JP2023153907A - Rna標的化方法および組成物 - Google Patents
Rna標的化方法および組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023153907A JP2023153907A JP2023123459A JP2023123459A JP2023153907A JP 2023153907 A JP2023153907 A JP 2023153907A JP 2023123459 A JP2023123459 A JP 2023123459A JP 2023123459 A JP2023123459 A JP 2023123459A JP 2023153907 A JP2023153907 A JP 2023153907A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cas13d
- seq
- rna
- sequence
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 163
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title abstract description 99
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 486
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 440
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 abstract description 104
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 abstract description 40
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 abstract description 14
- 101150027751 Casr gene Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 494
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 488
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 434
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 265
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 232
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 130
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 130
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 106
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 103
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 101
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 86
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 79
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 75
- 101100123845 Aphanizomenon flos-aquae (strain 2012/KM1/D3) hepT gene Proteins 0.000 description 70
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 69
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 66
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 65
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 48
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 45
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 43
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 41
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 41
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 40
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 36
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 35
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 35
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 35
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 35
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 33
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 33
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 32
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 32
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 31
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 31
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 31
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 30
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 30
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 30
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 30
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 29
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 28
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 27
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 25
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 25
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 24
- 208000009869 Neu-Laxova syndrome Diseases 0.000 description 23
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 23
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 22
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 22
- 102100040243 Microtubule-associated protein tau Human genes 0.000 description 21
- 241001531189 [Eubacterium] siraeum Species 0.000 description 21
- 238000003491 array Methods 0.000 description 21
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 21
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 19
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 19
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 18
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 18
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 18
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 18
- 101150102092 ccdB gene Proteins 0.000 description 17
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 16
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 15
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 14
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 14
- 238000010357 RNA editing Methods 0.000 description 14
- -1 RNA methylation Proteins 0.000 description 14
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 description 14
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 14
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 description 14
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 14
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 14
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 14
- 241000385097 uncultured Ruminococcus sp. Species 0.000 description 14
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 description 13
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 13
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 13
- 241000192026 Ruminococcus flavefaciens Species 0.000 description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 11
- 230000000981 bystander Effects 0.000 description 11
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 11
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 11
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 11
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 241001474297 Ruminococcus flavefaciens FD-1 Species 0.000 description 10
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 10
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 10
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 10
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 10
- 102100031505 Beta-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase 1 Human genes 0.000 description 9
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 9
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 9
- 108010066154 Nuclear Export Signals Proteins 0.000 description 9
- 241000192029 Ruminococcus albus Species 0.000 description 9
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 9
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 238000013461 design Methods 0.000 description 9
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 9
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 9
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 8
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 8
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 238000010446 CRISPR interference Methods 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 101000729811 Homo sapiens Beta-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase 1 Proteins 0.000 description 8
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 8
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 8
- 241000062639 Ruminococcus bicirculans Species 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 8
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 8
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 8
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 7
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 7
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 7
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 101000891579 Homo sapiens Microtubule-associated protein tau Proteins 0.000 description 7
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 7
- 102100038554 Neurogenin-2 Human genes 0.000 description 7
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 7
- 241000192031 Ruminococcus Species 0.000 description 7
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 7
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 7
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 7
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 7
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 7
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 7
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100034612 Annexin A4 Human genes 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 6
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 6
- 101000924461 Homo sapiens Annexin A4 Proteins 0.000 description 6
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 6
- 108020003217 Nuclear RNA Proteins 0.000 description 6
- 102000043141 Nuclear RNA Human genes 0.000 description 6
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 6
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 6
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 6
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 6
- 241000095588 Ruminococcaceae Species 0.000 description 6
- 241000134861 Ruminococcus sp. Species 0.000 description 6
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 6
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 6
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 6
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 5
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 description 5
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 5
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 101100219625 Mus musculus Casd1 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 5
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 5
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 5
- CCEKAJIANROZEO-UHFFFAOYSA-N sulfluramid Chemical group CCNS(=O)(=O)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F CCEKAJIANROZEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 241001300301 uncultured bacterium Species 0.000 description 5
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 5
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 4
- 101710165845 CD81 protein Proteins 0.000 description 4
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 4
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 4
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 4
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 4
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 4
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- 101000617738 Homo sapiens Survival motor neuron protein Proteins 0.000 description 4
- 241000700195 Hydrochoerus hydrochaeris Species 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 102100033448 Lysosomal alpha-glucosidase Human genes 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 4
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 4
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091008103 RNA aptamers Proteins 0.000 description 4
- 230000006093 RNA methylation Effects 0.000 description 4
- 102100021947 Survival motor neuron protein Human genes 0.000 description 4
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 4
- 239000003570 air Substances 0.000 description 4
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 4
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 4
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 4
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 4
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000030147 nuclear export Effects 0.000 description 4
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(C=2N=CN=C(NC=3C=CC(OC(F)(F)F)=CC=3)C=2)=C1 WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700020463 BRCA1 Proteins 0.000 description 3
- 102000036365 BRCA1 Human genes 0.000 description 3
- 101150072950 BRCA1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000052609 BRCA2 Human genes 0.000 description 3
- 108700020462 BRCA2 Proteins 0.000 description 3
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 3
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 3
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 3
- 102100022548 Beta-hexosaminidase subunit alpha Human genes 0.000 description 3
- 101150008921 Brca2 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 3
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 3
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 3
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 3
- 102100036252 Cyclin-dependent kinase 4 Human genes 0.000 description 3
- 102100033673 DAZ-associated protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 208000001914 Fragile X syndrome Diseases 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 3
- 102000006479 Heterogeneous-Nuclear Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010019372 Heterogeneous-Nuclear Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 3
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 3
- 101000871284 Homo sapiens DAZ-associated protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000743242 Homo sapiens RNA-binding protein 4 Proteins 0.000 description 3
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 3
- 101000663222 Homo sapiens Serine/arginine-rich splicing factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 241000256602 Isoptera Species 0.000 description 3
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 3
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 3
- 108020005198 Long Noncoding RNA Proteins 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 102100028089 RING finger protein 112 Human genes 0.000 description 3
- 108010039259 RNA Splicing Factors Proteins 0.000 description 3
- 102000015097 RNA Splicing Factors Human genes 0.000 description 3
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102100038153 RNA-binding protein 4 Human genes 0.000 description 3
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 3
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 3
- 102100037044 Serine/arginine-rich splicing factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 208000022292 Tay-Sachs disease Diseases 0.000 description 3
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 3
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 3
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 3
- XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N doxycycline monohydrate Chemical compound O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H](N(C)C)[C@@H]1[C@H]2O XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 102000005912 ran GTP Binding Protein Human genes 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- 101150064041 ALKBH5 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000015619 APOBEC Deaminases Human genes 0.000 description 2
- 108010024100 APOBEC Deaminases Proteins 0.000 description 2
- 101001082110 Acanthamoeba polyphaga mimivirus Eukaryotic translation initiation factor 4E homolog Proteins 0.000 description 2
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 101710187578 Alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 2
- 102100026882 Alpha-synuclein Human genes 0.000 description 2
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 2
- 101100421912 Arabidopsis thaliana SOT1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 2
- 102000008682 Argonaute Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010088141 Argonaute Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000014461 Ataxins Human genes 0.000 description 2
- 108010078286 Ataxins Proteins 0.000 description 2
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 102100032985 CCR4-NOT transcription complex subunit 7 Human genes 0.000 description 2
- 108050006912 CCR4-NOT transcription complex subunit 7 Proteins 0.000 description 2
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 description 2
- 206010008025 Cerebellar ataxia Diseases 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 2
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 2
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 2
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 2
- 102100026846 Cytidine deaminase Human genes 0.000 description 2
- 108010031325 Cytidine deaminase Proteins 0.000 description 2
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 101001082109 Danio rerio Eukaryotic translation initiation factor 4E-1B Proteins 0.000 description 2
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010093668 Deubiquitinating Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102100028027 Double-stranded RNA-binding protein Staufen homolog 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100029791 Double-stranded RNA-specific adenosine deaminase Human genes 0.000 description 2
- 102100038191 Double-stranded RNA-specific editase 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 2
- 101100118093 Drosophila melanogaster eEF1alpha2 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- 241001466953 Echovirus Species 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 102100038975 Exosome complex component RRP46 Human genes 0.000 description 2
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 2
- 208000000666 Fowlpox Diseases 0.000 description 2
- 238000001135 Friedman test Methods 0.000 description 2
- 208000032007 Glycogen storage disease due to acid maltase deficiency Diseases 0.000 description 2
- 206010053185 Glycogen storage disease type II Diseases 0.000 description 2
- 241000908634 Gnamptodon pumilio Species 0.000 description 2
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 2
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 2
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 2
- 102000017013 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1 Human genes 0.000 description 2
- 108010014594 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1 Proteins 0.000 description 2
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 2
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000697574 Homo sapiens Double-stranded RNA-binding protein Staufen homolog 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000865408 Homo sapiens Double-stranded RNA-specific adenosine deaminase Proteins 0.000 description 2
- 101000742223 Homo sapiens Double-stranded RNA-specific editase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000882125 Homo sapiens Exosome complex component RRP46 Proteins 0.000 description 2
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 description 2
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 description 2
- 101000833167 Homo sapiens Poly(A) RNA polymerase GLD2 Proteins 0.000 description 2
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000579423 Homo sapiens Regulator of nonsense transcripts 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000652359 Homo sapiens Spermatogenesis-associated protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 2
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 2
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 2
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 2
- 108700005090 Lethal Genes Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108091007460 Long intergenic noncoding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 2
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 2
- 108010059724 Micrococcal Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 2
- 206010068871 Myotonic dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 101710096140 Neurogenin-2 Proteins 0.000 description 2
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 2
- 241001263478 Norovirus Species 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710139464 Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 2
- 102100024380 Poly(A) RNA polymerase GLD2 Human genes 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102100028287 Regulator of nonsense transcripts 1 Human genes 0.000 description 2
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 2
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 241000369757 Sapovirus Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000009415 Spinocerebellar Ataxias Diseases 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 description 2
- 241000710951 Western equine encephalitis virus Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 2
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 2
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000004562 autosomal dominant cerebellar ataxia Diseases 0.000 description 2
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 2
- 208000037966 cold tumor Diseases 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 201000004502 glycogen storage disease II Diseases 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 210000000441 neoplastic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010079892 phosphoglycerol kinase Proteins 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 2
- 102000028499 poly(A) binding Human genes 0.000 description 2
- 108091023021 poly(A) binding Proteins 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 2
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000037426 transcriptional repression Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 4-[(1r)-1-aminoethyl]-n-pyridin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C1CC([C@H](N)C)CCC1C(=O)NC1=CC=NC=C1 IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 1
- 108020005176 AU Rich Elements Proteins 0.000 description 1
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036664 Adenosine deaminase Human genes 0.000 description 1
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101710098803 Beta-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000537222 Betabaculovirus Species 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 101710172824 CRISPR-associated endonuclease Cas9 Proteins 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000714198 Caliciviridae Species 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 241000700664 Capripoxvirus Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100026550 Caspase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000005243 Chondrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000006332 Choriocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000000454 Congenital Hyperinsulinism Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009798 Craniopharyngioma Diseases 0.000 description 1
- 108010060385 Cyclin B1 Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- 208000004449 DNA Virus Infections Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108700022150 Designed Ankyrin Repeat Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108091005942 ECFP Proteins 0.000 description 1
- 241000710945 Eastern equine encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 206010014967 Ependymoma Diseases 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 208000031637 Erythroblastic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001267419 Eubacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241001117875 Eubacterium sp. An11 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 208000006168 Ewing Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 102100032340 G2/mitotic-specific cyclin-B1 Human genes 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 241000963438 Gaussia <copepod> Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 241001641464 Gluconobacter cerevisiae Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 241001197893 Glyptemys herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001517118 Goose parvovirus Species 0.000 description 1
- 241000696272 Gull adenovirus Species 0.000 description 1
- 101150061822 HBEGF gene Proteins 0.000 description 1
- 108091092889 HOTTIP Proteins 0.000 description 1
- 108091007417 HOX transcript antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 102000036541 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein D0 Human genes 0.000 description 1
- 108091021225 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein D0 Proteins 0.000 description 1
- 102100030483 Histatin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100034533 Histone H2AX Human genes 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102000010029 Homer Scaffolding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010077223 Homer Scaffolding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101000614701 Homo sapiens ATP-sensitive inward rectifier potassium channel 11 Proteins 0.000 description 1
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101001082500 Homo sapiens Histatin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001067891 Homo sapiens Histone H2AX Proteins 0.000 description 1
- 101001011446 Homo sapiens Interferon regulatory factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001051093 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000967135 Homo sapiens N6-adenosine-methyltransferase catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- 101001013582 Homo sapiens N6-adenosine-methyltransferase non-catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000914035 Homo sapiens Pre-mRNA-splicing regulator WTAP Proteins 0.000 description 1
- 101001021281 Homo sapiens Protein HEXIM1 Proteins 0.000 description 1
- 101000964436 Homo sapiens Z-DNA-binding protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010084873 Human Immunodeficiency Virus nef Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 206010020460 Human T-cell lymphotropic virus type I infection Diseases 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701149 Human adenovirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701137 Human adenovirus 41 Species 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 1
- 241000702617 Human parvovirus B19 Species 0.000 description 1
- 208000025500 Hutchinson-Gilford progeria syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000000563 Hyperlipoproteinemia Type II Diseases 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100037924 Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030130 Interferon regulatory factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 102000017792 KCNJ11 Human genes 0.000 description 1
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- 102000008201 Lamin Type A Human genes 0.000 description 1
- 108010021099 Lamin Type A Proteins 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 201000003533 Leber congenital amaurosis Diseases 0.000 description 1
- 101000860104 Leptotrichia wadei (strain F0279) CRISPR-associated endoribonuclease Cas13a Proteins 0.000 description 1
- 206010024305 Leukaemia monocytic Diseases 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108091007767 MALAT1 Proteins 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 101150068888 MET3 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 1
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 1
- 208000025205 Mantle-Cell Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000007054 Medullary Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000172 Medulloblastoma Diseases 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108091007780 MiR-122 Proteins 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100118551 Mus musculus Egfr gene Proteins 0.000 description 1
- 101100238610 Mus musculus Msh3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 102100040619 N6-adenosine-methyltransferase catalytic subunit Human genes 0.000 description 1
- 102100031578 N6-adenosine-methyltransferase non-catalytic subunit Human genes 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 102100024014 Nestin Human genes 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 101100022915 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-11 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 201000010133 Oligodendroglioma Diseases 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108091033411 PCA3 Proteins 0.000 description 1
- 101150010115 PDCD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 208000007641 Pinealoma Diseases 0.000 description 1
- 108091007412 Piwi-interacting RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101710124239 Poly(A) polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 1
- 208000008601 Polycythemia Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 102100026431 Pre-mRNA-splicing regulator WTAP Human genes 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 208000007932 Progeria Diseases 0.000 description 1
- 101800001494 Protease 2A Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101800001066 Protein 2A Proteins 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 241000165031 Pseudomonas lactis Species 0.000 description 1
- 102000017742 Pumilio homology domains Human genes 0.000 description 1
- 108050005947 Pumilio homology domains Proteins 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 1
- 108020005093 RNA Precursors Proteins 0.000 description 1
- 208000009341 RNA Virus Infections Diseases 0.000 description 1
- 230000014632 RNA localization Effects 0.000 description 1
- 230000009948 RNA mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700638 Raccoonpox virus Species 0.000 description 1
- 101000599776 Rattus norvegicus Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 241001148570 Rhodothermus marinus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101100386089 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) MET17 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100022918 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) sua1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 108091007415 Small Cajal body-specific RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020003224 Small Nucleolar RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042773 Small Nucleolar RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000012167 Small RNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 102000001435 Synapsin Human genes 0.000 description 1
- 108050009621 Synapsin Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108091012456 T4 RNA ligase 1 Proteins 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018679 Tacrolimus Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010027179 Tacrolimus Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000034799 Tauopathies Diseases 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010045261 Type IIa hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000710959 Venezuelan equine encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 241000545067 Venus Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 208000014070 Vestibular schwannoma Diseases 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000033559 Waldenström macroglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001394207 [Eubacterium] siraeum DSM 15702 Species 0.000 description 1
- SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N [amino(ethoxy)phosphanyl]oxyethane Chemical compound CCOP(N)OCC SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 description 1
- 208000004064 acoustic neuroma Diseases 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 108010013829 alpha subunit DNA polymerase III Proteins 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 108010054176 apotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- MHHMNDJIDRZZNT-UHFFFAOYSA-N atto 680 Chemical compound OC(=O)CCCN1C(C)(C)C=C(CS([O-])(=O)=O)C2=C1C=C1OC3=CC4=[N+](CC)CCCC4=CC3=NC1=C2 MHHMNDJIDRZZNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008970 bacterial immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000003362 bronchogenic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-N bucladesine Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](OC(=O)CCC)[C@@H]2N1C(N=CN=C2NC(=O)CCC)=C2N=C1 CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-N 0.000 description 1
- 229960005263 bucladesine Drugs 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000025997 central nervous system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000024207 chronic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 201000005332 contagious pustular dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000001335 demethylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 230000009274 differential gene expression Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 108010084315 endopolyphosphatase Proteins 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006718 epigenetic regulation Effects 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 208000033442 familial 1 hyperinsulinemic hypoglycemia Diseases 0.000 description 1
- 208000033961 familial 2 hyperinsulinemic hypoglycemia Diseases 0.000 description 1
- 201000001386 familial hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 208000011532 familial hyperinsulinism Diseases 0.000 description 1
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 1
- 201000003415 fragile X-associated tremor/ataxia syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000025750 heavy chain disease Diseases 0.000 description 1
- 201000002222 hemangioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 206010024627 liposarcoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000023356 medullary thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000004630 mental health Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 108091051828 miR-122 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000034778 micropinocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 230000025608 mitochondrion localization Effects 0.000 description 1
- 201000006894 monocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000001611 myxosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108700043045 nanoluc Proteins 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000025189 neoplasm of testis Diseases 0.000 description 1
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000004031 neuronal differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000009207 neuronal maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001422 normality test Methods 0.000 description 1
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 1
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000030589 organelle localization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000004019 papillary adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000010198 papillary carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000003094 perturbing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 208000024724 pineal body neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000004123 pineal gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- ARIWANIATODDMH-UHFFFAOYSA-N rac-1-monolauroylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO ARIWANIATODDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007363 regulatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 210000003994 retinal ganglion cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 201000008407 sebaceous adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000007321 sebaceous carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 201000010965 sweat gland carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010809 targeting technique Methods 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000000107 tumor biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241000385095 uncultured Eubacterium sp. Species 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- H—ELECTRICITY
- H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
- H04L—TRANSMISSION OF DIGITAL INFORMATION, e.g. TELEGRAPHIC COMMUNICATION
- H04L51/00—User-to-user messaging in packet-switching networks, transmitted according to store-and-forward or real-time protocols, e.g. e-mail
- H04L51/21—Monitoring or handling of messages
- H04L51/212—Monitoring or handling of messages using filtering or selective blocking
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- H—ELECTRICITY
- H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
- H04L—TRANSMISSION OF DIGITAL INFORMATION, e.g. TELEGRAPHIC COMMUNICATION
- H04L45/00—Routing or path finding of packets in data switching networks
- H04L45/74—Address processing for routing
- H04L45/745—Address table lookup; Address filtering
-
- H—ELECTRICITY
- H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
- H04L—TRANSMISSION OF DIGITAL INFORMATION, e.g. TELEGRAPHIC COMMUNICATION
- H04L51/00—User-to-user messaging in packet-switching networks, transmitted according to store-and-forward or real-time protocols, e.g. e-mail
- H04L51/07—User-to-user messaging in packet-switching networks, transmitted according to store-and-forward or real-time protocols, e.g. e-mail characterised by the inclusion of specific contents
- H04L51/08—Annexed information, e.g. attachments
-
- H—ELECTRICITY
- H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
- H04L—TRANSMISSION OF DIGITAL INFORMATION, e.g. TELEGRAPHIC COMMUNICATION
- H04L51/00—User-to-user messaging in packet-switching networks, transmitted according to store-and-forward or real-time protocols, e.g. e-mail
- H04L51/07—User-to-user messaging in packet-switching networks, transmitted according to store-and-forward or real-time protocols, e.g. e-mail characterised by the inclusion of specific contents
- H04L51/18—Commands or executable codes
-
- H—ELECTRICITY
- H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
- H04L—TRANSMISSION OF DIGITAL INFORMATION, e.g. TELEGRAPHIC COMMUNICATION
- H04L51/00—User-to-user messaging in packet-switching networks, transmitted according to store-and-forward or real-time protocols, e.g. e-mail
- H04L51/21—Monitoring or handling of messages
- H04L51/214—Monitoring or handling of messages using selective forwarding
-
- H—ELECTRICITY
- H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
- H04L—TRANSMISSION OF DIGITAL INFORMATION, e.g. TELEGRAPHIC COMMUNICATION
- H04L9/00—Cryptographic mechanisms or cryptographic arrangements for secret or secure communications; Network security protocols
- H04L9/08—Key distribution or management, e.g. generation, sharing or updating, of cryptographic keys or passwords
-
- H—ELECTRICITY
- H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
- H04L—TRANSMISSION OF DIGITAL INFORMATION, e.g. TELEGRAPHIC COMMUNICATION
- H04L9/00—Cryptographic mechanisms or cryptographic arrangements for secret or secure communications; Network security protocols
- H04L9/30—Public key, i.e. encryption algorithm being computationally infeasible to invert or user's encryption keys not requiring secrecy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Signal Processing (AREA)
- Computer Networks & Wireless Communication (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Computer Security & Cryptography (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Computing Systems (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
【課題】標的RNAの検出、編集、または修飾に使用することができる、RNA分子を標的にするためのCRISPR/Cas方法および組成物を提供する。【解決手段】本開示は、RNAを修飾する(検出することを含む)ためのCRISPR/Cas系であって、新規なCas13dタンパク質(CasRおよびnCas1とも称される)およびガイドRNAを利用する、CRISPR/Cas系に関する。本願発明は、1つまたは複数の標的RNA分子を標的にする方法であって、1つまたは複数の標的RNA分子を、天然に存在しないかまたは操作されたクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造のリピート(CRISPR)関連(Cas)系と接触させるステップを含む。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2017年8月22日に出願された米国仮出願第62/548,846号、2017年10月16日に出願された米国仮出願第62/572,963号、2018年3月6日に出願された米国仮出願第62/639,178号、および2018年3月27日に出願された米国出願第15/937,699号に基づく優先権を主張し、これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2017年8月22日に出願された米国仮出願第62/548,846号、2017年10月16日に出願された米国仮出願第62/572,963号、2018年3月6日に出願された米国仮出願第62/639,178号、および2018年3月27日に出願された米国出願第15/937,699号に基づく優先権を主張し、これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
分野
本開示は、RNAを修飾する(検出することを含む)ためのCRISPR/Cas系であって、新規なCas13dタンパク質(CasRおよびnCas1とも称される)およびガイドRNAを利用する、CRISPR/Cas系に関する。
本開示は、RNAを修飾する(検出することを含む)ためのCRISPR/Cas系であって、新規なCas13dタンパク質(CasRおよびnCas1とも称される)およびガイドRNAを利用する、CRISPR/Cas系に関する。
政府の支援に関する謝辞
本発明は、National Institutes of Healthにより付与された、5 DP5 OD021369-02および5 R21 AG056811-02のもとに、政府の支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、National Institutes of Healthにより付与された、5 DP5 OD021369-02および5 R21 AG056811-02のもとに、政府の支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
背景
細胞機能および疾患におけるトランスクリプトーム変化のマッピングは、過去20年間にわたる技術進歩によって、マイクロアレイ(Schena et al., 1995)から、次世代シーケンシングおよび単一細胞研究(Shendure et al., 2017)へと転換した。しかしながら、個々の転写物の動力学の機能を調べ、観察された転写の変化と細胞表現型との間の因果関係を確立するには、所望される転写物を能動的に管理またはモジュレートする能力が必要である。
細胞機能および疾患におけるトランスクリプトーム変化のマッピングは、過去20年間にわたる技術進歩によって、マイクロアレイ(Schena et al., 1995)から、次世代シーケンシングおよび単一細胞研究(Shendure et al., 2017)へと転換した。しかしながら、個々の転写物の動力学の機能を調べ、観察された転写の変化と細胞表現型との間の因果関係を確立するには、所望される転写物を能動的に管理またはモジュレートする能力が必要である。
DNA操作技術、例えば、CRISPR-Cas9(Doudna and Charpentier, 2014; Hsu et al., 2014)により、研究者らが、特定の遺伝子エレメントの機能を分析
すること、または疾患の素因となる変異を正すことが可能となる。しかしながら、RNAの研究および取り扱いのための単純で拡張可能なツールは、DNA対応物に相当に遅れをとっている。既存のRNA干渉技術は、所望される転写物の切断または阻害を可能にするものであるが、相当なオフターゲット作用を有し、内因性プロセスにおける主要な役割に起因して、困難な操作標的のままである(Birmingham et al., 2006; Jackson et al., 2003)。結果として、RNAの機能的役割を直接的に研究するための方法は、限定的なままである。
すること、または疾患の素因となる変異を正すことが可能となる。しかしながら、RNAの研究および取り扱いのための単純で拡張可能なツールは、DNA対応物に相当に遅れをとっている。既存のRNA干渉技術は、所望される転写物の切断または阻害を可能にするものであるが、相当なオフターゲット作用を有し、内因性プロセスにおける主要な役割に起因して、困難な操作標的のままである(Birmingham et al., 2006; Jackson et al., 2003)。結果として、RNAの機能的役割を直接的に研究するための方法は、限定的なままである。
RNA操作における重大な制限の1つは、容易に再標的化および標的細胞への導入が可能であるRNA結合ドメインの欠如である。MS2 RNA結合ドメインは、例えば、不変の21ヌクレオチド(nt)のRNA配列を認識するため(Peabody, 1993)、所望される転写物をタグするためにはゲノム修飾が必要である。Pumilio相同性ドメインは、それぞれのタンパク質モジュールが別個のRNA塩基を認識するモジュラーのリピートを有するが、それらは短い8ntのRNA配列を標的にすることしかできない(Cheong
and Hall, 2006)。これまでに特徴付けられているII型(Batra et al., 2017;
O'Connell et al., 2014)およびVI型(Abudayyeh et al., 2016; East-Seletsky et al., 2016)のCRISPR-Cas系は、20~30ntのRNAを認識するように再プログラミングすることができるが、それらは、サイズが大きいため(約1200アミノ酸、aa)、主要な細胞およびin vivo送達のためにAAVにパッケージすることが困難となっている。
and Hall, 2006)。これまでに特徴付けられているII型(Batra et al., 2017;
O'Connell et al., 2014)およびVI型(Abudayyeh et al., 2016; East-Seletsky et al., 2016)のCRISPR-Cas系は、20~30ntのRNAを認識するように再プログラミングすることができるが、それらは、サイズが大きいため(約1200アミノ酸、aa)、主要な細胞およびin vivo送達のためにAAVにパッケージすることが困難となっている。
要旨
本出願は、CRISPR-Casリピートアレイの配列シグネチャーを識別するため、およびRNA標的化ツールに使用することができるこれまでに特徴付けされていなかったコンパクトなCasリボヌクレアーゼを発掘するための原核生物ゲノムのバイオインフォマティック分析を提供する。操作されたVI-D型CRISPRエフェクターを使用して、ヒト細胞において内因性RNAを効率的にノックダウンさせ、選択的スプライシングを扱い、RNA標的化適用およびトランスクリプトーム操作ツールボックスの一部としてのさらなるエフェクタードメイン融合体の道を開くことができる。
本出願は、CRISPR-Casリピートアレイの配列シグネチャーを識別するため、およびRNA標的化ツールに使用することができるこれまでに特徴付けされていなかったコンパクトなCasリボヌクレアーゼを発掘するための原核生物ゲノムのバイオインフォマティック分析を提供する。操作されたVI-D型CRISPRエフェクターを使用して、ヒト細胞において内因性RNAを効率的にノックダウンさせ、選択的スプライシングを扱い、RNA標的化適用およびトランスクリプトーム操作ツールボックスの一部としてのさらなるエフェクタードメイン融合体の道を開くことができる。
1つまたは複数の標的RNA分子を修飾する方法、例えば、クラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造のリピート(CRISPR)-CRISPR関連(Cas)系に媒介されるRNA編集方法が、本明細書において提供される。そのような方法は、1つまたは複数の標的RNA分子を、天然に存在しない(例えば、それが導入される細胞または系に天然に存在しない)か操作されたCRISPR-Cas系と接触させるステップを含み得る。そのようなCRISPR-Cas系には、(1)本明細書において提供される少なくとも1つのCas13dタンパク質または少なくとも1つのCas13d核酸コード配列(例えば、少なくとも1つのCas13dタンパク質をコードするmRNAまたはベクター)、および(2)1つまたは複数の標的RNA分子とハイブリダイズする少なくとも1つのCRISPR-Cas系ガイド核酸分子(例えば、ガイドRNA、gRNA)、またはgRNAをコードする少なくとも1つの核酸分子が含まれ得る。Cas13dタンパク質は、gRNAと複合体を形成し、gRNAは、複合体を、1つまたは複数の標的RNA分子へと指向させ、1つまたは複数の標的RNA分子を修飾する(例えば、切り離す、検出する)。一部の例では、1つまたは複数の標的RNA分子(または1つまたは複数の標的RNA分子を含有する細胞)を、少なくとも1つのCas13dタンパク質および少なくとも1つのgRNAを含む複合体と接触させる。一部の例では、系は、Mg2+を含む。しかしながら、標的RNAの切断が所望されない場合など、一部の例では、系は、Mg2+を含まない。
一部の例では、1つまたは複数の標的RNA分子を、天然に存在しないかまたは操作されたCRISPR-Cas系と接触させるステップは、1つまたは複数の標的RNA分子を含有する細胞(例えば、真核生物細胞または原核生物細胞)に、例えば、エンドサイトーシス、リポソーム、粒子、エクソソーム、微細小胞、遺伝子銃、エレクトロポレーション、ウイルス、またはこれらの組合せを使用して、天然に存在しないかまたは操作されたCRISPR-Cas系を導入することを含む。一部の例では、1つまたは複数の標的RNA分子を、天然に存在しないかまたは操作されたCRISPR-Cas系と接触させるステップは、1つまたは複数の標的RNA分子を含有する無細胞系(例えば、生物学的試料もしくは環境試料、または細胞ライセート)を、天然に存在しないかまたは操作されたCRISPR-Cas系と(例えば、標的RNAを検出するための診断方法において)接触させることを含む。
一部の例では、少なくとも1つのCas13dタンパク質は、(1)1つまたは複数のHEPNドメインを含むか、(2)150kD以下(例えば、140kD以下、130kD以下、120kD以下、例えば、約90~120kD、約100~120kD、または約110kDである)か、(3)1つまたは複数の変異型HEPNドメインを含み、ガイドRNAをプロセシングすることができるが、1つまたは複数の標的RNA分子を切断することも切り離すこともできないか、(4)原核生物ゲノムまたはメタゲノム、消化管メタゲノム、活性汚泥メタゲノム、嫌気性消化器メタゲノム、ニワトリ消化管メタゲノム、ヒト消化管メタゲノム、ブタ消化管メタゲノム、ウシ消化管メタゲノム、ヒツジ消化管メタゲノム、ヤギ消化管メタゲノム、カピバラ消化管メタゲノム、霊長類消化管メタゲノム、シロアリ消化管メタゲノム、糞便メタゲノム、Order ClostridialesまたはFamily Ruminococcaceae由来のゲノムに由来するCas13dオルソログを含むか、(5)Ruminococcus albus、Eubacterium siraeum、flavefaciens株XPD3002、Ruminococcus flavefaciens FD-1、無培養のEubacterium sp TS28-c4095、無培養Ruminococcus sp.、Ruminococcus bicirculans、またはRuminococcus sp
CAG57に由来するCas13dオルソログを含むか、(6)配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくは100%の配列同一性を含むか、または(7)これらの組合せ(例えば、1~6のうちのいずれかの組合せ)である。一部の例では、少なくとも1つのCas13dタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有し、配列番号195、196、または197に示される少なくとも1つのモチーフを含む。一部の例では、少なくとも1つのCas13dタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有し、配列番号288、289、290、または291に示される少なくとも1つのコンセンサス配列を含む。一部の例では、少なくとも1つのCas13dタンパク質は、1つまたは複数の他の薬剤、例えば、1つまたは複数の細胞内局在化シグナル、1つまたは複数のエフェクタードメイン、またはこれらの組合せをさらに含む(例えば、融合タンパク質である)。一部の例では、1つまたは複数のHEPNドメインを含む少なくとも1つのCas13dタンパク質は、1500aa以下、1200aa以下、1100aa以下、1000aa以下、例えば、約800~1500aa、約800~1250aa、または約850~950aaである。
CAG57に由来するCas13dオルソログを含むか、(6)配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくは100%の配列同一性を含むか、または(7)これらの組合せ(例えば、1~6のうちのいずれかの組合せ)である。一部の例では、少なくとも1つのCas13dタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有し、配列番号195、196、または197に示される少なくとも1つのモチーフを含む。一部の例では、少なくとも1つのCas13dタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有し、配列番号288、289、290、または291に示される少なくとも1つのコンセンサス配列を含む。一部の例では、少なくとも1つのCas13dタンパク質は、1つまたは複数の他の薬剤、例えば、1つまたは複数の細胞内局在化シグナル、1つまたは複数のエフェクタードメイン、またはこれらの組合せをさらに含む(例えば、融合タンパク質である)。一部の例では、1つまたは複数のHEPNドメインを含む少なくとも1つのCas13dタンパク質は、1500aa以下、1200aa以下、1100aa以下、1000aa以下、例えば、約800~1500aa、約800~1250aa、または約850~950aaである。
そのようなCas13dタンパク質をコードする単離された核酸分子、例えば、cDNA、ゲノムDNA、RNA、またはmRNAもまた、提供される。そのような単離された核酸分子は、ベクター(例えば、プラスミドまたはウイルスベクター)の一部であってもよく、プロモーターまたはエンハンサーエレメント(または両方)に作動可能に連結していてもよい。一部の例では、Cas13dタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号124、125、126、127、128、139、140、または141に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。一部の例では、少なくとも1つのCas13dタンパク質をコードする単離された核酸分子(ベクターの一部であり得る)は、真核生物細胞、例えば、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化された少なくとも1つのCas13dタンパク質コード配列、例えば、配列番号114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、142、143、144、または145に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するCas13dコード配列を含む。
