JP2023527768A - 核酸検出のためのヌクレアーゼ連鎖反応用の組成物および方法 - Google Patents

核酸検出のためのヌクレアーゼ連鎖反応用の組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本明細書では、シグナル増幅のための、内部ヌクレアーゼ連鎖反応（ＮＣＲ）を含む、核酸検出用組成物および核酸検出システム、ならびにこれらのＮＣＲ含有組成物およびシステムを使用する方法について記載される。【選択図】図１－２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月１９日に出願された、米国特許出願第６３／０２７，１７５号明細書の利益を主張する。先行出願の開示は、本出願の開示の一部であると考えられる（参照により、その開示に組み込まれる）。
技術分野
本発明は、核酸の検出のための方法および組成物であって、内部ヌクレアーゼ連鎖反応（ＮＣＲ）を含む、任意の標的核酸配列の、迅速かつ高感度の検出のための検出システムを含む方法および組成物に関する。
連邦政府による後援
本発明は、米国国立衛生研究所により支給された、助成金第ＯＤ０２１３６９号の下にある政府助成によりなされた。米国連邦政府は、本発明において、一定の権利を有する。
ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）は、１９８０年代後半に発見された。これらの配列が、細菌の防御系に関与するという考えは、その後、多年にわたり示唆されたが、２０００年代半ば～後期まで、この考えが、より広く受容されるようになることはなかった。この時期に、いくつかの論文が、この獲得免疫系の基礎：回文リピートにより挟まれた外来ＤＮＡ配列（例えば、プラスミドおよびウイルスに由来する）が、宿主ゲノム内に組み込まれ、それらのＲＮＡ産物が、相補性配列を含有する核酸を切断するように、Ｃａｓ複合体を方向付けることを解明した。
その後、操作ガイドＲＮＡと組み合わされた、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質の簡素化複合体は、特異的ＤＮＡ配列を探し当て切断することが可能であることが示された。これは、新規の技術、とりわけ、ゲノム編集技術の爆発的発展をもたらした。さらなる調査研究は、これらのタンパク質が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ゲノムを編集するのに使用されうることを示した。ＣＲＩＳＰＲシステムは、古細菌内および多数の細菌内に見出されている。ＤＮＡをターゲティングする、より広く認識された、それらの能力に加えて、一部の種類のＣａｓタンパク質はまた、ＲＮＡをターゲティングする活性も有する。例えば、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、およびＣａｓ１３ｄなど、酵素のＣａｓ１３ファミリーは、２つのＲＮＡエンドヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）ドメインを有する。
一部のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の、非特異的なリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）活性またはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）活性は、タンパク質またはタンパク質複合体への、他の因子の結合により活性化されるまで、休眠している場合がある。したがって、Ｃａｓ１３酵素またはＣａｓ１２酵素を、所望の標的配列を認識するガイドＲＮＡによりプログラム化し、非特異的なＲＮアーゼまたはＤＮアーゼ活性を活性化することができる。これは、蛍光などの検出用シグナルをもたらす、消光させられた蛍光レポーターなどの検出用標識を放出するのに使用されうる。例えば、ＳＨＥＲＬＯＣＫ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｈｉｇｈ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｐｏｒｔ ＵｎＬＯＣＫｉｎｇ）は、ＲＮＡ標的の検出のために、Ｃａｓ１３タンパク質を使用し、ＤＥＴＥＣＴＲシステムは、ＤＮＡ標的のために、Ｃａｓ１２タンパク質を使用して、指定された標的ＲＮＡ配列または標的ＤＮＡ配列の存在下に限り、消光レポーター分子を切断する。例えば、Li et al. (2019) Trends in Biotech. 37(7):730-743；Petri & Pattanayak (2018) The CRISPR Journal 1(3):209-211；Gootenberg et al. (2017) Science 356(6336):438-442；ならびに米国公開第２０１８０２７４０１７号明細書および同第２０１９０２４１９５４号明細書を参照されたい。
しかし、現行のＣａｓベースの検出システムは、感度が限定的な場合があり、加えて、ウイルスおよび他の病原体への広範な曝露時には、迅速な試験結果も所望される。「ポイントオブケア」状況またはＰＯＣ状況において、現場ベースで実施される場合もあり、使用者の「自家」使用において実施される場合もあるように、特殊装置を必要とせずに、高感度、特異的、かつ、迅速な結果をもたらすことが可能な試験もまた、高度に所望される。
したがって、直接的、高感度、迅速、かつ使いやすい核酸の検出を可能とする方法および組成物であって、試料中の病原体の検出を含む方法および組成物が、依然として必要とされている。
本明細書では、ＲＮＡまたはＤＮＡを検出するための組成物および方法が開示される。本明細書で記載されるシステムは、標的核酸を検出すると、指数関数的シグナルを発生させるように、増幅的フィード－フォワードループをもたらす、内部ヌクレアーゼ連鎖反応（ＮＣＲ）を有する一体型検出モダリティーで、高感度、定量的、かつ迅速なアッセイをもたらす。
本明細書では、核酸を検出するためのシステムについて記載される。システムは、典型的に、少なくとも２つの構成要素：（１）核酸を検出し、加えて、任意の試料中で、標的核酸を検出すると、それ自体、シグナルを発生させることが可能であるか、または、代替的に、１つもしくは複数の、他の分子（例えば、レポーター）を介して、シグナルを発生させる、第１の構成要素；および（２）第１の構成要素により検出されると発生させられるシグナルを増幅する、第２の構成要素を含む。システムは、第１の構成要素（例えば、一次活性化複合体）が、活性化されると、シグナル（例えば、検出用標識の放出）が、さらに増幅されるよう、活性化シグナル増幅因子となるように第２の認識複合体を活性化するように、不活性の第２の認識複合体の構成要素に作用することが可能である、「フィードフォワード」システムを含みうる。構成要素の各々は、１つまたは複数の分子（例えば、１つまたは複数の融合タンパク質、１つまたは複数の酵素、１つまたは複数の核酸、１つまたは複数の、核酸と、核酸との融合体など）を含みうる。検出シグナルを増幅する構成要素を含む、本明細書で記載されるシステムは、核酸の検出を、増幅構成要素を含まないシステムと比較して、１～１０倍、１～５０倍、１～１００倍、１～５００倍、１～１０００倍（またはこの間の任意の値）もしくはこれを超える量を含むがこれらに限定されない、任意の量だけ増大させうる。
本明細書のある特定の態様では、検出用標識を含み、レポーター分子が切断されると、検出用標識が、検出のために放出される、レポーター分子；第１の認識複合体（「標的センサー」）を含み、第１の認識複合体が、試料中の、１つまたは複数の標的配列（「一次活性化因子」）を認識し、標的配列を認識すると、一次活性化複合体が、活性化され、レポーター分子に作用し、検出用標識を放出させることが可能である、一次活性化複合体；第２の不活性認識複合体を含み、活性化一次活性化複合体が、第２の認識複合体の構成要素に作用した後に、第２の認識複合体が、活性化され、１つまたは複数の増幅配列（「活性化因子」）を認識し、レポーター分子に作用し、検出用標識を放出させ、他の不活性の第２の認識複合体が活性化されるように、それらに作用する、二次増幅複合体を含む核酸検出システムについて記載される。したがって、本発明は、（ｉ）検出用標識を含み、レポーター分子が切断されると、検出用標識が、検出のために放出される、レポーター分子；（ｉｉ）第１の認識複合体を含む一次活性化複合体；および（ｉｉｉ）不活性の二次複合体を含む核酸検出システムであって、（ａ）第１の認識複合体が、試料中の、１つまたは複数の一次活性化因子を認識し；（ｂ）一次活性化因子を認識すると、一次活性化複合体が、活性化され、検出用標識を放出させるように、レポーター分子に作用することが可能であり；（ｃ）活性化シグナル増幅因子となるように第２の認識複合体を活性化するように、活性化一次活性化複合体が、不活性の第２の認識複合体の構成要素に作用することが可能であり；（ｄ）前記活性化シグナル増幅因子が、検出用標識を放出させるように、レポーター分子に作用することが可能であり；（ｅ）フィード－フォワードループが開始されるよう、活性化シグナル増幅因子となるように第２の認識複合体を活性化するように、前記活性化シグナル増幅因子が、不活性の第２の認識複合体の構成要素に作用することが可能である、核酸検出システムに関する。
本明細書の他の態様では、検出用標識を含み、レポーター分子が切断されると、検出用標識が、検出のために放出される、レポーター分子；第１のガイドＲＮＡによりプログラム化された、第１のＣａｓエフェクター酵素（「標的センサー」）を含み、第１のガイドＲＮＡが、試料中の、１つまたは複数の標的配列（「一次活性化因子」）を認識し、第１のガイドＲＮＡの、標的配列へのハイブリダイゼーション時に、一次活性化複合体が、活性化され、レポーター分子を切断し、検出用標識を放出する非特異的ヌクレアーゼ活性を呈する、一次活性化複合体；および第２のＣａｓエフェクター酵素と、第２のガイドＲＮＡとを含み、第２のガイドＲＮＡが、１つまたは複数の増幅配列（「活性化因子」）を認識し、第２のガイドＲＮＡの、増幅配列へのハイブリダイゼーション時に、シグナル増幅因子が、活性化され、レポーター分子を切断し、検出用標識を放出する非特異的ヌクレアーゼ活性を呈し、さらなる、第２のＣａｓエフェクター酵素に作用して、これらが、シグナル増幅因子となるように活性化することが可能である、シグナル増幅複合体を含む核酸検出システムについて記載される。したがって、本発明は、検出用標識を含み、レポーター分子が切断されると、検出用標識が、検出のために放出される、レポーター分子；第１のガイドＲＮＡによりプログラム化された、第１のＣａｓエフェクター酵素を含み、第１のガイドＲＮＡが、試料中の、１つまたは複数の一次活性化因子を認識し、第１のガイドＲＮＡの、一次活性化因子へのハイブリダイゼーション時に、一次活性化複合体が、活性化され、レポーター分子を切断し、検出用標識を放出する非特異的ヌクレアーゼである、一次活性化複合体；および第２のＣａｓエフェクター酵素と、第２のガイドＲＮＡとを含み、一次活性化複合体の活性化が、第２のガイドＲＮＡにより認識される、１つまたは複数の活性化配列の活性化を結果としてもたらし、第２のガイドＲＮＡの、活性化配列へのハイブリダイゼーション時に、シグナル増幅複合体が、活性化され、レポーター分子を切断し、検出用標識を放出する非特異的ヌクレアーゼである、シグナル増幅因子を含む核酸検出システムに関する。
本明細書で記載される核酸検出システムは、好ましくは、一次活性化因子の検出が、一次活性化複合体の活性化を誘発し、これが、標的の存在下で、検出用シグナル（まず、標的センサー／一次活性化因子により検出される）を増幅するように、二次活性化複合体の活性化を引き起こす、「フィードフォワード」ループ、例えば、さらなる消光レポーター分子が切断され、さらなる検出用標識が放出されるよう、二次増幅複合体の、第２のガイドＲＮＡが、放出された活性化分子とハイブリダイズするように、活性化一次活性化複合体が、活性化分子および／または二次ガイドＲＮＡ（例えば、活性化分子上および／または二次ガイドＲＮＡ上のケージ構造の放出を介して）を活性化するシステムを伴う。
本明細書で記載される核酸検出システムのうちのいずれかでは、第１のＣａｓエフェクター酵素、および／または第２のＣａｓエフェクター酵素は、ＲＮアーゼおよび／またはＤＮアーゼ、例えば、１つもしくは複数のＣａｓ１３タンパク質、１つもしくは複数のＣａｓ１２タンパク質、１つもしくは複数のＣａｓ１４タンパク質、１つもしくは複数のＣｓｍ６タンパク質、および／または１つもしくは複数のＣｓｘ１タンパク質を、任意の組合せ（複数可）で含むことが可能であり、任意選択で、付属の表、図、または実施例のうちのいずれかに示される、１つまたは複数のタンパク質（配列番号１１５～２６８）を含みうる。ある特定の実施形態では、第１のＣａｓエフェクター酵素、および／または第２のＣａｓエフェクター酵素は、同じであるか、または異なる、Ｃａｓ１３ｄタンパク質のうちの１つまたは複数を含む。１つまたは複数のＣａｓエフェクター酵素は、同じタンパク質の場合もあり、異なるタンパク質の場合もある。さらに、本明細書で記載されるシステムの、第１のガイドＲＮＡ、および／または第２のガイドＲＮＡは、付属の表（例えば、表４）、図、または実施例のうちのいずれかにおいて示される、同じであるか、または異なるＲＮＡのうちの１つまたは複数（配列番号４２～８５）を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の定常領域を含みうる。
本明細書で記載される核酸検出システムのうちのいずれかでは、レポーターは、検出用標識に作動可能に連結された消光剤を含む場合があり、任意選択で、この場合、検出用標識は、１つまたは複数の蛍光分子（例えば、蛍光染料）を含む。レポーター分子は、消光剤と、フルオロフォアとを連結するオリゴヌクレオチドを含む場合があり、オリゴヌクレオチドは、任意選択でステムループ構造を有するケージ化構造を任意選択で含む。レポーター分子は、表８に示される配列を含みうる。ある特定の実施形態では、レポーター分子は、トランスケージ分子と複合体化している。
本明細書で記載される核酸検出システムのうちのいずれかでは、構成要素のうちの１つまたは複数（例えば、活性化因子、１つまたは複数のガイド分子、増幅配列、および／またはレポーター）は、ケージ化されうる（例えば、ケージ化構造またはケージ化分子により）。ある特定の実施形態では、ケージは、ステムループ構造を有する分子（例えば、オリゴヌクレオチド配列）を含むか、またはこれを創出する。活性化因子と共に組み入れられたオリゴヌクレオチド配列は、ＤＮＡ塩基および／またはＲＮＡ塩基を含む場合があり、加えて、ＤＮＡ塩基および／またはＲＮＡ塩基のうちの１つまたは複数は、任意選択で、１つもしくは複数のロックト核酸（ＬＮＡ）もしくは部分、および／または２’－ＯＭｅ ＲＮＡを含む、修飾ヌクレオチド塩基でありうる。例えば、増幅配列のうちの１つもしくは複数が、それらの３’末端および／または５’末端において、ケージ化構造を含む、１つまたは複数のケージ化構造が使用されうる。１つまたは複数のトランスケージ化分子はまた、本明細書で記載される核酸システムのうちのいずれかにおいても使用されうる。
本明細書で記載される核酸検出システムのうちのいずれかでは、構成要素のうちの１つまたは複数の間の相互作用は、ある特定量の時間（例えば、数秒間、数分間、またはこれを超える時間）に限定される場合がある、例えば、第１のガイドＲＮＡ、および第２のガイドＲＮＡの一方もしくは両方、ならびに／または増幅配列のうちの１つもしくは複数は、最適の時間枠において、Ｃａｓエフェクター酵素との条件付き相互作用を可能とするように修飾されている。ある特定の実施形態では、第１のガイドＲＮＡ、および第２のガイドＲＮＡの一方もしくは両方、ならびに／または増幅配列のうちの１つもしくは複数は、最適の時間枠において、Ｃａｓエフェクター酵素との条件付き相互作用を可能とするように修飾されている。本明細書で記載される核酸検出システムのうちのいずれかでは、１つまたは複数の増幅配列は、ポリＵ配列および／またはポリＡ配列、任意選択で、Ａ４－Ｕｎ配列、Ａ５－Ｕｎ配列、および／またはＡ６－Ｕｎ配列を含む。
本明細書で記載されるシステムのうちのいずれかの、標的配列および／または増幅配列は、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡに対して、１００％相補性の場合もあり、または代替的に、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡに対して、１００％相補性でない場合もある。本明細書で記載されるシステムのうちのいずれかにおける標的配列は、１つまたは複数の哺乳動物、ウイルス、細菌、および／または真菌に由来するＤＮＡおよび／またはＲＮＡでありうる。ある特定の実施形態では、標的配列は、ＲＮＡウイルス、例えば、コロナウイルス中、任意選択で、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２コロナウイルス中に存在する。
本明細書で記載される核酸検出システムのうちのいずれかでは、試料は、生体試料または環境試料でありうる。生体試料は、個体から回収された、血液、唾液、尿、生検、血漿、血清、気管支肺胞洗浄液、痰、糞便試料、脳脊髄液、細針吸引物、スワブ試料（例えば、口腔スワブ、子宮頸部スワブ、鼻腔スワブ）、間質液、滑液、鼻漏、涙液、軟膜、粘膜試料、および／または上皮細胞試料（例えば、上皮細胞掻爬試料）などを含みうる。試料は、液体試料であることが可能であり、無細胞液の場合もあり、細胞を含む液体の場合もある。
また、核酸（例えば、標的配列）を検出する方法であって、（ａ）核酸（例えば、標的配列）を含むことが疑われる試料を、（ｉ）本明細書で記載される核酸検出システムと接触させるステップと、（ｂ）検出用標識からの検出用シグナルを測定し、これにより、標的配列を検出するステップとを含む方法についても記載される。ある特定の実施形態では、方法は、検出用標識のレベルを定量するステップをさらに含む。接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける、無細胞環境内または細胞内において、二価金属イオンの存在下で実行されうる。接触させるステップは、数秒間、数分間、もしくは数時間、またはこれらを超える時間（またはこれらの間の任意の時間）を含む、任意の長さの時間、任意選択で、数秒間～２時間（またはこれらの間の任意の時間）実行されうる。
したがって、本発明の方法および組成物は、少なくとも以下の番号付け実施形態を含む。
実施形態
１．核酸を検出するためのシステムであって、核酸の検出時に、シグナルを発生させる核酸を検出するための、第１の組成物を含む、第１の構成要素と、第１の構成要素により発生させられたシグナルを増幅する、第２の組成物を含む、第２の構成要素とを含むシステム。
２．第１の構成要素および第２の構成要素が、実施形態４から４１に記載の組成物を含む、本明細書で記載される組成物のうちのいずれかを含む、実施形態１に記載のシステム。
３．核酸を検出する方法であって、実施形態４から４１に記載の、１つまたは複数のシステムを使用するステップを含む方法。
４．ｉ）検出用標識を含み、レポーター分子が切断されると、検出用標識が、検出のために放出される、レポーター分子；
ｉｉ）第１の認識複合体を含む一次活性化複合体；および
ｉｉｉ）不活性の二次複合体
を含む核酸検出システムであって、
ａ）第１の認識複合体が、試料中の、１つまたは複数の一次活性化因子を認識し；
ｂ）一次活性化因子を認識すると、一次活性化複合体が、活性化され、検出用標識を放出させるように、レポーター分子に作用することが可能であり；
ｃ）活性化シグナル増幅因子となるように第２の認識複合体を活性化するように、活性化一次活性化複合体が、不活性の第２の認識複合体の構成要素に作用することが可能であり；
ｄ）前記活性化シグナル増幅因子が、検出用標識を放出させるように、レポーター分子に作用することが可能であり；
ｅ）フィード－フォワードループが開始されるよう、活性化シグナル増幅因子となるように第２の認識複合体を活性化するように、前記活性化シグナル増幅因子が、不活性の第２の認識複合体の構成要素に作用することが可能である、
核酸検出システム。
５．検出用標識を含み、レポーター分子が切断されると、検出用標識が、検出のために放出される、レポーター分子；
第１のガイドＲＮＡによりプログラム化された、第１のＣａｓエフェクター酵素を含み、第１のガイドＲＮＡが、試料中の、１つまたは複数の一次活性化因子を認識し、第１のガイドＲＮＡの、一次活性化因子へのハイブリダイゼーション時に、一次活性化複合体が、活性化され、レポーター分子を切断し、検出用標識を放出する非特異的ヌクレアーゼである一次活性化複合体；ならびに
第２のＣａｓエフェクター酵素と、第２のガイドＲＮＡとを含み、一次活性化複合体の活性化が、第２のガイドＲＮＡにより認識される、１つまたは複数の活性化配列の活性化を結果としてもたらし、第２のガイドＲＮＡの、活性化配列へのハイブリダイゼーション時に、シグナル増幅複合体が、活性化され、レポーター分子を切断し、検出用標識を放出する非特異的ヌクレアーゼである、シグナル増幅因子
を含む核酸検出システム。
６．第１のＣａｓエフェクター酵素、および／または第２のＣａｓエフェクター酵素が、ＲＮアーゼまたはＤＮアーゼを含む、実施形態１から５のいずれかに記載の核酸検出システム。
７．第１のＣａｓエフェクター酵素、および／または第２のＣａｓエフェクター酵素が、１つもしくは複数のＣａｓ１３タンパク質、１つもしくは複数のＣａｓ１２タンパク質、１つもしくは複数のＣａｓ１４タンパク質、１つもしくは複数のＣｓｍ６タンパク質、および／または１つもしくは複数のＣｓｘ１タンパク質、任意選択で、付属の表、実施例、または図のうちのいずれかに示される、１つまたは複数のタンパク質（例えば、配列番号１１５～２６８）を含む、実施形態１から６のいずれかに記載の核酸検出システム。
８．第１のＣａｓエフェクター、および／または第２のＣａｓエフェクターが、１つもしくは複数のＣａｓ１３タンパク質、任意選択で、付属の表、実施例、または図のうちのいずれかに示される、１つもしくは複数のＣａｓ１３タンパク質（例えば、配列番号１１５～１３５）を含む、実施形態１から７のいずれかに記載の核酸検出システム。
９．第１のＣａｓエフェクター、および／または第２のＣａｓエフェクターが、１つまたは複数のＣａｓ１３ｄタンパク質を含む、実施形態１から８のいずれかに記載の核酸検出システム。
１０．第１のＣａｓエフェクター、および／または第２のＣａｓエフェクターが、１つもしくは複数のＣａｓ１２タンパク質、１つもしくは複数のＣａｓ１３タンパク質、１つもしくは複数のＣａｓ１４タンパク質、および／または１つもしくは複数のＣｓｍ６タンパク質を、任意の組合せで含む、実施形態１から９のいずれかに記載の核酸検出システム。
１１．第１のＣａｓエフェクター酵素、および第２のＣａｓエフェクター酵素が、同じタンパク質または異なるタンパク質のうちの１つまたは複数を含む、実施形態１から１０のいずれかに記載の核酸検出システム。
１２．第１のガイドＲＮＡ、および／または第２のガイドＲＮＡが、１つまたは複数の定常領域を含む、実施形態１から１１のいずれかに記載の核酸検出システム。
１３．第１のガイドＲＮＡ、および／または第２のガイドＲＮＡが、付属の表、図、または実施例のうちのいずれかによる、同じＲＮＡおよび／または異なるＲＮＡを含み、任意選択で、第１のガイドＲＮＡ、および／または第２のガイドＲＮＡが、表４に示される、配列番号４２～８５から選択される、実施形態１から１２のいずれかに記載の核酸検出システム。
１４．レポーター分子が、検出用標識に作動可能に連結された消光剤を含み、任意選択で、検出用標識が、１つまたは複数の蛍光分子を含む、実施形態１から１３のいずれかに記載の核酸検出システム。
１５．レポーター分子が、消光剤と、フルオロフォアとを連結するオリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドが、任意選択で、ステムループ構造を有するか、または創出する、任意選択で、ケージ化構造を含む、実施形態１から１４のいずれかに記載の核酸検出システム。
１６．レポーター分子が、表８に示される配列を含む、実施形態１から１５のいずれかに記載の核酸検出システム。
１７．レポーター分子が、トランスケージ分子と複合体化している、実施形態１から１６のいずれかに記載の核酸システム。
１８．検出用標識が、１つまたは複数の蛍光染料を含む、実施形態１から１７のいずれかに記載の核酸検出システム。
１９．活性化分子が、ケージ化されており、任意選択で、ステムループ構造を有する分子（例えば、オリゴヌクレオチド）を含むか、または創出する、実施形態１から１８のいずれかに記載の核酸検出システム。
２０．活性化分子が、オリゴヌクレオチド配列をさらに含み、オリゴヌクレオチド配列が、修飾ヌクレオチド塩基を含む、実施形態１から１９のいずれかに記載の核酸検出システム。
２１．活性化分子が、オリゴヌクレオチド配列をさらに含み、オリゴヌクレオチド配列が、ＲＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の両方を含む、実施形態１から２０のいずれかに記載の核酸検出システム。
２２．ガイド分子が、ケージ化されている、例えば、ケージ化構造またはケージ化分子であり、任意選択で、ステムループ構造を含むか、または創出する、実施形態１から２１のいずれかに記載の核酸検出システム。
２３．増幅配列のうちの１つもしくは複数、および／またはガイド配列の一方もしくは両方が、ケージ化されており、任意選択で、ケージが、ループ構造など、１つまたは複数の構造、ならびに／あるいは１つもしくは複数のロックト核酸（ＬＮＡ）もしくは部分、および／または２’－ＯＭｅ ＲＮＡを含む、増幅配列のうちの１つまたは複数に対する修飾を含むか、または引き起こす、実施形態１から２２のいずれかに記載の核酸検出システム。
２４．増幅配列のうちの１つもしくは複数が、それらの３’末端および／または５’末端において、ケージ化構造を含む、実施形態１から２３のいずれかに記載の核酸検出システム。
２５．トランスケージ化分子をさらに含む、実施形態１から２４のいずれかに記載の核酸検出システム。
２６．構成要素のうちの１つまたは複数の間の相互作用が、ある特定量の時間（例えば、数秒間、数分間、またはこれを超える時間）に限定され、例えば、第１のガイドＲＮＡ、および第２のガイドＲＮＡの一方もしくは両方、ならびに／または増幅配列のうちの１つもしくは複数が、最適の時間枠において、Ｃａｓエフェクター酵素との条件付き相互作用を可能とするように修飾されている、実施形態１から２５のいずれかに記載の核酸検出システム。
２７．１つまたは複数の増幅配列が、ポリＵ配列および／またはポリＡ配列、任意選択で、Ａ４－Ｕｎ、Ａ５－Ｕｎ、およびＡ６－Ｕｎ配列を含む、実施形態１から２６のいずれかに記載の核酸検出システム。
２８．標的配列および／または増幅配列が、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡに対して、１００％相補性である、実施形態１から２７のいずれかに記載の核酸検出システム。
２９．標的配列および／または増幅配列が、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡに対して、１００％相補性ではない、実施形態１から２８のいずれかに記載の核酸検出システム。
３０．標的配列が、１つまたは複数の哺乳動物、ウイルス、細菌、または真菌に由来するＤＮＡまたはＲＮＡである、実施形態１から２９のいずれかに記載の核酸検出システム。
３１．標的配列が、ＲＮＡウイルス中に存在する、実施形態１から３０のいずれかに記載の核酸検出システム。
３２．標的配列が、コロナウイルス中、任意選択で、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２コロナウイルス中に存在する、実施形態１から３１のいずれかに記載の核酸検出システム。
３３．試料が、生体試料または環境試料である、実施形態１から３２のいずれかに記載の核酸検出システム。
３４．生体試料が、個体から回収された、血液、唾液、尿、生検、血漿、血清、気管支肺胞洗浄液、痰、糞便試料、脳脊髄液、細針吸引物、スワブ試料（例えば、口腔スワブ、子宮頸部スワブ、鼻腔スワブ）、間質液、滑液、鼻漏、涙液、軟膜、粘膜試料、上皮細胞試料（例えば、上皮細胞掻爬試料）などを含む、実施形態１から３３のいずれかに記載の核酸検出システム。
３５．試料が、無細胞液体試料を含む、実施形態１から３４のいずれかに記載の核酸検出システム。
３６．試料が、無細胞液体環境試料を含む、実施形態１から３５のいずれかに記載の核酸検出システム。
３７．試料が、細胞を含む液体を含む、実施形態１から３６のいずれかに記載の核酸検出システム。
３８．試料中の標的配列を検出する方法であって、
（ａ）標的配列を含むことが疑われる試料を、
（ｉ）実施形態１から３７のいずれかに記載の核酸検出システム
と接触させるステップと、
（ｂ）検出用標識からの検出用シグナルを測定し、これにより、標的配列を検出するステップと
を含む方法。
３９．検出用標識のレベルを定量するステップをさらに含む、実施形態３８に記載の方法。
４０．接触させるステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける、無細胞環境内または細胞内において、二価金属イオンの存在下で実行される、実施形態３８または３９に記載の方法。
４１．接触させるステップが、数秒間～２時間である、実施形態３８から４０のいずれかに記載の方法。
これらの態様および他の態様は、全体としての本開示に照らして、当業者にたやすく明らかであろう。
本明細書で記載される、例示的ＮＣＲシステムを描示する概略図である。本発明の方法および組成物は、これらの例示的ＮＣＲシステムの構成要素の、任意の組合せを含む、全ての「ミックス／マッチ」変動を含むことが理解されるであろう。図１Ａは、一次活性化複合体（１）が、試料（例えば、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ）中の、所望の標的核酸配列を認識するガイドＲＮＡによりプログラム化されたＣａｓエフェクター酵素（Ｃａｓエフェクター酵素／ガイドは、「標的センサー」であり、また、「一次活性化因子」としても公知の、「標的」核酸を認識する）（２）を含むことを示す。標的配列の、標的センサーのガイドＲＮＡ（また、「ｃｒＲＮＡ」としても公知である）とのハイブリダイゼーション時に、標的センサーは、Ｃａｓヌクレアーゼとして活性化され、非特異的ＲＮアーゼ（例えば、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質）活性、またはＤＮアーゼ（例えば、Ｃａｓ１２エフェクタータンパク質）活性を呈する（「活性化センサー」）。活性化センサーは、レポーター分子（３）を切断して、検出用標識を放出し（例えば、蛍光レポーターを、消光剤から放出し）、検出用シグナル（蛍光など）をもたらす。この一次シグナリング経路では、シグナルは、標的核酸を検出するセンサーからの直接的応答として発生させられ、次いで、センサーを活性化する（活性化センサー）。次いで、活性化センサーは、一本鎖核酸の非特異的切断活性（「トランス切断」）に関与することが可能である。図１Ｂに示される通り、本明細書で記載されるＮＣＲシステムは、シグナル増幅因子（４）を含み、一部の実施形態では、シグナル増幅因子を、レポーター分子（３）を切断し、レポーターから検出されたシグナル（６）を増幅することが可能な非特異的ヌクレアーゼへと活性化するように、シグナル増幅因子のガイドＲＮＡとハイブリダイズする増幅ＲＮＡ（５）を認識する活性化ガイドＲＮＡによりプログラム化された第２のＣａｓエフェクタータンパク質を含む、さらなるシグナル増幅経路を含む。示される通り、増幅ＲＮＡ（５）は、増幅複合体と相互作用しないように、ケージ化されうる。活性化センサーまたは増幅複合体のトランス切断活性による、ケージ複合体内の一本鎖ループの切断は、ケージを放出し、増幅ＲＮＡが、増幅複合体と相互作用することを可能とする。一部の実施形態では、ガイドまたはｃｒＲＮＡはまた、ケージ複合体も含みうる。一部の実施形態では、活性化因子またはｃｒＲＮＡと相互作用し、ケージとして用いられるように、短鎖トランスケージ分子が添加される。一部の実施形態では、ケージは、アプタマー、リボザイムなどの使用を介するなど、他の機構により放出される。図１Ｃは、一次活性化複合体内のＣａｓ１３の、シグナル増幅経路内のＣａｓ１２を伴う使用を描示する。図１Ｄは、一次活性化複合体内のＣａｓ１２の、シグナル増幅経路内のＣａｓ１２を伴う使用を示す。この状況では、ＲＴ－ＬＡＭＰ （Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Fu et al (2011) Appl. Biochem. Biotechnol. 163 (7): 845-50）は、標的ＲＮＡを増幅するのに使用される。例えば、ミスマッチ寛容型ＬＡＭＰ、ＬＡＭＰ－Ｔ７、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）などを含む、他の増幅法も使用されうる（下記を参照されたい）。図１Ｅは、一次活性化複合体内のＣａｓ１３の、シグナル増幅経路内のＣａｓ１３を伴う使用を示し、図１Ｆは、一次活性化複合体内のＣａｓ１２の、シグナル増幅経路内のＣａｓ１３を伴う使用を示す。一部の実施形態では、ＲＴ－ＬＡＭＰ－Ｔ７増幅は、Ｃａｓ１３標的センサー複合体によるセンシングのために、一次増幅因子を増幅して、標的分子の数を増大させるのに使用される。この場合を、Ｃａｓ１３センサー複合体およびＣａｓ１３増幅複合体（図１Ｅ）の文脈で、またはＣａｓ１３センサー複合体およびＣａｓ１２センサー複合体を伴うシステム（図１Ｆ）において例示する。図１Ｇは、例示的ケージ化ガイドＲＮＡの使用を示すが、この場合、ケージは、ガイドＲＮＡの５’末端（上）または３’末端（下）に存在する。図１Ｈは、ケージ化増幅因子およびケージ化ガイドの使用のための、２つ戦略を描示し、増幅因子は、ＲＮＡヌクレオチドおよびＤＮＡヌクレオチドの両方を含みうる。一部の実施形態では、増幅ＲＮＡまたはガイドＲＮＡへと、共有結合的に連結されておらず、増幅因子またはガイドと相互作用することが可能であり、ケージ（トランスケージ分子）として作用するオリゴヌクレオチド配列が使用されうる。図１Ｉおよび図１Ｊは、Ｃｓｍ６を使用して、シグナルを増幅する経路を示す。これらの図では、「ＮＣＲ」という用語は、合成核酸を指し、ＮＣＲの後の数値コードは、特定の核酸（例えば、付属の表、実施例、または図のうちのいずれかに示される）を同定する。「ＲＮＰ」とは、リボヌクレオチド－タンパク質複合体、典型的に、Ｃａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡを指す。 図１－１の続きである。 図１－１の続きである。 図１－１の続きである。 図１－１の続きである。 図１－１の続きである。 図１－１の続きである。 図１－１の続きである。 図１－１の続きである。 いくつかの活性化ＲＮＡについて、一次活性化ＲＮＡ（各条件下に右バーとして示される、「一次活性化あり」）の存在下、および一次（各条件下に左バーとして示される、「一次活性化なし」）の非存在下で検出されるシグナルを示すグラフを描示する図である。「二次活性化なし」とは、一次活性化システムまたは二次活性化システムの非存在下におけるシグナルを示す。一次活性化ＲＮＡの存在下または非存在下で、示差的シグナルを呈する、２つの配列（ＮＣＲ＿０６１およびＮＣＲ＿０６４）が表示される。 ４つの活性化ＲＮＡ、ＮＣＲ＿０４５（図３Ａ）、ＮＣＲ＿０４２（図３Ｂ）、ＮＣＲ＿０６１（図３Ｃ）、およびＮＣＲ＿０６７（図３Ｄ）について、時間経過にわたるシグナルを示す、４つのグラフを描示する図である。ＮＣＲ＿０４５およびＮＣＲ＿０４２について、「ケージのみ」とは、増幅ＲＮＡのみの存在下で観察されるシグナルであり；「一次」とは、二次増幅を伴わない場合に観察されるシグナルを指し示し；「ケージ＋一次」とは、全ての構成要素が存在する場合に観察されるシグナルを指し示す。ＮＣＲ＿０６１およびＮＣＲ＿０６７について、データ曲線は、グラフに表示の通りである。「ＲＮＰ２」とは、二次増幅複合体を意味する。 図３－１の続きである。 一連の最適化反応物中で観察されるシグナルを描示するグラフである。図４Ａは、一次活性化ＲＮＡの濃度を、２００ｐＭ～２０ｆＭで変動させるときに観察されるシグナルを示す。２０ｐＭにおけるシグナルは、これらの条件下にあるＮＣＲ＿０６１について、ＮＣＲの非存在下におけるシグナルを、増幅の存在下と比較した場合の、最大の差違を呈する。図４Ｂは、時間経過にわたるシグナルの発生を描示し、２００ｐＭにおけるＮＣＲシグナルが、最も急速に発生することを裏付ける。図４Ｃは、最適化ガイドＲＮＡによるシグナルを描示する。図４Ｄは、これらの結果を、時間経過にわたり示し、このガイドについて、濃度を２０ｐＭとする一次活性化ＲＮＡが、最も急速に発光することを裏付ける。 図４－１の続きである。 活性化ＲＮＡの修飾について調べる実験からの結果を示す図である。図５Ａは、活性化因子が、抗タグ配列を組み入れた場合に得られるシグナルを示し、図５Ｂは、抗タグ配列が、非存在である場合のシグナルを示す。「通常型」とは、抗タグ配列を欠く活性化ＲＮＡが使用される場合に観察されるデータを指し示す。示差的シグナルは、抗タグ配列を組み入れる場合に観察される。図５Ｃ～５Ｅは、活性化ＲＮＡ内の変動に由来する、シグナル増幅に対する効果を裏付ける。図５Ｃは、活性化ＲＮＡ上に、ケージを伴わない場合における、時間経過にわたるシグナル発生を描示する。図５Ｄおよび図５Ｅは、活性化因子が、ケージ構造内に、さらなるウリジンを有する場合における、シグナル発生に対する効果を示す。 図５－１の続きである。 図５－１の続きである。 図５－１の続きである。 ケージ化ガイドＲＮＡの使用と関連する配列およびデータを描示する図である。図６Ａは、ガイドＲＮＡ（ＮＣＲ＿０１８、配列番号２１）を描示する。図６Ｂは、ケージ化ＮＣＲ＿０１８またはそのコグネイトの非ケージ化同等物（ＮＣＲ＿００９）が使用される場合に観察されるデータを描示する。２つの濃度を１０ｐＭおよび１０ｎＭとする、ＮＣＲ＿００９を使用した。図６Ｃは、バックグラウンドシグナルを、一次活性化因子および二次活性化の存在下におけるシグナルから差し引いた場合に観察される結果を描示する。 図６－１の続きである。 代替的ケージ化ガイドＲＮＡにより得られるデータを示すグラフを描示する図である。描示されるデータは、一次活性化および二次活性化（ケージ）の存在下で得られるデータが、一次シグナルのみから観察されるシグナルを有し、二次（ケージ）シグナルのみから観察されるシグナルが、これから差し引かれる場合に観察されるシグナルである。 異なる一本鎖ループ構造を含む、ケージ化ガイドＲＮＡが使用される場合に観察されるシグナル動態を示すグラフである。ガイドのステム－ループ区間は、表示される、それらの融点により特徴づけられる。融点が低いステムループを組み入れるガイドを使用すると、急速なシグナル動態が観察される。 トランスケージ分子を使用する実験の結果を示す図である。図９Ａは、その固有のケージ構造を欠くが、上図に、トランスケージ分子である、ＮＣＲ＿２７１と複合体化していることが示されるガイドＲＮＡ（ＮＣＲ＿００４）を描示する。下方に、上から下へと、ＮＣＲ＿２６８、ＮＣＲ＿２６９、ＮＣＲ＿２７０、ＮＣＲ＿２７１、およびＮＣＲ＿２７２を含む、一連のトランスケージ分子とアライメントさせられたＮＣＲ＿００４を示す。図９Ｂ（ＮＣＲ＿２６９）、図９Ｃ（ＮＣＲ＿２６８）、図９Ｄ（ＮＣＲ＿２７０）、図９Ｅ（ＮＣＲ＿２７１）、および図９Ｆ（ＮＣＲ＿２７２）は、トランスケージの、ガイドＲＮＡに対する比を変動させる、異なるトランスケージ分子を使用して発生させられるシグナルを描示する。 図９－１の続きである。 図９－１の続きである。 図９－１の続きである。
