CN113366105A - 一种用于在细胞内筛选体外展示文库的方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于针对文库的小分子化合物结合实体与感兴趣的蛋白质或RNA靶标的细胞内结合筛选体外展示文库、以便鉴定所述文库中能够在所述细胞内结合所述感兴趣的蛋白质或RNA靶标的至少一种单独化合物结合实体的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于针对文库的小分子化合物结合实体与感兴趣的蛋白质或RNA靶标的细胞内结合来筛选体外展示文库,以便鉴定所述文库中能够细胞内结合感兴趣的蛋白质或RNA靶标的至少一种单独化合物结合实体的方法。
背景技术
已经开发了展示技术以组合核酸的信息存储和扩增能力与其他化合物的功能活性。展示技术依赖于功能结合实体(即表型)与提供关于结合实体结构的信息的核酸序列(基因型)之间的关联。注:核酸适体技术被认为是一种展示技术,但特例为表型和基因型由同一分子(DNA或RNA)组成。
此类方法的优点是可以构建非常大型的文库,并且针对功能结合实体的所需活性进行探查。然后,可以将具有所需活性的文库成员与不具有所需活性的文库成员分开,从而产生富集文库,其具有更大部分的具有所需活性的成员。这种过程被称为选择或富集。一些展示技术允许多轮选择,其中对来自一轮的富集文库进行扩增并用于制备新的富集展示文库和用于下一轮选择,等等。然后,富集文库中的文库成员的结构可以通过其同源核酸序列进行鉴定,从而允许甚至从微量的材料进行鉴定。
本文的相关文库可以根据现有技术称为“体外展示文库”。
术语“体外展示文库”在本文中应当根据现有技术来理解–即理解为包含许多不同的结合实体的文库,其中每个结合实体连接到核酸分子,并且所述核酸分子包含允许鉴定所述结合实体的特定核酸序列信息–即一旦知晓所述核酸分子的所述特定核酸序列信息即可直接知晓连接到所述核酸分子的所述特定结合实体的结构–连接到所述核酸分子(基因型)的所述结合实体(即表型)的结构在本文中被称为B-结构。
当所连接的核酸分子是DNA分子时–术语“体外展示文库”在本领域中有时可以称为“DNA编码文库(DEL)”。术语“结合实体”在本领域中有时可以称为“配体”。
现有技术描述了许多不同的制备此类体外展示文库的方法-本文合适的实例包括例如EP1809743B1(Vipergen-(yR)文库技术);EP1402024B1(Nuevolution);EP1423400B1(David Liu);Nature Chem.Biol.(2009),5:647-654(Clark);WO 00/23458(Harbury);Nature Methods(2006),3(7),561-570,2006(Miller);Nat.Biotechnol.2004;22,568–574(Melkko);Nature.(1990);346(6287),818-822(Ellington);或Proc Natl Acad Sci USA(1997).94(23):12297-302(Roberts);WO06053571A2(Rasmussen)。
例如上述提到的现有技术中所描述的–今天可以制备包含非常多(例如1015种)特定结合实体(例如1015种不同的化合物)的体外展示文库。
鉴于此高数量的特定结合实体–很明显,此类文库用于制备富集文库的选择/富集步骤将是重要的–例如以更高效地能够鉴定结合感兴趣的靶标(例如医学上重要的受体分子)的特定结合实体(例如化合物)的结构。
在EP2622073B1(Vipergen)的图3中显示了如EP1809743B1(Vipergen-(yR)文库技术)中所述的体外展示技术的实例–如在EP2622073B1的该图3中可见的,该实例的选择步骤通过将靶标(例如受体)固定至固相表面(例如珠或玻璃板)来进行,并且通常洗掉未结合物和低亲和性结合物,而将富集结合物的群体从固相支持物回收。此类基于固相支持物的选择/富集方法的许多实例在本领域中得到描述。
EP2622073B1(Vipergen)同样涉及改进的基于体外展示的方法以便制备富集文库,所述方法称为共区室化的富集(ECC)或可替代地称为Binder Trap(BTE)–参见例如EP2622073B1的图1-2或Vipergen公司主页:http://www.vipergen.com。
如上文所论述的,在许多现有技术描述的“体外展示文库”方法中-特定结合实体(例如化合物)与感兴趣的靶标(例如医学上重要的受体分子)结合的选择/富集步骤以可以称为依赖于纯化的异源表达蛋白质的方式在非天然的人工环境中-诸如例如通过将靶标(例如受体)固定到固相表面(例如珠或玻璃板)进行。
关于这种所谓人工环境下的结合/选择-Lynn MM等人的文章(“Identificationof Ligand-Target Pairs from Combined Libraries of Small Molecules andUnpurified Protein Targets in Cell Lysates”;J.Am.Chem.Soc.2014,136,3264-3270)写着“在固定化靶标上的选择结果可能缺乏采用非天然构象的蛋白质的生物学相关性或缺乏在从细胞环境中取出时对其功能至关重要的结合配偶体或辅因子”。
鉴于此,Lynn的文章描述了所谓的相互作用确定,其使用未纯化蛋白质(IDUP)方法从DNA连接配体和细胞裂解物中的未纯化蛋白质靶标的一锅混合物中鉴定配体+靶标对。
Zining Wu等人的文章(“Cell-Based Selection Expands the Utility of DNA-Encoded Small-Molecule Library Technology to Cell Surface Drug Targets..”;ACSComb.Sci.2015,17,722-731)描述了用于从小分子DNA编码文库(DEL)中鉴定针对细胞表面靶标的高亲和力和选择性配体–即其中结合是在细胞表面上进行,同样不是在细胞内。
M.Schurmann等人的文章(“Small-Molecule Target Engagement in Cells”;Cell Chemical Biology 23,2016年4月21日)描述,可以将单一特定小分子化合物引入细胞中,并且然后有时可以鉴定/检测该单一(一种特定)化合物是否与靶标(例如受体)结合。
如由本发明背景下的技术人员理解的–该M.Schurmann文章不涉及用于筛选体外展示文库(诸如例如DNA编码文库)的文库–包含许多(例如1010)种不同结合实体的文库的方法。
简言之,该M.Schurmann文章基本上涉及其中已经知晓感兴趣的小分子结合感兴趣的靶标(例如受体)的情况,并且基本上仅想要确认在感兴趣的细胞内的此举或想要研究结合实际上发生在细胞的哪个地方(例如哪个区室中)。
总之并且在不受理论限制的情况下–本发明人相信,没有现有技术直接且明白地描述用于针对体外展示文库(例如DNA编码文库(DEL))的小分子化合物结合实体与感兴趣的蛋白质或RNA靶标的细胞内结合筛选所述文库–即其中使特定结合实体(例如化合物)与感兴趣的靶标(例如医学上重要的受体分子)
结合的文库选择/富集步骤是在细胞内进行的方法。
发明内容
本发明要解决的问题可以被视为提供用于针对感兴趣的小分子化合物与感兴趣的靶标(例如药学上相关的受体)的结合筛选体外展示文库的改进方法。
大多数先前的DNA编码文库(DEL)筛选实例都是对从细胞环境中取出的重组纯化蛋白质进行。所述纯化蛋白质可能缺乏对其功能至关重要的结合配偶体或辅因子,并且采用非天然构象。因此,在对细胞环境之外的纯化蛋白质的DEL筛选中鉴定的化学结合实体可能缺乏生物学相关性。在本发明中,对细胞内表达的蛋白质进行DEL筛选。在细胞内,感兴趣的蛋白质可以与天然环境中的至关重要结合配偶体和辅因子相互作用。因此,从细胞内的DEL筛选中鉴定出的化学结合实体具有更高的为生物活性的机会。后者对于将应用于药物发现的化学结合实体特别重要。
本发明允许对细胞内表达的蛋白质进行DEL筛选。因此,本发明不依赖于获得重组表达和纯化的蛋白质的费力方案,该费力方案是大多数先前的DEL筛选实例所需要的。
本文的工作实施例中描述了本发明人如何在细胞内(即非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞内)成功进行体外展示文库(DNA编码文库)的筛选以及鉴定所述文库中能够在细胞内结合所述感兴趣的蛋白质靶标的多种单独化合物结合实体(配体)。
如上文所论述的并且在不受理论限制的情况下–本发明人相信,没有现有技术直接且明白地描述这种“细胞内”方法–即其中使特定结合实体(例如化合物)与感兴趣的靶标(例如医学上重要的受体分子)结合的文库选择/富集步骤是在细胞内进行的方法。
在不受理论限制的情况下–可以获得在本文的工作实施例中所述的“细胞内”非常积极的筛选结果(参见例如本文实施例1的结论)对于本发明人初看起来不是明显的。
对于此的一个理由涉及,本领域中已知细胞内的“蛋白质密度”是非常高的,因为细胞包含许多蛋白质和其他区室–例如阅读Ron Milo的文章(“What is the total numberof protein molecules per cell volume?..”;Bioessays 35:1050–1055,2013):“在细菌、真菌和哺乳动物细胞中我们估计出2-4亿种蛋白质/立方微米(即1fL)的范围”。
关于本发明的用于筛选体外展示文库的方法-细胞内的高“蛋白质密度”由技术人员初看起来将认为是一个问题,因为体外展示文库包含许多(例如1010种)不同的化合物结合实体并且文库内的大量“良好结合物”实际上将能够发现感兴趣的靶标(例如受体)并且从而结合所述感兴趣的靶标乍看起来将被认为是不可信的。
