JP2022519684A - 官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを作製する方法及び産物 - Google Patents

官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを作製する方法及び産物 Download PDF

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Abstract

本発明は、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドに関し、特に、(a)切断ドメインが接しているオリゴヌクレオチド配列を含む環状DNA分子を準備する工程と; (b)鋳型として(a)の環状DNA分子及び1つ又は複数の官能化されたヌクレオチド(dNTPs)でローリングサークル増幅(RCA)反応を実行する工程と; (c)切断ドメインでRCA反応の産物を酵素的に切断して一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを遊離させる工程とを含む官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを作製する方法に関する。

Description

本発明は、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを作製する方法に関する。特に、本発明は、酵素媒介性ローリングサークル増幅(RCA)反応において官能化されたヌクレオチドを利用して、多数の官能化されたオリゴヌクレオチド(例えばライブラリ)を生成する方法を提供する。本方法に使用するためのキット及び本方法によって得られる官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドも提供される。特に、本発明は、本方法によって得られる複数の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを含むライブラリを提供する。
一本鎖ヌクレオチドは、ワトソン-クリック型塩基対によって相補配列に、例えば分子間的にハイブリダイズする能力のため、広範囲の適用に有用である。加えて、一本鎖オリゴヌクレオチドは、それ自身にハイブリダイズ(即ち、分子内相補性)して、アプタマーとして公知の二次構造を含めた複雑な位相的幾何形状及び分子集合体を形成することができる。これらのアプタマーは、非共有結合性の相互作用によって生物学的標的に高親和性で結合して、一連の異なる機能をもたらすことができる。オリゴヌクレオチドの有用性は、ヌクレオチド、特に核酸塩基への官能性の追加(即ち反応性化学基の追加)によって増強される場合があり、その官能性は、ワトソン-クリック型塩基対と干渉しない。しかしながら、そのような官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドの合成に問題がある場合があり、これが、上述した適用の成長を阻害してきた。
現時点では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、固相合成を使用して一般に作製され、ヌクレオチドは、固体支持体に結合している成長鎖へ段階的な様式で付加される。しかしながら、この方法は、作製されるオリゴヌクレオチドの長さ及び精度の点で厳しく制限され得る。固相合成によるオリゴヌクレオチドの作製における誤差率は、天然に観察されるポリメラーゼ酵素の誤差率より有意に高く、オリゴヌクレオチドの長さと共に劇的に増大し、長さおよそ50残基の市販のオリゴヌクレオチドではわずか70%の純度が一般的である。更に、官能化されたヌクレオチドを高密度で含有する一本鎖オリゴヌクレオチドの利用可能性は、固相合成の長さ、品質及び費用に関する制約のため制限されてきた。特に、固相合成によって作製される一本鎖オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る官能化されたヌクレオチドの数は、例えば官能基に起因する交差反応のため限られている。
合成オリゴヌクレオチドの使用の多くが高純度のレベルを必要とすることは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)又はポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)等の方法による精製の追加工程が、固相合成反応の所望の産物を単離するためにしばしば必要であることを意味する。これが、現在の方法を労働集約的のみならず高価にしている。更に、これら追加の精製工程の後でも、残留する不純物に起因する実際的な問題が、今なお観察され得る。
固相法によるこれらの問題を考えると、官能化されたオリゴヌクレオチドを作製する代替方法、特に、より高精度でより長いオリゴヌクレオチドを作製可能な費用効果が優れている方法に対する要望が存在する。
米国特許第5,449,603号 米国特許第5,534,407号 米国特許第6,867,028号
Ducaniら、2013, Nature Methods, 647～652頁 Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification, Genome Research, 11 , 1095～1099頁 Schwartzら、Nucl. Acids Res. 18:1079頁 (1990) Huang, DNA Cell. Biol. 15: 589～594頁 (1996) Ducaniら、Nucl. Acids Res. 42: 10596頁 (2014) Angew. Chem. Int. Ed., 2001 , 40(11):2004～2021頁 Pharm Res. 2008, 25(10): 2216～2230頁 Chem. Commun., 2011 , 47:6257～6259頁 Nature, 2015, 519(7544):486～90頁 Romesberg, JACS 2004, 10.1021/ja038525p
修飾された(例えば、官能化された)ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを作製するための酵素反応にこれまで使用されてきたが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又はプライマー伸長法(PE)反応によって官能化されたDNAを作製する場合だけであった。これらの反応は、次いで後に除去されなければならない特異的なプライマーの使用を必要とし、修飾ヌクレオチドがポリメラーゼによって組み込まれるだけでなく、PCRの際に官能化された産物が鋳型として認識されることを必要とする。これは、いくつかの修飾の際に問題を含む場合があり、従ってこれらの方法の有用性を制限している。更に、プライマーは固相法によって合成され、検証された配列ではなく、新しく合成されるDNAにおける誤りの増幅をもたらす。加えて、PCRに基づく方法は、二本鎖DNA産物を圧倒的多数でもたらし、従って官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを得るには溶出及び精製の追加の工程が必要である。
本発明者らは、配列を検証した鋳型から「モノクローナル化学量論的」(MOSIC)一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを酵素的に作製する方法について以前に記載している(Ducaniら、2013, Nature Methods, 647～652頁)。本発明者らは、MOSIC方法が、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを作製するように成功裏に構成され得ることを驚くべきことに決定した。
代表的な例において、本方法は、1つ又は複数のオリゴヌクレオチド配列を含む直鎖状配列の設計及び調製を含み、それぞれが、制限酵素部位を含有するヘアピン配列に接している。直鎖状配列は、二本鎖ローリングサークル増幅(RCA)鋳型へと次いで環状化され、ニックを入れられ、1つ又は複数の官能化されたヌクレオチドの存在下でのRCAによって増幅されて、官能化されたヌクレオチドを含む部分的に一本鎖の直鎖状コンカテマーが作製される。RCA産物は、上述したヘアピン領域内の制限部位を認識し、コンカテマーを切断する制限酵素で次いで処理されて、複数の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドが遊離する、即ち官能化されたオリゴヌクレオチドのライブラリが作製される。
実施例に示すように、本発明者らは、予想に反して、官能化されたヌクレオチドが、鎖置き換え活性を持つDNAポリメラーゼによって効率的に組み込まれ、ヘアピン構造の形成を妨げない又はヘアピン構造の安定性若しくは有効な切断と干渉しなかったことを有利に決定した。更に、本発明者らは、本方法と関連した有益な特徴をなお維持しながら官能化されたヌクレオチドが、MOSIC方法に利用され得ることを発見した。例えば、上述したPCRに基づく方法とは対照的に、本方法は、プライマーを必要とせず、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを直接作製することができる。これは、プライマーアニーリングを可能にする又は二本鎖産物を一本鎖オリゴヌクレオチドに変換するいかなる追加の工程も必要がない。更に、本方法は、更なる増幅のために鋳型として認識されるべき官能化されたヌクレオチドを必要とせず、このことは官能化された残基が多く組み込まれ得ることを意味する。
従って、広い意味では、本発明は、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドの作製における切断ドメインが接しているオリゴヌクレオチド配列を含む環状DNA分子の使用を提供すると見られ得る。特に、本発明は、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドの作製における切断ドメインが接しているオリゴヌクレオチド配列を含む環状DNA分子及び1つ又は複数の官能化されたヌクレオチドの使用と見られてもよい。
官能化されたヌクレオチドが同等の従来通りのヌクレオチドと組み合わせて使用される場合、官能化されたヌクレオチドは、RCA反応によって作製されるコンカテマーに無作為に組み込まれてもよく、従ってコンカテマーの切断が、多数の一本鎖官能化オリゴヌクレオチド(例えばライブラリ)、即ち官能化されたヌクレオチドがオリゴヌクレオチド中の異なる位置に組み込まれている、をもたらすことが明白になる。作製される官能化されたオリゴヌクレオチドの多様性は、それぞれ切断ドメインが接している複数のオリゴヌクレオチド配列を含有する環状DNA分子を使用することにより増大され得ることが、更に明白になる。オリゴヌクレオチド配列は、その配列及び/又は長さが異なっていてもよい。更に又は選択的に、官能化されたオリゴヌクレオチドの多様性は、RCA反応に官能化されたヌクレオチドの組合せを使用することによって増大されてもよい。なお更なる多様性は、例えば、オリゴヌクレオチド中の官能化されたヌクレオチドに分子又は成分をコンジュゲートすることによって合成後にオリゴヌクレオチドを修飾することにより官能化されたオリゴヌクレオチドのライブラリに導入されてもよい。従って、本発明が、DNA微小工学、核酸画像診断及び生物医学に新たな用途を開き得る高度に官能化された一本鎖DNAオリゴヌクレオチドの酵素的に作製するための新たな方法を有利に提供することが明白になる。従って、特定の一態様において、本発明は、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを作製する方法を提供し、前記方法は:
(a)切断ドメインが接しているオリゴヌクレオチド配列を含む環状DNA分子を準備する工程と;
(b)鋳型として(a)の環状DNA分子及び1つ又は複数の官能化されたヌクレオチド(dNTP)を用いてローリングサークル増幅(RCA)反応を実行する工程と;
(c)切断ドメインでRCA反応の産物を切断して一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを遊離させる工程とを含む。
以下でより詳細に述べられるように、環状DNA分子を提供する工程は、任意の適切な手段によって達成されてもよく、環状DNA分子の構造によって決まり得る。この点で、環状DNA分子は、一本鎖DNA分子又は二本鎖DNA分子でもよい。
環状DNA分子が二本鎖分子である実施形態において、RCA鋳型を準備するには環状DNA分子が、加工されなければならないことは明白になる。従って一部の実施形態において、本方法は、RCA反応が実行される前に、環状DNA分子の一本鎖を切断してRCA鋳型を準備する追加の工程を含む。
本発明を有利に使用して、任意のオリゴヌクレオチド配列を含む官能化されたオリゴヌクレオチドを作製し得る。従って、任意の適切な配列が、本発明の環状DNA分子内にオリゴヌクレオチド配列として使用され得る。適切な配列とは、オリゴヌクレオチド配列ドメインが、RCA産物の作製又は切断と干渉する(即ち、阻害する又は変形させる)べきでないことを意味する。例えば、一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、RCA反応を実行するポリメラーゼの進行を阻害する、又は置き換えをもたらす可能性がある二次構造の生成を回避するように設計されてもよい。にもかかわらず、一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド配列はアプタマーであってもよく、又はそれをコードしてもよい。
更に、オリゴヌクレオチド配列は、RCA産物中の切断ドメインに特異的にハイブリダイズしないように設計され得る。別の見方では、オリゴヌクレオチド配列に接する切断ドメインは、RCA産物中のオリゴヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズしないように設計され得る。
環状DNA分子が複数のオリゴヌクレオチド配列を含む実施形態において、各配列は、RCA産物中の他のオリゴヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズしないように設計され得る。しかしながら、一部の実施形態において、例えば、特にRCA産物からの遊離後に、前記オリゴヌクレオチドが相互作用できるような相補性がある領域を含有する官能化されたオリゴヌクレオチドを作製することが、望ましい場合がある。このように、一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、その相互作用がRCA産物の作製又は切断、即ち官能化されたオリゴヌクレオチドの作製と干渉しない限り、本方法で作製される官能化されたオリゴヌクレオチドの相互作用(例えばハイブリダイゼーション)を促進するように設計されてもよい。
従って、一部の実施形態において、環状DNA分子のオリゴヌクレオチド配列の核酸配列は、環状DNA分子内の切断ドメイン及び/又は他のオリゴヌクレオチド配列内の核酸配列と80%未満の配列同一性を有する。好ましくは、環状DNA分子のオリゴヌクレオチド配列は、環状DNA分子内の切断ドメイン及び/又は他のオリゴヌクレオチド配列内の核酸配列と70%、60%、50%未満又は40%未満の配列同一性を有する。配列同一性は、当業者に公知の任意の適切な方法、例えばBLAST整列化アルゴリズムを使用することによって決定され得る。
従って、用語「オリゴヌクレオチド配列」は、特に制限的ではなく、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド若しくは本発明のオリゴヌクレオチド又はその相補部を作製するために使用される鋳型配列のことを指す。この点において、環状DNA分子が一本鎖である場合、環状DNA分子の配列は、工程(b)において得られるRCA産物中の反復(タンデム)配列の逆相補である。環状DNA分子が二本鎖である場合、それは、工程(b)において得られるRCA産物内に反復配列とその逆相補の両方を含有する。従って、環状DNAをプロセッシングしてRCA鋳型を得る工程は、RCA産物内で反復されることになる配列を含有する環状DNA分子の鎖を切断する工程を含み得る。
本発明を使用して、任意の所望の長さの官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを作製できる。実施例に示すように、本方法を使用して、固相合成方法を使用して正確に作製され得るオリゴヌクレオチドをはるかに超える長さの官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを作製することができる。従って、オリゴヌクレオチド配列(従って、本方法によって作製される官能化されたオリゴヌクレオチド)は、長さ約6～約10000ヌクレオチドまでであり得る。従って、一部の実施形態において、本方法は、官能化されたポリヌクレオチドの作製と見ることができる。この点において、「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」との間のサイズの境界線は、当業者に明確でない。例えば、400ヌクレオチドより多い配列が、ポリヌクレオチドと称されてもよい。従って、用語オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、本明細書において互換的に使用され、上で指定されるサイズ範囲内のヌクレオチド配列のことを指す。しかしながら、用語「ポリヌクレオチド」が使用される場合、それは400を超えるヌクレオチドを含有する配列のことを一般に指すことになる。従って、一部の実施形態において、本方法及び使用は、一本鎖の官能化されたDNA分子を複数作製する工程と見ることができる。
一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、長さ約6～約750ヌクレオチドであり得、長さ約6～約500ヌクレオチド、例えば、長さ約8～約400ヌクレオチド、長さ約8～約300ヌクレオチド、長さ約8～約250ヌクレオチド、長さ約10～約200ヌクレオチド、長さ約10～約150ヌクレオチド、長さ約12～約100ヌクレオチド、長さ約12～約75ヌクレオチド、長さ約14～約70ヌクレオチド、長さ約14～約60ヌクレオチド等、長さ約6～約450ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、約10～400、11～390、12～380、13～370、14～360又は15～350ヌクレオチドを含有する。
上記したように、本発明は、例えば、約35、40、45、50、60、70、80、90、100又はそれより多いヌクレオチド等の約30若しくはそれより多いヌクレオチドを含むより長いオリゴヌクレオチドの作製に特に有効である。例えば、本発明によって作製されるオリゴヌクレオチドは、約30～1000、40～900、50～800、60～700、70～600、80～500、90～450又は100～400ヌクレオチドを含有し得る。一部の実施形態において、本発明によって作製されるオリゴヌクレオチド(例えばポリヌクレオチド)は、約400～10000、500～9000、600～8000、700～7000、800～6000、900～5000又は1000～4000ヌクレオチドを含有し、例えば約500、1000、1500、2000、2500、3000、3500又はそれより多いヌクレオチドを含み得る。
