CN117305334A - 靶向整合细胞及其制备方法、生产目标基因表达产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种靶向整合细胞及其制备方法、生产目标基因表达产物的方法，所述靶向整合细胞，其包含SEQ ID No.1所示的核酸片段且所述核酸片段内整合外源核苷酸序列。本发明经过前期大量的筛选，发现对应如SEQ ID No.1所示的核酸片段，将外源核苷酸序列整合到该核酸片段内，对应得到的靶向整合细胞具有稳定且高产的特点。

Description

靶向整合细胞及其制备方法、生产目标基因表达产物的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及靶向整合细胞及其制备方法、生产目标基因表达产物的方法。
背景技术
随着生物制药产业的不断发展，对产物表达量及表达稳定性的要求逐渐增高，而细胞系构建是决定产物表达产量及表达稳定性的关键因素。
传统细胞系的构建策略主要是随机整合编码目标多肽的核苷酸序列，这种方法具有多个不足之处，包括：
从构建工艺方面讲，将目标基因转染入CHO细胞后，经过一段时间的压力筛选，目标基因会逐渐整合到宿主细胞基因组内，由于整合频率较低、随机性强，所得筛选群体(即细胞池)呈现复杂的多样性，可能导致各种各样的基因表达和细胞生长表型，被称为“位置效应变异”。并且，需要通过大量的单克隆盲选、扩增最终确定高产、稳定的细胞株，这种方式对每一个细胞池都需要大量的筛选工作，后续还需针对每一株细胞进行工艺开发和培养基优化，耗费大量的重复性劳动，造成资源的浪费，成本高。
从制备细胞系质量讲，基于传统随机整合策略获得的细胞系，在培养过程中(特别是培养后期)，其表达稳定性难以预测。并且，随机整合位点的信息不明确，外源目标基因整合的位点效应也会导致目标基因的表达水平显著下降。尽管利用高严谨性选择系统例如GS(谷氨酰胺合成酶)基因表达系统富集高产细胞系可以产生基因扩增并增加基因拷贝数，但有时会导致不稳定的细胞生长和/或产物表达。
利用稳定且高表达目标基因的靶向整合细胞位点，将目标基因定点整合入靶向整合细胞，能够提升整合过程的可控性和重复性，利于目标基因的稳定高产表达，也能够简化后续筛选及工艺开发等步骤。因此，开发一种外源核苷酸序列定点整合的靶向整合细胞是必要的。
发明内容
基于此，本发明的目的包括提供一种靶向整合细胞，其包含SEQ ID No.1所示的核酸片段且所述核酸片段内整合外源核苷酸序列。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
在本发明的第一方面，提供一种核酸，所述核酸包含SEQ ID No.1所示的核酸片段，所述核酸片段内整合有外源核酸片段。
在本发明的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第100-3000个碱基区间内的任意位点。
在本发明的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第150-2820个碱基区间内的任意位点。
在本发明的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第324-2688个碱基区间内的任意位点。
在本发明的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第480-2460个碱基区间内的任意位点。
在本发明的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第700-2200个碱基区间内的任意位点。
在本发明的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第976-1900个碱基区间内的任意位点。
在本发明的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第1260-1879个碱基区间内的任意位点。
在本发明的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第1561-1800个碱基区间内的任意位点。
在本发明的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第1678-1744个碱基区间内的任意位点。
在本发明的一些实施方式中，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第1701-1720个碱基区间内的任意位点。
在本发明的一些实施方式中，所述外源核酸片段包含：重组酶识别的第一重组识别序列和第二重组识别序列，位于所述第一重组识别序列和所述第二重组识别序列之间的选择标记基因和目标基因，以及调控所述选择标记基因和所述目标基因表达的启动子。
在本发明的一些实施方式中，所述重组酶为Bxb1整合酶、ΦC31整合酶、Cre重组酶或者FLP重组酶。
在本发明的一些实施方式中，所述第一重组识别序列和所述第二重组识别序列独立地选自如下序列中的一种或者多种：LoxP序列、LoxPL3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、attP序列和attB序列。
在本发明的一些实施方式中，所述选择标记基因选自新霉素抗性基因、胸苷激酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、胸苷激酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、天冬酰胺合成酶基因、色氨酸合成酶基因、组氨醇脱氢酶基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因、色氨酸合成酶基因和荧光蛋白基因中的一种或者多种。
在本发明的一些实施方式中，所述启动子为CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子、β-globin启动子、UBC启动子、EF1a启动子、泛素启动子、β-actin启动子、PGK1启动子、Rosa26启动子、HSP70启动子、GAPDH启动子、Eif4A1启动子、Egr1启动子、FerH启动子、SM22α启动子或者Endothelin-1启动子。
在本发明的一些实施方式中，所述目标基因编码抗体、重组蛋白、多肽、酶、激素、生长因子和受体中的一种或者多种。
在本发明的第二方面，提供一种重组载体，所述重组载体包含：
a.与SEQ ID No.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的5’同源臂，
b.目标基因，
c.与SEQ ID No.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的3’同源臂。
在本发明的一些实施方式中，所述重组表达载体为慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体、乳头瘤病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体、整合性噬菌体载体、非病毒载体、转座子和/或转座酶、整合酶底物或者质粒。
在本发明的第三方面，提供一种靶向整合细胞，所述靶向整合细胞包含第一方面所述的核酸。
在本发明的一些实施方式中，所述靶向整合细胞为真核细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述真核细胞为哺乳动物细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述靶向整合细胞包括中国仓鼠卵巢CHO细胞、人胚肾HEK293细胞。
在本发明的第四方面，提供第三方面所述的靶向整合细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
将第一方面所述的核酸导入细胞，或者提供包含SEQ ID No.1所示的核酸片段的细胞并将所述外源核酸片段整合至所述核酸片段内，制备靶向整合细胞。
