KR20210119394A

KR20210119394A - 세포 내에서 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 방법

Info

Publication number: KR20210119394A
Application number: KR1020217022709A
Authority: KR
Inventors: 닐스 야콥 베스트 한슨; 야콥 안데르센; 올레 크리스텐슨; 앨랜 베크 크리스텐슨; 라르스 콜스터 피터슨
Original assignee: 비퍼겐 에이피에스
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2021-10-05
Also published as: CA3127137A1; EP3914704C0; CN113366105A; AU2020211270A1; JP2022518242A; EP3914704A1; AU2020211270A8; US11634835B2; SG11202107913VA; IL284893A; EP3914704B9; US20220090051A1; ES2954675T3; WO2020152028A1; EP3914704B1

Abstract

세포 내에서 목적 단백질 표적 또는 RNA 표적에 결합할 수 있는 라이브러리의 1종 이상의 개별적인 화합물 결합 물질(binding entity)를 식별하기 위해 세포 내에서 라이브러리의 소분자 화합물 결합 물질의 목적 단백질 표적 또는 RNA 표적으로의 결합에 대해 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 방법.

Description

세포 내에서 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 방법

본 발명은 세포 내에서 목적 단백질 또는 RNA 표적에 결합할 수 있는 라이브러리의 1종 이상의 개별적인 화합물 결합 물질(binding entity)를 식별하기 위해 세포 내에서 라이브러리의 소분자 화합물 결합 물질의 목적 단백질 또는 RNA 표적으로의 결합에 대해 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

디스플레이(display) 기술은 핵산의 정보 저장 및 증폭 능력과 다른 화합물의 기능적 활성을 결합하기 위해 개발되었다. 디스플레이 기술은 기능적 결합 물질(functional binding entity)(즉, 표현형)과 결합 물질의 구조에 대한 핵산 서열 정보(유전형) 간의 연관성에 의존한다. 주(note): 핵산 앱타머 기술은 표현형 및 유전형이 동일한 분자(DNA 또는 RNA)로 구성된 특별한 경우이나, 디스플레이 기술로 간주된다.

그러한 방법의 장점은 매우 큰 라이브러리가 구축되고, 기능적 결합 물질의 원하는 활성에 대해 탐색될 수 있다는 것이다. 그 후, 원하는 활성을 갖는 라이브러리 일원들을 원하는 활성을 갖지 않는 라이브러리 일원들과 분리하고, 원하는 활성을 갖는 일원들의 더 높은 분획을 갖는 농축된(enriched) 라이브러리를 생성할 수 있다. 이 과정을 선택 또는 농축(enrichment)이라 지칭한다. 일부 디스플레이 기술은 복수의 선택을 가능하게 하고, 1회의 선택으로부터 농축된 라이브러리가 증폭되고, 새로운 농축된 디스플레이 라이브러리를 제조하기 위해 사용되고, 다음 회의 선택에서 사용하는 것이 반복된다. 농축된 라이브러리에서 라이브러리 일원들의 구조가 그들의 동족(cognate) 핵산 서열에 의해 확인될 수 있어서, 심지어 소량의 물질로부터의 확인도 가능하게 한다.

본 명세서에서, 관련된 라이브러리는 당해 기술에 따라 "인 비트로 디스플레이 라이브러리(in vitro display libraries)"로 지칭될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "인 비트로 디스플레이 라이브러리(in vitro display library)"는 당해 기술에 따라, 각각의 결합 물질이 핵산 분자에 부착되고, 상기 핵산 분자는 상기 결합 물질을 식별할 수 있게 하는 특정한 핵산 서열을 포함하고, 즉, 상기 핵산 분자의 특정한 핵산 서열 정보를 알면, 직접적으로 상기 핵산 분자에 부착된 상기 특정한 결합 물질의 구조를 알 수 있는 것인 다수의 상이한 결합 물질의 라이브러리로 이해될 것이고, 상기 핵산 분자(유전형)에 부착된 결합 물질(즉, 표현형)의 구조는 본 명세서에서 B-구조(B-structure)로 지칭된다.

상기 부착된 핵산 분자가 DNA 분자인 경우, 용어 "인 비트로 디스플레이 라이브러리"는 당해 기술에서 종종 "DNA-코딩된 라이브러리(DNA-encoded library)(DEL)"로 지칭될 수 있다.

용어 "결합 물질(binding entity)"은 당해 기술에서 "리간드(ligand)"로 지칭될 수 있다.

선행 기술은 그러한 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 제조하기 위한 다수의 상이한 방법들을 기술한다- 본 명세서에서 적합한 예들은 예를 들면, EP1809743B1 (Vipergen - YoctoReactor® (yR) 라이브러리 기술), EP1402024B1 (Nuevolution), EP1423400B1 (David Liu), Nature Chem. Biol. (2009), 5:647-654 (Clark), WO 00/23458 (Harbury), Nature Methods (2006), 3(7), 561-570, 2006 (Miller), Nat. Biotechnol. 2004; 22, 568-574 (Melkko), Nature. (1990); 346(6287), 818-822 (Ellington), 또는 Proc Natl Acad Sci USA (1997). 94 (23): 12297-302 (Roberts), WO06053571A2 (Rasmussen)를 포함한다.

예를 들면, 전술된 선행 기술에 기재된 바와 같이, 현재 매우 많은 수(예를 들면, 10¹⁵)의 특정한 결합 물질(예를 들면, 10¹⁵ 종의 상이한 화합물)을 포함하는 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 제조할 수 있다.

이렇게 많은 개수의 특정한 결합 물질을 고려할 때, 농축된 라이브러리를 제조하기 위해, 예를 들면, 목적 표적(target of interest)(예를 들면, 의학적으로 중요한 수용체 분자)에 결합하는 특정한 결합 물질(예를 들면, 화합물)의 구조를 식별할 수 있도록 효율적이기 위해 그러한 라이브러리의 선택/농축 단계가 중요하다는 것이 명백하다.

EP2622073B1(Vipergen)의 도 3에 EP1809743B1 (Vipergen - YoctoReactor® (yR) 라이브러리 기술)에 기술된 인 비트로 디스플레이 기술의 예가 도시된다 - EP2622073B1의 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 이 예의 선택 단계는 고체 지지체 (예를 들변, 비드 또는 유리 플레이트)에 표적(예를 들면, 수용체)을 고정화시키는 것에 의해 수행되고, 결합되지 않은 물질(non-binders) 및 저 친화도 결합물질은 통상적으로 세척에 의해 제거하고, 결합 물질에 대해 농축된 집단을 상기 고체 지지체로부터 회수한다. 그러한 고체 지지체 기반 선택/농축 방법의 다수의 예가 당해 기술에서 기술된다.

EP2622073B1(Vipergen)은 ECC(Enrichment by Co-Compartmentalization) 또는, 대안적으로 BTE(Binder Trap Enrichment®)로 지칭된, 농축된 라이브러리를 제조하기 위한 개선된 인 비트로 디스플레이 기반 방법에 관한 것이다 - 예를 들면, EP2622073B1의 도 1 및 2, 또는 Vipergen사 홈페이지: http://www.vipergen.com를 참조한다.

앞서 기술된 "인 비트로 디스플레이 라이브러리" 방법을 기술하는 다수의 선행 기술에서 검토된 바와 같이, 목적 표적(예를 들면, 의학적으로 중요한 수용체 분자)으로의 특이적 결합 물질(예를 들면, 화합물)의 결합의 선택/농축 단계는 자연적이지 않은 인공적 상황에서, 예를 들면, 고체 지지체(예를 들면, 비드 또는 유리 플레이트)에 표적(예를 들면, 수용체)을 고정화시키는 것에 의해 정제된, 이종 발현(heterologously expressed) 단백질에 의존적인 것으로 지칭될 수 있다.

그러한 소위 인공적 상황에서 결합/선택과 관련하여, Lynn MM et al.에 의한 논문 ("Identification of Ligand-Target Pairs from Combined Libraries of Small Molecules and Unpurified Protein Targets in Cell Lysates"; J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 3264-3270)은 "고정화된 표적에서의 선택의 결과는 세포적 상황에서 분리되었을 때 비-고유한 구조(non-native conformation)를 취하거나 또는 그들의 기능에 필수적인 결합 파트너 또는 보조인자(cofactor)가 결핍된 단백질에 대한 생물학적 관련성을 결여할 수 있다."로 기술한다.

이를 고려하여, Lynn의 논문은 세포 용해물 중 DNA-결합 리간드와 미정제 단백질 표적의 원-팟(one-pot) 혼합물로부터 리간드+표적 쌍을 식별하는, 소위 미정제 단백질을 이용한 상호작용 결정(IUDP) 방법을 기술한다.

Zining Wu et al.의 논문 ("Cell-Based Selection Expands the Utility of DNA-Encoded Small-Molecule Library Technology to Cell Surface Drug Targets.."; ACS Comb. Sci. 2015, 17, 722-731)은 소분자 DNA-코딩 라이브러리(DEL)로부터 세포 표면 표적에 대한 고친화도 및 선택적 리간드를 식별하는 세포-기반 선택 방법, 즉, 결합이 세포 내에 있지 않은 세포 표면 상에서 이루어지는 것인 방법을 기술한다.

M. Schurmann et al.의 논문 ("Small-Molecule Target Engagement in Cells"; Cell Chemical Biology 23, April 21, 2016)은 단일의 특이적 소분자 화합물이 세포 내로 도입될 수 있고, 이러한 단일의(하나의 특이적) 화합물이 표적(예를 들면, 수용체)에 결합하는지 여부를 식별/검출할 수 있다는 것을 기술한다.

본 발명에서 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 이 M. Schurmann 문헌은 인 비트로 디스플레이 라이브러리(예를 들면, DNA-코딩된 라이브러리(DEL)), 즉, 다수의(예를 들면, 10¹⁰) 상이한 결합 물질을 포함하는 라이브러리를 스크리닝하는 방법과 관련되지 않는다. 간단히 말해서, 이 M. Schurmann 논문은 본질적으로 목적 소분자가 목적 표적(예를 들면, 수용체)에 결합한다는 것을 이미 알고 있고, 본질적으로 목적 세포 내에서 이를 확인하기를 원하거나, 또는 세포의 어느 부분(예를 들면, 어느 구획(compartment))에서 결합이 물리적으로 일어나는지를 연구하기를 원하는 상황에 관한 것이다.

요약하면, 및 이론에 의해 한정되기를 원치 않으면서, 본 발명자들은 어떠한 선행 문헌도 세포 내에서 라이브러리의 소분자 화합물 결합 물질의 목적 단백질 또는 RNA 표적으로의 결합에 대한 인 비트로 디스플레이 라이브러리(예를 들면, DEL(DNA-Encoded Library))를 스크리닝하는 방법, 즉, 특이적 결합 물질(예를 들면, 화합물)이 목적 표적(예를 들면, 의학적으로 중요한 수용체 분자)에 결합하는 라이브러리 선택/농축 단계가 세포 내에서 수행되는 것인 방법을 직접적으로 명확하게 기술하지 않는 것으로 믿고 있다.

발명의 요약

본 발명에 의해 해결하고자 하는 과제는 목적 표적(예를 들면, 의학적으로 유의미한 수용체)으로의 목적 소분자 화합물의 결합에 대해 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 개선된 방법을 제공하는 것으로 볼 수 있다.

DEL(DNA-encoded library) 스크리닝의 대부분의 이전 예들은 세포 상황에서 분리된 정제된 재조합 단백질 상에서 수행된다. 정제된 단백질은 그들의 기능에 필수적인 결합 파트너 또는 보조인자가 결핍될 수 있고 비-고유한(non-native) 구조를 취할 수 있다. 세포 상황(cellular context) 외부에서 정제된 단백질에서의 DEL 스크리닝에서 확인된 화학 결합 물질은 따라서 생물학적 관련성(biological relevance)이 결여될 수 있다. 본 발명에서, DEL 스크리닝은 세포 내에서 발현된 단백질 상에서 수행된다. 세포 내에서, 목적 단백질은 고유한 환경에서 필수적인 결합 파트너 및 보조인자들과 상호작용할 수 있다. 따라서, 세포 내에서 DEL 스크리닝으로부터 식별된 화학적 결합 물질(chemical binding entities)은 생물학적으로 활성일 가능성이 더 높다. 후자는 약물 발견을 위해 적용될 화학적 결합 물질을 위해 특히 중요하다.

본 발명은 DEL 스크리닝이 세포 내에서 발현된 단백질에 대해 수행될 수 있게 한다. 따라서, 본 발명은 DEL 스크리닝의 대부분의 이전 예들에서 요구되는, 재조합에 의해 발현되고 정제된 단백질을 수득하기 위한 어려운 프로토콜에 의존적이지 않다.

본 명세서에서 실제 실시예에서, 본 발명자들이 어떻게 세포(즉, 제노푸스 래비스( Xenopus leavis ) 난모세포) 내에서 , 인 비트로 디스플레이 라이브러리(DNA-코딩된 라이브러리)의 스크리닝을 성공적으로 수행하고, 상기 세포 내에서 목적 단백질 표적에 결합할 수 있는 라이브러리의 다수의 개별적인 화합물 결합 물질(리간드)을 식별했는지를 기술한다.

전술된 바와 같이 및 이론에 의해 한정되지 않으면서, 본 발명자들은 그러한 "세포 내(within the cell)" 방법, 즉, 목적 표적(예를 들면, 의학적으로 중요한 수용체 분자)으로의 특이적 결합 물질(예를 들면, 화학 물질)의 결합의 라이브러리 선택/농축 단계가 세포 내에서 수행되는 것인 방법을 직접적으로 및 명확하게 기술하는 선행 문헌은 없는 것으로 믿는다.

이론에 한정되지 않으면서, 본 명세서에 기재된 실시예에서 "세포 내"에서 매우 긍정적인 스크리닝 결과를 수득하는 것이 가능하다는 것은 본 발명의 발명자들에게 일응 자명하지 않았다. - 예를 들면, 본 명세서에서 실시예 1의 결론을 참조한다.

