KR100482274B1 - 염색체의 특정부위가 제거된 미생물 변이주의 제조를 위한선형 ｄｎａ 단편 및 이를 이용한 염색체의 특정부위가제거된 미생물 변이주의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 염색체의 특정부위가 제거된 미생물 변이주의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, sacB 유전자, I-sceI 제한효소 절제부위(restriction site), 선별마커(selectable marker) 및 미생물 염색체의 일부와 상동인 상동부위(homology arm)를 포함하는 선형 DNA 단편 및 이를 이용한 부위 특이적 동성 재조합(site specific homologous-recombination)에 의하여, 선별마커의 남김 없이 염색체의 특정부위를 제거함으로써, 새로운 미생물 변이주를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 상기와 같은 방법을 반복하여 순차적으로 특정 유전자들을 제거하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

Description

염색체의 특정부위가 제거된 미생물 변이주의 제조를 위한 선형 ＤＮＡ 단편 및 이를 이용한 염색체의 특정부위가 제거된 미생물 변이주의 제조방법{LINEAR DNA FRAGMENT FOR DEVELOPING A NOVEL STRAIN REMOVED A SPECIFIC REGION OF CHROMOSOME AND METHOD FOR PREPARING A NOVEL STRAIN REMOVED A SPECIFIC REGION OF CHROMOSOME USING THE SAME}

본 발명은 sacB 유전자, I-sceI 제한효소 절제부위(restriction site), 선별마커(selectable marker) 및 미생물 염색체의 일부와 상동인 상동부위(homology arms)를 포함하는 선형 DNA 단편 및 이를 이용한 부위 특이적 동성 재조합(site specific homologous-recombination)에 의하여, 선별마커의 남김없이 염색체의 특정부위를 제거함으로써, 염색체의 특정 부분이 제거된 새로운 미생물 변이주를 제조하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 선형 DNA 단편을 통한 부위 특이적 재조합 방법을 이용하여 대장균 염색체의 일부를 제거하는 기술은 이미 공지되었지만, 종래의 방법에 의한 경우, 염색체의 특정부위를 제거하고 난 후 선별마커가 남는 문제점이 있었다.

또한, 선별마커를 제거하는 기술도 이미 공지된 바가 있으나, 벡터를 이용한 동성 재조합(homologous recombination)으로 그 효율이 낮다는 문제점이 있었다. 그러나, 선형 DNA 단편을 이용하는 부위 특이적 재조합과 선별마커의 제거방법을 함께 사용하여 미생물 염색체의 일부를 제거하는 기술은 아직까지 보고된 바가 없다.

본 발명은, 미생물 염색체 특정 부위의 제거 후 선별마커가 남는 문제와 종래의 효율이 낮은 선별마커 제거 방법을 개선하여, 선형 DNA 단편을 이용하는 부위 특이적 재조합 방법과 개선된 선별마커 제거방법을 함께 이용함으로써, 보다 효율적으로 염색체의 특정부위를 제거할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 선별마커, SacB 유전자, I-sceI 제한효소 절단부위 및 미생물 염색체의 일부와 상동인 상동부위를 포함하는 선형 DNA 단편 및 이를 이용한 부위 특이적 재조합에 의하여, 염색체의 특정부위를 선별 마커의 남김없이 제거함으로써, 염색체의 특정 부위가 제거된 새로운 미생물 변이주를 제조하는 방법에 관한 것이다.

우선, 본 발명은, 염색체의 특정 부위를 보다 특이적이고 간편하게 제거하기 위하여, 고도의 특이성을 가지고 미생물 염색체의 특정 부위에 삽입되는 선형 유전자 서열(이하, "선형 DNA 단편"이라 한다.)을 제공하며, 상기 선형 DNA 단편은 선별마커, SacB 유전자, I-sceI 제한효소 절단부위 및 미생물 염색체의 일부와 상동인 상동부위를 포함한다.

보다 상세하게, 본 발명은

- 양쪽 말단에 상기 선형 DNA 단편의 미생물 내 도입시의 람다-레드 재조합에 관여하고 미생물 염색체의 일부와 상동인 500 bp 정도의 상동부위 A 및 C를 포함하고,

- 한쪽 말단에 선별마커의 제거시의 동성 재조합에 관여하고 미생물 염색체의 일부와 상동인 500 bp 정도의 상동부위 B를 포함하며,

- 선별마커, 선별마커의 제거 여부의 확인인자로서 sacB 유전자(SEQ ID NO:6), 및 선별마커 제거를 위한 동성 재조합에 관여하는 I-SceI 제한효소 절제부위(SEQ ID NO:4)를 포함하여 이루어지고, 선별마커의 남김없이 염색체의 특정부분이 제거된 미생물 변이주의 제조에 사용되는 선형 DNA 단편에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 염색체의 특정 부위가 제거된 미생물 변이주의 제조에 사용되는 선형 DNA 단편과 이를 이용하여 선별마커의 남김없이 특정부위가 제거된 미생물 변이주의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 제조방법은,

(1) 선별 마커, SacB 유전자, I-SceI 제한효소 절제부위, 및 미생물 염색체의 일부와 상동인 상동부위가 포함된 선형 DNA 단편을 제조하는 단계,

(2) 상기 선형 DNA 단편을 미생물 염색체의 특정 위치에 대체시키는(replacement) 단계,

(3) 상기 형질변환된 미생물 염색체에 I-SceI 제한효소 발현벡터를 도입하고 자당(sucrose)이 포함된 선택배지에서 배양하여 선별마커를 제거하는 단계를 포함하여 이루어지며, 임의적으로,

(4) 상기 염색체 일부가 제거된 변이주에 상기 (2) 및 (3) 단계를 반복하여 연속적으로 특정 유전자들을 제거하는 단계를 포함할 수 있다.

기존의 플라스미드를 이용한 특정 유전자 제거 시에는 각각의 유전자마다 해당 유전자의 플라스미드를 제작하여야 하는 문제가 있었는데, 람다 레드 재조합 방법을 이용하면 원형의 플라스이드 DNA 형태가 아닌 PCR을 통해서 얻은 고농도의 선형 DNA단편을 바로 이용할 수 있다는 장점이 있다.

이를 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 선형 DNA 단편과 이를 제조하는 상기 (1) 단계에 있어서, 상기 선형 DNA 단편은 선별마커 제거와 람다-레드 재조합에 필요한 요소를 가지고 있다. 상기 선별마커로서, 예컨대, 클로람페니콜 저항 유전자(chloramphenicol resistant gene, Cm^R, SEQ ID NO: 5), 카나마이신 저항 유전자(kanamycin resistant gene, Km^R, SEQ ID NO: 16) 또는 테트라사이클린 저항 유전자(tetracycline resistant gene, Tc^R, SEQ ID NO: 27)을 사용할 수 있다. 또한, 상기 선형 DNA 단편은 선별마커의 제거 여부의 확인인자로서 sacB 유전자(SEQ ID NO:6)를 포함한다.

상기 상동부위는 염색체가 변형될 미생물의 염색체 일부와 상동인 부분으로, 서열목록 및 도면 상에 상동부위(homology arm) A, B 및 C로 표시되어 있다. 이들 중 상동부위 A 및 C는 제거될 미생물 염색체 양 말단과 연결된 약 500 bp를 PCR 하여 얻은 상동부위로서, 선형 DNA 단편의 양쪽 말단에 위치하며, 선형 DNA 단편의 미생물 내 도입시의 람다-레드 재조합에 관여한다. 상동부위 B는 상동부위 A 또는 C와 상동인 미생물 염색체 중 어느 하나와 연결된 약 500 bp를 PCR 하여 얻은 상동부위로서, 선형 DNA 단편의 한 쪽 말단에 위치하며, 선별마커 제거시의 동성 재조합에 관여한다(도 5 참조). 이 때, 상기 상동부위 A, B 및 C는 대상 미생물과 제거하고자 하는 유전자에 따라 달라진다. 본 발명의 구체예에서 사용한 상동부위들을 서열목록에 나타내었다(SEQ ID NO:1 내지 3, SEQ ID NO:17 내지 19 및 SEQ ID NO:28 내지 30).

또한, 상기 I-SceI 제한효소 절제부위(SEQ ID NO:4)는 18 염기쌍으로 되어 있고, 선별마커의 제거시의 동성 재조합에 필요한 부위이며, 대장균(E. coli) 염색체에는 I-SceI 제한효소 절제부위가 존재하지 않기 때문에, 특정 유전자의 제거를 위한 상기 선형 DNA 단편은 I-SceI 제한효소 절제부위를 포함하고 있어야 한다.

