JPH08205897A

JPH08205897A - 特異結合検査法およびそれに用いる検査用試薬

Info

Publication number: JPH08205897A
Application number: JP7019572A
Authority: JP
Inventors: Kaoru Naito; 薫内藤; Jiyunko Kashima; 淳子賀嶋
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 1995-02-07
Filing date: 1995-02-07
Publication date: 1996-08-13

Abstract

(57)【要約】【目的】目的物質を、簡便かつ高感度に検出する。【構成】標識として二重鎖ＤＮＡを備える特異結合試薬
を検査試薬として用いる。標識二重鎖ＤＮＡは、所定の
構造のリボザイム３２の鋳型配列を有する。試料中の目
的物質と検査試薬とを反応させて複合体とし、未反応物
から分離して、得られた複合体の標識二重鎖ＤＮＡを鋳
型としてリボザイム３２（特定の塩基配列の核酸を所定
の位置で切断する触媒としての機能を有する核酸）を合
成する。該リボザイム３２を、所定の基質鎖３１に作用
させると、基質鎖３１は切断されて塩基配列長が短くな
る。この切断後の短い核酸を検出することで、試料中の
目的物質を定性的／定量的に推定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、検査対象の目的物質
を、該物質に特異的に結合する物質を用いて検出する方
法に係り、特に、目的物質が微量であっても高感度に検
出する特異結合検査法（specific binding assay）に関
する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、目的物質を高感度に同定、定
量するために、目的物質と高い特異性を持って結合する
物質（特異結合物質）を用いる特異結合検査法（specif
ic binding assay）といわれる検査法が用いられてい
る。この特異結合検査法には、例えば、特異結合物質に
あらかじめ標識を付与しておき、この標識された特異結
合物質を被検体中の目的物質と結合させ、被検体から未
反応物を分離、除去した後、被検体中に存在する標識を
検出することにより、該標識を備える特異結合物質と結
合している目的物質を検出するものがある。これらの特
異結合検査法のうち、特に、特異結合反応として抗原抗
体反応を用いる免疫検査法（immunoassay）が広く実施
されている。

【０００３】この免疫検査法は、抗原−抗体反応により
生じる沈澱物や凝集体を光学的に検出する免疫比濁法
（turbidimetric immunoassay：ＴＩＡ）と、分別検出
の容易な物質で標識した抗体または抗原を用いる標識化
免疫法とに大別される。

【０００４】現在用いられている検査を見てみると、Ｔ
ＩＡ法を使用しているものには、血清中の蛋白質である
トランスフェリン、Ｃ反応性タンパク（C-reactive pro
tein：ＣＲＰ）、免疫グロブリン（ＩgＧ、ＩgＡ、Ｉg
Ｍ）や、自己免疫関連物質であるリウマチ因子などの検
査が挙げられる。また、ＴＩＡ法による血液学的検査に
は、プラスミノーゲンの定量分析、アンチトロンビンII
Iの定量分析等が挙げられる。

【０００５】一方、標識化免疫測定法には、その標識物
によって種々の系があり、代表的なものとしては、放射
性同位元素を含むものを標識とする放射線免疫検定法
（radioimmunoassay：ＲＩＡ）、酵素を標識とする酵素
免疫定量法（enzyme immunoassay：ＥＩＡ）、蛍光体を
標識とする蛍光抗体法（fluorescent antibody techniq
ue：ＦＡＴ）等がある。ＲＩＡ法は、内分泌学検査（例
えばエリスロポエチン、プロスタグランディンなどの検
査）からウイルス学検査（例えばＢ型肝炎表面抗原（he
patitis B surface antigen：ＨＢｓ）抗体、Ｃ型肝炎
ウイルス（hepatitis C virus：ＨＣＶ）抗体などの検
査）、腫瘍関連検査（例えばＡＦＰ、ＣＥＡなどの検
査）、生化学検査（例えばトリプシン等）と広い範囲に
適用されている。また、ＥＩＡ法は、血液学検査（例え
ばプロテインＳ、ＦＰＡなど）、免疫血清学検査（例え
ば免疫複合体、マイクログロブリンなど）、ＦＡＴ法は
ウイルス抗体（例えばエプスタイン−バーウイルス（Ep
stein-barr virus：ＥＢＶ）抗体、ヘルペスウイルス抗
体など）の検査、免疫血清学検査（例えば抗核抗体な
ど）に使用される。

【０００６】

【本発明が解決しようとする課題】上述のように、免疫
検査法は広く臨床検査等に利用されている。これらの免
疫検査法のうち、ＥＩＡ法やＦＩＡ法などでは、感度の
点で使用が制限されるという問題がある。そこで、特に
高感度に目的物質を検出するためには、ＲＩＡ法を用い
ることが多い。しかし、このＲＩＡ法では、放射性同位
元素の取扱いに危険性を伴うという問題や、試薬の保存
期間が短いという問題がある。

【０００７】そこで、イムノＰＣＲ（polymerase chain
reaction）法が提案されている。このイムノＰＣＲ法
は、標識としてＤＮＡ（デオキシリボ核酸）を用い、こ
のＤＮＡの自己増殖能を利用して検査結果を増幅するこ
とにより、高い感度を確保するものである。すなわち、
イムノＰＣＲ法では、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）フラ
グメントを標識として備える特異結合物質を用い、該特
異結合物質と目的とを反応させて複合体を得る。この複
合体には標識であるＤＮＡフラグメントが含まれてい
る。そこで、複合体を分離したのち、該複合体に含まれ
るＤＮＡフラグメントを鋳型として、酵素によりＤＮＡ
フラグメントを複製、増殖し、増殖されたＤＮＡフラグ
メントを検出すれば、増幅された検出結果を得ることが
できる。しかし、このイムノＰＣＲ法は、ＤＮＡを増殖
させるために、一定時間ごとの温度変更を伴う厳密な温
度コントロールが必要になり、機器コストが高くなると
いう問題がある。このような厳密な温度コントロール
は、イムノＰＣＲ法に限らず、ＤＮＡ自体の増殖を伴う
検査法においては常に必要であり、簡便かつ安価な検査
の妨げとなっている。