이에 대한 하나의 이유는 세포가 다수의 단백질 및 기타 구획들을 포함하므로 세포 내에서 "단백질 밀도(proterin density)"가 매우 높다는 것으로 알려져 있다는 것이다- 예를 들면, Ron Milo의 논문을 참조한다 ("What is the total number of protein molecules per cell volume?.."; Bioessays 35: 1050-1055, 2013): "우리는 박테리아, 효모, 및 포유동물 세포에서 큐빅 마이크론(즉, 1fL) 당 2-4백만개 단백질의 범위를 추정한다."

본 발명의 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 방법과 관련하여, 세포 내의 높은 "단백질 밀도"는, 인 비트로 디스플레이 라이브러리는 다수의 (예를 들면, 10¹⁰개) 상이한 화합물 결합 물질을 포함하므로 당업자에 의해 과제인 것으로 간주되는 것이 자명하고, 라이브러리 내에서 "우수한 결합물질(good binders)"의 상당량이 목적 표적(예를 들면, 수용체)을 찾고 그에 의해 목적 표적에 결합할 수 있을 것이라는 것이 그럴듯하지 않은 것으로 간주되는 것이 자명할 것이다.

다시 말하면, 본 "세포 내" 발명의 개시 전에, 라이브러리 화합물 결합 물질의 어느 것도 실제로 세포 내에서 목적 표적(예를 들면, 수용체)을 찾고 그에 의해 결합할 수 없는 것(또는 매우 소수 만이 결합할 수 있는 것)으로 명확하게 믿었다- 즉, 그러한 시나리오에서 라이브러리의 우수한 결합 물질 화합물의 대표적인(representative) 양을 확인하지 못할 것이므로, "세포 내에서" 라이브러리 결합물질 스크리닝은 기술적으로 관련성이 없고/유용하지 않을 것이다.

본 명세서에서 검토된 바와 같이, 본 발명의 "세포 내" 라이브러리 스크리닝 방법을 이용하는 것에 의해, 본 발명자들은 다수의 개별적인 우수한 화합물 결합 물질, 즉, 라이브러리의 허용가능한 대표적인 다수의 우수한 결합 물질 화합물을 식별하였다.

따라서, 본 발명의 하나의 관련된 기술적 기여는 본 발명이 세포 내에서 인 비트로 디스플레이 라이브러리(DNA-코딩된 라이브러리)의 스크리닝을 성공적으로 수행하고, 그에 의해 세포 내에서 목적 단백질 표적에 결합할 수 있는 허용가능한 대표적인 다수의 개별적인 화합물 결합 물질(리간드)을 식별할 수 있다는 것을 입증했다는 사실과 관련된 것으로 볼 수 있다.

본 명세서의 실시예에서, 사용된 세포는 제노푸스 래비스 난모세포였다.

그러나, 앞서 검토된 가능한 세포 내에서 "단백질 밀도" 문제/이슈는 제노푸스 래비스 난모세포에만 관련된 것이 아닌 문제로 볼 수 있고, 반대로, 실질적으로 모든 목적 세포에 대한 일반적인 관심사로 볼 수 있다.

따라서, 본 명세서의 실시예가 본 발명의 방법이 제노푸스 래비스에 대해 작동한다는 것을 보여준다는 사실은 상당량의 다른 상이한 세포 종류(예를 들면, 다른 진핵생물 세포 종류, 예를 들면, 인간(예를 들면, CHO) 세포)에서도 작동할 것이라는 것을 그럴듯하게 하는 것으로 믿어진다.

따라서, 본 발명의 제1 양태는 세포 내에서 목적 단백질 또는 RNA 표적에 결합할 수 있는 라이브러리의 1종 이상의 개별적인 화합물 결합 물질(binding entity)를 식별하기 위해 세포 내에서 라이브러리의 소분자 화합물 결합 물질의 목적 단백질 또는 RNA 표적으로의 결합에 대해 인 비트로 디스플레이 라이브러리(in vitro display library)를 스크리닝하는 방법으로서, 상기 방법은:

(i): 세포에서 하나 이상의 표적 T_n을 발현시키는 단계로서, 상기 n은 1 이상이고, 상기 하나 이상의 표적은 단백질 또는 RNA이고, 상기 표적의 구조는 T-구조로 지칭되는 것인 단계;

(ii): 상기 (i)의 세포에 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 도입하는 단계로서:

(a): 상기 라이브러리는 1000개 이상의 상이한 결합 물질 B_n의 라이브러리이고, 상기 n = 1000 이상이며, 각각의 결합 물질은 핵산 분자에 부착되고, 상기 핵산 분자는 상기 결합 물질을 식별할 수 있게 하는 특정한 핵산 서열 정보를 포함하고, 상기 핵산 분자의 특정한 핵산 서열 정보를 알면, 직접적으로 상기 핵산 분자에 부착된 특정한 결합 물질의 구조를 알 수 있고, 상기 라이브러리의 결합 물질은 10000 달톤 미만의 평균 분자량 MW를 갖는 화합물이고, 상기 핵산 분자에 부착된 결합 물질의 구조는 B-구조로 지칭되며; 및

(b): 상기 라이브러리는 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 물질을 포함하는 B-구조가 동일한 표적에 결합할 수 없는 결합 물질을 포함하는 B-구조보다 효율적으로 상응하는 T-구조에 결합하는 것인 결합 조건 하에 상기 세포에 도입되고, 상기 세포 내에서 상기 라이브러리는 상기 결합 물질 중 하나 이상의 하나 이상의 표적으로의 결합을 얻어서, 세포 내에서 B_BoundToT-구조로 지칭되는, T-구조에 결합된 B-구조를 포함하는 복합체를 형성하는 것인 단계,

(iii): (ii)의 세포의 용해를 수행하여 세포의 막을 분해시키는 단계로서:

(A): 상기 세포로부터 (ii)의 B_BoundToT-구조를 나오게 하여 B_BoundToT-구조를 포함하는 용액을 수득하고, 상기 B_BoundToT-구조는 세포 내에 있지 않거나, 또는

(B): 단계 (ii)에서 표적에 결합되었고, 단계 (iii) 전에, 단계 (ii)에서 표적에 결합되지 않았던 B-구조로부터 구별될 수 있도록 마킹된(mark) B-구조를 세포로부터 나오게 하여, 결합이 마킹된(binder marked) B-구조를 포함하는 용액을 수득하고, 상기 결합이 마킹된 B-구조는 세포 내에 있지 않은 것인 단계; 및

(iv): 상기 (iii)의 용액 및 상기 B-구조의 결합 물질을 식별할 수 있게 하는 특정한 핵산 서열 정보를 포함하는 핵산 분자의 이용을 통해, (ii)의 세포 내에서 상기 하나 이상의 목적 표적에 결합하는 1종 이상의 개별적인 결합 물질을 식별하는 단계를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.

세포에서 하나 이상의 표적을 발현시키는 것과 관련된 단계 (i)은 당해 기술에 따라 수행될 수 있다- 당업자가 목적 세포에서 목적 단백질 또는 RNA 표적을 발현시키는 것은 일상적인 작업이다.

다수의 경우에, 상기 표적이 이종 발현 표적(herologous expressed target)인 것이 바람직할 수 있다.

당해 기술에 따라, 용어 "이종(heterologous)"은 정상적으로 해당 표적(예를 들면, 단백질)을 만들지(즉, 발현하지) 않는 세포에 실험에 의해 도입된 표적(예를 들면, 단백질)을 의미한다.

그러나, 일부 경우에, 표적이 세포에서 자연적으로 발현되는 표적-예를 들면, 인간(예를 들면, CHO) 세포에서 자연적으로 발현되는 인간 수용체 표적-인 것이 바람직할 수 있다. 일부 경우에, 표적, 예를 들면, 인간 수용체 표적의 변형된 버전은 형질전환 숙주로부터 유래된 세포에서 발현되는 것이 바람직할 수 있다.

앞서 검토된 바와 같이, 선행기술은 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 제조하는 다수의 상이한 방법들을 기술한다-따라서, 단계 (ii)의 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 제조하는 것은 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 제조하기 위한 공지된 선행기술 기법에 따라 수행될 수 있다.

단계 (ii)는 "(i)의 세포에 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 도입하는 것"을 의미하고- 본질적으로 이 단계는 선행기술의 공지된 기법에 기반하여 수행될 수 있다.

본 명세서의 실시예에서 검토된 바와 같이- 세포가 제노푸스 래비스 난모세포인 경우, 라이브러리는 선행기술의 공지된 주입(injection) 기법을 통해 상기 난모세포에 도입될 수 있고, 주입(예를 들면, 미세 주입)이 상당량의 다른 포유동물 세포에서 작용하지 않을 것으로 믿을 이유는 없다.

대안적으로, 및 목적 세포의 종류에 따라, 예를 들면, 형질감염(예를 들면, 전기천공 또는 화합물 기반 형질감염)에 의해 수행될 수 있다.

당업자가 단계 (ii)(b)에 따라 적합한 "결합 조건"을 식별하는 것은 통상적인 작업이다.

본질적으로, 단계 (ii)(b)의 "결합 조건"은 일반적으로 세포 내에서 자연적인 결합 조건이다- 즉, 본 발명의 장점 중 하나는 결합 물질(리간드)이 자연적인 세포 내 결합 조건일 수 있는 단계 (ii)(b)의 "결합 조건" 하에 표적에 결합할 수 있다는 것이다.

단계 (iii)은 "(ii)의 세포를 용해시켜 세포 막을 분해시키는 것"을 의미하고, 본질적으로 이 단계는 공지된 선행기술 기법에 근거하여 수행될 수 있다.

또한 단계 (iv)는 예를 들면, 앞서 검토된 바와 같이 공지된 선행기술 기법에 근거하여 수행될 수 있다.

요약하면, 및 하기에서 보다 상세하게 검토되는 바와 같이, 단계 (iv)의 "단계 (ii)의 세포 내에서 하나 이상의 목적 표적에 결합하는 1종 이상의 개별적인 결합 물질을... 식별하는 것"은 일반적인 상식 및 본 명세서의 기술적 교시에 근거하여 상이한 방식으로 수행될 수 있고, 당업자가 이 단계 (iv)를 수행하는 것은 통상적 작업이다.

요약하면, 본 명세서의 상세한 설명 및 일반적인 상식에 근거하여, 당업자는 제1 양태의 개별적인 단계 (i) 내지 단계 (iv) 모두를 다수의 상이한 방식/구체예로 수행할 수 있다.

본 발명의 구체예는 하기에서, 예시로서만, 설명된다.

발명의 상세한 설명

제1 양태의 단계 (i)

앞서 검토된 바와 같이, 단계 (i)은 하기와 같다:

"(i): 세포에서 하나 이상의 표적 T_n을 발현시키는 단계로서, 상기 n은 1 이상이고, 상기 하나 이상의 표적은 단백질 또는 RNA이고, 상기 표적의 구조는 T-구조로 지칭되는 것인 단계".

상기 표적은 임의의 적합한 목적 단백질 또는 RNA 표적일 수 있다.

앞서 검토된 바와 같이, 당업자가 목적 세포에서 목적 단백질 또는 RNA 표적을 발현시키는 것은 통상적 작업이다.

실시예에서 검토되고, 당해 기술 분야에서 알려진 바와 같이, 상기 세포가 제노푸스 래비스 난모세포인 경우, 표적의 발현은 mRNA의 주입에 의해 수행될 수 있고 그것이 바람직할 수 있다.

그러나, 상기 세포에서 표적의 발현은 다른 공지된 적절한 방식으로, 예를 들면, 목적 세포에서 목적 표적의 통상적인 재조합 발현을 통해(예를 들면, DNA로 이루어진 발현 벡터의 사용을 통해) 수행될 수 있다.

다수의 경우에, 표적이 이종 발현 표적(heterologous expressed target)인 것이 바람직할 수 있다.

일부 경우에, 상기 표적이 세포 중 특정한 세포 구획, 예를 들면, 핵에서 이종적으로 발현되는 것이 바람직할 수 있다. 당업자에게, 이는 표적 구조체(target construct)에 리더 서열 또는 신호 서열을 도입하는 것에 의해 수행될 수 있다.

바람직하게는, 상기 표적은 단백질이다.

당해 기술에서 알려진 바와 같이, 적절한 표적은 예를 들면, 인체 내에 존재하는 수용체 분자일 수 있고, 상기 수용체에 결합할 수 있는 결합 물질(예를 들면, 화합물)을 식별하는데 관심이 있을 것이다.

따라서, 상기 표적은 바람직하게는, 수용체, 예를 들면, 수용체 단백질 분자일 수 있다.

선행 기술에 따라, 적합한 예는 표적이 자가항원, 박테리아 단백질, 혈액 단백질, 세포 부착 단백질, 사이토카인, 세포골격(cytoskeleton) 단백질, DNA-결합 단백질, 발생(developmental) 단백질, 조작된(engineered) 단백질, 효소, 세포외 기질 단백질, GTP-결합 단백질 조절자, 당단백질(glycoprotein), 성장 인자, 열충격 단백질(heat shock protein), 지질단백질(lipoprotein), 막 단백질, 금속단백질(metalloprotein), 운동 단백질(motor protein), 인단백질(phosphoprotein), 프리온(prion), 단백질 복합체, 단백질 도메인, RNA-결합 단백질, 수용체, 재조합 단백질, 종자 저장(seed storage) 단백질, 구조 단백질, 전사 공조절자 단백질(transcription coregulator protein), 수송 단백질(transport protein), 바이러스 단백질 또는 그의 단편인 것일 수 있다.

요약하면, 당업자는 본 상황에서 흥미로울 수 있는 다수의 상이한 가능한 표적들을 알고 있다.

일부 경우에, 발현된 표적 단백질을, 예를 들면, 인산화, 메틸화, 아세틸화, 또는 탈인산화에 의해 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 당업자에 의해, 이는 표적 단백질과 함께 변형 효소(modifying enzyme), 예를 들면, 키나아제, 메틸트랜스퍼라아제, 아세틸트랜스퍼라아제, 또는 포스파타아제를 공-발현시키는 것에 의해 수행될 수 있다.

