CN113383084A - 生产功能化单链寡核苷酸的方法和产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及功能化单链寡核苷酸，尤其涉及生产功能化单链寡核苷酸的方法，包括：(a)提供环状DNA分子，该环状DNA分子包含与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列；(b)以(a)的环状DNA分子为模板，用一种以上功能化核苷酸(dNTP)进行滚环扩增(RCA)反应；以及(c)在裂解结构域酶促裂解RCA反应的产物，释放功能化单链寡核苷酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产功能化单链寡核苷酸的方法。特别地，本发明提供了一种方法，该方法在酶介导的滚环扩增(RCA)反应中利用功能化核苷酸来产生多个功能化寡核苷酸(例如文库)。还提供了用于该方法的试剂盒和通过该方法获得的功能化单链寡核苷酸。特别地，本发明提供了包含通过该方法获得的多个功能化单链寡核苷酸的文库。
背景技术
单链核苷酸可用于广泛的应用，因为它们能够通过沃森克里克碱基配对与互补序列(例如分子间)杂交。此外，单链寡核苷酸可以与自身杂交(即分子内互补)以形成复杂的拓扑几何结构和分子组装，包括被称为适配体的二级结构。这些适配体可以通过非共价相互作用与生物靶标以高亲和力结合来实现一系列不同的功能。寡核苷酸的效用可以通过向核苷酸添加官能团来增强，特别是在核碱基上(即添加反应性化学基团)，这样不会干扰沃森克里克碱基配对。然而，此类功能化单链寡核苷酸的合成可能存在问题，从而阻碍了上述应用的发展。
目前，单链寡核苷酸通常使用固相合成来生产，其中核苷酸以逐步添加的方式添加到与固体载体结合的生长链中。然而，这种方法产生的寡核苷酸在长度和准确性方面受到严重限制。固相合成生产寡核苷酸的错误率明显高于自然界中观察到的聚合酶的错误率，并且随着寡核苷酸长度的增加而急剧增加，以至于长度约为50个残基的商业寡核苷酸的纯度通常只有70％。此外，含有高密度功能化核苷酸的单链寡核苷酸的可用性会因为固相合成的长度、质量和成本方面而受到限制。尤其，例如由于官能团产生的交叉反应，可以掺入由固相合成产生的单链寡核苷酸的功能化核苷酸的数量是有限的。
合成寡核苷酸的诸多用途都要求其高纯度，这意味着通常需要通过高效液相色谱(HPLC)或聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)等方法进行额外的纯化步骤，以分离固相合成反应的所需产物。这使得当前的方法既费力又昂贵。此外，即使在这些额外的纯化步骤之后，仍可以观察到由残留杂质引起的实际问题。
鉴于固相方法的这些问题，需要一种生产功能化寡核苷酸的替代方法，特别是能够以更高的准确度生产更长的寡核苷酸的经济高效的方法。
修饰(例如功能化)的核苷酸以前已用于酶促反应以产生寡核苷酸，但仅在通过聚合酶链反应(PCR)或引物延伸(PE)反应产生功能化DNA的情况下使用。这些反应需要使用特定的引物，然后必须将其去除，并且不仅需要通过聚合酶来掺入修饰的核苷酸，而且如果是PCR的情况下，功能化的产物需要被识别为模板。在某些修饰下，这可能是有问题的，因此限制了这些方法的应用。此外，引物是通过固相方法合成的，没有经过序列验证，会导致新合成的DNA中的错误被放大。另外，基于PCR的方法也会产生大量的双链DNA产物，因此需要额外的洗脱和纯化步骤来获得功能化的单链寡核苷酸。
发明内容
本发明人之前已经描述了一种由经序列验证的模板酶促生产“单克隆化学计量”(MOSIC，monoclonal stoichiometric)单链DNA寡核苷酸的方法(Ducani等，2013，NatureMethods，647-652)。发明人惊奇的发现，MOSIC方法可以成功地适用于生产功能化单链寡核苷酸。
在代表性实施例中，该方法涉及设计和制备包含一个或多个寡核苷酸序列的线性序列，每个寡核苷酸序列与含有限制性酶切位点的发夹序列邻接。然后将线性序列环化成双链滚环扩增(RCA)模板，在一个或多个功能化核苷酸存在下，通过RCA裂解和扩增该模板以产生包含功能化核苷酸的部分单链线性多联体。然后用识别上述发夹区中限制性酶切位点的限制性核酸内切酶处理RCA产物，并裂解多联体以释放多个功能化单链寡核苷酸，即产生功能化的寡核苷酸文库。
如实施例中所示，发明人有利地确定，与预期相反，功能化核苷酸通过具有链置换活性的DNA聚合酶有效地掺入，并且不会阻止发夹结构的形成或干扰它们的稳定性或有效裂解。此外，发明人发现功能化核苷酸可用于MOSIC方法，同时仍保持与该方法相关的有益特性。例如，与上述基于PCR的方法相比，本方法不需要引物并且可以直接产生功能化单链寡核苷酸。这避免了让引物退火或将双链产物转化为单链寡核苷酸所需要的任何额外步骤。此外，本方法不需要将功能化核苷酸识别为进一步扩增的模板，这意味着可以掺入更多数量的功能化残基。
因此，从广义上讲，可以看出本发明提供了环状DNA分子在生产功能化单链寡核苷酸中的用途，所述环状DNA分子包含与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列。更具体地，本发明可被视为环状DNA分子和一个以上功能化核苷酸在生产功能化单链寡核苷酸中的用途，所述环状DNA分子包含与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列。
很明显，当功能化核苷酸与等效的常规核苷酸组合使用时，功能化核苷酸可以随机掺入由RCA反应产生的串联体中，因此串联体的裂解会得到多个功能化单链寡核苷酸(例如文库)，即其中功能化核苷酸掺入到寡核苷酸的不同位置。更明显的是，所产生的功能化寡核苷酸的多样性可以通过使用包含多个寡核苷酸序列的环状DNA分子来增加，每个寡核苷酸序列与裂解结构域邻接。寡核苷酸序列的序列和/或长度可以不同。另外或可选地，可以通过在RCA反应中使用功能化核苷酸的组合来增加功能化寡核苷酸的多样性。通过在寡核苷酸合成后修饰寡核苷酸，可以更进一步的将多样性引入到功能化寡核苷酸文库中，例如，通过将分子或组分与寡核苷酸中的功能化核苷酸缀合。因此很明显，本发明有利地提供了一种用于酶促生产高度功能化的单链DNA寡核苷酸的新方法，该方法可以在DNA纳米技术、核酸影像和生物医学中开辟新的应用。因此，在一个特定方面，本发明提供了一种生产功能化单链寡核苷酸的方法，所述方法包括：
(a)提供环状DNA分子，所述环状DNA分子包含与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列；
(b)以(a)的环状DNA分子为模板，用一种以上功能化核苷酸(dNTP)进行滚环扩增(RCA)反应；和
(c)在裂解结构域裂解RCA反应的产物，释放功能化单链寡核苷酸。
如下文更详细讨论的，提供环状DNA分子的步骤可以通过任何合适的方式实现，可取决于环状DNA分子的结构。在这方面，环状DNA分子可以是单链DNA分子或双链DNA分子。
在环状DNA分子是双链分子的实施方案中，显然环状DNA分子必须被加工以提供RCA模板。因此，在一些实施方案中，该方法包括附加步骤：在进行RCA反应之前，裂解环状DNA分子的单链，提供RCA模板。
本发明可有利地用于生产包含任何寡核苷酸序列的功能化寡核苷酸。因此，任何合适的序列都可以用作本发明环状DNA分子中的寡核苷酸序列。合适的序列是指寡核苷酸序列结构域不应干扰(即抑制或扭曲)RCA产物的产生或裂解。例如，在一些实施方案中，可以对寡核苷酸序列进行设计，以避免产生可能会抑制RCA反应中聚合酶的前进或导致聚合酶的置换的二级结构。然而，在一些实施方案中，寡核苷酸序列可以是适配体或可以编码适配体。
此外，可以设计寡核苷酸序列以使其不与RCA产物中的裂解结构域特异性杂交。或者，可以设计与寡核苷酸序列邻接的裂解结构域，使得它们不与RCA产物中的寡核苷酸序列特异性杂交。
在环状DNA分子包含多个寡核苷酸序列的实施方案中，可以设计每个序列以使其不与RCA产物中的其他寡核苷酸序列特异性杂交。然而，在一些实施方案中，可能需要产生含有互补区域的功能化寡核苷酸，例如使所述寡核苷酸能够相互作用，特别是在它们从RCA产物中释放后。因此，在一些实施方案中，寡核苷酸序列可以设计为促进由该方法生产的功能化寡核苷酸的相互作用(例如杂交)，只要这种相互作用不干扰RCA产物的生产或裂解，即功能化寡核苷酸的生产。
因此，在一些实施方案中，环状DNA分子的寡核苷酸序列的核酸序列与裂解结构域中的核酸序列和/或与环状DNA分子中的其他寡核苷酸序列具有小于80％的序列同一性。优选地，环状DNA分子的寡核苷酸序列与裂解结构域中的核酸序列和/或与环状DNA分子中的其他寡核苷酸序列具有小于70％、60％、50％或小于40％的序列同一性。序列同一性可以通过本领域已知的任何合适的方法来确定，例如，使用BLAST比对算法。
因此，术语“寡核苷酸序列”没有特别限制，是指用于产生本发明的功能化单链寡核苷酸或其互补物的模板序列。在这方面，当环状DNA分子是单链时，环状DNA分子的序列是步骤(b)中获得的RCA产物中重复(串联)序列的反向互补序列。当环状DNA分子是双链时，它包含步骤(b)中获得的RCA产物中的重复序列及其反向互补序列。因此，对环状DNA进行加工以提供RCA模板的步骤可包括裂解环状DNA分子的链的步骤，所述链包含将在RCA产物中重复的序列。
本发明可用于生产任何所需长度的功能化单链寡核苷酸。如实施例中所示，该方法可用于生产功能化单链寡核苷酸，其长度远远超过使用固相合成方法可准确生产的寡核苷酸长度。因此，寡核苷酸序列(以及由此方法产生的功能化寡核苷酸)的长度可以在约6至约10000个核苷酸之间。因此，在一些实施方案中，该方法可被视为生产功能化多核苷酸。在这方面，“寡核苷酸”和“多核苷酸”之间的大小界限在本领域中没有明确定义。例如，超过400个核苷酸的序列可称为多核苷酸。因此，术语寡核苷酸和多核苷酸在本文中可互换使用，指在上述大小范围内的核苷酸序列。然而，在使用术语“多核苷酸”时，它通常是指包含超过400个核苷酸的序列。因此，在一些实施方案中，该方法和用途可被视为生产多个功能化单链DNA分子。
在一些实施方案中，寡核苷酸序列的长度可约为6至约750个核苷酸，包括长度为约6至约500个核苷酸，例如长度为约6至约450个核苷酸，例如长度为约8至约400个核苷酸，长度为约8至约300个核苷酸，长度为约8至约250个核苷酸，长度为约10至约200个核苷酸，长度为约10至约150个核苷酸，长度为约12至约100个核苷酸，长度为约12至约75个核苷酸，长度为约14至约70个核苷酸，长度为约14至约60个核苷酸等。在一些实施方案中，寡核苷酸序列包含约10-400、11-390、12-380、13-370、14-360或15-350个核苷酸。
如上所述，本发明在生产更长的寡核苷酸方面特别有效，例如包含约30个或更多个核苷酸，例如约35、40、45、50、60、70、80、90、100个或更多个核苷酸。例如，本发明产生的寡核苷酸可含有约30-1000、40-900、50-800、60-700、70-600、80-500、90-450或100-400个核苷酸。在一些实施方案中，本发明产生的寡核苷酸(例如多核苷酸)可包含约400-10000、500-9000、600-8000、700-7000、800-6000、900-5000或1000-4000个核苷酸，例如包含约500、1000、1500、2000、2500、3000、3500或更多个核苷酸。
在一些实施方案中，环状DNA分子包含多个寡核苷酸序列，其中每个寡核苷酸序列与裂解结构域邻接。寡核苷酸序列可以彼此相同或不同或其组合。因此，在一些实施方案中，环状DNA分子可以包含多于一个拷贝的相同寡核苷酸序列，例如2、3、4、5个等拷贝，按下述定义。在一些实施方案中，环状DNA分子可以包含多个不同寡核苷酸序列(例如2、3、4、5个等不同寡核苷酸序列，定义如下)中每个的一个拷贝。在一些实施方案中，环状DNA分子可包含多个不同寡核苷酸序列的一个以上拷贝。如下文进一步讨论的，本发明可基于环状DNA分子中寡核苷酸序列的拷贝数，产生受控化学计量的多个功能化寡核苷酸。
显然，环状DNA分子中的多个寡核苷酸序列可以以任何顺序存在。例如，相同寡核苷酸序列的多个拷贝可以在环状DNA分子中彼此直接相邻(仅由与寡核苷酸序列邻接的裂解结构域分隔)。或者，相同寡核苷酸序列的多个拷贝可以散布有不同的寡核苷酸序列。可以设计环状DNA分子(例如多个寡核苷酸序列的顺序)以避免或最小化RCA产物中重复序列之间的相互作用，该相互作用可能干扰如上定义的RCA产物的产生或裂解。
如本文所用，术语“多个”是指两个以上，例如取决于本发明的上下文，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30或更多，例如50、100、150、200、250或更多。例如，环状DNA分子可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30个或更多个寡核苷酸序列，例如2-100、3-90、4-80、5-70、6-60、7-50、8-40、9-30或10-20个寡核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明的方法可产生至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30个或更多个功能化单链寡核苷酸，例如50、100、150、200、250个或更多个，即具有不同序列和/或结构的寡核苷酸。在这方面，不同的功能化寡核苷酸可以由相同模板的寡核苷酸序列产生，因为功能化的核苷酸可以随机掺入在RCA产物中，即当功能化的核苷酸以小于100％的相对量存在时，如上所述。此外，如果环状DNA分子含有多个不同的寡核苷酸序列，每个模板将产生多个不同的功能化单链寡核苷酸。此外，由于RCA反应可利用多个环状DNA分子，该反应将导致每个功能化单链寡核苷酸都会有多个拷贝，例如每个功能化单链寡核苷酸有103、104、105、106、107、108、109、1010或更多个拷贝。