换句话说,在本“细胞内”发明的公开之前-可能初看起来相信了没有(或仅非常少)的文库化合物结合实体将实际上能够发现并且从而结合细胞内的感兴趣的靶标(例如受体)–即在这种情况下,“细胞内”的文库结合物筛选将不是相关/有用的,因为将鉴定不出所述文库的代表量的良好结合物化合物。
如本文所论述的-通过使用本发明的“细胞内”文库筛选方法,本发明人鉴定出许多单独的不同良好结合物化合物结合实体–所述文库的可接受代表性高数量的良好结合物化合物。
因此,本发明的一个相关技术贡献可以被视为关于以下事实:本发明证明实际上可以成功在细胞内进行体外展示文库(DNA编码文库)的筛选并且从而鉴定所述文库中可接受代表性高数量的能够在细胞内结合感兴趣的蛋白质靶标的单独化合物结合实体(配体)。
在本文的工作实施例中,所使用的细胞是非洲爪蟾卵母细胞。
然而,上文论述的细胞内的“蛋白质密度”可能问题/缺陷可以被视为不仅是与非洲爪蟾卵母细胞相关的问题–相反,其可以被视为对于几乎任何感兴趣的细胞所关注的普遍问题。
因此,据信本文的工作实施例证明本发明的方法对非洲爪蟾卵母细胞起作用的事实使得以下是可信的:所述方法也将在大量的其他不同细胞类型(例如其他真核细胞类型诸如例如人(例如CHO)细胞)中起作用。
因此,本发明的第一方面涉及用于针对体外展示文库的小分子化合物结合实体与感兴趣的蛋白质或RNA靶标的细胞内结合筛选所述文库以便鉴定所述文库中能够在所述细胞内结合所述感兴趣的蛋白质或RNA靶标的至少一种单独化合物结合实体的方法,并且其中所述方法包括以下步骤:
(i):在细胞中表达至少一种靶标Tn,其中n=1或更多,并且其中所述至少一种靶标是蛋白质或RNA-所述靶标的结构在本文中称为T-结构;
(ii):将体外展示文库引入(i)的所述细胞中,其中:
(a):所述文库是具有至少1000种不同的结合实体Bn的文库,其中n=1000或更多,其中每种结合实体连接到核酸分子并且所述核酸分子包含允许鉴定所述结合实体的特定核酸序列信息–其中一旦知晓所述核酸分子的所述特定核酸序列信息即可直接知晓连接到所述核酸分子的所述特定结合实体的结构,并且其中所述文库的所述结合实体是平均分子量MW低于10000道尔顿的化合物-连接到所述核酸分子的所述结合实体的结构在本文中称为B-结构;并且
(b):在结合条件下将所述文库引入所述细胞中,所述条件是其中含有能够结合靶标分子的结合实体的B-结构与含有不能结合相同靶标的结合实体的B-结构相比更高效地结合相应的T-结构的条件,并且其中在所述细胞内得到所述结合实体中的至少一种与至少一种靶标的结合,从而在所述细胞内产生包含B-结构结合至T-结构的复合物,所述复合物称为B结合至T-结构;
(iii):进行(ii)的所述细胞的裂解以分解细胞膜,以便:
(A):从所述细胞中得到(ii)的所述B结合至T-结构并且从而获得包含B结合至T-结构的溶液,其中所述B结合至T-结构不在所述细胞内;或者
(B):从所述细胞中得到在步骤(ii)中已结合至靶标的并且在步骤(iii)之前已被标记的B-结构,所述标记以使得可区分标记的B-结构与在步骤(ii)中未结合至靶标的B-结构的方式进行,并且从而获得包含结合物标记的B-结构的溶液,其中所述结合物标记的B-结构不在所述细胞内;并且
(iv):经由使用(iii)的所述溶液和包含允许鉴定所述B-结构的所述结合实体的所述特定核酸序列信息的所述核酸分子,以鉴定在(ii)的所述细胞内结合至少一种感兴趣的靶标的至少一种单独结合实体。
涉及在细胞中表达至少一种靶标的步骤(i)可以根据本领域进行–在感兴趣的细胞中表达感兴趣的蛋白质或RNA靶标对于技术人员而言是常规工作。
常常,可能优选的是,所述靶标是异源的表达靶标。
根据本领域-术语“异源”涉及将靶标(例如蛋白质)以实验方式放进通常不产生(即表达)该靶标(例如蛋白质)中。
然而,在一些情况下,可能优选的是,所述靶标是在所述细胞中天然表达的靶标–例如在人(例如CHO)细胞中自然表达的人受体靶标。在一些情况下,可能优选的是,所述靶标在源自转基因宿主的细胞中表达–例如人受体靶标的修饰形式。
如上文所论述的,现有技术描述了许多不同的同样地制备体外展示文库的方法–因此,步骤(ii)的同样地制备体外展示文库可以根据用于制备此类体外展示技术的已知现有技术来进行。
步骤(ii)是指“将体外展示文库引入(i)的所述细胞中”–基本上该步骤可以基于现有技术已知的技术进行。
如本文的工作实施例中所论述的–当所述细胞是非洲爪蟾卵母细胞时,可以经由现有技术已知的注射技术将文库引入卵母细胞中,并且没有理由相信注射(例如微注射)不会在大量其他哺乳动物细胞类型中起作用。
可替代地且根据感兴趣的细胞类型-它可以例如通过转染(例如电穿孔或基于化学的)来进行。
根据步骤(ii)(b)鉴定合适的“结合条件”对于技术人员而言是常规工作。
本质上,步骤(ii)(b)的“结合条件”通常是细胞内的天然结合条件–本发明的优点之一在于,结合实体(配体)可以在步骤(ii)(b)的可以是细胞结合条件内天然的“结合条件”下结合靶标。
步骤(iii)是指“进行(ii)的所述细胞的裂解以分解细胞膜”–基本上该步骤可以基于现有技术已知的技术进行。
另外,步骤(iv)可以基于如例如上文所论述的现有技术已知的技术进行。
简言之且如本文进一步详细论述的,步骤(iv)的该“……鉴定在(ii)的所述细胞内结合至少一种感兴趣的靶标的至少一种单独结合实体”可以以不同的方式和基于公知常识和本文的技术教导进行,进行该步骤(iv)对于技术人员而言是常规工作。
简言之,基于本文的详细描述和公知常识–技术人员可以以多种不同的方式/实施方式进行第一方面的单独步骤(i)至步骤(iv)中的全部。
仅以举例的方式在下文描述了本发明的实施方式。
附图说明
图1:本文的第一方面(即权利要求1)的方法的实施方式的例示性实施例。
图2:本文的第一方面(即权利要求1)的方法的实施方式的例示性实施例,其中使用了猎物(Prey)-诱饵(Bait)。
图3:本文的工作实施例1的结果–关于另外的细节,参见实施例1。
具体实施方式
第一方面的步骤(i)
如上文所论述的,步骤(i)写着:
“(i):在细胞中表达至少一种靶标Tn,其中n=1或更多,并且其中所述至少一种靶标是蛋白质或RNA-所述靶标的结构在本文中称为T-结构”
靶标可以是任何合适的感兴趣的蛋白质或RNA靶标。
如上文所论述的,在感兴趣的细胞中表达感兴趣的蛋白质或RNA靶标对于技术人员而言是常规工作。
如本文的工作实施例中所论述的以及如本领域中已知的–当所述细胞是非洲爪蟾卵母细胞时,所述靶标的表达可以通过注射mRNA来进行并且其可能是优选的。
然而,细胞中靶标的表达可以以其他熟知的合适方式,如经由感兴趣的细胞中感兴趣的靶标的常规重组表达(经由例如使用由例如DNA制得的表达载体)来进行。
常常,可能优选的是,所述靶标是异源的表达靶标。
根据本领域-术语“异源”涉及将靶标(例如蛋白质)以实验方式放进通常不产生(即表达)该靶标(例如蛋白质)中。
在一些情况下,可能优选的是,所述靶标在细胞内的特定细胞区室中–例如在细胞核中异源表达。对于技术人员而言,这可以通过在靶标构建体中安置前导序列或信号序列来进行。
优选地,所述靶标是蛋白质。
如本技术中已知的–合适的靶标可以例如是存在于例如人体的受体分子并且将会对鉴定可以结合所述受体的结合实体(例如化合物)感兴趣。
因此,所述靶标可以优选地是受体,诸如例如受体蛋白分子。
根据现有技术-合适的实例可以是其中所述靶标是自身抗原、细菌蛋白、血蛋白、细胞粘附蛋白、细胞因子、细胞骨架蛋白、DNA-结合蛋白、发育蛋白、工程化蛋白、酶、细胞外基质蛋白、GTP-结合蛋白调节剂、糖蛋白、生长因子、热休克蛋白、脂蛋白、膜蛋白、金属蛋白、马达蛋白、磷蛋白、朊病毒、蛋白质复合物、蛋白结构域、RNA结合蛋白、受体、重组蛋白质、种子贮藏蛋白、结构蛋白、转录共调节蛋白、转运蛋白、病毒蛋白或其片段。
简言之,技术人员知晓在本发明背景下可感兴趣的许多不同的可能靶标。
在一些情况下,可能优选修饰表达的靶标蛋白–例如通过磷酸化、甲基化、乙酰化或脱磷酸化。通过技术人员,这可以通过与靶标蛋白一起共表达修饰酶–例如激酶、甲基转移酶、乙酰转移酶或磷酸酶来进行。
如上文所论述的,据信本文的工作实施例证明当所述细胞是非洲爪蟾卵母细胞时本发明的方法起作用的事实使得以下是可信的:所述方法也将在大量的其他不同细胞类型(例如其他真核细胞类型诸如例如人(例如CHO)细胞)中起作用。
优选地,所述细胞是真核细胞,诸如例如哺乳动物细胞,优选地其中哺乳动物细胞是人(例如CHO)。
在本文的工作实施例中显示,可以将包含许多不同的结合实体的体外展示文库引入(经由注射)单一单独细胞(即非洲爪蟾卵母细胞)中。
因此,在优选的实施方式中,所述细胞是爪蟾属卵母细胞,诸如例如热带爪蟾(Xenopus tropicalis)卵母细胞或非洲爪蟾卵母细胞–最优选地细胞是非洲爪蟾卵母细胞。
术语步骤(i)的“细胞”可以是单一细胞(例如当所述细胞是非洲爪蟾卵母细胞时)。
然而,如由本发明背景下的技术人员所理解的,术语步骤(i)的“细胞”在实践中常常可以是指细胞群体,其中所述群体中的单独细胞重组表达感兴趣的靶标。
例如,其中所述靶标通过使用例如在感兴趣的细胞类型(例如人CHO细胞)中以标准/常规重组表达靶标的表达载体来表达,这通常将产生细胞群体,其中所述群体中的单独细胞重组表达感兴趣的靶标。
第一方面的步骤(i)写着“至少一种靶标Tn,其中n=1或更多”。
如本文所述的方法的优点在于,可以以高效且快速的方式同时筛选可结合例如两种或更多种靶标的结合实体。
