得る。ポジティブ選択マーカーは、マーカーを保持する細胞の選択を可能にすることができるのに対し、ネガティブ選択マーカーは、マーカーを保持する細胞を選択的に排除することを可能にし得る。選択マーカーは、薬剤耐性を付与し、または宿主細胞の代謝的もしくは異化的欠陥を補い得る。原核細胞では、とりわけ、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、またはクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子が使用され得る。真核細胞の選択マーカーとして有用な耐性遺伝子としては、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(APH)(例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HYG)、ネオマイシンおよびG418 APH)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、チミジンキナーゼ(TK)、グルタミンシンテターゼ(GS)、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ(インドール)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(ヒスチジノールD)の遺伝子、ならびにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびマイコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。さらなるマーカー遺伝子は、国際公開第92/08796号および国際公開第94/28143号に記載されている。
対応する選択剤の存在下での選択を容易にすることを超えて、選択マーカーは、別法として、普通は細胞に存在しない分子、例えば、緑色蛍光性タンパク質(GFP)、高感度GFP(eGFP)、合成GFP、黄色蛍光性タンパク質(YFP)、高感度YFP(eYFP)、シアン蛍光性タンパク質(CFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed単量体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean、およびT-Sapphireであってよい。例えば、コードされるポリペプチドが発する蛍光の検出または不在にそれぞれ基づいて、そのような分子を発現する細胞を、この遺伝子を内部に持たない細胞と区別することができる。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、2つ以上の構成要素の並置を指し、構成要素は、意図される様式で機能することを可能する関係にある。例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサーがコード配列の転写を調節するように作用する場合、プロモーターおよび/またはエンハンサーは、コード配列に作動可能に連結されている。特定の実施態様では、「作動可能に連結された」DNA配列は、単一の染色体上で近接し、隣接している。特定の実施態様では、例えば、分泌リーダーおよびポリペプチドなどの2つのタンパク質をコードする領域を結合する必要がある場合、配列は、連続して隣接し、同じリーディングフレーム内に存在する。特定の実施態様では、作動可能に連結されたプロモーターは、コード配列の上流に位置し、それに隣接し得る。特定の実施態様では、例えば、コード配列の発現を調節するエンハンサー配列に関して、2つの構成要素は隣接していなくても、作動可能に連結され得る。エンハンサーは、コード配列の転写を増加させる場合、エンハンサーは、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、その中、または下流に位置し得、またコード配列のプロモーターから相当な距離を置いて位置し得る。作動可能な連結は、当技術分野で公知の組換え法によって、例えば、PCR法を使用して、および/または都合の良い制限部位でのライゲーションによって達成され得る。都合の良い制限部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、従来の方法に従って使用し得る。内部リボソーム侵入部位(IRES)が、5’末端に非依存的な方法により内部位置でORFの翻訳を開始できる場合、IRESは、オープン・リーディング・フレーム(ORF)に作動可能に連結されている。
本明細書において使用される場合、用語「隣接する」は、第1のヌクレオチド配列が第2のヌクレオチド配列の5’末端もしくは3’末端のいずれか、または両末端に位置していることを意味する。隣接するヌクレオチド配列は、第2のヌクレオチド配列に隣接するか、または第2のヌクレオチド配列から画定された距離にあり得る。隣接するヌクレオチド配列の長さに、具体的な制限はない。例えば、隣接配列は、数塩基対または数千塩基対であり得る。
デオキシリボ核酸は、コード鎖および非コード鎖を含む。用語「5’」および「3’」は、本明細書において使用される場合、コード鎖上の位置を指す。
本明細書において使用される場合、用語「外因性」は、あるヌクレオチド配列が特定の細胞に由来せず、DNA送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、または形質転換法によって前記細胞に導入されることを示す。したがって、外因性ヌクレオチド配列は人工配列であり、この人工物は、例えば、起源が異なる部分配列の組合せ(例えば、SV40プロモーターを有するリコンビナーゼ認識配列と緑色蛍光性タンパク質のコード配列との組合せは、人工核酸である)から、または配列(例えば、膜結合型受容体の細胞外ドメインのみをコードする配列もしくはcDNA)の部分的な欠失もしくは核酸塩基の変異から、生じ得る。用語「内因性」は、細胞に由来するヌクレオチド配列を意味する。「外因性」ヌクレオチド配列は、塩基組成が同一である「内因性」対応物を有し得るが、「外因性」配列は、例えば組換えDNA技術によって細胞に導入されている。
抗体
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)に示されている。
「重鎖」という用語は、本明細書ではその元の意味で使用される。すなわち、抗体を形成する4本のポリペプチド鎖のうちのより大きな2本のポリペプチド鎖を表す(例えば、Edelman,G.M.and Gally J.A.,J.Exp.Med.116(1962)207-227を参照のこと)。この文脈における「より大きな」という用語は、分子量、長さ、およびアミノ酸の数のいずれかを指すことができる。「重鎖」という用語は、そこに存在する個々の抗体ドメインの配列および数とは無関係である。重鎖は、それぞれのポリペプチドの文書利用に基づいてのみ割り当てられる。
本明細書において使用される場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Kabat,ら,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)において説明されるKabatナンバリングシステムによりナンバリングされ、本明細書では「Kabatによるナンバリング」と称される。具体的には、Kabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)のKabatナンバリングシステム(647-660ページを参照のこと)は、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLに使用され、Kabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)のKabat EUインデックスナンバリングシステム(661-723ページを参照のこと)は、重鎖定常ドメイン(CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3であって、本明細書ではこの場合、「Kabat EUインデックスによるナンバリング」と称することによってさらに明確にしている)に使用される。
本明細書での「抗体」という用語は、最も広義に使用され、完全長抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、および抗体-抗体断片-融合体、ならびにこれらの組み合わせを含む様々な抗体構造を包含するが、これらに限定されない。
「天然抗体」という用語は、さまざまな構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を表す。例えば、ネイティブIgG抗体は、2本の同一の軽鎖と2本の同一の重鎖がジスルフィド結合したものを含む、約150,000ダルトンのヘテロテトラメリック糖タンパク質である。N末端からC末端に向けて、各重鎖は、重鎖可変領域(VH)を有し、その後に3つの重鎖定常ドメイン(CH1、CH2、およびCH3)が続き、それによって、第1の重鎖定常ドメインと第2の重鎖定常ドメインとの間にヒンジ領域が位置している。同様に、N末端からC末端に向けて、各軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)を有し、その後に軽鎖定常ドメイン(CL)が続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる2種類のうちの一つに割り当てられてもよい。
「完全長抗体」という用語は、天然抗体の構造に実質的に類似した構造を有する抗体を表す。完全長抗体は、N末端からC末端の方向に可変領域および定常ドメインをそれぞれ含む2つ以上の完全長抗体軽鎖と、N末端からC末端の方向に可変領域、第1の定常ドメイン、ヒンジ領域、第2の定常ドメイン、および第3の定常ドメインとをそれぞれ含む2つの抗体重鎖とを含む。天然抗体とは対照的に、完全長抗体は、例えば、1つまたは複数の追加のscFvs、または重鎖もしくは軽鎖Fab断片、または完全長抗体の異なる鎖の末端のうちの1つまたは複数にコンジュゲートしたscFab(ただし、各末端には1つの断片のみ)などの、さらなる免疫グロブリンドメインを含み得る。これらのコンジュゲートもまた、完全長抗体という用語により包含される。
「抗体結合部位」という用語は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインのペアを表す。抗原への適切な結合を確実にするためには、これらの可変ドメインは、同族の可変ドメインであり、すなわち一緒に属している。抗体結合部位は、少なくとも3つのHVR(例えば、VHHの場合)または3~6つのHVR(例えば、天然に存在する、すなわち、VH/VLペアを有する従来の抗体の場合)を含む。一般に、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基が、結合部位を形成している。これらの残基は通常、抗体重鎖可変ドメインと対応する抗体軽鎖可変ドメインのペアに含有される。抗体の抗原結合部位は、「超可変領域」または「HVR」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「FR」領域は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインは、N末端からC末端に向けて、領域FR1、HVR1、FR2、HVR2、FR3、HVR3、およびFR4を含む。特に、重鎖可変ドメインのHVR3領域は、抗原結合に最も寄与し、抗体の結合特異性を定義する領域である。「機能的結合部位」は、その標的に特異的に結合することができる。「特異的に結合する」という用語は、インビトロアッセイにおいて、標的への結合部位の結合を表し、一実施態様では、結合アッセイにおいてである。そのような結合アッセイは、結合イベントが検出され得る限り、任意のアッセイであり得る。例えば、抗体を表面に結合させ、抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定される、結合アッセイである。あるいは、ブリッジングELISAを使用することができる。
本明細書で用いられる「超可変領域」または「HVR」という用語は、配列が超可変である、アミノ酸残基ストレッチを含む抗体可変ドメインの領域(「相補性決定領域」すなわち「CDR」)および/または構造的に既定されるループ(「超可変ループ」)を形成する抗体可変ドメインの領域および/または抗原に接触する残基(「抗原コンタクト(antigen contact)」を含有する抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般的に、抗体は、6つのHVRを含み、重鎖可変ドメインVHに3つ(H1、H2、H3)、軽鎖可変ドメインVLに3つ(L1、L2、L3)である。
HVRには、次のものが含まれる:
(a)アミノ酸残基26~32(L1)、50~52(L2)、91~96(L3)、26~32(H1)、53~55(H2)、および96~101(H3)に生じる超可変ループ(Chothia,C.およびLesk,A.M.、J.Mol.Biol.196(1987)901-917);
(b)アミノ酸残基24~34(L1)、50~56(L2)、89~97(L3)、31~35b(H1)、50~65(H2)、および95~102(H3)に生じるCDR(Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242.);
(c)アミノ酸残基27c~36(L1)、46~55(L2)、89~96(L3)、30~35b(H1)、47~58(H2)、および93~101(H3)に生じる抗原接触(MacCallumら、J.Mol.Biol.262:732-745(1996))、ならびに
(d)アミノ酸残基46~56(L2)、47~56(L2)、48~56(L2)、49~56(L2)、26~35(H1)、26~35b(H1)、49~65(H2)、93~102(H3)、および94~102(H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
別段の指示がない限り、HVR残基および可変ドメイン内の他の残基(例えば、FR残基)は、本明細書において、上記のKabatらに従ってナンバリングされている。
抗体の「クラス」は、定常ドメインまたは定常領域、好ましくは重鎖が持つFc領域の種類を指す。抗体の5つの主要なクラスがあり、すなわち、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2に更に分ける場合がある。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
「重鎖定常領域」という用語は、定常ドメインを含有する免疫グロブリン重鎖の領域、すなわち、天然免疫グロブリンの場合、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを表し、完全長免疫グロブリンの場合、第1の定常ドメイン、ヒンジ領域、第2の定常ドメイン、および第3の定常ドメインを表す。一実施態様では、ヒトIgG重鎖定常領域は、Ala118から重鎖のカルボキシ末端に延びる(Kabat EUインデックスによるナンバリング)。しかしながら、定常領域のC末端リジン(Lys447)は、存在していてもよく、存在していなくてもよい(Kabat EUインデックスによるナンバリング)。「定常領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合的に連結し得る2つの重鎖定常領域を含む二量体を表す。
「重鎖Fc領域」という用語は、少なくともヒンジ領域の一部(中間および下部ヒンジ領域)、第2の定常ドメイン、例えばCH2ドメイン、および第3の定常ドメイン、例えばCH3ドメインを含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を表す。一実施態様では、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Asp221またはCys226またはPro230から重鎖のカルボキシル末端に延びる(Kabat EUインデックスによるナンバリング)。したがって、Fc領域は定常領域よりも小さいが、C末端部分はそれと同一である。しかしながら、重鎖Fc領域のC末端リジン(Lys447)は、存在していてもよく、存在していなくてもよい(Kabat EUインデックスによるナンバリング)。「Fc領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合的に連結し得る2つの重鎖Fc領域を含む二量体を表す。
抗体の定常領域、より正確にはFc領域(および同様の定常領域)は、補体活性化、C1q結合、C3活性化およびFc受容体結合に直接関与する。補体系に対する抗体の影響は、特定の条件に依存するが、C1qへの結合は、Fc領域における画定された結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は、先行技術で公知であり、例えば、Lukas,T.J.ら、J.Immunol.127(1981)2555-2560、Brunhouse,R.およびCebra,J.J.、Mol.Immunol.16(1979)907-917、Burton,D.R.ら、Nature 288(1980)338-344、Thommesen,J.E.ら、Mol.Immunol.37(2000)995-1004、Idusogie,E.E.ら、J.Immunol.164(2000)4178-4184、Hezareh,M.ら、J.Virol.75(2001)12161-12168、Morgan,A.ら、Immunology 86(1995)319-324、およびEP0307434において記載されている。このような結合部位は、例えば、L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331およびP329(KabatのEUインデックスによるナンバリング)である。サブクラスIgG1、IgG2、およびIgG3の抗体は通常、補体活性化、C1q結合、およびC3活性化を示すのに対し、IgG4は、補体系を活性化せず、C1qと結合せず、C3を活性化しない。「抗体のFc領域」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて画定される。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、および/または同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得るバリアント抗体は例外であり、かかるバリアントは一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基(エピトープ)に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されないさまざまな技術によって作製されてもよい。
