CN118067982A - 一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法。本发明方法通过串联磁珠在磁力的作用下增加了对微量蛋白的捕捉效率，双抗体夹心法增加对微量蛋白捕获的特异性，使用Cas13a‑Cas12a联用系统能快速响应并进行两次放大检测的敏感性，因此本方法具有很高的敏感性和特异性，解决了肿瘤标志物微量蛋白捕获困难，检测时间长，检测灵敏度不高的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法。
背景技术
双抗夹心法是一种常用的免疫分析方法，由于使用针对不同抗原表位的抗体，可以有效地避免交叉反应，提高检测的特异性。适用于大量样本，且操作简便，适合于自动化检测。由于抗体与抗原的结合非常稳定，因此检测结果较为可靠，误差较小。但若应用于微量蛋白的检测时，抗体对微量蛋白的的直接捕获效率比较有限，因此常与磁珠结合使用，但普通的磁珠也无法很好的实现与微量蛋白的碰撞机会进行捕获。
CRISPR/Cas系统具备特异性序列识别能力，以及部分具有非特异性切割的信号扩增特性，使其可根据不同检测需求进行设计和选择。CRISPR/Cas在检测时间和灵敏度上的显著优势能够很好地满足当下的需求，在开发新一代分子诊断技术上具有显著的潜力。基于CRISPR/Cas系统的分子诊断方法具有高选择性、低成本、快速及操作简单等显著优势，在核酸检测和蛋白小分子等非核酸检测显示出其巨大潜力。
此前，我们已知使用普通磁珠连接双抗夹心法检测微量蛋白，和/或结合CRISPR/Cas系统进行放大检测微量蛋白正在被研究，但如何提高磁珠的捕获效率，以及通过应用CRISPR/Cas多系统联用信号放大的优势，以提高检测效率和灵敏度仍被需要，尤其是检测血液中的微量蛋白。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足而提供一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法，以解决现有技术中对肿瘤标志物微量蛋白捕获困难、检测时间长、灵敏度不高的问题。该发明不仅可以提供微量蛋白的捕获效率，还可以在短时间内，快速灵敏的对微量蛋白进行检测。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法，该方法包括以下步骤：待测样品与串联磁珠-抗体1复合物进行孵育，同时加上磁力驱动串联磁珠-抗体1混合样品并捕获待测微量蛋白。当样品中有待测微量蛋白时串联磁珠-抗体1与微量蛋白免疫结合为串联磁珠复合物1，使用磁力吸附固定串联磁珠复合物1，清洗。再与抗体2-T7启动序列孵育，形成串联磁珠-抗体1-微量蛋白-抗体2-T7启动序列复合物2，其中抗体2与T7启动子使用生物素-链霉亲和素链接。磁力吸附再次固定串联磁珠复合物2，清洗。加入T7 RNA聚合酶体系，上述复合物2被T7 RNA聚合酶识别并转录表达出优选目的RNA，上述优选目的RNA能被Cas13a-CrRNA1复合物快速识别响应，附属切割双链Trigger DNA-Bubble RNA中的Bubble RNA上环结构，释放出大量的Trigger DNA，实现一次放大检测目标效果，紧接着释放出大量的Trigger DNA能被Cas12a-CrRNA2复合物快速识别响应，附属切割荧光探针被检测仪器捕捉荧光信号，实现二次放大检测信号。
一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法，包含有如下步骤，
分别制备串联磁珠、抗体1、抗体2、T7启动序列、Cas13a-CrRNA1复合物、双链Trigger DNA-Bubble RNA、Cas12a-CrRNA2复合物、荧光探针；
制备磁珠串联捕获体系：串联磁珠-抗体1复合物与样本混合，使用变换磁力驱动串联磁珠-抗体1复合体搅拌样本追踪捕获样本中的微量蛋白，5min后停止，定向磁力固定磁珠去除上清，并使用1×PBS溶液清洗；再加入抗体2-T7启动序列孵育10min，定向磁力固定磁珠去除上清，并使用1×PBS溶液清洗后备用。
制备T7启动子转录体系：上述捕获结束清洗后的复合物中加入T7 RNA聚合酶和10×T7 RNA聚合酶反应缓冲液，进行转录37℃反应3个小时。
制备Cas13a-Cas12a联用体系：取上述转录后样本的溶液5μL，加入到在Cas13a-Cas12a反应体系中，反应体系包含Cas13a-CrRNA1复合物，Trigger DNA-Bubble RNA，Cas12a-CrRNA2复合物，荧光探针，1×NEB Buffer，RNase Inhibitor，在37℃反应30min。