앞서 검토된 바와 같이, 본 명세서의 실시예가 본 발명의 방법이 세포가 제노푸스 래비스 난모세포인 경우 작동한다는 것을 보여준다는 사실은 상당량의 다른 상이한 세포 종류(예를 들면, 다른 진핵생물 세포 종류, 예를 들면, 인간(예를 들면, CHO) 세포))에서도 작동할 것이라는 것을 그럴듯하게 하는 것으로 믿어진다.

바람직하게는, 상기 세포는 진핵 세포, 예를 들면, 포유동물 세포이고, 바람직하게는 상기 포유동물 세포는 인간 세포(예를 들면, CHO)이다.

본 명세서의 실시예에서, 다수의 상이한 결합 물질을 포함하는 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 하나의 개별적인 세포 (즉, 제노푸스 래비스 난모세포) 내로 (주입을 통해) 도입시키는 것이 가능하다는 것이 확인된다.

따라서, 바람직한 구체예에서, 상기 세포는 제노푸스 난모세포, 예를 들면, 제노푸스 트로피칼리스(Xenopus tropicalis) 난모세포, 또는 제노푸스 래비스(Xenopus laevis) 난모세포이고, 가장 바람직하게는, 상기 세포는 제노푸스 래비스 난모세포이다.

단계 (i)의 용어 "세포(a cell)"는 단일 세포일 수 있다(예를 들면, 상기 세포가 제노푸스 래비스(Xenopus laevis) 난모세포인 경우).

그러나, 본 발명에서 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 단계 (i)의 용어 "세포"는 실제로 다수의 경우 세포의 집단으로서, 상기 집단의 세포들이 목적 표적을 재조합에 의해 발현하는 것인 집단을 의미한다.

예를 들면, 상기 표적이 목적 세포 종류 (예를 들면, 인간 CHO 세포)에서 표적의 표준/통상적 재조합 발현에서 예를 들면, 발현 벡터의 이용에 의해 발현되는 경우, 이는 일반적으로 세포의 집단을 생성할 것이고, 상기 집단의 개별적인 세포들은 목적 표적을 재조합적으로 발현한다.

제1 양태의 단계 (i)은 "하나 이상의 표적 T_n으로서, n = 1 이상"으로 기재된다.

본 명세서에 기재된 방법의 장점은 예를 들면, 2개 이상의 표적에 결합할 수 있는 결합 물질에 대한 동시 스크리닝이 효율적이고 신속한 방식으로 수행될 수 있다는 것이다.

예를 들면, 표적은 2개의 상이한 수용체 분자이고, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 수용체들 중 하나에 결합하는 하나의 결합 물질 및 나머지 수용체에 결합하는 또 다른 결합 물질을 동시에 식별할 수 있다.

(2개의 상이한, 예를 들면, 수용체 표적을 갖는) 전술된 예에서, 본 발명자들은 표적이 Tn (n = 2) 또는 대안적으로 T₂로 표현된 것인 상황을 가질 것이다.

이에 따라, 단계 (i)에서 적어도 2개의 상이한 표적 [즉, Tn (n = 2 이상], 또는 단계 (i)에서 적어도 3개의 상이한 표적[즉, Tn (n = 3 이상], 또는 단계 (i)에서 적어도 10개의 상이한 표적 [즉, Tn (n = 10 이상], 또는 단계 (i)에서 적어도 100개의 상이한 표적 [즉, Tn (n = 100 이상]을 갖는 것이 적절할 수 있다.

이론에 한정되지 않으면서, 단계 (i)에서 1000개가 넘는 상이한 표적들, 즉, 세포 중 1000종이 넘는 상이한 T-구조를 갖는 것은 어려울 수 있다.

제1 양태의 단계 (ii)

앞서 검토된 바와 같이, 단계 (ii)는 하기와 같다:

"(ii): 상기 (i)의 세포에 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 도입하는 단계로서:

(a): 상기 라이브러리는 1000개 이상의 상이한 결합 물질 B_n의 라이브러리이고,...상기 라이브러리의 결합 물질은 10000 달톤 미만의 평균 분자량 MW를 갖는 화합물이고; 및

(b): 상기 라이브러리는 결합 조건 하에서 상기 세포에 도입되는 것인 단계."

단계 (ii)는 "상기 (i)의 세포에 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 도입하는 단계"를 의미하고, 본질적으로 이 단계는 공지된 선행기술 기법에 근거하여 수행될 수 있다.

본 명세서 중 실시예에서 검토된 바와 같이, 세포가 제노푸스 래비스 난모세포인 경우, 상기 라이브러리를 선행기술의 공지된 주입 기법을 통해 난모세포에 도입할 수 있고, 주입(예를 들면, 미세주입)이 상당량의 다른 포유동물 세포 종류에서 작동하지 않을 것으로 믿을 이유는 없다.

본 명세서의 실시예에서, (주입을 통해) 하나의 단일 세포(즉, 제노푸스 래비스 난모세포)로 다수의(약 10⁸개) 상이한 결합 물질을 포함하는 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 도입하는 것이 가능하다는 것이 확인된다.

단계 (ii)의 용어 "세포"는 단일 세포일 수 있다 (예를 들면, 상기 세포가 제노푸스 래비스 난모세포인 경우).

그러나, 전술된 바와 같이, 단계 (i)의 용어 "세포"는 실제로 많은 경우에 세포의 집단을 의미할 수 있고, 그러한 경우, 단계 (ii)의 용어 "세포"는 실제로 단계 (i)의 세포의 집단일 수 있다.

본 발명에서 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 단계 (ii)에서 예를 들면, 형질감염에 의해 단계 (i)의 세포 (예를 들면, 재조합적으로 발현된 표적을 갖는 인간 CHO)의 집단으로 예를 들면, 10⁶ 개의 상이한 결합 물질의 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 도입하는 경우, 상기 집단의 각 세포 내로 상이한 개수의 결합 물질이 도입될 수 있고, 예를 들면, 상기 집단의 일부 세포는 5개 미만의 결합 물질(예를 들면, 1개의 결합 물질)을 포함할 수 있고, 상기 집단의 다른 세포들은 1000가 넘는 상이한 결합 물질을 포함할 수 있다.

용어 "인 비트로 디스플레이 라이브러리(in vitro display library)"는 당해 기술에 따라, 각각의 결합 물질이 핵산 분자에 부착되고, 상기 핵산 분자는 상기 결합 물질을 식별할 수 있게 하는 특정한 핵산 서열을 포함하는, 즉, 상기 핵산 분자의 특정한 핵산 서열 정보를 알면, 직접적으로 상기 핵산 분자에 부착된 특정한 결합 물질의 구조를 알 수 있는 것인 다수의 상이한 결합 물질을 포함하는 라이브러리로 이해될 것이고, 상기 핵산 분자(유전형)에 부착된 결합 물질(즉, 표현형)의 구조는 본 명세서에서 B-구조(B-structure)로 지칭된다.

본 명세서에서 검토된 바와 같이, 선행기술은 그러한 인 비트로 디스플레이 라이브러리, 즉, 단계 (i)의 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 제조하기 위한 다수의 상이한 방법들을 기술한다.

바꾸어 말하면, 당업자가 핵산 분자(유전형)에 부착된 결합 물질(즉, 표현형)의 구조, 즉, 본 명세서에서 "B-구조"로 지칭되는 구조를 적절하게 제조하는 것은 통상적 작업이다.

당해 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 결합 물질(즉, 표현형)은 예를 들면, 공유 결합, 또는 예를 들면, 고친화도 비-공유결합에 의해 핵산 분자(유전형)에 부착될 수 있다.

본 발명에서 결합 물질(즉, 표현형)이 공유 결합에 의해 핵산 분자(유전형)에 부착되는 것이 바람직할 수 있다.

단계 (i)의 인 비트로 디스플레이 라이브러리는 다수의 상이한 B-구조를 포함하고, 즉, 전술된 바와 같이, 당업자가 단계 (i)의 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 제조하는 것은 통상적인 작업이다.

본 명세서에서 적합한 예들은 예를 들면, EP1809743B1 (Vipergen), EP1402024B1 (Nuevolution), EP1423400B1 (David Liu), Nature Chem. Biol. (2009), 5:647-654 (Clark), WO 00/23458 (Harbury), Nature Methods (2006), 3(7), 561-570, 2006 (Miller), Nat. Biotechnol. 2004; 22, 568-574 (Melkko), Nature. (1990); 346(6287), 818-822 (Ellington), 또는 Proc Natl Acad Sci USA (1997). 94 (23): 12297-302 (Roberts)를 포함한다.

바꾸어 말하면, 제1 양태의 단계 (i)의 인 비트로 디스플레이 라이브러리는 선행기술에 기재된 다수의 방식으로 제공될 수 있다.

이론에 한정되지 않으면서, 본 발명에서 인 비트로 디스플레이 라이브러리 기술의 적합한 예는 DNA 코딩 화합물 라이브러리(DNA Encoded Chemical Library) 기술, 앱타머(Aptamer) 기술, RNA/DNA 디스플레이 기술, 예를 들면, CIS 디스플레이, 리보솜 디스플레이, mRNA 디스플레이 또는 비드 디스플레이 시스템 (인코딩을 위한 핵산을 이용함)을 포함한다.

선행기술(예를 들면, EP1809743B1 (Vipergen))에 기술된 바와 같이, B-구조의 핵산 분자는 예를 들면, PNA, LNA, RNA, DNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직하게는, 상기 B-구조의 핵산 분자는 DNA이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, B-구조 중 결합 물질(표현형)에 부착된 핵산 분자(유전형)는 이중가닥 핵산 분자일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 B-구조의 결합 물질(표현형)에 부착된 핵산 분자(유전형)는 적어도 0% 이중가닥(즉, 단일가닥)일 수 있고, 적어도 10% 이중가닥, 적어도 20% 이중가닥, 적어도 30% 이중가닥, 적어도 40% 이중가닥, 적어도 50% 이중가닥, 적어도 60% 이중가닥, 적어도 70% 이중가닥, 적어도 80% 이중가닥, 적어도 90% 이중가닥, 또는 100% 이중가닥일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 B-구조의 결합 물질(표현형)에 부착된 핵산 분자(유전형)는 PCR 프라이밍 부위(priming site) 또는 그의 부분을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 B-구조의 결합 물질(표현형)에 부착된 핵산 분자(유전형)는 적어도 2개의 PCR 프라이밍 부위 또는 그의 부분을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 B-구조의 결합 물질(표현형)에 부착된 핵산 분자(유전형)는 적어도 3개의 PCR 프라이밍 부위 또는 그의 부분을 포함할 수 있다.

본 발명의 일부 구체예에서, PCR 프라이밍 부위의 부분은 적어도 5개의 뉴클레오티드, 적어도 6개의 뉴클레오티드, 적어도 7개의 뉴클레오티드, 적어도 8개의 뉴클레오티드, 적어도 9개의 뉴클레오티드, 적어도 10개의 뉴클레오티드, 적어도 11개의 뉴클레오티드, 적어도 12개의 뉴클레오티드, 적어도 13개의 뉴클레오티드, 적어도 14개의 뉴클레오티드, 적어도 15개의 뉴클레오티드, 적어도 16개의 뉴클레오티드, 적어도 17개의 뉴클레오티드, 적어도 18개의 뉴클레오티드, 적어도 19개의 뉴클레오티드, 또는 적어도 20개의 뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 일부 구체예에서, 상기 B-구조의 결합 물질(표현형)에 부착된 핵산 분자(유전형)(예를 들면, 하기에서 검토되는 베이트(bait)에 부착된 핵산 분자) 는 본 명세서에 기재된 방법에서 사용된 또 다른 관련된 핵산 분자(유전형)의 단일가닥 오버행에 대한 단일가닥 오버행 역방향 상보체(reverse complement)를 포함할 수 있다. 상기 오버행은 우선적으로 길이가 1개의 뉴클레오티드, 2개의 뉴클레오티드, 3개의 뉴클레오티드, 4개의 뉴클레오티드, 5개의 뉴클레오티드, 6개의 뉴클레오티드, 7개의 뉴클레오티드, 8개의 뉴클레오티드, 9개의 뉴클레오티드, 또는 10개의 뉴클레오티드일 수 있다.

상기 결합 물질은 적합한 목적 결합 물질일 수 있고, 상기 라이브러리의 결합 물질은 10000 달톤 미만의 평균 분자량 MW, 보다 바람직하게는 5000 달톤 미만의 평균 분자량 MW, 훨씬 더 바람직하게는 1000 달톤 미만의 평균 분자량 MW의 화합물이다.

본 발명에서 적합한 화합물 결합 물질의 적절한 예는 선행 기술에서 찾을 수 있다. 예를 들면, EP1809743B1 (Vipergen), EP1402024B1 (Nuevolution), EP1423400B1 (David Liu), Nature Chem. Biol. (2009), 5:647-654 (Clark), WO 00/23458 (Harbury), Nature Methods (2006), 3(7), 561-570, 2006 (Miller), Nat. Biotechnol. 2004; 22, 568-574 (Melkko), Nature. (1990); 346(6287), 818-822 (Ellington), 또는 Proc Natl Acad Sci USA (1997). 94 (23): 12297-302 (Roberts)를 참조한다.

요약하면, 당업자는 본 발명에서 흥미로울 수 있는 다수의 상이한 가능한 결합 물질을 알고 있다.

제1 양태의 단계 (ii)는 "n = 1000 이상인 것인 1000개 이상의 상이한 결합 물질 B_n"으로 기술된다.

실제로, 단계 (i)의 라이브러리에 더 많은 결합 물질, 예를 들면, 적어도 10⁴, 적어도 10⁶ 또는 적어도 10⁸개의 상이한 결합 물질이 있을 수 있고, 즉, n= 적어도 10⁴, n= 적어도 10⁶ 또는 n= 적어도 10⁸일 수 있다.

본 명세서의 실시예에서, 하나의 개별적인 세포(즉, 제노푸스 래비스 난모세포) 내로 (주입을 통해) 다수(약 10⁸개)의 상이한 결합 물질을 포함하는 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 도입할 수 있다는 것이 보여진다.