术语“不同”是指寡核苷酸序列或功能化单链寡核苷酸包含一种以上不同的核苷酸。因此，不同的寡核苷酸序列可能有一个或多个不同的核苷酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同的核苷酸，例如20、30、40、50、60、70、80、90或更多个不同的核苷酸。差异可能在于寡核苷酸序列的长度和/或序列。或者，不同的寡核苷酸序列彼此具有小于100％的序列同一性，例如彼此之间具有小于99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、70％、60％、50％的序列同一性。不同的功能化单链寡核苷酸可包含相同的核苷酸序列，但在寡核苷酸内功能化核苷酸的位置不同或在特定位置的功能化核苷酸的类型不同(例如在RCA反应中使用功能化核苷酸的组合时)。或者或额外的，不同的功能化单链寡核苷酸在如上定义的寡核苷酸序列上可能不同。
因此，本发明可用于同时产生多种不同的功能化单链寡核苷酸。特别地，通过改变环状DNA分子的序列，特别是通过控制存在的每个不同寡核苷酸序列的拷贝数，可以控制由本方法最终产生的功能化单链寡核苷酸的化学计量。然而，由于源自每个寡核苷酸序列的功能化单链寡核苷酸可能不同(由于功能化核苷酸随机掺入RCA产物中)，功能化单链寡核苷酸的化学计量可以根据寡核苷酸的数量在特定的寡核苷酸序列中进行控制。因此，环状DNA分子可包含多个不同寡核苷酸序列的多个拷贝。
本文使用的术语“裂解结构域(cleavage domain)”通常是指环状DNA分子内的结构域，其导致RCA产物内的结构域可以被特异性裂解来释放功能化的单链寡核苷酸。因此，环状DNA分子中的裂解结构域可能能够直接裂解，或者它可以简单地编码仅在RCA产物中起作用或在特定条件下(例如与辅助因子接触时)起作用的裂解结构域。
“裂解”包括破坏共价键的任何方式。因此，在本发明的上下文中，裂解包括核苷酸链中共价键的裂解(即链裂解或链断裂)，例如通过磷酸二酯键的裂解。
因此，在一些实施方案中，裂解结构域可包含被一种以上能够裂解核酸分子，即能够破坏两个以上核苷酸之间的磷酸二酯键的酶识别的序列。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种生产功能化单链寡核苷酸的方法，所述方法包括：
(a)提供环状DNA分子，所述环状DNA分子包含与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列；
(b)以(a)的环状DNA分子为模板，用一种以上功能化核苷酸(dNTP)进行滚环扩增(RCA)反应；和
(c)在裂解结构域酶促裂解RCA反应的产物，释放功能化单链寡核苷酸。
因此，在一些实施方案中，步骤(c)包括使RCA反应的产物与裂解酶接触。
例如，裂解结构域可包含限制性核酸内切酶(限制性核酸内切酶)识别序列。限制性核酸内切酶在称为限制性酶切位点的特定识别核酸序列处切割双链或单链DNA，合适的酶是本领域公知的。例如，可能特别有利是使用稀切限制酶，即具有长识别位点(长度至少8个碱基对)的酶，以促进环状DNA分子中的寡核苷酸序列的设计，例如以避免在寡核苷酸序列中包含裂解识别位点。
在一些实施方案中，裂解结构域可包含被II型限制性核酸内切酶、更优选IIs型限制性核酸内切酶识别的序列。尽管在本发明中可以使用任何合适的裂解结构域和裂解酶，但在一些实施方案中，识别与寡核苷酸序列邻接的裂解结构域的裂解酶可以是BseGI、BtsCI或其同裂酶，例如BstF5I或FokI。可以使用的其他代表性酶包括BsrDI、BtsI、BtsIMutI、MlyI或其同裂酶。
因此，在一些实施方案中，裂解RCA反应产物的步骤包括：在合适的条件下使RCA产物与裂解酶接触，以在裂解结构域中选择性裂解RCA产物。
在一些实施方案中，可通过添加另一组分使RCA产物中的裂解结构域具有功能性(可被激活)，即RCA产物可被设计成包含功能性裂解结构域，例如限制性核酸内切酶识别序列。例如，这可以通过将寡核苷酸(本文称为“限制性寡核苷酸”)与RCA产物的裂解结构域杂交以形成双链体来实现。所形成的双链体的至少一部分将包含限制性核酸内切酶识别位点，其可以被裂解导致功能化寡核苷酸的释放。在掺入RCA产物(特别是裂解结构域)的功能化核苷酸可能会干扰裂解酶的活性(例如降低效率)的实施方案中，这可能是尤为有利的。
因此，在一些实施方案中，裂解RCA反应产物的步骤可以包括：使RCA产物与限制性寡核苷酸和裂解酶接触。限制性寡核苷酸和裂解酶可以同时或依次与RCA产物接触。
在一些实施方案中，裂解结构域可以通过裂解酶以外的方式裂解。例如，裂解结构域可包含自裂解寡核苷酸序列，例如脱氧核酶。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种生产功能化单链寡核苷酸的方法，所述方法包括：
(a)提供环状DNA分子，所述环状DNA分子包含与自裂解裂解结构域(例如包含脱氧核酶的裂解结构域)邻接的寡核苷酸序列；
(b)以(a)的环状DNA分子为模板，用一种以上功能化核苷酸(dNTP)进行滚环扩增(RCA)反应；和
(c)在裂解结构域裂解RCA反应的产物，释放功能化单链寡核苷酸，
其中步骤(c)包括激活RCA反应产物中的自裂解裂解结构域。
合适的自裂解序列是本领域已知的。在利用自裂解序列的实施方案中，裂解结构域可能仅在RCA产物中是有功能的(活性的)。或者，自裂解序列在特定条件下可以是有功能的，因此该方法可以包括步骤：使RCA产物经受促进RCA产物在裂解结构域中裂解的条件，即激活自裂解序列的条件，例如使RCA产物与自裂解活性所需的辅助因子(例如金属离子)接触。或者，裂解RCA反应的产物的步骤可以包括使RCA产物经受促进RCA产物在裂解结构域中裂解的条件，即激活自裂解序列的条件，例如使RCA产物与自裂解活性所需的辅助因子(例如金属离子)接触。
在一些实施方案中，裂解结构域包含能够形成发夹结构的序列或由其组成。发夹结构也可称为发夹环或茎环并且这些术语在本文中可互换使用。发夹是一种分子内碱基配对模式，可以出现在单链DNA或RNA分子中。当同一链的两个区域通常在以相反方向阅读时核酸序列互补，就会出现发夹，碱基对(杂交)形成双链茎(双链体)和未配对的(即单链)环。由此产生的结构可以被描述为棒棒糖形状。
因此，在裂解结构域包含能够形成发夹结构的序列或由其组成的一些实施方案中，裂解结构域包含自我互补的序列。随着RCA产物的延伸，这些自互补区域杂交产生发夹结构，其中发夹结构的双链部分包含被裂解酶识别的序列。因此，RCA产物中发夹结构的双链部分的裂解会导致功能化单链寡核苷酸和发夹结构(即形成发夹结构的寡核苷酸)的释放。
如本文所用，术语“杂交”或“使杂交”是指在核苷酸序列之间形成双链体，其以沃森-克里克碱基配对方式充分互补形成双链体。当两个分子共享碱基对组织同源(organization homology)时，这两个核酸序列彼此“互补”。“互补”核酸序列在适当的杂交条件下将特异性结合形成稳定的双链体。例如，当第一个序列的一部分可以反平行结合第二个序列的一部分时，两个序列是互补的，其中每个序列的3'-末端与另一个序列的5'-末端结合，并且然后将一个序列的每个A、T(U)、G和C分别与另一序列的T(U)、A、C和G进行比对。RNA序列还可以包括互补的G＝U或U＝G碱基对。因此，根据本发明，两个序列不需要具有完美的同源性才能“互补”。通常，当至少约90％(优选至少约95％)的核酸在确定的分子长度上共享碱基对组织时，两个序列是充分互补的。
在裂解RCA产物后，功能化的寡核苷酸被释放。释放的功能化寡核苷酸可以仅由寡核苷酸序列组成(即没有额外的核苷酸)，或者它们可以在一端或两端包含来自与寡核苷酸序列邻接的裂解结构域的一个或多个额外的核苷酸。因此，在一些实施方案中，功能化的寡核苷酸可以在一端或两端包含来自裂解结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。优选地，环状DNA分子的序列被设计成当RCA产物被裂解时，释放的功能化寡核苷酸不包含来自裂解结构域的任何额外的核苷酸。或者，与寡核苷酸序列邻接的裂解结构域可以排列在环状DNA分子中，使得RCA产物中它们的裂解导致不包含来自裂解结构域的任何额外核苷酸的功能化寡核苷酸的释放。
由于裂解酶可以在裂解酶识别序列之外的位置裂解核酸分子，因此在裂解结构域和寡核苷酸序列之间可以存在一个或多个核苷酸。或者，除了裂解酶识别序列之外，裂解结构域还可以包含核苷酸序列以确保裂解导致完整的功能化单链寡核苷酸的释放，优选没有任何额外的核苷酸(例如，形成裂解结构域的一部分的核苷酸)。
因此，术语“邻接”是指裂解结构域与寡核苷酸序列直接相邻或间接相邻。或者，裂解结构域位于寡核苷酸序列的任一端，即裂解结构域位于寡核苷酸序列的上游和下游(在5'和3'端)。在一些实施方案中，裂解结构域的裂解位点(例如裂解酶对裂解结构域进行裂解的位点)与它所邻接的寡核苷酸序列的末端直接相邻。在一些实施方案中，寡核苷酸序列和裂解结构域序列可以重叠，即寡核苷酸序列的末端可以形成裂解结构域的一部分，例如当裂解位点是裂解结构域内的内部位点时，即裂解结构域可以形成寡核苷酸序列的末端或部分末端。因此，在一些实施方案中，可以有一个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸在裂解结构域和寡核苷酸序列之间(即在序列末端之间)。在一些实施方案中，裂解结构域和寡核苷酸序列可以重叠一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)核苷酸。
环状DNA分子中裂解结构域的大小没有特别限制，其将取决于裂解结构域的类型，如上所述。裂解结构域可以被设计或选择成使裂解结构域的长度不同于寡核苷酸序列的长度的方案，从而使得当RCA产物在裂解结构域处被裂解后，功能化单链寡核苷酸序列容易纯化。因此，在一些实施方案中，可以选择比环状DNA分子中的寡核苷酸序列短的裂解结构域。如果环状DNA分子包含多个不同长度的寡核苷酸序列，则可选择裂解结构域短于环状DNA分子中最短的寡核苷酸序列。在其他实施方案中，可选择裂解结构域长于环状DNA分子中的寡核苷酸序列。如果环状DNA分子包含多个不同长度的寡核苷酸序列，可选择裂解结构域长于环状DNA分子中最长的寡核苷酸序列。在一些实施方案中，裂解结构域和寡核苷酸序列的长度相差至少2个核苷酸，例如至少3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。
如果所需的寡核苷酸序列和裂解结构域的长度大致相同，则裂解结构域可以被延伸，以便它们可以通过大小来与最终的功能化单链寡核苷酸分开。例如，可以将额外的自互补区域添加到裂解结构域的末端以延长发夹结构茎区的长度。或者或额外的，将核苷酸添加到发夹结构的环区。
在一些实施方案中，裂解结构域的长度可约为4-50个核苷酸，例如长度约为5-45、6-40、7-35或8-30个核苷酸。在一些实施方案中，它们的长度可约为10至25个核苷酸，包括约12至22或约14至20。然而，显然任何合适长度的裂解结构域均可用于本发明，只要它满足上述功能要求。
与寡核苷酸序列邻接的裂解结构域可以彼此相同或不同。有利地，与寡核苷酸序列邻接的裂解结构域是相同的，使得单个裂解步骤足以释放所有的功能化单链寡核苷酸。例如，在一些实施方案中，裂解RCA产物的步骤包括在适合裂解RCA产物中的裂解结构域的条件下使RCA产物与单一裂解酶接触。
裂解RCA产物中的裂解结构域的合适条件将取决于用于实现裂解的手段。例如，当使用裂解酶(例如限制性核酸内切酶)实现裂解时，条件将根据选择的酶而不同，并且合适的条件是本领域众所周知的，例如裂解步骤可以按照制造商的说明进行。类似地，在使用自裂解序列如脱氧核糖核酸实现裂解的情况下，可以使用对特定序列合适的条件。可以在裂解步骤中使用的合适条件范围的例子会在下面列出。
例如，裂解酶，例如限制性核酸内切酶，可以特异性结合其裂解识别位点并在多种缓冲液中选择性地(例如特异性地)裂解核酸，缓冲液例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、HBS缓冲盐水(HBS)和三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS)，均包含或不包含EDTA。裂解可在约3.0-10.0的pH范围内发生，例如pH为4.0-9.0、5.0-8.0，在很宽的温度范围内，例如0-70℃。本领域技术人员能够容易地确定其他的合适条件。
本发明的方法包括使用环状DNA分子作为模板进行滚环扩增的步骤。滚环扩增(RCA)在本领域是众所周知的，描述于Dean等，2001(Rapid Amplification of Plasmidand Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling CircleAmplification，Genome Research，11，1095-1099页)，其公开内容以引用方式并入本文。简而言之，RCA涉及使用环状单链核酸分子(例如环或环状寡核苷酸)作为滚环模板(RCA模板)以及使用链置换聚合酶来延伸与模板杂交的引物来合成核酸分子。聚合酶和核苷酸的添加开始合成反应，即聚合。由于滚环模板是环状的(endless)，所得产物是由与滚环模板互补的串联重复序列组成的长单链核酸分子。