Ｃａｓタンパク質を伴う、現行のＣＲＩＳＰＲベースの核酸検出法は、Ｃａｓ１３酵素またはＣａｓ１２酵素が、所望の標的配列を認識し、非特異的な、ＲＮアーゼまたはＤＮアーゼ活性を活性化する、ガイドＲＮＡによりプログラム化されうるという事実を利用する。非特異的ヌクレアーゼは、蛍光などの検出用シグナルをもたらす、消光させられた蛍光レポーターなどの検出用標識を放出するのに使用される。しかし、現行の方法は、感度が限定的な場合がある。現行の方法はまた、特異的装置（例えば、ＰＣＲ機器）、特殊条件（例えば、温度）、複数のピペッティングステップなどの反復的手作業法、または報告の長時間化を結果としてもたらす、他の複雑なステップも要求しうる。
したがって、本明細書では、標的核酸を検出すると、指数関数的シグナルを発生させ、標的配列の、効率的な検出をもたらすように、増幅的フィード－フォワードループを付与する内部ヌクレアーゼ連鎖反応（ＮＣＲ）を含む一体型検出モダリティーをもたらすことにより、現行の方法の限界を克服する、核酸検出用の組成物、システム、および方法について記載される。本明細書で記載されるＮＣＲ用の組成物、システム、および方法は、任意の標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡの、高感度かつ迅速な検出であって、転写状態、がん、または細菌、もしくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９感染症と関連する）などのコロナウイルスを含むウイルスなどの病原体の検出を含む検出をもたらす。
全般
本明細書で開示される方法の実践、ならびに本明細書で開示される組成物の調製および使用は、そうでないことが指し示されない限りにおいて、分子生物学、生化学、クロマチンの構造および解析、計算化学、細胞培養法、組換えＤＮＡ法、ならびに当技術分野の技術範囲内にある関連分野における、常套的な技法を利用する。
定義
本明細書では、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、および「核酸」は、互換的に使用される。これらの用語は、任意の長さ、鎖状態（二本鎖または一本鎖）の核酸、ならびにリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはデオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）、およびこれらのハイブリッド分子（ＤＮＡおよびＲＮＡを含む）のポリマー形態を指す場合がある。開示される核酸はまた、天然に存在するヌクレオ塩基、および合成または非天然のヌクレオ塩基も含みうる。天然ヌクレオ塩基は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。
「相補性」とは、それが、第２の核酸と、「塩基対合する」か、「結合する」か、「アニールする」か、または「ハイブリダイズする」ことを可能とする、第１の配列を有する、第１の核酸を指す。結合は、相補性の量と、環境のイオン強度、温度など、ある特定の外部条件とに影響される場合がある。当技術分野では、塩基対合規則が周知である（Ａは、ＤＮＡでは、Ｔと対合し、ＲＮＡでは、Ｕと対合し；Ｇは、Ｃと対合する）。場合によって、ＲＮＡは、Ｇが、Ｕと対合しうる対合を含みうる。相補性は、全ての場合に、完全な相補性または１００％の相補性を指し示すわけではない。例えば、相補性は、１００％未満であり、かつ、約６０％を超える場合がある。
「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」は、互換的に使用される。用語は、天然残基および非天然残基を含みうる、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。残基はまた、ポリペプチドへの組込みの前に修飾される場合もあり、この後で修飾される場合もある。一部の実施形態では、ポリペプチドは、分枝状の場合もあり、直鎖状の場合もある。
Ｃａｓタンパク質に言及する場合の「プログラム化」とは、標的配列と相補性の配列を含有するガイドＲＮＡを含む、Ｃａｓタンパク質を指す。典型的に、プログラム化Ｃａｓタンパク質は、操作ガイドＲＮＡを含む。
「Ｃａｓタンパク質」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。本明細書で開示されるＣａｓタンパク質は、標的配列が、Ｃａｓタンパク質が結合したガイドＲＮＡに結合すると、活性化されうるヌクレアーゼ活性を有する。下記でより詳細に開示される通り、ガイドＲＮＡは、一部の実施形態では、プレｃｒＲＮＡ配列からプロセシングされうるｃｒＲＮＡを、他の配列と共に含みうる。ある実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、天然核酸、または合成核酸、例えば、限定せずに述べると、ロックト核酸（ＬＮＡ）、２’－ｏ－メチル化塩基、なおまたはｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）などの修飾核酸を含みうる。Ｃａｓタンパク質は、当業者に公知の、多様な供給源に由来しうる、Ｃａｓ１２群またはＣａｓ１３群に由来しうる。
Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」でありうる。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」とは、天然配列ポリペプチドと共通の、定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」は、それらが、対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物学的活性を有することを条件として、天然配列の断片、ならびに天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片を含むがこれらに限定されない。本明細書で想定される生物学的活性とは、機能的誘導体が、ＤＮＡ基質を、断片へと加水分解する能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、共有結合的修飾、およびこれらの融合体の全てを包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の、適切な誘導体は、Ｃａｓタンパク質またはその断片の、突然変異体、融合体、共有結合的修飾を含むがこれらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片のほか、Ｃａｓタンパク質またはその断片の誘導体を含むＣａｓタンパク質は、細胞から得られる場合もあり、化学合成される場合もあり、これらの２つの手順の組合せにより得られる場合もある。細胞は、Ｃａｓタンパク質を、天然で産生する細胞の場合もあり、Ｃａｓタンパク質を、天然で産生し、かつ、内因性Ｃａｓタンパク質を、高発現レベルで産生するか、または内因性Ｃａｓと同じであるか、または異なるＣａｓをコードする、外因的に導入された核酸から、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞の場合もある。場合によって、細胞は、Ｃａｓタンパク質を、天然で産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている。
「コード配列」とは、ポリペプチド配列またはＲＮＡ配列、例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列である。ポリペプチドをコードするコード配列は、まず、ＲＮＡへと転写され、ＲＮＡは、ポリペプチドのアミノ酸配列をコードしうる。ガイドＲＮＡなど、一部のＲＮＡ配列は、アミノ酸配列をコードしない場合がある。
「天然」、「天然に存在する」、「非改変」、または「野生型」とは、とりわけ、天然で見出される、タンパク質、アミノ酸、細胞、ヌクレオ塩基、核酸、ポリヌクレオチド、および生物について記載する。例えば、天然で見出される核酸配列と同一であり、人為により改変されていない核酸配列は、天然配列である。
「ハイブリダイズ可能」または「相補性」または「実質的に相補性」とは、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）が、温度および溶液イオン強度についての、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ条件、および／またはｉｎ ｖｉｖｏ条件下で、核酸が、配列特異的に、アンチパラレル式に（すなわち、核酸は、相補性核酸に特異的に結合する）、別の核酸に非共有結合的に結合する、すなわち、ワトソン－クリック型塩基対合、および／もしくはＧ／Ｕ塩基対合を形成するか、「アニールする」か、または「ハイブリダイズする」ことを可能とする、ヌクレオチド配列を含むことを意味する。標準的ワトソン－クリック型塩基対合は、アデニン／アデノシン（Ａ）の、チミジン／チミジン（Ｔ）との対合、Ａの、ウラシル／ウリジン（Ｕ）との対合、およびグアニン／グアノシン（Ｇ）の、シトシン／シチジン（Ｃ）との対合を含む。加えて、２つのＲＮＡ分子の間のハイブリダイゼーション（例えば、ｄｓＲＮＡ）、およびＤＮＡ分子の、ＲＮＡ分子とのハイブリダイゼーション（例えば、ＤＮＡである標的核酸が、ガイドＲＮＡと塩基対合する場合など）では、Ｇはまた、Ｕとも塩基対合しうる。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対合は、ｔＲＮＡアンチコドンの、ｍＲＮＡ内のコドンとの塩基対合の文脈では、部分的に、遺伝子コードの縮重（すなわち、冗長性）の一因となる。したがって、本開示の文脈では、Ｇ（例えば、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合性セグメント（例えば、ｄｓＲＮＡ二重鎖）；ガイドＲＮＡと塩基対合する標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ）の）は、ＵおよびＣの両方と相補性であると考えられる。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対が、ガイドＲＮＡ分子の、タンパク質結合性セグメント（例えば、ｄｓＲＮＡ二重鎖）の所与のヌクレオチド位置において成立しうる場合、この位置は、非相補性であるとは考えられず、相補性であると考えられる。
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が、相補性配列を含有することを要求するが、塩基間のミスマッチも可能である。２つの核酸の間のハイブリダイゼーションに適する条件は、当技術分野で周知の変数である、核酸の長さと、相補性の程度とに依存する。２つのヌクレオチド配列の間の相補性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッド体の融点（Ｔｍ）の値は大きい。典型的に、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、８ヌクレオチドもしくはこれを超える（例えば、１０ヌクレオチドもしくはこれを超えるか、１２ヌクレオチドもしくはこれを超えるか、１５ヌクレオチドもしくはこれを超えるか、２０ヌクレオチドもしくはこれを超えるか、２２ヌクレオチドもしくはこれを超えるか、２５ヌクレオチドもしくはこれを超えるか、または３０ヌクレオチドもしくはこれを超える）である。
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列と、１００％相補性である必要がないことが理解される。さらに、介在するセグメントまたは隣接セグメント（例えば、ループ構造またはヘアピン構造、「バルジ」など）が、ハイブリダイゼーションイベントに関与しないように、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のセグメントを越えてハイブリダイズしうる。ポリヌクレオチドは、それがハイブリダイズする標的核酸配列内の標的領域に対する、６０％もしくはこれを超えるか、６５％もしくはこれを超えるか、７０％もしくはこれを超えるか、７５％もしくはこれを超えるか、８０％もしくはこれを超えるか、８５％もしくはこれを超えるか、９０％もしくはこれを超えるか、９５％もしくはこれを超えるか、９８％もしくはこれを超えるか、９９％もしくはこれを超えるか、９９．５％もしくはこれを超えるか、または１００％の配列相補性を含みうる。例えば、アンチセンス化合物の、２０ヌクレオチドのうちの１８ヌクレオチドが、標的領域と相補性であり、したがって、特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸であれば、９０パーセントの相補性を表すであろう。残りの非相補性ヌクレオチドは、クラスター化している場合もあり、相補性ヌクレオチドが散在している場合もあり、互いと、または相補性ヌクレオチドと連続する必要がない。核酸内の核酸配列の特定の連なりの間の相補性パーセントは、任意の好都合な方法を使用して決定されうる。例示的な方法は、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的なローカルアライメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410；Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656）、またはＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ）の使用、例えば、Smith and Waterman（Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489）によるアルゴリズムを使用する、デフォルト設定の使用を介する方法を含む。
本明細書で使用される、「～に結合すること」（例えば、標的核酸に結合する、ポリペプチドのＲＮＡ結合性ドメインなどに関する）とは、高分子の間の、非共有結合的相互作用（例えば、タンパク質と核酸との間；ガイドＲＮＡと標的核酸との間など）を指す。非共有結合的相互作用の状態にある場合、高分子は、「会合している」または「相互作用している」または「結合している」と言われる（例えば、分子Ｘが、分子Ｙと相互作用すると言われる場合、これは、分子Ｘが、分子Ｙに、非共有結合的に結合することを意味する）。結合相互作用の全ての成分が、配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸残基と接触する）必要はなく、結合相互作用のうちの一部が配列特異的である場合もある。結合相互作用は、一般に、１０－６Ｍ未満、１０－７Ｍ未満、１０－８Ｍ未満、１０－９Ｍ未満、１０－１０Ｍ未満、１０－１１Ｍ未満、１０－１２Ｍ未満、１０－１３Ｍ未満、１０－１４Ｍ未満、または１０－１５Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）により特徴づけられる。「アフィニティー」とは、結合の強度を指し、結合アフィニティーの増大は、低値のＫｄと相関する。
「結合性ドメイン」とは、別の分子に非共有結合的に結合することが可能である、タンパク質ドメインを意味する。結合性ドメインは、例えば、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合性ドメイン）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合性ドメイン）に結合しうる。タンパク質結合性ドメインを有するタンパク質の場合、結合性ドメインは、場合によって、それ自体に結合する（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）場合もあり、かつ／または１つまたは複数の、異なるタンパク質の、１つまたは複数の領域に結合する場合もある。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、タンパク質内の、類似の側鎖を有するアミノ酸残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなり；脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンからなり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンからなり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンからなり；酸性側鎖を有するアミノ酸の群は、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンからなる。例示的な保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リシン－アルギニン、アラニン－バリン－グリシン、およびアスパラギン－グルタミンである。
本明細書では、「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、および「調節エレメント」という用語は、互換的に使用され、非コード配列（例えば、ガイドＲＮＡ）もしくはコード配列（例えば、タンパク質をコードする）の転写をもたらし、かつ／もしくは調節し、かつ／またはコードされるポリペプチドの翻訳を調節するなど、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写制御配列および翻訳制御配列を指す。
本明細書で使用される、「プロモーター配列」とは、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）における、コード配列または非コード配列の転写を誘発することが可能なＤＮＡ調節領域である。真核生物プロモーターは、常にではないが、しばしば、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有するであろう。誘導可能なプロモーターを含む、多様なプロモーターが、本開示の、多様な核酸（例えば、ベクター）を駆動するのに使用されうる。
核酸、ポリペプチド、細胞、または生物へと適用される場合に本明細書で使用される、「天然に存在する」または「非改変」または「野生型」という用語は、天然で見出される、核酸、ポリペプチド、細胞、または生物を指す。
本明細書で使用される「組換え」とは、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が、天然系において見出される内因性核酸から識別可能な、構造的コード配列または構造的非コード配列を有する構築物を結果としてもたらす、クローニングステップ、制限ステップ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ステップ、および／またはライゲーションステップの多様な組合せの生成物であることを意味する。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片からアセンブルされる場合もあり、細胞内または無細胞転写系内および無細胞翻訳系内に含有される組換え転写単位からの発現が可能な合成核酸をもたらす、一連の合成オリゴヌクレオチドからアセンブルされる場合もある。対象とする配列を含むゲノムＤＮＡもまた、組換え遺伝子または転写単位の形成において使用されうる。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’側に存在する場合もあり、３’側に存在する場合もあるが、これらの場合に、このような配列は、コード領域の操作または発現に干渉せず、実際には、多様な機構による、所望の生成物の作製をモジュレートするように作用しうる（下記の「ＤＮＡ調節配列」を参照されたい）。代替的に、翻訳されないＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列もまた、組換えであると考えられうる。したがって、「組換え」核酸という用語は、天然に存在しない核酸、例えば、ヒト介入を介して、天然に存在しない形で隔てられた、２つの配列セグメントの人工的組合せにより作製された核酸を指す。この人工的組合せは、単離核酸セグメントの化学合成手段または人工的操作により、例えば、遺伝子操作法により達せられることが多い。このような人工的組合せは、通例、コドンを、同じアミノ酸、保存的アミノ酸、または非保存的アミノ酸をコードするコドンで置きかえるようになされる。代替的に、人工的組合せは、所望の機能を有する核酸セグメントを、一体に接続して、所望の機能の組合せをもたらすように実施される。この人工的組合せは、単離核酸セグメントの化学合成手段または人工的操作により、例えば、遺伝子操作法により達せられることが多い。組換えポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードする場合、コードされるポリペプチドの配列は、天然に存在する（「野生型」）配列の場合もあり、天然に存在する配列の変異体（例えば、突然変異体）の場合もある。したがって、「組換え」ポリペプチドという用語は、その配列が、天然に存在しないポリペプチドを、必ずしも指さない場合がある。そうではなく、「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ配列によりコードされるが、ポリペプチドの配列は、天然に存在する（「野生型」）配列の場合もあり、天然に存在しない（例えば、変異体、突然変異体など）配列の場合もある。したがって、「組換え」ポリペプチドは、ヒト介入の結果であるが、天然に存在するアミノ酸配列でありうる。
「ベクター」または「発現ベクター」とは、接合されたセグメントの、細胞内の複製をもたらすように、別のＤＮＡセグメントすなわち、「インサート」が、接合されうるプラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドなどのレプリコンである。
「発現カセット」は、プロモーターに作動可能に連結された、ＤＮＡコード配列を含む。「作動可能に連結された」とは、そのように記載された構成要素が、意図された形で機能することを可能とする関係にある並置を指し、例えば、プロモーターが、その転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。
本明細書では、「組換え発現ベクター」または「ＤＮＡ構築物」という用語は、ベクターと、１つのインサートとを含むＤＮＡ分子を指すように、互換的に使用される。組換え発現ベクターは、通例、インサート（複数可）を発現および／または増殖させることを目的として作出され、または他の組換えヌクレオチド配列の構築のために作出される。インサート（複数可）は、プロモーター配列に作動可能に連結される場合もあり、そうでない場合もあり、ＤＮＡ調節配列に作動可能に連結される場合もあり、そうでない場合もある。
任意の所与の構成要素、または構成要素の組合せは、標識化されない場合もあり、標識部分により、検出可能な形で標識される場合もある。場合によって、２つまたはこれを超える構成要素が、標識付けされる場合、これらは、互いから識別可能な標識部分により標識されうる。
「標識」または「標識化」とは、構成要素を、１つまたは複数の技法により同定可能とする分子を伴う構成要素を指す。標識の非限定例は、ストレプトアビジンおよび蛍光分子を含む。「蛍光剤」という用語は、検出可能な範囲内で、蛍光を呈することが可能な物質またはその部分を指す。標識は、標識（例えば、ストレプトアビジンに結合するビオチン）との結合相互作用により検出される場合もあり、蛍光光度計を使用する、蛍光シグナルの検出を介して検出される場合もある。他の検出用標識は、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、またはアルカリホスファターゼなどの酵素標識を含む。「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、必ずしも、規定のアッセイにより測定されるわけではないが、好ましくは、規定のアッセイにより容易に測定される、タンパク質産物をもたらす、任意の配列を指す。適切なレポーター遺伝子は、発色タンパク質または蛍光タンパク質または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）をコードする配列を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、酵素標識は、ＣＲＩＳＰＲ酵素活性（例えば、一次活性化因子の存在による活性化の後におけるトランス切断）によりターゲティング可能な核酸リンカーにより連結される、２つもしくはこれを超える部分片への分割により不活化される。リンカーが切断されると、酵素レポーターの部分片は、検出用シグナルを発生させるように、基質へと作用しうる、活性酵素へのアセンブルが可能となるであろう。
本明細書では、「試料」という用語は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む、任意の試料（例えば、標的配列が、ポリヌクレオチド配列の集団の中に存在するのかどうかを決定するために）を意味するように使用される。試料は、任意の供給源に由来することが可能であり；例えば、試料は、精製ＲＮＡ／ＤＮＡの、合成による組合せの場合もあり；試料は、細胞溶解物、ＲＮＡ／ＤＮＡがエンリッチされた細胞溶解物、または細胞溶解物から単離および／または精製されたＲＮＡ／ＤＮＡの場合もある。試料は、環境試料、農業試料、または食物試料でありうる。試料は、患者（例えば、診断を目的として）に由来しうる。試料は、血液、汗、血漿、血清、痰、唾液、粘液、細胞、排出物、尿、脳脊髄体液（ＣＳＦ）、母乳、精液、膣液、組織などのうちの１つまたは複数から選択されるか、またはこれらに由来しうる。試料は、透過化細胞に由来しうる。試料は、架橋化細胞に由来しうる。試料は、組織切片内の細胞でありうる。試料は、架橋化、続いて脱脂化、および一様な屈折率をもたらすための補正により調製された組織に由来しうる。架橋化、続いて脱脂化、および一様な屈折率をもたらすための補正による組織調製の例については、例えば、Shah et al., Development (2016) 143, 2862-2867 doi:10.1242/dev.138560において記載されている。
値の範囲が提示される場合は、その範囲の上限と下限との間の、文脈によりそうでないことが明確に指示されない限りにおいて、下限の単位の１０分の１までの、各中間の値、およびその言明された範囲内の、他の任意の言明された値または中間の値が、本発明に包含されることが理解される。これらの小範囲の上限および下限は、独立に、より小さな範囲内に包含される場合があり、これらもまた、本発明の範囲内に包含され、言明された範囲内の、任意の、具体的に除外された限界により決まる。言明された範囲が、限界の一方または両方を包含する場合、これらの包含された限界の一方または両方を除外する範囲もまた、本発明に包含される。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により、一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試行では、本明細書で記載される方法および材料と、同様または同等である、任意の方法および材料が使用されうるが、ここでは、好ましい方法および材料が記載される。本明細書で言及される、全ての刊行物は、刊行物が引用される関連の方法および／または材料を開示し、これらについて記載するように、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
文脈が、そうでないことを明確に指示しない限りにおいて、本明細書および付属の特許請求の範囲において使用される、単数形の「ある（ａ）」「ある（ａｎ）」、および「その」は、複数形の指示対象も含むことに注意されたい。したがって、例えば、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質」への言及は、複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（同じであるか、または異なるＣａｓエフェクタータンパク質を含む）を含み、「ガイドＲＮＡ」への言及は、１つまたは複数のガイドＲＮＡ、および当業者に公知のその同等物への言及を含むなどである。特許請求の範囲は、任意選択の要素を除外するように起草されうることに、さらに注意されたい。このように、本言明は、特許請求の範囲の要素の列挙、または「否定的」限定の使用との関連における、「ただ」、「のみ」などの除外的用語法の使用のための先行詞として用いられることが意図される。
明確さのために、個別の実施形態の文脈で記載される、本発明のある特定の特色はまた、単一の実施形態に組み合わされても提示されうることが理解される。逆に、簡潔さのために、単一の実施形態の文脈でも記載される、本発明の多様な特色はまた、個別に提示される場合もあり、任意の適切な部分的組合せにおいて提示される場合もある。本発明に関する実施形態の、全ての組合せは、本発明により、具体的に包含され、本明細書では、各組合せおよびあらゆる組合せが、個別に、かつ、明示的に開示された場合と全く同様に開示される。加えて、多様な実施形態およびその要素の、全ての部分的組合せもまた、本発明により、具体的に包含され、本明細書では、このような各部分的組合せおよびあらゆる部分的組合せが、本明細書で、個別に、かつ、明示的に開示された場合と全く同様に開示される。
本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日の前における、それらの開示のみについて提示される。本明細書におけるいかなる内容も、本発明が、先行発明である理由で、このような刊行物に先行する権利がないことの容認として理解されるべきではない。さらに、提示される刊行日は、独立に確認される必要がありうる、実際の刊行日と異なりうる。試料中の特異的標的核酸配列（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の存在または非存在を検出するための組成物、方法、およびシステムは、１つまたは複数の特異的核酸配列の存在の同定により、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、もしくは真菌感染、または状態、疾患、もしくは障害を有する、患者または試料を、費用効果的に診断することを可能とする。本発明の組成物、方法、およびシステムはまた、遺伝子スクリーニング、がんスクリーニング、突然変異解析、マイクロＲＮＡ解析、ｍＲＮＡ解析、一塩基多型解析などにおいても有用である。
組成物およびシステム
試料中の標的ＲＮＡ配列または標的ＤＮＡ配列（二本鎖または一本鎖）を検出するための組成物、システム、および方法が提供される。特に、本明細書では、標的核酸の検出時に、増幅的フィード－フォワードループを発生させて、シグナルの指数関数的増大をもたらす、内部ＮＣＲを含むシステムについて記載される。システムおよび方法は、任意の数および種類の、検出構成要素および／または増幅構成要素、例えば、目的の核酸を検出し、検出後にシグナルを発生させることが可能な検出剤を含む、少なくとも第１の構成要素と、目的の核酸の存在下で発生させられるシグナルを増大させる（増幅する）増幅因子を含む、第２の構成要素とを含むシステムを含みうる。構成要素（例えば、検出剤および／または増幅因子）は、スプリット酵素、Ｔｔａｇｏ（ａｒｇｏｎａｕｔｅ）タンパク質、プログラム型単鎖ガイドＲＮＡなどの核酸結合性分子を含むがこれらに限定されない、任意の数の、同じ分子または異なる分子を含みうる。
組成物および本明細書で記載されるシステムは、（ｉ）第１のガイドＲＮＡと会合し、この第１のガイドＲＮＡが、試料の標的ＲＮＡ配列または標的ＤＮＡ配列（一次活性化因子）を認識する（これとハイブリダイズする）、第１のＣａｓエフェクタータンパク質（例えば、ＲＮＡの検出のためにはＣａｓ１３タンパク質、ＤＮＡの検出のためにはＣａｓ１２タンパク質またはＣａｓ１４）を含む標的センサー；（ｉｉ）第１のガイドＲＮＡにより認識されない配列を介して、消光剤へと連結された検出用標識（例えば、蛍光部分）を含み、検出用標識が測定されうるように、切断、例えば、複合体から、検出用標識を放出する、ヌクレアーゼによる切断（例えば、トランス切断）（例えば、標識を、消光剤またはケージへと連結する配列の切断）時に活性化される不活性レポーター分子（複合体）；（ｉｉｉ）第２のガイドＲＮＡと会合した、第２のＣａｓエフェクタータンパク質を含むシグナル増幅因子、またはケージが放出されるまで、シグナル増幅因子が、不活性であるように、ケージ化ガイドＲＮＡの存在下にある、第２のＣａｓエフェクタータンパク質を含むシグナル増幅因子；ならびに（ｉｖ）第２のシグナル増幅因子のガイドＲＮＡにより認識される配列を含み、任意選択で、シグナル増幅因子が、レポーターを切断して、検出用標識を放出することが可能な非特異的ヌクレアーゼとなるように、活性化因子の、シグナル増幅因子への結合（例えば、活性化因子の、シグナル増幅因子のガイドＲＮＡへのハイブリダイゼーション）が、シグナル増幅因子を活性化する、不活性レポーター複合体の一部である、活性化分子（本明細書でまた、「増幅活性化因子」とも称される）を含みうる。