【０００８】本発明はこのような問題点に鑑みてなされ
たもので、目的物質を、簡便かつ高感度に検出すること
を目的にしている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
め、本発明では、目的物質と特異的に結合する性質を有
する特異結合部分と、標識部分とを、一分子中に有する
検出試薬と、試料中の該目的物質とを結合させて複合体
を形成する複合体形成ステップと、上記複合体中の上記
標識を用いて上記試料中の目的物質の有無および／また
は量を推定する検出ステップとを備える特異結合検査法
において、上記標識部分は、リボザイムの合成に際して
鋳型として用いることのできる塩基配列を有する二重鎖
デオキシリボ核酸であり、上記検出ステップは、上記複
合体中の上記二重鎖デオキシリボ核酸を鋳型としてリボ
ザイムを合成する合成ステップと、上記合成したリボザ
イムを用いて、該リボザイムにより切断される塩基配列
であるリボザイム切断配列を少なくとも一部に有する核
酸分子である基質鎖を切断して切断された核酸を得るス
テップと、上記切断された核酸を検出するステップとを
有することを特徴とする特異結合検査法が提供される。
なお、リボザイム切断配列は、該基質鎖の分子とリボザ
イム分子とを結合する手段である塩基配列と、リボザイ
ム分子が切断点を識別するための塩基配列とを含む。

【００１０】特異的に結合する物質としては、抗原また
はハプテンおよび抗体、生理活性物質および該生理活性
物質の受容体、核酸および該核酸に相補的な塩基配列を
備える核酸、多糖類およびレクチン、免疫グロブリンＧ
およびプロテインＡなどがあり、これらの組み合わせ
は、いずれも、本発明における目的物質と特異結合部分
との組み合わせとして用いることができる。ここで生理
活性物質には、ホルモン、ビタミン、薬剤等を含む。

【００１１】また、基質鎖の各分子は、リボザイム切断
配列を、分子中のあらかじめ定められた位置に備えるこ
とが望ましく、リボザイム切断配列の基質鎖における位
置が、該リボザイム切断配列を有する基質鎖１分子が上
記リボザイムにより切断されて生成する２つの核酸分子
の塩基配列長が、互いに同じになるような位置であれ
ば、切断後の核酸の分子数が切断前の基質鎖の分子数の
２倍になるので、さらに望ましい。

【００１２】本発明の特異結合検査法は、目的物質が複
数種類の場合であっても、適用することができる。すな
わち、上記目的物質が複数種類の場合、検出試薬とし
て、各々の種類の検出試薬の特異結合部分が、それぞ
れ、対応する目的物質に特異的に結合する性質を有する
試薬が、目的物質に応じて複数種類用いられる。この場
合、各々の種類の検出試薬の標識部分は、それぞれ、対
応する目的物質ごとに異なる配列を切断するリボザイム
の鋳型となる塩基配列を有する二重鎖デオキシリボ核酸
とし、また、基質鎖としては、それぞれ、対応するリボ
ザイムのリボザイム切断配列を分子中に有する核酸が、
リボザイムに応じて複数種類用いられる。これらの基質
鎖は、同時に合成される他のリボザイムのリボザイム切
断配列を有しないことが望ましく、そのリボザイム切断
配列の位置が、リボザイムにより切断されて生じる核酸
の塩基配列長が互いに異なるような位置であることが望
ましい。

【００１３】なお、目的物質と検出試薬との複合体は、
固相に固定されていることが望ましい。これは、未反応
の試薬と複合体との分離が容易になるからである。そこ
で、上記複合体形成ステップは、試料中の目的物質を固
相の担体に固定するステップと、固定化した目的物質
に、上記検出試薬を結合させるステップとを備えること
が望ましい。このようにすれば、目的物質が固相に固定
されるため、複合体も固相に固定されることになるから
である。また、検出試薬が、固相の担体に固定化されて
いてもよい。この場合も、固定化された検出試薬に目的
物質が結合することで、生成する複合体は固相に固定化
されることになる。

【００１４】このように、複合体が固相に固定化される
場合は、検出試薬の標識部分は、上記特異結合部分と、
制限酵素により切断される塩基配列である制限酵素切断
配列を介して結合されており、検出ステップは、合成ス
テップの前に、制限酵素切断配列を、制限酵素により切
断するステップを、さらに備えていることが望ましい。
このようにすれば、制限酵素の作用により、固相に固定
化された複合体から標識部分を遊離させるので、固相化
による標識部分の反応性低下を回避することができる。

【００１５】また、本発明では、あらかじめ定められた
検査対象物質に対する特異結合物質との接続部分の配列
と、リボ核酸合成の開始のためのプロモータ配列と、リ
ボザイムの鋳型となる配列とを備える二重鎖デオキシリ
ボ核酸であることを特徴とする検査用試薬が提供され
る。

【００１６】この検査用試薬の具体例としては、５’末
端から順に、上記接続部分の配列であるビオチン化ポリ
Ａ鎖部と、上記プロモータ配列であるＴ７プロモータ配
列と、上記リボザイムの鋳型となる配列とを備える二重
鎖デキオキシリボ核酸が挙げられる。

【００１７】なお、接続部分の配列とプロモータ配列と
の間に、制限酵素によって切断される配列をさらに備え
ることが望ましい。制限酵素を作用させることにより、
プロモータ配列およびリボザイムの鋳型配列を、遊離さ
せることができるからである。

【００１８】

【作用】本発明においては、標識として二重鎖ＤＮＡを
備え、検査の目的物質に特異的に結合する性質を有する
特異結合物質を検査試薬として用いる。本発明において
標識として用いられる二重鎖ＤＮＡは、あらかじめ定め
られた構造のリボザイム（ribozyme）を合成する鋳型と
なる塩基配列を有する。なお、リボザイムは、核酸であ
りながら酵素的な機能を有する分子であり、あらかじめ
定められた塩基配列（リボザイム切断配列）に対してあ
らかじめ定められた位置（以下、「切断点」と呼ぶ）
で、その構造に応じてあらかじめ定められた塩基配列を
有する核酸（以下、このリボザイムにより切断される、
あらかじめ定められた塩基配列を有する核酸を「基質
鎖」と呼ぶ）を切断する反応の触媒として機能する触媒
核酸分子である。

【００１９】検査試料中の目的物質とこの検査試薬とが
反応すると、目的物質と標識された特異結合物質との複
合体が形成される。この複合体を反応溶液から分離し、
得られた複合体の二重鎖ＤＮＡを鋳型としてリボザイム
を合成する。これにより、特定の塩基配列を有する核酸
を、所定の位置で切断する触媒としての機能を有するリ
ボザイムが得られる。