따라서, 이론적 상황에서, 상기 라이브러리가 정확하게 10⁴개의 상이한 결합 물질을 포함하는 경우, 본 명세서에서 이를 B_n (n = 10⁴) 또는 B₁₀ ⁴로 표현할 수 있다.

이론에 한정되지 않으면서, 10²⁰ 개가 넘는 상이한 결합 물질을 갖는 라이브러리를 제조하는 것은 어려울 수 있다.

단계 (ii)(b)는 하기와 같다:

"(b): 상기 라이브러리는 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 물질을 포함하는 B-구조가 동일한 표적에 결합할 수 없는 결합 물질을 포함하는 B-구조보다 효율적으로 상응하는 T-구조에 결합하는 것인 결합 조건 하에 상기 세포에 도입되고, 상기 세포 내에서 상기 라이브러리는 상기 결합 물질 중 하나 이상의 하나 이상의 표적으로의 결합을 얻어서, 세포 내에서 B_BoundToT-구조로 지칭되는, T-구조에 결합된 B-구조를 포함하는 복합체를 형성하는 것인 단계"

용어 "보다 효율적으로 결합한다(binds more efficiently)"는 일반적인 관행(common practice)에 따라, 예를 들면, 더 높은 친화도, 더 빠른 속도, 또는 더 느린 해리 속도(dissociation rate)로 이해될 것이다.

당업자에게 알려진 바와 같이, 본 발명에서, 당업자가 이러한 "보다 효율적으로 결합하는(binds more efficiently)" 효과를 얻는 조건 하에 단계 (ii)(b)를 수행하는 것은 통상적인 작업이다.

당업자가 단계 (ii)(b)의 요구되는 "보다 효율적으로 결합하는" 효과를 얻기 위해 단계 (ii)(b)의 결합 조건을 최적화하는 것은 통상적인 작업일 것이다.

앞서 검토된 바와 같이, 단계(ii)(b)의 "결합 조건"은 일반적으로 세포 내의 자연적인 결합 조건이고, 즉, 본 발명의 장점 중 하나는 결합 물질(리간드)이 세포 내 자연적인 결합 조건일 수 있는 단계 (ii)(b)의 "결합 조건" 하에 표적에 결합할 수 있다는 것이다.

당업자에게 알려진 바와 같이, 본 발명에서, 적절한 최적화 파라미터는 예를 들면, 이온 강도, 온도 등일 수 있다.

따라서, 본 발명에서 실질적인 적절한 상황 하에, 당업자는 (예를 들면, 결합 조건의 적절한 일상적 조정 후에) 단계 (ii)(b)의 결합 조건 하에 작업할 것인지 여부에 대해 어떠한 합리적인 의심도 갖지 않을 것이다.

바람직한 구체예에서, 단계 (ii)(b)는 결합 조건 하에 수행되고, 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 물질을 포함하는 B-구조는 동일한 표적에 결합할 수 없는 결합 물질을 포함하는 B-구조보다 상응하는 T-구조에 10배(보다 바람직하게는 100배, 훨씬 더 바람직하게는 1000배) 더 효율적으로 결합한다.

본 명세서에 기재된 방법은 결합 물질의 표적으로의 결합에 대한 주요한 결합 특성, 예를 들면, 효능(potency)(친화도), 결합 물질과 표적의 회합(association) 속도(결합 속도(on rate)), 또는 해리 반감기(dissociative half life) (분리 속도(off rate))에 대해 최적화할 수 있게 한다.

친화도 기반 선택은 결합 단계 (ii)(b)에서, 예를 들면, 평형 조건을 이용하는 것에 의해 달성되고, 결합 단계에서 표적 농도에 의해 제어되고, 예를 들면, 표적 농도보다 10배 더 낮은 K_d를 갖는, 디스플레이 라이브러리 중 결합 물질의 분자의 90%가 표적에 결합하는 결합 조건 또는 표적 농도보다 2배 더 낮은 K_d를 갖는, 디스플레이 라이브러리 중 결합 물질의 분자의 90%가 표적에 결합하는 결합 조건에서 달성된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, "결합 단계인 단계(ii)(b)"에서 T-구조의 농도는 적어도 10^-15 M, 적어도 10^-14 M, 적어도 10^-13 M, 적어도 10^-12 M, 적어도 10^-11 M, 적어도 10^-10 M, 적어도 10^-9 M, 적어도 10^-8 M, 적어도 10^-7 M, 적어도 10^-6 M, 적어도 10^-5 M, 또는, 적어도 10^-4 M이다.

본 명세서의 실시예에서(하기 참조), "결합 단계" 단계 (ii)(b)에서 T-구조의 농도는 약 200 x 10^-9 M이었다.

대안적으로, 회합 속도(association rate) 기반 선택은 결합 단계 단계 (ii)(b)에 대해 허용된 시간을 제어하는 것에 의해 달성되고, 따라서, "결합 단계"는 결합 평형 조건에 도달하기 위해 필요한 시간보다 더 짧은 기간 동안 수행될 수 있다.

제1 양태의 단계 (iii)

앞서 검토된 바와 같이, 단계 (iii)은 하기와 같다:

"(iii): (ii)의 세포의 용해를 수행하여 세포의 막을 분해시키는 단계로서:

(B): 단계 (ii)에서 표적에 결합되었고, 단계 (iii) 전에, 단계 (ii)에서 표적에 결합되지 않았던 B-구조로부터 구별될 수 있도록 마킹된(mark), 마킹된 B-구조를 세포로부터 나오게 하여, 결합이 마킹된(binder marked) B-구조를 포함하는 용액을 수득하고, 상기 결합이 마킹된 B-구조는 세포 내에 있지 않은 것인 단계"

단계 (iii)은 "(ii)의 세포를 용해시켜 세포의 막을 분해시키는 단계"를 의미하고, 본질적으로, 이 단계는 선행기술의 공지된 기법, 예를 들면, 기계적 파쇄(mechanical crushing)(예를 들면, 원심분리 또는 피펫팅) 또는 화학적 용해(예를 들면, 막을 용해시키기 위한 SDS의 사용)에 근거하여 수행될 수 있다.

당업자의 공통된 일반적 상식 및 본 명세서의 기술적 교시(예를 들면, 하기 참조)를 고려할 때, 당업자는 다수의 상이한 적합한 방법으로 단계 (iii)을 수행할수 있다.

당업자에 의해 이해되고, 본 명세서에서 검토된 바와 같이, 옵션 단계 (iii)(A) 또는 단계 (iii)(B)를 사용하는지는 식별하는 단계 (iv)를 어떻게 수행하는 것을 원하는지와 관계된 것으로 볼 수 있다.

단계 (iii)이 단계 (iii)(A)인 것이 바람직할 수 있다.

도 1에 도시된 바와 같이, 단계 (iii)이 단계 (iii)(A)인 상황에서, 예를 들면, 단계 (iv)는:

- 상기 B_BoundToT-구조의 표적의 고체 지지체로의 결합을 통해 상기 용액 (iii)(A)의 B_BoundToT-구조를 상기 고체 지지체에 결합시키고, 상기 표적에 결합되지 않고, 따라서 상기 고체 지지체에 결합되지 않은 B-구조를 제거하고; 및

- 상기 고체 지지체에 결합된 B_BoundToT-구조의 결합 물질을 식별할 수 있게 하는 상기 특정한 핵산 서열 정보의 이용을 통해, (ii)의 세포 내에서 하나 이상의 목적 표적에 결합하는 1종 이상의 개별적인 결합 물질을 식별하는 것에 의해 수행된다.

본 명세서의 도 2 및 실시예에서 예시된 바와 같이, 단계 (iii)이 단계 (iii)(A)인 상황에서, 본 명세서에 기재된 방법은 바람직하게는:

- 제1 양태의 (i)의 T-구조는 프레이(prey)(예를 들면, 표적-프레이 융합 단백질)를 포함하고, 제1 양태의 단계 (ii)에서 핵산 분자(예를 들면, 상기 B-구조의 핵산 분자에 상보적인 접착(cohesive) 말단을 갖는 핵산 분자)에 부착된 베이트(bait)가 도입되고 상기 핵산 분자는 특정한 표적을 식별할 수 있게 하는 특정한 핵산 서열 정보를 포함하고, 상기 베이트는 제1 양태의 단계 (ii)에서 상기 표적의 프레이에 결합하여, 표적의 프레이에 결합된 베이트를 갖는 B_BoundToT-구조를 형성하고;

- (iii)(A)의 용해 단계 후에, 상기 표적의 프레이에 결합된 베이트를 갖는 B_BoundToT-구조의 핵산 분자를 (예를 들면, 리가아제의 이용에 의한 라이게이션에 의해) 융합시키고, 상기 융합된 핵산 분자는 결합 물질 및 표적을 식별할 수 있게 하는 서열 정보를 포함하며; 및

- 단계 (iv)에서 이전 단계의 융합된(예를 들면, 라이게이션된) 핵산 분자의 결합 물질과 표적을 식별할 수 있게 하는 특정한 핵산 서열 정보의 이용을 통해, 상기 (ii)의 세포 내에서 하나 이상 목적 표적에 결합하는 하나 이상의 개별적인 결합 물질을 식별하는 것인 방법에 의해 수행될 수 있다.

"상기 표적의 프레이에 결합된 베이트를 갖는 B_BoundToT-구조의 핵산 분자를 (예를 들면, 리가아제의 이용에 의한 라이게이션에 의해) 융합시키는" 단계 전에, 희석 단계(세포 용해 단계 (iii)으로부터 수득된 용액(예를 들면, 상층액)의 희석 단계)를 수행하는 것이 바람직할 수 있다.

세포 용해 단계 (iii)(바람직하게는 단계 (iii)(A))으로부터 수득된 용액(예를 들면, 상층액)의 희석 단계는 상기 용액을 적어도 10² 배, 예를 들면, 적어도 10³ 배, 적어도 10⁴ 배, 또는 적어도 10⁵ 배 희석시키는 것이 바람직할 수 있다.

본 명세서의 실시예에서(하기 참조), 상기 용액의 희석은 약 10⁴ 배였다.

이 희석 단계의 장점은 결합되지 않은 B-구조와 T-구조(즉, B-구조 및 T-구조 자체로서 단독)가 희석 후에 용액 내에서 상호 간에 훨씬 더 물리적으로 떨어질 수 있고, "상기 B_BoundToT-구조의 핵산 분자를 융합시키는" 단계 후에 "위 양성(false positive)"이 더 적을 것이다.

"상기 표적의 프레이에 결합된 베이트를 갖는 B_BoundToT-구조의 핵산 분자를 (예를 들면, 리가아제의 이용에 의한 라이게이션에 의해) 융합시키는" 단계 후에, 예를 들면, 후속 증폭(예를 들면, PCR을 통한 증폭) 단계를 위해 보다 순수한 핵산 분자(예를 들면, DNA)를 갖기 위해, 융합된(예를 들면, 라이게이션된) 핵산 분자의 정제를 수행하는 것이 바람직할 수 있다.

당업자는 목적 핵산 분자(예를 들면, DNA)를 정제하기 위해 다수의 상이한 전략들, 예를 들면, 아가로오스 겔 전기영동, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 스핀-컬럼(spin-column) 등이나 이에 한정되지 않는 전략들을 일상적으로 파악할 수 있다.

"식별하는" 단계 (iv)는 바람직하게는 결합 물질 및 표적에 대한 서열 정보를 포함하는 융합된 핵산 분자가 (바람직하게는 PCR(polymerase chain reaction)의 이용에 의해) 증폭되는 것인 단계를 포함한다.

명백한 바와 같이, 단계 (i)에서 단 하나의 표적(즉 n = 1)이 있는 경우, 1종 이상의 개별적인 결합 물질의 식별은 본질적으로 상기 결합 물질을 식별할 수 있게 하는 특정한 핵산 서열 정보의 이용에 의해 수행된다.

본 발명의 생물공학의 관련된 분야 내에서 선행 기술은 예를 들면, 하기와 같은 다수의 적절한 "프레이-베이트(prey-bait)" 시스템을 기재한다:

- 프레이: 4량체 스트렙타비딘 및 베이트: 비오틴;

- 프레이: 단량체 스트렙타비딘 (예를 들면, mSA2) 및 베이트: 비오틴;

- 프레이: His-tag 및 베이트: NTA;

- 프레이: SNAP-tag® 및 베이트: 벤질 구아닌 (BG);

- 프레이: Halo-Tag® 및 베이트: 관능기에 결합된 반응성 클로로알칸 링커;

- 프레이: 탄산 탈수소효소 IX (CAIX) 및 베이트: VD11-4-2; 또는

- 프레이: 말토오스 결합 단백질 (MBP), 및 베이트: 말토오스 또는 말토트리오스.

본 명세서의 실시예에서, "프레이-베이트(prey-bait)" 시스템은 프레이: CAIX(carbonic anhydrase IX) 및 베이트: VD11-4-2이고, 따라서, 이는 바람직한 "프레이-베이트" 시스템이다.

상기 "프레이-베이트" 시스템- 프레이: CAIX(carbonic anhydrase IX) 및 베이트: VD11-4-2는 예를 들면, V. Dudutiene et al.의 논문 ("Discovery and Characterization of Novel Selective Inhibitors of Carbonic Anhydrase IX"; J. Med. Chem. 2014, 57, 9435-9446)에 기재되고, 이 논문에서 VD11-4-2는 하기 구조를 갖는 소분자 화합물(small chemical compound)로 기재된다:

바람직하게는, 프레이를 포함하는, 제1 양태의 (i)의 T-구조는 세포 내에서 표적-프레이 융합 단백질 (예를 들면, 표적-CAIX)을 발현시키는 것에 의해 수득된다. - 예를 들면, 이의 예를 위해 본 명세서의 실시예를 참조한다.

당업자가 목적 세포 내에서 표적-프레이 융합 단백질을 발현시키는 것은 통상적인 작업이다.

가능한 구체예는 베이트가 실제로 결합 물질(즉, 리간드)의 결합 부위와 상이한, 표적의 결합 부위에 결합하는 것일 수 있다.

본 발명에서, "상기 표적의 프레이에 결합된 베이트를 갖는 B_BoundToT-구조의 핵산 분자를 (예를 들면, 라이게이션에 의해) 융합시키는" 것은 2개의 유전형(즉, 결합 물질에 대한 서열 정보를 갖는 핵산 분자와 표적에 대한 서열 정보를 갖는 핵산 분자)에 의해 운반되는 유전 정보를 합치는 것으로 이해될 것이다.

당업자에게 공지된 바와 같이(예를 들면, EP2622073B1(Vipergen)의 [0166] 참조), 이 "융합"은 여러 방법으로, 예를 들면 하기와 같은 방법으로 달성될 수 있다:

a) 예를 들면, 오버랩(overlap) PCR 또는 오버랩 게놈 신장(genome extension)에 의한 정보 전달;

b) 증폭가능한 활성화 결합(amplifiable facilitating bond)을 형성하는 효소, 예를 들면, 각각의 핵산 분자로부터의 하나 이상의 가닥 간에 포스포르디에스테르 결합이 형성되는 것인 DNA 리가아제에 의한 정보 연결(information joining).

바람직하게는, 상기 융합은 리가아제의 이용을 통한 라이게이션에 의해 수행된다.

예를 들면, 리가아제 효소가 핵산 분자의 융합을 위해 사용되는 경우, 핵산 분자들 간 염기쌍 형성 중복 영역(overlapping region)을 가질 필요가 없다.

그러나, (리가아제가 사용되는지 여부에 관계 없이) 상기 베이트에 부착된 핵산 분자가 B-구조의 핵산 분자에 상보적인 접착 말단을 갖는 핵산 분자인 경우, 보다 바람직하게는, 상기 B-구조의 핵산 분자와 상기 베이트에 부착된 핵산 분자 모두의 핵산 분자의 상보적 접착 말단에 포스포로티오에이트 결합이 있는 경우가 바람직할 수 있다.

바람직하게는, 포스포로티오에이트 결합이 상기 B-구조의 핵산 분자와 상기 베이트에 부착된 핵산 분자의 상보적 접합 말단에서 포스페이트 백본에 도입된다. 포스포로티오에이트 결합의 개수는 각 핵산 분자에 대해 우선적으로 적어도 1개의 포스포로티오에이트 결합, 적어도 2개의 포스포로티오에이트 결합, 또는 보다 바람직하게는 적어도 3개의 포스포로티오에이트 결합일 수 있다.

본 명세서의 실시예에서, 3개의 포스포로티오에이트 결합이 이용되었고, 본 명세서에서 실시예 2의 결과는 3개의 포스포로티오에이트 결합의 이용이 본 발명에서 비변형(unmodified) DNA (즉, 0개의 포스포로티오에이트 결합)의 이용에 비해 놀라운 유의한 기술적 장점을 제공한다는 것을 입증한다.

일부 경우에, 포스포로티오에이트 결합의 개수는 각 핵산 분자에 대해 우선적으로 적어도 4개의 포스포로티오에이트 결합, 예를 들면, 적어도 10개의 포스포로티오에이트 결합, 또는 적어도 20개의 포스포로티오에티트 결합일 수 있다.

B-구조와 유사하게, 베이트에 부착된 핵산 분자는 예를 들면, PNA, LNA, RNA, DNA 또는 이들의 조합이고 - 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 DNA이다.

앞서 검토된 B-구조의 핵산 분자(예를 들면, 이중 가닥 핵산 분자일 수 있고; PCR 프라이밍 부위를 포함할 수 있고; 등)에 대한 기타 바람직한 구체예는 또한 상기 베이트에 부착된 핵산 분자에 대한 바람직한 구체예일 수 있다.

상기 B_BoundToT-구조의 표적으로의 결합 물질의 상당한 결합이 있는 것인 "상기 핵산 분자를 (예를 들면, 라이게이션에 의해) 융합시키는" 단계가 수행될 수 있다-이의 예는 본 명세서의 도 2 및 실시예에서 설명된다.

그러나, 예를 들면, EP2622073B1(Vipergen)에서 검토된 바와 같이, 상기 B_BoundToT-구조의 표적으로의 결합 물질의 결합이 본질적으로 없는 것인 "상기 핵산 분자를 (예를 들면, 라이게이션에 의해) 융합시키는" 단계가 수행될 수 있다- 즉, 이것도 본 명세서에 기재된 방법에 대한 가능한 옵션이다.

따라서, 및 예를 들면, EP2622073B1(Vipergen)에 따라, 상기 B_BoundToT-구조의 핵산 분자와 표적의 프레이에 결합된 베이트를 (예를 들면, 리가아제의 이용에 의한 라이게이션에 의해) 융합시키는 용해 후 단계(after lysis step) (iiiA)는 EP2622073B1(Vipergen)의 청구항 1의 단계 (iv) 내지 (vi)에 따라 - 즉,

(A): 수득된 표적의 프레이에 결합된 베이트를 갖는 B_BoundToT-구조를 결합 조건 하에 인 비트로 구획화(compartmentalization) 시스템에 적용하는 단계로서, 상기 결합 조건은 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 물질을 포함하는 B-구조가, 동일한 표적에 결합할 수 없는 결합 물질을 포함하는 B-구조보다 상응하는 T-구조에 더 효율적으로 결합하는 조건이고, 바람직하게는, 상기 구획화 시스템은 상기 B-구조, T-구조, 및 B_BoundToT-구조가 개별적인 구획에 무작위로 들어가는 것인 조건 하에서 단계 (ii)에서 도입된 B-구조의 개수보다 적어도 2배 더 많은 개별적인 구획을 포함하는 것인 단계; 및

(B): 동일한 개별적인 구획 내에 존재하는 B-구조 및 T-구조의 핵산 분자들을 융합시키는 단계로서, 상기 B-구조의 핵산 분자를 상기 T-구조의 핵산 분자에 융합시키고, 형성된 구조는 BT_Fused-구조로 지칭되며, 상기 BT_Fused-구조는 상기 결합 물질을 식별할 수 있게 하는 특정한 핵산 서열 정보 및 특정한 표적을 식별할 수 있게 하는 특정한 서열 정보를 포함하는 것인 단계; 및

(C): 단계 (B)의 개별적인 구획의 내용물을 B-구조 및 T-구조의 핵산 분자들의 융합이 없는, 단계 (B)에서 이미 형성되지 않았던, 새로운 BT_Fused-구조는 생성되지 않는 것인 조건 하에 통합하여 BT_Fused-구조의 라이브러리를 수득하고, 상기 라이브러리는 표적와 결합 물질의 비결합 쌍(nonbinding pair)으로부터 유래되는 BT_Fused-구조에 비해 표적과 결합 물질의 결합 쌍(binding pair)으로부터 유래되는 BT_Fused-구조의 종들의 농축된 라이브러리(enriched library)인 것인 단계;에 의해 수행될 수 있고, 및

상기 B_BoundToT-구조는 단계 (A)의 개별적인 구획 중 용액에 현탁된 상태로 남고; 및/또는

상기 방법은 고체 지지체로의 표적 고정화에 의존하지 않고; 및

상기 단계 (C)의 농축된 라이브러리에 존재하는 BT_Fused-구조의 핵산이 증폭된다.

제1 양태의 단계 (iii)은 단계 (iii)(B)인 것이 바람직할 수 있다.

단계 (iii)이 단계 (iii)(B)인 경우, 본 명세서에 기재된 방법은:

- 제1 양태의 (i)의 T-구조는 상기 표적에 융합된 효소를 포함하고, 바람직하게는 이 효소는, 제1 양태의 (ii)의 B_BoundToT-구조의 결합 물질 및 표적의 결합에 의해 생성된 근접성(proximity) 때문에, B_BoundToT-구조의 B-구조 상에서 B-구조를 마킹하는 반응을 할 수 있고, 이로써 B_BoundToT-구조의 B-구조를 표적에 결합하지 않았던 B-구조로부터 구별할 수 있게 하는 것인 방법일 수 있다.

일 실시예는 예를 들면, 상기 표적에 융합된 효소가 리가아제이고, 제1 양태의 단계 (ii)에서 상기 B-구조의 핵산 분자 물질에 대한 상보적 접착 말단을 갖는 핵산 분자가 도입되고, 근접성 때문에 상기 리가아제가 상기 도입된 핵산 분자를 상기 B-구조의 핵산 분자에 라이게이션시키고, 그에 의해 상기 B-구조를 마킹하는 것일 수 있다.

또 다른 실시예는 예를 들면, 상기 표적에 융합된 효소는 근접성 때문에 상기 B-구조의 핵산 분자를 기질로 이용하여 반응하고, 그에 의해 상기 B-구조를 마킹할 수 있는 효소이고, 그의 예는 상기 핵산 분자를 비오티닐화시킬 수 있는 효소인 것일 수 있다.

제1 양태의 단계 (iv)

앞서 검토된 바와 같이, 단계 (iv)는 하기와 같다:

"(iv): 상기 (iii)의 용액 및 상기 B-구조의 결합 물질을 식별할 수 있게 하는 특정한 핵산 서열 정보를 포함하는 핵산 분자의 이용을 통해, (ii)의 세포 내에서 상기 하나 이상의 목적 표적에 결합하는 1종 이상의 개별적인 결합 물질을 식별하는 단계"

당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 결합 물질을 식별할 수 있게 하는 특이적 핵산 분자의 이용은 바람직하게는 일부 종류의 시퀀싱을 요구할 것이다. 물론 당업자가 목적 핵산 분자를 시퀀싱하는 것인 통상적인 작업이다.

단계 (iv)는 선행기술의 공지된 기법, 예를 들면, 본 명세서에서 검토된 기법에 근거하여 수행될 수 있다.

당업자에 의해 이해되고, 본 명세서에서 검토된 바와 같이, 옵션 단계 (iii)(A) 또는 단계 (iii)(B)를 이용하는지 여부는 식별하는 단계 (iv)를 수행하는 선호되는 방법과 관련되는 것으로 볼 수 있다.

제1 양태의 "식별하는" 단계 (iv)는 바람직하게는, 상기 B-구조의 결합 물질을 식별할 수 있게 하는 특정한 핵산 서열 정보를 포함하는 핵산 분자가 증폭되는 것인 단계를 포함한다.

당업자는 융합된 유전형의 핵산을 증폭시키기 위해 다수의 상이한 전략, 예를 들면, PCR (미국특허 4,683,202; Mullis), 에멀젼(Emulsion) PCR (Nakano et al., J Biotechnol. 2003;102(2):117-24), 디지털 PCR (Vogelstein, B; Kinzler KW (1999). "Digital PCR". Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16): 9236-41), NASBA (Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 1991;350(6313):91-2), 또는 RCA(Rolling Circle Amplification) (American Journal of Pathology. 2001;159:63-69)이나, 이에 한정되지 않는 전략을 일상적으로 찾을 수 있다.

바람직하게는, 상기 핵산 분자는 PCR을 통해 증폭된다.

상기 식별하는 단계 (iv)에서 (ii)의 세포 내에서 하나 이상의 목적 표적에 결합하는 적어도 2종(예를 들면, 적어도 3종, 또는 적어도 6종, 또는 적어도 10종)의 상이한 개별적인 결합 물질이 식별되는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명의 실시예에서(하기 참조), 식별하는 단계 (iv)에서 약 10종의 상이한 개별적인 결합 물질이 식별되었다.

이 단계 (iv)에서 예를 들면, 적어도 10개의 상이한 개별적인 결합 물질들을 식별할 수 있기 위해서:

- 단계 (iii)(A)의 용액이 10개를 초과하는 상이한 B_BoundToT-구조를 포함하거나; 또는

- 단계 (iii)(B)의 용액이 10개를 초과하는 상이한 "결합물질 마킹된 B-구조(binder marked B-structures)"를 포함하는 것이 요구된다는 것이 명확하다.

도 1: 본 발명의 제1 양태(즉, 청구항 1)의 방법의 구체예의 설명적 실시예(illustrative example).
도 2: 프레이-베이트(Prey-Bait)가 이용된 것인 본 발명의 제1 양태(즉, 청구항 1)의 방법의 구체예의 설명적 실시예.
도 3: 본 명세서의 실시예 1의 결과 - 세부사항은 실시예 1을 참조한다.

실시예 1:

약 10 ⁸ 개의 상이한 결합 물질을 포함하는 YoctoReactor 라이브러리에 대한 p38의 세포-내 스크리닝과 비교의 인 비트로(즉, 세포 내에서가 아님) 스크리닝

개요는 도 1 및 2를 참조한다.

방법

사용된 DNA 올리고뉴클레오티드

vip7460

AAAGCTGGGAGACACCA*A*T*G

(* = 포스포로티오에이트 DNA 염기)

vip7461

T*T*G*GTGTCTCCCAGCTTTGA

(* = 포스포로티오에이트 DNA 염기)

vip7442

A*G*C*ACTAAGCCTTGATGGCCACATTCCTACTTCTCCCTAAGGTGCAGTTTTGCCAAGG

(* = 포스포로티오에이트 DNA 염기)

vip7463

xCCTTGGCAAAACTGCACCTTAGGGAGAAGTAGGAATGTGGCCATCAAGGCTTAGTGC*T*C*A

(x = 5'-아미노변형기(aminomodifier) C6; * = 포스포로티오에이트 DNA 염기)

YoctoReactor 라이브러리 (Lib027b_TA01)의 제조

하기의 변형을 포함하여, 본질적으로 다른 곳에서 개시된 바에 따라(Hansen et al. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (3), pp 1322-1327) 삼량체 포맷(trimer format)으로 YoctoReactor 라이브러리를 구축하였다: 20-량체 어댑터 핵산 분자(올리고뉴클레오티드 vip7460 및 vip7461로 구성됨)를 YoctoReactor 라이브러리에 라이게이션시켜서 어댑터 변형 라이브러리, 즉, Lib027b_TA01을 생성하였다. 구축된 YoctoReactor DNA는 표적 DNA 상에 있는 중복(overlapping) 영역(2개의 뉴클레오티드로 구성된 3'-오버행)에 상보적인 중복 영역(2개의 뉴클레오티드로 구성된 3'-오버행)을 갖는다.