一部の実施形態において、環状DNA分子が複数のオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列は、切断ドメインに接している。オリゴヌクレオチド配列は、互いに同じ若しくは異なってもよく、又はその組合せでもよい。従って、一部の実施形態において、環状DNA分子は、下で定義するものと同じオリゴヌクレオチド配列のコピーを1つより多く、例えば2、3、4、5コピー、等含んでもよい。一部の実施形態において、環状DNA分子は、複数の異なるオリゴヌクレオチド配列のそれぞれを1コピー、例えば2、3、4、5つ、等の下で定義される異なるオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。一部の実施形態において、環状DNA分子は、複数の異なるオリゴヌクレオチド配列のコピーを1つ又は複数含み得る。更に下で述べられるように、本発明を使用して、環状DNA分子中のオリゴヌクレオチド配列のコピー数に基づいて、制御された化学量論で複数の官能化されたオリゴヌクレオチドが生成され得る。
環状DNA分子内で複数のオリゴヌクレオチド配列が任意の順序で存在し得ることは明白であろう。例えば、複数コピーの同じオリゴヌクレオチド配列は、環状DNA分子内で互いに直接隣接していてもよい(オリゴヌクレオチド配列に接している切断ドメインによってのみ分離される)。別法として、複数コピーの同じオリゴヌクレオチド配列は、異なるオリゴヌクレオチド配列が間に入っていてもよい。環状DNA分子は、上で定義したRCA産物の作製若しくは切断と干渉する可能性があるRCA産物内の反復配列同士の間の相互作用を回避又は最小化するように設計されてもよい(例えば複数のオリゴヌクレオチド配列の順序)。
本明細書では用語「複数」は、本発明の状況に応じて2つ以上、例えば少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、20若しくは30個又はそれより多い、50、100、150、200、250個若しくはそれより多い等を意味する。例えば、環状DNA分子は、2～100、3～90、4～80、5～70、6～60、7～50、8～40、9～30若しくは10～20個のオリゴヌクレオチド配列等、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、20若しくは30個又はそれより多くのオリゴヌクレオチド配列を含有し得る。一部の実施形態において、本発明の方法は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、20若しくは30個又はそれより多い、50、100、150、200、250個若しくはそれより多い官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド、即ち異なる配列及び/又は構造を持つオリゴヌクレオチドを作製し得る。この点において、官能化されたヌクレオチドは、即ち官能化されたヌクレオチドが上記の通り100%未満の相対量で存在する場合、RCA産物に無作為に組み込まれ得るので、異なる官能化されたオリゴヌクレオチドが、同じ鋳型オリゴヌクレオチド配列から作製される場合もある。更に、環状DNA分子が、複数の異なるオリゴヌクレオチド配列を含有する場合、各鋳型は、複数の異なる官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドをもたらすことになる。更に、RCA反応は、複数の環状DNA分子を利用し得るので、前記反応は、複数の各官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド、例えば103、104、105、106、107、108、109、1010個又はそれより多くのコピーの各官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドをもたらすことになる。
用語「異なる」は、1つ若しくは複数の異なるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列又は官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドのことを指す。従って、異なるオリゴヌクレオチド配列は、1つ又は複数、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多いヌクレオチド、例えば20、30、40、50、60、70、80、90若しくはそれより多いヌクレオチドで異なり得る。差異は、オリゴヌクレオチド配列の長さ及び/又は配列であり得る。別の見方では、異なるオリゴヌクレオチド配列は、互いに99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、70%、60%、50%未満等、互いに100%未満の配列同一性を有する。異なる官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドは、同じヌクレオチド配列を含み得るが、オリゴヌクレオチド内の官能化されたヌクレオチドの位置又は特定の位置における官能化されたヌクレオチドの型が異なる場合がある(例えば、RCA反応において官能化されたヌクレオチドの組合せが使用される場合)。代わりに又は更に、異なる官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドは、上で定義したオリゴヌクレオチド配列の点で異なり得る。
従って、本発明を使用して、いくつかの異なる一本鎖官能化オリゴヌクレオチドが同時に作製されてもよい。特に、環状DNA分子の配列を改変することによって、特に、存在する各異なるオリゴヌクレオチド配列のコピー数を制御することによって、本方法によって最終的に作製される一本鎖官能化オリゴヌクレオチドの化学量論を制御することが可能である。しかしながら、各オリゴヌクレオチド配列から得られる官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドは、異なり得る(RCA産物中の官能化されたヌクレオチドの無作為な組み込みのため)ので、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドの化学量論は、特定のオリゴヌクレオチド配列に基づいてオリゴヌクレオチド数に関して制御され得る。従って、環状DNA分子は、複数の異なるオリゴヌクレオチド配列のコピーを複数含み得る。
本明細書では用語「切断ドメイン」とは、特異的に切断されて官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを遊離させることができるRCA産物内のドメインをもたらす環状DNA分子内のドメインのことを一般に指す。従って、環状DNA分子内の切断ドメインは、直接切断する能力があってもよく、又はRCA産物においてのみ機能的な若しくは特定の条件下、例えば補因子と接触すると機能的な切断ドメインを単純にコードしてもよい。
「切断」は、共有結合を壊す任意の手段を含む。従って、本発明の文脈において、切断は、例えばホスホジエステル結合の切断によるヌクレオチド鎖内の共有結合の切断(即ち鎖切断又は鎖分割)を含む。
従って、一部の実施形態において、切断ドメインは、核酸分子を切断することができる、即ち2つ以上のヌクレオチド間のホスホジエステル結合を壊すことができる1つ若しくは複数の酵素によって認識される配列を含み得る。
従って、一部の実施形態において、本発明は、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを作製する方法を提供し、前記方法は:
(a)切断ドメインが接しているオリゴヌクレオチド配列を含む環状DNA分子を準備する工程と;
(b)鋳型として(a)の環状DNA分子及び1つ又は複数の官能化されたヌクレオチド(dNTP)を用いてローリングサークル増幅(RCA)反応を実行する工程と;
(c)切断ドメインでRCA反応の産物を酵素的に切断して一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを遊離させる工程とを含む。
従って、一部の実施形態において、工程(c)は、RCA反応の産物を切断酵素と接触させる工程を含む。
例えば、切断ドメインは、制限エンドヌクレアーゼ(制限酵素)認識配列を含んでもよい。制限酵素は、制限部位として公知の特異的認識ヌクレオチド配列で二本鎖又は一本鎖DNAを切り、適切な酵素は当業者に周知である。例えば、レアカッティング制限酵素、即ち長い認識部位を持つ酵素(長さ少なくとも8塩基対)を使用して、環状DNA分子内のオリゴヌクレオチド配列の設計を容易にする、例えばオリゴヌクレオチド配列内の切断認識部位の内包を回避することも特に有利となり得る。
一部の実施形態において、切断ドメインは、II型制限エンドヌクレアーゼ、より好ましくはIIs型制限エンドヌクレアーゼによって認識される配列を含んでもよい。任意の適切な切断ドメイン及び切断酵素が、本発明において使用され得るが、一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド配列に接している切断ドメインを認識する切断酵素は、BseGI、BtsCI又はそのアイソシゾマー、例えばBstF5l若しくはFoklでもよい。使用され得る他の代表的な酵素には、BsrDI、BtsI、BtsIMutl、MlyI又はそのアイソシゾマーがある。
従って、一部の実施形態において、RCA反応の産物を切断する工程は、適切な条件下でRCA産物を切断酵素と接触させて、切断ドメインにおいてRCA産物を選択的に切断する工程を含む。
一部の実施形態において、切断ドメインは、別の成分の追加によってRCA産物において機能的にされ得る(活性化され得る)、即ち、RCA産物が操作されて、機能的切断ドメイン、例えば制限エンドヌクレアーゼ認識配列が含められてもよい。例えば、これは、オリゴヌクレオチド(本明細書において「制限オリゴヌクレオチド」と称される)をRCA産物の切断ドメインにハイブリダイズさせて二本鎖を形成することによって達成されてもよい。形成された二本鎖の少なくとも一部分は制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことになり、その部位は、切断されて官能化されたオリゴヌクレオチドの遊離をもたらし得る。これは、RCA産物、特に切断ドメインに組み込まれる官能化されたヌクレオチドが、切断酵素の活性と干渉し得る(例えば、効率を減少させる)実施形態において、特に有利であり得る。
従って、一部の実施形態において、RCA反応の産物を切断する工程は、RCA産物を制限オリゴヌクレオチド及び切断酵素と接触させる工程を含んでもよい。制限オリゴヌクレオチド及び切断酵素は、RCA産物と同時又は順次接触されてもよい。
一部の実施形態において、切断ドメインは、切断酵素以外の手段で切断されてもよい。例えば、切断ドメインは、DNAzymeヌクレアーゼ等の自己切断性オリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。
従って、一部の実施形態において、本発明は、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを作製する方法を提供し、前記方法は:
(a)自己切断する切断ドメイン(例えばDNAzymeヌクレアーゼを含む切断ドメイン)に接しているオリゴヌクレオチド配列を含む環状DNA分子を準備する工程と;
(b)鋳型として(a)の環状DNA分子及び1つ又は複数の官能化されたヌクレオチド(dNTPs)を用いてローリングサークル増幅(RCA)反応を実行する工程と;
(c)切断ドメインでRCA反応の産物を切断して一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを遊離させる工程とを含み、
工程(c)は、RCA反応の産物中の自己切断性切断ドメインを活性化する工程を含む。
適切な自己切断性配列は、当業者に公知である。自己切断性配列を利用する実施形態において、切断ドメインは、RCA産物中でのみ機能的(活性)であり得る。別法として、自己切断性配列は、特定の条件下で機能的であり得、従って、本方法は、切断ドメインにおけるRCA産物の切断を容易にする条件、即ち自己切断性配列を活性化する条件、例えば、RCA産物を自己切断性活性に必要とされる金属イオン等の補因子と接触させる条件にRCA産物を供する工程を含んでもよい。別の見方では、RCA反応の産物を切断する工程は、切断ドメインにおけるRCA産物の切断を容易にする条件、即ち自己切断性配列を活性化する条件、例えば、RCA産物を自己切断性活性に必要とされる金属イオン等の補因子と接触させる条件にRCA産物を供する工程を含んでもよい。
一部の実施形態において、切断ドメインは、ヘアピン構造を形成する能力がある配列を含む又はそれからなる。ヘアピン構造は、ヘアピンループ又はステムループとしても公知であり得、これらの用語は、本明細書において互換的に使用される。ヘアピンは、一本鎖DNA又はRNA分子において起こり得る分子内塩基対合パターンである。ヘアピンは、反対方向に読んだ場合にヌクレオチド配列において通常相補的な同じ鎖の2つの領域が塩基対形成(ハイブリダイズ)して、二本鎖ステム(二重鎖)及び対になってない、即ち一本鎖のループを形成する場合に起こる。得られた構造は、ロリポップ形状と言われ得る。
従って、切断ドメインが、ヘアピン構造を形成する能力がある配列を含む又はそれからなる一部の実施形態において、切断ドメインは、自己相補的である配列を含む。RCA産物が伸長するにつれて、これら自己相補領域のハイブリダイゼーションは、ヘアピン構造をもたらし、ヘアピン構造の二本鎖部分は、切断酵素によって認識される配列を含む。従って、RCA産物内のヘアピン構造の二本鎖部分の切断は、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド及びヘアピン構造(即ち、ヘアピン構造を形成するオリゴヌクレオチド)の遊離をもたらす。
本明細書では用語「ハイブリダイゼーション」又は「ハイブリダイズする」とは、ワトソン-クリック型塩基対によって二重鎖を形成するのに十分に相補的なヌクレオチド配列同士の間の二重鎖の形成のことを指す。2つのヌクレオチド配列は、それら分子が塩基対組織化相同性を共有する場合、互いに「相補的」である。「相補的な」ヌクレオチド配列は、適当なハイブリダイゼーション条件下で特異性をもって組み合わさって安定な二重鎖を形成することになる。例えば、第1の配列の区域が、逆並行センスで第2の配列の区域に結合できる場合、2つの配列は相補的であり、各配列の3'-末端は、他の配列の5'-末端に結合し、一方の配列の各A、T(U)、G及びCが、それぞれ他方の配列のT(U)、A、C及びGと次いで整列される。RNA配列も、相補的なG=U又はU=G塩基対を含み得る。従って、2つの配列は、本発明の下で「相補的」になるために完全な相同性を有する必要はない。通常、少なくとも約90%(好ましくは少なくとも約95%)のヌクレオチドが、分子の定義された長さにわたって塩基対組織化を共有する場合、2つの配列は十分に相補的である。
RCA産物が切断されると、官能化されたオリゴヌクレオチドが遊離する。遊離する官能化されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド配列のみからなってもよく(即ちいかなる追加のヌクレオチドもない)、又は一方若しくは両方の末端にオリゴヌクレオチド配列に接している切断ドメインからの追加のヌクレオチドを1つ若しくは複数含んでもよい。従って一部の実施形態において、官能化されたオリゴヌクレオチドは、一方若しくは両方の末端に切断ドメインからの1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10又はそれより多いヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、環状DNA分子の配列は、RCA産物が切断された場合に遊離する官能化されたオリゴヌクレオチドが、切断ドメインからの追加のヌクレオチドを全く含有しないように設計される。別の見方では、オリゴヌクレオチド配列に接している切断ドメインは、RCA産物におけるその切断により、切断ドメインからの追加のヌクレオチドを全く含有しない官能化されたオリゴヌクレオチドの遊離を生じるように環状DNA分子内に配置されてもよい。
切断酵素は、切断酵素認識配列の外側の位置で核酸分子を切断し得るので、1つ又は複数のヌクレオチドが切断ドメインとオリゴヌクレオチド配列との間に存在する場合がある。別の見方では、切断により、好ましくは追加のヌクレオチド(例えば、切断ドメインの部分を形成するヌクレオチド)を全く含まずに完全な官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドの遊離を生じることを確実にするために、切断ドメインは、切断酵素認識配列に加えてヌクレオチド配列を含有してもよい。
従って、用語「接している(bordered)」とは、オリゴヌクレオチド配列に直接又は間接的に隣接している切断ドメインのことを指す。別の見方では、切断ドメインは、オリゴヌクレオチド配列のいずれかの末端に配置され、即ち、切断ドメインは、オリゴヌクレオチド配列の上流及び下流(5'及び3'末端)にある。一部の実施形態において、切断ドメインの切断部位(例えば、切断酵素が切断ドメインを切断する部位)は、それが接しているオリゴヌクレオチド配列の末端に直接隣接している。一部の実施形態において、例えば、切断部位が切断ドメイン内の内部部位である、即ち切断ドメインがオリゴヌクレオチド配列の末端又は末端の部分を形成し得る場合、オリゴヌクレオチド配列及び切断ドメイン配列は重複していてもよい、即ち、オリゴヌクレオチド配列の末端は切断ドメインの部分を形成してもよい。従って、一部の実施形態において、1つ若しくは複数、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10又はそれより多いヌクレオチドが、切断ドメインとオリゴヌクレオチド配列との間(即ち配列の末端同士の間)に存在してもよい。一部の実施形態において、切断ドメイン及びオリゴヌクレオチド配列は、1つ若しくは複数、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10又はそれより多いヌクレオチドに重なっていてもよい。
環状DNA分子中の切断ドメインのサイズは、特に限定されず、上記の切断ドメインの型によって決まることになる。切断ドメインは、切断ドメインの長さがオリゴヌクレオチド配列の長さと異なるように設計又は選択してRCA産物が切断ドメインで切断されたら、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド配列を容易に精製できるようにされてもよい。従って、一部の実施形態において、切断ドメインは、環状DNA分子においてオリゴヌクレオチド配列より短く選択され得る。環状DNA分子が、異なる長さの複数のオリゴヌクレオチド配列を含有する場合、切断ドメインは、環状DNA分子内で最も短いオリゴヌクレオチド配列より短く選択され得る。他の実施形態において、切断ドメインは、環状DNA分子においてオリゴヌクレオチド配列より長く選択されてもよい。環状DNA分子が、異なる長さの複数のオリゴヌクレオチド配列を含有する場合、切断ドメインは、環状DNA分子において最も長いオリゴヌクレオチド配列より長く選択されてもよい。一部の実施形態において、切断ドメインの長さとオリゴヌクレオチド配列は、少なくとも3、4、5、6、7、8、9又は10ヌクレオチド等少なくとも2つのヌクレオチドによって異なる。
所望のオリゴヌクレオチド配列及び切断ドメインがおよそ同じ長さの場合、切断ドメインは、サイズによって最終的な一本鎖官能化オリゴヌクレオチドから分離され得るように伸長されてもよい。例えば、自己相補性の追加領域を、切断ドメインの末端に追加して、ヘアピン構造のステム領域の長さを伸長してもよい。代わりに又は更に、ヌクレオチドは、ヘアピン構造のループ領域に追加されてもよい。
一部の実施形態において、切断ドメインは、長さ約5～45、6～45、7～35又は8～30ヌクレオチド等の長さ約4～50ヌクレオチドあり得る。一部の実施形態において、切断ドメインは、約12～22又は約14～20を含めた長さ約10～25ヌクレオチドの範囲であり得る。しかしながら、上記の機能的要求を満たす限り任意の適切な長さの切断ドメインが、本発明において使用され得ることは明白であろう。