【００２０】このリボザイムを、該リボザイムにより切
断される配列を有する基質鎖に作用させると、基質鎖は
あらかじめ定められた位置で切断され、分子量の小さい
核酸になる。そこで、この切断された核酸を検出、測定
すれば、試料中の目的物質を定性的あるいは定量的に検
出することができる。

【００２１】このように、本発明では、検出試薬の備え
る標識であるＤＮＡを、直接増殖させるのではなく、該
ＤＮＡを鋳型としてリボザイムを合成し、さらに該リボ
ザイムにより基質鎖を切断することにより、検出結果を
増幅させる。従って、本発明によれば、ＤＮＡを直接増
殖させる場合のように厳密に一定の温度サイクルを維持
することなく、一定の温度に保持するだけで、検出結果
の簡便かつ精密な増幅が実現される。

【００２２】上述のように、本発明では、触媒核酸分子
であるリボザイムを合成し、その合成したリボザイムの
触媒としての性質を利用することにより、検出結果を増
幅するので、微量の目的物質を感度よく検出することが
できる。そこで、まず、リボザイムについて説明してお
く。

【００２３】核酸フラグメントに作用する機能分子とし
ては、制限酵素やリガーゼなどが従来より知られていお
り、それぞれ目的に応じてよく使用されている。制限酵
素は核酸フラグメントを切断する機能を有し、また、リ
ガーゼは核酸フラグメントを結合する機能を有する。こ
のように、核酸フラグメントに作用する酵素には、多く
の種類が知られているが、いずれも基質の二重鎖の核酸
配列を識別して処理するものである。これらの酵素は蛋
白質であり、その調製には多大な時間とコストとを費や
さなくてはならない。なお、本明細書において「核酸を
切断する」とは、核酸のホスホジエステル結合を切断す
ることを意味する。

【００２４】これに対し、近年になって、核酸分子であ
りながら核酸フラグメントを切断する機能を有する分子
「リボザイム」が見出された。リボザイムの基本構造
は、本来的にはＲＮＡ（リボ核酸）分子である。しか
し、その機能を高めるために、人工的にデオキシリボヌ
レオチドとオキシリボヌクレオチドのハイブリッドによ
り構成された、いわゆるキメラタイプの分子も調製され
ている。

【００２５】リボザイムは、基質との結合部位が２つ
と、それらの結合部位の間にある触媒ループ部位とを備
える。すなわち、リボザイムは、「５’−基質との結合
部（以下、結合部Ａと呼ぶ）−触媒ループ部−基質との
結合部（以下、結合部Ｂと呼ぶ）−３’」と表される核
酸配列を備える。

【００２６】なお、結合部Ａ，Ｂは、塩基対を形成する
ことにより基質と結合する部位である。従って、リボザ
イムは、結合部Ａ，Ｂの配列と塩基対を形成して結合す
る塩基配列を備える核酸を切断することになる。結合部
Ａ，Ｂは、通常、５〜１０個程度のヌクレオチドからな
るオリゴヌクレオチドである。

【００２７】また、触媒ループ部は、特定のループを形
成して、配位子としてマグネシウムイオンを取り込むこ
とのできる分子鎖である。触媒ループ部としては、例え
ば、5'CUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAC3'と表される塩基配列
を備えるものが挙げられる。なお、本明細書において
は、塩基配列は慣例の表記法に従って記載し、Ｇ、Ｃ、
Ａ、およびＵは、それぞれグアニン、シトシン、アデニ
ン、ウラシルを表す。

【００２８】一方、このリボザイムにより切断される基
質は、「５’−触媒との結合部位（以下、結合部Ｂ’と
呼ぶ）−切断対象配列−触媒との結合部位（以下、結合
部Ａ’と呼ぶ）−３’」と表される構成を備える。切断
対象配列は、例えば、−GUX（切断点）−である。な
お、ここでＸはＣ、ＵおよびＡのうちのいずれか一つで
ある。

【００２９】この基質とリボザイムとは、基質の結合部
Ａ’とリボザイムの結合部Ａとが塩基対を形成し、さら
に基質の結合部Ｂ’とリボザイムの結合部Ｂとが塩基対
を形成することにより、結合する。この状態で、リボザ
イムの機能活性化の条件が整うと、基質のGUX部位のＸ
の３’末端と結合部Ａ’との結合が切断される。このよ
うに、リボザイムは、核酸分子でありながら核酸フラグ
メントを酵素的に切断する機能を有する触媒核酸分子で
ある。

【００３０】本発明の検査方法は、目的物質に特異的に
結合する検出試薬を用い、検査試薬と目的物質との結合
した複合体を分離し、その量を増幅することにより、微
量の目的物質を感度よく検出する特異結合検査法であ
る。特異結合検査法では、検出試薬として、目的物質に
特異的に結合する特異結合物質であって、標識を備える
ものを用いることが多いが、本発明では、この標識とし
て、特定塩基配列を切断するリボザイムを合成する鋳型
二重鎖ＤＮＡを用いる。すなわち、本発明では、まず、
リボザイムの鋳型となるＤＮＡの結合した特異結合物質
を、検出試薬として用い、これと試料中の目的物質とを
反応させることによって、目的物質と検出試薬との複合
体を得る。検出試薬として特異結合物質を用いるので、
試料中の目的物質は、非常に高い特異性を持って検出試
薬と結合する。そこで、複合体と未反応の検出試薬等と
を分離（Ｂ／Ｆ分離：binding/free分離）すれば、目的
物質が、検出試薬との複合体の形で得られる。

【００３１】得られた複合体の分子数は、試料中に含ま
れていた目的物質と同様に、非常に微量である。例え
ば、目的物質と検出試薬との結合が１：１であれば、目
的物質の分子数と同じである。そこで、検出感度を改善
するためには、この分子数を増幅する必要がある。本発
明では、この分子数を２段階の反応により増幅する。

【００３２】まず、第１の増幅では、複合体に結合して
いる標識（リボザイム合成用二重鎖ＤＮＡ）を用いて検
出結果が増幅される。すなわち、本発明では、この標識
二重鎖ＤＮＡを鋳型として、特定配列を切断するリボザ
イムを合成する。この場合、個々の標識ＤＮＡがそれぞ
れ鋳型となり、複数のリボザイムが合成される。従っ
て、生成するリボザイムの分子数は、複合体の分子数が
増幅されたものとなる。