在本发明的第五方面，提供生产目标基因表达产物的方法，所述方法包括如下步骤：培养第三方面所述的靶向整合细胞，收集目标基因表达产物。
相对于传统技术，本发明具备如下有益效果：
本发明经过前期大量的筛选，发现对应如SEQ ID No.1所示的核酸片段或者与其保持至少90％一致性的同源片段，将外源核苷酸序列(包括目标基因等)整合到该核酸片段或其同源片段内，对应得到的靶向整合细胞具有稳定且高产的特点。
并且，本发明靶向整合细胞基于其稳定、高产的特点，对后续培养工艺(例如培养条件、培养基配方)要求不高。
同时，本发明提供靶向整合细胞，外源核苷酸序列插入位点确定，因此相对于传统随机整合的细胞构建方法，本发明靶向整合细胞所需的构建工艺简单，耗时缩短，效率提升，成本降低，并且不确定性降低，重复性好，可控性强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案、更完整地理解本发明及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1的操作流程图；
图2为实施例1用于位点筛选的RMCE示意图；
图3为实施例1用于位点筛选的重组质粒图谱；
图4为GBB-01荧光母细胞生长稳定性结果图；
图5为实施例1用于目标基因转染的RMCE示意图；
图6为实施例1用于目标基因转染的重组质粒图谱；
图7为实施例1制备的靶向整合细胞的目标基因流加培养表达量评估结果图；
图8为实施例1制备的靶向整合细胞表达量稳定性评估结果图；
图9为实施例1制备的靶向整合细胞比产率稳定性评估结果图；
图10为实施例1制备的靶向整合细胞糖谱与随机整合对照细胞产品糖谱对比图；
图11为实施例1制备的靶向整合细胞与随机整合对照细胞产品电荷异质性对比图；
图12为实施例1制备的靶向整合细胞整合位点验证图。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本发明的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1-10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
在本发明提及的所有文献都在本发明中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本发明的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本发明中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本发明中的描述相冲突时，以本发明为准或者适应性地根据本发明的描述进行修正。
本发明中，“约”或“大约”意指在如通过本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其部分取决于如何测量或确定所述值，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在3个或超过3个标准差内。可替代地，“约”可以意指给定值的至多20％、优选至多10％、更优选至多5％、以及又更优选至多1％的范围。可替代地，特别是关于生物系统或过程，所述术语可以意指在值的一个数量级内，优选在5倍内，并且更优选在2倍内。
本发明中，“选择标记基因”可以是如下基因，所述基因允许在存在相应的选择剂的情况下，携带所述基因的靶向整合细胞可对于或针对所述基因而被特异性地选择。例如但非限制性地，选择标记可以允许在存在所述基因的情况下，用选择标记基因转化的靶向整合细胞被阳性选择；非转化的靶向整合细胞将不能在选择条件下生长或存活。选择标记可以是阳性、阴性或双功能的。阳性选择标记可以允许选择携带标记的细胞，而阴性选择标记可以允许携带标记的细胞被选择性地消除。选择标记可以赋予对药物的抗性或补偿靶向整合细胞中的代谢或分解代谢缺陷。
本发明中，“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、半抗体和抗体片段，只要所述片段展现出所需的抗原结合活性。如本文所用，术语“抗体片段”是指除了完整抗体以外的包含完整抗体中结合完整抗体所结合抗原的一部分的分子。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。有关某些抗体片段的综述，参见Holliger和Hudson,NatureBiotechnology 23:1126-1136(2005)。
本发明中，术语“靶向整合细胞”是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。靶向整合细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括具有与针对初始转化细胞中所筛选或选择的相同的功能或生物活性的突变体后代。
本发明中，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的靶向整合细胞的基因组中的载体。在某些实施方案中，载体引导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
本发明中，术语“同源片段”是指如通过序列比对所确定共有显著序列相似性的序列片段。例如，两个序列片段可以是约50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、或99.9％同源的。比对是通过算法和计算机程序(包括但不限于BLAST、FASTA和HMME)进行的，所述比对比较序列片段并基于因素(如序列长度、序列身份和相似性、以及序列错配和空位的存在和长度)来计算匹配的统计显著性；例如可以是相似序列片段长度与对齐区域长度的比值。同源序列片段可以指DNA和蛋白质序列二者。
当前公开的主题提供了适合于外源核苷酸序列的靶向整合细胞。在某些实施方案中，靶向整合细胞包含在宿主细胞的基因组上的整合位点处整合的外源核苷酸序列。“整合位点”包含靶向整合细胞基因组内的核酸序列，在所述核酸序列中插入外源核苷酸序列。在某些实施方案中，整合位点是在靶向整合细胞基因组上的两个相邻核苷酸之间。在某些实施方案中，整合位点包括核苷酸延伸段，可以在任何所述核苷酸之间插入外源核苷酸序列。
本发明的第一方面
本发明提供一种核酸，所述核酸包含SEQ ID No.1所示的核酸片段，所述核酸片段内整合有外源核酸片段。
SEQ ID No.1:
gattggccccagagaagcacagagagccaagggaggcttcccgattataaaaaaaaatgctgccttccaaggctagtcctgctcacttcttttgggtctcagggttaagctctgccattcctgttagtcacaaacaaattaagtcagtaacagcaacacatcttgcttgagtttgaagacaagccaatgacacacatagtttccagaagaccctctcccaggactccctatagcaggagcgtgtgggagagagccaatgacttatcagtcacctactacaccacccctttttacagtttctgcagccaacagctgcaccctccttaacagtctgcatttctctcttttccggtctgttgtgttctttcctagttggagatgctacctgtttttgtttgaattacttactggaatagacaagtaaaggtctctttgtccttagactcatcaccctctctgctacagcatgcttaaaaaaaaaaaaagtttgatcatgttatttatttgttaaaaatatttggctcttctccaaagcattgaggctgaaattgaaagtctttctgtagagtggcaaaatgaaaatgtcaacagactttttataagtctttttctagaagggtgtagaagaccccagaccacaggtaactgcttctttattatcttcttgcggcaatagaagagagtgggccttctggaacacaaactatgtggctagacagaaagatcaggtccctaaggccaaagcttggcctggaagcttccatctgggtcatgttgtaaggtgaactgaagttttatcctctaaaattcatatgtccaaattgtgatgcctggtgtgatggaattaggaggagggactctttaaggaatagtattagatcatggtgtagggcccttgggagtaaaggcttttattaaaggggtcacaggtagccttctagccttcctgcatgtgagcttatgctgagaagtgggaagggtgtcctccttcatatagacatctgtttttgaaccttcagtttcatggaactgagagaaatagtttgtggttcataaggcagacagtgtattttgttcaacagccaggcctgagcaaagctcctaataaaatattgaatttccagttaaccttcagtttcaggaaacaatgactaacttttgagattgtattttatgtaacatttatgggtctgaagtccaacttttactaggtatcctgtatctttttatctgccaaatatgataacctcataccagtatggggtggaaggtgaggctgaggacagtgaccaaggaggagaaatctgagctccagcaaaaggactgccagttaaatgtgacagataacaaaggtccacttagctccatctagaaaaacctccagaataaaagagaaatgacaacaatggcaaaaatatggcatgaagaaaatgggactaatacctgatagtaggtaacagatttcaaaacattttggatcatagaaaataacatataaatgggaactaattagcatagtgctggtaggggtgttgacaagaagagacacctattaagcagactctagaaaggcagctgggggtgacaaagtaacaaaataatgcagccacactaagatggcaaatgccactcaactatacatttcaaatagttaaggtggtgaattaagcagtaaatattttaccacaactgatagtgtaagaaaacaaactgaagtagatagtcacccacaccagagacaaagacagaaggctaaaacctcctggggaaggaagaggtctcagatcaagaattagacacagctctgactcaagccacggggaacagttgggaaatcccttcacagttctgtgggaaaaatacttccagacaagaactttatctcatggcaagctatcaaggatatcacctgcaagtgtagattgaagacatgaaggcaggattagtgtcccaggaggatatgccaaggcaatagaaggccaaacaaagctggctacctcagcttggccttgctatcactgcttcaacccttgagtccctagccccagatacattacacttggacacttaaggtctcaagtgttacaagtacagcggtccttgctctcacaggtaagcactagggataccagaaatgctaacatgtggagttgtctctttaatggaagagatttataacctgttttctcccagaagcctgagaatggaggtggctaatagccttaagtgatccttgttttatctgtatgaccagggactcccccaagctcccacaactaggatttgaggtggccaatagtctaggtgacttctgtgctatcctgtatgaccaagaccataccagattctccccctaggcccttaagataacacaggtagcccatctttagaatccatccttatggaagaagcaccatgtactttgagaagagttttgatgtgattatgcttccttgtatacaggggattgtgttatagtagaaaacttttctccaaattgtactgtacctcaatatgcctaaaataaacagcctggcatcagactctagaagtttgaaccaacattagctactgagatgtgttgaaccagatttccttcttgccttcatggattgttactctgcttttcatagatgtccgcattcaagaatccctgcctcataacatcactgctcaccagctaatagaattggctatcataccttctacccagtgaatagaccaaggttcattaccatttataccatcccatttcatccgtcaacttatcccttttttttttttctgatgtctgatggggaatccaagtctcaggtaggaatctgttgggcagataaacataaaggccttcagaaaccaataatgttactgagaattgtagctatagaaagggaaaggtctccacattgagactggatgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgttgggagggagggggagttcatttttaatttctcccaagaagcagaatgcattcattcattcagttgaagcattttgtgtactatgtttacactctactagaattatgtggactattagataatggcttctgctatctaattccattaactttacttttttaaggaaaaatttgtgtaataaatcaatattaaaacagctttatt
在本发明的一些实施方式中，所述外源核酸片段被整合入的序列片段与所述SEQID No.1所示的核酸片段保持不低于90％的一致性，例如90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的一致性。
在本发明的一些实施例中，所述外源核酸片段的整合位点可以为所述核酸片段的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、……1679、1680、1681、1682、1683、1684、1685、1686、1687、1688、1689、1690、1691、1692、1693、1694、1695、1696、1697、1698、1699、1700、1701、1702、1703、1704、1705、1706、1707、1708、1709、1710、1711、1712、1713、1714、1715、1716、1717、1718、1719、1720、1721、1722、1723、1724、1725、1726、1727、1728、1729、1730、1731、1732、1733、1734、1735、1736、1737、1738、1739、1740、1741、1742、1743、1744……3145、3146、3147、3148、3149、3150个碱基。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第100-3000个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第150-2820个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第324-2688个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第480-2460个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第700-2200个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第976-1900个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第1260-1879个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第1561-1800个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第1678-1744个碱基区间内的任意位点。