オリゴヌクレオチド配列に接している切断ドメインは、互いに同じ又は異なっていてもよい。有利には、単一の切断工程が、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドの全てを遊離させるのに十分であるように、オリゴヌクレオチド配列に接している切断ドメインは同一である。例えば、一部の実施形態において、RCA産物を切断する工程は、RCA産物内の切断ドメインを切断するのに適した条件下でRCA産物を単一の切断酵素と接触させる工程を含む。
RCA産物内の切断ドメインを切断する適切な条件は、切断を達成するために使用される手段によって決まることになる。例えば、切断が、制限エンドヌクレアーゼ等の切断酵素を使用して達成される場合、条件は、選択される酵素によって異なることになり、適切な条件は、当業者に周知であり、例えば切断工程は製造業者の指示に従ってもよい。同様に、切断が、DNAzyme等の自己切断性配列を使用して達成される場合、特定の配列に適当な条件が使用されてもよい。切断工程に使用され得る範囲の適切な条件の例は、下で述べられる。
例えば、切断酵素、例えば制限エンドヌクレアーゼは、リン酸緩衝食塩水(PBS)、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、HEPES緩衝食塩水(HBS)及びEDTA有りと無しの両方のトリス緩衝食塩水(TBS)等の種々の緩衝液中で切断認識部位に特異的に結合し、核酸を選択的(例えば、特異的)に切断し得る。切断は、広範囲にわたる温度、例えば0～70℃にわたって、約3.0～10.0、例えば4.0～9.0、5.0～8.0のpH範囲で起こり得る。当業者は、他の適切な条件を決定することが直ちに可能である。
本発明の方法は、鋳型として環状DNA分子を使用するローリングサークル増幅を実行する工程を含む。ローリングサークル増幅(RCA)は、当業者に周知であり、Deanら、2001(Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification, Genome Research, 11 , 1095～1099頁)に記載されており、その開示を参照により本明細書に組み込む。要するに、RCAは、ローリングサークル鋳型(RCA鋳型)として環状一本鎖核酸分子、例えば円形又は環状オリゴヌクレオチド、及び鎖置き換えポリメラーゼを使用して、鋳型にハイブリダイズされるプライマーを伸長させる、核酸分子の合成に関する。ポリメラーゼ及びヌクレオチドの添加は、合成反応、即ちポリメラーゼ反応を開始する。ローリングサークル鋳型は無限なので、得られる産物は、ローリングサークル鋳型に相補的なタンデムリピートで構成される長い一本鎖核酸分子である。
典型的なRCA反応混合物は、環状DNA分子及びプライマー伸長反応に利用される1つ又は複数のプライマーを含み、例えば、RCAは、単一のプライマーによって鋳型にされて、単一のコンカテマー状産物又は環状オリゴヌクレオチドの異なる領域に各々アニーリングして一周当たり複数のコンカテマー状産物を作製する複数のプライマーを生成してもよい。環状核酸が接触され得るオリゴヌクレオチドプライマーは、アニーリング条件下で環状DNA分子へのハイブリダイゼーションを得るのに充分な長さのものになる。一部の実施形態において、プライマーは、工程(a)において得られる二本鎖環状DNA分子の一本鎖を切断する(例えば、ニックを入れる)ことによって提供されてもよい。
上記の成分に加えて、本発明において使用される反応混合物は、ポリメラーゼ(下で更に定義される、例えばphi29 DNAポリメラーゼ)、1つ若しくは複数の官能化されたヌクレオチド、1つ又は複数の従来通りのヌクレオチド及び下記のDNAポリメラーゼ反応に必要とされる他の成分を一般に含む。所望のポリメラーゼ活性は、1つ又は複数の固有のポリメラーゼ酵素によって提供されてもよい。
RCA反応混合物は、一価イオンの供給源、二価陽イオンの供給源及び緩衝剤を含む水性緩衝媒体を更に含んでもよい。KCl、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、グルタミン酸カリウム、NH4Cl、硫酸アンモニウム、等、一価イオンの任意の簡便な供給源が、利用され得る。二価陽イオンは、マグネシウム、マンガン、亜鉛、等でもよく、陽イオンは、一般にマグネシウムになる。MgCl2、酢酸マグネシウム、等を含めた、マグネシウム陽イオンの任意の簡便な供給源が、利用されてもよい。緩衝液中に存在するMg2+の量は、0.5～10mMの範囲でもよいが、好ましくは約3～6mMの範囲になり、理想的には約5mMになる。緩衝液中に存在し得る代表的な緩衝剤又は塩には、トリス、トリシン、HEPES、MOPS、等があり、緩衝剤の量は、一般に約5～150mM、通常には約10～100mM、より通常には約20～50mMの範囲になり、特定の好ましい実施形態において、緩衝剤は、約6.0～9.5のpH範囲を得るのに十分な量で存在することになる。緩衝媒体中に存在し得る他の薬剤には、EDTA、EGTA、等のキレート化剤がある。
二本鎖環状DNA分子の一本鎖を切断して(例えば、ニックを入れて)RCA鋳型(及びRCA反応のためのプライマー)を得る実施形態において、RCA反応混合物に一本鎖結合タンパク質を含めることが有用な場合がある。例えば、大腸菌(E.coli)一本鎖DNA結合タンパク質を使用して、プライマー伸長反応並びにPCR反応の収量及び特異性を増大させる(米国特許第5,449,603号及び同第5,534,407号)。T4ファージの遺伝子32タンパク質(一本鎖DNA結合タンパク質)は、より大きいDNA断片を増幅する能力を明らかに改善し(Schwartzら、Nucl. Acids Res. 18:1079頁 (1990))、DNAポリメラーゼ忠実度を増強し(Huang, DNA Cell. Biol. 15: 589～594頁 (1996))、最も重要なことには、DNAポリメラーゼが、例えば、すでに作製された一本鎖DNAへと鋳型を切り替え、二本鎖DNAを合成することを防ぐ(Ducaniら、Nucl. Acids Res. 42: 10596頁 (2014))。利用した場合、そのようなタンパク質を使用して、約0.01ng/μL～約1μg/μL;約0.1ng/μL～約100ng/μL等;約1ng/μL～約10ng/μLを含む範囲である反応混合物中の濃度を達成することになる。
RCA反応は、環状DNA分子の相補配列の隣接した(タンデム)反復を含むポリヌクレオチド産物を最終的に作製する。この産物は、コンカテマー、RCA産物又は「RCP」として公知であり得る。従って、RCA産物は、切断ドメインに接している、官能化されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列(又は特に環状DNA分子鋳型のオリゴヌクレオチド配列の逆相補)からなる直鎖状配列を含む。
上記のように、環状DNA分子が一本鎖の場合、RCA反応混合物は、RCA重合反応を始める1つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでもよい。プライマーは、アニーリング条件下で環状DNA分子へのハイブリダイゼーションを得るのに充分な長さであることになる。プライマーは、一般に長さ少なくとも10ヌクレオチド、通常は長さ少なくとも15ヌクレオチド、より通常には長さ少なくとも16ヌクレオチドになり、長さ30ヌクレオチドもの長さ又はより長くてもよく、プライマーの長さは、一般に長さ18～50ヌクレオチド、通常は長さ約20～35ヌクレオチドの範囲になる。
プライマーは、環状DNA分子内の任意の領域にアニールし得る。一部の実施形態において、環状DNA分子は、プライマーがハイブリダイズできる特定のドメイン(RCAプライマー結合部位)を含んでもよい。代表的な実施形態において、環状DNA分子は、オリゴヌクレオチド配列に接している切断ドメイン同士の間にオリゴヌクレオチド配列ではなく、RCAプライマー結合部位として機能し得る配列を含んでもよい。上述の切断ドメインに類似して、RCAプライマー結合部位をオリゴヌクレオチド配列と異なる長さのものになるように設計して、RCA産物の切断時に官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドから直ちに分離され得ることを確実にしてもよい。切断ドメインが接している複数のオリゴヌクレオチド配列を含む環状DNA分子において、RCAプライマー結合部位が、任意の2つの切断ドメインの間にあってもよいことは明白であろう。
用語「アニーリング条件」とは、相補的なヌクレオチド配列を含む2つの核酸分子が互いに特異的にハイブリダイズすることになる条件のことを指す。温度、塩濃度、核酸濃度、組成及び長さ、並びに緩衝液組成を含めた様々なパラメータが、ハイブリダイゼーションに影響を及ぼす。当業者は、慣例としてRCA反応のための特定のプライマー/鋳型の組合せに適切なアニーリング条件を直ちに決定することができる。
上記したように、一部の実施形態において、環状DNA分子は二本鎖であり、本方法は、RCA反応が実行される前に、環状DNA分子の一本鎖を切断してRCA鋳型を準備する追加の工程を含む。環状DNA分子の一本鎖を切断する工程が、RCA反応を開始するためのプライマーを提供する工程を置き換え得る、即ち、切断された鎖がRCAプライマーとして機能することは明白であろう。従って、別の見方で、本方法は、RCA反応が実行される前に、環状DNA分子の一本鎖を切断してRCA鋳型及びプライマーを準備する追加の工程を含み、即ち、環状DNA分子における一本鎖破壊の導入は、RCA反応のためのプライマーとして作用できる3'末端を創出する。しかしながら、一部の実施形態において、例えば一周当たりに得られるRCA産物の数を増大させるには、二本鎖環状DNA分子の一方の鎖を切断することに加えて反応混合物に1つ又は複数のRCAプライマーを提供することが有利になり得る。
一部の実施形態において、環状DNA分子の一本鎖を切断してRCA鋳型を準備する工程は、切断酵素で環状DNA分子の一本鎖を切断する工程を含む。環状DNA分子の一本鎖のこの切断の結果、一本鎖破壊(ニック)を得られる。
一部の実施形態において、切断によって生成される3'末端へのDNAポリメラーゼの結合を容易にするために環状DNA分子の一本鎖を非常に近くで複数回切断することが有利になり得る。従って、環状DNA分子の一本鎖は、2回以上切断されてもよく、即ち2つ以上のニックが、互いに近接して生成され得る。好ましくは、ニックは、互いに20ヌクレオチド以内、より好ましくは10ヌクレオチド以内、より好ましくは5ヌクレオチド以内、例えば互いに1、2、3、4又は5ヌクレオチド以内で生成される。
一部の実施形態において、二本鎖環状DNA分子の一方の鎖を切断するために使用される切断酵素は、ニッカーゼである。ニッカーゼは、DNA二重鎖の一本鎖だけを切断するエンドヌクレアーゼである。一部のニッカーゼは、特定のヌクレオチド認識配列に結合し、認識することによって、DNA分子上の特定の部位にのみ一本鎖のニックを導入する。天然に存在するニッカーゼがいくつか発見されており、現在少なくとも4つについてその配列認識特性が決定されている。ニッカーゼは、米国特許第6,867,028号に記載されており、その全体を参照により本明細書に組み込み、任意の適切なニッカーゼが本発明の方法に使用され得る。一部の実施形態において、切断酵素(ニッカーゼ)は、Nb.BsrDI、Nt.BspQI又はその組合せでもよい。
ニッカーゼ酵素を利用する一部の実施形態において、ニッカーゼ酵素は、RCA産物の不要な切断を防止するために環状DNA分子の切断後にアッセイから除去されてもよく又は不活性化されてもよい。
環状DNA分子の一本鎖を切断する切断酵素(例えばニッカーゼ)は、環状DNA分子内の任意の部位で切断してもよい。一部の実施形態において、環状DNA分子は、切断酵素が作用し得る特定のドメイン(一本鎖切断部位又はドメイン、例えばニッカーゼ部位)を含んでもよい。代表的な実施形態において、環状DNA分子は、切断ドメインの間にオリゴヌクレオチド配列ではなく、一本鎖切断部位又はドメインとして機能し得る配列を含んでもよい。切断酵素によって認識される配列(一本鎖切断部位又はドメイン)がオリゴヌクレオチド配列内に無いという事実のため、RCA産物の5'末端から作製されるオリゴヌクレオチドが、短縮されないことが確実になる。上述の切断ドメイン及びRCAプライマー結合部位に類似して、一本鎖切断部位又はドメインをオリゴヌクレオチド配列と異なる長さのものになるように設計して、RCA産物の切断時に官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドから直ちに分離され得ることを確実にしてもよい。従って、一部の実施形態において、RCAプライマー結合部位も、一本鎖切断部位若しくはドメイン又はその逆として機能する。
少なくとも一部の鎖置き換え活性を持つ任意のDNAポリメラーゼが、本発明のRCA反応に使用され得る。鎖置き換え活性は、ポリメラーゼが環状DNA分子の周りで伸長すると、プライマー配列及び伸びている産物を置き換え、鋳型の周りを「回転」し続け得ることを確実にする。環状DNA分子のニックの入った鎖が、RCA伸長のためのプライマーを形成する実施形態において、鎖置き換え活性は、ポリメラーゼがニックの入った鎖を置き換え得ることを確実にする。少なくとも一部の鎖置き換え活性を持つ適切なDNAポリメラーゼ酵素には、phi29 DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼI、Bsu DNAポリメラーゼ(ラージフラグメント)、Bst DNAポリメラーゼ(ラージフラグメント)及びクレノウ断片がある。本明細書では、用語「DNAポリメラーゼ」は、天然に存在する酵素だけでなく、そのような修飾された誘導体の全ても含み、天然に存在するDNAポリメラーゼ酵素の誘導体も含む。例えば、一部の実施形態において、DNAポリメラーゼは、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を除去するために修飾され得る。
特に、本発明に使用するための好ましいDNAポリメラーゼ酵素には、phi29 DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ及び誘導体、例えば配列修飾誘導体又はその変異体がある。
DNAポリメラーゼ酵素の配列修飾誘導体又は変異体は、野生型配列の機能活性の少なくとも一部、例えばDNAポリメラーゼ活性及び鎖置き換え活性の少なくとも一部を保持する変異体を含む。突然変異は、異なる反応条件、例えば温度、鋳型濃度、プライマー濃度、等の下で、酵素の活性プロファイルに影響を及ぼし得る、例えば、重合速度を増強又は減少させる。突然変異又は配列修飾が、酵素のエキソヌクレアーゼ活性及び/又は耐熱性に影響を及ぼす場合もある。
上記したように、本方法のRCA反応は、官能化された及び従来通りのヌクレオチドの混合物を使用して一般に行われる。
本明細書では用語「従来通りのヌクレオチド」とは、DNA中に見られる4つの塩基;アデニン、グアニン、シトシン及びチミンのうちの1つを含むデオキシヌクレオチドのことを指す。従って用語「従来通りのヌクレオチド」は、例えば、dATP、dGTP、dCTP及びdTTPを包含する。ウラシルは、天然にはDNA中には一般に見られないが、dUTPは、dTTPの代わりに、又はそれに加えて容易に使用され得る。従って、本発明の文脈において、dUTPは「従来通りの」ヌクレオチドと見られてもよい。通常、反応混合物は、存在する天然に存在する4つの塩基に対応するdNTPの異なる4つの型、即ちdATP、dTTP、dCTP及びdGTPのうちの少なくとも3つを含むことになる。しかしながら、上記したように、dUTPが、dTTPの代わりに、又はそれに加えて使用されてもよい。更に、一部の実施形態において、反応混合物は4つ若しくは5つのdNTP、即ちdATP、dCTP、dGTP、dTTP及び/又はdUTPを含んでもよい。主題の方法において、各dNTPは、約10～5000μM、通常約20～1000μMの範囲の量で一般に存在することになる。各dNTPは、異なる量で存在してもよく、又は等量の各dNTPが使用されてもよい。
用語「官能化されたヌクレオチド」又は「官能化されたdNTP」とは、無修飾の従来通りのヌクレオチドと比較して修飾を含むヌクレオチドのことを指し、前記修飾は、前記官能化されたヌクレオチド、及び/又は即ち対応する従来通りのヌクレオチドと比較して、追加的若しくは選択的な特性若しくは特徴を持つ少なくとも1つの官能化されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供する。例えば、修飾は、ヌクレオチドを、例えば標識の組み込みによって検出可能にする、又は別の成分、即ち対応する従来通りのヌクレオチドが相互作用若しくは反応しない成分、と相互作用及び/若しくは反応可能にすることができる。一部の実施形態において、修飾は、分解、例えば化学及び/若しくは酵素的分解(例えばヌクレアーゼ分解)に対して抵抗性のヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドになってもよく、又はヌクレオチドの代謝を改変してもよい。
用語「官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド」、「一本鎖官能化オリゴヌクレオチド」及び「官能化されたオリゴヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用され、少なくとも1つの官能化されたヌクレオチドを含有する一本鎖オリゴヌクレオチドのことを指す。従って、官能化されたオリゴヌクレオチドは、従来通りのヌクレオチドだけを含有する対応するオリゴヌクレオチドと比較して追加又は選択的な特性若しくは特徴を有する。例えば、1つ又は複数の官能化されたヌクレオチドの組み込みは、オリゴヌクレオチドを、例えば標識の組み込みによって検出可能にする、又は別の成分、即ち従来通りのヌクレオチドだけを含有する対応するオリゴヌクレオチドが相互作用若しくは反応しない成分、と相互作用及び/若しくは反応可能にすることができる。一部の実施形態において、修飾は、分解、例えば化学及び/若しくは酵素的分解(例えばヌクレアーゼ分解)に対して抵抗性のオリゴヌクレオチドになってもよく、又はオリゴヌクレオチドの代謝を改変してもよい。一部の実施形態において、修飾は、オリゴヌクレオチドの安定性を改善し、例えば、二重鎖の耐熱性(例えば融解温度)等、オリゴヌクレオチドによって形成される二重鎖の安定性を改善する場合がある。一部の実施形態において、1つ又は複数の官能化されたヌクレオチドの組み込みは、オリゴヌクレオチドを、従来通りのヌクレオチドだけを含有する対応するオリゴヌクレオチドでは形成されない2次又は3次構造を形成可能にし得る。
従って、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドの文脈において、用語「一本鎖」は、変性条件下で、例えば熱又は適切な化学変性剤の適用後に一本鎖であるオリゴヌクレオチド、即ち連続する骨格を1つだけ持つオリゴヌクレオチド(1つの鎖)のことを指すことは理解されよう。上記したように、これは、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドが2次又は3次構造を形成することを妨げない。例えば、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己相補性領域を含んでもよく、従って同じオリゴヌクレオチド内の他の部分にある相補領域にハイブリダイズする官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドの一領域によって媒介されるヘアピン又はステムループ構造を形成する能力があってもよい。
従来通りのヌクレオチドの官能化は、ヌクレオチドの任意の部分の構造の改変又はそれに対する修飾によって達成されてもよい。従って、官能化されたヌクレオチドは、核酸塩基、糖又はヌクレオチド間の連結に関わる基に修飾、例えば化学修飾を含有してもよい。一部の好ましい実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、核酸塩基上に修飾、例えば化学修飾を含有する。様々な位置における修飾については以下で更に詳細に記載され、以下で記載される特定の位置のいずれも、以下で記載される官能基のいずれかで修飾され得ると考えられる。