【００３３】第２の増幅では、生成したリボザイムによ
って基質鎖を切断することにより行われる。リボザイム
自身は触媒であるため、１分子のリボザイムが複数の切
断点を順次切断する。従って、切断されて生成する分子
量の小さい核酸の分子数は、リボザイムの分子数を増幅
したものとなる。

【００３４】また、基質鎖は切断されることにより分子
量が極端に変化する。従って、切断された基質鎖の切断
片である核酸と未反応の基質鎖とは、この分子量の差に
より容易に判別することができる。この基質鎖が切断さ
れて生成した低分子量の核酸の検出は、例えば、電気泳
動法やクロマトグラフなどの分析方法を用いることによ
り簡単に行うことができる。

【００３５】なお、検査結果の増幅に用いる基質鎖に
は、リボザイムによって切断された後の核酸を容易に解
析することのできるような塩基配列をあらかじめ備える
核酸フラグメントを用いることが望ましい。このような
核酸フラグメントとしては、例えば、該核酸フラグメン
トの一端よりあらかじめ定められた位置に切断対象配列
が配置されているものや、端部より等間隔に切断対象配
列が複数個配置されているものなどが挙げられる。これ
は、リボザイムによる切断後に、一定の長さ、あるいは
一定の長さの整数倍の長さの核酸鎖が得られるため、切
断された基質鎖の量を容易に解析することができる。

【００３６】また、検査試薬として、固相に固定した試
薬を用いれば、目的物質と結合した複合体も固相に固定
されることになる。このように、複合体を固相に固定す
ることは、Ｂ／Ｆ分離が容易になるため好ましい。ただ
し、複合体が固相に固定される場合は、標識であるＤＮ
Ａの反応性を高めるために、標識を複合体より遊離させ
る過程を加えることが好ましい。

【００３７】標識を遊離させる方法としては、例えば、
標識である二重鎖ＤＮＡを制限酵素により切断すること
で、標識ＤＮＡの分子中のリボザイムの鋳型になる部分
を固相から遊離させることが考えられる。この場合、特
異結合物質との結合部位と、リボザイムの鋳型となる部
位との間に、制限酵素により切断するための部位を備え
るＤＮＡを、標識として用いる。このような制限酵素に
より切断される部位を備えるＤＮＡを標識として用いれ
ば、Ｂ／Ｆ分離後に、制限酵素を作用させて、特異結合
物質との結合部位とリボザイムの鋳型となる部位との間
を切断することができるので、リボザイムの合成前に、
あらかじめ、標識のＤＮＡ分子のうちリボザイムの鋳型
となる部位を固相から遊離させ、反応性を高めることが
できる。

【００３８】また、本発明によれば、目的物質が多種類
ある場合にも、つぎのようにして容易にそれらの同時検
出ができる。

【００３９】複数種の目的物質が混在する試料につい
て、各目的物質をそれぞれ同時に検出する場合には、各
目的物質ごとに、その特異結合物質を用意し、各特異結
合物質に、それぞれ切断対象の配列が異なるリボザイム
の鋳型である二重鎖ＤＮＡを、標識として結合させたも
のを、検出試薬として用いる。また、リボザイムにより
切断される基質鎖についても、標識ＤＮＡにより合成さ
れるリボザイムの切断対象配列をそれぞれ一箇所ずつ含
む、複数種類の核酸を用意する。なお、各種類の基質鎖
は、切断後の核酸が、その種類に応じて互いに異なる塩
基配列長になるような配列のものを用いる。

【００４０】このようにすれば、各標識により合成され
るリボザイムが、各々異なる配列を切断する機能を有す
るので、切断された基質鎖の塩基配列長とその量とを解
析することにより、各目的物質の量を知ることができ
る。

【００４１】なお、塩基鎖として、一分子中に各リボザ
イムの結合配列および切断配列を有し、かつ任意の切断
点の組み合わせにおいて切断されても、切断片の塩基配
列長が同一にならないような塩基配列の核酸を用いれ
ば、塩基鎖として上述のように複数種類のものを用いず
に、一種類の塩基鎖を用いて、複数種のリボザイムの存
在を検出することもできる。

【００４２】切断された基質鎖の分析は、例えば、ゲル
電気泳動により行うことができる。切断後の基質鎖は、
ゲル電気泳動法を行うと、ゲルパターンとして、その分
子量ごとに、各々異なる場所に局在化する。そこで、こ
の局在化した核酸を、エチジウムブロマイド等で染色し
て蛍光を観察すれば、各々の分子量（塩基配列長）の切
断された基質鎖を、同時に簡単に判別することができ
る。従って、複数の目的物質の存在を、同時にそれぞれ
検出することができる。また、螢光強度を測定すること
により、各々の核酸の量を測定することができるので、
複数の目的物質の有無のみならず、その量も測定するこ
とができる。

【００４３】なお、螢光を測定する方法の他、基質鎖を
染色することなく、吸光度の測定などの分光分析法によ
る定量を行ってもよく、核酸の局在化した領域のゲルを
取り出し、その中に含まれる核酸の量を、公知の方法で
定量しても、切断された核酸の量を知ることができる。

【００４４】また、クロマトグラフィ法を用いても、ゲ
ル電気泳動法による場合と同様に、複数の目的物質が混
在する試料中の各目的物質を簡単に検出できる。

【００４５】ゲル電気泳動法や薄層クロマトグラフィ
法、カラムクロマトグラフィ法などを用いた場合、検出
結果である、切断された核酸の局在化した標本（ゲル
板、カラムなど）をそのまま保存することができるの
で、データを、後日、いつでも再チェックすることがで
きるという利点もある。さらに、ゲル電気泳動法を用い
る場合は、１枚の泳動パターンで簡単に検体相互の比較
ができるというメリットもある。

【００４６】

【実施例】本発明を用いて、試料中に微量に存在するガ
ン胎児性抗原（ＣＥＡ）を定量分析する場合の実施例を
説明する。なお、本実施例では、特異結合物質として、
目的物質であるガン胎児性抗原（ＣＥＡ）の抗体を用い
た。

【００４７】Ａ．検査用試薬の調製本実施例では、目的物質に特異的に結合して、その検出
を容易にするための検査試薬であるＤＮＡ標識抗体と、
目的物質を固相に固定化してＢ／Ｆ分離を容易にするた
めの固相化抗体と、標識であるＤＮＡを鋳型として合成
されるリボザイムにより切断されることで検査結果を増
幅するための基質鎖とを用いて、目的物質の検出を行
う。そこで、まず、ＤＮＡ標識抗体と、固相化抗体と、
基質鎖とを調製した。