本願内で使用される場合の「価」という用語は、抗体における特定数の結合部位の存在を表す。このように、「二価」、「四価」および「六価」という用語は、抗体中、それぞれ二つの結合部位、四つの結合部位および六つの結合部位の存在を表す。
「単一特異性抗体」は、単一の結合特異性を有する、すなわち1つの抗原に特異的に結合する抗体を表す。単一特異性抗体を、完全長抗体もしくは抗体断片(例えば、F(ab’))またはそれらの組合せ(例えば、完全長抗体と追加のscFvまたはFab断片)として調製することができる。単一特異性抗体は、一価である必要はない。すなわち、単一特異性抗体は、1つの抗原に特異的に結合する2つ以上の結合部位を含んでもよい。例えば、天然型の抗体は、単一特異性であるが二価である。
「多重特異性抗体」は、同じ抗原または2つの異なる抗原上の少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体を表す。多重特異性抗体を、完全長抗体もしくは抗体断片(例えば、F(ab’)二重特異性抗体)またはそれらの組合せ(例えば、完全長抗体と追加のscFvまたはFab断片)として調製することができる。多重特異性抗体は、少なくとも二価である。すなわち、2つの抗原結合部位を含む。また、多重特異性抗体は、少なくとも二重特異性である。したがって、二価の二重特異性抗体は、多重特異性抗体の最も単純な形態である。2つ、3つまたはより多く(例えば、4つ)の機能的な抗原結合部位を有する操作された抗体が報告されている(例えば、US2002/0004587A1を参照)。
特定の実施態様において、抗体は、多重特異性抗体、例えば、少なくとも二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原またはエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様において、結合特異性の一方は、第1の抗原に対するものであり、他方は、異なる第2の抗原に対するものである。特定の実施態様において、多重特異性抗体は、同じ抗原の2つの異なるエピトープに結合し得る。多重特異性抗体を使用して、抗原を発現する細胞に細胞毒性剤を局在化させることもできる。
多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体-抗体断片融合体として調製され得る。
多重特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え共発現(Milstein,C.およびCuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540、国際公開第93/08829号およびTraunecker,A.ら、EMBO J.10(1991)3655-3659参照)および「ノブインホール」操作(例えば、米国特許第5,731,168号明細書を参照)が含まれるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電気的ステアリング効果を操作すること(WO2009/089004);2つまたはそれ以上の抗体または断片を架橋結合すること(例えば米国特許第4,676,980号、およびBrennan,M.ら、Science 229(1985)81-83参照);二重特異性抗体を作製するためにロイシンジッパーを使用すること(例えばKostelny,S.A.ら、J.Immunol.148(1992)1547-1553参照);二重特異性抗体断片を作製するために「特異的な」技術を使用すること(例えばHolliger,P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448参照);一本鎖Fv(sFv)二量体を使用すること(例えばGruber,M.ら、J.Immunol.152(1994)5368-5374参照);ならびに例えばTutt,A.ら、J.Immunol.147(1991)60-69に記載のように三重特異性抗体を調製することによって作製され得る。
抗体または断片は、WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254、WO2010/112193、,WO2010/115589、WO2010/136172、WO2010/145792、またはWO2010/145793に記載される多重特異性抗体でもあり得る。
抗体またはその断片は、国際公開第2012/163520号に開示されている多重特異性抗体でもあり得る。
二重特異性抗体は、一般に、同じ抗原上の2つの異なる重複しないエピトープまたは異なる抗原上の2つのエピトープに特異的に結合する抗体分子である。
異なる二重特異性抗体フォーマットが知られている。
例示的な二重特異性抗体フォーマットは、以下の通りである。
- ドメイン交換を有する完全長抗体:
第1のFab断片および第2のFab断片を含む多重特異性IgG抗体であって、
第1のFab断片において、
a)CH1およびCLドメインのみが互いに置き換えられている(すなわち、第1のFab断片の軽鎖はVLおよびCH1ドメインを含み、第1のFab断片の重鎖はVHおよびCLドメインを含む);
b)VHおよびVLドメインのみが互いに置き換えられている(すなわち、第1のFab断片の軽鎖はVHおよびCLドメインを含み、第1のFab断片の重鎖はVLおよびCH1ドメインを含む);または
c)CH1とCLドメインが互いに置き換えられ、VHおよびVLドメインが互いに置き換えられている(すなわち、第1のFab断片の軽鎖はVHおよびCH1ドメインを含み、第1のFab断片の重鎖はVLおよびCLドメインを含む);
第2のFab断片が、VLおよびCLドメインを含む軽鎖と、VHおよびCH1ドメインを含む重鎖とを含み、
ドメイン交換された抗体は、CH3ドメインを含む第1の重鎖およびCH3ドメインを含む第2の重鎖を含み得、両方のCH3ドメインは、第1の重鎖および改変された第2の重鎖のヘテロ二量体化をサポートするために、それぞれのアミノ酸置換によって相補的になるように操作されており、このことは、例えばWO96/27011、WO98/050431、EP1870459、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012/058768、WO2013/157954、またはWO2013/096291(参照により本明細書に組み込まれる)に開示されている;
- ドメイン交換および追加の重鎖C末端結合部位を有する完全長抗体:
多重特異性IgG抗体であって、
a)完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ2対を含む1つの完全長抗体であって、完全長重鎖と完全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第1の抗原に特異的に結合する、1つの完全長抗体と、
b)さらなるFab断面が、完全長抗体の1つの重鎖のC末端に融合し、さらなるFab断片の結合部位が第2の抗原に特異的に結合する、1つのさらなるFab断片と
を含み、
第2の抗原に特異的に結合するさらなるFab断片が、i)a)軽鎖可変ドメイン(VL)および重鎖可変ドメイン(VH)が互いに置き換えられか、もしくはb)軽鎖定常ドメイン(CL)および重鎖定常ドメイン(CH1)が互いに置き換えられるように、ドメインクロスオーバーを含むか、またはii)一本鎖Fab断片である;
- 1アーム一本鎖フォーマット(=1アーム一本鎖抗体):
第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである:
- 軽鎖(可変軽鎖ドメイン+軽鎖カッパ定常ドメイン)
- 軽鎖/重鎖の組み合わせ(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン+ペプチドリンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+CH3、ノブ変異あり)
- 重鎖(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+CH3、ホール変異あり);
- 2アーム一本鎖フォーマット(=2アーム一本鎖抗体):
第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである:
- 軽鎖/重鎖1の組み合わせ(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン+ペプチドリンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+CH3、ホール変異あり)
- 軽鎖/重鎖2の組み合わせ(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン+ペプチドリンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+CH3、ノブ変異あり);
- 一般的な軽鎖二重特異性フォーマット(=一般的な軽鎖二重特異性抗体):
第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである:
- 軽鎖(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン)
- 重鎖1(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+CH3、ホール変異あり)
- 重鎖2(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+CH3、ノブ変異あり)。
この文脈における「非重複」という用語は、二重特異性Fabの第1のパラトープ内に含まれるアミノ酸残基が第2のパラトープ内に含まれず、二重特異性Fabの第2のパラトープ内に含まれるアミノ酸が第1のパラトープ内に含まれないことを示す。
「ノブ・イントゥー・ホール」二量体化モジュールおよび抗体操作におけるその使用は、Carter P.;Ridgway J.B.B.;Presta L.G.:Immunotechnology,Volume 2,Number 1,February 1996,pp.73-73(1)に記載されている。
抗体の重鎖のCH3ドメインを、「ノブ・イントゥー・ホール」技術によって改変することができる。例えば、WO96/027011、Ridgway,J.B.ら、Protein Eng.9(1996)617-621、およびMerchant,A.M.ら、Nat.Biotechnol.16(1998)677-681に、いくつかの例を伴って詳細に記載されている。この方法では、2つのCH3ドメインの相互作用表面を改変して、これら2つのCH3ドメインのヘテロ二量体化を増加させ、それによってそれらを含むポリペプチドのヘテロ二量体化を増加させる。(2つの重鎖の)2つのCH3ドメインのそれぞれは「ノブ」であることができ、他方は「ホール」である。ジスルフィドブリッジの導入はさらに、ヘテロ二量体を安定化させ(Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16(1998)677-681;Atwell,S.,et al.,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)、収率を増加させる。
(抗体重鎖の)CH3ドメインの変異T366Wは、「ノブ変異」または「変異ノブ」として表され、(抗体重鎖の)CH3ドメインの変異T366S、L368A、Y407Vは、「ホール変異」または「変異ホール」として表される(KabatのEUインデックスによるナンバリング)。CH3ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋(Merchant,A.M.ら、Nature Biotech.16(1998)677-681)も、例えば、「ノブ変異」を有する重鎖のCH3ドメインにS354C変異を導入(「ノブ-cys-変異」または「変異ノブ-cys」と表記)すること、および「ホール変異」を有する重鎖のCH3ドメインにY349C変異を導入(「ホール-cys-変異」または「変異ホール-cys」と表記)することにより、使用できる(KabatのEUインデックスによるナンバリング)。
「ドメインクロスオーバー」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体重鎖VH-CH1断片とその対応する同族の抗体軽鎖とのペアにおいて、すなわち抗体Fab(断片-抗原結合)において、少なくとも1つの重鎖ドメインが、対応する軽鎖ドメインによって置換されている、もしくはその逆、という点について、ドメイン配列が天然型の抗体の配列から逸脱していることを表す。ドメインクロスオーバーは、一般的に3種類あり、(i)CH1およびCLドメインのクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってVL-CH1ドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってVH-CLドメイン配列(またはVH-CL-ヒンジ-CH2-CH3ドメイン配列を有する完全長抗体重鎖)がもたらされるもの、(ii)VHおよびVLドメインのドメインクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってVH-CLドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってVL-CH1ドメイン配列がもたらされるもの、ならびに(iii)完全な軽鎖(VL-CL)および完全なVH-CH1重鎖断片のドメインクロスオーバー(「Fabクロスオーバー」)であって、ドメインクロスオーバーによってVH-CH1ドメイン配列を有する軽鎖がもたらされ、ドメインクロスオーバーによってVL-CLドメイン配列を有する重鎖断片がもたらされるもの(上述のすべてのドメイン配列は、N末端からC末端への方向で示されている)がある。
本明細書で使用される場合、対応する重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインに関して「互いに置き換えられた」という用語は、上述のドメインクロスオーバーを指す。そのため、CH1およびCLドメインが「互いに置き換えられた」場合、用語は、項目(i)の下で言及されたドメインクロスオーバー、ならびに結果として生じる重鎖および軽鎖ドメイン配列を指す。したがって、VHおよびVLが「互いに置き換えられた」場合、用語は、項目(ii)の下で言及されたドメインクロスオーバーを指し、またCH1およびCLドメインが「互いに置き換えられ」、かつVHおよびVLドメインが「互いに置き換えられた」場合、用語は、項目(iii)の下で言及されたドメインクロスオーバーを指す。ドメインクロスオーバーを含む二重特異性抗体は、例えば、WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254、およびSchaefer,W.ら、Proc.Natl.Acad.Sci USA 108(2011)11187-11192において報告されている。そのような抗体は、通常、ドメイン交換された抗体またはCrossMabと呼ばれている。
多重特異性抗体はまた、一実施態様では、上記の項目(i)で述べたCH1およびCLドメインのドメインクロスオーバー、または上記の項目(ii)で述べたVHおよびVLドメインのドメインクロスオーバー、または上記の項目(iii)で述べたVH-CH1およびVL-VLドメインのドメインクロスオーバーのいずれかを含む、少なくとも1つのFab断片を含む。ドメインクロスオーバーを伴う多重特異性抗体の場合、同じ抗原に特異的に結合するFabは、同じドメイン配列であるように構築される。そのため、ドメインクロスオーバーを伴う2つ以上のFabが、多重特異性抗体に含まれる場合、前記Fabは、同じ抗原に特異的に結合する。
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基、およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む抗体を指す。ある特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、それにおいて、HVR(例えば、CDR)の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに相当し、FRの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