典型的RCA反应混合物包括环状DNA分子和一种以上用于引物延伸反应的引物，例如RCA可以以单个引物为模板来产生单个多连体产物或多个引物，每个引物与环状寡核苷酸的不同区域退火以使每个环产生多个多连体产物。可与环状核酸接触的寡核苷酸引物将具有足够的长度以在退火条件下提供与环状DNA分子的杂交。在一些实施方案中，引物可以通过裂解(例如切开)步骤(a)中提供的双链环状DNA分子的单链来提供。
除上述组分外，本发明中使用的反应混合物通常包括聚合酶(下文进一步定义，例如phi29 DNA聚合酶)、一种以上功能化核苷酸、一种以上常规核苷酸和DNA聚合酶反应所需的其他组分，如下所述。所需的聚合酶活性可以由一种以上不同的聚合酶提供。
RCA反应混合物还可包括水性缓冲介质，其包括一价离子源、二价阳离子源和缓冲剂。可以使用任何方便的一价离子源，例如氯化钾、K-乙酸盐、NH4-乙酸盐、K-谷氨酸盐、NH4Cl、硫酸铵等。二价阳离子可以是镁、锰、锌等，其中阳离子通常是镁。可以使用任何方便的镁阳离子源，包括MgCl2、乙酸镁等。存在于缓冲液中的Mg2+的量可以在0.5至10mM的范围内，但优选地在约3至6mM的范围内，并且理想地为约5mM。缓冲液中可能存在的代表性缓冲剂或盐包括Tris、Tricine、HEPES、MOPS等，其中缓冲剂的量通常约为5至150mM，通常约为10至100mM，以及更多通常约为20至50mM，其中在某些优选实施方案中，缓冲剂的存在量足以提供约6.0至9.5的pH值。缓冲介质中可能存在的其他试剂包括螯合剂，例如EDTA、EGTA等。
在双链环状DNA分子的单链被裂解(例如切开)以提供RCA模板(和用于RCA反应的引物)的实施方案中，RCA反应混合物中包含单链结合蛋白可能是有用的。例如，大肠杆菌单链DNA结合蛋白已被用于提高引物延伸反应和PCR反应的产量和特异性。(美国专利号5,449,603和5,534,407)。噬菌体T4的32基因蛋白(单链DNA结合蛋白)明显提高了较大DNA片段的扩增能力(Schwartz等，Nucl.Acids Res.18：1079(1990))，它增强了DNA聚合酶的保真度(Huang，DNA Cell.Biol.15：589-594(1996))，最重要的是，它可以防止DNA聚合酶将模板转换为例如已产生的单链DNA并合成双链DNA(Ducanietal等，Nucl.Acids Res.42：10596(2014))。当使用时，使用这种蛋白质在反应混合物中达到约0.01ng/μL至约1μg/μL的浓度；例如约0.1ng/μL至约100ng/μL；包括约1ng/μL至约10ng/μL。
RCA反应最终产生包含与环状DNA分子互补序列的相邻(串联)重复序列的多核苷酸产物。该产品可能被称为串联体、RCA产品或“RCP”。因此，RCA产物包含由寡核苷酸序列(或更具体地，环状DNA分子模板的寡核苷酸序列的反向互补序列)组成的线性序列，所述寡核苷酸序列包含功能化核苷酸，与裂解结构域邻接。
如上所述，当环状DNA分子是单链时，RCA反应混合物可包含一种以上寡核苷酸引物，来引发RCA聚合反应。引物的长度足以在退火条件下与环状DNA分子杂交。引物长度通常至少为10个核苷酸，通常长度至少为15个核苷酸，更通常长度至少为16个核苷酸，并且长度可以长达30个核苷酸或更长，其中引物的长度通常为长度为18到50个核苷酸，通常长度为约20到35个核苷酸。
引物可以与环状DNA分子内的任何区域退火。在一些实施方案中，环状DNA分子可包含一个可与引物杂交的特异性结构域(RCA引物结合位点)。在代表性实施方案中，环状DNA分子可包含与寡核苷酸序列邻接的裂解结构域之间的序列，该序列不是寡核苷酸序列并且可用作RCA引物结合位点。类似于上文讨论的裂解结构域，RCA引物结合位点可以设计成与寡核苷酸序列具有不同长度，以确保在裂解RCA产物时可以容易地将其与功能化单链寡核苷酸分离。很明显，在包含多个与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列的环状DNA分子中，RCA引物结合位点可以在任何两个裂解结构域之间。
术语“退火条件”是指包含互补核苷酸序列的两个核酸分子特异性杂交的条件。各种参数均会影响杂交，包括温度、盐浓度、核酸浓度、组成和长度以及缓冲液组成。作为常规事项，本领域技术人员可以容易地确定用于RCA反应的特定引物/模板组合的合适退火条件。
如上所述，在一些实施方案中，环状DNA分子是双链的，并且该方法包括附加步骤：在进行RCA反应之前裂解环状DNA分子的单链以提供RCA模板。显然，裂解环状DNA分子的单链的步骤可以代替提供引物的步骤来启动RCA反应，即裂解的链起到RCA引物的作用。因此，从另一方面来看，该方法包括附加步骤：在进行RCA反应之前裂解环状DNA分子的单链以提供RCA模板和引物，即在环状DNA分子中引入单链断裂会产生一个3'末端，它可以作为RCA反应的引物。然而，在一些实施方案中，除了裂解双链环状DNA分子的一条链之外，在反应混合物中提供一种以上RCA引物也可能是有利的，例如以增加每个环获得的RCA产物的数量。
在一些实施方案中，裂解环状DNA分子的单链以提供RCA模板的步骤包括：用裂解酶裂解环状DNA分子的单链。这种环状DNA分子单链的裂解会导致单链断裂(切口)。
在一些实施方案中，多次近距离的裂解环状DNA分子的单链可能是有利的，以促进DNA聚合酶与裂解产生的3'末端的结合。因此，环状DNA分子的单链可以被裂解两次以上，即可以产生两个以上彼此靠近的切口。优选地，切口在彼此相距20个核苷酸内、更优选地在10个核苷酸内、更优选地在5个核苷酸内产生，例如彼此相距1、2、3、4或5个核苷酸内。
在一些实施方案中，用于裂解双链环状DNA分子一条链的裂解酶是切口酶。切口酶是仅裂解DNA双链体中单链的核酸内切酶。一些切口酶通过结合并识别特定的核酸序列，可以仅在DNA分子的特定位点引入单链切口。现在已经发现了许多天然存在的切口酶，目前其中至少确定了四种的序列识别特性。切口酶在美国专利号6,867,028中有所描述，该专利通过引用整体并入本文，并且任何合适的切口酶均可用于本发明的方法中。在一些实施方案中，裂解酶(切口酶)可以是Nb.BsrDI、Nt.BspQI或其组合。
在使用切口酶的一些实施方案中，在环状DNA分子裂解后可以将切口酶从试验中去除或失活，以防止RCA产物发生不必要的裂解。
裂解环状DNA分子单链的裂解酶(例如切口酶)可以在环状DNA分子内的任何位点裂解。在一些实施方案中，环状DNA分子可包含裂解酶能起作用的特定结构域(单链裂解位点或结构域，例如切口酶位点)。在代表性实施方案中，环状DNA分子可包含裂解结构域之间的序列，该序列不是寡核苷酸序列并且可用作单链裂解位点或结构域。被裂解酶识别的序列(单链裂解位点或结构域)不在寡核苷酸序列中这一事实确保了从RCA产物的5'端产生的寡核苷酸不是截短的。类似于上文讨论的裂解结构域和RCA引物结合位点，单链裂解位点或结构域可以设计为与寡核苷酸序列的长度不同，以确保在裂解RCA产物时可以容易地将其与功能化单链寡核苷酸分离。因此，在一些实施方案中，RCA引物结合位点还用作单链裂解位点或结构域，反之亦然。
具有至少一些链置换活性的任何DNA聚合酶可用于本发明的RCA反应。链置换活性确保一旦聚合酶围绕环状DNA分子延伸，它就可以置换引物序列和延伸产物并继续围绕模板“滚动”。在环状DNA分子的切口链为RCA延伸提供引物的实施方案中，链置换活性确保聚合酶可以置换切口链。具有至少一些链置换活性的合适的DNA聚合酶包括phi29 DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I、Bsu DNA聚合酶(大片段)、Bst DNA聚合酶(大片段)和Klenow片段。如本文所用，术语“DNA聚合酶”不仅包括天然存在的酶，而且包括所有此类修饰的衍生物，还包括天然存在的DNA聚合酶的衍生物。例如，在一些实施方案中，DNA聚合酶可以被改性以去除5'-3'核酸外切酶活性。
用于本发明的特别优选的DNA聚合酶包括phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶及其衍生物，例如序列修饰的衍生物或其突变体。
DNA聚合酶的序列修饰衍生物或突变体包括保留至少一些功能活性的突变体，例如野生型序列的DNA聚合酶活性和至少一些链置换活性。突变可能会影响酶在不同的反应条件下(例如温度、模板浓度、引物浓度等)的活性谱，例如提高或降低聚合速率。突变或序列修饰也可能影响核酸外切酶活性和/或酶的热稳定性。
如上所述，本方法的RCA反应通常使用功能化核苷酸和常规核苷酸的混合物进行。
如本文所用，术语“常规核苷酸”是指包含DNA中发现的四种碱基之一的脱氧核苷酸；腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。因此，术语“常规核苷酸”包括例如dATP、dGTP、dCTP和dTTP。虽然通常在天然DNA中不存在尿嘧啶，但可以很容易地使用dUTP代替dTTP，或者除dTTP之外还使用dUTP。因此，在本发明的上下文中，dUTP可被视为“常规”核苷酸。通常，反应混合物将包括对应于四种天然存在的碱基的四种不同类型dNTP(即dATP、dTTP、dCTP和dGTP)中的至少三种。然而，如上所述，可以使用dUTP代替dTTP，或者除dTTP之外还使用dUTP。此外，在一些实施方案中，反应混合物可包括四种或五种dNTP，即dATP、dCTP、dGTP、dTTP和/或dUTP。在主题的方法中，每种dNTP通常以约10至5000μM，通常约20至1000μM的量存在。每种dNTP可以以不同的量存在，或者对每种dNTP使用等量的。
术语“功能化核苷酸”或“功能化dNTP”是指包含相对于未修饰的常规核苷酸经过修饰的核苷酸，其中所述修饰提供所述功能化核苷酸和/或包含至少一种功能化核苷酸的寡核苷酸，所述功能化核苷酸(即相对于相应的常规核苷酸)具有额外的或其他的性质或特征。例如，修饰可以使核苷酸可检测，例如通过引入标记，或能够与另一组分相互作用和/或反应，即相应的常规核苷酸不与之相互作用或反应的组分。在一些实施方案中，修饰可使含有核苷酸的寡核苷酸抗降解，例如化学和/或酶促降解(例如核酸酶降解)，或可改变核苷酸的代谢。
术语“功能化单链寡核苷酸”、“功能化单链寡核苷酸”和“功能化寡核苷酸”在本文中可互换使用，是指包含至少一个功能化核苷酸的单链寡核苷酸。因此，相对于仅包含常规核苷酸的相应寡核苷酸，功能化寡核苷酸具有额外的或其他的性质或特征。例如，一种以上功能化核苷酸的结合可使寡核苷酸可检测，例如通过引入标记，或能够与另一组分相互作用和/或反应，即相应的常规核苷酸不与之相互作用或反应的组分。在一些实施方案中，修饰可使寡核苷酸抗降解，例如化学和/或酶促降解(例如核酸酶降解)，或可改变寡核苷酸的代谢。在一些实施方案中，修饰可以提高寡核苷酸的稳定性，例如提高由寡核苷酸形成的双链体的稳定性，例如双链体的热稳定性(例如解链温度)。在一些实施方案中，一种以上功能化核苷酸的结合可使寡核苷酸能够形成不能由仅包含常规核苷酸的相应寡核苷酸形成的二级或三级结构。
因此，应当理解在功能化单链寡核苷酸的上下文中，术语“单链”是指在变性条件下(例如在应用热或合适的化学变性剂后)是单链的寡核苷酸，即只有一个连续骨架(一条链)的寡核苷酸。如上所述，这并不排除功能化单链寡核苷酸形成二级或三级结构。例如，功能化单链寡核苷酸可包含自我互补的区域，因此可能能够形成发夹或茎环结构，由功能化单链寡核苷酸的一个区域与同一寡核苷酸中另一区域的互补区域杂交介导。
常规核苷酸的功能化可以通过改变或修饰核苷酸任意部分的结构来实现。因此，功能化核苷酸可以包含核碱基、糖或核苷酸间键合所涉及的基团上的修饰，例如化学修饰。在一些优选的实施方案中，功能化核苷酸含有核碱基上的修饰，例如化学修饰。下文更详细地描述了在各个位置的修饰，并且预期下文描述的任何特定位置都可被下文描述的任何官能团修饰。
例如，嘧啶(即胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶)中的C5位置被一个小的、刚性的疏水基团取代可以改善包含功能化核苷酸(其含有取代嘧啶)的寡核苷酸的碱基堆积相互作用和/或稳定由其形成的双链体。小的刚性疏水基团可以是炔基，例如甲基、乙炔基、丙炔基或卤素基团，例如氟、氯或溴。因此，在一些实施方案中，功能化核苷酸包含在C5位置具有取代(例如，如上定义的炔基或卤素)的嘧啶。
在一些实施方案中，使核苷酸可检测的修饰涉及到将标记结合到核苷酸中。任何标记都可以用于本发明并且可以是直接或间接的信号释放分子。例如，直接提供信号的标记可以是荧光分子，即功能化核苷酸可以是荧光标记的核苷酸。间接提供信号的标记可以是，例如，生物素分子，即标记的核苷酸可以是生物素标记的核苷酸，这需要额外的步骤来提供信号，例如添加与酶偶联的链霉亲和素，该酶可作用于化学底物以提供可检测信号，例如明显可检测的颜色变化。在一些实施方案中，标记被并入(缀合到)核碱基中。
因此，在一些实施方案中，功能化核苷酸包含与核碱基缀合的生物素基团。在一些实施方案中，生物素基团可以间接地缀合至核碱基，例如，经由接头或连接结构域，合适的接头可以容易地从本领域众所周知的那些中选择。例如，可以选择接头以促进生物素和链霉亲和素之间的相互作用，即最小化或防止空间位阻。在一些实施方案中，生物素基团在C5位置与嘧啶缀合。在一个代表性的实施方案中，含有生物素的功能化核苷酸可以是生物素-16-氨基烯丙基-2'-dUTP、生物素-16-氨基烯丙基-2'-dTTP或生物素-16-氨基烯丙基-2'-dCTP。