본 발명의 한 구체예에 따르면, 상기 선형 DNA 단편은, 예컨대, 선별마커로서 Cm^R을 포함하는 pCSI 벡터(SEQ ID NO:7)와 미생물 염색체로부터 얻어지는 PCR 반응물을 주형(template)으로 하는 PCR 반응으로부터 얻을 수 있으며(도 1 참조), 이 외에도 양 말단에 람다-레드 재조합을 위한 미생물과의 상동부위와 한쪽 말단에 선별 마커의 제거를 위한 미생물과의 상동부위(SEQ ID NO:1 내지 3) 를 포함하고, 그 사이에 Cm^R, sacB 유전자 및 I-SceI 제한효소 절단부위를 포함하는 모든 선형 DNA 단편을 포함한다. 예컨대, 상기 DNA 단편의 일례로서, 히스티딘 오페론의 유전자 제거를 위한 선형 DNA 단편을 도 2 및 SEQ ID NO:8에 나타내었다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 선별마커로서 Km^R을 포함하고, 양 말단에 상동부위 A(SEQ ID NO:17) 및 C(SEQ ID NO:19)를, 한쪽 말단에 상동부위 B(SEQ ID NO:18)를 포함하는, 트립토판 오페론의 유전자 절단을 위한 선형 DNA 단편을 도 3 및 SEQ ID NO:20에 나타내었다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 선별마커로서 Tc^R을 포함하고, 양 말단에 상동부위 A(SEQ ID NO:28) 및 C(SEQ ID NO:30)를, 한쪽 말단에 상동부위 B(SEQ ID NO:29)를 포함하는, ProAB 오페론의 유전자 절단을 위한 선형 DNA 단편을 도 4 및 SEQ ID NO:31에 나타내었다.

본 발명의 따른 유전자 제거방법은 500 bp 정도의 상동부위를 사용하므로, 보다 특이적인 재조합이 일어나서, 원하는 부분을 보다 정확하게 제거할 수 있다는 장점이 있다.

상기 (2) 단계에 있어서, 상기 선형 DNA단편을 통상적인 일렉트로포레이션(electrophoration)을 방법을 이용하여 미생물 균주에 전달하고, 선형 DNA 단편의 양 말단에 위치하는 미생물 염색체와의 상동부위 A, C 및 이와 상동인 미생물 염색체상의 부위에서의 람다-레드 재조합에 의하여 상기 DNA 단편을 미생물 균주 염색체의 특정 위치에 대체(replacement)시켜 해당 부분을 제거시킨 후, 상기 선형 DNA 단편이 대체된 미생물 변이주를 선별마커의 종류에 따라 해당 항생제를 포함하는 배지, 예컨대, 클로람페니콜 배지, 카나마이신 배지 또는 테트라사이클린 배지에서 배양하여 선별한다. 선별된 변이주 내의 람다-레드 재조합에 의한 선형 DNA 대체를 PCR을 통하여 확인 할 수 있다.

상기 (3) 단계에 있어서, 상기 변이주 내로 I-SecI 제한효소 유전자를 포함하는 I-SecI 제한효소 발현 벡터를 도입시키고 I-SecI 제한효소 유전자를 발현시켜서, 상기 선형 DNA 단편의 한쪽 말단에 위치하는 미생물 염색체와의 상동부위 B 및 이와 상동성을 갖는 미생물 염색체 부위 사이의 동성 재조합을 촉진시킴으로써, 미생물 변이주 내의 선별마커를 제거한다. 본 발명의 구체예에서는 상기 발현 벡터로서 pST98AS (SEQ ID NO:9, ACCESSION AF170483, Posfai G, Kolisnychenko V, Bereczki Z, Blattner FR. 1999. Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome Nucleic Acids Res 27(22), 4409-15) 발현 벡터를 사용하였다.

상기 발현벡터에 존재하는 I-SceI 제한효소 유전자는 테트라사이클린 프로모터에 의해서 전사조절 되므로, pST98AS 발현벡터가 도입된 변이주를 클로로테트라사이클린이 존재하는 배지에서 배양하여 I-SceI 유전자를 발현시킴으로써, I-SceI 제한효소 인식 부위가 특이적으로 절단되도록 한다. 이와 같이 I-SceI 제한효소 인식 부위가 특이적으로 절단됨으로써, 선형 DNA에 포함된 미생물 염색체 일부와의 상동부위와, 이와 상동성을 갖는 미생물 염색체 부위 사이의 동성 재조합이 촉진된다.

그리고 나서, 상기 미생물 변이주를 자당(sucrose)이 포함된 배지에서 배양하여, 미생물 변이주 내에 도입된 선형 DNA 단편 내의 sacB 유전자를 발현시켜 독성을 유발시킨다. 일반적으로, sacB 유전자는 레반수크라아제(levansucrase)를 발현시키며, 이는 자당(sucrose)을 포도당(glucose)과 과당(fructose)으로 분해하고, 과당을 중합체인 레반(levan)으로 합성한다. 이 때, 상기 레반이 미생물에 대하여 독성을 가지고 있기 때문에, sacB 유전자를 지닌 미생물은 자당이 포함된 배지에서 생존하지 못한다. 따라서, 동성 재조합에 의하여 선별마커가 제거된 미생물 변이주를 자당을 포함하는 배지에서 배양함으로써 선별할 수 있다.

또한, 상기 제 (2) 단계와 제 (3) 단계를 반복 실시함으로써, 미생물 내 염색체의 특정 유전자 부위를 연속적으로 제거시킬 수 있다.

본 발명은 상기 대상 미생물로 대장균(E. coli)을 사용하였으며, 상기 선형 DNA의 대체는 람다-레드 재조합 방법을 기초로 했다. 람다-레드 재조합 방법을 통하여 대장균 염색체의 일부를 PCR 반응을 통해서 얻은 선형 DNA 단편으로 대체시킬 수 있다는 것이 보고되어 있으며(Kirill and Barry L. Wanner. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. PNAS 97(12), 6640-5), 대장균 염색체의 절단에 의하여 촉진되는 선별마커를 제거시키는 동성 재조합 방법도 보고되어 있다(Posfai G, Kolisnychenko V, Bereczki Z, Blattner FR. 1999. Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome Nucleic Acids Res 27(22), 4409-15). 또한, sacB 유전자가 독성으로 인하여 선별마커로 활용될 수 있음이 알려져 있다( Van der Geize R, Hessels GI, van Gerwen R, van der Meijden P, Dijkhuizen L. 2001. Unmarked gene deletion mutagenesis of kstD, encoding 3-ketosteroid Delta1-dehydrogenase, in Rhodococcus erythropolis SQ1 using sacB as counter-selectable marker. FEMS Microbiol Lett 205(2):197-202).

그러므로, 본 발명은 선형 DNA단편을 람다-레드 재조합 방법을 이용하여 미생물 염색체 내의 특정 위치에 대체시키고, 여기에 I-SceI 제한효소에 의한 염색체 절단과 더불어 sacB 유전자의 독성 유발에 의해 개선된 선별 마커 제거 방법을 통해서, 대체된 부위가 제거되고 선별마커를 가지지 않는 새로운 미생물 변이주를 제조하는 기술을 개발한 것이다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 상세히 설명하겠으나, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예1

선별 마커와 SacB 유전자 및 I-SceI 제한효소 절제부위 그리고 미생물 염색체 일부와의 상동부위를 포함하는 선형 DNA 단편의 제조

1-1. 히스티딘 오페론 유전자 제거를 위한 선형 DNA 단편의 제조

도 1은 선형 DNA 단편의 제조과정을 나타낸 것으로, 도 1의 (c)에서 알 수 있는 바와 같이, 제조된 선형 DNA 단편은 Cm^R(SEQ ID NO:5), sacB 유전자(SEQ ID NO:6) 및 I-SceI 제한효소 절제부위(SEQ ID NO:4)를 포함하고, 양 말단에 상기 단편의 미생물 내 도입시의 람다-레드 재조합에 관여하는 미생물 염색체 일부와의 500 bp 상동부위 A(SEQ ID NO:1, AE000293:3685-4236, Escherichia coli K12 MG1655 section 183 of 400 of the complete genome)와 상동부위 C(SEQ ID NO:3, AE000293:11117-11624, Escherichia coli K12 MG1655 section 183 of 400 of the complete genome), 및 선별마커 제거시의 상동 재조합에 관여하는 미생물 염색체 일부와의 500 bp 상동부위 B(SEQ ID NO:2, AE000294:76-513, Escherichia coli K12 MG1655 section 184 of 400 of the complete genome)를 포함하고 있다. 상기 선형 DNA 단편은 도 1의 (a)에 나타난 pSCI 벡터와 도 1의 (b)에 나타난 미생물 염색체로부터 얻은 PCR 반응물들을 주형으로 한 PCR반응을 통해 얻을 수 있다(도 1 참조).