一部の例では、Cas13dに媒介される様式で、1つまたは複数の標的RNA分子とハイブリダイズするgRNAは、1つまたは複数のダイレクトリピート(DR)配列、1つまたは複数のスペーサー配列、例えば、DR-スペーサー-DR-スペーサーのアレイを含む1つまたは複数の配列を含む。一部の例では、1つまたは複数のDR配列は、配列番号129、130、131、132、133、134、135、136、137、148、150、151、152、154、156、157、159、161、163、165、167、169、176、178、180、182、184、186、188、190、191、192、193、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、または254に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。1つの例では、gRNAは、追加の配列、例えば、アプタマー配列(例えば、MS2ステムループ)を含む。
一部の例では、複数のgRNAが、単一のアレイから生成され、それぞれのgRNAは、異なってもよく、例えば、異なるRNAを標的化してもよく、もしくは単一のRNAの複数の領域を標的化してもよく、またはそれらの組合せであってもよい。
1つまたは複数の標的RNA分子を標的にする方法が、提供される。一部の例では、RNA全体が、標的化される。一部の例では、RNAの一部分が、標的化される。RNA分子を標的にするステップは、1つまたは複数の標的RNA分子を切り離すかまたはそれにニックを入れるステップ、1つまたは複数の標的RNA分子を活性化するステップ、1つまたは複数の標的RNA分子を脱活性化するステップ、1つまたは複数の標的RNA分子を視覚化または検出するステップ、1つまたは複数の標的RNA分子を標識するステップ、1つまたは複数の標的RNA分子を結合するステップ、1つまたは複数の標的RNA分子を編集するステップ、1つまたは複数の標的RNA分子を輸送するステップ、および1つまたは複数の標的RNA分子をマスクするステップのうちの1つまたは複数を含み得る。一部の例では、1つまたは複数の標的RNA分子を修飾するステップは、RNA塩基置換、RNA塩基欠失、RNA塩基挿入、標的RNAにおける破断、RNAのメチル化、およびRNAの脱メチル化のうちの1つまたは複数を含む。
一部の例では、そのような方法は、疾患、例えば、ヒトにおける疾患を処置するために使用される。そのような例では、1つまたは複数の標的RNA分子は、疾患と関連している。
天然に存在しないタンパク質を含む、単離されたタンパク質もまた、提供される。一部の例では、タンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。一部の例では、本開示によって包含される単離されたCas13dタンパク質は、配列番号195、196、197、288、289、290、または291に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する配列を含む。一部の例では、単離されたタンパク質は、原核生物ゲノムまたはメタゲノム、消化管メタゲノム、活性汚泥メタゲノム、嫌気性消化器メタゲノム、ニワトリ消化管メタゲノム、ヒト消化管メタゲノム、ブタ消化管メタゲノム、ウシ消化管メタゲノム、ヒツジ消化管メタゲノム、ヤギ消化管メタゲノム、カピバラ消化管メタゲノム、霊長類消化管メタゲノム、シロアリ消化管メタゲノム、糞便メタゲノム、Order ClostridialesまたはFamily Ruminococcaceae由来のゲノムに由来するCas13dオルソログである。一部の例では、Cas13dオルソログは、Ruminococcus albus、Eubacterium siraeum、Ruminococcus flavefaciens株XPD3002、Ruminococcus flavefaciens FD-1、無培養Eubacterium sp TS28-c4095、無培養Ruminococcus sp.、Ruminococcus bicirculans、またはRuminococcus sp CAG57に由来するCas13dオルソログを含む。Cas13dタンパク質は、1つまたは複数の他の薬剤またはドメイン、例えば、1つまたは複数の細胞内局在化シグナル、1つまたは複数のエフェクタードメイン、またはこれらの組合せをさらに含み得る(例えば、融合タンパク質である)。
単離されたガイドRNA(gRNA)分子もまた、提供される。一部の例では、単離されたgRNAは、1つまたは複数のダイレクトリピート(DR)配列、例えば、プロセシングされていない(例えば、約36nt)またはプロセシングされたDR(例えば、約30nt)を含む。一部の例では、DRは、配列番号129、130、131、132、133、134、135、136、137、148、150、151、152、154、156、157、159、161、163、165、167、169、176、178、180、182、184、186、188、190、191、192、193、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、または254に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。そのようなgRNAは、標的RNAに特異的な(例えば、それに相補的な)1つまたは複数のスペーサー配列をさらに含み得る。
本明細書において提供されるCas13dタンパク質および本明細書において提供されるgRNAを含む、リボ核タンパク質(RNP)複合体もまた、提供される。
本明細書において提供される任意のCas13dタンパク質(またはCas13dをコードする核酸分子)、任意のgRNA、任意のRNP複合体、または任意のベクターを含む、組換え細胞もまた、提供される。1つの例では、細胞は、細菌細胞ではない。1つの例では、細胞は、細菌細胞である。
本明細書において提供される任意のCas13dタンパク質(またはCas13dをコードする核酸分子)、任意のgRNA、任意のRNP複合体、任意の単離された核酸分子、任意のベクター、または任意の細胞のうちの1つまたは複数を含む、組成物もまた、提供される。そのような組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。
キットもまた、提供される。そのようなキットは、本明細書において提供される任意のCas13dタンパク質(またはCas13dをコードする核酸分子)、任意のgRNA、任意のRNP複合体、任意の単離された核酸分子、任意のベクター、任意の細胞、または任意の組成物のうちの1つまたは複数を含み得る。そのような試薬は、組み合わされていてもよく、または別個の容器に入っていてもよい。
本開示の上述およびその他の目的および特性は、添付の図面を参照しながら進められる以下の詳細な説明により、さらに明らかとなろう。
配列表
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、37C.F.R.1.822に定義されるように、ヌクレオチド塩基については標準的な略字およびアミノ酸については3文字コードを使用して示されている。それぞれの核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、提示された鎖に対する任意の参照により含まれると理解される。配列表は、2018年8月22日に作成された0.99MBのASCIIテキストファイルとして提出されており、参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表においては、以下の通りである。
配列番号1は、HEPN部位を含有するEubacterium siraeumに由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号2は、変異型HEPN部位を含有するEubacterium siraeumに由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号3は、HEPN部位を含有する無培養Ruminococcus sp.に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号4は、変異型HEPN部位を含有する無培養Ruminococcus sp.に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号5は、Gut_metagenome_contig2791000549に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号6は、Gut_metagenome_contig855000317に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号7は、Gut_metagenome_contig3389000027に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号8は、Gut_metagenome_contig8061000170に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号9は、Gut_metagenome_contig1509000299に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号10は、Gut_metagenome_contig9549000591に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号11は、Gut_metagenome_contig71000500に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号12は、ヒト消化管メタゲノムに由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号13は、Gut_metagenome_contig3915000357に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号14は、Gut_metagenome_contig4719000173に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号15は、Gut_metagenome_contig6929000468に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号16は、Gut_metagenome_contig7367000486に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号17は、Gut_metagenome_contig7930000403に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号18は、Gut_metagenome_contig993000527に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号19は、Gut_metagenome_contig6552000639に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号20は、Gut_metagenome_contig11932000246に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号21は、Gut_metagenome_contig12963000286に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号22は、Gut_metagenome_contig2952000470に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号23は、Gut_metagenome_contig451000394に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号24は、Eubacterium_siraeum_DSM_15702に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号25は、gut_metagenome_P19E0k2120140920,_c369000003に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号26は、Gut_metagenome_contig7593000362に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号27は、Gut_metagenome_contig12619000055に由来する例示的なCas13d配列である。配列番号28は、Gut_metagenome_contig1405000151に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号29は、Chicken_gut_metagenome_c298474に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号30は、Gut_metagenome_contig1516000227に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号31は、Gut_metagenome_contig1838000319に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号32は、Gut_metagenome_contig13123000268に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号33は、Gut_metagenome_contig5294000434に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号34は、Gut_metagenome_contig6415000192に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号35は、Gut_metagenome_contig6144000300に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号36は、Gut_metagenome_contig9118000041に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号37は、Activated_sludge_metagenome_transcript_124486に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号38は、Gut_metagenome_contig1322000437に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号39は、Gut_metagenome_contig4582000531に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号40は、Gut_metagenome_contig9190000283に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号41は、Gut_metagenome_contig1709000510に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号42は、HEPNドメインを有するM24_(LSQX01212483_Anaerobic_digester_metagenome)に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号43は、Gut_metagenome_contig3833000494に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号44は、Activated_sludge_metagenome_transcript_117355に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号45は、Gut_metagenome_contig11061000330に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号46は、ヒツジ消化管メタゲノムに由来するGut_metagenome_contig338000322に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号47は、ヒト消化管メタゲノムに由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号48は、Gut_metagenome_contig9530000097に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号49は、Gut_metagenome_contig1750000258に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号50は、Gut_metagenome_contig5377000274に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号51は、gut_metagenome_P19E0k2120140920_c248000089に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号52は、Gut_metagenome_contig11400000031に由来する例示的なCas13d配列である。配列番号53は、Gut_metagenome_contig7940000191に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号54は、Gut_metagenome_contig6049000251に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号55は、Gut_metagenome_contig1137000500に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号56は、Gut_metagenome_contig9368000105に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号57は、Gut_metagenome_contig546000275に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号58は、Gut_metagenome_contig7216000573に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号59は、Gut_metagenome_contig4806000409に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号60は、Gut_metagenome_contig10762000480に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号61は、Gut_metagenome_contig4114000374に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号62は、Ruminococcus_flavefaciens_FD1に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号63は、Gut_metagenome_contig7093000170に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号64は、Gut_metagenome_contig11113000384に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号65は、Gut_metagenome_contig6403000259に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号66は、Gut_metagenome_contig6193000124に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号67は、Gut_metagenome_contig721000619に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号68は、Gut_metagenome_contig1666000270に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号69は、Gut_metagenome_contig2002000411に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号70は、Ruminococcus_albusに由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号71は、Gut_metagenome_contig13552000311に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号72は、Gut_metagenome_contig10037000527に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号73は、Gut_metagenome_contig238000329に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号74は、Gut_metagenome_contig2643000492に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号75は、Gut_metagenome_contig874000057に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号76は、Gut_metagenome_contig4781000489に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号77は、Gut_metagenome_contig12144000352に由来する例示的なCas13d配列である。配列番号78は、Gut_metagenome_contig5590000448に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号79は、Gut_metagenome_contig9269000031に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号80は、Gut_metagenome_contig8537000520に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号81は、Gut_metagenome_contig1845000130に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号82は、gut_metagenome_P13E0k2120140920_c3000072に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号83は、gut_metagenome_P1E0k2120140920_c1000078に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号84は、Gut_metagenome_contig12990000099に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号85は、Gut_metagenome_contig525000349に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号86は、Gut_metagenome_contig7229000302に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号87は、Gut_metagenome_contig3227000343に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号88は、Gut_metagenome_contig7030000469に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号89は、Gut_metagenome_contig5149000068に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号90は、Gut_metagenome_contig400200045に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号91は、Gut_metagenome_contig10420000446に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号92は、new_flavefaciens,_strain_XPD3002に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号93は、M26_Gut_metagenome_contig698000307に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号94は、M36_Uncultured_Eubacterium_sp_TS28_c40956に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号95は、M12_gut_metagenome_P25C0k2120140920_c134000066に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号96は、ヒト消化管メタゲノムに由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号97は、M10_gut_metagenome_P25C90k2120140920,_c28000041に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号98は、M11_gut_metagenome_P25C7k2120140920_c4078000105に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号99は、gut_metagenome_P25C0k2120140920_c32000045に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号100は、M13_gut_metagenome_P23C7k2120140920_c3000067に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号101は、M5_gut_metagenome_P18E90k2120140920に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号102は、M21_gut_metagenome_P18E0k2120140920に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号103は、M7_gut_metagenome_P38C7k2120140920_c4841000003に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号104は、Ruminococcus_bicirculansに由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号105は、例示的なCas13d配列である。
配列番号106は、例示的なCas13dコンセンサス配列である。
配列番号107は、M18_gut_metagenome_P22E0k2120140920_c3395000078に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号108は、M17_gut_metagenome_P22E90k2120140920_c114に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号109は、Ruminococcus_sp_CAG57に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号110は、gut_metagenome_P11E90k2120140920_c43000123に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号111は、M6_gut_metagenome_P13E90k2120140920_c7000009に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号112は、M19_gut_metagenome_P17E90k2120140920に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号113は、gut_metagenome_P17E0k2120140920,_c87000043に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号114は、例示的なヒトコドン最適化Eubacterium siraeum
Cas13d核酸配列である。
配列番号115は、変異体HEPNドメインを有する例示的なヒトコドン最適化Eubacterium siraeum Cas13d核酸配列である。
配列番号116は、N末端NLSを有する例示的なヒトコドン最適化Eubacterium siraeum Cas13d核酸配列である。
配列番号117は、N末端およびC末端NLSタグを有する例示的なヒトコドン最適化Eubacterium siraeum Cas13d核酸配列である。
配列番号118は、例示的なヒトコドン最適化無培養Ruminococcus sp.Cas13d核酸配列である。
配列番号119は、変異体HEPNドメインを有する例示的なヒトコドン最適化無培養Ruminococcus sp.Cas13d核酸配列である。
配列番号120は、N末端NLSを有する例示的なヒトコドン最適化無培養Ruminococcus sp.Cas13d核酸配列である。
配列番号121は、N末端およびC末端NLSタグを有する例示的なヒトコドン最適化無培養Ruminococcus sp.Cas13d核酸配列である。
配列番号122は、例示的なヒトコドン最適化無培養Ruminococcus flavefaciens FD1 Cas13d核酸配列である。
配列番号123は、変異型HEPNドメインを有する例示的なヒトコドン最適化無培養Ruminococcus flavefaciens FD1 Cas13d核酸配列である。
配列番号124は、Ruminococcus bicirculansに由来する例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号125は、Eubacterium siraeumに由来する例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号126は、Ruminococcus flavefaciens FD1に由来する例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号127は、Ruminococcus albusに由来する例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号128は、Ruminococcus flavefaciens XPDに由来する例示的なCas13d核酸配列である。配列番号129は、E.siraeum Cas13dの例示的なコンセンサスDR核酸配列である。
配列番号130は、Rum.Sp.Cas13dの例示的なコンセンサスDR核酸配列である。
配列番号131は、Rum.Flavefaciens株XPD3002 Cas13dおよびCasRxの例示的なコンセンサスDR核酸配列である。
配列番号132~137は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である。
配列番号138は、7つの全長Cas13dオルソログの例示的な50%コンセンサス配列である。
配列番号139は、消化管メタゲノムP1E0に由来する例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号140は、嫌気性消化器に由来する例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号141は、Ruminococcus sp.CAG:57に由来する例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号142は、例示的なヒトコドン最適化無培養消化管メタゲノムP1E0 Cas13d核酸配列である。
配列番号143は、例示的なヒトコドン最適化嫌気性消化器Cas13d核酸配列である。
配列番号144は、例示的なヒトコドン最適化Ruminococcus flavefaciens XPD Cas13d核酸配列である。
配列番号145は、例示的なヒトコドン最適化Ruminococcus albus Cas13d核酸配列である。
配列番号146は、Ruminococcus sp.CAG:57 CRISPRアレイの例示的なプロセシングである。
配列番号147は、コンティグemb|OBVH01003037.1、ヒト消化管メタゲノム配列に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である(WGSコンティグemb|OBXZ01000094.1|およびemb|OBJF01000033.1においても見出される。
配列番号148は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号147に付随する)。
配列番号149は、コンティグtpg|DBYI01000091.1|(ウシ消化管メタゲノムからアセンブリした無培養Ruminococcus flavefaciens UBA1190)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号150~152は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号149に付随する)。
配列番号153は、コンティグtpg|DJXD01000002.1|(無培養Ruminococcusアセンブリ、UBA7013、ヒツジ消化管メタゲノム由来)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号154は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号153に付随する)。
配列番号155は、コンティグOGZC01000639.1(ヒト消化管メタゲノムアセンブリ)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号156~177は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号155に付随する)。
配列番号158は、コンティグemb|OHBM01000764.1(ヒト消化管メタゲノムアセンブリ)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号159は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号158に付随する)。
配列番号160は、コンティグemb|OHCP01000044.1(ヒト消化管メタゲノムアセンブリ)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。配列番号161は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号160に付随する)。
配列番号162は、コンティグemb|OGDF01008514.1|(ヒト消化管メタゲノムアセンブリ)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号163は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号162に付随する)。
配列番号164は、コンティグemb|OGPN01002610.1(ヒト消化管メタゲノムアセンブリ)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号165は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号164に付随する)。
配列番号166は、コンティグNFIR01000008.1(Eubacterium
sp.An3、ニワトリ消化管メタゲノム由来)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号167は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号166に付随する)。
配列番号168は、コンティグNFLV01000009.1(Eubacterium
sp.An11、ニワトリ消化管メタゲノム由来)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号169は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号168に付随する)。
配列番号171~174は、例示的なCas13dモチーフ配列である。
配列番号175は、コンティグOJMM01002900ヒト消化管メタゲノム配列に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号176は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号175に付随する)。
配列番号177は、コンティグODAI011611274.1消化管メタゲノム配列に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号178は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号177に付随する)。
配列番号179は、コンティグOIZX01000427.1に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号180は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号179に付随する)。
配列番号181は、コンティグemb|OCVV012889144.1に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号182は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号181に付随する)。
配列番号183は、コンティグOCTW011587266.1に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号184は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号183に付随する)。
配列番号185は、コンティグemb|OGNF01009141.1に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号186は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号185に付随する)。
配列番号187は、コンティグemb|OIEN01002196.1に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号188は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号187に付随する)。
配列番号189は、コンティグe-k87_11092736に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号190~193は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号189に付随する)。
配列番号194は、Gut_metagenome_contig6893000291に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号195~197は、例示的なCas13dモチーフ配列である。
配列番号198は、Ga0224415_10007274に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号199は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号198に付随する)。
配列番号200は、EMG_10003641に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号201は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号200に付随する)。
配列番号202は、Ga0129306_1000735に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号203は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号202に付随する)。
配列番号204は、Ga0129317_1008067に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号205は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号204に付随する)。
配列番号206は、Ga0224415_10048792に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号207は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号206に付随する)。
配列番号208は、160582958 _gene49834に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号209は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号208に付随する)。
配列番号210は、250twins_35838_GL0110300に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号211は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号210に付随する)。
配列番号212は、250twins_36050_GL0158985に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号213は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号212に付随する)。
配列番号214は、31009_GL0034153に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号215は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号214に付随する)。
配列番号216は、530373_GL0023589に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号217は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号216に付随する)。
配列番号218は、BMZ-11B_GL0037771に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号219は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号218に付随する)。配列番号220は、BMZ-11B_GL0037915に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号221は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号220に付随する)。
配列番号222は、BMZ-11B_GL0069617に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号223は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号222に付随する)。
配列番号224は、-DLF014_GL0011914に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号225は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号224に付随する)。
配列番号226は、EYZ-362B_GL0088915に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号227~228は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号226に付随する)。
配列番号229は、Ga0099364_10024192に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号230は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号229に付随する)。
配列番号231は、Ga0187910_10006931に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号232は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号231に付随する)。
配列番号233は、Ga0187910_10015336に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号234は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号233に付随する)。
配列番号235は、Ga0187910_10040531に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号236は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号235に付随する)。
配列番号237は、Ga0187911_10069260に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号238は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号237に付随する)。
配列番号239は、MH0288_GL0082219に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号240は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号239に付随する)。
配列番号241は、O2.UC29-0_GL0096317に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号242は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号241に付随する)。
配列番号243は、PIG-014_GL0226364に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号244は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号243に付随する)。
配列番号245は、PIG-018_GL0023397に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。配列番号246は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号245に付随する)。
配列番号247は、PIG-025_GL0099734に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号248は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号247に付随する)。
配列番号249は、PIG-028_GL0185479に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号250は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号249に付随する)。
配列番号251は、-Ga0224422_10645759に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号252は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号251に付随する)。
配列番号253は、ODAIキメラに由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号254は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号253に付随する)。
配列番号255は、HEPNモチーフである。
配列番号256および257は、それぞれ、例示的なCas13d核局在化シグナルのアミノ酸配列および核酸配列である。
配列番号258および260は、それぞれ、例示的なSV40大型T抗原核局在化シグナルのアミノ酸配列および核酸配列である。
配列番号259は、dCas9標的配列である。
配列番号261は、ccdBを標的にする人工Eubacterium siraeum
nCas1アレイである。
配列番号262は、全長36ntダイレクトリピートである。
配列番号263~266は、スペーサー配列である。
配列番号267は、ccdBを標的にする人工無培養Ruminoccus sp.nCas1アレイである。
配列番号268は、全長36ntダイレクトリピートである。
配列番号269~272は、スペーサー配列である。
配列番号273は、ccdB標的RNA配列である。
配列番号274~277は、スペーサー配列である。
配列番号278は、変異型Cas13d配列、NLS-Ga_0531(trunc)-NLS-HAである。この変異体は、非保存的N末端の欠失を有する。
配列番号279は、変異型Cas13d配列、NES-Ga_0531(trunc)-NES-HAである。この変異体は、非保存的N末端の欠失を有する。
配列番号280は、全長Cas13d配列、NLS-RfxCas13d-NLS-HAである。
配列番号281は、変異型Cas13d配列、NLS-RfxCas13d(del5)-NLS-HAである。この変異体は、アミノ酸558~587の欠失を有する。
配列番号282は、変異型Cas13d配列、NLS-RfxCas13d(del5.12)-NLS-HAである。この変異体は、アミノ酸558~587および953~966の欠失を有する。
配列番号283は、変異型Cas13d配列、NLS-RfxCas13d(del5.13)-NLS-HAである。この変異体は、アミノ酸376~392および558~587の欠失を有する。
配列番号284は、変異型Cas13d配列、NLS-RfxCas13d(del5.12+5.13)-NLS-HAである。この変異体は、アミノ酸376~392、558~587、および953~966の欠失を有する。
配列番号285は、変異型Cas13d配列、NLS-RfxCas13d(del13)-NLS-HAである。この変異体は、アミノ酸376~392の欠失を有する。
配列番号286は、ADAR2の発現を編集するために使用されるエフェクター配列である。アミノ酸1~969は、dRfxCas13であり、aa970~991は、NLS配列であり、アミノ酸992~1378は、ADAR2DDである。
配列番号287は、例示的なHIV NESタンパク質配列である。
配列番号288~291は、例示的なCas13dモチーフ配列である。
配列番号292は、Cas13dオルソログ配列MH_4866である。
配列番号293は、037_-_emb|OIZA01000315.1|に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号294は、PIG-022_GL0026351に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号295は、PIG-046_GL0077813に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号296は、pig_chimeraに由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、37C.F.R.1.822に定義されるように、ヌクレオチド塩基については標準的な略字およびアミノ酸については3文字コードを使用して示されている。それぞれの核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、提示された鎖に対する任意の参照により含まれると理解される。配列表は、2018年8月22日に作成された0.99MBのASCIIテキストファイルとして提出されており、参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表においては、以下の通りである。
配列番号1は、HEPN部位を含有するEubacterium siraeumに由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号2は、変異型HEPN部位を含有するEubacterium siraeumに由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号3は、HEPN部位を含有する無培養Ruminococcus sp.に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号4は、変異型HEPN部位を含有する無培養Ruminococcus sp.に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号5は、Gut_metagenome_contig2791000549に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号6は、Gut_metagenome_contig855000317に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号7は、Gut_metagenome_contig3389000027に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号8は、Gut_metagenome_contig8061000170に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号9は、Gut_metagenome_contig1509000299に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号10は、Gut_metagenome_contig9549000591に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号11は、Gut_metagenome_contig71000500に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号12は、ヒト消化管メタゲノムに由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号13は、Gut_metagenome_contig3915000357に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号14は、Gut_metagenome_contig4719000173に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号15は、Gut_metagenome_contig6929000468に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号16は、Gut_metagenome_contig7367000486に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号17は、Gut_metagenome_contig7930000403に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号18は、Gut_metagenome_contig993000527に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号19は、Gut_metagenome_contig6552000639に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号20は、Gut_metagenome_contig11932000246に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号21は、Gut_metagenome_contig12963000286に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号22は、Gut_metagenome_contig2952000470に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号23は、Gut_metagenome_contig451000394に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号24は、Eubacterium_siraeum_DSM_15702に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号25は、gut_metagenome_P19E0k2120140920,_c369000003に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号26は、Gut_metagenome_contig7593000362に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号27は、Gut_metagenome_contig12619000055に由来する例示的なCas13d配列である。配列番号28は、Gut_metagenome_contig1405000151に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号29は、Chicken_gut_metagenome_c298474に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号30は、Gut_metagenome_contig1516000227に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号31は、Gut_metagenome_contig1838000319に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号32は、Gut_metagenome_contig13123000268に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号33は、Gut_metagenome_contig5294000434に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号34は、Gut_metagenome_contig6415000192に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号35は、Gut_metagenome_contig6144000300に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号36は、Gut_metagenome_contig9118000041に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号37は、Activated_sludge_metagenome_transcript_124486に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号38は、Gut_metagenome_contig1322000437に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号39は、Gut_metagenome_contig4582000531に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号40は、Gut_metagenome_contig9190000283に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号41は、Gut_metagenome_contig1709000510に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号42は、HEPNドメインを有するM24_(LSQX01212483_Anaerobic_digester_metagenome)に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号43は、Gut_metagenome_contig3833000494に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号44は、Activated_sludge_metagenome_transcript_117355に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号45は、Gut_metagenome_contig11061000330に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号46は、ヒツジ消化管メタゲノムに由来するGut_metagenome_contig338000322に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号47は、ヒト消化管メタゲノムに由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号48は、Gut_metagenome_contig9530000097に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号49は、Gut_metagenome_contig1750000258に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号50は、Gut_metagenome_contig5377000274に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号51は、gut_metagenome_P19E0k2120140920_c248000089に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号52は、Gut_metagenome_contig11400000031に由来する例示的なCas13d配列である。配列番号53は、Gut_metagenome_contig7940000191に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号54は、Gut_metagenome_contig6049000251に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号55は、Gut_metagenome_contig1137000500に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号56は、Gut_metagenome_contig9368000105に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号57は、Gut_metagenome_contig546000275に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号58は、Gut_metagenome_contig7216000573に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号59は、Gut_metagenome_contig4806000409に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号60は、Gut_metagenome_contig10762000480に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号61は、Gut_metagenome_contig4114000374に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号62は、Ruminococcus_flavefaciens_FD1に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号63は、Gut_metagenome_contig7093000170に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号64は、Gut_metagenome_contig11113000384に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号65は、Gut_metagenome_contig6403000259に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号66は、Gut_metagenome_contig6193000124に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号67は、Gut_metagenome_contig721000619に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号68は、Gut_metagenome_contig1666000270に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号69は、Gut_metagenome_contig2002000411に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号70は、Ruminococcus_albusに由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号71は、Gut_metagenome_contig13552000311に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号72は、Gut_metagenome_contig10037000527に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号73は、Gut_metagenome_contig238000329に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号74は、Gut_metagenome_contig2643000492に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号75は、Gut_metagenome_contig874000057に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号76は、Gut_metagenome_contig4781000489に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号77は、Gut_metagenome_contig12144000352に由来する例示的なCas13d配列である。配列番号78は、Gut_metagenome_contig5590000448に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号79は、Gut_metagenome_contig9269000031に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号80は、Gut_metagenome_contig8537000520に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号81は、Gut_metagenome_contig1845000130に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号82は、gut_metagenome_P13E0k2120140920_c3000072に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号83は、gut_metagenome_P1E0k2120140920_c1000078に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号84は、Gut_metagenome_contig12990000099に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号85は、Gut_metagenome_contig525000349に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号86は、Gut_metagenome_contig7229000302に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号87は、Gut_metagenome_contig3227000343に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号88は、Gut_metagenome_contig7030000469に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号89は、Gut_metagenome_contig5149000068に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号90は、Gut_metagenome_contig400200045に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号91は、Gut_metagenome_contig10420000446に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号92は、new_flavefaciens,_strain_XPD3002に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号93は、M26_Gut_metagenome_contig698000307に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号94は、M36_Uncultured_Eubacterium_sp_TS28_c40956に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号95は、M12_gut_metagenome_P25C0k2120140920_c134000066に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号96は、ヒト消化管メタゲノムに由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号97は、M10_gut_metagenome_P25C90k2120140920,_c28000041に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号98は、M11_gut_metagenome_P25C7k2120140920_c4078000105に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号99は、gut_metagenome_P25C0k2120140920_c32000045に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号100は、M13_gut_metagenome_P23C7k2120140920_c3000067に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号101は、M5_gut_metagenome_P18E90k2120140920に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号102は、M21_gut_metagenome_P18E0k2120140920に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号103は、M7_gut_metagenome_P38C7k2120140920_c4841000003に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号104は、Ruminococcus_bicirculansに由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号105は、例示的なCas13d配列である。
配列番号106は、例示的なCas13dコンセンサス配列である。
配列番号107は、M18_gut_metagenome_P22E0k2120140920_c3395000078に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号108は、M17_gut_metagenome_P22E90k2120140920_c114に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号109は、Ruminococcus_sp_CAG57に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号110は、gut_metagenome_P11E90k2120140920_c43000123に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号111は、M6_gut_metagenome_P13E90k2120140920_c7000009に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号112は、M19_gut_metagenome_P17E90k2120140920に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号113は、gut_metagenome_P17E0k2120140920,_c87000043に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号114は、例示的なヒトコドン最適化Eubacterium siraeum
Cas13d核酸配列である。
配列番号115は、変異体HEPNドメインを有する例示的なヒトコドン最適化Eubacterium siraeum Cas13d核酸配列である。
配列番号116は、N末端NLSを有する例示的なヒトコドン最適化Eubacterium siraeum Cas13d核酸配列である。
配列番号117は、N末端およびC末端NLSタグを有する例示的なヒトコドン最適化Eubacterium siraeum Cas13d核酸配列である。
配列番号118は、例示的なヒトコドン最適化無培養Ruminococcus sp.Cas13d核酸配列である。
配列番号119は、変異体HEPNドメインを有する例示的なヒトコドン最適化無培養Ruminococcus sp.Cas13d核酸配列である。
配列番号120は、N末端NLSを有する例示的なヒトコドン最適化無培養Ruminococcus sp.Cas13d核酸配列である。
配列番号121は、N末端およびC末端NLSタグを有する例示的なヒトコドン最適化無培養Ruminococcus sp.Cas13d核酸配列である。
配列番号122は、例示的なヒトコドン最適化無培養Ruminococcus flavefaciens FD1 Cas13d核酸配列である。
配列番号123は、変異型HEPNドメインを有する例示的なヒトコドン最適化無培養Ruminococcus flavefaciens FD1 Cas13d核酸配列である。
配列番号124は、Ruminococcus bicirculansに由来する例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号125は、Eubacterium siraeumに由来する例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号126は、Ruminococcus flavefaciens FD1に由来する例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号127は、Ruminococcus albusに由来する例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号128は、Ruminococcus flavefaciens XPDに由来する例示的なCas13d核酸配列である。配列番号129は、E.siraeum Cas13dの例示的なコンセンサスDR核酸配列である。
配列番号130は、Rum.Sp.Cas13dの例示的なコンセンサスDR核酸配列である。
配列番号131は、Rum.Flavefaciens株XPD3002 Cas13dおよびCasRxの例示的なコンセンサスDR核酸配列である。
配列番号132~137は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である。
配列番号138は、7つの全長Cas13dオルソログの例示的な50%コンセンサス配列である。
配列番号139は、消化管メタゲノムP1E0に由来する例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号140は、嫌気性消化器に由来する例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号141は、Ruminococcus sp.CAG:57に由来する例示的なCas13d核酸配列である。
配列番号142は、例示的なヒトコドン最適化無培養消化管メタゲノムP1E0 Cas13d核酸配列である。
配列番号143は、例示的なヒトコドン最適化嫌気性消化器Cas13d核酸配列である。
配列番号144は、例示的なヒトコドン最適化Ruminococcus flavefaciens XPD Cas13d核酸配列である。
配列番号145は、例示的なヒトコドン最適化Ruminococcus albus Cas13d核酸配列である。
配列番号146は、Ruminococcus sp.CAG:57 CRISPRアレイの例示的なプロセシングである。
配列番号147は、コンティグemb|OBVH01003037.1、ヒト消化管メタゲノム配列に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である(WGSコンティグemb|OBXZ01000094.1|およびemb|OBJF01000033.1においても見出される。
配列番号148は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号147に付随する)。
配列番号149は、コンティグtpg|DBYI01000091.1|(ウシ消化管メタゲノムからアセンブリした無培養Ruminococcus flavefaciens UBA1190)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号150~152は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号149に付随する)。
配列番号153は、コンティグtpg|DJXD01000002.1|(無培養Ruminococcusアセンブリ、UBA7013、ヒツジ消化管メタゲノム由来)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号154は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号153に付随する)。
配列番号155は、コンティグOGZC01000639.1(ヒト消化管メタゲノムアセンブリ)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号156~177は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号155に付随する)。
配列番号158は、コンティグemb|OHBM01000764.1(ヒト消化管メタゲノムアセンブリ)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号159は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号158に付随する)。
配列番号160は、コンティグemb|OHCP01000044.1(ヒト消化管メタゲノムアセンブリ)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。配列番号161は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号160に付随する)。
配列番号162は、コンティグemb|OGDF01008514.1|(ヒト消化管メタゲノムアセンブリ)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号163は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号162に付随する)。
配列番号164は、コンティグemb|OGPN01002610.1(ヒト消化管メタゲノムアセンブリ)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号165は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号164に付随する)。
配列番号166は、コンティグNFIR01000008.1(Eubacterium
sp.An3、ニワトリ消化管メタゲノム由来)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号167は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号166に付随する)。
配列番号168は、コンティグNFLV01000009.1(Eubacterium
sp.An11、ニワトリ消化管メタゲノム由来)に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号169は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号168に付随する)。
配列番号171~174は、例示的なCas13dモチーフ配列である。
配列番号175は、コンティグOJMM01002900ヒト消化管メタゲノム配列に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号176は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号175に付随する)。
配列番号177は、コンティグODAI011611274.1消化管メタゲノム配列に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号178は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号177に付随する)。
配列番号179は、コンティグOIZX01000427.1に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号180は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号179に付随する)。
配列番号181は、コンティグemb|OCVV012889144.1に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号182は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号181に付随する)。
配列番号183は、コンティグOCTW011587266.1に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号184は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号183に付随する)。
配列番号185は、コンティグemb|OGNF01009141.1に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号186は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号185に付随する)。
配列番号187は、コンティグemb|OIEN01002196.1に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号188は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号187に付随する)。
配列番号189は、コンティグe-k87_11092736に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号190~193は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号189に付随する)。
配列番号194は、Gut_metagenome_contig6893000291に由来する例示的なCas13d配列である。
配列番号195~197は、例示的なCas13dモチーフ配列である。
配列番号198は、Ga0224415_10007274に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号199は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号198に付随する)。
配列番号200は、EMG_10003641に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号201は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号200に付随する)。
配列番号202は、Ga0129306_1000735に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号203は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号202に付随する)。
配列番号204は、Ga0129317_1008067に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号205は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号204に付随する)。
配列番号206は、Ga0224415_10048792に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号207は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号206に付随する)。
配列番号208は、160582958 _gene49834に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号209は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号208に付随する)。
配列番号210は、250twins_35838_GL0110300に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号211は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号210に付随する)。
配列番号212は、250twins_36050_GL0158985に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号213は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号212に付随する)。
配列番号214は、31009_GL0034153に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号215は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号214に付随する)。
配列番号216は、530373_GL0023589に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号217は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号216に付随する)。
配列番号218は、BMZ-11B_GL0037771に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号219は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号218に付随する)。配列番号220は、BMZ-11B_GL0037915に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号221は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号220に付随する)。
配列番号222は、BMZ-11B_GL0069617に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号223は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号222に付随する)。
配列番号224は、-DLF014_GL0011914に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号225は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号224に付随する)。
配列番号226は、EYZ-362B_GL0088915に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号227~228は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号226に付随する)。
配列番号229は、Ga0099364_10024192に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号230は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号229に付随する)。
配列番号231は、Ga0187910_10006931に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号232は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号231に付随する)。
配列番号233は、Ga0187910_10015336に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号234は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号233に付随する)。
配列番号235は、Ga0187910_10040531に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号236は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号235に付随する)。
配列番号237は、Ga0187911_10069260に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号238は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号237に付随する)。
配列番号239は、MH0288_GL0082219に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号240は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号239に付随する)。
配列番号241は、O2.UC29-0_GL0096317に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号242は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号241に付随する)。
配列番号243は、PIG-014_GL0226364に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号244は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号243に付随する)。
配列番号245は、PIG-018_GL0023397に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。配列番号246は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号245に付随する)。
配列番号247は、PIG-025_GL0099734に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号248は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号247に付随する)。
配列番号249は、PIG-028_GL0185479に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号250は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号249に付随する)。
配列番号251は、-Ga0224422_10645759に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号252は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号251に付随する)。
配列番号253は、ODAIキメラに由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号254は、例示的なコンセンサスDR核酸配列である(配列番号253に付随する)。
配列番号255は、HEPNモチーフである。
配列番号256および257は、それぞれ、例示的なCas13d核局在化シグナルのアミノ酸配列および核酸配列である。
配列番号258および260は、それぞれ、例示的なSV40大型T抗原核局在化シグナルのアミノ酸配列および核酸配列である。
配列番号259は、dCas9標的配列である。
配列番号261は、ccdBを標的にする人工Eubacterium siraeum
nCas1アレイである。
配列番号262は、全長36ntダイレクトリピートである。
配列番号263~266は、スペーサー配列である。
配列番号267は、ccdBを標的にする人工無培養Ruminoccus sp.nCas1アレイである。
配列番号268は、全長36ntダイレクトリピートである。
配列番号269~272は、スペーサー配列である。
配列番号273は、ccdB標的RNA配列である。
配列番号274~277は、スペーサー配列である。
配列番号278は、変異型Cas13d配列、NLS-Ga_0531(trunc)-NLS-HAである。この変異体は、非保存的N末端の欠失を有する。
配列番号279は、変異型Cas13d配列、NES-Ga_0531(trunc)-NES-HAである。この変異体は、非保存的N末端の欠失を有する。
配列番号280は、全長Cas13d配列、NLS-RfxCas13d-NLS-HAである。
配列番号281は、変異型Cas13d配列、NLS-RfxCas13d(del5)-NLS-HAである。この変異体は、アミノ酸558~587の欠失を有する。
配列番号282は、変異型Cas13d配列、NLS-RfxCas13d(del5.12)-NLS-HAである。この変異体は、アミノ酸558~587および953~966の欠失を有する。
配列番号283は、変異型Cas13d配列、NLS-RfxCas13d(del5.13)-NLS-HAである。この変異体は、アミノ酸376~392および558~587の欠失を有する。
配列番号284は、変異型Cas13d配列、NLS-RfxCas13d(del5.12+5.13)-NLS-HAである。この変異体は、アミノ酸376~392、558~587、および953~966の欠失を有する。
配列番号285は、変異型Cas13d配列、NLS-RfxCas13d(del13)-NLS-HAである。この変異体は、アミノ酸376~392の欠失を有する。
配列番号286は、ADAR2の発現を編集するために使用されるエフェクター配列である。アミノ酸1~969は、dRfxCas13であり、aa970~991は、NLS配列であり、アミノ酸992~1378は、ADAR2DDである。
配列番号287は、例示的なHIV NESタンパク質配列である。
配列番号288~291は、例示的なCas13dモチーフ配列である。
配列番号292は、Cas13dオルソログ配列MH_4866である。
配列番号293は、037_-_emb|OIZA01000315.1|に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号294は、PIG-022_GL0026351に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号295は、PIG-046_GL0077813に由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
配列番号296は、pig_chimeraに由来する例示的なCas13dタンパク質配列である。
詳細な説明
別途注記されない限り、技術用語は、従来的な使用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes VII, published by Oxford University Press, 1999; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of
Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994;およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995;ならびに他の同様の参考文献において見出すことができる。