在一些实施方案中，核苷酸可以用甾醇基团标记，即核苷酸可以包含甾醇基团。在一些实施方案中，核苷酸可以用胆固醇基团标记或可以包含胆固醇基团。
可直接检测的标记是一种无需使用其他试剂即可直接检测的标记，而间接可检测的标记是可通过使用一种以上其他试剂来检测的标记。例如其中标记是由两个或多个组件组成的信号产生系统的成员。在许多实施方案中，标记是可直接检测的标记，其中，关注的可直接检测的标记包括但不限于荧光标记、有色标记、放射性同位素标记、化学发光标记等。可以使用任何分光光度法或光学可检测的标记。在其他实施方案中，标记可以间接地提供信号，即它可能需要添加其他的组件来生成信号。例如，标记能够结合与提供信号的分子缀合的分子。
在一些实施方案中，功能化核苷酸是荧光标记的核苷酸。虽然荧光标记需要激发来提供可检测信号，但由于激发源来自用于检测信号的仪器/装置，荧光标记可被视为直接提供信号的标记。
可用于标记核苷酸的荧光分子是本领域众所周知的。荧光团可通过从紫外到近红外波长的激发和发射光谱进行鉴定。因此，荧光团可以具有在UV、可见光或IR光谱范围内的激发和/或发射波长。
荧光团可以是蛋白质、肽、小的有机化合物、合成低聚物或合成聚合物。在一些实施方案中，荧光团是小的有机化合物，例如分子量为5000Da以下的有机化合物。因此，在一些实施方案中，荧光团的分子量为4000Da以下，例如3500Da、3000Da、2500Da、2250Da、2000Da、1900Da、1800Da、1700Da、1600Da、1500Da或更小。
因此，荧光团可以是呫吨衍生物(例如荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、曙红、德克萨斯红)、花青衍生物(例如花青、吲哚羰花青、氧杂碳花青、硫杂碳花青、部花青)、方酸衍生物(例如环取代方酸、Seta、SeTau)、萘衍生物(例如丹磺酰或Prodan衍生物)、香豆素衍生物、恶二唑衍生物(例如吡啶基恶唑、硝基苯并恶二唑和苯并恶二唑)、蒽衍生物(例如蒽醌，包括DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK Orange)、芘衍生物(例如级联蓝)、恶嗪衍生物(例如尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、恶嗪170)、吖啶衍生物(例如原黄素、吖啶橙、吖啶黄)、芳基次甲基衍生物(例如金胺、结晶紫、孔雀石绿)或四吡咯衍生物(如卟啉、酞菁、胆红素)。
可用于本发明的荧光团或荧光团系列的具体实例包括Alexa Fluors(例如AlexaFluors 488、Alexa Fluors 647等)、Atto、花青(Cy)、吲哚菁、磺菁、DyLight、AbberiorSTAR、Chromeo、俄勒冈绿、荧光素、德克萨斯红、罗丹明、硅罗丹明(SiR)、方酸、FluoProbes、四吡咯、Bodipy、HiLyte、Quasar、CAL fluor、香豆素、Seta、CF、Tracy、IRDye、CruzFluor、TideFluor、Oyster、iFluor、Chromis和Brilliant Violet及其荧光衍生物或类似物。
在一些实施方案中，功能化核苷酸含有花青荧光标记，例如Cy3。在一些特定实施方案中，功能化核苷酸是用Cy3标记的dATP，例如7-炔丙基氨基-7-脱氮-ATP-Cy3。
在一些实施方案中，功能化核苷酸含有atto荧光标记，例如atto-488。在一些特定实施方案中，功能化核苷酸是用atto-488标记的dATP，例如7-炔丙基氨基-7-脱氮-ATP-Atto-488。
在一些实施方案中，可使核苷酸具有反应性的修饰包括引入反应性基团，例如能够与另一个化学基团形成共价键的基团，例如将与功能化寡核苷酸缀合的分子或组分上的化学基团，例如本文定义的标记。潜在的反应性基团包括亲核官能团(炔烃、烯基、胺、醇、硫醇、酰肼、叠氮化物)、亲电官能团(醛、酯、乙烯基酮、环氧化物、异氰酸酯、马来酰亚胺)、能够进行环加成反应、形成二硫键或与金属结合的官能团。具体实例包括乙炔(电石气)、丙炔、1-丁炔、2-丁炔叠氮化物、乙烯基(次乙基)、丙烯基、1-丁烯基、伯胺和仲胺、异羟肟酸、N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯、氧羰基咪唑、硝基苯酯、三氟乙酯、缩水甘油醚、乙烯基砜、叠氮化物和马来酰亚胺。
在一些实施方案中，可使核苷酸具有反应性的修饰包括引入能够通过点击化学与另一化学基团反应的反应性基团，该另一化学基团例如将与功能化寡核苷酸缀合的分子或组分上的化学基团。如本文所用，术语“点击化学”通常是指模块化的、范围广、产率高、仅产生无害副产物的反应，无害副产物例如可以通过非色谱方法去除的那些，并且是立体特异性的(但不一定是对映选择性的)。参见，例如，Angew.Chem.Int.Ed.，2001，40(11)：2004-2021，其通过引用将其全部并入本文。在某些情况下，点击化学可以描述为成对的官能团，它们可以在温和的水性条件下选择性地相互反应。因此，点击化学官能团适用于将额外的官能团缀合到本方法的寡核苷酸上。常见的点击化学反应包括叠氮化物-炔烃环加成反应、炔烃-硝酮环加成反应、烯烃-四嗪反应和烯烃-四唑反应。因此，功能化核苷酸可包含叠氮基、炔基、烯烃基、硝酮基、四嗪基或四唑基。
点击化学反应的一个具体例子可以是叠氮化物和炔烃的Huisgen 1,3-偶极环加成反应，即叠氮化物与炔烃的铜催化反应形成称为1,2,3-三唑的五元杂环。该反应也可以称为Cu(I)-催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)、Cu(I)点击化学或Cu+点击化学。点击化学的催化剂可以是Cu(I)盐，或通过用还原剂将Cu(II)试剂还原为Cu(I)试剂而原位制备的Cu(I)盐(PharmRes.2008，25(10)：2216-2230)。已知的用于点击化学的Cu(II)试剂可以包括但不限于Cu(II)(TBTA)复合物和Cu(II)(THPTA)复合物。TBTA，即三-[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺，也称为三-(苄基三唑基甲基)胺，可以作为Cu(I)盐的稳定配体。THPTA，即三-(羟丙基三唑基甲基)胺，可以是Cu(I)稳定剂的另一个例子。也可以达到其他条件以使用无铜点击化学由叠氮化物和炔烃(例如环炔烃，例如环辛炔或环壬炔)来构建1,2,3-三唑环，例如通过应变促进的叠氮-炔烃点击化学反应(SPAAC，参见，例如Chem.Commun.，2011，47：6257-6259和Nature，2015，519(7544)：486-90)，其各自通过引用完全并入本文。
在一些实施方案中，功能化核苷酸在糖基中含有反应性基团，例如在脱氧核糖的第2位进行修饰，例如用氟、氯、溴或叠氮基取代氢。在一些实施方案中，功能化核苷酸是2'-叠氮基-dNTP，例如2'-叠氮基-dATP。
在一些实施方案中，功能化核苷酸在核碱基中含有反应性基团，特别是选自炔基、烯基、硫基或卤素基团。如上所述，功能化核苷酸可包含在C5位置含有取代的嘧啶。在一些实施方案中，炔基是乙炔，例如功能化核苷酸是乙炔基-dNTP，例如5'-乙炔基-dUTP。或者，炔基可以是丙炔基，例如功能化核苷酸是丙炔基dNTP，例如5'-丙炔基-dUTP。在一些实施方案中，烯基是乙烯基(ethenyl)，例如功能化核苷酸是乙烯基-dNTP，例如5'-乙烯基-dUTP。在一些实施方案中，功能化核苷酸是硫代-dNTP，例如4’-硫代-dTTP。在一些实施方案中，卤素基团是溴，例如功能化核苷酸是溴-dNTP，例如5'-溴-dUTP。将卤素基团引入功能化寡核苷酸可用于促进亲核芳香取代或紫外线介导的交联，例如与蛋白质的交联。因此，在一些实施方案中，通过本方法产生的功能化寡核苷酸可被进一步修饰来包含芳族基团或可通过紫外线介导的交联而缀合至其他分子，例如蛋白质或肽。
在一些实施方案中，功能化核苷酸可包含能够与另一组分相互作用的基团，例如通过非共价键相互作用。例如，核苷酸可以被修饰以结合同源结合对(cognate bindingpair)的一个部分或组分，同源结合对例如亲和结合配体(partner)，例如生物素或半抗原，能够与其结合配体结合，即同源结合配体，例如链霉亲和素或抗体。例如此类功能化核苷酸可用于生产可固定在固体支持物上的功能化寡核苷酸。
在一些实施方案中，功能化核苷酸含有修饰，该修饰使含有该核苷酸的寡核苷酸对降解具有抗性，例如化学和/或酶促降解(例如核酸酶降解)。在一些实施方案中，核苷酸在糖基中包含修饰，例如在脱氧核糖的第2位进行修饰，例如用氟、氯、O-甲基或O-乙基取代氢。因此，在一些实施方案中，功能化核苷酸是2'-氟-dNTP，例如2-氟-UTP。在一些实施方案中，功能化核苷酸包含O-甲基基团，例如2'-O-甲基-ATP。在一些实施方案中，核苷酸在形成核苷酸间键的磷酸基团中含有修饰，例如用硫取代氧，例如核苷酸含有硫代磷酸酯基团。因此，在一些实施方案中，功能化核苷酸是核苷酸硫代三磷酸，例如2-脱氧胸苷-5'-O-(1-硫代三磷酸)、2-脱氧胞苷-5'-O-(1-硫代三磷酸)、2-脱氧尿苷-5'-O-(1-硫代三磷酸)、2-脱氧腺苷-5'-O-(1-硫代三磷酸)或2-脱氧鸟苷-5'-O-(1-硫代三磷酸)。在一些实施方案中，功能化核苷酸在核碱基中包含修饰，例如氨基、甲基、乙基或丙炔基修饰，例如2-氨基-dATP、5-甲基-dCTP、C-5丙炔基-dCTP或C-5丙炔基-dUTP。
在一些实施方案中，功能化核苷酸含有影响寡核苷酸热稳定性的修饰。在一些实施方案中，核苷酸包含锁核糖，即包含在戊糖环的2'氧和4'碳之间的额外共价键。在一些实施方案中，核苷酸是LNA(锁核酸)核苷酸，即LNA-NTP，例如LNA-ATP。锁核糖构象增强了碱基堆积，从而提高了包含LNA核苷酸的寡核苷酸的解链温度。
因此，在一些实施方案中，可用于本发明的功能化核苷酸包括：包含(内化的)炔烃或叠氮基的核苷酸、荧光标记的核苷酸、包含甾醇基团的核苷酸、包含聚醚基团的核苷酸、包含金属络合物的核苷酸、包含乙烯基基团的核苷酸、包含硫醇基团的核苷酸、硫代的核苷酸、经修饰以具有增加的核酸酶抗性的核苷酸、包含能够参与点击化学的化学基团的核苷酸、影响(例如增加)寡核苷酸的热稳定性的核苷酸(例如LNA-核苷酸)或它们的组合。将这些功能化核苷酸引入本发明的单链寡核苷酸可以提供一系列有用的功能。例如，包含荧光团的单链寡核苷酸可用作序列特异性荧光探针。在单链寡核苷酸中包含硫醇化核苷酸使得寡核苷酸可以被硫醇反应性分子标记，并可用作探针用于分子检测此类硫醇反应性分子。
在一些实施方案中，可用于本发明的功能化核苷酸不包括包含地高辛基团的核苷酸。或者，在一些实施方案中，功能化核苷酸不是地高辛标记的核苷酸。特别地，在一些实施方案中，功能化核苷酸不是地高辛-11-dUTP。
在一个优选的实施方案中，功能化dNTP是包含炔基或乙烯基的核苷酸，例如含有炔基(例如乙炔基)或乙烯基的修饰核碱基，例如包含在C5位具有炔基或乙烯基的嘧啶的核苷酸。在另一个优选的实施方案中，功能化dNTP是包含叠氮基的核苷酸，例如包含含有叠氮基的修饰糖的核苷酸，例如在脱氧核糖的第2位包含叠氮基的核苷酸。
RCA反应的反应混合物必须包含能够从模板环状DNA分子产生RCA产物的组分组合。例如，反应混合物中存在的核苷酸(例如常规和功能化核苷酸的混合物)必须能够与环状DNA模板中的相应核苷酸杂交，以允许滚环扩增。反应混合物中存在的功能化核苷酸和常规核苷酸的相对量可以根据功能化核苷酸和聚合酶的特性而变化。此外，反应混合物中存在的每种核苷酸的相对量可用于控制功能化核苷酸引入RCA产物中。例如，增加功能化核苷酸的浓度(或降低常规核苷酸的比例)可能导致RCA产物中功能化核苷酸的比例更大(例如，当功能化核苷酸与其等效的常规核苷酸组合使用时)。相反，降低功能化核苷酸的浓度(或增加常规核苷酸的比例)可能会导致RCA产品中功能化核苷酸的比例降低。
因此，除了与模板DNA中的相同DNA碱基(核苷酸)杂交的常规核苷酸之外，还可以使用功能化核苷酸，或用功能化核苷酸完全代替常规核苷酸。在一些实施方案中，反应混合物可以仅包含一种类型的功能化核苷酸。在一些实施方案中，不同的功能化核苷酸的组合可用于同一反应中。在一些实施方案中，反应混合物中的所有功能化核苷酸都含有相同类型的官能团，例如炔基。在一些实施方案中，反应混合物中的功能化核苷酸含有不同类型的官能团。例如，不同类型的功能化核苷酸可能能够与相同的DNA碱基(核苷酸)杂交，例如用荧光团功能化的dATP核苷酸和用甾醇基团功能化的第二个dATP核苷酸。在另一个代表性实例中，不同类型的功能化核苷酸可能能够与不同的DNA碱基(核苷酸)杂交，例如用荧光团功能化的dATP核苷酸和用甾醇基团功能化的dTTP核苷酸(或用与dATP核苷酸上的荧光团不同的荧光团功能化的dTTP核苷酸)。因此，在本发明中可以使用功能化核苷酸和常规核苷酸的任何组合。在优选的实施方案中，RCA反应混合物仅包含一种类型的功能化核苷酸。
反应混合物中存在的功能化核苷酸的量可以测量为相对于能够与特定DNA碱基(核苷酸)杂交的总核苷酸的相对百分比。或者，该值可以被认为是功能化核苷酸取代相应常规核苷酸的百分比。例如，使用等量的常规dATP和用荧光团修饰的dATP可以表示为被修饰(功能化)的总dATP核苷酸的50％，或用功能化dATP核苷酸替换常规dATP核苷酸的50％。
RCA反应混合物中功能化核苷酸的相对量可以变化以控制最终单链寡核苷酸中功能化核苷酸的频率。在一些实施方案中，功能化核苷酸可占能够与特定DNA碱基(核苷酸)杂交的总核苷酸的最多约5％，例如约1％、2％、3％、4％或5％。或者，在一些实施方案中，功能化核苷酸可以占能够结合特定DNA碱基(核苷酸)的总核苷酸的更高比例，例如25％、50％、75％或100％。