상기 pSCI 벡터를 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 우선 I-SceI 제한효소 절제부위를 갖는 pST76K (Posfai G, Kolisnychenko V, Bereczki Z, Blattner FR. 1999. Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome Nucleic Acids Res 27(22), 4409-15) 벡터와 Cm^R 유전자를 갖는 pSG76C(Posfai G, Kolisnychenko V, Bereczki Z, Blattner FR. 1999. Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome Nucleic Acids Res 27(22), 4409-15) 벡터를 각각 두 개의 제한효소 KpnI(New England Biolabs, Beverly, MA)과 BamHI(New England Biolabs, Beverly, MA)으로 절단하였다. 그리고 나서, 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 상기 Cm^R 유전자를 KpnI과 BamHI 제한효소로 절단시킨 선상의 pST76K 벡터에 삽입하고, 이를 BamHI 제한효소로 한 번 더 절단한 후, 여기에 pDELTA(GIBCOBRL-DELETION FACTORY SYSTEM VERSION 2.) 벡터를 BamHI(New England Biolabs, Beverly, MA) 제한효소로 절단하여 얻은 sacB 유전자를 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 삽입하여 새로운 벡터를 제조한 후 이를 pSCI(SEQ ID NO:7)라 명명하였다.

그리고 나서, 미생물 염색체로부터 상기 pSCI에 BamHI 제한효소(New England Biolabs, Beverly, MA)를 처리하여 얻은 단편의 양 말단에 결합하여 람다-레드 동성 재조합에 관여하는 약 500 염기쌍으로 이루어진 미생물 염색체 일부와 상동성을 갖는 부위(상동부위 A와 C, SEQ ID NO:1 및 3)를 제거될 대장균 염색체 부위 양 말단의 약 500bp 부분을 PCR 하여 얻었으며, 상기 벡터의 한 쪽 말단에 결합하여 선별마커 제거시의 동성 재조합에 관여하는 미생물 염색체의 일부와 상동성을 갖는 500 염기쌍으로 이루어진 부위(상동부위 B, SEQ ID NO:2)를 상기 제거될 대장균 염색체 부위 양 말단 부분 중 한 부분에 인접한 약 500 bp 부분을 PCR 반응시켜서 얻었다. 상기 pSCI 양 말단에 상동부위 A 및 C를 위치시키고, 한 쪽 말단에 상동부위 B를 위치시키고 PCR 반응시켜서 선형 DNA 단편(SEQ ID NO:8)을 얻었다.

도 7a의 (a)는 상동부위 A, B 및 C를 얻기 위한 PCR과정을 나타낸 것이고, (b)는 선형DNA 단편을 얻기위한 PCR 과정을 나타낸 것이며, 여기에 사용되는 프라이머들은 다음과 같다.

프라이머 HisAA: 5'-AGACGGTGCTCCTCTGTAATG-3' (SEQ ID NO:10)

프라이머 HisAB: 5'-GCTCTACGCAATTACAACGCGAAGTAATCAGCCTGGATTTTCGTCTCAC-3' (SEQ ID NO:11)

프라이머 HisBA: 5'-GATTACTTCGCGTTGTAATTGCGTAGAGC-3' (SEQ ID NO:12)

프라이머 HisBB: 5'-ATTAATTTCGATAAGCCAGATCAAGAACGCAGGAAGTAGTCG-3' (SEQ ID NO:13)

프라이머 HisCA: 5'-AGAGTCGACCTGCAGGCATGCGAAGTGCTAATGCTGGGCTA-3' (SEQ ID NO:14)

프라이머 HisCB: 5'-GCAGGTTCTCAATTACCGTC-3' (SEQ ID NO:15)

증폭된 DNA는 뉴클레오진 겔-추출 키트(Nucleogene Gel-Extraction KIT)를 사용하여 분리하였다. 이렇게 얻어진 선형 DNA 단편은 대장균 내 히스티딘 오페론 유전자를 제거하기 위한 삽입서열(SEQ ID NO:8)로 사용되었다.

1-2. 트립토판 오페론 유전자 제거를 위한 선형 DNA 단편의 제조

선별마커로서 Km^R((SEQ ID NO:16)을 사용하여 상기의 단편을 기초로 하여 트립토판 오페론 제거를 위한 선형 DNA 단편을 제작하였다. 이 때, 양 말단에 상기 단편의 미생물 내 도입시의 람다-레드 재조합에 관여하는 미생물 염색체 일부와의 500 bp 상동부위 A(SEQ ID NO:17, AE000224:1902-2341, Escherichia coli K12 MG1655 section 114 of 400 of the complete genome)와 C(SEQ ID NO:18, AE000224:8915-9300, Escherichia coli K12 MG1655 section 114 of 400 of the complete genome), 및 선별마커 제거시의 상동 재조합에 관여하는 미생물 염색체 일부와의 500 bp 상동부위 B(SEQ ID NO:19, AE000224:9344-9890, Escherichia coli K12 MG1655 section 114 of 400 of the complete genome)를 사용하여 제작하였다.

보다 빠르고 간편한 선형 DNA 단편의 제작을 위해서, 실시예 1-1에서 제조된 히스티딘 오페론을 제거하기 위한 선형 DNA 삽입 단편(SEQ ID NO:8)의 Cm^R 유전자만을 Km^R 유전자로 대체하기 위한 재조합 PCR(Recombinant PCR)을 수행하였다. Cm^R 유전자 앞부분과 뒷부분을 PCR을 통하여 증폭해 내고, 이 앞부분과 뒷부분을 Km^R 유전자와 함께 재조합 PCR 반응 시켜서 Km^R 유전자로 대체된 선형 DNA 삽입 단편을 얻을 수 있었다. 이와 같은 Km^R을 이용한 Cm^R의 대체 과정을 도 8a에 나타내었다. 이때 사용된 프라이머는 다음과 같으며, Km^R 유전자의 PCR을 위한 주형 벡터로서 pKD4(Kirill and Barry L. Wanner. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. PNAS 97(12), 6640-5)를 사용하였다.

프라이머 IN_F gatctggctt atcgaaattaa tacg (SEQ ID NO:38)

프라이머 IN_B tttagcttcc ttagctcctg (SEQ ID NO:39)

프라이머 Km_F caggagctaa ggaagctaaa ccctgcaaag taaactggat g (SEQ ID NO:40)

프라이머 Km_B ggcgtcccgg aaaacgattc cg (SEQ ID NO:41)

프라이머 SacB_Km_F cggaatcgtt ttccgggacg ccttttttta aggcagttat tgg (SEQ ID NO:45)

프라이머 SacB_B gcatgcctgc aggtcgactc (SEQ ID NO:46)

그리고 나서, 양 말단에 결합하여 람다-레드 동성 재조합에 관여하는 약 500 염기쌍으로 이루어진 미생물 염색체 일부와 상동성을 갖는 부위(상동부위 A와 C, SEQ ID NO:17 및 19)를 제거될 대장균 염색체 부위 양 말단의 약 500bp 부분을 PCR 하여 얻었으며, 상기 벡터의 한 쪽 말단에 결합하여 선별마커 제거시의 동성 재조합에 관여하는 미생물 염색체의 일부와 상동성을 갖는 500 염기쌍으로 이루어진 부위(상동부위 B, SEQ ID NO:18)를 상기 제거될 대장균 염색체 부위 양 말단 부분 중 한 부분에 인접한 약 500 bp 부분을 PCR 반응시켜서 얻었다. 그리고 나서, 상기 벡터 양쪽 말단에 상동부위 A 및 C를, 한 쪽 말단에 상동부위 B를 위치시키고, PCR 반응시켜 선형 DNA 단편(SEQ ID NO:20)을 완성하였다.

도 7b의 (a)는 상동부위 A, B 및 C를 얻기 위한 PCR과정을 나타낸 것이고, (b)는 선형DNA 단편을 얻기위한 PCR 과정을 나타낸 것이며, 여기에 사용되는 프라이머들은 다음과 같다.

프라이머 TrpAA: 5'-cgctgtaggtatctgaaagcag-3' (SEQ ID NO:21)

프라이머 TrpAB: 5'-cgacatcataacggttctggcaaatattctgccctctatcttctcgttg cg-3' (SEQ ID NO:22)

프라이머 TrpBA: 5'-agagtcgacctgcaggcatgcgaaagtgcctggattgtgac-3' (SEQ ID NO:23)

프라이머 TrpBB: 5'-cgcaagttcacgtaaaaagg-3' (SEQ ID NO:24)

프라이머 TrpCA: 5'-cagaatatttgccagaaccgttatgatgtcg-3' (SEQ ID NO:25)

프라이머 TrpCB: 5'-attaatttcgataagccagatcaagacatccgccattgaact3' (SEQ ID NO:26)

증폭된 DNA는 뉴클레오진 겔-추출 키트(Nucleogene Gel-Extraction KIT)를 사용하여 분리하였다. 이렇게 얻어진 선형 DNA 단편은 대장균 내 트립토판 오페론 유전자를 제거하기 위한 삽입서열(SEQ ID NO:20)로 사용되었다.