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第1701-1720个碱基区间内的任意位点。
优选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第1711个和第1712个碱基之间。
在本发明的一些实施方式中，所述外源核酸片段包含：重组酶识别的第一重组识别序列和第二重组识别序列，位于所述第一重组识别序列和所述第二重组识别序列之间的选择标记基因和目标基因，以及调控所述选择标记基因和所述目标基因表达的启动子。
在本发明的一些实施方式中，所述重组酶为Bxb1整合酶、ΦC31整合酶、Cre重组酶或者FLP重组酶。
在本发明的一些实施方式中，所述第一重组识别序列和所述第二重组识别序列独立地选自如下序列中的一种或者多种：所述重组识别序列为LoxP序列、LoxPL3序列、LoxP2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、attP序列和attB序列。
在本发明的一些实施方式中，所述选择标记基因选自新霉素抗性基因、胸苷激酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、胸苷激酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、天冬酰胺合成酶基因、色氨酸合成酶基因、组氨醇脱氢酶基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因、色氨酸合成酶基因和荧光蛋白基因中的一种或者多种。
在本发明的一些实施方式中，所述启动子为CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子、β-globin启动子、UBC启动子、EF1a启动子、泛素启动子、β-actin启动子、PGK1启动子、Rosa26启动子、HSP70启动子、GAPDH启动子、Eif4A1启动子、Egr1启动子、FerH启动子、SM22α启动子或者Endothelin-1启动子。
在本发明的一些实施方式中，所述目标基因编码抗体、重组蛋白、多肽、酶、激素、生长因子和受体中的一种或者多种。
本发明的第二方面
本发明提供一种重组载体，所述重组载体包含：
a.与SEQ ID No.1所示的核酸片段或者与所述核酸片段保持至少90％一致性的同源片段中所存在的序列片段同源的5’同源臂，
b.目标基因，
c.与SEQ ID No.1所示的核酸片段或者与所述核酸片段保持至少90％一致性的同源片段中所存在的序列片段同源的3’同源臂。
在本发明的一些实施方式中，所述重组表达载体为慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体、乳头瘤病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体、整合性噬菌体载体、非病毒载体、转座子和/或转座酶、整合酶底物或者质粒。
本发明的第三方面
本发明提供一种靶向整合细胞，所述靶向整合细胞包含第一方面所述的核酸。
在本发明的一些实施方式中，所述靶向整合细胞为真核细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述真核细胞为哺乳动物细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢CHO细胞、人胚肾HEK293细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述CHO细胞包括CHO宿主细胞、CHO K1宿主细胞、CHO K1SV宿主细胞、DG44宿主细胞、DUKXB-11宿主细胞、CHOK1S宿主细胞或者CHO K1M宿主细胞。
本发明的第四方面
本发明提供第三方面所述的靶向整合细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
将第一方面所述的核酸导入细胞，或者提供包含SEQ ID No.1所示的核酸片段或者与所述核酸片段保持至少90％一致性的同源片段的细胞并将所述外源核酸片段整合至所述SEQ ID No.1所示的核酸片段或者与所述核酸片段保持至少90％一致性的同源片段内，制备靶向整合细胞。
在本发明的一些实施方式中，整合的方式包括但不限于同源重组技术衍生的位点特异性重组技术，依靠针对特异识别位点的整合酶，在基因组和外源DNA间实现基因置换、基因敲出及敲入等基因工程操作，例如可以是重组酶介导的盒式交换，例如可以是CRISPR/Cas9介导的基因靶向整合。
本发明的第五方面
本发明提供一种生产目标基因表达产物的方法，所述方法包括如下步骤：培养第三方面所述靶向整合细胞，收集目标基因表达产物。
在本发明的一些实施方式中，依照本法的靶向整合细胞具备稳定、高产的特点。
在本发明的一些实施方式中，可以通过实验来鉴定整合位点和/或侧接整合位点的核苷酸序列：在本发明的一些实施方式中，可以通过全基因组筛选方法来鉴定整合位点和/或侧接整合位点的核苷酸序列以分离宿主细胞；在本发明的一些实施方式中，可以在基于转座酶的盒整合事件之后通过全基因组筛选方法来鉴定整合位点和/或侧接整合位点的核苷酸序列；在本发明的一些实施方式中，可以通过强力(brute force)随机整合筛选来鉴定整合位点和/或侧接整合位点的核苷酸序列；在本发明的一些实施方式中，可以通过常规测序方法(如靶基因座扩增)，之后进行下一代测序和全基因组来确定整合位点和/或侧接整合位点的核苷酸序列；在本发明的一些实施方式中，可以通过常规细胞生物学方法(如荧光原位杂交分析)来确定染色体上整合位点的位置。
具体实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
下述的具体实施例中的耗材涉及：细胞电转仪专用重悬缓冲液NeonResuspension Buffer R(ThermoFisher)，电击液E(ThermoFisher)，恢复培养基EX-CELLAdvanced CHO Fed-batch Medium(Sigma-Aldrich)，扩增培养基为EX-CELLAdvancedCHO Fed-batch Medium加200μg/ml hygromycin(ThermoFisher)和1％GlutaMAX(ThermoFisher)，摇瓶培养基为EX-CELLAdvanced CHO Fed-batch Medium加1％GlutaMAX，流加培养基中基础培养基使用100％EX-CELLAdvanced CHO Fed-batch Medium，补料培养基为4％Cell Boost 7a/7b(HyClone)。
实施例1
本实施例的操作流程参见图1，主要包括如下步骤：
(1)将绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选的标记基因，利用Attp序列作为同源臂，构建一个包含RMCE(图2)的重组质粒，见图3；
(2)将构建好的质粒扩增、线性化后，用于转染；
(3)取3×10E6个CHO细胞到50mL离心管，1000rpm室温离心5min，弃上清；
(4)用5mL Ex-Cell Advanced CHO Fed-batch培养基清洗细胞，1000rpm室温离心5min，弃上清；
(5)用细胞电转仪专用重悬缓冲液100μL重悬细胞；
(6)取线性化后质粒15μg到步骤(5)重悬细胞中，轻柔混匀，吹打50次，避免产生气泡；
(7)打开细胞电转仪，调节参数，电机槽装入电转仪，槽中加入3mL电击液E；
(8)将步骤(6)细胞质粒混悬液吸入电转枪头，装入电击槽中，进行电击；
(9)将电转后的细胞立即转入加有2mL恢复培养基的6孔板转入37℃5％CO2培养箱过夜培养；
(10)电转48h后进行加压筛选，细胞每2-3天传代一次，细胞活率先降低后上升，当细胞活率大于90％时，该细胞为稳定的细胞池；
(11)将稳定细胞池细胞利用流式细胞分选筛选高荧光细胞，获取最高荧光的1％细胞；