例えば、小さく、剛直で疎水性の基を持つピリミジン(即ちシトシン、チミン及びウラシル)内のC5位の置換は、置換されたピリミジンを含有する官能化されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基スタッキング相互作用を改善し、及び/又はそれによって形成される二重鎖を安定させ得る。小さく、剛直な疎水性基は、アルキニル基、例えばメチル、エチニル、プロピニル又はハロゲン基、例えばフルオロ、クロロ若しくはブロモでもよい。従って、一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、C5位に置換、例えば上で定義したアルキニル基又はハロゲンを持つピリミジンを含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチドを検出可能にし得る修飾は、ヌクレオチドへの標識の組み込みと関係し得る。任意の標識が、本発明において有用性を見いだしてもよく、直接又は間接的にシグナルを与える分子でもよい。例えば、直接的シグナルを与える標識は蛍光分子でもよく、即ち官能化されたヌクレオチドは蛍光標識されたヌクレオチドでもよい。間接的シグナルを与える標識は、例えば、ビオチン分子であってもよい、即ち標識されたヌクレオチドはビオチン標識されたヌクレオチドでもよく、ビオチンは、シグナルを得るための追加の工程、例えば、化学基質に作用できる酵素にコンジュゲートされたストレプトアビジンを添加して、検出可能なシグナル、例えば目に見えて検出可能な色の変化を得る工程を必要とする。一部の実施形態において、標識は、核酸塩基に組み込まれる(コンジュゲートされる)。
従って、一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、核酸塩基にコンジュゲートされたビオチン基を含む。一部の実施形態において、ビオチン基は、例えばリンカー又は連結ドメインを介して核酸塩基に間接的にコンジュゲートされてもよく、適切なリンカーは、当業者に周知のそれから容易に選択され得る。例えば、リンカーは、ビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用を促進する、即ち立体障害を最小化又は防止するように選択され得る。一部の実施形態において、ビオチン基は、C5位でピリミジンにコンジュゲートされる。代表的な実施形態において、官能化されたヌクレオチドを含有するビオチンは、ビオチン-16-アミノアリル-2'-dUTP、ビオチン-16-アミノアリル-2'-dTTP又はビオチン-16-アミノアリル-2'-dCTPでもよい。
一部の実施形態において、ヌクレオチドは、ステロール基で標識されてもよく、即ちヌクレオチドは、ステロール基を含んでもよい。一部の実施形態において、ヌクレオチドは、コレステロール基で標識されてもよく、又は含んでもよい。
直接的に検出可能な標識は、追加の試薬を使用せずに直接検出され得るものであり、間接的に検出可能な標識は、1つ又は複数の追加の試薬を利用することによって検出可能なものであり、例えば、標識が、2つ以上の成分で構成されるシグナル生成システムのメンバーである場合が挙げられる。多くの実施形態において、標識は、直接的に検出可能な標識であり、対象となる直接的に検出可能な標識には、蛍光標識、着色標識、放射性同位体標識、化学発光標識、等があるが、これに限定されない。任意の分光測光的又は光学的に検出可能な標識が、使用されてもよい。他の実施形態において、標識は、間接的にシグナルを生じてもよく、即ち、シグナルを生成するために更なる成分の添加を必要としてもよい。例えば、標識は、シグナルを与える分子にコンジュゲートされた分子を結合する能力があり得る。
一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、蛍光標識されたヌクレオチドである。蛍光標識は、検出可能なシグナルを得るのに励起を必要とするが、励起の供給源は、シグナルを検出するために使用される機器/装置から得られるので、蛍光標識は、直接的にシグナルを与える標識として見られてもよい。
ヌクレオチドを標識するために使用され得る蛍光分子は、当業者に周知である。フルオロフォアは、励起及び放射スペクトルが、UVから近赤外線波長の範囲で同定されている。従って、フルオロフォアは、UV、可視若しくは赤外線スペクトルの範囲に励起及び/又は放射波長を有し得る。
フルオロフォアは、タンパク質、ペプチド、小さい有機化合物、合成オリゴマー又は合成ポリマーでもよい。一部の実施形態において、フルオロフォアは、小さい有機化合物、例えば分子量5000Da又はそれより小さい有機化合物である。従って、一部の実施形態において、フルオロフォアは、3500Da、3000Da、2500Da、2250Da、2000Da、1900Da、1800Da、1700Da、1600Da、1500Da又はそれより小さい等、4000Da又はそれより小さい分子量を有する。
従って、フルオロフォアは、キサンテン誘導体(例えば、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッド)、シアニン誘導体(例えばシアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン)、スクアライン誘導体(例えば、環置換スクアライン、Seta、SeTau)、ナフタレン誘導体(例えば、ダンシル又はプロダン誘導体)、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体(ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール及びベンゾオキサジアゾール等)、アントラセン誘導体(DRAQ5、DRAQ7及びCyTRAKオレンジを含めたアントラキノン等)、ピレン誘導体(例えばカスケードブルー)、オキサジン誘導体(例えばナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン170)、アクリジン誘導体(プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー等)、アリールメチン誘導体(例えばオーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン)又はテトラピロール誘導体(ポルフィリン、フタロシアニン、ビリルビン等)でもよい。
本発明に有用性を見いだし得るフルオロフォア又はフルオロフォア系列の特定の例には、Alexa Fluor(Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、等)、Atto、シアニン(Cy)、インドシアニン、スルホシアニン、DyLight、Abberior STAR、Chromeo、オレゴングリーン、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、シリコンローダミン(SiR)、スクアライン、FluoProbes、テトラピロール、Bodipy、HiLyte、Quasar、CAL fluor、クマリン、Seta、CF、トレイシー、IRDye、CruzFluor、Tide Fluor、オイスター、iFluor、Chromis及びBrilliant Violet並びにその蛍光誘導体又は類似体がある。
一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、Cy3等のシアニン蛍光標識を含有する。一部の特定の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、Cy3で標識されたdATP、例えば7-プロパルギルアミノ-7-デアザ-ATP-Cy3である。
一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、atto-488等のatto蛍光標識を含有する。一部の特定の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、atto-488で標識されたdATP、例えば7-プロパルギルアミノ-7-デアザ-ATP-Atto-488である。
一部の実施形態において、ヌクレオチドを反応性にすることができる修飾は、反応基、例えば別の化学基と共有結合を形成することができる基、例えば本明細書に定義される標識等、官能化されたオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる分子又は成分上の化学基、の組み込みを含む。潜在的反応基には、求核性官能基(アルキン、アルケニル、アミン、アルコール、チオール、ヒドラジド、アジド)、求電子官能基(アルデヒド、エステル、ビニルケトン、エポキシド、イソシアン酸エステル、マレイミド)、環化付加反応、ジスルフィド結合の形成又は金属への結合が可能な官能基がある。特定の例には、エチン(アセチレン)、プロピン、1-ブチン、2-ブチンアジド、ビニル(エテニル)、プロペニル、1-ブテニル、第一級及び第二級アミン、ヒドロキサム酸、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、N-ヒドロキシスクシンイミジルカルボナート、オキシカルボニルイミダゾール、ニトロフェニルエステル、トリフルオロエチルエステル、グリシジルエーテル、ビニルスルホン、アジド並びにマレイミドがある。
一部の実施形態において、ヌクレオチドを反応性にすることができる修飾は、別の化学基、例えば、クリック化学によって官能化されたオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる分子又は成分上の化学基と反応できる反応基の組み込みを含む。本明細書では、用語「クリック化学」とは、モジュール式であり、広範囲であり、高い収率が得られ、非クロマトグラフィー的方法によって除去され得、立体特異的である(しかし、必ずしもエナンチオ選択性ではない)等、無害の副産物しか生成しない反応のことを一般に指す。例えば、Angew. Chem. Int. Ed., 2001 , 40(11):2004～2021頁を参照、全体を参照により本明細書に組み込む。一部の場合において、クリック化学は、緩やかな水性条件で互いに選択的に反応できる官能基の対を記載できる。従って、クリック化学基は、本方法のオリゴヌクレオチドへの追加の官能基のコンジュゲーションに適している。一般的なクリック化学反応には、アジド-アルキン環化付加、アルキン-ニトロン環化付加、アルケン-テトラジン反応及びアルケン-テトラゾール反応がある。従って、官能化されたヌクレオチドは、アジド基、アルキン基、アルケン基、ニトロン基、テトラジン基又はテトラゾール基を含んでもよい。
クリック化学反応の特定の例は、アジドとアルキンのヒュスゲン1,3双極子環化付加、即ち、1,2,3-トリアゾールと呼ばれる5員環ヘテロ原子環を形成するためのアルキンとアジドとの銅触媒反応であり得る。反応は、Cu(I)触媒アジド-アルキン環化付加(CuAAC)、Cu(I)クリック化学又はCu+クリック化学としても公知であり得る。クリック化学のための触媒は、Cu(I)塩、又は還元試薬でCu(II)試薬をCu(I)試薬に還元することによってin situで作られるCu(I)塩であり得る(Pharm Res. 2008, 25(10): 2216～2230頁)。クリック化学のための公知のCu(II)試薬には、Cu(II)(TBTA)複合体及びCu(II)(THPTA)複合体があり得るが、これに限定されない。トリス-[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミンであり、またトリス-(ベンジルトリアゾリルメチル)アミンとしても公知のTBTAは、Cu(I)塩の安定化リガンドであり得る。トリス-(ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミンであるTHPTAは、Cu(I)の安定剤の別の例であり得る。歪み促進型アジド-アルキンクリック化学反応による等、銅不要のクリック化学を使用する他の条件を遂行して、アジドとアルキンから1,2,3-トリアゾール環(例えば、シクロオクチン又はシクロノニン等のシクロアルキン)を構築することもできる(SPAAC、例えば、Chem. Commun., 2011 , 47:6257～6259頁及びNature, 2015, 519(7544):486～90頁を参照)、それぞれを全体に参照により本明細書に組み込む。
一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、糖基内に反応基、例えば、水素をフルオロ、クロロ、ブロモ又はアジド基で置換する等デオキシリボース糖の2位における修飾を含有する。一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、2'-アジドdNTP、例えば2'-アジドdATPである。
一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、特にアルキン、アルケニル、チオ又はハロゲン基から選択される反応基を核酸塩基に含有する。上記したように、官能化されたヌクレオチドは、C5位で置換を含むピリミジンを含んでもよい。一部の実施形態において、アルキン基は、エチンであり、例えば、官能化されたヌクレオチドは、5'-エチニル-dUTP等のエチニル-dNTPである。別法として、アルキン基は、プロピニル基でもよく、例えば、官能化されたヌクレオチドは、5'-プロピニル-dUTP等のプロピニル-dNTPである。一部の実施形態において、アルケニル基は、ビニル(エテニル)であり、例えば、官能化されたヌクレオチドは、5'-ビニル-dUTP等のビニル-dNTPである。一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、4'-チオ-dTTP等のチオ-dNTPである。一部の実施形態において、ハロゲン基は臭素であり、例えば、官能化されたヌクレオチドは、5'-ブロモ-dUTP等のブロモ-dNTPである。官能化されたオリゴヌクレオチドへのハロゲン基の組み込みを使用して、求核性芳香族の置換又はUVに媒介される、例えばタンパク質との架橋を促進することができる。従って、一部の実施形態において、本方法によって作製される官能化されたオリゴヌクレオチドは、更に修飾されて芳香族基を含んでもよく、又はUVに媒介される架橋によって他の分子、例えばタンパク質若しくはペプチドにコンジュゲートされてもよい。
一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、別の成分と相互作用する能力がある基、例えば非共有結合によって相互作用する基を含有してもよい。例えば、ヌクレオチドを修飾して、結合パートナー、即ち同族の結合パートナー、例えばストレプトアビジン若しくは抗体に結合する能力がある同族の結合対、例えば親和性結合パートナー、例えばビオチン若しくはハプテンの一部又は成分を組み込んでもよい。そのような官能化されたヌクレオチドは、例えば、固体支持体に固定され得る官能化されたオリゴヌクレオチドの作製に有用性を見いだし得る。
一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、分解、例えば化学及び/又は酵素的分解(例えばヌクレアーゼ分解)に対して抵抗性のヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドになる修飾を含有する。一部の実施形態において、ヌクレオチドは、糖基の修飾、例えば、水素をフルオロ、クロロ、O-メチル又はO-エチル基で置換する等デオキシリボース糖の2位における修飾を含有する。従って、一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、2'-フルオロ-dNTP、例えば2-フルオロ-UTPである。一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、O-Me基、例えば2'-O-メチル-ATPを含む。一部の実施形態において、ヌクレオチドは、酸素を硫黄で置換する等、ヌクレオチド間の連結を形成するリン酸基内に修飾を含有し、例えば、ヌクレオチドはホスホロチオナート基を含有する。従って、一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、ヌクレオチドチオ三リン酸、例えば2-デオキシチミジン-5'-O-(1-チオ三リン酸)、2-デオキシシチジン-5'-O-(1-チオ三リン酸)、2-デオキシウリジン-5'-O-(1-チオ三リン酸)、2-デオキシアデノシン-5'-O-(1-チオ三リン酸)又は2-デオキシグアノシン-5'-O-(1-チオ三リン酸)である。一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、核酸塩基内にアミノ、メチル、エチル若しくはプロピニル修飾等の修飾を含有し、例えば2-アミノ-dATP、5-メチル-dCTP、C-5プロピニル-dCTP又はC-5プロピニル-dUTPである。
一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの耐熱性に影響を及ぼす修飾を含有する。一部の実施形態において、ヌクレオチドは、ロックされたリボース糖を含み、即ちペントース環の2'酸素と4'炭素との間に追加の共有結合を含む。一部の実施形態において、ヌクレオチドは、LNA(ロック核酸)ヌクレオチド、即ちLNA-ATP等のLNA-NTPである。ロックされたリボース配座は、塩基スタッキングを増強させ、従ってLNAヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの融解温度を増大させる。
従って、一部の実施形態において、本発明に使用され得る官能化されたヌクレオチドには: (内在化した)アルキン若しくはアジド基を含むヌクレオチド、蛍光標識されたヌクレオチド、ステロール基を含むヌクレオチド、ポリエーテル基を含むヌクレオチド、金属錯体を含むヌクレオチド、ビニル基を含むヌクレオチド、チオール基を含むヌクレオチド、チオン酸化された(thionated)ヌクレオチド、ヌクレアーゼ抵抗性を増大させるために修飾されたヌクレオチド、クリック化学に関与する能力がある化学基を含むヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの耐熱性に影響を及ぼす(例えば増大する)ヌクレオチド(例えばLNAヌクレオチド)又はその組合せがある。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドへのこれら官能化されたヌクレオチドの組み込みは、様々な有用な機能を提供し得る。例えば、フルオロフォアを含む一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列特異的蛍光プローブとして使用され得る。一本鎖オリゴヌクレオチド中にチオール化されたヌクレオチドを含めることにより、オリゴヌクレオチドが、チオール反応性分子で標識され、そのようなチオール反応性分子の分子検出用プローブとして使用することが可能になる。
一部の実施形態において、本発明に使用され得る官能化されたヌクレオチドは、ジゴキシゲニン基を含むヌクレオチドを含まない。別法として、一部の実施形態に加えて、官能化されたヌクレオチドは、ジゴキシゲニン標識したヌクレオチドではない。特に、一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、ジゴキシゲニン-11-dUTPではない。
好ましい実施形態において、官能化されたdNTPは、アルキン基又はビニル基を含むヌクレオチド、例えば、アルキン(例えばエチニル)基又はビニル基を含有する修飾された核酸塩基、例えば、C5位にアルキン又はビニル基を持つピリミジンを含むヌクレオチドである。別の好ましい実施形態において、官能化されたdNTPは、アジド基を含む、例えばアジド基を含有する修飾された糖を含むヌクレオチド、例えばデオキシリボース糖の2位にアジド基を含むヌクレオチドである。