1-3. ProAB 오페론 유전자 제거를 위한 선형 DNA 단편의 제조

선별마커로서 Tc^R((SEQ ID NO:27)을 사용하여 상기의 단편을 기초로 하여 ProAB 오페론 제거를 위한 선형 DNA 단편을 제작하였다. 이 때, 양 말단에 상기 단편의 미생물 내 도입시의 람다-레드 재조합에 관여하는 미생물 염색체 일부와의 500 bp 상동부위 A(SEQ ID NO:28, AE000123:5798-6283, Escherichia coli K12 MG1655 section 22 of 400 of the complete genome)와 C(SEQ ID NO:30, AE000123:8766-9227, Escherichia coli K12 MG1655 section 22 of 400 of the complete genome), 및 선별마커 제거시의 상동 재조합에 관여하는 미생물 염색체 일부와의 500 bp 상동부위 B(SEQ ID NO:29, AE000123:8130-8695, Escherichia coli K12 MG1655 section 22 of 400 of the complete genome)를 사용하여 제작하였다.

우선, 실시예 1-1에서 제조된 히스티딘 오페론을 제거하기 위해서 사용되는 선형 DNA 삽입 단편의 Cm^R 유전자만을 Tc^R 유전자로 대체하기 위한 재조합 PCR을 수행하였다. Cm^R 유전자 앞부분과 뒷부분을 PCR을 통하여 증폭해 내고, 이 앞부분과 뒷부분을 Tc내성 유전자와 함께 재조합 PCR 반응 시켜서 Tc^R 유전자로 대체된 선형 DNA 삽입 단편을 얻을 수 있었다. 이와 같은 과정을 도 8b에 나타내었다. 이때 사용된 프라이머는 다음과 같으며, Tc^R 유전자의 PCR을 위한 templete 벡터는 pTN10(Michael D. Koob ;Institute of Human Genetics, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455, USA) 다.

프라이머 IN_F gatctggctt atcgaaattaa tacg (SEQ ID NO:38)

프라이머 IN_B tttagcttcc ttagctcctg (SEQ ID NO:39)

프라이머 Tc_F caggagctaa ggaagctaaa actttactta tctaatctag ac (SEQ ID NO:42)

프라이머 Tc_B ttgggttatc aagagggtc (SEQ ID NO:43)

프라이머 SacB_Tc_F gaccctcttg ataacccaat ttttttaagg cagttattgg (SEQ ID NO:44)

프라이머 SacB_B gcatgcctgc aggtcgactc (SEQ ID NO:46)

그리고 나서, 양 말단에 결합하여 람다-레드 동성 재조합에 관여하는 약 500 염기쌍으로 이루어진 미생물 염색체 일부와 상동성을 갖는 부위(상동부위 A와 C, SEQ ID NO:28 및 30)를 제거될 대장균 염색체 부위 양 말단의 약 500bp 부분을 PCR 하여 얻었으며, 상기 벡터의 한 쪽 말단에 결합하여 선별마커 제거시의 동성 재조합에 관여하는 미생물 염색체의 일부와 상동성을 갖는 500 염기쌍으로 이루어진 부위(상동부위 B, SEQ ID NO:29)를 상기 제거될 대장균 염색체 부위 양 말단 부분 중 한 부분에 인접한 약 500 bp 부분을 PCR 반응시켜서 얻었다. 그리고 나서, 상기 벡터 양쪽 말단에 상동부위 A 및 C를, 한 쪽 말단에 상동부위 B를 위치시키고, PCR 반응시켜 선형 DNA 단편(SEQ ID NO:31)을 완성하였다.

도 7c의 (a)는 상동부위 A, B 및 C를 얻기 위한 PCR과정을 나타낸 것이고, (b)는 선형DNA 단편을 얻기위한 PCR 과정을 나타낸 것이며, 여기에 사용되는 프라이머들은 다음과 같다.

프라이머 ProAA: 5'-aactctgcttcccaacgac-3' (SEQ ID NO:32)

프라이머 ProAB: 5'-gaatcacggtggacaaggttaaaacgttttagcaggactgtcgtc-3' (SEQ ID NO:33)

프라이머 ProBA: 5'-agagtcgacctgcaggcatgcgatgaaagtgtagagatcgctg-3' (SEQ ID NO:34)

프라이머 ProBB: 5'-tacgcacgaatggtgtaatc-3' (SEQ ID NO:35)

프라이머 ProCA: 5'-gttttaaccttgtccaccgtgattc-3' (SEQ ID NO:36)

프라이머 ProCB: 5'-attaatttcgataagccagatcctcccttgtttacctattgcg-3' (SEQ ID NO:37)

증폭된 DNA는 뉴클레오진 겔-추출 키트(Nucleogene Gel-Extraction KIT)를 사용하여 분리하였다. 이렇게 얻어진 선형 DNA 단편은 대장균 내 ProAB 오페론 유전자를 제거하기 위한 삽입서열(SEQ ID NO:31)로 사용되었다.

실시예2

선형 DNA 단편을 미생물 염색체의 특정 위치에 대체(Replacement)시키는 단계

바이러스 유래 유전자를 이용하여 실시예 1에서 제작된 선형 DNA 단편들을 람다-레드 재조합 방법으로 대장균 MG1655(서울대학교 미생물학과 노정혜 교수)에 전달하였다. 이 때, pKD46 (Kirill and Barry L. Wanner. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. PNAS 97(12), 6640-5) 벡터 내에 존재하는 바이러스 유래 유전자를 사용하였다. 즉, 열충격에 의한 형질 전환법(heat shock transformation)을 이용하여 pKD46벡터를 대장균 MG1655에 전달하였다.

2-1. 히스티딘 오페론 유전자 제거를 위한 대체

상기 실시예 1-1에서 제조된 ENA 단편을 대장균 염색체 내에 대체시켰다. 우선 이 때, 대체되는 대장균 내 특정 유전자로서, 가지를 가진(branched chain) 아미노산의 생합성에 관련된 유전자 군(히스티딘 오페론 유전자)을 선택하여 실시하였다. 상기 유전자 군은 약 9kb와 7kb 크기를 갖는 두 부분으로 나눌 수 있다. 우선, 9kb 크기의 유전자 군에 대하여 대체를 시행하였다. pKD46 벡터가 삽입된 대장균 MG1655에 상기 실시예 1에서 제작한 선형 DNA 단편을 표준적인 일렉트로포레이션(electrophoration)방법 (Bio-RAD, Bacterial electro- transformation and Plus Controller Instruction Manual, Cat.No 165-2098 ; Thompson, JR, et al. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electrophoration. Yeast 14, 565-571 (1998) ; Grant, SG, et al. Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methyllation-restriction mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4645-4649 (1990))을 통해서 대장균 MG1655 균주내로 전달시켰다. 이 때, 상기 선형 DNA 단편은 균주 염색체의 제거될 부분의 양 말단 부분과의 상동부위(A 및 C)를 가지므로, 이들 간의 람다-레드 재조합에 의하여, 균주 유전자로부터 상기 두 부분 사이의 유전자 부분이 제거되고, 선형 DNA 단편으로 대체된다(도 5 참조, 도 5의 (a)는 선형 DNA 단편이며, (b)는 균주 염색체의 제거될 부위이며, (c)는 균주 염색체의 제거될 부분이 선형 DNA 단편으로 대체된 것이며, (d)는 I-SceI 제한효소의 발현으로 선형 DNA 단편의 상동부위 B와 이와 상동인 균주 염색체 부위와의 동성 재조합 되는 것을 나타낸 것이며, (e)는 특정 염색체 부위가 제거된 균주 염색체이다).

상기 선형 DNA 단편으로 대체된 대장균 변이주는 선형 DNA 단편에 존재하는 Cm^R 유전자 때문에 클로람페니콜 저항성을 가지므로, 클로람페니콜 배지에서 선별하였다. 이 때, 대장균 MG1655 균주 염색체 내로 대체된 것을 PCR반응을 통해서 확인하였다. 상기 PCR 반응에서는, 선형 DNA 단편의 일부에 특이하게 결합하는 프라이머와 선형 DNA 단편이 대체된 주변부위에 특이하게 결합하는, 상기한 바와 같은 프라이머(SEQ ID NO:10 및 15)로 특정 길이의 PCR반응물을 얻을 수 있었다. 이와 같이. 아미노산 생합성 관련 유전자(히스티딘 오페론 유전자)가 제거되고, 외래의 선형 DNA가 대체된 변이주는, 최소배지(minimal media)에서 배양을 통해 관련 아미노산(히스티딘)을 합성하지 못하는 변이주임을 확인하였다.