(12)富集后细胞利用精准挑选系统荧光排序后进行精准挑选，完成单克隆化；
(13)单克隆的荧光细胞，进行扩增培养，形成细胞株，并在摇瓶阶段进行荧光检测，保留高荧光细胞株，记作GBB-01细胞；
(14)上述高荧光细胞株进行90天左右的传代稳定性研究，确认荧光值变化较小并且细胞株生长稳定的细胞为稳定高荧光细胞，图4显示GBB-01细胞90天传代生长稳定，表1显示GBB-01细胞荧光表达稳定；
表1
平均荧光值 荧光细胞占比(％)
P3(第10天) 25.5 100
P26(第91天) 22.3 100
(15)参照步骤(1)，将目标基因(Fc融合蛋白)片段克隆入质粒中，构建一个包含RMCE(图5)的重组质粒，见图6；
目标基因片段具有SEQ ID No.2所示的序列，SEQ ID No.2：
cacggcgagggcaccttcaccagcgatgtctcctcttacctggaagagcaggccgctaaagagttcatcgcctggctggtgaagggaggaggcggcggcggaggctctggcggaggcggctccggcggcggtggctccgctgagtccaaatacggccctccatgtcctccttgccctgctcctgaggctgctggcggaccctccgtgttcctgttccctcccaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccctgaagtgacctgtgtggtcgtggacgtgtctcaagaggaccctgaggtgcagtttaactggtacgtggatggcgtggaagtacataacgccaagaccaagcctcgggaggaacagttcaactccacctacagagtggtgtctgtgctgacagtgctccaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtctccaacaagggcctgccttcctccatcgagaagaccatctctaaggccaagggccagcctagagagcctcaagtgtacaccctgcctccctctcaggaagagatgaccaagaatcaggtgagcctgacctgcctggtcaagggcttctacccttctgatatcgccgtggaatgggagtctaatggccagcccgagaacaactacaaaaccacaccacctgtgctggactccgacggctccttcttcctgtactccagactgaccgtggacaagtctagatggcaggagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactatacacagaagtccttg agcctgtctctgggctga
(16)选取步骤(14)稳定高荧光细胞GBB-01进行转染、整合验证，将上述步骤(15)重组质粒扩增、线性化后，与Bxb-1整合酶共转染入稳定高荧光细胞GBB-01，转染步骤如前述；
(17)转染2天后细胞池进行加压筛选，2周左右形成稳定细胞池；
(18)对细胞池中无荧光细胞比例进行统计，并在细胞活率恢复至90％以上后进行有限稀释法铺板，将细胞池单克隆化；
(19)单克隆细胞中无荧光细胞进行继续扩增(采用扩增培养基)，扩大到摇瓶阶段培养(采用摇瓶培养基)，并通过流加培养(采用流加培养基)进行表达量评估，定点整合的产品单拷贝细胞株(记作产品克隆-1或者GBB-01-H8)与同条件下培养的随机整合的3拷贝细胞株表达量比较结果见图7；
为考察靶向整合细胞产品克隆-1的稳定性，产品克隆-1连续传代90天左右进行稳定性评估，7天的批次培养(只有基础培养基培养)结果产品克隆-1细胞无论从表达量(图8)和比产率(图9)均显示出稳定和高产；
对靶向整合细胞部分质量属性进行了研究，从以下几个方面与随机整合方法[1]得到的细胞株表达产物进行对比：
结果显示质量属性接近，没有显著差异，见图10糖谱对比结果和图11电荷异质性对比结果；
对荧光、目标基因均高表达细胞株GBB-01-H8进行二代全基因组测序，获取整合位点在CHO上的注释信息如下：NC_048596:34375010位于基因间区。
整合目标基因后的NC_048596序列片段如SEQ ID No.3所示，SEQ ID No.3：
tgcagccacactaagatggcaaatgccactcaactatacatttcaaatagttaaggtggtgaattaagcagtaaatattttaccacaactgatagtgtaagaaaacaaaccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtcgactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtaggtttgtctggtcaaccaccgcggtctccgtcgtcaggatcatgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgggatccagatcttctagaaagcttggtaccgatatcatggaactgggcctgcggtgggtgtttctggtggccatcctggaaggcgtgcagtgccacggcgagggcaccttcaccagcgatgtctcctcttacctggaagagcaggccgctaaagagttcatcgcctggctggtgaagggaggaggcggcggcggaggctctggcggaggcggctccggcggcggtggctccgctgagtccaaatacggccctccatgtcctccttgccctgctcctgaggctgctggcggaccctccgtgttcctgttccctcccaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccctgaagtgacctgtgtggtcgtggacgtgtctcaagaggaccctgaggtgcagtttaactggtacgtggatggcgtggaagtacataacgccaagaccaagcctcgggaggaacagttcaactccacctacagagtggtgtctgtgctgacagtgctccaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtctccaacaagggcctgccttcctccatcgagaagaccatctctaaggccaagggccagcctagagagcctcaagtgtacaccctgcctccctctcaggaagagatgaccaagaatcaggtgagcctgacctgcctggtcaagggcttctacccttctgatatcgccgtggaatgggagtctaatggccagcccgagaacaactacaaaaccacaccacctgtgctggactccgacggctccttcttcctgtactccagactgaccgtggacaagtctagatggcaggagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcaca accactatacacagaagtccttgagcctgtctctgg。
用上述断点上游引物F(SEQ ID No.4):tgcagccacactaagatgg与产品所用质粒上产品基因下游引物R(SEQ ID No.5)：ccagagacaggctcaaggac扩增该产品细胞株基因组，得到符合理论大小(2876bp)的片段，如图12(GBB-01-H8泳道对应条带)所示。
将扩增出来的条带切胶回收，纯化，并设计多对引物进行DNA测序，测序结果拼接后序列如下所示，和理论序列一致(序列SEQ ID No.3)，从而证实目标基因正确整合入目标位点。
参考文献：
[1]Takeshi Omasa et al,.Cell engineering and cultivation of chinesehamster ovary(CHO)cells.Curr Pharm Biotechnol.2010Apr；11(3):233-40.