功能化核苷酸存在的相对量可能因多种原因而变化。例如，一些功能化的核苷酸，如用Cy3修饰的dATP，在商业上无法以高浓度获得。此外，如实施例中所示，发明人已经确定包含功能化核苷酸可能影响本发明产生的功能化单链寡核苷酸的产率，例如使用高相对量的功能化核苷酸会抑制负责RCA反应的DNA聚合酶的活性(例如降低合成RCA产物的效率)，或负责裂解RCA产物和释放功能化单链寡核苷酸的裂解酶的活性(例如降低RCA产物的裂解效率)。
然而，值得注意的是，发明人已经令人惊讶地确定，即使使用高相对量的功能化寡核苷酸，也可以实现功能化单链寡核苷酸的高产率，高相对量的功能化寡核苷酸例如高达约75％，例如高达约70％、65％、60％、55％或50％。在一些实施方案中，可能使用超过75％的功能化寡核苷酸，例如约80％、85％、90％、95％或100％。特别地，本发明人意外地发现，在核碱基中含有炔基或乙烯基的功能化核苷酸在本发明中特别有用，因为它们可以有效地结合到RCA产物中。此外，RCA产物可以容易地被裂解以产生功能化单链寡核苷酸，尽管如下所述，在一些实施方案中，相对于裂解仅包含常规核苷酸的等效RCA产物所需的量，可能需要更大量的裂解酶。
类似地，发明人已经发现，在脱氧核糖中含有O-甲基的功能化核苷酸可以完全替代RCA反应中的常规核苷酸并且仍然产生RCA产物。此外，本发明人出人意料地确定，将这些核苷酸引入RCA产物中不影响裂解结构域(例如发夹裂解结构域)的形成或它们的酶促裂解(例如使用限制性核酸内切酶)。
因此，可以调节反应混合物中存在的功能化核苷酸的相对量以优化所需功能化单链寡核苷酸的产率或优化RCA产物的产生。基于以下实施例中描述的方法，此类修改在本领域技术人员的能力范围内。因此，在一些实施方案中，反应混合物中官能化核苷酸的相对量可以是约1-5％、1-10％、1-25％、5-25％、10-25％、25-50％、25-75％、25-100％、50-75％、50-100％或75-100％。
除了反应混合物中功能化核苷酸的相对量、步骤(b)中产生RCA产物后核苷酸(常规和功能化核苷酸)的绝对量之外，该方法还包括步骤：在裂解结构域裂解RCA产物以释放功能化单链寡核苷酸。如上所述，裂解RCA产物的步骤可以通过在合适的条件下使RCA产物与裂解酶接触以选择性地在裂解结构域中裂解RCA产物来实现。
术语“释放”在本上下文中用于指在与寡核苷酸序列邻接的裂解结构域处裂解RCA产物，以便从裂解结构域脱离或分离功能化的寡核苷酸。最好是给定的功能化寡核苷酸的释放涉及与寡核苷酸序列邻接的两个裂解结构域的切割。
为了产生功能化的单链寡核苷酸，不必要RCA产物中的所有裂解结构域都发生裂解。如上所述，在RCA产物中，特别是在裂解结构域中掺入功能化核苷酸，可能会降低裂解步骤的效率。然而，裂解结构域的一部分裂解将导致释放功能化单链寡核苷酸的一部分。因此，在一些实施方案中，裂解RCA产物的步骤导致RCA产物中的裂解结构域裂解至少约30％，例如至少约35％、40％、45％、50％、60％、70％或80％。在一些实施方案中，裂解RCA产物的步骤导致RCA产物中的裂解结构域裂解至少约90％，例如95％或更多。
或者，在一些实施方案中，裂解RCA产物的步骤导致释放包含在RCA产物中的功能化单链寡核苷酸的至少约30％，例如至少约35％、40％、45％、50％、60％、70％或80％。在一些实施方案中，裂解RCA产物的步骤导致释放包含在RCA产物中的功能化单链寡核苷酸的至少约90％，例如95％或更多。
一旦功能化单链寡核苷酸已经被释放，期望从裂解反应混合物(例如反应组分和/或降解产物如裂解结构域、未裂解的RCA产物等)中分离或纯化功能化单链寡核苷酸，并用于其他的应用。
因此，在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括分离或纯化功能化单链寡核苷酸的步骤。这种分离或纯化可以通过本领域已知的任何合适的方法进行。
在一些实施方案中，在分离或纯化步骤之后，功能化单链寡核苷酸优选基本上不含源自分离过程中或在它们的制备中使用的材料或组分的任何污染组分(例如反应组分和/或降解产物，例如裂解结构域、未裂解的RCA产物等)。在一些实施方案中，功能化的单链寡核苷酸被纯化至纯度超过约50％或60％，例如超过约70％、80％或90％，例如超过约95％或99％的纯度，以w/w(干重)评价。这种纯度水平可能会包含功能化单链寡核苷酸的降解产物。
在一些实施方案中，制备具有较低纯度的功能化单链寡核苷酸的富集制剂可能是有用的，具有较低纯度的功能化单链寡核苷酸例如含有少于约50％的目标功能化单链寡核苷酸，例如小于约40％或30％。
如上所述，本发明可产生功能化单链寡核苷酸的混合物或多个(例如文库)。因此，在一些实施方案中，可能需要进一步分离功能化单链寡核苷酸，例如通过大小，来获得特定的功能化单链寡核苷酸(即分离特定的功能化单链寡核苷酸)或生成功能化单链寡核苷酸的子组或子文库。可以使用用于分离功能化单链寡核苷酸的混合物以获得特定功能化单链寡核苷酸或功能化单链寡核苷酸的子组或子文库的任何合适的手段。
因此，在一些实施方案中，该方法还包括步骤：从通过上述方法获得的功能化单链寡核苷酸的混合物(例如文库)中分离功能化单链寡核苷酸，以分离特定的功能化单链寡核苷酸或功能化单链寡核苷酸的子组。
例如，裂解反应的产物可以通过使用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶的凝胶电泳按大小分离。然后可以根据本领域已知的方法从凝胶中分离并进一步纯化所需的功能化寡核苷酸，如果需要的话。用于纯化或分离本发明的功能化寡核苷酸的其他方法可以利用色谱法(例如HPLC、尺寸排阻、离子交换、亲和、疏水相互作用、反相)或毛细管电泳。
如上所述，通过上述方法产生的功能化寡核苷酸可以含有能够例如通过点击化学与另一化学基团反应的反应基团，另一化学基团例如将与功能化寡核苷酸缀合的分子或组分上的化学基团。例如，将其他分子或组分(它们本身可以包含或被视为官能团)与单链寡核苷酸缀合可能特别适用于结合大的或庞大的基团，例如可抑制或降低本方法效率的基团如果存在于RCA反应中使用的功能化核苷酸中。因此，例如可以生产功能化寡核苷酸，其包含在RCA反应过程中不能通过聚合酶直接结合或只能以低效率或产率结合的分子或组分。另外或可选地，使通过该方法获得的功能化寡核苷酸经历进一步的缀合步骤可以增加功能化寡核苷酸文库中存在的结构多样性。
因此，在一些实施方案中，该方法还包括步骤：通过寡核苷酸中的功能性(例如反应性)基团，例如通过点击化学，将分子或组分与功能化寡核苷酸缀合。在一些优选的实施方案中，分子或组分通过炔基、乙烯基或叠氮基(即在本文定义的方法中结合至RCA产物中的功能化核苷酸中的炔基、乙烯基或叠氮基)缀合至功能化寡核苷酸。
本发明上下文中，关于将分子或组分连接或接合到功能化寡核苷酸(例如所述功能化寡核苷酸中的炔基、乙烯基或叠氮基)的术语“缀合”是指将所述分子或组分通过共价键连接到所述寡核苷酸。特别是，这种缀合可以通过点击化学反应发生。
可用于将额外的分子或组分与本发明的包含一个或多个炔基的功能化单链寡核苷酸缀合的具体点击化学反应实例是叠氮化物-炔烃环加成。为了实现所需的缀合，可以将包含炔基的寡核苷酸与包含叠氮基的分子或组分(例如标记物，例如荧光团)一起温育一段合适的时间。叠氮化物-炔烃环加成反应通常使用铜催化剂，特别是铜(I)催化剂。在一些实施方案中，寡核苷酸和含叠氮化物的分子或组分可以在硫酸铜的存在下温育。还可以使用还原剂来产生活性铜(I)催化剂。还原剂可以是例如抗坏血酸钠。
将额外的分子或组分缀合到本发明的包含一个或多个乙烯基的功能化单链寡核苷酸的另一代表性实例为利用烯烃-四嗪反应。该反应的优点是不含铜。此外，它与上述炔烃-叠氮化物点击化学反应完全正交。因此，包含炔基和乙烯基的功能化单链寡核苷酸可以独立地参与两个点击化学反应，以将两种不同的额外分子或组分缀合至相同的寡核苷酸。
因此，在一些实施方案中，本发明可被视为提供了用于生产功能化单链寡核苷酸的两步方法，包括：第一步，使用本文所述的方法将功能化核苷酸(例如包含反应性基团，例如能够参与点击化学反应的基团，例如炔基、乙烯基或叠氮基)掺入寡核苷酸；以及第二步，通过功能化核苷酸中的官能团将额外的分子或组分缀合至单链寡核苷酸。
显然，可以将任何需要的分子或组分(即实体)缀合至通过本方法产生的单链寡核苷酸中的官能团。此类分子或组分仅需要具有能够与寡核苷酸中的官能团反应以形成共价键的基团(例如反应性基团)。在一些实施方案中，分子或组分可以是核酸分子、蛋白质、肽、小分子有机化合物(例如甾醇，例如胆固醇)、荧光团、金属配体复合物、多糖、纳米颗粒、纳米管、聚合物、细胞、细胞器、囊泡、病毒、病毒样颗粒或这些的任何组合。
细胞可以是原核或真核细胞。在一些实施方案中，细胞是原核细胞，例如一个细菌细胞。
在一些实施方案中，功能化寡核苷酸可缀合或融合至具有治疗或预防作用的化合物或分子，例如抗生素、抗病毒剂、疫苗、抗肿瘤剂，例如放射性化合物或同位素、细胞因子、毒素、寡核苷酸、核酸编码基因或核酸疫苗。
在一些实施方案中，功能化寡核苷酸(例如适配体)可以缀合或融合至标记物，例如放射性标记、荧光标记、发光标记、发色团标记以及产生可检测底物的物质和酶，例如辣根过氧化物酶、荧光素酶或碱性磷酸酶。这种检测可通常应用于使用抗体的多种分析，包括蛋白质印迹/免疫印迹、组织化学、酶联免疫吸附分析(ELISA)或流式细胞术(FACS)方法。用于磁共振成像的标记、正电子发射断层扫描探针和用于中子俘获疗法的硼10也可以与本文所述的功能化寡核苷酸缀合。
在一些实施方案中，分子或组分可选自：荧光团、甾醇(例如胆固醇)、聚醚、金属络合物、含硫醇的分子、含提供增加的核酸酶抗性的基团的分子和含有能够参与点击化学反应的基团的分子。
很明显，与功能化寡核苷酸缀合的分子或组分可以与其他分子相互作用，并且这种相互作用可以是共价或非共价相互作用。例如，与寡核苷酸缀合的肽可以与其同源结合配体例如抗体非共价相互作用。在另一个实例中，含有能够参与点击化学反应的基团的分子可以通过与所述分子或组分的反应性基团反应形成共价复合物而缀合至如上定义的另一分子或组分。
本方法的步骤(a)中提供的环状DNA分子可以通过任何合适的方式产生，并且本领域公知多种方式。因此，本发明的方法在提供环状DNA分子的步骤(a)之前可以包括额外的步骤。
例如，产生环状DNA分子的过程可以包括步骤：在计算机中设计包含一个或多个所需的与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列的序列(本文称为“假基因”)。因此，该方法可以利用计算机实施设计假基因的方法，并且此类方法在本领域中有描述，例如，Ducani等人，2013年，同上。
如本文所用，术语“假基因”是指包含一个或多个所需寡核苷酸序列的核苷酸序列，所需的寡核苷酸序列与裂解结构域邻接。或者，该序列在本文中可称为“核酸构建体”。
计算机设计的假基因序列可以使用市售的基因合成方法产生(例如合成)，或本领域已知的任何其他合适的手段，例如组装PCR。因此，该方法可以包括产生假基因的步骤。
假基因可以作为单链或双链分子产生。可以使用本领域已知的任何合适的方法将假基因环化以提供步骤(a)的环状DNA分子。例如，如下所述，可以使用连接酶连接双链分子。在这方面应理解，假基因的至少一个5'末端被磷酸化以使连接能够发生。在产生假基因的步骤得到5'末端未被磷酸化的DNA分子的实施方案中，该方法可以还包括步骤：将假基因的5'末端磷酸化，例如使用激酶，例如T4多核苷酸激酶。
类似地，当假基因作为单链分子提供时，可以使用能够催化单链寡核苷酸分子的分子内连接的合适连接酶例如CircLigase将其环化。同样，该方法可以还包括步骤：将假基因的5'末端磷酸化，例如使用激酶，例如T4多核苷酸激酶，以促进连接反应。
在一些实施方案中，将假基因插入质粒可能是有利的，该质粒可以在细菌例如大肠杆菌中复制。合适的质粒序列是本领域公知的。这允许核查假基因的序列(例如通过测序)并纠正序列中的任何错误，例如通过使用任何合适方法的测序和诱变迭代。
将假基因插入质粒也有助于产生大量环状DNA分子的拷贝。例如，可以培养含有包含序列验证的假基因的质粒的单个细菌菌落以扩增质粒，随后可以使用本领域已知的任何合适的方法从细菌中纯化质粒。
然后从质粒中切除假基因序列，例如使用上述限制酶。切除的线性假基因序列可以使用PAGE和凝胶提取或其他合适的方法进行纯化。然后可以使用合适的连接酶例如T4连接酶重新环化纯化的线性假基因序列，以形成将在本方法的步骤(a)中提供的环状DNA分子。
除了扩增之外，将含有假基因的质粒转染到细菌中的过程也允许产生细菌甘油原液。包含所需假基因质粒的细菌可以在甘油中制备，冷冻并长期稳定储存。
因此，在一些实施方案中，本方法的步骤(a)包括：
(i)将线性DNA分子克隆到DNA质粒中，所述线性DNA分子包含与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列；
(ii)扩增所述质粒；
(iii)切除含有DNA分子的质粒的一部分，该DNA分子包含与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列；和
(iv)环化步骤(iii)中获得的质粒部分。
在一些实施方案中，步骤(ii)包括将所述DNA质粒转染到细菌中并培养细菌。
在一些实施方案中，包含与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列的线性DNA分子还包含各自含有裂解结构域的5'末端区和3'末端区，并且其中步骤(iii)包括用裂解酶裂解末端区的裂解结构域.