「組換え抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、組換え手段により調製、発現、作製、または単離された全ての抗体(キメラ、ヒト化、およびヒト)、例えば組換え細胞を表す。これには、NS0、HEK、BHK、またはCHO細胞などの組換え細胞から単離された抗体が含まれる。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指し、すなわちそれは、機能的な断片である。抗体断片の例としては、以下に限定されないが、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、二重特異性Fab、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子(例えば、scFvまたはscFab)が挙げられる。
II.組成物および方法
通常、例えば治療用ポリペプチドのような目的のポリペプチドの組換え大量生産のためには、前記ポリペプチドを安定に発現し分泌する細胞が必要とされる。この細胞は、「組換え細胞」または「組換え生産細胞」と呼ばれ、このような細胞を作製するために使用される方法は「細胞株開発」と呼ばれる。細胞株開発方法の第1の工程において、例えばCHO細胞などの適切な宿主細胞に、前記目的のポリペプチドの発現に適した核酸配列をトランスフェクトする。第2の工程において、目的のポリペプチドを安定に発現する細胞を、目的のポリペプチドをコードする核酸と共にコトランスフェクトしておいた選択マーカーの共発現に基づいて選択する。
ポリペプチドをコードする核酸、すなわちコード配列は、構造遺伝子と呼ばれる。このような構造遺伝子は単純な情報であり、その発現には追加の制御エレメントが必要とされる。したがって、普通は、構造遺伝子は発現カセットに組み込まれる。発現カセットが哺乳動物細胞において機能的となるために必要とされる最小限の制御エレメントは、構造遺伝子の上流、すなわち5’側に位置する、前記哺乳動物細胞において機能的なプロモーター、および構造遺伝子の下流、すなわち3’側に位置する、前記哺乳動物細胞において機能的なポリアデニル化シグナル配列である。プロモーター配列、構造遺伝子配列、およびポリアデニル化シグナル配列は、作動可能に連結された形態で並べられる。
目的のポリペプチドが、互いに異なる(単量体)ポリペプチドから構成されるヘテロ多量体ポリペプチドであるならば、1つの発現カセットだけでなく、含まれる構造遺伝子が異なる多数の発現カセット、すなわち、ヘテロ多量体ポリペプチドの異なる(単量体)ポリペプチドのそれぞれについて少なくとも1つの発現カセットが必要とされる。例えば、完全長抗体は、軽鎖の2個のコピーおよび重鎖の2個のコピーを含むヘテロ多量体ポリペプチドである。したがって、完全長抗体は、2つの異なるポリペプチドから構成される。したがって、完全長抗体の発現のためには2つの発現カセット、すなわち軽鎖のための1個および重鎖のための1個が必要とされる。例えば、完全長抗体が二重特異性抗体である、すなわち抗体が、2つの異なる抗原に特異的に結合する2つの異なる結合部位を含む場合、軽鎖同士も互いに異なり、重鎖同士も互いに異なる。したがって、このような二重特異性完全長抗体は、4つの異なるポリペプチドから構成され、4つの発現カセットが必要とされる。
目的のポリペプチドのための発現カセットは、いわゆる「発現ベクター」に順に組み込まれる。「発現ベクター」は、細菌細胞中で前記ベクターを増幅し、かつ含まれる構造遺伝子を哺乳動物細胞中で発現させるのに必要とされるすべてのエレメントを提供する核酸である。典型的には、発現ベクターは、例えば大腸菌(E. coli)の場合、複製開始点および原核生物選択マーカー、さらには真核生物選択マーカー、ならびに目的の構造遺伝子の発現に必要とされる発現カセットを含む、原核生物プラスミド増殖単位を含む。「発現ベクター」は、哺乳動物細胞に発現カセットを導入するための輸送運搬体である。
以前のパラグラフで概説したように、発現しようとするポリペプチドが複雑であるほど、必要とされる異なる発現カセットの数もまた多くなる。本質的に、発現カセットの数と共に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる核酸のサイズも大きくなる。同時に、発現ベクターのサイズも大きくなる。しかし、ベクターのサイズの実用的な上限は約15kbpの範囲にあり、それを上回ると、操作および処理の効率が著しく落ちる。この問題は、2つ以上の発現ベクターを用いることによって対処することができる。それによって、発現カセットを、発現カセットの一部のみをそれぞれ含む異なる発現ベクター間で分け合うことができる。
従来の細胞株開発(CLD)は、目的のポリペプチド(SOI)のための発現カセットを有するベクターのランダム組込み(RI)に依拠している。一般に、ランダム手法によってベクターがトランスフェクトされる場合、いくつかのベクターまたはその断片が細胞ゲノム中に組み込まれる。したがって、RIに基づくトランスフェクションプロセスは、予測不可能である。
このようにして、異なる発現ベクター間で発現カセットを分け合うことでサイズの問題に対処することにより、新たな問題―組み込まれる発現カセットの不揃いな数およびその空間的分布―が生じる。
通常、構造遺伝子の発現用の発現カセットが細胞ゲノム中により多く組み込まれるほど、発現される各ポリペプチドの量は多くなる。組み込まれた発現カセットの数のほかに、組込みの部位および遺伝子座も発現収率に影響を与える。例えば、発現カセットが、細胞ゲノム中の転写活性が低い部位に組み込まれる場合、コードされたポリペプチドはごく少量しか発現されない。しかし、同じ発現カセットが、細胞ゲノム中の転写活性が高い部位に組み込まれる場合、コードされたポリペプチドは多量に発現される。
ヘテロ多量体ポリペプチドの互いに異なるポリペプチドのための発現カセットが、同じ頻度で、かつ同程度の転写活性を有する遺伝子座にすべて組み込まれる限り、この発現の違いが問題を引き起こしてはいない。このような状況下では、多量体ポリペプチドに含まれるすべてのポリペプチドが同量で発現され、多量体ポリペプチドが正確に組み立てられる。
しかし、このシナリオが起こる可能性は非常に低く、2つより多いポリペプチドで構成される分子に対してこのシナリオを保証することはできない。例えば、WO2018/162517では、i)発現カセット配列およびii)異なる発現ベクター間での発現カセットの分布に応じて、発現収率および生産物の質の大きな差異がRIによって観察されたことが開示されている。この理論に縛られるわけではないが、この観察結果は、異なる発現ベクターに由来する異なる発現カセットが、細胞中で異なる頻度で異なる遺伝子座に組み込まれ、その結果、ヘテロ多量体ポリペプチドに含まれる様々なポリペプチドが差次的に、すなわち適切ではない様々な比率で発現されるという事実に起因する。その結果、単量体ポリペプチドの一部が、相対的に多い量で存在し、それ以外が相対的に少ない量で存在する。ヘテロ多量体ポリペプチドに含まれる単量体がこのように不均衡であることが原因で、不完全な組立て、間違った組立て、および分泌速度の低下が起こる。前述のどれも、正確に折り畳まれたヘテロ多量体ポリペプチドの発現収率の低下、および生産物に関係する副産物の割合の上昇を招く。
従来のRI CLDとは違って、標的指向性組込み(TI)CLDは、細胞ゲノム中のあらかじめ定められた「ホットスポット」に、様々な発現カセットを含む導入遺伝子を導入する。また、この導入は、所定の比率の発現カセットを用いる。その結果、この理論に縛られるわけではないが、ヘテロ多量体ポリペプチドに含まれる様々なポリペプチドのすべてが、同じ(または少なくとも同程度であり、少ししか違わない)速度かつ適切な比率で発現される。その結果、正確に組み立てられたヘテロ多量体ポリペプチドの量は増加するはずであり、生産物に関係する副産物の割合は低下するはずである。
また、所定のコピー数および所定の組込み部位が与えられたとすると、TIによって得られる組換え細胞は、RIによって得られる細胞と比べて、優れた安定性を有しているはずである。さらに、選択マーカーは、適切なTIを有する細胞を選択するためだけに使用され、高レベルの導入遺伝子発現を示す細胞を選択するためには使用されないことから、メトトレキサート(MTX)またはメチオニンスルホキシミン(MSX)のような選択剤の変異誘発性が原因の一部である配列バリアント(SV)が生じる可能性を最小限にするために、変異誘発性の低いマーカーを適用してよい。
しかしながら、今日、Cre mRNAが例えばCre DNAの代わりに使用される場合、標的指向性組込みによって得られたクローンの数は改善できることが分かっている。より詳細には、選択期間後にCre mRNA作製組換え細胞プールにおけるクローンの絶対数が、Creプラスミド作製組換え細胞プールにおけるよりも大きいことが発見された。よって、Cre DNA(プラスミド)の代わりにCre mRNAを使用することにより、より大きなサイズと異質性を有する組換え細胞プールが生産される。この理論に拘束されることなく、それにより、高力価で良好な製品品質を有する組換え細胞クローンを発見する可能性が高まると想定される。さらに、Cre DNA(プラスミド)作製細胞プールと比較して、Cre mRNA作製プールからの組換え細胞クローンの数の増加は安定している。
導入遺伝子の画定された組込みには、TI方法論が使用される。本発明は、2プラスミドリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)反応を用いて、ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を作製する新規の方法を提供する。改良点は、特に、画定された配列中の同じ遺伝子座における画定された組込み、ならびにそれによるポリペプチドの高発現および生産物に関係する副産物の形成の減少である。
本開示の主題は、ポリペプチドの安定な大量生産のために組換え哺乳動物細胞を生産するための方法だけでなく、ポリペプチドの生産力が高い組換え哺乳動物細胞もまた、提供する。
本明細書において使用される2プラスミドRMCE戦略は、同じTI遺伝子座に複数の発現カセットを挿入することを可能にする。
II.a 本発明の方法
本発明の一態様は、異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を作製するための方法、および前記組換え哺乳動物細胞を用いて異種ポリペプチドを生産するための方法である。
本発明は、少なくとも部分的に、例えばCre DNAの代わりにCre mRNAが使用される場合、目的のタンパク質をコードする異種核酸でトランスフェクトされており、かつ前記異種核酸をそれらのゲノムへ安定して組み込んだ、標的指向性組込みによって得られた組換え哺乳動物細胞クローンの数、すなわち哺乳動物細胞の数が、改善され得るという知見に基づいている。より詳細には、選択期間後にリコンビナーゼの供給源としてCre mRNAのみを使用して作成された組換え細胞プール内のクローンの絶対数は、リコンビナーゼの供給源としてCreプラスミドを使用した組換え細胞プールにおけるものよりも多い。よって、Cre DNA(Cre プラスミド)の代わりにCre mRNAを使用することにより、より大きなサイズと異質性を有する組換え細胞プールが生産される。これは、実施例6ならびに図2、3、および4に示される。この理論に拘束されることなく、それにより、高力価で良好な製品品質を有する組換え細胞クローンを発見する可能性が高まると想定される。さらに、本発明は、少なくとも部分的に、Creプラスミド作製細胞プールと比較して、Cre mRNA作製プールからの組換え細胞クローンの数の増加は安定しているという知見に基づいている。
本発明の一態様は、異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞である。異種ポリペプチドの発現を実現するために、特定かつ所定の配列中に異なる発現カセットを含む組換え核酸が、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれた。
本発明の一態様は、組換え哺乳動物細胞の数を増加させるためのCreリコンビナーゼmRNAの使用であって、前記細胞が、標的指向性組込みにより前記細胞のゲノム中の単一の部位に安定して組み込まれた目的の(異種)ポリペプチドをコードする(異種および/またはトランスジェニック)デオキシリボ核酸(の厳密に一つのコピー)を含む、使用である。一実施態様では、組換え細胞はまた、培養培地中で培養すると、目的のポリペプチドを培養培地中に分泌する。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、哺乳動物細胞および/または導入されたCreリコンビナーゼmRNAは、デオキシリボ核酸をコードするCreリコンビナーゼを含まない。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、CreリコンビナーゼmRNAは、単離されたCreリコンビナーゼmRNAである。
本発明は、組換えCHO細胞などの組換え哺乳動物細胞を生産するために二重リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)を使用することができ、その際、所定かつ特定の発現カセット配列がゲノム中に組み込まれ、その結果として、異種ポリペプチドの効率的な発現および生産がもたらされるという知見に、少なくともある程度は基づいている。この組込みは、標的指向性組込みによって哺乳動物細胞のゲノムの特定の部位に引き起こされる。
標的指向性組込みでは、部位特異的組換えは、ドナーの核酸をTI宿主細胞のゲノム中の特定の遺伝子座に導入するのに用いられる。これは、ゲノムに組み込まれた部位の配列がドナー核酸と交換される酵素プロセスである。このような核酸交換を実行するのに使用される一システムは、Cre-loxシステムである。交換を触媒する酵素はCreリコンビナーゼである。交換される配列は、ゲノム中およびドナー核酸中の二つのlox部位の位置によって定義される。これらのlox部位は、Creリコンビナーゼによって認識される。他に必要とされるものはなく、すなわちATPも必要とされない。元来、Cre-loxシステムはバクテリオファージP1で発見された。
Cre-loxシステムは、哺乳動物、植物、細菌、および酵母など、さまざまな種類の細胞で機能する。
RMCEの効率は、他の要因の中でも、フロックスDNAの長さによって決定される。フロックス配列の長さを増加させると、RMCE 効率は減少する。
さらに、RMCEの効率は、Creリコンビナーゼの起源の選択に依拠する。Creリコンビナーゼの不十分な発現は、非平行な組換えをもたらし、これは、RMCEが抗体生産核酸の導入に使用される場合に有害である。
交換反応は酵素反応であるため、第1の交換反応が起こった後、酵素が依然として存在/活性である限り、lox部位が交換後にそれらの機能を保持するため、さらなる交換反応が可能である。よって、活性Creリコンビナーゼを含む細胞とそれらのゲノム中のloxP部位は、意図されたものだけでなく、意図されていない組換え事象が発生する傾向がある。
よって、Cre-loxシステムの活性を適時制御して、一次的な意図された交換反応が生じた後、二次的な意図されていないさらなる交換反応を防止することが必要である。
これは、リコンビナーゼの唯一の供給源としてCre mRNAを使用する本発明の方法によって実現された。
Creリコンビナーゼの唯一の供給源としてCre DNAをCre mRNAで置き換えることにより、ランダムな組込みとそれによるCreリコンビナーゼの持続活性の可能性が排除された。また、これは、Cre DNAも組み込んだクローンのスクリーニングを実施する必要がないため、ワークロードの削減をもたらす。
Cre DNAをCre mRNAに置き換えることにより、プールの増加と力価に関する単一クローンの品質を得ることができる。
Cre DNAをCre mRNAに置き換えることにより、プールの増加と導入遺伝子発現に関する安定性を得ることができる。
例えば、TI後の生存率の回復に関しては、常に欠点はないが、Cre mRNAを使用すると改善が見られることがある(図2を参照のこと)。交換効率/プール品質に関しては、常に欠点はないが、Cre mRNAを使用すると改善が見られることがある(図3および4を参照のこと)。
複合抗体フォーマットの生産のためのCHOプールは、リコンビナーゼの唯一の供給源としてCREプラスミドまたはCRE mRNAのいずれかを用いて作製された。選択期間、すなわち、選択剤の存在下での培養の前後に、CHOプール内のクローンをFACSによって分析した。
選択期間後、CRE mRNA作製CHOプールにおける交換効率/プール品質は、CREプラスミド作製CHOプールにおけるよりも高いことがわかった(図3および4を参照のこと)。よって、CRE DNAの代わりにCRE mRNAを使用することにより、より大きなサイズと異質性を有するCHOプールが生産される。それにより、高力価で良好な製品品質を有するCHOクローンを発見する可能性は高くなる。
さらにCre mRNAを使用して得られたクローンにおける生存率の回復は改善される(図2を参照のこと)。
さらに、CRE mRNA作製CHOプールからのクローンは、CREプラスミド作製CHOプールからのクローンと比較してより安定していることが予想される。
本発明を以下に要約する。
本発明の1つの独立した態様は、ポリペプチドを生産するための方法であって、
a)ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞を、任意でポリペプチドの発現に適した条件下で、培養する工程と、
b)細胞または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含み、
ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸が、mRNAを使用したCreリコンビナーゼ媒介カセット交換により、哺乳動物細胞のゲノムに安定して組み込まれる、
方法である。
本発明の独立した1つの態様は、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、
a)哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1の組換え認識配列および第2の組換え認識配列、ならびに第1の組換え認識配列と第2の組換え認識配列の間に位置する第3の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なる、哺乳動物細胞を提供する工程;