図１Ａ～１Ｊに示される通り、第１のＣａｓエフェクタータンパク質の、一次活性化配列へのハイブリダイゼーション（結合）（第１のガイドＲＮＡを介する）がなされて、標的センサーが活性化されると、非特異的なＲＮアーゼ（Ｃａｓ１３エフェクター）またはＤＮアーゼ（Ｃａｓ１２エフェクターまたはＣａｓ１４エフェクター）を含む活性化一次活性化複合体が形成される。この活性化一次活性化複合体は、トランスの非特異的ヌクレアーゼ活性を呈し、次いで、標識が、検出可能となる（もはや、消光させられない）ように、不活性レポーター複合体を切断することにより、レポーター（検出用標識）を活性化するが、この反応は、標的の存在下でのみ生じる。加えて、活性化一次活性化複合体は、二次増幅複合体の、第２のガイドＲＮＡが、放出された活性化分子とハイブリダイズするか、または二次ガイドが放出されて、ガイドＲＮＡの複合体化を欠くＣａｓタンパク質（ａｐｏ Ｃａｓタンパク質）および遊離活性化因子と結合するように、活性化分子を放出しうる。活性化分子とハイブリダイズさせられると、さらなる検出用標識が放出されるように、二次増幅複合体が、不活性レポーター複合体を切断することが可能である、非特異的な活性化トランスＲＮアーゼまたは活性化トランスＤＮアーゼとなるか、またはケージが放出されて、ケージ化活性化ＲＮＡおよび／またはケージ化ガイドＲＮＡが、二次増幅複合体と相互作用することを可能とするように、トランス切断活性が作用する。この工程は、「フィードフォワード増幅」と称される。２つの活性化センサー（一次活性化複合体および二次増幅複合体）の存在は、迅速かつ高感度の検出のために、一次活性化配列の存在下で得られるシグナルを増幅する。このシステムでは、一次活性化複合体が、一次活性化複合体の検出からの、シグナルの直線的増幅を結果としてもたらすのに対し、二次増幅システムの付加は、指数関数的増幅を結果としてもたらす。場合によって、ケージは、１つまたは複数のステムループ構造を含む。場合によって、ループ構造は、場合によって一本鎖ループを残して、ＲＮＡにフォールドバックする相補性配列の付加により、ＲＮＡ上で引き起こされる。このようにして、ケージ配列の付加は、ＲＮＡ上における、１つまたは複数のステムループの形成を引き起こす。
したがって、開示されるシステムは、最小限の試料調製を伴うが、特に、試料から核酸を増幅する必要を伴わずに、哺乳動物、ウイルス、細菌、真菌などを含む、様々な供給源からの、廉価かつ迅速な核酸標的配列の検出をもたらす。試料は、ヒト患者または非ヒト患者に由来する生物学的試料の場合もあり、水、食物などに由来する環境試料の場合もある。
ＣａｓセンサーおよびＣｓｍ６センサーならびにシグナル増幅因子
組成物およびシステムのＣａｓエフェクター分子（標的センサーおよび／またはシグナル増幅因子）内では、任意の種類のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えば、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＶＩ型）、Ｃｓｍ６タンパク質、Ｃｓｘ１タンパク質などに由来するＣａｓタンパク質を含むがこれらに限定されない、任意のＣａｓタンパク質（複数可）が使用されうる。
Ｃａｓタンパク質は、古細菌および細菌を含む、任意の適切な供給源に由来しうる。一部の実施形態では、天然Ｃａｓタンパク質は、パルディバクター属（Paludibacter）、カルノバクテリウム属（Carnobacterium）、リステリア属（Listeria）、ヘルビニクス属（Herbinix）、ロドバクター属（Rhodobacter）、レプトトリキア属（Leptotrichia）、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、エウバクテリウム属（Eubacterium）、またはクロストリジウム属（Clostridium）に由来しうる。一部の実施形態では、天然Ｃａｓタンパク質は、パルジバクター・プロピオニキゲネス（Paludibacter propionicigenes）、カルノバクテリウム・ガリナルム（Carnobacterium gallinarum）、リステリア・セーリゲリ（Listeria seeligeri）、リステリア・ニューヨーケンシンス（Listeria newyorkensis）、ヘルビニクス・ヘミセルロシリティカ（Herbinix hemicellulosilytica）、ロドバクター・カプスラートゥス（Rhodobacter capsulatus）、レプトトリキア・ウェイディイ（Leptotrichia wadei）、レプトトリキア・ブッカーリス（Leptotrichia buccalis）、レプトトリキア・シャーイイ（Leptotrichia shahii）、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）菌ＮＫ４Ａ１７９株、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）菌ＭＡ２０２０株、エウバクテリウム・レクターレ（Eubacterium rectale）、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）菌ＮＫ４Ａ１４４株、およびクロストリジウム・アミノフィルム（Clostridium aminophilum）に由来しうる。
本明細書で記載されるＣａｓタンパク質（複数可）は、天然Ｃａｓタンパク質と相同でありうる。一部の実施形態では、開示されるＣａｓタンパク質は、天然Ｃａｓタンパク質配列と、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％を超え、かつ、約１００％、９９％、９８％、９７％、９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％未満同一である。開示されるＣａｓタンパク質は、１つまたは複数のＨＥＰＮドメインを有する場合があり、活性化の後で、前駆体ガイドＲＮＡと、インディケーターＲＮＡとを含む、一本鎖ＲＮＡを切断することが可能でありうる。
Ｃａｓタンパク質の活性化は、１つまたは複数の標的配列を、Ｃａｓタンパク質と会合したガイドＲＮＡ配列と接触させることを含みうる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質のガイドＲＮＡは、相補性の標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズすることにより、Ｃａｓタンパク質のＲＮアーゼ活性を活性化する一助となりうる。
開示されるＣａｓタンパク質は、Ｖ型（例えば、Ｃａｓ１２および／またはＣａｓ１４）、ＶＩ型（例えば、Ｃａｓ１３）、および／またはＩＩＩ型（例えば、Ｃｓｍ６）タンパク質を含むがこれらに限定されない、任意のＣａｓタンパク質でありうる。
ある特定の実施形態では、組成物、システム、および方法は、各々が、２つのコンセンサスＨＥＰＮ（Ｈｉｇｈｅｒ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ結合性ドメイン）のＲＮアーゼモチーフである、Ｒ－Ｘ４－６－Ｈを別として、著明な配列分岐を呈する、これまでに特徴づけられている、４つの亜型（Ｃａｓ１３ａ～Ｃａｓ１３ｄ）を伴う、１つまたは複数のＣａｓ１３タンパク質を含む。ウイルス感染に対して防御するために、Ｃａｓ１３酵素は、プレｃｒＲＮＡを、成熟ｃｒＲＮＡガイドへと、ＨＥＰＮ非依存的にプロセシングした後で、シスにおいて、相補性「活性化因子」標的ＲＮＡの、ＨＥＰＮ依存性切断を行う。標的依存性活性化がなされると、Ｃａｓ１３はまた、トランスにおいて、バイスタンダーＲＮＡを切断することも可能であり、シス切断およびトランス切断の両方が可能である、一般的なＲＮアーゼ活性を反映する（例えば、米国公開第２０２０００３２３２４号明細書、および国際公開第２０１７２１８５７３号パンフレット、Konnermann et al (2018) Cell Apr 19;173(3):665-676；Zhang et al (2018) Cell 175 (1), 212-223を参照されたい）。ＶＩ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、Ｃａｓ１３ａ（旧称：Ｃ２ｃ２）の署名タンパク質は、ｃｒＲＮＡの成熟、およびＲＮＡ活性化ｓｓＲＮＡ切断の両方の一因となる、二重ヌクレアーゼである（East-Seletsky et al., (2016) Nature 538(7624):270-273）。Ｃａｓ１３ａは、前駆体ｃｒＲＮＡ（プレｃｒＲＮＡ）転写物に結合し、それらを、リピート領域内で切断して、成熟ｃｒＲＮＡをもたらす。プレｃｒＲＮＡが、個々の成熟ｃｒＲＮＡへとプロセシングされても、ＣＲＩＳＰＲアレイ内のスペーサー領域の各々を隔てる、８ヌクレオチド片のリピート領域は、成熟ｃｒＲＮＡへの接合を維持し、「タグ」と称される。ｃｒＲＮＡと相補性である、ｓｓＲＮＡ活性化因子（標的）配列への結合は、Ｃａｓ１３ａを、トランスｓｓＲＮＡ切断のために活性化し、宿主生物の細胞死または休眠を、潜在的に誘発する。しかし、標的ＲＮＡまたは活性化ＲＮＡが、タグ配列と相補性である配列（「抗タグ」配列として公知である）を含む場合、複合体は、活性化を阻害される。これは、自己免疫の阻止に関与する機構であると考えられている（Meeske & Marriffini (2018) Mol Cell 71:791）。異なるＣａｓ１３ａ相同体に対する優先性に対応する、ケージ配列の使用により微調整されうる活性である、Ｃａｓ１３ａのトランスｓｓＲＮＡ活性は、ＲＮＡ上のケージ構造の放出における使用のために利用されうる。
一部の実施形態では、Ｃａｓ１３タンパク質は、任意のＣａｓ１３ａアミノ酸配列、例えば、表１および／または実施例３に示されるＣａｓ１３ａ配列に対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｃａｓ１３ａポリペプチドである。
Figure 2023527768000002
さらなるＣａｓ１３タンパク質は、ＢｚｏＣａｓ１３ｂ（ベルゲイエラ・ゾオヘルクム（Bergeyella zoohelcum）；ＷＰ＿００２６６４４９２）；ＰｉｎＣａｓ１３ｂ（プレボテラ・インテルメディア（Prevotella intermedia）；ＷＰ＿０３６８６０８９９）；ＰｂｕＣａｓ１３ｂ（プレボテラ・ブッケ（Prevotella buccae）；ＷＰ＿００４３４３９７３）；ＡｓｐＣａｓ１３ｂ（アリスティペス属（Alistipes）種ＺＯＲ０００９株；ＷＰ＿０４７４４７９０１）；ＰｓｍＣａｓ１３ｂ（プレボテラ属（Prevotella）種ＭＡ２０１６株；ＷＰ＿０３６９２９１７５）；ＲａｎＣａｓ１３ｂ（リエメレラ・アナティペスティフェル（Riemerella anatipestifer）；ＷＰ＿００４９１９７５５）；ＰａｕＣａｓ１３ｂ（プレボテラ・アウランティアーカ（Prevotella aurantiaca）；ＷＰ＿０２５０００９２６）；ＰｓａＣａｓ１３ｂ（プレボテラ・サッカロリティカ（Prevotella saccharolytica）：ＷＰ＿０５１５２２４８４）；Ｐｉｎ２Ｃａｓ１３ｂ（プレボテラ・インテルメディア（Prevotella intermedia）；ＷＰ＿０６１８６８５５３）；ＣｃａＣａｓ１３ｂ（カプノシトファーガ・カニモルスス（Capnocytophaga canimorsus）；ＷＰ＿０１３９９７２７１）；ＰｇｕＣａｓ１３ｂ（ポルフィロモナス・グレ（Porphyromonas gulae）；ＷＰ＿０３９４３４８０３）；ＰｓｐＣａｓ１３ｂ（プレボテラ属（Prevotella）種Ｐ５－１２５株：ＷＰ＿０４４０６５２９４０）；ＰｇｉＣａｓ１３ｂ（ポルフィロモナス・ギンギバリス（Porphyromonas gingivalis）；ＷＰ＿０５３４４４４１７）；ＦｂｒＣａｓ１３ｂ（フラボバクテリウム・ブランキオフィルム（Flavobacterium branchiophilum）；ＷＰ＿０１４０８４６６６）；およびＰｉｎ３Ｃａｓ１３ｂ（プレボテラ・インテルメディア（Prevotella intermedia）；ＷＰ＿０５０９５５３６９）；ＦｎｓＣａｓ１３ｃ（フソバクテリウム・ネクロフォルム・フンドゥリフォルメ亜種（Fusobacterium necrophorum subsp.funduliforme）ＡＴＣＣ ５１３５７株コンティグ００００３；ＷＰ＿００５９５９２３１．１）；ＦｎｄＣａｓ１３ｃ（フソバクテリウム・ネクロフォルム（Fusobacterium necrophorum）ＤＪ－２株コンティグ００６５、全ゲノムショットガン配列；ＷＰ＿０３５９０６５６３．１）；ＦｎｆＣａｓ１３ｃ（フソバクテリウム・ネクロフォルム・フンドゥリフォルメ亜種（Fusobacterium necrophorum subsp.funduliforme）１＿１＿３６Ｓ ｃｏｎｔ１．１４；ＥＨＯ１９０８１．１）；ＦｐｅＣａｓ１３ｃ（フソバクテリウム・ペルフェテンス（Fusobacterium perfoetens）ＡＴＣＣ ２９２５０ Ｔ３６４ＤＲＡＦＴ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ００００９．９＿Ｃ；ＷＰ＿０２７１２８６１６．１）；ＦｕｌＣａｓ１３ｃ（フソバクテリウム・ウルセランス（Fusobacterium ulcerans）ＡＴＣＣ ４９１８５ ｃｏｎｔ２．３８；ＷＰ＿０４０４９０８７６．１）；ＡｓｐＣａｓ１３ｃ（アネロサリバクター属（Anaerosalibacter）種ＮＤ１株のゲノムアセンブリーによる、アネロサリバクター・マシリエンシス（Anaerosalibacter massiliensis）ＮＤ１株；ＷＰ＿０４２６７８９３１．１）；ルミノコッカス属（Ruminococcus）種によるＣａｓ１３ｄ（ＧＩ：１６９０５３２９７８）；ＥｓＣａｓ１３ｄ（［エウバクテリウム・］シレウム（［Eubacterium］siraeum）ＤＳＭ １５７０２株；ＧＩ：１４８６９４２１３２またはＧＩ：１４８６９４２１３１）、および米国特許公開第２０１９００６２７２４号明細書で開示されている、Ｃａｓ１３ｄ相同体を含む。
ある特定の実施形態では、組成物、システム、および方法は、１つまたは複数のＶ型Ｃａｓタンパク質を含む。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の非限定例は、Ｃａｓ１２タンパク質およびＣａｓ１４タンパク質を含む。例えば、米国公開第２０１９０２４１９５４号明細書を参照されたい。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、任意のＣａｓ１２アミノ酸配列、例えば、図６Ａ～６Ｃに示されるＣａｓ１２配列に対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｃａｓ１２ポリペプチドである。例えば、ＰＣＴ／米国特許出願第２０２０／０２１２１３号明細書、国際公開第２０２００２３５２９号パンフレット、国際公開第２０１９１０４０５８号パンフレット、および国際公開第２０１９０８９７９６号パンフレットを参照されたい。
一部の実施形態では、Ｃａｓ１４タンパク質は、任意のＣａｓ１４アミノ酸配列、例えば、図６に示されるＣａｓ１４配列に対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｃａｓ１４ポリペプチドである。例えば、Harrington et al（Harrington LB, (2018) Science 362(6416):839-842）、およびＰＣＴ／米国特許出願第２０２０／０２１２１４号明細書（Ｃａｓ１４）を参照されたい。例えば、ＰＣＴ／米国特許出願第２０２０／０２１２１４号明細書を参照されたい。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるシステム、組成物および方法は、Ｃｓｍ６タンパク質を含む。Ｃｓｍ６は、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系と関連する、一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）エンドヌクレアーゼのファミリーである。Ｃｓｍ６のＲＮＡ切断活性は、環状オリゴアデニル酸（ｃＡｎ）、または末端２’－３’環状リン酸（Ａｎ＞Ｐ）を有する短鎖直鎖状オリゴアデニル酸の結合により、アロステリックに活性化されうる。Ｃｓｍ６は、ＳＨＥＲＬＯＣＫシステムにおいて、ウイルスＲＮＡの検出を増幅するのに使用されている。一部の実施形態では、ＥｉＣａｓｍ６（エンテロコッカス・イタリクス（Enterococcus italicus）；ＷＰ＿００７２０８９５３．１）、ＬｓＣｓｍ６（ラクトバシルス・サリワリウス（Lactobacillus salivarius）；ＷＰ＿０８１５０９１５０．１）、および／またはＴｔＣｓｍ６（テルムス・テルモフィルス（Thermus thermophilus）；ＷＰ＿０１１２２９１４８．１）が使用される。一実施形態では、ＴｔＣｓｍ６は、長さを４アデノシンとするオリゴアデニル酸（ｃＡ４またはＡ４＞Ｐ）により、特異的に活性化され、ＡおよびＣを伴うＲＮＡ配列に対する、切断優先性を呈する。一実施形態では、ＥｉＣｓｍ６および／またはＬｓＣｓｍ６は、Ａ６の長さを含むガイドと共に、保護（ケージ化）増幅ＲＮＡの切断の後に、シグナルを増幅するのに使用される。したがって、Ｃｓｍ６変異体は、例えば、このような好ましい配列を含む、適切な基質（例えば、トリガー基質）の組入れによる、標的の存在下における、検出用シグナルの増幅のために使用されうる。例えば、一部の実施形態では、その一次ＲＮＡ活性化因子との相互作用の後で、Ｃａｓ１３が活性化すると、Ｃａｓ１３による、Ａ６Ｕ６ＲＮＡのトランス切断が、レポーター分子を切断するよう、ＥｉＣｓｍ６を誘導する、ＥｉＣｓｍ６のための活性化因子を創出し、これにより、Ｃａｓ１３の、その一次活性化因子との、元の相互作用により誘発されたシグナルを増幅するように、ＲＮＡを含むＡ６Ｕ５が、Ｃａｓ１３およびＥｉＣｓｍ６を含む反応混合物へと添加される。別の実施形態では、ＥｉＣｓｍ６ではなく、ＴｔＣｓｍ６を含む反応において、Ａ５ＵｘＲＮＡが使用される（Gootenberg et al, (2018) Science 360(6387): 439）。
ある実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ガイド配列もしくは標的配列とのその相互作用を変更し、かつ／またはそのヌクレアーゼ活性、例えば、特異性、代謝回転、ヌクレオチド優先性などを変更するように、修飾もしくは操作されるか、または突然変異させられた、修飾タンパク質である。他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、単離、同定、分離、ヌクレアーゼ活性、標的配列への結合などの一助となるように、別のタンパク質、ペプチド、またはマーカーと融合させうる。
場合によって、ＲＮＡ（ウイルスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、低分子ＲＮＡなど）が、野生型Ｃａｓ１３タンパク質および／または修飾Ｃａｓ１３タンパク質を含むシステムを使用して直接（逆転写酵素を必要とせずに）検出されるのに対して、ＤＮＡ（ウイルスＤＮＡなど）は、野生型Ｃａｓ１２タンパク質もしくは野生型Ｃａｓ１４タンパク質、および／または操作Ｃａｓ１２タンパク質もしくは操作Ｃａｓ１４タンパク質を含むシステムを使用して直接検出される。他の場合に、ＲＮＡは、Ｃａｓ１２エフェクタータンパク質またはＣａｓ１４エフェクタータンパク質を使用して検出されるＤＮＡへと逆転写されうる。
本明細書記載されるシステムでは、同じであるか、または異なるＣａｓエフェクタータンパク質のうちの１つまたは複数が使用されうる。場合によって、標的センサーおよびシグナル増幅因子は、いずれも、例えば、標的ＤＮＡ配列を検出するために、１つまたは複数のＣａｓ１２タンパク質および／またはＣａｓ１４タンパク質を含む。１つまたは複数のＣａｓ１２タンパク質および／またはＣａｓ１４タンパク質は、それら自体、同じタンパク質の場合もあり、異なるタンパク質の場合もある（修飾タンパク質または操作タンパク質でありうる）。他の場合に、標的センサーおよびシグナル増幅因子は、いずれも、例えば、標的ＲＮＡ配列を検出するために、１つまたは複数のＣａｓ１３タンパク質を含む。Ｃａｓ１３タンパク質は、それら自体、同じＣａｓ１３タンパク質の場合もあり、異なるＣａｓ１３タンパク質の場合もある（修飾Ｃａｓ１３タンパク質または操作Ｃａｓ１３タンパク質でありうる）。他の実施形態では、標的センサーおよびシグナル増幅因子は、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質、Ｃａｓ１４タンパク質、およびＣｓｍ６タンパク質を含む、異なる種類のＣａｓエフェクタータンパク質を含むことが可能であり、例えば、この場合、標的センサーは、標的ＲＮＡ配列を検出するために、１つまたは複数のＣａｓ１３タンパク質を含み、シグナル増幅因子は、１つまたは複数のＣａｓ１２タンパク質および／またはＣａｓ１４タンパク質を含む。場合によって、シグナル増幅因子はまた、Ｃｓｍ６タンパク質（酵素）も含む。一部の実施形態では、標的センサーは、標的核酸配列を検出するために、１つまたは複数のＣａｓ１２タンパク質および／またはＣａｓ１４タンパク質を含み、シグナル増幅因子は、１つもしくは複数のＣａｓ１３タンパク質を含む。場合によって、シグナル増幅因子はまた、Ｃｓｍ６タンパク質（酵素）も含む。
ガイドＲＮＡ配列
本明細書で記載されるＮＣＲシステムおよびＮＣＲ組成物はまた、ガイドＲＮＡが、コグネイト（標的、活性化因子など）配列に結合したときに、ヌクレアーゼへと活性化するように、１つもしくは複数のＣａｓタンパク質をプログラム化するのに使用される分子、典型的に、ガイドＲＮＡも含む。
本明細書では、Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１３タンパク質またはＣａｓ１２タンパク質）と会合し（これに結合し）、リボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成し、この複合体を、ポリヌクレオチド内の特異的標的配列へとターゲティングする核酸分子は、「ガイドＲＮＡ」と称される。場合によって、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡは、ガイドＲＮＡが、ＲＮＡ塩基に加えて、ＤＮＡ塩基も含むように作製されうる（しかし、本明細書では、このようなハイブリッド分子を包含するのにもやはり、「ガイドＲＮＡ」という用語が使用される）ことが理解されるものとする。対象のガイドＲＮＡは、（標的ＲＮＡまたは標的ＤＮＡの標的配列とハイブリダイズする）ガイド配列（また、「スペーサー」とも称される）と、定常領域（例えば、ガイド配列と隣接し、Ｃａｓエフェクタータンパク質に結合する領域）とを含みうる。本明細書では、「定常領域」はまた、「タンパク質結合性セグメント」とも称されうる。場合によって、定常領域は、ガイド配列の５’側にある。
ガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡ配列と相補性である、少なくとも１つの配列を含む。一部の実施形態では、この標的相補性配列は、スペーサー配列と称される場合があり、さらなる配列は、足場配列と称される場合がある。一部の実施形態では、スペーサー配列は、ヒト（例えば、ゲノムＤＮＡまたは逆転写ＲＮＡ）に由来する場合もあり、非ヒト供給源（例えば、病原体）に由来する場合もある。一部の実施形態では、選択される病原体は、細菌、ウイルス、真菌、および寄生虫に由来しうる。一部の実施形態では、病原体は、ウイルス（例えば、オルトコロナウイルス亜科（Orthocoronavirinae）、ディペンドウイルス属（Dependovirus）、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、ポックスウイルス科（Poxviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、トガウイルス科（Togaviridae）、フィロウイルス科（Filoviridae）、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、ブニヤウイルス科（Bunyaviridae）、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）、アデノウイルス科（Adenoviridae）、レトロウイルス科（Retroviridae）、パピローマウイルス科（Papillomaviridae）、ニューモウイルス科（Pneumoviridae）、オルトミクスウイルス科（Orthomyxoviridae）、アレナウイルス科（Arenaviridae）、およびパラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）、カリシウイルス科（Caliciviridae））または細菌（例えば、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、連鎖球菌属（Streptococcus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、赤痢菌属（Shigella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、サルモネラ属（Salmonella）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、およびトレポネーマ属（Treponema））でありうる。一部の実施形態では、ウイルスは、オルトコロナウイルス亜科（Orthocoronavirinae）、アデノウイルス科（Adenoviridae）、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）、レトロウイルス科（Retroviridae）、オルトミクスウイルス科（Orthomyxoviridae）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）、パポバウイルス科（Papovaviridae）、ポリオーマウイルス科（Polyomavirus）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、およびトガウイルス科（Togaviridae）を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスから選択されうる。一部の実施形態では、病原性真菌は、カンジダ属（Candida）、アスペルギルス属（Aspergillus）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、ニューモシスティス属（Pneumosystis）、およびスタキボトリス属（Stachybotrys）を含む。
他の実施形態では、スペーサーのＲＮＡ配列は、非病原体と相補性である。例えば、スペーサーのＲＮＡ配列は、任意の目的の核酸配列とハイブリダイズするように操作されうる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、目的の哺乳動物配列、例えば、ゲノム配列、または転写配列（ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡなど）と相補性であるように操作されうる。多様な実施形態では、ガイドＲＮＡは、哺乳動物の生物学的状態、敗血症、がん、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染などの状態、疾患、または障害と関連する配列と相補性の配列を含みうる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｍＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡ署名内のマイクロＲＮＡ配列と相補性でありうる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、前駆体ＲＮＡ内のガイドＲＮＡ配列の場合があり、前駆体ＲＮＡは、複数のガイドＲＮＡ配列を伴うアレイの一部でありうる。一部の実施形態では、前駆体ＲＮＡ配列は、ガイドＲＮＡ配列をもたらすように、Ｃａｓタンパク質によりプロセシングされうる。
ガイドＲＮＡ配列は、標的配列と相補性である、スペーサー配列と、スペーサー配列の５’側にある、より定常的な配列とを含む。この定常配列は、足場配列、リピート、ハンドル、または定常領域と称される場合があり、ガイドＲＮＡの、Ｃａｓタンパク質への結合の一助となる。一部の実施形態では、定常配列は、進化的に類縁である定常配列で置きかえられうる。当技術分野で公知である通り、Ｃａｓタンパク質は、ｃｒＲＮＡの直交セットを認識し、異なるｓｓＲＮＡ切断特異性を有する機能群を含む、異なるファミリーへと群分けされうる。一部の実施形態では、定常配列は、天然に存在するヌクレオ塩基、および合成もしくは非天然のヌクレオ塩基、または骨格修飾を含むことにより、アフィニティーおよび安定性を改善するように修飾されうる。一部の実施形態では、定常配列は、前駆体配列を含みうる。ある実施形態では、プレｃｒＲＮＡ配列は、ガイド配列を含む、ｃｒＲＮＡ配列を形成するようにプロセシングされうる。
標的ＲＮＡ配列または標的ＤＮＡ配列の標的配列との相補性を有する（これらとハイブリダイズする）ガイド配列は、任意の適切な長さでありうる。場合によって、ガイド配列は、１５～２８ヌクレオチド（ｎｔ）の長さ（例えば、１５～２６、１５～２４、１５～２２、１５～２０、１５～１８、１６～２８、１６～２６、１６～２４、１６～２２、１６～２０、１６～１８、１７～２６、１７～２４、１７～２２、１７～２０、１７～１８、１８～２６、１８～２４、または１８～２２ｎｔの長さ）である。場合によって、ガイド配列は、１８～２４ヌクレオチド（ｎｔ）の長さである。場合によって、ガイド配列は、少なくとも１５ｎｔ長（例えば、少なくとも１６、１８、２０、または２２ｎｔ長）である。場合によって、ガイド配列は、少なくとも１７ｎｔ長である。場合によって、ガイド配列は、少なくとも１８ｎｔ長である。場合によって、ガイド配列は、少なくとも２０ｎｔ長である。
場合によって、ガイド配列は、標的配列との、８０％もしくはこれを超える（例えば、８５％もしくはこれを超えるか、９０％もしくはこれを超えるか、９５％もしくはこれを超えるか、または１００％の）相補性を有する。場合によって、ガイド配列は、標的配列に対して、１００％相補性である。場合によって、標的配列は、ガイドＲＮＡのガイド配列との、少なくとも１５ヌクレオチド（ｎｔ）の相補性を含む。
ガイドＲＮＡは、ＲＮＡとして提供される場合もあり、ガイドＲＮＡをコードする核酸（例えば、組換え発現ベクターなどのＤＮＡ）として提供される場合もある。Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、ＬｓｈＣａｓ１３ａ、ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＬｓｅＣａｓ１３ａ、ＬｂｍＣａｓ１３ａ、ＬｂｎＣａｓ１３ａ、ＣａｍＣａｓ１３ａ、ＣｇａＣａｓ１３ａ、Ｃｇａ２Ｃａｓ１３ａ、ＰｐｒＣａｓ１３ａ、ＬｗｅＣａｓ１３ａ、ＬｎｅＣａｓ１３ａ、Ｌｗａ２Ｃａｓ１３ａ、ＲｃｓＣａｓ１３ａ、ＲｃｒＣａｓ１３ａ、ＲｃｄＣａｓ１３ａ、ＬｂｕＣａｓ１３ａ、ＲｃａＣａｓ１３ａ、ＥｒｅＣａｓ１３ａ、ＢｚｏＣａｓ１３ｂ、ＰｉｎＣａｓ１３ｂ、ＰｂｕＣａｓ１３ｂ、ＡｓｐＣａｓ１３ｂ、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、ＲａｎＣａｓ１３ｂ、ＰａｕＣａｓ１３ｂ、ＰｓａＣａｓ１３ｂ、Ｐｉｎ２Ｃａｓ１３ｂ、ＣｃａＣａｓ１３ｂ、ＰｇｕＣａｓ１３ｂ、ＰｉｇＣａｓ１３ｂ、Ｐｉｎ３Ｃａｓ１３ｂ、およびＨｈｅＣａｓ１３ａ、ＥｓＣａｓ１３ｄ（［エウバクテリウム・］シレウム（［Eubacterium］siraeum）ＤＳＭ １５７０２株）、ＵｒＣａｓ１３ｄ、ルミノコッカス属（Ruminococcus）種から単離されたＣａｓ１３ｄ、消化管メタゲノムから単離されたＣａｓ１３ｄ、ｎｅｗ＿ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ，＿ｓｔｒａｉｎ＿ＸＰＤ３００２に由来するＣａｓ１３ｄ（例えば、米国特許出願第２０１９００６２７２４号明細書を参照されたい）などのＣａｓ１３タンパク質、ならびに／またはＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質、ならびに／またはＣａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、Ｃａｓ１４ｃ、Ｃａｓ１４ｉ、Ｃａｓ１４ｊ、Ｃａｓ１４ｋ、Ｃａｓ１４ｕなどのＣａｓ１４タンパク質）は、タンパク質として提供される場合もあり、またはタンパク質をコードする核酸（例えば、組換え発現ベクターなどのｍＲＮＡ、ＤＮＡ）として提供される場合もある（Harrington et al (2018) Science 362(6416):839-842）。場合によって、２つもしくはこれを超える（例えば、３つもしくはこれを超えるか、４つもしくはこれを超えるか、５つもしくはこれを超えるか、または６つもしくはこれを超える）ガイドＲＮＡは、例えば、Ｃａｓエフェクタータンパク質により、個々の（「成熟」）ガイドＲＮＡへと切断されうる前駆体ガイドＲＮＡアレイを使用することにより提供されうる。
ガイドＲＮＡを含むＣａｓタンパク質は、「プログラム化」Ｃａｓタンパク質と称されうる。ガイドＲＮＡ配列は、Ｃａｓタンパク質へと導入されえ、ガイドＲＮＡ配列にＣａｓタンパク質が結合しうる。例えば、ガイドＲＮＡは、細胞内または細胞外において、Ｃａｓタンパク質に接触しうる。ガイドＲＮＡを、Ｃａｓタンパク質と接触させて、プログラム化Ｃａｓタンパク質を作製するのに、多様な方法が使用されうる。一部の実施形態では、接触は、約２時間未満、例えば、約９０分間、６０分間、４０分間、３０分間、２０分間、１０分間、５分間、４分間、３分間、２分間、または１分間未満を要求する。
定常領域
本発明のガイドＲＮＡでは、任意の定常領域が使用されうる。定常領域の非限定例については、米国公開第２０１９０２４１９５４号明細書において開示されている。
場合によって、ガイドＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を含む。場合によって、ガイドＲＮＡは、長さを、２～１２ｂｐ（例えば、２～１０ｂｐ、２～８ｂｐ、２～６ｂｐ、２～５ｂｐ、２～４ｂｐ、３～１２ｂｐ、３～１０ｂｐ、３～８ｂｐ、３～６ｂｐ、３～５ｂｐ、３～４ｂｐ、４～１２ｂｐ、４～１０ｂｐ、４～８ｂｐ、４～６ｂｐ、または４～５ｂｐ）とする、ｄｓＲＮＡ二重鎖を含む。場合によって、ガイドＲＮＡは、２もしくはこれを超えるｂｐの長さ（例えば、３もしくはこれを超えるか、４もしくはこれを超えるか、５もしくはこれを超えるか、６もしくはこれを超えるか、または７もしくはこれを超えるｂｐの長さ）である、ｄｓＲＮＡ二重鎖を含む。場合によって、ガイドＲＮＡは、対応する野生型ガイドＲＮＡのｄｓＲＮＡ二重鎖より長い、ｄｓＲＮＡ二重鎖を含む。場合によって、ガイドＲＮＡは、対応する野生型ガイドＲＮＡのｄｓＲＮＡ二重鎖より短い、ｄｓＲＮＡ二重鎖を含む。
場合によって、ガイドＲＮＡの定常領域は、１５ヌクレオチド（ｎｔ）もしくはこれを超える長さ（例えば、１８ｎｔもしくはこれを超えるか、２０ｎｔもしくはこれを超えるか、２１ｎｔもしくはこれを超えるか、２２ｎｔもしくはこれを超えるか、２３ｎｔもしくはこれを超えるか、２４ｎｔもしくはこれを超えるか、２５ｎｔもしくはこれを超えるか、２６ｎｔもしくはこれを超えるか、２７ｎｔもしくはこれを超えるか、２８ｎｔもしくはこれを超えるか、２９ｎｔもしくはこれを超えるか、３０ｎｔもしくはこれを超えるか、３１ｎｔもしくはこれを超えるか、３２ｎｔもしくはこれを超えるか、３３ｎｔもしくはこれを超えるか、３４ｎｔもしくはこれを超えるか、または３５ｎｔもしくはこれを超える長さ）である。場合によって、ガイドＲＮＡの定常領域は、１８ｎｔもしくはこれを超える長さである。
場合によって、ガイドＲＮＡの定常領域は、１２～１００ｎｔ（例えば、１２～９０、１２～８０、１２～７０、１２～６０、１２～５０、１２～４０、１５～１００、１５～９０、１５～８０、１５～７０、１５～６０、１５～５０、１５～４０、２０～１００、２０～９０、２０～８０、２０～７０、２０～６０、２０～５０、２０～４０、２５～１００、２５～９０、２５～８０、２５～７０、２５～６０、２５～５０、２５～４０、２８～１００、２８～９０、２８～８０、２８～７０、２８～６０、２８～５０、２８～４０、２９～１００、２９～９０、２９～８０、２９～７０、２９～６０、２９～５０、または２９～４０ｎｔ）の範囲の長さを有する。場合によって、ガイドＲＮＡの定常領域は、２８～１００ｎｔの範囲の長さを有する。場合によって、ガイド配列の５’側である、ガイドＲＮＡの領域は、２８～４０ｎｔの範囲の長さを有する。