別途注記されない限り、技術用語は、従来的な使用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes VII, published by Oxford University Press, 1999; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of
Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994;およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995;ならびに他の同様の参考文献において見出すことができる。
本明細書で使用される場合、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈により別途明確に示されない限り、単数形ならびに複数形の両方を指す。本明細書で使用される場合、「含む(comprise)」という用語は、「含む(include)」を意味する。したがって、「核酸分子を含む(comprising a nucleic acid molecule)」は、他の要素を排除することなく、「核酸分子を含む(including a nucleic acid molecule)」を意味する。核酸に関するありとあらゆる塩基サイズは、およそのものであり、別途示されない限り、説明目的で提供されることを、さらに理解されたい。本明細書に記載されるものに類似であるかまたはそれと同等である多数の方法および材料を使用することができるが、特に好適な方法および材料が、以下に記載されている。矛盾が生じた場合には、用語の説明を含め、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。特許出願および特許を含め、全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示の様々な実施形態の考察を容易にするために、特定の用語の以下の説明を、提供する。
I.用語
投与:対象に、薬剤、例えば、本明細書に開示されるCas13dタンパク質(またはCas13dコード配列)またはガイド分子(またはコード配列)を、任意の有効な経路で、提供または供与することである。例示的な投与経路としては、注射(例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、腫瘍内、および静脈内)、経皮、鼻内、および吸入の経路が挙げられるが、これらに限定されない。
投与:対象に、薬剤、例えば、本明細書に開示されるCas13dタンパク質(またはCas13dコード配列)またはガイド分子(またはコード配列)を、任意の有効な経路で、提供または供与することである。例示的な投与経路としては、注射(例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、腫瘍内、および静脈内)、経皮、鼻内、および吸入の経路が挙げられるが、これらに限定されない。
Cas13d(CRISPR関連RNaseについてCasRとも称される):RNAを切り離すことができるかまたはRNAに結合することができる、RNAにガイドされるRNAエンドヌクレアーゼ酵素である。Cas13dタンパク質は、1つまたは2つのHEPNドメインを含む(例えば、配列番号1-3、42、62、70、82、83、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、および296を参照されたい)。天然のHEPNドメインは、配列RXXXXH(配列番号255)を含む。変異型HEPNドメインを含み、したがって、RNAを切り離すことができないが、ガイドRNAをプロセシングすることはできる、Cas13dタンパク質もまた、本開示によって包含される(例えば、配列番号2および4を参照されたい)。天然のCas13dタンパク質のアライメントは、図18A~18MMMに示される。加えて、Cas13dタンパク質は、特定の二次構造を有するgRNAのダイレクトリピート配列を特異的に認識する(例えば、図S2Cを参照されたい)。1つの例では、Cas13dタンパク質は、(1)約4~8ntのループ、(2)ステムにおけるntミスマッチに起因する小さな(例えば、1または2bpの)バルジを含み得る、相補的なヌクレオチドから形成される4~12ntのステム、および(3)約10~14nt(例えば、いずれかの側に5~7)であり得る、不対ntから形成されるバルジまたはオーバーハングを有するDRを認識し、かつ/またはそれに結合する。
1つの例では、全長(非短縮型)Cas13dタンパク質は、870~1080の間のアミノ酸長である。1つの例では、Cas13dタンパク質は、Order Clostridialesに由来する細菌のゲノム配列またはメタゲノム配列に由来する。1つの例では、Cas13dタンパク質の対応するDR配列は、Cas13d gRNAを含む分子においてスペーサー配列の5’末端に位置する。1つの例では、Cas13d gRNAにおけるDR配列は、プロセシングされていないCas13dガイドアレイ転写物におけるDR配列と比べて、5’末端において短縮されている(例えば、少なくとも1nt、少なくとも2nt、少なくとも3nt、少なくとも4nt、少なくとも5nt、例えば、1~3nt、3~6nt、5~7nt、または5~10nt短縮されている)。1つの例では、Cas13d gRNAにおけるDR配列は、Cas13dタンパク質によって、5’末端において5~7nt短縮されている。1つの例では、Cas13dタンパク質は、スペーサー-標的二重鎖の3’末端に隣接した標的RNAをA、U、G、またはCリボヌクレオチドのいずれかによって、5’末端に隣接した標的RNAをA、U、G、またはCリボヌクレオチドのいずれかによって、切り離すことができる。
1つの例では、Cas13dタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する。
1つの例では、Cas13dタンパク質は、2つのHEPN Rnaseドメインを含有し、これらは、RXXXXHアミノ酸モチーフ(配列番号255、ここで、Xは、任意のアミノ酸を示す)を含有する。加えて、Cas13dタンパク質は、一般的なProsite形式で記述された以下のアミノ酸モチーフのうちの1つまたは複数を含み得る。
したがって、一部の例では、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するCas13dタンパク質は、配列番号195、196、または197のモチーフを含む。
加えて、一部の例では、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するCas13dタンパク質は、配列番号288、289、290、または291のコンセンサス配列を含む。
相補性:核酸が、従来的なワトソンクリック塩基対合または他の非従来的な種類のいずれかによって、別の核酸配列と水素結合を形成する能力である。相補性パーセントは、ある核酸分子における、第2の核酸配列と水素結合(例えば、ワトソンクリック塩基対合)を形成することができる、残基のパーセンテージを示す(例えば、10個中5個、6個、7個、8個、9個、10個は、50%、60%、70%、80%、90%、および100%相補的となる)。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続した残基が、第2の核酸配列における同じ数の連続した残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」とは、本明細書で使用される場合、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、またはそれを上回るヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%である相補性の程度を指すか、またはストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする2つの核酸を指す。
CRISPR(クラスター化された規則的に間隔が空いたリピート):CRISPR RNAアレイは、CRISPR系の明確な特徴である。「CRISPR」という用語は、可変スペーサーが間に入った一定なダイレクトリピート(DR)を含むアレイのアーキテクチャーを指す。一部の例では、CRISPRアレイは、少なくとも、DR-スペーサー-DR-スペーサーを含む(図1Aを参照されたい)。この特徴を、開示される計算パイプラインにおいて、新規なCas13dタンパク質ファミリーを特定するために使用した(図1A)。細菌において、アレイは、単一の転写物(複数のcrRNA単位を含有する)として転写され、これが、次いで、Cas13dタンパク質および他のRNaseによって個々のcrRNAへとプロセシングされる。CRISPRは、シーケンシングされている細菌ゲノムのおよそ40%およびシーケンシングされている古細菌の90%に見出される。CRISPRには、しばしば、CRISPRと関連するタンパク質(例えば、本明細書において提供されるCas13dタンパク質)をコードするcas遺伝子が付随する。開示されるCRISPR/Cas系は、RNA標的化に、例えば、標的RNAを検出するため、任意の所望される位置において標的RNAを修飾するため、または任意の所望される位置において標的RNAを切り離すために使用することができる。
下方調節またはノックダウンされる:分子、例えば、標的RNAの発現に関連して使用される場合、標的RNAの産生の減少をもたらすが、一部の例では、標的RNA産物または標的RNA機能の完全な排除はもたらさない、任意のプロセスを指す。1つの例では、下方調節またはノックダウンは、検出可能な標的RNA発現または標的RNA活性の完全な排除をもたらすものではない。一部の例では、標的RNAは、コーディングRNAである。一部の例では、標的RNAは、非コーディングRNAである。下方調節の標的とされ得るRNA分子の具体的な例としては、mRNA、miRNA、rRNA、tRNA、核RNA、lincRNA、環状RNA、および構造RNAが挙げられる。一部の例では、標的RNAの下方調節またはノックダウンは、標的RNAの翻訳を減少させ、したがって、対応するタンパク質の存在を減少させることができる、プロセスを含む。開示されるCRISPR/Cas系は、目的の任意の標的RNAを下方調節するために使用することができる。
下方調節またはノックダウンには、標的RNAの任意の検出可能な減少が含まれる。ある特定の例では、細胞または無細胞系における検出可能な標的RNAは、対照(対応する正常細胞または試料において検出される標的RNAの量など)と比較して、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%(例えば、40%~90%、40%~80%、または50%~95%の減少)減少する。1つの例では、対照は、正常細胞(例えば、Cas13dまたはガイドRNAを含まない非組換え細胞)における相対的な発現の量である。
有効量:有益または所望される結果を達成するために十分である薬剤(例えば、本明細書において提供されるCRISPR/Cas剤)の量である。
治療有効量は、処置されている対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などのうちの1つまたは複数に応じて、変動し得、これらは、当業者によって容易に決定することができる。有益な治療効果としては、診断決定の可能化、疾患、症状、障害、もしくは病態の緩和、疾患、症状、障害、もしくは状態の発症の低減もしくは予防、および疾患、症状、障害、または病態への全般的な対抗を挙げることができる。一実施形態では、「有効量」は、疾患の症状を、例えば、(治療剤の投与がない場合と比較して)少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも50%、少なくとも70%、または少なくとも90%低減するのに十分な量である。
この用語は、本明細書のCas13dおよび/またはgRNAの発現を可能にするであろう用量、ならびに標的RNAの標的化(例えば、検出または修飾)を可能にする用量にも、適用される。
増加または減少:それぞれ、数の形式での、対照値からの統計学的に有意な正または負の変化である。増加は、対照値と比較して、正の変化、例えば、少なくとも50%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%、または少なくとも500%の増加である。減少は、対照値と比較して、負の変化、例えば、少なくとも20%の減少、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の減少である。一部の例では、減少は、100%未満の減少であり、例えば、90%以下、95%以下、または99%以下の減少である。
単離された:「単離された」生物学的成分(例えば、Cas13dタンパク質もしくは核酸、gRNA、またはそれを含有する細胞)は、成分が生じた生物の細胞または組織における他の生物学的成分、例えば、他の細胞、染色体および染色体外DNAおよびRNA、ならびにタンパク質から、実質的に分離、それらとは別に産生、またはそれらから精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸およびタンパク質を包含する。単離されたCas13dタンパク質もしくは核酸、またはそれを含有する細胞は、一部の例では、少なくとも50%純粋である、例えば、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも100%純粋である。
標識:別の分子(例えば、核酸分子)に直接的または間接的にコンジュゲートされて、その分子の検出を容易にするための化合物または組成物である。標識の具体的な非限定的な例としては、蛍光部分および蛍光発生部分、色素発生部分、ハプテン、親和性タグ、ならびに放射性同位体が挙げられる。標識は、直接的に検出可能であってもよく(例えば、光学的に検出可能である)、または間接的に検出可能であってもよい(例えば、順に検出可能である1つまたは複数の追加の分子との相互作用を介して)。
モジュレートする:RNAの内容を変化させることである。モジュレーションとしては、RNAの活性化(例えば、上方調節)、RNAの抑制(例えば、下方調節)、リボヌクレオチドの欠失、リボヌクレオチドの挿入、リボヌクレオチドの化学修飾、リボヌクレオチドの共有結合もしくは非共有結合による連結、および/またはリボヌクレオチドの置換を挙げることができるが、これらに限定されない。
天然に存在しないかまたは操作された:本明細書において互換可能に使用される用語であり、人間の手の関与を示す。核酸分子またはポリペプチドに言及する場合、この用語は、核酸分子またはポリペプチドが、少なくとも実質的に、それらが自然界で天然に関連しており、かつ自然界に見出される、少なくとも1つの他の成分を含まないことを示す。加えて、この用語は、核酸分子またはポリペプチドが、自然界に見出されない配列を有することを示し得る。
作動可能に連結した:第1の核酸配列が、第2の核酸配列との機能的関係にある場合、第1の核酸配列は、第2の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモーターが、コード配列(例えば、Cas13dタンパク質のコード配列)の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、そのコード配列に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したDNA配列は、連続的であり、2つのタンパク質コーディング領域を接合する必要がある場合は、同じリーディングフレーム内にある。
薬学的に許容される担体:本発明において有用な薬学的に許容される担体は、従来的なものである。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)は、Cas13dタンパク質または核酸分子(または開示されるCas13dタンパク質を有する開示されるCRISPR/Cas系を使用してRNAを修飾するために必要とされる他の分子)の薬学的送達に好適な組成物および製剤について記載している。
一般に、担体の性質は、用いられる具体的な投与様式に依存することになる。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどといった、薬学的および生理学的に許容される流体を含む、注射可能な流体を含む。生物学的に中性な担体に加えて、投与しようとする医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有してもよい。
ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質:任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖であっても分枝鎖であってもよく、これは、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。この用語はまた、修飾されているアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば、標識化成分とのコンジュゲーションも包含する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語には、天然および/または非天然もしくは合成のアミノ酸が含まれ、グリシンおよびDまたはLの両方の光学異性体、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体が含まれる。
プロモーター:核酸の転写を指示する核酸制御配列のアレイである。プロモーターは、転写の開始部位の近傍の必要な核酸配列を含む。プロモーターは、必要に応じて、遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含む。「構成的プロモーター」は、継続的に活性であり、外部シグナルまたは分子による調節に供されないプロモーターである。対照的に、「誘導性プロモーター」の活性は、外部シグナルまたは分子(例えば、転写因子)によって調節される。
組換えまたは宿主細胞:外因性ポリヌクレオチド、例えば、組換えプラスミドまたはベクターの導入によって、遺伝子改変されているか、または遺伝子改変することができる、細胞である。典型的に、宿主細胞は、ベクターを伝播することができ、その核酸が発現される、細胞である。そのような細胞は、真核生物のものであっても原核生物のものであってもよい。この用語には、対象宿主細胞の任意の子孫も含まれる。全ての子孫は、複製の最中に生じる変異が存在し得るため、親細胞と同一ではない可能性があることを理解されたい。しかしながら、「宿主細胞」という用語が使用される場合、そのような子孫が含まれる。
調節エレメント:プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位(IRES)、および他の発現制御エレメント(例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリ-U配列)を含む語句である。そのような調節エレメントは、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されており、これは、これにより参照
によりその全体が本明細書に組み込まれる。調節エレメントには、多数の種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、およびある特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの(例えば、組織特異的調節配列)が含まれる。組織特異的プロモーターは、主として、目的の所望される組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の器官(例えば、肝臓、膵臓)、または特定の細胞型(例えば、リンパ球)において、発現を指示することができる。調節エレメントはまた、時間依存性様式で、例えば、細胞周期依存性または発生段階依存性の様式で、発現を指示することもでき、これは、さらに組織または細胞型特異的であってもそうでなくてもよい。
によりその全体が本明細書に組み込まれる。調節エレメントには、多数の種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、およびある特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの(例えば、組織特異的調節配列)が含まれる。組織特異的プロモーターは、主として、目的の所望される組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の器官(例えば、肝臓、膵臓)、または特定の細胞型(例えば、リンパ球)において、発現を指示することができる。調節エレメントはまた、時間依存性様式で、例えば、細胞周期依存性または発生段階依存性の様式で、発現を指示することもでき、これは、さらに組織または細胞型特異的であってもそうでなくてもよい。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるベクターには、pol IIIプロモーター(例えば、U6およびH1プロモーター)、pol IIプロモーター(例えば、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター(必要に応じて、RSVエンハンサーを伴う)、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(必要に応じて、CMVエンハンサーを伴う)、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホグリセリン酸(phosphoglycerol)キナーゼ
(PGK)プロモーター、およびEF1αプロモーター)、または両方が含まれる。
(PGK)プロモーター、およびEF1αプロモーター)、または両方が含まれる。
エンハンサーエレメント、例えば、WPRE、CMVエンハンサー、HTLV-IのLTRにおけるR-U5’セグメント、SV40エンハンサー、ならびにウサギβ-グロビンのエクソン2および3の間のイントロン配列もまた、「調節エレメント」という用語に包含される。
一部の例では、Cas13dコード配列は、プロモーター、エンハンサーエレメント、または両方に作動可能に連結している。
RNA編集:操作されたヌクレアーゼ(例えば、本明細書において提供されるCas13dタンパク質)を使用して、生物のゲノムにおいてRNA分子(またはRNAのリボヌクレオチド)を挿入するか、欠失させるか、または置き換え、それにより、RNAの所望される位置に部位特異的な鎖の破断を生じる、遺伝子操作の一種である。誘導された破断部は、修復され、標的化された変異または修復をもたらす。本明細書に開示されるCRISPR/Cas方法、例えば、Cas13dを使用するものは、1つまたは複数の標的RNA、例えば、がん(例えば、乳がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、黒色腫)、感染性疾患(例えば、HIV、肝炎、HPV、および西ナイルウイルス)、または神経変性障害(例えば、ハンチントン病またはALS)と関連するものの配列を編集するために使用することができる。例えば、RNA編集は、疾患またはウイルス感染を処置するために使用することができる。
RNA挿入部位:外因性ポリヌクレオチドの挿入の標的とされるかまたは挿入を受けた、RNAの部位である。開示される方法は、開示されるCas13dタンパク質の使用を含み、これは、RNAを、RNA挿入部位における操作の標的とするために使用することができる。
配列同一性/類似性:アミノ酸(またはヌクレオチド)配列間の類似性は、配列間の類似性に関して表され、それ以外には配列同一性と称される。配列同一性は、同一性(または類似性もしくは相同性)のパーセンテージに関して測定されることが多く、パーセンテージが高いほど、2つの配列は類似している。
比較のための配列のアライメント方法は、当該技術分野において周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988; Higgins
and Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989;
Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988;およびPearson and
Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988において記載されている。Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994は、配列アライメント方法および相同性の計算についての詳細な考察を提示している。
and Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989;
Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988;およびPearson and
Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988において記載されている。Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994は、配列アライメント方法および相同性の計算についての詳細な考察を提示している。
NCBIのBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990)が、Nati
onal Center for Biotechnology Information(NCBI、Bethesda、MD)を含む様々な供給源から、およびインターネット上で、配列分析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、およびtblastxと併せて使用するために、入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を判定する方法に関する説明は、インターネット上でNCBIのウェブサイトにおいて入手可能である。
onal Center for Biotechnology Information(NCBI、Bethesda、MD)を含む様々な供給源から、およびインターネット上で、配列分析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、およびtblastxと併せて使用するために、入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を判定する方法に関する説明は、インターネット上でNCBIのウェブサイトにおいて入手可能である。
当該技術分野において公知であり本明細書に開示されるタンパク質および核酸配列のバリアントは、典型的に、NCBI Blast 2.0を、ギャップ付きblastpをデフォルトのパラメーターに設定して使用して、アミノ酸配列との全長アライメントにわたって計数される少なくとも約80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有することによって特徴付けられる。約30アミノ酸を上回るアミノ酸配列の比較については、Blast 2配列関数を、デフォルトのBLOSUM62マトリックスをデフォルトのパラメーター(ギャップ存在コスト11および残基ごとのギャップコスト1)に設定して使用して、用いる。短いペプチド(およそ30アミノ酸よりも少ない)をアライメントする場合、アライメントは、Blast 2配列関数を使用し、PAM30マトリックスをデフォルトのパラメーター(ギャップオープンペナルティ9、ギャップ伸長ペナルティ1)に設定して用いて、実行するものとする。参照配列に対してさらに高い類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価した場合、同一性パーセンテージの増加、例えば、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を示すであろう。全長に満たない配列を、配列同一性に関して比較する場合、ホモログおよびバリアントは、典型的に、10~20アミノ酸の短い枠にわたって少なくとも80%の配列同一性を有し、参照配列に対する類似性に応じて、少なくとも85%または少なくとも90%または少なくとも95%の配列同一性を有し得る。そのような短い枠にわたる配列同一性を判定するための方法は、インターネット上でNCBIのウェブサイトにおいて入手可能である。当業者であれば、これらの配列同一性の範囲が、案内のためだけに提供されており、提供された範囲に含まれない強力に有意なホモログが入手され得ることもまったく可能であることを、理解するであろう。
したがって、1つの例では、Cas13dタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、19、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する。
対象:脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトである。哺乳動物には、ネズミ科動物、類人猿、ヒト、家畜、競技動物、および愛玩動物が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物対象、例えば、サルまたは他の非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシである。一部の例では、対象は、本明細書において提供される方法を使用して処置することができる障害(例えば、ウイルス感染)または遺伝子疾患を有する。一部の例では、対象は、本明細書において提供される方法を使用して診断することができる障害(例えば、ウイルス感染)または遺伝子疾患を有する。一部の例では、対象は、研究室動物/生物、例えば、ゼブラフィッシュ、Xenopus、C.elegans、Drosophila、マウス、ウサギ、またはラットである。in vivoで得られたかまたはin vitroで培養された生物学的実体の組織、細胞、およびそれらの子孫もまた、包含される。
治療剤:対象に投与したときに、何らかの有益な効果を付与する1つまたは複数の分子または化合物を指す。有益な治療効果としては、診断決定の可能化、疾患、症状、障害、もしくは病態の緩和、疾患、症状、障害、もしくは状態の発症の低減もしくは予防、ならびに疾患、症状、障害、または病態への全般的な対抗を挙げることができる。
形質導入された、形質転換された、およびトランスフェクトされた:ウイルスまたはベクターは、核酸分子を細胞に移入する場合、細胞に「形質導入する」。細胞ゲノムへの核酸の組込みまたはエピソーム複製のいずれかによって、核酸が細胞によって安定に複製されるようになる場合、細胞は、細胞に形質導入された核酸によって「形質転換されている」かまたは「トランスフェクトされている」。
これらの用語は、ウイルスベクターのトランスフェクション、プラスミドベクターを用いた形質転換、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクション、粒子銃加速、および当該技術分野において公知の他の方法によるネイキッドDNAの導入を含め、核酸分子をそのような細胞に導入することができる全ての技法を包含する。一部の例では、方法は、化学的方法(例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション)、物理的方法(例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子銃)、融合(例えば、リポソーム)、受容体に媒介されるエンドサイトーシス(例えば、DNA-タンパク質複合体、ウイルスエンベロープ/キャプシド-DNA複合体)、ならびにウイルス、例えば、組換えウイルスによる生物学的感染(Wolff, J. A., ed, Gene Therapeutics, Birkhauser, Boston, USA, 1994)である。核酸分子を細胞に導入するための方法は、公
知である(例えば、米国特許第6,110,743号を参照されたい)。これらの方法を使用して、細胞に、そのゲノムを操作するための開示される薬剤を形質導入することができる。
知である(例えば、米国特許第6,110,743号を参照されたい)。これらの方法を使用して、細胞に、そのゲノムを操作するための開示される薬剤を形質導入することができる。
導入遺伝子:外因性遺伝子である。
処置すること、処置、および治療法:あらゆる客観的または主観的パラメーター、例えば、症状の減退、寛解、減少、または状態を患者にとってより寛容されるものにすること、変性または低下の速度の遅延、変性の最終点を衰弱性の低いものにすること、患者の身体的または精神的健康状態を改善すること、または生存期間の長さを延長することを含め、外傷、病理、または状態の軽減または緩和におけるあらゆる成功またはその成功の兆候である。処置は、身体検査、血液検査、および他の臨床検査の結果などを含む、客観的または主観的パラメーターによって評価することができる。予防上の利益のために、開示される組成物は、特定の疾患、状態、または症状を発症する危険性にある対象に、または疾患の生理学的症状のうちの1つまたは複数を報告している対象に、疾患、状態、または症状が、まだ現れていない可能性がある場合であったとしても、投与することができる。
上方調節される:分子、例えば、標的RNAの発現に関連して使用される場合、標的RNAの産生の増加をもたらす任意のプロセスを指す。1つの例では、例えば、標的RNAが、それ自体の転写を伴うフィードバックループに関与する場合、直接的な上方調節を含む。1つの例では、間接的な上方調節、例えば、miRNAの標的の活性化をもたらす、阻害性miRNAのノックダウンによるものを含む。
一部の例では、標的RNAは、コーディングRNAである。一部の例では、標的RNAは、非コーディングRNAである。上方調節の標的とされ得るRNA分子の具体的な例としては、mRNA、miRNA、rRNA、tRNA、核RNA、および構造RNAが挙げられる。一部の例では、標的RNAの上方調節または活性化は、標的RNAの翻訳を増加させ、したがって、対応するタンパク質の存在を増加させることができる、プロセスを含む。開示されるCRISPR/Cas系は、目的の任意の標的RNAを上方調節するために使用することができる。
上方調節には、標的RNAの任意の検出可能な増加が含まれる。ある特定の例では、細胞または無細胞系(例えば、本明細書に開示されるCas13dタンパク質およびgRNAを発現する細胞)における検出可能な標的RNAの発現は、対照(例えば、対応する正常細胞または試料において検出される標的RNAの量)と比較して、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも400%、または少なくとも500%増加する。1つの例では、対照は、正常細胞(例えば、Cas13dまたはガイドRNAを含まない非組換え細胞)における相対的な発現の量である。
十分な条件下:所望される活性を可能にする任意の環境を説明して使用される語句である。1つの例では、所望される活性は、例えば、標的RNAをモジュレートするための、他の必要なエレメントと組み合わせた、本明細書に開示されるCas13dタンパク質の発現である。
ベクター:宿主細胞におけるベクターの複製および/または組込みの能力を破壊することなく、外来核酸分子を導入することができる、核酸分子である。ベクターには、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である核酸分子、1つまたは複数の遊離末端を含む、遊離末端を含まない(例えば、環状の)核酸分子、DNA、RNA、または両方を含む核酸分子、ならびに当該技術分野において公知の他の様々なポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
ベクターは、宿主細胞においてそれが複製するのを可能にする核酸配列、例えば、複製起点を含み得る。ベクターはまた、1つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および当該技術分野において公知の他の遺伝子エレメントも含み得る。組込みベクターは、それ自体を宿主核酸に組み込むことができる。発現ベクターは、挿入された遺伝子の転写および翻訳を可能にするために必要な調節配列を含有するベクターである。
ベクターの1つの種類には、「プラスミド」があり、これは、追加のDNAセグメントを、例えば、標準的な分子クローニング技法によって挿入することができる、環状二本鎖DNAループを指す。別の種類のベクターには、ウイルスベクターがあり、これは、ウイルス由来のDNAまたはRNA配列が、ウイルス(例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)へのパッケージングのためにベクターに存在している。ウイルスベクターには、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって担持されるポリヌクレオチドが含まれる。一部の実施形態では、ベクターは、レンチウイルス(例えば、組込み欠損レンチウイルスベクター)またはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。
ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製することができる(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。
ある特定のベクターは、それらが動作可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と称される。一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。組換え発現ベクターは、本明細書において提供される核酸(例えば、ガイドRNA[RNA配列またはRNA配列から発現され得る]、Cas13dタンパク質をコードする核酸)を、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態で含み得るが、これは、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され得る、発現させようとする核酸配列に動作可能に連結された1つまたは複数の調節エレメントを含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結した」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節エレメントに連結されていることを意図する(例えば、in vitro転写/翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において)。当業者であれば、発現ベクターの設計が、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望される発現のレベルなどの要因に依存し得ることを理解するであろう。ベクターを、宿主細胞に導入し、それによって、本明細書に記載される核酸によってコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含めた転写物、タンパク質、またはペプチド(例えば、クラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造のリピート(CRISPR)転写物、タンパク質、酵素、その変異体形態、その融合タンパク質など)を産生することができる。
II.いくつかの実施形態の概要
クラス2のCRISPR-Cas系は、微生物に、多様な獲得免疫機序を与えている。VI-D型として分類される、RNAにガイドされるRNA標的化CRISPR系の特徴付けがなされていないファミリーを特定するための、原核生物ゲノムおよびメタゲノム配列の分析が、本明細書において提供される。7つの異なるオルソログの生物化学的特徴付けおよびタンパク質操作により、ヒト細胞においてロバストな活性を有するRuminococcus flavefaciens XPD3002に由来するリボヌクレアーゼエフェクター(CasRx)が得られた。CasRxに媒介されるノックダウンは、多様な内因性転写物にわたり、RNA干渉と比べて高い効率性および特異性を呈する。最もコンパクトな単一エフェクターCas酵素の1つとして、CasRxはまた、アデノ随伴ウイルスに柔軟にパッケージングすることができる。ウイルスによりコードされる触媒不活性CasRxは、選択的スプライシングを操作するためのプレmRNAのシスエレメントを標的にすることができ、前頭側頭型認知症の神経細胞モデルにおいて、調節不全となったタウ異性体比を改善する。本明細書における結果は、CasRxを、細胞内RNAの効率的な標的化のためのプログラム可能なRNA結合モジュールとして提示し、トランスクリプトーム操作および治療方法のための一般的なプラットフォームを実現する。
クラス2のCRISPR-Cas系は、微生物に、多様な獲得免疫機序を与えている。VI-D型として分類される、RNAにガイドされるRNA標的化CRISPR系の特徴付けがなされていないファミリーを特定するための、原核生物ゲノムおよびメタゲノム配列の分析が、本明細書において提供される。7つの異なるオルソログの生物化学的特徴付けおよびタンパク質操作により、ヒト細胞においてロバストな活性を有するRuminococcus flavefaciens XPD3002に由来するリボヌクレアーゼエフェクター(CasRx)が得られた。CasRxに媒介されるノックダウンは、多様な内因性転写物にわたり、RNA干渉と比べて高い効率性および特異性を呈する。最もコンパクトな単一エフェクターCas酵素の1つとして、CasRxはまた、アデノ随伴ウイルスに柔軟にパッケージングすることができる。ウイルスによりコードされる触媒不活性CasRxは、選択的スプライシングを操作するためのプレmRNAのシスエレメントを標的にすることができ、前頭側頭型認知症の神経細胞モデルにおいて、調節不全となったタウ異性体比を改善する。本明細書における結果は、CasRxを、細胞内RNAの効率的な標的化のためのプログラム可能なRNA結合モジュールとして提示し、トランスクリプトーム操作および治療方法のための一般的なプラットフォームを実現する。
クラス2のCRISPR系は、多様な細菌および古細菌の生命全体で見出される。原核生物ゲノムおよびメタゲノム配列のバイオインフォマティック発掘に、CRISPRリピートアレイおよび近傍のタンパク質のみを必要とするCRISPR遺伝子座の最小の定義を使用し、VI型CRISPR-Cas13dと表記される、特徴付けがなされていない著しくコンパクトなRNAを標的にするクラス2のCRISPR系のファミリーの特定が、本明細書において提供される。
CRISPR系は、概して、ゲノム配列の20キロ塩基以内に機能性オペロンとして存在するため、断片化されたメタゲノムリードでさえ、生体操作目的に有用なCas酵素を回収するのに十分であり得る。本明細書およびその他(Shmakov et al., 2015)によ
って記載されるCRISPRゲノム発掘戦略は、次世代シーケンシングにより微生物集団をプロファイリングするための現在行われている試みとの組合せで、ゲノム操作ツールボックスへの機械的に多様な付加に寄与するはずである。
って記載されるCRISPRゲノム発掘戦略は、次世代シーケンシングにより微生物集団をプロファイリングするための現在行われている試みとの組合せで、ゲノム操作ツールボックスへの機械的に多様な付加に寄与するはずである。
CRISPRリピートアレイを、HEPNドメインに依存しない機序により、成熟したガイドへとプロセシングし、続いて、相補的な活性化RNAのガイド配列依存性認識を行う、Cas13dエフェクターの2つの異なるリボヌクレアーゼ特性を、生物化学的に特徴付けた。これは、HEPNに媒介されるRNase活性をトリガーし、Cas13dが、活性化RNAおよびバイスタンダーRNAの両方を切断することを可能にするが、この特性は、他のRNA標的化CRISPR系に共通している。Cas13dは、さらに、明らかな隣接配列の要件を示さず、標的RNAをタイリングするcrRNAにわたって活性であることが見出され、任意の一本鎖RNA配列を標的にする能力が示唆された。
Cas13dファミリーの異なる分枝から試料採取したCas13dオルソログの、ヒト細胞における包括的な活性レポータースクリーニングにより、Ruminococcus flavefaciens株XPD3002に由来するCas13d(CasRx)へのNLS融合体を、真核生物の状況において、プログラム可能なRNA標的化のために操作することができることが明らかとなった(図8D)。CasRx融合体は、14の内因性mRNAおよびlncRNAの多様なセットをノックダウンし、RNA干渉、dCas9に媒介されるCRISPR干渉、およびCas13スーパーファミリーの他のメンバーと比べて、90%を上回るノックダウンを、望ましい効率で、一貫して達成した(図10A~10C)。加えて、CasRx干渉は、スペーサーが一致するshRNAよりも顕著に特異性が高く、RNA干渉での数百と比較して、検出可能なオフターゲットの変化はない。
CasRxは、操作されたCRISPR-Cas13dエフェクターおよび関連するガイドRNAを含む最小の2つの構成要素のプラットフォームであり、完全に遺伝的にコードすることができる。CasRxは、直交的に送達されるタンパク質であるため、HEPN不活性dCasRxは、特定のRNAエレメントを標的にするように、可動性RNA結合モジュールとして操作することができる。重要なことに、CasRxは、ガイドRNAをプロセシングするために異なるリボヌクレアーゼ活性を使用するため、dCasRxは、依然として、多重の適用のためにリピートアレイと対合させることができる。この概念の有用性は、選択的スプライシングおよび結果として得られるタンパク質異性体比を調整するためのdCasRxスプライスエフェクター融合体を作製し、前頭側頭型認知症の神経細胞モデルにそれを適用することによって、本明細書において示される。
平均サイズが930aaで、Cas13dは、哺乳動物細胞において特徴付けられている最も小さなクラス2のCRISPRエフェクターである。このことにより、CasRxエフェクタードメイン融合体を、複数のガイドRNAをコードするCRISPRアレイと対合させ、同時に、初代細胞およびin vivo送達のために多用途のアデノ随伴ウイルス(AAV)送達ビヒクル(Naldini, 2015)のパッケージングサイズ限度下に留めることが可能となっている。さらに、特定の有糸分裂後細胞型、例えば、ニューロンへのCasRxの標的化AAV送達は、調整的ペイロードの長期発現を媒介して恒久的な遺伝子修飾および頻繁な再投与を回避し(Chiriboga et al., 2016)、他の核酸標的化技術
、例えば、DNAヌクレアーゼ編集またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを補うことができる。RNAのミススプライシングによる疾患は、最大で遺伝子疾患の15%を占めると推測されており(Hammond and Wood, 2011)、多重標的化を可能にする操作された
スプライスエフェクターの可能性が強調される。本明細書において提供される材料は、ノックダウンおよびスプライシングのRNA標的化、例えば、生細胞標識および遺伝子スクリーニングから、転写物のイメージング、輸送、または調節に、使用することができる。CRISPR-Cas13dおよび操作されたバリアント、例えば、CasRxは、集合的に、柔軟な核酸操作、トランスクリプトーム関連の研究、および治療を可能にし、DNAを越えてRNAへとゲノム編集ツールボックスを拡張する。
、例えば、DNAヌクレアーゼ編集またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを補うことができる。RNAのミススプライシングによる疾患は、最大で遺伝子疾患の15%を占めると推測されており(Hammond and Wood, 2011)、多重標的化を可能にする操作された
スプライスエフェクターの可能性が強調される。本明細書において提供される材料は、ノックダウンおよびスプライシングのRNA標的化、例えば、生細胞標識および遺伝子スクリーニングから、転写物のイメージング、輸送、または調節に、使用することができる。CRISPR-Cas13dおよび操作されたバリアント、例えば、CasRxは、集合的に、柔軟な核酸操作、トランスクリプトーム関連の研究、および治療を可能にし、DNAを越えてRNAへとゲノム編集ツールボックスを拡張する。
1つまたは複数の標的RNA分子を標的にする(例えば、修飾、検出する)方法、例えば、クラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造のリピート(CRISPR)-CRISPR関連(Cas)系に媒介されるRNA編集方法が、本明細書において提供される。そのような方法は、1つまたは複数の標的RNA分子を、天然に存在しないかまたは操作された(例えば、それが導入される細胞または系に天然に存在しない)CRISPR-Cas系と接触させるステップを含み得る。したがって、一部の例では、開示されるCRISPR-Cas系は、天然に存在するCas13dタンパク質(またはコード配列)および天然に存在するgRNAを含むが、そのCas1タンパク質(またはコード配列)およびgRNAが天然に見出されない系または細胞において使用される。さらに、gRNA分子内のスペーサー配列は、天然に存在せず、標的RNA分子に相補的となるように修飾されている。
一部の例では、標的RNAは、コーディングRNAである。一部の例では、RNAは、非コーディングRNAである。
開示されるCRISPR-Cas系には、(1)少なくとも1つのCas13dタンパク質または少なくとも1つのCas13d核酸コード配列(例えば、少なくとも1つのCas13dタンパク質をコードするmRNAまたはベクター)、および(2)標的RNA分子とハイブリダイズすることができるように、標的RNAに対して十分な相補性を有する少なくとも1つのCRISPR-Cas系ガイド核酸分子(例えば、gRNA)(またはgRNAをコードする少なくとも1つの核酸分子)が含まれ得る。Cas13dタンパク質は、gRNAと複合体を形成し、gRNAが、この複合体を、1つまたは複数の標的RNA分子へと指向させる。この標的化により、Cas13d-gRNA複合体が、1つまたは複数の標的RNA分子を修飾または検出することが可能となり得る。一部の例では、1つまたは複数の標的RNA分子(または1つもしくは複数の標的RNA分子を含有する細胞)を、少なくとも1つのCas13dタンパク質および少なくとも1つのgRNAを含む複合体と接触させる。一部の例では、系は、Mg2+を含む。しかしながら、標的RNAの切断が所望されない場合など、一部の例では、系は、Mg2+を必要としない。
一部の例では、1つまたは複数の標的RNA分子を、天然に存在しないかまたは操作されたCRISPR-Cas系と接触させるステップは、例えば、エンドサイトーシス(例えば、受容体に媒介されるエンドサイトーシス、マイクロピノサイトーシス)、リポソーム、粒子、エクソソーム、微細小胞、遺伝子銃、エレクトロポレーション、ウイルス、RNP-抗体融合体(例えば、Cas13d RNPを、抗体、抗体断片、または他の標的化部分[例えば、ScFv、アプタマー、DARPin、ナノボディ、アフィボディなど]にテザリングすることによって、RNPは、細胞内にエンドサイトーシスされるが、RNPは、それ以外の多数のものにテザリングすることができることが想定される)、またはこれらの組合せを使用して、1つまたは複数の標的RNA分子を含有する細胞(例えば、真核生物細胞または原核生物細胞)に、天然に存在しないかまたは操作されたCRISPR-Cas系を導入するステップを含む。したがって、細胞は、開示されるCRISPR-Cas系の適切な核酸分子が形質転換され得るか、形質導入され得るか、トランスフェクトされ得るか、またはそれ以外では接触され得る。結果として得られる細胞は、組換え細胞である。一部の例では、1つまたは複数の標的RNA分子を、天然に存在しないかまたは操作されたCRISPR-Cas系と接触させるステップは、1つまたは複数の標的RNA分子を含有する無細胞系(例えば、生物学的試料もしくは環境試料、または細胞ライセート)を、天然に存在しないかまたは操作されたCRISPR-Cas系と(例えば、標的RNAを検出するための診断方法において)接触させることを含む。
一部の例では、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも10、または少なくとも20の異なるgRNAが、使用される。例えば、そのような方法には、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも10、または少なくとも20の異なる標的RNA分子を標的にすること、1つまたは複数のRNA分子の少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも10、または少なくとも20の異なる領域を標的にすること、またはこれらの組合せが含まれ得る。
そのようなCas13dタンパク質をコードする単離された核酸分子、例えば、cDNA、ゲノムDNA、RNA、またはmDNAもまた、提供される。そのような単離された核酸分子は、ベクター(例えば、プラスミドまたはウイルスベクター)の一部であってもよく、プロモーターに作動可能に連結していてもよい。一部の例では、Cas13dタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号124、125、126、127、128、139、140、または141に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するか、または配列番号114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、142、143、144、または145に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。追加の例では、単離された核酸は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、または296に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するCas13dタンパク質をコードする。
一部の例では、少なくとも1つのCas13dタンパク質をコードする単離された核酸分子(これは、ベクターの一部であってもよい)は、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている少なくとも1つのCas13dタンパク質コード配列、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている少なくとも1つのCas13dタンパク質コード配列を含む。1つの例では、そのようなCas13dコード配列は、配列番号114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、142、143、144、または145に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するか、または配列番号124、125、126、127、128、139、140、または141に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。追加の例では、真核生物細胞コドン最適化核酸配列は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、または296に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するCas13dタンパク質をコードする。
一部の例では、1つまたは複数の標的RNA分子とハイブリダイズするgRNAは、1つまたは複数のダイレクトリピート(DR)配列、1つまたは複数のスペーサー配列、またはDR-スペーサー-DR-スペーサーを含む1つまたは複数の配列を含む。一部の例では、1つまたは複数のDR配列は、配列番号129、130、131、132、133、134、135、136、137、148、150、151、152、154、156、157、159、161、163、165、167、169、176、178、180、182、184、186、188、190、191、192、193、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、または254に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。1つの例では、gRNAは、追加の配列、例えば、アプタマー配列を含む。
一部の例では、複数のgRNAが、単一のアレイ転写物からプロセシングされ、それぞれのgRNAは、例えば、異なるRNAを標的にするか、または単一のRNAの複数の領域を標的にするために、異なってもよい。
一部の例では、DRは、例えば、成熟した事前プロセシングガイドRNAとして発現させるために、5’末端において、1~10ヌクレオチド(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチド)短縮されている。
1つまたは複数の標的RNA分子を標的にする方法が、提供される。RNA分子を標的にするステップは、1つまたは複数の標的RNA分子を切り離すかまたはそれにニックを入れるステップ、1つまたは複数の標的RNA分子を活性化または上方調節するステップ、1つまたは複数の標的RNA分子の翻訳を活性化または抑制するステップ、1つまたは複数の標的RNA分子を脱活性化するステップ、1つまたは複数の標的RNA分子を視覚化、標識、または検出するステップ、1つまたは複数の標的RNA分子を結合するステップ、1つまたは複数の標的RNA分子を編集するステップ、1つまたは複数の標的RNA分子を輸送するステップ、および1つまたは複数の標的RNA分子をマスクするステップのうちの1つまたは複数を含み得る。一部の例では、1つまたは複数の標的RNA分子を修飾するステップは、RNA塩基置換、RNA塩基欠失、RNA塩基挿入、標的RNAにおける破断、RNAのメチル化、およびRNAの脱メチル化のうちの1つまたは複数を含む。
一部の例では、そのような方法は、疾患、例えば、ヒトにおける疾患を処置するために使用される。そのような例では、1つまたは複数の標的RNA分子は、疾患と関連している。
天然に存在しないタンパク質を含む、単離されたタンパク質もまた、提供される。一部の例では、タンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する。一部の例では、単離されたタンパク質は、原核生物ゲノムまたはメタゲノム、消化管メタゲノム、活性汚泥メタゲノム、嫌気性消化器メタゲノム、ニワトリ消化管メタゲノム、ヒト消化管メタゲノム、ブタ消化管メタゲノム、ウシ消化管メタゲノム、ヒツジ消化管メタゲノム、ヤギ消化管メタゲノム、カピバラ消化管メタゲノム、霊長類消化管メタゲノム、シロアリ消化管メタゲノム、糞便メタゲノム、Order ClostridialesまたはFamily Ruminococcaceae由来のゲノムに由来するCas13dオルソログである。一部の例では、Cas13dオルソログは、Ruminococcus albus、Eubacterium siraeum、Ruminococcus flavefaciens株XPD3002、Ruminococcus flavefaciens FD-1、無培養Eubacterium sp TS28-c4095、無培養Ruminococcus sp.、Ruminococcus bicirculans、またはRuminococcus sp CAG57に由来するCas13dオルソログを含む。そのようなタンパク質は、細胞内局在化シグナルを含み得る。一部の例では、そのようなタンパク質は、少なくとも1つの天然のHEPNドメインにおける変異を含む。
単離されたガイドRNA(gRNA)分子もまた、提供される。一部の例では、単離されたgRNAは、1つまたは複数のダイレクトリピート(DR)配列、例えば、配列番号129、130、131、132、133、134、135、136、137、148、150、151、152、154、156、157、159、161、163、165、167、169、176、178、180、182、184、186、188、190、191、192、193、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、または254に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するものを含む。そのようなgRNAは、標的RNAに特異的な(例えば、それに相補的な)1つまたは複数のスペーサー配列をさらに含み得る。そのようなガイドRNAは、さらに、必要に応じて、例えば、事前プロセシングガイドRNAを生成するために、DRの5’末端において、1~10ヌクレオチド(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチド)短縮されていてもよい。
本明細書において提供される1つまたは複数のCas13dタンパク質および本明細書において提供される1つまたは複数のgRNAを含む、リボ核タンパク質(RNP)複合体もまた、提供される。
本明細書において提供される任意のCas13dタンパク質(またはCas13dをコードする核酸分子)、任意のgRNA、任意のRNP複合体、または任意のベクターを含む、組換え細胞もまた、提供される。1つの例では、細胞は、細菌細胞ではない。1つの例では、細胞は、細菌細胞である。
本明細書において提供される任意のCas13dタンパク質(またはCas13dをコードする核酸分子)、任意のgRNAもしくはアレイ、任意のRNP複合体、任意の単離された核酸分子、任意のベクター、または任意の細胞のうちの1つまたは複数を含む、組成物もまた、提供される。そのような組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。
キットもまた、提供される。そのようなキットは、本明細書において提供される任意のCas13dタンパク質(またはCas13dをコードする核酸分子)、任意のgRNAもしくはアレイ、任意のRNP複合体、任意の単離された核酸分子、任意のベクター、任意の細胞、または任意の組成物のうちの1つまたは複数を含み得る。そのような試薬は、組み合わされていてもよく、または別個の容器に入っていてもよい。
一部の例では、Cas13dタンパク質は、タンパク質(またはタンパク質コードする核酸)を、全長もしくは部分的なダイレクトリピート配列に続いてRNA標的に相補的な「スペーサー」配列からなる操作されたRNAガイド(またはRNAガイドをコードする核酸)(またはその変化形、すなわち、アレイ(DR-スペーサー-DR-スペーサー-DR-スペーサーなど)またはpreガイドRNA(DR-スペーサー-DR)と組み合わせることによって、そのRNA標的に対してプログラムされる。Cas13dタンパク質は、触媒的に不活性化させ、保存されたRNAse HEPNモチーフ(RXXXXH)を変異させることによって、RNA結合モジュールに形質転換させることができる。例示的なCas13dタンパク質および対応するガイドが、本明細書において提供される(例えば、配列番号147~170、175~193、および配列番号198~254)。
A.Cas13dタンパク質 新規なCas13dタンパク質、例えば、配列表に示されているものが、本明細書において提供される。配列番号1、3、42、62、70、82、83、92、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、292、293、294、295および296は、異なる全長タンパク質を提供し、配列番号2、4~41、43~61、63~69、71~81、84~91、93~113、194、278、279、280、281、282、283、284、および285は、Cas13dバリアントおよび断片を提供する。そのようなタンパク質は、開示される方法、組成物、およびキットにおいて使用することができる。
一部の例では、Cas13dタンパク質は、1つまたは複数(例えば、1つまたは2つ)の天然のHEPNドメインを含む。一部の例では、Cas13dタンパク質は、1つまたは複数の変異型HEPNドメインを含む(例えば、変異体Cas13dタンパク質は、gRNAをプロセシングすることができるが、標的RNAを修飾することはできない)。一部の例では、Cas13dタンパク質は、150kD以下、140kD以下、130kD以下、120kD以下、例えば、約90~120kD、約100~120kD、または約110kDである。
本明細書において提供されるCas13dタンパク質に加えて、本開示は、原核生物ゲノムまたはメタゲノム、消化管メタゲノム、活性汚泥メタゲノム、嫌気性消化器メタゲノム、ニワトリ消化管メタゲノム、ヒト消化管メタゲノム、ブタ消化管メタゲノム、ウシ消化管メタゲノム、ヒツジ消化管メタゲノム、ヤギ消化管メタゲノム、カピバラ消化管メタゲノム、霊長類消化管メタゲノム、シロアリ消化管メタゲノム、糞便メタゲノム、Order ClostridialesまたはFamily Ruminococcaceae由来のゲノムに由来するCas13dオルソログ、例えば、Ruminococcus
albus、Eubacterium siraeum、Ruminococcus flavefaciens株XPD3002、Ruminococcus flavefaciens FD-1、無培養Eubacterium sp TS28-c4095、無培養Ruminococcus sp.、Ruminococcus bicirculans、またはRuminococcus sp CAG57に由来するCas13dオルソログを包含する。
albus、Eubacterium siraeum、Ruminococcus flavefaciens株XPD3002、Ruminococcus flavefaciens FD-1、無培養Eubacterium sp TS28-c4095、無培養Ruminococcus sp.、Ruminococcus bicirculans、またはRuminococcus sp CAG57に由来するCas13dオルソログを包含する。
一部の例では、Cas13dタンパク質は、少なくとも800aa、少なくとも900aa、または少なくとも1000aa、例えば、800~1200aa、850~1050aa、または860~1040aaである。
1.バリアントCas13d配列
本明細書において提供される配列のバリアント(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、または296のバリアント)を含む、Cas13dタンパク質が、本開示に包含される。一部の例では、本明細書において提供されるCas13dタンパク質は、1つまたは複数の変異、例えば、単一の挿入、単一の欠失、単一の置換、またはこれらの組合せを含有し得る。一部の例では、Cas13dタンパク質は、少なくとも1、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、または少なくとも300のaa挿入、例えば、1~20の挿入(例えば、N末端もしくはC末端におけるまたはタンパク質内における、例えば、小さなドメイン全体の挿入)、少なくとも1、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、または少なくとも300のaa欠失(例えば、小さなドメイン全体の欠失)、例えば、1~20の欠失(例えば、N末端もしくはC末端におけるまたはタンパク質内における)、少なくとも1、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30のaa置換、例えば、1~20の置換、またはこれらの任意の組合せ(例えば、単一の挿入と、1~19の置換)を含むが、gRNA分子内のスペーサー配列に相補的な標的RNA分子に結合するおよび/もしくまたはガイドアレイRNA転写物をgRNA分子にプロセシングする能力を保持する、かつ/または標的RNAを切断する能力を保持する。非保存的領域に欠失を有する例示的なCas13タンパク質は、配列番号278、279、280、281、282、283、284、および285に示されている。一部の例では、本開示は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個のアミノ酸変化を有するが、gRNA分子内のスペーサー配列に相補的な標的RNA分子に結合するおよび/またはガイドアレイRNA転写物をgRNA分子にプロセシングする能力を保持する、任意の開示されるCas13dタンパク質(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296)のバリアントを提供する。一部の例では、任意の開示されるCas13dタンパク質(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251もしくは25、またはそれらのバリアント、例えば、配列番号278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、または296は、1~8つのアミノ酸挿入、1~15のアミノ酸欠失、1~10のアミノ酸置換、またはこれらの任意の組合せ(例えば、1~15、1~4、または1~5つのアミノ酸欠失と、1~10、1~5、または1~7つのアミノ酸置換)をさらに含み、gRNA分子内のスペーサー配列に相補的な標的RNA分子に結合するおよび/またはガイドアレイRNA転写物をgRNA分子にプロセシングする能力が、保持されている。1つの例では、そのようなバリアントペプチドは、標準的な手順、例えば、部位指向的変異生成またはPCRを使用して、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって、産生される。そのようなバリアントはまた、化学的に合成することができる。
本明細書において提供される配列のバリアント(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、または296のバリアント)を含む、Cas13dタンパク質が、本開示に包含される。一部の例では、本明細書において提供されるCas13dタンパク質は、1つまたは複数の変異、例えば、単一の挿入、単一の欠失、単一の置換、またはこれらの組合せを含有し得る。一部の例では、Cas13dタンパク質は、少なくとも1、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、または少なくとも300のaa挿入、例えば、1~20の挿入(例えば、N末端もしくはC末端におけるまたはタンパク質内における、例えば、小さなドメイン全体の挿入)、少なくとも1、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、または少なくとも300のaa欠失(例えば、小さなドメイン全体の欠失)、例えば、1~20の欠失(例えば、N末端もしくはC末端におけるまたはタンパク質内における)、少なくとも1、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30のaa置換、例えば、1~20の置換、またはこれらの任意の組合せ(例えば、単一の挿入と、1~19の置換)を含むが、gRNA分子内のスペーサー配列に相補的な標的RNA分子に結合するおよび/もしくまたはガイドアレイRNA転写物をgRNA分子にプロセシングする能力を保持する、かつ/または標的RNAを切断する能力を保持する。非保存的領域に欠失を有する例示的なCas13タンパク質は、配列番号278、279、280、281、282、283、284、および285に示されている。一部の例では、本開示は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個のアミノ酸変化を有するが、gRNA分子内のスペーサー配列に相補的な標的RNA分子に結合するおよび/またはガイドアレイRNA転写物をgRNA分子にプロセシングする能力を保持する、任意の開示されるCas13dタンパク質(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296)のバリアントを提供する。一部の例では、任意の開示されるCas13dタンパク質(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251もしくは25、またはそれらのバリアント、例えば、配列番号278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、または296は、1~8つのアミノ酸挿入、1~15のアミノ酸欠失、1~10のアミノ酸置換、またはこれらの任意の組合せ(例えば、1~15、1~4、または1~5つのアミノ酸欠失と、1~10、1~5、または1~7つのアミノ酸置換)をさらに含み、gRNA分子内のスペーサー配列に相補的な標的RNA分子に結合するおよび/またはガイドアレイRNA転写物をgRNA分子にプロセシングする能力が、保持されている。1つの例では、そのようなバリアントペプチドは、標準的な手順、例えば、部位指向的変異生成またはPCRを使用して、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって、産生される。そのようなバリアントはまた、化学的に合成することができる。
一部の例では、Cas13dタンパク質は、配列番号195、196、または197に示されるモチーフを含む。したがって、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するCas13dタンパク質は、一部の例では、配列番号195、196、または197に示される少なくとも1つのモチーフを含む。
一部の例では、Cas13dタンパク質は、配列番号288、289、290、または291に示される保存された配列を含む。したがって、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するCas13dタンパク質は、一部の例では、配列番号288、289、290、または291に示される少なくとも1つのモチーフを含む。
1つの種類の修飾または変異としては、アミノ酸を類似の生物化学的特性を有するアミノ酸残基と置換すること、すなわち、保存的置換(例えば、1~4、1~8、1~10、または1~20の保存的置換)が挙げられる。典型的に、保存的置換は、結果として得られるペプチドの活性にほとんど影響を及ぼさないかまたはまったく影響を及ぼさない。例えば、保存的置換は、Cas13dタンパク質がgRNA分子内のスペーサー配列に相補的な標的RNA分子に結合するおよび/またはガイドアレイRNA転写物をgRNA分子にプロセシングする能力に実質的に影響を及ぼさない、Cas13dタンパク質(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296)におけるアミノ酸置換である。アラニンスキャンを使用して、Cas13dタンパク質(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296)におけるどのアミノ酸残基がアミノ酸置換を寛容することができるかを特定することができる。1つの例では、バリアントCas13dタンパク質(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296)がCRISPR/Cas系における遺伝子発現を修飾する能力は、アラニンまたは他の保存的アミノ酸が、1~4、1~8、1~10、または1~20個の天然のアミノ酸と置換される場合、25%を上回って改変されない、例えば、20%を上回って改変されない、例えば、10%を上回って改変されない。タンパク質における本来のアミノ酸と置換することができ、保存的置換とみなされる、アミノ酸の例としては、SerとAla;LysとArg;GlnまたはHisとAsn;GluとAsp;SerとCys;AsnとGln;AspとGlu;ProとGly;AsnまたはGlnとHis;LeuまたはValとIle;IleまたはValとLeu;ArgまたはGlnとLys;LeuまたはIleとMet;Met、Leu、またはTyrとPhe;ThrとSer;SerとThr;TyrとTrp;TrpまたはPheとTyr;およびIleまたはLeuとValが挙げられる。
挿入、置換、または欠失に特に適した領域を特定するための1つの方法は、オルソログ間で低い保存レベルを呈するアミノ酸のストレッチを標的にすることである。そのような領域は、図1Bに提供されるCas13dタンパク質のアライメントの保存グラフに示されている。Cas13dの保存された残基は、図18A~18MMMに提供されるCas13dタンパク質アライメントにおいてさらに示されている(アライメントした保存された残基の下に、記号「.」、「:」、または「*」で示される)。欠失の例およびそれらの機能性試験は、さらに、図16A~16Bに提供されている。そのような方法を使用して、配列番号278、279、280、281、282、283、284、および285に示されるCas13dの機能性欠失バリアントを生成した。バリアントなどは、例えば、1~30、1~20、または5~30のアミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換をさらに含み得るか、または変更する。
別の種類の置換は、1つのオルソログの部分を、別のオルソログの相同性領域と入れ替えて、組合せの「キメラ」タンパク質を得ることによって、達成することができる。そのようなキメラタンパク質は、複数のCas13dオルソログの望ましい特性を組み合わせることができる。
より実質的な変更は、保存性の低い置換を使用すること、例えば、(a)置換の範囲における、例えば、シートもしくはヘリックス構成としてのポリペプチド骨格の構造、(b)標的部位におけるポリペプチドの電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖のかさ高さを維持することに対するそれらの作用がより顕著に異なる残基を選択することによって、行うことができる。一般に、ポリペプチド機能に最も大きな変更をもたらすことが予測される置換は、(a)親水性残基、例えば、セリンまたはスレオニンが、疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、またはアラニンと(またはそれによって)置換されるもの、(b)システインまたはプロリンが、任意の他の残基と(またはそれによって)置換されるもの、(c)正電荷の側鎖を有する残基、例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジンが、負電荷の残基、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸と(またはそれによって)置換されるもの、または(d)かさ高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有さないもの、例えば、グリシンと(またはそれによって)置換されるものである。
したがって、本開示は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するCas13dタンパク質、またはそれらの組合せ(例えば、キメラ)を提供する。
1つの例では、Cas13dタンパク質は、天然に存在しないアミノ酸を含む。
2.他のエレメントを有するCas13dタンパク質
Cas13dタンパク質(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、または296のうちのいずれか)は、例えば、N末端またはC末端(または両方)に、他のエレメントまたはドメインを含み得る。結果として得られるタンパク質は、Cas13d融合タンパク質と称することができる。
Cas13dタンパク質(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、または296のうちのいずれか)は、例えば、N末端またはC末端(または両方)に、他のエレメントまたはドメインを含み得る。結果として得られるタンパク質は、Cas13d融合タンパク質と称することができる。
1つの例では、本明細書において提供されるCas13dタンパク質(例えば、天然のCas13d、短縮型Cas13d、または変異型HEPNドメインを有するCas13d)は、細胞内局在化シグナルを含む。例示的な細胞内局在化シグナルとしては、小器官局在化シグナル、例えば、核局在化シグナル(NLS)、核外輸送シグナル(NES)、またはミトコンドリア局在化シグナルが挙げられる。1つの例では、Cas13dタンパク質は、NLS、例えば、SPKKKRKVEAS(配列番号256;例えば、AGCCCCAAGAAgAAGAGaAAGGTGGAGGCCAGC、配列番号257によってコードされる)またはGPKKKRKVAAA(SV40大型T抗原NLS、配列番号258;例えば、ggacctaagaaaaagaggaaggtggcggccgct、配列番号260によってコードされる)を含む。Cas13dタンパク質の一部となり得る例示的なNESとしては、アデノウイルス5型E1B核外輸送配列、HIV核外輸送配列(例えば、配列番号287を参照されたい)、MAPK核外輸送配列、またはPTK2核外輸送配列が挙げられる。
一部の例では、少なくとも1つのCas13dタンパク質(例えば、天然のCas13d、短縮型Cas13d、または変異型HEPNドメインを有するCas13d)は、さらに、1つまたは複数のエフェクタードメインを含む。例示的なエフェクタードメインとしては、タンパク質および/または酵素、例えば、RNAを切断することができるもの(例えば、PINエンドヌクレアーゼドメイン、NYNドメイン、SOT1に由来するSMRドメイン、またはブドウ球菌ヌクレアーゼに由来するRNaseドメイン)、RNAの安定性に影響を及ぼし得るもの(例えば、トリステトラプロリン(TTP)、またはUPF1、EXOSC5、およびSTAU1に由来するドメイン)、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを編集することができるもの(例えば、シチジンデアミナーゼ、PPRタンパク質、アデノシンデアミナーゼ、ADARファミリータンパク質、またはAPOBECファミリータンパク質)、翻訳を活性化することができるもの(例えば、eIF4Eおよび他の翻訳開始因子、酵母ポリ(A)結合タンパク質のドメイン、またはGLD2)、翻訳を抑制することができるもの(例えば、PumilioまたはFBF PUFタンパク質、デアデニラーゼ、CAF1、アルゴノートタンパク質)、RNAをメチル化することができるもの(例えば、METTL14、METTL3、またはWTAPなどのm6Aメチルトランスフェラーゼ因子に由来するドメイン)、RNAを脱メチル化することができるもの(例えば、ヒトアルキル化修復ホモログ5またはAlkbh5)、スプライシングに影響を及ぼすことができるもの(例えば、SRSF1のRSリッチドメイン、hnRNP A1のGlyリッチドメイン、RBM4のアラニンリッチモチーフ、またはDAZAP1のプロリンリッチモチーフ)、親和性精製または免疫沈降を可能にすることができるもの(例えば、FLAG、HA、ビオチン、またはHALOタグ)、ならびに近傍性に基づくタンパク質の標識化および特定を可能にすることができるもの(例えば、標的RNAと相互作用するタンパク質をビオチン標識するためのビオチンリガーゼ(例えば、BirA)またはペルオキシダーゼ(例えば、APEX2))が挙げられる。
一部の例では、Cas13dタンパク質およびエフェクターモジュールの組合せにより、転写センサーを構築することができる。例えば、転写センサーは、変異型HEPNドメインを有する少なくとも1つのCas13dタンパク質(例えば、配列番号2または4)、標的RNAに特異的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有する少なくとも1つのgRNA、およびエフェクターモジュール、例えば、必要に応じてスプリットされる蛍光タンパク質またはプローブ(例えば、スプリットVenus蛍光タンパク質、スプリットGFP、スプリット強GFP、スプリットmCherry、スプリットスーパーフォルダーmCherry、および他の蛍光タンパク質バリアント、例えば、ECFP、YFP、RFP、ならびにそれらの誘導体または断片)、必要に応じてスプリットされる発光タンパク質またはプローブ(例えば、Gaussia、Firefly、NanoLuc、またはRenillaバリアント)、必要に応じてスプリットされる酵素(例えば、ユビキチンまたはTEVプロテアーゼ)、FRET適合性タンパク質対、切断可能なリンカーを介してCas13dに融合された1つまたは複数の転写因子(例えば、人工GAL4、亜鉛フィンガー、転写活性化因子様エフェクター(TALE)、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1、またはTetRに基づく転写因子、または内因性転写因子)、転写因子など、タンパク質をトランスでスプライシングしてその機能を修復するスプリットインテイン(例えば、Rhodothermus marinusまたはDnaEに由来するインテイン)、リン酸化により活性化するキナーゼ-基質対(例えば、TYK2-STAT3)、二量体化または多量体化により活性化する1つ、2つ、もしくはそれよりも多くの単量体(例えば、カスパーゼ9)、または相互作用により構造的および機能的変化を誘導する1つまたは複数のタンパク質から構成され得る。1つの例では、特定の転写物への結合に起因する2つまたはそれよりも多くのCas13dタンパク質およびgRNAの空間的近接性は、エフェクターモジュールを活性化させ、細胞における検出可能なシグナルまたは検出可能な活性をもたらす。
1つの例では、エフェクタードメインは、RNAアプタマー、例えば、gRNA分子に付属するかまたはそこに挿入され得るもの(例えば、MS2、PP7、Qβ、および他のアプタマー)を特異的に認識し、それに結合するタンパク質に融合される。このアプタマー-エフェクタードメイン融合体は、Cas13dおよびgRNA複合体が、アプタマータンパク質-エフェクタードメインを、標的RNAの近傍に誘導するため、標的RNAを標的にするために使用することができる。
別の例では、フルオロフォアアプタマー(例えば、Spinach、Mangoなど)など、アプタマーは、標的RNAの検出を可能にするために、gRNA分子に直接的に挿入することができる。
一部の例では、Cas13dタンパク質(例えば、天然のCas13d、短縮型Cas13d、または変異型HEPNドメインを有するCas13d)は、精製タグ、例えば、HAタグ、Hisタグ(例えば、6-His)、Mycタグ、Eタグ、Sタグ、カルモジュリンタグ、FLAGタグ、GSTタグ、MBPタグなどを含む。そのようなタグは、一部の例では、Cas13dタンパク質のN末端またはC末端にある。
一部の例では、Cas13dタンパク質(例えば、天然のCas13d、短縮型Cas13d、または変異型HEPNドメインを有するCas13d)は、1つまたは複数の細胞内局在化シグナル、エフェクタードメイン、および精製タグを含む。
一部の例では、Cas13dタンパク質は、複数の断片にスプリットされ得、これが、次いで、個別に発現される。Cas13dのそのような断片は、必要に応じて、他のタンパク質ドメインに融合されてもよい。1つの例では、Cas13dは、半分ずつ2つにスプリットされ得、これが、次いで、誘導性ヘテロ二量体対の2つの部分に融合される。ヘテロ二量体結合の誘導の際に、Cas13dの半分ずつが、互いに動員されて、活性タンパク質が形成される。そのような系は、Cas13d活性の誘導的制御を可能にするであろう。有用なヘテロ二量体対は、とりわけ、光照射によってかまたは小分子化合物の投与を通じて二量体化する、2つのタンパク質を含む。ヘテロ二量体対の具体的な例としては、光誘導性Magnetタンパク質、光誘導性iLID-SspB対、光誘導性Cryptochrome2-CIB1二量体、および小分子誘導性FKBPタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。スプリットCas13d設計の別の例では、Cas13dタンパク質の半分ずつ2つが、タンパク質トランススプライシングドメインに融合され得る。そのような設計により、半分ずつ2つを別個に発現させ、それを、細胞内で発現させた後に全長タンパク質に再構成することが可能となるであろう。そのようなトランススプライシングドメインの例としては、インテイン系が挙げられる。
タンパク質のスプリットに特に適した領域を特定するための1つの方法は、オルソログ間で低い保存レベルを呈するアミノ酸のストレッチを特定することである。そのような領域は、図1Bに提供されるCas13dタンパク質のアライメントの保存グラフに示されている。Cas13dの保存された残基の領域は、図18A~18MMMに提供されるCas13dタンパク質アライメントにおいてさらに示されている(アライメントした保存された残基の下に、記号.、:、または*で示される)。
3.Cas13dタンパク質の生成
1つの例では、Cas13dタンパク質は、in vitroで、例えば、原核生物細胞(例えば、細菌、例えば、Lactobacillus、Lactococcus、Bacillus(例えば、B.subtilis)、Escherichia(例えば、E.coli)、Salmonella typhimurium、およびClostridium)、古細菌細胞、植物もしくは植物細胞、真菌細胞(例えば、Neurospora)、酵母細胞(例えば、SaccharomycesまたはPichia(例えば、S.cerevisiaeまたはP.pastoris)、Kluyveromyces lactis)、昆虫細胞(例えば、SF9細胞)、または哺乳動物細胞(例えば、293細胞、または不死化哺乳動物骨髄およびリンパ系細胞株)において、発現される。発現されると、Cas13dタンパク質は、単離および/または精製され得る(例えば、クロマトグラフィーまたは免疫学的分離を使用して)。一部の例では、Cas13dタンパク質上のタグにより、培養培地からのタンパク質の単離が可能である。例示的な手順としては、硫酸アンモニウム沈降、親和性カラム、カラムクロマトグラフィーなどが挙げられる(概して、R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982を参照されたい)。少なくとも約90~95%の均質性、例えば、98%~99%の均質性の実質的に純粋な組成物を、本明細書において提供される方法において使用することができる。例えば、Cas13dタンパク質の精製された調製物は、CRISPR/Cas系において核酸分子からCas13dタンパク質を発現するための代替策として使用することができる。
1つの例では、Cas13dタンパク質は、in vitroで、例えば、原核生物細胞(例えば、細菌、例えば、Lactobacillus、Lactococcus、Bacillus(例えば、B.subtilis)、Escherichia(例えば、E.coli)、Salmonella typhimurium、およびClostridium)、古細菌細胞、植物もしくは植物細胞、真菌細胞(例えば、Neurospora)、酵母細胞(例えば、SaccharomycesまたはPichia(例えば、S.cerevisiaeまたはP.pastoris)、Kluyveromyces lactis)、昆虫細胞(例えば、SF9細胞)、または哺乳動物細胞(例えば、293細胞、または不死化哺乳動物骨髄およびリンパ系細胞株)において、発現される。発現されると、Cas13dタンパク質は、単離および/または精製され得る(例えば、クロマトグラフィーまたは免疫学的分離を使用して)。一部の例では、Cas13dタンパク質上のタグにより、培養培地からのタンパク質の単離が可能である。例示的な手順としては、硫酸アンモニウム沈降、親和性カラム、カラムクロマトグラフィーなどが挙げられる(概して、R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982を参照されたい)。少なくとも約90~95%の均質性、例えば、98%~99%の均質性の実質的に純粋な組成物を、本明細書において提供される方法において使用することができる。例えば、Cas13dタンパク質の精製された調製物は、CRISPR/Cas系において核酸分子からCas13dタンパク質を発現するための代替策として使用することができる。
組換え方法に加えて、本明細書に開示されるCas13dタンパク質はまた、天然の化学的ライゲーションおよび/または発現されたタンパク質のライゲーションを使用して、全体または部分的に構築することができる。
B.Cas13dタンパク質をコードする核酸分子
Cas13dタンパク質をコードする核酸分子は、本開示によって包含される。核酸分子は、Cas13dペプチドをコードするDNA、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、およびRNA配列を含む。そのような核酸分子には、天然に存在するかまたは天然に存在しない、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドが含まれ得る。配列番号1、3、42、62、70、82、83、92、および104の新規なCas13dタンパク質をコードする例示的な核酸分子は、配列番号124~128、139、140、および141に示される。新規なCas13dタンパク質をコードするコドン最適化された核酸分子、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞における発現のために最適化されたものもまた、提供される(配列番号114~123および142~145)。例えば、配列番号114、118、および122は、ヒト細胞における発現のために最適化された核酸分子を提供する。配列番号115、119、および123は、ヒト細胞における発現のために最適化されており、変異体HEPN部位をコードする、核酸分子を提供する。配列番号116および120は、ヒト細胞における発現のために最適化されており、N末端核局在化(NLS)コード配列(すなわち、SPKKKRKVEAS)を含む、核酸分子を提供する。配列番号117および121は、ヒト細胞における発現のために最適化されており、N末端およびC末端のNLSコード配列(すなわち、それぞれ、SPKKKRKVEAS、配列番号256、およびGPKKKRKVAAA配列番号258)を含む、核酸分子を提供する。
Cas13dタンパク質をコードする核酸分子は、本開示によって包含される。核酸分子は、Cas13dペプチドをコードするDNA、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、およびRNA配列を含む。そのような核酸分子には、天然に存在するかまたは天然に存在しない、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドが含まれ得る。配列番号1、3、42、62、70、82、83、92、および104の新規なCas13dタンパク質をコードする例示的な核酸分子は、配列番号124~128、139、140、および141に示される。新規なCas13dタンパク質をコードするコドン最適化された核酸分子、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞における発現のために最適化されたものもまた、提供される(配列番号114~123および142~145)。例えば、配列番号114、118、および122は、ヒト細胞における発現のために最適化された核酸分子を提供する。配列番号115、119、および123は、ヒト細胞における発現のために最適化されており、変異体HEPN部位をコードする、核酸分子を提供する。配列番号116および120は、ヒト細胞における発現のために最適化されており、N末端核局在化(NLS)コード配列(すなわち、SPKKKRKVEAS)を含む、核酸分子を提供する。配列番号117および121は、ヒト細胞における発現のために最適化されており、N末端およびC末端のNLSコード配列(すなわち、それぞれ、SPKKKRKVEAS、配列番号256、およびGPKKKRKVAAA配列番号258)を含む、核酸分子を提供する。
1つの例では、核酸配列は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、または296に対して少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または少なくとも99%の配列同一性を有するCas13dタンパク質をコードする。そのような核酸配列は、本明細書において提供されるアミノ酸配列、および遺伝子コードに基づいて、生成され得る。1つの例では、Cas13d核酸配列は、配列番号124、125、126、127、128、139、140、または141に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する。1つの例では、Cas13d核酸配列は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞における発現のために最適化されており、例えば、配列番号114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、142、143、144、または145に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するものである。
当業者であれば、機能的に同等の核酸、例えば、配列は異なるが同じCas13dタンパク質配列をコードする核酸を含有する、様々なクローンを容易に構築することができる。コード配列におけるサイレント変異は、遺伝子コードの縮重(すなわち、冗長性)から生じ、それによって、1つを上回るコドンが、同じアミノ酸残基をコードし得る。したがって、例えば、ロイシンは、CTT、CTC、CTA、CTG、TTA、またはTTGによってコードすることができ、セリンは、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、またはAGCによってコードすることができ、アスパラギンは、AATまたはAACによってコードすることができ、アスパラギン酸は、GATまたはGACによってコードすることができ、システインは、TGTまたはTGCによってコードすることができ、アラニンは、GCT、GCC、GCA、またはGCGによってコードすることができ、グルタミンは、CAAまたはCAGによってコードすることができ、チロシンは、TATまたはTACによってコードすることができ、イソロイシンは、ATT、ATC、またはATAによってコードすることができる。標準的な遺伝子コードを示す表は、様々な出典において見出すことができる(例えば、Stryer, 1988, Biochemistry, 3rd Edition, W.H. 5 Freeman and Co., NYを参照されたい)。
遺伝子コードに基づいて、任意のCas13d配列をコードする核酸配列を、生成することができる。一部の例では、そのような配列は、宿主または標的細胞、例えば、Cas13dタンパク質を発現させるために使用される宿主細胞、または開示される方法が実施される細胞(例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞)における発現のために、最適化されている。特定の種に関するコドン優先度およびコドン使用頻度の表を使用して、Cas13dをコードする単離された核酸分子(例えば、その特定の種のコドン使用優先度を利用する、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251または253に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するタンパク質をコードするもの)を操作することができる。例えば、本明細書に開示されるCas13dタンパク質は、目的の特定の生物によって優先的に使用されるコドンを有するように設計することができる。1つの例では、Cas13d核酸配列は、ヒト細胞における発現のために最適化されており、例えば、配列番号114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、142、143、144、または145に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するものである。
Cas13dタンパク質をコードする核酸(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するタンパク質をコードするもの)は、in vitro方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、転写に基づく増幅系(TAS)、自己持続性配列複製系(3SR)、およびQβレプリカーゼ増幅系(QB)によって、クローニングまたは増幅させることができる。加えて、Cas13dタンパク質をコードする核酸(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するタンパク質をコードするもの)は、クローニング技法によって調製することができる。適切なクローニングおよびシーケンシング技法、ならびに当業者にクローニングの指示を行うのに十分な説明の例は、Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor, N.Y., 1989およびAusubel et al., (1987) in "Current Protocols in Molecular
Biology," John Wiley and Sons, New York, N.Y.に見出される。
Biology," John Wiley and Sons, New York, N.Y.に見出される。
Cas13dタンパク質をコードする核酸配列(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するタンパク質をコードするもの)は、例えば、適切な配列のクローニング、またはNarang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979のホスホトリエステル方法、Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979のホスホジエステル方法、Beaucage et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862, 1981のジエチルホスホラミダイト方法
、例えば、例としてNeedham-VanDevanter et al., Nucl. Acids Res. 12:6159-6168, 1984に記載されている自動化合成装置を使用するBeaucage & Caruthers, Tetra.