b)a)で提供された細胞に、2つのデオキシリボ核酸を含む組成物を導入する工程であって、当該2つのデオキシリボ核酸が、3つの異なる組換え認識配列および1~8つの発現カセットを含み、
第1のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
- 第1の組換え認識配列と、
- 1つまたは複数の発現カセットと、
- 1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの5’末端部分と、
- 第3の組換え認識配列の第1のコピーと、
を含み、かつ
第2のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
- 第3の組換え認識配列の第2のコピーと、
- 1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの3’末端部分と、
- 1つまたは複数の発現カセットと、
- 第2の組換え認識配列と、
を含み、
第1および第2のデオキシリボ核酸の第1~第3の組換え認識配列が、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列の第1~第3の組換え認識配列と一致しており、
前述の1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの5’末端部分および3’末端部分が、まとまると、前述の1つの第2の選択マーカーの機能的発現カセットを形成する、
2つのデオキシリボ核酸を含む組成物を細胞に導入する工程;
c)CreリコンビナーゼmRNAを
i)b)の第1および第2のデオキシリボ核酸と同時に、または
ii)その後で逐次的に
のいずれかで導入する工程であって、
Creリコンビナーゼが、第1および第2のデオキシリボ核酸の組換え認識配列を認識する(かつ、任意で、1つまたは複数のリコンビナーゼが、2つのリコンビナーゼ媒介カセット交換を行う)、
Creリコンビナーゼを導入する工程;ならびに、
d)第2の選択マーカーを発現しポリペプチドを分泌する細胞を選択する工程
を含み、
それによって、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつヒトFcRnを分泌する組換え哺乳動物細胞が生産される、
方法である。
ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸の哺乳動物細胞のゲノムへの安定した組込みは、発現カセットの特定の配列が維持される限り、当業者に知られる任意の方法によってなされ得る。
本発明の一態様は、組換え哺乳動物細胞の数を増加させるためのCreリコンビナーゼmRNAの使用であって、前記細胞が、標的指向性組込みにより前記細胞のゲノム中の単一の部位に安定して組み込まれた目的の(異種)ポリペプチドをコードする(異種および/またはトランスジェニック)デオキシリボ核酸(の厳密に一つのコピー)を含む、使用である。一実施態様では、組換え細胞はまた、培養培地中で培養すると、目的のポリペプチドを培養培地中に分泌する。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、哺乳動物細胞および/または導入されたCreリコンビナーゼmRNAは、デオキシリボ核酸をコードするCreリコンビナーゼを含まない。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、CreリコンビナーゼmRNAは、単離されたCreリコンビナーゼmRNAである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、Cre mRNAは、配列番号12のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、Cre mRNAは、配列番号12のアミノ酸配列を含み、NもしくはC末端または両方に核局在化配列をさらに含むポリペプチドをコードする。一実施態様では、Cre mRNAは、配列番号12のアミノ酸配列を含み、NもしくはC末端または互いに独立して両方に1から5の核局在化配列をさらに含むポリペプチドをコードする。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、Cre mRNAは、配列番号13のヌクレオチド配列またはそのコドン使用最適化バリアントを含む。本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、配列番号13のヌクレオチド配列またはそのコドン使用最適化バリアントは、5’もしくは3’末端または両方に核局在化配列をコードするさらなる核酸をさらに含む。すべての態様の一実施態様では、Cre mRNAは、配列番号13のヌクレオチド配列またはそのコドン使用最適化バリアントを含み、5’もしくは3’末端または互いに独立して両方に核局在化配列をコードする1から5の核酸をさらに含む。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、デオキシリボ核酸の厳密に1つのコピーが、単一の部位または遺伝子座で、哺乳動物細胞のゲノム内に安定して組み込まれる。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、1から8つの発現カセットを含む。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、少なくとも4つの発現カセットを含み、ここで、
- 第1の組換え認識配列は、最も5’側(すなわち、第1)の発現カセットの5’側に位置しており、
- 第2の組換え認識配列は、最も3’側の発現カセットの3’側に位置しており、
- 第3の組換え認識配列は、
- 第1の組換え認識配列と第2の組換え認識配列との間、かつ
- 発現カセットのうちの2つの間
に位置しており、
組換え認識配列はすべて異なる。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、第3の組換え認識配列は、第4の発現カセットと第5の発現カセットとの間に位置している。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含む。
本発明のすべての態様および実施態様の一実施態様では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含み、選択マーカーをコードする発現カセットは、第3の組換え認識配列の5’側に一部が、3’側に一部が位置しており、前記発現カセットの、5’側に位置する部分は、プロモーターおよび開始コドンを含み、前記発現カセットの、3’側に位置する部分は、開始コドンのないコード配列およびポリAシグナルを含み、開始コドンはコード配列に作動可能に連結される。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、選択マーカーをコードする発現カセットは、第3の組換え認識配列に対して、
i)5’側、または
ii)3’側、または
iii)一部が5’側、一部が3’側
のいずれかに位置している。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、選択マーカーをコードする発現カセットは、第3の組換え認識配列の5’側に一部が、3’側に一部が位置しており、前記発現カセットの、5’側に位置する部分は、プロモーターおよび開始コドンを含み、前記発現カセットの、3’側に位置する部分は、開始コドンのないコード配列およびポリAシグナルを含む。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、選択マーカーをコードする発現カセットの、5’側に位置する部分は、開始コドンに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、プロモーター配列は、上流側で、それぞれ、第2、第3、または第4の発現カセットと隣接し(すなわち、第2、第3、または第4の発現カセットに対して下流の位置にあり)、開始コドンは、下流側で第3の組換え認識配列と隣接し(すなわち、第3の組換え認識配列に対して上流の位置にあり);かつ、選択マーカーをコードする発現カセットの、3’側に位置する部分は、開始コドンを欠く選択マーカーをコードする核酸を含み、上流側で第3の組換え認識配列と隣接し、下流側で第3、第4、または第5の発現カセットと隣接している。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、開始コドンは転写開始コドンである。一実施態様では、開始コドンはATGである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、第1のデオキシリボ核酸は第1のベクターに組み込まれ、第2のデオキシリボ核酸は第2のベクターに組み込まれる。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、Cre mRNAと第1のベクターおよび第2のベクターの混合物との間の重量比は、1:3から2:1の範囲にある。好ましい一実施態様では、Cre mRNAと第1のベクターおよび第2のベクターの混合物との間の重量比は、約1:5である。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、発現カセットのそれぞれは、5’から3’の方向に、プロモーターと、コード配列と、ポリアデニル化シグナル配列と、任意で、それに続くターミネーター配列とを含む。
ターミネーター配列は、RNAポリメラーゼIIによる非常に長いRNA転写物の生成、すなわち、本発明のデオキシリボ核酸および本発明の方法で使用されるデオキシリボ核酸における次の発現カセットへのリードスルーを防止する。つまり、目的の1つの構造遺伝子の発現は、それ自体のプロモーターによって制御される。
よって、ポリアデニル化シグナルおよびターミネーター配列の組み合わせにより、効率的な転写終結が実現される。つまり、RNAポリメラーゼIIのリードスルーは、二重の終結シグナルの存在によって防止される。ターミネーター配列は、複雑な分解を開始し、DNAテンプレートからのRNAポリメラーゼの解離を促進する。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、プロモーターは、イントロンAを有するまたは有しないヒトCMVプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列はbGHポリA部位であり、ターミネーターはhGTターミネーターである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、プロモーターは、イントロンAを含むヒトCMVプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列はbGHポリアデニル化シグナル配列であり、かつターミネーター配列はhGTターミネーターであり;ただし例外として選択マーカーの発現カセットでは、プロモーターがSV40プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列部位がSV40ポリA部位であり、かつターミネーター配列が存在しない。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、哺乳動物細胞はCHO細胞である。一実施態様では、CHO細胞はCHO-K1細胞である。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、二価の単一特異性抗体、少なくとも1つのドメイン交換を含む二価の二重特異性抗体、および少なくとも1つのドメイン交換を含む三価の二重特異性抗体からなるポリペプチドの群より選択される。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ四量体ポリペプチドであって、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、第1の軽鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第1の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第2の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第2の重鎖可変ドメインとCLドメインとを含む、第1の軽鎖、および
- N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含む、第2の軽鎖
を含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第2の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ四量体ポリペプチドであって、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、第2の重鎖可変ドメインと、CLドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第1の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第2の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の軽鎖可変ドメインとCH1ドメインとを含む、第1の軽鎖、および
- N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含む、第2の軽鎖
を含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第2の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ四量体ポリペプチドであって、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第1の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の軽鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第2の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第2の重鎖可変ドメインとCLドメインとを含む、第1の軽鎖、および
- N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含む、第2の軽鎖
を含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第2の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ四量体ポリペプチドであって、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第1の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CLドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第2の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の軽鎖可変ドメインとCH1ドメインとを含む、第1の軽鎖、および
- N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含む、第2の軽鎖
を含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第2の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ多量体ポリペプチドであって、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインと、第1の軽鎖可変ドメインとを含む、第1の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインと、第2の重鎖可変ドメインとを含む、第2の重鎖、および
- N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含む、第1の軽鎖
を含み、
第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第1の結合部位を形成し、第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第2の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ四量体ポリペプチドであって、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインと、ペプチドリンカーと、第2の重鎖可変ドメインと、CLドメインとを含む、第1の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含む、第2の重鎖、
- N末端からC末端に向けて、第1の軽鎖可変ドメインとCH1ドメインとを含む、第1の軽鎖、および
- N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含む、第2の軽鎖
を含み、