例如–所述靶标可以是两种不同的受体分子,并且如本文所述的方法然后可以同时鉴定结合一种受体的一种结合实体和结合另一种受体的另一种结合实体。
在上文的实例中(具有两种不同的例如受体靶标),我们将有一种情况,其中靶标Tn(n=2)或可替代地表示为T2。
基于上文-可能相关的是在步骤(i)中具有至少两种不同的靶标[即Tn(n=2或更多],或者在步骤(i)中具有至少三种不同的靶标[即Tn(n=3或更多],或者在步骤(i)中具有至少十种不同的靶标[即Tn(n=10或更多],或者在步骤(i)中具有至少一百种不同的靶标[即Tn(n=100或更多]。
在不受理论限制的情况下,可能很难在步骤(i)中具有超过1000种不同的靶标–即细胞中的超过1000种不同的T-结构。
第一方面的步骤(ii)
如上文所论述的,步骤(ii)涉及:
“(ii):将体外展示文库引入(i)的所述细胞中,其中:
(a):所述文库是具有至少1000种不同的结合实体Bn的文库,……并且其中所述文库的所述结合实体是平均分子量MW低于10000道尔顿的化合物;并且
(b):将所述文库在结合条件下引入所述细胞中,……”
步骤(ii)是指“将体外展示文库引入(i)的所述细胞中”–基本上该步骤可以基于现有技术已知的技术进行。
如本文的工作实施例中所论述的–当所述细胞是非洲爪蟾卵母细胞时,可以经由现有技术已知的注射技术将文库引入卵母细胞中,并且没有理由相信注射(例如微注射)不会在大量其他哺乳动物细胞类型中起作用。
可替代地且根据感兴趣的细胞类型-它可以例如通过转染(例如电穿孔或基于化学的)来进行。
在本文的工作实施例中显示,可以将包含许多(大约108种)不同的结合实体的体外展示文库引入(经由注射)单一单独细胞(即非洲爪蟾卵母细胞)中。
术语步骤(ii)的“所述细胞”可以是单一细胞(例如当所述细胞是非洲爪蟾卵母细胞时)。
然而,如上文所论述的,步骤(i)的术语“细胞”在实践中常常可以是指细胞群体,并且在这种情况下术语步骤(ii)的“所述细胞”在实践中可以是步骤(i)的细胞群体。
如由本发明背景下的技术人员所理解的–如果在步骤(ii)中例如通过例如转染将例如106种不同的结合实体的体外展示文库引入至步骤(i)的细胞群体(例如具有重组表达靶标的人CHO)中,则可以将不同数量的结合实体引入所述群体中的每个细胞中–诸如例如所述群体中的一些细胞可以包含少于5种结合实体(例如一种结合实体)并且所述群体的其他细胞可以包含超过1000种不同的结合实体。
术语“体外展示文库”应当根据现有技术来理解–即理解为包含许多不同的结合实体的文库,其中每个结合实体连接到核酸分子,并且所述核酸分子包含允许鉴定所述结合实体的特定核酸序列信息–即一旦知晓所述核酸分子的所述特定核酸序列信息即可直接知晓连接到所述核酸分子的所述特定结合实体的结构–连接到所述核酸分子(基因型)的所述结合实体(即表型)的结构在本文中被称为B-结构。
当所连接的核酸分子是DNA分子时–术语“体外展示文库”在本领域中有时可以称为“DNA编码文库(DEL)”。
术语“结合实体”在本领域中有时可以称为“配体”。
如本文所论述的–现有技术描述了许多不同的制备此类体外展示文库–即步骤(i)的体外展示文库的方法。
换句话说,今天适当地制备连接到核酸分子(基因型)的结合实体(即表型)的结构–即在本文中称为“B-结构”的结构对于技术人员而言是常规工作。
正如本领域中已知的-结合实体(即表型)可以通过例如共价结合或例如高亲和力非共价结合而连接到核酸分子(基因型)。
在本文中可能优选的是,结合实体(即表型)通过共价结合而连接到核酸分子(基因型)。
步骤(i)的体外展示文库包括许多不同的B-结构–即基于上文,制备步骤(i)的体外展示文库对于技术人员而言是常规工作。
本文合适的实例包括例如EP1809743B1(Vipergen);EP1402024B1(Nuevolution);EP1423400B1(David Liu);Nature Chem.Biol.(2009),5:647-654(Clark);WO 00/23458(Harbury);Nature Methods(2006),3(7),561-570,2006(Miller);Nat.Biotechnol.2004;22,568–574(Melkko);Nature.(1990);346(6287),818-822(Ellington);或Proc NatlAcad Sci USA(1997).94(23):12297-302(Roberts)。
换句话说,第一方面的步骤(i)的体外展示文库可以以如现有技术中所述的多种方式制备。
在不受理论限制的情况下–本文合适的体外展示文库技术实例包括DNA编码化学文库技术、适体技术、RNA/DNA展示技术诸如CIS展示、核糖体展示、mRNA展示或珠展示系统(使用核酸用于编码)。
如现有技术中所述的(参见例如EP1809743B1(Vipergen))–B-结构的核酸分子可以是例如PNA、LNA、RNA、DNA或其组合。优选地,B-结构的核酸分子是DNA。
在本发明的优选实施方式中,B-结构中连接到结合实体(表型)的核酸分子(基因型)可以是双链核酸分子。
在本发明的优选的实施方式中,B-结构中连接到结合实体(表型)的核酸分子(基因型)可以是为至少0%双链的(即单链的),可以是至少10%双链、至少20%双链、至少30%双链、至少40%双链、至少50%双链、至少60%双链、至少70%双链、至少80%双链、至少90%双链或100%双链的。
在本发明的优选实施方式中,B-结构中连接到结合实体(表型)的核酸分子(基因型)可以含有一个PCR引发位点或其一部分。
在本发明的优选实施方式中,B-结构中连接到结合实体(表型)的核酸分子(基因型)可以含有2个PCR引发位点或其一部分。
在本发明的优选实施方式中,B-结构中连接到结合实体(表型)的核酸分子(基因型)可以含有至少3个PCR引发位点或其一部分。
在本发明的一些实施方式中,PCR引发位点的一部分包括至少5个核酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸或至少20个核苷酸。
在本发明的一些实施方式中,B-结构中连接到结合实体(表型)的核酸分子(基因型)可以含有与如本文所述的方法中使用的另一相关核酸分子(基因型)(例如如下文论述的连接至诱饵的核酸分子)的单链突出端反向互补的单链突出端。突出端可以优选地是1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸或10个核苷酸长。
结合实体可以是任何合适的感兴趣的结合实体,其中文库的结合实体是平均分子量MW低于10000道尔顿、更优选地平均分子量MW低于5000道尔顿、甚至更优选地平均分子量MW低于1000道尔顿的化合物。
本文相关的化合物结合实体的合适实例可以在现有技术中找到-参见例如EP1809743B1(Vipergen);EP1402024B1(Nuevolution);EP1423400B1(David Liu);NatureChem.Biol.(2009),5:647-654(Clark);WO 00/23458(Harbury);Nature Methods(2006),3(7),561-570,2006(Miller);Nat.Biotechnol.2004;22,568–574(Melkko);Nature.(1990);346(6287),818-822(Ellington);或Proc Natl Acad Sci USA(1997).94(23):12297-302(Roberts)。
简言之,技术人员知晓在本发明背景下可感兴趣的许多不同的可能结合实体。
第一方面的步骤(ii)写着“至少1000种不同的结合实体靶标Bn,其中n=1000或更多”。
在实践中,在步骤(i)的文库中可能常常存在更多种不同的结合实体–诸如例如至少104、至少106或至少108种不同的结合实体–即其中n=至少104,n=至少106或n=至少108。
在本文的工作实施例中显示,可以将包含许多(大约108种)不同的结合实体的体外展示文库引入(经由注射)单一单独细胞(即非洲爪蟾卵母细胞)中。
因此,在理论上的情况下,其中所述文库包含确切的104种不同的结合实体–本文中可以可将此表达为Bn(n=104)或B10 4。
在不受理论限制的情况下,可能很难制备具有超过1020种不同的结合实体的文库。
步骤(ii)(b)写着:
“(b):在结合条件下将所述文库引入所述细胞中,所述条件是其中含有能够结合靶标分子的结合实体的B-结构与含有不能结合相同靶标的结合实体的B-结构相比更高效地结合相应的T-结构的条件,并且其中在所述细胞内得到所述结合实体中的至少一种与至少一种靶标的结合,从而在所述细胞内产生包含B-结构结合至T-结构的复合物,所述复合物称为B结合至T-结构”。
术语“更高效地结合”应当根据普通实践理解,例如更高的亲和力、更快的结合速率或更慢的解离速率。
如技术人员已知的-在本发明背景下,在条件下进行步骤(ii)(b)对于技术人员而言是常规工作,其中得到这个“更高效地结合”效果。
优化步骤(ii)(b)的结合条件以便得到所需的步骤(ii)(b)的“更高效地结合”效果对于技术人员而言将是常规工作。
如上文所论述的,步骤(ii)(b)的“结合条件”通常是细胞内的天然结合条件–本发明的优点之一在于,结合实体(配体)可以在步骤(ii)(b)的可以是细胞结合条件内天然的“结合条件”下结合靶标。
如技术人员已知的–本文的相关优化参数可以是例如离子强度、温度等。
因此,在本文的任何实际相关情况中–无论技术人员(在例如结合条件的适当常规调整之后)在步骤(ii)(b)的结合条件下工作与否,他将不会有任何合理的疑问。