Letts. 22(20):1859-1862, 1981によって記載されている固相ホスホラミダイトトリ
エステル方法、および米国特許第4,458,066号の固体支持体方法などの方法による直接的な化学合成によるものを含む、任意の好適な方法によって、調製することができる。化学合成により、一本鎖オリゴヌクレオチドを産生する。これを、相補的な配列とのハイブリダイゼーションによって、またはこの一本鎖を鋳型として使用したDNAポリメラーゼによる重合によって、二本鎖DNAに変換することができる。当業者であれば、DNAの化学合成が、一般に、約100塩基の配列に限定されるが、より長い配列を、より短い配列のライゲーションによって得ることができることを、認識するであろう。
、例えば、例としてNeedham-VanDevanter et al., Nucl. Acids Res. 12:6159-6168, 1984に記載されている自動化合成装置を使用するBeaucage & Caruthers, Tetra.
Letts. 22(20):1859-1862, 1981によって記載されている固相ホスホラミダイトトリ
エステル方法、および米国特許第4,458,066号の固体支持体方法などの方法による直接的な化学合成によるものを含む、任意の好適な方法によって、調製することができる。化学合成により、一本鎖オリゴヌクレオチドを産生する。これを、相補的な配列とのハイブリダイゼーションによって、またはこの一本鎖を鋳型として使用したDNAポリメラーゼによる重合によって、二本鎖DNAに変換することができる。当業者であれば、DNAの化学合成が、一般に、約100塩基の配列に限定されるが、より長い配列を、より短い配列のライゲーションによって得ることができることを、認識するであろう。
1つの例では、Cas13dタンパク質(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するタンパク質)は、Cas13dタンパク質をコードするcDNAをプラスミドまたはベクターに挿入することによって調製される。挿入は、Cas13dタンパク質がフレームで読み取られ、Cas13dタンパク質が産生されるように、行うことができる。
Cas13d核酸コード配列(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するもの)は、配列の挿入または組込みを可能にするように操作することができ、原核生物または真核生物のいずれかにおいて発現させることができる、プラスミド、ウイルス、または他のビヒクルを含むがこれらに限定されない、発現ベクターに挿入することができる。宿主としては、微生物、酵母、昆虫、植物、および哺乳動物生物を挙げることができる。ベクターは、選択可能なマーカー、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子または抗生物質耐性遺伝子をコードし得る。
Cas13dタンパク質をコードする核酸配列(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するタンパク質をコードするもの)は、発現制御配列に動作可能に連結していてもよい。Cas13dコード配列に動作可能に連結した発現制御配列は、Cas13dタンパク質コード配列の発現が、発現制御配列と適合性のある条件下において達成されるように、ライゲーションされる。発現制御配列としては、適切なプロモーター、エンハンサー、転写終結因子、Cas13dタンパク質コーディング遺伝子の前の開始コドン(すなわち、ATG)、イントロンのスプライシングシグナル、mRNAの適切な翻訳を可能にするためのその遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、および終止コドンが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ベクターは、酵母、例えば、S.cerevisiae、P.pastoris、またはKluyveromyces lactisにおける発現に使用される。酵母発現系において使用するための例示的なプロモーターとしては、構成的プロモーター、形質膜H+-ATPase(PMA1)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GPD)、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1(PGK1)、アルコールデヒドロゲナーゼ-1(ADH1)、および多面的薬物耐性ポンプ(PDR5)が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、多数の誘導性プロモーター、例えば、GAL1-10(ガラクトースによって誘導される)、PHO5(低細胞外無機リン酸によって誘導される)、およびタンデム熱ショックHSEエレメント(37℃への温度上昇によって誘導される)が有用である。滴定可能な誘導因子に応答して変動性の発現を指示するプロモーターとしては、メチオニン応答性MET3およびMET25プロモーター、ならびに銅依存性CUP1プロモーターが挙げられる。これらのプロモーターのいずれも、多重コピー(2μ)または単一コピー(CEN)プラスミドにクローニングして、発現レベルにおけるさらなるレベルの制御をもたらすことができる。プラスミドは、酵母における選択のための栄養マーカー(例えば、URA3、ADE3、HIS1、およびその他)、および細菌における繁殖のための抗生物質耐性(AMP)を含み得る。K.lactisにおける発現のためのプラスミド、例えば、pKLAC1が、公知である。
Cas13dをコードするウイルスベクター(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、または296)に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するタンパク質をコードするもの)もまた、調製することができる。例示的なウイルスベクターとしては、ポリオーマ、SV40、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、HSVおよびEBVを含むヘルペスウイルス、レンチウイルス、シンドビスウイルス、アルファウイルス、ならびにトリ、ネズミ科動物、およびヒト起源のレトロウイルスが挙げられる。バキュロウイルス(Autographa californica核多角体病ウイルス、AcMNPV)ベクターを使用することができ、これは、市販の供給源から入手することができる。他の好適なベクターとしては、レトロウイルスベクター、オルソポックスベクター、トリポックスベクター、鶏痘ベクター、カプリポックスベクター、ブタポックスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびポリオウイルスベクターが挙げられる。特定の例示的なベクターは、ポックスウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、および高度に減弱化されたワクシニアウイルス(MVA)、アデノウイルス、バキュロウイルスなどである。有用なポックスウイルスとしては、オルソポックス、ブタポックス、トリポックス、およびカプリポックスウイルスが挙げられる。オルソポックスには、ワクシニア、欠肢症、およびアライグマポックスが挙げられる。有用なオルソポックスの1つの例は、ワクシニアである。トリポックスとしては、鶏痘、カナリア痘、および鳩痘が挙げられる。カプリポックスとしては、山羊痘および羊痘が挙げられる。1つの例では、ブタポックスは、豚痘である。使用することができる他のウイルスベクターとしては、他のDNAウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルスおよびアデノウイルス、ならびにRNAウイルス、例えば、レトロウイルスおよびポリオが挙げられる。
Cas13dタンパク質をコードするウイルスベクター(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するタンパク質をコードするもの)は、Cas13dタンパク質をコードする核酸配列に操作可能に連結された少なくとも1つの発現制御エレメントを含み得る。発現制御エレメントは、Cas13d核酸配列の発現を制御および調節する。使用することができる例示的な発現制御エレメントとしては、lac系、ファージラムダのオペレーターおよびプロモーター領域、酵母プロモーター、ならびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、またはSV40に由来するプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。1つの例では、プロモーターは、CMV、U6、CBh、CMW、Cbh、EF1aである。1つの例では、プロモーターは、細胞型特異的プロモーター、例えば、シナプシンもしくはGFAP、または誘導性プロモーター、例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーターである。追加の操作エレメントとしては、リーダー配列、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、ならびに宿主系におけるCas13dタンパク質をコードする核酸配列の適切な転写およびそれに続く翻訳に必要とされる任意の他の配列が挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターは、宿主系における核酸配列を含有する発現ベクターの移入およびそれに続く複製に必要とされる追加のエレメントを含有し得る。そのようなエレメントの例としては、複製起点および選択可能なマーカーが挙げられるが、これらに限定されない。
1つの例では、ベクターは、Cas13dタンパク質コード配列の後のポリAシグナル、ウイルスベクターにおける発現のためのWPREシグナル、またはこれらの組合せを含む。
1つの例では、方法は、Cas13dタンパク質をコードするmRNAの直接的な送達を使用する。
C.ガイド核酸分子
本開示は、本明細書で提供される方法、組成物およびキットにおいて使用され得るガイド核酸分子、例えば、ガイドRNA(gRNAまたはcrRNA、CRISPR(ガイド)RNA)を提供する。かかる分子は、天然に存在するまたは天然に存在しないヌクレオチドまたはリボヌクレオチド(例えば、例えばガイドRNAを分解から保護するための、LNAまたは他の化学的改変ヌクレオチドまたはリボヌクレオチド)を含み得る。一部の例では、ガイド配列は、RNAである。ガイド核酸は、改変された塩基または化学的改変を含み得る(例えば、Latorre et al., Angewandte Chemie 55:3548-50, 2016を参照のこと)。ガイド配列は、Cas13dタンパク質を標的RNAに指向させ、それによって、RNAを標的にする(例えば、RNAを改変または検出する)。
本開示は、本明細書で提供される方法、組成物およびキットにおいて使用され得るガイド核酸分子、例えば、ガイドRNA(gRNAまたはcrRNA、CRISPR(ガイド)RNA)を提供する。かかる分子は、天然に存在するまたは天然に存在しないヌクレオチドまたはリボヌクレオチド(例えば、例えばガイドRNAを分解から保護するための、LNAまたは他の化学的改変ヌクレオチドまたはリボヌクレオチド)を含み得る。一部の例では、ガイド配列は、RNAである。ガイド核酸は、改変された塩基または化学的改変を含み得る(例えば、Latorre et al., Angewandte Chemie 55:3548-50, 2016を参照のこと)。ガイド配列は、Cas13dタンパク質を標的RNAに指向させ、それによって、RNAを標的にする(例えば、RNAを改変または検出する)。
ガイド分子は、スペーサーと呼ばれる1つまたは複数の領域を含む。スペーサーは、標的RNAとハイブリダイズし、標的RNAへのCas13dタンパク質の配列特異的結合を指示するのに十分な、標的RNA配列との相補性を有する。したがって、スペーサーは、ガイド配列の可変性の部分である。一部の例では、スペーサーは、標的RNA(または標的化されるRNAの領域)に対する100%の相補性を有するが、スペーサーは、標的RNAに対して100%未満の相補性、例えば、標的RNAに対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%の相補性を有し得る。
ガイド配列は、1つまたは複数のダイレクトリピート(DR)もまた含み得る。DRは、ガイドの不変の部分であり、Cas13dタンパク質とガイド分子との間の相互作用を促進する強い二次構造を含有する(図3C)。各オルソログは、わずかに異なるDR配列(例えば、配列番号129、130、131、132、133、134、135、136、137、148、150、151、152、154、156、157、159、161、163、165、167および169)を有する。一例では、gRNAは、配列番号129、130、131、132、133、134、135、136、137、148、150、151、152、154、156、157、159、161、163、165、167、169、176、178、180、182、184、186、188、190、191、192、193、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252または254に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する少なくとも1つのDR配列(例えば、かかるDR配列のうち1、2、3または4つ)を含む。
一例では、ガイド配列は、その5’末端に一定のDRを、その3’末端に可変性のスペーサーを含む。一例では、配列DR-スペーサー-DR-スペーサーを含む。一部の例では、配列DR-スペーサーは、2回またはそれよりも多く、例えば、少なくとも3回または少なくとも4回、反復される。この型の配列は、ガイドアレイと呼ばれる。
ガイド分子は一般に、プロセシングの種々の状態で存在する。一例では、プロセシングされていないガイドRNAは、36ntのDRとその後の30~32ntのスペーサーである。ガイドRNAは、Cas13d自体または他のRNaseによって、より短い「成熟」形態へとプロセシング(短縮/改変)される。一部の実施形態では、プロセシングされていないガイド配列は、約、または少なくとも約30、35、40、45、50、55、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75またはそれよりも多くのヌクレオチド(nt)長である。一部の実施形態では、プロセシングされたガイド配列は、約44~60nt(例えば、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69または70nt)である。一部の実施形態では、プロセシングされていないスペーサーは、約28~32nt長(例えば、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35nt)であるが、成熟(プロセシングされた)スペーサーは、約10~30nt、10~25nt、14~25nt、20~22ntまたは14~30nt(例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35nt)であり得る。一部の実施形態では、プロセシングされていないDRは、約36nt(例えば、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40または41nt)であるが、プロセシングされたDRは、約30nt(例えば、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35nt)である。
ガイド配列がCRISPR複合体の標的RNAへの配列特異的結合を指示する能力は、任意の適切なアッセイによって評価され得る。例えば、試験されるガイド配列を含む、CRISPR複合体を形成するのに十分なCRISPR系の構成成分は、例えば、CRISPR配列の構成成分をコードするベクターによるトランスフェクションによって、対応する標的RNA分子を有する宿主細胞に提供され、その後、標的配列内の優先的な切断が評価され得る。同様に、標的RNA配列の切断は、標的RNA、試験されるガイド配列を含む、CRISPR複合体の構成成分、および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を提供すること、ならびに試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応との間で、標的RNAにおける結合、または切断の速度を比較することによって、試験管中で評価され得る。他のアッセイが可能であり、当業者に想起される。
ガイド核酸分子を含むベクター、例えば、ウイルスベクターまたはプラスミド(例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたは単純ヘルペスウイルス)もまた提供される。例示的なベクターは、本明細書に記載される。一部の例では、ガイド核酸分子は、プロモーターまたは発現制御エレメント(その例は、本出願の他の場所で提供される)に作動可能に連結している。本明細書の他の場所に記載されるように、かかるベクターは、他のエレメント、例えば、選択可能なマーカー、例えば抗生物質、例えば、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、または検出可能なマーカー、例えば、GFPもしくは他のフルオロフォアをコードする遺伝子を含み得る。
一例では、複数のgRNAは、アレイ(これは、ベクター、例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドの一部であり得る)の一部である。例えば、配列DR-スペーサー-DR-スペーサー-DR-スペーサーを含むガイドアレイは、3つの独自のプロセシングされていないgRNA(各DR-スペーサー配列について1つ)を含み得る。細胞または無細胞系中に導入されると、アレイは、Cas13dタンパク質によって、3つの個々の成熟gRNAへとプロセシングされる。これは、例えば、複数の標的RNA、または単一の標的RNA内の複数の位置(またはそれらの組合せ)を標的にするための、細胞または系への複数のgRNAの送達の多重化を可能にする。
D.Cas13dおよびガイド核酸分子をコードするベクター
本開示は、1つまたは複数のガイド分子コード配列(例えば、1つまたは複数のRNA分子の標的化を可能にするため)および1つまたは複数のCas13dタンパク質コード配列を含むベクター、例えば、本明細書の他の場所に記載されるプラスミドおよびウイルスベクターを提供する。かかるベクターは、本明細書で提供される方法、組成物およびキットにおいて使用され得る。かかるベクターは、天然に存在するまたは天然に存在しないヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み得る。かかるベクターは、ガイド分子(これは、少なくとも2つの異なるガイド分子を含むアレイの一部であり得る)およびCas13dタンパク質コード配列に作動可能に連結した単一のプロモーターを含み得る。あるいは、ガイド分子(これは、少なくとも2つの異なるガイド分子を含むアレイの一部であり得る)およびCas13dタンパク質コード配列は、異なるプロモーターに作動可能に連結していてもよい。一部の例では、ガイド分子(これは、少なくとも2つの異なるガイド分子を含むアレイの一部であり得る)およびCas13dタンパク質コード配列は、プロモーター、エンハンサーまたはそれら両方に作動可能に連結している。
本開示は、1つまたは複数のガイド分子コード配列(例えば、1つまたは複数のRNA分子の標的化を可能にするため)および1つまたは複数のCas13dタンパク質コード配列を含むベクター、例えば、本明細書の他の場所に記載されるプラスミドおよびウイルスベクターを提供する。かかるベクターは、本明細書で提供される方法、組成物およびキットにおいて使用され得る。かかるベクターは、天然に存在するまたは天然に存在しないヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み得る。かかるベクターは、ガイド分子(これは、少なくとも2つの異なるガイド分子を含むアレイの一部であり得る)およびCas13dタンパク質コード配列に作動可能に連結した単一のプロモーターを含み得る。あるいは、ガイド分子(これは、少なくとも2つの異なるガイド分子を含むアレイの一部であり得る)およびCas13dタンパク質コード配列は、異なるプロモーターに作動可能に連結していてもよい。一部の例では、ガイド分子(これは、少なくとも2つの異なるガイド分子を含むアレイの一部であり得る)およびCas13dタンパク質コード配列は、プロモーター、エンハンサーまたはそれら両方に作動可能に連結している。
E.組換え細胞および無細胞系
非ネイティブCas13dタンパク質、非ネイティブCas13dタンパク質コード配列、ガイド分子(またはコード配列)、またはそれらの組合せを含む細胞が提供される。かかる組換え細胞は、本明細書で提供される方法、組成物およびキットにおいて使用され得る。本明細書で開示されるCas13dタンパク質をコードする核酸分子および/またはガイド分子をコードする核酸分子は、形質転換された(例えば、組換え)細胞を生成するために、細胞中に導入され得る。一部の例では、かかる細胞は、1つまたは複数の非ネイティブCas13dタンパク質および1つまたは複数のガイド分子(例えば、gRNA)を、例えば、リボ核タンパク質(RNP)複合体として、細胞中に導入することによって生成される。
非ネイティブCas13dタンパク質、非ネイティブCas13dタンパク質コード配列、ガイド分子(またはコード配列)、またはそれらの組合せを含む細胞が提供される。かかる組換え細胞は、本明細書で提供される方法、組成物およびキットにおいて使用され得る。本明細書で開示されるCas13dタンパク質をコードする核酸分子および/またはガイド分子をコードする核酸分子は、形質転換された(例えば、組換え)細胞を生成するために、細胞中に導入され得る。一部の例では、かかる細胞は、1つまたは複数の非ネイティブCas13dタンパク質および1つまたは複数のガイド分子(例えば、gRNA)を、例えば、リボ核タンパク質(RNP)複合体として、細胞中に導入することによって生成される。
同様に、Cas13dタンパク質、Cas13dタンパク質コード配列、ガイド分子(またはコード配列)、またはそれらの組合せを含む無細胞系、例えば、溶解された細胞から生成されたもの(またはin vitro転写されたまたは化学的に合成された標的RNAが添加される試験管または他の容器中にCas13d RNPを含むもの)が提供される。かかる無細胞系は、本明細書で提供される方法、組成物およびキットにおいて使用され得る。一部の例では、1つまたは複数の非ネイティブCas13dタンパク質および1つまたは複数のガイド分子(例えば、gRNA)は、例えば、RNP複合体として、無細胞系に添加される。
したがって、Cas13dタンパク質(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するタンパク質)を含有する細胞および無細胞系が、開示される。同様に、ガイド分子、例えば、配列番号129、130、131、132、133、134、135、136または137に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する少なくとも1つのDR配列を有するもの、および一部の例では、標的RNAに対して相補的な少なくとも1つのスペーサー配列も含有する細胞および無細胞系が提供される。
かかる組換え細胞(例えば、これは、無細胞系を生成するために使用され得る)は、真核生物または原核生物であり得る。かかる細胞の例には、細菌、古細菌、植物、真菌、酵母、昆虫および哺乳動物細胞、例えば、Lactobacillus、Lactococcus、Bacillus(例えば、B.subtilis)、Escherichia(例えば、E.coli)、Clostridium、SaccharomycesまたはPichia(例えば、S.cerevisiaeまたはP.pastoris)、Kluyveromyces lactis、Salmonella typhimurium、Drosophila細胞、C.elegans細胞、Xenopus細胞、SF9細胞、C129細胞、293細胞、Neurosporaおよび不死化哺乳動物細胞系(例えば、Hela細胞、骨髄性細胞系およびリンパ系細胞系)が含まれるがこれらに限定されない。
一例では、細胞は、原核生物細胞、例えば細菌細胞、例えばE.coliである。
一例では、細胞は、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である。一例では、細胞は、初代真核生物細胞、幹細胞、腫瘍/がん細胞、循環腫瘍細胞(CTC)、血液細胞(例えば、T細胞、B細胞、NK細胞、Tregなど)、造血幹細胞、特殊化した免疫細胞(例えば、腫瘍浸潤性リンパ球または腫瘍抑制されるリンパ球)、腫瘍微小環境中の間質細胞(例えば、がん関連線維芽細胞など)である。一例では、細胞は、中枢神経系または末梢神経系の脳細胞(例えば、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア、網膜神経節細胞、杆体/錐体など)である。
一例では、細胞は、生体試料、例えば、対象から取得された、ゲノムDNA、RNA(例えば、mRNA)、タンパク質、またはそれらの組合せを含有する生体検体の一部である(またはそれから取得される)。例には、末梢血、血清、血漿、尿、唾液、痰、組織生検、細針吸引物、手術検体および剖検材料が含まれるがこれらに限定されない。かかる細胞は、無細胞系を生成するためにも使用され得る。
一例では、細胞(または無細胞系)は、腫瘍、例えば、血液学的腫瘍(例えば、急性白血病(例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病)、慢性白血病(例えば、慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病、慢性骨髄性白血病および慢性リンパ球性白血病)を含む白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫(低グレード、中間グレードおよび高グレードを含む)、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、マントル細胞リンパ腫および脊髄形成異常症)または固形腫瘍(例えば、肉腫および癌腫:線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性腫瘍、膵がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、膀胱癌およびCNS腫瘍(例えば、神経膠腫、星細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫(craniopharyogioma)、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突
起神経膠腫、髄膜腫(menangioma)、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫)由来である。
起神経膠腫、髄膜腫(menangioma)、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫)由来である。
一例では、細胞(または無細胞系)は、環境試料、例えば、水、土壌または空気試料から取得される。
F.組成物およびキット
Cas13dタンパク質、Cas13dタンパク質コード配列、ガイド分子(またはコード配列)、またはそれらの組合せを含む組成物およびキットが提供される。一例では、組成物またはキットは、1つまたは複数のCas13dタンパク質および1つまたは複数のガイド分子(例えば、gRNA)から構成されるRNP複合体を含む。一例では、組成物またはキットは、Cas13dタンパク質、ガイド分子、またはそれら両方をコードするベクターを含む。一例では、組成物またはキットは、非ネイティブCas13dタンパク質、非ネイティブCas13dタンパク質コード配列、ガイド分子(またはコード配列)、またはそれらの組合せを含む細胞、例えば、細菌細胞または真核生物細胞を含む。一例では、組成物またはキットは、非ネイティブCas13dタンパク質、非ネイティブCas13dタンパク質コード配列、ガイド分子(またはコード配列)、またはそれらの組合せを含む無細胞系を含む。
Cas13dタンパク質、Cas13dタンパク質コード配列、ガイド分子(またはコード配列)、またはそれらの組合せを含む組成物およびキットが提供される。一例では、組成物またはキットは、1つまたは複数のCas13dタンパク質および1つまたは複数のガイド分子(例えば、gRNA)から構成されるRNP複合体を含む。一例では、組成物またはキットは、Cas13dタンパク質、ガイド分子、またはそれら両方をコードするベクターを含む。一例では、組成物またはキットは、非ネイティブCas13dタンパク質、非ネイティブCas13dタンパク質コード配列、ガイド分子(またはコード配列)、またはそれらの組合せを含む細胞、例えば、細菌細胞または真核生物細胞を含む。一例では、組成物またはキットは、非ネイティブCas13dタンパク質、非ネイティブCas13dタンパク質コード配列、ガイド分子(またはコード配列)、またはそれらの組合せを含む無細胞系を含む。
かかる組成物は、薬学的に許容される担体(例えば、生理食塩水、水、グリセロール、DMSOまたはPBS)を含み得る。一部の例では、組成物は、液体、凍結乾燥粉末であるか、または凍結保存される。
一部の例では、キットは、送達系(例えば、リポソーム、粒子、エクソソーム、微細小胞、ウイルスベクターまたはプラスミド)および/または標識(例えば、細胞型特異的取込みを指示する/エンドソーム回避を増強する/血液脳関門横断を可能にするためなどに、直接Cas13d RNPにまたはCas13d RNPを含有する粒子にコンジュゲートされ得るペプチドまたは抗体)を含む。一部の例では、キットは、細胞培養物または成長培地、例えば、細菌、植物、昆虫または哺乳動物細胞を成長させるのに適切な培地をさらに含む。
一部の例では、キットのかかるパーツは、別々のコンテナ中にある。
G.RNAを標的にする
開示されたCas13dタンパク質(およびコード配列)およびガイド分子(例えば、gRNAおよびコード配列)は、1つまたは複数のRNA分子、例えば、試料(例えば、生体試料、環境試料(例えば、土壌、空気または水試料)など)中に存在するものを標的にするために、CRISPR/Cas系において使用され得る。一例では、標的RNAは、コーディングRNAである。一例では、標的RNAは、核RNAである。他の例では、標的RNAは、非コーディングRNA(例えば、機能的RNA、siRNA、microRNA、snRNA、snoRNA、piRNA、scaRNA、tRNA、rRNA、lncRNAまたはlincRNA)である。かかるRNA標的化法は、in vitroで(例えば、細胞培養物または無細胞系において)またはin vivoで(例えば、生物、胚または哺乳動物において)実施され得る。
開示されたCas13dタンパク質(およびコード配列)およびガイド分子(例えば、gRNAおよびコード配列)は、1つまたは複数のRNA分子、例えば、試料(例えば、生体試料、環境試料(例えば、土壌、空気または水試料)など)中に存在するものを標的にするために、CRISPR/Cas系において使用され得る。一例では、標的RNAは、コーディングRNAである。一例では、標的RNAは、核RNAである。他の例では、標的RNAは、非コーディングRNA(例えば、機能的RNA、siRNA、microRNA、snRNA、snoRNA、piRNA、scaRNA、tRNA、rRNA、lncRNAまたはlincRNA)である。かかるRNA標的化法は、in vitroで(例えば、細胞培養物または無細胞系において)またはin vivoで(例えば、生物、胚または哺乳動物において)実施され得る。
本明細書で提供されるCRISPR/Cas系は、2つの一般的な構成成分:(1)Cas13dタンパク質またはそのコード配列(その発現は、プロモーターによって駆動され得る)および(2)標的RNAに特異的なガイド核酸分子、例えばRNA(gRNA)(その発現もまた、プロモーターによって駆動され得る)を含む。例えば、(1)Cas13d mRNAおよびCas13d gRNAとして、(2)単一のベクターもしくはプラスミドの一部として、または複数のベクターもしくはプラスミドへと分割されて、(3)別々のCas13dタンパク質およびガイド分子として、あるいは(4)Cas13dタンパク質およびガイド分子のRNP複合体として、細胞中に(または無細胞系に)導入される場合、ガイド分子は、Cas13dを標的RNAにガイドする。Cas13dタンパク質がネイティブHEPNドメインを有する、またはRNase活性を有する適切なエフェクタードメインに融合される場合、RNAは切断され得る。Cas13dタンパク質が突然変異したHEPNドメインを有する場合、ガイドアレイは、成熟gRNAへとプロセシングされ得るが、標的RNAは切断されない。この系を使用して、RNA配列は、必要に応じてエフェクタードメインを用いて、容易に標的化、例えば、編集または検出される。
1.細胞中への直接的なCas13dタンパク質の導入
一例では、Cas13dタンパク質は、組換え細胞、例えばE.coliにおいて発現され、精製される。次いで、得られた精製されたCas13dタンパク質は、標的RNAに特異的な適切なガイド分子と共に、1つまたは複数のRNAが標的化され得る細胞または生物中に導入される。一部の例では、Cas13dタンパク質およびガイド核酸分子は、別々の構成成分として標的細胞/生物中に導入される。他の例では、精製されたCas13dタンパク質は、ガイド核酸(例えば、gRNA)と複合体化され、このリボ核タンパク質(RNP)複合体は、標的細胞中に(例えば、トランスフェクションまたは注射を使用して)導入される。一部の例では、Cas13dタンパク質およびガイド分子は、胚(例えば、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュまたはXenopus胚)中に注射される。
一例では、Cas13dタンパク質は、組換え細胞、例えばE.coliにおいて発現され、精製される。次いで、得られた精製されたCas13dタンパク質は、標的RNAに特異的な適切なガイド分子と共に、1つまたは複数のRNAが標的化され得る細胞または生物中に導入される。一部の例では、Cas13dタンパク質およびガイド核酸分子は、別々の構成成分として標的細胞/生物中に導入される。他の例では、精製されたCas13dタンパク質は、ガイド核酸(例えば、gRNA)と複合体化され、このリボ核タンパク質(RNP)複合体は、標的細胞中に(例えば、トランスフェクションまたは注射を使用して)導入される。一部の例では、Cas13dタンパク質およびガイド分子は、胚(例えば、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュまたはXenopus胚)中に注射される。
Cas13dタンパク質およびガイド核酸分子が細胞中にあると、1つまたは複数のRNAが標的化され得る。
2.核酸からのCas13dの発現
一例では、Cas13dタンパク質は、標的RNA、例えば、検出または改変されるRNAを含有する細胞において、核酸分子から発現される。一部のかかる例では、Cas13dタンパク質は、細胞中または無細胞系中に導入されたベクター、例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドから発現される。これは、細胞、生物または系におけるCas13dタンパク質の産生を生じる。さらに、これらの核酸分子は、標的RNAに特異的なガイド核酸分子(例えば、gRNA)と共に、細胞/生物/系において共発現され得る。
一例では、Cas13dタンパク質は、標的RNA、例えば、検出または改変されるRNAを含有する細胞において、核酸分子から発現される。一部のかかる例では、Cas13dタンパク質は、細胞中または無細胞系中に導入されたベクター、例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドから発現される。これは、細胞、生物または系におけるCas13dタンパク質の産生を生じる。さらに、これらの核酸分子は、標的RNAに特異的なガイド核酸分子(例えば、gRNA)と共に、細胞/生物/系において共発現され得る。
一例では、複数のプラスミドまたはベクターが、RNA標的化に使用される。Cas13dをコードする核酸分子は、例えば、1つのベクターまたはプラスミド上で、ガイド核酸分子(例えば、gRNA)は、別のプラスミドまたはベクター上で提供され得る。複数のプラスミドまたはウイルスベクターは、混合され、細胞(または無細胞系)中に同時に、または別々に導入され得る。
一部の例では、複数の核酸分子が、単一のベクターまたはプラスミドから発現される。例えば、単一のベクターが、Cas13dをコードする核酸分子を含み得、別のベクターが、ガイド分子を含み得る。
一部の例では、各標的(例えば、1、2、3、4、5または10個の異なる標的)について1つの、複数の異なるガイド分子(例えば、gRNA)が、単一のアレイおよび/またはベクター上に存在する。一例では、方法は、アレイ(これは、ベクター、例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドの一部であり得る)の一部である複数のgRNA(例えば、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20または少なくとも50個の異なるgRNA)を送達するステップを含む。細胞または無細胞系中に導入されると、アレイは、Cas13dタンパク質によって、個々の成熟gRNAへとプロセシングされる。
ベクターから発現される核酸分子は、プロモーターの制御下にあり、必要に応じて、選択マーカー(例えば、抗生物質耐性)を含有し得る。
一部の例では、タンパク質およびガイド分子は、胚(例えば、ゼブラフィッシュまたはXenopus胚)によって発現される。Cas13dタンパク質は、注射されたプラスミドDNA、注射されたmRNA、または動物ゲノム中に安定に組み込まれたコピーから発現され得る。gRNAは、直接注射されるか、またはベクター、もしくは動物ゲノム中に安定に組み込まれたコピーから発現され得る。
3.標的
1つまたは複数のRNA、例えば、細胞、無細胞系または生物中の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4または少なくとも5つの異なるRNA、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の異なるRNAが、開示された方法によって標的化され得る。一例では、RNAは、嚢胞性線維症、ハンチントン病、テイ・サックス病、脆弱X症候群、脆弱X関連振戦/失調症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症または家族性ALSなどの疾患と関連する。一例では、RNAは、がん(例えば、肺、乳房、結腸、肝臓、膵臓、前立腺、骨、脳、皮膚(例えば、黒色腫)または腎臓のがん)と関連する。標的RNAの例には、がんと関連するもの(例えば、BCR-ABL、Ras、Raf、p53、BRCA1、BRCA2、CXCR4、ベータ-カテニン、HER2およびCDK4)が含まれるがこれらに限定されない。
1つまたは複数のRNA、例えば、細胞、無細胞系または生物中の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4または少なくとも5つの異なるRNA、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の異なるRNAが、開示された方法によって標的化され得る。一例では、RNAは、嚢胞性線維症、ハンチントン病、テイ・サックス病、脆弱X症候群、脆弱X関連振戦/失調症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症または家族性ALSなどの疾患と関連する。一例では、RNAは、がん(例えば、肺、乳房、結腸、肝臓、膵臓、前立腺、骨、脳、皮膚(例えば、黒色腫)または腎臓のがん)と関連する。標的RNAの例には、がんと関連するもの(例えば、BCR-ABL、Ras、Raf、p53、BRCA1、BRCA2、CXCR4、ベータ-カテニン、HER2およびCDK4)が含まれるがこれらに限定されない。
一例では、RNAは、ウイルス感染、例えば、プラス鎖RNAウイルス、例えば、ピコルナウイルス(例えば、アフトウイルス科[例えば、口蹄疫ウイルス(FMDV)])、カルジオウイルス科;エンテロウイルス科(例えば、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルスおよびポリオウイルス);ライノウイルス科(ライノウイルス));ヘパトウイルス科(Hepataviridae)(A型肝炎ウイルス);トガウイルス(その例
には、風疹;アルファウイルス(例えば、西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルス)が含まれる);フラビウイルス(その例には、デングウイルス、ウエストナイルウイルスおよび日本脳炎ウイルスが含まれる);カリシウイルス科(Calciviridae)(これには、ノロウイルスおよびサポウイルスが含まれる);もしくはコロナウイルス(その例には、Urbani株などのSARSコロナウイルスが含まれる)、またはマイナス鎖RNAウイルス、例えば、オルソミクソウイルス(Orthomyxyovirus)(例えば、インフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病ウイ
ルス)およびパラミクソウイルス(その例には、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルスまたはパラインフルエンザウイルスが含まれる)による感染、あるいはDNAウイルス感染(例えば、ヘルペスウイルス(例えば、水痘帯状疱疹ウイルス、例えばOka株;サイトメガロウイルス;ならびに単純ヘルペスウイルス(HSV)1型および2型)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス1型およびアデノウイルス41型)、ポックスウイルス(例えば、ワクシニアウイルス)またはパルボウイルス(例えば、パルボウイルスB19)による感染)と関連する。
には、風疹;アルファウイルス(例えば、西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルス)が含まれる);フラビウイルス(その例には、デングウイルス、ウエストナイルウイルスおよび日本脳炎ウイルスが含まれる);カリシウイルス科(Calciviridae)(これには、ノロウイルスおよびサポウイルスが含まれる);もしくはコロナウイルス(その例には、Urbani株などのSARSコロナウイルスが含まれる)、またはマイナス鎖RNAウイルス、例えば、オルソミクソウイルス(Orthomyxyovirus)(例えば、インフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病ウイ
ルス)およびパラミクソウイルス(その例には、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルスまたはパラインフルエンザウイルスが含まれる)による感染、あるいはDNAウイルス感染(例えば、ヘルペスウイルス(例えば、水痘帯状疱疹ウイルス、例えばOka株;サイトメガロウイルス;ならびに単純ヘルペスウイルス(HSV)1型および2型)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス1型およびアデノウイルス41型)、ポックスウイルス(例えば、ワクシニアウイルス)またはパルボウイルス(例えば、パルボウイルスB19)による感染)と関連する。
一例では、RNAは、細菌感染、または細菌感染の特性、例えば、耐菌性、持続性もしくは抗生物質耐性と関連する。これらのRNAの検出は、診断的方法のために使用され得るが、細胞ベースの系または無細胞系におけるこれらのRNAの編集は、治療的方法に使用され得る。
4.RNAを検出する方法
一例では、RNAを標的にする方法は、標的RNAの検出、視覚化または標識化を生じる。例えば、突然変異したHEPNドメインを有する少なくとも1つのCas13dタンパク質(例えば、配列番号2または4)、標的RNAに特異的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有する少なくとも1つのgRNA、およびエフェクターモジュールを使用することによって、標的RNAは、Cas13dによって認識されるが、切断もニックを入れることもされず、一方でエフェクターモジュールは、活性化される。一部の例では、かかる方法は、標的RNAを検出するために使用される。かかる方法は、標的RNAが例えば腫瘍細胞中に存在するかどうかを決定するために、細胞または無細胞系において使用され得る。一部の例では、細胞または無細胞系は、組織試料、血液試料または唾液試料から取得される。
一例では、RNAを標的にする方法は、標的RNAの検出、視覚化または標識化を生じる。例えば、突然変異したHEPNドメインを有する少なくとも1つのCas13dタンパク質(例えば、配列番号2または4)、標的RNAに特異的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有する少なくとも1つのgRNA、およびエフェクターモジュールを使用することによって、標的RNAは、Cas13dによって認識されるが、切断もニックを入れることもされず、一方でエフェクターモジュールは、活性化される。一部の例では、かかる方法は、標的RNAを検出するために使用される。かかる方法は、標的RNAが例えば腫瘍細胞中に存在するかどうかを決定するために、細胞または無細胞系において使用され得る。一部の例では、細胞または無細胞系は、組織試料、血液試料または唾液試料から取得される。
一例では、RNAを検出する方法は、標的RNAに特異的なスペーサー配列を含有するgRNAと共に、蛍光タンパク質または他の検出可能な標識に融合されたCas13dタンパク質を含む。標的RNAへのCas13dの結合は、顕微鏡法、またはイメージングの他の方法によって、視覚化され得る。別の例では、RNAアプタマー配列、例えば、MS2、PP7、Qβ、および他のアプタマーは、gRNA分子に付け足されるか、またはその中に挿入され得る。Cas13d-gRNA-標的RNA複合体は、アプタマー相互作用を介して標識されるので、蛍光タンパク質または他の検出可能な標識に融合された、これらのアプタマーに特異的に結合するタンパク質、例えば、MS2ファージコートタンパク質の導入は、標的RNAを検出するために使用され得る。
別の例では、RNAを検出する方法は、診断薬または治療薬のための転写センサー(例えば、合成回路の一部としての)である。例えば、転写センサーは、突然変異したHEPNドメインを有する少なくとも1つのCas13dタンパク質(例えば、配列番号2または4)、標的RNAに特異的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有する少なくとも1つのgRNA、およびエフェクターモジュール、例えば、必要に応じてスプリットされた蛍光タンパク質またはプローブ;必要に応じてスプリットされた発光タンパク質またはプローブ;検出可能な反応を触媒する、必要に応じてスプリットされた酵素、例えば、ユビキチンまたはTEVプロテアーゼ;FRET適合性のタンパク質対;切断可能なリンカーを介してCas13dに融合された1つまたは複数の転写因子;転写因子などの機能を回復させるためにタンパク質をトランススプライシングするスプリットインテイン;リン酸化の際に活性化するキナーゼ-基質対;二量体化または多量体化の際に活性化する1つ、2つまたはそれよりも多くのモノマー;または相互作用の際にコンフォメーションおよび機能的変化を誘導する1つまたは複数のタンパク質から構成され得る。一例では、特定の転写物を結合することに起因する2つまたはそれよりも多くのCas13dタンパク質およびgRNAの空間的近接は、エフェクターモジュールを活性化し、細胞において検出可能なシグナルまたは検出可能な活性を生じる。
例えば、転写センサーは、がん特異的転写物、炎症特異的転写物、疾患特異的転写物または細胞状態特異的転写物が検出されるのを可能にし得る。特定の転写物を感知することができるCas13dベースの系を含有する合成回路は、例えば、治療適用のために遺伝子を上方調節または下方調節するために標的検出を必要とする、条件付きロジック(conditional logic)をコードし得る。
一例では、方法は、検出され得る標的RNAに結合している検出可能な薬剤を生じる。例えば、各々がフルオロフォア(例えば、GFP)の一部を含む2つの別々のCas13d融合タンパク質、および密接に近接したRNAの領域を標的にする異なるスペーサー配列を有する2つの異なるgRNAが、使用され得る。2つの部分が標的RNAに近接して結合する場合、フルオロフォアの2つの部分は、完全なフルオロフォアを形成し、それによって、検出可能なシグナルを生成する。
一例では、方法は、例えば、応答を、例えば、第2の遺伝子の発現、タンパク質の改変、異なる位置へのタンパク質またはRNAの転座、自殺遺伝子を介した細胞死の誘導、細胞増殖の誘導、二次機能を可能にする導入遺伝子の誘導、過去の転写事象の記憶を保存することを可能にするDNA配列における永続的変化の誘導を誘発すること、またはプルダウンを可能にするためにRNAを変更することによって、RNA検出を生じる。
一実施形態では、転写因子の2つの半分は、スプリットインテイン系を介して、2つの別々のCas13dに連結され得る。Cas13dタンパク質には、密接に近接したRNAの領域を標的にする異なるスペーサー配列を有する2つの異なるgRNAが提供される。標的RNAに近接して結合すると、スプリットインテインは、再構成された転写因子(TF)をトランススプライシングして、それが核に転座し、標的遺伝子または標的遺伝子のクラスターのスイッチをオンにできるようにする。一例では、標的遺伝子は、細胞中の内因性遺伝子であり得る。別の例では、標的遺伝子は、ベクター上で発現される、または遺伝子操作を介して導入される導入遺伝子、例えば、蛍光タンパク質または毒素であり得る。
5.無細胞系においてRNAを検出する方法 一例では、無細胞系において標的RNAを検出する方法は、検出可能な標識または酵素活性を生じる。例えば、少なくとも1つのCas13dタンパク質(例えば、配列番号3、42、62、70、82、83および92)、標的RNAに特異的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有する少なくとも1つのgRNA、および検出可能な標識を使用することによって、標的RNAは、Cas13dによって認識される。Cas13dによる標的RNAの結合は、そのRNase活性を誘発し、これが、標的RNAの切断ならびに検出可能な標識をもたらし得る。
一例では、検出可能な標識は、蛍光プローブおよびクエンチャーに連結されたRNAである。インタクトな検出可能なRNAは、蛍光プローブおよびクエンチャーを連結して、蛍光を抑制する。Cas13dによる検出可能なRNAの切断の際に、蛍光プローブは、クエンチャーから放出され、蛍光活性を示す。かかる方法は、標的RNAが、溶解された細胞試料、溶解された組織試料、血液試料、唾液試料、環境試料(例えば、水、土壌または空気試料)、または他の溶解された細胞もしくは無細胞試料中に存在するかどうかを決定するために使用され得る。かかる方法は、病原体、例えば、ウイルスまたは細菌を検出する、またはがんなどの疾患状態を診断するためにも使用され得る。
一例では、標的RNAの検出は、疾患および/もしくは病理学的状態、またはウイルスもしくは細菌感染の存在の診断を補助する。例えば、非コーディングRNA、例えばPCA3の、Cas13d媒介性の検出は、患者尿中で検出された場合、前立腺がんを診断するために使用され得る。別の例では、胃がんのバイオマーカーであるlncRNA-AA174084のCas13d媒介性の検出は、胃がんを診断するために使用され得る。
6.標的RNAを編集する方法
一例では、RNAを標的にする方法は、標的RNAの配列の編集を生じる。例えば、突然変異していないHEPNドメインを有するCas13dタンパク質(例えば、配列番号1、3、42、62、70、82、83または92)、および標的RNAに特異的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有するgRNAを使用することによって、標的RNAは、正確な位置において切断またはニックを入れられ得る。一部の例では、かかる方法は、標的RNAの発現を減少させるために使用され、これが、対応するタンパク質の翻訳を減少させる。かかる方法は、RNAの増加した発現が所望されない細胞において使用され得る。一例では、RNAは、嚢胞性線維症、ハンチントン病、テイ・サックス病、脆弱X症候群、脆弱X関連振戦/失調症候群、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症または家族性ALSなどの疾患と関連する。別の例では、RNAは、がん(例えば、肺、乳房、結腸、肝臓、膵臓、前立腺、骨、脳、皮膚(例えば、黒色腫)または腎臓のがん)と関連する。標的RNAの例には、がんと関連するもの(例えば、PD-L1、BCR-ABL、Ras、Raf、p53、BRCA1、BRCA2、CXCR4、ベータ-カテニン、HER2およびCDK4)が含まれるがこれらに限定されない。かかる標的RNAを編集することは、治療効果を有し得る。
一例では、RNAを標的にする方法は、標的RNAの配列の編集を生じる。例えば、突然変異していないHEPNドメインを有するCas13dタンパク質(例えば、配列番号1、3、42、62、70、82、83または92)、および標的RNAに特異的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有するgRNAを使用することによって、標的RNAは、正確な位置において切断またはニックを入れられ得る。一部の例では、かかる方法は、標的RNAの発現を減少させるために使用され、これが、対応するタンパク質の翻訳を減少させる。かかる方法は、RNAの増加した発現が所望されない細胞において使用され得る。一例では、RNAは、嚢胞性線維症、ハンチントン病、テイ・サックス病、脆弱X症候群、脆弱X関連振戦/失調症候群、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症または家族性ALSなどの疾患と関連する。別の例では、RNAは、がん(例えば、肺、乳房、結腸、肝臓、膵臓、前立腺、骨、脳、皮膚(例えば、黒色腫)または腎臓のがん)と関連する。標的RNAの例には、がんと関連するもの(例えば、PD-L1、BCR-ABL、Ras、Raf、p53、BRCA1、BRCA2、CXCR4、ベータ-カテニン、HER2およびCDK4)が含まれるがこれらに限定されない。かかる標的RNAを編集することは、治療効果を有し得る。
別の例では、RNAは、免疫細胞において発現される。標的RNAは、例えば、望ましい免疫応答の抑制、例えば、腫瘍の浸潤をもたらすタンパク質をコードし得る。かかるRNAのノックダウンは、かかる望ましい免疫応答の進行を可能にし得る(例えば、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3)。別の例では、標的RNAは、例えば、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、クローン病、ループスまたは関節リウマチの状況において、免疫応答の望ましくない活性化を生じるタンパク質をコードする。
一例では、標的RNAを標的にすることは、RNAによってコードされる標的タンパク質の発現を減少させることを可能にする。例えば、突然変異したHEPNドメインを有するCas13d融合タンパク質(例えば、配列番号2または4)および翻訳抑制ドメイン(例えば、PumilioまたはFBF PUFタンパク質、デアデニラーゼ(deadenylase)、CAF1、アルゴノートタンパク質およびその他)、ならびに標的RNAに特異
的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有するガイドRNAを使用することによって、標的RNAの発現が減少され得る。
的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有するガイドRNAを使用することによって、標的RNAの発現が減少され得る。