第2の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが第1の結合部位を形成し、第1の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが第2の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは治療用抗体である。好ましい実施態様において、多重特異性抗体は、二重特異性(治療用)抗体である。一態様において、二重特異性(治療用)抗体はTCBである。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、二重特異性(治療用)抗体(TCB)であって、
- 第1および第2のFab断片であって、第1および第2のFab断片の各結合部位が第2の抗原に特異的に結合する、第1および第2のFab断片と、
- 第3のFab断片であって、第3のFab断片の結合部位が第1の抗原に特異的に結合し、可変軽鎖ドメイン(VL)と可変重鎖ドメイン(VH)とが互いに置き換えられるようにドメインクロスオーバーを含む、第3のFab断片と、
- 第1のFc領域ポリペプチドおよび第2のFc領域ポリペプチドを含む、Fc領域と
を含み、
第1および第2のFab断片がそれぞれ、重鎖断片および完全長軽鎖を含み、
第1のFab断片の重鎖断片のC末端は、第1のFc領域ポリペプチドのN末端に融合されており、
第2のFab断片の重鎖断片のC末端が、第3のFab断片の可変軽鎖ドメインのN末端に融合されており、第3のFab断片の重鎖定常ドメイン1のC末端が、第2のFc領域ポリペプチドのN末端に融合されている。
本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、抗CD3/CD20二重特異性抗体である。一態様において、抗CD3/CD20二重特異性抗体はTCBであり、CD20は第2の抗原である。特定の実施態様では、抗CD3/CD20抗体はRG6026である。
本発明のこれまでのすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、リコンビナーゼ認識配列は、L3、2L、およびLoxFasである。一実施態様では、L3は配列番号01の配列を有し、2Lは配列番号02の配列を有し、LoxFasは配列番号03の配列を有する。一実施態様では、第1のリコンビナーゼ認識配列はL3であり、第2のリコンビナーゼ認識配列は2Lであり、第3のリコンビナーゼ認識配列はLoxFasである。
本発明のこれまでのすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、プロモーターは、イントロンAを含むヒトCMVプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列は、bGHポリA部位であり、ターミネーター配列は、hGTターミネーターである。
本発明のこれまでのすべての態様および実施形態のうちの一実施態様では、プロモーターは、イントロンAを含むヒトCMVプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列はbGHポリA部位であり、かつターミネーター配列はhGTターミネーターであり;ただし例外として選択マーカーの発現カセットでは、プロモーターがSV40プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列部位がSV40ポリA部位であり、かつターミネーター配列が存在しない。
本発明のこれまでのすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ヒトCMVプロモーターは、配列番号04の配列を有する。一実施態様では、ヒトCMVプロモーターは、配列番号06の配列を有する。
本発明のこれまでのすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、bGHポリアデニル化シグナル配列は、配列番号08である。
本発明のこれまでのすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、hGTターミネーターは、配列番号09の配列を有する。
本発明のこれまでのすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、SV40プロモーターは、配列番号10の配列を有する。
本発明のこれまでのすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、SV40ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号07である。
II.b リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)
標的指向性組込みにより、哺乳動物細胞ゲノムのあらかじめ定められた部位に外因性ヌクレオチド配列が組み込まれることが可能になる。特定の実施態様では、標的指向性組込みは、1つ以上の組換え認識配列(RRS)を認識するリコンビナーゼによって媒介される。特定の実施態様では、標的指向性組込みは、相同組換えによって媒介される。
「組換え認識配列」(RRS)は、リコンビナーゼによって認識されるヌクレオチド配列であり、リコンビナーゼ媒介性組換え事象に必要かつ十分である。RRSは、組換え事象がヌクレオチド配列内で発生する位置を定義するために使用され得る。
特定の実施態様では、RRSは、LoxP配列、LoxP L3配列、LoxP 2L配列、LoxFas配列、Lox511配列、Lox2272配列、Lox2372配列、Lox5171配列、Loxm2配列、Lox71配列、Lox66配列、FRT配列、Bxb1 attP配列、Bxb1 attB配列、φC31 attP配列、およびφC31 attB配列からなる群より選択される。複数のRRSが存在しなければならない場合、同一でないRRSが選択される限りにおいて、各配列の選択は他方に依存する。
特定の実施態様では、RRSは、Creリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施態様では、RRSは、FLPリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施態様では、RRSは、Bxb1インテグラーゼによって認識され得る。特定の実施態様では、RRSは、φC31インテグラーゼによって認識され得る。
RRSがLoxP部位である特定の実施態様において、細胞は、組換えを行うためにCreリコンビナーゼを必要とする。RRSがFRT部位である特定の実施態様において、細胞は、組換えを行うためにFLPリコンビナーゼを必要とする。RRSがBxb1 attP部位またはBxb1 attB部位である特定の実施態様において、細胞は、組換えを行うためにBxb1インテグラーゼを必要とする。RRSがφC31 attP部位またはφC31attB部位である特定の実施態様では、細胞は、組換えを行うためにφC31インテグラーゼを必要とする。これらのリコンビナーゼは、これらの酵素のコード配列を含む発現ベクターを用いて細胞中に導入することができる。
Cre-LoxP部位特異的組換え系は、多くの生物学的実験系で広く使用されている。Creは、34bpのLoxP配列を認識する38kDaの部位特異的DNAリコンビナーゼである。CreはバクテリオファージP1に由来し、チロシンファミリーの部位特異的リコンビナーゼに属する。Creリコンビナーゼは、LoxP配列間の分子内および分子間組換えの両方を媒介できる。LoxP配列は、2つの13bpの逆方向反復に挟まれた8bpの非パリンドロームコア領域で構成されている。Creリコンビナーゼは13bpの反復に結合し、それによって8bpのコア領域内の組換えを媒介する。Cre-LoxP媒介性組換えは高効率で起こり、他の宿主因子を必要としない。2つのLoxP配列が同じヌクレオチド配列上で同じ方向に配置されている場合、Cre媒介性組換えにより、2つのLoxP配列の間に位置するDNA配列が共有結合で閉じた円として切り出される。2つのLoxP配列が同じヌクレオチド配列上で逆方向の位置に配置されている場合、Cre媒介性組換えにより、2つの配列の間に位置するDNA配列の方向が反転する。2つのLoxP配列が2つの異なるDNA分子上にあり、1つのDNA分子が環状である場合、Cre媒介性組換えにより、環状DNA配列の組込みをもたらす。
特定の実施態様では、LoxP配列は、野生型LoxP配列である。特定の実施態様では、LoxP配列は、変異体LoxP配列である。変異体LoxP配列は、Cre媒介性組込みまたは置換の効率を高めるために開発された。特定の実施態様では、変異体LoxP配列は、LoxP L3配列、LoxP 2L配列、LoxFas配列、Lox511配列、Lox2272配列、Lox2372配列、Lox5171配列、Loxm2配列、Lox71配列、およびLox66配列からなる群から選択される。例えば、Lox71配列では、左側の13bpの反復で5bpが変異している。Lox66配列では、右側の13bpの反復で5bpが変異している。野生型と変異体の両方のLoxP配列は、Cre依存性組換えを媒介し得る。
「一致するRRS」という用語は、2つのRRS間で組換えが起こることを示す。特定の実施態様では、2つの一致RRSは同一である。特定の実施態様では、両方のRRSは野生型LoxP配列である。特定の実施態様では、両方のRRSは変異体LoxP配列である。特定の実施態様では、両方のRRSは野生型FRT配列である。特定の実施態様では、両方のRRSは変異体FRT配列である。特定の実施態様では、2つの一致するRRSは異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施態様では、第1の一致するRRSは、Bxb1 attP配列であり、第2の一致するRRSは、Bxb1 attB配列である。特定の実施態様では、第1の一致するRRSはφC31 attB配列であり、第2の一致するRRSはφC31 attB配列である。
II.c TIに適した例示的哺乳動物細胞
前述したような、外因性核酸(「ランディング部位」)を含む、TIに適した任意の公知または今後得られる哺乳動物細胞を、本発明において使用することができる。
これまでのセクションに基づく、外因性核酸(ランディング部位)を含むCHO細胞を用いて、本発明を例示する。これは、本発明を例示するためにのみ提示されており、いかなる方法であっても限定として解釈されるべきではない。本発明の真の範囲は、特許請求の範囲で設定される。
1つの好ましい実施態様において、哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞は、CHO細胞である。
本発明において使用するために適している、そのゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む例示的哺乳動物細胞は、Creリコンビナーゼの媒介によるDNA組換えのための3つの異種特異的loxP部位を含むランディング部位(=哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列)を内部に持つ、CHO細胞である。これらの異種特異的loxP部位は、L3、LoxFas、および2Lであり(例えば、Lanzaら、Biotechnol.J.7(2012)898~908;Wongら、Nucleic acids Res.33(2005)e147を参照されたい)、その際、L3および2Lはランディング部位の5’末端および3’末端にそれぞれ隣接しており、LoxFasはL3部位と2L部位の間に位置している。ランディング部位は、IRESを介した選択マーカーの発現を蛍光性GFPタンパク質の発現に結び付けて、ポジティブ選択によってランディング部位を安定化することならびにトランスフェクションおよびCre組換え後に部位が存在しないものを選択すること(ネガティブ選択)を可能にする、バイシストロン性単位をさらに含む。緑色蛍光性タンパク質(GFP)は、RMCE反応をモニターするのに役立つ。例示的なGFPは、配列番号11の配列を有する。
先のパラグラフで概説したようにランディング部位がこのように編成されていることによって、2つのベクター、いわゆる、L3部位およびLoxFas部位を有するフロントベクターならびにLoxFas部位および2L部位を内部に持つバックベクターを同時に組み込むことが可能になる。ランディング部位に存在するものとは異なる、選択マーカー遺伝子の機能的エレメントは、両方のベクター間に分配されている:プロモーターおよび開始コドンはフロントベクター上に位置しているのに対し、コード領域およびポリAシグナルはバックベクター上に位置している。両方のベクターに由来する前記核酸がCreを媒介として正確に組み込まれた場合にのみ、各選択剤に対する耐性が誘導される。
通常、TIに適した哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞であって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1の組換え認識配列および第2の組換え認識配列、ならびに第1の組換え認識配列と第2の組換え認識配列の間に位置する第3の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なる、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞である。前記外因性ヌクレオチド配列は、「ランディング部位」と呼ばれる。
本開示の主題では、外因性ヌクレオチド配列のTIに適した哺乳動物細胞を使用する。特定の実施態様において、TIに適した哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞のゲノム中の組込み部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む。TIに適したこのような哺乳動物細胞は、TI宿主細胞と表記することもできる。
特定の実施態様において、TIに適した哺乳動物細胞は、ランディング部位を含む、ハムスター細胞、ヒト細胞、ラット細胞、またはマウス細胞である。特定の実施態様において、TIに適した哺乳動物細胞は、ランディング部位を含む、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、CHO K1細胞、CHO K1SV細胞、CHO DG44細胞、CHO DUKXB-11細胞、CHO K1S細胞、またはCHO K1M細胞である。
特定の実施態様において、TIに適した哺乳動物細胞は、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含み、外因性ヌクレオチド配列は、1つまたは複数の組換え認識配列(RRS)を含む。特定の実施態様では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも2つのRRSを含む。RRSは、リコンビナーゼ、例えば、Creリコンビナーゼ、FLPリコンビナーゼ、Bxb1インテグラーゼ、またはφC31インテグラーゼによって認識され得る。RRSは、LoxP配列、LoxP L3配列、LoxP 2L配列、LoxFas配列、Lox511配列、Lox2272配列、Lox2372配列、Lox5171配列、Loxm2配列、Lox71配列、Lox66配列、FRT配列、Bxb1 attP配列、Bxb1 attB配列、φC31 attP配列、およびφC31 attB配列からなる群から選択され得る。
特定の実施態様において、外因性ヌクレオチド配列は、第1のRRS、第2のRRS、および第3のRRS、ならびに第1のRRSと第2のRRSの間に位置する少なくとも1つの選択マーカーを含み、かつ第3のRRSは、第1のRRSおよび/または第2のRRSとは異なる。特定の実施態様では、外因性ヌクレオチド配列は、第2の選択マーカーをさらに含み、第1および第2の選択マーカーは異なる。特定の実施態様において、外因性ヌクレオチド配列は、第3の選択マーカーおよび配列内リボソーム進入部位(IRES)もさらに含み、IRESは第3の選択マーカーに作動可能に連結されている。第3の選択マーカーは、第1または第2の選択マーカーとは異なり得る。
選択マーカーは、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ(APH)(例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HYG)、ネオマイシン、およびG418 APH)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、チミジンキナーゼ(TK)、グルタミン合成酵素(GS)、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素(インドール)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(ヒスチジノールD)、ならびにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され得る。また、選択マーカーは、緑色蛍光性タンパク質(GFP)、高感度GFP(eGFP)、合成GFP、黄色蛍光性タンパク質(YFP)、高感度YFP(eYFP)、シアン蛍光性タンパク質(CFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed単量体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald6、CyPet、mCFPm、Cerulean、およびT-Sapphireからなる群から選択される蛍光性タンパク質であってもよい。
特定の実施態様において、外因性ヌクレオチド配列は、第1のRRS、第2のRRS、および第3のRRS、ならびに第1のRRSと第3のRRSの間に位置する少なくとも1つの選択マーカーを含む。
