JP2660661B2 - 遺伝子の定量方法 - Google Patents
遺伝子の定量方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、微量の遺伝子の定量方
法に関する。その主たる利用分野としては、医学、薬理
学、生物学、獣医学などの分野における定量的遺伝子測
定が挙げられる。
法に関する。その主たる利用分野としては、医学、薬理
学、生物学、獣医学などの分野における定量的遺伝子測
定が挙げられる。
【０００２】
【従来の技術】ポリメラーゼチェインリアクション（以
下、「ＰＣＲ」と略記する。）は、検出対象となる遺伝
子（以下、「検出対象遺伝子」と略記することがあ
る。）の中の特定の領域をはさむ２種のプライマーを用
いて、その特定塩基配列の遺伝子断片を指数関数的に増
幅させる反応であり、近年、微量の遺伝子の検出に多用
されている。ＰＣＲを用いると、微量の遺伝子を容易に
１万ないし１００万倍に増幅することができるが、未知
の反応促進物質や反応抑制物質が存在するために、増幅
効率の再現性に乏しく、その定量的測定は極めて困難で
ある。
下、「ＰＣＲ」と略記する。）は、検出対象となる遺伝
子（以下、「検出対象遺伝子」と略記することがあ
る。）の中の特定の領域をはさむ２種のプライマーを用
いて、その特定塩基配列の遺伝子断片を指数関数的に増
幅させる反応であり、近年、微量の遺伝子の検出に多用
されている。ＰＣＲを用いると、微量の遺伝子を容易に
１万ないし１００万倍に増幅することができるが、未知
の反応促進物質や反応抑制物質が存在するために、増幅
効率の再現性に乏しく、その定量的測定は極めて困難で
ある。
【０００３】ＰＣＲにより増幅された遺伝子（以下、
「増幅遺伝子」と略記する。）を定量的に測定する方法
としては、Ｗａｎｇらが開発した「競合的ＰＣＲ法」が
挙げられる［プロシーディングズ オブ ザ ナショナ
ル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ユーエス
エー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、86巻、9717頁
（1989年）参照］。該方法においては、検出対象遺伝
子、放射性同位元素で標識されたプライマー、および該
プライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより増幅遺
伝子を得ることができるが、検出対象遺伝子を用いてＰ
ＣＲ反応を行った場合とは若干異なる鎖長の増幅遺伝子
を与えるように設計された既知量の人工的遺伝子（以
下、「競合遺伝子」と略記する。）を共存させた状態
で、ＰＣＲ反応を行う。その後、反応液を電気泳動に供
し、検出対象遺伝子から得られた増幅遺伝子および競合
遺伝子から得られた増幅遺伝子を分離し、それぞれのバ
ンドの放射能を測定する。この様な測定を、競合遺伝子
の添加量を変化させながら行い、両バンドの強度が等し
くなったところで両者の濃度が等しいと仮定して、検出
対象遺伝子の濃度を決定する。
「増幅遺伝子」と略記する。）を定量的に測定する方法
としては、Ｗａｎｇらが開発した「競合的ＰＣＲ法」が
挙げられる［プロシーディングズ オブ ザ ナショナ
ル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ユーエス
エー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、86巻、9717頁
（1989年）参照］。該方法においては、検出対象遺伝
子、放射性同位元素で標識されたプライマー、および該
プライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより増幅遺
伝子を得ることができるが、検出対象遺伝子を用いてＰ
ＣＲ反応を行った場合とは若干異なる鎖長の増幅遺伝子
を与えるように設計された既知量の人工的遺伝子（以
下、「競合遺伝子」と略記する。）を共存させた状態
で、ＰＣＲ反応を行う。その後、反応液を電気泳動に供