一部の例では、Cas13dは、リボヌクレアーゼ(例えば、PINエンドヌクレアーゼドメイン、NYNドメイン、SOT1由来のSMRドメイン、またはブドウ球菌ヌクレアーゼ由来のRNaseドメイン)、またはRNA安定性に影響を与えるドメイン(例えば、トリステトラプロリン、またはUPF1、EXOSC5およびSTAU1由来のドメイン)に融合され得る。
別の例では、RNAアプタマー配列、例えば、MS2、PP7、Qβ、および他のアプタマーは、gRNA分子に付け足されか、またはその中に挿入され得る。これらのアプタマーに特異的に結合するタンパク質、例えば、MS2ファージコートタンパク質は、翻訳抑制ドメイン、リボヌクレアーゼ、またはRNA安定性に影響を与えるドメインに融合され得る。Cas13dおよびgRNA複合体は、アプタマータンパク質-エフェクタードメインを標的RNAに近接するようにガイドするので、このアプタマー-エフェクタードメイン融合物は、標的RNAを標的にするために使用され得る。
かかる方法は、RNAの増加した発現が所望されない細胞において、例えば、発現されたRNAが、嚢胞性線維症、ハンチントン病、テイ・サックス病、脆弱X症候群、脆弱X関連振戦/失調症候群、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症または家族性ALSなどの疾患と関連する場合に、使用され得る。別の例では、標的RNAは、がん(例えば、肺、乳房、結腸、肝臓、膵臓、前立腺、骨、脳、皮膚(例えば、黒色腫)または腎臓のがん)と関連する。標的RNAの例には、がんと関連するもの(例えば、PD-L1、BCR-ABL、Ras、Raf、p53、BRCA1、BRCA2、CXCR4、ベータ-カテニン、HER2およびCDK4)が含まれるがこれらに限定されない。かかる標的RNAを編集することは、治療効果を有する。
別の例では、RNAは、免疫細胞において発現される。標的RNAは、例えば、望ましい免疫応答の抑制、例えば、腫瘍の浸潤をもたらすタンパク質をコードし得る。かかるRNAのノックダウンは、かかる望ましい免疫応答の進行を可能にし得る(例えば、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3)。別の例では、標的RNAは、例えば、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、クローン病、ループスまたは関節リウマチの状況において、免疫応答の望ましくない活性化を生じるタンパク質をコードし得る。
一例では、標的RNAを標的にすることは、標的RNAの発現を活性化または増加させることを可能にする。例えば、突然変異したHEPNドメインを有するCas13d融合タンパク質(例えば、配列番号2または4)および翻訳活性化ドメイン(例えば、eIF4Eおよび他の翻訳開始因子、酵母ポリ(A)結合性タンパク質またはGLD2のドメイン)、ならびに標的RNAに特異的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有するガイドRNAを使用することによって、標的RNAの発現が増加され得る。翻訳活性化ドメインに融合された同族アプタマー結合性タンパク質を用いたgRNA中へのアプタマー導入もまた使用され得る。一例では、RNAアプタマー配列、例えば、MS2、PP7、Qβ、および他のアプタマーは、gRNA分子に付け足されるか、またはその中に挿入される。Cas13dおよびgRNA複合体は、アプタマータンパク質-翻訳活性化ドメインを標的RNAに近接させるので、翻訳活性化ドメインに融合された、これらのアプタマーに特異的に結合するタンパク質、例えば、MS2ファージコートタンパク質の導入は、標的RNAを標的にするために使用され得る。
一部の例では、かかる方法は、標的RNAの活性または発現を増加させるために使用され、これが、対応するタンパク質の翻訳を増加させる(RNAがコーディングRNAである場合)。かかる方法は、RNAの増加した発現が所望される細胞、例えば、コピー数変異によって引き起こされるヘテロ接合性遺伝性疾患または障害において使用され得る。所望のタンパク質産物の翻訳を増加させることは、事実上治療的であり得る。
別の例では、標的RNA(例えば、サイクリンB1)の発現を増加させることは、標的細胞(例えば、がん)を、薬物(例えば、化学療法剤)に対してより感受性にし得る。
一例では、標的RNAを標的にすることは、標的RNAにおける、1つまたは複数のRNA塩基置換、RNA塩基編集、RNA塩基欠失、RNA塩基挿入、またはそれらの組合せを可能にする。一部の例では、突然変異したHEPNドメインを有するCas13dタンパク質は、直接的融合またはgRNA-アプタマー改変のいずれかを介して、塩基編集を可能にするエフェクタードメイン(例えば、シチジンデアミナーゼ、PPRタンパク質、アデノシンデアミナーゼ、ADARファミリータンパク質またはAPOBECファミリータンパク質)と関連する。一部の例では、かかる方法は、RNA配列を改変するため、RNA突然変異を編集する、またはRNA転写物を改変するため(例えば、遺伝子治療)、例えば、疾患、例えば、ALSおよび黒色腫、または不要なスプライス部位によって引き起こされる遺伝性障害、例えばレーバー先天黒内障を処置するために、使用される。
一例では、標的RNAを標的にすることは、標的RNAのメチル化を可能にする。一部の例は、直接的融合またはgRNA-アプタマー改変のいずれかを介して、メチル化ドメイン(例えば、m6A)、および標的RNAに特異的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有するガイドRNAと関連した、突然変異したHEPNドメインを有するキメラCas13dタンパク質(例えば、配列番号2または4)を使用し得る。一部の例では、かかる方法は、異常なRNA脱メチル化と戦うために使用される。一例では、かかる方法は、例えば、乳がん細胞中でのそれらの安定性を減少させるために、多能性転写物、例えば、NANOGまたはKLF4のメチル化レベルを改変するために使用され、これが、増加した増殖およびがん幹細胞形成と関連する乳がん幹細胞表現型の獲得を抑制し得る。
一例では、標的RNAを標的にすることは、標的RNAの脱メチル化を可能にする。一部の例は、突然変異したHEPNドメインを有するCas13dタンパク質(例えば、配列番号2または4)、標的RNAに特異的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有するガイドRNA、および脱メチル化ドメイン(例えば、ヒトアルキル化修復ホモログ5、すなわちAlkbh5)を使用することができる。脱メチル化ドメインは、Cas13dタンパク質への直接的融合、またはgRNA-アプタマー改変のいずれかを介して、関連し得る。一部の例では、かかる方法は、m6Aレベルを減少させることによって、例えば、骨髄性白血病を処置するために、異常なRNAメチル化を逆転させるために使用される。
一例では、標的RNAを標的にすることは、標的RNAへの結合を可能にする。例えば、突然変異したHEPNドメインを有するCas13dタンパク質(例えば、配列番号2または4)および標的RNAに特異的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有するガイドRNAを使用することによって、分子は、標的RNAに結合または係留され得る。一部の例では、かかる方法は、標的RNAを捕捉するため(例えば、免疫沈降)に使用される。これは、特異的RNA転写物と相互作用するタンパク質を識別するために、キットの一部として使用され得る。一例では、エピトープタグ化Cas13d(例えば、FLAG、HA、ビオチン、HALOタグ)は、特異的標的RNAに標的化され、固定化(例えば、パラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを用いる)を介して架橋され得る。エピトープ認識抗体によるCas13dの免疫沈降は、ウエスタンブロットまたは質量分析を介した、共免疫沈降されたタンパク質の識別を可能にする。
別の例では、Cas13dは、標的RNAと相互作用するタンパク質をビオチン化するために、ビオチンリガーゼ(例えば、BirA)またはペルオキシダーゼ(例えば、APEX2)に融合され得る。次いで、標識されたタンパク質は、ストレプトアビジンビーズによってプルダウンされ、その後質量分析またはウエスタンブロットされ得る。
一部の例では、ビオチン化されたCas13dは、gRNAを用いてリボソームRNA配列に標的化され得る。ストレプトアビジンビーズ媒介性プルダウンは、RNAシーケンシングライブラリー調製のためにrRNAを枯渇させるために使用され得る。
一例では、標的RNAを標的にすることは、標的RNAのマスクを可能にする。例えば、突然変異したまたはインタクトなHEPNドメインを有するCas13dタンパク質、および標的RNAに特異的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有するガイドRNAを使用することによって、標的RNAは、RNA結合性タンパク質またはRNA結合性エレメント、例えばmiRNAからマスクされ得る。
一部の例では、Cas13dは、RNA結合性部位をRNA結合性タンパク質(RBP)からマスクするために使用され得る。別の例では、Cas13dは、miRNA結合性部位をマスクすることができる。例えば、肝臓特異的miR-122は、C型肝炎ウイルスRNAと共に、分解からそれを保護する複合体を形成する。HEPN活性なCas13dタンパク質は、miRNA-122媒介性保護を逆転させるのと同時にHCV RNAを直接分解することによって、HCV感染と相乗的に戦うために、ウイルスRNA上のmiRNA-122結合性部位に標的化され得る。一部の例では、かかる方法は、例えば、標的RNAを分解から保護するために、標的RNA分子を保存または保護するために使用される。例えば、標的遺伝子の3’UTR中のAU-リッチエレメントを標的にすることによって、HEPN突然変異したCas13dは、標的転写物の分解をもたらすRNA結合性タンパク質、例えば、トリステトラプロリン(TTR)またはAUF1の結合を遮断することができる。
一例では、標的RNAを標的にすることは、標的RNAのスプライシングを変化させることを可能にする。スプライスアクセプターおよび/またはドナー部位ならびにスプライスエフェクタードメインの直接的結合は共に、スプライシングを操作するために使用され得る。例えば、突然変異したHEPNドメインを有するCas13dタンパク質(例えば、配列番号2または4)、標的RNAに特異的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有するガイドRNA、および必要に応じて、スプライシングに影響を与えるエフェクタードメイン(例えば、SRSF1のRS-リッチドメイン、hnRNP A1のGly-リッチドメイン、RBM4のアラニン-リッチモチーフ、またはDAZAP1のプロリン-リッチモチーフ)を使用することによって、RNAの選択的スプライシングが達成され得る。
一部の例では、かかる方法は、エクソン包含のため、例えば、ポンペ病を処置するために酸性アルファ-グルコシダーゼ(GAA)のエクソン2を含むために、または脊髄性筋萎縮症(SMA)を処置するためにSMN2のエクソン7を含むために使用される。一部の例では、かかる方法は、エクソン排除のため、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するためにジストロフィンのリーディングフレームを回復させるため、またはがんを処置するために抗アポトーシス性の長いアイソフォームからアポトーシス促進性の短いアイソフォームへとBcl-xプレmRNAのスプライシングをシフトさせるために使用される。
一部の例では、方法は、スプライスアクセプターまたはドナー部位をマスクするため、例えば、コールドの腫瘍をホットにするためのネオ抗原を創出するために、突然変異したHEPNドメインを有するCas13dタンパク質を使用する。ある特定の標的プレmRNAのスプライシングに影響を与えることによって、この方法は、がん細胞におけるネオエピトープの創出をもたらし得る新規エクソン-エクソン接合部を生成することができる。これは、非天然抗原のディスプレイに起因して、がん細胞を、免疫系に対して脆弱なものにすることができる。他の例では、この方法は、アイソフォーム比を動的に操作するため、またはタンパク質(例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーについてはジストロフィン)のリーディングフレームを回復させるために使用され得る。
一例では、標的RNAを標的にすることは、標的RNAの転写物輸送の制御を可能にする。例えば、突然変異したHEPNドメインを有するCas13d融合タンパク質(例えば、配列番号2または4)および細胞内局在化シグナルまたはエクスポート配列、標的RNAに特異的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有するガイドRNAを使用することによって。一部の例では、かかる方法は、標的RNA分子を特定のオルガネラまたは細胞質ゾル区画に輸送するために、またはさらには、標的RNA転写物を、例えば、細胞外放出のためにエンドソームにエクスポートするために使用される。
別の例では、方法は、RNA輸送に影響を与え得る。例えば、ジップコード結合性タンパク質ZBP1は、線維芽細胞の前縁へのある特定の転写物の局在化をもたらすRNA配列5’-CGGAC(C/A-CA-C/U)を特異的に認識する。特定のRNAジップコードまたは調節配列を、調節タンパク質複合体による認識からマスクまたは操作することによって、この方法は、細胞内でのRNA局在化または輸送に影響を与え得る。
一例では、標的RNAは、核局在化したRNAである。例えば、核局在化シグナルに融合された、突然変異していないHEPNドメインを有するCas13dタンパク質(例えば、配列番号1、3、42、62、70、82、83および92)、および標的核RNAに特異的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有するガイドRNAを使用することによって、核局在化したRNAは、標的化または分解され得る。一部の例では、かかる方法は、標的核RNA分子を分解するため、例えば、非コーディング核RNA、例えば、乳がんにおける転移性の進行と関連するHOTAIRをノックダウンするために使用される。
一例では、標的RNAは、ウイルスRNA、またはDNAウイルスの転写物である。例えば、突然変異していないHEPNドメインを有するCas13dタンパク質(例えば、配列番号1、3、42、62、70、82、83および92)および標的RNAに特異的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有するガイドRNAが使用され得る。一部の例では、かかる方法は、例えば、ウイルスRNA、またはDNAウイルスの転写物を切断することによって、RNAウイルス感染、例えば、プラス鎖RNAウイルス、例えば、ピコルナウイルス(例えば、アフトウイルス科[例えば、口蹄疫ウイルス(FMDV)])、カルジオウイルス科;エンテロウイルス科(例えば、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルスおよびポリオウイルス);ライノウイルス科(ライノウイルス));ヘパトウイルス科(A型肝炎ウイルス);トガウイルス(その例には、風疹;アルファウイルス(例えば、西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルス)が含まれる);フラビウイルス(その例には、デングウイルス、ウエストナイルウイルスおよび日本脳炎ウイルスが含まれる);カリシウイルス科(これには、ノロウイルスおよびサポウイルスが含まれる);もしくはコロナウイルス(その例には、Urbani株などのSARSコロナウイルスが含まれる)、またはマイナス鎖RNAウイルス、例えば、オルソミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病ウイルス)およびパラミクソウイルス(その例には、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルスまたはパラインフルエンザウイルスが含まれる)による感染、あるいはDNAウイルス感染(例えば、ヘルペスウイルス(例えば、水痘帯状疱疹ウイルス、例えばOka株;サイトメガロウイルス;ならびに単純ヘルペスウイルス(HSV)1型および2型)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス1型およびアデノウイルス41型)、ポックスウイルス(例えば、ワクシニアウイルス)またはパルボウイルス(例えば、パルボウイルスB19)による感染)を処置するために使用される。したがって、かかる方法は、RNAベースの抗ウイルス薬または抗菌薬として使用され得る。
(実施例1)
材料および方法
この実施例は、実施例2~7に示される結果を得るために使用した材料および方法を記載する。
材料および方法
この実施例は、実施例2~7に示される結果を得るために使用した材料および方法を記載する。
ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞系293FTの細胞培養
ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞系293FT(Thermo Fisher)を、10%FBS(GE Life Sciences)および10mM HEPESを補充したDMEM(4.5g/Lグルコース)中で、37℃で5%CO2で維持した。80~90%コンフルエンシーに達したところで、細胞を、TrypLE Express(Life Technologies)を使用して解離させ、1:2の比で継代した。
ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞系293FT(Thermo Fisher)を、10%FBS(GE Life Sciences)および10mM HEPESを補充したDMEM(4.5g/Lグルコース)中で、37℃で5%CO2で維持した。80~90%コンフルエンシーに達したところで、細胞を、TrypLE Express(Life Technologies)を使用して解離させ、1:2の比で継代した。
ヒト骨肉腫上皮細胞系U2OSの細胞培養
ヒト骨肉腫上皮U2OSを、10%FBSおよび10mM HEPESを補充したDMEM(4.5g/Lグルコース)中で、37℃で5%CO2で維持した。70%コンフルエンスに達したところで、細胞を1:3の比で継代した。この細胞系は、認証しなかった。
ヒト骨肉腫上皮U2OSを、10%FBSおよび10mM HEPESを補充したDMEM(4.5g/Lグルコース)中で、37℃で5%CO2で維持した。70%コンフルエンスに達したところで、細胞を1:3の比で継代した。この細胞系は、認証しなかった。
誘導多能性幹細胞の維持およびニューロン分化
FTDP-17 IVS10+16突然変異を含有する安定なヒトiPSC系統または年齢および性別がマッチした対照系統を、Fen-Biao Gaoの実験室から取得した(Biswas et al., 2016)。簡潔に述べると、MAPT IVS10+16突然変異を有する1人の男性患者から取得した細胞および1人の男性対照患者由来の2つの別々の系統を、hiPSCへとリプログラムした(Almeida et al., 2012)。iPSCに、
ドキシサイクリン誘導性Ngn2カセットを含有するレンチウイルスを形質導入した。レンチウイルスプラスミドは、S.SchaferおよびF.Gageからの贈与であった。次いで、iP
SCを、Accutaseを用いて継代し、ROCK阻害剤Y-27632(10μM、Cayman)を含有するmTESR培地を有するMatrigelコーティングされた6ウェルプレート中に、1ウェル当たり500,000細胞でプレートした。1日目に、培地をmTESRに交換した。2日目に、培地を、ドキシサイクリン(2μg/ml、Sigma)を含有するmTESRに交換して、Ngn2発現を誘導した。3日目に、培養培地を、神経誘導培地(NIM、BSA(0.1mg/ml、Sigma)、アポ-トランスフェリン(0.1mg/ml、Sigma)、プトレシン(16μg/ml、Sigma)、プロゲステロン(0.0625μg/ml、Sigma)、亜セレン酸ナトリウム(0.0104μg/ml、Sigma)、インスリン(5μg/ml、Roche)、BDNF(10ng/ml、Peprotech)、SB431542(10μM、Cayman)、LDN-193189(0.1μM、Sigma)、ラミニン(2μg/ml、Life Technologies)、ドキシサイクリン(2μg/ml、Sigma)およびピューロマイシン(Life Technologies)を含有するDMEM/F12(Life Technologies))で置き換えた。NIM培地を毎日交換した。3日間のピューロマイシン選択後、未熟なニューロン細胞を、Accumax(Innovative Cell Technologies)を用いて継代し、ポリ-D-リシンおよびMatrigelでコーティングされた96ウェルプレート上に、神経成熟化培地(NMM;B27(Life Technologies)、BDNF(10ng/ml、Peprotech)、N-アセチルシステイン(Sigma)、ラミニン(2μg/ml、Life Technologies)、dbcAMP(49μg/ml、Sigma)およびドキシサイクリン(2μg/ml、Sigma)を含有する1:1 Neurobasal/DMEM(Life Technologies))中でプレートした。培地を、次の日(7日目)に、AraC(2μg/ml、Sigma)を含有するNMMで置き換えて、いずれの残りの非分化細胞をも排除した。8日目に、AraCを除去し、アストロサイトを、ニューロンの上にプレートして、hbEGF(5ng/ml、Peprotech)を含有するNMM中でのニューロン培養物を支持した。細胞に、10日目にAAVを形質導入し、24日目にアッセイした。
FTDP-17 IVS10+16突然変異を含有する安定なヒトiPSC系統または年齢および性別がマッチした対照系統を、Fen-Biao Gaoの実験室から取得した(Biswas et al., 2016)。簡潔に述べると、MAPT IVS10+16突然変異を有する1人の男性患者から取得した細胞および1人の男性対照患者由来の2つの別々の系統を、hiPSCへとリプログラムした(Almeida et al., 2012)。iPSCに、
ドキシサイクリン誘導性Ngn2カセットを含有するレンチウイルスを形質導入した。レンチウイルスプラスミドは、S.SchaferおよびF.Gageからの贈与であった。次いで、iP
SCを、Accutaseを用いて継代し、ROCK阻害剤Y-27632(10μM、Cayman)を含有するmTESR培地を有するMatrigelコーティングされた6ウェルプレート中に、1ウェル当たり500,000細胞でプレートした。1日目に、培地をmTESRに交換した。2日目に、培地を、ドキシサイクリン(2μg/ml、Sigma)を含有するmTESRに交換して、Ngn2発現を誘導した。3日目に、培養培地を、神経誘導培地(NIM、BSA(0.1mg/ml、Sigma)、アポ-トランスフェリン(0.1mg/ml、Sigma)、プトレシン(16μg/ml、Sigma)、プロゲステロン(0.0625μg/ml、Sigma)、亜セレン酸ナトリウム(0.0104μg/ml、Sigma)、インスリン(5μg/ml、Roche)、BDNF(10ng/ml、Peprotech)、SB431542(10μM、Cayman)、LDN-193189(0.1μM、Sigma)、ラミニン(2μg/ml、Life Technologies)、ドキシサイクリン(2μg/ml、Sigma)およびピューロマイシン(Life Technologies)を含有するDMEM/F12(Life Technologies))で置き換えた。NIM培地を毎日交換した。3日間のピューロマイシン選択後、未熟なニューロン細胞を、Accumax(Innovative Cell Technologies)を用いて継代し、ポリ-D-リシンおよびMatrigelでコーティングされた96ウェルプレート上に、神経成熟化培地(NMM;B27(Life Technologies)、BDNF(10ng/ml、Peprotech)、N-アセチルシステイン(Sigma)、ラミニン(2μg/ml、Life Technologies)、dbcAMP(49μg/ml、Sigma)およびドキシサイクリン(2μg/ml、Sigma)を含有する1:1 Neurobasal/DMEM(Life Technologies))中でプレートした。培地を、次の日(7日目)に、AraC(2μg/ml、Sigma)を含有するNMMで置き換えて、いずれの残りの非分化細胞をも排除した。8日目に、AraCを除去し、アストロサイトを、ニューロンの上にプレートして、hbEGF(5ng/ml、Peprotech)を含有するNMM中でのニューロン培養物を支持した。細胞に、10日目にAAVを形質導入し、24日目にアッセイした。
Cas13d識別のための計算的パイプライン
本発明者らは、2016年6月にNCBI Genomeから全ゲノム、染色体およびスキャフォールドレベルの原核生物ゲノムアセンブリを取得し、CRISPRリピートを識別するために、CRISPRfinder、PILER-CRおよびCRTを比較した。各推定CRISPRリピート周囲の20キロベースの隣接領域を抽出して、Pythonを使用して、近隣タンパク質および予測されたタンパク質を識別した。候補Casタンパク質は、>750aa長かつリピートアレイの5タンパク質以内である必要があり、抽出されたCRISPR遺伝子座は、I~III型CRISPRなどの公知のCRISPR系と関連するCas遺伝子をそれらが含有した場合、濾別した。推定エフェクターを、全て対全て(all-by-all)のBLASTp分析とその後の単リンク(single-linkage)階層的クラスタリングとを介して、ファミリーへとクラスター化し、このとき、少なくとも60のビットスコアが、クラスター割当てに必要であった。少なくとも2つのタンパク質の各クラスターを、類似性を割り当てるためにビットスコア>200を要求する、NCBI非冗長(nr)タンパク質データベースに対するBLAST検索に供した。CRISPRアレイに対する各拡張されたクラスター中の相同なタンパク質の同時出現を分析したところ、>70%であることが必要であった。タンパク質ファミリーを、平均アミノ酸長によって選別し、各クラスターについての複数の配列アライメントを、Blosum62 costマトリックスと共にClustal OmegaおよびGeneiousアライナーを使用して実施した。RxxxxH HEPNモチーフが、このアライメントに基づいて、Cas13dファミリーにおいて識別された。TBLASTNを、予測されたオープンリーディングフレーム(ORF)なしの公的メタゲノム全ゲノムショットガン配列に対する全ての予測されたCas13dエフェクターに対して実施した。Cas13dファミリーを、ゲノムおよびメタゲノムデータベースに対する毎月のBLAST検索を介して定期的にアップデートして、任意の新たに寄託された配列を識別した。新たな全長ホモログおよび相同な断片を、Clustal Omegaを使用してアラインし、PhyML 3.2を使用してクラスター化した。CRISPRDetectを使用して、Cas13dアレイ中のダイレクトリピートの方向を予測し、DRフォールディング予測を、37℃でAndronescu 2007 RNAエネルギーモデルを使用して実施した。Cas13dダイレクトリピートについての配列ロゴは、Geneious 10を使用して生成した。
本発明者らは、2016年6月にNCBI Genomeから全ゲノム、染色体およびスキャフォールドレベルの原核生物ゲノムアセンブリを取得し、CRISPRリピートを識別するために、CRISPRfinder、PILER-CRおよびCRTを比較した。各推定CRISPRリピート周囲の20キロベースの隣接領域を抽出して、Pythonを使用して、近隣タンパク質および予測されたタンパク質を識別した。候補Casタンパク質は、>750aa長かつリピートアレイの5タンパク質以内である必要があり、抽出されたCRISPR遺伝子座は、I~III型CRISPRなどの公知のCRISPR系と関連するCas遺伝子をそれらが含有した場合、濾別した。推定エフェクターを、全て対全て(all-by-all)のBLASTp分析とその後の単リンク(single-linkage)階層的クラスタリングとを介して、ファミリーへとクラスター化し、このとき、少なくとも60のビットスコアが、クラスター割当てに必要であった。少なくとも2つのタンパク質の各クラスターを、類似性を割り当てるためにビットスコア>200を要求する、NCBI非冗長(nr)タンパク質データベースに対するBLAST検索に供した。CRISPRアレイに対する各拡張されたクラスター中の相同なタンパク質の同時出現を分析したところ、>70%であることが必要であった。タンパク質ファミリーを、平均アミノ酸長によって選別し、各クラスターについての複数の配列アライメントを、Blosum62 costマトリックスと共にClustal OmegaおよびGeneiousアライナーを使用して実施した。RxxxxH HEPNモチーフが、このアライメントに基づいて、Cas13dファミリーにおいて識別された。TBLASTNを、予測されたオープンリーディングフレーム(ORF)なしの公的メタゲノム全ゲノムショットガン配列に対する全ての予測されたCas13dエフェクターに対して実施した。Cas13dファミリーを、ゲノムおよびメタゲノムデータベースに対する毎月のBLAST検索を介して定期的にアップデートして、任意の新たに寄託された配列を識別した。新たな全長ホモログおよび相同な断片を、Clustal Omegaを使用してアラインし、PhyML 3.2を使用してクラスター化した。CRISPRDetectを使用して、Cas13dアレイ中のダイレクトリピートの方向を予測し、DRフォールディング予測を、37℃でAndronescu 2007 RNAエネルギーモデルを使用して実施した。Cas13dダイレクトリピートについての配列ロゴは、Geneious 10を使用して生成した。
タンパク質発現および精製
組換えCas13dタンパク質を、培養された単離体のゲノムDNA抽出またはメタゲノム試料からPCR増幅し、N末端His-MBP融合物およびTEVプロテアーゼ切断部位を有するpETベースのベクター中にクローニングした。得られたプラスミドを、Rosetta2(DE3)細胞(Novagen)中に形質転換し、OD6000.5において200μM IPTGで誘導し、18℃で20時間成長させた。次いで、細胞をペレット化し、凍結-解凍し、1×プロテアーゼ阻害剤錠剤、1mg/mLリゾチーム、2.5U/mL Turbo DNase(Life Technologies)および2.5U/mL塩活性ヌクレアーゼ(Sigma Aldrich)を補充した溶解緩衝液(50mM HEPES、500mM NaCl、2mM MgCl2、20mMイミダゾール、1%v/v Triton X-100、1mM DTT)中に再懸濁した。次いで、溶解された試料を超音波処理し、遠心分離(4℃で18,000×gで1時間)を介して清澄化し、0.45μM PVDFフィルターで濾過し、元の細菌培養物10L当たり50mLのNi-NTA Superflow樹脂(Qiagen)と共に1時間インキュベートした。ビーズ-溶解物混合物を、クロマトグラフィーカラムにアプライし、5カラム体積の溶解緩衝液および3カラム体積の溶出緩衝液(50mM HEPES、500mM NaCl、300mMイミダゾール、0.01%v/v Triton X-100、10%グリセロール、1mM DTT)で洗浄した。次いで、試料を、カチオン交換(HiTrap SP、GE Life Sciences)およびゲル濾過(Superdex 200 16/600、GE Life Sciences)の前に、TEV切断緩衝液(50mM Tris-HCl、250mM KCl、7.5%v/vグリセロール、0.2mM TCEP、0.8mM DTT、TEVプロテアーゼ)中に一晩透析した。精製され溶出されたタンパク質画分をプールし、タンパク質貯蔵緩衝液(50mM Tris-HCl、1M NaCl、10%グリセロール、2mM DTT)中4mg/mLで凍結させた。
組換えCas13dタンパク質を、培養された単離体のゲノムDNA抽出またはメタゲノム試料からPCR増幅し、N末端His-MBP融合物およびTEVプロテアーゼ切断部位を有するpETベースのベクター中にクローニングした。得られたプラスミドを、Rosetta2(DE3)細胞(Novagen)中に形質転換し、OD6000.5において200μM IPTGで誘導し、18℃で20時間成長させた。次いで、細胞をペレット化し、凍結-解凍し、1×プロテアーゼ阻害剤錠剤、1mg/mLリゾチーム、2.5U/mL Turbo DNase(Life Technologies)および2.5U/mL塩活性ヌクレアーゼ(Sigma Aldrich)を補充した溶解緩衝液(50mM HEPES、500mM NaCl、2mM MgCl2、20mMイミダゾール、1%v/v Triton X-100、1mM DTT)中に再懸濁した。次いで、溶解された試料を超音波処理し、遠心分離(4℃で18,000×gで1時間)を介して清澄化し、0.45μM PVDFフィルターで濾過し、元の細菌培養物10L当たり50mLのNi-NTA Superflow樹脂(Qiagen)と共に1時間インキュベートした。ビーズ-溶解物混合物を、クロマトグラフィーカラムにアプライし、5カラム体積の溶解緩衝液および3カラム体積の溶出緩衝液(50mM HEPES、500mM NaCl、300mMイミダゾール、0.01%v/v Triton X-100、10%グリセロール、1mM DTT)で洗浄した。次いで、試料を、カチオン交換(HiTrap SP、GE Life Sciences)およびゲル濾過(Superdex 200 16/600、GE Life Sciences)の前に、TEV切断緩衝液(50mM Tris-HCl、250mM KCl、7.5%v/vグリセロール、0.2mM TCEP、0.8mM DTT、TEVプロテアーゼ)中に一晩透析した。精製され溶出されたタンパク質画分をプールし、タンパク質貯蔵緩衝液(50mM Tris-HCl、1M NaCl、10%グリセロール、2mM DTT)中4mg/mLで凍結させた。
ガイドおよび標的RNAの調製
T7プロモーターおよび適切な下流配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し(IDT)、crRNAについてはアンチセンスT7オリゴとアニーリングさせ、標的およびアレイ鋳型についてはPCR増幅した。ホモポリマー標的RNAを、Synthegoによって合成した。オリゴアニールおよびPCR鋳型を、Hiscribe T7 High Yield RNA Synthesisキット(New England Biolabs)を用いて31℃で12時間in vitroで転写した。標識された標的について、蛍光標識されたアミノアリル-UTP atto 680(Jena Biosciences)を、2mMでさらに添加した。ガイドRNAを、RNA-grade Agencourt AMPure XPビーズ(Beckman Coulter)を用いて精製し、アレイおよび標的を、MEGAclear Transcription Clean-Up Kit(Thermo Fisher)を用いて精製し、-80℃で凍結した。ssDNAおよびdsDNA標的について、対応するオリゴヌクレオチド配列を合成し(IDT)、ゲル精製またはPCR増幅し、次いで、それぞれ引き続いてゲル精製した。
T7プロモーターおよび適切な下流配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し(IDT)、crRNAについてはアンチセンスT7オリゴとアニーリングさせ、標的およびアレイ鋳型についてはPCR増幅した。ホモポリマー標的RNAを、Synthegoによって合成した。オリゴアニールおよびPCR鋳型を、Hiscribe T7 High Yield RNA Synthesisキット(New England Biolabs)を用いて31℃で12時間in vitroで転写した。標識された標的について、蛍光標識されたアミノアリル-UTP atto 680(Jena Biosciences)を、2mMでさらに添加した。ガイドRNAを、RNA-grade Agencourt AMPure XPビーズ(Beckman Coulter)を用いて精製し、アレイおよび標的を、MEGAclear Transcription Clean-Up Kit(Thermo Fisher)を用いて精製し、-80℃で凍結した。ssDNAおよびdsDNA標的について、対応するオリゴヌクレオチド配列を合成し(IDT)、ゲル精製またはPCR増幅し、次いで、それぞれ引き続いてゲル精製した。
生化学的切断反応
精製されたEsCas13dタンパク質およびガイドRNAを、RNA切断緩衝液(25mM Tris pH7.5、15mM Tris pH7.0、1mM DTT、6mM MgCl2)中に2:1のモル比で混合した(特記しない限り)。反応物を、氷上で調製し、37℃で15分間インキュベートし、その後、EsCas13dに対して1:2のモル比で標的を添加した。引き続いて、反応物を、37℃で45分間インキュベートし、1μLの酵素停止溶液(10mg/mLプロテイナーゼK、4M尿素、80mM EDTA、20mM Tris pH8.0)で37℃で15分間クエンチした。次いで、反応物を、2×RNAローディング緩衝液(2×:13mM Ficoll、8M尿素、25mM EDTA)で85℃で10分間変性させ、10%TBE-尿素ゲル(Life
Technologies)上で分離した。標識された標的を含有するゲルを、Odyssey Imager(Li-Cor)で視覚化した;未標識のアレイまたは標的切断ゲルを、SYBR Goldで染色し、その後、Gel Doc EZシステム(Bio-Rad)を介してイメージングした。
精製されたEsCas13dタンパク質およびガイドRNAを、RNA切断緩衝液(25mM Tris pH7.5、15mM Tris pH7.0、1mM DTT、6mM MgCl2)中に2:1のモル比で混合した(特記しない限り)。反応物を、氷上で調製し、37℃で15分間インキュベートし、その後、EsCas13dに対して1:2のモル比で標的を添加した。引き続いて、反応物を、37℃で45分間インキュベートし、1μLの酵素停止溶液(10mg/mLプロテイナーゼK、4M尿素、80mM EDTA、20mM Tris pH8.0)で37℃で15分間クエンチした。次いで、反応物を、2×RNAローディング緩衝液(2×:13mM Ficoll、8M尿素、25mM EDTA)で85℃で10分間変性させ、10%TBE-尿素ゲル(Life
Technologies)上で分離した。標識された標的を含有するゲルを、Odyssey Imager(Li-Cor)で視覚化した;未標識のアレイまたは標的切断ゲルを、SYBR Goldで染色し、その後、Gel Doc EZシステム(Bio-Rad)を介してイメージングした。
ヒト細胞系の一過的トランスフェクション 操作されたCas13コード配列を、EF1aプロモーターを含有する規格化されたプラスミド発現骨格中にクローニングし、製造業者のプロトコールに従ってNucleobond Xtra Midi EF Kit(Machery Nagel)を使用して調製した。NLS-LwaCas13a-msfGFPおよびPspCas13b-NES-HIVを、それぞれ、Feng Zhangからの贈与であるAddgene #10385
4および#103862からPCR増幅した。Cas13dプレgRNAおよびgRNAを、U6プロモーターを含有する最小の骨格中にクローニングした。LwaCas13aについてのshRNAおよびガイドを、同じ骨格中にクローニングし、標的配列の3’においてそれらの対応するガイドRNAに位置をマッチさせた。PspCas13bについてのマッチしたgRNAを、最も近い5’-Gヌクレオチドに移動させた。
4および#103862からPCR増幅した。Cas13dプレgRNAおよびgRNAを、U6プロモーターを含有する最小の骨格中にクローニングした。LwaCas13aについてのshRNAおよびガイドを、同じ骨格中にクローニングし、標的配列の3’においてそれらの対応するガイドRNAに位置をマッチさせた。PspCas13bについてのマッチしたgRNAを、最も近い5’-Gヌクレオチドに移動させた。
一過的トランスフェクションのために、HEK293FT細胞を、96ウェルプレート中に1ウェル当たり20,000細胞の密度でプレートし、製造業者のプロトコールに従ってLipofectamine 2000(Life Technologies)を使用して、>90%コンフルエンスにおいて、200ngのCas13発現プラスミドおよび200ngのgRNA発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、フローサイトメトリー、遺伝子発現分析または他の下流のプロセシングのために、トランスフェクションの48~72時間後に収集した。
レポーターアッセイのために、HEK293FT細胞に、Lipofectamine
2000(Life Technologies)を用いて、192ngのCas13d発現プラスミド、192ngのガイド発現プラスミドおよび12ngのmCherry発現プラスミドを、96ウェルフォーマットでトランスフェクトした。細胞を、48時間後に収集し、フローサイトメトリーによって分析した。
2000(Life Technologies)を用いて、192ngのCas13d発現プラスミド、192ngのガイド発現プラスミドおよび12ngのmCherry発現プラスミドを、96ウェルフォーマットでトランスフェクトした。細胞を、48時間後に収集し、フローサイトメトリーによって分析した。
U2OS細胞を、96ウェルプレート中に1ウェル当たり20,000細胞の密度でプレートし、製造業者のプロトコールに従ってLipofectamine 3000(Life Technologies)を使用して、>90%コンフルエンスにおいて、100ngのCas13d発現プラスミドをトランスフェクトし、48時間後に免疫細胞化学のためにプロセシングした。
フローサイトメトリー
細胞を、トランスフェクションの48時間後にTrypLE Expressを用いて解離させ、FACS緩衝液(1×DPBS-/-、0.2%BSA、2mM EDTA)中に再懸濁した。フローサイトメトリーを、MACSQuant VYB(Miltenyi Biotec)を使用して96ウェルプレートフォーマットで実施し、FlowJo 10を使用して分析した。RG6は、Thomas Cooperからの贈与であり(Addgeneプラスミド#80167)、EGFPをmTagBFP2で置き換えるように改変した。示された全ての試料を、3つの生物学的複製でアッセイした。mCherryレポーターアッセイでは、データは、1つの条件当たり少なくとも20,000個のゲートされた事象を示す。スプライシングレポーターアッセイでは、データは、1つの条件当たり少なくとも2,500個のゲートされた事象を示す。
細胞を、トランスフェクションの48時間後にTrypLE Expressを用いて解離させ、FACS緩衝液(1×DPBS-/-、0.2%BSA、2mM EDTA)中に再懸濁した。フローサイトメトリーを、MACSQuant VYB(Miltenyi Biotec)を使用して96ウェルプレートフォーマットで実施し、FlowJo 10を使用して分析した。RG6は、Thomas Cooperからの贈与であり(Addgeneプラスミド#80167)、EGFPをmTagBFP2で置き換えるように改変した。示された全ての試料を、3つの生物学的複製でアッセイした。mCherryレポーターアッセイでは、データは、1つの条件当たり少なくとも20,000個のゲートされた事象を示す。スプライシングレポーターアッセイでは、データは、1つの条件当たり少なくとも2,500個のゲートされた事象を示す。
遺伝子発現分析
細胞を、トランスフェクションの48時間後に、DTTを補充したRLT緩衝液で溶解させ、総RNAを、RNeasy Mini Plusカラム(Qiagen)を使用して抽出した。次いで、200ngの総RNAを、ランダムヘキサマープライマーおよびRevertaid Reverse Transcriptase(Thermo Fisher)を使用して、25℃で10分間、37℃で60分間および95℃で5分間逆転写し、その後、2×Taqman Fast Advanced Master Mix(Life Technologies)ならびに必要に応じてGAPDHおよび標的遺伝子に対するTaqmanプローブ(Life TechnologiesおよびIDT)を使用してqPCRを行った。Taqmanプローブおよびプライマーセットは一般に、Cas13またはshRNA標的部位位置にわたってcDNAを増幅するように選択して、切断された転写物断片の検出を防止した(その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Konermann et al., Cell 173:1-12, 2018の表S4を参照のこと)。qPCRを、LightCycler 480 Instrument II(Roche)を使用して、5μLの多重化反応および384ウェルフォーマットで実施した。倍数の変化を、ddCt法を使用して、GFPトランスフェクトしたビヒクル対照と比較して計算した。多重比較補正を用いた一元配置または二元配置ANOVAを使用して、Prism 7を使用して転写物変化の統計的有意性を評価した。
細胞を、トランスフェクションの48時間後に、DTTを補充したRLT緩衝液で溶解させ、総RNAを、RNeasy Mini Plusカラム(Qiagen)を使用して抽出した。次いで、200ngの総RNAを、ランダムヘキサマープライマーおよびRevertaid Reverse Transcriptase(Thermo Fisher)を使用して、25℃で10分間、37℃で60分間および95℃で5分間逆転写し、その後、2×Taqman Fast Advanced Master Mix(Life Technologies)ならびに必要に応じてGAPDHおよび標的遺伝子に対するTaqmanプローブ(Life TechnologiesおよびIDT)を使用してqPCRを行った。Taqmanプローブおよびプライマーセットは一般に、Cas13またはshRNA標的部位位置にわたってcDNAを増幅するように選択して、切断された転写物断片の検出を防止した(その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Konermann et al., Cell 173:1-12, 2018の表S4を参照のこと)。qPCRを、LightCycler 480 Instrument II(Roche)を使用して、5μLの多重化反応および384ウェルフォーマットで実施した。倍数の変化を、ddCt法を使用して、GFPトランスフェクトしたビヒクル対照と比較して計算した。多重比較補正を用いた一元配置または二元配置ANOVAを使用して、Prism 7を使用して転写物変化の統計的有意性を評価した。
免疫組織化学
免疫組織化学的分析のために、U2OS細胞を、96ウェルの光学的に透明なプレート(Greiner Bio-One)上で培養し、以前に記載されたようにトランスフェクトし、次いで、PBS(Gibco)中に希釈した4%PFA(Electron Microscopy Sciences)中で固定し、PBS中0.3Mのグリシン(Sigma)で洗浄して、PFAをクエンチした。試料をブロッキングし、8%ロバ血清(Jackson ImmunoResearch)、8%ヤギ血清(Cell Signaling Technologies)および0.3%Triton-X 100(Sigma)を含有するPBS溶液中で1時間透過処理し、その後、1%BSA(Fisher Bioreagents)、1%ヤギ血清および0.25%Triton-X中で4℃で一晩の一次抗体インキュベーションを行った。試料を、0.1%BSAおよび0.1%Triton-X 100を含有するPBSで3回洗浄し、その後、0.05%Triton-X 100および1%BSAを含むPBS中でフルオロフォアコンジュゲートした二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。細胞を、0.1%Triton-Xを含むPBSで洗浄し、DAPIで染色し、次いで、Mounting Media(Ibidi)で覆って、その後イメージングした。一次抗体であるHA-タグ6E2(Cell Signaling、2367)を、製造業者の使用説明書に従って1:100希釈で使用した。使用した二次抗体は、ヤギ抗マウスIgG1-Alexa-Fluor
647(Thermo Fisher、A21240)および抗マウスIgG1 CF
633(Sigma、SAB4600335)であった。共焦点画像を、Zeiss Airyscan LSM 880を使用して撮影し、その後、Zen 2.3(Zeiss)で画像処理した。
免疫組織化学的分析のために、U2OS細胞を、96ウェルの光学的に透明なプレート(Greiner Bio-One)上で培養し、以前に記載されたようにトランスフェクトし、次いで、PBS(Gibco)中に希釈した4%PFA(Electron Microscopy Sciences)中で固定し、PBS中0.3Mのグリシン(Sigma)で洗浄して、PFAをクエンチした。試料をブロッキングし、8%ロバ血清(Jackson ImmunoResearch)、8%ヤギ血清(Cell Signaling Technologies)および0.3%Triton-X 100(Sigma)を含有するPBS溶液中で1時間透過処理し、その後、1%BSA(Fisher Bioreagents)、1%ヤギ血清および0.25%Triton-X中で4℃で一晩の一次抗体インキュベーションを行った。試料を、0.1%BSAおよび0.1%Triton-X 100を含有するPBSで3回洗浄し、その後、0.05%Triton-X 100および1%BSAを含むPBS中でフルオロフォアコンジュゲートした二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。細胞を、0.1%Triton-Xを含むPBSで洗浄し、DAPIで染色し、次いで、Mounting Media(Ibidi)で覆って、その後イメージングした。一次抗体であるHA-タグ6E2(Cell Signaling、2367)を、製造業者の使用説明書に従って1:100希釈で使用した。使用した二次抗体は、ヤギ抗マウスIgG1-Alexa-Fluor
647(Thermo Fisher、A21240)および抗マウスIgG1 CF
633(Sigma、SAB4600335)であった。共焦点画像を、Zeiss Airyscan LSM 880を使用して撮影し、その後、Zen 2.3(Zeiss)で画像処理した。
細菌小RNAシーケンシングおよび分析
E.coli DH5α細胞に、無培養Ruminococcus sp.株に由来するCRISPR-Cas13d遺伝子座を有するpACYC184を形質転換した。細胞を、定常期に収集し、PBS中ですすぎ、TRIzol(Life Technologies)中に再懸濁し、0.1mmシリカビーズを含有するLysing Matrix
B管(MP Biomedicals)に移し、3回の30秒サイクルでBead Mill 24(Fisher Scientific)でホモジナイズした。総RNAを、フェノール-クロロホルム抽出によって単離し、次いで、DirectZol Miniprep Kit(Zymo Research)を使用して精製した。RNA品質を、Agilent 2200 Tapestationとその後のTurbo DNase処理(Ambion)とで評価した。総RNAを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(NEB)で処理し、細菌用Ribo-Zero rRNA Removal Kit(Illumina)を使用して、rRNA枯渇させた。RNAを、RNA 5’ポリホスファターゼで処理し、E.coliポリ(A)ポリメラーゼでポリ(A)テイル付加し、T4
RNAリガーゼ1(NEB)を使用して5’RNAシーケンシングアダプターとライゲーションさせた。cDNAを、オリゴ-dTプライマーおよびM-MLV RT/RNase Block(AffinityScript、Agilent)を使用する逆転写を介して生成し、その後、PCR増幅し、バーコード化した。得られたライブラリーを、Illumina MiSeqでシーケンシングし、カスタムPythonスクリプトを使用して逆多重化し、Bowtie 2を使用してCas13d CRISPR遺伝子座に対してアラインした。アライメントを、Geneiousで視覚化した。
E.coli DH5α細胞に、無培養Ruminococcus sp.株に由来するCRISPR-Cas13d遺伝子座を有するpACYC184を形質転換した。細胞を、定常期に収集し、PBS中ですすぎ、TRIzol(Life Technologies)中に再懸濁し、0.1mmシリカビーズを含有するLysing Matrix
B管(MP Biomedicals)に移し、3回の30秒サイクルでBead Mill 24(Fisher Scientific)でホモジナイズした。総RNAを、フェノール-クロロホルム抽出によって単離し、次いで、DirectZol Miniprep Kit(Zymo Research)を使用して精製した。RNA品質を、Agilent 2200 Tapestationとその後のTurbo DNase処理(Ambion)とで評価した。総RNAを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(NEB)で処理し、細菌用Ribo-Zero rRNA Removal Kit(Illumina)を使用して、rRNA枯渇させた。RNAを、RNA 5’ポリホスファターゼで処理し、E.coliポリ(A)ポリメラーゼでポリ(A)テイル付加し、T4
RNAリガーゼ1(NEB)を使用して5’RNAシーケンシングアダプターとライゲーションさせた。cDNAを、オリゴ-dTプライマーおよびM-MLV RT/RNase Block(AffinityScript、Agilent)を使用する逆転写を介して生成し、その後、PCR増幅し、バーコード化した。得られたライブラリーを、Illumina MiSeqでシーケンシングし、カスタムPythonスクリプトを使用して逆多重化し、Bowtie 2を使用してCas13d CRISPR遺伝子座に対してアラインした。アライメントを、Geneiousで視覚化した。
Ngn2レンチウイルス調製
低継代HEK293FT細胞に、プレーティングの間にDMEM+10%FBS培地中で、Polyethylenimine Max(PEI、Polysciences)ならびにNgn2標的プラスミド+pMDG.2およびpsPAX2パッケージングプラスミド(Didier Tronoからの贈与、Addgene #12259および#12260
)をトランスフェクトした。次の日、培地を、無血清の化学的に規定された最小培地(Glutamaxを補充したUltraculture、Lonza)に交換した。ウイルス上清を48時間後に収集し、0.45ミクロンPVDFフィルター(Millipore)を介して清澄化し、超遠心分離を使用して濃縮した。
低継代HEK293FT細胞に、プレーティングの間にDMEM+10%FBS培地中で、Polyethylenimine Max(PEI、Polysciences)ならびにNgn2標的プラスミド+pMDG.2およびpsPAX2パッケージングプラスミド(Didier Tronoからの贈与、Addgene #12259および#12260
)をトランスフェクトした。次の日、培地を、無血清の化学的に規定された最小培地(Glutamaxを補充したUltraculture、Lonza)に交換した。ウイルス上清を48時間後に収集し、0.45ミクロンPVDFフィルター(Millipore)を介して清澄化し、超遠心分離を使用して濃縮した。
AAV調製
低継代HEK293FT細胞に、プレーティングの間にDMEM+10%FBS培地中で、Polyethylenimine Max(PEI、Polysciences)ならびにAAV標的プラスミド+AAV1血清型およびpAdDeltaF6ヘルパーパッケージングプラスミド(UPenn Vector Core)をトランスフェクトした。次の日、培地の60%を、化学的に規定された最小培地(Glutamaxを補充したUltraculture、Lonza)に交換した。48時間後、AAV含有上清を収集し、0.45μm PVDFフィルター(Millipore)を介して清澄化し、製造業者のプロトコールに従うポリエチレングリコール(PEGウイルス沈殿キット#K904、Biovision)による沈殿を使用して濃縮した。