場合によって、ガイドＲＮＡの定常領域は、対応する野生型ガイドＲＮＡの、対応する領域と比べて、切断されている（これより短い）。場合によって、ガイドＲＮＡの定常領域は、対応する野生型ガイドＲＮＡの、対応する領域と比べて、伸長させられている（これより長い）。場合によって、対象のガイドＲＮＡは、３０ヌクレオチド（ｎｔ）もしくはこれを超える長さ（例えば、３４ｎｔもしくはこれを超えるか、４０ｎｔもしくはこれを超えるか、４５ｎｔもしくはこれを超えるか、５０ｎｔもしくはこれを超えるか、５５ｎｔもしくはこれを超えるか、６０ｎｔもしくはこれを超えるか、６５ｎｔもしくはこれを超えるか、７０ｎｔもしくはこれを超えるか、または８０ｎｔもしくはこれを超える長さ）である。場合によって、ガイドＲＮＡは、３５ｎｔもしくはこれを超える長さである。
前駆体ガイドＲＮＡアレイ
Ｃａｓエフェクタータンパク質は、例えば、前駆体のエンドリボ核酸分解性切断により、例えば、前駆体ガイドＲＮＡアレイ（タンデムで配置された、１つを超えるガイドＲＮＡを含む）を、２つまたはこれを超える、個々のガイドＲＮＡへと切断することにより、前駆体ガイドＲＮＡを、成熟ガイドＲＮＡへと切断しうる。したがって、場合によって、前駆体ガイドＲＮＡアレイは、２つまたはこれを超える（例えば、３つまたはこれを超えるか、４つまたはこれを超えるか、５つまたはこれを超えるか、２つ、３つ、４つ、または５つの）ガイドＲＮＡ（例えば、前駆体分子としてタンデムで配置された）を含む。言い換えれば、場合によって、２つまたはこれを超えるガイドＲＮＡは、アレイ（前駆体ガイドＲＮＡアレイ）上に存在しうる。本明細書で記載されるＣａｓエフェクタータンパク質は、前駆体ガイドＲＮＡアレイを、個々のガイドＲＮＡへと切断しうる。
場合によって、対象のガイドＲＮＡアレイは、２つまたはこれを超えるガイドＲＮＡ（例えば、３つもしくはこれを超えるか、４つもしくはこれを超えるか、５つもしくはこれを超えるか、６つもしくはこれを超えるか、または７つもしくはこれを超えるガイドＲＮＡ）を含む。所与のアレイのガイドＲＮＡは、同じ標的ＲＮＡ／ＤＮＡの、異なる標的部位（例えば、検出感度を増大させうる）をターゲティングする（すなわち、これとハイブリダイズするガイド配列を含みうる）場合もあり、かつ／または異なる標的ＲＮＡ／ＤＮＡ分子（例えば、特定のウイルスの、一塩基多型（ＳＮＰ）、異なる株など）をターゲティングする場合もあり、このようなガイドＲＮＡは、例えば、複数のウイルス株を検出するのに使用されうるであろう。場合によって、前駆体ガイドＲＮＡアレイの、各ガイドＲＮＡは、異なるガイド配列を有する。場合によって、前駆体ガイドＲＮＡアレイの、２つまたはこれを超えるガイドＲＮＡは、同じガイド配列を有する。
場合によって、前駆体ガイドＲＮＡアレイは、同じ標的配列内の、異なる標的部位をターゲティングする、２つまたはこれを超えるガイドＲＮＡを含む。場合によって、前駆体ガイドＲＮＡアレイは、異なる標的配列をターゲティングする、２つまたはこれを超えるガイドＲＮＡを含む。例えば、このような状況は、潜在的な標的ＲＮＡ／ＤＮＡのファミリーのうちの、いずれか１つが存在する場合に、陽性シグナルを結果としてもたらしうる。このようなアレイは、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）などの変異に基づき、転写物のファミリーをターゲティングするために（例えば、診断を目的として）使用されうるであろう。このようなアレイはまた、多数の異なるウイルス株のうちのいずれか１つが存在するのかどうかを検出するために有用でもありうるであろう。このようなアレイはまた、ウイルスまたは細菌の、多数の異なる種、株、分離株、または変異体のうちのいずれか１つが存在するのかどうかを検出するために有用でもありうるであろう。このように、場合によって、組成物（例えば、キット）または方法は、対象として、２つまたはこれを超えるガイドＲＮＡを含む（前駆体ガイドＲＮＡアレイの文脈で、または前駆体ガイドＲＮＡアレイの文脈ではなく、例えば、ガイドＲＮＡが、成熟ガイドＲＮＡでありうる文脈で）。
プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）
標的配列が、ｄｓＤＮＡである場合、標的内のＰＡＭ配列の同定が要求される場合がある。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ＤＮＡターゲティングＲＮＡと、標的ＤＮＡとの相補性に関わる領域により規定される、標的配列において、標的ＤＮＡに結合する。多くのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼについての場合と同様に、二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的結合（および／または切断）は、（ｉ）ガイドＲＮＡと、標的ＤＮＡとの、塩基対合相補性；および（ｉｉ）標的ＤＮＡ内の短いモチーフ［プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される］の両方により決定される位置において生じる。
場合によって、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質のためのＰＡＭは、標的配列のすぐ５’側にある（例えば、標的ＤＮＡの非相補鎖（相補鎖が、ガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズするのに対し、非相補鎖は、ガイドＲＮＡと、直接ハイブリダイズせず、非相補鎖の逆相補体である））。場合によって、（例えば、本明細書で記載されるＣａｓ１２ａまたはＣａｓ１２ｂが使用される場合）、ＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＮ－３’である。場合によって、ＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＴＮ－３’である。
場合によって、異なるＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（すなわち、多様な種に由来するＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質）は、所望の特色（例えば、異なるＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質の、特異的酵素特徴）を、十分に活用するために、提示される多様な方法において使用するのに有利でありうる。異なる種に由来するＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、標的ＤＮＡ内の、異なるＰＡＭ配列を要求しうる。したがって、選り抜きである、特定のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質のために、ＰＡＭ配列の要求は、上記で記載された、５’－ＴＴＮ－３’配列または５’－ＴＴＴＮ－３’配列と異なりうる。当技術分野では、適切なＰＡＭ配列を同定するための、多様な方法（コンピュータ法および／またはウェットラボ法を含む）が、公知かつ規定であり、任意の好都合な方法が使用されうる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３系のメンバーは、ｃｒＲＮＡが、ｔｒａｃｒＲＮＡの関与を伴わずに、Ｃａｓ１３タンパク質との複合体を形成する、二構成要素システムとして働く。プロトスペーサーのフランキング領域は、Ｃａｓ１３ａ媒介型ターゲティングの有効性に影響を及ぼす、３’側のプロトスペーサーフランキング部位（ＰＦＳ）を含む（Abudayyeh et al (2016) Science. 353(6299)）。ＰＦＳは、プロトスペーサーの標的と隣接するが、一般に使用される、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の用語法は、ＲＮＡターゲティング系では妥当ではない、自己対非自己の差別化において使用される配列を含意するようになってきたので、使用されない。したがって、場合によって、標的内の、ＰＦＳ配列の同定が要求される場合がある。
レポーター
本明細書で記載されるシステムでは、任意のレポーター分子（また、検出配列とも称される）が使用されうる。
レポーター分子（複合体）は、検出用標識（また、シグナル部分とも称される）を含む。検出用標識の非限定例は、蛍光標識、酵素的標識、および／または生物発光標識を含む。レポーターは、典型的に、検出用標識と近接する（これと連結される）場合に、例えば、シグナルを発することにより、標識が検出されることを阻止する分子（また、「消光剤」または「消光分子」または「消光部分」とも称される）をさらに含む。
場合によって、検出用シグナルは、レポーター分子（例えば、また、Ｆ／Ｑレポーターとも称される、消光剤／フルオロフォア対）が切断された場合にもたらされる。シグナル消光対のうちの、一方のシグナルパートナーは、検出用シグナルをもたらし、他方のシグナルパートナーは、第１のシグナルパートナーの検出用シグナルを消光させる、消光部分である（すなわち、シグナルパートナーが、互いと近接する、例えば、シグナル対のシグナルパートナーが近接する場合に、消光部分は、シグナル部分からのシグナルが低減される（消光させられる）ように、シグナル部分のシグナルを消光させる）。
例えば、場合によって、標識化レポーターが、切断されると、検出用シグナルの量は、増大する。例えば、場合によって、例えば、両方が、非特異的活性化Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、活性化センサーおよびシグナル増幅因子）による切断の前に、同じ分子上に存在する場合に、シグナル消光対のうちの、一方のシグナルパートナー（シグナル部分）により呈されるシグナルは、他方のシグナルパートナー（消光剤シグナル部分）により消光させられる。本明細書では、このようなシグナル対は、「消光剤／フルオロフォア対」、「消光対」、または「シグナル消光対」と称される。例えば、場合によって、一方のシグナルパートナー（例えば、第１のシグナルパートナー）は、第２のシグナルパートナー（例えば、消光部分）により消光させられる、検出用シグナルをもたらすシグナル部分である。したがって、このような消光剤／フルオロフォア対のシグナルパートナーは、パートナーが隔てられた（例えば、活性化センサーまたはシグナル増幅因子による、レポーター分子の切断の後に）場合には、検出用シグナルをもたらすが、パートナーが近接する（例えば、レポーターの切断の前に）場合には、シグナルが消光させられる。
レポーターは、典型的に、本明細書で記載される、増幅因子の活性化基質を含む。場合によって、増幅活性化配列は、Ｆ／Ｑ対の間に配置され、ＡまたはＣを含みうるが、また、Ｃａｓ１３（Ｕ）、Ｃａｓ１２（デオキシリボヌクレオチド）、Ｃｓｍ６などの活性に必要な、さらなるヌクレオチド、すなわち、Ｃａｓエフェクタータンパク質が結合する、シグナル増幅因子の配列も有しうる。例えば、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）Ｃｓｍ６（ＳｅＣｓｍ６）など、Ａ６＞Ｐに応答するＣｓｍ６相同体を含むレポーターは、ケージ化ｃｒＲＮＡ内のヘアピンループの、Ａの数を、４から６へと変化させることにより作出されうる。
検出用標識は、バックグラウンド活性を低減し、かつ／または感度を改善する、１つまたは複数の修飾を含みうる。一部の実施形態では、検出用標識は、オリゴヌクレオチド配列により連結された、フルオロフォアおよび消光分子から構成される。フルオロフォアの、消光剤との近接性、およびループの長さを増大させるのに、ステムループ構造の利用が可能であり、Ｃａｓヌクレアーゼ活性による、それらの放出の効率をモジュレートするように、配列（Ｕ塩基およびＡ塩基など）が組み込まれうる。場合によって、フルオロフォアを、消光剤へと連結するオリゴの配列は、特異的トランスヌクレアーゼ活性による放出に対して高感度である、ケージ化構造を含む。場合によって、レポーター分子は、トランスケージ化分子と会合している。「トランスケージ化分子」は、二重鎖構造が、形成または創出されるように、別の核酸に結合する、任意の核酸を含みうる。場合によって、二重鎖構造は、１つまたは複数のループ（例えば、ステムループ）を含む。
消光部分は、シグナル部分からのシグナル（例えば、切断の前における）を、様々な程度で消光しうる。場合によって、消光部分の存在下で検出されるシグナル（シグナルパートナーが、互いと近接する場合の）が、消光部分の非存在下で検出されるシグナル（シグナルパートナーが隔てられている場合の）の、９５％またはこれ未満である場合、消光部分は、シグナル部分からのシグナルを消光している。例えば、場合によって、消光部分の存在下で検出されるシグナルは、消光部分の非存在下で検出されるシグナルの、９０％もしくはこれ未満、８０％もしくはこれ未満、７０％もしくはこれ未満、６０％もしくはこれ未満、５０％もしくはこれ未満、４０％もしくはこれ未満、３０％もしくはこれ未満、２０％もしくはこれ未満、１５％もしくはこれ未満、１０％もしくはこれ未満、または５％もしくはこれ未満でありうる。場合によって、消光部分の存在下では、シグナル（例えば、バックグラウンドを上回る）が検出されない。
場合によって、消光部分の非存在下で検出されるシグナル（シグナルパートナーが隔てられている場合の）は、消光部分の存在下で検出されるシグナル（シグナルパートナーが、互いと近接する場合の）の、少なくとも１．２倍（例えば、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍）である。
場合によって、シグナル部分は、蛍光標識である。一部のこのような場合では、消光部分は、蛍光標識からのシグナル（光シグナル）を消光させる（例えば、標識の発光スペクトル内で、エネルギーを吸収することにより）。したがって、消光部分が、シグナル部分と近接しない場合、シグナルは、消光部分により吸収されないため、蛍光標識からの発光（シグナル）は、検出可能である。任意の好都合なドナー／アクセプター対（シグナル部分／消光部分対）の使用が可能であり、当技術分野では、多くの適切な対が公知である。
場合によって、消光部分は、シグナル部分（本明細書ではまた、「検出用標識」とも称される）からエネルギーを吸収し、次いで、シグナル（例えば、異なる波長の光）を発する。したがって、場合によって、消光部分は、それ自体、シグナル部分（例えば、シグナル部分が、６－カルボキシフルオレセインでありうるのに対し、消光部分は、６－カルボキシ－テトラメチルローダミンでありうる）であり、一部のこのような場合では、対はまた、ＦＲＥＴ対でもありうるであろう。場合によって、消光部分は、ダーククエンチャーである。ダーククエンチャーは、励起エネルギーを吸収することが可能であり、エネルギーを、異なる形で（例えば、熱として）散逸させうる。したがって、ダーククエンチャーは、それ自体では、最小～ゼロの蛍光をもたらす（蛍光を発しない）。ダーククエンチャーの例については、それらの全てが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第８，８２２，６７３号明細書、および同第８，５８６，７１８号明細書；米国特許公開第２０１４０３７８３３０号明細書、同第２０１４０３４９２９５号明細書、および同第２０１４０１９４６１１号明細書；ならびに国際特許公開：国際公開第２００１４２５０５号パンフレット、および国際公開第２００１８６００１号パンフレットにおいて、さらに記載されている。
蛍光標識の例は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）染料、ＡＴＴＯ染料（例えば、ＡＴＴＯ ３９０、ＡＴＴＯ ４２５、ＡＴＴＯ ４６５、ＡＴＴＯ ４８８、ＡＴＴＯ ４９５、ＡＴＴＯ ５１４、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ ５４２、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ ５９０、ＡＴＴＯ ５９４、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ ６１０、ＡＴＴＯ ６２０、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ ６３３、ＡＴＴＯ ６４７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ ６５５、ＡＴＴＯ Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ ６６５、ＡＴＴＯ ６８０、ＡＴＴＯ ７００、ＡＴＴＯ ７２５、ＡＴＴＯ ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ染料、シアニン染料（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ染料、Ｓｕｌｆｏ Ｃｙ染料、Ｓｅｔａ染料、ＩＲＩＳ染料、ＳｅＴａｕ染料、ＳＲｆｌｕｏｒ染料、Ｓｑｕａｒｅ染料、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ、量子ドット、およびテザリング蛍光タンパク質を含むがこれらに限定されない。
場合によって、検出用標識は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）染料、ＡＴＴＯ染料（例えば、ＡＴＴＯ ３９０、ＡＴＴＯ ４２５、ＡＴＴＯ ４６５、ＡＴＴＯ ４８８、ＡＴＴＯ ４９５、ＡＴＴＯ ５１４、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ ５４２、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ ５９０、ＡＴＴＯ ５９４、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ ６１０、ＡＴＴＯ ６２０、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ ６３３、ＡＴＴＯ ６４７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ ６５５、ＡＴＴＯ Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ ６６５、ＡＴＴＯ ６８０、ＡＴＴＯ ７００、ＡＴＴＯ ７２５、ＡＴＴＯ ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ染料、シアニン染料（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ染料、Ｓｕｌｆｏ Ｃｙ染料、Ｓｅｔａ染料、ＩＲＩＳ染料、ＳｅＴａｕ染料、ＳＲｆｌｕｏｒ染料、Ｓｑｕａｒｅ染料、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｇｒｅｅｎ、およびＰａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅから選択される蛍光標識である。
場合によって、検出用標識は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）染料、ＡＴＴＯ染料（例えば、ＡＴＴＯ ３９０、ＡＴＴＯ ４２５、ＡＴＴＯ ４６５、ＡＴＴＯ ４８８、ＡＴＴＯ ４９５、ＡＴＴＯ ５１４、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ ５４２、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ ５９０、ＡＴＴＯ ５９４、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ ６１０、ＡＴＴＯ ６２０、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ ６３３、ＡＴＴＯ ６４７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ ６５５、ＡＴＴＯ Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ ６６５、ＡＴＴＯ ６８０、ＡＴＴＯ ７００、ＡＴＴＯ ７２５、ＡＴＴＯ ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ染料、シアニン染料（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ染料、Ｓｕｌｆｏ Ｃｙ染料、Ｓｅｔａ染料、ＩＲＩＳ染料、ＳｅＴａｕ染料、ＳＲｆｌｕｏｒ染料、Ｓｑｕａｒｅ染料、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ、量子ドット、およびテザリング蛍光タンパク質から選択される蛍光標識である。
ＡＴＴＯ染料の例は、ＡＴＴＯ ３９０、ＡＴＴＯ ４２５、ＡＴＴＯ ４６５、ＡＴＴＯ ４８８、ＡＴＴＯ ４９５、ＡＴＴＯ ５１４、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ ５４２、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ ５９０、ＡＴＴＯ ５９４、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ ６１０、ＡＴＴＯ ６２０、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ ６３３、ＡＴＴＯ ６４７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ ６５５、ＡＴＴＯ Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ ６６５、ＡＴＴＯ ６８０、ＡＴＴＯ ７００、ＡＴＴＯ ７２５、およびＡＴＴＯ ７４０を含むがこれらに限定されない。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ染料の例は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）７５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）７９０などを含むがこれらに限定されない。
消光部分の例は、ダーククエンチャーである、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（ＢＨＱ（商標））（例えば、ＢＨＱ－０、ＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２、ＢＨＱ－３）、Ｑｘ１消光剤、ＡＴＴＯ消光剤（例えば、ＡＴＴＯ ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ ５８０Ｑ、およびＡＴＴＯ ６１２Ｑ）、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（Ｄａｂｓｙｌ）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ 染料（例えば、ＱＳＹ ７、ＱＳＹ ９、ＱＳＹ ２１）、ＡｂｓｏｌｕｔｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、および金ナノ粒子などの金属クラスターを含むがこれらに限定されない。
場合によって、消光部分は、ダーククエンチャーである、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（ＢＨＱ（商標））（例えば、ＢＨＱ－０、ＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２、ＢＨＱ－３）、Ｑｘ１消光剤、ＡＴＴＯ消光剤（例えば、ＡＴＴＯ ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ ５８０Ｑ、およびＡＴＴＯ ６１２Ｑ）、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（Ｄａｂｓｙｌ）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ 染料（例えば、ＱＳＹ ７、ＱＳＹ ９、ＱＳＹ ２１）、ＡｂｓｏｌｕｔｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、および金属クラスターから選択される。
ＡＴＴＯ消光剤の例は、ＡＴＴＯ ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ ５８０Ｑ、およびＡＴＴＯ ６１２Ｑを含むがこれらに限定されない。Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（ＢＨＱ（商標））の例は、ＢＨＱ－０（４９３ｎｍ）、ＢＨＱ－１（５３４ｎｍ）、ＢＨＱ－２（５７９ｎｍ）、およびＢＨＱ－３（６７２ｎｍ）を含むがこれらに限定されない。
一部の検出用標識（例えば、蛍光染料）および／または消光部分の例については、それらの全てが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、例えば、Bao et al., Annu Rev Biomed Eng. 2009;11:25-47のほか；米国特許第８，８２２，６７３号明細書、および同第８，５８６，７１８号明細書；米国特許公開第２０１４０３７８３３０号明細書、同第２０１４０３４９２９５号明細書、同第２０１４０１９４６１１号明細書、同第２０１３０３２３８５１号明細書、同第２０１３０２２４８７１号明細書、同第２０１１０２２３６７７号明細書、同第２０１１０１９０４８６号明細書、同第２０１１０１７２４２０号明細書、同第２００６０１７９５８５号明細書、および同第２００３０００３４８６号明細書；ならびに国際特許公開：国際公開第２００１４２５０５号パンフレット、および国際公開第２００１８６００１号パンフレットを参照されたい。
場合によって、標識化検出剤の切断は、比色リードアウトを測定することにより検出されうる。例えば、フルオロフォアの遊離（例えば、ＦＲＥＴ対からの遊離、消光剤／フルオロフォア対からの遊離など）は、検出用シグナルの波長シフト（かつ、これによる、色シフト）を結果としてもたらしうる。したがって、場合によって、対象の標識化検出剤であるｓｓＤＮＡの切断は、色シフトにより検出されうる。このようなシフトは、１つの色（波長）のシグナル量の喪失、別の色のシグナル量の獲得、１つの色から別の色への配分の変化などとして表されうる。
場合によって、シグナルは、側方流クロマトグラフィーを使用して検出される。簡単なサンドイッチ型のシステムでは、試料は、吸収工程の第１段階として作用し、場合によって、試料の高精度／制御流動を確保するように、フィルターを含有する、側方流デバイス内のパッドへと適用される。コンジュゲートされた標識と、抗体とを保持するコンジュゲートパッドは、試料を受容するものとする。標的が存在する場合、固定化され、コンジュゲートされた抗体および標識は、標的に結合し、判定ラインに沿って泳動され続ける。試料が、デバイスに沿って移動するにつれて、ニトロセルロース膜上に配置された結合性試薬は、判定ラインにおいて、標的に結合するであろう。発色ラインが形成され、ラインの密度は、存在する標的の数量に応じて変動するであろう。一部の標的は、標的濃度を決定する定量を要求しうる。迅速な検査が、定量結果をもたらすリーダーと組み合わされうるのは、この点においてである。
場合によって、方法は、側方流を介して検出されるレポーター分子により実行される。一次活性化因子が存在すれば、システムが活性化され、ＮＣＲが生じる。活性化Ｃａｓタンパク質は、検出用シグナルを含む、トランスレポーターの切断を呈する。反応混合物を、側方流デバイスへとロードすると、切断されなかったレポーター分子が、対照ラインまで流動するのに対し、検出剤を含む、任意の切断されたレポーターの一部は、対照ラインを流過して、検出剤に結合する捕捉分子を含む帯域まで流動する。場合によって、Ｍｉｌｅｎｉａ Ｇｅｎｌｉｎｅ ＨｙｂｒｉＤｅｔｅｃｔ １（ＴｗｉｓｔＤｘ（商標））試験紙が使用される。例えば、場合によって、測定するステップは、金ナノ粒子ベースの検出（例えば、Xu et al., (2017) Angew Chem Int Ed Engl.;46(19):3468-70；ならびにXia et al., (2010) Proc Natl Acad Sci U S A. Jun 15;107(24):10837-41を参照されたい）蛍光の偏光、コロイドの相転移／分散（例えば、Baksh et al., (2004) Nature. Jan 8;427(6970): 139-41）、電気化学検出、半導体ベースのセンシング（例えば、Rothberg et al., (2011) Nature Jul 20;475(7356):348-52；例えば、２’－３’環状リン酸エステルを開環させ、無機リン酸エステルを、溶液へと放出することにより、ｓｓＤＮＡ切断反応の後で、ｐＨの変化をもたらすように、ホスファターゼを使用しうるであろう）、および標識化検出剤であるｓｓＤＮＡの検出のうちの１つまたは複数を含みうる。このような検出法のリードアウトは、任意の簡便なリードアウトでありうる。可能なリードアウトの例は、検出用蛍光シグナルの量測定；ゲル上のバンド（例えば、切断された産物を、切断されていない基質と対比して表すバンド）の、目視による解析、色の存在または非存在の、目視による検出、またはセンサーベースの検出（すなわち、色検出法）、および電気信号の存在または非存在（または特定の量の電気信号）を含むがこれらに限定されない。
場合によって、測定される検出用シグナルは、蛍光発光染料対によりもたらされる。例えば、場合によって、対象の方法は、試料を、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対もしくは消光剤／フルオロフォア対、またはこれらの両方を含む標識化検出剤であるｓｓＤＮＡと接触させるステップを含む。
場合によって、対象の方法は、試料を、ＦＲＥＴ対を含む標識化検出剤であるｓｓＤＮＡと接触させるステップを含む。場合によって、対象の方法は、試料を、フルオロフォア／消光剤対を含む標識化検出剤であるｓｓＤＮＡと接触させるステップを含む。蛍光発光染料対は、ＦＲＥＴ対、または消光剤／フルオロフォア対を含む。ＦＲＥＴ対、および消光剤／フルオロフォア対のいずれの場合でも、染料のうちの一方の発光スペクトルは、対内の他の染料の吸収スペクトルの領域と重複する。本明細書で使用される、「蛍光発光染料対」という用語は、それらの用語のいずれもが、下記でより詳細に論じられる、「蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対」および「消光剤／フルオロフォア対」の両方を包含するように使用される、一般用語である。「蛍光発光染料対」という用語は、「ＦＲＥＴ対および／または消光剤／フルオロフォア対」という語句と互換的に使用される。場合によって（例えば、検出用ｓｓＤＮＡが、ＦＲＥＴ対を含む場合）、標識化検出剤であるｓｓＤＮＡは、切断される前における、検出用シグナルの量をもたらし、標識化検出剤であるｓｓＤＮＡが切断されると、測定される検出用シグナルの量は、低減される。場合によって、標識化検出剤であるｓｓＤＮＡは、切断される前における、第１の検出用シグナル（例えば、ＦＲＥＴ対からの）と、標識化検出剤であるｓｓＤＮＡが切断された場合における、第２の検出用シグナル（例えば、消光剤／フルオロフォア対からの）とをもたらす。このように、場合によって、標識化検出剤であるｓｓＤＮＡは、ＦＲＥＴ対、および消光剤／フルオロフォア対を含む。場合によって、標識化検出剤であるｓｓＤＮＡは、ＦＲＥＴ対を含む。ＦＲＥＴとは、励起状態のフルオロフォアから、近接する第２の発色団へと、無放射のエネルギー移動が生じる過程である。エネルギー移動が生じうる範囲は、約１０ナノメートル（１００オングストローム）に限定され、移動の効率は、フルオロフォア間の隔離距離に対して、極めて高感度である。したがって、本明細書で使用される、「ＦＲＥＴ」（「蛍光共鳴エネルギー移動」；「フェルスター共鳴エネルギー移動」としてもまた公知である）という用語は、ドナーフルオロフォアと、ドナーの発光スペクトルが、アクセプターの励起スペクトルと重複するように選択され、かつ、エネルギーの一部は、量子カップリング効果を介して、ドナーから、アクセプターへと受け渡されるので、ドナーと、アクセプターが、互いと近接する（通例、１０ｎｍまたはこれ未満に）場合、ドナーの励起が、アクセプターの励起およびアクセプターからの発光を引き起こすように、さらに選択された、マッチするアクセプターフルオロフォアとを伴う物理現象を指す。したがって、ＦＲＥＴシグナルは、ドナーおよびアクセプターについての近接性ゲージとして用いられ；それらが、互いと近接する場合に限り、シグナルが発生させられる。本明細書では、ＦＲＥＴドナー部分（例えば、ドナーフルオロフォア）およびＦＲＥＴアクセプター部分（例えば、アクセプターフルオロフォア）は、併せて、「ＦＲＥＴ対」と称される。本明細書では、ドナー－アクセプター対（ＦＲＥＴドナー部分およびＦＲＥＴアクセプター部分）は、「ＦＲＥＴ対」または「シグナルＦＲＥＴ対」と称される。したがって、場合によって、一方のシグナルパートナーが、ＦＲＥＴドナー部分であり、他方のシグナルパートナーが、ＦＲＥＴアクセプター部分である場合、対象の標識化検出剤であるｓｓＤＮＡは、２つのシグナルパートナー（シグナル対）を含む。したがって、シグナルパートナーが、近接する（例えば、同じＲＮＡ分子上にある場合）場合、このようなＦＲＥＴ対（ＦＲＥＴドナー部分およびＦＲＥＴアクセプター部分）を含む、対象の標識化検出剤であるｓｓＤＮＡは、検出用シグナル（ＦＲＥＴシグナル）を呈するが、パートナーが、隔てられると、シグナルは、低減されるであろう（または非存在であろう）。当業者には、ＦＲＥＴドナー部分およびＦＲＥＴアクセプター部分（ＦＲＥＴ対）が公知であり、任意の好都合なＦＲＥＴ対（例えば、任意の好都合な、ドナー部分と、アクセプター部分との対）が使用されうる。Bajar et al. (2016) Sensors (Basel). Sep 14; 16(9)；およびAbraham et al. (2015) PLoS One. Aug 3; l0(8):e0l34436を参照されたい。
シグナル増幅核酸
任意の増幅活性化核酸（また、「ＲＮＡ増幅因子」（ＲＮＡの場合）、「活性化因子」、または「基質」とも称される）は、本明細書で記載されるＮＣＲ用の組成物、システム、および方法において使用されうる。Ｃａｓ１２またはＣａｓ１３による、標的核酸（例えば、コロナウイルス配列）の検出の前に、本明細書で記載されるシステムの活性化因子は、シグナル増幅因子に結合すること（これを活性化する）ことが可能でない、例えば、シグナル増幅因子とハイブリダイズすることができない（またはこれを活性化することができない）ように、ケージ化されている。しかし、検出される標的配列の存在下で、標的センサーが活性化されると、増幅基質は、放出され、シグナル増幅因子とハイブリダイズする（かつ、これを活性化する）のに利用可能となる。したがって、放出された基質は、シグナル増幅因子を活性化し、Ｃａｓ酵素活性の第２のカスケードを解放して、より多くの検出用標識をもたらし、これにより、同じ反応において、指数関数的シグナルを発生させる。
したがって、活性化基質は、レポーター複合体を切断し、検出用標識を放出することが可能な非特異的ヌクレアーゼとなるように、シグナル増幅因子を活性化する、任意の配列を含む。適切な配列の非限定例は、ガイドＲＮＡ、またはそれらのコグネイトの活性化核酸（例えば、Ｃａｓ１３の場合のＲＮＡ、およびＣａｓ１２の場合のＤＮＡ）を含む。