【００４８】（Ａ−１）標識用ＤＮＡ溶液の調製ＤＮＡ標識抗体を調製するために、まず、標識用ＤＮＡ
溶液を調製した。本実施例では、アビジン−マレイミド
のリンカーを介して抗体と標識とを結合させる。そこ
で、標識用ＤＮＡとして、ビオチン化された二重鎖ＤＮ
Ａを合成した。すなわち、公知のＤＮＡ合成法により、
核酸自動合成装置を用いて、ビオチン化二重鎖ＤＮＡを
合成し、得られたビオチン化二重鎖ＤＮＡ１ｍｇを、
０．１ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）０．３ｍｌに溶解して標識用ＤＮＡ溶液とした。

【００４９】本実施例において合成したビオチン化二重
鎖ＤＮＡの構造を図１に示す。なお、本実施例および図
面では、慣習に従って、核酸の構造を、該核酸を構成す
るヌクレオチドの塩基の略号（Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ａ、Ｕ）の
配列により表現する。ここで、「Ｇ」、「Ｔ」、
「Ｃ」、「Ａ」、「Ｕ」は、それぞれグアニン、チミ
ン、シトシン、アデニン、ウラシルを表し、「＊」は塩
基対が形成されていることを表し、「Ｎ」は任意のヌク
レオチドを表す。また、二重鎖ＤＮＡについては、慣例
に従って、転写されない鎖の塩基配列によりその構造を
表現し、３’と５’とは、それぞれ、核酸の３’末端と
５’末端とを表す。

【００５０】本実施例の標識用ＤＮＡ鎖は、図１に示す
ように、5'末端から順にビオチン化ポリＡ鎖部１０、Ｅ
ｃｏＲＩ切断配列１１、Ｔ７プロモータ配列１２、第
１の基質との結合部位の鋳型配列１３ａ、触媒ループ部
位の鋳型配列１４、および、第２の基質との結合部位の
鋳型配列１３ｂを備える。

【００５１】ビオチン化ポリＡ鎖部１０の塩基配列は、
5'AAAAAAAA3'である。ＥｃｏＲＩ切断配列１１は、制
限酵素ＥｃｏＲＩによって切断される部位であり、そ
の塩基配列は、5'GAATTC3'である。Ｔ７プロモータ配列
１２の塩基配列は、5'TAATACGACTCACTATA3'であり、第
１の基質鎖との結合部位の鋳型配列１３ａの塩基配列は
5'ATTTT3'である。また、触媒ループ部位の鋳型配列１
４の配列は5'CTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAC3'であり、第２
の基質鎖との結合部位の鋳型配列１３ｂの配列は5'TTA
3'である。これらの配列のうち、基質鎖との結合部位の
鋳型配列１３ａおよび１３ｂと触媒ループ部位の鋳型配
列１４とが、リボザイムを合成する際の鋳型となる。

【００５２】（Ａ−２）ＤＮＡ標識抗体（検査試薬）の
調製上述したように、本実施例では、アビジン−マレイミド
のリンカーを介して、抗体と標識とを結合させる。そこ
で、まず、アビジン化抗体を合成した。

【００５３】３．４ｍｇのアビジンを、０．３ｍｌのリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、０．１ｍｏｌ／
ｌ）に溶解し、そこへ１．２ｍｇ（３６００ｎｍｏｌ）
のＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル)シクロヘキサン−１−カルボキシレートをＮ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド０．０３ｍｌに溶解したものを加
え、３０℃にて１時間反応させ、沈殿した未反応のマレ
イミド化合物を遠心分離にて除去して、上清を採取し
た。なお、本実施例では、Ｎ−スクシンイミジル−４−
（Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボ
キシレートの添加量は１．２ｍｇとしたが、０．８〜
１．６ｍｇ（２４００〜４８００ｎｍｏｌ）の範囲であ
ればよい。

【００５４】この上清を、０．１ｍｏｌ／ｌリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したSephadex G-2
5カラム（ファルマシア社製）を用い、移動相を０．１
ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）とし
たゲル濾過により精製し、反応生成物（マレイミド化合
物）を含む画分約０．３ｍｌを採取した。

【００５５】つぎに、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）をリン酸ナトリウム緩衝液に５ｍｍｏｌ／ｌになる
ように溶解して、ＥＤＴＡ含有リン酸ナトリウム緩衝液
を調製し、この緩衝液０．３ｍｌに約２．０ｍｇの抗Ｃ
ＥＡ抗体を溶解して、抗体溶液を得た。

【００５６】この抗体溶液０．３ｍｌに、上記の反応生
成物を含む画分０．３ｍｌを添加して混ぜ合わせ、４℃
にて２０時間インキュベートした後、反応溶液を、０．
１ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を
移動相として、０．１ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ６．５）で平衡化したUltrogel AcA 44カラム
（ＬＫＢプロダクツ社製）を用いてゲル濾過により精製
し、アビジンの結合した抗ＣＥＡ抗体（アビジン化され
た抗体）を得た。

【００５７】つぎに、アビジン化された抗体とビオチン
化された標識とを結合させて標識化抗体を得た。

【００５８】このアビジン化された抗体に、（Ａ−１）
で調製した標識ＤＮＡ溶液（ビオチン化ＤＮＡを１ｍｇ
含む）を加えて反応させたのち、反応溶液を、０．１ｍ
ｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を移動
相として、０．１ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．０）で平衡化したSephadex G-25カラムを用
いてゲル濾過により精製し、目的とする、ＤＮＡの結合
した抗ＣＥＡ抗体（ＤＮＡ標識抗体）を得た。

【００５９】（Ａ−３）検出用基質核酸（ＲＮＡ）鎖の
調製つぎに、リボザイムの生成を確認するための基質鎖を調
製した。本実施例では、図２に示す配列を有するＲＮＡ
を、公知のＲＮＡ合成法により、核酸自動合成装置を用
いて合成し、基質鎖として用いた。この基質鎖は、塩基
配列長が４００ｂｐｓであり、（Ａ−１）で合成したＤ
ＮＡを鋳型として合成されるリボザイムによって切断さ
れる配列２０を一箇所のみ有している。なお、配列２０
は、本実施例のリボザイムが切断点を特定するのに用い
る配列であり、ここでは、切断点配列と呼ぶ。また、リ
ボザイムの作用する基質鎖中の配列は、結合部位配列と
切断点配列とであるが、これらを合わせてリボザイム切
断配列と呼ぶ。