低継代HEK293FT細胞に、プレーティングの間にDMEM+10%FBS培地中で、Polyethylenimine Max(PEI、Polysciences)ならびにAAV標的プラスミド+AAV1血清型およびpAdDeltaF6ヘルパーパッケージングプラスミド(UPenn Vector Core)をトランスフェクトした。次の日、培地の60%を、化学的に規定された最小培地(Glutamaxを補充したUltraculture、Lonza)に交換した。48時間後、AAV含有上清を収集し、0.45μm PVDFフィルター(Millipore)を介して清澄化し、製造業者のプロトコールに従うポリエチレングリコール(PEGウイルス沈殿キット#K904、Biovision)による沈殿を使用して濃縮した。
RNA-seqライブラリー調製およびシーケンシング
トランスフェクションの48時間後、総RNAを、QiagenのRNeasy Plus Miniキットを使用して293FT細胞から抽出した。標準的なmRNAライブラリーを、New England BiolabsのNEBNext II Ultra Directional RNA Library Prep Kit(Cat#E7760S)を使用して調製し、42ntのペアードエンド読み取りを用いてIllumina NextSeq500でシーケンシングした。1つの条件当たり約15Mの総読み取りを逆多重化した。
トランスフェクションの48時間後、総RNAを、QiagenのRNeasy Plus Miniキットを使用して293FT細胞から抽出した。標準的なmRNAライブラリーを、New England BiolabsのNEBNext II Ultra Directional RNA Library Prep Kit(Cat#E7760S)を使用して調製し、42ntのペアードエンド読み取りを用いてIllumina NextSeq500でシーケンシングした。1つの条件当たり約15Mの総読み取りを逆多重化した。
RNA-seq分析
シーケンシングされた読み取りを、FASTQCを使用して品質試験し、2.5.1b
STARアライナー(Dobin et al., 2013)を使用して、hg19ヒトゲノムに対
してアラインした。マッピングを、デフォルトパラメーター(読み取り1つ当たり最大10個のミスマッチ、および読み取り1つ当たり最大9個のマルチマッピング位置)を使用して実施した。ゲノムインデックスを、hg19 Illumina iGenomesコレクション(Illumina)により提供される遺伝子アノテーションおよび100のsjdbOverhang値を使用して構築した。独自にマッピングされた読み取りを、HOMER分析スイート(Heinz et al., 2010)を用いて、遺伝子発現の代理とし
て最も多く発現されたアイソフォームを使用して全ての遺伝子エクソンにわたって定量し、三連を使用し、DESeq2 v 1.14.1(Love et al., 2014)を用いて差次的遺伝子発現を実施して、群内分散を計算し、対比させて標的化条件と非標的化条件とを比較した。顕著な差次的に発現された遺伝子を、偽発見率(FDR)<0.01およびlog2倍数の変化>0.75を有すると定義した。Volcanoプロットを、含まれたプロッティングライブラリーおよびscales 0.5.0パッケージからのアルファ()色関数を使用して、R 3.3.2で生成した。
シーケンシングされた読み取りを、FASTQCを使用して品質試験し、2.5.1b
STARアライナー(Dobin et al., 2013)を使用して、hg19ヒトゲノムに対
してアラインした。マッピングを、デフォルトパラメーター(読み取り1つ当たり最大10個のミスマッチ、および読み取り1つ当たり最大9個のマルチマッピング位置)を使用して実施した。ゲノムインデックスを、hg19 Illumina iGenomesコレクション(Illumina)により提供される遺伝子アノテーションおよび100のsjdbOverhang値を使用して構築した。独自にマッピングされた読み取りを、HOMER分析スイート(Heinz et al., 2010)を用いて、遺伝子発現の代理とし
て最も多く発現されたアイソフォームを使用して全ての遺伝子エクソンにわたって定量し、三連を使用し、DESeq2 v 1.14.1(Love et al., 2014)を用いて差次的遺伝子発現を実施して、群内分散を計算し、対比させて標的化条件と非標的化条件とを比較した。顕著な差次的に発現された遺伝子を、偽発見率(FDR)<0.01およびlog2倍数の変化>0.75を有すると定義した。Volcanoプロットを、含まれたプロッティングライブラリーおよびscales 0.5.0パッケージからのアルファ()色関数を使用して、R 3.3.2で生成した。
統計学
全ての値を、適切な図の説明文中に示されるように、平均±SDまたは平均±SEMとして報告する。2つの群を比較するために、片側スチューデントt検定を使用し、統計的有意性を、アルファ=0.05を用いてHolm-Sidak法を使用して決定した。テューキーの多重仮説補正と共に一元配置ANOVAを使用して、2つよりも多い群間の有意性を評価した。2つの因子(すなわち、RNA標的化モダリティおよびガイド位置)にわたって比較する場合、二元配置ANOVAを使用し、Sidakの多重比較検定による多重仮説補正のために調整した。ダゴスティーノおよびピアソンの正規性検定により正規分布の仮定を満たさないことが見出された群を比較するために、ダンの多重比較調整を用いたノンパラメトリックフリードマン検定を実施した。PRISM 7.0を、全ての統計分析に使用した。試料サイズは、事前に決定しなかった。少なくとも3つの生物学的複製を、各図において具体的に示されるように、各実験に使用した。
全ての値を、適切な図の説明文中に示されるように、平均±SDまたは平均±SEMとして報告する。2つの群を比較するために、片側スチューデントt検定を使用し、統計的有意性を、アルファ=0.05を用いてHolm-Sidak法を使用して決定した。テューキーの多重仮説補正と共に一元配置ANOVAを使用して、2つよりも多い群間の有意性を評価した。2つの因子(すなわち、RNA標的化モダリティおよびガイド位置)にわたって比較する場合、二元配置ANOVAを使用し、Sidakの多重比較検定による多重仮説補正のために調整した。ダゴスティーノおよびピアソンの正規性検定により正規分布の仮定を満たさないことが見出された群を比較するために、ダンの多重比較調整を用いたノンパラメトリックフリードマン検定を実施した。PRISM 7.0を、全ての統計分析に使用した。試料サイズは、事前に決定しなかった。少なくとも3つの生物学的複製を、各図において具体的に示されるように、各実験に使用した。
本明細書で報告されるシーケンシングデータは、GEO Series受託番号GSE108519の下でNCBI Gene Expression Omnibus中に見出すことができる。
配列などの、使用される材料および方法に関するさらなる詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるKonermann et al., Cell 173:1-12, 2018中に見出すことができる。
(実施例2)
VI型様Casリボヌクレアーゼファミリーの計算的識別
この実施例は、クラス2 CRISPR-Cas遺伝子座のための計算的パイプラインを開発することによって、以前に検出されていないかまたは特徴付けられていないRNA標的化CRISPR-Cas系を識別するために使用される方法を記載し、これは、CRISPR干渉のための単一のヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cas12a(以前にはCpf1)またはCas13a(以前にはC2c2)のみを必要とする(Makarova et al., 2015; Shmakov et al., 2015)。スペーサー獲得に関与する保存されたCas遺伝子のセットを発見することに焦点を当てたCRISPR系の生物情報学的マイニングのための以前の戦略(Shmakov et al., 2015)を改善するために、CRISPR遺伝
子座についての最低限の要件が、CRISPRリピートアレイおよび近隣エフェクターヌクレアーゼの存在であると定義された。検索アンカーとしてCRISPRアレイを使用して、全ての原核生物ゲノムアセンブリおよびスキャフォールドをNCBI WGSデータベースから取得し、アルゴリズムをde novo CRISPRアレイ検出(Bland et al., 2007; Edgar, 2007; Grissa et al., 2007)に適応させて、21,17
5個の推定CRISPRリピートアレイを識別した(図1A)。
VI型様Casリボヌクレアーゼファミリーの計算的識別
この実施例は、クラス2 CRISPR-Cas遺伝子座のための計算的パイプラインを開発することによって、以前に検出されていないかまたは特徴付けられていないRNA標的化CRISPR-Cas系を識別するために使用される方法を記載し、これは、CRISPR干渉のための単一のヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cas12a(以前にはCpf1)またはCas13a(以前にはC2c2)のみを必要とする(Makarova et al., 2015; Shmakov et al., 2015)。スペーサー獲得に関与する保存されたCas遺伝子のセットを発見することに焦点を当てたCRISPR系の生物情報学的マイニングのための以前の戦略(Shmakov et al., 2015)を改善するために、CRISPR遺伝
子座についての最低限の要件が、CRISPRリピートアレイおよび近隣エフェクターヌクレアーゼの存在であると定義された。検索アンカーとしてCRISPRアレイを使用して、全ての原核生物ゲノムアセンブリおよびスキャフォールドをNCBI WGSデータベースから取得し、アルゴリズムをde novo CRISPRアレイ検出(Bland et al., 2007; Edgar, 2007; Grissa et al., 2007)に適応させて、21,17
5個の推定CRISPRリピートアレイを識別した(図1A)。
各CRISPRアレイに隣接する最大20キロベース(kb)のゲノムDNA配列を抽出して、直ぐ近傍にある予測されたタンパク質コード遺伝子を識別した。Cas12aおよびCas13aを除いて、Cas3またはCas9などの、公知のクラス1およびクラス2 CRISPR-Cas系のシグネチャー遺伝子を含有する候補遺伝子座を、さらなる分析から排除して、パイプラインがこれらの公知のクラス2エフェクターファミリーを検出しクラスター化する能力を判断した。新たなクラス2 Casエフェクターを識別するために、候補タンパク質は、>750残基長かつリピートアレイの5タンパク質コード遺伝子内であることが必要であったが、これは、CRISPRリピートと密接に関連する大きいタンパク質が、公知の単一エフェクターの重要な特徴だからである。得られたタンパク質を、相同性に基づいて、単リンク階層的クラスタリングを使用して408個の推定タンパク質ファミリーへと分類した。
ゲノム中の確率または全体的存在量に起因して、CRISPRアレイに密接に近接して存在するタンパク質クラスターを切り捨てるために、各クラスターに対するさらなる相同タンパク質を、NCBI非冗長タンパク質データベースおよび決定されたCRISPRアレイに対するそれらの近接性から識別した。真のCas遺伝子はCRISPRリピートとの高い同時出現率を有すると考えると、各拡張されたクラスターについてのタンパク質の>70%が、CRISPRリピートの20kb以内に存在する必要があった。これらの残りのタンパク質ファミリーを、ヌクレアーゼドメインおよびモチーフについて分析した。
最近記載されたCas13b系(Smargon et al., 2017)を含む候補のうち、2つ
の予測されたHEPNリボヌクレアーゼモチーフ(Anantharaman et al., 2013)を含有する候補CRISPR関連リボヌクレアーゼをコードする特徴付けられていない推定クラス2 CRISPR-Cas系のファミリーを識別した(図2A)。重要なことに、これらは、今日までに記載された最も小さいクラス2 CRISPRエフェクター(約930aa)の中にある。VI型CRISPR-Cas13スーパーファミリーは、配列が多様な単一エフェクターシグネチャーヌクレアーゼ、および2つのHEPNドメインの存在によって実証される。これら2つのRxxxxH HEPNモチーフ(図3A)以外では、候補エフェクターは、以前に記載されたCas13酵素に対する顕著な配列類似性を有さず、したがって、このファミリーの推定CRISPRリボヌクレアーゼは、VI型Cas13dまたはVI型-Dと呼ばれる(図3B)。
の予測されたHEPNリボヌクレアーゼモチーフ(Anantharaman et al., 2013)を含有する候補CRISPR関連リボヌクレアーゼをコードする特徴付けられていない推定クラス2 CRISPR-Cas系のファミリーを識別した(図2A)。重要なことに、これらは、今日までに記載された最も小さいクラス2 CRISPRエフェクター(約930aa)の中にある。VI型CRISPR-Cas13スーパーファミリーは、配列が多様な単一エフェクターシグネチャーヌクレアーゼ、および2つのHEPNドメインの存在によって実証される。これら2つのRxxxxH HEPNモチーフ(図3A)以外では、候補エフェクターは、以前に記載されたCas13酵素に対する顕著な配列類似性を有さず、したがって、このファミリーの推定CRISPRリボヌクレアーゼは、VI型Cas13dまたはVI型-Dと呼ばれる(図3B)。
CRISPR-Cas13d系は、腸常在微生物に由来するので、本発明者らは、最近の大規模マイクロバイオームシーケンシングの試みにより、アライメントを介してCas13dファミリーをメタゲノムコンティグに拡張しようとした。予測されたオープンリーディングフレーム(ORF)なしの公的メタゲノム配列に対するCas13dタンパク質の比較により、いくつかの別個の分岐でクラスター化する、さらなる全長系ならびに複数のエフェクターおよびアレイ断片を識別した(図1B)。Cas13dタンパク質ファミリーの異なる分岐から、全長Cas13dオルソログタンパク質および遺伝子座を生成するために、ゲノムDNA試料を、関連するアセンブリおよび実施された標的化されたSangerシーケンシングから取得し、例えば、メタゲノムオルソログ「嫌気性消化器メタゲノム」(Adm)(Treu et al., 2016)について、不完全なシーケンシング適用範囲に起因するギャップを埋めた。
Cas13d CRISPR遺伝子座は、Ruminococcus属の良性グラム陽性腸内細菌内で大部分がクラスター化されており、CRISPR遺伝子座アーキテクチャーの驚くべき多様性を示す(図2A)。メタゲノムAdmCas13d系を除いて、Cas13d系は、それらのCRISPR遺伝子座内の重要なスペーサー獲得タンパク質Cas1を欠いており(Yosef et al., 2012)、これは、Cas1遺伝子もCas2遺伝
子も要求しないクラス2 CRISPR発見パイプラインの有用性を強調している。Cas13dダイレクトリピート(DR)は、長さおよび予測された二次構造において高度に保存されており(図3C)、36ntの長さ、A/U-リッチループを有する8~10ntのステム、およびダイレクトリピートの3’末端における5’-AAAACモチーフを有する(図3D)。この保存された5’-AAAACモチーフは、II型Cas1/2スペーサー獲得複合体によって特異的に認識されることが示されている(Wright and Doudna, 2016)。実際、Cas1は、一部のCas13d系に対して相対的に近接して見出され得るが(P1E0およびRfxについては10~30kb以内)、残りのCas13d含有細菌は、別のCRISPR遺伝子座の一部として、それらのゲノム中の別の場所にCas1を含有する可能性が高い。
子も要求しないクラス2 CRISPR発見パイプラインの有用性を強調している。Cas13dダイレクトリピート(DR)は、長さおよび予測された二次構造において高度に保存されており(図3C)、36ntの長さ、A/U-リッチループを有する8~10ntのステム、およびダイレクトリピートの3’末端における5’-AAAACモチーフを有する(図3D)。この保存された5’-AAAACモチーフは、II型Cas1/2スペーサー獲得複合体によって特異的に認識されることが示されている(Wright and Doudna, 2016)。実際、Cas1は、一部のCas13d系に対して相対的に近接して見出され得るが(P1E0およびRfxについては10~30kb以内)、残りのCas13d含有細菌は、別のCRISPR遺伝子座の一部として、それらのゲノム中の別の場所にCas1を含有する可能性が高い。
(実施例3)
CRISPR-Cas13dは、二重RNase活性を有する
Cas13dリピートアレイが転写され、CRISPRガイドRNA(gRNA)へとプロセシングされることを実証するために、Cas13d CRISPR遺伝子座を、無培養Ruminococcus sp.試料(Ur)から、細菌発現プラスミド中にクローニングした。CRISPR系は、独立した発現のために必要な調節配列と共に、自己完結型のオペロンを形成する傾向があり、E.coliにおける異種発現を促進する(Gasiunas et al., 2012)。RNAシーケンシング(Heidrich et al., 2015)により、30ntの5’ダイレクトリピートと、その後の14~26nt長の範囲の可変性の3’スペーサーとを有する、約52ntの成熟gRNAへのアレイのプロセシングが明らかになった(図2B)。
CRISPR-Cas13dは、二重RNase活性を有する
Cas13dリピートアレイが転写され、CRISPRガイドRNA(gRNA)へとプロセシングされることを実証するために、Cas13d CRISPR遺伝子座を、無培養Ruminococcus sp.試料(Ur)から、細菌発現プラスミド中にクローニングした。CRISPR系は、独立した発現のために必要な調節配列と共に、自己完結型のオペロンを形成する傾向があり、E.coliにおける異種発現を促進する(Gasiunas et al., 2012)。RNAシーケンシング(Heidrich et al., 2015)により、30ntの5’ダイレクトリピートと、その後の14~26nt長の範囲の可変性の3’スペーサーとを有する、約52ntの成熟gRNAへのアレイのプロセシングが明らかになった(図2B)。
Cas13d特性をin vitroで特徴付けるために、Eubacterium siraeum Cas13dタンパク質(EsCas13d)を、E.coliにおけるそのロバストな組換え発現に基づいて精製したところ(図4A~4C)、EsCas13dは、さらなるヘルパーリボヌクレアーゼなしに、そのマッチするCRISPRアレイを構成要素ガイドへとプロセシングするのに単独で十分であったことが見出され(その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Konermann et al., " Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors," Cell 173:1-12,
2018の図2C、表S1)、これは、一部のクラス2 CRISPR-Cas系によって共有される特性である(East-Seletsky et al., 2016; Fonfara et al., 2016; Smargon et al., 2017)。さらに、HEPNモチーフの正に荷電した触媒的残基(Anantharaman et al., 2013)を不活性化すること(dCas13d:R295A、H3
00A、R849A、H854A)は、アレイプロセシングに影響を与えず、これは、Cas13aと類似したgRNAバイオジェネシスを指示する別個のRNase活性を示している(East-Seletsky et al., 2016; Liu et al., 2017)。
2018の図2C、表S1)、これは、一部のクラス2 CRISPR-Cas系によって共有される特性である(East-Seletsky et al., 2016; Fonfara et al., 2016; Smargon et al., 2017)。さらに、HEPNモチーフの正に荷電した触媒的残基(Anantharaman et al., 2013)を不活性化すること(dCas13d:R295A、H3
00A、R849A、H854A)は、アレイプロセシングに影響を与えず、これは、Cas13aと類似したgRNAバイオジェネシスを指示する別個のRNase活性を示している(East-Seletsky et al., 2016; Liu et al., 2017)。
Casエフェクタータンパク質は、典型的には、成熟gRNAと共に二元複合体を形成して、免疫防御のために外来核酸を切断することが可能なRNAガイドされるサーベイランスリボ核タンパク質を生成する(van der Oost et al., 2014)。Cas13dが、2つのHEPNモチーフの存在によって示される、プログラム可能なRNA標的化活性を有するかどうかを評価するために、EsCas13dタンパク質を、in vitro転写される同族標的と一緒に、アレイまたは成熟gRNAと対にした。RNAシーケンシング結果に基づいて、30ntのダイレクトリピートおよび22ntの中間のスペーサー長を含有する成熟gRNA(配列番号129のヌクレオチド6~36と、その後のRNA標的に対して相補的な22塩基)を選択した。
Cas13dは、ガイド配列依存的な様式で、プロセシングされていないアレイおよび成熟gRNAの両方と相補的な標的ssRNAを効率的に切断することができたが、マッチしていないスペーサー配列は、Cas13d活性を消失させた(図5A)。dCas13dによる置換または切断反応へのEDTAの添加もまた、ガイド依存的RNA標的化を消失させ、これは、Cas13d標的化がHEPNおよびMg2+依存的であることを示している(図5B)。効率的なCas13d標的化のための最小のスペーサー長を決定するために、プロセシングされていない30nt長から10ntに至るまでの範囲の一連のスペーサー短縮を生成した(図6A)。切断活性は、21ntのスペーサー長を下回ると顕著に低下し、22ntのスペーサーの選択が確認された(図6B)。
RNAを標的にするクラス2 CRISPR系は、外来RNAのセンサーとして作用すると提唱されており(Abudayyeh et al., 2016; East-Seletsky et al., 2016)
、このとき、エフェクターヌクレアーゼの通常のRNase活性は、ガイドマッチする標的によって誘発される。Cas13dにおいて類似の特性についてアッセイするために、二元EsCas13d:gRNA複合体のRNase活性を、マッチするRNA標的の存在下でモニタリングした。EsCas13dは、標的RNAによって活性化されて、相補的ssRNA標的に対するその活性と比較して非効率的ではあるが、バイスタンダーRNA標的を切断することができることが観察された(図3C)。マッチしていないバイスタンダー標的単独の存在では、切断を誘導するのに不十分であったが、dCas13dの置換またはEDTAの添加は活性を消失させたので、バイスタンダー切断は、ガイド配列およびHEPN依存的である。これらの結果は、バイスタンダーRNase活性が、CRISPR適応細菌免疫におけるRNAを標的にするクラス2系の一般的な特性であり得ることを示している(図3D)。
、このとき、エフェクターヌクレアーゼの通常のRNase活性は、ガイドマッチする標的によって誘発される。Cas13dにおいて類似の特性についてアッセイするために、二元EsCas13d:gRNA複合体のRNase活性を、マッチするRNA標的の存在下でモニタリングした。EsCas13dは、標的RNAによって活性化されて、相補的ssRNA標的に対するその活性と比較して非効率的ではあるが、バイスタンダーRNA標的を切断することができることが観察された(図3C)。マッチしていないバイスタンダー標的単独の存在では、切断を誘導するのに不十分であったが、dCas13dの置換またはEDTAの添加は活性を消失させたので、バイスタンダー切断は、ガイド配列およびHEPN依存的である。これらの結果は、バイスタンダーRNase活性が、CRISPR適応細菌免疫におけるRNAを標的にするクラス2系の一般的な特性であり得ることを示している(図3D)。
Cas13dリプログラミングの一般化可能性を評価するために、相補的RNA標的をタイリングする12個のガイドを生成したところ、全ての場合において効率的な切断が観察された(図7A)。Cas13dは、ssRNA標的のssDNAバージョン(図6C)もssRNA標的のdsDNAバージョン(図6D)も切断することができず、これは、Cas13dがRNA特異的ヌクレアーゼであることを示している。さらに、RNA標的切断は、3’-H(Abudayyeh et al., 2016)または両面DR近位5’-Dおよび
3’-NANまたはNNA(Smargon et al., 2017)を必要とする他のRNAを標的
にするクラス2系とは対照的に、プロトスペーサー隣接配列(PFS)に依存しなかった(図7A)。アデニンPFSに対するわずかなバイアスが最初に観察されたが(図6E)、一定のガイド配列を用い、標的PFS塩基を変動させることは、標的化効率において有意な差異を生じなかった(P=0.768)(図6F)。
3’-NANまたはNNA(Smargon et al., 2017)を必要とする他のRNAを標的
にするクラス2系とは対照的に、プロトスペーサー隣接配列(PFS)に依存しなかった(図7A)。アデニンPFSに対するわずかなバイアスが最初に観察されたが(図6E)、一定のガイド配列を用い、標的PFS塩基を変動させることは、標的化効率において有意な差異を生じなかった(P=0.768)(図6F)。
DNAを標的にするクラス2 CRISPR系(Gasiunas et al., 2012; Jinek et al., 2012; Zetsche et al., 2015)および一部のRNAを標的にするクラス1系は、標的-ガイド二重鎖と比較して、規定された位置において切断する傾向があるが(Samai et al., 2015; Zhang et al., 2016)、Cas13d切断パターンは、異
なる標的について変動し(図5A、5C、6H)、ガイド配列の位置にかかわらず、顕著に類似したままである(図7A)。これは、Cas13dが、標的RNA中の特異的配列または構造的にアクセス可能な領域を優先的に切断し得ることを示している。Cas13dを、ヘアピンのループ領域中にまたは直鎖一本鎖リピートとして可変性のホモポリマーリピートを含有する標的に対する活性について試験した。EsCas13dは、両方の標的構造中のウラシル塩基への顕著な優先性を示し、全ての他の塩基では、活性はより低いが検出可能であった(図7B)。
なる標的について変動し(図5A、5C、6H)、ガイド配列の位置にかかわらず、顕著に類似したままである(図7A)。これは、Cas13dが、標的RNA中の特異的配列または構造的にアクセス可能な領域を優先的に切断し得ることを示している。Cas13dを、ヘアピンのループ領域中にまたは直鎖一本鎖リピートとして可変性のホモポリマーリピートを含有する標的に対する活性について試験した。EsCas13dは、両方の標的構造中のウラシル塩基への顕著な優先性を示し、全ての他の塩基では、活性はより低いが検出可能であった(図7B)。
Cas酵素は、広範な環境温度にわたる、ほぼ全ての古細菌および約半分の細菌において見出されている(Hsu et al., 2014; van der Oost et al., 2014)。Cas13d活性について最適な温度範囲を決定するために、16~62℃の様々な切断温度条件を試験したところ、24~41℃の範囲において最大の活性が観察された(図6G、6H)。この温度範囲は、広範な原核生物および真核生物宿主と適合性であり、このことは、Cas13dが、異なる細胞および生物においてRNA標的化のために適応され得ることを示している。
(実施例4)
操作されたオルソログの、細胞ベースの活性スクリーニング
Cas13dヌクレアーゼを、哺乳動物細胞におけるプログラム可能なRNA標的化のための柔軟性のあるツールとして使用した。別個の細菌種由来のCRISPRオルソログは、特に、ヒト細胞での異種発現の際に(Ran et al., 2015; Zetsche et al., 2017)、可変性の活性を共通して示す(Abudayyeh et al., 2017; East-Seletsky et
al., 2017)。高度に活性なCas13dオルソログを、真核生物細胞ベースのmCherryレポータースクリーニングにおいて識別した。
操作されたオルソログの、細胞ベースの活性スクリーニング
Cas13dヌクレアーゼを、哺乳動物細胞におけるプログラム可能なRNA標的化のための柔軟性のあるツールとして使用した。別個の細菌種由来のCRISPRオルソログは、特に、ヒト細胞での異種発現の際に(Ran et al., 2015; Zetsche et al., 2017)、可変性の活性を共通して示す(Abudayyeh et al., 2017; East-Seletsky et
al., 2017)。高度に活性なCas13dオルソログを、真核生物細胞ベースのmCherryレポータースクリーニングにおいて識別した。
Cas13dファミリー内の別個の分岐からの7つのオルソログ(図1B)のヒトコドン最適化されたバージョンを合成することによって、触媒的に活性なおよびHEPN不活性なタンパク質を有する哺乳動物発現プラスミドを生成した。次いで、各タンパク質を、N末端およびC末端の核局在化シグナル(NLS)に、必要に応じて融合させた。これらのCas13dエフェクター設計をHAタグ化し、プロセシングされていないガイドRNA(プレgRNA)を模倣する、2つのダイレクトリピート配列が隣接する30ntのスペーサー、または成熟ガイドRNAを模倣すると予測される22ntのスペーサーを伴う30ntのダイレクトリピート(gRNA)のいずれかを有する、2つの別個のガイドRNAアーキテクチャーと対にした(図8A)。次いで、各ガイド設計について、mCherry転写物に対して相補的な4つの別個のスペーサー配列をプールして、標的化効率における潜在的なスペーサー依存的可変性を最小化した。Cas13dがmCherryタンパク質レベルをノックダウンする能力を、ヒト胎児由来腎臓(HEK)293FT細胞ベースのレポーターアッセイにおいて決定した。
トランスフェクションの48時間後、フローサイトメトリーにより、RfxCas13dおよびAdmCas13dが、非標的化対照ガイドと比較して、それぞれ最大で92%および87%(P<0.0003)、mCherryタンパク質レベルを効率的にノックダウンしたことが示された(図8B)。対照的に、EsCas13dは、RaCas13dおよびRffCas13dと共に、ヒト細胞において限定された活性を示した。さらに、HEPN不活性なRfx-dCas13d構築物のいずれも、mCherry蛍光に顕著な影響を与えず、これは、HEPN依存的ノックダウンを示している(全ての場合についてP>0.43)。RfxおよびAdmCas13d NLS融合構築物のロバストな核転座が免疫細胞化学を介して観察されたが、野生型エフェクターは、主に核外に残留する(図8C)。
RfxCas13dおよびAdmCas13dをリード候補として進めて、本発明者らは次に、それらが内因性転写物をノックダウンする能力を比較した。最適なオルソログおよびガイドアーキテクチャーを決定するために、RfxおよびAdmCas13d構築物バリアントがβ-1,4-N-アセチル-ガラクトサミニルトランスフェラーゼ1(B4GALNT1)転写物を標的にする能力を、体系的にアッセイした。各条件において、B4GALNT1転写物をタイリングする別個のスペーサー配列を含有する4つのガイドをプールした。RfxCas13d-NLS融合物は、野生型RfxCas13d、およびAdmCas13dの両方のバリアントよりも効率的にB4GALNT1を標的化し、gRNAおよびプレgRNAの両方が、強力なノックダウンを媒介した(約82%、P<0.0001)(図8D)。したがって、Ruminococcus flavefaciens株XPD3002由来のCas13d-NLS(Cas13d-NLS from
Ruminococcus flavefaciens strain XPD3002)を、残りの実験のために選択した(CasRx)。
Ruminococcus flavefaciens strain XPD3002)を、残りの実験のために選択した(CasRx)。
(実施例5)
CasRxによる、ヒト細胞におけるプログラム可能なRNAノックダウン
Cas13dは、それ自体のCRISPRアレイをプロセシングすることが可能であるので、この特性を、単純な単一ベクター系での複数の標的化ガイドの同時送達のために活用した(図9A)。mRNA(B4GALNT1およびANXA4)または核局在化したlncRNA(HOTTIPおよびMALAT1)の転写物を各々がタイリングする4つのスペーサーをコードするアレイは、CasRxによるロバストな(>90%)RNAノックダウンを一貫して促進した(P<0.0001)(図9B)。
CasRxによる、ヒト細胞におけるプログラム可能なRNAノックダウン
Cas13dは、それ自体のCRISPRアレイをプロセシングすることが可能であるので、この特性を、単純な単一ベクター系での複数の標的化ガイドの同時送達のために活用した(図9A)。mRNA(B4GALNT1およびANXA4)または核局在化したlncRNA(HOTTIPおよびMALAT1)の転写物を各々がタイリングする4つのスペーサーをコードするアレイは、CasRxによるロバストな(>90%)RNAノックダウンを一貫して促進した(P<0.0001)(図9B)。
CasRxを、一過的トランスフェクションを介して、CasRx媒介性RNA干渉を、dCas9媒介性CRISPR干渉(Gilbert et al., 2014; Gilbert et al.,
2013)およびスペーサー配列がマッチしたshRNA(図9C)と比較することによって、転写物のノックダウンまたは抑制のためのより確立されたテクノロジーと比較した。CRISPRiベースの抑制について、以前の報告からのB4GALNT1についての最も強力なdCas9ガイドを分析した(Gilbert et al., 2014; Zalatan et al.,
2015)。3つの内因性転写物にわたって、CasRxは、各場合においてshRNA(11/11)およびCRISPRi(4/4)よりも優れており(図9D)、48時間後に、shRNAについての65%およびCRISPRiについての53%と比較して、96%の中央値ノックダウンを示した。さらに、CasRxによるノックダウンを、2つの最近記載されたCas13aおよびCas13bエフェクター(Abudayyeh et al., 2017; Cox et al., 2017)と比較した(図10A)。3つの遺伝子および8つのガイ
ドRNAにわたって、CasRxは、LwaCas13a-msfGFP-NLSおよびPspCas13b-NESの両方よりも顕著に高い転写物ノックダウンを媒介した(中央値:それぞれ80%および66%と比較して97%、P<0.0001)(図10B)。
2013)およびスペーサー配列がマッチしたshRNA(図9C)と比較することによって、転写物のノックダウンまたは抑制のためのより確立されたテクノロジーと比較した。CRISPRiベースの抑制について、以前の報告からのB4GALNT1についての最も強力なdCas9ガイドを分析した(Gilbert et al., 2014; Zalatan et al.,
2015)。3つの内因性転写物にわたって、CasRxは、各場合においてshRNA(11/11)およびCRISPRi(4/4)よりも優れており(図9D)、48時間後に、shRNAについての65%およびCRISPRiについての53%と比較して、96%の中央値ノックダウンを示した。さらに、CasRxによるノックダウンを、2つの最近記載されたCas13aおよびCas13bエフェクター(Abudayyeh et al., 2017; Cox et al., 2017)と比較した(図10A)。3つの遺伝子および8つのガイ
ドRNAにわたって、CasRxは、LwaCas13a-msfGFP-NLSおよびPspCas13b-NESの両方よりも顕著に高い転写物ノックダウンを媒介した(中央値:それぞれ80%および66%と比較して97%、P<0.0001)(図10B)。
RNAiは、単純な再標的化原理、スケーラブルな合成、ノックダウン効力、および試薬送達の容易さの組合せに起因して、目的の任意の遺伝子を破壊するために広く使用されてきた。しかし、広範なオフターゲット転写物サイレンシングが、内因性miRNA経路中へのRNAi試薬の進入におそらくは起因して(Doench et al., 2003; Smith et
al., 2017)、一貫した懸念となってきた(Jackson et al., 2003; Sigoillot et al., 2012)。これらの報告と一致して、B4GALNT1標的化shRNAをトラ
ンスフェクトしたヒト細胞のRNAシーケンシングの際に、非標的化shRNAと比較して広範なオフターゲット転写変化が観察された(>500の顕著なオフターゲット変化、P<0.01、図9E、9G)。対照的に、スペーサーマッチしたCasRxガイドRNAのトランスクリプトームプロファイリングにより、標的化された転写物以外の顕著なオフターゲット変化は明らかにならなかった(図9F)。これは、in vitroで観察された中程度のバイスタンダー切断(図5C)が、哺乳動物細胞において観察可能なオフターゲットトランスクリプトーム撹乱を生じない可能性があることを示している。ANXA4を標的化した場合に類似のパターンが観察され(図11A~11B)、900を超える顕著なオフターゲット変化が、CasRxによるゼロと比較して、shRNA標的化から生じた(図9G)。
al., 2017)、一貫した懸念となってきた(Jackson et al., 2003; Sigoillot et al., 2012)。これらの報告と一致して、B4GALNT1標的化shRNAをトラ
ンスフェクトしたヒト細胞のRNAシーケンシングの際に、非標的化shRNAと比較して広範なオフターゲット転写変化が観察された(>500の顕著なオフターゲット変化、P<0.01、図9E、9G)。対照的に、スペーサーマッチしたCasRxガイドRNAのトランスクリプトームプロファイリングにより、標的化された転写物以外の顕著なオフターゲット変化は明らかにならなかった(図9F)。これは、in vitroで観察された中程度のバイスタンダー切断(図5C)が、哺乳動物細胞において観察可能なオフターゲットトランスクリプトーム撹乱を生じない可能性があることを示している。ANXA4を標的化した場合に類似のパターンが観察され(図11A~11B)、900を超える顕著なオフターゲット変化が、CasRxによるゼロと比較して、shRNA標的化から生じた(図9G)。
CasRx干渉が広く適用可能であることを確認するために、がん、細胞シグナル伝達およびエピジェネティック調節において多様な役割を有する11個のさらなる遺伝子のパネルを選択し、遺伝子1つ当たり3つのガイドをスクリーニングした。CasRxは、96%の中央値低減で、遺伝子にわたって高いレベルの転写物ノックダウンを一貫して媒介した(図9H)。各試験したガイドは、少なくとも80%のノックダウンを媒介し、RNA干渉についてのCasRx系の一貫性を強調している。
(実施例6)
dCasRxによるスプライスアイソフォーム操作
CasRxによるRNA標的化に関する実験により、標的RNAおよびタンパク質ノックダウンが、HEPNドメインの触媒活性に依存することが明らかになった(図8B、5B)。CasRxによる効率的なノックダウンを媒介する同じガイド配列は、触媒的に不活性なdCasRxと対にした場合、mCherryレベルを顕著に低減させることができず(図8B)、これは、mRNAのコード部分へのdCasRxの標的化が、タンパク質翻訳を必ずしも撹乱させないことを示している。この観察は、転写物内の特異的コードおよび非コードエレメントの標的化のためにdCasRxを利用して、RNAを研究および操作する可能性を示した。この概念を検証するために、dCasRx系の有用性を、スプライスエフェクターを創出することによって拡張した。
dCasRxによるスプライスアイソフォーム操作
CasRxによるRNA標的化に関する実験により、標的RNAおよびタンパク質ノックダウンが、HEPNドメインの触媒活性に依存することが明らかになった(図8B、5B)。CasRxによる効率的なノックダウンを媒介する同じガイド配列は、触媒的に不活性なdCasRxと対にした場合、mCherryレベルを顕著に低減させることができず(図8B)、これは、mRNAのコード部分へのdCasRxの標的化が、タンパク質翻訳を必ずしも撹乱させないことを示している。この観察は、転写物内の特異的コードおよび非コードエレメントの標的化のためにdCasRxを利用して、RNAを研究および操作する可能性を示した。この概念を検証するために、dCasRx系の有用性を、スプライスエフェクターを創出することによって拡張した。
選択的スプライシングは、一般に、プレmRNA中のシス作用性エレメントの、エクソンの包含または排除を媒介することができる陽性または陰性トランス作用性スプライシング因子との相互作用によって調節される(Matera and Wang, 2014; Wang et al.,
2015)。かかるモチーフへのdCasRx結合は、標的化されたアイソフォーム撹乱に十分であり得ると考えられた。概念実証のために、別個のスプライスエレメントを、選択的スプライシングされたエクソンに続く、2つの異なるリーディングフレームでmTagBFP2の上流にDsRedを含有する二色スプライシングレポーターにおいて識別した(Orengo et al., 2006)(図12A)。この2番目のエクソンの包含または排除は、リーディングフレームおよび生じる蛍光を切り替え、フローサイトメトリーによるスプライシングパターンの定量的読み出しを促進する。エクソンスキッピングを媒介するために、4つのガイドRNAを設計して、エクソン2のイントロン分岐点ヌクレオチド、スプライスアクセプター部位、推定エクソンスプライスエンハンサーおよびスプライスドナーを標的化した。
2015)。かかるモチーフへのdCasRx結合は、標的化されたアイソフォーム撹乱に十分であり得ると考えられた。概念実証のために、別個のスプライスエレメントを、選択的スプライシングされたエクソンに続く、2つの異なるリーディングフレームでmTagBFP2の上流にDsRedを含有する二色スプライシングレポーターにおいて識別した(Orengo et al., 2006)(図12A)。この2番目のエクソンの包含または排除は、リーディングフレームおよび生じる蛍光を切り替え、フローサイトメトリーによるスプライシングパターンの定量的読み出しを促進する。エクソンスキッピングを媒介するために、4つのガイドRNAを設計して、エクソン2のイントロン分岐点ヌクレオチド、スプライスアクセプター部位、推定エクソンスプライスエンハンサーおよびスプライスドナーを標的化した。
陰性スプライス因子の1つの広範なファミリーは、C末端のグリシン-リッチドメインを介してエクソン包含を典型的には阻害する、高度に保存された異種核リボ核タンパク質(hnRNP)である(Wang et al., 2015)。スプライシングレポーターを、dCasRx、および最も豊富なhnRNPファミリーメンバーの1つであるhnRNPa1のGly-リッチC末端ドメインへの操作された融合物を用いて標的化した(図12B)。
ガイド位置は、操作されたエクソンスキッピングの効率の主要な決定因子のようである。各ガイド位置は、非標的化ガイドと比較して、エクソン排除における顕著な増加(全ての場合においてP<0.0001)を媒介したが、スプライスアクセプターの標的化は、最も強力なエクソン排除を生じた(8%の基底スキッピングから、dCasRx単独について65%およびhnRNPa1融合物について75%への増加)。比較として、dLwaCas13a-msfGFP-NLSは、4つ全ての位置にわたって、顕著に低いレベルのエクソンスキッピングを媒介した(スプライスアクセプターガイドについて19%のスキッピング)(図10Cおよび10D、P<0.0001)。
CRISPRアレイを用いて4つ全ての位置を同時に標的にすることは、個々のガイド単独よりも高いレベルのエクソンスキッピングを達成した(dCasRxについて81%およびhnRNPa1融合物について85%、SAガイドと比較してP<0.006)(図12B)。これらの結果は、dCasRxが、ガイド配置を変動させることを介したアイソフォーム比のチューニングを可能にすることを示し、特異的RNAエレメントの標的化および操作のために、ヒト細胞において効率的なRNA結合性モジュールとしてこれが活用され得ることを示唆している。
(実施例7)
前頭側頭葉型認知症のニューロンモデルへのdCasRxのウイルス送達
Cas13dファミリーは、Cas9(サブタイプに依存して約1100aa~約1400aa、コンパクトな外れ値、例えば、CjCas9またはSaCas9を有する)、Cas13a(1250aa)、Cas13b(1150aa)およびCas13c(1120aa)とは対照的に、平均して930アミノ酸長である(図3B)(Chylinski et al., 2013; Cox et al., 2017; Hsu et al., 2014; Kim et al., 2017;
Shmakov et al., 2015; Smargon et al., 2017)。アデノ随伴ウイルス(AAV)は、その広範なカプシド血清型、低レベルの挿入突然変異誘発、および明らかな病原性の欠如に起因して、導入遺伝子送達および遺伝子治療のための多用途のビヒクルであるが、その限定的なパッケージング容量(約4.7kb)により、多くの単一エフェクターCRISPR酵素を効果的に送達することは困難である(Abudayyeh et al., 2017; Ran et al., 2015; Swiech et al., 2015)。Cas13dエフェクターの顕著に小さいサイズにより、これらは、CRISPRアレイ、必要に応じたエフェクタードメイン、および必要な発現または調節エレメントを伴った、一体型のAAV送達に独自に適したものになっている(図12C)。
前頭側頭葉型認知症のニューロンモデルへのdCasRxのウイルス送達
Cas13dファミリーは、Cas9(サブタイプに依存して約1100aa~約1400aa、コンパクトな外れ値、例えば、CjCas9またはSaCas9を有する)、Cas13a(1250aa)、Cas13b(1150aa)およびCas13c(1120aa)とは対照的に、平均して930アミノ酸長である(図3B)(Chylinski et al., 2013; Cox et al., 2017; Hsu et al., 2014; Kim et al., 2017;
Shmakov et al., 2015; Smargon et al., 2017)。アデノ随伴ウイルス(AAV)は、その広範なカプシド血清型、低レベルの挿入突然変異誘発、および明らかな病原性の欠如に起因して、導入遺伝子送達および遺伝子治療のための多用途のビヒクルであるが、その限定的なパッケージング容量(約4.7kb)により、多くの単一エフェクターCRISPR酵素を効果的に送達することは困難である(Abudayyeh et al., 2017; Ran et al., 2015; Swiech et al., 2015)。Cas13dエフェクターの顕著に小さいサイズにより、これらは、CRISPRアレイ、必要に応じたエフェクタードメイン、および必要な発現または調節エレメントを伴った、一体型のAAV送達に独自に適したものになっている(図12C)。
第17染色体に連結したパーキンソニズムを伴う前頭側頭葉型認知症(FTDP-17)は、タウをコードする遺伝子であるMAPT中の多様な点突然変異によって引き起こされる、常染色体優性の主要な神経変性疾患である。タウは、ヒトニューロンにおいて、2つの主要なアイソフォーム4Rおよび3Rとして存在し、これらは、タウエクソン10の存在または非存在によって識別され、したがって、4つまたは3つの微小管結合性ドメインを含有する。これら2つのアイソフォームのバランスは、一般に、FTDP-17ならびに他のタウオパチーにおいて撹乱され、これが、神経変性の進行を駆動する(Boeve and Hutton, 2008)。FTDの一部の形態は、MAPTエクソン10に続くイントロン
中の突然変異によって引き起こされ、これが、イントロンスプライスサイレンサーを破壊し、4Rタウの発現を上昇させ(Kar et al., 2005)、それによって、病理学的変化
を誘導する(Schoch et al., 2016)。
中の突然変異によって引き起こされ、これが、イントロンスプライスサイレンサーを破壊し、4Rタウの発現を上昇させ(Kar et al., 2005)、それによって、病理学的変化
を誘導する(Schoch et al., 2016)。
MAPTエクソン10に標的化されたdCasRxは、エクソン排除を誘導して、調節不全の4R/3Rタウ比を緩和することができると考えられた。患者由来のヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)を、2週間ニューロゲニン-2により指示された分化を介して、皮質ニューロンへと分化させた(Zhang et al., 2013)。次いで、有糸分裂後ニュー
ロンに、エクソン10スプライスアクセプターおよび2つの推定エクソンスプライスエンハンサー(図12E)を標的にする3つのスペーサーを含有するリピートアレイと対にした、dCasRxを有するAAV1を形質導入した(図12D)。dCasRx媒介性エクソン排除は、相対的4R/3Rタウ比を、BFPビヒクル対照と比較してほぼ50%(図12F)、罹患していない対照ニューロンと類似のレベルまで低減させることができ、これは、CasRxが、AAV送達を介して初代細胞型において転写モジュレーションに利用され得ることを実証している。
ロンに、エクソン10スプライスアクセプターおよび2つの推定エクソンスプライスエンハンサー(図12E)を標的にする3つのスペーサーを含有するリピートアレイと対にした、dCasRxを有するAAV1を形質導入した(図12D)。dCasRx媒介性エクソン排除は、相対的4R/3Rタウ比を、BFPビヒクル対照と比較してほぼ50%(図12F)、罹患していない対照ニューロンと類似のレベルまで低減させることができ、これは、CasRxが、AAV送達を介して初代細胞型において転写モジュレーションに利用され得ることを実証している。
(実施例8)
Cas13dを使用したヒト細胞におけるRNA標的化
RNAは、活性なCas13dヌクレアーゼを使用して、ヒト細胞において標的化され得る。概念実証として、ヒトU-2 OS骨肉腫細胞に、mCherryレポーターを安定に組み込み、mCherry転写物を標的にする、ヒトコドン最適化されたCas13dおよびガイドRNAをコードするプラスミドをトランスフェクトした(図13)。
Cas13dを使用したヒト細胞におけるRNA標的化
RNAは、活性なCas13dヌクレアーゼを使用して、ヒト細胞において標的化され得る。概念実証として、ヒトU-2 OS骨肉腫細胞に、mCherryレポーターを安定に組み込み、mCherry転写物を標的にする、ヒトコドン最適化されたCas13dおよびガイドRNAをコードするプラスミドをトランスフェクトした(図13)。
核局在化がmCherryノックダウンに影響を与えることができるかどうかを理解するために、Cas13dタンパク質をまた、N末端およびC末端NLS配列(N末端NLSについてSPKKKRKVEAS、配列番号256、C末端NLSについてGPKKKRKVAAA、配列番号258)と融合させた(これらは、2xNLS構築物と称される)。ガイドRNAを、プロセシングされていないCRISPRガイドアレイを模倣する36ntのDR-30ntのスペーサー-36ntのDR配列(DR36と称される)またはプロセシングされた成熟gRNAを模倣する30ntのDR-22ntのスペーサー(gRNAと称される)に作動可能に連結したU6プロモーターを有するベクター中で提供した。DR36構築物は、Cas13dによって細胞内で成熟gRNAへとプロセシングされると推定される。DR36またはgRNA分子内のスペーサー配列は、mCherry標的RNAに対して相補的であるか(オンターゲットmCherry)、またはmCherryもしくは任意の内因性ヒト転写物に対する相補性を回避するために計算的に最適化された(非標的化mCherry)かのいずれかであった。
mCherryノックダウンを、フローサイトメトリーを介して定量し、トランスフェクション対照に対して標準化した。非標的化mCherryガイドは、おそらくはmCherry転写物が標的化されないことに起因して、フローサイトメトリーを介したmCherryタンパク質レベルに影響を与えない。しかし、4つの異なるCas13dオルソログと対にしたオンターゲットmCherryガイドは、顕著なmCherryノックダウンを示した(図13)。「XPD」は、Ruminococcus flavefaciens XPD3002 Cas13dを指し;「P1E0」は、消化管メタゲノムP1E0 Cas13dを指し;「AnDig」は、嫌気性消化器消化管メタゲノムCas13dを指し;「無培養」は、無培養Ruminococcus sp.Cas13dを指す。
(実施例9)
Cas13dを使用したin vivo RNA標的化
RNAは、がんのマウスモデルにおいて標的化され得る。マウス中のどの細胞がEGFRを発現しているかを観察するために、マウスEGFRに対して相補的な1つまたは複数のスペーサー領域を含むガイドRNAを設計し、突然変異したHEPNドメインを有するCas13d(例えば、配列番号2または4)、およびビオチン標識と組み合わせる。gRNAおよびCas13dコード配列を、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルス)中にクローニングし、これを使用して、100%の感染率を保証する力価で、尾静脈注射によってマウスに感染させる。蛍光ストレプトアビジン標識をマウスに投与する。EGFRを発現している細胞を視覚化し、蛍光標識に適切な励起周波数を用いて検出する。あるいは、Cas13dを、その活性な形態でin vivo送達して、標的ノックダウンを媒介する。
Cas13dを使用したin vivo RNA標的化
RNAは、がんのマウスモデルにおいて標的化され得る。マウス中のどの細胞がEGFRを発現しているかを観察するために、マウスEGFRに対して相補的な1つまたは複数のスペーサー領域を含むガイドRNAを設計し、突然変異したHEPNドメインを有するCas13d(例えば、配列番号2または4)、およびビオチン標識と組み合わせる。gRNAおよびCas13dコード配列を、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルス)中にクローニングし、これを使用して、100%の感染率を保証する力価で、尾静脈注射によってマウスに感染させる。蛍光ストレプトアビジン標識をマウスに投与する。EGFRを発現している細胞を視覚化し、蛍光標識に適切な励起周波数を用いて検出する。あるいは、Cas13dを、その活性な形態でin vivo送達して、標的ノックダウンを媒介する。
(実施例10)
がんの処置
組織学的に確認されたステージ1のEGFR+乳がんを有するヒト対象は、開示された方法で処置され得る。各対象に、乳腺腫瘍摘出手術を受けた後に、HEPNドメインが突然変異した活性なCas13dまたはCas13dタンパク質(例えば、配列番号2または4)、EGFRを標的にするガイドRNAおよび毒素を含む複合体を投与する。処置された個体を、乳がん再発についてモニタリングする。
がんの処置
組織学的に確認されたステージ1のEGFR+乳がんを有するヒト対象は、開示された方法で処置され得る。各対象に、乳腺腫瘍摘出手術を受けた後に、HEPNドメインが突然変異した活性なCas13dまたはCas13dタンパク質(例えば、配列番号2または4)、EGFRを標的にするガイドRNAおよび毒素を含む複合体を投与する。処置された個体を、乳がん再発についてモニタリングする。
(実施例11)
HIV感染の処置
HIV感染を有するヒト対象は、開示された方法で処置され得る。各対象に、HEPNドメインが突然変異した活性なCas13dまたはCas13dタンパク質(例えば、配列番号2または4)、HIV Nefタンパク質を標的にするガイドRNAおよび毒素を含む構築物を投与する。処置された個体を、HIV進行についてモニタリングする。
HIV感染の処置
HIV感染を有するヒト対象は、開示された方法で処置され得る。各対象に、HEPNドメインが突然変異した活性なCas13dまたはCas13dタンパク質(例えば、配列番号2または4)、HIV Nefタンパク質を標的にするガイドRNAおよび毒素を含む構築物を投与する。処置された個体を、HIV進行についてモニタリングする。