し、検出対象遺伝子から得られた増幅遺伝子および競合
遺伝子から得られた増幅遺伝子を分離し、それぞれのバ
ンドの放射能を測定する。この様な測定を、競合遺伝子
の添加量を変化させながら行い、両バンドの強度が等し
くなったところで両者の濃度が等しいと仮定して、検出
対象遺伝子の濃度を決定する。
【０００４】一方、増幅遺伝子を酵素免疫測定法により
測定することも、近年盛んになってきた［特開平５−１
７６８００号公報；プロシーディングズ オブ ザ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、86巻、24
23頁（1989年）；クリニカル ケミストリー（Clin.Che
m. ）、37巻、422 頁（1991年）；同37巻、1626頁（199
1年）；アナリティカル バイオケミストリー（Anal. B
iochem.）、205 巻、１頁（1992年）；および同208
巻、110 頁（1993年）等参照］。
測定することも、近年盛んになってきた［特開平５−１
７６８００号公報；プロシーディングズ オブ ザ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、86巻、24
23頁（1989年）；クリニカル ケミストリー（Clin.Che
m. ）、37巻、422 頁（1991年）；同37巻、1626頁（199
1年）；アナリティカル バイオケミストリー（Anal. B
iochem.）、205 巻、１頁（1992年）；および同208
巻、110 頁（1993年）等参照］。
【０００５】かかる方法は、いずれも増幅遺伝子の定性
分析を行う方法であり、例えば、特開平５−１７６８０
０号公報に記載の方法について説明すると、次のとおり
である。まず、検出対象遺伝子の塩基配列に対応する１
対のプライマーを選択してＰＣＲを行う。該増幅遺伝子
を酵素免疫測定法で測定するために、これらのプライマ
ーはあらかじめリガンドによって標識化しておく。得ら
れたＰＣＲ反応液を、プライマーの一方を標識化するた
めに用いたリガンドに対するレセプターを固定化した固
相上に供し、増幅遺伝子を固相上に捕捉する。遊離の標
識プライマーを除去した後、プライマーの他方を標識化
するために用いたリガンドに対するレセプターと検出用
標識体Ｅとのコンジュゲートを反応させ、Ｅの活性を測
定する。このように、増幅遺伝子の酵素免疫測定法にお
いては、ＰＣＲを行うためのプライマーまたは増幅遺伝
子を検出するためのプローブを、リガンドで標識し、こ
れらの標識を介して酵素免疫測定を行う。
分析を行う方法であり、例えば、特開平５−１７６８０
０号公報に記載の方法について説明すると、次のとおり
である。まず、検出対象遺伝子の塩基配列に対応する１
対のプライマーを選択してＰＣＲを行う。該増幅遺伝子
を酵素免疫測定法で測定するために、これらのプライマ
ーはあらかじめリガンドによって標識化しておく。得ら
れたＰＣＲ反応液を、プライマーの一方を標識化するた
めに用いたリガンドに対するレセプターを固定化した固
相上に供し、増幅遺伝子を固相上に捕捉する。遊離の標
識プライマーを除去した後、プライマーの他方を標識化
するために用いたリガンドに対するレセプターと検出用
標識体Ｅとのコンジュゲートを反応させ、Ｅの活性を測
定する。このように、増幅遺伝子の酵素免疫測定法にお
いては、ＰＣＲを行うためのプライマーまたは増幅遺伝
子を検出するためのプローブを、リガンドで標識し、こ
れらの標識を介して酵素免疫測定を行う。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、増幅遺
伝子を定量的に測定する方法として比較的信頼性が高い
方法は「競合的ＰＣＲ法」のみであるが、該方法におい
ては、検出対象遺伝子から得られた増幅遺伝子および競
合遺伝子から得られた増幅遺伝子を、それぞれの鎖長の
違いに応じて分離定量するために、電気泳動および放射
能測定を要する。電気泳動は繁雑な操作と長い測定時間
を要し、多数検体の測定および自動化には適さない。さ