RCA反応の反応混合物は、鋳型環状DNA分子からRCA産物を生成する能力がある成分の組合せを含有しなければならない。例えば、反応混合物(例えば従来通りの及び官能化されたヌクレオチドの混合物)中に存在するヌクレオチドは、ローリングサークル増幅を可能にするために環状DNA鋳型中のそれぞれのヌクレオチドにハイブリダイズする能力がなければならない。反応混合物中に存在する官能化された及び従来通りのヌクレオチドの相対量は、官能化されるヌクレオチド及びポリメラーゼの同一性に応じて変動してもよい。更に、反応混合物中に存在する各ヌクレオチドの相対量を使用して、RCA産物への官能化されたヌクレオチドの組み込みを制御してもよい。例えば、官能化されたヌクレオチドの濃度を増大させる(又は従来通りのヌクレオチドの割合を低下させる)ことにより、(例えば官能化されたヌクレオチドが、同等の従来通りのヌクレオチドと組み合わせて使用される場合)RCA産物中の官能化されたヌクレオチドの割合はより大きくなり得る。反対に、官能化されたヌクレオチドの濃度を低下させる(又は従来通りのヌクレオチドの割合を増大させる)ことにより、RCA産物中の官能化されたヌクレオチドの割合はより低くなり得る。
従って、官能化されたヌクレオチドは、鋳型DNA中の同じDNA塩基(ヌクレオチド)にハイブリダイズする従来通りのヌクレオチドに加えて又はその代わりに使用されてもよい。一部の実施形態において、反応混合物は、1つの型だけの官能化されたヌクレオチドを含有してもよい。一部の実施形態において、官能化された異なるヌクレオチドの組合せが、同じ反応に使用されてもよい。一部の実施形態において、反応混合物中の官能化されたヌクレオチドの全ては、同じ型の官能基、例えばアルキン基を含有する。一部の実施形態において、反応混合物中の官能化されたヌクレオチドは、異なる型の官能基を含有する。例として、官能化されたヌクレオチドの異なる型は、フルオロフォアで官能化されたdATPヌクレオチド及びステロール基で官能化された第2のdATPヌクレオチド等、同じDNA塩基(ヌクレオチド)にハイブリダイズする能力があってもよい。別の代表的な例において、官能化されたヌクレオチドの異なる型は、フルオロフォアで官能化されたdATPヌクレオチド及びステロール基で官能化されたdTTPヌクレオチド(又はdATPヌクレオチド上のフルオロフォアとは異なるフルオロフォア)等、異なるDNA塩基(ヌクレオチド)にハイブリダイズする能力があってもよい。従って、官能化された及び従来通りのヌクレオチドの任意の組合せが、本発明に使用されてもよい。好ましい実施形態において、RCA反応混合物は、1つの型だけの官能化されたヌクレオチドを含有する。
反応混合物中に存在する官能化されたヌクレオチドの量は、特定のDNA塩基(ヌクレオチド)にハイブリダイズする能力がある総ヌクレオチドの相対的パーセンテージとして測定され得る。別法として、この値は、官能化されたヌクレオチドが対応する従来通りのヌクレオチドを置き換えたパーセンテージと見なすことができる。例えば、従来通りのdATPとフルオロフォアで修飾されているdATPの等量の使用は、総dATPヌクレオチドの50%が修飾されている(官能化されている)、又は官能化されたdATPヌクレオチドによる従来通りのdATPヌクレオチドの50%の置きかえと表現され得た。
RCA反応混合物中の官能化されたヌクレオチドの相対量を変動させて、最終的な一本鎖オリゴヌクレオチド中の官能化されたヌクレオチドの頻度を制御することができる。一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、特定のDNA塩基(ヌクレオチド)にハイブリダイズする能力がある総ヌクレオチドの最大約5%、例えば約1%、2%、3%、4%又は5%を表してもよい。別法として、一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、特定のDNA塩基(ヌクレオチド)に結合する能力がある総ヌクレオチドの25%、50%、75%又は100%等、より高い割合を表してもよい。
存在する官能化されたヌクレオチドの相対量は、多くの理由で変動され得る。例えば、Cy3で修飾されたdATP等一部の官能化されたヌクレオチドは、高濃度で市販されていない。更に、実施例に示すように、本発明者らは、官能化されたヌクレオチドの内包は、本発明によって作製される官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドの収量に影響を与え得ると決定し、例えば、高い相対量の官能化されたヌクレオチドの使用は、RCA反応に関与するDNAポリメラーゼ(例えば、RCA産物が合成される効率を減少させる)、又はRCA産物の切断及び一本鎖官能化オリゴヌクレオチドの遊離に関与する切断酵素(例えば、RCA産物が切断される効率を減少させる)の活性を阻害することがあり得る。
しかしながら、特に、本発明者らは、高い相対量、例えば最大約70%、65%、60%、55%又は50%等の最大約75%の官能化されたオリゴヌクレオチドを使用する場合であっても、高い収量の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドが達成され得ることを驚くべきことに見出した。一部の実施形態において、約80%、85%、90%、95%又は100%等の75%を超える官能化されたオリゴヌクレオチドを使用することが可能になり得る。特に、本発明者らは、核酸塩基内にアルキン又はビニル基を含有する官能化されたヌクレオチドは、RCA産物に効率的に組み込まれ得るので、本発明において特に有用であることを予想外に発見した。更に、RCA産物は容易に切断されて、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを産生できたが、後述するように、一部の実施形態において従来通りのヌクレオチドだけを含有する同等のRCA産物を切断するのに必要な量と比較して、より多量の切断酵素が必要とされ得る。
同様に、本発明者らは、デオキシリボース糖にO-メチル基を含有する官能化されたヌクレオチドが、RCA反応において従来通りのヌクレオチドを完全に置換し、なおRCA産物を産生し得ることを発見した。更に、本発明者らは、RCA産物へのこれらヌクレオチドの組み込みが、切断ドメイン(例えばヘアピン切断ドメイン)の形成又はその酵素的切断(例えば制限エンドヌクレアーゼによる)に影響を及ぼさないことを驚くべきことに、見出した。
従って、反応混合物中に存在する官能化されたヌクレオチドの相対量を調整して、所望の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドの収量を最適化又はRCA産物の生成を最適化してもよい。そのような修飾は、以下の実施例に記載される方法に基づく当業者の範囲内である。従って、一部の実施形態において、反応混合物中の官能化されたヌクレオチドの相対量は、約1～5%、1～10%、1～25%、5～25%、10～25%、25～50%、25～75%、25～100%、50～75%、50～100%又は75～100%でもよい。
反応混合物中の官能化されたヌクレオチドの相対量、工程(b)におけるRCA産物の生成後のヌクレオチド(従来通りと官能化されたヌクレオチドの両方)の絶対量に加えて、本方法は、切断ドメインでRCA産物を切断して一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを遊離させる工程を含む。前述のとおり、RCA産物を切断する工程は、適切な条件下でRCA産物を切断酵素と接触させて、切断ドメインにおいてRCA産物を選択的に切断することによって達成され得る。
本文脈において使用される用語「遊離」とは、オリゴヌクレオチド配列に接している切断ドメインでRCA産物を切断して、切断ドメインから官能化されたオリゴヌクレオチドを外す又は分離することを指す。所与の官能化されたオリゴヌクレオチドの遊離が、オリゴヌクレオチド配列に接している切断ドメインの両方における切断を含むことになることが望ましい。
切断がRCA産物中の切断ドメインの全てで起こって、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する必要はない。上記したように、RCA産物における、特に切断ドメインにおける官能化されたヌクレオチドの組み込みは、切断工程の効率を減少させ得る。にもかかわらず、切断ドメインの一部の切断は、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドの一部の遊離をもたらすことになる。従って、一部の実施形態において、RCA産物を切断する工程は、RCA産物中の切断ドメインの少なくとも約30%、例えば少なくとも約35%、40%、45%、50%、60%、70%又は80%の切断をもたらす。一部の実施形態において、RCA産物を切断する工程は、RCA産物中の切断ドメインの少なくとも約90%、例えば95%又はそれより多くの切断をもたらす。
別の見方では、一部の実施形態において、RCA産物を切断する工程は、RCA産物中に含有される官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも約30%、例えば少なくとも約35%、40%、45%、50%、60%、70%又は80%の遊離をもたらす。一部の実施形態において、RCA産物を切断する工程は、RCA産物中に含有される官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも約90%、例えば95%又はそれより多くの遊離をもたらす。
一本鎖官能化オリゴヌクレオチドが遊離したら、他の用途に使用するために切断反応混合物(例えば、切断ドメイン、切断されていないRCA産物、等の反応成分及び/又は分解産物)から一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを単離、分離又は精製することが望ましい場合がある。
従って、一部の実施形態において、本発明の方法は、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを単離、分離又は精製する工程を更に含む。この単離、分離又は精製は、当業者に公知の任意の適切な方法によって行われてもよい。
一部の実施形態において、単離、分離又は精製工程後に、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドは、単離手順又はその調製において使用した材料若しくは成分から得られるいかなる混入成分(例えば、切断ドメイン、切断されていないRCA産物、等の反応成分及び/又は分解産物)を好ましくは実質的に含まない。一部の実施形態において、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドは、評価された質量/質量(乾燥質量)として約50又は60%より高い、例えば約70、80若しくは90%より高い純度、約95若しくは99%より高い純度等に精製される。そのような純度レベルは、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドの分解産物を含み得る。
一部の実施形態において、より低い純度を有する、例えば、対象とする官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを約50%未満、例えば約40又は30%未満含有する官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドの富化調製物を調製することは有用であり得る。
前述のとおり、本発明は、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドの混合物又は複数(例えばライブラリ)をもたらし得る。従って、一部の実施形態において、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを例えばサイズによって更に分離して、特定の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを得る(即ち、特定の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを単離する)又は官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドのサブグループ若しくはサブライブラリを生成することが望ましい場合がある。官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドの混合物を分離して、特定の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド又は官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドのサブグループ若しくはサブライブラリを単離するのに適当な任意の手段が、利用されてもよい。
従って、一部の実施形態において、本方法は、上記の方法によって得られる官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドの混合物(例えばライブラリ)から官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを分離して、特定の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド又は官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドのサブグループを単離する更なる工程を含む。
例えば、切断反応の産物は、アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルを使用するゲル電気泳動を使用してサイズによって分離されてもよい。所望の官能化されたオリゴヌクレオチドは、次いでゲルから単離され、必要に応じて、当業者に公知の方法に従って、更に精製され得る。本発明の官能化されたオリゴヌクレオチドを精製、単離又は分離するための他の方法は、クロマトグラフィー(例えばHPLC、サイズ排除、イオン交換、親和性、疎水的相互作用、逆相)又はキャピラリー電気泳動法を利用する。
上述の通り、上記の方法によって作製される官能化されたオリゴヌクレオチドは、例えばクリック化学によって別の化学基、例えば官能化されたオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしようとする分子又は成分上の化学基と反応する能力がある反応基を含有してもよい。例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドに追加の分子又は成分(それ自体が官能基を含む又は官能基と見られ得る)をコンジュゲートする工程は、RCA反応に使用される官能化されたヌクレオチド中に存在する場合に本方法の効率を阻害又は低下させ得る基等大きい若しくは嵩高い基を組み込むのに特に有用になり得る。従って、例えば、RCA反応の間に直接ポリメラーゼによって組み込まれ得ない、又は低い効率若しくは収量でしか組み込まれないことになる分子若しくは成分を含有する官能化されたオリゴヌクレオチドが、作製され得る。更に又は選択的に、本方法によって得られた官能化されたオリゴヌクレオチドを更なるコンジュゲーション工程に供することは、官能化されたオリゴヌクレオチドライブラリ中に存在する構造の多様性を増大させ得る。
従って、一部の実施形態において、本方法は、クリック化学等によって、オリゴヌクレオチド中の官能(例えば反応性)基を介して官能化されたオリゴヌクレオチドに分子又は成分をコンジュゲートする工程を更に含む。一部の好ましい実施形態において、分子又は成分は、アルキン、ビニル若しくはアジド基(即ち、本明細書に定義される方法においてRCA産物に組み込まれる官能化されたヌクレオチド中のアルキン、ビニル又はアジド基)を介して官能化されたオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。
本発明の文脈において、分子若しくは成分を官能化されたオリゴヌクレオチド(例えば前記官能化されたオリゴヌクレオチド中のアルキン、ビニル又はアジド基)に連結又は接続することに関して、用語「コンジュゲーション」とは、共有結合によって前記分子又は成分を前記オリゴヌクレオチドに接続することを指す。特に、このコンジュゲーションは、クリック化学反応によって起こってもよい。
1つ若しくは複数のアルキン基を含む本発明の一本鎖官能化オリゴヌクレオチドに追加の分子又は成分をコンジュゲートするために使用され得る特定のクリック化学反応の例は、アジド-アルキン環化付加である。所望のコンジュゲーションを実現するために、アルキン基を含むオリゴヌクレオチドは、アジド基を含有する分子又は成分(例えばフルオロフォア等の標識)と適切な時間インキュベートされ得る。アジド-アルキン環化付加反応は、銅の触媒、特に銅(I)触媒を一般に使用する。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド及びアジド含有分子又は成分は、硫酸銅の存在下でインキュベートされ得る。還元剤も使用して、活性な銅(I)触媒を生成してもよい。還元剤は、例えば、アスコルビン酸ナトリウムでもよい。
1つ若しくは複数のビニル基を含む本発明の一本鎖官能化オリゴヌクレオチドに追加の分子又は成分をコンジュゲートする更なる代表的な例は、アルケン-テトラジン反応を利用してもよい。この反応は、銅を含まないという長所がある。更に、その反応は、上述したアルキン-アジドクリック化学反応と完全に直交する。従って、アルキン基とビニル基の両方を含む一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを2つのクリック化学反応にそれぞれ独立に供して、同じオリゴヌクレオチドに異なる2つの追加の分子又は成分をコンジュゲートできよう。
従って、一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される方法を使用してオリゴヌクレオチドに官能化されたヌクレオチド(例えば、クリック化学反応に関与する能力がある基、例えばアルキン、ビニル又はアジド基等の反応基を含む)を組み込む第1の工程及び官能化されたヌクレオチド中の官能基を介して一本鎖オリゴヌクレオチドに追加の分子又は成分をコンジュゲートする第2の工程を含む、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを作製するための2工程の方法を提供すると見ることができる。
任意の望ましい分子又は成分(即ち実体)が、本方法によって作製される一本鎖オリゴヌクレオチド中の官能基にコンジュゲートされ得ることは明白であろう。そのような分子又は成分は、オリゴヌクレオチド中の官能基と反応して、共有結合を形成する能力がある基(例えば反応基)の存在を単純に必要とする。一部の実施形態において、分子又は成分は、核酸分子、タンパク質、ペプチド、小分子有機化合物(例えばコレステロール等のステロール)、フルオロフォア、金属-リガンド複合体、多糖、ナノ粒子、ナノチューブ、ポリマー、細胞、細胞小器官、小胞、ウイルス、ウイルス様粒子又はこれらの任意の組合せでもよい。
細胞は、原核又は真核細胞でもよい。一部の実施形態において、細胞は原核生物細胞、例えば細菌細胞である。
一部の実施形態において、官能化されたオリゴヌクレオチドは、治療若しくは予防効果を有する化合物若しくは分子、例えば抗生物質、抗ウイルス薬、ワクチン、例えば放射性化合物若しくは同位元素の抗腫瘍薬、サイトカイン、毒素、オリゴヌクレオチド、遺伝子をコードしている核酸若しくは核酸ワクチンにコンジュゲート又は融合されてもよい。