实施例2
(1)构建Cas9编辑质粒：
设计可以靶向SEQ ID No.1所示的核酸片段第1678-1744个碱基区间(ttttaccacaactgatagtgtaagaaaacaaactgaagtagatagtcacccacaccagagacaaag)具有较高剪切效率的sgRNA(SEQ ID No.6：gatagtcacccacaccagaggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc；GC＝55％，无二级)，双链合并退火。反应体系为正反向oligo各5μL，5μL 10×NEB buffer 2，用水补至50μL。体系于95℃(必须用温度计量取)孵育5min，之后自然降温至25℃。得到的产物质粒和PvuI酶切过的pDonor CRISPR/Cas9载体连接。连接产物转化于DH5α感受态中，涂于氨苄抗性的LB固体平板，次日挑取单克隆，并抽取质粒。最后通过一代测序验证得到正确的Cas9编码质粒。
(2)构建供体质粒：
供体质粒由5’同源臂、anti-PD1单克隆抗体编码基因，潮霉素编码基因和3’同源臂串联于pUC19质粒上构成。
(3)电穿孔转染Cas9编码质粒和anti-PD1供体质粒：
使用悬浮型的中国仓鼠卵巢癌细胞，即CHOK1细胞株。转染前一天将细胞密度调整为5×105个/mL。第二天使用电穿孔的方法进行转染，条件为电压1575V，脉冲时程10ms，脉冲个数3个，转染使用细胞培养的6孔板，3×106个细胞，培养基体积为2mL，所需质粒为15μg。转染完成后放置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。其中，加入Cas9编码质粒和anti-PD1供体质粒进行共转染可以得到定点整合细胞池，仅加入anti-PD1供体质粒转染可以得到表达anti-PD1的随机整合细胞池。
(4)加压筛选并富集定点整合的细胞池。
(5)5’/3’junction PCR初步鉴定定点整合细胞池，对扩增得到的目标片段测序，确定得到了定点整合细胞池后，收集上清。
(6)Western blot检测定点整合细胞池anti-PD1抗体的表达，确定得到了定点整合细胞池。随机整合细胞池在加药筛选3周后通过Western blot基本检测不到anti-PD1抗体的表达，而定点整合细胞池的anti-PD1抗体表达量较高。
(7)有限稀释法获得单克隆细胞株：将之前的定点整合细胞池通过有限稀释法获得单克隆细胞株。即将细胞池铺于96孔板，细胞密度为0.8个/孔。当天查板，确定单克隆。细胞生长约5周时，将单克隆细胞吸取1×106个并提取基因组DNA，再次进行5’/3’junctionPCR检测，方法同步骤(5)。将Junction PCR检测得到阳性细胞株进一步进行Western blot检测，判断anti-PD1抗体是否正确表达。
(8)定点整合细胞株anti-PD1抗体表达量的评估：靶向整合细胞株的anti-PD1抗体表达量约为随机整合细胞株表达量的2.3倍。
实施例3
表2
整合位点 靶向整合细胞株的anti-PD1抗体表达量(mg/L)
NC_048596:34373499 621
NC_048596:34374860 726
NC_048596:34375011 705
NC_048596:34375099 689
NC_048596:34376119 536
单拷贝随机整合的细胞株 285mg/L
依实施例1步骤构建靶向整合细胞，以单拷贝随机整合的细胞株为对照，于基础培养基中，6孔板批次培养的表达量见表2，其中单拷贝随机整合的细胞株anti-PD1抗体在6孔板批次培养表达量为285mg/L，而靶向整合细胞株的表达量为其2倍以上水平。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本发明的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 深圳太力生物技术有限责任公司
<120> 靶向整合细胞及其制备方法、生产目标基因表达产物的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3150
<212> DNA
<213> 中国仓鼠(Cricetulus barabensis)
<400> 1
gattggcccc agagaagcac agagagccaa gggaggcttc ccgattataa aaaaaaatgc 60
tgccttccaa ggctagtcct gctcacttct tttgggtctc agggttaagc tctgccattc 120
ctgttagtca caaacaaatt aagtcagtaa cagcaacaca tcttgcttga gtttgaagac 180
aagccaatga cacacatagt ttccagaaga ccctctccca ggactcccta tagcaggagc 240
gtgtgggaga gagccaatga cttatcagtc acctactaca ccaccccttt ttacagtttc 300
tgcagccaac agctgcaccc tccttaacag tctgcatttc tctcttttcc ggtctgttgt 360
gttctttcct agttggagat gctacctgtt tttgtttgaa ttacttactg gaatagacaa 420
gtaaaggtct ctttgtcctt agactcatca ccctctctgc tacagcatgc ttaaaaaaaa 480
aaaaagtttg atcatgttat ttatttgtta aaaatatttg gctcttctcc aaagcattga 540
ggctgaaatt gaaagtcttt ctgtagagtg gcaaaatgaa aatgtcaaca gactttttat 600
aagtcttttt ctagaagggt gtagaagacc ccagaccaca ggtaactgct tctttattat 660
cttcttgcgg caatagaaga gagtgggcct tctggaacac aaactatgtg gctagacaga 720
aagatcaggt ccctaaggcc aaagcttggc ctggaagctt ccatctgggt catgttgtaa 780
ggtgaactga agttttatcc tctaaaattc atatgtccaa attgtgatgc ctggtgtgat 840
ggaattagga ggagggactc tttaaggaat agtattagat catggtgtag ggcccttggg 900
agtaaaggct tttattaaag gggtcacagg tagccttcta gccttcctgc atgtgagctt 960
atgctgagaa gtgggaaggg tgtcctcctt catatagaca tctgtttttg aaccttcagt 1020
ttcatggaac tgagagaaat agtttgtggt tcataaggca gacagtgtat tttgttcaac 1080
agccaggcct gagcaaagct cctaataaaa tattgaattt ccagttaacc ttcagtttca 1140
ggaaacaatg actaactttt gagattgtat tttatgtaac atttatgggt ctgaagtcca 1200
acttttacta ggtatcctgt atctttttat ctgccaaata tgataacctc ataccagtat 1260
ggggtggaag gtgaggctga ggacagtgac caaggaggag aaatctgagc tccagcaaaa 1320
ggactgccag ttaaatgtga cagataacaa aggtccactt agctccatct agaaaaacct 1380
ccagaataaa agagaaatga caacaatggc aaaaatatgg catgaagaaa atgggactaa 1440
tacctgatag taggtaacag atttcaaaac attttggatc atagaaaata acatataaat 1500
gggaactaat tagcatagtg ctggtagggg tgttgacaag aagagacacc tattaagcag 1560
actctagaaa ggcagctggg ggtgacaaag taacaaaata atgcagccac actaagatgg 1620
caaatgccac tcaactatac atttcaaata gttaaggtgg tgaattaagc agtaaatatt 1680
ttaccacaac tgatagtgta agaaaacaaa ctgaagtaga tagtcaccca caccagagac 1740
aaagacagaa ggctaaaacc tcctggggaa ggaagaggtc tcagatcaag aattagacac 1800
agctctgact caagccacgg ggaacagttg ggaaatccct tcacagttct gtgggaaaaa 1860
tacttccaga caagaacttt atctcatggc aagctatcaa ggatatcacc tgcaagtgta 1920
gattgaagac atgaaggcag gattagtgtc ccaggaggat atgccaaggc aatagaaggc 1980
caaacaaagc tggctacctc agcttggcct tgctatcact gcttcaaccc ttgagtccct 2040