재료

전용(Proprietary) Vipergen YoctoReactor 라이브러리 (배치(batch) Lib027b, 약 1.1*10⁸ 개의 상이한 분자들)

올리고뉴클레오티드 vip7460 및 vip7461 (제조된 100μM 스톡; Eurofins Genomics)

NaCl (제조된 4M 스톡; Sigma-Aldrich)

HEPES, pH 7.5 (1M; Sigma-Aldrich)

Tris-HCl, pH 7.5 (1M; Sigma-Aldrich)

글리코겐 (20mg/mL; Thermo Fisher Scientific)

에탄올 (96%; Honeywell)

MgCl₂ (2M; Sigma-Aldrich)

PEG4000 (50%; Thermo Fisher Scientific)

ATP (제조된 100mM 스톡; Sigma-Aldrich)

T4 DNA 리가아제 (30 Weiss U/㎕; Thermo Fisher Scientific)

물 (분자생물학 등급; Sigma-Aldrich)

20% TBE-PAGE 겔 (Kem-En-Tec)

NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up 컬럼 (Macherey-Nagel)

Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific)

Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific)

프로토콜

공개된 프로토콜(https://eu.idtdna.com/pages/education/decoded/article/annealing-oligonucleotides)에 따라 vip7460과 vip7461을 어닐링시키는 것에 의해 20-량체 핵산 어댑처 분자를 제조했다. 20㎕ 4M NaCl, 1㎕ 글리코겐 및 1ml 얼음-냉각(ice-cold) 에탄올을 300㎕ 어닐링 반응에 첨가하고 원심분리(4℃에서 20,000g로 30분 이상)하여 어닐링된 올리고를 침전시켰다. 펠렛을 80% 에탄올로 2회 세척하고, 실온에서 자연건조시키고, 100μM의 농도까지 물에 용해시켰다. (제조사의 프로토콜에 따라) Qubit 어세이에 의해 농도를 확인하고 20% TBE-PAGE (200V, 55분, 20℃)에서 20-량체 핵산 어댑터의 온전성(integrity)을 확인했다.

총 200㎕의 물 중에서 YoctoReactor 라이브러리 (Lib027b)와 어닐링된 어댑터 (2배 몰 과량(2-fold molar excess))를 혼합하고 200㎕ 2X 라이게이션 마스터 믹스(80mM Tris-HCl pH 7.5, 20mM MgCl₂, 4% PEG4000, 2mM ATP 및 60U T4 DNA 리가아제)를 첨가하여 20-량체 핵산 어댑터를 전용 YoctoReactor 라이브러리 (batch Lib027b)에 라이게이션시켰다. 상기 라이게이션을 실온에서 밤새 진행되게 하였다. 1.2mL 얼름-냉각 에탄올, 1㎕ 글리코겐 및 40㎕ 4M NaCl의 첨가에 의해 라이게이션된 YoctoReactor 라이브러리를 침전시켰다. 수득된 혼합물을 -20℃에서 1시간 동안 보관한 후 원심분리 (4℃에서 20,000g로 30분 이상)에 의해 펠렛화하고, 실온에서 자연건조시켰다. 과량의 20량체 핵산 어댑터를 제거하기 위해, 라이게이션된 YoctoReactor 라이브러리를 NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up 컬럼에서 정제하였다. 정제된 어댑터 변형(adapter modified) YoctoReactor 라이브러리를 침전시키고(NaCl, 글리코겐, 및 얼음-냉각 에탄올), 47.9μM (제조사의 프로토콜에 따라 PicoGreen Assay에 의해 결정됨)의 농도로 완충액(5mM Tris-HCl pH 7.5, 20mM NaCl, 0.001% Tween20)에 용해시켰다. 중요하게, 상기 어댑터 변형 YoctoReactor 라이브러리 (즉, Lib027b_TA01)는 vip7442/vip7463 표적 DNA로의 라이게이션에 100% 적격(competent)이었다.

표적 DNA (TD_VD11-4-2)에 부착된 CAIX-결합물질 (즉, 베이트 = VD11-4-2)의 제조

소분자 CAIX-결합물질(binder), VD11-4-2를 60-량체 올리고뉴클레오티드 (vip7463)에 공유결합에 의해 부착시켰다. 그 후에 상기 올리고뉴클레오티드를 역방향(reverse) 상보적 올리고뉴클레오티드 (vip7442)와 조랍하여, 베이트 화합물, VD11-4-2에 부착된 이중가닥 핵산 분자(즉, 표적 DNA)를 형성시켰다. 형성된 표적 DNA (즉, TD_VD11-4-2)는 YoctoReactor DNA 상에 있는 중복 영역(2개의 뉴클레오티드로 구성된 3'-오버행)에 상보적인 중복 영역(2개의 뉴클레오티드로 구성된 3'-오버행)을 갖는다.

재료

펜타플루오로페닐술폰아미드 (Fluorochem, 034664)

8-머캅토옥탄산 (Sigma-Aldrich, 675075)

무수 메탄올 (Fisher Scientific, 10499560; 4Å MS 상에서 보관)

트리에틸아민 (Sigma-Aldrich, 90340)

과산화수소 용액 (Sigma-Aldrich, 95321)

시클로옥틸 아민 (Sigma-Aldrich, C110604)

HPLC 등급 물 (Fisher Scientific, 10221712)

트리에닐암모늄 아세테이트 (Sigma-Aldrich, 90358)

아세토니트릴 (Fisher Scientific, 10629112)

DMSO (Sigma-Aldrich, D8418)

에틸-(N',N'-디메틸아미노)프로필카르보디이미드히드로클로라이드 (EDC; Sigma-Aldrich, E6383)

N-히드록시숙신이미드 (NHS; Sigma-Aldrich, 130672)

N-메틸피롤리돈 (NMP; Sigma-Aldrich, 494496)

프로토콜

V. Dudutiene et al. ("Discovery and Characterization of Novel Selective Inhibitors of Carbonic Anhydrase IX"; J. Med. Chem. 2014, 57, 9435-9446)로부터의 개조된 절차를 이용하여 VD11-4-2의 유사체를 제조했다. 2-머캅토에탄올 대신에, 8-메캅토옥탄산을 사용하고, 말단(distal) 카르복시산을 갖는 유사체를 제조했다:

VD11-4-2 VD11-4-2의 유사체

HPLC에 의해 정제된 산물(3.3 mg)을 뒤이어 N-메틸피롤리딘(NMP, 60 ㎕) 중 에틸-(N',N'-디메틸아미노)프로필카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC, 1.2 mg) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS, 0.7 mg)를 이용하여 활성화시켰다. 미정제 활성화 혼합물(50 ㎕)을 vip7463 (10 nmol; 100 μM 100 ㎕), HEPBS 완충액(100 ㎕, 1M 스톡), NMP (200 ㎕) 및 물 (50 ㎕)의 프리믹스(premixed) 용액에 첨가했다.

16시간 동안 커플링 후에, DNA를 에탄올로 침전시키고 미정제 컨쥬게이트를 물/MeCN 중 트리에틸암모늄 아세테이트를 이용한 RP-HPLC에 의해 정제했다. 원하는 컨쥬게이트를 갖는 분획을 동결건조에 의해 농축하고 최종 산물을 물에 용해시켰다. LCMS에 의한 QC (ESI; neg 모드): obs m/z 19322, calc 19324.6 (하기 HPLC 크로마토그램 참조).

정제된 단일-가닥 접합체, 즉, vip7463_VD11-4-2를 뒤이어 역방향 상보적 DNA 올리고뉴클레오티드 vip7442에 혼성화시켜, VD11-4-2에 부착된 이중가닥 표적 DNA (즉, TD_VD11-4-2)를 생성하였다.

난모세포 외부 DNA에 접합된 p38에서의 인 비트로 스크리닝(e1; 기준)

Lib027b_TA01(즉, 세포-내(in-cell) 스크리닝을 위해 적용된 동일한 YoctoReactor 라이브러리)에 대해 DNA에 접합된 재조합 p38 단백질 상에서 인 비트로 스크리닝(즉, 세포 내가 아님)을 참조를 위해 수행하였다. p38 단백질의 표적 DNA로의 접합, 및 뒤이은 Lib027b_TA01에 대한 스크리닝 (20nM 표적 DNA에 접합된 p38을 약 5.6*10¹²개라이브러리 분자/㎕에 대해 스크리닝했다)을 본질적으로 이전에 기술된 바와 같이 수행했다(Petersen et al., "Novel p38α MAP kinase inhibitors identified from YoctoReactor DNA-encoded small molecule library", Med. Chem. Commun., 2016, 7, 1332-1339).

난모세포에서 발현된 p38에서의 세포-내 스크리닝(in-cell screening)(e2 및 e3)

제노푸스 래비스 난모세포에서 표적-프레이 융합 단백질 (예를 들면, CAIX-p38)의 발현

인간 CAIX의 촉매 도메인에 6-아미노산 링커를 통해 N-말단 융합된 p38 (UniProt accession code: Q16539)을 코딩하는 유전자를 합성하고 pSP64 발현 벡터 (Eurofins Genomics)의 HindIII 부위와 BamHI 부위 사이에 서브-클로닝시켰다. 상기 벡터를 EcoRI으로 선형화시키고, Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 전사 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 mRNA를 합성하였다. RNeasy 컬럼 (Qiagen)을 통해 mRNA를 정제했다.

약 50ng의 CAIX-p38 mRNA를 50nL (물에 희석됨)의 부피로 Nanoliter 2010 주입기(injector) (World Precision Instruments)를 이용하여 제노푸스 래비스 난모세포(Ecocyte Bioscience)에 주입했다. 실험 전까지 상기 난모 세포를 18℃에서 Modified Barth's Medium (88mM NaCl, 1mM KCl, 0.4mM CaCl₂, 0.33mM Ca(NO₃)₂, 0.8mM MgSO₄, 5mM Tris-HCl, 2.4mM NaHCO₃, pH 7.4) 중에서 유지시켰다.

제노푸스 래비스 난모세포에서 발현된 표적-프레이 융합 단백질 (예를 들면, CAIX-p38)의 정량화

mRNA의 주입 후 4일 차에, 제노푸스 래비스 난모세포 내에서 CAIX-p38 단백질의 발현을 인간 CAIX DuoSet ELISA 어세이(Bio-techne)를 이용하여 정량하였다. 대조군으로서, 미주입(unjected) 제노푸스 래비스 난모세포를 병렬로 처리했다. 요약하면, 하나의 제노푸스 래비스 난모세포를 원심분리(4℃에서 20,000g, 2분)에 의해 25㎕ 완충액 (PBS 중 1mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 5mM NaF) 중에서 파쇄시키고, 상층액을 CAIX-포획(cpature) 항체가 코팅된 ELISA 플레이트로 옮기고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 모든 웰을 세척하고(세척 완충액; PBS 중 0.05% Tween20으로 3회), 비오티닐화 CAIX-검출 항체를 첨가했다. 플레이트를 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시키고 모든 웰을 세척했다. 호스래디쉬 퍼옥시다아제에 접합된 스트렙타비딘(스트렙타비딘-HRP)을 첨가하고, 상기 플레이트를 암 조건 하에 RT에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. HRP 기질 TMB SENS (Kem-En-Tec)의 첨가 전에 모든 웰을 세척했다. 상기 플레이트를 암 조건 하에 RT에서 5분 동안 인큐베이션시키고 2M H₂SO₄의 첨가에 의해 반응을 중단시켰다. 450nm에서의 광학 밀도(OD)를 DTX880 Multimode Detector (Beckman Coulter)에서 측정했다. 재조합 CAIX 단백질로 병렬로 생성된, CAIS 표준 곡선에 근거하여, 제노푸스 래비스 난모세포 내에서 발현된 CAIS-p38 단백질의 농도가 약 200nM인 것으로 결정하였다.

표적 DNA 및 YoctoReactor 라이브러리의 제노푸스 래비스 난모세포로의 도입

약 1.1*10⁸개의 상이한 분자들 (즉, 이중가닥 핵산 분자에 커플링된 잠재적인 결합물질(binder))로 구성된 광범위한 YoctoReactor 라이브러리 (Lib027b_TA01)를 TD_VD11-4-2 (즉, 베이트 화합물, VD11-4-2에 공유결합에 의해 부착된 표적 DNA)와 혼합하고, 수득된 혼합물을 CAIX-p38을 발현하는 제노푸스 래비스 난모세포에 주입했다. CAIX-p38을 코딩하는 mRNA의 주입 후 4일차에 YoctoReactor 라이브러리와 TD_VD11-4-2의 주입을 수행했다. 약 6.6*10¹¹개 YoctoReactor 라이브러리 분자 및 1.5*10¹¹개 TD_VD11-4-2 분자로로 구성된 총 50 nL를 각 난모세포 (e2)에 주입했다. 병렬 실험에서, 주입(e3) 전에 Lib027b_TA01/TD_VD11-4-2 믹스에 0.1 ㎍/ml RNaseA를 보충했다. 잠재적으로 난모 세포 내에서 선택 과정에 영향을 미칠 수 있는 내인성 RNA를 분해시키기 위해 RNaseA의 주입을 수행했다.

상기 제노푸스 래비스 난모세포를 18℃에서 2-4시간 동안 인큐베이션시켰다. 이 기간 내에, 발현된 CAIX-p38 단백질이 1) YoctoReactor 라이브러리 리간드 (목적 단백질, p38로의 결합), 및 2) TD_VD11-4-2 (CAIX-택(tag)으로의 결합)에 결합될 수 있게 했다.

제노푸스 래비스 난모세포 막의 파괴 및 DNA 라이게이션

제노푸스 래비스 난모세포의 막을 파괴시켜 상기 세포로부터 결합 복합체, 즉, 1) YoctoReactor 라이브러리 리간드 및 2) TD_VD11-4-2에 결합된 CAIX-p38을 방출시켰다. CAIX-p38 단백질과 회합된 DNA 단편들(즉, 각각 표적 DNA 및 YoctoReactor DNA)은 중복 영역을 가져서, 두 단편들의 DNA 라이게이션에 의해 통합된 단편들로의 잠재적 조립을 초래했다. 두 DNA 단편들이 CAIX-p38 단백질과 회합된 경우 근접성에 의해 라이게이션이 추진되어, 원하는 결합 활성을 갖는 일원들의 보다 높은 분획을 갖는 농축된 라이브러리를 생성할 것이다.