外因性ヌクレオチド配列は、特定の細胞に由来しないが、DNA送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、または形質転換法などによって前記細胞に導入することができるヌクレオチド配列である。特定の実施態様において、TIに適した哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞のゲノム中の1つまたは複数の組込み部位に組み込まれた少なくとも1つの外因性ヌクレオチド配列を含む。特定の実施態様において、外因性ヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の1つまたは複数の組込み部位に組み込まれる。
特定の実施態様では、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は、1つ以上の組換え認識配列(RRS)を含み、RRSは、リコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施態様では、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも2つのRRSを含む。特定の実施態様では、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は、3つのRRSを含み、第3のRRSは、第1のRRSと第2のRRSとの間に位置する。特定の実施態様では、第1のRRSと第2のRRSとは同一であり、第3のRRSは、第1のRRSまたは第2のRRSとは異なる。特定の好ましい実施態様では、3つのRRSはすべて互いに異なる。特定の実施態様では、RRSは、LoxP配列、LoxP L3配列、LoxP 2L配列、LoxFas配列、Lox511配列、Lox2272配列、Lox2372配列、Lox5171配列、Loxm2配列、Lox71配列、Lox66配列、FRT配列、Bxb1 attP配列、Bxb1 attB配列、φC31 attP配列、およびφC31 attB配列からなる群より互いに独立して選択される。
特定の実施態様では、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの選択マーカーを含む。特定の実施態様では、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は、第1、第2および第3のRRS、ならびに少なくとも1つの選択マーカーを含む。特定の実施態様では、選択マーカーは、第1のRRSと第2のRRSとの間に位置する。特定の実施態様において、2つのRRSは、少なくとも1つの選択マーカーに隣接する。すなわち、第1のRRSが選択マーカーの5’側(上流)に位置し、第2のRRSが選択マーカーの3’側(下流)に位置している。特定の実施態様において、第1のRRSは、選択マーカーの5’末端の隣に存在し、かつ第2のRRSは、選択マーカーの3’末端の隣に存在する。
特定の実施態様では、選択マーカーは、第1のRRSと第2のRRSとの間に位置し、2つの隣接するRRSは異なる。特定の好ましい実施態様において、第1の隣接RRSはLoxP L3配列であり、第2の隣接RRSはLoxP 2L配列である。特定の実施態様では、LoxP L3配列は、選択マーカーの5’側に位置し、LoxP 2L配列は、選択マーカーの3’側に位置する。特定の実施態様では、第1の隣接するRRSは、野生型FRT配列であり、第2の隣接するRRSは、変異体FRT配列である。特定の実施態様では、第1の隣接するRRSは、Bxb1 attP配列であり、第2の隣接するRRSは、Bxb1 attB配列である。特定の実施態様では、第1の隣接するRRSは、φC31 attP配列であり、第2の隣接するRRSは、φC31 attB配列である。特定の実施態様では、2つのRRSは同じ方向に配置される。特定の実施態様では、2つのRRSはいずれもフォワードまたはリバース方向に存在する。特定の実施態様では、2つのRRSは反対方向に配置される。
特定の実施態様において、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は、2つのRRSが隣接する、第1の選択マーカーおよび第2の選択マーカーを含み、第1の選択マーカーは第2の選択マーカーとは異なる。特定の実施態様において、2つの選択マーカーのどちらも、相互に独立して、グルタミン合成酵素選択マーカー、チミジンキナーゼ選択マーカー、HYG選択マーカー、およびピューロマイシン耐性選択マーカーからなる群から選択される。特定の実施態様では、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は、チミジンキナーゼ選択マーカーおよびHYG選択マーカーを含む。特定の実施態様において、第1の選択マーカーは、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ(APH)(例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HYG)、ネオマイシン、およびG418 APH)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、チミジンキナーゼ(TK)、グルタミン合成酵素(GS)、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素(インドール)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(ヒスチジノールD)、ならびにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され、第2の選択マーカーは、GFP、eGFP、合成GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed単量体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean、およびT-Sapphire蛍光性タンパク質からなる群から選択される。特定の実施態様において、第1の選択マーカーはグルタミン合成酵素選択マーカーであり、第2の選択マーカーはGFP蛍光性タンパク質である。特定の実施態様では、両方の選択マーカーに隣接する2つのRRSは異なる。
特定の実施態様では、選択マーカーは、プロモーター配列に作動可能に連結されている。特定の実施態様では、選択マーカーは、SV40プロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施態様において、選択マーカーは、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターに作動可能に連結されている。
特定の実施態様では、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は、3つのRRSを含む。特定の実施態様では、第3のRRSは、第1のRRSと第2のRRSとの間に位置する。特定の実施態様では、第1のRRSと第2のRRSとは同一であり、第3のRRSは、第1のRRSまたは第2のRRSとは異なる。特定の好ましい実施態様では、3つのRRSはすべて互いに異なる。
II.d 本発明を実施するために適した例示的ベクター
上記に概説した「単一ベクターRMCE」のほかに、2つの核酸を同時に標的指向性組込みするために、新規な「2ベクターRMCE」を実施することができる。
「2ベクターRMCE」戦略は、本発明のベクターの組合せを用いる本発明の方法において実施される。例えば、限定ではないが、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は3つのRRSを含み、例えば、第3のRRS(「RRS3」)が第1のRRS(「RRS1」)と第2のRRS(「RRS2」)の間に存在し、一方で、第1のベクターは、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列上の第1のRRSおよび第3のRRSに一致する2つのRRSを含み、第2のベクターは、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列上の第3のRRSおよび第2のRRSに一致する2つのRRSを含む場合の配置であり得る。2ベクターRMCE戦略の例を図1に示す。このような2ベクターRMCE戦略により、TIに適した哺乳動物細胞のゲノムにおけるTI後に本発明の発現カセット構成が得られるように、各配列の各RRSペアの間に適切な数のSOIを組み入れることによって複数のSOIを導入することが可能になる。
2プラスミドRMCE戦略では、3つのRRS部位を使用して、2つの独立したRMCEを同時に実行することを含む(図1)。したがって、2プラスミドRMCE戦略を用いるTIに適した哺乳動物細胞のランディング部位は、第1のRRS部位(RRS1)に対しても第2のRRS部位(RRS2)に対してもクロスオーバー活性を有していない第3のRRS部位(RRS3)を含む。標的とされる2つの発現プラスミドは、効率的な標的指向性のために同じ隣接RRS部位を必要とし、一方の発現プラスミド(前方)はRRS1およびRRS3に隣接し、他方(後方)はRRS3およびRRS2に隣接する。また、2プラスミドRMCEでは、2つの選択マーカーも必要とされる。1つの選択マーカー発現カセットは、2つの部分に分割された。フロントプラスミドは、プロモーターと、それに続く開始コドンおよびRRS3配列を含む。バックプラスミドは、開始コドン(ATG)を欠き、選択マーカーコード領域のN末端に融合されたRRS3配列を有する。融合タンパク質のインフレーム翻訳、すなわち作動可能な連結を確実にするために、RRS3部位と選択マーカー配列の間に付加的なヌクレオチドを挿入する必要がある場合がある。両方のプラスミドが正確に挿入された場合にのみ、選択マーカーの完全な発現カセットが組み立てられ、したがって、各選択剤に対する耐性が細胞に与えられる。図1は、2プラスミドRMCE戦略を示す模式図である。
単一ベクターRMCEと2ベクターRMCEのどちらも、ドナーDNA上に存在するDNA配列と組込み部位が存在する哺乳動物細胞ゲノム中のDNA配列とを正確に交換することにより、哺乳動物細胞ゲノムのあらかじめ定められた部位に1つまたは複数のドナーDNA分子を一方向性に組み込むことを可能にする。これらのDNA配列は、i)少なくとも1つの選択マーカー、もしくはある種の2ベクターRMCEの場合のような「分割された選択マーカー」、および/またはii)少なくとも1つの外因性SOI、に隣接する2つの異種特異的RRSを特徴とする。
RMCEは、リコンビナーゼによって触媒される、標的ゲノム遺伝子座内の2つの異種特異的RRSとドナーDNA分子の間の二重組換えクロスオーバーイベントを伴う。RMCEは、フロントベクターおよびバックベクターに由来する組み合わせられたDNA配列のコピーを、哺乳動物細胞ゲノムのあらかじめ定められた遺伝子座に導入するように設計されている。ただ1回の乗換え事象を伴う組換えとは違って、RMCEは、原核生物ベクターの配列が哺乳動物細胞ゲノム中に導入されず、したがって、宿主の免疫または防御機構の望まれない誘発を減らし、かつ/または防ぐように、実行することができる。RMCE手順は、複数のDNA配列を用いて繰り返すことができる。
特定の実施態様において、標的指向性組込みは、2回のRMCEによって実現され、その際、2つの異なるDNA配列が両方とも、TIに適した哺乳動物細胞のゲノムのあらかじめ定められた部位に組み込まれ、各DNA配列は、ヘテロ多量体ポリペプチドの一部分および/または2つの異種特異的RRSが隣接する少なくとも1つの選択マーカーもしくはその一部分をコードする、少なくとも1つの発現カセットを含む。特定の実施態様において、標的指向性組込みは、複数回のRMCEによって実現され、その際、複数のベクターに由来するDNA配列がすべて、TIに適した哺乳動物細胞のゲノムのあらかじめ定められた部位に組み込まれ、各DNA配列は、ヘテロ多量体ポリペプチドの一部分および/または2つの異種特異的RRSが隣接する少なくとも1つの選択マーカーもしくはその一部分をコードする、少なくとも1つの発現カセットを含む。特定の実施態様において、選択マーカーは、一部が第1のベクターにおいてコードされ、一部が第2のベクターにおいてコードされてよく、その結果、二重RMCEによって両方が正確に組み込まれた場合にのみ、その選択マーカーの発現が可能になる。このようなシステムの例を図1に示す。
特定の実施態様において、リコンビナーゼに媒介された組換えによる標的指向性組込みにより、原核生物ベクターに由来する配列を含まずに、宿主細胞ゲノムの1つまたは複数のあらかじめ定められた組込み部位に、選択マーカーおよび/または多量体ポリペプチドの様々な発現カセットが組み込まれる。
記載され、かつ特許請求される様々な実施態様に加えて、本開示の主題は、本明細書に開示され、特許請求される特徴の他の組合せを有する他の実施態様も対象とする。したがって、本明細書に提示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組合せを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組み合わせられ得る。本開示の主題の特定の実施態様の前述の説明は、例示および説明目的のために提示されている。網羅的であるように、または本開示の主題を開示される実施態様に限定することを意図するものではない。
本開示の主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、本開示の主題の組成物および方法に様々な修正および変形を加えることができることは、当業者には明らかである。したがって、本開示の主題が添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内の修正および変形を含むことを意図する。
様々な刊行物、特許、および特許出願が本明細書に引用されており、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。
2つの独立したRMCEを同時に実行するために、3つのRRS部位の使用を伴う2プラスミドRMCE戦略のスキーム。 Cre DNAおよびCre mRNAでのTI後の生存率回復。 Cre DNA/プラスミドでのTI後の交換効率/プール品質;外面積サイズ:687AU;中面積サイズ:132AU;内面積サイズ:27AU。 Cre mRNAでのTI後の交換効率/プール品質;外面積サイズ:812AU;中面積サイズ:114AU;内面積サイズ:32AU。
配列の説明
配列番号01:L3リコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号02:2Lリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号03:LoxFasリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号04~06:ヒトCMVプロモーターの例示的なバリアント
配列番号07:例示的なSV40ポリアデニル化シグナル配列
配列番号08:例示的なbGHポリアデニル化シグナル配列
配列番号09:例示的なhGT終結配列
配列番号10:例示的なSV40プロモーター配列
配列番号11:例示的なGFP核酸配列
配列番号12:Creリコンビナーゼアミノ酸配列
配列番号13:最小限のCreリコンビナーゼmRNA
配列番号14:lox部位パリンドローム配列 1
配列番号15:lox部位パリンドローム配列 2
配列番号16:コア配列lox部位野生型
配列番号17:コア配列lox部位変異体L3
配列番号18:コア配列lox部位変異体2L
配列番号19:コア配列lox部位変異体LoxFas
配列番号20:コア配列lox部位変異型Lox511
配列番号21:コア配列lox部位変異体Lox5171
配列番号22:コア配列lox部位変異体Lox2272
配列番号23:コア配列lox部位変異体M2
配列番号24:コア配列lox部位変異体M3
配列番号25:例示的な核局在化配列
配列番号26:例示的な核局在化配列
配列番号27:例示的な核局在化配列
配列番号28:例示的な核局在化配列
配列番号29:例示的な核局在化配列
実施例:
実施例1
一般的技術
1)組換えDNA技術
標準的な方法を使用して、Sambrookら、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3d edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.、分子生物学的試薬は、製造元の説明書に従って使用した。
2)DNA配列決定
DNA配列決定は、SequiServe GmbH(Vaterstetten、Germany)で実施した。
3)DNAおよびタンパク質配列解析ならびに配列データ管理
EMBOSS(European Molecular Biology Open Software Suite)ソフトウェアパッケージおよびInvitrogenのVector NTIバージョン11.5を、配列の作成、マッピング、解析、注釈付け、および図解に使用した。
4)遺伝子とオリゴヌクレオチドの合成
所望の遺伝子分節を、Geneart GmbH(Regensburg,Germany)において化学合成により調製した。合成された遺伝子断片を、伝播/増幅のために大腸菌プラスミド中にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。代替的に、短い合成DNA断片を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、またはPCRを介して構築した。それぞれのオリゴヌクレオチドを、metabion GmbH(Planegg-Martinsried,Germany)により調製した。
5)試薬
すべての市販の化学物質、抗体、およびキットは、別途記載されていない限り、製造業者のプロトコールに従って提供されるとおりに使用された。
6)TI宿主細胞株の培養