本文定义的任何合适的裂解酶均可用于从质粒中切除假基因。在一些实施方案中，裂解酶是BsmBI或BsaI或其同裂酶。
在本发明的一些特定实施方案中，该方法使用phi29 DNA聚合酶或其衍生物和包含修饰核碱基的功能化核苷酸。在一些实施方案中，功能化核苷酸包含核碱基中的反应基团，例如能够参与点击化学反应的反应基团。在一些实施方案中，核碱基中的反应性基团是如上定义的炔基或乙烯基。在一些实施方案中，RCA混合物中功能化核苷酸的相对量是约25-100％，例如25-75％、50-100％或75-100％或这些范围内的任何值。在一些实施方案中，裂解结构域能够在如上定义的RCA产物中形成发夹结构。
在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，特别是用于生产功能化单链寡核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)包含与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列的环状DNA分子；和可选的：
(ii)裂解(i)中裂解结构域的一种以上裂解酶；和/或
(iii)功能化的dNTP。
在一些实施方案中，本发明提供用于本文所述方法的试剂盒，包括：
(i)包含与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列的环状DNA分子，其中裂解结构域包含或由能够形成发夹结构的序列组成，其中发夹结构的双链部分包含被裂解酶识别的序列；和
(ii)功能化的dNTP(例如，如本文所定义)；和可选的：
(iii)裂解(i)中裂解结构域的一种以上裂解酶。
在一些实施方案中，试剂盒可包含能够进行滚环扩增的DNA聚合酶，即包含至少一些如本文定义的链置换活性。例如，该试剂盒可包含phi29聚合酶或其衍生物，或Bst DNA聚合酶或其衍生物。
在一些实施方案中，试剂盒可包含一种以上切口酶。例如，该试剂盒可包含Nb.BsrDI、Nt.BspQI或它们的组合。
在一些实施方案中，试剂盒可包含一种以上如本文定义的单链结合蛋白。例如，该试剂盒可包含大肠杆菌单链DNA结合蛋白、T4噬菌体的32基因蛋白或它们的组合。
在一些实施方案中，试剂盒可包含一种以上分子或组分以缀合至如上定义的功能化单链寡核苷酸。
试剂盒的环状DNA分子、裂解酶和功能化dNTP如上所述。
在另一方面，本发明提供通过如本文所述的方法获得的功能化单链寡核苷酸。
在一些实施方案中，功能化单链寡核苷酸包含至少20个核苷酸。例如，功能化单链寡核苷酸可包含至少25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多个核苷酸。在一些优选的实施方案中，功能化单链寡核苷酸含有至少50个核苷酸，例如至少约55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸。在一些实施方案中，功能化单链寡核苷酸含有约50-1000、55-900、60-800、65-700、70-600、80-500、90-450或100-400个核苷酸。在一些实施方案中，功能化单链寡核苷酸包含约400-10000、500-9000、600-8000、700-7000、800-6000、900-5000或1000-4000个核苷酸，例如包含约500、1000、1500、2000、2500、3000、3500或更多个核苷酸。
在一些实施方案中，功能化单链寡核苷酸的至少5％的核苷酸残基是功能化核苷酸，即包含如本文定义的官能团的核苷酸。在一些实施方案中，功能化单链寡核苷酸的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的核苷酸残基是功能化核苷酸。因此，在一些实施方案中，功能化单链寡核苷酸的约5-100％的核苷酸残基是功能化核苷酸，例如功能化单链寡核苷酸的约10-95％、15-90％、20-85％、25-80％、30-75％、35-70％、40-65％或45-55％的核苷酸残基是功能化的核苷酸。
在一些实施方案中，功能化单链寡核苷酸含有至少一个内部功能化核苷酸，即不在寡核苷酸的5'或3'末端的功能化核苷酸。在一些实施方案中，功能化单链寡核苷酸含有2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个内部功能化核苷酸，例如15、20、25、30、35、40、45、50或更多个内部功能化核苷酸。
功能化单链寡核苷酸可包含本文定义的任何一种以上功能化核苷酸。在一些实施方案中，链状功能化寡核苷酸包含含有官能团的功能化核苷酸，所述官能团选自炔基、烯烃基(例如乙烯基)、叠氮基、卤素基团、O-甲基、锁核糖或它们的组合。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了通过本文所述方法获得的功能化单链寡核苷酸，其中；
(i)寡核苷酸含有至少50个核苷酸；和
(ii)至少5％的核苷酸残基包含选自炔基、烯烃基团(例如乙烯基)、叠氮基、卤素基团、O-甲基、锁核糖或其组合的官能团，其中功能化核苷酸残基内官能团的优选位置如上定义。
在又一方面，本发明提供包含通过如本文所述的方法获得的多个功能化单链寡核苷酸的文库。多个功能化单链寡核苷酸的文库可以包括一个或多个如上定义的功能化单链寡核苷酸。
又一方面，本发明提供了一种如本文所定义的方法，该方法是用于生产功能化单链寡核苷酸库的方法，该功能化单链寡核苷酸库用于单分子荧光原位杂交(smFISH)，其中功能化核苷酸是荧光标记的核苷酸，并且其中库中的每个功能化单链寡核苷酸含有约15-30个，优选约20-25个核苷酸。在优选的实施方案中，功能化核苷酸用相同的荧光分子标记。
作为使用直接荧光标记的功能化核苷酸的替代方案，该方法可以涉及使用包含能够参与点击化学的化学基团的核苷酸，随后可将荧光标记缀合至该化学基团。合适的荧光标记是本领域众所周知的和如上所定义的。
因此，在又一个方面，本发明提供了一种如本文所定义的方法，该方法是用于生产功能化单链寡核苷酸库的方法，该功能化单链寡核苷酸库用于单分子荧光原位杂交(smFISH)，其中功能化核苷酸是包含能够参与点击化学的化学基团的核苷酸，并且其中该方法还包括步骤：通过点击化学将荧光标记缀合至每个功能化寡核苷酸中的至少一个功能化核苷酸，并且其中库中的每个功能化单链寡核苷酸包含约15-30个，优选约20-25个核苷酸。包含能够参与点击化学的化学基团的核苷酸如上文所定义，包括具有叠氮基、炔基、烯烃基、硝酮基、四嗪基或四唑基或其组合的核苷酸。
在smFISH技术中，功能化单链寡核苷酸充当杂交探针，以识别包含待测特定目标序列的核酸分子的存在和位置。因此，一旦用于单分子荧光原位杂交(smFISH)的功能化单链寡核苷酸库已经通过本文公开的方法产生，该功能化寡核苷酸可以在smFISH方法中与包含待测目标序列的核酸分子杂交。
当功能化单链寡核苷酸包含含有能够参与点击化学的化学基团的功能化核苷酸时，通过点击化学将荧光标记与功能化核苷酸缀合的步骤可以在功能化寡核苷酸与包含目标序列的核酸分子杂交之前或之后进行。
例如，包含含有能够参与点击化学的化学基团的功能化核苷酸的功能化寡核苷酸可进行如下步骤：通过点击化学将荧光标记与每个功能化寡核苷酸中的至少一个功能化核苷酸缀合，一旦荧光标记已经缀合，然后可以与包含目标序列的核酸分子杂交。或者，包含含有能够参与点击化学的化学基团的功能化核苷酸的功能化寡核苷酸可以首先与包含目标序列的核酸分子杂交，一旦与目标序列杂交，然后进行如下步骤：通过点击化学将荧光标记与每个功能化寡核苷酸中的至少一个功能化核苷酸缀合。
因此，在又一个方面，本发明提供了一种如本文所定义的方法，该方法是产生功能化单链寡核苷酸库的方法，该功能化单链寡核苷酸库用于单分子荧光原位杂交(smFISH)，其中功能化核苷酸是包含能够参与点击化学的化学基团的核苷酸，并且其中该方法还包括步骤：通过点击化学将荧光标记与每个功能化寡核苷酸中的至少一个功能化核苷酸缀合，并且其中库中的每个功能化单链寡核苷酸包含约15-30个，优选约20-25个核苷酸，并且其中在功能化寡核苷酸与包含目标序列的核酸分子杂交之前，进行通过点击化学将荧光标记与每个功能化寡核苷酸中的至少一个功能化核苷酸缀合的步骤。
类似地，本发明还提供了一种如本文所定义的方法，该方法是产生功能化单链寡核苷酸库的方法，该功能化单链寡核苷酸库用于单分子荧光原位杂交(smFISH)，其中功能化核苷酸是包含能够参与点击化学的化学基团的核苷酸，并且其中该方法还包括步骤：通过点击化学将荧光标记与每个功能化寡核苷酸中的至少一个功能化核苷酸缀合，并且其中库中的每个功能化单链寡核苷酸包含约15-30个，优选约20-25个核苷酸，并且其中在功能化寡核苷酸与包含目标序列的核酸分子杂交之后，进行通过点击化学将荧光标记与每个功能化寡核苷酸中的至少一个功能化核苷酸缀合的步骤。
功能化单链寡核苷酸的“库”是指具有不同序列的多个寡核苷酸，即与靶标(待测分子)内的不同(例如非重叠)序列杂交的序列。在一些实施方案中，该库包含至少约20个寡核苷酸，例如约22、25、27、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个寡核苷酸。例如，在一些实施方案中，该库包含约30-96个寡核苷酸，例如约36、48、60、72、84或96个寡核苷酸。
或者，在一些实施方案中，假基因包含至少约20个与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列，例如约22、25、27、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列。例如在一些实施方案中，假基因包含约30-96个与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列，例如约36、48、60、72、84或96个与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列。
附图说明
现在将参考以下附图在下述非限制性实施例中更详细地描述本发明：
图1显示了在溴化乙锭染色后使用紫外光可视化的琼脂糖凝胶照片(顶部)，以及使用与荧光团发射波长相对应的波长的荧光成像(底部)。琼脂糖凝胶显示包含荧光团ATTO-488(A)或Cy3(B)的本发明的功能化单链寡核苷酸产物(含有378个核苷酸)。
图2显示了在溴化乙锭染色后使用紫外光可视化的琼脂糖凝胶照片的阴像。琼脂糖凝胶显示了本发明的功能化单链寡核苷酸产物(含有420个核苷酸)，其包含使用各种相对量(即25％、50％、75％和100％)的5-EdUTP/dTTP核苷酸和phi29 DNA聚合酶(A)或BstDNA聚合酶(B)产生的5-乙炔基-dUTP(5-EdUTP)。
图3显示了在溴化乙锭染色后使用紫外光可视化的琼脂糖凝胶照片(左)，和使用对应于Cy3荧光团发射波长的波长的荧光成像(右)。琼脂糖凝胶显示本发明的单链寡核苷酸产物(含有420个核苷酸)，其包含5-乙炔基-dUTP(5-EdUTP)或常规dTTP，其随后与Cy3荧光团-叠氮化物分子(N3-Cy3)反应。阴影框表示指定物种的存在。
图4显示了在溴化乙锭染色后使用紫外光可视化的琼脂糖凝胶照片的阴像。琼脂糖凝胶显示本发明的功能化单链寡核苷酸产物(含有420个核苷酸)，其包含使用不同相对量的功能化核苷酸生产的(A)2'-氟-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸(2'F-dUTP)；(B)2'-脱氧胸苷-5'-O-(1-硫代三磷酸)(α-硫醇-dTTP)；(C)2-dNTP Alpha S核苷酸(Alpha S-dATP、Alpha S-dTTP、Alpha S-dCTP、Alpha S-dTTP和Alpha S-dNTP混合物)。A和B中的右图显示了对应于100％功能化核苷酸的泳道，其过度曝光以显示对应于RCA产物的条带。C中的右图显示了对应于Alpha S-dNTP混合物的泳道，其过度曝光以显示对应于RCA产物的条带。
图5显示了在溴化乙锭染色后使用紫外光可视化的琼脂糖凝胶照片的阴像。琼脂糖凝胶显示本发明生产的寡核苷酸在不同浓度的DNAse I作用下，其中：(A)显示仅含有常规核苷酸(天然ODN)的寡核苷酸的反应产物；(B)显示含有2'-氟-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸功能化核苷酸(2'F-dUTP)的寡核苷酸的反应产物；(C)显示含有2'-脱氧胸苷-5'-O-(1-硫代三磷酸)(S-ODN)的寡核苷酸的反应产物。
图6显示了在SybrGold染色后使用紫外光可视化的变性PAGE凝胶照片的阴像。PAGE凝胶显示本发明的功能化单链寡核苷酸产物，其包含使用各种相对量(即25％、50％、75％和100％)的5-乙烯基-dUTP核苷酸产生的5-乙烯基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸(5-乙烯基-dUTP)。
图7显示了在SybrGold染色后使用紫外线进行可视化的变性PAGE凝胶照片的阴像。PAGE凝胶显示本发明的功能化单链寡核苷酸产物，其包含使用各种相对量(即25％、50％、75％和100％)的5-乙烯基-dUTP核苷酸产生的4-硫胸苷-5'-三磷酸(4-硫代-dTTP)。
图8显示了用于生产具有对应于SEQ ID NO：1-13的序列的寡核苷酸的假基因序列的注释版本。确认了裂解酶和切口酶识别的序列、发夹序列和最终的寡核苷酸序列。
图9显示了2'-叠氮基-dATP(A)的结构和在SybrGold染色后使用紫外光进行可视化的变性PAGE凝胶照片的阴像(B和C)。PAGE凝胶显示本发明的功能化单链寡核苷酸产物，其包含使用各种相对量(即25％、50％、75％和100％)的2’-叠氮基-dATP核苷酸和phi29DNA聚合酶(B)或Bst DNA聚合酶(C)产生的2’-叠氮基-dATP。
图10显示了生物素-16-氨基烯丙基-2'-dUTP的结构(A)和SybrGold染色后使用UV光可视化的变性PAGE凝胶照片的阴像(B)。PAGE凝胶显示本发明的功能化单链寡核苷酸产物，其包含使用各种相对量(即25％、50％、75％和100％)的生物素-16-AA-dUTP核苷酸和phi29 DNA聚合酶产生的生物素-16-氨基烯丙基-2'-dUTP。
图11显示了5'-溴-2'-脱氧尿苷-5'三磷酸核苷酸(A)和5’-丙炔基-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸核苷酸(B)的结构；SybrGold染色后使用紫外光可视化的变性PAGE凝胶照片的阴像(C、D、E和F)。PAGE凝胶显示了本发明的功能化单链寡核苷酸产物，其包含使用各种相对量(即25％、50％、75％和100％)的相应功能化核苷酸和phi29 DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶产生的5'-溴-dUTP(C和E)或5'-丙炔基-dCTP(D和F)。
图12显示了2'-O-甲基腺苷-5'-三磷酸核苷酸的结构(A)和SybrGold染色后使用紫外光可视化的变性PAGE凝胶照片的阴像(B)。PAGE凝胶显示本发明的功能化单链寡核苷酸产物，其包含使用各种相对量(即25％、50％、75％和100％)的2'-OMe-ATP核苷酸和phi29DNA聚合酶产生的2'-OMe-ATP。
图13显示了LNA-腺苷-5'-三磷酸核苷酸的结构(A)和SybrGold染色后使用紫外线可视化的变性PAGE凝胶照片的阴像(B和C)。PAGE凝胶显示本发明的功能化单链寡核苷酸产物，其包含使用各种相对量(即25％、50％、75％和100％)的LNA-ATP核苷酸和phi29 DNA聚合酶(B)或Bst DNA聚合酶(C)产生的LNA-ATP。
具体实施方式
实施例1–包含荧光核苷酸的单链寡核苷酸的酶促生产
使用phi29 DNA聚合酶酶促产生长度为378个核苷酸的单链荧光寡核苷酸(SEQ IDNO：1)。这是通过结合两种不同的功能化dATP核碱基完成的，一种包含荧光团Cy3(7-炔丙基氨基-7-脱氮-ATP-Cy3)，另一种包含荧光团ATTO-488(7-炔丙基氨基-7-脱氮-ATP-ATTO-488)。
如Ducani等，2013，Nature Methods，647-652中所述制备包含SEQ ID NO：1和发夹裂解结构域的双链环状DNA模板。模板(1ng/μL)用Nb.BsrDI和Nt.BspQI(0.25U/μL)切口，并且在每个反应中使用不同比例的天然dATP和功能化dATP(即不同相对量的功能化dATP，2％、3％或5％)进行多次滚环扩增反应(0.1-0.25ng/μL模板DNA，0.25U/μL phi29 DNA聚合酶，0.1μg T4的32基因)。所得RCA产物在去离子水和1X消化缓冲液(50mM醋酸钾、20mMTris-醋酸盐、10mM醋酸镁、100μg/ml BSA，pH 7.9，25℃)中稀释五倍，然后用BtsCI限制酶(0.5U/μL)在50℃消化过夜，消化产物在琼脂糖凝胶上运行。在溴化乙锭染色后，使用对应于两种荧光团的发射波长通过UV可视化进行成像。