제노푸스 래비스 난모세포 막의 파괴를 위해, ATP 및 리가아제를 포함하지 않는 600㎕ 라이게이션 완충액 중에서 1개의 난모세포를 원심분리시켰다(4℃에서 20,000g, 2분). 상층액 (600㎕)을 2개의 연속적 단계에서 300 Weiss 유닛 T4 DNA 리가아제 (Thermo Fisher Scientific)가 보충된 총 11mL 라이게이션 완충액 (50mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.75% BSA, 9mM KCl, 4.5% 글리세롤, 1mM DTT, 5mM MgCl₂, 1mM ATP, pH 7.4)으로 희석시켰다. 그에 의해 결합 복합체를 총 약 10⁴-배 희석시키고, 16℃에서 4분 동안 라이게이션이 진행될 수 있게 했다. 그 후, 11mL 중단 완충액(stop buffer) (50mM EDTA, 0.2㎍/㎕ Proteinase K, 0.2% N-라우릴 사르코신에 의해 보충된 NTI 완충액)의 첨가에 의해 T4 리가아제를 불활성화시키고 결과적으로 수득된 혼합물을 뒤이어 65℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. RT까지 냉각 후에, DNA를 NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up 컬럼(Macherey-Nagel)에서 정제하였다.

라이게이션된 DNA의 증폭

라이게이션시키고 정제한 DNA 단편을 (유리된, 라이게이션되지 않은 5'-인산화 DNA 단편을 제거하기 위해) Lambda Exonuclease로 처리하고 PCR에 의해 증폭시켰다.

PCR 혼합물 (최종 농도):

25㎕ 정제되고 라이게이션된 DNA (PCR 주형)

1X Vent (-exo) PCR 완충액 (New England Biolabs)

0.4mM CleanAmp dNTP (tebu-bio)

6mM MgCl₂ (Sigma-Aldrich)

3% DMSO (Sigma-Aldrich)

0.25μM 정방향 PCR 프라이머

0.25μM 역방향 PCR 프라이머

1U Vent (-exo) 폴리머라아제 (New England Biolabs)

총 100㎕가 되게 하는 물

PCR 장치에서 하기 프로그램을 적용하여 혼합물에 온도 순환(thermal cycling)을 수행했다:

95℃ 10분, (95℃ 30초, 62℃ 30초, 72℃ 2분 30초)의 사이클 27회, 72℃ 2분

결과적으로 수득된 DNA 단편의 라이브러리를 NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up 컬럼 (Macherey-Nagel)에서 정제하고, Illumina 시퀀싱을 위한 프라이밍 부위를 도입하기 위해 2차 PCR을 수행했다.

PCR 혼합물:

5㎕ 정제된 증폭 DNA (PCR 주형)

1X Vent (-exo) PCR 완충액 (New England Biolabs)

0.2mM dNTP (Thermo Fisher Scientific)

6mM MgCl₂(Sigma-Aldrich)

0.5M 베타인 (Sigma-Aldrich)

0.25μM 정방향 Illumina 프라이머

0.25μM 역방향 Illumina 프라이머

1U Vent (-exo) 폴리머라아제 (New England Biolabs)

총 100 ㎕가 되게 하는 물

PCR 장치에서 하기 프로그램을 적용하여 혼합물에 온도 순환을 수행했다:

92℃ 2분, (92℃ 30초, 62℃ 30초, 72℃ 2분 30초)의 사이클 10회, 72℃ 2분

결과적으로 수득된 DNA 단편의 라이브러리를 Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter Life Sciences) 및 분취용(preparative) 10% TBE-PAGE (Kem-En-Tec)에 의해 정제하고, Illumina DNA 시퀀싱 (Fulgent Genetics)을 수행했다.

Illumina 시퀀싱 기술을 이용한 DNA 시퀀싱에 의한 농축(enrichment)의 분석

다른 곳에 기술된 바와 같이 (Petersen et al., "Novel p38α MAP kinase inhibitors identified from yoctoReactor DNA-encoded small molecule library", Med. Chem. Commun., 2016, 7, 1332-1339), DNA 시퀀싱 데이터를 해독하고 분석했다.

주어진 라이브러리 일원이 시퀀싱 시료 내에서 관찰되는 횟수를 계수하는 것에 의해, 랜덤 라이게이션 사건 위에서 농축된 히트(hit)가 식별될 수 있다. 다수회 관찰된 라이브러리 일원은 표적 결합물질(히트)이고, 단지 수회 관찰된 화합물은 주로 랜덤 사건(백그라운드)의 결과이다. 랜덤 사건에 기반한 관찰의 횟수는 로그 스케일로 선형 붕괴선(linear decay line)을 나타낸다(신호 플롯 중 적색 구). 따라서, 붕괴 상(decay phase)에서 신호 상으로의 전환을 초과하는 관찰 횟수를 갖는 라이브러리 일원들은 따라서, 수학적 역치(mathematical thershold)(MT, 신호 플롯 중 녹색 구)를 초과한다. 3회의 개별적인 선택 실험(e1-e3)으로부터, 신호 플롯을 작성했다(도 3의 패널 A-C). 신호 플롯 A는 YoctoReactor 라이브러리 Lib027b_TA01 (e1, 기준)에 대한 표적 DNA에 접합된 p38에서의 스크리닝으로부터 유래되고, 신호 플롯 B 또는 C는 RNaseA의 공-주입(co-injection)의 부재 (e2) 또는 존재(e3) 하에 난모세포에서 발현된 p38에서의 세포-내 스크리닝으로부터 유래된다. e1-e3에서 약 1.1*10⁸개의 상이한 분자들에 대한 스크리닝으로부터, 본 발명자들은 MT를 초과한 총 38개의 히트를 확인했다(녹색 구(sphere)). 상기 39개의 히트를 통합하고 DNA 시퀀싱으로부터의 3개의 데이터 풀에서의 관찰의 횟수에 대해 주석을 달았다(도 3의 패널 D). 3회의 실험 중 하나 이상에서 MT를 초과하는 39개의 히트를 관찰했다. 기준 실험(e1) 및 2회의 세포-내 스크리닝 실험(e2 또는 e3) 모두에서 상당한 개수의 히트를 확인했다. Hit ID #31은 이전에 검증된 p38a 억제제였다 (vpc00249; IC₅₀ 0.51 μM; Petersen et al., "Novel p38α MAP kinase inhibitors identified from yoctoReactor DNA-encoded small molecule library", Med. Chem. Commun., 2016, 7, 1332-1339).

결론

앞서 검토된 바와 같이, 약 10⁸개의 상이한 결합 물질의 인 비트로 디스플레이 라이브러리에 근거하여, 이러한 "세포 내(within the cell)" 스크리닝 실시예에서, 식별하는 단계(제1 양태의 식별하는 단계 (iv)에 해당함)에서 수개의 비-검증(non-validated) 히트와 함께, 이전에 검증된 p38 억제제를 포함한, 약 10-30개의 상이한 개별적인 우수한 결합제 화합물 결합 물질을 식별했다. 본 발명에서, 이는 라이브러리의 우수한 결합제 화합물의 허용가능한 대표적인 높은 개수로 간주된다.

식별된 개수의 우수한 결합제 물질이 허용가능한 것으로 간주되는 이유는 이 표적 (즉, p38)에 대해, 앞서 검토된 바와 같이, 동일한 인 비트로 디스플레이 라이브러리의 비교의 인 비트로(즉 세포 내가 아님) 스크리닝이 수행되었고 약 10개의 상이한 개별적인 우수한 결합제가 식별되었다는 것이고, 즉, "세포내" 스크리닝의 식별된 결합제의 개수는 적어도 비교의 인 비트로 스크리닝과 비슷했고, 즉, 허용가능한 것으로 간주되었다.

또한, 본 발명의 세포내 스크리닝에서 식별된 개별적인 우수한 결합제는 비교의 인 비트로 스트리닝에서 식별된 우수한 결합제와 일치했다.

예를 들면, 본 실시예의 "세포내" 스크니링에서 1개 또는 2개의 개별적인 우수한 결합제 화합물 결합 물질만 식별되었다면, 본 실시예에서 실제로 식별된 약 10개의 상이한 개별적인 우수한 결합제가 우수한 것으로 간주되지 않았을 것이다. 이에 대한 하나의 이유는 단 1개 내지 2개의 개별적인 우수한 결합제만이 식별되었다면, 가능한 관련된 우수한 결합제, 즉, 귀중한 우수한 결합제 정보를 상실했을 수 있다는 것이다.

논의된 바와 같이, "세포내" 및 비교의 인 비트로 스크리닝의 식별된 우수한 결합제 중 일부는 동일하고, "세포내" 스크리닝의 우수한 결합제 중 일부는 비교의 인 비트로 스크니링에서 식별되지 않았고, 이에 대한 이유는 "실제(real life)" 우수한 결합제의 일부는 이 실시예의 "세포내" 스크리닝 방법, 즉 본 발명의 방법의의 자연적인 "세포내" 결합 조건(즉, 제1 양태의 단계 (ii)(b)) 하에서만 식별될 수 있다는 것과 관련된다.

실시예 2:

비교예 - 3개의 포스포로티오에이트 결합의 사용을 비변형 DNA(즉, 0개의 포스포로티오에이트 결합)에 대해 비교함

방법

사용된 DNA 올리고뉴클레오티드 (도식적 설명)

제노푸스 래비스 난모세포에 주입된 이중가닥 핵산 분자(즉, 표적 DNA(TD))

주: TD_001, TD_002, 및 TD_003은 하부 가닥의 3'-말단에 2-nt 오버행을 포함하고, 이는 라이게이션 DNA(LD_001) 상의 2-nt 오버행에 상보적임

이중가닥 핵산 라이게이션 분자(즉, 라이게이션 DNA, LD):

주: LD_001은 상부 가닥의 3'-말단에 2-nt 오버행을 포함하고, 이는 표적 DNA(즉, TD_001, TD_002, TD_003)의 2-nt 오버행에 상보적임

제노푸스 래비스 난모세포로의 주입 및 그로부터의 추출 후 포스포로티오에이트 결합을 갖거나 또는 갖지 않는 표적 DNA의 라이게이션 효율(ligation potential)의 평가

포스포로티오에이트 DNA 염기를 갖거나 또는 갖지 않는 표적 DNA(즉, TD_001, TD_002 및 TD_003)를 제노푸스 래비스 난모세포에 주입했다. 표적 DNA를 증가하는 시간 간격 동안 난모세포 내부에서 인큐베이션시키고, 그 후에 제노푸스 래비스 난모세포의 막을 파괴하고, 주입된 표적 DNA를 회수하였다. 회수된 표적 DNA의 라이게이션 효율을 라이게이션 DNA(즉, LD_001)와의 DNA 라이게이션 반응에서 조사했다. 세포 내부에서 인큐베이션 후에 표적 DNA의 라이게이션 효율을 유지시키는 것이 세포-내 스크리닝의 상황에서 중요한 파라미터라는 것에 주목한다.

표적 DNA의 제노푸스 래비스 난모세포로의 주입

약 1-2 pmol의 포스포로티오에이트 결합을 갖거나 또는 갖지 않는 표적 DNA (즉, TD_001, TD_002 또는 TD_003)를 50nL (물에 희석됨)의 부피로 Nanoliter 2010 주입기(World Precision Instruments)를 이용하여 제노푸스 래비스 난모세포(Ecocyte Bioscience) 내로 주입하였다. 난모세포를 18℃에서 Modified Barth's Medium (mM, 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.4 mM CaCl₂, 0.33 mM Ca(NO₃)₂, 0.8 mM MgSO₄, 5 mM Tris-HCl, 2.4 mM NaHCO₃, pH 7.4) 중에 유지시켰다. 상기 난모세포를 증가하는 시간 간격동안 인큐베이션하고, 그 후에 (하기에 상술된 바와 같이) 막을 파괴하고 주입된 표적 DNA를 회수했다.

제노푸스 래비스 난모세포 막의 파괴 및 주입된 표적 DNA의 회수

주입된 표적 DNA를 회수하기 위해 제노푸스 래비스 난모세포의 막을 파괴시켰다. 제노푸스 래비스 난모세포 막의 파괴를 위해, 5개의 난모세포를 200㎕ 파쇄 완충액 (10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.01% Tween-20) 중에서 원심분리시켰다(4℃에서 20,000g, 2분). 회수된 표적 DNA(5개의 난모세포로부터 유래됨)를 NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up 컬럼에서 정제했다. 정제된 표적 DNA를 침전시키고(NaCl, 글리코겐, 및 얼름-냉각 에탄올) 원심분리(4℃에서 20,000g, 30분 이상)에 의해 펠렛화하였다. DNA 펠렛을 실온에서 자연건조시키고 물에 용해시켰다.