agccccagat acattacact tggacactta aggtctcaag tgttacaagt acagcggtcc 2100
ttgctctcac aggtaagcac tagggatacc agaaatgcta acatgtggag ttgtctcttt 2160
aatggaagag atttataacc tgttttctcc cagaagcctg agaatggagg tggctaatag 2220
ccttaagtga tccttgtttt atctgtatga ccagggactc ccccaagctc ccacaactag 2280
gatttgaggt ggccaatagt ctaggtgact tctgtgctat cctgtatgac caagaccata 2340
ccagattctc cccctaggcc cttaagataa cacaggtagc ccatctttag aatccatcct 2400
tatggaagaa gcaccatgta ctttgagaag agttttgatg tgattatgct tccttgtata 2460
caggggattg tgttatagta gaaaactttt ctccaaattg tactgtacct caatatgcct 2520
aaaataaaca gcctggcatc agactctaga agtttgaacc aacattagct actgagatgt 2580
gttgaaccag atttccttct tgccttcatg gattgttact ctgcttttca tagatgtccg 2640
cattcaagaa tccctgcctc ataacatcac tgctcaccag ctaatagaat tggctatcat 2700
accttctacc cagtgaatag accaaggttc attaccattt ataccatccc atttcatccg 2760
tcaacttatc cctttttttt ttttctgatg tctgatgggg aatccaagtc tcaggtagga 2820
atctgttggg cagataaaca taaaggcctt cagaaaccaa taatgttact gagaattgta 2880
gctatagaaa gggaaaggtc tccacattga gactggatgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 2940
gtgtgttggg agggaggggg agttcatttt taatttctcc caagaagcag aatgcattca 3000
ttcattcagt tgaagcattt tgtgtactat gtttacactc tactagaatt atgtggacta 3060
ttagataatg gcttctgcta tctaattcca ttaactttac ttttttaagg aaaaatttgt 3120
gtaataaatc aatattaaaa cagctttatt 3150
<210> 2
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacggcgagg gcaccttcac cagcgatgtc tcctcttacc tggaagagca ggccgctaaa 60
gagttcatcg cctggctggt gaagggagga ggcggcggcg gaggctctgg cggaggcggc 120
tccggcggcg gtggctccgc tgagtccaaa tacggccctc catgtcctcc ttgccctgct 180
cctgaggctg ctggcggacc ctccgtgttc ctgttccctc ccaagcccaa ggacaccctg 240
atgatcagcc ggacccctga agtgacctgt gtggtcgtgg acgtgtctca agaggaccct 300
gaggtgcagt ttaactggta cgtggatggc gtggaagtac ataacgccaa gaccaagcct 360
cgggaggaac agttcaactc cacctacaga gtggtgtctg tgctgacagt gctccaccag 420
gactggctga acggcaaaga gtacaagtgc aaggtctcca acaagggcct gccttcctcc 480
atcgagaaga ccatctctaa ggccaagggc cagcctagag agcctcaagt gtacaccctg 540
cctccctctc aggaagagat gaccaagaat caggtgagcc tgacctgcct ggtcaagggc 600
ttctaccctt ctgatatcgc cgtggaatgg gagtctaatg gccagcccga gaacaactac 660
aaaaccacac cacctgtgct ggactccgac ggctccttct tcctgtactc cagactgacc 720
gtggacaagt ctagatggca ggagggcaac gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc 780
ctgcacaacc actatacaca gaagtccttg agcctgtctc tgggctga 828
<210> 3
<211> 2876
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcagccaca ctaagatggc aaatgccact caactataca tttcaaatag ttaaggtggt 60
gaattaagca gtaaatattt taccacaact gatagtgtaa gaaaacaaac cgtcgtgtag 120
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 180
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 240
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 300
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 360
gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 420
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 480
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 540
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 600
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 660
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 720
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 780
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 840
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 900
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 960
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 1020
ccacctgacg tcgacggatc gggagatctc ccgatcccct atggtcgact ctcagtacaa 1080
tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt atctgctccc tgcttgtgtg ttggaggtcg 1140
ctgagtagtg cgcgagcaaa atttaagcta caacaaggca aggcttgacc gacaattgca 1200
tgaagaatct gcttagggtt aggcgttttg cgctgcttcg cgatgtaggt ttgtctggtc 1260
aaccaccgcg gtctccgtcg tcaggatcat gacattgatt attgactagt tattaatagt 1320
aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta 1380
cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga 1440
cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt 1500
tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta 1560
ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg 1620
actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt 1680
tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 1740
accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 1800
gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 1860
atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt 1920
ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg ggatccagat cttctagaaa 1980
gcttggtacc gatatcatgg aactgggcct gcggtgggtg tttctggtgg ccatcctgga 2040
aggcgtgcag tgccacggcg agggcacctt caccagcgat gtctcctctt acctggaaga 2100
gcaggccgct aaagagttca tcgcctggct ggtgaaggga ggaggcggcg gcggaggctc 2160
tggcggaggc ggctccggcg gcggtggctc cgctgagtcc aaatacggcc ctccatgtcc 2220
tccttgccct gctcctgagg ctgctggcgg accctccgtg ttcctgttcc ctcccaagcc 2280
caaggacacc ctgatgatca gccggacccc tgaagtgacc tgtgtggtcg tggacgtgtc 2340
tcaagaggac cctgaggtgc agtttaactg gtacgtggat ggcgtggaag tacataacgc 2400
caagaccaag cctcgggagg aacagttcaa ctccacctac agagtggtgt ctgtgctgac 2460
agtgctccac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag tgcaaggtct ccaacaaggg 2520
cctgccttcc tccatcgaga agaccatctc taaggccaag ggccagccta gagagcctca 2580
agtgtacacc ctgcctccct ctcaggaaga gatgaccaag aatcaggtga gcctgacctg 2640
cctggtcaag ggcttctacc cttctgatat cgccgtggaa tgggagtcta atggccagcc 2700
cgagaacaac tacaaaacca caccacctgt gctggactcc gacggctcct tcttcctgta 2760
ctccagactg accgtggaca agtctagatg gcaggagggc aacgtgttct cctgctccgt 2820
gatgcacgag gccctgcaca accactatac acagaagtcc ttgagcctgt ctctgg 2876
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcagccaca ctaagatgg 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccagagacag gctcaaggac 20
<210> 6
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatagtcacc cacaccagag gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96

Claims (13)

1.核酸，其特征在于，所述核酸包含SEQ ID No.1所示的核酸片段，所述核酸片段内整合有外源核酸片段。
2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第100-3000个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第150-2820个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第324-2688个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第480-2460个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第700-2200个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第976-1900个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第1260-1879个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第1561-1800个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第1678-1744个碱基区间内的任意位点；
可选地，所述外源核酸片段的整合位点对应所述核酸片段的第1701-1720个碱基区间内的任意位点。
3.根据权利要求1或者2所述的核酸，其特征在于，所述外源核酸片段包含：重组酶识别的第一重组识别序列和第二重组识别序列，位于所述第一重组识别序列和所述第二重组识别序列之间的选择标记基因和目标基因，以及调控所述选择标记基因和所述目标基因表达的启动子。
4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述重组酶为Bxb1整合酶、ΦC31整合酶、Cre重组酶或者FLP重组酶；或/和，
所述第一重组识别序列和所述第二重组识别序列独立地选自如下序列中的一种或者多种：LoxP序列、LoxPL3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、attP序列和attB序列。
5.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述选择标记基因选自新霉素抗性基因、胸苷激酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、胸苷激酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、天冬酰胺合成酶基因、色氨酸合成酶基因、组氨醇脱氢酶基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因、色氨酸合成酶基因和荧光蛋白基因中的一种或者多种。
6.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述启动子为CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子、β-globin启动子、UBC启动子、EF1a启动子、泛素启动子、β-actin启动子、PGK1启动子、Rosa26启动子、HSP70启动子、GAPDH启动子、Eif4A1启动子、Egr1启动子、FerH启动子、SM22α启动子或者Endothelin-1启动子。
7.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述目标基因编码抗体、重组蛋白、多肽、酶、激素、生长因子和受体中的一种或者多种。
8.重组载体，其特征在于，所述载体包含：
a.与SEQ ID No.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的5’同源臂，
b.目标基因，
c.与SEQ ID No.1所示的核酸片段所存在的序列片段同源的3’同源臂。
9.根据权利要求8所述的重组载体，其特征在于，所述重组表达载体为慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体、乳头瘤病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体、整合性噬菌体载体、非病毒载体、转座子和/或转座酶、整合酶底物或者质粒。
10.靶向整合细胞，其特征在于，所述靶向整合细胞包含权利要求1至7任一项所述的核酸。
11.根据权利要求10所述的靶向整合细胞，其特征在于，所述靶向整合细胞为真核细胞；
可选地，所述真核细胞为哺乳动物细胞；
可选地，所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢CHO细胞、人胚肾HEK293细胞。
12.权利要求10或者11所述的靶向整合细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
将权利要求1至7任一项所述的核酸导入细胞，或者提供包含SEQ ID No.1所示的核酸片段的细胞并将所述外源核酸片段整合至所述核酸片段，制备靶向整合细胞。
13.生产目标基因表达产物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：培养权利要求10或者11所述的靶向整合细胞，收集所述外源核酸片段中目标基因的表达产物。
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