ATTO-488和Cy3的结果图像分别显示在图1A和B中。可以看出，增加dATP-ATTO-488核苷酸的百分比导致寡核苷酸具有更高的荧光。然而，当5％的dATP核苷酸是dATP-ATTO-488时，RCA产物的总量下降了大约60％。
令人惊讶的是，与使用dATP-ATTO-488相比，dATP-Cy3核苷酸的存在百分比含量似乎并未影响phi29 DNA聚合酶的效率；单链DNA产物在含有5％的dATP-Cy3的RCA混合物中是可见的(图1B)。此外，修饰核苷酸的引入不会阻止或降低BtsCI限制酶的效率，因此也不会阻止或降低设计含有裂解结构域的发夹的释放。
SEQ ID NO：1
CCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTG
实施例2–酶促生产单链寡核苷酸，其包括具有内化(internalised)炔基(即核碱
基中的炔基)的核苷酸
使用phi29 DNA聚合酶以酶促方式生产长度为420个核苷酸的单链寡核苷酸(SEQID NO：2)，其中包含具有炔基的核苷酸。
如Ducani等，2013，Nature Methods，647-652中所述制备包含SEQ ID NO：2和发夹裂解结构域的双链环状DNA模板。使用实施例1中描述的条件对RCA反应的模板进行切口，但增加了使用的5'-乙炔基-dUTP(5'-EdUTP)的相对量，即用5'-EdUTP替换dTTP，使得5'-EdUTP的相对量为0％(对照反应)、25％、50％、75％或100％。扩增后，RCA产物用BtsCI限制性核酸内切酶消化并加载到琼脂糖凝胶上，如实施例2所述。
图2A中的结果令人惊讶地表明，即使100％的dTTP核苷酸被炔烃功能化的dUTP取代，RCA产率也仅下降了15-20％。因此，图2A还表明RCA产物被BtsCI成功有效地裂解。通过观察到功能化寡核苷酸的较低迁移率这一事实证实了经炔烃功能化的dUTP核苷酸的掺入。
用Bst DNA聚合酶代替phi29 DNA聚合酶进行了额外的实验。凝胶电泳显示，功能化dUTP高达50％时扩增产率没有变化，与25％的修饰dUTP相比，最终产物发生了变化，证实掺入了分子量高于其相应天然核苷酸(dTTP)的修饰核苷酸(图2B)。
SEQ ID NO：2
ATTGAAGCATGCGGCGTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATGCGTAAGATACCACCACACCCGCATTCGCCATTCAGGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTGCTGTTTCCTGTGTAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGTCATATTTGTTCCCTTTAGATCCGCCTCCATCTACAGGGCGCGTCCCCGCGCTTAATGCGCGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACTTACCTTCGGAAAAGAAATTGTTATCCGCTCACAAAAGCCAGAGTATTTAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGGGTTATTGTCTCATCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCTTATCAGACCCTGCCGCTTACAAGTGGTCGCCAGTCTATTAACAGCACTCAATACGGGATAATTTTTCAATATT
实施例3–通过点击化学反应将叠氮化物-荧光团与包含内化炔基的单链核苷酸缀
合
通过进行点击化学反应进一步证明了功能化的5-乙炔基-dUTP核苷酸成功掺入实施例2中产生的寡核苷酸。
来自与75％炔烃功能化dUTP核苷酸反应的功能化寡核苷酸与Cy3-叠氮化物(50μM)一起温育。点击化学溶液还包括作为催化剂的硫酸铜(50μM)、抗坏血酸钠(50mM)和THPTA(250μM)。作为阴性对照，通过相同方法从相同模板但使用常规dNTP产生的寡核苷酸也与Cy3-叠氮化物一起温育。此外，还在不存在Cy3-叠氮化物的情况下温育包含内化炔基的功能化寡核苷酸。来自三个反应的反应混合物在琼脂糖凝胶上运行并成像(图3)。仅在包含功能化寡核苷酸和荧光团叠氮化物的反应中观察到预期长度的荧光单链寡核苷酸。此外，由于硫酸铜的存在，没有观察到可见的DNA降解。
实施例4–酶促生产包含核酸内切酶抗性核苷酸的单链寡核苷酸
2'-氟-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐(2'F-dUTP)或2'-脱氧胸苷-5'-O-(1-硫代三磷酸)(硫代磷酸dTTP)以前都被用于修饰DNA和RNA寡核苷酸用于生物医学和治疗学应用，因为它们具有让核酸酶稳定的能力。使用上述实验方案，通过RCA将这些修饰的核苷酸引入单链DNA寡核苷酸中。以从0％增加到100％的百分比，用功能化核苷酸取代常规dTTP核苷酸。然后串联重复RCA产物被BtsCI限制性核酸内切酶消化成离散的420个碱基的功能化单链寡核苷酸(SEQ ID NO：2)。
在使用2'F-dUTP功能化核苷酸进行的实验中，从0％到75％的功能化核苷酸都可以看到类似的RCA产量，在100％的功能化核苷酸下观察到产量急剧下降(图4A)。
在硫代磷酸dTTP实验中，RCA产量随着功能化核苷酸量的增加而逐渐下降，相对于仅使用常规核苷酸的产量，用75％的功能化核苷酸使产量下降了大约65％(图4B)。
然而，即使在含有100％的功能化核碱基的情况下，功能化的单链寡核苷酸是如何产生的也可通过琼脂糖凝胶的过曝显示——参见图4A和B的右侧部分。
其他硫代磷酸dNTP(表示为Alpha S dNTP)在额外的实验中进行了测试，逐一添加或组合添加(图4C)。即使在后种情况下，其中所有常规核苷酸的75％被其相应的Alpha S功能化核苷酸取代，RCA产物也被合成并酶切以产生在琼脂糖凝胶上可见的寡核苷酸。
研究了功能化寡核苷酸相对于仅用常规核苷酸产生的对照寡核苷酸的核酸内切酶抗性。以一个仅使用常规核苷酸的420-nt长的寡核苷酸作为对照，将2'-F-dUTP功能化寡核苷酸和硫代磷酸dTTP功能化寡核苷酸(均使用75％相对量的功能化核苷酸产生)与浓度增加的DNAse I一起孵育(图5A-C)。对照寡核苷酸用18mU/ml的DNAse I完全消化，但酶促产生的2'-F-dUTP和硫代磷酸dTTP功能化的DNA寡核苷酸在与相同浓度的核酸内切酶孵育后在琼脂糖凝胶上仍然可见。
实施例5–酶促生产包含带有乙烯基的核苷酸的单链寡核苷酸
用胸苷类似物5-乙烯基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸(5-乙烯基-dUTP)功能化的长度为76-81个碱基的单链DNA寡核苷酸(SEQ ID NO：3-13)是根据上述实验方案进行RCA反应酶促产生的。所有寡核苷酸都编码在单个假基因上(SEQ ID NO：16)。在单链寡核苷酸中引入这样的功能化核苷酸使得无铜点击化学反应能被用于将四嗪样分子与寡核苷酸缀合。这种烯烃-四嗪反应可以与之前进行的炔烃-叠氮化物点击化学反应完全正交。
增加RCA反应混合物中功能化核苷酸相对于常规核苷酸dTTP的量，会导致5-乙烯基-dUTP被成功掺入到单链RCA产物中并成功消化发夹结构。然而，用于裂解RCA产物的phi29 DNA聚合酶和II型核酸内切酶的活性水平低于不存在功能化核苷酸的情况，因此当功能化核苷酸完全取代常规的dTTP核苷酸时，会导致具有未消化的发夹结构的更高分子量条带(图6)。
实施例6–酶促生产包含硫醇化核苷酸的单链寡核苷酸
使用上述反应方案和模板，通过RCA反应酶促生产用硫醇化dTTP(4-硫代胸苷-5'-三磷酸)功能化的单链DNA寡核苷酸(SEQ ID NO：3-13)。所有寡核苷酸都编码在单个假基因上(SEQ ID NO：16)。
非常成功地通过phi29 DNA聚合酶将硫醇化核苷酸引入单链寡核苷酸中，高达75％的功能化核苷酸取代了相应的常规核苷酸(dTTP)(图7)，即相对数量为75％功能化核苷酸。
RCA产物用上述II型限制酶消化，然而，功能化RCA产物的完全消化需要比仅包含常规核苷酸的RCA产物所用浓度高10倍的酶浓度。当常规的dTTP核苷酸被功能化的硫醇化核苷酸完全取代时，在用II型限制酶处理后没有观察到单链寡核苷酸，尽管在孔中只观察到非常微弱的未消化RCA产物的积累，表明聚合酶的活性也受到影响。
实施例7–酶促生产包含叠氮核苷酸的单链寡核苷酸
使用phi29 DNA聚合酶(图9B)和Bst DNA聚合酶(图9C)酶促产生长度为420个核苷酸的单链寡核苷酸(SEQ ID NO：2)，其包含百分比增加的功能化2'-叠氮基-dATP核苷酸(图9A)，其取代了相应的常规dATP核苷酸。
新合成的DNA链中的高密度叠氮基使得可以通过Cu(I)催化的Huisgen环加成(“点击”化学)或通过应变促进的(strain-promoted)[3+2]叠氮化物和环炔烃(例如环辛炔或环壬炔)的环加成反应进行炔分子的合成后功能化。
在扩增步骤中使用了具有链置换活性的两种不同聚合酶：phi29 DNA聚合酶或BstDNA聚合酶。两种聚合酶都能够将功能化的核苷酸引入扩增产物中，然后将其消化并在琼脂糖凝胶上运行。
phi29 DNA聚合酶产生的DNA产物在凝胶中可见高达75％的修饰核苷酸(图9B)，而Bst DNA聚合酶产物可见高达100％的修饰核苷酸(图9C)，尽管Bst扩增缓冲盐会导致涂抹效应(即使在对应于0％的2'-叠氮基dATP泳道中)。功能化的核苷酸被成功引入并且没有显著影响发夹结构的形成，这使得能够裂解扩增产物。
实施例8–酶促生产包含生物素化核苷酸的单链寡核苷酸
使用phi29 DNA聚合酶(图10B)以酶促方式产生长度为420个核苷酸的单链寡核苷酸(SEQ ID NO：2)，其包含百分比增加(25％-100％)的功能化生物素-16-氨基烯丙基-2'-dUTP(图10A)，其取代了相应的常规核苷酸dTTP。
生物素化核苷酸的引入仅对DNA扩增反应产生轻微影响，并且令人惊讶的是，尽管由于功能化核苷酸的大尺寸会存在空间位阻的潜在影响，但并未干扰发夹结构的形成，这使得能够裂解RCA产品。将多种内部生物素引入功能化的多核苷酸中使得可以与链霉亲和素功能化的分子缀合。
实施例9–酶促生产包含5-嘧啶修饰：5-溴-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸和5-丙炔基-
2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸的单链寡核苷酸
使用phi29 DNA聚合酶(图11C和11D)和Bst DNA聚合酶(图11E和图11F)酶促生产长度为420个核苷酸的单链寡核苷酸(SEQ ID NO：2)，其包含百分比增加(25％-100％)的非天然5-修饰嘧啶：5-溴-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸(图11A)和5-丙炔基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸(图11B)，分别替换相应的常规核苷酸dTTP和dCTP。令人惊讶的是，两种功能化核苷酸都成功地掺入到新合成的DNA序列中，而不会影响RCA产物中发夹结构的形成，从而允许发生裂解反应。
实施例10–酶促生产包含2'-O-甲基-ATP的单链寡核苷酸
使用phi29 DNA聚合酶(图12B)酶促产生长度为420个核苷酸的单链寡核苷酸(SEQID NO：2)，其包含百分比增加(25％-100％)的2'-O-甲基-ATP(图12A)，其取代了相应的常规核苷酸dATP。即使存在100％的功能化核苷酸，扩增产物仍然可见。该结果与之前的研究相反，之前的研究表明没有已知的天然聚合酶能够有效地接受这些修饰的底物(Romesberg，JACS2004，10.1021/ja038525p)。
此外，在凝胶中看不到更高分子量的未消化DNA条带，表明功能化核苷酸的存在不影响发夹结构的形成和限制性核酸内切酶的消化。鉴于O-甲基赋予DNA分子的核酸酶抗性，这是一个令人惊讶的结果。
实施例11酶促生产包含LNA-腺苷-5'-三磷酸的单链寡核苷酸
使用phi29 DNA聚合酶(图13B)和Bst DNA聚合酶(图13C)酶促产生长度为420个核苷酸的单链寡核苷酸(SEQ ID NO：2)，其包含百分比增加(25％-100％)的LNA-腺苷-5'-三磷酸(图13A)，其取代相应的常规核苷酸dATP。
尽管LNA单体在结构上模拟RNA，即使使用100％的功能化核苷酸，聚合酶(phi29DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶)的效率也没有受到显著影响。此外，功能化核苷酸不干扰使得扩增产物能够被消化的发夹结构的形成。
序列表
<110> 莫利戈技术公司(MOLIGO TECHNOLOGIES AB)
<120> 生产功能化单链寡核苷酸的方法和产品
<130> 20.11.140968/01
<150> GB1901583.3
<151> 2019-02-05
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 1
ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 60
ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 120
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acccgcattc gccattcagg cggccgccac cgcggtggag ctccagctgc tgtttcctgt 120
gtagagttgg tagctcttga tccggtcata tttgttccct ttagatccgc ctccatctac 180
agggcgcgtc cccgcgctta atgcgcggcc taactacggc tacactagaa ggacttacct 240
tcggaaaaga aattgttatc cgctcacaaa agccagagta tttaagctcc ctcgtgcgct 300
ctcctgttcc gggttattgt ctcatcggcg accgagttgc tcttgcttat cagaccctgc 360
cgcttacaag tggtcgccag tctattaaca gcactcaata cgggataatt tttcaatatt 420
<210> 3
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 3
gaaccgtccc aagcgttgcg ccacatctgc tggaaggtgg acagtgagag gacacctacg 60
aatcgcaacg ggtatcct 78
<210> 4
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 4
gaaccgtccc aagcgttgcg cctgggtaca tggtggtacc accagacagg acacctacga 60
atcgcaacgg gtatcct 77
<210> 5
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 5
gaaccgtccc aagcgttgcg gagagcatag ccctcgtaga tgggcaagga cacctacgaa 60
tcgcaacggg tatcct 76
<210> 6
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 6
gaaccgtccc aagcgttgcg gtcccagttg gtaacaatgc catgttcaat gaggacacct 60
acgaatcgca acgggtatcc t 81
<210> 7
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 7
gaaccgtccc aagcgttgcg cggactcatc gtactcctgc ttgctgagga cacctacgaa 60
tcgcaacggg tatcct 76
<210> 8
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 8
gaaccgtccc aagcgttgcg ttctctttga tgtcacgcac gatttcccag gacacctacg 60
aatcgcaacg ggtatcct 78
<210> 9
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 9
gaaccgtccc aagcgttgcg ctcggtcagg atcttcatga ggtagtctgt aggacaccta 60
cgaatcgcaa cgggtatcct 80
<210> 10
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 10