2-2. 트립토판 오페론 유전자의 제거를 위한 대체

상기 실시예 1-2에서 제조된 DNA 단편을 사용하여 상기와 같은 방법으로 대장균 내 트립토판 오페론 유전자를 대체시켰다. 상기 선형 DNA 단편으로 대체된 대장균 변이주는 선형 DNA 단편에 존재하는 Km^R 유전자 때문에 카나마이신 저항성을 가지므로, 카나마이신 배지에서 선별하였다. 이 때, 대장균 MG1655 균주 염색체 내로 대체된 것을 PCR반응을 통해서 확인하였다. 상기 PCR 반응에서는, 선형 DNA 단편의 일부에 특이하게 결합하는 프라이머와 선형 DNA 단편이 대체된 주변부위에 특이하게 결합하는, 상기한 바와 같은 프라이머(SEQ ID NO:21 및 26)로 특정 길이의 PCR반응물을 얻을 수 있었다. 이와 같이. 트립토판 오페론 유전자가 제거되고, 외래의 선형 DNA가 대체된 변이주는, 최소배지에서 배양을 통해 관련 아미노산(트립토판)을 합성하지 못하는 변이주임을 확인하였다.

2-3. 트립토판 오페론 유전자의 제거를 위한 대체

상기 실시예 1-2에서 제조된 DNA 단편을 사용하여 상기와 같은 방법으로 대장균 내 ProAB 오페론 유전자를 대체시켰다. 상기 선형 DNA 단편으로 대체된 대장균 변이주는 선형 DNA 단편에 존재하는 Tc^R 유전자 때문에 테트라사이클린 저항성을 가지므로, 테트라사이클린 배지에서 선별하였다. 이 때, 대장균 MG1655 균주 염색체 내로 대체된 것을 PCR반응을 통해서 확인하였다. 상기 PCR 반응에서는, 선형 DNA 단편의 일부에 특이하게 결합하는 프라이머와 선형 DNA 단편이 대체된 주변부위에 특이하게 결합하는, 상기한 바와 같은 프라이머(SEQ ID NO:32 및 37)로 특정 길이의 PCR반응물을 얻을 수 있었다. 이와 같이. ProAB 오페론 유전자가 제거되고, 외래의 선형 DNA가 대체된 변이주는, 최소배지에서 배양을 통해 관련 아미노산을 합성하지 못하는 변이주임을 확인하였다.

실시예3

pST98AS I-SceI 제한효소 발현벡터를 도입 발현시키고, 자당(sucrose)이 포함된 배지에서 배양하여 하여 선별마커를 제거하는 단계

실시예 2에 따라 제조된, 미생물 염색체의 일부가 대체되고 선별마커를 가진 대장균 변이주에 I-SecI 발현 벡터(pST98AS, SEQ ID NO:9)를 도입시켰다. pST98AS에 존재하는 I-SceI 제한효소 유전자는 테트라사이클린 프로모터에 의해 전사 조절 되므로, 클로로테트라사이클린이 존재하는 배지에서 배양하여 I-SceI 제한효소를 발현시켰다. 이 때, 상기 배지에 자당(sucrose)을 포함시킴으로써, 상기 대장균에 도입된 선형 DNA 단편 상에 존재하는 sacB 유전자의 발현을 유도하였다. I-SceI 제한효소에 의한 미생물 염색체의 특정부위의 절제에 의하여, 상기 도입된 선형 DNA 단편들에 존재하는 미생물 유래의 부위(상동부위 B)와, 이와 동성을 갖는 미생물 염색체에 존재하는 부위와의 동성 재조합이 유도되, 선별마커와 sacB 유전자가 미생물 염색체에서 제거되어 각각 클로람페니콜, 카나마이신 및 테트라사이클린 내성을 잃고, sacB에 의한 독성이 제거 되었다(도5 참조). 이와 같이 선별마커가 제거된 변이주는 자당을 포함하는 배지에서 배양함으로써 선별할 수 있었다. 선변된 변이주에서 선별마커가 제거된 것은 PCR을 통해서 확인할 수 있었다.

실시예4

마커가 제거된 변이주에 Lambd-red 재조합에 의한 형질 전환법을 이용하여 순차적인 염색체 결실부위를 갖는 변이주의 제조

상기 미생물 염색체에서 가지를 가진(branched chain) 아미노산 생합성에 관련된 유전자군이 제거된 변이주에 상동부위를 달리하여 실시예 2 및 3을 반복적으로 수행함으로써, 변이주의 염색체에 나머지 남은 7kb 크기의 유전자군을 선별마커의 남김없이 제거할 수 있었다(도 6 참조).

상술한 바와 같이, 본 발명은 람다-레드 재조합 방법과 sacB 유전자와 I-SceI 제한효소 절제에 의해 촉진되는 동성 재조합 방법을 통한 선별마커의 제거법으로, 미생물염색체의 특정 부위를 선별마커와 더불어 외래의 어떤 DNA도 남지 않게 제거하여 순차적인 미생물 염색체의 특정 부위의 제거를 가능하게 하는 효과가 있다. 이는 다수의 유전자가 관여하는 하나의 대사 경로나, 신호 전달 경로를 제거하는데 있어서의 선별마커가 남는 문제를 해결하는데 효과가 있다.

도 1은 선별마커로서 Cm^R, I-SceI 제한효소 절제부위 및 sacB 유전자 및 미생물 염색체 일부와 상동부분을 포함하는 선형 DNA 단편의 제조과정을 나타낸 것이다.

도 2는 선별마커로서 Cm^R, I-SceI 제한효소 절제부위 및 sacB 유전자 및 미생물 염색체 일부와 상동부분을 포함하고 히스티딘 오페론에 삽입을 위한 선형 DNA 단편을 나타낸 것이다.

도 3은 선별마커로서 Km^R, I-SceI 제한효소 절제부위 및 sacB 유전자 및 미생물 염색체 일부와 상동부분을 포함하고 트립토판 오페론에 삽입을 위한 선형 DNA 단편을 나타낸 것이다.

도 4는 선별마커로서 Tc^R, I-SceI 제한효소 절제부위 및 sacB 유전자 및 미생물 염색체 일부와 상동부분을 포함하고 ProAB 오페론에 삽입을 위한 선형 DNA 단편을 나타낸 것이다.

도 5는 람다-레드(Lambda-red) 재조합을 이용하여 선형 DNA 단편을 대장균 염색체로 대체(replacement)시키고, 동성 재조합(homologous-recombination)을 통하여 선별 마커를 제거하는 과정을 나타낸 것이다.

도 6은 선별 마커와 미생물 염색체의 특정부분이 제거된 변이주의 다른 부위를 같은 방법으로 제거하여 한 염색체내에 제거된 구간의 수를 늘려 가는 과정을 나타낸 것이다.

도 7a 내지 7c는 선형 DNA 단편의 제작을 위한 PCR 과정과 여기에 사용되는 프라이머를 나타낸 것이다.