本明細書で記載されるヌクレオチド配列のうちのいずれかは、核酸に、新たな特色または特色の増強（例えば、安定性の改善）をもたらすように、１つまたは複数の修飾、例えば、塩基修飾、骨格修飾、糖修飾などを含みうる。当技術分野で公知の通り、ヌクレオシドとは、塩基－糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基である。このような複素環式塩基の、２つの、最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドとは、ヌクレオシドの糖部分へと、共有結合的に連結されたリン酸基をさらに含む、ヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドでは、リン酸基は、糖の２’ヒドロキシル部分、３’ヒドロキシル部分、または５’ヒドロキシル部分へと連結されうる。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを、互いと共有結合的に連結して、直鎖状ポリマー化合物を形成する。この直鎖状ポリマー化合物のそれぞれの末端は、環状化合物を形成するように、さらに接続されうるが、一般には、直鎖状化合物が適切である。加えて、直鎖状化合物は、内部におけるヌクレオチド塩基の相補性を有しうるので、完全二本鎖化合物または部分的二本鎖化合物をもたらす形でフォールディングしうる。オリゴヌクレオチド内で、リン酸基は、一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成すると称される。ＲＮＡおよびＤＮＡの、通常の連結または骨格は、３’－５’ホスホジエステル連結である。
骨格の修飾、ヌクレオシド間連結、模倣体の使用、ロックト核酸（ＬＮＡ）の使用、および／または１つまたは複数のヌクレオ塩基の組入れなどの置換による塩基修飾を含む、さらなるヌクレオチド修飾については、米国公開第２０１９０２４１９５４号明細書に記載されている。
本明細書で記載される核酸のうちの１つまたは複数はまた、１つまたは複数の置換糖部分も含みうる。
１つまたは複数のＲＮＡ増幅因子は、レポーター分子内の、例えば、レポーター複合体の検出用標識と、消光部分とを連結する配列の一部として組み入れられる場合もあり、かつ／または検出用標識および／または消光剤の一方または両方に対して、遠位の位置に組み入れられる場合もある。場合によって、１つまたは複数の増幅活性化因子は、検出用標識と、消光剤との間に組み入れられる。代替的に、かつ／またはレポーター分子が、トリガー基質の配列を含む実施形態に加えて、トリガーは、本明細書で記載される組成物、システム、および方法における構成要素を隔てる場合がある。
増幅活性化因子は、選択的切断を可能とするように、ポリＵ配列またはポリＡ配列を含みうる。Ｃａｓ１３酵素は、２’，３’環状リン酸エステルを伴う、切断されたＲＮＡ断片をもたらし、これらのサブセットは、Ｕにおける切断を優先する。したがって、Ａ４－Ｕｎの配列を伴う基質を使用することにより、Ｃａｓ１３は、ＴｔＣｓｍ６のリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）活性を活性化するＡ４＞Ｐを発生させる。かつて、Ａ５－Ｕｎ、およびＡ６－Ｕｎを伴う配列が、Ｃｓｍ６を、Ｃａｓ１３へとカップリングさせるのに使用された（Gootenberg et al. (2017) Science 356(6336):438-442）が、これらは、ＴｔＣｓｍ６など、Ａ４を認識するＣｓｍ６酵素の、最適の活性化をもたらさない。加えて、Ｃｓｍ６酵素は、既存の核酸検出法より高度の検出速度および高感度をもたらすフィード－フォワードループとして働くことが裏付けられていない。
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび／または活性化ＲＮＡは、相互作用が、標的核酸の検出の後など、最適の時間枠のみにおいて生じるよう、Ｃａｓタンパク質との条件付き相互作用を可能とするように修飾されうる。条件付き相互作用を可能とする、多くの異なる機構であって、ｇＲＮＡ活性に対する保護剤としての、切断可能なアンチセンスＤＮＡ（Jain et al, (2016) Angew Chem Int Ed Engl 55 (40) 12440-4）；リガンド依存性のＲＮＡ切断およびＲＮＡ脱保護（Ferry et al (2017) Nat Commun 8:14633）；転写活性化因子の、ｄＣａｓへのリガンド依存性動員（Maji et al (2017) Nat Chem Biol 13 (1):9-11）；およびＣａｓ：ガイドＲＮＰ複合体の低分子誘導性リアセンブリー（Kunert et al (2019) Nat Commun. 10(1):2127）；および光を使用して、ＲＮＰとｄｓＤＮＡとの間の相互作用を直接調節するための、ｇＲＮＡの光ケージ化デザイン（Zhou et al (2020) Angew Chem Int Ed Engl doi: 10.1002/anie.201914575の使用を含む機構が存在する。別の手法は、異なるＣａｓ酵素の、固有の切断優先性に依拠する。一部の実施形態では、活性化因子は、それらのコグネイトガイドＲＮＡとの、完全なアンチセンスマッチではない。一部の実施形態では、非マッチ型ヌクレオチドを使用して、ガイドとの相互作用の微調整を解除して、これを低感度化し、非特異的シグナルを結果としてもたらす可能性を低下させる。一部の実施形態では、非マッチ型ヌクレオチドを、相補性領域内の「揺らぎ」位置へと導入する。
一部の実施形態では、活性化分子は、ＲＮＡ配列およびＤＮＡ配列の両方を含む。
場合によって、活性化ＲＮＡ分子は、ケージ化されている。ケージ化は、任意の物理的手段または化学的手段により達せられうる。例えば、トリガーは、Ｃａｓ酵素の結合または切断についての、最重要の特色をモジュレートしうる、５’側および３’側の配列伸長部を使用してケージ化されうる。この点で、Ｃａｓ１２およびＣａｓ１３の非特異的ヌクレアーゼ活性の選択性は、ガイドＲＮＡの直接的リピート、ガイドＲＮＡスペーサー、ガイドＲＮＡスペーサー内のシード配列（活性化配列とのミスマッチに対して高感度であることが公知である、ガイドＲＮＡ内の配列；Abudayyeh et al (2016) Science 353: aaf5573を参照されたい）、および／または活性化核酸内のシード配列のコグネイトと塩基対合しうる配列伸長部を利用することにより、一本鎖核酸に対して利用されうる。このようなケージ化配列は、直鎖状の場合もあり、ループ状の場合もあり、他の形態の場合もある。これらの５’側の配列伸長部と、３’側の配列伸長部とは、同じケージ化基質状で組み合わされうる。配列伸長部の異なる組合せは、ガイドＲＮＡおよび活性化核酸対にわたり使用されうる。
場合によって、基質ケージもまた、ガイドＲＮＡまたは活性化因子と塩基対合する分子を隔てうる。このケージは、Ｘｒｎ１またはＣｓｍ６などのエンドヌクレアーゼ活性またはエクソヌクレアーゼ活性を介して放出されうる。一部の実施形態では、ケージは、本明細書で記載される、ロックト核酸（ＬＮＡ）部分または２’－ＯＭｅ ＲＮＡなどの化学修飾を含有しうる。また、米国公開第２０１９０２４１９５４号明細書も参照されたい。
基質は、任意の方式で活性化（非ケージ化）されうる。場合によって、配列伸長部内のケージ化配列（例えば、露出されるループ領域）は、ケージの放出および機能的なガイドＲＮＡまたは活性化因子の産生を引き起こす、Ｃａｓタンパク質の顕著に異なる亜型（Ｃａｓ１３またはＣａｓ１２）により、特異的に切断されるようにデザインされる。Ｃａｓ１２タンパク質およびＣａｓ１３タンパク質の、ホモポリマーのレポーター基質に対する切断優先性をプロファイリングすることで、一般的なオーソログが、ウリジン、塩基の組合せ、またはアデニンを優先することを裏付けた（East-Seletsky (2017) Mol Cell 66(3); 373-383；Gootenberg et al (2018) Science 360(6387): 439-444）。例えば、ＬｍａＣａｓ１３ａ、ＬｂｕＣａｓ１３ａ、およびＰｐｒＣａｓ１３ａが、ポリＵに対する、強力な優先性を呈したのに対し、ＣｃａＣａｓ１３ｂは、ポリＵに対する、中程度の優先性を呈した。Ｐｉｎ２Ｃａｓ１３ｂは、ポリＵおよびポリＣに対する、中程度の優先性を裏付けた。ＰｂｕＣａｓ１３ｂおよびＰｇｕＣａｓ１３ｂは、いずれも、ポリＵに対する、微弱な優先性を示したのに対し、ＬｂａＣａｓ１３ａは、ポリＡに対する、強力な優先性を有する。最後に、ＢｚｏＣａｓ１３ｂは、ポリＵおよびポリＡに対する、微弱な優先性を裏付けた。さらに、被験Ｃａｓ１３オーソログの一部は、イオン濃度および／またはガイドＲＮＡの長さに応じて、示差的活性を示した。したがって、ケージ構造は、無傷の場合、ガイドが、そのコグネイト標的と相互作用することを阻止するように、ガイドＲＮＡへと付加されうる。ケージが、例えば、Ｃａｓ１３ａ複合体によるトランス切断の後で放出される場合、ガイドは、標的と、自由に相互作用し、ＲＮＰ複合体の活性化を引き起こす。一部の実施形態では、活性化核酸は、ＤＮＡであり、ＤＮＡ配列は、ＲＮＡケージを含む。一部の実施形態では、例えば、Ｃａｓ１３ ＲＮＰ複合体増幅因子およびＣａｓ１２ ＲＮＰ複合体増幅因子との二次増幅複合体を使用する場合、ＲＮＡ活性化核酸およびＤＮＡ活性化核酸が使用される。この場合、活性化ＲＮＰ複合体は、より多くのケージ化基質を切断する。さらなる活性化Ｃａｓ複合体の各々は、蛍光シグナルをもたらすことに加えて、より多くのケージ化基質を活性化することが可能であり、Ｃａｓ指向性ヌクレアーゼ活性の、フィード－フォワードサイクルをもたらす。反応が進むにつれ、これらの酵素は、さらにより多くの検出用標識を切断することが可能であり、シグナルの指数関数的増幅をもたらす。
一部の実施形態では、Ｃｓｍ６は、検出反応をさらに増幅するのに使用される。このシステムでは、ポリＡの連なりに続いて、Ｃａｓ１３が、ガイド内の、全てのウリジンを、ホモポリマーであるＡの連なりへと分解するように、ウラシル優先型Ｃａｓ１３酵素により切断されうる、保護的なポリＵの連なりを含む保護型ガイドＲＮＡ増幅因子が使用される。一部の実施形態では、例えば、ポリＡの連なりに続いて、Ｃａｓ１３が、ガイド内の、全てのウリジンを、ホモポリマーであるＡの連なりへと分解するように、ウラシル優先型Ｃａｓ１３酵素により切断されうる、保護的なポリＵの連なりを含む、保護型Ｃｓｍ６活性化ＲＮＡが使用される。保護型ガイドＲＮＡ増幅因子および保護型活性化ＲＮＡは、Ｃａｓ１３切断の後で、２’－３’環状リン酸を有し、これにより、Ｃｓｍ６を活性化するであろう。（Ａ）６ポリヌクレオチドは、Ｃｓｍ６を活性化することが公知であり、ＥｉＣｓｍ６およびＬｓＣｓｍ６のいずれもが、標的核酸への初期結合の後に、検出シグナルを増幅することが示された（Gootenberg et al (2018) Science 360(6387): 439-444）。
Ｃｓｍ６もまた、フィード－フォワードループを開始するように、Ｃａｓ１３により活性化される、第２の酵素として使用されうる。Ｃｓｍ６のためのケージ化活性化因子は、それ自体またはＣａｓ１３による未成熟切断を防止するように修飾されうる（例えば、２’－ＯＭｅ、２’－Ｈ、２’－Ｆ）、配列の５’末端において、４つ、５つ、または６つのアデノシン（Ａ４、Ａ５、またはＡ６）を含むであろう。ケージ化活性化因子はまた、その３’末端において、基質をケージ化する、さらなる切断可能なＡまたはＵも有するであろう。ケージ化の解除は、Ａ４＞Ｐ、Ａ５＞Ｐ、またはＡ６＞Ｐを作出して、Ｃｓｍ６を活性化するように、Ｃａｓ１３を介して、３’側のＲＮＡヌクレオチドをトリミングすることにより達せられるであろう。基質をケージ化するのに使用される３’－ヌクレオチドのアイデンティティーは、非ケージ化のために使用されるＣａｓ酵素のヌクレオチド優先性に応じて変動しうる。例えば、１つの潜在的な基質は、５’－ｆＡ－ｆＡ－ｆＡ－ＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号１）［配列中、３つのｆＡヌクレオチドは、２’－Ｆ修飾を有し、末端の５つのＡは、Ｃｓｍ６またはＬｂａＣａｓ１３により切断されうるであろう］でありうるであろう。
Ｃａｓ酵素であるＣｓｍ６によるＮＣＲ増幅についての一実施形態では、ＬｂａＣａｓ１３は、相補性ＲＮＡを感知し、トランスＲＮＡ切断のために活性化するであろう。次いで、ＬｂａＣａｓ１３は、ケージ化Ｃｓｍ６活性化因子の３’末端において、アデノシンをトリミングし、Ｃｓｍ６酵素に結合し、これを活性化する修飾Ａ４＞Ｐ、修飾Ａ５＞Ｐ、または修飾Ａ６＞Ｐを残すであろう。次いで、活性化Ｃｓｍ６は、さらなるケージ化活性化因子を非ケージ化し、次いで、これは、Ｃｓｍ６分子のさらなる活性化をもたらし、初期検出の後のフィード－フォワードループを誘発するであろう。活性化Ｃｓｍ６分子はまた、蛍光レポーター基質をも切断し、検出用シグナルをもたらすであろう。この戦略は、修飾基質は、高感度をもたらすＣｓｍ６を伴う、フィード－フォワードループを可能とするので、Ｃａｓ１３を伴う、従来のＣｓｍ６の使用（Gootenberg et al., 2018, Science, ibid）と異なる。
この戦略はまた、その３’末端において、Ａではなく、Ｕを伴う活性化因子（例えば、５’－ＡＡＡＡＵＵＵＵＵＵ－３’、配列番号２）をケージ化することにより、Ｕ切断をもたらすＣａｓ１３オーソログによって、一次ＲＮＡ検出剤を増幅するようにも適合されうる。例えば、ＬｂｕＣａｓ１３は、Ａ４－Ｕ６ケージ化活性化因子を切断して、Ａ４＞Ｐをもたらすであろう。この非ケージ化基質は、ＴｔＣｓｍ６を活性化し、次いで、これが、第２の活性化因子（例えば、５’－ｆＡ－ｆＡ－ｆＡ－ＡＡＡＡＡＡＡ－３’、配列番号１）を非ケージ化するほか、レポーターを切断するであろう。これは、一次検出イベントを増幅するフィード－フォワードループを誘発するであろう。Ｃｓｍ６による、活性化因子の分解を防止するのに、活性化配列を含む、ヌクレオチドの２’－ＯＨの修飾が使用されるであろう。
Ａ４活性化配列、Ａ５活性化配列、またはＡ６活性化配列の後のケージ化ヌクレオチドの非修飾形、または異なる数もしくは配列を含む、活性化因子の多様な変化形について調べられうる。記載された全ての手法が、潜在的に、任意のＣｓｍ６酵素またはＣｓｘ１酵素へと適用されうるであろう。この戦略はまた、Ｃａｓ酵素の切断優先性の差違に基づき、複数のＲＮＡ標的を、同時に検出するように、Ｃａｓ１３またはＣａｓ１２を伴う、他のＮＣＲ経路と共に、マルチプレックス化するのにも使用されうるであろう。
一部の実施形態では、Ｃｓｍ６活性化配列は、例えば、ガイドＲＮＡ上の、ケージ配列内に組み入れられる（図１Ｉ、上）。一次活性化ＲＮＡとのその相互作用により活性化されたＣａｓ１３（例えば、ＬｂｕＣａｓ１３ａ）により、Ｃｓｍ６活性化配列の両側において、配列がトランス切断されると、Ｃｓｍ６配列が放出され、Ｃｓｍ６と相互作用し、これを活性化することが可能となる。次いで、活性化Ｃｓｍ６は、ケージ化ガイドＲＮＡに対して作用し、Ｃａｓ１３酵素との複合体に対する利用可能性を増大させ、これにより、一次活性化因子に対する利用可能性も増大させて、一次活性化因子の検出の増大を持続することが可能となる。同時に、活性化Ｃｓｍ６はまた、レポーター分子も切断し、シグナルを増幅するであろう。一部の実施形態では、活性化Ｃｓｍ６による切断の後で、非ケージ化ＲＮＡが、Ｃａｓ１２ベースの増幅システムと相互作用しうるように、Ｃｓｍ６活性化配列を含む、ケージ化活性化ＲＮＡが使用される。一部の実施形態では、Ｃｓｍ６活性化因子を含むケージ化ガイド、およびＣｓｍ６活性化因子を含むケージ化活性化ＲＮＡの両方が使用される。検出される、全てのシグナルは、Ｃａｓ１３の、一次活性化因子との初期相互作用に依存する。
一部の実施形態では、保護型Ｃｓｍ６特異的活性化ＲＮＡが、システムに組み入れられる（図１Ｉ、下）。この実施形態では、保護型Ｃｓｍ６活性化因子は、一次活性化因子との、その相互作用を介して活性化されたＣａｓ１３によりトリミングされるヌクレオチドにより保護される。トリミングされたＣｓｍ６特異的活性化ＲＮＡは、今や、Ｃｓｍ６酵素と相互作用し、これを活性化することができ、活性化Ｃｓｍ６酵素は、検出が、Ｃａｓ１３の、一次活性化因子との初期相互作用に依存するように、ケージ化ガイドＲＮＡ、ケージ化活性化ＲＮＡ、およびＲＮＡレポーター分子などの分子に作用して検出剤を増幅しうる。
一部の実施形態では、保護型Ｃｓｍ６特異的活性化ＲＮＡが、システムに組み入れられ（図１Ｊ、上）、Ｃｓｍ６による増幅が、唯一の増幅因子として用いられる（例えば、さらなるＣａｓ１２増幅ステップは用いられない）。この実施形態では、保護型Ｃｓｍ６特異的活性化ＲＮＡが、システムに組み入れられ、この場合、保護は、ポリＡ配列の使用を含み、Ｃｓｍ６特異的活性化因子の５’末端におけるＡの一部は、２’－Ｆ（フッ素）を含む。Ｃａｓ１３酵素は、古典的な金属非依存性切断機構を使用する可能性が高いので、２’－Ｆを含むＡを切断することができない（Gootenberg et al., (2018) ibid；Yang, W. (2011) Q. Rev. Biophys. 44, 1-93）。次いで、一次活性化因子との、その相互作用を介して活性化されたＣａｓ１３は、２’－Ｆを含むＡの連なりのすぐ３’側のＡを除き、２’－ＯＨを含む、全てのＡヌクレオチドをトリミングする。この結果としてトリミングされた配列は、Ｃｓｍ６の活性化のために要求される、２’－３’環状リン酸を有するであろう。活性化Ｃｓｍ６は、今や、検出が、Ｃａｓ１３の、一次活性化因子との初期相互作用に依存するように、ケージ化ガイドＲＮＡおよびレポーター分子などの分子に作用して、検出剤を増幅しうる。一部の実施形態では、２’－Ｆを伴う５’側のＡを含む、Ｃｓｍ６特異的活性化ＲＮＡが、二次Ｃａｓ１２増幅システムを含むシステムにおいて使用される。
一部の実施形態では、Ｃｓｍ６の活性化は、長鎖ポリＡ ＲＮＡの使用を介して達せられる（図１Ｊ、下）。この実施形態では、Ｃｓｍ６の活性化は、Ｃａｓ１３による、長鎖ポリＡ ＲＮＡの切断の後で達せられる。これらの長鎖ポリＡ分子は、反応物中に供給され、Ｃａｓ１３のトランス切断活性が活性となるように、一次活性化ＲＮＡとの相互作用を介して活性化されたＣａｓ１３により切断される。ポリＡ ＲＮＡは、ランダムの長さで切断され、全長の３’末端に、２’－３’環状リン酸を有するであろう。これらの長さの一部は、Ｃｓｍ６を活性化するのに適正なサイズ（例えば、Ａ４＞Ｐ、Ａ５＞ＰまたはＡ６＞Ｐ）となるであろう。活性化Ｃｓｍ６酵素は、今や、検出が、Ｃａｓ１３の、一次活性化因子との初期相互作用に依存するように、ケージ化ガイドＲＮＡ、ケージ化活性化ＲＮＡ、およびＲＮＡレポーター分子などの分子に作用して、検出剤を増幅しうる。一部の実施形態では、適正な長さのポリＡが、Ｃｓｍ６を刺激したら、次いで、活性化Ｃｓｍ６が、保護型Ｃｓｍ６特異的活性化ＲＮＡ（上記で記載された）を放出する結果として、シグナルの増幅をもたらすように、上記で論じられた、Ｃｓｍ６特異的保護型活性化因子もまた組み入れられる。
場合によって、例えば、Ｃａｓ１３を使用する場合、Ｃａｓ酵素が、ケージの切断を伴わずに活性化する場合の、バックグラウンドのヌクレアーゼ活性を抑制するように、抗タグ配列を、３’末端上の切断可能なループ内などの活性化ＲＮＡに組み入れる。
Ｃａｓ１２およびＣａｓ１３、またはＵ特異的な、切断をもたらすＣａｓ１３およびＡ特異的な、切断をもたらすＣａｓ１３の、顕著に異なるサブファミリーなど、直交ターゲティング系から発生させられたシグナルは、シグナル伝達カスケードのために組み合わされうる。複数の顕著に異なる配列が、増幅について検出される必要がある、論理ゲートもまた、組み込まれうる。顕著に異なるＣａｓ酵素はまた、マルチプレックス化シグナルリードアウトのために組み込まれうる、ジヌクレオチドモチーフなど、異なるヌクレオチドモチーフ優先性も呈しうる。
場合によって、Ｃａｓ酵素の活性は、例えば、バックグラウンドシグナル（これは、偽陽性増幅をもたらしうる）を低下させるために、抑制させる場合がある。これは、任意の適切な手段により、例えば、酵素活性を低下させる突然変異の使用を介して達せられうる。適切な突然変異は、公知の技法を使用して、実験により得られる場合もあり、市販品を得られる場合もあり、文献から同定される場合もある。
ＬＡＭＰ（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法および／またはＬＡＭＰ核酸増幅もまた利用されうる。例えば、Gadkar et al. (2018) Scientific Methods 8:5548；Notomi et al. (2006) Nucleic Acids Research 28(12):e63；Piepenburg et al. (2000) PLoS Biology 4(7):1115-1121を参照されたい。ＬＡＭＰは、検査室状況およびポイントオブケア状況において、広範に使用されている、単純かつ正確な等温核酸増幅法である（Gadkar et al (2018) Sci Reports 8 (5548)）。ＬＡＭＰ法は、単一の温度（６０℃～６５℃）で実行され、短時間（１５分間）で、約５０倍の量の増幅産物をもたらすことが可能である。ＬＡＭＰは、典型的に、４つのプライマー（ＦＩＰ（ｆｏｒｗａｒｄ ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）、ＢＩＰ（ｂａｃｋｗａｒｄ ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）、Ｆ３（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）、およびＢ３（ｂａｃｋｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ））を活用して、標的配列の、６つの異なる領域を認識する。ＬＡＭＰは、ＲＮＡ分子を検出するための、逆転写酵素ステップと組み合わされうる（Shen (2020) J Pharm Anal 10(2):97を参照されたい）。
場合によって、ミスマッチ寛容型ＬＡＭＰ法が使用される。ミスマッチ寛容型ＬＡＭＰは、付加増幅時に、ＬＡＭＰプライマーの３’末端におけるミスマッチを除去する高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの、反応混合物への添加を含む。ミスマッチ寛容型ＬＡＭＰの使用は、遺伝学的に多様なウイルス株に由来する配列を増幅する場合に有用でありうる（Zhou et al (2019) Front Micro 10, art 1056）。
核酸配列ベース増幅および転写媒介性増幅（それぞれ、ＮＡＳＢＡおよびＴＭＡ）は、ＲＮＡを介して進行する、類似の等温増幅法であり、使用が可能である。ＮＡＳＢＡは、２つのＲＮＡ標的特異的プライマー、および３つの酵素（すなわち、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、Ｔ７ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＤｄＲｐ）、およびＲＮアーゼＨ）を活用する。ＲＮＡ増幅のための標準的ＮＡＳＢＡプロトコールは、酵素を添加する前に、標的を変性する、６５℃のＲＮＡインキュベーションステップを要求する。初期段階では、Ｔ７ ＤｄＲｐのプロモーターに対応する、５’側配列を有する特異的フォワードプライマー（Ｐ１）が、試料中に存在する、任意の標的ＲＮＡとハイブリダイズし、逆転写酵素により伸長させられる。その後、結果として得られるＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖のＲＮＡ部分が、ＲＮアーゼＨにより分解される一方で、特異的リバースプライマー（Ｐ２）が、相補性配列とハイブリダイズし、逆転写酵素により伸長させられ、標的配列およびＴ７プロモーターを伴うｄｓＤＮＡの形成をもたらす。次いで、Ｔ７ ＤｄＲｐは、元の標的ＲＮＡと相補性である、多くのＲＮＡ分子をもたらす。増幅段階では、新規に合成された各ＲＮＡがコピーされる結果として、標的と相補的なＲＮＡの指数関数的増幅をもたらしうる。
プライマーは、目的の領域をターゲティングするようにデザインされるが、重要なことは、１つのプライマーが、５’末端において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含むことである。これは、反応物中に含まれる逆転写酵素により、ｃＤＮＡへと逆転写される一本鎖ＲＮＡ分子種の作製を可能とする。ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド体内のＲＮＡは、ＲＮアーゼＨ活性（ＮＡＳＢＡにおける外因性タンパク質から、またはＴＭＡにおけるＲＮアーゼＨ＋ＲＴにより）により破壊され、ｄｓＤＮＡは、ＲＴにより作製される。次いで、この鋳型は、Ｔ７ ＲＮＡＰにより、ＲＮＡへと転写され、指数関数的増幅が生じる（Compton (1991) Nature. 350 (6313): 91-2；米国特許第５，４８０，７８４号明細書）。
鎖置換増幅（ＳＤＡ）またはニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）は、ＤＮＡの増幅のために使用されうる、２つの類似の手法であり、本発明の方法および組成物と共に使用されうる。いずれの技法も、プライマー内に含有される部位において、鎖限定的制限エンドヌクレアーゼまたはニッキング酵素により創出されるニックにおいて反応を開始するのに、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、典型的に、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｌａｒｇｅ断片、またはＫｌｅｎｏｗ断片（３’－５’ｅｘｏ－）に依拠する。ニッキング部位は、各ポリメラーゼ置換ステップにより再生される結果として、指数関数的増幅をもたらす。ＮＥＡＲは、極めて迅速かつ高感度であり、少量の標的の検出を、数分間で可能とする（Van Ness et al (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4504-9）。ＳＤＡおよびＮＥＡＲは、典型的に、臨床適用およびバイオセイフティー適用において利用される。
場合によって、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）が使用される。ＨＤＡは、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡの相補性鎖をほどき、これにより、プライマーのハイブリダイゼーション、およびＤＮＡポリメラーゼによる、後続のプライマーの伸長のための、一本鎖鋳型をもたらすのに、温度サイクリングを回避するＤＮＡヘリカーゼの活性を利用する。ＨＤＡは、複製フォークを模倣し、ｄｓＤＮＡ鋳型へとロードされ、２つの鎖を連結する水素結合を破壊しながら、標的ＤＮＡに沿って横断する場合、ＡＴＰの存在下における、ＤＮＡの合成を可能とする。２つの配列特異的プライマーは、各ｓｓＤＮＡ鋳型の３’末端とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼは、ｄｓＤＮＡをもたらすことにより、標的とアニールさせられたプライマーを伸長させる。次いで、２つの、新規に合成されたｄｓＤＮＡ産物は、次の反応ラウンドにおいて、ＤＮＡヘリカーゼのための基質として作用する結果として、選択された標的配列の指数関数的増幅をもたらす（Jeong, Y-J. et al; (2009) Cell. Mol. Life Sci. 66, 3325-3336）。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）は、逆行するオリゴヌクレオチドプライマーの、鋳型ＤＮＡまたは標的ＤＮＡへの結合、およびＤＮＡポリメラーゼによるそれらの伸長により達成される、特異的ＤＮＡ断片の等温増幅である。プライマーが、それらの相補性標的配列へと方向付けられるのに、増幅鋳型の全体的溶融は要求されない。そうではなくて、ＲＰＡは、リコンビナーゼ－プライマー複合体を利用して、二本鎖ＤＮＡを走査し、コグネイト部位における鎖交換を容易とする。結果として得られる構造は、押しのけられた鋳型鎖と相互作用する一本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質により安定化させられ、これにより、分岐点移動によるプライマーの放出を阻止する。リコンビナーゼのディスアセンブリーは、この場合、枯草菌（Bacillus subtilis）Ｐｏｌ Ｉ（Ｂｓｕ）の大型断片である鎖置換ＤＮＡポリメラーゼがアクセス可能な、オリゴヌクレオチドの３’末端を残し、プライマーの伸長が後続する。指数関数的増幅は、この工程サイクルの反復により達せられる。したがって、一部の実施形態では、標的核酸の前増幅は、ＬＡＭＰ、ＲＰＡ、または鎖置換増幅（ＳＤＡ；Walker et al (1992) PNAS USA 89:392-396）、およびヘリカーゼ依存性増幅（Vincent et al (2004) EMBO Rep 5: 795-800）を含む、他の等温増幅法を使用して実施されうる。
増幅法は、マイクロ流体デバイス内で実施されうる（Zanoli and Spoto (2013) Biosensors 3(1), 18-43）。
一部の実施形態では、システムによる検出は、マルチプレックス化ガイドＲＮＡを活用して、標的一次活性化因子を検出する。標的核酸である、一次活性化因子の異なる区間を認識する、複数のガイドが使用されうる。一部の実施形態では、マルチプレックス化は、異なる標的である、一次活性化因子を認識するようになされうる。異なるＣａｓオーソログ、検出のための、異なるフルオロフォア－消光剤レポーターと共に、異なる核酸基質および／またはマルチプレックス化ガイドを切断する、Ｃｓｍ６酵素またはＣｓｘ１酵素が使用されうる。これは、単一の反応における、１つまたは複数の一次活性化因子の同定を可能とするであろう。場合によって、複数の標的の存在または非存在がアッセイされうるように、複数の一次活性化因子を検出するシステムがデザインされる。例えば、１つのＣａｓ／フルオロフォアの組合せが、１種類のウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）を検出するのに使用される一方で、別のＣａｓ／フルオロフォアの組合せが、別の種類のウイルス（例えば、コロナウイルス）を検出する場合もあり、システムが、ウイルス（例えば、コロナウイルス）のほか、Ａ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルス、ＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）ウイルス、非ＣＯＶＩＤ－１９コロナウイルス、アデノウイルス、１～４型パラインフルエンザウイルス、ヒトメタ肺炎ウイルス、リノウイルス／エンテロウイルス、肺炎クラミジア（Chlamydia pneumoniae）、および肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）など、任意の共感染病原体の存在を検出するのに使用される場合もある（Kim et al (2020) JAMA doi:10.1001/jama.2020.6266）。
標的（一次活性化因子）配列
一次標的配列の供給源は、哺乳動物、ウイルス、細菌、および真菌を含む、任意の供給源でありうる。一部の実施形態では、標的配列は、微生物配列またはウイルス配列、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９などのコロナウイルス配列である。さらに他の実施形態では、標的配列は、哺乳動物のゲノム配列または転写配列である。一部の実施形態では、供給源は、ヒト、ヒト以外、または動物でありうる。一部の実施形態では、動物供給源は、家畜の場合もあり、非家畜、例えば、野生動物の場合もある。一部の実施形態では、家畜は、介助動物もしくは愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ、鳥類、魚類、または爬虫類）、または農場家畜である。
病原性供給源に由来する一次標的配列について述べると、病原体は、細菌、真菌、または原虫など、大きな、公衆衛生との関連性を有する場合があり、標的配列は、限定せずに述べると、コロナウイルス（例えば、重症呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）関連コロナウイルス、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）関連コロナウイルス、ＣＯＶＩＤ－１９など）、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、またはジカウイルスのうちの１つまたは複数において見出されうる。任意の病原体（例えば、ウイルス、細菌など）が検出されうる。
一次標的配列は、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）のＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）でありうる。標的配列が、一本鎖である場合、標的内のＰＡＭ配列について、優先性または要求は存在しない。しかし、標的ＤＮＡが、ｄｓＤＮＡである場合、ＰＡＭは、通例、標的ＤＮＡの標的配列と隣接して存在する（例えば、本明細書の別の箇所における、ＰＡＭについての議論を参照されたい）。標的ＤＮＡの供給源は、例えば、下記で記載される、試料の供給源と同じでありうる。
場合によって、一次標的配列は、ウイルス配列（例えば、ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ、またはＤＮＡウイルスのゲノムＤＮＡ）である。このように、対象の方法は、核酸集団（例えば、試料中の）内の、ウイルス配列の存在を検出するための方法でありうる。
可能な一次ＲＮＡ標的の非限定例は、コロナウイルス（ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、オルトミクスウイルス科のウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エボラウイルス病ウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ならびに１型成人ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ－１）、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含むレトロウイルスなどのウイルスＲＮＡを含む。
可能な標的ＤＮＡの非限定例は、パポバウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス）；肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））；ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、リンパ向性ヘルペスウイルス、バラ色粃糠疹ウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）；アデノウイルス（例えば、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス、マスタデノウイルス、シアデノウイルス）；ポックスウイルス（例えば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘ウイルス、ウシ丘疹性口内炎ウイルス；タナポックスウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス；伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ））；パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、パルボウイルスＢ１９、ヒトボカウイルス、ブファウイルス、ヒトｐａｒｖ４ Ｇ１）；ジェミニウイルス科（Geminiviridae）；ナノウイルス科（Nanoviridae）；フィコドナウイルス科（Phycodnaviridae）などのウイルスＤＮＡを含むがこれらに限定されない。場合によって、標的ＤＮＡは、寄生虫ＤＮＡである。場合によって、標的ＤＮＡは、細菌ＤＮＡ、例えば、病原性細菌のＤＮＡである。