gaaccgtccc aagcgttgcg tttcacggtt ggccttaggg ttcaggggag gacacctacg 60
aatcgcaacg ggtatcct 78
<210> 11
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 11
gaaccgtccc aagcgttgcg gtacttcagg gtcaggatac ctctcttgag gacacctacg 60
aatcgcaacg ggtatcct 78
<210> 12
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 12
gaaccgtccc aagcgttgcg ctgctcgaag tctagagcaa catagcacaa ggacacctac 60
gaatcgcaac gggtatcct 79
<210> 13
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 13
gaaccgtccc aagcgttgcg cctcgtcacc cacataggag tccttcagga cacctacgaa 60
tcgcaacggg tatcct 76
<210> 14
<211> 461
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 假基因序列
<400> 14
ggtctcacat tgcataatta acatccgcgg aacgcggatg ttccggcgtc aatacgggat 60
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 120
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 180
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 240
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 300
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 360
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 420
catccgcgga acgcggatgc agctcttctg cattggagac c 461
<210> 15
<211> 510
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 假基因序列
<400> 15
ggtctcacat tgcataaatt tcatccgtgg gaaccacgga tgaaattgaa gcatgcggcg 60
tgcataattc tcttactgtc atgccatgcg taagatacca ccacacccgc attcgccatt 120
caggcggccg ccaccgcggt ggagctccag ctgctgtttc ctgtgtagag ttggtagctc 180
ttgatccggt catatttgtt ccctttagat ccgcctccat ctacagggcg cgtccccgcg 240
cttaatgcgc ggcctaacta cggctacact agaaggactt accttcggaa aagaaattgt 300
tatccgctca caaaagccag agtatttaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgggtta 360
ttgtctcatc ggcgaccgag ttgctcttgc ttatcagacc ctgccgctta caagtggtcg 420
ccagtctatt aacagcactc aatacgggat aatttttcaa tattcatccg tgggaaccac 480
ggatgaatag ctcttcatgc attggagacc 510
<210> 16
<211> 1177
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 假基因序列
<400> 16
ggtctcacat tgcataatct tcatccgtgg gaaccacgga tgaagaaccg tcccaagcgt 60
tgcgccacat ctgctggaag gtggacagtg agaggacacc tacgaatcgc aacgggtatc 120
ctcatccgtg ggaaccacgg atgaggaacc gtcccaagcg ttgcgcctgg gtacatggtg 180
gtaccaccag acaggacacc tacgaatcgc aacgggtatc ctcatccgtg ggaaccacgg 240
atgaggaacc gtcccaagcg ttgcggagag catagccctc gtagatgggc aaggacacct 300
acgaatcgca acgggtatcc tcatccgtgg gaaccacgga tgaggaaccg tcccaagcgt 360
tgcggtccca gttggtaaca atgccatgtt caatgaggac acctacgaat cgcaacgggt 420
atcctcatcc gtgggaacca cggatgagga accgtcccaa gcgttgcgcg gactcatcgt 480
actcctgctt gctgaggaca cctacgaatc gcaacgggta tcctcatccg tgggaaccac 540
ggatgaggaa ccgtcccaag cgttgcgttc tctttgatgt cacgcacgat ttcccaggac 600
acctacgaat cgcaacgggt atcctcatcc gtgggaacca cggatgagga accgtcccaa 660
gcgttgcgct cggtcaggat cttcatgagg tagtctgtag gacacctacg aatcgcaacg 720
ggtatcctca tccgtgggaa ccacggatga ggaaccgtcc caagcgttgc gtttcacggt 780
tggccttagg gttcagggga ggacacctac gaatcgcaac gggtatcctc atccgtggga 840
accacggatg aggaaccgtc ccaagcgttg cggtacttca gggtcaggat acctctcttg 900
aggacaccta cgaatcgcaa cgggtatcct catccgtggg aaccacggat gaggaaccgt 960
cccaagcgtt gcgctgctcg aagtctagag caacatagca caaggacacc tacgaatcgc 1020
aacgggtatc ctcatccgtg ggaaccacgg atgaggaacc gtcccaagcg ttgcgcctcg 1080
tcacccacat aggagtcctt caggacacct acgaatcgca acgggtatcc tcatccgtgg 1140
gaaccacgga tgaggagctc ttcatgcatt ggagacc 1177
Claims (37)
1.一种生产功能化单链寡核苷酸的方法，所述方法包括：
(a)提供环状DNA分子，所述环状DNA分子包含与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列；
(b)以(a)的环状DNA分子为模板，用一种以上功能化核苷酸(dNTP)进行滚环扩增(RCA)反应；和
(c)在裂解结构域酶促裂解RCA反应的产物，释放功能化单链寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述环状DNA分子是双链的，所述方法还包括如下附加步骤：在进行RCA反应之前裂解环状DNA分子的单链以提供RCA模板。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述功能化dNTP选自：包含炔基的核苷酸、荧光标记的核苷酸、包含甾醇基团的核苷酸、包含聚醚基团的核苷酸、包含金属络合物的核苷酸、包含乙烯基的核苷酸、包含硫醇基团的核苷酸、硫代核苷酸、经修饰具有增加的核酸酶抗性的核苷酸、包含能够参与点击化学反应的化学基团的核苷酸，和影响寡核苷酸热稳定性的核苷酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述功能化dNTP是包含炔基、烯烃基、叠氮基、卤素基团、O-甲基、锁核糖的核苷酸，优选地，所述功能化dNTP是包含炔基、乙烯基或叠氮基的核苷酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述方法还包括通过炔基、乙烯基或叠氮基将分子或组分与寡核苷酸缀合的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述分子或组分选自：荧光基团、甾醇、聚醚、金属络合物、含有硫醇基团的分子、含有提供增加核酸酶抗性的基团的分子，和包含能够参与点击化学反应的基团的分子。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述裂解结构域与所述寡核苷酸序列直接相邻。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述裂解结构域包含被裂解酶识别的序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述裂解结构域包含能够形成发夹结构的序列或由能够形成发夹结构的序列组成。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述发夹结构的双链部分包含被裂解酶识别的序列。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中，所述裂解酶是II型限制性核酸内切酶，任选地是IIS型限制性核酸内切酶，例如BseGI或BtsCI。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，与寡核苷酸序列邻接的裂解结构域是相同的。
13.根据权利要求2至12中任一项所述的方法，其中，所述裂解环状DNA分子的单链以提供RCA模板的步骤包括用裂解酶裂解环状DNA分子的单链。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述的环状DNA分子含有被裂解酶识别的序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述被裂解酶识别的序列位于与寡核苷酸序列邻接的裂解结构域之间，且不在寡核苷酸序列中。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中，所述裂解酶是切口酶，任选地，所述裂解酶是Nb.BsrDI、Nt.BspQI或它们的组合。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，所述RCA反应使用phi29 DNA聚合酶。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，所述RCA反应使用Bst DNA聚合酶。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，所述环状DNA分子包含多个寡核苷酸序列，每个寡核苷酸序列都与裂解结构域邻接。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述寡核苷酸序列是不同的。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，步骤(a)包括：
(i)将线性DNA分子克隆到DNA质粒中，所述线性DNA分子包含与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列；
(ii)扩增所述质粒；
(iii)切除含有DNA分子的质粒的一部分，所述DNA分子包含与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列；和
(iv)环化步骤(iii)中获得的质粒部分。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，步骤(ii)包括将所述DNA质粒转染到细菌中并培养细菌。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中，所述包含与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列的线性DNA分子还包含5'末端区和3'末端区，所述5'末端区和3'末端区各自包含裂解结构域，步骤(iii)包括用裂解酶裂解末端区中的裂解结构域，可选地，所述裂解酶是BsmBI或BsaI。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括分离或纯化所述功能化单链寡核苷酸的步骤。
25.环状DNA分子在生产功能化单链寡核苷酸中的用途，其中，所述环状DNA分子包含与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列，所述裂解结构域含有被裂解酶识别的序列。
26.根据权利要求25所述的用途，其中，所述裂解结构域如权利要求7或9至12中任一项所定义和/或DNA分子如权利要求19所定义。
27.用于权利要求1至24中任一项所述的方法的试剂盒，包含：
(i)包含与裂解结构域邻接的寡核苷酸序列的环状DNA分子，所述裂解结构域包含能够形成发夹结构的序列或由能够形成发夹结构的序列组成，所述发夹结构的双链部分包含被裂解酶识别的序列；和
(ii)功能化dNTP，可选地，所述功能化dNTP如权利要求3或4中所定义；和可选的：
(iii)裂解(i)中裂解结构域的一种以上裂解酶。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中，所述裂解结构域如权利要求7、11或12中任一项所定义和/或DNA分子如权利要求19所定义。
29.通过权利要求1至24中任一项所述的方法获得的功能化单链寡核苷酸，其中：
(i)寡核苷酸含有至少50个核苷酸；并且
(ii)至少5％的核苷酸残基含有选自炔基、烯烃基、叠氮基、卤素基团、O-甲基、锁核糖或它们的组合的官能团。
30.根据权利要求29所述的功能化单链寡核苷酸，其中，至少一个含有官能团的核苷酸残基是内部残基。
31.根据权利要求29或30所述的功能化单链寡核苷酸，其中，至少10％的核苷酸残基含有选自炔基、烯烃基、叠氮基、卤素基团、O-甲基、锁核糖或它们的组合的官能团。
32.一种文库，其包含多个通过权利要求1至24中任一项所述的方法获得的功能化单链寡核苷酸，所述文库包含如权利要求29至31中任一项所定义的功能化单链寡核苷酸。
33.根据权利要求1至3或7至24中任一项所述的方法，其中，所述方法为用于产生功能化单链寡核苷酸库的方法，所述功能化单链寡核苷酸库用于单分子荧光原位杂交(smFISH)，所述功能化核苷酸是荧光标记的核苷酸，所述库中的每个功能化单链寡核苷酸含有约15-30个，优选约20-25个核苷酸。
34.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中，所述方法为用于生产功能化单链寡核苷酸库的方法，所述功能化单链寡核苷酸库用于单分子荧光原位杂交(smFISH)，所述功能化核苷酸是包含能够参与点击化学的化学基团的核苷酸，所述方法还包括如下步骤：通过点击化学将荧光标记与每个功能化寡核苷酸中的至少一个功能化核苷酸缀合，所述库中的每个功能化单链寡核苷酸含有约15-30个，优选约20-25个核苷酸。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，包含能够参与点击化学的化学基团的核苷酸是包含叠氮基、炔基、烯烃基、硝酮基、四嗪基或四唑基或它们的组合的核苷酸。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中，通过点击化学将荧光标记与每个功能化寡核苷酸中的至少一个功能化核苷酸缀合的步骤在功能化寡核苷酸与包含目标序列的核酸分子杂交之前进行。
37.根据权利要求34或35所述的方法，其中，通过点击化学将荧光标记与每个功能化寡核苷酸中的至少一个功能化核苷酸缀合的步骤在功能化寡核苷酸与包含目标序列的核酸分子杂交之后进行。
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