一部の実施形態において、官能化されたオリゴヌクレオチド(例えばアプタマー)は、標識、例えば放射性標識、蛍光標識、発光標識、発色団標識、並びに物質及び検出可能な基質を生成する酵素、例えばワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ又はアルカリホスファターゼにコンジュゲート若しくは融合されてもよい。この検出は、ウェスタンブロッティング/免疫ブロッティング、組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)又はフローサイトメトリー(FACS)形式を含めた抗体が従来通り使用される非常に多くのアッセイに適用され得る。磁気共鳴画像法のための標識、ポジトロン断層撮影法プローブ及び中性子捕捉療法のためのホウ素10が、本明細書に記載される官能化されたオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされてもよい。
一部の実施形態において、分子又は成分は:フルオロフォア、ステロール(例えばコレステロール)、ポリエーテル、金属錯体、チオール含有分子、ヌクレアーゼ抵抗性の増大をもたらす基を含有する分子及びクリック化学反応に関与する能力がある基を含有する分子からなる群から選択され得る。
官能化されたオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる分子又は成分は、他の分子と相互作用してもよく、そのような相互作用が共有結合又は非共有結合相互作用でもよいことは明白であろう。例えば、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされるペプチドは、抗体等のその同族の結合パートナーと非共有結合的に相互作用し得る。更なる例において、クリック化学反応に関与する能力がある基を含有する分子を、前記分子又は成分の反応基を用いる反応によって上で定義した別の分子又は成分にコンジュゲートして、共有結合複合体を形成してもよい。
本方法の工程(a)において得られる環状DNA分子は、任意の適切な手段で作製されてもよく、種々の手段が当業者に周知である。従って、本発明の方法は、環状DNA分子を提供する工程(a)の前に追加の工程を含んでもよい。
例えば、環状DNA分子を作製する方法は、切断ドメインが接している所望のオリゴヌクレオチド配列(本明細書において「偽遺伝子」と称される)を1つ又は複数含む配列をin silicoで設計する工程を含んでもよい。従って、本方法は、偽遺伝子を設計するコンピュータで実行する方法を利用してもよく、そのような方法は、論文、例えば、上記Ducaniら、2013に記載されている。
本明細書では用語「偽遺伝子」は、切断ドメインが接している、1つ又は複数の所望のオリゴヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列のことを指す。代わりに、この配列は、本明細書において「核酸構築物」とも呼ばれ得る。
in silicoで設計される偽遺伝子配列は、市販の遺伝子合成方法又は当業者に公知の他の任意の適切な手段、例えばアセンブリPCRを使用して作製(例えば、合成)され得る。従って、本方法は、偽遺伝子を作製する工程を含んでもよい。
偽遺伝子は、一本鎖又は二本鎖分子として作製されてもよい。偽遺伝子を、当業者に公知の任意の適切な手段を使用して環化して工程(a)の環状DNA分子を得てもよい。例えば、二本鎖分子は、下記のリガーゼ酵素を使用してライゲートされてもよい。この点に関しては、ライゲーションが起こることを可能にするために偽遺伝子の5'末端の少なくとも1つがリン酸化されることは理解されよう。偽遺伝子を作製する工程が、5'末端がリン酸化されていないDNA分子をもたらす実施形態において、本方法は、例えば、T4ポリヌクレオチドキナーゼ等のキナーゼ酵素を使用して偽遺伝子の5'末端をリン酸化する更なる工程を含んでもよい。
同様に、偽遺伝子が一本鎖分子として得られる場合、それは、CircLigase等の、一本鎖オリゴヌクレオチド分子の分子内ライゲーションを触媒する能力がある適当なリガーゼ酵素を使用して環化されてもよい。また、本方法は、偽遺伝子の5'末端をリン酸化する、例えば、T4ポリヌクレオチドキナーゼ等のキナーゼ酵素を使用してライゲーション反応を促進する更なる工程を含んでもよい。
一部の実施形態において、大腸菌等の細菌中で複製され得るプラスミドに偽遺伝子を挿入することが有利な場合がある。適切なプラスミド配列は当業者に周知である。これにより、偽遺伝子の配列を確認し(例えば配列決定によって)、配列中の任意の誤りを、例えば、任意の適切な方法を使用する配列決定及び突然変異誘発の繰り返しによって修正することが可能になる。
プラスミドへの偽遺伝子の挿入も、有意なコピー数の環状DNA分子の生成を容易にする。例えば、配列を検証した偽遺伝子を含むプラスミドを含有する単一の細菌コロニーを増殖させてプラスミドを増幅してもよく、その後、当業者に公知の任意の適切な手段を使用して細菌から精製され得る。
次いで、偽遺伝子配列は、例えば上記の制限酵素を使用してプラスミドから切り出される。切り出される直鎖状偽遺伝子配列は、PAGE及びゲル抽出又は他の適切な方法を使用して精製され得る。次いで、精製した直鎖状偽遺伝子配列をT4リガーゼ等の適切なリガーゼ酵素を使用して再環化して、本方法の工程(a)において得られる環状DNA分子を形成することができる。
増幅に加えて、細菌にプラスミドを含有する偽遺伝子をトランスフェクトする方法により、細菌グリセロール貯蔵物を作製することも可能になる。所望の偽遺伝子プラスミドを含む細菌は、グリセロール中に調製され、凍結され、長期間安定して貯蔵され得る。
従って、一部の実施形態において、本方法の工程(a)は:
(i)切断ドメインが接しているオリゴヌクレオチド配列を含む直鎖状DNA分子をDNAプラスミドにクローニングする工程と;
(ii)前記プラスミドを増幅する工程と;
(iii)切断ドメインが接しているオリゴヌクレオチド配列を含むDNA分子を含有するプラスミドの部分を切り出す工程と;
(iv)工程(iii)で得たプラスミドの部分を環状化する工程とを含む。
一部の実施形態において、工程(ii)は、細菌へ前記DNAプラスミドをトランスフェクトし、細菌を増殖させる工程を含む。
一部の実施形態において、切断ドメインが接しているオリゴヌクレオチド配列を含む直鎖状DNA分子は、各々切断ドメインを含む5'末端領域及び3'末端領域を更に含み、工程(iii)は、切断酵素で末端領域内の切断ドメインを切断する工程を含む。
本明細書に定義される任意の適切な切断酵素を使用して、偽遺伝子をプラスミドから切り出してもよい。一部の実施形態において、切断酵素は、BsmBI若しくはBsal又はそのアイソシゾマーである。
本発明の一部の特定の実施形態において、本方法は、phi29 DNAポリメラーゼ又はその誘導体、及び修飾された核酸塩基を含む官能化されたヌクレオチドを使用する。一部の実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、クリック化学反応に関与する能力がある反応基等の反応基を核酸塩基内に含む。一部の実施形態において、核酸塩基中の反応基は、上で定義したアルキン又はビニル基である。一部の実施形態において、RCA混合物中の官能化されたヌクレオチドの相対量は、約25～100%、例えば25～75%, 50～100%若しくは75～100%又はこれら範囲内の任意の値である。一部の実施形態において、切断ドメインは、上で定義したRCA産物内にヘアピン構造を形成する能力がある。
更なる態様において、本発明は、キット、特に官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドを作製するのに使用するキットを提供し、前記キットは:
(i)切断ドメインが接しているオリゴヌクレオチド配列を含む環状DNA分子;及び任意選択で
(ii)(i)の切断ドメインを切断する1つ又は複数の切断酵素;及び/又は
(iii)官能化されたdNTPを含む。
一部の実施形態において、本発明は:
(i)切断ドメインが接しているオリゴヌクレオチド配列を含む環状DNA分子であって;切断ドメインが、ヘアピン構造を形成する能力がある配列を含む又はそれからなり、ヘアピン構造の二本鎖部分が、切断酵素によって認識される配列を含む環状DNA分子;及び
(ii)官能化されたdNTP(例えば、本明細書に定義される);及び任意選択で
(iii)(i)の切断ドメインを切断する1つ又は複数の切断酵素
を含む、本明細書に記載される方法における使用のためのキットを提供する。
一部の実施形態において、キットは、ローリングサークル増幅を実行する能力がある、即ち本明細書に定義される鎖置き換え活性を少なくとも一部含むDNAポリメラーゼ酵素を含み得る。例えば、キットはphi29ポリメラーゼ若しくその誘導体又はBst DNAポリメラーゼ若しくはその誘導体を含み得る。
一部の実施形態において、キットは、1つ又は複数のニッカーゼを含んでもよい。例えば、キットは、Nb.BsrDI、Nt.BspQI又はその組合せを含み得る。
一部の実施形態において、キットは、本明細書に定義される1つ又は複数の一本鎖結合タンパク質を含んでもよい。例えば、キットは、大腸菌一本鎖DNA結合タンパク質、T4ファージの遺伝子32タンパク質又はその組合せを含んでもよい。
一部の実施形態において、キットは、上で定義した官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる分子又は成分を1つ若しくは複数含んでもよい。
キットの環状DNA分子、切断酵素及び官能化されたdNTPは、上述した通りである。
更なる態様において、本発明は、本明細書に記載の方法によって得られる一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態において、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドは、少なくとも20ヌクレオチドを含有する。例えば、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドは、少なくとも25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100又はそれより多いヌクレオチドを含有してもよい。一部の好ましい実施形態において、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドは、少なくとも50ヌクレオチド、例えば少なくとも約55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100ヌクレオチドを含有する。一部の実施形態において、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドは、約50～1000、55～900、60～800、65～700、70～600、80～500、90～450又は100～400ヌクレオチドを含有する。一部の実施形態において、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドは、約400～10000、500～9000、600～8000、700～7000、800～6000、900～5000又は1000～4000ヌクレオチドを含有し、例えば約500、1000、1500、2000、2500、3000、3500又はそれより多いヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド残基の少なくとも5%は、官能化されたヌクレオチド、即ち本明細書に定義される官能基を含有するヌクレオチドである。一部の実施形態において、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド残基の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%又はそれより多くは、官能化されたヌクレオチドである。従って、一部の実施形態において、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド残基の約5～100%は、官能化されたヌクレオチドであり、例えば、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド残基の約10～95%、15～90%、20～85%、25～80%、30～75%、35～70%、40～65%又は45～55%は、官能化されたヌクレオチドである。
一部の実施形態において、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの内部の官能化されたヌクレオチド、即ちオリゴヌクレオチドの5'又は3'末端ではない官能化されたヌクレオチドを含有する。一部の実施形態において、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドは、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれより多くの内部の官能化されたヌクレオチド、例えば15、20、25、30、35、40、45、50個又はそれより多くの内部の官能化されたヌクレオチドを含有する。
一本鎖官能化オリゴヌクレオチドは、本明細書に定義される官能化されたヌクレオチドのうち任意の1つ又は複数を含有し得る。一部の実施形態において、鎖官能化されたオリゴヌクレオチドは、アルキン基、アルケン基(例えばビニル基)、アジド基、ハロゲン基、O-メチル基、ロックされたリボース糖から選択される官能基又はその組合せを含有する官能化されたヌクレオチドを含む。
従って一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の方法によって得られる一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを提供し、
(i)オリゴヌクレオチドは、少なくとも50ヌクレオチドを含有し;
(ii)ヌクレオチド残基の少なくとも5%は、アルキン基、アルケン基(例えばビニル)、アジド基、ハロゲン基、O-メチル基、ロックされたリボース糖から選択される官能基又はその組合せを含有し、官能化されたヌクレオチド残基内の官能基の好ましい位置は、上で定義した通りである。
なお更なる態様において、本発明は、本明細書に記載の方法によって得られる一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを複数含むライブラリを提供する。複数の一本鎖官能化オリゴヌクレオチドのライブラリは、上で定義した1つ又は複数の一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを含んでもよい。
なお更なる態様において、本発明は、単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション(smFISH)に使用するための一本鎖官能化オリゴヌクレオチドのプールを作製する方法である本明細書に定義される方法を提供し、官能化されたヌクレオチドは、蛍光標識されたヌクレオチドであり、プール中の各一本鎖官能化オリゴヌクレオチドは、約15～30、好ましくは約20～25ヌクレオチドを含有する。好ましい実施形態において、官能化されたヌクレオチドは、同じ蛍光分子で標識される。
直接蛍光標識された官能化されたヌクレオチドの使用に代わるものとして、本方法は、クリック化学に関与する能力がある化学基を含むヌクレオチドの使用を含んでもよく、蛍光標識は、その化学基にその後コンジュゲートされ得る。適切な蛍光標識は、当業者に周知であり、上で定義されている。
従って、なお更なる態様において、本発明は、単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション(smFISH)に使用するための一本鎖官能化オリゴヌクレオチドのプールを作製する方法である本明細書に定義される方法を提供し、官能化されたヌクレオチドは、クリック化学に関与する能力がある化学基を含むヌクレオチドであり、前記方法は、クリック化学によって各官能化されたオリゴヌクレオチド中の少なくとも1つの官能化されたヌクレオチドに蛍光標識をコンジュゲートする工程を更に含み、プール中の各一本鎖官能化オリゴヌクレオチドは、約15～30、好ましくは約20～25ヌクレオチドを含有する。クリック化学に関与する能力がある化学基を含むヌクレオチドは、上で定義されており、アジド基、アルキン基、アルケン基、ニトロン基、テトラジン基若しくはテトラゾール基又はその組合せを含むヌクレオチドである。
smFISH技術において、一本鎖官能化オリゴヌクレオチドは、検出しようとする特定の標的配列を含む核酸分子の存在及び場所を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして作用する。従って、単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション(smFISH)に使用するための一本鎖官能化オリゴヌクレオチドのプールが、本明細書に開示される方法によって作製されたら、官能化されたオリゴヌクレオチドは、smFISH方法において検出される標的配列を含む核酸分子にハイブリダイズされ得る。
一本鎖官能化オリゴヌクレオチドが、クリック化学に関与する能力がある化学基を含む官能化されたヌクレオチドを含む場合、クリック化学によって官能化されたヌクレオチドに蛍光標識をコンジュゲートする工程は、官能化されたオリゴヌクレオチドが、標的配列を含む核酸分子にハイブリダイズされる前又は後に実施されてもよい。
例えば、クリック化学に関与する能力がある化学基を含む官能化されたヌクレオチドを含む官能化されたオリゴヌクレオチドは、クリック化学によって各官能化されたオリゴヌクレオチド中の少なくとも1つの官能化されたヌクレオチドに蛍光標識をコンジュゲートする工程に供されてもよく、蛍光標識がコンジュゲートされたら、標的配列を含む核酸分子に次いでハイブリダイズされてもよい。別法として、クリック化学に関与する能力がある化学基を含む官能化されたヌクレオチドを含む官能化されたオリゴヌクレオチドは、標的配列を含む核酸分子に、最初にハイブリダイズされてもよく、標的配列にハイブリダイズしたら、クリック化学によって各官能化されたオリゴヌクレオチド中の少なくとも1つの官能化されたヌクレオチドに蛍光標識をコンジュゲートする工程に次いで供されてもよい。
従って、なお更なる態様において、本発明は、単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション(smFISH)に使用するための一本鎖官能化オリゴヌクレオチドのプールを作製する方法である本明細書に定義される方法を提供し、官能化されたヌクレオチドは、クリック化学に関与する能力がある化学基を含むヌクレオチドであり、本方法は、クリック化学によって各官能化されたオリゴヌクレオチド中の少なくとも1つの官能化されたヌクレオチドに蛍光標識をコンジュゲートする工程を更に含み、プール中の各一本鎖官能化オリゴヌクレオチドは、約15～30、好ましくは約20～25ヌクレオチドを含有し、クリック化学によって各官能化されたオリゴヌクレオチド中の少なくとも1つの官能化されたヌクレオチドに蛍光標識をコンジュゲートする工程は、官能化されたオリゴヌクレオチドが、標的配列を含む核酸分子にハイブリダイズされる前に、実施される。
同様に、本発明は、単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション(smFISH)に使用するための一本鎖官能化オリゴヌクレオチドのプールを作製する方法である本明細書に定義される方法も提供し、官能化されたヌクレオチドは、クリック化学に関与する能力がある化学基を含むヌクレオチドであり、本方法は、クリック化学によって各官能化されたオリゴヌクレオチド中の少なくとも1つの官能化されたヌクレオチドに蛍光標識をコンジュゲートする工程を更に含み、プール中の各一本鎖官能化オリゴヌクレオチドは、約15～30、好ましくは約20～25ヌクレオチドを含有し、クリック化学によって各官能化されたオリゴヌクレオチド中の少なくとも1つの官能化されたヌクレオチドに蛍光標識をコンジュゲートする工程は、官能化されたオリゴヌクレオチドが、標的配列を含む核酸分子にハイブリダイズされた後に、実施される。