【００６０】この基質鎖のうち、図２にａおよびａ’と
して表した配列は、本実施例で用いられるリボザイムの
リボザイム切断配列を含まない任意の塩基配列である。
残る配列（図２においてｂとして表した配列）が、本実
施例においてリボザイムと作用する部位であり、その配
列は、5'UAAGUCAAAAU3'である。このうち、３’末端側
の配列「ＡＡＡＡＵ」２１ａと５’末端側の配列「ＵＡ
Ａ」２１ｂとは、リボザイムの基質との結合部位と塩基
対を形成する配列であり、これらの結合部位配列２１ａ
およびｂに挾まれている配列「ＧＵＣ」２０が切断点配
列である。リボザイム切断配列は、配列２１ａ、配列２
０、配列２１ｂである。

【００６１】図３に、本実施例で用いたリボザイムと基
質鎖との結合状態を模式的に示す。本実施例のリボザイ
ム３２は、（Ａ−１）で合成したＤＮＡを鋳型として合
成されるＲＮＡであり、図１に示したＤＮＡの第１の結
合部位鋳型配列１３ａに起因する配列３３ａと、該ＤＮ
Ａの触媒ループ部位鋳型配列１４に起因する配列３４
と、該ＤＮＡの第２の結合部位鋳型配列１３ｂに起因す
る配列３３ｂとを備える。このリボザイムの塩基配列長
は、３２ｂｐｓである。

【００６２】本実施例の基質鎖３１は、配列２１ａが、
リボザイムの第１の結合部位配列３３ａと塩基対を形成
し、配列２１ｂが、リボザイムの第２の結合部位配列３
３ｂと塩基対を形成することにより、図３に示すように
リボザイム分子と結合する。この結合状態において触媒
条件が整うと、基質鎖の配列２０は、リボザイムの触媒
ループ部位配列３４により切断される。

【００６３】なお、切断点配列は、「ＧＵＸ（ＸはＣ、
ＵおよびＡのうちのいずれか）」であるが、本実施例で
調製した検出用基質鎖は、切断点配列２０として配列
「ＧＵＣ」を備えている。切断点配列２０の切断点は、
配列「ＧＵＣ」のＣの３’位である。本実施例の基質鎖
では、該基質鎖の３’末端から切断点までの塩基配列
長、および、該基質鎖の５’末端から切断点までの塩基
配列長は、いずれも２００ｂｐｓである。

【００６４】（Ａ−４）固相化抗体の作製０．１ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
２）１．０ｍｌに、抗ＣＥＡ抗体約４．０ｍｇを溶解し
たものを、マイクロタイタープレートの各ウエルに加
え、そのまま４℃にて１晩インキュベートした。これに
より、マイクロタイタープレートに抗ＣＥＡ抗体が固定
化された。そこで、マイクロタイタープレート上の液を
捨て、マイクロタイタープレートをリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７．２）にて洗浄して、マイクロタイタープ
レートに固定化された抗ＣＥＡ抗体である固相化抗体が
得られた。なお、このマイクロタイタープレートは、反
応容器として使用できる凹みである複数のウエルを備え
ており、各々のウエルの内壁に、それぞれ抗体が固定化
された。

【００６５】Ｂ．検量線の作成以上のようにして調製したＤＮＡ標識抗体、固相化抗
体、および基質鎖を用い、目的物質を既知の種々の濃度
で含む標準試料について、それぞれ次の（Ｂ−１）〜
（Ｂ−５）の処理を行い、その結果から、後述する（Ｂ
−６）に示すように、目的物質の定量分析のための検量
線を作成した。

【００６６】（Ｂ−１）標識化免疫反応複合体の形成Ｂ／Ｆ分離を容易にするためには、検出試薬および目的
物質のうちのいずれかが固相に固定化されていることが
好ましい。そこで、本実施例では、まず目的物質を固相
に固定化したのち、固定化された目的物質に検出試薬を
結合させる。このようにすれば、目的物質と検出試薬と
の複合体は、固相化抗体−抗原−標識化抗体複合体（標
識化免疫反応複合体）となり、固定化されるので、Ｂ／
Ｆ分離および洗浄が容易になる。

【００６７】まず、（Ａ−４）で作製した抗体の固定化
されたマイクロタイタープレートのウエルにＣＥＡの標
準試料５ｍｌを加え、室温にて２時間インキュベートし
た。これにより、固相化抗体に抗原である目的物質（Ｃ
ＥＡ）が結合した。なお、検量線の作成のためには、同
一マイクロタイタープレートを用いて、濃度の異なる複
数の標準試料についてそれぞれ測定するが、この場合、
各標準試料ごとに、それぞれ異なるウエルを用いる。

【００６８】つぎに、目的物質を結合させたウエルから
液を除去し、該ウエルをリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．２）にて洗浄したのち、該ウエルに検出試薬溶液
１．０ｍｌを加え、室温にて１時間インキュベートし
た。これにより、固相化抗体に結合した抗原に、標識化
抗体が結合した。なお、検出試薬溶液は、（Ａ−２）で
調製したＤＮＡ標識化抗体を、０．１ｍｏｌ／ｌリン酸
ナトリウム緩衝液に、その濃度が５０μｍｏｌ／ｌにな
るように溶解したものである。

【００６９】最後に、ウエルから液を除去したのち、該
ウエルをリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）にて洗
浄して未反応検出試薬を除去し、固相化抗体−抗原（Ｃ
ＥＡ）−標識化抗体複合体（標識化免疫反応複合体）を
得た。

【００７０】（Ｂ−２）標識の分離得られた標識化免疫反応複合体に１０μｌの制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩと５００μｌの緩衝液（５０ｍｍｏｌ／ｌの
ＮａＣｌと、７ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ₂とを含むＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ溶液、ｐＨ７．５）を加え、３７℃で３０
分間インキュベートした。これにより、標識ＤＮＡのＥ
ｃｏＲＩ切断配列１１が切断され、ＤＮＡ標識のＴ７
プロモータ配列１２、第１の基質との結合部位配列１３
ａ、リボザイムの触媒ループ部位配列１４、および、第
２の基質との結合部位配列１３ｂの部分が、標識化免疫
反応複合体から反応溶液中に遊離した。最後に、反応溶
液をフェノール・クロロホルム処理した後、エタノール
を加えて、遊離したＤＮＡ標識を沈殿させ、標識ＤＮＡ
（配列１０、１１を除く）を回収した。なお、得られた
標識ＤＮＡの塩基配列長は３９ｂｐｓである。