도 8a 및 도8b는 재조합 PCR(recombinant PCR) 과정을 나타낸 것으로, 8a는 Cm^R 유전자를 Km^R 유전자로 대체시키기 위한 재조합 PCR을 보여주는 것이고, 8b는 Cm^R 유전자를 Tc^R 유전자로 대체시키기 위한 재조합 PCR을 보여주는 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> LINEAR DNA FRAGMENT FOR DEVELOPING A NOVEL STRAIN REMOVED A SPECIFIC REGION OF CHROMOSOME AND METHOD FOR PREPARING A NOVEL STRAIN REMOVED A SPECIFIC REGION OF CHROMOSOME USING THE SAME <160> 46 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 496 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homology arm A for Histidine operon deletion <400> 1 agacggtgct cctctgtaat gcgtcgggac cagaaacctg acaaattatg tttcaggggt 60 tctggcttcc ccttaccttc aaatggcgtt ctgcgggtat ctttgataag ttcattgatc 120 tttttaacaa ttcgcttatc tgtttcctgc cagtacagat aatcgtccca tgattcctca 180 gaccagatta gtttcactca atgatgtcct tttccgttcc tttgcctgat ttcaggctat 240 cgattgagtc catcaatctc cgggcgttag cgggggagcg cagtagataa gccgtctctt 300 ccagcgagtt gtattcttcg agtgacatca gaacacaagc ctctccattc tgacgagtaa 360 taaggatcgg ggcatgatct tcaacggctt tcatcattgt tgccgacaaa ttctgacgcg 420 cttcgctgta gctaattgta cgcatgtcaa tctcctcttt tgtacagttc attgtacaat 480 gatgagcgtt aattaa 496 <210> 2 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homology arm B for Histidine operon deletion <400> 2 gattacttcg cgttgtaatt gcgtagagca ttacgcccca gcacaatccc cgcgccaacc 60 atgccaccca gcagcaccgc cagaatcaag gtaattgcct ttttcgggct atcacgacga 120 ataggtaaca tcggtttcat cacataacgg taagcatgaa tatcaagatc atcaactttt 180 aagctttcga tatccagcag gttttgacga gtctgatagt agtttggcga gaacaccaac 240 ggacgggtcg cctcatgctt aatcatcgac tccagcgctt cgctccccaa aaggaacaac 300 gtatcttgtg tgatatcttc gccagtctgt tgaatctgcg gttttttctg ctcctgcgcg 360 actacttcct gcgttctt 378 <210> 3 <211> 508 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homology arm C for Histidine operon deletion <400> 3 gaagtgctaa tgctgggcta tatgaacccg gaagccttag acaaaaccct cgaaagcggc 60 aaagtcacct tcttctcgcg cactaaacag cgactgtgga ccaaaggcga aacgtcgggc 120 aatttcctca acgtagtgag tattgccccg gactgcgaca acgacacgtt actggtgctg 180 gcgaatccca tcggcccgac ctgccacaaa ggcaccagca gttgcttcgg cgacaccgct 240 caccagtggc tgttcctgta tcaactggaa caactgctcg ccgagcgcaa atctgccgat 300 ccggaaacct cctacaccgc caaactgtat gccagcggca ccaaacgcat tgcgcagaaa 360 gtgggtgaag aaggcgtgga aaccgcgctg gcagcaacgg tacatgaccg ctttgagctg 420 accaacgagg cgtctgattt gatgtatcac ctgctggtgt tgttgcagga tcaggggctg 480 gatttaacga cggtaattga gaacctgc 508 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I-SceI restriction site <400> 4 tagggataac agggtaat 18 <210> 5 <211> 658 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chloramphenicol resistant gene <400> 5 atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60 cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 120 attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 180 cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaattac gtatggcaat gaaagacggt 240 gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 300 acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat 360 tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag 420 aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg 480 gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc 540 gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg ccgtttgtga tggcttccat 600 gtcggcagat gcttaatgaa tacaacagta ctgcgatgag tggcagggcg gggcgtaa 658 <210> 6 <211> 1429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sacB gene <400> 6 atgaacgatg aacatcaaaa agtttgcaaa acaagcaaca gtattaacct ttactaccgc 60 actgctggca ggaggcgcaa ctcaagcgtt tgcgaaagaa acgaaccaaa agccatataa 120 ggaaacatac ggcatttccc atattacacg ccatgatatg ctgcaaatcc ctgaacagca 180 aaaaaatgaa aaatatcaag ttcctgaatt tgattcgtcc acaattaaaa atatctcttc 240 tgcaaaaggc ctggacgttt gggacagctg gccattacaa aacgctgacg gcactgtcgc 300 aaactatcac ggctaccaca tcgtctttgc attagccgga gatcctaaaa atgcggatga 360 cacatcgatt tacatgttct atcaaaaagt cggcgaaact tctattgaca gctggaaaaa 420 cgctggccgc gtctttaaag acagcgacaa attcgatgca aatgattcta tcctaaaaga 480 ccaaacacaa gaatggtcag gttcagccac atttacatct gacggaaaaa tccgtttatt 540 ctacactgat ttctccggta aacattacgg caaacaaaca ctgacaactg cacaagttaa 600 cgtatcagca tcagacagct ctttgaacat caacggtgta gaggattata aatcaatctt 660 tgacggtgac ggaaaaacgt atcaaaatgt acagcagttc atcgatgaag gcaactacag 720 ctcaggcgac aaccatacgc tgagagatcc tcactacgta gaagataaag gccacaaata 780 cttagtattt gaagcaaaca ctggaactga agatggctac caaggcgaag aatctttatt 840 taacaaagca tactatggca aaagcacatc attcttccgt caagaaagtc aaaaacttct 900 gcaaagcgat aaaaaacgca cggctgagtt agcaaacggc gctctcggta tgattgagct 960 aaacgatgat tacacactga aaaaagtgat gaaaccgctg attgcatcta acacagtaac 1020 agatgaaatt gaacgcgcga acgtctttaa aatgaacggc aaatggtatc tgttcactga 1080 ctcccgcgga tcaaaaatga cgattgacgg cattacgtct aacgatattt acatgcttgg 1140 ttatgtttct aattctttaa ctggcccata caagccgctg aacaaaactg gccttgtgtt 1200 aaaaatggat cttgatccta acgatgtaac ctttacttac tcacacttcg ctgtacctca 1260 agcgaaagga aacaatgtcg tgattacaag ctatatgaca aacagaggat tctacgcaga 1320 caaacaatca acgtttgcgc cgagcttcct gctgaacatc aaaggcaaga aaacatctgt 1380 tgtcaaagac agcatccttg aacaaggaca attaacagtt aacaaataa 1429 <210> 7 <211> 6155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSCI vector <400> 7 atcgatgaat tgatccgaag ttcctattct ctagaaagta taggaacttc gaattgtcga 60 caagcttgat ctggcttatc gaaattaata cgactcacta tagggagacc ggaattcgag 120 ctcggtacct tttggcgaaa atgagacgtt gatcggcacg taagaggttc cagctttcac 180 cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttttgagt tatcgagatt ttcaggagct 240 aaggaagcta aaatggagaa aaaaatcact ggatatacca ccgttgatat atcccaatgg 300 catcgtaaag aacattttga ggcatttcag tcagttgctc aatgtaccta taaccagacc 360 gttcagctgg atattacggc ctttttaaag accgtaaaga aaaataagca caagttttat 420 ccggccttta ttcacattct tgcccgcctg atgaatgctc atccgaaatt ccgtatggca 480 atgaaagacg gtgagctggt gatatgggat agtgttcacc cttgttacac cgttttccat 540 gagcaaactg aaacgttttc atcgctctgg agtgaatacc acgacgattt ccggcagttt 600 ctacacatat attcgcaaga tgtggcgtgt tacggtgaaa acctggccta tttccctaaa 660 gggtttattg agaatatgtt tttcgtctca gccaatccct gggtgagttt caccagtttt 720 gatttaaacg tggccaatat ggacaacttc ttcgcccccg 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gctttgctcg cagatggttg gcaaccgacg acagtcctgc 480 taaaa 485 <210> 29 <211> 566 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homology arm B for ProAB operon deletion <400> 29 gatgaaagtg tagagatcgc tgaagcatta aaagtgatcg tcaacgcgaa aactcagcgt 60 ccgagcacat gtaatacggt tgaaacgttg ctggtgaata aaaacatcgc cgatagcttc 120 ctgcccgcat taagcaaaca aatggcggaa agcggcgtga cattacacgc agatgcagct 180 gcactggcgc agttgcaggc aggccctgcg aaggtggttg ctgttaaagc cgaagagtat 240 gacgatgagt ttctgtcatt agatttgaac gtcaaaatcg tcagcgatct tgacgatgcc 300 atcgcccata ttcgtgaaca cggcacacaa cactccgatg cgatcctgac ccgcgatatg 360 cgcaacgccc agcgttttgt taacgaagtg gattcgtccg ctgtttacgt taacgcctct 420 acgcgtttta ccgacggcgg ccagtttggt ctgggtgcgg aagtggcggt aagcacacaa 480 aaactccacg cgcgtggccc aatggggctg gaagcactga ccacttacaa gtggatcggc 540 attggtgatt acaccattcg tgcgta 566 <210> 30 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homology arm C for ProAB operon deletion <400> 30 aaccttgtcc accgtgattc acgttcgtga acatgtcctt tcagggccga tatagctcag 60 ttggtagagc agcgcattcg taatgcgaag gtcgtaggtt cgactcctat tatcggcacc 120 attaaaatca aattgttacg taagatctta tcattctccc accaaaaaat tatcttaatg 180 taacagctgg tgtaagtaaa ttctatcaac gaagatcaat cttatctact gaccaaaaag 240 gcctgatagg gcttcgctca ctatacatcc ttggctgcag gtttagttgt acaccactcc 300 taaatttaat gtgttggcaa tgtgttcaat aaagctcgaa caaattagct cattatgatc 360 ggttaatact tcaacttctg gttgcatgat tgtttgtccg taaaaagata acgcgcctgc 420 cgggtagtag caggcgcatt acgcaatagg taaacaaggg ag 462 <210> 31 <211> 5145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insertion sequence for ProAB operon deletion <400> 31 aaactctgct tcccaacgac cataaccagt cagttgatcg ttaatttgtg tttcgccttt 60 gaaaccaaaa cggatataac tctggtcgcc atctttactg gcgttatcac