在优选的实施方式中,步骤(ii)(b)在结合条件下进行,其中含有能够结合靶标分子的结合实体的B-结构与含有不能结合相同靶标的结合实体的B-结构相比10倍(更优选地100倍、甚至更优选地1000倍)更高效地结合相应T-结构。
如本文所述的方法允许针对结合实体与靶标的结合优化主要结合特征。例如,结合实体和靶标的效力(亲和力)、缔合速率(结合速率)或解离半衰期(解离速率)。
基于亲和力的选择在结合步骤(ii)(b)中例如通过使用平衡条件实现,并且由结合步骤中的靶标浓度控制–例如,其中展示文库中Kd比靶标浓度小10倍的结合实体的90%分子是靶标结合的结合条件,或者其中展示文库中Kd比靶标浓度小2倍的结合实体的90%分子是靶标结合的结合条件。
在本发明的优选的实施方式中-在“结合步骤步骤(ii)(b)”中T-结构的浓度是至少10-15M、至少10-14M、至少10-13M、至少10-12M、至少10-11M、至少10-10M、至少10-9M、至少10-8M、至少10-7M、至少10-6M、至少10-5M、或至少10-4M。
在本文的工作实施例(参见下文)中,“结合步骤”步骤(ii)(b)中T-结构的浓度是大约200x10-9M。
可替代地,基于缔合速率的选择通过控制对于结合步骤步骤(ii)(b)允许的时间来实现–因此,“结合步骤”可以进行比达到结合平衡条件所需的时间更短的时间段。
第一方面的步骤(iii)
如上文所论述的,步骤(iii)写着:
“(iii):进行(ii)的所述细胞的裂解以分解细胞膜,以便:
(A):从所述细胞中得到(ii)的所述B结合至T-结构并且从而获得包含B结合至T-结构的溶液,其中所述B结合至T-结构不在所述细胞内;或者
(B):从所述细胞中得到在步骤(ii)中已结合至靶标的并且在步骤(iii)之前已被标记的B-结构,所述标记以使得可区分标记的B-结构与在步骤(ii)中未结合至靶标的B-结构的方式进行,并且从而获得包含结合物标记的B-结构的溶液,其中所述结合物标记的B-结构不在所述细胞内”。
步骤(iii)是指“进行(ii)的所述细胞的裂解以分解细胞膜”–基本上该步骤可以基于现有技术已知的技术,诸如例如通过机械粉碎(例如离心或吸移)或通过化学裂解(例如通过使用SDS溶解膜)进行。
鉴于技术人员的公知常识和本文的技术教导(参见例如下面)–技术人员可以以许多不同的适合方式进行步骤(iii)。
如由技术人员所理解的和本文所论述的-使用选项步骤(iii)(A)还是步骤(iii)(B)可以被视为与进行鉴定步骤(iv)的优选方式相关。
可能优选的是,步骤(iii)是步骤(iii)(A)。
如本文的图1中所展示–在其中步骤(iii)是步骤(iii)(A)的情况下,例如可以的是,步骤(iv)通过以下方式进行:
-经由将B结合至T-结构的靶标与固相支持物结合以使(iii)(A)的所述溶液的所述B结合至T-结构与所述固相支持物结合,并且去除未结合至靶标并从而未结合至所述固相支持物的B-结构;以及
-经由使用允许鉴定结合至所述固相支持物的所述B结合至T-结构的所述结合实体的所述特定核酸序列信息,以鉴定在(ii)的所述细胞内结合至少一种感兴趣的靶标的至少一种单独结合实体。
如本文的图2中所展示并且在本文的工作实施例中–在其中步骤(iii)是步骤(iii)(A)的情况下,如本文所述的方法可以优选地通过下述方法来进行,在所述方法中:
-第一方面的(i)的所述T-结构包含猎物(例如靶标-猎物融合蛋白)并且在第一方面的步骤(ii)中还引入了连接到核酸分子(其例如具有与所述B-结构的所述核酸分子互补的粘性末端)的诱饵,并且所述核酸分子包含允许鉴定所述特定靶标的特定核酸序列信息并且其中所述诱饵在步骤(ii)中结合所述靶标的所述猎物并且从而产生其中所述诱饵结合至所述靶标猎物的B结合至T-结构;
-在裂解步骤(iii)(A)之后-将所述B结合至T-结构的所述核酸分子与结合至所述靶标猎物的所述诱饵融合(例如通过经由使用连接酶的连接),其中所述融合核酸分子包含允许鉴定结合实体和靶标的序列信息;以及
-在步骤(iv)中经由使用允许鉴定前一步骤的所述融合(例如连接)核酸分子的所述结合实体和靶标的所述特定核酸序列信息,以鉴定在(ii)的所述细胞内结合至少一种感兴趣的靶标的至少一种单独结合实体。
在所述“将所述B结合至T-结构的所述核酸分子与结合至所述靶标猎物的所述诱饵融合(例如通过经由使用连接酶的连接)”步骤之前,可能优选进行稀释步骤(例如,对获自细胞裂解步骤(iii)的所述溶液(例如悬浮液)的稀释步骤。
可能优选的是,对获自细胞裂解步骤(iii)(优选地步骤(iii)(A))的所述溶液(例如悬浮液)的稀释步骤是将所述溶液稀释至少102倍,诸如至少103倍、至少104倍或至少105倍。
在本文的工作实施例(参见下文)中,将所述溶液稀释大约104倍。
该稀释步骤的优点在于,未结合的B和T-结构(即本身的单独B和T-结构)可以在稀释之后彼此在溶液中在物理上甚至进一步分开,并且然后在“融合所述B结合至T-结构的所述核酸分子”步骤之后将存在较少“假阳性”。
在“将所述B结合至T-结构的所述核酸分子与结合至所述靶标猎物的所述诱饵融合(例如通过经由使用连接酶的连接)”步骤之前,可能优选的是进行所述融合(例如连接)核酸分子的纯化–例如以便具有更纯的核酸分子(例如DNA)用于例如随后扩增(例如经由PCR)步骤。
本领域技术人员能够为了纯化感兴趣的核酸分子(例如DNA)而常规地鉴定许多不同的策略,例如但不限于:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、离心柱(spun-column)等。
“鉴定”步骤(iv)优选地包括以下步骤,其中对包含关于结合实体和靶标的序列信息的所述融合核酸分子进行扩增(优选地通过使用聚合酶链反应(PCR))。
显然,如果在步骤(i)中仅存在一种靶标(即n=1,则至少一种单独结合实体的鉴定基本上通过使用允许鉴定所述结合实体的特定核酸序列信息来进行。
本文相关生物技术领域内的现有技术描述了许多本文合适的“猎物-诱饵”系统,诸如例如:
-猎物:四聚体链霉亲和素和诱饵:生物素;
-猎物:单体链霉亲和素(例如mSA2)和诱饵:生物素;
-猎物:His标签和诱饵:NTA;
-猎物:碳酸酐酶IX(CAIX)和诱饵:VD11-4-2;或
-猎物:麦芽糖结合蛋白(MBP)和诱饵:麦芽糖和麦芽三糖。
在本文的工作实施例中是“猎物-诱饵”系统-猎物:碳酸酐酶IX(CAIX)和诱饵:VD11-4-2–因此,这是优选的“猎物-诱饵”系统。
“猎物-诱饵”系统-猎物:碳酸酐酶IX(CAIX)和诱饵:VD11-4-2描述于例如V.Dudutiene等人的文章(“Discovery and Characterization of Novel SelectiveInhibitors of Carbonic Anhydrase IX”;J.Med.Chem.2014,57,9435-9446)中,其中描述了VD11-4-2是具有以下结构的小化合物:
优选地,第一方面的(i)的包含猎物的T-结构通过在细胞内表达靶标-猎物融合蛋白(例如靶标-CAIX)而获得–关于此实例参见例如本文的工作实施例。
在感兴趣的细胞内表达靶标-猎物融合蛋白对于技术人员而言是常规工作。
一个可能的实施方式可以是其中诱饵实际上结合靶标的结合位点,所述结合位点与结合实体(即配体)的结合位点不同。
在本发明背景下“将所述B结合至T-结构的所述核酸分子与结合至所述靶标猎物的所述诱饵融合(例如通过连接)”应当被理解为联合由两种基因型(即具有关于结合实体的序列信息的核酸分子和具有关于靶标的序列信息的核酸分子)携带的遗传信息。
如技术人员已知的(参见例如EP2622073B1(Vipergen)的[0166]),该融合可以以若干种方式完成,所述若干种方式诸如例如:
a)通过例如重叠PCR或重叠基因组延伸进行的信息转移;
b)通过形成可扩增促进键的酶–例如通过DNA连接酶催化的信息联合,其中在来自每个核酸分子的至少一条链之间形成磷酸二酯键。
优选地,融合通过经由使用连接酶的连接来进行。
如果例如使用连接酶来得到核酸分子的融合–则不需要在核酸分子之间具有任何碱基配对重叠区域。
然而,可能优选的是(独立地,如果例如使用或不使用连接酶),连接至所述诱饵的所述核酸分子是以下核酸分子,所述核酸分子具有与所述B-结构的所述核酸分子互补的粘性末端-更优选地,其中在所述B-结构的所述核酸分子与连接到所述诱饵的所述核酸分子两者的核酸分子的所述互补粘性末端处存在硫代磷酸酯键。
优选地,在所述B-结构的所述核酸分子和连接到所述诱饵的所述核酸分子的所述互补粘性末端处的磷酸骨架中安置有硫代磷酸酯键。对于每个核酸分子,硫代磷酸酯键的数量可以优先地是至少1个硫代磷酸酯键、至少2个硫代磷酸酯键或更优选地至少3个硫代磷酸酯键。
在本文的工作实施例1中使用了3个硫代磷酸酯键,并且本文的实施例2的结果证明,与使用未修饰的DNA(即零个硫代磷酸酯键)相比,使用3个硫代磷酸酯键在本发明背景下产生了令人惊讶的显著技术优势。
在一些情况下,可能优选的是,对于每个核酸分子,硫代磷酸酯键的数量可以优先地是至少4个硫代磷酸酯键,诸如至少10个硫代磷酸酯键或至少20个硫代磷酸酯键。
类似于B-结构-连接到诱饵的核酸分子是例如PNA、LNA、RNA、DNA或其组合-优选地,核酸分子是DNA。
如上文所论述的B-结构的核酸分子的其他优选实施方式(例如可以是双链核酸分子;可以含有PCR引发位点等)也可以是连接到诱饵的核酸分子的优选实施方式。
“融合(例如通过连接)核酸分子”可以进行为其中存在B结合至T-结构的结合实体与靶标的显著结合–此实例展示于本文的图2中和本文的工作实施例中。
