CN117106860A - 基于CRISPR/Cas的酶标探针的检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于CRISPR/Cas的酶标探针的检测方法及应用，包括两步酶促反应，第一步酶促反应由激发序列激活Cas蛋白，对酶标探针的核酸序列进行切割，释放固定的酶；第二步酶促反应由释放的酶对底物进行催化反应，根据酶的不同，选择不同的反应底物，根据产生的信号，进行比色法、荧光或者化学发光检测。本发明通过CRISPR的旁路核酸切割活性及酶促反应两级信号放大过程，实现在没有核酸扩增的情况下，实现超灵敏核酸检测。同时借助于适配体及核酸修饰抗体，可以实现低浓度非核酸靶标的检测。
Description
技术领域
本发明属于属于检测技术领域，涉及蛋白质的检测，尤其涉及一种基于CRISPR/Cas的酶标探针的检测方法及在核酸及非核酸靶标检测中的应用。
背景技术
近年来，CRISPR系统的发现和研究为核酸检测提供了全新的方法，这些方法主要通过具有旁路切割活性的Cas蛋白对荧光修饰的探针进行非特异性切割产生荧光信号，来检测样品中目标核酸分子的浓度。目前用于核酸检测的CRISPR蛋白有Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b、Cas14以及Csm6等。其检测原理基本相似，由Cas蛋白与crRNA结合形成CrRNA-Cas蛋白复合体，当目标核酸分子存在时，可特异性性与目标核酸分子结合并激活Cas蛋白的旁路核酸切割活性，任意切割荧光修饰报告探针。
在这一过程中，Cas蛋白的活性是由目标核酸(激活序列)激活的，目标核酸的浓度直接影响检测灵敏度。大量研究显示，在不经扩增的情况下，该方法只能检测到pM(10-9M)浓度级别的核酸。为了进一步提高检测灵敏度，目前常用的方法是在CRISPR反应前增加一步核酸扩增的过程(PCR、LAMP、RPA、RCA、NASB等)，以此来提高激活序列的量。然而这一扩增过程的加入通常需要专门的仪器、操作复杂、时间长、成本高且容易导致样品之间的交叉污染。
主要缺陷在于：需要专门的仪器、操作复杂、时间长、成本高且容易导致样品之间的交叉污染。
发明内容
本发明所要解决的技术问题就是克服现有技术缺陷，提供一种基于CRISPR/Cas的酶标探针信号放大技术及其在核酸及非核酸靶标检测中的应用。通过CRISPR的旁路核酸切割活性及酶促反应两级信号放大过程，实现在没有核酸扩增的情况下，实现超灵敏核酸检测。同时借助于适配体及核酸修饰抗体，可以实现低浓度非核酸靶标的检测。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了基于CRISPR/Cas的酶标探针的检测方法，所述检测方法包括两步酶促反应，第一步酶促反应由激发序列激活Cas蛋白，对酶标探针的核酸序列进行切割，释放固定的酶；第二步酶促反应由释放的酶对底物进行催化反应，根据酶的不同，选择不同的反应底物，根据产生的信号，进行比色法、荧光或者化学发光检测。
作为本发明的一种优选方案，第一步酶促反应中，所述激发序列为与gRNA互补配对的序列，包括单链或双链DNA、RNA或其他寡核酸序列；所述Cas蛋白为具有旁路切割活性的蛋白，包括Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b、Cas14或Csm6。
作为本发明的一种优选方案，第一步酶促反应中，所述酶标探针为一段可被激活的Cas蛋白非特异性切割的核酸序列，其一端与酶结合，另一端与固定材料结合。
作为本发明的一种优选方案，第一步酶促反应中，所述探针的核酸序列可以是单链DNA或者是单链RNA，其长度为5到30，核酸探针序列与酶的结合为共价或非共价结合。
作为本发明的一种优选方案，第一步酶促反应中，所述酶为可催化底物进行信号放大的酶，包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或者β-半乳糖苷酶。