一本鎖官能化オリゴヌクレオチドの「プール」とは、異なる配列、即ち標的(検出しようとする分子)内の異なる(例えば重なり合わない)配列にハイブリダイズする配列を持つ複数のオリゴヌクレオチドのことを指す。一部の実施形態において、プールは、少なくとも約20個のオリゴヌクレオチド、例えば、約22、25、27、30、35、40、45、50、60、70、80、90又は100個のオリゴヌクレオチドを含有する。例えば、一部の実施形態において、プールは、約30～96個のオリゴヌクレオチド、例えば約36、48、60、72、84又は96個のオリゴヌクレオチドを含有する。
別の見方では、一部の実施形態において、偽遺伝子は、切断ドメインが接しているオリゴヌクレオチド配列を少なくとも約20個、例えば切断ドメインが接しているオリゴヌクレオチド配列を約22、25、27、30、35、40、45、50、60、70、80、90又は100個含有する。例えば、一部の実施形態において、偽遺伝子は、切断ドメインが接しているオリゴヌクレオチド配列を約30～96個、例えば切断ドメインが接しているオリゴヌクレオチド配列を約36、48、60、72、84又は96個含有する。
本発明は、以下の図面を参照して以下の非限定的な実施例においてより詳細に次に記載される:
臭化エチジウム染色後にUV光を使用して可視化したアガロースゲルの写真(上段)及びフルオロフォアの放射波長に対応する波長を使用した蛍光イメージング(下段)を示す図である。アガロースゲルは、フルオロフォアATTO-488(A)又はCy3(B)を含む本発明の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド産物(378ヌクレオチドを含有する)を示す。 臭化エチジウム染色後にUV光を使用して可視化したアガロースゲルの写真の陰画を示す図である。アガロースゲルは、様々な相対量、即ち25%、50%、75%及び100%の5-EdUTP/dTTPヌクレオチド及びphi29 DNAポリメラーゼ(A)又はBst DNAポリメラーゼ(B)を使用して作製した5-エチニル-dUTP(5-EdUTP)を含む本発明の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド産物(420ヌクレオチドを含有する)を示す。 臭化エチジウム染色後にUV光を使用して可視化したアガロースゲルの写真(左)及びCy3フルオロフォアの放射波長に対応する波長を使用した蛍光イメージング(右)を示す図である。アガロースゲルは、Cy3フルオロフォア-アジド分子(N3-Cy3)とその後反応させた5-エスニル(ethnyl)-dUTP(5-EdUTP)又は従来通りのdTTPを含む本発明の一本鎖オリゴヌクレオチド産物(420ヌクレオチドを含有する)を示す。影付きの四角は、示した種の存在を意味する。 臭化エチジウム染色後にUV光を使用して可視化したアガロースゲルの写真の陰画を示す図である。アガロースゲルは: (A) 2'-フルオロ-2'-デオキシウリジン5'-三リン酸(2'F-dUTP); (B) 2'-デオキシチミジン-5'-O-(1-チオ三リン酸)(αチオール-dTTP);及び(C)様々な相対量の官能化されたヌクレオチドを使用して作製された2-dNTPアルファSヌクレオチド(アルファS-dATP、アルファS-dTTP、アルファS-dCTP、アルファS-dTTP及びアルファS-dNTP混合物)を含む本発明の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド産物(420ヌクレオチドを含有する)を示す。A及びBにおける右パネルは、RCA産物に対応するバンドを示すために過度に曝露した(overexposed)100%の官能化されたヌクレオチドに対応するレーンを示す。Cにおける右パネルは、RCA産物に対応するバンドを示すために過度に曝露したアルファS-dNTP混合物に対応するレーンを示す。 臭化エチジウム染色後にUV光を使用して可視化したアガロースゲルの写真の陰画を示す図である。アガロースゲルは、様々な濃度のDNase Iに供した本発明によって作製したオリゴヌクレオチドを示し、(A)は、従来通りのヌクレオチドだけを含有するオリゴヌクレオチドの反応産物を示し(天然のODN); (B)は、2'-フルオロ-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸官能化されたヌクレオチド(2'F-dUTP)を含有するオリゴヌクレオチドの反応産物を示し;及び(C)は、2'-デオキシチミジン-5'-O-(1-チオ三リン酸)を含有するオリゴヌクレオチドの反応産物を示す(S-ODN)。 SybrGold染色後にUV光を使用して可視化した変性PAGEゲルの写真の陰画を示す図である。PAGEゲルは、様々な相対量、即ち25%、50%、75%及び100%の5-ビニル-dUTPヌクレオチドを使用して作製した5-ビニル-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸(5-ビニル-dUTP)を含む本発明の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド産物を示す。 SybrGold染色後にUV光を使用して可視化した変性PAGEゲルの写真の陰画を示す図である。PAGEゲルは、様々な相対量、即ち25%、50%、75%及び100%の5-ビニル-dUTPヌクレオチドを使用して作製した4-チオチミジン-5'-三リン酸(4-チオ-dTTP)を含む本発明の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド産物を示す。 配列番号1～13に対応する配列を有するオリゴヌクレオチドの作製に使用した偽遺伝子配列の注釈付きバージョンを示す図である。切断及びニッキング酵素によって認識される配列、ヘアピン配列並びに最終的なオリゴヌクレオチド配列が同定される。 2'-アジド-dATPの構造(A)及びSybrGold染色後にUV光を使用して可視化した変性PAGEゲルの写真の陰画(B及びC)を示す図である。PAGEゲルは、様々な相対量、即ち25%、50%、75%及び100%の2'-アジド-dATPヌクレオチド及びphi29 DNAポリメラーゼ(B)又はBst DNAポリメラーゼ(C)を使用して作製した2'-アジド-dATPを含む本発明の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド産物を示す。 ビオチン-16-アミノアリル-2'-dUTPの構造(A)及びSybrGold染色後にUV光を使用して可視化した変性PAGEゲルの写真の陰画(B)を示す図である。PAGEゲルは、様々な相対量、即ち25%、50%、75%及び100%のビオチン-16-AA-dUTPヌクレオチド並びにphi29 DNAポリメラーゼを使用して作製したビオチン-16-アミノアリル-2'-dUTPを含む本発明の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド産物を示す。 5'-ブロモ-2'-デオキシウリジン-5'三リン酸ヌクレオチドの構造(A)及び5'-プロピニル-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸ヌクレオチドの構造(B);SybrGold染色後にUV光を使用して可視化した変性PAGEゲルの写真の陰画(C、D、E及びF)を示す図である。PAGEゲルは、様々な相対量、即ち25%、50%、75%及び100%のそれぞれの官能化されたヌクレオチド並びにphi29 DNAポリメラーゼ若しくはBst DNAポリメラーゼを使用して作製した5'-Br-dUTP(C及びE)又は5'-プロピニル-dCTP(D及びF)を含む本発明の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド産物を示す。 2'-O-メチルアデノシン-5'-三リン酸ヌクレオチドの構造(A)及びSybrGold染色後にUV光を使用して可視化した変性PAGEゲルの写真の陰画(B)を示す図である。PAGEゲルは、様々な相対量、即ち25%、50%、75%及び100%の2'-OMe-ATPヌクレオチド並びにphi29 DNAポリメラーゼを使用して作製した2'-OMe-ATPを含む本発明の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド産物を示す。 LNA-アデノシン-5'-三リン酸塩ヌクレオチドの構造(A)及びSybrGold染色後にUV光を使用して可視化した変性PAGEゲルの写真の陰画(B及びC)を示す図である。PAGEゲルは、様々な相対量、即ち25%、50%、75%及び100%のLNA-ATPヌクレオチド及びphi29 DNAポリメラーゼ(B)又はBst DNAポリメラーゼ(C)を使用して作製したLNA-ATPを含む本発明の官能化された一本鎖オリゴヌクレオチド産物を示す。
(実施例1)
蛍光ヌクレオチドを含む一本鎖オリゴヌクレオチドの酵素的作製
長さ378ヌクレオチドの一本鎖蛍光オリゴヌクレオチド(配列番号1)を、phi29 DNAポリメラーゼを使用して酵素的に作製した。これは、異なる2つの官能化されたdATP核酸塩基の組み込みによって行われ、1つはフルオロフォアCy3(7-プロパルギルアミノ-7-デアザ-ATP-Cy3)を含み、1つはフルオロフォアATTO-488(7-プロパルギルアミノ-7-デアザ-ATP-ATTO-488)を含んだ。
配列番号1及びヘアピン切断ドメインを含有する二本鎖環状DNA鋳型を、Ducaniら、2013, Nature Methods, 647～652頁に記載の通り調製した。鋳型(1ng/μL)を、Nb.BsrDI及びNt.BspQI(0.25U/μL)でニックを入れ、ローリングサークル増幅反応(鋳型DNA 0.1～0.25ng/μL、phi29 DNAポリメラーゼ0.25U/μL、T4遺伝子32 0.1μg)を、各反応において異なる比の天然のdATPと官能化されたdATP(即ち異なる相対量の官能化されたdATP、2%、3%又は5%)を用いて数回実行した。得られたRCA産物を、脱イオン水及び1×消化緩衝液(50mM酢酸カリウム、20mM tris-酢酸、10mM酢酸マグネシウム、100μg/mL BSA、25℃でのpH7.9)中に5倍希釈し、次いでBtsCI制限酵素(0.5U/μL)で、50℃で終夜消化し、消化産物をアガロースゲルに流した。画像化は、2つのフルオロフォアに対応する放射波長を使用して、及び臭化エチジウム染色後にUV可視化によって行った。
得られた画像を、ATTO-488及びCy3についてそれぞれ図1A及び図1Bに示す。dATP-ATTO-488ヌクレオチドのパーセンテージを増大させることにより、より高い蛍光を持つオリゴヌクレオチドを得られたことが分かる。しかしながら、dATPヌクレオチドの5%が、dATP-ATTO-488であった場合、RCA産物の総量は、およそ60%低下した。
驚くべきことに、またdATP-ATTO-488の使用とは対照的に、存在するdATP-Cy3ヌクレオチドのパーセンテージは、phi29 DNAポリメラーゼの効率に影響を及ぼさなかったようであり;一本鎖DNA産物は、RCA混合物中に5%のdATP-Cy3で目に見えた(図1B)。更に、修飾ヌクレオチドの組み込みは、BtsCI制限酵素の効率、結果的に切断ドメインを含む設計されたヘアピンの遊離を防止又は減少させなかった。
配列番号1:
Figure 2022519684000001
(実施例2)
内在化したアルキン基、即ち核酸塩基中にアルキン基を持つヌクレオチドを含む一本鎖オリゴヌクレオチドの酵素的作製
アルキン基を持つヌクレオチドを含む長さ420ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチド(配列番号2)を、phi29 DNAポリメラーゼを使用して酵素的に作製した。
配列番号2及びヘアピン切断ドメインを含有する二本鎖環状DNA鋳型を、Ducaniら、2013, Nature Methods, 647～652頁に記載の通り調製した。鋳型RCA反応のニッキングを、実施例1に記載される条件を使用したが、5'-エチニル-dUTP(5'-EdUTP)の相対量を増大させて、即ち、5'-EdUTPの相対量が、0%(対照反応)、25%、50%、75%又は100%になるようにdTTPを5'-EdUTPで置き換えて使用して実行した。増幅後、RCA産物をBtsCI制限酵素で消化し、実施例2に記載の通りアガロースゲルにロードした。
図2Aにおける結果は、dTTPヌクレオチドの100%を、アルキンで官能化したdUTPと置き換えた場合でも、RCA収量は15～20%しか低下しなかったことを驚くべきことに示す。従って、図2Aは、RCA産物が、BtsCIによって成功裏に及び効率的に切断されたことも実証する。アルキン官能化されたdUTPヌクレオチドの組み込みは、官能化されたオリゴヌクレオチドのより低い移動度が観察されたという事実によって確認された。
追加の実験を、phi29 DNAポリメラーゼをBst DNAポリメラーゼと置き換えて実行した。ゲル電気泳動は、官能化されたdUTPの50%まで増幅収量に全く変化を示さなかった。最終産物は、修飾されたdUTPの25%のそれと比較して移動しており、対応する天然のヌクレオチド(dTTP)より高い分子量を有する修飾ヌクレオチドの組み込みが確認された(図2B)。
配列番号2:
Figure 2022519684000002
(実施例3)
内在化されたアルキン基を含む一本鎖ヌクレオチドにアジド-フルオロフォアをコンジュゲートするためのクリック化学反応
実施例2において作製したオリゴヌクレオチドへの官能化された5-エチニルdUTPヌクレオチドの組み込みの成功が、クリック化学反応を実行することによって更に実証された。
75%のアルキン官能化されたdUTPヌクレオチドとの反応からの官能化されたオリゴヌクレオチドを、Cy3-アジド(50μM)とインキュベートした。クリック化学溶液は、触媒として硫酸銅(50μM)、アスコルビン酸ナトリウム(50mM)及びTHPTA(250μM)も含んだ。陰性対照として、同じ鋳型から従来通りのdNTPを用いる以外同じ方法で作製したオリゴヌクレオチドも、Cy3-アジドとインキュベートした。加えて、内在化されたアルキン基を含む官能化されたオリゴヌクレオチドを、Cy3-アジドの非存在下でもインキュベートした。3つの反応からの反応混合物をアガロースゲルに流し、撮像した(図3)。予想される長さの蛍光一本鎖オリゴヌクレオチドは、官能化されたオリゴヌクレオチドとフルオロフォア-アジドを含む反応に対してのみ観察された。加えて、硫酸銅の存在による目に見えるDNA分解は観察されなかった。
(実施例4)
エンドヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む一本鎖オリゴヌクレオチドの酵素的作製
2'-フルオロ-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸(2'F-dUTP)又は2'-デオキシチミジン-5'-O-(1-チオ三リン酸)(ホスホロチオエートdTTP)のヌクレアーゼ安定性を付与する能力ゆえに、その両方をこれまで使用して生物医学並びに治療的適用のためのDNA及びRNAオリゴヌクレオチドを修飾してきた。これら修飾ヌクレオチドは、上述した実験的スキームを使用するRCAによって一本鎖DNAオリゴヌクレオチドに組み込まれた。従来通りのdTTPヌクレオチドを、0～100%のパーセンテージで増大させながら官能化されたヌクレオチドと置き換えた。タンデムリピートRCA産物を、別々の420塩基の一本鎖官能化オリゴヌクレオチド(配列番号2)へとBtsCI制限酵素によって次いで消化した。
2'F-dUTP官能化されたヌクレオチドで実行した実験において、同程度のRCA収量が、官能化されたヌクレオチドの0%から最大75%で目に見え、官能化されたヌクレオチドの100%で収量の急激な低下が観察された(図4A)。
ホスホロチオエートdTTP実験において、RCA収量は、官能化されたヌクレオチドの量が増大するとともに徐々に低下し、従来通りのヌクレオチドだけによる収量と比較して、官能化されたヌクレオチドの75%でおよそ最大65%低下した(図4B)。
しかしながら、アガロースゲルの過度の曝露は、官能化された核酸塩基の100%であっても、官能化された一本鎖オリゴヌクレオチドが作製されたことを示した、図4A及び図4Bの右のパネルを参照。
他のホスホロチオエートdNTP(アルファS dNTPと示される)を、順次又は組合せのいずれかで添加する追加の実験において試験した(図4C)。全ての従来通りのヌクレオチドの75%が、対応するアルファS官能化されたヌクレオチドで置き換えられた最後の場合であっても、RCA産物は合成され、酵素的に切断されて、アガロースゲル上で見えるオリゴヌクレオチドを産した。
従来通りのヌクレオチドだけで作製した対照オリゴヌクレオチドと比較して官能化されたオリゴヌクレオチドのエンドヌクレアーゼ抵抗性を調査した。従来通りのヌクレオチドのみで作製した長さ420ntの対照のオリゴヌクレオチド、2'-F-dUTP官能化されたオリゴヌクレオチド及びホスホロチオエートdTTP官能化されたオリゴヌクレオチド(両方とも相対量75%の官能化されたヌクレオチドを使用して作製した)を、DNAse Iの濃度を増大させながらインキュベートした(図5A～図5C)。対照オリゴヌクレオチドは18mU/mLのDNAse Iで完全に消化されたが、酵素的に作製した2'-F-dUTPとホスホロチオエートdTTPで官能化されたDNAオリゴヌクレオチドの両方は、同じ濃度のエンドヌクレアーゼとのインキュベーション後にアガロースゲル上にまだ見えた。
(実施例5)
ビニル基を持つヌクレオチドを含む一本鎖オリゴヌクレオチドの酵素的作製
チミジン類似体5-ビニル-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸(5-ビニル-dUTP)で官能化した76～81塩基長の一本鎖DNAオリゴヌクレオチド(配列番号3～13)を、上述した実験的スキームに従ってRCA反応によって酵素的に作製した。オリゴヌクレオチドの全ては、単一の偽遺伝子(配列番号16)上にコードされていた。一本鎖オリゴヌクレオチドにそのような官能化されたヌクレオチドを組み込むことにより、銅を含まないクリック化学反応を使用してオリゴヌクレオチドにテトラジン様分子をコンジュゲートすることが可能になる。このアルケン-テトラジン反応は、これまで実行されてきたアルキン-アジドクリック化学反応と完全に直交し得る。
従来通りのヌクレオチドdTTPと比較してRCA反応混合物中の官能化されたヌクレオチドの量を増大させることにより、一本鎖のRCA産物への5-ビニル-dUTPの組み込みの成功及びヘアピン構造の消化の成功をもたらした。しかしながら、官能化されたヌクレオチドが従来通りのdTTPヌクレオチドを完全に置き換えた場合、phi29 DNAポリメラーゼとRCA産物を切断するために使用したII型エンドヌクレアーゼの両方の活性レベルは、官能化されたヌクレオチドの非存在下より低く、結果的に、これは消化されていないヘアピン構造を含むより高い分子量バンドをもたらした(図6)。
Figure 2022519684000003
(実施例6)
チオール化されたヌクレオチドを含む一本鎖オリゴヌクレオチドの酵素的作製
チオール化されたdTTP(4-チオチミジン-5'-三リン酸)で官能化された一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを、上述した反応スキーム及び鋳型(配列番号3～13)を使用するRCA反応によって酵素的に作製した。オリゴヌクレオチドの全ては、単一の偽遺伝子(配列番号16)上にコードされていた。
phi29 DNAポリメラーゼの組み込みによる一本鎖オリゴヌクレオチドへのチオール化されたヌクレオチドの組み込みは、対応する従来通りのヌクレオチド(dTTP)を最大75%置きかえた官能化されたヌクレオチドの量、即ち相対量75%の官能化されたヌクレオチドにおいて非常に成功した(図7)。