然而,如例如EP2622073B1(Vipergen)中论述的,“融合(例如通过连接)核酸分子”可以进行为其中基本上不存在B结合至T-结构的结合实体与靶标的结合–这也是与如本文所述的方法有关的可能选项。
因此并且与例如基于EP2622073B1(Vipergen),在裂解步骤之后,“将所述B结合至T-结构的所述核酸分子与结合至所述靶标猎物的所述诱饵融合(例如通过经由使用连接酶的连接)”的(iiiA)步骤可以根据EP2622073B1(Vipergen)的权利要求1的步骤(iv)至(vi)通过以下方式进行:
(A):将所产生的具有结合至所述靶标猎物的所述诱饵的B结合至T-结构施加至体外区室化系统-在结合条件下,所述条件是其中含有能够结合靶标分子的结合实体的B-结构与含有不能结合相同靶标的结合实体的B-结构相比更高效地结合相应的T-结构的条件–优选地,所述区室化系统包括比步骤(ii)中在其中所述B-结构、T-结构和B结合至T-结构随机进入单独区室中的条件下引入的B-结构数量多至少2倍的单独区室;以及
(B):将均存在于相同的单独区室内的B-结构和T-结构的核酸分子融合–即将所述B-结构的核酸分子融合至所述T-结构的核酸分子–该结构在本文中称为BT融合-结构并且所述BT融合-结构包含允许鉴定所述结合实体的特定核酸序列信息和允许鉴定所述特定靶标的所述特定核酸序列信息;以及
(C):在其中没有B-结构和T-结构的核酸分子的融合的条件下组合步骤(B)的所述单独区室的内容物–其中没有产生任何新的已在步骤(B)中产生的BT融合-结构–以便得到BT融合-结构的文库,其中所述文库是与源自靶标与结合实体的未结合对的BT融合-结构相比富集的源自靶标与结合实体的结合对的BT融合-结构种类文库;并且
其中所述BT结合至T-结构在步骤(A)的所述单独区室中保持悬浮于溶液中;和/或
其中所述方法不依赖于靶标固定在固相支持物上;并且
其中扩增存在于步骤(C)的所述富集文库中的BT融合-结构的所述核酸。
可能优选的是,第一方面的步骤(iii)是步骤(iii)(B)。
当步骤(iii)是步骤(iii)(B)时,如本文所述的方法可以优选地是以下方法,其中
-第一方面的(i)的所述T-结构包含融合至所述靶标的酶,并且该酶由于通过第一方面的(ii)的所述B结合至T-结构的所述结合实体和靶标的结合而产生的接近度而能够在所述B结合至T-结构的所述B-结构上产生反应,所述反应标记B-结构并且从而使得可以区分所述B结合至T-结构的所述B-结构与未结合至靶标的B-结构。
一个实例可以例如是,其中融合至所述靶标的所述酶是连接酶,并且其中在第一方面的步骤(ii)中还引入了具有与所述B-结构的所述核酸分子互补的粘性末端的核酸分子,并且其中所述连接酶由于所述接近度而将所引入的核酸分子与所述B-结构的所述核酸分子连接并且从而标记所述B-结构。
另一个实例可以例如是,其中融合至所述靶标的所述酶是由于所述接近度而能够使用所述B-结构的核酸分子作为底物来产生反应并且从而标记所述B-结构的酶–一个实例可以是例如可以生物素化核酸分子的酶。
第一方面的步骤(iv)
如上文所论述的,步骤(iv)写着:
“(iv):经由使用(iii)的所述溶液和包含允许鉴定所述B-结构的所述结合实体的所述特定核酸序列信息的所述核酸分子,以鉴定在(ii)的所述细胞内结合至少一种感兴趣的靶标的至少一种单独结合实体”。
如由技术人员所理解的-使用允许鉴定所述结合实体的特定核酸序列信息将优选地需要某种测序。当然,对感兴趣的核酸分子进行测序对于技术人员而言是常规工作。
步骤(iv)可以基于如例如本文所论述的现有技术已知的技术进行。
如由技术人员所理解的和本文所述的–使用选项步骤(iii)(A)还是步骤(iii)(B)可以被视为与进行鉴定步骤(iv)的优选方式相关。
第一方面的“鉴定”步骤(iv)优选地包括以下步骤,其中对包含允许鉴定所述B-结构的所述结合实体的所述特定核酸序列信息的所述核酸分子进行扩增。
本领域技术人员可以常规地鉴定许多不同的策略以便扩增融合基因型中的核酸,例如但不限于:PCR(美国专利4,683,202;Mullis)、乳液PCR(Nakano等人,JBiotechnol.2003;102(2):117-24)、数字PCR(Vogelstein,B;Kinzler KW(1999)."DigitalPCR".Proc Natl Acad Sci U S A.96(16):9236–41)、NASBA(Compton J.Nucleic acidsequence-based amplification.Nature.1991;350(6313):91-2)或滚环扩增(AmericanJournal of Pathology.2001;159:63-69)。
优选地,核酸分子经由PCR扩增。
可能优选的是,在鉴定步骤(iv)中鉴定了至少两种(诸如例如至少3种或至少6种或至少10种)不同的在(ii)的所述细胞内结合至少一种感兴趣的靶标的单独结合实体。
在本文的工作实施例中(参见下文),在鉴定步骤(iv)中鉴定了大约10种不同的单独结合实体。
很明显,为了在该步骤(iv)中能够鉴定例如至少10种不同的单独结合实体–需要:
-步骤(iii)(A)的所述溶液包含多于10种不同的B结合至T-结构;或者
-步骤(iii)(B)的所述溶液包含多于10种不同的“结合物标记的B-结构”。
实施例
实施例1:
针对含有大约108种不同的结合实体的YoctoReactor文库对p38的细胞内筛选和比较性体外(即不在细胞内)筛选
关于概述,参见图1和图2。
方法
使用的DNA寡核苷酸
vip7460
AAAGCTGGGAGACACCA*A*T*G
(*=硫代磷酸化DNA碱基)
vip7461
T*T*G*GTGTCTCCCAGCTTTGA
(*=硫代磷酸化DNA碱基)
vip7442
A*G*C*ACTAAGCCTTGATGGCCACATTCCTACTTCTCCCTAAGGTGCAGTTTTGCCAAGG
(*=硫代磷酸化DNA碱基)
vip7463
xCCTTGGCAAAACTGCACCTTAGGGAGAAGTAGGAATGTGGCCATCAAGGCTTAGTGC*T*C*A
(x=5’-氨基修饰物C6;*=硫代磷酸化DNA碱基)
YoctoReactor文库(Lib027b_TA01)的制备
YoctoReactor文库基本上如在别处(Hansen等人J.Am.Chem.Soc.,2009,131(3),第1322-1327页)所述以三聚体形式构建并作以下修改:将20聚体衔接子核酸分子(由寡核苷酸vip7460和vip7461组成)连接至YoctoReactor文库上,从而产生衔接子修饰文库,即Lib027b_TA01。所构建的YoctoReactor DNA具有与靶标DNA上的重叠区域(2个核苷酸的3’-突出端)互补的重叠区域(2个核苷酸的3’-突出端)。
材料
专有Vipergen YoctoReactor文库(批次Lib027b,大约1.1*108种不同分子)
寡核苷酸vip7460和vip7461(制备的100μM原液;Eurofins Genomics)
NaCl(制备的4M原液;Sigma-Aldrich)
HEPES,pH 7.5(1M;Sigma-Aldrich)
Tris-HCl,pH 7.5(1M;Sigma-Aldrich)
糖原(20mg/mL;Thermo Fisher Scientific)
乙醇(96%;Honeywell)
MgCl2(2M;Sigma-Aldrich)
PEG4000(50%;Thermo Fisher Scientific)
ATP(制备的100mM原液;Sigma-Aldrich)
T4 DNA连接酶(30Weiss U/μl;Thermo Fisher Scientific)
水(分子生物学级;Sigma-Aldrich)
20%TBE-PAGE凝胶(Kem-En-Tec)
NucleoSpin凝胶和PCR清除柱(Macherey-Nagel)
Qubit dsDNA HS测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)
Quant-iT PicoGreen dsDNA测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)
方案
通过根据已公开的方案(https://eu.idtdna.com/pages/education/decoded/article/annealing-oligonucleotides)对vip7460和vip7461进行退火来制备20聚体核酸衔接子分子。通过将20μl 4M NaCl、1μl糖原和1ml冰冷乙醇添加到300μl退火反应并且离心(20000g在4℃下至少30min)来沉淀退火的寡核苷酸。将沉淀物用80%乙醇洗涤两次、在室温下风干并且溶解于水至100μM的浓度。通过Qubit测定(根据制造商的方案)确认浓度,并且在20%TBE-PAGE(200V,55min,20℃)上验证20聚体核酸衔接子的完整性。
通过以下方式将20聚体核酸衔接子连接至专有YoctoReactor文库(批次Lib027b):将YoctoReactor文库(Lib027b)和退火衔接子(2倍摩尔过量)在总共200μL水中混合,之后添加200μL 2X连接主混合物(80mM Tris-HCl pH 7.5、20mM MgCl2、4%PEG4000、2mM ATP和60U T4 DNA连接酶)。使连接在室温下进行过夜。通过添加1.2mL冰冷乙醇、1μL糖原和40μL 4M NaCl沉淀连接的YoctoReactor文库。将混合物在-20℃下储存1h,然后通过离心(20000g在4℃下至少30min)进行沉淀并且在室温下风干。为了消除过量的20聚体核酸衔接子,将连接的YoctoReactor文库在NucleoSpin凝胶和PCR清除柱上进行纯化。将纯化的衔接子修饰的YoctoReactor文库沉淀(NaCl、糖原和冰冷的乙醇)并且以47.9μM的浓度(根据制造商方案通过PicoGreen测定而确定的)溶解于缓冲液(5mM Tris-HCl pH 7.5、20mMNaCl、0.001%Tween20)中。重要的是,衔接子修饰的YoctoReactor文库(即Lib027b_TA01)在与vip7442/vip7463靶标DNA连接方面是有100%能力的。