作为本发明的一种优选方案，第一步酶促反应中，固定酶所用的固定载体包括微球、磁珠、或酶标板，通过共价或非共价方式与核酸探针进行结合。
作为本发明的一种优选方案，第一步酶促反应中，所述酶标探针与Cas/gRNA混合组成混合物一起加入反应体系，或者是作为单独的试剂，待Cas/gRNA与激活序列组成复合体后再加入反应体系。
作为本发明的一种优选方案，第一步酶促反应中，根据Cas蛋白的差异，设计合成gRNA与激活序列，gRNA与Cas蛋白混合，形成Cas蛋白-gRNA复合体。
本发明还提供了上述的基于CRISPR/Cas的酶标探针的检测方法的在核酸及非核酸靶标检测中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明通过CRISPR的旁路核酸切割活性及酶促反应两级信号放大过程，实现在没有核酸扩增的情况下，实现超灵敏核酸检测。同时借助于适配体及核酸修饰抗体，可以实现低浓度非核酸靶标的检测。
2)本发明的方法灵敏、快速、无扩增、方便(可裸眼观察)。
附图说明
图1是本发明工作原理示意图。
图2是CRISPR/FQ探针对合成DNA检测能力。
图3是1pM浓度时，CRISPR/HRP探针检测颜色变化。
图4是CRISPR/HRP探针对合成DNA检测能力。
图5是CRISPR/FQ探针对合成RNA检测能力。
图6是CRISPR/HRP探针对合成RNA检测能力。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
参见图1，本发明提供了基于CRISPR/Cas的酶标探针的检测方法，需要两步酶促反应。第一步酶促反应由激发序列激活Cas蛋白，然后对酶标探针的核酸序列进行切割，释放固定的酶。
所述激发序列为与gRNA互补配对的序列，可以是DNA(单链或双链)、RNA或者是其他寡核酸序列。此外，激发序列也可以通过共价或非共价方式与抗体、抗原等结合。
所述Cas蛋白为具有旁路切割活性的蛋白，包括Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b、Cas14以及Csm6等。根据Cas蛋白的差异，设计合成gRNA及其激活序列。gRNA与Cas蛋白混合，形成Cas蛋白-gRNA复合体。
所述酶标探针为一段可被激活的Cas蛋白非特异性切割的核酸序列，其一端与酶结合，另一端与固定材料结合。
所述探针的核酸序列可以是单链DNA或者是单链RNA，其长度为5到30，优选10到25，最优选25个碱基。核酸探针序列与酶的结合为共价或非共价结合。
所述酶为可催化底物进行信号放大的酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)等。
所述固定载体为微球、磁珠、或酶标板等。可通过共价或非共价方式与核酸探针进行结合。
所述酶标探针可以与Cas/gRNA混合组成混合物一起加入反应体系，或者是作为单独的试剂，待Cas/gRNA与激活序列组成复合体后再加入反应体系。
第二步酶促反应由释放的酶对底物进行催化反应。根据偶联酶的不同，选择不同的反应底物，并且根据其产生的信号，可进行比色法、荧光或者是化学发光检测。从而建立起信号强度与靶标浓度的对应关系。
实施例1
以基于CRISPR/Cas的酶标探针信号放大技术进行合成DNA检测为例说明具体技术方案。本实施例仅作为示例进行说明。
1)待检测序列合成
人工合成DNA序列1：5’TGCCCTCCGGACCAGCACACGCATAACG-3’(SEQ ID No.1)，合成序列经HPLC纯化后，用PBS溶解并按梯度稀释至10μM，备用。
其中横线部分为与gRNA互补配对序列。
2)gRNA序列设计及合成