进一步的，所述的串联磁珠制备方法为；在定向磁场作用下，单个磁珠随机有序排列成串，解除磁场后，加入聚丙烯酰胺水凝胶将串联磁珠包裹，以防止串联磁珠再次游离。
进一步的，所述的抗体1和抗体2分别识别微量蛋白不同表位，其中抗体1与串联磁珠制备为复合物；其中抗体2与T7启动序列制备为复合物，抗体2与T7启动序列使用生物素-链霉亲和素连接。
进一步的，所述的T7启动序列由T7启动子和T7模板链组成，T7启动子核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，T7模板链核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，转录出的目的RNA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步的，所述的Cas13a-CrRNA1复合物由Cas13a蛋白和CrRNA1混合而成，CrRNA1核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
进一步的，所述的双链Trigger DNA-Bubble RNA，其中Trigger DNA为DNA单链，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；其中Bubble RNA为带有RNA的单链，其核苷酸序列如CCCGGAACAAUCU/iXNA_C/AUUUA/iXNA_C/UCUAACAAGGCCC。Trigger DNA与Bubble RNA形成双链时，Bubble RNA链部分形成RNA环状结构。
进一步的，所述的Cas12a-CrRNA2复合物由Cas12a蛋白和CrRNA2混合而成，CrRNA2核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
进一步的，所述的荧光探针为DNA单链，一端修饰一个荧光报告基团，另一端修饰一个淬灭基团，其核苷酸序列如5’-FAM-TTTTTT-BHQ1-3’。
有益效果：
本发明通过制备了一种聚丙烯酰胺包裹的串联磁珠-抗体1复合物，可以在变换磁力作用下快速搅拌，横扫追踪样本的微量蛋白并被抗体1捕获，提高了微量蛋白捕获效率，改善了微量蛋白捕获不易的难题。当待检测微量蛋白存在时，结合抗体2-T7启动序列后，双抗夹心提高了特异性，且T7启动序列可以转录出用于CRISPR联用的系统的目的RNA。转录出的目的RNA，加入到CRISPR联用的系统后可以快速得到响应，先是Cas13a进行识别反应，瞬间释放出大量的Trigger DNA可以与Cas12a迅速响应识别切割荧光探针，荧光信号被仪器捕捉，30min内形成级联式的二次放大检测效果，不仅检测时间短，且有极高的敏感性。
附图说明
图1为本发明一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法的实现原理及流程示意图；
图2为Cas13a-Cas12a联用系统蛋白浓度优化检测结果图；
图3为Cas13a-Cas12a联用系统检测敏感性结果图；
图4为Cas13a-Cas12a联用系统检测特异性结果图；
图5为Cas13a-Cas12a联用系统检测血液临床样本中微量蛋白结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。其中附图1为一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法的实现原理及流程示意图。
下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例中使用的抗体和抗原均购自Abcam公司，所使用的合成序列均由北京擎科生物科技股份有限公司合成。
实施例1磁珠串联捕获体系：
串联磁珠的一种制备方法：在定向磁场作用下，单个磁珠随机有序排列成串，解除磁场后，加入6％聚丙烯酰胺和0.6％过硫酸铵溶液(APS)，再加入四甲基乙二胺(TEMED)催化聚丙烯酰胺的聚合反应将串联磁珠包裹，以防止串联磁珠再次游离。
上述制备完成的串联磁珠与抗体1室温孵育10min，磁力吸附去上清，1×PBS溶液清洗3次，即为串联磁珠-抗体1复合物。
抗体2与T7启动序列制备为复合物，抗体2使用链霉亲和素标记试剂盒按说明书进行制备得到(试剂盒购自Abcam公司)。T7启动序列合成修饰上生物素，抗体2与T7启动序列通过生物素-链霉亲和素连接。
待检测的微量蛋白例如血液样本中的癌胚抗原(CEA)，所适用的待检测微量蛋白至少含有两个抗原决定簇的表位。
本实施例1当样本中存在待测的微量蛋白时，串联磁珠-抗体1复合物在变换磁力作用下捕获追踪捕获样本中的微量蛋白，5min后停止。串联磁珠-抗体1复合物与微量蛋白免疫结合为串联磁珠复合物1，使用磁力吸附固定串联磁珠复合物1，清洗。再与抗体2-T7启动序列孵育，形成串联磁珠-抗体1-微量蛋白-抗体2-T7启动序列复合物2。