连接到靶标DNA的CAIX-结合物(即诱饵=VD11-4-2)(TD_VD11-4-2)的制备
将小分子CAIX-结合物VD11-4-2共价连接到60聚体寡核苷酸(vip7463)。此后将寡核苷酸与反向互补寡核苷酸(vip7442)组装,从而形成连接到诱饵化合物VD11-4-2的双链核酸分子(即靶标DNA)。所构建的靶标DNA(即TD_VD11-4-2)具有与YoctoReactor DNA上的重叠区域(2个核苷酸的3’-突出端)互补的重叠区域(2个核苷酸的3’-突出端)。
材料
五氟苯基磺酰胺(Fluorochem,034664)
8-巯基辛酸(Sigma-Aldrich,675075)
三乙胺(Sigma-Aldrich,90340)
过氧化氢溶液(Sigma-Aldrich,95321)
环辛基胺(Sigma-Aldrich,C110604)
HPLC级水(Fisher Scientific,10221712)
三乙铵乙酸酯(Sigma-Aldrich,90358)
乙腈(Fisher Scientific,10629112)
DMSO(Sigma-Aldrich,D8418)
乙基-(N’,N’-二甲氨基)丙基碳二亚胺盐酸盐(EDC;Sigma-Aldrich,E6383)
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS;Sigma-Aldrich,130672)
N-甲基吡咯烷酮(NMP;Sigma-Aldrich,494496)
方案
使用V.Dudutiene等人(“Discovery and Characterization of NovelSelective Inhibitors of Carbonic Anhydrase IX”;J.Med.Chem.2014,57,9435-9446)的改编程序制备VD11-4-2的类似物。使用8-巯基辛酸代替2-巯基乙醇,并且产生了携带远端羧酸的类似物:
随后使用乙基-(N',N'-二甲氨基)丙基碳二亚胺盐酸盐(EDC,1.2mg)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,0.7mg)在N-甲基吡咯烷(NMP,60μL)中活化HPLC纯化产物(3.3mg)。将粗活化混合物(50μL)添加到vip7463(10nmol;100μM的100μL)、HEPBS缓冲液(100μL,1M原液)、NMP(200μL)和水(50μL)的预混合溶液。
在偶联16h之后,将DNA进行EtOH沉淀,并且将粗缀合物通过RP-HPLC使用在水/MeCN中的三乙铵乙酸酯进行纯化。通过冻干浓缩具有所需缀合物的级分并且将最终产物溶解于水中。通过LCMS(ESI;阴性模式)进行的QC:观测值m/z 19322,计算值19324.6(参见下面的HPLC色谱图)。
随后将纯化的单链缀合物,即vip7463_VD11-4-2与反向互补DNA寡核苷酸vip7442杂交,以此产生连接到VD11-4-2的双链靶标DNA(即TD_VD11-4-2)。
对在卵母细胞之外的缀合至DNA的p38的体外筛选(e1,参考)
为了参考,针对Lib027b_TA01(即应用于细胞内筛选的相同YoctoReactor文库)对缀合至DNA的重组p38蛋白进行体外筛选(即不在细胞内)。基本上如先前所述(Petersen等人,“Novel p38αMAP kinase inhibitors identified from YoctoReactor DNA-encodedsmall molecule library”,Med.Chem.Commun.,2016,7,1332-1339)进行p38与靶DNA的缀合和随后针对Lib027b_TA01(针对大约5.6*1012种文库分子/μl筛选缀合至靶标DNA的20nMp38)的筛选。
对卵母细胞中表达的p38的细胞内筛选(e2和e3)
靶标-猎物融合蛋白(例如CAIX-p38)在非洲爪蟾卵母细胞中的表达
合成经由6个氨基酸接头在N末端与人CAIX的催化结构域融合的编码p38的基因(UniProt登录代码:Q16539),并且在pSP64表达载体(Eurofins Genomics)中的HindIII位点与BamHI位点之间进行亚克隆。将载体用EcoRI线性化,并且用Ambion mMESSAGEmMACHINE SP6转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)合成mRNA。经由RNeasy柱(Qiagen)纯化mRNA。
使用Nanoliter 2010注射器(World Precision Instruments)将大约50ng的CAIX-p38 mRNA以50nL的体积(在水中稀释)注射至非洲爪蟾卵母细胞(EcocyteBioscience)中。将卵母细胞在18℃下保持在改良Barth培养基(以mM计,88NaCl、1KCl、0.4CaCl2、0.33Ca(NO3)2、0.8MgSO4、5Tris-HCl、2.4NaHCO3,pH 7.4)中,直到实验。
对在非洲爪蟾卵母细胞中表达的靶标-猎物融合蛋白(例如CAIX-p38)的定量
在注射mRNA后四天,通过使用人CAIX DuoSet ELISA测定(Bio-techne)定量非洲爪蟾卵母细胞内CAIX-p38蛋白的表达。作为对照,平行处理未注射的非洲爪蟾卵母细胞。简而言之,将一个非洲爪蟾卵母细胞在25μl缓冲液(在PBS中的1mM EDTA、0.5%Triton X-100、5mM NaF)中通过离心(20000g在4℃下2min)粉碎,将上清液转移到包被有CAIX-捕获抗体的ELISA板并且在室温下孵育1h。洗涤所有孔(在洗涤缓冲液;在PBS中的0.05%Tween20中三次),并且添加生物素化CAIX检测抗体。将板在室温下孵育1h,并且洗涤所有孔。添加缀合至辣根过氧化物酶的链霉亲和素(链霉亲和素-HRP),并且将板在黑暗中在室温下孵育20min。在添加HRP底物TMB SENS(Kem-En-Tec)之前洗涤所有孔。将板在黑暗中在室温下孵育5min,之后通过添加2M H2SO4终止反应。在DTX880多模式检测器(Beckman Coulter)上测定450nm处的光密度。基于与重组CAIX蛋白平行生成的CAIX标准曲线,确定在非洲爪蟾卵母细胞内表达的CAIX-p38蛋白浓度为大约200nM。
将靶标DNA和YoctoReactor文库向非洲爪蟾卵母细胞中的引入
将由约1.1*108种不同的分子(即与双链核酸分子偶联的潜在结合物)组成的多样YoctoReactor文库(Lib027b_TA01)与TD_VD11-4-2(即共价连接到诱饵化合物VD11-4-2的靶标DNA)混合,并将混合物注射至表达CAIX-p38蛋白的非洲爪蟾卵母细胞。在注射编码CAIX-p38的mRNA后4天进行YoctoReactor文库和TD_VD11-4-2的注射。将由总共大约6.6*1011个YoctoReactor文库分子和1.5*1011个TD_VD11-4-2分子组成的总共50nL注射至每个卵母细胞中(e2)。在平行实验中,在注射前使Lib027b_TA01/TD_VD11-4-2混合物补充有0.1μg/ml RNA酶(e3)。进行RNA酶的注射以消化可以潜在地影响卵母细胞内的选择过程的内源RNA。
将非洲爪蟾卵母细胞在18℃下孵育2-4h。在该时段内,使表达的CAIX-p38蛋白结合:1)YoctoReactor文库配体(结合感兴趣的蛋白质p38结合)、和2)TD_VD11-4-2(结合CAIX标签)。
非洲爪蟾卵母细胞膜的破坏和DNA连接
将非洲爪蟾卵母细胞的膜破坏以便从细胞中释放结合复合物,即结合至以下的CAIX-p38:1)YoctoReactor文库配体和2)TD_VD11-4-2。与CAIX-p38蛋白缔合的DNA片段(即分别为靶标DNA和YoctoReactor DNA)具有重叠区域,导致两个片段可能通过DNA连接组装成组合片段。连接将由在两个DNA片段都与CAIX-p38蛋白缔合时的接近度驱动,从而产生具有更高分数的具有所需结合活性的成员的富集文库。
为了破坏非洲爪蟾卵母细胞膜,将一个卵母细胞在不含ATP和连接酶的600μl连接缓冲液中离心(20000g在4℃下2min)。将上清液(600μl)以两个顺序步骤稀释至补充有300Weiss单位T4 DNA连接酶(Thermo Fisher Scientific)的总共11mL连接缓冲液(50mMTris-HCl、50mM NaCl、0.1%Triton X-100、0.75%BSA、9mM KCl、4.5%甘油、1mM DTT、5mMMgCl2、1mM ATP,pH 7.4)中。从而将结合复合物总共稀释大约104倍,并且使连接在16℃下进行4min。然后,通过添加11mL终止缓冲液(补充有50mM EDTA、0.2μg/μl蛋白酶K、0.2%N-月桂基肌氨酸的NTI缓冲液)来灭活T4 DNA连接酶,并且随后将所得混合物在65℃下孵育1h。在冷却至室温之后,将DNA在NucleoSpin凝胶和PCR清除柱(Macherey-Nagel)上进行纯化。