设计并合成gRNA序列：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGUUAUGCGUGUGCUGGUCC-3’(SEQ IDNo.2)。(序列表中“U”以“T”表示，下同。)
3)报告探针的设计及制备
设计并合成报告探针:5’/FAM/-TTATTATTATTATTATTATTATTAT-/BHQ1/3’(SEQ IDNo.3)，该探针用于验证现有无扩增CRISPR核酸检测灵敏度。
酶标探针的设计及合成
合成DBCO TEG和生物素修饰的核酸序列：5’/DBCOTEG/-TTATTATTATTATTATTATTATTAT-/Biotin/3’。
HRP叠氮化修饰
按照说明书要求对HRP进行叠氮化修饰。简单地，将2mg HRP冗余1mL 0.1M NaHCO3溶液中，然后加入1000倍摩尔量的azido-PEG4-NHS试剂(Thermo ScientificTM，货号:26130)，室温反应2小时。反应结束后进行脱盐处理，去除过量的叠氮修饰试剂。然后进行浓缩(30-kDa MWCO，4000rpm，5min)，备用。
HRP-DNA偶联
将上述偶联好的N3-HRP与DBCO TEG和生物素修饰的核酸序列偶联。取200μL上述偶联的N3-HRP，加入等量的修饰DNA，室温条件下反应15h，然后用30-kDa MWCO浓缩清洗三次，备用。
酶标探针偶联
将上述偶联好的HRP-DNA序列与SA磁珠偶联，制备酶标探针。首先，取40μL SA磁珠，用PBS清洗三次，然后加入600μL含0.1％ Tween 20的PBS溶液。随后，加入5μL(800nM)上述偶联的HRP-DNA，室温条件下旋转孵育5min。因DNA序列含生物素修饰，所以HRP-DNA可通过生物素与SA磁珠紧密连接。反应结束后，富集磁珠，弃上清，并用PBS清洗三次，去除未结合的HRP-DNA。然后加入含0.5％ BSA的PBS孵育2h，富集磁珠，弃上清，并用PBS清洗三次，加入PBS(含0.1％ Tween 20,0.2％ BSA)，保存备用。
4)Cas蛋白反应体系配置
在1mL 1×NEB 2.1Buffer中加入Cas12a蛋白(30pmol)和引导RNA(30pmol)并轻轻混匀，然后加入180pmol荧光修饰的ssDNA报告探针(FQ探针)。混匀后备用。
在酶标探针反应体系中，将荧光修饰的ssDNA报告探针替换为酶标探针(HRP探针)。
5)实验步骤
将人工合成的DNA序列，按照10倍梯度，稀释至10fM，备用。
Cas酶促反应：
对照组：在PCR八联管中加入45μL Cas蛋白反应液(含FQ探针)，并加入5μL梯度稀释的合成DNA序列，室温反应30min。并经荧光PCR仪检测不同浓度底物时的荧光强度。
实验组：在1.5mL离心管中加入45μLCas蛋白反应液(含HRP探针)，并加入5μL梯度稀释的合成DNA序列，室温反应30min。
去除实验组的磁珠并收集上清40μL转移至酶标板，然后在酶标板中加入40μL含TMB的二级酶促反应底液，室温继续反应15min。
反应结束后，在上述反应体系中加入2M H2SO4终止反应并转移至酶标仪中进行信号检测。
实验结果及分析
使用FQ探针进行CRISPR一级酶促反应时，不同靶标浓度反应体系产生的荧光信号与空白对照组产生的信号变化如图2所示。从检测结果看，该反应体系可以对1pM靶标进行检测，与现有文献报道的无扩增CRISPR仅能检测到pM及相同。
当使用HRP探针时，当靶标浓度为1pM时，可裸眼观察到与空白实验组的颜色差异(参见图3)。进一步地，通过仪器检测，经过二级酶促反应可检测到1fM的靶标，比单纯使用FQ探针进行CRISPR一级酶促反应灵敏度提高了100倍(参见图4)。
实施例2
基于CRISPR/Cas的酶标探针信号放大技术系统的RNA检测
1)设计合成待检RNA序列及其对应gRNA序列
待检靶RNA序列：5’-AAAUGCACCCCGCAUUACGUUUGGUGGACCCUCAGAUUCA-3’(SEQ IDNo.4).