实施例2T7启动子转录体系，包括如下序列：
T7启动子：TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO：1)；
T7模板链：TCAACATCAGTCTGATAAGCTA(SEQ ID NO：2)；
专利后的目的RNA：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO：3)；
本实施例为实施例1的进一步检测，当实施例1中存在待检的微量蛋白时形成串联磁珠-抗体1-微量蛋白-抗体2-T7启动序列复合物2，清洗后加入T7 RNA聚合酶和10×T7RNA聚合酶反应缓冲液，按照转录试剂盒说明书要求操作(试剂盒购自HiScribee公司)，在37℃条件反应3个小时，获得目的RNA。
实施例3Cas13a-Cas12a联用体系：包括如下序列：
CrRNA1：GAGACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACUCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA(SEQ IDNO：4)
Trigger DNA：GGGCCTTGTTAGAGGAGATTGTTCCGGG(SEQ ID NO：5)；
Bubble RNA：CCCGGAACAAUCU/iXNA_C/AUUUA/iXNA_C/UCUAACAAGGCCC；
CrRNA2：AAUUUCUACUCUUGUAGAUCGGAACAAUCUCCUCUAACAAGGC(SEQ ID NO：6)；
荧光探针：5’-FAM-TTTTTT-BHQ1-3’；
本实施例为实施例2的进一步检测，取上述实施例2转录后的含有目的RNA的样本溶液5μL，加入到在Cas13a-Cas12a反应体系中，反应体系包含Cas13a-CrRNA1复合物，Trigger DNA-Bubble RNA，Cas12a-CrRNA2复合物，荧光探针，1×NEB Buffer，RNaseInhibitor，在37℃反应30min。
实施例4Cas13a-Cas12a联用系统的蛋白浓度优化
为进一步提升Cas13a-Cas12a联用体系检测性能，优选了Cas13a-Cas12a联用系统的蛋白浓度，设计了如下6个组合：
| 组合 | Cas13a-CrRNA1 | Cas12a-CrRNA2 |
| 组合1 | 10nM | 8nM |
| 组合2 | 10nM | 10nM |
| 组合3 | 8nM | 10nM |
| 组合4 | 5nM | 4nM |
| 组合5 | 5nM | 5nM |
| 组合6 | 4nM | 5nM |
由附图2结果可知，Cas13a-Cas12a联用系统的蛋白浓度组合2效果最佳。
实施例5一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法检测癌胚抗原(CEA)的性能验证：
采用实施例1、2、3的方法进行测定，测定结果见图3、图4、图5；
由附图3结果可知，一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法检测癌胚抗原(CEA)灵敏度为200fg/mL。
由附图4结果可知，以血液中的癌胚抗原(CEA)为检测靶标，可以特异性检出。且与其他4种微量蛋白：甲胎蛋白(AFP)、肿瘤抗原CA-125、肿瘤抗原CA-153、肿瘤抗原CA-199不发生交叉。
由附图5结果可知，以血液中的癌胚抗原(CEA)为检测靶标检测4例阳性临床样本，4例阴性临床样本，符合率为100％。
Claims (9)
1.一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：待测样品与串联磁珠-抗体1复合物进行孵育，同时加上磁力驱动串联磁珠-抗体1混合样品并捕获待测微量蛋白；当样品中有待测微量蛋白时串联磁珠-抗体1与微量蛋白免疫结合为串联磁珠复合物1，使用磁力吸附固定串联磁珠复合物1；再与抗体2-T7启动序列孵育，形成串联磁珠-抗体1-微量蛋白-抗体2-T7启动序列复合物2，其中抗体2与T7启动子使用生物素-链霉亲和素链接；磁力吸附再次固定串联磁珠复合物2；加入T7 RNA聚合酶体系，上述复合物2被T7 RNA聚合酶识别并转录表达出优选目的RNA，上述优选目的RNA能被Cas13a-CrRNA1复合物快速识别响应，附属切割双链Trigger DNA-BubbleRNA中的Bubble RNA上环结构，释放出大量的Trigger DNA，实现一次放大检测目标效果，紧接着释放出大量的Trigger DNA能被Cas12a-CrRNA2复合物快速识别响应，附属切割荧光探针被检测仪器捕捉荧光信号，实现二次放大检测信号。