一部の実施形態では、標的核酸は、がんと関連するＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列である。これらの標的核酸は、ＤＮＡのメチル化、ヒストンの修飾、メッセージのスプライシング、およびマイクロＲＮＡの発現において役割を果たす遺伝子を含みうる。慢性骨髄性白血病と関連する、いわゆるフィラデルフィア染色体など、周知の例と並んで、一部の実施形態では、標的は、各々が、Ｃ－Ｍｙｃの変更と関連し、急性リンパ性白血病と関連する、ｔ（８；１４）（ｑ２４；ｑ３２）、ｔ（２；８）（ｐ１２；ｑ２４）、ｔ（８；２２）（ｑ２４；ｑ１１）、ｔ（８；１４）（ｑ２４；ｑ１１）、およびｔ（８；１２）（ｑ２４；ｑ２２）などの転座と関連するＤＮＡである。他の例は、ＬＹＴ１０遺伝子に影響を及ぼす、ｔ（１０；１４）（ｑ２４；ｑ３２）を含み、Ｂ細胞リンパ腫と関連する（Nambiar (2008) Biochim Biophys Acta 1786: 139-152を参照されたい）。他の標的は、ＢＲＣＡ２（卵巣がん）、ＢＭＰ２、３、４、７（子宮内膜がん）、ＣＡＧＥ（子宮頸がん）、ＨＯＸＡ１０（卵巣がん）、およびさらなる標的など、がんと関連する突然変異体遺伝子を含む（Jeong et al (2014) Front Oncol 4(12)を参照されたい）。
場合によって、本発明の方法および組成物は、転写状態の変更を呈する、他の障害を検査するのに使用される。例は、糖尿病、メタボリックシンドローム（Hawkins et al (2018) Peer J 6; e5062）、ハンチントン病、および他の神経疾患（Xiang et al, (2018) Front Mol Neurosci 11:153）、およびがんを含む。場合によって、方法および組成物は、転写状態の変更により特徴づけられる障害の処置のために投与される治療に対する応答をモニタリングするのに使用される。場合によって、方法および組成物は、思春期、妊娠、または閉経の発生など、非疾患状態における、転写活性の変更をモニタリングするのに使用される。
試料
本明細書で記載される組成物、システム、および方法では、核酸（例えば、複数の核酸）を含む、任意の試料が使用されうる。本明細書では、「複数」という用語は、２つもしくはこれを超える数量を意味するように使用される。したがって、場合によって、試料は、２つもしくはこれを超える（例えば、３もしくはこれを超えるか、５もしくはこれを超えるか、１０もしくはこれを超えるか、２０もしくはこれを超えるか、５０もしくはこれを超えるか、１００もしくはこれを超えるか、５００もしくはこれを超えるか、１，０００もしくはこれを超えるか、または５，０００もしくはこれを超える）核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含む。対象の方法は、試料中に存在する（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸の、複雑な混合物中の）標的配列を検出するための、極めて高感度の方式として使用されうる。場合によって、試料は、配列が互いと異なる、５もしくはこれを超えるＲＮＡまたはＤＮＡ（例えば、１０もしくはこれを超えるか、２０もしくはこれを超えるか、５０もしくはこれを超えるか、１００もしくはこれを超えるか、５００もしくはこれを超えるか、１，０００もしくはこれを超えるか、または５，０００もしくはこれを超えるＲＮＡまたはＤＮＡ）を含む。場合によって、試料は、１０もしくはこれを超えるか、２０もしくはこれを超えるか、５０もしくはこれを超えるか、１００もしくはこれを超えるか、５００もしくはこれを超えるか、１０３もしくはこれを超えるか、５×１０３もしくはこれを超えるか、１０４もしくはこれを超えるか、５×１０４もしくはこれを超えるか、１０５もしくはこれを超えるか、５×１０５もしくはこれを超えるか、１０６もしくはこれを超えるか、５×１０６もしくはこれを超えるか、または１０７もしくはこれを超える、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む。場合によって、試料は、１０～２０、２０～５０、５０～１００、１００～５００、５００～１０３、１０３～５×１０３、５×１０３～１０４、１０４～５×１０４、５×１０４～１０５、１０５～５×１０５、５×１０５～１０６、１０６～５×１０６、または５×１０６～１０７、または１０７を超える、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む。場合によって、試料は、５～１０７のＲＮＡまたはＤＮＡ（例えば、配列が互いと異なる）（例えば、５～１０６、５～１０５、５～５０，０００、５～３０，０００、１０～１０６、１０～１０５、１０～５０，０００、１０～３０，０００、２０～１０６、２０～１０５、２０～５０，０００、または２０～３０，０００の、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含む。場合によって、試料は、配列が互いと異なる、２０またはこれを超えるＲＮＡまたはＤＮＡを含む。場合によって、試料は、細胞溶解物（例えば、真核細胞溶解物、哺乳動物細胞溶解物、ヒト細胞溶解物、原核細胞溶解物、植物細胞溶解物など）に由来するＲＮＡまたはＤＮＡを含む。例えば、場合によって、試料は、真核細胞、例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞などの細胞に由来するＲＮＡまたはＤＮＡを含む。
適切な試料は、唾液試料、血液試料、血清試料、血漿試料、尿試料、吸引試料、および生検試料を含むがこれらに限定されない。したがって、患者に関する、「試料」という用語は、血液および他の生体由来の液体試料、生検検体もしくは組織培養物、またはこれらに由来する細胞およびこれらの後代などの固体組織試料を包含する。定義はまた、それらの調達の後における、試薬を伴う処理によるか；洗浄されるか；またはがん細胞など、ある特定の細胞集団についてのエンリッチメントなど、任意の方式で操作された試料も含む。定義はまた、特定の種類の分子、例えば、ＤＮＡについてエンリッチされた試料も含む。「試料」という用語は、血液、血漿、血清、吸引物、脳脊髄液（ＣＳＦ）などの臨床試料などの生体試料を包含し、手術における切除により得られた組織、生検により得られた組織、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、組織試料、臓器、骨髄などもまた含む。「生体試料」は、これらに由来する体液（例えば、がん性細胞、感染細胞など）、例えば、このような細胞から得られるＤＮＡを含む試料（例えば、ＤＮＡを含む、細胞溶解物または他の細胞抽出物）を含む。
試料は、様々な細胞、組織、臓器、または無細胞体液のうちのいずれかを含みうるか、またはこれらから得られうる。適切な試料供給源は、真核細胞、細菌細胞、および古細菌細胞を含む。適切な試料供給源は、単細胞生物および多細胞生物を含む。適切な試料供給源は、単細胞真核生物；植物または植物細胞；藻類細胞、例えば、ポツリオコッカス・ブラウニイ（Botryococcus braunii）、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）、ナンノクロロプシス・ガディターナ（Nannochloropsis gaditana）、クロレラ・ピレノイドーサ（Chlorella pyrenoidosa）、ヤツマタモク（Sargassum patens；C. agardh）など；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；動物の細胞、組織、または臓器；非脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫、昆虫、クモ形類動物など）に由来する細胞、組織、または臓器；脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）に由来する細胞、組織、体液、または臓器；哺乳動物（例えば、ヒト；非ヒト霊長動物；有蹄類動物；ネコ；ウシ；ヒツジ；ヤギなど）に由来する細胞、組織、体液、または臓器を含む。適切な試料供給源は、線虫、原虫などを含む。適切な試料供給源は、蠕虫、マラリア寄生虫などの寄生虫を含む。
適切な試料供給源は、６つの界、例えば、細菌界（Bacteria（例えば、真正細菌界（Eubacteria））；古細菌界（Archaebacteria）；原生生物界（Protista）；真菌界（Fungi）；植物界（Plantae）；および動物界（Animalia）のうちのいずれかの細胞、組織、または生物を含む。適切な試料供給源は、藻類（例えば、緑色藻類、赤色藻類、灰色藻、藍藻）を含むがこれらに限定されない、原生生物界（Protista）の植物様メンバー；原生生物界（Protista）の真菌様メンバー、例えば、粘菌、水生菌など；原生生物界（Protista）の動物様メンバー、例えば、鞭毛虫（例えば、ミドリムシ属（Euglena））、アメーバ様原生動物（例えば、アメーバ）、胞子虫（例えば、アピコンプレックス門（Apicomplexa）、ミクソゾア亜門（Myxozoa）、微胞子虫門（Microsporidia））、および旋毛虫類（例えば、ゾウリムシ属（Paramecium））を含む。適切な試料供給源は、以下の門（ｐｈｙｌａ）：担子菌門（Basidiomycota）（ホウキタケ類；例えば、ハラタケ属（Agaricus）、テングダケ属（Amanita）、ヤマドリタケ属（Boletus）、アンズタケ属（Cantherellus）などのメンバー）；子嚢菌門（Ascomycota）（例えば、サッカロミケス属（Saccharomyces）を含む子嚢菌）；ミコフィコフィタ門（Mycophycophyta）（地衣類）；接合菌門（Zygomycota）（接合菌類）；および不完全菌門（Deuteromycota）のうちのいずれかのメンバーを含むがこれらに限定されない、真菌界（Fungi）のメンバーを含む。適切な試料供給源は、以下の門（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）：コケ植物門（Bryophyta）（例えば、蘇類）、ツノゴケ植物門（Anthocerotophyta）（例えば、ツノゴケ類）、ヘパティコフィタ門（Hepaticophyta）（例えば、苔類）、小葉植物門（Lycopodiophyta）（例えば、ヒカゲノカズラ類）、有節植物門（Sphenophyta）（例えば、トクサ類）、裸茎植物門（Psilophyta）（例えば、マツバラン類）、オフィオグロソフィタ門（Ophioglossophyta）、シダ門（Pterophyta）（例えば、シダ類）、ソテツ門（Cycadophyta）、イチョウ門（Ginkgophyta）、球果植物門（Pinophyta）、グネツム門（Gnetophyta）、および被子植物門（Magnoliophyta）（例えば、顕花植物類）のうちのいずれかのメンバーを含むがこれらに限定されない、植物界（Plantae）のメンバーを含む。適切な試料供給源は、以下の門：海綿動物門（Porifera）（海綿動物類）；平板動物門（Placozoa）；直泳動物門（Orthonectida）（海洋無脊椎動物類の寄生虫）；菱形動物門（Rhombozoa）；刺胞動物門（Cnidaria）（珊瑚類、アネモネ類、クラゲ、ウミエラ類、ウミシイタケ類、オーストラリアンウンバチクラゲ）；有櫛動物門（Ctenophora）（有櫛動物類）；扁形動物門（Platyhelminthes）（扁形動物類）；ひも形動物門（Nemertina）（ひも形動物類）；顎口動物門（Gnathostomulida）（顎口動物類）；腹毛動物門（Gastrotricha）；輪形動物門（Rotifera）；鰓曳動物門（Priapulida）；動吻動物門（Kinorhyncha）；胴甲動物門（Loricifera）；鈎頭虫門（Acanthocephala）；内肛動物門（Entoprocta）；線形動物門（Nematoda）；類線形動物門（Nematomorpha）；有輪動物門（Cycliophora）；軟体動物門（Mollusca）（軟体動物類）；星口動物門（Sipuncula）（星口動物類）；環形動物門（Annelida）（環形動物類）；緩歩動物門（Tardigrada）（緩歩動物類）；有爪動物門（Onychophora）（有爪動物類）；節足動物門（Arthropoda）（以下の亜門：鋏角亜門（Chelicerata）、多足亜門（Myriapoda）、六脚亜門（Hexapoda）、および甲殻亜門（Crustacea）を含み、ここで、鋏角亜門（Chelicerata）は、例えば、クモ形類動物類、節口綱（Merostomata）、およびウミグモ綱（Pycnogonida）を含み、多足亜門（Myriapoda）は、例えば、ムカデ綱（Chilopoda）（ムカデ類）、ヤスデ綱（Diplopoda）（ヤスデ類）、コムカデ綱（Paropoda）、および結合綱（Symphyla）を含み、六脚亜門（Hexapoda）は、昆虫を含み、甲殻亜門（Crustacea）は、エビ、オキアミ、フジツボ類などを含む）；箒虫動物門（Phoronida）；外肛動物門（Ectoprocta）（コケムシ類）；腕足動物門（Brachiopoda）；棘皮動物門（Echinodermata）（例えば、ヒトデ類、シャリンヒトデ類、ウミユリ類、ウニ類、ナマコ類、クモヒトデ類、テヅルモヅル類など）；毛顎動物門（Chaetognatha）（毛顎動物類）；半索動物門（Hemichordata）（キボシムシ類）；および脊索動物門（Chordata）のうちのいずれかのメンバーを含むがこれらに限定されない、動物界（Animalia）のメンバーを含む。脊索動物門（Chordata）の、適切なメンバーは、以下の亜門：尾索動物亜門（Urochordata）（ホヤ綱（Ascidiacea）、サルバ綱（Thaliacea）、および幼形綱（Larvacea）を含む ホヤ類）；頭索動物亜門（Cephalochordata）（ナメクジウオ類）；ヌタウナギ綱（Myxini）（ヌタウナギ）；ならびに脊椎動物亜門（Vertebrata）のメンバーが、例えば、ヤツメウナギ綱（Petromyzontida）（ヤツメウナギ類）、軟骨魚綱（Chondrichthyces）（軟骨魚類）、条鰭綱（Actinopterygii）（条鰭類）、輻鰭下綱（Actinistia）（シーラカンス類）、肺魚亜綱（Dipnoi）（肺魚）、爬虫綱（Reptilia）（爬虫類、例えば、ヘビ類、アリゲーター類、クロコダイル類、トカゲ類など）、鳥亜綱（Aves）（鳥類）；および哺乳動物綱（Mammalian）（哺乳動物）のメンバーを含む、脊椎動物亜門（Vertebrata）の任意のメンバーを含む。適切な植物は、任意の単子葉植物、および任意の双子葉植物を含む。
適切な試料の供給源は、生物から採取された、細胞、体液、組織、または臓器；生物から分離された、特定の細胞または細胞群などに由来する供給源を含む。例えば、生物が、植物である場合、適切な供給源は、木部、師部、形成層、葉、根などを含む。生物が、動物である場合、適切な供給源は、特定の組織（例えば、肺、肝臓、心臓、腎臓、脳、脾臓、皮膚、胎児組織など）、または特定の細胞型（例えば、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、星状細胞、マクロファージ、グリア細胞、膵島細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球など）を含む。
場合によって、試料の供給源は、例えば、ヒト対象の、罹患細胞、罹患体液、罹患組織、または罹患臓器である（またはこれらであることが疑われる）。場合によって、試料の供給源は、正常（非罹患）細胞、正常（非罹患）体液、正常（非罹患）組織、または正常（非罹患）臓器である。場合によって、試料の供給源は、病原体に感染した細胞、組織、または臓器である（またはこれらであることが疑われる）。例えば、試料の供給源は、感染している場合もあり、感染していない場合もある個体であることが可能であり、試料は、個体から回収された、任意の生体試料（例えば、血液、唾液、生検、血漿、血清、気管支肺胞洗浄液、痰、糞便試料、脳脊髄液、細針吸引物、スワブ試料（例えば、口腔スワブ、子宮頸部スワブ、鼻腔スワブ）、間質液、滑液、鼻漏、涙液、軟膜、粘膜試料、上皮細胞試料（例えば、上皮細胞掻爬試料）など）でありうるであろう。場合によって、試料は、無細胞液体試料である。場合によって、試料は、細胞を含みうる液体試料である。
試料中で検出される病原体は、ウイルス、細菌、真菌、蠕虫、原虫、マラリア寄生虫、プラスモジウム属（Plasmodium）寄生虫、トキソプラズマ属（Toxoplasma）寄生虫、住血吸虫属（Schistosoma）寄生虫などを含む。「蠕虫」は、回虫、大糸状虫、および草食性線虫（線形動物門（Nematoda））、吸虫（吸虫綱（Trematoda））、鈎頭虫門（Acanthocephala）、および条虫（条虫綱（Cestoda））を含む。原虫感染症は、ジアルジア属（Giardia）種、トリコモナス属（Trichomonas）種に由来する感染症、アフリカトリパノソーマ症、アメーバ赤痢、バベシア症、バランチジウム症、シャーガス病、コクシジウム症、マラリア、およびトキソプラズマ症を含む。寄生虫／原虫病原体などの病原体の例は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）、およびトキソプラズマ・ゴンディイ（Toxoplasma gondii）を含むがこれらに限定されない。真菌病原体は、クリプトコッカス・ヘオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラズマ・カスプラートゥム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、ブラストミセス・デルマティティディス（Blastomyces dermatitidis）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、およびカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）を含むがこれらに限定されない。病原性ウイルスは、例えば、コロナウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳなど）；免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）；インフルエンザウイルス；デング；西ナイルウイルス；ヘルペスウイルス；黄熱ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；Ａ型肝炎ウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；パピローマウイルスなどを含む。病原性ウイルスは、パポバウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス）；肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））；ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、リンパ向性ヘルペスウイルス、バラ色粃糠疹ウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）；アデノウイルス（例えば、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス、マスタデノウイルス、シアデノウイルス）；ポックスウイルス（例えば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘ウイルス、ウシ丘疹性口内炎ウイルス；タナポックスウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス；伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ））；パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、パルボウイルスＢ１９、ヒトボカウイルス、ブファウイルス、ヒトｐａｒｖ４ Ｇ１）；ジェミニウイルス科（Geminiviridae）；ナノウイルス科（Nanoviridae）；フィコドナウイルス科（Phycodnaviridae）などのＤＮＡウイルスを含みうる。病原体は、例えば、ＤＮＡウイルス［例えば、：パポバウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス）；肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））；ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、リンパ向性ヘルペスウイルス、バラ色粃糠疹ウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）；アデノウイルス（例えば、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス、マスタデノウイルス、シアデノウイルス）；ポックスウイルス（例えば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘ウイルス、ウシ丘疹性口内炎ウイルス；タナポックスウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス；伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ））；パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、パルボウイルスＢ１９、ヒトボカウイルス、ブファウイルス、ヒトｐａｒｖ４ Ｇ１）；ジェミニウイルス科（Geminiviridae）；ナノウイルス科（Nanoviridae）；フィコドナウイルス科（Phycodnaviridae）など］、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、大腸菌（Escherichia coli）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、肺炎球菌、クリプトコッカス・ヘオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラズマ・カスプラートゥム（Histoplasma capsulatum）、Ｂ型ヘルモフィルス・インフルエンゼ（Hemophilus influenzae）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、ライム病スピロヘータ、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、らい菌（Mycobacterium leprae）、ブルセラ・アボルトゥス（Brucella abortus）、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルス、ＩＩ型単純ヘルペスウイルス、ヒト血清パルボウイルス様ウイルス、ＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞性白血病ウイルス、エプスタイン－バーウイルス、マウスの白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス、疣贅ウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、サルウイルス４０、マウス乳腺腫瘍ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、トキソプラズマ・ゴンディイ（Toxoplasma gondii）、ランゲルトリパノソーマ（Trypanosoma rangeli）、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）、ローデシアトリパノソーマ（ブルーストリパノソーマ（Trypanosoma brucei） rhodesiense）、ブルーストリパノソーマ（Trypanosoma brucei）、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）、ウシバベシア（Babesia bovis）、ニワトリコクシジウム（Eimeria tenella）、回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）、リーシュマニア・トロピカ（Leishmania tropica）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、旋毛虫（Trichinella spiralis）、テイレリア・パルバ（Theileria parva）、胞状条虫（Taenia hydatigena）、ヒツジ条虫（Taenia ovis）、無鉤条虫（Taenia saginata）、単包条虫（Echinococcus granulosus）、ネズミ中殖条虫（Mesocestoides corti）、マイコプラズマ・アルトリティディス（Mycoplasma arthritidis）、Ｍ．ヒオルトニス（M. hyorhinis）、Ｍ．オラーレ（M. orale）、Ｍ．アルギニニー（M. arginini）、アコレプラズマ・レイドローウィイ（Acholeplasma laidlawii）、Ｍ．サリワリウム（M. salivarium）および肺炎マイコプラズマ（M. pneumoniae）を含みうる。
方法
したがって、本発明の方法は、（ａ）標的配列を潜在的に含む試料を、（ｉ）本明細書で記載される組成物またはシステムのうちのいずれかと接触させるステップと、（ｂ）検出用シグナルを測定し、これにより、標的配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を検出するステップとを含む。
場合によって、方法は、標的センサーが、非特異的ヌクレアーゼ（例えば、標的センサーが、Ｃａｓ１３エフェクタータンパク質を含む場合における、非特異的ＲＮアーゼ、または標的センサーが、Ｃａｓ１２エフェクタータンパク質を含む場合における、非特異的ＤＮアーゼ）へと活性化されるように、試料（例えば、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ）中の、所望の標的核酸配列（複数可）を認識する、１つまたは複数のガイドＲＮＡによりプログラム化された、１つまたは複数のＣａｓエフェクター酵素を含む標的センサーを接触させるステップを含む。ある特定の場合には、標的センサーは、１つのＣａｓエフェクタータンパク質と、１つのガイドＲＮＡとを含む。方法はまた、活性化標的センサー（非特異的ヌクレアーゼ）を、検出用標識と、増幅活性化配列とを含み、非特異的ヌクレアーゼによる切断の前には、検出用標識は、遮蔽されて（消光させられて）おり、増幅活性化分子は、ケージ化されている（ハイブリダイゼーションが不可能である）、レポーター分子と接触させるステップも含む。切断されると、検出用標識（例えば、蛍光標識）、および増幅活性化分子のいずれもが放出される。その後、放出された増幅活性化因子は、プログラム化されたＣａｓエフェクタータンパク質と、ガイドＲＮＡとを含むシグナル増幅因子のガイドＲＮＡに結合し（とハイブリダイズし）、レポーター分子を切断し、レポーター複合体から、検出用標識および増幅活性化分子を放出することが可能な、さらなる非特異的ヌクレアーゼを活性化する。方法はまた、検出用標識を測定するステップと、任意選択で、レベルを定量するステップとも含む。
接触させるステップと、測定するステップとは、液体中および／または固体支持体内の、同じ容器内で実施される場合もあり、異なる容器内で実施される場合もある。例えば、接触させるステップが、同じ容器内で実施され、検出のために移される場合もあり、代替的に、接触させるステップと、測定するステップとが、同じ容器内で実施される場合もある。
アッセイ混合物は、試料中に存在する場合に、標的核酸配列が、ガイドＲＮＡとハイブリダイズすることを可能とする、多様な条件下でインキュベートしうる。一部の実施形態では、条件は、ＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションの一助となるようにデザインされ、配列は、１００％相補性である。他の実施形態では、アッセイ混合物のインキュベーションのための条件は、ガイドＲＮＡ配列と、標的配列との間の１００％未満の相補性、例えば、標的核酸と、ガイドＲＮＡとの間の、１つのミスマッチ、または約２つ未満のミスマッチ、３つ未満のミスマッチ、４つ未満のミスマッチ、もしくは５つ未満のミスマッチを可能とするように変動しうる。一部の実施形態では、標的ＲＮＡと、ガイドＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションは、相補性が、約８０％を超える場合に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の非特異的ＲＮアーゼ活性を活性化しうる。
対象の方法の接触させるステップは、二価金属イオンを含む組成物中で実行されうる。接触させるステップは、例えば、細胞外の無細胞環境内で実行されうる。接触させるステップは、細胞内で実行されうる。接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞内で実行されうる。接触させるステップは、ｅｘ ｖｉｖｏの細胞内で実行されうる。接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞内で実行されうる。
接触させるステップは、測定するステップの前における、２時間またはこれ未満（例えば、１．５時間もしくはこれ未満、１時間もしくはこれ未満、４０分間もしくはこれ未満、３０分間もしくはこれ未満、２０分間もしくはこれ未満、１０分間もしくはこれ未満、または５分間もしくはこれ未満、または１分間もしくはこれ未満）を含むがこれらに限定されない、任意の長さの時間にわたる、接触させるステップでありうる。例えば、場合によって、試料は、測定するステップの前に、４０分間またはこれ未満にわたり接触させられる。場合によって、試料は、測定するステップの前に、２０分間またはこれ未満にわたり接触させられる。場合によって、試料は、測定するステップの前に、１０分間またはこれ未満にわたり接触させられる。場合によって、試料は、測定するステップの前に、５分間またはこれ未満にわたり接触させられる。場合によって、試料は、測定するステップの前に、１分間またはこれ未満にわたり接触させられる。場合によって、試料は、測定するステップの前に、５０秒間～６０秒間にわたり接触させられる。場合によって、試料は、測定するステップの前に、４０秒間～５０秒間にわたり接触させられる。場合によって、試料は、測定するステップの前に、３０秒間～４０秒間にわたり接触させられる。場合によって、試料は、測定するステップの前に、２０秒間～３０秒間にわたり接触させられる。場合によって、試料は、測定するステップの前に、１０秒間～２０秒間にわたり接触させられる。一部の実施形態では、試料は、Ｃａｓタンパク質と共に、約２時間、９０分間、６０分間、４０分間、３０分間、２０分間、１０分間、５分間、４分間、３分間、２分間、１分間、５５秒間、５０秒間、４０秒間、３０秒間、２０秒間、または１０秒間未満であり、かつ、約５秒間、１０秒間、２０秒間、３０秒間、４０秒間、５０秒間、６０秒間、２分間、３分間、４分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、または９０分間を超える時間にわたりインキュベートされる。
方法は、約３０℃～約３０℃（またはこの間の任意の温度）を含む、任意の温度で行われうる。一部の実施形態では、アッセイ（方法）は、生理学的温度、例えば、約３７℃で行われる。これは、方法が、診察室または自宅（例えば、体温を使用して（例えば、アッセイを、腋下に含有させて、皮膚に対して保持するなどして）アッセイを実施することにより）を含む、任意の場所で、たやすく実施されることを可能とする。一部の実施形態では、アッセイ（方法）は、６０～６５℃で行われる。
本明細書で記載される方法は、標的配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を、高感度で検出しうる。場合によって、本開示の方法は、複数のヌクレオチド（標的配列と、複数の非標的配列とを含む）を含む試料中に存在する標的配列を検出するのに使用される場合があり、この場合、標的配列は、非標的配列１０７個当たり１つもしくは複数のコピー（例えば、非標的配列１０６個当たり１つもしくは複数のコピー、非標的配列１０５個当たり１つもしくは複数のコピー、非標的配列１０４個当たり１つもしくは複数のコピー、非標的配列１０３個当たり１つもしくは複数のコピー、非標的配列１０２個当たり１つもしくは複数のコピー、非標的配列５０個当たり１つもしくは複数のコピー、非標的配列２０個当たり１つもしくは複数のコピー、非標的配列１０個当たり１つもしくは複数のコピー、または非標的配列５個当たり１つもしくは複数のコピー）で存在する。場合によって、本開示の方法は、複数の配列（標的配列と、複数の非標的配列とを含む）を含む試料中に存在する標的配列を検出するのに使用される場合があり、この場合、標的配列は、非標的配列１０１８個当たり１つもしくは複数のコピー（例えば、非標的配列１０１５個当たり１つもしくは複数のコピー、非標的配列１０１２個当たり１つもしくは複数のコピー、非標的配列１０９個当たり１つもしくは複数のコピー、非標的配列１０６個当たり１つもしくは複数のコピー、非標的配列１０５個当たり１つもしくは複数のコピー、非標的配列１０４個当たり１つもしくは複数のコピー、非標的配列１０３個当たり１つもしくは複数のコピー、非標的配列１０２個当たり１つもしくは複数のコピー、非標的配列５０個当たり１つもしくは複数のコピー、非標的配列２０個当たり１つもしくは複数のコピー、非標的配列１０個当たり１つもしくは複数のコピー、または非標的配列５個当たり１つもしくは複数のコピー）で存在する。
場合によって、本開示の方法は、試料中に存在する標的配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を検出することが可能であり、この場合、標的配列は、非標的配列１０７個当たり１コピー～非標的配列１０個当たり１コピー（例えば、非標的配列１０７個当たり１コピー～非標的配列１０２個当たり１コピー、非標的配列１０７個当たり１コピー～非標的配列１０３個当たり１コピー、非標的配列１０７個当たり１コピー～非標的配列１０４個当たり１コピー、非標的配列１０７個当たり１コピー～非標的配列１０５個当たり１コピー、非標的配列１０７個当たり１コピー～非標的配列１０６個当たり１コピー、非標的配列１０６個当たり１コピー～非標的配列１０個当たり１コピー、非標的配列１０６個当たり１コピー～非標的配列１０２個当たり１コピー、非標的配列１０６個当たり１コピー～非標的配列１０３個当たり１コピー、非標的配列１０６個当たり１コピー～非標的配列１０４個当たり１コピー、非標的配列１０６個当たり１コピー～非標的配列１０５個当たり１コピー、非標的配列１０５個当たり１コピー～非標的配列１０個当たり１コピー、非標的配列１０５個当たり１コピー～非標的配列１０２個当たり１コピー、非標的配列１０５個当たり１コピー～非標的配列１０３個当たり１コピー、または非標的配列１０５個当たり１コピー～非標的配列１０４個当たり１コピー）で存在する。
場合によって、本開示の方法は、試料中に存在する標的配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を検出することが可能であり、この場合、標的配列は、非標的配列１０１８個当たり１コピー～非標的配列１０個当たり１コピー（例えば、非標的配列１０１８個当たり１コピー～非標的配列１０２個当たり１コピー、非標的配列１０１５個当たり１コピー～非標的配列１０２個当たり１コピー、非標的配列１０１２個当たり１コピー～非標的配列１０２個当たり１コピー、非標的配列１０９個当たり１コピー～非標的配列１０２個当たり１コピー、非標的配列１０７個当たり１コピー～非標的配列１０２個当たり１コピー、非標的配列１０７個当たり１コピー～非標的配列１０３個当たり１コピー、非標的配列１０７個当たり１コピー～非標的配列１０４個当たり１コピー、非標的配列１０７個当たり１コピー～非標的配列１０５個当たり１コピー、非標的配列１０７個当たり１コピー～非標的配列１０６個当たり１コピー、非標的配列１０６個当たり１コピー～非標的配列１０個当たり１コピー、非標的配列１０６個当たり１コピー～非標的配列１０２個当たり１コピー、非標的配列１０６個当たり１コピー～非標的配列１０３個当たり１コピー、非標的配列１０６個当たり１コピー～非標的配列１０４個当たり１コピー、非標的配列１０６個当たり１コピー～非標的配列１０５個当たり１コピー、非標的配列１０５個当たり１コピー～非標的配列１０個当たり１コピー、非標的配列１０５個当たり１コピー～非標的配列１０２個当たり１コピー、非標的配列１０５個当たり１コピー～非標的配列１０３個当たり１コピー、または非標的配列１０５個当たり１コピー～非標的配列１０４個当たり１コピー）で存在する。