【００７１】（Ｂ−３）リボザイムの合成まず、４０ｍｍｏｌ／ｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．０）に、それぞれ０．５ｍｍｏｌ／ｌになるよう
に、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン
５’−三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン５’−三リン酸
（ＣＴＰ）、ウリジン５’−三リン酸（ＡＴＰ）を加
え、さらに、８ｍｍｏｌ／ｌになるようにＭｇＣｌ
₂を、５ｍｍｏｌ／ｌになるようにジチオトレイトール
（ＤＤＴ）を、２ｍｍｏｌ／ｌになるようにスペルミジ
ンを加え、最後に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ３００Ｕ
と、リボヌクレアーゼ抑制剤（ＲＮａｓｅインヒビタ
ー）５０Ｕとを加えて、ｉｎｖｉｔｒｏ転写反応液と
した。

【００７２】このｉｎｖｉｔｒｏ転写反応液１ｍｌ中
に、（Ｂ−２）で回収したＤＮＡの全量を加え、３７℃
で４時間保温した。これにより、ＲＮＡであるリボザイ
ムが合成されたので、反応溶液をフェノール・クロロホ
ルム処理した後、エタノールを加えて核酸を沈殿させ、
濾取して、ＤＮＡと反応生成物であるリボザイムとの混
合物を得た。

【００７３】（Ｂ−４）基質鎖の切断５０ｍｍｏｌ／ｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．
０）に２５ｍｍｏｌ／ｌになるようにＭｇＣｌ₂を加え
た溶液１ｍｌに、（Ａ−３）で調製した基質鎖１ｍｍｏ
ｌと、（Ｂ−３）で得たＤＮＡとリボザイムとの混合物
の全量とを添加して、リボザイム反応溶液とした。この
リボザイム反応溶液を３７℃で３時間インキュベートし
た。これにより、基質鎖がリボザイムの作用で切断され
た。反応溶液をフェノール・クロロホルム処理した後、
エタノールを加えて核酸を沈殿させ、濾取して、ＤＮ
Ａ、リボザイム、未反応の基質鎖、および切断された基
質鎖を含む核酸混合物を得た。

【００７４】（Ｂ−５）検出（Ｂ−４）で得られた核酸混合物の全量を、０．５ｍｌ
の尿素-ＥＤＴＡ溶液（８Ｎの尿素水溶液に、５ｍｍｏ
ｌ／ｌになるようにＥＤＴＡを溶解したもの（ｐＨ
７））に溶解し、さらに、等量のスクロース・色素溶液
（２０％スクロース水溶液に、５ｍｍｏｌ／ｌになるよ
うにＥＤＴＡを溶解したもの（ｐＨ７）に、０．０５％
のブロモフェノールブルーおよび０．０５％のキシレン
シアノールＦＦを加えたもの）を加えた。この溶液を、
８．３ｍｏｌ／ｌの尿素水溶液を加えたアクリルアミド
ゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した
ところ、ＤＮＡに起因するバンドと、リボザイムに起因
するバンドと、未反応の基質鎖に起因するバンドとに加
えて、さらに切断された基質鎖に起因するバンドを有す
る泳動パターンが得られた。

【００７５】得られた泳動パターンの例として、ＣＥＡ
標準試料の濃度が０．０１μｍｏｌ／ｌの場合の泳動パ
ターンを、図４に示す。この試料の検出結果では、ゲル
板４０上に、泳動方向４５に対して直角な３つのバンド
４１〜４３が見られた。各バンドの塩基配列長は、泳動
距離が短い方から順に、バンド４１が４００ｐｂｓ、バ
ンド４２が２００ｂｐｓ、バンド４３が３０〜４０ｂｐ
ｓであった。従って、バンド４１は未反応の基質鎖のバ
ンドであり、バンド４２はリボザイムにより２つに切断
された基質鎖両方のバンドであり、バンド４３は標識Ｄ
ＮＡ（３９ｂｐｓ）およびリボザイム（３２ｂｐｓ）の
バンドであると考えられる。

【００７６】そこで、染色された核酸１ｍｏｌあたりの
螢光強度をあらかじめ求めておき、切断された基質鎖の
バンド４２の螢光強度から、切断された基質鎖の量（ｍ
ｏｌ）を求めた。なお、ゲル板４０から、切断された基
質鎖のバンド４２の部分のゲルを取りだし、そのゲルに
含まれているＲＮＡを公知の方法で定量分析して、切断
された基質鎖の量を測定してもよい。

【００７７】（Ｂ−６）検量線の作成上記で用いた同一の免疫検査用タイタープレートの未使
用ウエルにて、既知濃度の各標準試料について、（Ｂ−
１）〜（Ｂ−５）の検出操作をそれぞれ行い、標準試料
中のＣＥＡ濃度（μｍｏｌ／ｌ）と、切断された基質鎖
の量（μｍｏｌ）との関係をプロットし、検量線を作成
した。その結果、図５のような検量線を得た。

【００７８】Ｃ．目的物質の定量分析既知の濃度（この濃度を真の濃度と呼ぶ）の目的物質を
含む試料について、上記（Ｂ−１）〜（Ｂ−５）の操作
を行い、切断された基質鎖の量を求め、該基質鎖量をも
とに、（Ｂ−６）で作成した検量線から、試料中の目的
物質の濃度を求めたところ、求められた目的物質の濃度
は、真の濃度に一致した。このことからわかるように、
本実施例の検査方法によれば、微量な目的物質を正確に
検出できる。

【００７９】

【発明の効果】以上のように、本発明によれば、標識と
してリボザイムの鋳型であるＤＮＡを用いることによ
り、目的物質を、簡便かつ高感度に検出することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】標識として使用したＤＮＡの構成例を示す模
式図である。