RCA産物は、上記のII型制限酵素によって消化された、しかしながら、官能化されたRCA産物の完全な消化には、従来通りのヌクレオチドだけを含むRCA産物に使用した濃度より10倍高い酵素濃度を必要とした。従来通りのdTTPヌクレオチドが、官能化されたチオール化ヌクレオチドで完全に置き換えられた場合、一本鎖オリゴヌクレオチドは、II型制限酵素による処理後に全く観察されなかったが、ウェル内に消化されていないRCA産物の蓄積がごくわずかしか観察されなかったことから、ポリメラーゼの活性も影響を受けたことが示唆された。
(実施例7)
アジドヌクレオチドを含む一本鎖オリゴヌクレオチドの酵素的作製
対応する従来通りのdATPヌクレオチドを置き換える官能化された2'-アジド-dATPヌクレオチドを漸増パーセンテージで含む(図9A)長さ420ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチド(配列番号2)を、phi29 DNAポリメラーゼ(図9B)及びBst DNAポリメラーゼ(図9C)を使用して酵素的に作製した。
新しく合成されたDNA鎖中の高密度アジド基は、Cu(I)に触媒されるヒュスゲン環化付加(「クリック」化学)又はアジドとシクロアルキン、例えばシクロオクチン若しくはシクロノニンの歪み促進型[3+2]環化付加のいずれかによってアルキン分子による合成後官能化を可能にする。
鎖置き換え活性を持つ異なる2つのポリメラーゼ: phi29 DNAポリメラーゼ又はBst DNAポリメラーゼを、増幅工程に使用した。両方のポリメラーゼは、増幅産物に官能化されたヌクレオチドを組み込むことができ、その産物は、次いで消化され、アガロースゲルに流された。
phi29 DNAポリメラーゼで作製したDNA産物は、修飾ヌクレオチドの75%までゲル中で見え(図9B)、一方でBst DNAポリメラーゼ産物は100%まで見えた(図9C)、しかし、Bst増幅緩衝塩は、スミアー効果を(0%の2'-アジドdATPに対応するレーンにおいても)もたらした。官能化されたヌクレオチドは、成功裏に組み込まれ、増幅産物の切断を可能にするヘアピン構造の形成に有意に影響を及ぼさなかった。
(実施例8)
ビオチン化ヌクレオチドを含む一本鎖オリゴヌクレオチドの酵素的作製
対応する従来通りのヌクレオチドdTTPを置き換える官能化されたビオチン-16-アミノアリル-2'-dUTPを漸増パーセンテージ(25%～100%)で含む(図10A)長さ420ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチド(配列番号2)を、phi29 DNAポリメラーゼ(図10B)を使用して酵素的に作製した。
ビオチン化ヌクレオチドの組み込みは、DNA増幅反応にわずかしか影響を及ぼさず、驚くべきことに、大きなサイズの官能化されたヌクレオチドによる立体障害の潜在性にもかかわらず、RCA産物の切断を可能にするヘアピン構造の形成と干渉しなかった。官能化されたポリヌクレオチドへの複数の内部ビオチンの組み込みは、ストレプトアビジン官能化された分子とのコンジュゲーションを可能にする。
(実施例9)
5修飾されたピリミジン: 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸及び5-プロピニル-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの酵素的作製
対応する従来通りのヌクレオチドdTTP及びdCTPを置き換える非天然の5修飾されたピリミジン:5-ブロモ-2'-デオキシウリジン5'-三リン酸(図11A)及び5-プロピニル-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸(図11B)の漸増パーセンテージ(25%～100%)を含む長さ420ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチド(配列番号2)を、それぞれ、phi29 DNAポリメラーゼ(図11C及び図11D)及びBst DNAポリメラーゼ(図11E及び図11F)を使用して酵素的に作製した。驚くべきことに、両方の官能化されたヌクレオチドは、RCA産物におけるヘアピン構造の形成に影響を及ぼすことなく新しく合成されたDNA配列に成功裏に組み込まれ、従って、切断反応を起すことが可能になった。
(実施例10)
2'-O-メチル-ATPを含む一本鎖オリゴヌクレオチドの酵素的作製
対応する従来通りのヌクレオチドdATPを置き換える2'-O-メチル-ATP(図12A)の漸増パーセンテージ(25%～100%)を含む長さ420ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチド(配列番号2)を、phi29 DNAポリメラーゼ(図12B)を使用して酵素的に作製した。官能化されたヌクレオチドの100%であっても、増幅産物は依然として見えた。この結果は、公知のいかなる天然のポリメラーゼも、これらの修飾された基質を効率的に受け入れる能力がないことを示した以前の研究と相反した(Romesberg, JACS 2004, 10.1021/ja038525p)。
加えて、より高分子量の消化されていないDNAバンドがゲル中に全く見えなかったことは、官能化されたヌクレオチドの存在が、ヘアピン構造の形成及び制限酵素によるその消化に影響を及ぼさなかったことを示した。これは、O-メチル基によってDNA分子に付与されるヌクレアーゼ抵抗性を考えると驚くべき結果であった。
(実施例11)
LNA-アデノシン-5'-三リン酸を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの酵素的作製
対応する従来通りのヌクレオチドdATPを置き換えるLNA-アデノシン-5'-三リン酸(図13A)を漸増パーセンテージ(25%～100%)で含む長さ420ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチド(配列番号2)を、phi29 DNAポリメラーゼ(図13B)及びBst DNAポリメラーゼ(図13C)を使用して酵素的に作製した。
LNAモノマーは、RNAを構造的に模倣するにもかかわらず、官能化されたヌクレオチドの100%であっても、ポリメラーゼ、phi29 DNAポリメラーゼ及びBst DNAポリメラーゼの両方の効率は、有意に影響を受けなかった。更に、官能化されたヌクレオチドは、増幅産物の消化を可能にするヘアピン構造の形成と干渉しなかった。

Claims (37)

  1. 一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを作製する方法であって、前記方法が：
    (a)切断ドメインが接しているオリゴヌクレオチド配列を含む環状DNA分子を準備する工程;
    (b)鋳型としての(a)の前記環状DNA分子及び1つ又は複数の官能化されたヌクレオチド(dNTP)を用いてローリングサークル増幅(RCA)反応を実行する工程;並びに
    (c)前記切断ドメインで前記RCA反応の産物を酵素的に切断して、前記一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを遊離させる工程
    を含む、方法。
  2. 前記環状DNA分子が、二本鎖であり、前記方法が、前記RCA反応が実行される前に、前記環状DNA分子の一本鎖を切断してRCA鋳型を準備する追加の工程を含む、請求項1に記載の方法。
  3. 前記官能化されたdNTPが、アルキン基を含むヌクレオチド、蛍光標識されたヌクレオチド、ステロール基を含むヌクレオチド、ポリエーテル基を含むヌクレオチド、金属錯体を含むヌクレオチド、ビニル基を含むヌクレオチド、チオール基を含むヌクレオチド、チオン酸化されたヌクレオチド、ヌクレアーゼ抵抗性を増大させるように修飾されたヌクレオチド、クリック化学反応に関与する能力がある化学基を含むヌクレオチド、及び前記オリゴヌクレオチドの耐熱性に影響を及ぼすヌクレオチドからなる群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
  4. 前記官能化されたdNTPが、アルキン基、アルケン基、アジド基、ハロゲン基、O-メチル基、ロックされたリボース糖を含むヌクレオチドであり、好ましくは、前記官能化されたdNTPが、アルキン基、ビニル基又はアジド基を含むヌクレオチドである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記方法が、前記アルキン、ビニル又はアジド基を介して前記オリゴヌクレオチドに分子又は成分をコンジュゲートする工程を更に含む、請求項4に記載の方法。
  6. 前記分子又は成分が、フルオロフォア、ステロール、ポリエーテル、金属錯体、チオール基を含有する分子、ヌクレアーゼ抵抗性の増大をもたらす基を含有する分子及びクリック化学反応に関与する能力がある基を含有する分子からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
  7. 前記切断ドメインが、前記オリゴヌクレオチド配列に直接隣接している、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記切断ドメインが、切断酵素によって認識される配列を含有する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記切断ドメインが、ヘアピン構造を形成する能力がある配列を含む又はそれからなる、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記ヘアピン構造の二本鎖部分が、切断酵素によって認識される配列を含む、請求項9に記載の方法。
  11. 前記切断酵素が、II型制限エンドヌクレアーゼ、任意選択でBseGI又はBtsCI等のIIS型制限エンドヌクレアーゼである、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記オリゴヌクレオチド配列に接している前記切断ドメインが、同一である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記環状DNA分子の一本鎖を切断してRCA鋳型を準備する工程が、切断酵素で前記環状DNA分子の一本鎖を切断する工程を含む、請求項2から12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記環状DNA分子が、前記切断酵素によって認識される配列を含有する、請求項13に記載の方法。
  15. 前記切断酵素によって認識される前記配列が、前記オリゴヌクレオチド配列に接している前記切断ドメインの間にあり、前記オリゴヌクレオチド配列内にはない、請求項14に記載の方法。
  16. 前記切断酵素が、ニッカーゼであり、任意選択で前記切断酵素が、Nb.BsrDI、Nt.BspQI又はその組合せである、請求項13から15のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記RCA反応が、phi29 DNAポリメラーゼを使用する、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記RCA反応が、Bst DNAポリメラーゼを使用する、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記環状DNA分子が、複数のオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列に、切断ドメインが接している、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記オリゴヌクレオチド配列が、異なっている、請求項19に記載の方法。
  21. 工程(a)が、
    (i)切断ドメインが接している前記オリゴヌクレオチド配列を含む直鎖状DNA分子を、DNAプラスミドにクローニングする工程;
    (ii)前記プラスミドを増幅する工程;
    (iii)切断ドメインが接している前記オリゴヌクレオチド配列を含む前記DNA分子を含有する前記プラスミドの部分を切り出す工程;及び
    (iv)工程(iii)で得た前記プラスミドの前記部分を環状化する工程
    を含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
  22. 工程(ii)が、細菌へ前記DNAプラスミドをトランスフェクトし、前記細菌を増殖させる工程を含む、請求項21に記載の方法。
  23. 切断ドメインが接している前記オリゴヌクレオチド配列を含む前記直鎖状DNA分子が、各々切断ドメインを含む5'末端領域及び3'末端領域を更に含み、工程(iii)が、切断酵素で前記末端領域内の前記切断ドメインを切断する工程を含み、任意選択で前記切断酵素が、BsmBI又はBsalである、請求項21又は22に記載の方法。
  24. 前記一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを単離又は精製する工程を更に含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
  25. 一本鎖官能化オリゴヌクレオチドの作製における切断ドメインが接しているオリゴヌクレオチド配列を含む環状DNA分子の使用であって、前記切断ドメインが、切断酵素によって認識される配列を含有する、使用。
  26. 前記切断ドメインが、請求項7若しくは9から12のいずれか一項に規定の通りであり、及び/又は前記DNA分子が、請求項19に規定の通りである、請求項25に記載の使用。
  27. 請求項1から24のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキットであって、
    (i)切断ドメインが接しているオリゴヌクレオチド配列を含む環状DNA分子であって、前記切断ドメインが、ヘアピン構造を形成する能力がある配列を含む又はそれからなり、前記ヘアピン構造の二本鎖部分が、切断酵素によって認識される配列を含む、環状DNA分子;及び
    (ii)任意選択で請求項3又は4に規定される、官能化されたdNTP;及び任意選択で
    (iii)(i)の切断ドメインを切断する1つ又は複数の切断酵素
    を含む、キット。
  28. 前記切断ドメインが、請求項7、11若しくは12のいずれか一項に規定の通りであり、及び/又は前記DNA分子が、請求項19に規定の通りである、請求項27に記載のキット。
  29. (i)前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも50ヌクレオチドを含有し;及び
    (ii)前記ヌクレオチド残基の少なくとも5%が、アルキン基、アルケン基、アジド基、ハロゲン基、O-メチル基、ロックされたリボース糖から選択される官能基又はその組合せを含有する、
    請求項1から24のいずれか一項に記載の方法によって得られる一本鎖官能化オリゴヌクレオチド。
  30. 官能基を含有する前記ヌクレオチド残基の少なくとも1つが、内部残基である、請求項29に記載の一本鎖官能化オリゴヌクレオチド。
  31. 前記ヌクレオチド残基の少なくとも10%が、アルキン基、アルケン基、アジド基、ハロゲン基、O-メチル基、ロックされたリボース糖から選択される官能基又はその組合せを含有する、請求項29又は30に記載の一本鎖官能化オリゴヌクレオチド。
  32. 請求項1から24のいずれか一項に記載の方法によって得られる一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを複数含むライブラリであり、前記ライブラリが、請求項29から31のいずれか一項に記載の一本鎖官能化オリゴヌクレオチドを含む、ライブラリ。
  33. 単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション(smFISH)における使用のための一本鎖官能化オリゴヌクレオチドのプールを作製する方法であって、前記官能化されたヌクレオチドが、蛍光標識されたヌクレオチドであり、前記プール中の各一本鎖官能化オリゴヌクレオチドが、約15～30、好ましくは約20～25ヌクレオチドを含有する、請求項1から3又は7から24のいずれか一項に記載の方法。
  34. 単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション(smFISH)における使用のための一本鎖官能化オリゴヌクレオチドのプールを作製する方法であり、前記官能化されたヌクレオチドが、クリック化学に関与する能力がある化学基を含むヌクレオチドであり、前記方法が、クリック化学によって各官能化されたオリゴヌクレオチド中の少なくとも1つの官能化されたヌクレオチドに蛍光標識をコンジュゲートする工程を更に含み、前記プール中の各一本鎖官能化オリゴヌクレオチドが、約15～30、好ましくは約20～25ヌクレオチドを含有する、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
  35. クリック化学に関与する能力がある化学基を含む前記ヌクレオチドが、アジド基、アルキン基、アルケン基、ニトロン基、テトラジン基若しくはテトラゾール基、又はその組合せを含むヌクレオチドである、請求項34に記載の方法。
  36. クリック化学によって各官能化されたオリゴヌクレオチド中の少なくとも1つの官能化されたヌクレオチドに蛍光標識をコンジュゲートする前記工程が、前記官能化されたオリゴヌクレオチドが標的配列を含む核酸分子にハイブリダイズされる前に実施される、請求項34又は35に記載の方法。
  37. クリック化学によって各官能化されたオリゴヌクレオチド中の少なくとも1つの官能化されたヌクレオチドに蛍光標識をコンジュゲートする前記工程が、前記官能化されたオリゴヌクレオチドが標的配列を含む核酸分子にハイブリダイズされた後に実施される、請求項34又は35に記載の方法。
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US6077668A (en) * 1993-04-15 2000-06-20 University Of Rochester Highly sensitive multimeric nucleic acid probes
GB0018120D0 (en) 2000-07-24 2000-09-13 Fermentas Ab Nuclease
EP1871907A4 (en) * 2005-03-31 2009-05-13 Hamilton Thorne Biosciences In ABSTRACT NUCLEIC ACID EFFERS AND AMPLIFICATION PROCESS
WO2006108422A2 (en) * 2005-04-12 2006-10-19 In Situ Rcp A/S Under Founding Methods for production of oligonucleotides
US8080393B2 (en) * 2005-04-12 2011-12-20 Olink Ab Methods for production of oligonucleotides
US9476089B2 (en) * 2012-10-18 2016-10-25 President And Fellows Of Harvard College Methods of making oligonucleotide probes
CN103276074B (zh) * 2013-05-21 2015-08-19 昆山彭济凯丰生物科技有限公司 一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法
GB201321123D0 (en) * 2013-11-29 2014-01-15 Linea Ab Q Amplification of circular molecules
EP3146082A4 (en) * 2014-05-20 2018-05-16 Sens Foundation, Inc. High throughput telomeric circle assay
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