连接DNA的扩增
将连接和纯化的DNA片段用λ核酸外切酶处理(去除游离的、未连接的5'-磷酸化DNA片段)并且通过PCR扩增。
PCR混合物(最终浓度):
25μl纯化的连接DNA(PCR模板)
1X Vent(-外)PCR缓冲液(New England Biolabs)
0.4mM CleanAmp dNTP(tebu-bio)
6mM MgCl2(Sigma-Aldrich)
3%DMSO(Sigma-Aldrich)
0.25μM正向PCR引物
0.25μM反向PCR引物
1U Vent(-外)聚合酶(New England Biolabs)
水总共至100μl
通过在PCR机中应用以下程序来对混合物进行热循环:
95℃ 10min,27个循环的(95℃30s,62℃30s,72℃2min30s),72℃2min
将所得的DNA片段文库在NucleoSpin凝胶和PCR清除柱(Macherey-Nagel)上进行纯化,并且对其进行第二轮的PCR以引入用于Illumina测序的引发位点。
PCR混合物:
5μl纯化的扩增DNA(PCR模板)
1X Vent(-外)PCR缓冲液(New England Biolabs)
0.2mM dNTP(Thermo Fisher Scientific)
6mM MgCl2(Sigma-Aldrich)
0.5M甜菜碱(Sigma-Aldrich)
0.25μM正向Illumina引物
0.25μM反向Illumina引物
1U Vent(-外)聚合酶(New England Biolabs)
水总共至100μl
通过在PCR机中应用以下程序来对混合物进行热循环:
92℃ 2min,10个循环的(92℃ 30s,62℃30s,72℃2min30s),72℃2min
将所得DNA片段文库通过Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter LifeSciences)和制备型10%TBE-PAGE(Kem-En-Tec)纯化,并且提交用于Illumina DNA测序(Fulgent Genetics)。
通过使用Illumina测序技术的DNA测序进行的富集分析
将DNA测序数据如在别处(Petersen等人,“Novel p38αMAP kinase inhibitorsidentified from yoctoReactor DNA-encoded small molecule library”,Med.Chem.Commun.,2016,7,1332-1339)所述进行解码和分析。
通过计算在测序样品中观察到给定文库成员的次数,可以鉴定富集高于随机连接事件的命中。多次观察到的库成员是靶标结合物(命中),而仅观察到几次的化合物主要是随机事件(背景)的结果。基于随机事件的观察数代表对数刻度上的线性衰减线(信号图中的红色球体)。因此,观察数高于从衰减阶段到信号阶段的过渡期的库成员因此高于数学阈值(MT,信号图中的绿色球体)。从三个单独的选择实验(e1-e3)中,产生了信号图(本文的图3上的面板A-C)。信号图A源自针对YoctoReactor文库Lib027b_TA01对缀合至靶标DNA的p38的筛选(e1,参考),并且信号图B或C是来自在不进行(e2)或进行(e3)RNA酶的注射的情况下对卵母细胞中表达的p38的细胞内筛选。从在e1-e3中针对大约1.1*108种不同的分子的筛选中,我们鉴定出总共39个高于MT(绿色球体)的命中。将39个命中组合,并且针对来自DNA测序的三个数据池中的观察数进行注释(图3上的面板D)。在三个实验中的至少一个实验中,观察到39个高于MT的命中。在参考实验(e1)和两个细胞内筛选实验(e2或e3)中都发现了显著量的命中。命中ID#31是先前经验证的p38a抑制剂(vpc00249;IC500.51μM;Petersen等人,“Novel p38αMAP kinase inhibitors identified from yoctoReactor DNA-encoded small molecule library”,Med.Chem.Commun.,2016,7,1332-1339)。
结论
如上文所论述,基于大约108种不同的结合实体的体外展示文库-在该“细胞内”筛选实施例中,在鉴定步骤(对应于第一方面的鉴定步骤(iv))中鉴定了大约10-30种不同的单独良好结合物化合物结合实体,包括先前经验证的p38抑制剂以及若干个未经验证的命中。在本发明背景下,这被认为是文库的可接受的代表性高数量的良好结合物化合物。
良好结合物实体的鉴定数量被认为是可接受的一个原因涉及,如上所论述针对该靶标(即p38)进行对相同的体外展示文库的比较性体外(即不在细胞内)筛选,并且鉴定了大约10种不同的单独良好结合物,即“细胞内”筛选中鉴定出的结合物数量至少与比较性体外筛选相当–即,它被认为是可接受的。
此外,在本发明的细胞内筛选中鉴定的单独良好结合物对应于在比较性体外筛选中鉴定的良好结合物。
例如,如果在该实施例的“细胞内”筛选中将仅鉴定出一种或两种单独良好结合物化合物结合实体,则它将不会被认为与该实施例中实际鉴定的大约10种不同的单独良好结合物一样好。对于此的一个原因涉及,如果将仅鉴定出1-2种单独良好结合物,则可能存在丢失可能相关的良好结合物–即丢失有价值的良好结合物信息的风险。
如所论述的,“细胞内”和比较性体外筛选的一些鉴定的良好结合物是相同的,且“细胞内”筛选的一些良好结合物在比较性体外筛选中没有鉴定出–对于此的一个原因可能涉及,一些“真实”中良好结合物可能只能在该实施例的“细胞内”筛选方法–即本发明的方法的天然“细胞内”结合条件(即第一方面的步骤(ii)(b))下鉴定出。
实施例2:
比较例–将使用3个硫代磷酸酯键与未修饰DNA(即零个硫代磷酸酯键)进行了比较
方法
使用的DNA寡核苷酸(示意图)
对在注射至非洲爪蟾卵母细胞中并从其提取之后有或没有硫代磷酸酯键的靶标DNA的连接潜力的评价
将有或没有硫代磷酸化DNA碱基的靶标DNA(即TD_001、TD_002和TD_003)注射至非洲爪蟾卵母细胞中。将靶标DNA以渐增的时间间隔在卵母细胞内孵育,然后将非洲爪蟾卵母细胞的膜破坏并且回收注射的靶标DNA。在与连接DNA(即LD_01)的DNA连接反应中检查回收的靶标DNA的连接潜力。注意,在细胞内孵育后保留靶标DNA的连接潜力是细胞内筛选的本发明背景下的关键参数。
将靶标DNA向非洲爪蟾卵母细胞中的注射
使用Nanoliter 2010注射器(World Precision Instruments)将大约1-2pmol的有或没有硫代磷酸酯键(即TD_001、TD_002或TD_003)的靶标DNA以50nL的体积(在水中稀释)注射至非洲爪蟾卵母细胞(Ecocyte Bioscience)中。将卵母细胞在18℃下保持在改良Barth培养基(以mM计,88NaCl、1KCl、0.4CaCl2、0.33Ca(NO3)2、0.8MgSO4、5Tris-HCl、2.4NaHCO3,pH 7.4)中。将卵母细胞以渐增的时间间隔孵育,然后破坏膜并且回收注射的靶标DNA(如下文详述的)。
非洲爪蟾卵母细胞膜的破坏和注射的靶DNA的回收
破坏非洲爪蟾卵母细胞膜以回收注射的靶标DNA。为了破坏非洲爪蟾卵母细胞膜,将五个卵母细胞在200μl粉碎缓冲液(10mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.01%Tween-20)中离心(20000g在4℃下2min)。将回收的靶标DNA(源自五个卵母细胞)在NucleoSpin凝胶和PCR清除柱上进行纯化。沉淀出(NaCl、糖原和冰冷乙醇)纯化的靶标DNA并且通过离心(20000g在4℃下至少30min)使其沉淀。将DNA沉淀物在室温下风干并溶解于水中。
DNA连接
通过将回收的靶标DNA与连接DNA(即LD_01)一起施加在DNA连接反应中来评价所述回收的靶标DNA的连接潜力。将纯化的靶标DNA(源自五个卵母细胞)与大约2pmol的LD_01连接DNA在补充有大约1Weiss单位T4 DNA连接酶(Thermo Fisher Scientific)的连接缓冲液(50mM Tris-HCl、50mM NaCl、0.1%Triton X-100、0.75%BSA、9mM KCl、4.5%甘油、2mMDTT、10mM MgCl2、2mM ATP,pH 7.4)中混合。使连接反应在16℃下进行1-2h。将连接混合物施加至天然PAGE(10%TBE-PAGE,200V,35min,室温)以评价回收的靶标DNA的连接潜力。未修饰的靶标DNA(即TD_001)的连接潜力在非洲爪蟾卵母细胞内孵育之后以时间依赖性方式丧失。具体地,在孵育30min之后50%的连接潜力丧失,并且在卵母细胞内孵育1h之后连接潜力几乎完全丧失。对于在一条链上安置了硫代磷酸酯键的靶标DNA(即TD_002),在卵母细胞内孵育2h之后大约50%的结扎潜力丧失。相比之下,当在靶标DNA(即TD_003)的两条链中都安置了硫代磷酸酯键时,在卵母细胞内孵育2h之后连接潜力几乎不受影响。
结论
该实施例的结果证明,与使用未修饰的DNA(即零个硫代磷酸酯键)相比,使用3个硫代磷酸酯键在本发明背景下产生了令人惊讶的显著技术优势。
参考文献列表
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17.Petersen等人(“Novel p38αMAP kinase inhibitors identified fromyoctoReactor DNA-encoded small molecule library”,Med.Chem.Commun.,2016,7,1332-1339)。