場合によって、本開示の方法は、試料中に存在する標的配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を検出することが可能であり、この場合、標的配列は、非標的配列１０７個当たり１コピー～非標的配列１００個当たり１コピー（例えば、非標的配列１０７個当たり１コピー～非標的配列１０２個当たり１コピー、非標的配列１０７個当たり１コピー～非標的配列１０３個当たり１コピー、非標的配列１０７個当たり１コピー～非標的配列１０４個当たり１コピー、非標的配列１０７個当たり１コピー～非標的配列１０５個当たり１コピー、非標的配列１０７個当たり１コピー～非標的配列１０６個当たり１コピー、非標的配列１０６個当たり１コピー～非標的配列１００個当たり１コピー、非標的配列１０６個当たり１コピー～非標的配列１０２個当たり１コピー、非標的配列１０６個当たり１コピー～非標的配列１０３個当たり１コピー、非標的配列１０６個当たり１コピー～非標的配列１０４個当たり１コピー、非標的配列１０６個当たり１コピー～非標的配列１０５個当たり１コピー、非標的配列１０５個当たり１コピー～非標的配列１００個当たり１コピー、非標的配列１０５個当たり１コピー～非標的配列１０２個当たり１コピー、非標的配列１０５個当たり１コピー～非標的配列１０３個当たり１コピー、または非標的配列１０５個当たり１コピー～非標的配列１０４個当たり１コピー）で存在する。
場合によって、試料中の標的配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を検出する、対象の方法のための検出閾値は、１０ｎＭまたはこれ未満である。本明細書では、「検出閾値」という用語は、検出が生じるために、試料中に存在しなければならない標的配列の最小量について記載するのに使用される。したがって、例示的な例として述べると、検出閾値が、１０ｎＭである場合、シグナルは、標的配列が、試料中に、１０ｎＭまたはこれを超える濃度で存在する場合に検出されうる。場合によって、本開示の方法は、５ｎＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、１ｎＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、０．５ｎＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、０．１ｎＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、０．０５ｎＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、０．０１ｎＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、０．００５ｎＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、０．００１ｎＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、０．０００５ｎＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、０．０００１ｎＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、０．００００５ｎＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、０．００００１ｎＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、１０ｐＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、１ｐＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、５００ｆＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、２５０ｆＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、１００ｆＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、５０ｆＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、５００ａＭ（アットモル）またはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、２５０ａＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、１００ａＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、５０ａＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、１０ａＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、１ａＭまたはこれ未満の検出閾値を有する。
場合によって、検出閾値（対象の方法において、標的配列を検出するための）は、５００ｆＭ～１ｎＭ（例えば、５００ｆＭ～５００ｐＭ、５００ｆＭ～２００ｐＭ、５００ｆＭ～１００ｐＭ、５００ｆＭ～１０ｐＭ、５００ｆＭ～１ｐＭ、８００ｆＭ～１ｎＭ、８００ｆＭ～５００ｐＭ、８００ｆＭ～２００ｐＭ、８００ｆＭ～１００ｐＭ、８００ｆＭ～１０ｐＭ、８００ｆＭ～１ｐＭ、１ｐＭ～１ｎＭ、１ｐＭ～５００ｐＭ、１ｐＭ～２００ｐＭ、１ｐＭ～１００ｐＭ、または１ｐＭ～１０ｐＭ）（ここで、濃度は、標的配列が検出されうる、標的配列の閾値濃度を指す）の範囲である。場合によって、本開示の方法は、８００ｆＭ～１００ｐＭの範囲の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、１ｐＭ～１０ｐＭの範囲の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、１０ｆＭ～５００ｆＭの範囲の検出閾値、例えば、１０ｆＭ～５０ｆＭ、５０ｆＭ～１００ｆＭ、１００ｆＭ～２５０ｆＭ、または２５０ｆＭ～５００ｆＭを有する。
場合によって、標的配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が、試料中で検出されうる、最小濃度は、５００ｆＭ～１ｎＭ（例えば、５００ｆＭ～５００ｐＭ、５００ｆＭ～２００ｐＭ、５００ｆＭ～１００ｐＭ、５００ｆＭ～１０ｐＭ、５００ｆＭ～１ｐＭ、８００ｆＭ～１ｎＭ、８００ｆＭ～５００ｐＭ、８００ｆＭ～２００ｐＭ、８００ｆＭ～１００ｐＭ、８００ｆＭ～１０ｐＭ、８００ｆＭ～１ｐＭ、１ｐＭ～１ｎＭ、１ｐＭ～５００ｐＭ、１ｐＭ～２００ｐＭ、１ｐＭ～１００ｐＭ、または１ｐＭ～１０ｐＭ）の範囲である。場合によって、標的配列が、試料中で検出されうる、最小濃度は、８００ｆＭ～１００ｐＭの範囲である。場合によって、標的配列が、試料中で検出されうる、最小濃度は、１ｐＭ～１０ｐＭの範囲である。
場合によって、検出閾値（標的配列を検出するための）は、１ａＭ～１ｎＭ（例えば、１ａＭ～５００ｐＭ、１ａＭ～２００ｐＭ、１ａＭ～１００ｐＭ、１ａＭ～１０ｐＭ、１ａＭ～１ｐＭ、１００ａＭ～１ｎＭ、１００ａＭ～５００ｐＭ、１００ａＭ～２００ｐＭ、１００ａＭ～１００ｐＭ、１００ａＭ～１０ｐＭ、１００ａＭ～１ｐＭ、２５０ａＭ～１ｎＭ、２５０ａＭ～５００ｐＭ、２５０ａＭ～２００ｐＭ、２５０ａＭ～１００ｐＭ、２５０ａＭ～１０ｐＭ、２５０ａＭ～１ｐＭ、５００ａＭ～１ｎＭ、５００ａＭ～５００ｐＭ、５００ａＭ～２００ｐＭ、５００ａＭ～１００ｐＭ、５００ａＭ～１０ｐＭ、５００ａＭ～１ｐＭ、７５０ａＭ～１ｎＭ、７５０ａＭ～５００ｐＭ、７５０ａＭ～２００ｐＭ、７５０ａＭ～１００ｐＭ、７５０ａＭ～１０ｐＭ、７５０ａＭ～１ｐＭ、１ｆＭ～１ｎＭ、１ｆＭ～５００ｐＭ、１ｆＭ～２００ｐＭ、１ｆＭ～１００ｐＭ、１ｆＭ～１０ｐＭ、１ｆＭ～１ｐＭ、５００ｆＭ～５００ｐＭ、５００ｆＭ～２００ｐＭ、５００ｆＭ～１００ｐＭ、５００ｆＭ～１０ｐＭ、５００ｆＭ～１ｐＭ、８００ｆＭ～１ｎＭ、８００ｆＭ～５００ｐＭ、８００ｆＭ～２００ｐＭ、８００ｆＭ～１００ｐＭ、８００ｆＭ～１０ｐＭ、８００ｆＭ～１ｐＭ、１ｐＭ～１ｎＭ、１ｐＭ～５００ｐＭ、１ｐＭ～２００ｐＭ、１ｐＭ～１００ｐＭ、または１ｐＭ～１０ｐＭ）（ここで、濃度は、標的配列が検出されうる、標的配列の閾値濃度を指す）の範囲である。場合によって、本開示の方法は、１ａＭ～８００ａＭの範囲の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、５０ａＭ～１ｐＭの範囲の検出閾値を有する。場合によって、本開示の方法は、５０ａＭ～５００ｆＭの範囲の検出閾値を有する。
場合によって、標的配列が、試料中で検出されうる、最小濃度は、１ａＭ～１ｎＭ（例えば、１ａＭ～５００ｐＭ、１ａＭ～２００ｐＭ、１ａＭ～１００ｐＭ、１ａＭ～１０ｐＭ、１ａＭ～１ｐＭ、１００ａＭ～１ｎＭ、１００ａＭ～５００ｐＭ、１００ａＭ～２００ｐＭ、１００ａＭ～１００ｐＭ、１００ａＭ～１０ｐＭ、１００ａＭ～１ｐＭ、２５０ａＭ～１ｎＭ、２５０ａＭ～５００ｐＭ、２５０ａＭ～２００ｐＭ、２５０ａＭ～１００ｐＭ、２５０ａＭ～１０ｐＭ、２５０ａＭ～１ｐＭ、５００ａＭ～１ｎＭ、５００ａＭ～５００ｐＭ、５００ａＭ～２００ｐＭ、５００ａＭ～１００ｐＭ、５００ａＭ～１０ｐＭ、５００ａＭ～１ｐＭ、７５０ａＭ～１ｎＭ、７５０ａＭ～５００ｐＭ、７５０ａＭ～２００ｐＭ、７５０ａＭ～１００ｐＭ、７５０ａＭ～１０ｐＭ、７５０ａＭ～１ｐＭ、１ｆＭ～１ｎＭ、１ｆＭ～５００ｐＭ、１ｆＭ～２００ｐＭ、１ｆＭ～１００ｐＭ、１ｆＭ～１０ｐＭ、１ｆＭ～１ｐＭ、５００ｆＭ～５００ｐＭ、５００ｆＭ～２００ｐＭ、５００ｆＭ～１００ｐＭ、５００ｆＭ～１０ｐＭ、５００ｆＭ～１ｐＭ、８００ｆＭ～１ｎＭ、８００ｆＭ～５００ｐＭ、８００ｆＭ～２００ｐＭ、８００ｆＭ～１００ｐＭ、８００ｆＭ～１０ｐＭ、８００ｆＭ～１ｐＭ、１ｐＭ～１ｎＭ、１ｐＭ～５００ｐＭ、１ｐＭ～２００ｐＭ、１ｐＭ～１００ｐＭ、または１ｐＭ～１０ｐＭ）の範囲である。場合によって、標的配列が、試料中で検出されうる、最小濃度は、１ａＭ～５００ｐＭの範囲である。場合によって、標的配列が、試料中で検出されうる、最小濃度は、１００ａＭ～５００ｐＭの範囲である。
場合によって、対象の組成物または方法は、アットモル（ａＭ）単位の検出感度を呈する。場合によって、対象の組成物または方法は、フェムトモル（ｆＭ）単位の検出感度を呈する。場合によって、対象の組成物または方法は、ピコモル（ｐＭ）単位の検出感度を呈する。場合によって、対象の組成物または方法は、ナノモル（ｎＭ）単位の検出感度を呈する。
測定するステップは、場合によって、例えば、検出されるシグナルの量が、試料中に存在する標的配列の量を決定するのに使用されうるという意味で、定量的でありうる。測定するステップは、場合によって、例えば、検出用シグナルの存在または非存在が、標的配列（例えば、ウイルス、ＳＮＰなど）の存在または非存在を指し示しうるという意味で、定性的でありうる。場合によって、標的配列（複数可）（例えば、ウイルス、ＳＮＰなど）が、特定の閾値濃度を上回って存在しない限りにおいて、検出用シグナルは、存在しないであろう（例えば、所与の閾値レベルを上回って）。場合によって、検出閾値は、システム（例えば、センサーまたは増幅）のＣａｓエフェクタータンパク質、ガイドＲＮＡ、試料容量、および／または検出剤（検出剤が使用される場合）の量を変更することにより滴定されうる。このように、例えば、当業者により理解される通り、所望の場合、各々が、標的配列の異なる閾値レベルを検出するように用意される、１つまたは複数の反応を用意し、これにより、試料中に存在する標的配列の量を決定するのに、このような一連の反応が使用されうる（例えば、標的配列が、試料中に、「少なくともＸの濃度で」存在することを決定するのに、このような一連の反応を使用しうるであろう）ために、多数の対照が使用されうる。
場合によって、本開示の方法は、試料（例えば、標的配列と、複数の非標的配列とを含む試料）中の、標的配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の量を決定するのに使用されうる。試料中の標的配列の量の決定は、被検試料から発生した検出用シグナルの量を、参照試料から発生した検出用シグナルの量と比較するステップを含みうる。試料中の標的配列の量の決定は、検出用シグナルを測定して、被験測定値を生成するステップと；参照試料によりもたらされる検出用シグナルを測定して、参照測定値を生成するステップと；被験測定値を、参照測定値と比較して、試料中に存在する標的配列の量を決定するステップを含みうる。
本明細書で記載される方法では、ＲＮアーゼ阻害剤が使用される場合がある。一部の実施形態では、アッセイ混合物は、非Ｃａｓ１３ａ依存性ＲＮアーゼ活性は阻害するが、活性化Ｃａｓ１３ａタンパク質によるＲＮアーゼ活性には影響を及ぼさない、１つまたは複数の分子を含みうる。例えば、阻害剤は、限定せずに述べると、ＲＮアーゼＡおよびＲＮアーゼＨなどの、哺乳動物ＲＮアーゼ、細菌ＲＮアーゼ、またはウイルスＲＮアーゼを阻害しうる。一部の実施形態では、ＲＮアーゼ阻害剤は、標的核酸配列を保存する一助となるように、試料へと添加されうる。これらの実施形態では、方法は、１つまたは複数のＲＮＡ保存化合物、例えば、１つまたは複数のＲＮアーゼ阻害剤を、試料へと添加するステップを含みうる。
標識の検出は、当技術分野で公知の、多様な方式で達成されうる。例えば、比色標識、蛍光標識、または発光標識の検出は、特定の波長における吸光または発光の測定により達せられうる。一部の実施形態では、シグナルは、目視、顕微鏡、または光の検出により検出されうる。
キット
本開示は、例えば、複数の配列を含む試料中の、標的ヌクレオチド配列を検出するためのキットを提示する。場合によって、キットは、本明細書で記載される、１つまたは複数のＮＣＲ組成物またはＮＣＲシステムを含む。陽性対照および／または陰性対照もまた、組み入れられる場合があり、かつ／または使用のための指示書もまた、組み入れられうる。
[実施例１]
ヌクレアーゼ連鎖反応による、コロナウイルスＤＮＡの検出
ヌクレアーゼ連鎖反応（ＮＣＲ）を伴わない検出と、合成標的配列（「一次活性化因子」）を使用する、本明細書で記載されるＮＣＲシステムとを比較する実験を行った。特に、蛍光シグナルをもたらす非特異的切断活性を誘発する一次活性化複合体により検出される一次活性化配列を使用する、本明細書で記載されるＮＣＲシステムにより、アッセイを行った（図１Ａを参照されたい）。非特異的切断活性が、ケージ化活性化ＲＮＡから、ケージを放出すると、一次活性化複合体の活性化に加えて、シグナル増幅複合体の活性化もまた生じうる（図１Ｂ）。場合によって、Ｃｓｍ６を介する、さらなる活性化も生じる。ある場合には、一次活性化複合体が、Ｃａｓ１３タンパク質を含むＲＮＰである（図１Ｃ）のに対し、他の場合には、一次活性化複合体は、Ｃａｓ１２タンパク質を含む（図１Ｄ）。Ｃａｓ１２を、一次活性化法で使用する場合、一次活性化分子が、ＲＮＡであるならば、一次活性化核酸を、ＲＴ－ＬＡＭＰにかけうる。これらのシステムのいずれも、シグナルをブーストする、Ｃｓｍ６の使用を含みうる。Ｃｓｍ６のためのケージ化活性化因子は、それ自体またはＣａｓ１３による未成熟切断を防止するように修飾されうる（例えば、２’－ＯＭｅ、２’－Ｈ、２’－Ｆ）、配列の５’末端において、４つまたは６つのアデノシン（Ａ４またはＡ６）を含むであろう。Ｃｓｍ６活性化因子はまた、その３’末端において、基質をケージ化する、さらなる切断可能なＡまたはＵも有する。ケージ化の解除は、Ａ４＞ＰまたはＡ６＞Ｐを作出して、Ｃｓｍ６を活性化するように、３’側のＲＮＡヌクレオチドをトリミングすることにより達せられるであろう。基質をケージ化するのに使用される３’－ヌクレオチドのアイデンティティーは、非ケージ化のために使用されるＣａｓ酵素のヌクレオチド優先性に応じて変動しうる。例えば、１つの潜在的な基質は、５’－ｆＡ－ｆＡ－ｆＡ－ＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号１）［配列中、ｆＡヌクレオチドは、２’－Ｆ修飾を有し、末端の６つのＡは、Ｃｓｍ６またはＬｂａＣａｓ１３により切断されうるであろう］でありうるであろう。
場合によって、一次活性化複合体が、Ｃａｓ１３タンパク質と、一次活性化ＲＮＡに特異的なガイドとを含むＲＮＰであるのに対し、シグナル増幅複合体はまた、Ｃａｓ１３タンパク質と、活性化ＲＮＡに特異的なガイドとを含むＲＮＰも含む（図１Ｅ）。場合によって、一次活性化複合体は、Ｃａｓ１２タンパク質と、ＲＴ－ＬＡＭＰを使用して作製される、一次活性化ＲＮＡに特異的なガイドとを含むＲＮＰである。シグナル活性化複合体はまた、Ｃａｓ１２タンパク質および活性化ＤＮＡに特異的なガイドも含む（図１Ｆ）。いずれの場合にも、Ｃｓｍ６による増幅もまた利用されうる。
場合によって、一次活性化複合体は、Ｃａｓ１３を含み、ケージ化ガイドＲＮＡが使用される。ある場合には、ケージは、ガイド分子の３’末端上にあるが、他の場合には、ケージは、ガイドの５’末端上にある（図１Ｅ）。ある場合には、活性化ＲＮＡがケージ化される（図１Ｆ、戦略１）が、他の場合には、活性化ＲＮＡおよび／または増幅因子ガイドがケージ化される（図１Ｆ、戦略２）。いずれの場合にも、ケージは、分子の５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端に存在しうる。ケージはまた、Ｃｓｍ６による増幅と共に使用される、核酸活性化因子上で使用されうる。
多様な活性化ＲＮＡについて、一次活性化因子の存在下または非存在下で調べた。加えて、ＮＣＲ能を伴わないアッセイもまた、活性化ＲＮＡ配列および一次活性化複合体を欠く実験（図２における、「二次活性化なし」）で行った。これらの実験では、一次活性化因子と、活性化ＲＮＡ配列とは、同じであり、対照実験の、下記の表２Ａにおける配列Ｒ００４であった。被験活性化ＲＮＡは、全て、増幅経路の、最良の誘導を結果としてもたらし、一次活性化因子の非存在下における活性化を阻止する、ケージ構造を決定するように、異なるケージ化配列へと連結された、同じ配列を含有した。この実験で使用された配列を、下記の表２Ａに提示する。注：「ケージなし」の表示は、ケージ構造を欠く核酸を同定する。
Figure 2023527768000003
表示される全ての反応物について、１倍濃度の緩衝液：２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）、５０ｍＭのＫＣＬ、１００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．０１％のＩｇｅｐａｌとした。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）が、ガイドＲＮＡを合成し、１倍濃度の緩衝液を使用して、５μＭの反応物中で、活性化ＲＮＡをアセンブルし、サーモサイクラー内、９５℃で、３分間にわたり煮沸するのに続き、氷上で速やかに冷却して、フォールディングさせた。１μＭのＣａｓ１３、および０．５μＭのｃｒＲＮＡによる、２：１のタンパク質対ｃｒＲＮＡ比を使用して、一次活性化ＲＮＡをターゲティングするＣａｓ１３－ｃｒＲＮＡ複合体と、増幅ＲＮＡをターゲティングするＣａｓ１３－ｃｒＲＮＡ複合体とを、１倍濃度の緩衝液中、室温で、１０分間にわたり、個別にアセンブルした。次いで、ケージ化増幅因子をターゲティングするＲＮＰ複合体を、一次活性化因子をターゲティングするＲＮＰと混合し、２００ｎＭのＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ基質（ＩＤＴ ＤＮＡ）、２０ｎＭの増幅ＲＮＡ、および変動量の一次活性化因子（１ｎＭ～１ａＭ）の存在下で、１倍濃度の緩衝液を使用して、さらに希釈した。最終濃度を５０ｎＭとする、一次活性化因子をターゲティングするＲＮＰと、最終濃度を１ｎＭ～５０ｎＭとする、増幅ＲＮＡをターゲティングするＲＮＰを使用した。反応物を、蛍光プレートリーダー内、３７℃で、最長１２０分間インキュベートし、３０秒ごとに蛍光を測定した（励起波長：４８５ｎｍ；発光波長：５３５ｎｍ）。
図２に示される通り、査定された、異なる活性化ＲＮＡ中、ＮＣＲ＿０６１が、活性化因子の存在下におけるシグナルと、活性化因子を伴わないシグナルとの間で、最大の差違を示した。さらに、ＮＣＲシステムは、合成標的配列による検出用シグナルの、一次活性化因子を欠く実験におけるシグナルと比較した、差違増大を示した。ＮＣＲ＿４５およびＮＣＲ＿４２は、増幅の非存在下（「一次活性化のみ」）のシグナルと、活性化工程および増幅工程の両方が行われている場合（「ケージ＋一次」）のシグナルとの間における、ある程度のシグナル差を示した。ＮＣＲ＿６７は、示差的シグナルを呈さなかった。ＮＣＲ＿０６１は、一次活性化および増幅の両方が行われた場合（「ＮＣＲ０６１増幅」）に、一次活性化シグナルのみにより観察可能なデータ（「一次活性化のみ」）から隔たった、迅速な増幅をもたらした。ＮＣＲ＿０６１増幅経路のみ（「ＮＣＲ０６１ケージのみ」）の使用は、活性化＋増幅と比較した、シグナルの遅延をもたらした。
図３Ａ～３Ｄは、時間経過にわたり、４つの被験活性化ＲＮＡ（ＮＣＲ＿４２、ＮＣＲ＿４５、ＮＣＲ＿６１、およびＮＣＲ＿６７）を使用する実験の結果が、異なる範囲の結果を示したことを示す（図３）。
添加される一次活性化ＲＮＰ複合体の濃度を変動させることにより、シグナルの、さらなる最適化を行った（図４Ａ）。この実験では、２００ｐＭの一次活性化複合体を使用する場合に、時間経過にわたる測定が、迅速なシグナルの発生を示した（図４Ｂ）。終了時点において、一次活性化因子のみ、および一次活性化＋ＮＣＲを使用する増幅について検出されたシグナルは、類似のシグナルを示した（図４Ｃ）が、時間経過にわたり測定したところ、一次活性化＋ＮＣＲによる実験は、より迅速なシグナルの上昇を示した（図４Ｄ）。
抗タグ配列を含む活性化ＲＮＡについてもまた調べた。一次活性化および活性化ＲＮＡ単独により駆動されるシグナルが、一次活性化＋ＮＣＲをはるかに下回るように、抗タグ配列を、ＮＣＲ＿０６１に組み入れた（図５Ａ～５Ｅ）。
代替的ケージ化構造を含むＮＣＲ＿０６１配列に基づく活性化ＲＮＡをデザインし、これについて調べた。ＮＣＲ＿１７６活性化ＲＮＡは、３つのさらなるポリＵ配列を含み、ＮＣＲ＿１７７は、６つのさらなるポリＵ配列を含む。これらの実験では、Ｃａｓ１２を、一次センシング複合体内で使用する一方で、Ｃａｓ１３を、増幅複合体内で使用した。ＬｂｕＣａｓ１３ａを、Ｃａｓ１３構成要素のために使用し、そのトランスＲＮアーゼ活性による、潜在的な認識および切断の増大のために、ポリＵ配列の増大を組み入れた。結果（図５Ａ～５Ｅ）は、ＬｂｕＣａｓ１３ａより、より容易に放出される、ケージ化活性化因子を使用する場合における、シグナルの増大を示す。
別のケージ化増幅ｃｒＲＮＡの使用について調べるＮＣＲ反応もまた実施した。非ケージ化ガイドおよびケージ化ガイドのための配列のほか、他の被験配列を、下記の表２Ｂに示す。
Figure 2023527768000004
ケージ化増幅ｃｒＲＮＡである、ＮＣＲ＿０１８の使用は、非ケージ化増幅ｃｒＲＮＡ ＮＣＲ＿００９と比較した、シグナルのブーストを裏付けた（図６Ａ～６Ｃを参照されたい）。バックグラウンドシグナル（一次活性化因子の非存在下におけるシグナル、およびケージ化増幅ｃｒＲＮＡのみによるシグナル）を差し引くと、検出の増大が観察される。
さらに、ケージ化増幅ｃｒＲＮＡおよびＣａｓ１３単独の存在下で観察されるバックグラウンドシグナルを低減しようとする試みにおいて、多様な代替的ケージ化構造についても調べた。例示的結果を、図７に示すが、ここでは、バックグラウンドを差し引いたシグナルの、ある程度の改善が観察された。
ケージ化構造内の、ループのサイズについてもまた調べた。融点の異なるループを含む、ケージ化ｃｒＲＮＡについて調べた（図８を参照されたい）。結果は、融点の最も低いケージ構造が、最も迅速なシグナルの発生を示すことを裏付けた。例えば、ＮＣＲ＿０３８は、融点を３４℃とする、１４ヌクレオチドの一本鎖ループを含み、非ケージ化活性化ＲＮＡ（ＮＣＲ＿０３５）と同様のシグナル動態を裏付けた。この実験では、ＮＣＲ＿０３９（１２ヌクレオチドループ）およびＮＣＲ＿０３６（１２ヌクレオチドループ）は、緩徐なシグナル動態を裏付けた。
システムでは、トランスケージについてもまた調べた。活性化Ｃａｓ複合体のトランスヌクレアーゼ活性による潜在的な切断のための、異なる一本鎖領域を含む、いくつかのトランスケージ（表２Ｂを参照されたい）を、Ｃａｓ１３ａ ｃｒＲＮＡのために合成した。トランスケージは、ｃｒＲＮＡと複合体化している場合に、異なる位置において、一本鎖ループを生じさせるように構築した（図９Ａを参照されたい）。次いで、トランスケージ分子について、使用されるｃｒＲＮＡに対する比を変動させて調べた（例えば、２０：１、２：１、１：１、および１：２の、トランスケージ：ｃｒＲＮＡ比）。結果は、２：１、１：１、および１：２の比では、バックグラウンドシグナルが、依然として検出されたので、この実験では、非特異的バックグラウンドシグナルの阻害は、２０：１の比の場合に限り検出されることを裏付けた（図９Ｂを参照されたい）。
[実施例２]
Ｃａｓ１３－ガイドＲＮＡ複合体は標的ｓｓＲＮＡ配列を認識し、これは、この複合体を、ＲＮＡ切断のために活性化する。標的ｓｓＲＮＡは、ＳＡＲＳ－Ｃｏ－Ｖ２に特異的な配列である。また、汎コロナウイルス特異的（「汎コロナ」）である標的ｓｓＲＮＡにより試行される実験も組み入れる。これらの配列の例を、下記の表３に示す。また、特異的標的配列を同定するのに使用されうる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ遺伝子およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｅ遺伝子の配列も示す。
Figure 2023527768000005
Figure 2023527768000006
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムをターゲティングするＣａｓ１３ａと共に使用するためのガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を調製する。例示的ガイド配列を、下記の表４に示す。
Figure 2023527768000007
Figure 2023527768000008
Figure 2023527768000009
表４によるガイド配列のサブセット（ＮＣＲ＿２７３～ＮＣＲ＿２８２）について調べるために、標準的プロトコールに従うｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により、一連のガイドＲＮＡを作製する。これらの配列はまた、ＲＰＡ増幅およびＲＴ－ＬＡＭＰ－Ｔ７増幅を可能とするように、Ｔ７プロモーター配列も含む。例示的配列（ＮＣＲ＿３１７～ＮＣＲ＿３２６）を、表５に示すが、表中、下線を付した部分は、Ｔ７プロモーター配列を同定する。加えて、また、システムについて調べるように、合成の一次活性化配列または標的配列も作出する。表５によるガイドＲＮＡについて調べるのに使用される例示的配列（ＮＣＲ＿３２７～ＮＣＲ＿３３６）を、表６に示す。
Figure 2023527768000010
Figure 2023527768000011
実施例１で記載された条件下で、合成一次活性化配列と、合成ｃｒＲＮＡとを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、実験を実施し、ＮＣＲシステムが、一次活性化配列を検出することを裏付ける。
場合によって、特異的活性化複合体（例えば、Ｃａｓ１３を含む）による切断前のレポーターオリゴを保護するケージ化構造を含む、修飾レポーター分子を使用する。例示的配列を、下記の表７に示す。「／５６－ＦＡＭ」とは、５’側６－ＦＡＭ（フルオレセイン）分子を意味し、「／３ＩＡＢｋＦＱ」とは、３’側Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ消光剤（ＩＤＴ）である。配列は、本発明の方法および組成物と共に使用され、バックグラウンドシグナルの低減を呈する。
Figure 2023527768000012
合成試薬を使用するシステムの実証後、標準的プロトコールに従い、患者試料を処理する。例えば、健常ドナーおよび患者から、鼻咽頭スワブを収集する。一部の実施形態では、唾液試料を得る。Ｑｉａｇｅｎ ＤＳＰ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）、およびＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ２４測定器（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ＣＤＣ ＥＵＡ承認プロトコール（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ Ｐａｎｅｌ ｆｏｒ 検出 ２０１９－ｎＣｏＶ（ＵＳ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、２０２０）；インプット：１２０μｌ、溶出：１２０μｌ）に記載される指示に従い、試料ＲＮＡｏｆＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を抽出する。場合によって、患者スワブを、特異的ウイルス不活化緩衝液（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｈｉｅｌｄ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、またはＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）（Ｌｕｃｉｇｅｎ））、または輸送用緩衝液（例えば、ＰＢＳ－Ａｚｉｄｅ）へと挿入する。Ｃａｓ１３センサー複合体の初期相互作用は、ＮＣＲイベントを誘発する、ケージ化活性化因子またはケージ化ガイド分子の切断イベントをもたらす。ここで、Ｃｓｍ６のための、Ａ４活性化配列を、ウラシルにより挟まれた、増幅Ｃａｓ酵素の、ケージ化ｃｒＲＮＡ内のヘアピンループに組み入れる。
Ｃａｓ１３による、ループ上のさらなる切断イベントは、Ａ４＞Ｐを遊離させ、これが、ＴｔＣｓｍ６に結合し、ＲＮアーゼ活性を活性化する。活性化の後、Ｃｓｍ６は、検出用標識、ならびに残存する、任意の、非ケージ化ｃｒＲＮＡの一本鎖ヘアピンループ、の両方を切断し、ＮＣＲを、さらに活性化する。
ＤＮＡ標的を検出するために、Ｃａｓ１３ではなくＣａｓ１２のケージ化ｃｒＲＮＡ内に存在するフランキングＵを伴うＡ４配列を使用して、同様の実験を実施する。
検出用標識は、Ｆ／Ｑレポーターでありうる。使用される蛍光レポーターは、ＡまたはＣを含みうるが、また、Ｃａｓ１３（Ｕ）またはＣａｓ１２（デオキシヌクレオチド）の活性に必要な、さらなるヌクレオチドも有しうる。この戦略はまた、ケージ化ｃｒＲＮＡ内のヘアピンループの、Ａの数を、４から６へと変化させることにより、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）Ｃｓｍ６（ＳｅＣｓｍ６）など、Ａ６＞Ｐに応答するＣｓｍ６相同体によっても使用されうるであろう。
[実施例３]
本発明の方法および組成物と共に使用されうるタンパク質の配列である。
Ｃａｓ１３ａ配列
ＬｓｈＣａｓ１３ａ：ＷＰ＿０１８４５１５９５．１（Abudayyeh,O.O., (2016) Science 353 (6299), aaf5573）
Figure 2023527768000013
ＬｗａＣａｓ１３ａ：ＷＰ＿０２１７４６７７４．１（仮説的タンパク質）
Figure 2023527768000014
ＬｓｅＣａｓ１３ａ：ＷＰ＿０１２９８５４７７．１（Liu, L. et al (2017) Cell 170 (4), 714-726）
Figure 2023527768000015
ＬｂｍＣａｓ１３ａ：ＷＰ＿０４４９２１１８８．１（仮説的タンパク質）
Figure 2023527768000016
ＬｂｎＣａｓ１３ａ：ＷＰ＿０２２７８５４４３．１（Liu, L. et al, Cell 170 (4), 714-726）
Figure 2023527768000017
ＣａｍＣａｓ１３ａ：ＷＰ＿０３１４７３３４６．１（仮説的タンパク質）
Figure 2023527768000018
ＣｇａＣａｓ１３ａ：ＷＰ＿０３４５６０１６３．１（仮説的タンパク質）
Figure 2023527768000019
Ｃｇａ２Ｃａｓ１３ａ：ＷＰ＿０３４５６３８４２．１（仮説的タンパク質）
Figure 2023527768000020
ＰｐｒＣａｓ１３ａ：ＷＰ＿０１３４４３７１０．１（Liu, L. et al, Cell 170 (4), 714-726）
Figure 2023527768000021
ＬｗｅＣａｓ１３ａ：ＷＰ＿０３６０５９１８５．１（仮説的タンパク質）
Figure 2023527768000022
ＬｎｅＣａｓ１３ａ：ＷＰ＿０３６０９１００２．１（仮説的タンパク質）
Figure 2023527768000023
Ｌｗａ２Ｃａｓ１３ａ：ＷＰ＿０２１７４６７７４．１（仮説的タンパク質）
Figure 2023527768000024
ＲｃｓＣａｓ１３ａ：ＷＰ＿０１３０６７７２８．１（仮説的タンパク質）
Figure 2023527768000025
ＲｃｒＣａｓ１３ａ：ＷＰ＿０２３９１１５０７．１（仮説的タンパク質）
Figure 2023527768000026
ＲｃｄＣａｓ１３ａ：ＷＰ＿０２３９１１５０７．１（仮説的タンパク質）
Figure 2023527768000027
ＬｂｕＣａｓ１３ａ：ＷＰ＿０１５７７０００４（Liu, L. et al, Cell 170 (4), 714-726）
Figure 2023527768000028
ＲｃａＣａｓ１３ａ：ＥＴＤ７６９３４．１（Ding, H. et al (2014) Genome Announc 2 (1), e00050-14）
Figure 2023527768000029
ＥｒｅＣａｓ１３ａ：ＷＰ＿０５５０６１０１８．１（仮説的タンパク質）
Figure 2023527768000030
ＨｈｅＣａｓ１３ａ：ＣＲＺ３５５５４．１ （Ｄａｎｉｅｌ Ｗｉｂｂｅｒｇによる直接的寄託）
Figure 2023527768000031
ＬｂａＣａｓ１３ａ：ＷＰ＿０２２７８５４４３．１（Liu, L. et al, Cell 170 (4), 714-726）
Figure 2023527768000032
Ｃａｓ１３ｄ
［エウバクテリウム・］シレウム（［Eubacterium］siraeum）ＤＳＭ １５７０２株によるＥＳＣａｓ１３ｄ
Figure 2023527768000033
非培養型ルミノコッカス属（Ruminococcus）種によるＵＲＣａｓ１３ｄ（ＰＤＢ：６ＩＶ９＿Ａ）
Figure 2023527768000034
Ｃａｓ１２ａ配列
ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）菌（ＬｂＣａｓ１２ａ）
Figure 2023527768000035
アシドアミノコッカス属（Acidaminococcus）種ＢＶ３Ｌ６株（Ｃａｓ１２ａ）
Figure 2023527768000036
フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）（ＦｎＣａｓ１２ａ）
Figure 2023527768000037
ポルフィロモナス・マカセ（Porphyromonas macacae）Ｃａｓ１２ａ
Figure 2023527768000038
モラクセラ・ボウォクリ（Moraxella bovoculi）２３７株Ｃａｓ１２ａ
Figure 2023527768000039
チオミクロスピラ属（Thiomicrospira）種ＸＳ５株Ｃａｓ１２ａ
Figure 2023527768000040
ブチリビブリオ属（Butyrivibrio）種ＮＣ３００５株Ｃａｓ１２ａ
Figure 2023527768000041
ブルミミクロビウム・アウランティアクム（Brumimicrobium aurantiacum）Ｃａｓ１２ａ