【図２】使用した基質ＲＮＡの構成例を示す模式図で
ある。

【図３】リボザイムと基質ＲＮＡとの結合状態を示す
模式図である。

【図４】切断されたＲＮＡの泳動パターンを示す模式
図である。

【図５】リボザイム量と生成するＲＮＡ断片量との関
係をプロットした検量線を示すグラフである。

【符号の説明】

１０…標識ＤＮＡのビオチン化ポリＡ鎖部、１１…標識
ＤＮＡのＥｃｏＲＩ切断配列、１２…標識ＤＮＡのＴ
７プロモータ配列、１３ａ…標識ＤＮＡの第１の基質と
の結合部位の鋳型配列、１３ｂ…標識ＤＮＡの第２の基
質との結合部位の鋳型配列、１４…標識ＤＮＡの触媒ル
ープ部位の鋳型配列、２０…リボザイム切断部位、２１
ａ…第１のリボザイムとの結合部位配列、２１ｂ第２の
リボザイムとの結合部位配列、３１…基質鎖、３２…リ
ボザイム、３３ａ…リボザイムの第１の基質との結合部
位、３３ｂ…リボザイムの第２の基質との結合部位、３
４…リボザイムの触媒ループ部位、４０…電気泳動用ゲ
ル板、４１…未反応の基質鎖のバンド、４２…リボザイ
ムにより切断された基質鎖のバンド、４３…標識ＤＮＡ
のバンド、４４…リボザイムのバンド、４５…泳動方
向。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成７年２月２８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項６

【補正方法】変更

【補正内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 9/00 15/09 ＺＮＡＧ０１Ｎ 33/53 ＤＪ 33/535

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】目的物質と特異的に結合する性質を有する
特異結合部分と、標識部分とを、一分子中に有する検出
試薬と、試料中の該目的物質とを結合させて複合体を形
成する複合体形成ステップと、上記複合体中の上記標識
部分を用いて上記試料中の目的物質の有無および／また
は量を推定する検出ステップとを備える特異結合検査法
において、上記標識部分は、リボザイムの合成に際して鋳型として用いることのでき
る塩基配列を有する二重鎖デオキシリボ核酸であり、上記検出ステップは、上記複合体中の上記二重鎖デオキシリボ核酸を鋳型とし
てリボザイムを合成する合成ステップと、上記合成したリボザイムを用いて、該リボザイムにより
切断される塩基配列であるリボザイム切断配列を分子中
の少なくとも一部に有する核酸分子である基質鎖を切断
して切断された核酸を得るステップと、上記切断された核酸を検出するステップとを有すること
を特徴とする特異結合検査法。
【請求項２】請求項１において、上記目的物質と上記特異結合部分との組み合わせは、抗原またはハプテンおよび抗体と、生理活性物質および該生理活性物質の受容体と、核酸および該核酸に相補的な塩基配列を備える核酸と、多糖類およびレクチンと、免疫グロブリンＧおよびプロテインＡとのいずれかであ
ることを特徴とする特異結合検査法。
【請求項３】請求項１ににおいて、上記基質鎖の各分子は、上記リボザイム切断配列を、分子中のあらかじめ定めら
れた位置に備えることを特徴とする特異結合検査法。
【請求項４】請求項３において、上記リボザイム切断配列は、該リボザイム切断配列を有
する基質鎖１分子が上記リボザイムにより切断されて生
成する２つの核酸分子の塩基配列長が、互いに同じにな
るような位置に存在することを特徴とする特異結合検査
法。
【請求項５】請求項１において、上記目的物質は複数種類であり、上記検出試薬は、上記目的物質に応じて複数種類用いら
れ、各々の種類の検出試薬の特異結合部分は、それぞれ、対
応する目的物質に特異的に結合する性質を有し、各々の種類の検出試薬の標識部分は、それぞれ、対応す
る目的物質ごとに異なる配列を切断するリボザイムの鋳
型となる塩基配列を有する二重鎖デオキシリボ核酸であ
り、上記基質鎖は、上記リボザイムに応じて複数種類用いら
れ、各々の種類の基質鎖は、それぞれ、対応する上記リボザ
イムのリボザイム切断配列を分子中に有することを特徴
とする特異結合検査法。
【請求項６】請求項１において、上記目的物質は複数種類であり、上記検出試薬は、上記目的物質に応じて複数種類用いら
れ、各々の種類の検出試薬の特異結合部分は、それぞれ、対
応する目的物質に特異的に結合する性質を有し、各々の種類の検出試薬の標識部分は、それぞれ、対応す
る目的物質ごとに異なる配列を切断するリボザイムであ
り、上記基質鎖は、分子中に、上記各検出試薬のリボザイム
のリボザイム切断配列を有することを特徴とする特異結
合検査法。
【請求項７】請求項５において、上記各々の種類の基質鎖は、同時に合成される他のリボ
ザイムのリボザイム切断配列を有しないことを特徴とす
る特異結合検査法。
【請求項８】請求項５において、上記各々の種類の基質鎖におけるリボザイム切断配列の
位置は、それぞれ、対応する上記リボザイムごとにあらかじめ定
められており、上記対応するリボザイムにより切断されて生じる核酸の
塩基配列長が、対応するリボザイムごとに互いに異なる
ような位置であることを特徴とする特異結合検査法。
【請求項９】請求項１において、上記複合体形成ステップは、上記試料中の目的物質を固相の担体に固定するステップ
と、上記固定化した目的物質に、上記検出試薬を結合させる
ステップとを備えることを特徴とする特異結合検査法。
【請求項１０】請求項１において、上記検出試薬は、固相の担体に固定化されていることを
特徴とする特異結合検査法。
【請求項１１】請求項９または１０において、上記検出試薬の標識部分は、上記特異結合部分と、制限
酵素により切断される塩基配列である制限酵素切断配列
を介して結合されており、上記検出ステップは、上記合成ステップの前に、上記制限酵素切断配列を、制限酵素により切断するステ
ップを、さらに備えていることを特徴とする特異結合検
査法。
【請求項１２】あらかじめ定められた検査対象物質に対
する特異結合物質との接続部分の配列と、リボ核酸合成の開始のためのプロモータ配列と、リボザイムの鋳型となる配列とを備える二重鎖デオキシ
リボ核酸であることを特徴とする検査用試薬。
【請求項１３】請求項１２において、上記二重鎖デキオキシリボ核酸は、５’末端から順に、上記接続部分の配列であるビオチン化ポリＡ鎖部と、上記プロモータ配列であるＴ７プロモータ配列と、上記リボザイムの鋳型となる配列とを備えることを特徴
とする検査用試薬。
【請求項１４】請求項１３において、上記接続部分の配列と、上記プロモータ配列との間に、制限酵素によって切断される配列を、さらに備えること
を特徴とする検査用試薬。