(実施例12)
ハンチントン病の処置
ハンチントン病を有するヒト対象は、開示された方法で処置され得る。各個体に、Cas13d、ハンチントン突然変異を標的にするガイドRNAを含む構築物を投与する。処置された個体を、疾患進行についてモニタリングする。
ハンチントン病の処置
ハンチントン病を有するヒト対象は、開示された方法で処置され得る。各個体に、Cas13d、ハンチントン突然変異を標的にするガイドRNAを含む構築物を投与する。処置された個体を、疾患進行についてモニタリングする。
(実施例13)Cas13dを使用する選択的スプライシング
Cas13dスプライスエフェクターは、治療的タンパク質の回復(例えば、これは、突然変異または欠失から生じる)、フレームシフト誘導を介した遺伝子ノックダウン、所望のアイソフォーム比をチューニングもしくは回復させる、または所望の優性スプライスアイソフォームを誘導するために使用され得る(図14)。選択的スプライシングは、一般に、プレmRNA中のシス作用性エレメントの、エクソンの包含または排除を媒介することができる陽性または陰性トランス作用性スプライシング因子との相互作用によって調節される。陽性または陰性スプライシング因子への必要に応じた融合を伴うdCas13dおよびCas13dは、スプライシングを操作するために、プレmRNA中の前記シス作用性エレメントを標的にするスプライシングエフェクターとして使用され得る。かかるエレメントには、エクソンスプライシングエンハンサーまたはサプレッサー、イントロンスプライシングエンハンサーまたはサプレッサー、スプライスアクセプターおよびスプライスドナー部位、ならびにより一般には、その特定のプレmRNA、mRNAまたは他のRNA種、例えば、非コードRNA、tRNA、miRNAなどの上のタンパク質相互作用性またはRNA相互作用性のモチーフまたはエレメントが含まれ得る。
Cas13dスプライスエフェクターは、治療的タンパク質の回復(例えば、これは、突然変異または欠失から生じる)、フレームシフト誘導を介した遺伝子ノックダウン、所望のアイソフォーム比をチューニングもしくは回復させる、または所望の優性スプライスアイソフォームを誘導するために使用され得る(図14)。選択的スプライシングは、一般に、プレmRNA中のシス作用性エレメントの、エクソンの包含または排除を媒介することができる陽性または陰性トランス作用性スプライシング因子との相互作用によって調節される。陽性または陰性スプライシング因子への必要に応じた融合を伴うdCas13dおよびCas13dは、スプライシングを操作するために、プレmRNA中の前記シス作用性エレメントを標的にするスプライシングエフェクターとして使用され得る。かかるエレメントには、エクソンスプライシングエンハンサーまたはサプレッサー、イントロンスプライシングエンハンサーまたはサプレッサー、スプライスアクセプターおよびスプライスドナー部位、ならびにより一般には、その特定のプレmRNA、mRNAまたは他のRNA種、例えば、非コードRNA、tRNA、miRNAなどの上のタンパク質相互作用性またはRNA相互作用性のモチーフまたはエレメントが含まれ得る。
さらに、Cas13dベースのスプライスエフェクターの効果は、ガイド位置依存的であり得る。これは、立体障害、遮断、動員またはエフェクター媒介性相互作用を介して、RNA転写物中の特定のモチーフまたは部位、例えば、タンパク質結合性部位を撹乱させるまたは発見するために利用され得る。例えば、非コードRNAと特定のクロマチンリモデリング複合体との間の相互作用が、撹乱され得る。リボソーム結合性部位および他のエレメントのアクセスは、翻訳を減少、増加、または他の方法で操作するために、5’または3’UTRにおいて(または適切なエフェクタードメインを動員するために)遮断され得る。
Cas13dガイドをプレmRNAに沿って標的化またはタイリングすることは、新たなシス作用性エレメント、例えば、イントロンまたはエクソンスプライスエンハンサーを発見またはマッピングするために使用され得る。これは、最適なアンチセンスオリゴヌクレオチド位置付けのために、ジストロフィン遺伝子の場合には治療的文脈で利用されており、最適なCas13d位置付けのためにも使用され得る。これは、輸送および局在化、クロマチンリモデリング、ポリアデニル化、RNAの安定性および半減期、またはナンセンス媒介性減衰のレベルに影響を与えるために、RNAジップコードまたは他のシス作用性エレメントをマッピング、マスク、または他の方法で撹乱させるためにも使用され得る。
一例では、RNAを標的にすることは、標的RNAのスプライシングを変化させることを可能にする。スプライスアクセプターおよび/またはドナー部位ならびにスプライスエフェクタードメインの直接的結合は共に、スプライシングを操作するために使用され得る。例えば、突然変異したHEPNドメインを有するdCas13dタンパク質(例えば、配列番号2または4)、標的RNAに特異的な少なくとも1つのスペーサー配列を含有するガイドRNA、および必要に応じて、スプライシングに影響を与えるエフェクタードメイン(例えば、SRSF1のRS-リッチドメイン、hnRNPA1のGly-リッチドメイン、RBM4のアラニン-リッチモチーフ、またはDAZAP1のプロリン-リッチモチーフ)を使用することによって、RNAの選択的スプライシングが達成され得る。
一部の例では、かかる方法は、エクソン包含のため、例えば、ポンペ病を処置するために酸性アルファ-グルコシダーゼ(GAA)のエクソン2を含むために、または脊髄性筋萎縮症(SMA)を処置するためにSMN2のエクソン7を含むために使用される。一部の例では、かかる方法は、エクソン排除のため、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するためにジストロフィンのリーディングフレームを回復させるため、がんを処置するために抗アポトーシス性の長いアイソフォームからアポトーシス促進性の短いアイソフォームへとBcl-xプレmRNAのスプライシングをシフトさせるため、3Rおよび4Rタウの比に影響を与えるためにMAPT転写物のスプライシングをシフトさせるため、またはハッチンソン・ギルフォード早老症候群または加齢の他の遺伝性疾患の場合にはラミンA転写物のスプライシングを操作するために使用される。
一部の例では、方法は、スプライスアクセプターまたはドナー部位をマスクするため、例えば、コールドの腫瘍をホットにするためのネオ抗原を創出するために、突然変異したHEPNドメインを必要に応じて有するCas13dタンパク質を使用する。ある特定の標的プレmRNAのスプライシングに影響を与えることによって、この方法は、がん細胞におけるネオエピトープの創出をもたらし得る新規エクソン-エクソン接合部を生成することができる。これは、非天然抗原のディスプレイに起因して、がん細胞を、免疫系に対して脆弱なものにすることができる。他の例では、この方法は、アイソフォーム比を動的に操作するため、またはタンパク質(例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーについてはジストロフィン)のリーディングフレームを回復させるために使用され得る。
(実施例14)
Cas13dのAAV送達
上の実施例に記載されるように、Cas13dは、プラスミド送達に適さない細胞型における発現を媒介するため、またはCas13dのin vivo送達のために、AAV中に効果的にパッケージングされ得る。ヌクレアーゼ活性Cas13dのAAV送達は、目的の細胞型においてRNA標的ノックダウンを媒介するために使用され得る。他の単一エフェクターCRISPRヌクレアーゼと比較したその小さいサイズに起因して、Cas13dは、単一のAAVベクター中に、ガイドRNA、または複数のガイドRNAを含有するアレイと一緒にパッケージングされ得る。
Cas13dのAAV送達
上の実施例に記載されるように、Cas13dは、プラスミド送達に適さない細胞型における発現を媒介するため、またはCas13dのin vivo送達のために、AAV中に効果的にパッケージングされ得る。ヌクレアーゼ活性Cas13dのAAV送達は、目的の細胞型においてRNA標的ノックダウンを媒介するために使用され得る。他の単一エフェクターCRISPRヌクレアーゼと比較したその小さいサイズに起因して、Cas13dは、単一のAAVベクター中に、ガイドRNA、または複数のガイドRNAを含有するアレイと一緒にパッケージングされ得る。
(実施例15)
Cas13dを用いた核酸ベースの診断薬
Cas13d酵素は、リボ核タンパク質複合体の形成を促進するために、細胞に由来する無細胞溶解物、または操作されたCas13d酵素およびガイドRNAを含有する無細胞系を使用して、細胞との関連で、核酸ベースの診断薬として利用され得る。前記ガイドRNAは、プレガイドRNA、成熟ガイドRNA、または1つもしくは複数のスペーサー配列を含有するアレイの形態で、提供され得る。構成成分は、必要な構成成分の生成を促進するために、in vitro転写/翻訳系を介して、Cas13d酵素および適切なガイドRNA設計をコードするDNAまたはRNA前駆体の形態でも提供され得る。診断キットのこれらの構成成分は、「センサー」モジュールを含む。
Cas13dを用いた核酸ベースの診断薬
Cas13d酵素は、リボ核タンパク質複合体の形成を促進するために、細胞に由来する無細胞溶解物、または操作されたCas13d酵素およびガイドRNAを含有する無細胞系を使用して、細胞との関連で、核酸ベースの診断薬として利用され得る。前記ガイドRNAは、プレガイドRNA、成熟ガイドRNA、または1つもしくは複数のスペーサー配列を含有するアレイの形態で、提供され得る。構成成分は、必要な構成成分の生成を促進するために、in vitro転写/翻訳系を介して、Cas13d酵素および適切なガイドRNA設計をコードするDNAまたはRNA前駆体の形態でも提供され得る。診断キットのこれらの構成成分は、「センサー」モジュールを含む。
かかる方法は、標的RNAが試験試料中に存在するかどうかを決定するために使用され得る。かかる方法は、病原体、例えば、ウイルスまたは細菌を検出する、またはがんなどの疾患状態を診断するためにも使用され得る(例えば、ここで、標的RNAは、特定の微生物または疾患に特異的である)。かかる方法は、環境試料または農業試料、例えば、種子または土壌の純度または正体を試験するためにも使用され得る。
次いで、「センサー」モジュールに、RNAの形態の試験試料を負荷する。前記試験試料は、例えばin vitro転写を介してRNAに変換されるゲノムDNA試料、または直接的RNA試料であり得るがこれらに限定されない。これらの試料は、生物学的材料、例えば、患者試料(例えば、細胞、組織、血液、血漿、血清、唾液、尿、腫瘍生検、無細胞DNAもしくはRNA、エクソソーム、担体小胞または粒子)および環境試料(例えば、土壌、水、空気、種子または植物試料)から抽出され得る。診断感度を改善するための一実施形態では、試料中の核酸分子は、増幅技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、ループ媒介性等温増幅、核酸配列ベースの増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、リガーゼ連鎖反応およびその他(例えば、等温増幅を使用するもの)を使用して増幅される。前記増幅技術は、必要に応じて、核酸変換技術、例えば、ランダム化されたプライマーまたは標的化されたプライマーを用いる転写または逆転写を用いることができる。
センサーモジュールが試験試料中の同族標的を認識すると、これは、RNase活性を活性化する。このRNase活性は、検出可能な標識を使用することによって検出され得る。一例では、検出可能な標識には、フルオロフォアおよびクエンチャーに連結されたRNAが含まれる。インタクトな検出可能なRNAは、フルオロフォアおよびクエンチャーを連結して、蛍光を抑制する。Cas13dによる検出可能なRNAの切断の際に、フルオロフォアは、クエンチャーから放出され、検出可能な蛍光活性を示す。
別の例では、レポーターRNAの切断は、非蛍光分子を放出し、これが、可視シグナル(例えば、目に見える)へと変換され得る。一例では、レポーターRNAの切断は、側方流動を介して検出され得る分子を放出する。側方流動によって検出され得る分子は、抗体が特異的に結合し得る任意の分子である。一例では、Cas13dタンパク質は、標的を検出するガイドRNAおよびレポーター分子にコンジュゲートされたレポーターRNAと共に、乾燥試験ストリップの形態で、単一の系として送達され得る。試験試料とのインキュベーションの際に、Cas1Cas13dタンパク質a3d、ガイドRNAおよびレポーターRNAは、RNA標的の存在下で再水和される。Cas13dタンパク質は、レポーターRNAを切断して、側方流動を介した試験ストリップにおけるレポーター分子の遊走、およびそこに局在した抗体への結合によって生じる陽性試験ラインシグナルを生じる。特別な(凍結)貯蔵を必要としないかかる貯蔵安定性の乾燥検出システムは、例えば、標的RNAまたはDNAの検出が、中央集中型の実験施設の外側、例えば、診療所、病院、薬局、農業状況などにおける野外作業の間に実施される状況において有利であると証明され得る。
Cas13dは、広範な温度にわたって活性であり、制御された実験室環境の外側でのかかる適用を実現可能にしている。
(実施例16)
RNA、またはin vitroでRNAへと転写されるDNAについての診断薬としてのCas13d
Cas13dは、最小の診断的なin vitro系において、マッチした標的RNAの存在を可視シグナルへと変換することが可能である。図15A~15D(A)Cas13dは、ガイドRNAのスペーサー配列とマッチする標的を結合した際に、活性なRNase複合体へと変換される。これは、gRNA相補的標的RNAまたは非相補的バイスタンダーRNAを切断することが可能である。(B)Cas13d標的依存的RNase活性は、例えば、Cas13dガイドRNAのスペーサーとマッチする標的の存在下でのみ切断される標識された検出用RNAの切断を介して、検出可能なシグナルへと変換され得る。この例では、検出用RNAは、フルオロフォア「F」および蛍光を消失させるクエンチャー「Q」を含有する。フルオロフォアがクエンチャーから遊離され、蛍光が生成されるのは、バイスタンダーRNA切断の際のみである。(C)E.siraeum由来のCas13dは、完全にマッチした標的の存在下でのみ可視シグナルを生じ、異なるミスマッチした標的の存在下では可視シグナルを生じない。(D)R.flavefaciens株XPD3002由来のCas13dは、完全にマッチした標的の存在下でのみ可視シグナルを生じ、異なるミスマッチした標的の存在下では可視シグナルを生じない。
RNA、またはin vitroでRNAへと転写されるDNAについての診断薬としてのCas13d
Cas13dは、最小の診断的なin vitro系において、マッチした標的RNAの存在を可視シグナルへと変換することが可能である。図15A~15D(A)Cas13dは、ガイドRNAのスペーサー配列とマッチする標的を結合した際に、活性なRNase複合体へと変換される。これは、gRNA相補的標的RNAまたは非相補的バイスタンダーRNAを切断することが可能である。(B)Cas13d標的依存的RNase活性は、例えば、Cas13dガイドRNAのスペーサーとマッチする標的の存在下でのみ切断される標識された検出用RNAの切断を介して、検出可能なシグナルへと変換され得る。この例では、検出用RNAは、フルオロフォア「F」および蛍光を消失させるクエンチャー「Q」を含有する。フルオロフォアがクエンチャーから遊離され、蛍光が生成されるのは、バイスタンダーRNA切断の際のみである。(C)E.siraeum由来のCas13dは、完全にマッチした標的の存在下でのみ可視シグナルを生じ、異なるミスマッチした標的の存在下では可視シグナルを生じない。(D)R.flavefaciens株XPD3002由来のCas13dは、完全にマッチした標的の存在下でのみ可視シグナルを生じ、異なるミスマッチした標的の存在下では可視シグナルを生じない。
したがって、本明細書で開示される系は、診断において使用され得る側方流動デバイス(または他の固体支持体)の一部であり得る。RNAまたはDNA配列の存在は、従来の側方流動によって次いで検出され得るシグナルへと変換され得る。
(実施例17)
Cas13d改変
図16A~16B、Cas13dは、オルソログ間で低い保存を有する領域の短縮を含む改変に適している。図16A中のCas13dオルソログのアライメントは、高い(緑色の棒)および低い(赤色の棒)保存を有する領域を示す。
Cas13d改変
図16A~16B、Cas13dは、オルソログ間で低い保存を有する領域の短縮を含む改変に適している。図16A中のCas13dオルソログのアライメントは、高い(緑色の棒)および低い(赤色の棒)保存を有する領域を示す。
(実施例18)
in vivoで転写物を標的にする
細菌細胞中のccdB遺伝子を、異なるnCas1オルソログ、Eubacterium siraeum nCas1(Es_nCas1;配列番号1);突然変異したHEPNドメインを有するEubacterium siraeum nCas1(Es_nCas1 HEPN-/-;配列番号2);無培養Ruminococcus sp.nCas1(uncul_nCas1;配列番号3)および突然変異したHEPNドメインを有する無培養Ruminococcus sp.nCas1(uncul_nCas1
HEPN-/-;配列番号4)を使用して、in vivoで標的化した(図17A)。化学的にコンピテントなE.coli(株BW25141-DE3)細胞に、(1)アラビノース誘導性ccdBプラスミド、ならびに(2)適合性の複製起点、nCas1タンパク質コード配列、およびccdB転写物を標的にする4つのスペーサー配列を含有するnCas1ガイドアレイを有する第2のプラスミド(標的化ベクター)を形質転換した(図17A)。
in vivoで転写物を標的にする
細菌細胞中のccdB遺伝子を、異なるnCas1オルソログ、Eubacterium siraeum nCas1(Es_nCas1;配列番号1);突然変異したHEPNドメインを有するEubacterium siraeum nCas1(Es_nCas1 HEPN-/-;配列番号2);無培養Ruminococcus sp.nCas1(uncul_nCas1;配列番号3)および突然変異したHEPNドメインを有する無培養Ruminococcus sp.nCas1(uncul_nCas1
HEPN-/-;配列番号4)を使用して、in vivoで標的化した(図17A)。化学的にコンピテントなE.coli(株BW25141-DE3)細胞に、(1)アラビノース誘導性ccdBプラスミド、ならびに(2)適合性の複製起点、nCas1タンパク質コード配列、およびccdB転写物を標的にする4つのスペーサー配列を含有するnCas1ガイドアレイを有する第2のプラスミド(標的化ベクター)を形質転換した(図17A)。
形質転換された細菌を、2mMアラビノースプレート上にプレートして、ccdB発現を誘導し、24時間後に収集した。総RNAを、Trizolを用いて抽出し、その後、ランダムヘキサマー媒介性の逆転写およびTaqmanプローブベースのqPCRを行った。
各nCas1タンパク質中の2つのHEPNドメインの突然変異は、ccdBの標的化を示さないが(図17B、HEPN-/-)、活性な野生型nCas1タンパク質は、ccdBの発現をノックダウンした(図17B、Es_nCas1;uncul_nCas1)。転写開始部位の下流のDNA配列の結合を介したdCas9(触媒的に不活性な、すなわち「死んだ」Cas9)媒介性転写抑制は、当該分野での現在の標準であるので、本発明者らは、dCas9をccdBプロモーターに標的化して、ccdB遺伝子の転写を抑制することによって、アッセイを検証する。合わせると、このデータは、HEPNドメイン依存的様式での、原核生物細胞内でin vivoでの標的転写物のガイドRNA特異的分解を実証している。
(実施例19)
Cas13dオルソログは、ヒト細胞における発現を減少させる
50個の異なるCas13dオルソログ(その一部は、NLSタグSPKKKRKVEAS 配列番号256およびGPKKKRKVAAA 配列番号25、または2つのHIV NES配列(LQLPPLERLTL、配列番号287)を含んだ、表1を参照のこと)を、293細胞においてmCherryまたは内因性CD81発現を減少させるそれらの能力について試験した。
Cas13dオルソログは、ヒト細胞における発現を減少させる
50個の異なるCas13dオルソログ(その一部は、NLSタグSPKKKRKVEAS 配列番号256およびGPKKKRKVAAA 配列番号25、または2つのHIV NES配列(LQLPPLERLTL、配列番号287)を含んだ、表1を参照のこと)を、293細胞においてmCherryまたは内因性CD81発現を減少させるそれらの能力について試験した。
細胞培養
ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞系293FT(Thermo Fisher)を、10%FBS(GE Life Sciences)および10mM HEPESを補充したDMEM(4.5g/Lグルコース)中で、37℃で5%CO2で維持した。80~90%コンフルエンシーに達したところで、細胞を、TrypLE Express(Life Technologies)を使用して解離させ、1:2の比で継代した。
ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞系293FT(Thermo Fisher)を、10%FBS(GE Life Sciences)および10mM HEPESを補充したDMEM(4.5g/Lグルコース)中で、37℃で5%CO2で維持した。80~90%コンフルエンシーに達したところで、細胞を、TrypLE Express(Life Technologies)を使用して解離させ、1:2の比で継代した。
ヒト細胞系の一過的トランスフェクション
Cas13dオルソログを、2つのHIV NES配列(配列番号287)または2つのSV40 NLS配列(SPKKKRKVEAS、配列番号256およびGPKKKRKVAAA、配列番号25)のいずれか、およびT2A連結されたEGFPが隣接する共通の発現骨格中にクローニングした。CD81を標的にするスペーサーを、2つのスペーサーのアレイがU6プロモーターによって駆動されるガイド発現構築物中にクローニングした。
Cas13dオルソログを、2つのHIV NES配列(配列番号287)または2つのSV40 NLS配列(SPKKKRKVEAS、配列番号256およびGPKKKRKVAAA、配列番号25)のいずれか、およびT2A連結されたEGFPが隣接する共通の発現骨格中にクローニングした。CD81を標的にするスペーサーを、2つのスペーサーのアレイがU6プロモーターによって駆動されるガイド発現構築物中にクローニングした。
一過的トランスフェクションの前に、HEK293FT細胞を、96ウェルプレート中に1ウェル当たり20,000細胞の密度でプレートし、製造業者のプロトコールに従ってLipofectamine 2000(Life Technologies)を使用して、>90%コンフルエンスにおいて、200ngのCas13発現プラスミドおよび200ngのgRNA発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、フローサイトメトリーのために、トランスフェクションの72時間後に収集した。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーによる分析の前に、293FT細胞を、FACS緩衝液(1×DPBS-/-、0.2%BSA、2mM EDTA)中で室温で10分間、Human Trustain FcX Blocking Solution(Biolegend)でブロッキングした。次いで、細胞を、氷上でα-CD81-APC(293FT Miltenyi Biotecについて1:400)またはREA293(S)Isotype Control(Miltenyi Biotec)抗体で15分間染色した。フローサイトメトリーを、MACSQuant VYB(Miltenyi Biotec)を使用して96ウェルプレートフォーマットで実施し、FlowJo 10を使用して分析した。
フローサイトメトリーによる分析の前に、293FT細胞を、FACS緩衝液(1×DPBS-/-、0.2%BSA、2mM EDTA)中で室温で10分間、Human Trustain FcX Blocking Solution(Biolegend)でブロッキングした。次いで、細胞を、氷上でα-CD81-APC(293FT Miltenyi Biotecについて1:400)またはREA293(S)Isotype Control(Miltenyi Biotec)抗体で15分間染色した。フローサイトメトリーを、MACSQuant VYB(Miltenyi Biotec)を使用して96ウェルプレートフォーマットで実施し、FlowJo 10を使用して分析した。
表1に示されるように、いくつかのオルソログは、顕著なノックダウン活性(すなわち、ノックダウン効率についてより低い値)を有した。表1において、(trunc)は、保存されていないN末端の短縮を有するオルソログのバージョンを示す。NESは、二重HIV NES融合(配列番号287)を有するオルソログを示し、NLSは、二重SV40 NLS融合(配列番号256および25)を有するオルソログを示す。
表1中のデータを、相対的mCherry発現(ノックダウン効率)対オルソログのサイズとしてプロットし、CasRx(配列番号280)と比較した。図19Aに示されるように、3つのオルソログ(Ga0531-NLS、k87-NESおよびGa7274-NLS、それぞれ、配列番号235、189および198)は、CasRxバリアント(配列番号280)と匹敵する活性を示す。
表1および図19Aに示される25個の最も活性なオルソログを、HEK293細胞における内因性遺伝子CD81の発現を減少させるそれらの能力について試験した。図19Bに示されるように、CasRxバリアントRfxCas13d-NLS(配列番号280)は、最も高いレベルのノックダウンを示し、いくつかのさらなるオルソログは、この内因性標的に対して>75%のノックダウンを示した。
>70%のノックダウンを示す5つのオルソログの分析により、以下のコンセンサスモチーフが、低い活性(<50%のノックダウン)を有するCas13dオルソログと比較して、ヒト細胞において高い活性を有するCas13dオルソログにおいて、より高い頻度で存在することが示された。したがって、かかるコンセンサスモチーフを有するCas13dタンパク質(例えば、配列番号288、289、290または291を含むタンパク質配列、ならびにそれらをコードする核酸、かかる核酸をコードするベクター、およびかかるタンパク質/核酸を使用する方法)が、本明細書で提供される:
(実施例20)
CasRxのPspCas13b-NESに対するノックダウン活性の比較
CasRx(RfxCas13d-NLS設計;配列番号280)が293FT細胞において内因性CD81タンパク質発現をノックダウンする能力を、PspCas13b-NESと比較した(Cox et al., Science. 2017 Nov 24;358(6366):1019-1027を参照のこと)。293FT細胞を培養し、一過的にトランスフェクトし、3日後、CD81発現を、実施例19に記載されるように、フローサイトメトリーを使用して検出した。
CasRxのPspCas13b-NESに対するノックダウン活性の比較
CasRx(RfxCas13d-NLS設計;配列番号280)が293FT細胞において内因性CD81タンパク質発現をノックダウンする能力を、PspCas13b-NESと比較した(Cox et al., Science. 2017 Nov 24;358(6366):1019-1027を参照のこと)。293FT細胞を培養し、一過的にトランスフェクトし、3日後、CD81発現を、実施例19に記載されるように、フローサイトメトリーを使用して検出した。
図20に示されるように、CasRx(配列番号280)は、等価なタンパク質レベルにおいて顕著により高い活性を示し(Cas13-GFP発現によって測定される)、これは、酵素1単位当たりのより高い活性、したがって、生物学的/治療的に適切なレベルのノックダウンに達するための、より低い必要用量を示している。さらに、CasRxは、PspCas13bよりも顕著に小さい。小さいサイズ、および低い容量での高い活性は、CasRxを、治療的送達にとって有用なものにする。
(実施例21)
Cas13dオルソログに対する欠失の効果
Cas13dオルソログに対する欠失の効果を、以下のように試験した。簡潔に述べると、アミノ酸(aa)欠失を、2つの異なるCas13dオルソログGa-531(配列番号235)およびRfxCas13d(配列番号280)中に操作した。アミノ酸欠失を、N末端、C末端または内部において行った。短縮のための領域は、Cas13dオルソログ間でのそれらの低い保存に基づいて選択した(例えば、図18A~18MMMを参照のこと)。最大50aaの欠失を、単一のタンパク質において行った。得られたタンパク質配列を、表2に示す。
Cas13dオルソログに対する欠失の効果
Cas13dオルソログに対する欠失の効果を、以下のように試験した。簡潔に述べると、アミノ酸(aa)欠失を、2つの異なるCas13dオルソログGa-531(配列番号235)およびRfxCas13d(配列番号280)中に操作した。アミノ酸欠失を、N末端、C末端または内部において行った。短縮のための領域は、Cas13dオルソログ間でのそれらの低い保存に基づいて選択した(例えば、図18A~18MMMを参照のこと)。最大50aaの欠失を、単一のタンパク質において行った。得られたタンパク質配列を、表2に示す。
293FT細胞を培養し、一過的にトランスフェクトし、3日後、CD81発現を、実施例19に記載されるように、フローサイトメトリーを使用して検出した。
図21に示されるように、Cas13dオルソログである、低保存された領域中に欠失を含有するCasRxおよびGa0531は、ヒトHEK293FT細胞においてノックダウン活性を維持する。これらの結果に基づいて、類似の欠失が、本明細書で提供される配列アライメントを使用して、本明細書で提供される他のCas13dオルソログに対して行われ得る。
(実施例22)
dCas13d媒介性スプライシング
高レベルのタンパク質ノックダウンを示した(実施例19~20を参照のこと)いくつかのCas13dオルソログ(ネイティブおよび短縮型バリアント、実施例21を参照のこと)がスプライシングを指示する能力を、以下のように試験した。Cas13dオルソログ(標的RNA切断を消失させる、突然変異したHEPNドメインを有する)は、二色の青対赤のスプライスレポーターのスプライスアクセプター部位に標的化されて、エクソン排除(mTagBFP2発現における低減によって測定される)を媒介した。293FT細胞を培養し、一過的にトランスフェクトし、3日後、CD81発現を、実施例19に記載されるように、フローサイトメトリーを使用して検出した。
dCas13d媒介性スプライシング
高レベルのタンパク質ノックダウンを示した(実施例19~20を参照のこと)いくつかのCas13dオルソログ(ネイティブおよび短縮型バリアント、実施例21を参照のこと)がスプライシングを指示する能力を、以下のように試験した。Cas13dオルソログ(標的RNA切断を消失させる、突然変異したHEPNドメインを有する)は、二色の青対赤のスプライスレポーターのスプライスアクセプター部位に標的化されて、エクソン排除(mTagBFP2発現における低減によって測定される)を媒介した。293FT細胞を培養し、一過的にトランスフェクトし、3日後、CD81発現を、実施例19に記載されるように、フローサイトメトリーを使用して検出した。
図22に示されるように、高レベルの内因性タンパク質ノックダウン(>70%のCD81タンパク質ノックダウン)を有するオルソログについてさえ、スプライシングモジュレーションは、一部の場合には非効率的であった。しかし、dCasRx(配列番号280)、dCasRx-del13(配列番号285)およびdGa7274(配列番号198)は全て、良好なスプライシング活性を示した。これら3つの配列は、比較的密接に関連しており、>70%の配列同一性を共有する。したがって、Cas13dオルソログ、例えばCasRx、および短縮型CasRxバリアント、例えばCasRx-del13は、スプライシングをモジュレートするために使用され得る。
(実施例23)
Cas13dを使用するRNA編集
この実施例は、ヒト細胞においてRNA発現を編集するためのCas13dの使用を記載する。
Cas13dを使用するRNA編集
この実施例は、ヒト細胞においてRNA発現を編集するためのCas13dの使用を記載する。
細胞培養
ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞系293FT(Thermo Fisher)を、10%FBS(GE Life Sciences)および10mM HEPESを補充したDMEM(4.5g/Lグルコース)中で、37℃で5%CO2で維持した。80~90%コンフルエンシーに達したところで、細胞を、TrypLE Express(Life Technologies)を使用して解離させ、1:2の比で継代した。
ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞系293FT(Thermo Fisher)を、10%FBS(GE Life Sciences)および10mM HEPESを補充したDMEM(4.5g/Lグルコース)中で、37℃で5%CO2で維持した。80~90%コンフルエンシーに達したところで、細胞を、TrypLE Express(Life Technologies)を使用して解離させ、1:2の比で継代した。
dCas13d-ADAR哺乳動物発現構築物のクローニング
図23Aに示されるように、dCas13bおよびdCas13dコード配列を、ADAR2DD(T375G)へのN末端またはC末端融合、ならびにC末端NLSまたはNES配列(例えば、配列番号286を参照のこと)と共に、哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。dCas13-ADAR融合物によるAからIへのRNA編集を評価するために使用したEGFPレポーターは、トリプトファン57において成熟前停止コドン(UAG)を含有するように操作し(W57X)、P2AペプチドリンカーによってmCherryに連結させた。このEGFPレポーターを標的にするガイドを、可変性のスペーサー長、およびダイレクトリピート配列(RfxCas13dについては5’、PspCas13bについては3’)から規定された距離離れたA-Cミスマッチを用いて設計した。
図23Aに示されるように、dCas13bおよびdCas13dコード配列を、ADAR2DD(T375G)へのN末端またはC末端融合、ならびにC末端NLSまたはNES配列(例えば、配列番号286を参照のこと)と共に、哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。dCas13-ADAR融合物によるAからIへのRNA編集を評価するために使用したEGFPレポーターは、トリプトファン57において成熟前停止コドン(UAG)を含有するように操作し(W57X)、P2AペプチドリンカーによってmCherryに連結させた。このEGFPレポーターを標的にするガイドを、可変性のスペーサー長、およびダイレクトリピート配列(RfxCas13dについては5’、PspCas13bについては3’)から規定された距離離れたA-Cミスマッチを用いて設計した。
ヒト細胞系の一過的トランスフェクション
一過的トランスフェクションの前に、HEK293FT細胞を、96ウェルプレート中に1ウェル当たり20,000細胞の密度でプレートし、製造業者のプロトコールに従ってLipofectamine 2000(Life Technologies)を使用して、>90%のコンフルエンスにおいて、40ngのEGFP(W57X)レポータープラスミドおよびガイド発現ベクターに対する変動するモル比のdCas13d-ADARベクターと共に、500ngの総プラスミドDNAを、トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、フローサイトメトリーのために、トランスフェクションの48時間後に収集した。
一過的トランスフェクションの前に、HEK293FT細胞を、96ウェルプレート中に1ウェル当たり20,000細胞の密度でプレートし、製造業者のプロトコールに従ってLipofectamine 2000(Life Technologies)を使用して、>90%のコンフルエンスにおいて、40ngのEGFP(W57X)レポータープラスミドおよびガイド発現ベクターに対する変動するモル比のdCas13d-ADARベクターと共に、500ngの総プラスミドDNAを、トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、フローサイトメトリーのために、トランスフェクションの48時間後に収集した。
フローサイトメトリー
細胞を、トランスフェクションの48時間後にTrypLE Expressで解離させ、FACS緩衝液(1×DPBS-/-、0.2%BSA、2mM EDTA)中に再懸濁した。フローサイトメトリーを、MACSQuant VYB(Miltenyi Biotec)を使用して96ウェルプレートフォーマットで実施し、FlowJo 10を使用して分析した。分析は、BFP+(dCas13d-ADAR-P2A-mTagBFP2を発現している)およびmCherry+(mCherry-P2A-EGFP(W47X)を発現している)集団を示し、これらを、ベースラインを上回ってEGFPを発現している細胞の%を観察することによって、RNA編集について評価した。
細胞を、トランスフェクションの48時間後にTrypLE Expressで解離させ、FACS緩衝液(1×DPBS-/-、0.2%BSA、2mM EDTA)中に再懸濁した。フローサイトメトリーを、MACSQuant VYB(Miltenyi Biotec)を使用して96ウェルプレートフォーマットで実施し、FlowJo 10を使用して分析した。分析は、BFP+(dCas13d-ADAR-P2A-mTagBFP2を発現している)およびmCherry+(mCherry-P2A-EGFP(W47X)を発現している)集団を示し、これらを、ベースラインを上回ってEGFPを発現している細胞の%を観察することによって、RNA編集について評価した。
図23Bに示されるように、GFPレポーターにおける、成熟前停止コドンの、Cas13dを使用する標的化されたAからIへのRNA編集は、GFP発現を再活性化するが、非標的化ガイドは、RNA編集を生じなかった。図23Cは、細胞中にトランスフェクトされたdCas13d-ADARベクターの量に基づいた、Cas13d媒介性RNA編集効率の定量を提供する。
(実施例24)
アンチセンスオリゴヌクレオチドのCas13媒介性識別
有効なアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)結合性部位の発見は、遺伝子コード化の欠如、ASO生成の労力を要する性質、および化学的改変の頻繁な必要に起因して、低スループットで高価なプロセスであり得る。Cas13酵素およびそのバリアント、例えば、本明細書で開示されるCas13dタンパク質およびバリアントは、ASO結合性部位の識別を単純化および加速するために使用され得るが、それは、触媒的に活性なまたは不活性なCas13/dCas13の結合が、ASO媒介性のRNA切断および/または結合の効果を模倣することができるからである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのCas13媒介性識別
有効なアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)結合性部位の発見は、遺伝子コード化の欠如、ASO生成の労力を要する性質、および化学的改変の頻繁な必要に起因して、低スループットで高価なプロセスであり得る。Cas13酵素およびそのバリアント、例えば、本明細書で開示されるCas13dタンパク質およびバリアントは、ASO結合性部位の識別を単純化および加速するために使用され得るが、それは、触媒的に活性なまたは不活性なCas13/dCas13の結合が、ASO媒介性のRNA切断および/または結合の効果を模倣することができるからである。
一例では、Cas13ガイドRNAのライブラリーは、例えば、ウェル毎の、またはプールされたオリゴヌクレオチドのフォーマットで生成され、所望のRNAの特異的シス-エレメントを標的にするために設計される(例えば、有効かつ部位アクセス可能なASO結合性部位を識別するために、治療的に重要なタンパク質、例えば、ジストロフィンまたはSMN1/SMN2のプレmRNAのイントロン、またはUTRまたは遺伝子本体内の所望の位置をタイリングする)。この方法は、ASOリード発見、in vivo RNA二次構造の照合、および公知のまたは新規のスプライシング調節エレメントの識別に利用され得る。
(実施例25)
Cas13を用いて翻訳を増加させる
本明細書で開示されるCas13d酵素およびバリアントは、転写後調節プロセスの標的化された操作によって、標的タンパク質の翻訳を増加させるために使用され得る。上流オープンリーディングフレーム(uORF)のCas13d媒介性阻害(例えば、立体遮断または他の機構を介した)は、この操作を達成するために使用され得る。例えば、本明細書で開示されるCas13d酵素およびバリアントを使用するCas13d媒介性阻害は、ヒトまたは哺乳動物遺伝子の翻訳のための代替的開始部位、または標的遺伝子のUTR内の翻訳阻害性モチーフおよびエレメントとして機能し得る。uORFを阻害することによって、減少したリボソーム競合および他の機構が、カノニカルまたは所望の開始コドンからの標的遺伝子の翻訳を増加させ得る。ヒト転写物のほぼ半分がuORFを示し(Barbosa et al., Plos Genetics 9:e1003529, 2013)、これが、タンパク質発現の広範な低減を引き起こし得る。同様に、5’UTR内の阻害性エレメント、例えば、二次構造またはG-四重鎖を不活性化することによって、翻訳が増加され得る。
Cas13を用いて翻訳を増加させる
本明細書で開示されるCas13d酵素およびバリアントは、転写後調節プロセスの標的化された操作によって、標的タンパク質の翻訳を増加させるために使用され得る。上流オープンリーディングフレーム(uORF)のCas13d媒介性阻害(例えば、立体遮断または他の機構を介した)は、この操作を達成するために使用され得る。例えば、本明細書で開示されるCas13d酵素およびバリアントを使用するCas13d媒介性阻害は、ヒトまたは哺乳動物遺伝子の翻訳のための代替的開始部位、または標的遺伝子のUTR内の翻訳阻害性モチーフおよびエレメントとして機能し得る。uORFを阻害することによって、減少したリボソーム競合および他の機構が、カノニカルまたは所望の開始コドンからの標的遺伝子の翻訳を増加させ得る。ヒト転写物のほぼ半分がuORFを示し(Barbosa et al., Plos Genetics 9:e1003529, 2013)、これが、タンパク質発現の広範な低減を引き起こし得る。同様に、5’UTR内の阻害性エレメント、例えば、二次構造またはG-四重鎖を不活性化することによって、翻訳が増加され得る。
これは、ガイドRNAを使用して、翻訳阻害を増加させ得るエフェクタータンパク質(例えば、Pdcd4のC末端ドメインMA3ドメイン)に、uORFまたは翻訳阻害性エレメントに、必要に応じて融合させたCas13dエフェクターを標的にすることによって達成され得る。前記ガイドRNAは、複数のガイドRNAまたはプレgRNAアレイのいずれかを介して、多重化様式でも送達され得る。かかる方法は、治療的またはバイオテクノロジー的に有用なタンパク質、例えば、家族性高コレステロール血症におけるLDLR、嚢胞性線維症におけるCFTR、先天性高インスリン症におけるKCNJ11、鎌状赤血球症におけるHBB;PRKAR1A、IRF6およびその他の翻訳を増加させるために使用され得る(Barbosa et al., Plos Genetics 9:e1003529, 2013; Calvo et al., PNAS 106:7507-12, 2009)。
(実施例26)
Cas13による合成致死遺伝子スクリーニング
本明細書で開示されるCas13d酵素およびバリアントは、例えば、リード小分子または阻害性RNA(RNAi)を模倣することによって、治療的化合物の識別を補助するために、スクリーニング方法において使用され得る。例えば、腫瘍サプレッサーまたは癌遺伝子についての合成致死相互作用を利用することで、目的のがん細胞または他の細胞を選択的に阻害する化合物(例えば、小分子または阻害性RNA)の識別が可能になる。化学的化合物、CRISPR-Cas9およびRNAiによる合成致死遺伝子相互作用の発見のための従来のハイスループットスクリーニングは全て、未知のまたは複数の標的遺伝子(化学的化合物について)、オフターゲット遺伝子に対する多面的な効果(化学的化合物およびRNAi)、および不適切な二重機能喪失(CRISPR-Cas9または他のヌクレアーゼベースのアプローチについて)を含む制限を有する。
Cas13による合成致死遺伝子スクリーニング
本明細書で開示されるCas13d酵素およびバリアントは、例えば、リード小分子または阻害性RNA(RNAi)を模倣することによって、治療的化合物の識別を補助するために、スクリーニング方法において使用され得る。例えば、腫瘍サプレッサーまたは癌遺伝子についての合成致死相互作用を利用することで、目的のがん細胞または他の細胞を選択的に阻害する化合物(例えば、小分子または阻害性RNA)の識別が可能になる。化学的化合物、CRISPR-Cas9およびRNAiによる合成致死遺伝子相互作用の発見のための従来のハイスループットスクリーニングは全て、未知のまたは複数の標的遺伝子(化学的化合物について)、オフターゲット遺伝子に対する多面的な効果(化学的化合物およびRNAi)、および不適切な二重機能喪失(CRISPR-Cas9または他のヌクレアーゼベースのアプローチについて)を含む制限を有する。
1)公知の標的遺伝子または遺伝子のセットを標的にするためのその特異性、および2)小分子リードの阻害機構をより正確に反映するそのノックダウン機構、に起因して、薬理学的に方向付けられた合成致死性について「第2のヒット」をモデリングする際のこれらの課題に対処するための腫瘍学リード発見において、本明細書で開示されるCas13d酵素およびバリアントを使用するための方法が提供される。例えば、Cas13dまたは他のCas13酵素は、特定の突然変異を有する細胞(例えば、KRAS突然変異体肺がん細胞、BRCA-ヌル卵巣がん細胞およびその他多数)中に、同族ガイドRNAと共に導入され得る。次いで、成長阻害または細胞喪失の表現型読み出しが、アレイされたフォーマットまたはガイドRNAプールされた遺伝子スクリーニングのいずれかにおいて実施され、その後、目的の遺伝子を識別するための遺伝子分析が行われ得る。
参考文献
Abudayyeh (2017). RNA targeting with CRISPR-Cas13 . Nature. 550:280-4.
Abudayye et al., (2016). Science 353, aaf5573.
Almeida et al., (2012). Cell Rep 2, 789-798.
Anantharaman et al., (2013) Biol Direct 8, 15.
Batra et al., (2017). Cell 170, 899-912 e810.
Birmingham et al., (2006) Nat Methods 3, 199-204.
Biswas et al., (2016) Stem Cell Reports 7, 316-324.
Bland et al., (2007). BMC Bioinformatics 8, 209.
Boeve, B.F., and Hutton, M. (2008). Arch Neurol 65, 460-464.
Cheong, C.G., and Hall, T.M. (2006). Proc Natl Acad Sci U S A 103,
13635-13639.
Chiriboga et al., (2016). Neurology 86, 890-897.
Chylinski et al., (2013). RNA Biol 10, 726-737.
Cox et al., (2017). Science 358, 1019-1027.
Deltcheva et al., (2011). Nature 471, 602-607.
Dobin et al., (2013). Bioinformatics 29, 15-21.
Doench et al., . (2003). Genes Dev 17, 438-442.
Doudna, J.A., and Charpentier, E. (2014). Science 346, 1258096.
Du et al., (2006). Mol Cell Proteomics 5, 1033-1044.
East-Seletsky et al., (2017). Mol Cell 66, 373-383 e373.
East-Seletsky et al., (2016). Nature 538, 270-273.
Edgar, R.C. (2007). BMC Bioinformatics 8, 18.
Fonfara et al., (2016). Nature 532, 517-521.
Gasiunas et al., (2012). Proc Natl Acad Sci U S A 109, E2579-2586.
Gilbert et al., (2014). Cell 159, 647-661.
Gilbert et al. (2013). Cell 154, 442-451.
Grissa, I., Vergnaud, G., and Pourcel, C. (2007). Nucleic Acids Res 35, W52-57.
Hammond, S.M., and Wood, M.J. (2011). Trends Genet 27, 196-205.Heidrich et al.,. (2015). Methods Mol Biol 1311, 1-21.
Heinz et al., (2010). Mol Cell 38, 576-589.
Hsu, P.D., Lander, E.S., and Zhang, F. (2014). Cell 157, 1262-1278.
Jackson et al., (2003). Nat Biotechnol 21, 635-637.
Jinek et al., (2012). Science 337, 816-821.
Ka et al., (2005) Alzheimer Dis Assoc Disord 19 Suppl 1, S29-36.
Kim et al. (2017). Nat Commun 8, 14500.
Liu et al., (2017). Cell 168, 121-134 e112.
Love, M.I., Huber, W., and Anders, S. (2014). Genome Biol 15, 550.
Makarova et al. (2015). Nat Rev Microbiol 13, 722-736.
Matera, A.G., and Wang, Z. (2014). Nat Rev Mol Cell Biol 15, 108-121.
Naldini, L. (2015). Gene therapy returns to centre stage. Nature 526,
351-360.
O'Connell et al., (2014). Nature 516, 263-266.
Orengo, J.P., Bundman, D., and Cooper, T.A. (2006). Nucleic Acids Res 34, e148.
Peabody, D.S. (1993). EMBO J 12, 595-600.
Ran et al., (2015). Nature 520, 186-191.
Samai et al., (2015). Cell 161, 1164-1174.
Schena et al., (1995). Science 270, 467-470.
Schoch et al., (2016). I Neuron 90, 941-947.
Shendure et al., (2017). Nature 550:345-53.
Shmakov et al., (2015) Mol Cell 60, 385-397.
Sigoillot et al., (2012). Nat Methods 9, 363-366.
Smargon et al., (2017). Mol Cell 65, 618-630 e617.
Smith et al., (2017). PLoS Biol 15, e2003213.
Swiech et al., (2015). Nat Biotechnol 33, 102-106.
Treu et al., (2016). Bioresour Technol 216, 260-266.
van der Oos et al., (2014).. Nat Rev Microbiol 12, 479-492.
Wang et al., (2015). Biomed Rep 3, 152-158.
Wright, A.V., and Doudna, J.A. (2016). Nat Struct Mol Biol 23, 876-883.
Yang et al., (2010). J Proteome Res 9, 1402-1415.
Yosef et al., (2012). Nucleic Acids Res 40, 5569-5576.
Zalatan et al., (2015). Cell 160, 339-350.
Zetsche et al.,. (2015). Cell 163, 759-771.
Zetsche, et al., (2017). A Survey of Genome Editing Activity for 16 Cpf1 orthologs. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/134015
Zhang et al., (2016). M Nucleic Acids Res 44, 1789-1799.
Zhang et al., (2013). RNeuron 78, 785-798.
Abudayyeh (2017). RNA targeting with CRISPR-Cas13 . Nature. 550:280-4.
Abudayye et al., (2016). Science 353, aaf5573.
Almeida et al., (2012). Cell Rep 2, 789-798.
Anantharaman et al., (2013) Biol Direct 8, 15.
Batra et al., (2017). Cell 170, 899-912 e810.
Birmingham et al., (2006) Nat Methods 3, 199-204.
Biswas et al., (2016) Stem Cell Reports 7, 316-324.
Bland et al., (2007). BMC Bioinformatics 8, 209.
Boeve, B.F., and Hutton, M. (2008). Arch Neurol 65, 460-464.
Cheong, C.G., and Hall, T.M. (2006). Proc Natl Acad Sci U S A 103,
13635-13639.
Chiriboga et al., (2016). Neurology 86, 890-897.
Chylinski et al., (2013). RNA Biol 10, 726-737.
Cox et al., (2017). Science 358, 1019-1027.
Deltcheva et al., (2011). Nature 471, 602-607.
Dobin et al., (2013). Bioinformatics 29, 15-21.
Doench et al., . (2003). Genes Dev 17, 438-442.
Doudna, J.A., and Charpentier, E. (2014). Science 346, 1258096.