tcatataatg 120 catggcttta actttgccat agacatccag tttattaccg tctttattat atatttctgc 180 agcctgtaca gatgcagatg ccacaatgcc catcaccact aatgccagag tgctcttttt 240 cattttcatt cctgatttta attaacgcgc gaatattcag cgggagagtc ccgttgaaaa 300 caggaaagtt tttaacctga gattgttaaa gatatattac agattaataa tattcttaaa 360 atgtggtaat ttattaaatc tgtaataaaa gcgtaaacaa ctgccgctag gcttgctgat 420 cccgcgcaac aaaacgccat gctttgctcg cagatggttg gcaaccgacg acagtcctgc 480 taaaagatct ggcttatcga aattaatacg actcactata gggagaccgg aattcgagct 540 cggtaccttt tggcgaaaat gagacgttga tcggcacgta agaggttcca gctttcacca 600 taatgaaata agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta tcgagatttt caggagctaa 660 ggaagctaaa actttactta tctaatctag acatcattaa ttcctaattt ttgttgacac 720 tctatcattg atagagttat tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa gtgaaatgaa 780 tagttcgaca aagatcgcat tggtaattac gttactcgat gccatgggga ttggccttat 840 catgccagtc ttgccaacgt tattacgtga atttattgct tcggaagata tcgctaacca 900 ctttggcgta ttgcttgcac tttatgcgtt aatgcaggtt atctttgctc cttggcttgg 960 aaaaatgtct gaccgatttg gtcggcgccc agtgctgttg ttgtcattaa taggcgcatc 1020 gctggattac ttattgctgg ctttttcaag tgcgctttgg atgctgtatt taggccgttt 1080 gctttcaggg atcacaggag ctactggggc tgtcgcggca tcggtcattg ccgataccac 1140 ctcagcttct caacgcgtga agtggttcgg ttggttaggg gcaagttttg ggcttggttt 1200 aatagcgggg cctattattg gtggttttgc aggagagatt tcaccgcata gtcccttttt 1260 tatcgctgcg ttgctaaata ttgtcacttt ccttgtggtt atgttttggt tccgtgaaac 1320 caaaaataca cgtgataata cagataccga agtaggggtt gagacgcaat cgaattcggt 1380 atacatcact ttatttaaaa cgatgcccat tttgttgatt atttattttt cagcgcaatt 1440 gataggccaa attcccgcaa cggtgtgggt gctatttacc gaaaatcgtt ttggatggaa 1500 tagcatgatg gttggctttt cattagcggg tcttggtctt ttacactcag tattccaagc 1560 ctttgtggca ggaagaatag ccactaaatg gggcgaaaaa acggcagtac tgctcgaatt 1620 tattgcagat agtagtgcat ttgccttttt agcgtttata tctgaaggtt ggttagattt 1680 ccctgtttta attttattgg ctggtggtgg gatcgcttta cctgcattac agggagtgat 1740 gtctatccaa acaaagagtc atgagcaagg tgctttacag ggattattgg tgagccttac 1800 caatgcaacc ggtgttattg gcccattact gtttactgtt atttataatc attcactacc 1860 aatttgggat ggctggattt ggattattgg tttagcgttt tactgtatta ttatcctgct 1920 atcgatgacc ttcatgttaa cccctcaagc tcaggggagt aaacaggaga caagtgctta 1980 gttatttcgt caccaaatga tgttattccg cgaaatataa tgaccctctt gataacccaa 2040 tttttttaag gcagttattg gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagatccggg 2100 gaatttatgg gattcacctt tatgttgata agaaataaaa gaaaatgcca ataggatatc 2160 ggcattttct tttgcgtttt tatttgttaa ctgttaattg tccttgttca aggatgctgt 2220 ctttgacaac agatgttttc ttgcctttga tgttcagcag gaagctcggc gcaaacgttg 2280 attgtttgtc tgcgtagaat cctctgtttg tcatatagct tgtaatcacg acattgtttc 2340 ctttcgcttg aggtacagcg aagtgtgagt aagtaaaggt tacatcgtta ggatcaagat 2400 ccatttttaa cacaaggcca gttttgttca gcggcttgta tgggccagtt aaagaattag 2460 aaacataacc aagcatgtaa atatcgttag acgtaatgcc gtcaatcgtc atttttgatc 2520 cgcgggagtc agtgaacaga taccatttgc cgttcatttt aaagacgttc gcgcgttcaa 2580 tttcatctgt tactgtgtta gatgcaatca gcggtttcat cacttttttc agtgtgtaat 2640 catcgtttag ctcaatcata ccgagagcgc cgtttgctaa ctcagccgtg cgttttttat 2700 cgctttgcag aagtttttga ctttcttgac ggaagaatga tgtgcttttg ccatagtatg 2760 ctttgttaaa taaagattct tcgccttggt agccatcttc agttccagtg tttgcttcaa 2820 atactaagta tttgtggcct ttatcttcta cgtagtgagg atctctcagc gtatggttgt 2880 cgcctgagct gtagttgcct tcatcgatga actgctgtac attttgatac gtttttccgt 2940 caccgtcaaa gattgattta taatcctcta caccgttgat gttcaaagag ctgtctgatg 3000 ctgatacgtt aacttgtgca gttgtcagtg tttgtttgcc gtaatgttta ccggagaaat 3060 cagtgtagaa taaacggatt tttccgtcag atgtaaatgt ggctgaacct gaccattctt 3120 gtgtttggtc ttttaggata gaatcatttg catcgaattt gtcgctgtct ttaaagacgc 3180 ggccagcgtt tttccagctg tcaatagaag tttcgccgac tttttgatag aacatgtaaa 3240 tcgatgtgtc atccgcattt ttaggatctc cggctaatgc aaagacgatg tggtagccgt 3300 gatagtttgc gacagtgccg tcagcgtttt gtaatggcca gctgtcccaa acgtccaggc 3360 cttttgcaga agagatattt ttaattgtgg acgaatcaaa ttcaggaact tgatattttt 3420 catttttttg ctgttcaggg atttgcagca tatcatggcg tgtaatatgg gaaatgccgt 3480 atgtttcctt atatggcttt tggttcgttt ctttcgcaaa cgcttgagtt gcgcctcctg 3540 ccagcagtgc ggtagtaaag gttaatactg ttgcttgttt tgcaaacttt ttgatgttca 3600 tcgttcatgt ctcctttttt atgtactgtg ttagcggtct gcttcttcca gccctcctgt 3660 ttgaagatgg caagttagtt acgcacaata aaaaaagacc taaaatatgt aaggggtgac 3720 gccaaagtat acactttgcc ctttacacat tttaggtctt gcctgcttta tcagtaacaa 3780 acccgcgcga tttacttttc gacctcattc tattagactc tcgtttggat tgcaactggt 3840 ctattttcct cttttgtttg atagaaaatc ataaaaggat ttgcagacta cgggcctaaa 3900 gaactaaaaa atctatctgt ttcttttcat tctctgtatt ttttatagtt tctgttgcat 3960 gggcataaag ttgccttttt aatcacaatt cagaaaatat cataatatct catttcacta 4020 aataatagtg aacggcaggt atatgtgatg ggttaaaaag gatccgctag ggataacagg 4080 gtaatataga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaac cttgtccacc gtgattcacg 4140 ttcgtgaaca tgtcctttca gggccgatat agctcagttg gtagagcagc gcattcgtaa 4200 tgcgaaggtc gtaggttcga ctcctattat cggcaccatt aaaatcaaat tgttacgtaa 4260 gatcttatca ttctcccacc aaaaaattat cttaatgtaa cagctggtgt aagtaaattc 4320 tatcaacgaa gatcaatctt atctactgac caaaaaggcc tgatagggct tcgctcacta 4380 tacatccttg gctgcaggtt tagttgtaca ccactcctaa atttaatgtg ttggcaatgt 4440 gttcaataaa gctcgaacaa attagctcat tatgatcggt taatacttca acttctggtt 4500 gcatgattgt ttgtccgtaa aaagataacg cgcctgccgg gtagtagcag gcgcattacg 4560 caataggtaa acaagggagg atgaaagtgt agagatcgct gaagcattaa aagtgatcgt 4620 caacgcgaaa actcagcgtc cgagcacatg taatacggtt gaaacgttgc tggtgaataa 4680 aaacatcgcc gatagcttcc tgcccgcatt aagcaaacaa atggcggaaa gcggcgtgac 4740 attacacgca gatgcagctg cactggcgca gttgcaggca ggccctgcga aggtggttgc 4800 tgttaaagcc gaagagtatg acgatgagtt tctgtcatta gatttgaacg tcaaaatcgt 4860 cagcgatctt gacgatgcca tcgcccatat tcgtgaacac ggcacacaac actccgatgc 4920 gatcctgacc cgcgatatgc gcaacgccca gcgttttgtt aacgaagtgg attcgtccgc 4980 tgtttacgtt aacgcctcta cgcgttttac cgacggcggc cagtttggtc tgggtgcgga 5040 agtggcggta agcacacaaa aactccacgc gcgtggccca atggggctgg aagcactgac 5100 cacttacaag tggatcggca ttggtgatta caccattcgt gcgta 5145 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer proAA <400> 32 aaactctgct tcccaacgac 20 <210> 33 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer proAB <400> 33 gaatcacggt ggacaaggtt aaaacgtttt agcaggactg tcgtc 45 <210> 34 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer proBA <400> 34 agagtcgacc tgcaggcatg cgatgaaagt gtagagatcg ctg 43 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer proBB <400> 35 tacgcacgaa tggtgtaatc 20 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer proCA <400> 36 gttttaacct tgtccaccgt gattc 25 <210> 37 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer proCB <400> 37 attaatttcg ataagccaga tcctcccttg tttacctatt gcg 43 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer IN_F for recombinant PCR <400> 38 gatctggctt atcgaaatta atacg 25 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer IN_B for recombinant PCR <400> 39 tttagcttcc ttagctcctg 20 <210> 40 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Km_F for recombinant PCR <400> 40 caggagctaa ggaagctaaa ccctgcaaag taaactggat g 41 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Km_B for recombinant PCR <400> 41 ggcgtcccgg aaaacgattc cg 22 <210> 42 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Tc_F for recombinant PCR <400> 42 caggagctaa ggaagctaaa actttactta tctaatctag ac 42 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Tc_B for recombinant PCR <400> 43 ttgggttatc aagagggtc 19 <210> 44 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SacB_Tc_F for recombinant PCR <400> 44 gaccctcttg ataacccaat ttttttaagg cagttattgg 40 <210> 45 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SacB_Km_F for recombinant PCR <400> 45 cggaatcgtt ttccgggacg ccttttttta aggcagttat tgg 43 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer SacB_B for recombinant PCR <400> 46 gcatgcctgc aggtcgactc 20