TI CHO宿主細胞を、85%の湿度および5%のCOの加湿インキュベーター内で37℃で培養した。300μg/mlのハイグロマイシンBおよび4μg/mlの第2の選択マーカーを含有する独自のDMEM/F12ベースの培地で、それらを培養した。細胞を3日または4日ごとに0.3×10E6細胞/mlの濃度で総量30mlに分割した。培養には、125mlの非バッフルエルレンマイヤー振盪フラスコを使用した。振盪振幅5cm、150rpmで細胞を振盪した。Cedex HiRes Cell Counter(Roche)を用いて細胞数を決定した。細胞は、60日齢に達するまで、培養を続けた。
7)クローニング
一般
R部位でのクローニングは、目的の遺伝子(GOI)の隣のDNA配列に依存し、これは、次の断片にある配列と同じである。同様に、断片の組立ては、等しい配列の重なりと、それに続くDNAリガーゼによる組み立てられたDNAのニックの封鎖によって可能である。したがって、正しいR部位を有する特定の予備ベクターの単一の遺伝子のクローニングが必要であるこれらの予備ベクターの首尾よいクローニングの後、R部位に隣接する目的の遺伝子は、R部位のすぐ隣を切断する酵素による制限消化を介して切断される。最後の工程は、すべてのDNA断片を一工程で組み立てることである。より詳細には、5’エキソヌクレアーゼは、重なる領域の5’末端(R部位)を除去する。その後、R部位のアニーリングを行うことができ、DNAポリメラーゼは、3 ’末端を拡張して配列のギャップを充填する。最後に、DNAリガーゼは、ヌクレオチド間のニックを封鎖する。エキソヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、およびリガーゼのような異なる酵素を含有するアセンブリマスター混合物の添加と、後に続く50℃での反応混合物のインキュベーションは、1つのプラスミドへの単一の断片のアセンブリにつながる。その後、コンピテント大腸菌細胞をプラスミドで形質転換する。
いくつかのベクターについては、制限酵素を介するクローニング戦略を使用した。適切な制限酵素を選択することにより、所望の目的の遺伝子を切断し、その後、ライゲーションによって異なるベクターへ挿入することができる。したがって、マルチクローニングサイト(MCS)で切断する酵素を使用し、スマートな方法で選択することで、正しいアレイ内の断片のライゲーションを行うことができる。ベクターおよび断片が以前に同じ制限酵素で切断されている場合、断片とベクターの粘着末端は完全に適合し、その後DNAリガーゼによってライゲーションすることができる。ライゲーションの後、コンピテント大腸菌細胞を新しく作製したプラスミドで形質転換する。
制限消化を介したクローニング
制限酵素でのプラスミドの消化について、以下の成分を一緒に氷上にピペットで移した。
表:制限消化反応混合物
Figure 0007410983000002
1回の消化でより多くの酵素を使用した場合、各酵素1μlを使用し、PCRグレードの水を多かれ少なかれ添加して容量を調整した。すべての酵素は、New England BiolabsのCutSmartバッファー(100%活性)での使用に適格であり、同じインキュベーション温度(すべて37℃)であるという前提条件で選択された。
インキュベーションは、サーモミキサーまたはサーマルサイクラーを使用して行い、サンプルを一定温度(37℃)でインキュベートできるようにした。インキュベーション中にサンプルは撹拌しなかった。インキュベーション時間を60分に設定した。その後、サンプルをローディング染料と直接混合し、アガロース電気泳動ゲルにロードするかまたはさらなる使用のために4℃で/氷上で保管した。
1%のアガロースゲルをゲル電気泳動用に調製した。そのため、1.5gの多目的アガロースを125 エルレンマイヤー振盪フラスコに量り入れ、150mlのTAEバッファーで満たした。アガロースが完全に溶解するまで、混合物をマイクロ波オーブン内で加熱した。0.5μg/mlの臭化エチジウムをアガロース溶液に添加した。その後、ゲルを型に流し込んだ。アガロースをセットした後、型を電気泳動チャンバ内に置き、チャンバをTAEバッファーで満たした。その後、サンプルをロードした。最初のポケット(左から)に、適切なDNA分子量マーカーをロードし、続いてサンプルをロードした。ゲルを<130Vでおよそ60分間操作した。電気泳動後、ゲルをチャンバから除去し、UV-Imagerで分析した。
ターゲットのバンドを切断し、1.5mlのEppendorfチューブに移した。ゲルの精製には、QiagenのQIAquick Gel Extraction Kitを製造業者の指示に従って使用した。DNA断片をさらなる使用のために-20℃で保管した。
ライゲーション用の断片は、インサートとベクター断片の長さ、およびそれらの相互の相関関係に応じて、1:2、1:3、または1:5のインサートに対するベクターのモル比で、一緒にピペットで移した。ベクターに挿入されるべき断片が短い場合は、1:5の比を使用した。インサートが長い場合は、ベクターとの相関関係で使用されるインサートの量は少なくなった。50Ngの量のベクターを各ライゲーションに使用し、特定の量のインサートをNEBioCalculatorで計算した。ライゲーションには、NEBのT4 DNAライゲーションキットを使用した。ライゲーション混合物の例を、以下の表に示す。
表:ライゲーション反応混合物
Figure 0007410983000003
すべての成分を一緒に氷上にピペットで移し、DNAと水の混合から初め、バッファーを添加し、そして酵素を添加した。反応物を上下にピペッティングすることにより穏やかに混合し、短時間マイクロ遠心分離し、次に室温で10分間インキュベートした。インキュベーションの後、T4リガーゼを65℃で10分間熱不活性化した。サンプルを氷上で冷やした。最終工程では、10ベータコンピテント大腸菌細胞を、2μlのライゲーションプラスミドで形質転換した(以下を参照のこと)。
R部位アセンブリを介したクローニング
アセンブリのために、両端にR部位を有するすべてのDNA断片を氷上でピペットした。4つを超える断片を組み立てる場合は、製造業者が推奨するように、すべての断片の等モル比(0.05 ng)を使用した。反応混合物の2分の1をNEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mixによって具体化した。総反応量は40μlであり、それはPCR用清浄水を満たすことによって達成した。以下の表では、例示的なピペットスキームを示す。
表:アセンブリ反応混合物
Figure 0007410983000004
反応混合物のセットアップ後、チューブをサーモサイクラー内で60分間50℃で一定してインキュベートした。首尾よいアセンブリの後、10ベータコンピテント大腸菌細菌を2μlの組み立てられたプラスミドDNAで形質転換した(以下を参照のこと)。
10ベータコンピテント大腸菌細胞の形質転換
形質転換のために、10ベータコンピテント大腸菌細胞を氷上で解凍した。その後、2μlのプラスミドDNAを細胞懸濁液中に直接ピペットした。チューブをはじき、30分間氷上に置いた。その後、細胞を42℃の温かいサーマルブロックに入れ、厳密に30秒間熱ショックを与えた。その直後に、細胞を氷上で2分間冷却した。950μlのNEB 10ベータ増殖培地を細胞懸濁液に添加した。細胞を振盪しながら37℃で1時間インキュベートした。その後、50~100μlを予熱した(37℃)LB-Amp寒天プレート上にピペットし、使い捨てスパチュラで広げた。プレートを37℃で一晩インキュベートした。アンピシリンに対する耐性遺伝子を持った、プラスミドの取り込みに成功したバクテリアのみが、このプレート上で増殖できる。単一コロニーを翌日採取し、後に続くプラスミド調製のためにLB-Amp培地で培養した。
細菌培養
大腸菌の培養は、LB培地(Luria Bertaniの略)で行い、1ml/L 100mg/mlアンピシリンをスパイクして、0.1mg/mlのアンピシリン濃度にした。異なるプラスミド調製量について、以下の量に単一の細菌コロニーを接種した。
表:大腸菌培養量
Figure 0007410983000005
ミニプレップのために、96ウェル、深さ2mlのウェルプレートを、1ウェルあたり1.5mlのLB-Amp培地で満たした。コロニーを採取し、つまようじを培地に押し込んだ。すべてのコロニーを採取して、プレートを粘着性のある空気多孔質膜で閉じた。プレートを、23時間、200rpmの振盪速度で、37℃のインキュベーター内でインキュベートした。
ミニプレップのために、15mlのチューブ(通風リッドを有する)を3.6mlのLB-Amp培地で満たし、細菌コロニーを等しく接種した。つまようじは除去しなかったが、インキュベーション中にチューブに残した。96ウェルプレートと同様に、チューブを、37℃、200rpmで23時間インキュベートした。
マキシプレップのために、200mlのLB-Amp培地をオートクレーブ処理したガラスの1Lエルレンマイヤーフラスコに満たし、約5時間経過した1mlの細菌の日用培養物を接種した。エルレンマイヤーフラスコをペーパープラグで閉じ、37℃、200rpmで16時間インキュベートした。
プラスミドの調製
ミニプレップのために、50μlの細菌懸濁液を深さ1mlのウェルプレートに移した。その後、細菌細胞をプレート内で、3000rpm、4℃で5分間遠心分離した。上清を除去し、細菌ペレットを有するプレートをEpMotion内に置いた。およそ90分後、操作を行い、溶出したプラスミドDNAをさらなる使用のためにEpMotionから除去することができた。
ミニプレップのために、15mlのチューブをインキュベーターから取り出し、3.6mlの細菌培養物を二つの2mlのエッペンドルフチューブに分割した。チューブを卓上マイクロ遠心機で、6,800xg、室温で3分間遠心分離した。その後、ミニプレップを、製造業者の指示に従ってQiagen QIAprep Spin Miniprep Kitを用いて実施した。プラスミドDNA濃度をNanodropで測定した。
マキシプレップを、製造業者の指示に従って、Macherey-Nagel NucleoBond(商標登録)Xtra Maxi EF Kitを使用して実施した。DNA濃度をNanodropで測定した。
エタノール沈殿
DNA溶液の容量を2.5倍容量のエタノール100%と混合した。混合物を-20℃で10分間インキュベートした。その後、DNAを30分間、14,000rpm、4℃で遠心分離した。上清を慎重に除去し、ペレットを70%エタノールで洗浄した。再度、チューブを5分間、14,000rpm、4℃で遠心分離した。ピペットによって上清を慎重に除去し、ペレットを乾燥させた。エタノールが蒸発した後、適量のエンドトキシン非含有水を添加した。DNAを4℃で一晩水に再溶解する時間を与えた。少量のアリコートを取り、NanodropデバイスでDNA濃度を測定した。
実施例2
プラスミド作製
発現カセットの組成
抗体鎖の発現には、以下の機能的要素を含む転写単位を使用した:
- イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
- ヒト重鎖免疫グロブリン5’非翻訳領域(5’UTR)、
- マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
- それぞれの抗体鎖をコードする核酸、
- ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)、および
- 任意で、ヒトガストリンターミネーター(hGT)。
発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット/カセットに加えて、塩基性/標準的な哺乳動物発現プラスミドは、
- 大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18からの複製起点、および
- 大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータ-ラクタマーゼ遺伝子
を含む。
前方および後方ベクタークローニング
2プラスミド抗体コンストラクトを構築するために、抗体HCおよびLC断片を、L3およびLoxFAS配列を含む前方ベクターバックボーン、ならびにLoxFASおよび2L配列ならびにpac選択可能マーカーを含む後方ベクターにクローニングした。すべてのRMCEプロセスに、CreリコンビナーゼプラスミドpOG231(Wong,E.T.,et al.,Nuc.Acids Res.33(2005)e147;O’Gorman,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)14602-14607)を使用した。
遺伝子合成により、それぞれの抗体鎖をコードするcDNAを作製した(Geneart,Life Technologies Inc.)。37℃で1時間、遺伝子合成物およびバックボーンベクターをHindIII-HFおよびEcoRI-HF(NEB)で消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離した。挿入断片およびバックボーンのDNA断片をアガロースゲルから切り取り、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を用いて抽出した。製造業者のプロトコールに従ってRapid Ligation Kit(Roche)を用いて、3:1の挿入断片/バックボーン比で、精製した挿入断片およびバックボーン断片をライゲーションした。次いで、42℃で30秒間の熱ショックによってライゲーションアプローチをコンピテント大腸菌DH5αに形質転換し、37℃で1時間インキュベートした後、選択用のアンピシリンを含む寒天プレートに播種した。プレートを37℃で一晩インキュベートした。
翌日、クローンを採取し、ミニプレップまたはマキシプレップのために振盪しながら37℃で一晩インキュベートした。これは、EpMotion(登録商標)5075(Eppendorf)を用いて、またはそれぞれQIAprepスピンミニプレップキット(Qiagen)/NucleoBond XtraマキシEFキット(Macherey&Nagel)を用いて、実施した。すべてのコンストラクトを配列決定して、いかなる不適切な変異も存在しないように徹底した(SequiServe GmbH)。
第2のクローニング工程において、第1のクローニングの場合と同じ条件を用いて、あらかじめクローニングしたベクターをKpnI-HF/SalI-HFおよびSalI-HF/MfeI-HFで消化した。TIバックボーンベクターをKpnI-HFおよびMfeI-HFで消化した。分離および抽出を、前述したようにして実施した。製造業者のプロトコールに従ってT4 DNAリガーゼ(NEB)を用いて、1:1:1のインサート/インサート/バックボーン比で、精製したインサートおよびバックボーンのライゲーションを4℃で一晩実施し、65℃で10分間、不活性化した。前述したようにして、下記のクローニング工程を実施した。
クローニングされたプラスミドを、TIトランスフェクションおよびプール作製のために使用した。
実施例3
培養、トランスフェクション、選択、および単一細胞クローニング
TI宿主細胞を、独自のDMEM/F12ベースの培地中、150rpmの一定の撹拌速度、標準的な加湿条件下(95%rH、37℃、および5%CO)で、使い捨て125mlベント型振盪フラスコ内にて増殖させた。3~4日ごとに、細胞を、選択マーカー1および選択マーカー2を有効濃度で含む化学的に定義された培地に、3×10E5細胞/mlの濃度で播種した。培養物の密度と生存率を、Cedex HiRes細胞カウンタ(F.Hoffmann-La Roche Ltd、Basel、Switzerland)で測定した。
安定したトランスフェクションのために、等モル量の前方ベクターおよび後方ベクターを混合した。5μgの混合物あたり1μgのCre発現プラスミドを添加した。すなわち、25μgの前方ベクターおよび後方ベクター混合物に、5μgのCre発現プラスミドまたはCre mRNAを添加した。
トランスフェクションの2日前に、TI宿主細胞を、4×10E5細胞/mlの密度で、新鮮な培地に播種した。トランスフェクションは、NucleofectorキットV(Lonza、Switzerland)を使用して、製造元のプロトコールに従ってNucleofectorデバイスで実施した。3×10E7細胞を総量30μgの核酸で、すなわち、30μgのプラスミド(5μgのCreプラスミドならびに25μgの前方ベクターおよび後方ベクター混合物)または5μgのCre mRNAならびに25μgの前方ベクターおよび後方ベクター混合物のいずれかで、トランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、選択剤を含まない30mlの培地に播種した。
播種後5日目に、細胞を遠心分離し、組換え細胞の選択のために、ピューロマイシン(選択剤1)および1-(2’-デオキシ-2’-フルオロ-1-ベータ-D-アラビノフラノシル-5-ヨード)ウラシル(FIAU;選択剤2)を有効濃度で含む80mLの化学的に定義された培地に、6×10E5細胞/mlの濃度で移した。この日から、細胞を、分割することなく、37℃、150rpm、5% CO2、および85%の湿度でインキュベートした。培養物の細胞密度および生存率を定期的にモニターした。培養物の生存率が再び増加し始めたとき、選択剤1および2の濃度を、以前に使用した量の約半分に減少させた。より詳細には、細胞の回収を促進するために、生存率が40%より高く、かつ生細胞濃度(VCD)が0.5×10E6細胞/mLより高い場合は選択圧を下げた。したがって、4×10E5細胞/mlを遠心分離し、選択培地II(化学限定培地、1/2選択マーカー1および2)40mlに再懸濁した。これらの細胞を以前と同じ条件で、かつこの場合も分割せずに、インキュベートした。