gRNA序为:5’-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACGGUCCACCAAACGUAAUGCG-3’(SEQIDNo.5)。
2)报告探针的设计及制备
设计并合成报告探针:5’/FAM/-UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU-/BHQ1/3’(SEQ IDNo.6)，该探针用于验证现有无扩增CRISPR核酸检测灵敏度。
酶标探针的设计及合成
合成DBCO TEG和生物素修饰的核酸序列：5’/DBCOTEG/-UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU-/Biotin/3’，酶标探针的制备方法同实施例1中酶标探针的制备。
3)Cas蛋白反应体系配置
本实施例选择LbuCas13a作为一级酶促反应蛋白，反应缓冲体系组成为：20mMHEPES,50mM NaCl,10mM MgCl2,RNase inhibitor(1U/mL),and 5％glycerol at pH≈6.8。在上述缓冲体系中加入Cas13a蛋白(50pmol)和引导RNA(50pmol)并轻轻混匀，然后加入180pmol荧光修饰的ssRNA报告探针(FQ探针)。混匀后备用。
在酶标探针反应体系中，将荧光修饰的ssRNA报告探针替换为酶标探针(HRP探针)。
4)实验步骤
将合成的待检靶RNA按梯度稀释至10fM，其他操作同实施例1。
5)实验结果及分析
使用FQ探针进行CRISPR一级酶促反应时，不同靶标浓度反应体系产生的荧光信号与空白对照组产生的信号变化如图5所示。从检测结果看，该反应体系可以对1pM靶标进行检测
当使用HRP探针时，通过仪器对产生的信号进行检测，经过二级酶促反应可检测到1fM的靶标浓度，比单纯使用FQ探针进行CRISPR一级酶促反应，灵敏度提高了100倍(参见图6)。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (9)
1.基于CRISPR/Cas的酶标探针的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括两步酶促反应，第一步酶促反应由激发序列激活Cas蛋白，对酶标探针的核酸序列进行切割，释放固定的酶；第二步酶促反应由释放的酶对底物进行催化反应，根据酶的不同，选择不同的反应底物，根据产生的信号，进行比色法、荧光或者化学发光检测。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas的酶标探针的检测方法，其特征在于，第一步酶促反应中，所述激发序列为与gRNA互补配对的序列，包括单链或双链DNA、RNA或其他寡核酸序列；所述Cas蛋白为具有旁路切割活性的蛋白，包括Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b、Cas14或Csm6。
3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas的酶标探针的检测方法，其特征在于，第一步酶促反应中，所述酶标探针为一段可被激活的Cas蛋白非特异性切割的核酸序列，其一端与酶结合，另一端与固定材料结合。
4.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas的酶标探针的检测方法，其特征在于，第一步酶促反应中，所述探针的核酸序列为单链DNA或者是单链RNA，其长度为5到30，核酸探针序列与酶的结合为共价或非共价结合。
5.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas的酶标探针的检测方法，其特征在于，第一步酶促反应中，所述酶为可催化底物进行信号放大的酶，包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或者β-半乳糖苷酶。
6.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas的酶标探针的检测方法，其特征在于，第一步酶促反应中，固定酶所用的固定载体包括微球、磁珠、或酶标板，通过共价或非共价方式与核酸探针进行结合。
7.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas的酶标探针的检测方法，其特征在于，第一步酶促反应中，所述酶标探针与Cas/gRNA混合组成混合物一起加入反应体系，或者是作为单独的试剂，待Cas/gRNA与激活序列组成复合体后再加入反应体系。
8.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas的酶标探针的检测方法，其特征在于，第一步酶促反应中，根据Cas蛋白的差异，设计合成gRNA与激活序列，gRNA与Cas蛋白混合，形成Cas蛋白-gRNA复合体。
9.基于CRISPR/Cas的酶标探针的检测方法的应用，其特征在于，权利要求1-8任一项所述的基于CRISPR/Cas的酶标探针的检测方法的在核酸及非核酸靶标检测中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN118028473A (zh) * | 2024-04-07 | 2024-05-14 | 上海医之本科技有限公司 | 基于crispr识别及双重信号放大的空间基因检测体系及其检测方法和应用 |
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