序列表
<110> 威泊根私人有限公司
<120> 用于在细胞内筛选体外展示文库的方法
<130> PD10161PC00
<160> 4
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
aaagctggga gacaccaatg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
ttggtgtctc ccagctttga 20
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
agcactaagc cttgatggcc acattcctac ttctccctaa ggtgcagttt tgccaagg 58
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
ccttggcaaa actgcacctt agggagaagt aggaatgtgg ccatcaaggc ttagtgctca 60
Claims (15)
1.一种用于针对文库的小分子化合物结合实体与感兴趣的蛋白质或RNA靶标的细胞内结合来筛选体外展示文库、以便鉴定所述文库中能够在所述细胞内结合所述感兴趣的蛋白质或RNA靶标的至少一种单独化合物结合实体的方法,并且其中所述方法包括以下步骤:
(i):在细胞中表达至少一种靶标Tn,其中n=1或更多,并且其中所述至少一种靶标是蛋白质或RNA-所述靶标的结构在本文中称为T-结构;
(ii):将体外展示文库引入(i)的所述细胞中,其中:
(a):所述文库是具有至少1000种不同的结合实体Bn的文库,其中n=1000或更多,其中每种结合实体连接到核酸分子并且所述核酸分子包含允许鉴定所述结合实体的特定核酸序列信息–其中一旦知晓所述核酸分子的所述特定核酸序列信息即可直接知晓连接到所述核酸分子的特定结合实体的结构,并且其中所述文库的所述结合实体是平均分子量MW低于10000道尔顿的化合物-连接到所述核酸分子的所述结合实体的结构在本文中称为B-结构;并且
(b):在结合条件下将所述文库引入所述细胞中,所述条件是其中含有能够结合靶标分子的结合实体的B-结构与含有不能结合相同靶标的结合实体的B-结构相比更高效地结合相应的T-结构的条件,并且其中在所述细胞内得到所述结合实体中的至少一种与至少一种靶标的结合,从而在所述细胞内产生包含B-结构结合至T-结构的复合物,所述复合物称为B结合至T-结构;
(iii):进行(ii)的所述细胞的裂解以分解细胞膜,以便:
(A):从所述细胞中得到(ii)的所述B结合至T-结构并且从而获得包含B结合至T-结构的溶液,其中所述B结合至T-结构不在所述细胞内;或者
(B):从所述细胞中得到在步骤(ii)中已结合至靶标的并且在步骤(iii)之前已被标记的B-结构,所述标记以使得可区分标记的B-结构与在步骤(ii)中未结合至靶标的B-结构的方式进行,并且从而获得包含结合物标记的B-结构的溶液,其中所述结合物标记的B-结构不在所述细胞内;并且
(iv):经由使用(iii)的所述溶液和包含允许鉴定所述B-结构的所述结合实体的所述特定核酸序列信息的所述核酸分子,以鉴定在(ii)的所述细胞内结合至少一种感兴趣的靶标的至少一种单独结合实体。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述靶标T是蛋白质并且其中所述细胞是真核细胞。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述细胞是爪蟾属卵母细胞。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述细胞是非洲爪蟾卵母细胞。
5.根据权利要求3至4中任一项所述的方法,其中根据权利要求1所述的将所述体外展示文库引入步骤(ii)的所述细胞中是经由将所述体外展示文库注射至所述爪蟾属卵母细胞中进行的;并且
其中根据权利要求1所述的步骤(ii)的所述体外展示文库是具有至少106种不同的结合实体Bn的文库,其中n=106。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中根据权利要求1所述的结合步骤步骤(ii)(b)中T-结构的浓度是至少10-10M。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中根据权利要求1所述的步骤(iii)是步骤(iii)(A)。
8.根据权利要求7所述的方法,其中根据权利要求1所述的步骤(iv)通过以下方式来进行:
-经由将B结合至T-结构的靶标与固相支持物结合以使(iii)(A)的所述溶液的所述B结合至T-结构与所述固相支持物结合,并且去除未结合至靶标并从而未结合至所述固相支持物的B-结构;以及
-经由使用允许鉴定结合至所述固相支持物的所述B结合至T-结构的所述结合实体的所述特定核酸序列信息,以鉴定在(ii)的所述细胞内结合至少一种感兴趣的靶标的至少一种单独结合实体。
9.根据权利要求7所述的方法,其中所述方法是以下方法,其中:
-根据权利要求1所述的(i)的所述T-结构包含猎物(例如靶标-猎物融合蛋白)并且在根据权利要求1所述的步骤(ii)中还引入了连接到核酸分子(其例如具有与所述B-结构的所述核酸分子互补的粘性末端)的诱饵,并且所述核酸分子包含允许鉴定所述特定靶标的特定核酸序列信息,并且其中所述诱饵在根据权利要求1所述的步骤(ii)中结合所述靶标的所述猎物并从而产生其中所述诱饵结合至所述靶标猎物的B结合至T-结构;
-在裂解步骤(iii)(A)之后-将所述B结合至T-结构的所述核酸分子与结合至所述靶标猎物的所述诱饵融合(例如通过经由使用连接酶的连接),其中所述融合核酸分子包含允许鉴定结合实体和靶标的序列信息;以及
-在根据权利要求1所述的步骤(iv)中经由使用允许鉴定前一步骤的所述融合(例如连接)核酸分子的所述结合实体和靶标的所述特定核酸序列信息,以鉴定在(ii)的所述细胞内结合至少一种感兴趣的靶标的至少一种单独结合实体。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述细胞是爪蟾属卵母细胞,优选地其中所述细胞是非洲爪蟾卵母细胞。
11.根据权利要求9至10中任一项所述的方法,其中在所述“将所述B结合至T-结构的所述核酸分子与结合至所述靶标猎物的所述诱饵融合(例如通过经由使用连接酶的连接)”步骤之前进行对获自细胞裂解步骤(iii)的所述溶液(例如悬浮液)的稀释步骤,并且其中所述稀释是将所述溶液稀释至少102倍;并且
其中在根据权利要求1所述的步骤(i)中仅存在一种靶标(n=1);并且
其中所述“鉴定”步骤(iv)包括以下步骤,其中对包含关于结合实体和靶标的序列信息的所述融合核酸分子进行扩增,优选地通过使用聚合酶链反应(PCR);并且
其中所述“猎物-诱饵”系统是:
-猎物:四聚体链霉亲和素和诱饵:生物素;
-猎物:单体链霉亲和素(例如mSA2)和诱饵:生物素;
-猎物:His标签和诱饵:NTA;
-猎物:碳酸酐酶IX(CAIX)和诱饵:VD11-4-2;或
-猎物:麦芽糖结合蛋白(MBP)和诱饵:麦芽糖和麦芽三糖;并且
其中连接到所述诱饵的所述核酸分子是DNA并且所述B-结构的所述核酸分子是DNA。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法,其中连接到所述诱饵的所述核酸分子是具有与所述B-结构的所述核酸分子的互补粘性末端的核酸分子;并且
其中在所述B-结构的所述核酸分子和连接到所述诱饵的所述核酸分子的所述互补粘性末端处的磷酸骨架中安置有硫代磷酸酯键;并且
对于每个核酸分子,所述硫代磷酸酯键的数量是至少2个硫代磷酸酯键。
13.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中根据权利要求1所述的步骤(iii)是步骤(iii)(B);并且其中方法是以下方法,其中:
-根据权利要求1所述的(i)的所述T-结构包含融合至所述靶标的酶,并且该酶由于通过根据权利要求1所述的(ii)的所述B结合至T-结构的所述结合实体和靶标的结合产生的接近度而能够在所述B结合至T-结构的所述B-结构上产生反应,所述反应标记B-结构并且从而使得可区分所述B结合至T-结构的所述B-结构与未结合至靶标的B-结构;并且
其中融合至所述靶标的所述酶是连接酶,并且其中在第一方面的步骤(ii)中还引入了具有与所述B-结构的所述核酸分子的互补粘性末端的核酸分子,并且其中所述连接酶由于所述接近度而将所引入的核酸分子与所述B-结构的所述核酸分子连接并且从而标记所述B-结构。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中根据权利要求1所述的“鉴定”步骤(iv)包括以下步骤,其中对包含允许鉴定所述B-结构的所述结合实体的所述特定核酸序列信息的所述核酸分子进行扩增,优选地通过使用聚合酶链反应(PCR)来扩增所述核酸分子。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在根据权利要求1所述的鉴定步骤(iv)中鉴定出至少6种不同的在(ii)的所述细胞内结合至少一种感兴趣的靶标的单独结合实体;并且
其中在根据权利要求1所述的步骤(i)中仅存在一种靶标(n=1)。
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