Claims (9)

1. 선별마커를 남기지 않고 미생물 염색체의 특정 부분을 제거하는데 사용되는 선형 DNA 단편으로서,

   상기 선형 DNA 단편의 미생물 내 도입시 람다-레드 재조합에 관여하는 상동부위 A 및 상동부위 C; 선별마커 제거시 동성 재조합에 관여하는 상동부위 B; 선별마커; 상기 선별마커 제거 여부의 확인인자로서 sacB 유전자 (SEQ ID NO: 6); 및 선별마커 제거를 위한 동성 재조합에 관여하는 I-SceI 제한 효소 절제 부위 (SEQ ID NO: 4)를 포함하여 이루어지며,

   상기 상동부위 A는 미생물 염색체의 제거하고자 하는 부분의 한 쪽 말단의 500 bp와 상동인 부위이고, 상동부위 C는 상기 미생물 염색체의 제거하고자 하는 부분의 다른 쪽 말단의 500 bp와 상동인 부위이며,

   상기 상동부위 B는 상동부위 A 및 상동부위 C와 상동인 미생물 염색체 부위 중 어느 하나와 인접하는 500 bp 부위와 상동인 부위이며,

   상동부위 A 및 상동부위 C는 양쪽 말단에 하나씩 위치하고, 그 내부에 상동부위 B, 선별마커, sacB 유전자 및 I-SceI 제한효소 절제부위가 위치하며, 상동부위 B는 상동부위 A 및 상동부위 C 중에서 자신과 상동인 미생물 염색체 부위에 인접한 말단과 상동이 아닌 것에 인접하여 위치하는 것을 특징으로 하는,

   선형 DNA 단편.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 선별마커가 클로람페니콜 저항 유전자(Cm^R, SEQ ID NO:5)이고, 상기 상동부위 A, B 및 C가 각각 SEQ ID NO:1, 2 및 3의 서열을 갖는 선형 DNA 단편.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 선별마커가 카나마이신 저항 유전자(Km^R, SEQ ID NO:16)이고, 상기 상동부위 A, B 및 C가 각각 SEQ ID NO:17, 18 및 19의 서열을 갖는 선형 DNA 단편.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 선별마커가 테트라사이클린 저항 유전자(Tc^R, SEQ ID NO:27)이고, 상기 상동부위 A, B 및 C가 각각 SEQ ID NO:28, 29 및 30의 서열을 갖는 선형 DNA 단편.
5. (1) 제1항에 따른 선형 DNA 단편을 제조하는 단계;

   (2) 상기 DNA 단편 상의 상동 부위 A와 상동부위 C 및 이와 상동인 미생물 염색체 부위 간의 람다-레드 재조합을 이용하여, 상기 선형 DNA 단편을 미생물 염색체의 특정 위치에 대체(replacement)시키는 단계; 및

   (3) 상기 특정 염색체 부분이 대체된 미생물에 I-SceI 제한 효소 발현 벡터를 도입하고 I-SceI 제한효소를 발현시켜, 상기 DNA 단편 상의 상동 부위 B 및 이와 상동인 미생물 염색체 부위 간의 동성 재조합을 유발하여, 선별마커를 제거하는 단계를 포함하고,

   상기 상동부위 A는 미생물 염색체의 제거하고자 하는 부분의 한 쪽 말단의 약 500 bp와 상동인 부위이고, 상동부위 C는 상기 미생물 염색체의 제거하고자 하는 부분의 다른 쪽 말단의 500 bp와 상동인 부위이며,

   상기 상동부위 B는 상동부위 A 및 상동부위 C와 상동인 미생물 염색체 부위 중 어느 하나와 인접하는 500 bp 부위와 상동인 부위인 것을 특징으로 하는,

   선별마커를 남기지 않고 특정 염색체 부위가 제거된 미생물 변이주를 제조하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 선형 DNA 단편을 제조하는 단계가,

   Cm^R 유전자를 갖는 pSG76C 벡터를 두 개의 제한효소 KpnI과 BamHI으로 절단하고, 리가아제를 이용하여 상기 Cm^R 유전자를 KpnI과 BamHI 제한효소로 절단시킨 I-SceI 제한효소 절제부위를 갖는 선상의 pST76K 벡터에 삽입하고, 이를 BamHI 제한효소로 한 번 더 절단한 후, 여기에 pDELTA 벡터를 BamHI 제한효소로 절단하여 얻은 sacB 유전자를 리가아제를 이용하여 삽입하여 pCSI 벡터(SEQ ID NO:7)를 제조하고,

   특정 프라이머를 사용하여 제거될 미생물 염색체 부분의 양 말단에 위치하는 두 개의 약 500bp 염기서열 부분을 증폭하여 상동부위 A 및 C(SEQ ID NO:1 및 3)를 얻고 상기 양 말단 중 어느 한 쪽에 인접하여 위치하는 약 500 bp 염기서열 부분을 증폭하여 상동부위 B(SEQ ID NO:2)를 얻은 후,

   상기 pSCI 벡터와 3 개의 상동부위를 주형으로 하고, 상기 pSCI 벡터의 양쪽 말단에 상동부위 A 및 C를 위치시키고, 한쪽 말단에 상동부위 B를 위치시켜서 PCR 반응을 하여 선형 DNA 단편을 제조하는 것을 포함하는 방법.
7. 제 5 항에 있어서, 상기 선형 DNA 단편을 제조하는 단계가,

   제 6 항의 방법에 따라서 얻어진 선형 DNA 단편의 Cm^R 유전자 앞부분과 뒷부분을 PCR을 통하여 증폭해 내고, 이 앞부분과 뒷부분을 Km^R 유전자와 함께 재조합 PCR 반응 시켜서 Cm^R 유전자가 Km^R 유전자로 대체된 PCR 단편을 얻고,

   특정 프라이머를 사용하여 제거될 미생물 염색체 부분의 양 말단에 위치하는 두 개의 약 500bp 염기서열 부분을 증폭하여 상동부위 A 및 C(SEQ ID NO:17 및 19)를 얻고 상기 양 말단 중 어느 한 쪽에 인접하여 위치하는 약 500 bp 염기서열 부분을 증폭하여 상동부위 B(SEQ ID NO:18)를 얻은 후,

   상기 PCR 단편과 3개의 상동부위를 주형으로 하고, 상기 PCR 단편의 양쪽 말단에 상동부위 A 및 C를 위치시키고, 한쪽 말단에 상동부위 B를 위치시켜서 PCR 반응을 하여 선형 DNA 단편을 제조하는 것을 포함하는 방법.
8. 제 5 항에 있어서, 상기 선형 DNA 단편을 제조하는 단계가,

   제 6 항의 방법에 따라서 얻어진 선형 DNA 단편의 Cm^R 유전자 앞부분과 뒷부분을 PCR을 통하여 증폭해 내고, 이 앞부분과 뒷부분을 Tc^R 유전자와 함께 재조합 PCR 반응 시켜서 Tc^R 유전자로 대체된 PCR 단편을 얻고,

   특정 프라이머를 사용하여 제거될 미생물 염색체 부분의 양 말단에 위치하는 두 개의 약 500bp 염기서열 부분을 증폭하여 상동부위 A 및 C(SEQ ID NO:28 및 30)를 얻고 상기 양 말단 중 어느 한 쪽에 인접하여 위치하는 약 500 bp 염기서열 부분을 증폭하여 상동부위 B(SEQ ID NO:29)를 얻은 후,

   상기 PCR 단편과 3 개의 상동부위를 주형으로 하고, 상기 PCR 단편의 양쪽 말단에 상동부위 A 및 C를 위치시키고, 한쪽 말단에 상동부위 B를 위치시켜서 PCR 반응을 하여 선형 DNA 단편을 제조하는 것을 포함하는 방법.
9. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 (2) 단계와 제 (3) 단계를 반복하여 수행하는 단계를 추가적으로 포함함으로써, 순차적으로 특정 유전자를 제거할 수 있는 방법.