Du et al., (2006). Mol Cell Proteomics 5, 1033-1044.
East-Seletsky et al., (2017). Mol Cell 66, 373-383 e373.
East-Seletsky et al., (2016). Nature 538, 270-273.
Edgar, R.C. (2007). BMC Bioinformatics 8, 18.
Fonfara et al., (2016). Nature 532, 517-521.
Gasiunas et al., (2012). Proc Natl Acad Sci U S A 109, E2579-2586.
Gilbert et al., (2014). Cell 159, 647-661.
Gilbert et al. (2013). Cell 154, 442-451.
Grissa, I., Vergnaud, G., and Pourcel, C. (2007). Nucleic Acids Res 35, W52-57.
Hammond, S.M., and Wood, M.J. (2011). Trends Genet 27, 196-205.Heidrich et al.,. (2015). Methods Mol Biol 1311, 1-21.
Heinz et al., (2010). Mol Cell 38, 576-589.
Hsu, P.D., Lander, E.S., and Zhang, F. (2014). Cell 157, 1262-1278.
Jackson et al., (2003). Nat Biotechnol 21, 635-637.
Jinek et al., (2012). Science 337, 816-821.
Ka et al., (2005) Alzheimer Dis Assoc Disord 19 Suppl 1, S29-36.
Kim et al. (2017). Nat Commun 8, 14500.
Liu et al., (2017). Cell 168, 121-134 e112.
Love, M.I., Huber, W., and Anders, S. (2014). Genome Biol 15, 550.
Makarova et al. (2015). Nat Rev Microbiol 13, 722-736.
Matera, A.G., and Wang, Z. (2014). Nat Rev Mol Cell Biol 15, 108-121.
Naldini, L. (2015). Gene therapy returns to centre stage. Nature 526,
351-360.
O'Connell et al., (2014). Nature 516, 263-266.
Orengo, J.P., Bundman, D., and Cooper, T.A. (2006). Nucleic Acids Res 34, e148.
Peabody, D.S. (1993). EMBO J 12, 595-600.
Ran et al., (2015). Nature 520, 186-191.
Samai et al., (2015). Cell 161, 1164-1174.
Schena et al., (1995). Science 270, 467-470.
Schoch et al., (2016). I Neuron 90, 941-947.
Shendure et al., (2017). Nature 550:345-53.
Shmakov et al., (2015) Mol Cell 60, 385-397.
Sigoillot et al., (2012). Nat Methods 9, 363-366.
Smargon et al., (2017). Mol Cell 65, 618-630 e617.
Smith et al., (2017). PLoS Biol 15, e2003213.
Swiech et al., (2015). Nat Biotechnol 33, 102-106.
Treu et al., (2016). Bioresour Technol 216, 260-266.
van der Oos et al., (2014).. Nat Rev Microbiol 12, 479-492.
Wang et al., (2015). Biomed Rep 3, 152-158.
Wright, A.V., and Doudna, J.A. (2016). Nat Struct Mol Biol 23, 876-883.
Yang et al., (2010). J Proteome Res 9, 1402-1415.
Yosef et al., (2012). Nucleic Acids Res 40, 5569-5576.
Zalatan et al., (2015). Cell 160, 339-350.
Zetsche et al.,. (2015). Cell 163, 759-771.
Zetsche, et al., (2017). A Survey of Genome Editing Activity for 16 Cpf1 orthologs. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/134015
Zhang et al., (2016). M Nucleic Acids Res 44, 1789-1799.
Zhang et al., (2013). RNeuron 78, 785-798.
本開示の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮すると、例示された実施形態は、本発明の例に過ぎず、本発明の範囲の限定と解釈すべきでないことを認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、本発明者らの発明として、これらの特許請求の範囲の範囲および精神に入るものを全て特許請求する。
本願発明は、また、下記態様を提供する。
(項目1)
1つまたは複数の標的RNA分子を標的にする方法であって、
1つまたは複数の標的RNA分子を、天然に存在しないかまたは操作されたクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造のリピート(CRISPR)関連(Cas)系と接触させるステップであって、前記系が、
少なくとも1つのCas13dタンパク質または前記少なくとも1つのCas13dタンパク質をコードする核酸分子、および
前記1つまたは複数の標的RNA分子とハイブリダイズする少なくとも1つのCRISPR-Cas系ガイドRNA(gRNA)、または前記gRNAをコードする少なくとも1つの核酸分子
を含み、
それによって、前記Cas13dタンパク質が、前記gRNAと複合体を形成し、前記gRNAが、前記複合体を、前記1つまたは複数の標的RNA分子へと指向させ、前記1つまたは複数の標的RNA分子を標的にする、ステップ
を含む、方法。
(項目2)
CRISPR-Cas系に媒介されるRNA標的化方法であって、
1つまたは複数の標的RNA分子を、天然に存在しないかまたは操作されたクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造のリピート(CRISPR)-CRISPR関連(Cas)系と接触させるステップであって、前記系が、
少なくとも1つのCas13dタンパク質または前記少なくとも1つのCas13dタンパク質をコードする核酸分子、および
前記1つまたは複数の標的RNA分子とハイブリダイズする少なくとも1つのCRISPR-Cas系gRNA、または前記gRNAをコードする少なくとも1つの核酸分子を含み、
それによって、前記Cas13dタンパク質が、前記gRNAと複合体を形成し、前記gRNAが、前記複合体を、前記1つまたは複数の標的RNA分子へと指向させ、前記1つまたは複数の標的RNA分子を標的にする、ステップ
を含む、方法。
(項目3)
前記1つまたは複数の標的RNA分子を、前記天然に存在しないかまたは操作されたCRISPR-Cas系と接触させるステップが、前記1つまたは複数の標的RNA分子を含有する細胞に、前記天然に存在しないかまたは操作されたCRISPR-Cas系を導入することを含む、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記CRISPR-Cas系が、エンドサイトーシス、リポソーム、粒子、エクソソーム、微細小胞、遺伝子銃、エレクトロポレーション、ウイルス、またはこれらの組合せを使用して、前記細胞に導入される、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記細胞が、真核生物細胞である、項目3または4に記載の方法。
(項目6)
前記1つまたは複数の標的RNA分子または前記細胞が、前記少なくとも1つのCas13dタンパク質および前記少なくとも1つのCRISPR-Cas系gRNAを含む複合体と接触する、項目1から5のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
前記少なくとも1つのCas13dタンパク質が、
1つまたは複数のHEPNドメインを含むか、
150kD以下、140kd以下、130kD以下、120kD以下、例えば、約90~120kD、約100~120kD、または約110kDであるか、 1つまたは複数の変異型HEPNドメインを含み、前記ガイドRNAをプロセシングすることができるが、前記1つまたは複数の標的RNA分子を切り離すことはできないか、
原核生物ゲノムまたはメタゲノム、消化管メタゲノム、活性汚泥メタゲノム、嫌気性消化器メタゲノム、ニワトリ消化管メタゲノム、ヒト消化管メタゲノム、ブタ消化管メタゲノム、ウシ消化管メタゲノム、ヒツジ消化管メタゲノム、ヤギ消化管メタゲノム、カピバラ消化管メタゲノム、霊長類消化管メタゲノム、シロアリ消化管メタゲノム、糞便メタゲノム、Order ClostridialesまたはFamily Ruminococcaceae由来のゲノムに由来するCas13dオルソログを含むか、
Ruminococcus albus、Eubacterium siraeum、Ruminococcus flavefaciens株XPD3002、Ruminococcus flavefaciens FD-1、無培養Eubacterium sp TS28-c4095、無培養Ruminococcus sp.、Ruminococcus bicirculans、またはRuminococcus sp CAG57に由来するCas13dオルソログを含むか、
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含むか、
配列番号195、196、または197に示されるモチーフを含むか、
配列番号288、289、290、または291に示されるコンセンサス配列を含むか、
1つまたは複数のアミノ酸欠失を含むか、
1つまたは複数のアミノ酸挿入を含むか、
共送達された場合に全長機能性酵素を再構成することができる、2つまたはそれを上回る断片に分割されているか、
異なるCas13dオルソログのキメラとなるように修飾されているか、
少なくとも1%、例えば、1~10%短縮されているか、
必要に応じて、1つまたは複数の細胞内局在化シグナル、エフェクタードメイン、精製タグ、親和性タグをさらに含むか、または
これらの組合せである、項目1から6のいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
前記少なくとも1つのCas13dタンパク質をコードする前記核酸分子が、
真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている少なくとも1つのCas13dタンパク質コード配列、
原核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている少なくとも1つのCas13dタンパク質コード配列、 ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されており、配列番号114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、142、143、144、または145に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含む、少なくとも1つのCas13dタンパク質コード配列、
配列番号124、125、126、127、128、139、140、または141に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含む、少なくとも1つのCas13dタンパク質コード配列、
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含むタンパク質をコードする、少なくとも1つのCas13dタンパク質コード配列、
原核生物ゲノムまたはメタゲノムに由来する少なくとも1つのCas13dオルソログ、または
消化管メタゲノム、活性汚泥メタゲノム、嫌気性消化器メタゲノム、ニワトリ消化管メタゲノム、ヒト消化管メタゲノム、ブタ消化管メタゲノム、ウシ消化管メタゲノム、ヒツジ消化管メタゲノム、ヤギ消化管メタゲノム、カピバラ消化管メタゲノム、霊長類消化管メタゲノム、シロアリ消化管メタゲノム、糞便メタゲノム、Order ClostridialesまたはFamily Ruminococcaceae由来のゲノムに由来する少なくとも1つのCas13dオルソログ
を含む、項目1から7のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記少なくとも1つのCas13dタンパク質をコードする前記核酸分子が、前記少なくとも1つのCas13dタンパク質コード配列に作動可能に連結したプロモーターを含み、必要に応じて、ベクターの一部である、項目1から8のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記1つまたは複数の標的RNA分子とハイブリダイズするgRNAが、
成熟gRNA、
プレgRNA、
1つまたは複数の全長または短縮型ダイレクトリピート(DR)配列、
1つまたは複数のスペーサー配列、DR-スペーサー-DR-スペーサーを含む、1つまたは複数の配列、
配列番号129、130、131、132、133、134、135、136、137、148、150、151、152、154、156、157、159、161、163、165、167、169、176、178、180、182、184、186、188、190、191、192、193、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252または254に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含む、1つまたは複数のDR配列、
必要に応じて、前記gRNAに挿入された核酸アプタマー、
またはこれらの組合せ
を含む、項目1から9のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
1つまたは複数の標的RNA分子を標的にするステップが、前記1つまたは複数の標的RNA分子を切り離すこと、前記1つまたは複数の標的RNA分子にニックを入れること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を活性化すること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を脱活性化すること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を視覚化または検出すること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を標識すること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を結合すること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を濃縮すること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を枯渇させること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を編集すること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を輸送すること、前記1つまたは複数の標的RNA分子をスプライシングするかまたはその前記スプライシングを撹乱させること、および前記1つまたは複数の標的RNA分子をマスクすることのうちの1つまたは複数を含む、項目1から10のいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
1つまたは複数の標的RNA分子を修飾するステップが、
RNA塩基置換、
RNA塩基欠失、
RNA塩基挿入、
標的RNAにおける破断、
エクソンの排除、
エクソンの包含、
RNAスプライシングの撹乱、
前記RNA分子の翻訳の撹乱、
RNAのメチル化、
RNAの脱メチル化
のうちの1つまたは複数を含む、項目1から11のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
前記1つまたは複数の標的RNA分子が、非コードRNAである、項目1から12のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記方法が、疾患を処置し、前記1つまたは複数の標的RNA分子が、前記疾患と関連している、項目1から13のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
複数のgRNAが、アレイの一部である、項目1から13のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記方法が、診断方法であり、 前記1つまたは複数の標的RNA分子を、前記天然に存在しないかまたは操作されたCRISPR-Cas系と接触させるステップが、前記天然に存在しないかまたは操作されたCRISPR-Cas系を、前記1つまたは複数の標的RNA分子を含む試料および標識を含む別個のRNAと接触させることを含み、
必要に応じて、前記試料に存在する核酸分子を転写させること、
必要に応じて、前記試料に存在する核酸分子を増幅させること、および
前記標識を検出すること
を含み、前記標識を検出することが、前記試料における1つまたは複数の標的RNAの存在を示す、項目1から15のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
前記試料が、DNA、RNA、RNAに変換および/もしくは増幅されるゲノムDNA、生物学的患者試料、または環境試料を含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
標識を含む前記RNAが、フルオロフォアおよびクエンチャーを含むRNAを含み、前記標識を検出することが、前記フルオロフォアから放出される蛍光を検出することを含むか、
標識を含む前記RNAが、フルオロフォアを含むRNAを含み、前記標識を検出することが、前記フルオロフォアから放出される蛍光を検出することを含むか、または
標識を含む前記RNAが、非蛍光性分子を含むRNAを含み、前記標識を検出することが、前記非蛍光性分子を検出することを含む、項目16または17に記載の方法。
(項目19)
ex vivo、in vitro、または無細胞系において行われる、項目1から18のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性、
配列番号195、196、197、288、289、290、または291に示されるモチーフ、
原核生物ゲノムまたはメタゲノム、消化管メタゲノム、活性汚泥メタゲノム、嫌気性消化器メタゲノム、ニワトリ消化管メタゲノム、ヒト消化管メタゲノム、ブタ消化管メタゲノム、ウシ消化管メタゲノム、ヒツジ消化管メタゲノム、ヤギ消化管メタゲノム、カピバラ消化管メタゲノム、霊長類消化管メタゲノム、シロアリ消化管メタゲノム、糞便メタゲノム、Order ClostridialesまたはFamily Ruminococcaceae由来のゲノムに由来するCas13dオルソログ、または これらの組合せ
を含む、単離されたタンパク質。
(項目21)
Cas13dオルソログが、Ruminococcus albus、Eubacterium siraeum、Ruminococcus flavefaciens株XPD3002、Ruminococcus flavefaciens FD-1、無培養Eubacterium sp TS28-c4095、無培養Ruminococcus sp.、Ruminococcus bicirculans、またはRuminococcus sp CAG57に由来するCas13dオルソログを含む、項目20に記載の単離されたタンパク質。
(項目22)
細胞内局在化シグナルをさらに含む、項目20または21に記載の単離されたタンパク質。
(項目23)
少なくとも1つの天然のHEPNドメインにおける変異を含む、項目20から22のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質。
(項目24)
配列番号129、130、131、132、133、134、135、136、137、148、150、151、152、154、156、157、159、161、163、165、167、169、176、178、180、182、184、186、188、190、191、192、193、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252または254、またはそれらの短縮されたバージョンに対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含む1つまたは複数のダイレクトリピート(DR)配列を含む、単離されたガイドRNA(gRNA)。
(項目25)
標的RNAに特異的な1つまたは複数のスペーサー配列をさらに含む、項目24に記載の単離されたgRNA。
(項目26)
項目20から23のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質、および
項目24または25に記載の単離されたgRNA
を含む、リボ核タンパク質(RNP)複合体。
(項目27)
項目20から23のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする、単離された核酸分子。
(項目28)
配列番号124、125、126、127、128、139、140、または141に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性、
配列番号114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、142、143、144、または145に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含むか、または
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するタンパク質配列をコードする、項目27に記載の単離された核酸分子。
(項目29)
項目27または28に記載の単離された核酸分子を含む、組換えベクター。
(項目30)
プラスミドまたはウイルスベクターを含む、項目29に記載の組換えベクター。
(項目31)
項目27または28に記載の単離された核酸分子が、プロモーターに作動可能に連結している、項目29または30に記載の組換えベクター。
(項目32)
項目24または25に記載の少なくとも1つのgRNA、項目20から23のいずれかに記載のnCas1タンパク質をコードする少なくとも1つの配列、または両方をさらに含む、項目27から28のいずれかに記載のベクター。
(項目33)
項目20から23のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質、および項目24または25に記載の単離されたgRNA、項目26に記載のRNP複合体、項目27から28のいずれか1項に記載の単離された核酸分子、項目29から32のいずれか1項に記載のベクター、またはこれらの組合せを含む、非細菌細胞。
(項目34)
項目20から23のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質、および項目24または25に記載の単離されたgRNA、項目26に記載のRNP複合体、項目27から28のいずれか1項に記載の単離された核酸分子、項目29から32のいずれか1項に記載のベクター、またはこれらの組合せを含む、細菌細胞であって、項目20から23のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質、項目24または25に記載の単離されたgRNA、項目26に記載のRNP複合体、項目27から28のいずれか1項に記載の単離された核酸分子、項目29から32のいずれか1項に記載のベクターが、前記細菌細胞にとって天然ではない、細菌細胞。
(項目35)
項目20から23のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質、
項目24または25に記載のgRNA、
項目26に記載のRNP複合体、
項目27から28のいずれか1項に記載の単離された核酸分子、
項目29から32のいずれか1項に記載のベクター、および/または
項目33に記載の非細菌細胞、および/または
項目34に記載の細菌細胞のうちの1つまたは複数と、 薬学的に許容される担体と
を含む、組成物。
(項目36)
項目20から23のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質、
項目24または25に記載のgRNA、
項目26に記載のRNP複合体、
項目27から28のいずれか1項に記載の単離された核酸分子、
項目29から32のいずれか1項に記載のベクター、および/または
項目33に記載の非細菌細胞、および/または
項目34に記載の細菌細胞、および/または
項目35に記載の組成物
のうちの1つまたは複数を含む、キット。
(項目37)
送達系、標識、または両方をさらに含む、項目36に記載のキット。
本願発明は、また、下記態様を提供する。
(項目1)
1つまたは複数の標的RNA分子を標的にする方法であって、
1つまたは複数の標的RNA分子を、天然に存在しないかまたは操作されたクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造のリピート(CRISPR)関連(Cas)系と接触させるステップであって、前記系が、
少なくとも1つのCas13dタンパク質または前記少なくとも1つのCas13dタンパク質をコードする核酸分子、および
前記1つまたは複数の標的RNA分子とハイブリダイズする少なくとも1つのCRISPR-Cas系ガイドRNA(gRNA)、または前記gRNAをコードする少なくとも1つの核酸分子
を含み、
それによって、前記Cas13dタンパク質が、前記gRNAと複合体を形成し、前記gRNAが、前記複合体を、前記1つまたは複数の標的RNA分子へと指向させ、前記1つまたは複数の標的RNA分子を標的にする、ステップ
を含む、方法。
(項目2)
CRISPR-Cas系に媒介されるRNA標的化方法であって、
1つまたは複数の標的RNA分子を、天然に存在しないかまたは操作されたクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造のリピート(CRISPR)-CRISPR関連(Cas)系と接触させるステップであって、前記系が、
少なくとも1つのCas13dタンパク質または前記少なくとも1つのCas13dタンパク質をコードする核酸分子、および
前記1つまたは複数の標的RNA分子とハイブリダイズする少なくとも1つのCRISPR-Cas系gRNA、または前記gRNAをコードする少なくとも1つの核酸分子を含み、
それによって、前記Cas13dタンパク質が、前記gRNAと複合体を形成し、前記gRNAが、前記複合体を、前記1つまたは複数の標的RNA分子へと指向させ、前記1つまたは複数の標的RNA分子を標的にする、ステップ
を含む、方法。
(項目3)
前記1つまたは複数の標的RNA分子を、前記天然に存在しないかまたは操作されたCRISPR-Cas系と接触させるステップが、前記1つまたは複数の標的RNA分子を含有する細胞に、前記天然に存在しないかまたは操作されたCRISPR-Cas系を導入することを含む、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記CRISPR-Cas系が、エンドサイトーシス、リポソーム、粒子、エクソソーム、微細小胞、遺伝子銃、エレクトロポレーション、ウイルス、またはこれらの組合せを使用して、前記細胞に導入される、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記細胞が、真核生物細胞である、項目3または4に記載の方法。
(項目6)
前記1つまたは複数の標的RNA分子または前記細胞が、前記少なくとも1つのCas13dタンパク質および前記少なくとも1つのCRISPR-Cas系gRNAを含む複合体と接触する、項目1から5のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
前記少なくとも1つのCas13dタンパク質が、
1つまたは複数のHEPNドメインを含むか、
150kD以下、140kd以下、130kD以下、120kD以下、例えば、約90~120kD、約100~120kD、または約110kDであるか、 1つまたは複数の変異型HEPNドメインを含み、前記ガイドRNAをプロセシングすることができるが、前記1つまたは複数の標的RNA分子を切り離すことはできないか、
原核生物ゲノムまたはメタゲノム、消化管メタゲノム、活性汚泥メタゲノム、嫌気性消化器メタゲノム、ニワトリ消化管メタゲノム、ヒト消化管メタゲノム、ブタ消化管メタゲノム、ウシ消化管メタゲノム、ヒツジ消化管メタゲノム、ヤギ消化管メタゲノム、カピバラ消化管メタゲノム、霊長類消化管メタゲノム、シロアリ消化管メタゲノム、糞便メタゲノム、Order ClostridialesまたはFamily Ruminococcaceae由来のゲノムに由来するCas13dオルソログを含むか、
Ruminococcus albus、Eubacterium siraeum、Ruminococcus flavefaciens株XPD3002、Ruminococcus flavefaciens FD-1、無培養Eubacterium sp TS28-c4095、無培養Ruminococcus sp.、Ruminococcus bicirculans、またはRuminococcus sp CAG57に由来するCas13dオルソログを含むか、
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含むか、
配列番号195、196、または197に示されるモチーフを含むか、
配列番号288、289、290、または291に示されるコンセンサス配列を含むか、
1つまたは複数のアミノ酸欠失を含むか、
1つまたは複数のアミノ酸挿入を含むか、
共送達された場合に全長機能性酵素を再構成することができる、2つまたはそれを上回る断片に分割されているか、
異なるCas13dオルソログのキメラとなるように修飾されているか、
少なくとも1%、例えば、1~10%短縮されているか、
必要に応じて、1つまたは複数の細胞内局在化シグナル、エフェクタードメイン、精製タグ、親和性タグをさらに含むか、または
これらの組合せである、項目1から6のいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
前記少なくとも1つのCas13dタンパク質をコードする前記核酸分子が、
真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている少なくとも1つのCas13dタンパク質コード配列、
原核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている少なくとも1つのCas13dタンパク質コード配列、 ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されており、配列番号114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、142、143、144、または145に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含む、少なくとも1つのCas13dタンパク質コード配列、
配列番号124、125、126、127、128、139、140、または141に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含む、少なくとも1つのCas13dタンパク質コード配列、
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含むタンパク質をコードする、少なくとも1つのCas13dタンパク質コード配列、
原核生物ゲノムまたはメタゲノムに由来する少なくとも1つのCas13dオルソログ、または
消化管メタゲノム、活性汚泥メタゲノム、嫌気性消化器メタゲノム、ニワトリ消化管メタゲノム、ヒト消化管メタゲノム、ブタ消化管メタゲノム、ウシ消化管メタゲノム、ヒツジ消化管メタゲノム、ヤギ消化管メタゲノム、カピバラ消化管メタゲノム、霊長類消化管メタゲノム、シロアリ消化管メタゲノム、糞便メタゲノム、Order ClostridialesまたはFamily Ruminococcaceae由来のゲノムに由来する少なくとも1つのCas13dオルソログ
を含む、項目1から7のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記少なくとも1つのCas13dタンパク質をコードする前記核酸分子が、前記少なくとも1つのCas13dタンパク質コード配列に作動可能に連結したプロモーターを含み、必要に応じて、ベクターの一部である、項目1から8のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記1つまたは複数の標的RNA分子とハイブリダイズするgRNAが、
成熟gRNA、
プレgRNA、
1つまたは複数の全長または短縮型ダイレクトリピート(DR)配列、
1つまたは複数のスペーサー配列、DR-スペーサー-DR-スペーサーを含む、1つまたは複数の配列、
配列番号129、130、131、132、133、134、135、136、137、148、150、151、152、154、156、157、159、161、163、165、167、169、176、178、180、182、184、186、188、190、191、192、193、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252または254に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含む、1つまたは複数のDR配列、
必要に応じて、前記gRNAに挿入された核酸アプタマー、
またはこれらの組合せ
を含む、項目1から9のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
1つまたは複数の標的RNA分子を標的にするステップが、前記1つまたは複数の標的RNA分子を切り離すこと、前記1つまたは複数の標的RNA分子にニックを入れること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を活性化すること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を脱活性化すること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を視覚化または検出すること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を標識すること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を結合すること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を濃縮すること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を枯渇させること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を編集すること、前記1つまたは複数の標的RNA分子を輸送すること、前記1つまたは複数の標的RNA分子をスプライシングするかまたはその前記スプライシングを撹乱させること、および前記1つまたは複数の標的RNA分子をマスクすることのうちの1つまたは複数を含む、項目1から10のいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
1つまたは複数の標的RNA分子を修飾するステップが、
RNA塩基置換、
RNA塩基欠失、
RNA塩基挿入、
標的RNAにおける破断、
エクソンの排除、
エクソンの包含、
RNAスプライシングの撹乱、
前記RNA分子の翻訳の撹乱、
RNAのメチル化、
RNAの脱メチル化
のうちの1つまたは複数を含む、項目1から11のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
前記1つまたは複数の標的RNA分子が、非コードRNAである、項目1から12のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記方法が、疾患を処置し、前記1つまたは複数の標的RNA分子が、前記疾患と関連している、項目1から13のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
複数のgRNAが、アレイの一部である、項目1から13のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記方法が、診断方法であり、 前記1つまたは複数の標的RNA分子を、前記天然に存在しないかまたは操作されたCRISPR-Cas系と接触させるステップが、前記天然に存在しないかまたは操作されたCRISPR-Cas系を、前記1つまたは複数の標的RNA分子を含む試料および標識を含む別個のRNAと接触させることを含み、
必要に応じて、前記試料に存在する核酸分子を転写させること、
必要に応じて、前記試料に存在する核酸分子を増幅させること、および
前記標識を検出すること
を含み、前記標識を検出することが、前記試料における1つまたは複数の標的RNAの存在を示す、項目1から15のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
前記試料が、DNA、RNA、RNAに変換および/もしくは増幅されるゲノムDNA、生物学的患者試料、または環境試料を含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
標識を含む前記RNAが、フルオロフォアおよびクエンチャーを含むRNAを含み、前記標識を検出することが、前記フルオロフォアから放出される蛍光を検出することを含むか、
標識を含む前記RNAが、フルオロフォアを含むRNAを含み、前記標識を検出することが、前記フルオロフォアから放出される蛍光を検出することを含むか、または
標識を含む前記RNAが、非蛍光性分子を含むRNAを含み、前記標識を検出することが、前記非蛍光性分子を検出することを含む、項目16または17に記載の方法。
(項目19)
ex vivo、in vitro、または無細胞系において行われる、項目1から18のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295または296に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性、
配列番号195、196、197、288、289、290、または291に示されるモチーフ、
原核生物ゲノムまたはメタゲノム、消化管メタゲノム、活性汚泥メタゲノム、嫌気性消化器メタゲノム、ニワトリ消化管メタゲノム、ヒト消化管メタゲノム、ブタ消化管メタゲノム、ウシ消化管メタゲノム、ヒツジ消化管メタゲノム、ヤギ消化管メタゲノム、カピバラ消化管メタゲノム、霊長類消化管メタゲノム、シロアリ消化管メタゲノム、糞便メタゲノム、Order ClostridialesまたはFamily Ruminococcaceae由来のゲノムに由来するCas13dオルソログ、または これらの組合せ
を含む、単離されたタンパク質。
(項目21)
Cas13dオルソログが、Ruminococcus albus、Eubacterium siraeum、Ruminococcus flavefaciens株XPD3002、Ruminococcus flavefaciens FD-1、無培養Eubacterium sp TS28-c4095、無培養Ruminococcus sp.、Ruminococcus bicirculans、またはRuminococcus sp CAG57に由来するCas13dオルソログを含む、項目20に記載の単離されたタンパク質。
(項目22)
細胞内局在化シグナルをさらに含む、項目20または21に記載の単離されたタンパク質。
(項目23)
少なくとも1つの天然のHEPNドメインにおける変異を含む、項目20から22のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質。
(項目24)
配列番号129、130、131、132、133、134、135、136、137、148、150、151、152、154、156、157、159、161、163、165、167、169、176、178、180、182、184、186、188、190、191、192、193、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252または254、またはそれらの短縮されたバージョンに対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含む1つまたは複数のダイレクトリピート(DR)配列を含む、単離されたガイドRNA(gRNA)。
(項目25)
標的RNAに特異的な1つまたは複数のスペーサー配列をさらに含む、項目24に記載の単離されたgRNA。
(項目26)
項目20から23のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質、および
項目24または25に記載の単離されたgRNA
を含む、リボ核タンパク質(RNP)複合体。
(項目27)
項目20から23のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする、単離された核酸分子。
(項目28)
配列番号124、125、126、127、128、139、140、または141に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性、
配列番号114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、142、143、144、または145に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を含むか、または
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、138、147、149、153、155、158、160、162、164、166、168、170、175、177、179、181、183、185、187、189、194、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、278、279、280、281、282、283、284、285、292、293、294、295、または296に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有するタンパク質配列をコードする、項目27に記載の単離された核酸分子。
(項目29)
項目27または28に記載の単離された核酸分子を含む、組換えベクター。
(項目30)
プラスミドまたはウイルスベクターを含む、項目29に記載の組換えベクター。
(項目31)
項目27または28に記載の単離された核酸分子が、プロモーターに作動可能に連結している、項目29または30に記載の組換えベクター。
(項目32)
項目24または25に記載の少なくとも1つのgRNA、項目20から23のいずれかに記載のnCas1タンパク質をコードする少なくとも1つの配列、または両方をさらに含む、項目27から28のいずれかに記載のベクター。
(項目33)
項目20から23のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質、および項目24または25に記載の単離されたgRNA、項目26に記載のRNP複合体、項目27から28のいずれか1項に記載の単離された核酸分子、項目29から32のいずれか1項に記載のベクター、またはこれらの組合せを含む、非細菌細胞。
(項目34)
項目20から23のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質、および項目24または25に記載の単離されたgRNA、項目26に記載のRNP複合体、項目27から28のいずれか1項に記載の単離された核酸分子、項目29から32のいずれか1項に記載のベクター、またはこれらの組合せを含む、細菌細胞であって、項目20から23のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質、項目24または25に記載の単離されたgRNA、項目26に記載のRNP複合体、項目27から28のいずれか1項に記載の単離された核酸分子、項目29から32のいずれか1項に記載のベクターが、前記細菌細胞にとって天然ではない、細菌細胞。
(項目35)
項目20から23のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質、
項目24または25に記載のgRNA、
項目26に記載のRNP複合体、
項目27から28のいずれか1項に記載の単離された核酸分子、
項目29から32のいずれか1項に記載のベクター、および/または
項目33に記載の非細菌細胞、および/または
項目34に記載の細菌細胞のうちの1つまたは複数と、 薬学的に許容される担体と
を含む、組成物。
(項目36)
項目20から23のいずれか1項に記載の単離されたタンパク質、
項目24または25に記載のgRNA、
項目26に記載のRNP複合体、
項目27から28のいずれか1項に記載の単離された核酸分子、
項目29から32のいずれか1項に記載のベクター、および/または
項目33に記載の非細菌細胞、および/または
項目34に記載の細菌細胞、および/または
項目35に記載の組成物
のうちの1つまたは複数を含む、キット。
(項目37)
送達系、標識、または両方をさらに含む、項目36に記載のキット。
Claims (1)
- 明細書に記載の発明。
Applications Claiming Priority (10)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762548846P | 2017-08-22 | 2017-08-22 | |
US62/548,846 | 2017-08-22 | ||
US201762572963P | 2017-10-16 | 2017-10-16 | |
US62/572,963 | 2017-10-16 | ||
US201862639178P | 2018-03-06 | 2018-03-06 | |
US62/639,178 | 2018-03-06 | ||
US15/937,699 | 2018-03-27 | ||
US15/937,699 US10476825B2 (en) | 2017-08-22 | 2018-03-27 | RNA targeting methods and compositions |
JP2020511377A JP2020532968A (ja) | 2017-08-22 | 2018-08-22 | Rna標的化方法および組成物 |
PCT/US2018/047597 WO2019040664A1 (en) | 2017-08-22 | 2018-08-22 | RNA TARGETING METHODS AND COMPOSITIONS |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020511377A Division JP2020532968A (ja) | 2017-08-22 | 2018-08-22 | Rna標的化方法および組成物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023153907A true JP2023153907A (ja) | 2023-10-18 |
Family
ID=65437120
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020511377A Pending JP2020532968A (ja) | 2017-08-22 | 2018-08-22 | Rna標的化方法および組成物 |
JP2023123459A Pending JP2023153907A (ja) | 2017-08-22 | 2023-07-28 | Rna標的化方法および組成物 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020511377A Pending JP2020532968A (ja) | 2017-08-22 | 2018-08-22 | Rna標的化方法および組成物 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (16) | US10476825B2 (ja) |
EP (1) | EP3673055A4 (ja) |
JP (2) | JP2020532968A (ja) |
CN (1) | CN111328343B (ja) |
AU (1) | AU2018320870A1 (ja) |
CA (1) | CA3072610A1 (ja) |
SG (1) | SG11202001208XA (ja) |
WO (1) | WO2019040664A1 (ja) |
Families Citing this family (69)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SG11201804372PA (en) | 2015-11-23 | 2018-06-28 | Univ California | Tracking and manipulating cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9 |
CA3084252A1 (en) | 2017-03-28 | 2018-10-04 | Caribou Biosciences, Inc. | Crispr-associated (cas) protein |
CA3062595A1 (en) | 2017-05-10 | 2018-11-15 | The Regents Of The University Of California | Directed editing of cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9 |
US11168322B2 (en) | 2017-06-30 | 2021-11-09 | Arbor Biotechnologies, Inc. | CRISPR RNA targeting enzymes and systems and uses thereof |
US10476825B2 (en) | 2017-08-22 | 2019-11-12 | Salk Institue for Biological Studies | RNA targeting methods and compositions |
US11970720B2 (en) | 2017-08-22 | 2024-04-30 | Salk Institute For Biological Studies | RNA targeting methods and compositions |
BR112020006757A2 (pt) * | 2017-10-04 | 2020-10-06 | The Broad Institute Inc. | diagnóstico baseado no sistema de efetor crispr |
US11807877B1 (en) | 2018-03-22 | 2023-11-07 | National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc | CRISPR/Cas activity assays and compositions thereof |
CA3102779A1 (en) | 2018-06-08 | 2019-12-12 | Locanabio, Inc. | Rna-targeting fusion protein compositions and methods for use |
US20220160870A1 (en) * | 2018-08-28 | 2022-05-26 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Neoantigen engineering using splice modulating compounds |
EP3856898A4 (en) * | 2018-09-28 | 2022-06-22 | The Jackson Laboratory | ARTIFICIAL RNA-GUIDED SPLICING FACTORS |
EP3918069A1 (en) * | 2019-01-31 | 2021-12-08 | Bar Ilan University | Neoantigens created by aberrant-induced splicing and uses thereof in enhancing immunotherapy |
CN110257420A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-09-20 | 中国科学院武汉植物园 | 基于CasRx的植物基因沉默载体及其构建方法和应用 |
CN112143701A (zh) * | 2019-06-26 | 2020-12-29 | 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 | 基于rna定点编辑的抑制脉络膜新生血管形成的方法及试剂 |
US20210009987A1 (en) | 2019-07-10 | 2021-01-14 | Locana, Inc. | Rna-targeting knockdown and replacement compositions and methods for use |
US20220403356A1 (en) * | 2019-07-12 | 2022-12-22 | Duke University | 3' utr crispr-dcas 13 engineering system and methods of using same |
EP3999117A4 (en) * | 2019-07-12 | 2023-07-26 | Duke University | NANOPARTICLE SYSTEMS FOR TARGETED CRISPR/CAS13 DELIVERY AND METHODS OF USE THEREOF |
JP2022544688A (ja) * | 2019-08-16 | 2022-10-20 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | Crispr/cas13を使用する標的化トランススプライシング |
CN112538482A (zh) * | 2019-09-23 | 2021-03-23 | 华东理工大学 | 一种rna检测与定量的方法 |
EP4045665A4 (en) * | 2019-10-15 | 2023-11-15 | University of Massachusetts | RNA EDITOR ENHANCED RNA TRANS-SPLICING |
CN110669795A (zh) * | 2019-10-18 | 2020-01-10 | 福州大学 | 一种在鱼类胚胎中实现精确定点rna剪切的技术 |
WO2021076060A1 (en) * | 2019-10-18 | 2021-04-22 | Nanyang Technological University | Programmable rna editing platform |
EP4065703A2 (en) * | 2019-11-26 | 2022-10-05 | New York Genome Center, Inc. | Methods and compositions involving crispr class 2, type vi guides |
EP4069842A1 (en) | 2019-12-02 | 2022-10-12 | Shape Therapeutics Inc. | Therapeutic editing |
CN111041049A (zh) * | 2019-12-04 | 2020-04-21 | 江苏大学 | 一种基于近红外光控的CRISPR-Cas13a系统制备方法及其应用 |
WO2021154809A1 (en) * | 2020-01-28 | 2021-08-05 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Cell specific, self-inactivating genomic editing crispr-cas systems having rnase and dnase activity |
WO2021169980A1 (en) * | 2020-02-25 | 2021-09-02 | Shanghaitech University | Compositions and methods for detecting nucleic acid-protein interactions |
BR112022017070A2 (pt) * | 2020-02-28 | 2022-11-16 | Huigene Therapeutics Co Ltd | Sistema crispr-cas tipo vi-e e tipo vi-f e usos do mesmo |
EP4121539A4 (en) * | 2020-03-20 | 2024-06-12 | Agency Science Tech & Res | MOLECULAR SYSTEMS AND THERAPIES USING THEM |
WO2021204492A1 (en) * | 2020-04-08 | 2021-10-14 | Georg-August-Universitaet Goettingen Stiftung Oeffentlichen Rechts, Universitaetsmedizin | All-in-one aav vectors for treating coronavirus-induced diseases |
CN113583982B (zh) * | 2020-04-30 | 2023-06-27 | 香港城市大学深圳研究院 | 确定长链非编码核糖核酸相互作用蛋白的新方法 |
JP2023527768A (ja) * | 2020-05-19 | 2023-06-30 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 核酸検出のためのヌクレアーゼ連鎖反応用の組成物および方法 |
CN111876421A (zh) * | 2020-08-04 | 2020-11-03 | 蒋望 | 靶向KrasG12D突变转录本的gRNA序列、载体及其应用 |
KR102422842B1 (ko) * | 2020-09-07 | 2022-07-18 | 성균관대학교산학협력단 | 크리스퍼 간섭을 이용한 rna 번역 조절용 조성물 |
CN112048559B (zh) * | 2020-09-10 | 2023-10-17 | 辽宁省肿瘤医院 | 基于m6A相关的IncRNA网络胃癌预后的模型构建及临床应用 |
CN112143731B (zh) * | 2020-09-14 | 2022-03-15 | 广州瑞风生物科技有限公司 | 靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的gRNA及其应用 |
WO2022068912A1 (en) * | 2020-09-30 | 2022-04-07 | Huigene Therapeutics Co., Ltd. | Engineered crispr/cas13 system and uses thereof |
WO2022188039A1 (en) * | 2021-03-09 | 2022-09-15 | Huigene Therapeutics Co., Ltd. | Engineered crispr/cas13 system and uses thereof |
CN112430597A (zh) * | 2020-11-24 | 2021-03-02 | 深圳市瑞吉生物科技有限公司 | 一种使目的基因沉默的CasRx制剂及其应用 |
AU2021391643A1 (en) | 2020-12-01 | 2023-06-29 | Locanabio, Inc. | Rna-targeting compositions and methods for treating cag repeat diseases |
US20240108751A1 (en) | 2020-12-01 | 2024-04-04 | Locanabio, Inc. | Rna-targeting compositions and methods for treating myotonic dystrophy type 1 |
CN112575059A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-03-30 | 天津大学 | 核酸检测试剂及检测方法 |
WO2022133329A1 (en) * | 2020-12-17 | 2022-06-23 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Method for programmable control of rna transcript levels with autoregulated crispr-cas13d |
CA3203046A1 (en) * | 2020-12-22 | 2022-06-30 | Helmholtz Zentrum Muenchen - Deutsches Forschungszentrum Fur Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) | Application of crispr/cas13 for therapy of rna virus and/or bacterium induced diseases |
CN113025656A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-06-25 | 深圳市第二人民医院 | 一种外泌体递送CasRx基因沉默的AAV载体及其构建方法和应用 |
WO2022187440A1 (en) | 2021-03-03 | 2022-09-09 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | La protien as a novel regulator of osteoclastogenesis |
EP4301849A1 (en) * | 2021-03-05 | 2024-01-10 | The Jackson Laboratory | Multiplex rna targeting |
WO2022188797A1 (en) * | 2021-03-09 | 2022-09-15 | Huigene Therapeutics Co., Ltd. | Engineered crispr/cas13 system and uses thereof |
WO2022221278A1 (en) | 2021-04-12 | 2022-10-20 | Locanabio, Inc. | Compositions and methods comprising hybrid promoters |
GB202105455D0 (en) * | 2021-04-16 | 2021-06-02 | Ucl Business Ltd | Composition |
WO2022240824A1 (en) | 2021-05-13 | 2022-11-17 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Compositions and methods for treating sickle cell diseases |
US20230058054A1 (en) * | 2021-06-29 | 2023-02-23 | Huigene Therapeutics Co., Ltd. | Crispr/cas system and uses thereof |
CN113667017A (zh) * | 2021-07-28 | 2021-11-19 | 上海南方模式生物科技股份有限公司 | 一种可提高CRISPR/Cas9系统同源重组效率的方法和应用 |
CN113667735A (zh) * | 2021-08-04 | 2021-11-19 | 中山大学附属第一医院 | Alkbh5在糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测中的应用 |
WO2023051734A1 (en) * | 2021-09-29 | 2023-04-06 | Huidagene Therapeutics Co., Ltd. | Engineered crispr-cas13f system and uses thereof |
WO2023064895A1 (en) * | 2021-10-15 | 2023-04-20 | The Broad Institute, Inc. | Rna-guided trans-splicing of rna |
CA3236236A1 (en) * | 2021-10-29 | 2023-05-04 | Z. Josh Huang | Compositions and systems for rna-programmable cell editing and methods of making and using same |
WO2023096584A2 (en) * | 2021-11-25 | 2023-06-01 | Casbio (S) Pte Ltd | Novel crispr/cas13 systems and uses thereof |
CN114231561A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-03-25 | 重庆医科大学 | 一种基于CRISPR-Cas13d敲低动物mRNA的方法及其应用 |
WO2023154807A2 (en) | 2022-02-09 | 2023-08-17 | Locanabio, Inc. | Compositions and methods for modulating pre-mrna splicing |
WO2023154843A2 (en) * | 2022-02-11 | 2023-08-17 | The Regents Of The University Of California | Methods of targeting repetitive rna in huntington's disease |
WO2023205637A1 (en) | 2022-04-18 | 2023-10-26 | Locanabio, Inc. | Rna-targeting compositions and methods for treating c9/orf72 diseases |
CN116949011A (zh) * | 2022-04-26 | 2023-10-27 | 中国科学院动物研究所 | 经分离的Cas13蛋白、基于它的基因编辑系统及其用途 |
WO2023215816A1 (en) * | 2022-05-05 | 2023-11-09 | University Of Rochester | Rna targeting compositions and methods of use thereof |
CN114990093B (zh) * | 2022-06-24 | 2024-02-13 | 吉林大学 | 氨基酸序列小的蛋白序列mini rfx-cas13d |
WO2024044672A2 (en) * | 2022-08-24 | 2024-02-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | A multiplexed rna regulation platform for primary immune cell engineering |
CN118159650A (zh) * | 2022-08-26 | 2024-06-07 | 广州瑞风生物科技有限公司 | 一种CRISPR-Cas13系统及其应用 |
WO2024081888A1 (en) * | 2022-10-14 | 2024-04-18 | Spark Therapeutics, Inc. | Gene editing for controlled expression of episomal genes |
CN115819543B (zh) * | 2022-11-29 | 2023-07-21 | 华南师范大学 | 转录因子Tbx20启动子区G4调控元件在害虫防治中的应用 |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4458066A (en) | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
US6110743A (en) | 1995-02-10 | 2000-08-29 | The Regents Of The University Of California | Development and use of human pancreatic cell lines |
WO2007044468A2 (en) | 2005-10-05 | 2007-04-19 | The Cbr Institute For Biomedical Research, Inc. | Method to treat flavivirus infection with sirna |
US20140189896A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-07-03 | Feng Zhang | Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation |
US10774338B2 (en) | 2014-01-16 | 2020-09-15 | The Regents Of The University Of California | Generation of heritable chimeric plant traits |
EP4159856A1 (en) | 2015-06-18 | 2023-04-05 | The Broad Institute, Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
US9790490B2 (en) | 2015-06-18 | 2017-10-17 | The Broad Institute Inc. | CRISPR enzymes and systems |
US20170211142A1 (en) | 2015-10-22 | 2017-07-27 | The Broad Institute, Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
SG11201804372PA (en) | 2015-11-23 | 2018-06-28 | Univ California | Tracking and manipulating cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9 |
EP3601576A1 (en) | 2017-03-24 | 2020-02-05 | CureVac AG | Nucleic acids encoding crispr-associated proteins and uses thereof |
CA3084252A1 (en) | 2017-03-28 | 2018-10-04 | Caribou Biosciences, Inc. | Crispr-associated (cas) protein |
CA3062595A1 (en) | 2017-05-10 | 2018-11-15 | The Regents Of The University Of California | Directed editing of cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9 |
US11168322B2 (en) | 2017-06-30 | 2021-11-09 | Arbor Biotechnologies, Inc. | CRISPR RNA targeting enzymes and systems and uses thereof |
US10476825B2 (en) | 2017-08-22 | 2019-11-12 | Salk Institue for Biological Studies | RNA targeting methods and compositions |
US11970720B2 (en) | 2017-08-22 | 2024-04-30 | Salk Institute For Biological Studies | RNA targeting methods and compositions |
WO2019094969A1 (en) | 2017-11-13 | 2019-05-16 | Synthetic Genomics, Inc. | Compositions, systems, kits, and methods for modifying rna |
-
2018
- 2018-03-27 US US15/937,699 patent/US10476825B2/en active Active
- 2018-08-22 JP JP2020511377A patent/JP2020532968A/ja active Pending
- 2018-08-22 SG SG11202001208XA patent/SG11202001208XA/en unknown
- 2018-08-22 EP EP18848522.1A patent/EP3673055A4/en active Pending
- 2018-08-22 WO PCT/US2018/047597 patent/WO2019040664A1/en unknown
- 2018-08-22 CA CA3072610A patent/CA3072610A1/en active Pending
- 2018-08-22 CN CN201880068076.4A patent/CN111328343B/zh active Active
- 2018-08-22 AU AU2018320870A patent/AU2018320870A1/en active Pending
- 2018-12-31 US US16/237,381 patent/US10666592B2/en active Active
-
2019
- 2019-01-25 US US16/257,493 patent/US11228547B2/en active Active
-
2020
- 2020-01-30 US US16/777,604 patent/US10931613B2/en active Active
- 2020-03-17 US US16/821,890 patent/US11005799B2/en active Active
- 2020-06-03 US US16/891,769 patent/US11032225B2/en active Active
- 2020-06-03 US US16/891,574 patent/US11025574B2/en active Active
- 2020-06-03 US US16/891,518 patent/US11032224B2/en active Active
-
2021
- 2021-06-21 US US17/352,564 patent/US11316812B2/en active Active
- 2021-06-21 US US17/352,551 patent/US11310179B2/en active Active
- 2021-06-21 US US17/352,579 patent/US11303592B2/en active Active
- 2021-06-21 US US17/352,590 patent/US11303593B2/en active Active
- 2021-06-21 US US17/352,611 patent/US11303594B2/en active Active
- 2021-06-21 US US17/352,725 patent/US11310180B2/en active Active
-
2022
- 2022-04-01 US US17/711,924 patent/US11706177B2/en active Active
-
2023
- 2023-05-26 US US18/324,926 patent/US20230328020A1/en active Pending
- 2023-07-28 JP JP2023123459A patent/JP2023153907A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2023153907A (ja) | Rna標的化方法および組成物 | |
Konermann et al. | Transcriptome engineering with RNA-targeting type VI-D CRISPR effectors | |
US11970720B2 (en) | RNA targeting methods and compositions | |
WO2017015101A1 (en) | Methods for maximizing the efficiency of targeted gene correction | |
JP2023537158A (ja) | Krab融合抑制因子並びに遺伝子発現を抑制する方法及び組成物 | |
Zinnall et al. | HDLBP binds ER-targeted mRNAs by multivalent interactions to promote protein synthesis of transmembrane and secreted proteins | |
Papadopoulos et al. | Direct RNA-binding by MYCN mediates feedback from RNA processing to transcription control | |
JP7506405B2 (ja) | 真核生物の遺伝子編集のためのレンチウイルスベースのベクターならびに関連システムおよび方法 | |
Rogowski | Identification and characterization of non-coding RNAs and their associated proteins involved in cellular stress responses | |
Elguindy | Regulation of Pumilio RNA Binding Proteins by Long Noncoding RNA NORAD | |
Tomar | Role of promoter DNA sequences and environmental stress in gene regulation by RNA Polymerase II pausing |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230728 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240606 |