Figure 2023527768000042
ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Porphyromonas crevioricanis）Ｃａｓ１２ａ
Figure 2023527768000043
フランシセラ・トゥラレンシス（Francisella tularensis）Ｃａｓ１２ａ（ＦｔＣａｓ１２ａ）
Figure 2023527768000044
エウバクテリウム・ウェントゥリオースム（Eubacterium ventriosum）Ｃａｓ１２ａ
Figure 2023527768000045
Ｃａｓ１２ｂ配列
アィシクロバチルス・アシドデレストリス（Alicyclobacillus acidoterrestris）Ｃａｓ１２ｂ
Figure 2023527768000046
アィシクロバチルス・カケガウェンシス（Alicyclobacillus kakegawensis）Ｃａｓ１２ｂ
Figure 2023527768000047
アィシクロバチルス・マクロスポランギイドゥス（Alicyclobacillus macrosporangiidus）Ｃａｓ１２ｂ
Figure 2023527768000048
アィシクロバチルス・エスペリドゥム（Alicyclobacillus hesperidum）Ｃａｓ１２ｂ
Figure 2023527768000049
スルフォバチルス・テルモトレランス（Sulfobacillus thermotolerans）Ｃａｓ１２ｂ
Figure 2023527768000050
Ｃａｓ１２ｃ（ｃ２ｃ３）配列
Ｃａｓ１２ｃ１（Yan et al (2019) Science Vol. 363, Issue 6422, pp. 88-91を参照されたい）
Figure 2023527768000051
Ｃａｓ１２ｃ２（Yan et al (2019) Science Vol. 363, Issue 6422, pp. 88-91を参照されたい）
Figure 2023527768000052
Ｃａｓ１２ｃ３（Yan et al (2019) Science Vol. 363, Issue 6422, pp. 88-91を参照されたい）
Figure 2023527768000053
Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）配列
カタノバクテリア群（Katanobacteria）候補Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ．１）：ＭＯＥＨ０１００００２９
Figure 2023527768000054
フォーゲルバクテリア群（Vogelbacteria）候補Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ．２）：ＭＯＥＪ０１００００２８
Figure 2023527768000055
フォーゲルバクテリア群（Vogelbacteria）候補Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ．３）：ＭＯＥＫ０１０００００６
Figure 2023527768000056
パルクバクテリア群（Parcubacteria）候補Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ．４）：ＫＹ０４０２４２
Figure 2023527768000057
コメイリバクテリア群（Komeilibacteria）候補Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ．５）：ＭＯＥＩ０１００００２２
Figure 2023527768000058
ケルフェルトバクテリア群（Kerfeldbacteria）候補Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ．６）：ＭＨＫＤ０１００００３６
Figure 2023527768000059
Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）
＞デルタプロテオバクテリア（Deltaproteobacteria）綱細菌（ＧＷＡ２＿４３＿１９）Ｃａｓ１２ｅ１（ＣａｓＸ１）
Figure 2023527768000060
＞プランクトミケス（Planctomycetes）門細菌Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ２）
Figure 2023527768000061
＞Ｃａｓ１２ｅ３（ＣａｓＸ３）
Figure 2023527768000062
Ｃａｓ１２Ｊ
Ｃａｓ１２Ｊ＿１９４７４５５
Figure 2023527768000063
Ｃａｓ１２Ｊ＿２０７１２４２
Figure 2023527768000064
Ｃａｓ１２Ｊ＿１９７３６４０
Figure 2023527768000065
Ｃａｓ１２Ｊ＿３３３９３８０
Figure 2023527768000066
Ｃａｓ１２Ｊ＿１００３７０４２＿３
Figure 2023527768000067
Ｃａｓ１２Ｊ＿１００２０９２１＿９
Figure 2023527768000068
Ｃａｓ１２Ｊ＿１００００００２＿４７
Figure 2023527768000069
Ｃａｓ１２Ｊ＿１０１００７６３＿４
Figure 2023527768000070
Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００４１４９＿１０
Figure 2023527768000071
Ｃａｓ１２Ｊ＿１００００７２４＿７１
Figure 2023527768000072
Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００００１＿２６７
Figure 2023527768000073
Ｃａｓ１２Ｊ＿１００００２８６＿５３
Figure 2023527768000074
Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００１２８３＿７
Figure 2023527768000075
Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００００２＿１１２
Figure 2023527768000076
Ｃａｓ１２Ｊ＿１００００５０６＿８
Figure 2023527768000077
Ｃａｓ１２Ｊ＿１０００００７＿１４３
Figure 2023527768000078
Ｃａｓ１２Ｊ＿３８７７１０３＿１６
Figure 2023527768000079
Ｃａｓ１２Ｊ＿８７７６３６＿１２
Figure 2023527768000080
Ｃａｓ１２Ｌ配列
＞Ｃａｓ１２Ｌ＿１＿２５７９０５５０８
Figure 2023527768000081
＞Ｃａｓ１２Ｌ＿２＿１９６８４８７５３
Figure 2023527768000082
＞Ｃａｓ１２Ｌ＿３＿６６７４１１６７
Figure 2023527768000083
＞Ｃａｓ１２Ｌ＿４＿６７０３１１６３
Figure 2023527768000084
＞Ｃａｓ１２Ｌ＿５＿６７７９３３５１
Figure 2023527768000085
＞Ｃａｓ１２Ｌ＿９＿６８４５４１２４
Figure 2023527768000086
＞Ｃａｓ１２Ｌ＿１０＿６８６０５３１３
Figure 2023527768000087
＞Ｃａｓ１２Ｌ＿１３＿６９７３３２１４
Figure 2023527768000088
＞Ｃａｓ１２Ｌ＿１５＿７０７２４７４３
Figure 2023527768000089
＞Ｃａｓ１２Ｌ＿１６＿７０７３１０３８
Figure 2023527768000090
＞Ｃａｓ１２Ｌ＿１７＿７０９５９３９１
Figure 2023527768000091
＞Ｃａｓ１２Ｌ＿１８＿７１０７８０８６
Figure 2023527768000092
＞Ｃａｓ１２Ｌ＿２２＿７１４５６６８７
Figure 2023527768000093
＞Ｃａｓ１２Ｌ＿２３＿７１７０８９７１
Figure 2023527768000094
Ｃａｓ１４ａ配列
＞Ｃａｓ１４ａ．１｜ｒｉｆｃｓｐｈｉｇｈｏ２＿０２＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿２１６７＿ｃｕｒａｔｅｄ｜３０２９６．．３１７９８｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000095
＞Ｃａｓ１４ａ．２｜ｇｗａ２＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１８０２７＿ｃｕｒａｔｅｄ｜７１０５．．８６２８
Figure 2023527768000096
＞Ｃａｓ１４ａ．３｜ｇｗａ１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１７９５＿ｃｕｒａｔｅｄ｜２５６３５．．２７２２４｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000097
＞Ｃａｓ１４ａ．４｜ＣＧ１０＿ｂｉｇ＿ｆｉｌ＿ｒｅｖ＿８＿２１＿１４＿０．１０＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿２０９０６＿ｃｕｒａｔｅｄ｜６４９．．２８２９
Figure 2023527768000098
＞Ｃａｓ１４ａ．５｜ｒｉｆｃｓｐｌｏｗｏ２＿０１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿３４４６１＿ｃｕｒａｔｅｄ｜４９６８．．６５２１
Figure 2023527768000099
＞Ｃａｓ１４ａ．６｜３３０００１２３５９．ａ｜Ｇａ０１３７３８５＿１００００１５６｜４１２８９．．４２７３４
Figure 2023527768000100
Ｃａｓ１４ｂ配列
＞Ｃａｓ１４ｂ．１０｜ＣＧ０８＿ｌａｎｄ＿８＿２０＿１４＿０．２０＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１６０９＿ｃｕｒａｔｅｄ｜６１３４．．７９７５
Figure 2023527768000101
＞Ｃａｓ１４ｂ．１１｜ＣＧ＿４＿１０＿１４＿０．８＿ｕｍ＿ｆｉｌｔｅｒ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿２０７６２＿ｃｕｒａｔｅｄ｜１３７２．．３２１９
Figure 2023527768000102
＞Ｃａｓ１４ｂ．１２｜ＣＧ２２＿ｃｏｍｂｏ＿ＣＧ１０－１３＿８＿２１＿１４_ａｌｌ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿２００３＿ｃｕｒａｔｅｄ｜５５３．．２８８０｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000103
＞Ｃａｓ１４ｂ．１３｜ｒｉｆｃｓｐｈｉｇｈｏ２＿０１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿８２３６７＿ｃｕｒａｔｅｄ｜１５２３．．３８５６｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000104
＞Ｃａｓ１４ｂ．１４｜ｇｗｃ１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿８７３２＿ｃｕｒａｔｅｄ｜２７０５．．４５３７
Figure 2023527768000105
＞Ｃａｓ１４ｂ．１５｜３３０００１０２９３．ａ｜Ｇａ０１１６２０４＿１００８５７４｜２１３４．．４０３２
Figure 2023527768000106
＞Ｃａｓ１４ｂ．１６｜３３００００５５７３．ａ｜Ｇａ００７８９７２＿１００１０１５ａ｜３３７５０．．３５６２７
Figure 2023527768000107
＞Ｃａｓ１４ｂ．１｜ｒｉｆｃｓｐｌｏｗｏ２＿０１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿２３９＿ｃｕｒａｔｅｄ｜５４６５３．．５６２５７
Figure 2023527768000108
＞Ｃａｓ１４ｂ．２｜ｒｉｆｃｓｐｌｏｗｏ２＿０１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿２８２＿ｃｕｒａｔｅｄ｜７７３７０．．７８９８３
Figure 2023527768000109
＞Ｃａｓ１４ｂ．３｜ｒｉｆｃｓｐｈｉｇｈｏ２＿０１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿３６７８１＿ｃｕｒａｔｅｄ｜２５９２．．４２１７
Figure 2023527768000110
＞Ｃａｓ１４ｂ．４｜ｃｇ１＿０．２＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿７８５＿ｃ＿ｃｕｒａｔｅｄ｜３２５２１．．３４１５５
Figure 2023527768000111
＞Ｃａｓ１４ｂ．５｜ｒｉｆｃｓｐｈｉｇｈｏ２＿０２＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿５５５８９＿ｃｕｒａｔｅｄ｜１９０４．．３５９８
Figure 2023527768000112
＞Ｃａｓ１４ｂ．６｜ＣＧ０３＿ｌａｎｄ＿８＿２０＿１４＿０．８０＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿２２１４＿ｃｕｒａｔｅｄ｜６６３４．．８４６６｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000113
＞Ｃａｓ１４ｂ．７｜３３０００１３１２５．ａ｜Ｇａ０１７２３６９＿１００００７３７｜９９４．．２６５２｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000114
＞Ｃａｓ１４ｂ．８｜３３０００１３１２５．ａ｜Ｇａ０１７２３６９＿１００１０４６４｜８８５．．２４８９｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000115
＞Ｃａｓ１４ｂ．９｜３３０００１３１２７．ａ｜Ｇａ０１７２３６５＿１０００４４２１｜６３３．．２３６６｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000116
Ｃａｓ１４ｃ配列
＞Ｃａｓ１４ｃ．１｜ＣＧ１０＿ｂｉｇ＿ｆｉｌ＿ｒｅｖ＿８＿２１＿１４＿０．１０＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿４４７７＿ｃｕｒａｔｅｄ｜１９３２７．．２０８８０｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000117
＞Ｃａｓ１４ｃ．２｜３３００００１２４５．ａ｜ＪＧＩ１２０４８Ｊ１３６４２＿１０２０１２８６｜４２５７．．５４８９｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000118
Ｃａｓ１４ｄ配列
＞Ｃａｓ１４ｄ．１｜ＲＩＦＣＳＰＨＩＧＨＯ２＿０１＿ＦＵＬＬ＿ＣＰＲ＿４６＿３６＿ｒｉｆｃｓｐｈｉｇｈｏ２＿０１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿６４６＿ｃｕｒａｔｅｄ｜４９８０８．．５１６１６｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000119
＞Ｃａｓ１４ｄ．２｜ｒｉｆｃｓｐｈｉｇｈｏ２＿０１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１０９８１＿ｃｕｒａｔｅｄ｜５７６２．．７２４６｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000120
＞Ｃａｓ１４ｄ．３｜ＲＩＦＣＳＰＬＯＷＯ２＿０１＿ＦＵＬＬ＿ＯＤ１＿４５＿３４ｂ＿ｒｉｆｃｓｐｌｏｗｏ２＿０１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿３４９５＿ｃｕｒａｔｅｄ｜２５６５６．．２７６０５｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000121
Ｃａｓ１４ｅ配列
＞Ｃａｓ１４ｅ．１｜ｒｉｆｃｓｐｈｉｇｈｏ２＿０１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿５６６＿ｃｕｒａｔｅｄ｜１１３０６９．．１１４３１３
Figure 2023527768000122
＞Ｃａｓ１４ｅ．２｜ｒｉｆｃｓｐｌｏｗｏ２＿０１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿８１２３１＿ｃｕｒａｔｅｄ｜９７６．．２２１７
Figure 2023527768000123
＞Ｃａｓ１４ｅ．３｜ｒｉｆｃｓｐｈｉｇｈｏ２＿０１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿４７０２＿ｃｕｒａｔｅｄ｜８２８８１．．８４２３０｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000124
Ｃａｓ１４ｆ配列
＞Ｃａｓ１４ｆ．１｜ｒｉｆｃｓｐ１３＿１＿ｓｕｂ１０＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿３＿ｃｕｒａｔｅｄ｜３８９０６．．４１０４１
Figure 2023527768000125
＞Ｃａｓ１４ｆ．２｜３３００００９９９１．ａ｜Ｇａ０１０５０４２＿１００１４０｜１６２４．．３３４８
Figure 2023527768000126
Ｃａｓ１４ｇ配列
＞Ｃａｓ１４ｇ．１｜ＲＢＧ＿１３＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１４０１＿ｃｕｒａｔｅｄ｜１５９４９．．１８１８０
Figure 2023527768000127
＞Ｃａｓ１４ｇ．２｜３３００００９６５２．ａ｜Ｇａ０１２３３３０＿１０１０３９４｜２８１４．．５１２３
Figure 2023527768000128
Ｃａｓ１４ｈ配列
＞Ｃａｓ１４ｈ．１｜３３００００５６０２．ａ｜Ｇａ００７０７６２＿１０００１７４０｜７３７７．．９０７１｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000129
＞Ｃａｓ１４ｈ．２｜３３００００５９２１．ａ｜Ｇａ００７０７６６＿１００１１９１２｜３８４．．２０８１
Figure 2023527768000130
＞Ｃａｓ１４ｈ．３｜３３００００９６９８．ａ｜Ｇａ０１１６２１６＿１００００９０５｜８００５．．９５０４
Figure 2023527768000131
Ｃａｓ１４ｉ配列
＞Ｇａ００６６８６８＿１００１６２７５２
Figure 2023527768000132
＞ＰｈａｇｅＣａｓ１４＿ＳＲ－ＶＰ＿２－４＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１４１＿２５４８３２９＿９２
Figure 2023527768000133
＞ＰｈａｇｅＣａｓ１４＿ＳＲ－ＶＰ＿４－６＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１４１＿３６４０６８９＿５
Figure 2023527768000134
Ｃａｓ１４Ｊ配列
＞ＰｈａｇｅＣａｓ１４Ｊ＿ｋ８７＿９３７４２４７＿１６
Figure 2023527768000135
＞ＰｈａｇｅＣａｓ１４Ｊ＿ＬａｃＰａｖｉｎ＿０８１８＿ＷＣ４０＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿４０７２０１＿２０５
Figure 2023527768000136
＞ＰｈａｇｅＣａｓ１４Ｊ＿ＢＭＬ＿０８０４２０１６＿６＿５ｍ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１８＿ｐｒｏｄｉｇａｌ－ｓｉｎｇｌｅ＿５４
Figure 2023527768000137
＞Ｇａ０１９４１１９＿１０００１１３８２３
Figure 2023527768000138
＞Ｇａ０１１６１９７＿１０００５４５８
Figure 2023527768000139
＞Ｇａ０１１６１７９＿１０４２６８８１
Figure 2023527768000140
＞Ｇａ０２６８２８５＿１００６２０９５
Figure 2023527768000141
Ｃａｓ１４Ｋ配列
＞ＰｈａｇｅＣａｓ１４＿ＲｉｆＳｅｄ
Figure 2023527768000142
＞ＰｈａｇｅＣａｓ１４＿１６ｆｔ＿４＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿２＿４６５＿１６ｆｔ＿４＿Ｐｈａｇｅ＿２９＿１３
Figure 2023527768000143
＞Ｇａ０１１６１７９＿１０１０９３２２
Figure 2023527768000144
＞Ｇａ０１１６１７９＿１０４６５７８２
Figure 2023527768000145
＞Ｇａ０１３４１０１＿１０１６５７５２
Figure 2023527768000146
＞Ｇａ００６６６６５＿１００８１５６３２
Figure 2023527768000147
＞Ｇａ０２２４５２３＿１００７０５１２
Figure 2023527768000148
＞Ｇａ０２４７８３９＿１０５８３９９４
Figure 2023527768000149
Ｃａｓ１４ｕ配列
＞Ｃａｓ１４ｕ９｜ＰｈａｇｅＣａｓ１４｜ＬａｃＰａｖｉｎ＿０８１８＿ＷＣ５５＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿５６３４４＿ｐｒｏｄｉｇａｌ－ｓｉｎｇｌｅ＿１６
Figure 2023527768000150
＞Ｃａｓ１４ｕ１０｜Ｇａ０１５３７９８＿１００５２２２０１
Figure 2023527768000151
＞Ｃａｓ１４ｕ＿ＶＵ＿ｕ１１｜ｒｉｆｃｓｐｌｏｗｏ２＿１２＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿２３＿ｐｒｏｄｉｇａｌ－ｓｉｎｇｌｅ＿２３
Figure 2023527768000152
＞Ｃａｓ１４ｕ＿ＶＵ＿ｕ１２｜ＳＲ－ＶＰ＿４－６＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１４１＿２６３０３５７＿５０９
Figure 2023527768000153
＞Ｃａｓ１４ｕ＿ＶＵ＿ｕ１３｜ｇｗｄ１＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１５５４＿３
Figure 2023527768000154
＞Ｃａｓ１４ｕ＿ＶＵ＿ｕ１４｜ｐｉｇ＿Ｆ１００＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１３３８８＿４
Figure 2023527768000155
＞Ｃａｓ１４ｕ＿ＶＵ＿ｕ１５｜ｐｉｇ＿ＩＤ＿３６４０＿Ｆ６５＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿７３７６２＿２
Figure 2023527768000156
＞Ｃａｓ１４ｕ＿ＶＵ＿ｕ１６｜ｐｉｇ＿ＩＤ＿１８５１＿Ｆ４０＿２＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿５５１２６＿１
Figure 2023527768000157
＞Ｃａｓ１４ｕ＿ＶＵ＿ｕ１７｜ｐｉｇ＿ＩＤ＿３７８４＿Ｆ９６＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１３５０９＿１０
Figure 2023527768000158
＞Ｃａｓ１４ｕ＿ＶＵ＿ｕ１８｜ＳＲＲ１７４７０６５＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿２８
Figure 2023527768000159
＞Ｃａｓ１４ｕ．１｜３３００００９０２９．ａ｜Ｇａ００６６７９３＿１００１００９１｜３７．．１１１３｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000160
＞Ｃａｓ１４ｕ．２｜３３００００２１７２．ａ｜ＪＧＩ２４７３０Ｊ２６７４０＿１００２７８５｜４９６．．１６０５｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000161
＞Ｃａｓ１４ｕ．３｜１９ｆｔ＿２＿ｎｏｐｈａｇｅ＿ｎｏｋｎｏｗｎ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿０＿ｃｕｒａｔｅｄ｜５０８１８８．．５０９６４８
Figure 2023527768000162
＞Ｃａｓ１４ｕ．４｜ｒｉｆｃｓｐ２＿１９＿４＿ｆｕｌｌ＿ｓｃａｆｆｏｌｄ＿１６８＿ｃｕｒａｔｅｄ｜８４４５５．．８５６５７
Figure 2023527768000163
＞Ｃａｓ１４ｕ．５｜３３０００１２５３２．ａ｜Ｇａ０１３７３７３＿１００００３１６｜３２８６．．５２８６
Figure 2023527768000164
＞Ｃａｓ１４ｕ．６｜３３００００６０２８．ａ｜Ｇａ００７０７１７＿１０００００７７｜５４５１９．．５６２０１｜ｒｅｖｃｏｍ
Figure 2023527768000165
＞Ｃａｓ１４ｕ．７｜３３００００１２５６．ａ｜ＪＧＩ１２２１０Ｊ１３７９７＿１０００４６９０｜５７９２．．７００６
Figure 2023527768000166
＞Ｃａｓ１４ｕ．８｜３３００００５６６０．ａ｜Ｇａ００７３９０４＿１００２１６５１｜７６５．．１９４３
Figure 2023527768000167

Claims (37)

  1. ｉ）検出用標識を含み、レポーター分子が切断されると、前記検出用標識が、検出のために放出される、レポーター分子；
    ｉｉ）第１の認識複合体を含む一次活性化複合体；および
    ｉｉｉ）不活性の二次複合体
    を含む核酸検出システムであって、
    ａ）前記第１の認識複合体が、試料中の、１つまたは複数の一次活性化因子を認識し；
    ｂ）前記一次活性化因子を認識すると、前記一次活性化複合体が、活性化され、前記検出用標識を放出させるように、前記レポーター分子に作用することが可能であり；
    ｃ）活性化シグナル増幅因子となるように第２の認識複合体を活性化するように、前記活性化一次活性化複合体が、不活性の第２の認識複合体の構成要素に作用することが可能であり；
    ｄ）前記活性化シグナル増幅因子が、前記検出用標識を放出させるように、前記レポーター分子に作用することが可能であり；
    ｅ）フィード－フォワードループが開始されるよう、活性化シグナル増幅因子となるように前記第２の認識複合体を活性化するように、前記活性化シグナル増幅因子が、不活性の第２の認識複合体の構成要素に作用することが可能である、
    核酸検出システム。
  2. 検出用標識を含み、レポーター分子が切断されると、前記検出用標識が、検出のために放出される、レポーター分子；
    第１のガイドＲＮＡによりプログラム化された、第１のＣａｓエフェクター酵素を含み、前記第１のガイドＲＮＡが、試料中の、１つまたは複数の一次活性化因子を認識し、前記第１のガイドＲＮＡの、前記一次活性化因子へのハイブリダイゼーション時に、一次活性化複合体が、活性化され、前記レポーター分子を切断し、前記検出用標識を放出する非特異的ヌクレアーゼである一次活性化複合体；ならびに
    第２のＣａｓエフェクター酵素と、第２のガイドＲＮＡとを含み、前記一次活性化複合体の活性化が、前記第２のガイドＲＮＡにより認識される、１つまたは複数の活性化配列の前記活性化を結果としてもたらし、前記第２のガイドＲＮＡの、前記活性化配列へのハイブリダイゼーション時に、シグナル増幅複合体が、活性化され、前記レポーター分子を切断し、前記検出用標識を放出する非特異的ヌクレアーゼである、シグナル増幅因子
    を含む核酸検出システム。
  3. 第１のＣａｓエフェクター酵素、および／または第２のＣａｓエフェクター酵素が、活性化された場合に、非特異的ＲＮアーゼおよび／または非特異的ＤＮアーゼを含む、請求項１に記載の核酸検出システム。
  4. 前記第１のＣａｓエフェクター酵素、および／または第２のＣａｓエフェクター酵素が、１つもしくは複数のＣａｓ１３タンパク質、１つもしくは複数のＣａｓ１２タンパク質、１つもしくは複数のＣａｓ１４タンパク質、１つもしくは複数のＣｓｍ６タンパク質、および／または１つもしくは複数のＣｓｘ１タンパク質、任意選択で、配列番号１１５～２６８のうちのいずれか１つに示される、１つまたは複数のタンパク質を含む、請求項１から３のいずれかに記載の核酸検出システム。
  5. 前記第１のＣａｓエフェクター、および／または第２のＣａｓエフェクターが、１つまたは複数のＣａｓ１３タンパク質、任意選択で、配列番号１１５～１３５のうちのいずれか１つに示される、１つまたは複数のＣａｓ１３タンパク質を含む、請求項１から４のいずれかに記載の核酸検出システム。
  6. 前記第１のＣａｓエフェクター、および／または第２のＣａｓエフェクターが、１つまたは複数のＣａｓ１３ｄタンパク質を含む、請求項１から５のいずれかに記載の核酸検出システム。
  7. 前記第１のＣａｓエフェクター、および／または第２のＣａｓエフェクターが、１つもしくは複数のＣａｓ１２タンパク質、１つもしくは複数のＣａｓ１３タンパク質、１つもしくは複数のＣａｓ１４タンパク質、および／または１つもしくは複数のＣｓｍ６タンパク質を、任意の組合せで含む、請求項１から６のいずれかに記載の核酸検出システム。
  8. 前記第１のＣａｓエフェクター酵素、および第２のＣａｓエフェクター酵素が、同じタンパク質または異なるタンパク質のうちの１つまたは複数を含む、請求項１から７のいずれかに記載の核酸検出システム。
  9. 前記第１のガイドＲＮＡ、および／または第２のガイドＲＮＡが、１つまたは複数の定常領域を含む、請求項２から８のいずれか一項に記載の核酸検出システム。
  10. 前記第１のガイドＲＮＡ、および第２のガイドＲＮＡが、独立に、配列番号４２～８５のいずれか１つに明示された配列から選択される、請求項２から９のいずれか一項に記載の核酸検出システム。
  11. 前記レポーター分子が、前記検出用標識に作動可能に連結された消光剤を含み、任意選択で、前記検出用標識が、１つまたは複数の蛍光分子を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の核酸検出システム。
  12. 前記レポーター分子が、前記消光剤と、フルオロフォアとを連結するオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、任意選択で、ステムループ構造を有するか、または引き起こすケージ化構造を含む、請求項１から１１のいずれかに記載の核酸検出システム。
  13. 前記レポーター分子が、任意選択でステムループ構造を有するか、または引き起こすトランスケージ分子と複合体化している、請求項１から１２のいずれかに記載の核酸検出システム。
  14. 前記検出用標識が、１つまたは複数の蛍光染料を含む、請求項１から１３のいずれかに記載の核酸検出システム。
  15. 前記活性化複合体が、ケージ化されており、任意選択で、ステムループ構造を有するか、または引き起こす、請求項１から１４のいずれかに記載の核酸検出システム。
  16. 前記活性化複合体が、オリゴヌクレオチド配列をさらに含み、前記オリゴヌクレオチド配列が、修飾ヌクレオチド塩基を含む、請求項１から１５のいずれかに記載の核酸検出システム。
  17. 前記活性化複合体が、オリゴヌクレオチド配列をさらに含み、前記オリゴヌクレオチド配列が、ＲＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の両方を含む、請求項１から１６のいずれかに記載の核酸検出システム。
  18. 前記ガイドＲＮＡが、ケージ化されており、任意選択で、ステムループ構造を有するか、または引き起こす、請求項１から１７のいずれかに記載の核酸検出システム。
  19. 増幅配列のうちの１つもしくは複数、および／または前記ガイドＲＮＡの一方もしくは両方が、ケージ化されており、任意選択で、前記ケージが、ループ構造など、１つまたは複数の構造、ならびに／あるいは１つもしくは複数のロックト核酸（ＬＮＡ）もしくは部分、および／または２’－ＯＭｅ ＲＮＡを含む、増幅配列のうちの１つまたは複数に対する修飾を含むか、または引き起こす、請求項１から１８のいずれかに記載の核酸検出システム。
  20. 増幅配列のうちの１つまたは複数が、それらの３’末端および／または５’末端において、ケージ化構造を含む、請求項１から１９のいずれかに記載の核酸検出システム。
  21. トランスケージ化分子をさらに含む、請求項１から２０のいずれかに記載の核酸検出システム。
  22. 前記第１のガイドＲＮＡ、および第２のガイドＲＮＡの一方もしくは両方、ならびに／または増幅配列のうちの１つもしくは複数が、最適の時間枠において、前記Ｃａｓエフェクター酵素との条件付き相互作用を可能とするように修飾されている、請求項１から２１のいずれかに記載の核酸検出システム。
  23. 前記１つまたは複数の増幅配列が、ポリＵ配列および／またはポリＡ配列、任意選択で、Ａ４－Ｕｎ、Ａ５－Ｕｎ、およびＡ６－Ｕｎ配列を含む、請求項１から２２のいずれかに記載の核酸検出システム。
  24. 標的配列および／または増幅配列が、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡに対して、１００％相補性である、請求項１から２３のいずれかに記載の核酸検出システム。
  25. 前記標的配列および／または増幅配列が、第１のガイドＲＮＡおよび／または第２のガイドＲＮＡに対して、１００％相補性ではない、請求項１から２４のいずれかに記載の核酸検出システム。
  26. 前記標的配列が、１つまたは複数の哺乳動物、ウイルス、細菌、または真菌に由来するＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１から２５のいずれかに記載の核酸検出システム。
  27. 前記標的配列が、ＲＮＡウイルス中に存在する、請求項１から２６のいずれかに記載の核酸検出システム。
  28. 前記標的配列が、コロナウイルス中、任意選択で、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２コロナウイルス中に存在する、請求項１から２７のいずれかに記載の核酸検出システム。
  29. 前記試料が、生体試料または環境試料である、請求項１から２８のいずれかに記載の核酸検出システム。
  30. 前記生体試料が、個体から回収された、血液、唾液、尿、生検、血漿、血清、気管支肺胞洗浄液、痰、糞便試料、脳脊髄液、細針吸引物、口腔スワブ、子宮頸部スワブ、鼻腔スワブ、間質液、滑液、鼻漏、涙液、軟膜、粘膜試料、または上皮細胞試料を含む、請求項１から２９のいずれかに記載の核酸検出システム。
  31. 前記試料が、無細胞液体試料を含む、請求項１から３０のいずれかに記載の核酸検出システム。
  32. 前記試料が、無細胞液体環境試料を含む、請求項１から３１のいずれかに記載の核酸検出システム。
  33. 前記試料が、細胞を含む液体を含む、請求項１から３２のいずれかに記載の核酸検出システム。
  34. 試料中の標的配列を検出する方法であって、
    （ａ）前記標的配列を含むことが疑われる試料を、
    （ｉ）請求項１から３３のいずれかに記載の核酸検出システム
    と接触させるステップと、
    （ｂ）検出用標識からの検出用シグナルを測定し、これにより、前記標的配列を検出するステップと
    を含む方法。
  35. 前記検出用標識のレベルを定量するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 接触させるステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける、無細胞環境内または細胞内において、二価金属イオンの存在下で実行される、請求項３４または３５に記載の方法。
  37. 接触させるステップが、数秒間～２時間である、請求項３４から３６のいずれかに記載の方法。
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