選択を開始してから10日後、細胞内GFPおよび細胞表面に結合した細胞外異種ポリペプチドの発現を測定するフローサイトメトリによって、Cre媒介性カセット交換の成功を確認した。ヒト抗体の軽鎖および重鎖に対するAPC抗体(アロフィコシアニン標識F(ab’)2断片ヤギ抗ヒトIgG)を、FACS染色用に使用した。フローサイトメトリは、BD FACS Canto IIフローサイトメータ(BD、Heidelberg、Germany)を使用して実施した。1試料あたり10,000イベントを測定した。生細胞を、側方散乱(SSC)に対する前方散乱(FSC)のプロットでゲートした。生細胞ゲートは、トランスフェクトされていないTI宿主細胞で定義され、FlowJo 7.6.5 ENソフトウェア(TreeStar、Olten、Switzerland)を用いて、すべての試料に適用された。GFPの蛍光を、FITCチャネル(488nmでの励起、530nmでの検出)で定量化した。異種ポリペプチドを、APCチャネル(645nmでの励起、660nmでの検出)で測定した。CHO親細胞、すなわちTI宿主細胞の作製に使用された細胞を、GFPおよび[[X]]発現に対するネガティブコントロールとして使用した。選択開始から14日後、生存率は90%を超え、選択は完了したと見なされた。
選択後、安定的にトランスフェクトされた細胞のプールを、限界希釈による単一細胞クローニングに供した。この目的のために、細胞をCell Tracker GreenTM(Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA)で染色し、384ウェルプレートに0.6細胞/ウェルで播種した。単一細胞クローニングおよびその後のすべての培養工程では、選択剤2を培地から除外した。1つの細胞のみを含むウェルを、明視野および蛍光ベースのプレートイメージングによって同定した。1つの細胞を含むウェルのみを、さらに検討した。プレーティング後約3週間で、コンフルエントなウェルからコロニーを採取し、96ウェルプレートでさらに培養した。
96ウェルプレートで4日後、培養培地中の抗体力価を、抗ヒトIgGサンドイッチELISAで測定した。簡単に説明すると、抗体を、MaxiSorpマイクロタイタープレート(NuncTM、Sigma-Aldrich)に結合した抗ヒトFc抗体で細胞培養液から捕捉し、捕捉抗体とは異なるエピトープに結合する抗ヒトFc 抗体がPODコンジュゲートで検出した。二次抗体を、BM化学発光ELISA基質(POD)(Sigma-Aldrich)を用いた化学発光によって定量した。
実施例4
FACSスクリーニング
FACS解析を実施して、トランスフェクション効率およびトランスフェクションのRMCE効率を調べた。トランスフェクトされたアプローチの4×10E5細胞を遠心分離し(1200rpm、4分)、1mL PBSで2回洗浄した。PBSを用いる洗浄工程の後、沈殿物を400μLのPBSに再懸濁し、FACSチューブ(セルストレーナーキャップ付きのFalcon(登録商標)丸底チューブ、Corning)に移した。FACS CantoIIを用いて測定を実施し、ソフトウェアFlowJoを用いてデータを解析した。
実施例5
フェッドバッチ培養
フェッドバッチ生産培養は、独自の化学的に定義された培地を含む振盪フラスコまたはAmbr15容器(Sartorius Stedim)で実施した。細胞を0日目に1×10E6細胞/mlで播種し、3日目に温度を変化させた。3、7、および10日目に、培養物に独自のフィード培地を加えた。Cedex HiRes機器(Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ)を使用して、0、3、7、10、および14日目に、培養物中の細胞の生細胞数(VCC)および生存率パーセントを測定した。グルコース、ラクテート、および製品力価の濃度を、Cobas Analyzer(Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ)を使用して、3,5,7,10,12、および14日目に測定した。フェッドバッチ開始後14日目に、遠心分離(10分、1000rpmおよび10分、4000rpm)によって上清を採取し、濾過(0.22μm)によって清澄化した。UV検出を伴うプロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して、14日目の力価を測定した。製品品質をCaliperのLabChip(Caliper Life Sciences)によって決定した。
実施例6
CRE mRNA標的指向性組込みは、CHOプールにおける陽性クローンの数の増加をもたらす
複合抗体フォーマットの生産のためのCHOプールを、CREプラスミドまたはCRE mRNAのいずれかを用いて作製した。選択期間の前後に、CHOプールにおけるクローンの絶対数を、クローンに特異的なタグを使用して測定した。このクローンに特異的なタグは、標的指向性組込み技術の一部であり、プールサイズおよび異質性の同定を可能するディープシークエンシングを使用して読み取られる。選択期間の後、CRE mRNA作製CHOプールにおけるクローンの絶対数は、CREプラスミド作製CHOプールにおけるよりも有意に大きい。よって、CREプラスミドの代わりにCRE mRNAを使用することによって、より大きなサイズで異質性が高いCHOプールが生産され、それにより、より高い力価と製品品質を有するCHOクローンを発見する可能性が高くなる。さらに、CRE mRNA作製CHOプールからのクローン数の増加は、CREプラスミド作製CHOプールからのクローンと比較して、安定している。

Claims (16)

  1. ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつ前記ポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、該方法が、
    a)前記哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの第1の選択マーカーを含むヌクレオチド配列に隣接する第1および第2の組換え認識配列、ならびに前記第1の組換え認識配列と前記第2の組換え認識配列の間に位置する第3の組換え認識配列を含み、前記組換え認識配列がすべて異なり、前記哺乳動物細胞が、CreリコンビナーゼをコードするDNAを含まず、かつ、該哺乳動物細胞がCHO細胞である、哺乳動物細胞を提供する工程;
    b)a)で提供された細胞に、3つの異なる組換え認識配列および1から8つの発現カセットを含む2つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程であって、
    第1のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
    - 第1の組換え認識配列と、
    - 1つまたは複数の発現カセットと、
    - 1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの5’末端部分と、
    - 第3の組換え認識配列の第1のコピーと、
    を含み、かつ、
    第2のデオキシリボ核酸が、5’から3’の方向に、
    - 前記第3の組換え認識配列の第2のコピーと、
    - 前記1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの3’末端部分と、
    - 1つまたは複数の発現カセットと、
    - 第2の組換え認識配列と、
    を含み、
    前記第1および第2のデオキシリボ核酸の前記第1~第3の組換え認識配列が、組み込まれている前記外因性ヌクレオチド配列の前記第1~第3の組換え認識配列と一致しており、
    前記1つの第2の選択マーカーをコードする前記発現カセットの5’末端部分および3’末端部分が、まとまると、前記1つの第2の選択マーカーの機能的発現カセットを形成し、
    前記デオキシリボ核酸が、CreリコンビナーゼをコードするDNAを含まない、
    2つのデオキシリボ核酸の組成物を細胞に導入する工程;
    c)CreリコンビナーゼmRNAを、Creリコンビナーゼの唯一の供給源として、b)の前記第1および第2のデオキシリボ核酸と同時にトランスフェクトする工程であって、
    前記Creリコンビナーゼが、前記第1および第2のデオキシリボ核酸の前記組換え認識配列を認識する(かつ、任意で、前記Creリコンビナーゼの1つまたは複数が、2つのリコンビナーゼ媒介カセット交換を行う)、
    CreリコンビナーゼmRNAをトランスフェクトする工程;ならびに、
    d)前記第2の選択マーカーを発現しかつ前記ポリペプチドを分泌する細胞を選択する工程
    を含み、それによって、前記ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつ前記ポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞が生産される、方法。
  2. 前記Cre mRNAが、配列番号12のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項1に記載の方法。
  3. 前記Cre mRNAが、配列番号13のヌクレオチド配列またはそのコドン使用最適化バリアントを含む、請求項1に記載の方法。
  4. 前記デオキシリボ核酸の厳密に1つのコピーが、単一の部位または遺伝子座で、前記哺乳動物細胞のゲノム内に安定して組み込まれる、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ポリペプチドをコードする前記デオキシリボ核酸が、少なくとも4つの発現カセットを含み、ここで、
    - 第1の組換え認識配列が、最も5’側の(すなわち、第1の)発現カセットの5’側に位置しており、
    - 第2の組換え認識配列が、最も3’側の発現カセットの3’側に位置しており、
    - 第3の組換え認識配列が、
    - 前記第1の組換え認識配列と前記第2の組換え認識配列との間、かつ
    - 前記発現カセットのうちの2つの間
    に位置しており、
    前記組換え認識配列がすべて異なる、
    請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ポリペプチドをコードする前記デオキシリボ核酸が、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ポリペプチドをコードする前記デオキシリボ核酸が、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含み、前記選択マーカーをコードする前記発現カセットは、前記第3の組換え認識配列の5’側に一部が、3’側に一部が位置しており、前記発現カセットの、前記5’側に位置する部分が、プロモーターおよび開始コドンを含み、前記発現カセットの、前記3’側に位置する部分が、開始コドンのないコード配列およびポリAシグナルを含み、前記開始コドンが、前記コード配列に作動可能に連結される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記第1のデオキシリボ核酸が第1のベクターに組み込まれ、前記第2のデオキシリボ核酸が第2のベクターに組み込まれ、かつ、Cre mRNAと第1および第2のベクターの混合物との間の重量比が、1:3から2:1の範囲にある、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記第1のデオキシリボ核酸が第1のベクターに組み込まれ、前記第2のデオキシリボ核酸が第2のベクターに組み込まれ、かつ、Cre mRNAと第1および第2のベクターの混合物との間の重量比が、1:5である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記発現カセットのそれぞれが、5’から3’の方向に、プロモーターと、コード配列と、ポリアデニル化シグナル配列と、任意で続いてターミネーター配列とを含み、前記プロモーターが、イントロンAを有するヒトCMVプロモーターであり、前記ポリアデニル化シグナル配列がbGHポリアデニル化シグナル配列であり、かつ前記ターミネーターがhGTターミネーターであり、ただし例外として前記選択マーカーの前記発現カセットでは、前記プロモーターがSV40プロモーターであり、前記ポリアデニル化シグナル配列がSV40ポリアデニル化シグナル配列であり、かつ前記ターミネーターが存在しない、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ポリペプチドが、第1の抗体重鎖と、第2の抗体重鎖と、第1の抗体軽鎖と、第2の抗体軽鎖とを含むヘテロ四量体であり、前記デオキシリボ核酸が、4つの発現カセットを含み、
    - 前記第1の抗体重鎖が、N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、第1の軽鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含み、
    - 前記第2の抗体重鎖が、N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含み、
    - 前記第1の抗体軽鎖が、N末端からC末端に向けて、第2の重鎖可変ドメインとCLドメインとを含み、
    - 前記第2の抗体軽鎖が、N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含み、
    前記第1の重鎖可変ドメインおよび前記第2の軽鎖可変ドメインが、第1の結合部位を形成し、前記第2の重鎖可変ドメインおよび前記第1の軽鎖可変ドメインが、第2の結合部位を形成する、
    請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ポリペプチドが、第1の抗体重鎖と、第2の抗体重鎖と、第1の抗体軽鎖と、第2の抗体軽鎖とを含むヘテロ四量体であり、前記デオキシリボ核酸が、4つの発現カセットを含み、
    - 前記第1の抗体重鎖が、N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含み、
    - 前記第2の抗体重鎖が、N末端からC末端に向けて、第1の軽鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含み、
    - 前記第1の抗体軽鎖が、N末端からC末端に向けて、第2の重鎖可変ドメインとCLドメインとを含み、
    - 前記第2の抗体軽鎖が、N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含み、
    前記第1の重鎖可変ドメインおよび前記第2の軽鎖可変ドメインが、第1の結合部位を形成し、前記第2の重鎖可変ドメインおよび前記第1の軽鎖可変ドメインが、第2の結合部位を形成する、
    請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記ポリペプチドが、第1の抗体重鎖と、第2の抗体重鎖と、第1の抗体軽鎖と、第2の抗体軽鎖とを含むヘテロ四量体であり、前記デオキシリボ核酸が、4つの発現カセットを含み、
    - 前記第1の抗体重鎖が、N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインと、ペプチドリンカーと、第2の重鎖可変ドメインと、CLドメインとを含み、
    - 前記第2の抗体重鎖が、N末端からC末端に向けて、第1の重鎖可変ドメインと、CH1ドメインと、ヒンジ領域と、CH2ドメインと、CH3ドメインとを含み、
    - 前記第1の抗体軽鎖が、N末端からC末端に向けて、第1の軽鎖可変ドメインとCH1ドメインとを含み、
    - 前記第2の抗体軽鎖が、N末端からC末端に向けて、第2の軽鎖可変ドメインとCLドメインとを含み、
    前記第2の重鎖可変ドメインおよび前記第1の軽鎖可変ドメインが、第1の結合部位を形成し、前記第1の重鎖可変ドメインおよび前記第2の軽鎖可変ドメインが、第2の結合部位を形成する、
    請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
  14. 第1のリコンビナーゼ認識配列がL3であり、第2のリコンビナーゼ認識配列が2Lであり、第3のリコンビナーゼ認識配列がLoxFasである、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 組換え哺乳動物細胞の数を増加させるためのCreリコンビナーゼmRNAの使用であって、前記細胞が、標的指向性組込みによって前記細胞のゲノム内の単一の部位に安定して組み込まれた目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードするデオキシリボ核酸を含み、該細胞が、哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含み、該外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの第1の選択マーカーを含むヌクレオチド配列に隣接する第1および第2の組換え認識配列、ならびに前記第1の組換え認識配列と前記第2の組換え認識配列の間に位置する第3の組換え認識配列を含み、前記組換え認識配列がすべて異なり、該細胞が、5’から3’の方向に、第1の組換え認識配列、1つまたは複数の発現カセット、1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの5’末端部分、および第3の組換え認識配列の第1のコピーを含む、第1のデオキシリボ核酸;5’から3’の方向に、前記第3の組換え認識配列の第2のコピー、前記1つの第2の選択マーカーをコードする発現カセットの3’末端部分、1つまたは複数の発現カセット、および第2の組換え認識配列を含む、第2のデオキシリボ核酸;ならびに、Creリコンビナーゼの唯一の供給源としてのCreリコンビナーゼmRNAの同時の導入により取得され、かつ、該哺乳動物細胞がCHO細胞である、使用。
  16. 前記組換え細胞がさらに、培養培地中での培養時に、前記目的のポリペプチドを前記培養培地中に分泌する、請求項15に記載の使用。
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