2.根据权利要求1所述的一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法，其特征在于，包含有如下步骤，
分别制备串联磁珠、抗体1、抗体2、T7启动序列、Cas13a-CrRNA1复合物、双链TriggerDNA-Bubble RNA、Cas12a-CrRNA2复合物、荧光探针；
制备磁珠串联捕获体系：串联磁珠-抗体1复合物与样本混合，使用变换磁力驱动串联磁珠-抗体1复合体搅拌样本追踪捕获样本中的微量蛋白，5min后停止，定向磁力固定磁珠去除上清，并使用1×PBS溶液清洗；再加入抗体2-T7启动序列孵育10min，定向磁力固定磁珠去除上清，并使用1×PBS溶液清洗后备用；
制备T7启动子转录体系：上述捕获结束清洗后的复合物中加入T7 RNA聚合酶和10×T7RNA聚合酶反应缓冲液，进行转录37℃反应3个小时；
制备Cas13a-Cas12a联用体系：取上述转录后样本的溶液5μL，加入到在Cas13a-Cas12a反应体系中，反应体系包含Cas13a-CrRNA1复合物，Trigger DNA-Bubble RNA，Cas12a-CrRNA2复合物，荧光探针，1×NEB Buffer，RNase Inhibitor，在37℃反应30min。
3.根据权利要求2所述的一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法，其特征在于：所述的串联磁珠制备方法为；在定向磁场作用下，单个磁珠随机有序排列成串，解除磁场后，加入聚丙烯酰胺水凝胶将串联磁珠包裹，以防止串联磁珠再次游离。
4.根据权利要求2所述的一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法，其特征在于：所述的抗体1和抗体2分别识别微量蛋白不同表位，其中抗体1与串联磁珠制备为复合物；其中抗体2与T7启动序列制备为复合物，抗体2与T7启动序列使用生物素-链霉亲和素连接。
5.根据权利要求2所述的一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法，其特征在于：所述的T7启动序列由T7启动子和T7模板链组成，T7启动子核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，T7模板链核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，转录出的目的RNA核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
6.根据权利要求2所述的一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法，其特征在于：所述的Cas13a-CrRNA1复合物由Cas13a蛋白和CrRNA1混合而成，CrRNA1核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
7.根据权利要求2所述的一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法，其特征在于：所述的双链Trigger DNA-Bubble RNA，其中Trigger DNA为DNA单链，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；其中Bubble RNA为带有RNA的单链，其核苷酸序列如CCCGGAACAAUCU/iXNA_C/AUUUA/iXNA_C/UCUAACAAGGCCC；Trigger DNA与Bubble RNA形成双链时，Bubble RNA链部分形成RNA环状结构。
8.根据权利要求2所述的一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法，其特征在于：所述的Cas12a-CrRNA2复合物由Cas12a蛋白和CrRNA2混合而成，CrRNA2核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
9.根据权利要求2所述的一种基于Cas13a与Cas12a联用的信号放大系统检测血液中微量蛋白的方法，其特征在于：所述的荧光探针为DNA单链，一端修饰一个荧光报告基团，另一端修饰一个淬灭基团，其核苷酸序列如5’-FAM-TTTTTT-BHQ1-3’。
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