DNA 라이게이션

회수된 표적 DNA의 라이게이션 효율을, 이를 라이게이션 DNA, 즉, LD_01과 함께 DNA 라이게이션 반응에 적용하여 평가했다. 정제된 표적 DNA(5개의 난모세포로부터 유래됨)를 약 1 Weiss 유닛 T4 DNA 리가아제(Thermo Fisher Scientific)가 보충된 라이게이션 완충액 (50mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.75% BSA, 9mM KCl, 4.5% 글리세롤, 2mM DTT, 10mM MgCl₂, 2mM ATP, pH 7.4)에서 약 2pmol의 LD_01 라이게이션 DNA와 혼합했다. 16℃에서 1 내지 2시간 동안 라이게이션 반응이 진행되게 하였다. 라이게이션 혼합물을 고유한(native) PAGE (10% TBE-PAGE, 200V, 35분, 실온)에 적용하여 회수된 표적 DNA의 라이게이션 효율을 평가하였다. 비변형 표적 DNA (즉, TD_001)의 라이게이션 효율은 제노푸스 래비스 난모세포 내에서의 인큐베이션 후에 시간-의존적 방식으로 상실되었다. 구체적으로, 난모세포 내에서 30분의 인큐베이션 후에, 라이게이션 효율의 50%가 상실되었고, 난모세포 내에서 1시간의 인큐베이션 후에 거의 완전히 상실되었다. 하나의 가닥에 포스포로티오에이트 결합이 도입된 표적 DNA(즉, TD_002)의 경우, 난모세포 내에서 2시간 동안 인큐베이션한 후에 약 50%의 라이게이션 효율이 상실되었다. 대조적으로, 표적 DNA의 양 가닥에 포스포로티오에이트 결합이 도입된 경우(즉, TD_003), 난모세포 내에서 2시간 동안 인큐베이션한 후에, 라이게이션 효율이 거의 영향을 받지 않았다.

결론

본 실시예의 결과는 3개의 포스포로티오에이트 결합의 이용이 비변형 DNA(즉, 0개의 포스포로티오에이트 결합)의 이용에 비해 본 발명의 상황에서 놀라울 정도로 유의한 기술적 장점을 가져온다는 것을 보여준다.

참조문헌 목록

1: EP1809743B1 (Vipergen)

2: EP1402024B1 (Nuevolution)

3: EP1423400B1 (David Liu)

4: Nature Chem. Biol. (2009), 5:647-654 (Clark)

5: WO 00/23458 (Harbury)

6: Nature Methods (2006), 3(7), 561-570 7: 2006 (Miller)

7: Nat. Biotechnol. 2004; 22, 568-574 (Melkko)

8: Nature. (1990); 346(6287), 818-822 (Ellington)

9: Proc Natl Acad Sci USA (1997). 94 (23): 12297-302 (Roberts)

10: WO2006/053571A2 (Rasmussen)

11: EP2622073B1(Vipergen)

12: Lynn MM et al. ("Identification of Ligand-Target Pairs from Combined Libraries of

Small Molecules and Unpurified Protein Targets in Cell Lysates"; J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 3264-3270)

13: Zining Wu et al. ("Cell-Based Selection Expands the Utility of DNA-Encoded Small-Molecule Library Technology to Cell Surface Drug Targets.."; ACS Comb. Sci. 2015, 17, 722-731)

14: M. Schurmann et al. ("Small-Molecule Target Engagement in Cells"; Cell Chemical Biology 23, April 21, 2016)

15: Ron Milo ("What is the total number of protein molecules per cell volume?.."; Bioessays 35: 1050-1055, 2013)

16: V. Dudutiene et al. ("Discovery and Characterization of Novel Selective Inhibitors of Carbonic Anhydrase IX"; J. Med. Chem. 2014, 57, 9435-9446)

17. Petersen et al. ("Novel p38α MAP kinase inhibitors identified from yoctoReactor DNA-encoded small molecule library", Med. Chem. Commun., 2016, 7, 1332-1339)

SEQUENCE LISTING <110> Vipergen ApS <120> A METHOD FOR SCREENING OF AN IN VITRO DISPLAY LIBRARY WITHIN A CELL <130> PD10161PC00 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 aaagctggga gacaccaatg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ttggtgtctc ccagctttga 20 <210> 3 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 agcactaagc cttgatggcc acattcctac ttctccctaa ggtgcagttt tgccaagg 58 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ccttggcaaa actgcacctt agggagaagt aggaatgtgg ccatcaaggc ttagtgctca 60

Claims

세포 내에서 목적 단백질 또는 RNA 표적에 결합할 수 있는 라이브러리의 1종 이상의 개별적인 화합물 결합 물질(binding entity)를 식별하기 위해 세포 내에서 라이브러리의 소분자 화합물 결합 물질의 목적 단백질 또는 RNA 표적으로의 결합에 대해 인 비트로 디스플레이 라이브러리(in vitro display library)를 스크리닝하는 방법으로서, 상기 방법은:
(i): 세포에서 하나 이상의 표적 T_n을 발현시키는 단계로서, 상기 n은 1 이상이고, 상기 하나 이상의 표적은 단백질 또는 RNA이고, 상기 표적의 구조는 T-구조로 지칭되는 것인 단계;
(ii): 상기 (i)의 세포에 인 비트로 디스플레이 라이브러리를 도입하는 단계로서:
(a): 상기 라이브러리는 1000개 이상의 상이한 결합 물질 B_n의 라이브러리이고, 상기 n = 1000 이상이며, 각각의 결합 물질은 핵산 분자에 부착되고, 상기 핵산 분자는 상기 결합 물질을 식별할 수 있게 하는 특정한 핵산 서열 정보를 포함하고, 상기 핵산 분자의 특정한 핵산 서열 정보를 알면, 직접적으로 상기 핵산 분자에 부착된 특정한 결합 물질의 구조를 알고, 상기 라이브러리의 결합 물질은 10000 달톤 미만의 평균 분자량 MW를 갖는 화합물이고, 상기 핵산 분자에 부착된 결합 물질의 구조는 B-구조로 지칭되며; 및
(b): 상기 라이브러리는 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 물질을 포함하는 B-구조가 동일한 표적에 결합할 수 없는 결합 물질을 포함하는 B-구조보다 효율적으로 상응하는 T-구조에 결합하는 것인 결합 조건 하에 상기 세포에 도입되고, 상기 세포 내에서 상기 결합 물질 중 하나 이상의 하나 이상의 표적으로의 결합을 얻어서, 세포 내에서 B_BoundToT-구조로 지칭되는, T-구조에 결합된 B-구조를 포함하는 복합체를 형성하는 것인 단계,
(iii): (ii)의 세포의 용해를 수행하여 세포의 막을 분해시키는 단계로서:
(A): 상기 세포로부터 (ii)의 B_BoundToT-구조를 나오게 하여 B_BoundToT-구조를 포함하는 용액을 수득하고, 상기 B_BoundToT-구조는 세포 내에 있지 않거나, 또는
(B): 단계 (ii)에서 표적에 결합되었고, 단계 (iii) 전에, 단계 (ii)에서 표적에 결합되지 않았던 B-구조로부터 구별될 수 있도록 마킹된(mark), B-구조를 세포로부터 나오게 하여, 결합이 마킹된(binder marked) B-구조를 포함하는 용액을 수득하고, 상기 결합이 마킹된 B-구조는 세포 내에 있지 않은 것인 단계; 및
(iv): 상기 (iii)의 용액 및 상기 B-구조의 결합 물질을 식별할 수 있게 하는 특정한 핵산 서열 정보를 포함하는 핵산 분자의 이용을 통해, (ii)의 세포 내에서 상기 하나 이상의 목적 표적에 결합하는 1종 이상의 개별적인 결합 물질을 식별하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 표적 T는 단백질이고, 상기 세포는 진핵 세포인 것인 방법.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 제노푸스(Xenopus) 난모세포인 것인 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 세포는 제노푸스 래비스(Xenopus laevis) 난모 세포인 것인 방법.
청구항 3 또는 4에 있어서, 청구항 1의 단계 (ii)의 세포로 인 비트로 디스플레이 라이브러리의 도입은 상기 인 비트로 디스플레이 라이브러리의 제노푸스 난모세포로의 주입을 통해 수행되고; 및
청구항 1의 단계 (ii)의 상기 인 비트로 디스플레이 라이브러리는 적어도 10⁶ 개의 상이한 결합 물질 B_n의 라이브러리이며, n = 10⁶인 것인 방법.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 청구항 1의 결합 단계인 단계 (ii)(b)에서 T-구조의 농도는 10^-10 M 이상인 것인 방법.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 청구항 1의 단계 (iii)은 단계 (iii)(A)인 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 청구항 1의 단계 (iv)는:
- 상기 B_BoundToT-구조의 표적의 고체 지지체로의 결합을 통해 상기 용액 (iii)(A)의 B_BoundToT-구조를 상기 고체 지지체에 결합시키고, 상기 표적에 결합되지 않고, 따라서 상기 고체 지지체에 결합되지 않은 B-구조를 제거하고; 및
- 상기 고체 지지체에 결합된 B_BoundToT-구조의 결합 물질을 식별할 수 있게 하는 상기 특정한 핵산 서열 정보의 이용을 통해, (ii)의 세포 내에서 하나 이상의 목적 표적에 결합하는 1종 이상의 개별적인 결합 물질을 식별하는 것에 의해 수행되는 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 방법은:
- 청구항 1의 (i)의 T-구조는 프레이(prey)(예를 들면, 표적-프레이 융합 단백질)를 포함하고, 청구항 1의 단계 (ii)에서 핵산 분자(예를 들면, 상기 B-구조의 핵산 분자에 상보적인 접착(cohesive) 말단을 갖는 핵산 분자)에 부착된 베이트(bait)가 도입되고 상기 핵산 분자는 특정한 표적을 식별할 수 있게 하는 특정한 핵산 서열 정보를 포함하고, 상기 베이트는 청구항 1의 단계 (ii)에서 상기 표적의 프레이에 결합하여, 표적의 프레이에 결합된 베이트를 갖는 B_BoundToT-구조를 형성하고;
- (iii)(A)의 용해 단계 후에, 상기 표적의 프레이에 결합된 베이트를 갖는 B_BoundToT-구조의 핵산 분자를 (예를 들면, 리가아제의 이용에 의한 라이게이션에 의해) 융합시키고, 상기 융합된 핵산 분자는 결합 물질 및 표적을 식별할 수 있게 하는 서열 정보를 포함하며; 및
- 청구항 1의 단계 (iv)에서 선행 단계의 융합된(예를 들면, 라이게이션된) 핵산 분자의 결합 물질과 표적을 식별할 수 있게 하는 특정한 핵산 서열 정보의 이용을 통해, 상기 (ii)의 세포 내에서 1종 이상의 목적 표적에 결합하는 1종 이상의 개별적인 결합 물질을 식별하는 것에 의해 수행되는 것인 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 세포는 제노푸스 난모세포이고, 바람직하게는 상기 세포는 제노푸스 래비스 난모세포인 것인 방법.
청구항 9 또는 10에 있어서, "상기 표적의 프레이에 결합된 베이트를 갖는 B_BoundToT-구조의 핵산 분자를 (예를 들면, 리가아제의 이용에 의한 라이게이션에 의해) 융합"시키는 단계 전에, 세포 용해 단계 (iii)에서 수득된 용액(예를 들면, 상층액)의 희석 단계가 수행되고, 상기 희석은 상기 용액을 10² 배 이상 희석시키고; 및
청구항 1의 단계 (i)에서 단 하나의 표적 (n = 1)이 있고; 및
상기 "식별하는" 단계 (iv)는 상기 결합 물질 및 표적에 대한 서열 정보를 포함하는 융합된 핵산 분자를, 바람직하게는 PCR(polymerase chain reaction)에 의해, 증폭시키는 것인 단계를 포함하고; 및
상기 "프레이-베이트" 시스템은:
- 프레이: 4량체 스트렙타비딘 및 베이트: 비오틴이거나;
- 프레이: 단량체 스트렙타비딘 (예를 들면, mSA2) 및 베이트: 비오틴이거나;
- 프레이: His-tag 및 베이트: NTA이거나;
- 프레이: SNAP-tag® 및 베이트: 벤질 구아닌 (BG)이거나;
- 프레이: Halo-Tag® 및 베이트: 관능기에 결합된 반응성 클로로알칸 링커이거나;
- 프레이: 탄산 탈수소효소 IX (CAIX) 및 베이트: VD11-4-2이거나; 또는
- 프레이: 말토오스 결합 단백질 (MBP) 및 베이트: 말토오스 또는 말토트리오스;이고 및
상기 베이트에 부착된 핵산 분사는 DNA이고, 상기 B-구조의 핵산 분자는 DNA인 것인 방법.
청구항 9 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베이트에 부착된 핵산 분자는 상기 B-구조의 핵산 분자에 상보적인 접착 말단을 갖는 핵산 분자이고; 및
상기 베이트에 부착된 핵산 분자와 상기 B-구조의 핵산 분자의 상보적 접착 말단에서 포스페이트 백본에 배치된 포스포로티오에이트 결합이 있고,
포스포로티오에이트 결합의 개수는 각 핵산 분자 당 2개 이상의 포스포로티오에이트 결합인 것인 것인 방법.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 청구항 1의 단계 (iii)은 단계 (iii)(B)이고; 상기 방법은:
- 청구항 1의 T-구조는 상기 표적에 융합된 효소를 포함하고, 상기 효소는, 청구항 1의 (ii)의 B_BoundToT-구조의 결합 물질 및 표적의 결합에 의해 생성된 근접성(proximity) 때문에, B_BoundToT-구조의 B-구조 상에서 B-구조를 마킹하는 반응을 할 수 있고, 이로써 B_BoundToT-구조의 B-구조를 표적에 결합하지 않았던 B-구조로부터 구별할 수 있게 하며; 및
상기 표적에 융합된 효소는 리가아제이고, 제1 양태의 단계 (ii)에서 상기 B-구조의 핵산 분자에 상보적인 접착 말단을 갖는 핵산 분자가 도입되고, 근접성 때문에 상기 리가아제는 상기 도입된 핵산 분자를 상기 B-구조의 핵산 분자에 라이게이션시키고, 이로써 상기 B-구조를 마킹하는 것인 방법.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 청구항 1의 "식별하는" 단계 (iv)는 상기 B-구조의 결합 물질을 식별할 수 있게 하는 특정한 핵산 서열 정보를 포함하는 핵산 분자를 증폭시키는 단계를 포함하고, 바람직하게는 상기 핵산 분자는 PCR(polymerase chain reaction)의 이용에 의해 증폭되는 것인 방법.
선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 청구항 1의 식별하는 단계 (iv)에서, (ii)의 세포 내에서 하나 이상의 목적 표적에 결합하는 6종 이상의 상이한 개별적인 결합 물질이 식별되고; 및
청구항 1의 단계 (i)에서 단 하나의 표적 (n = 1)이 있는 것인 방법.