らに、放射能測定は測定と廃棄物処理に特別の施設を要
する。一方、酵素免疫測定法は、多数検体の測定や自動
化には適しているものの、該方法を適用した増幅遺伝子
の測定方法はいずれも定性分析用である。
伝子を定量的に測定する方法として比較的信頼性が高い
方法は「競合的ＰＣＲ法」のみであるが、該方法におい
ては、検出対象遺伝子から得られた増幅遺伝子および競
合遺伝子から得られた増幅遺伝子を、それぞれの鎖長の
違いに応じて分離定量するために、電気泳動および放射
能測定を要する。電気泳動は繁雑な操作と長い測定時間
を要し、多数検体の測定および自動化には適さない。さ
らに、放射能測定は測定と廃棄物処理に特別の施設を要
する。一方、酵素免疫測定法は、多数検体の測定や自動
化には適しているものの、該方法を適用した増幅遺伝子
の測定方法はいずれも定性分析用である。
【０００７】しかして、本発明の目的は、操作が簡便で
あり、多数検体の測定や自動化に適し、かつ高精度で定
量的に増幅遺伝子を測定する方法を提供することにあ
る。
あり、多数検体の測定や自動化に適し、かつ高精度で定
量的に増幅遺伝子を測定する方法を提供することにあ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、上記の
目的は、リガンドＡによって標識されたプライマーＰ1
およびリガンドＢによって標識されたプライマーＰ2 か
らなるプライマー対を用いて、検出対象遺伝子をＰＣＲ
によって増幅させる工程、リガンドＡに対するレセプタ
ーＲa が固定化された固相に増幅遺伝子を反応させる工
程、検出用標識体Ｅによって標識されたリガンドＢに対
するレセプターＲb を該固相に反応させる工程、および
検出用標識体Ｅの量を測定する工程からなる遺伝子の定
量法において、該ＰＣＲ反応液中に一定量の内部標準遺
伝子を共存させ、該内部標準遺伝子をリガンドＣによっ
て標識されたプライマーＰ3 およびリガンドＢによって
標識されたプライマーＰ4 からなるプライマー対を用い
て同時にＰＣＲを行い、得られた反応液の一部をリガン
ドＡに対するレセプターＲa が固定化された固相と、他
の一部をリガンドＣに対するレセプターＲc が固定化さ
れた固相と、それぞれ反応させ、それぞれの固相に検出
用標識体Ｅによって標識されたリガンドＢに対するレセ
プターＲb を反応させ、それぞれの固相上の検出用標識
体Ｅに対応する信号を測定し、両者の信号比を求めるこ
とを特徴とする遺伝子の定量方法を提供することにより
達成される。
目的は、リガンドＡによって標識されたプライマーＰ1
およびリガンドＢによって標識されたプライマーＰ2 か
らなるプライマー対を用いて、検出対象遺伝子をＰＣＲ
によって増幅させる工程、リガンドＡに対するレセプタ
ーＲa が固定化された固相に増幅遺伝子を反応させる工
程、検出用標識体Ｅによって標識されたリガンドＢに対
するレセプターＲb を該固相に反応させる工程、および
検出用標識体Ｅの量を測定する工程からなる遺伝子の定
量法において、該ＰＣＲ反応液中に一定量の内部標準遺
伝子を共存させ、該内部標準遺伝子をリガンドＣによっ
て標識されたプライマーＰ3 およびリガンドＢによって
標識されたプライマーＰ4 からなるプライマー対を用い
て同時にＰＣＲを行い、得られた反応液の一部をリガン
ドＡに対するレセプターＲa が固定化された固相と、他
の一部をリガンドＣに対するレセプターＲc が固定化さ
れた固相と、それぞれ反応させ、それぞれの固相に検出
用標識体Ｅによって標識されたリガンドＢに対するレセ
プターＲb を反応させ、それぞれの固相上の検出用標識
体Ｅに対応する信号を測定し、両者の信号比を求めるこ
とを特徴とする遺伝子の定量方法を提供することにより
達成される。
【０００９】本発明において用いられるプライマー、固
相およびレセプターを、本明細書中で以下のように略記
することがある。 リガンドＡによって標識されたプライマーＰ1 ：Ａ・Ｐ
1 リガンドＢによって標識されたプライマーＰ2 ：Ｂ・Ｐ
2 リガンドＣによって標識されたプライマーＰ3 ：Ｃ・Ｐ
3 リガンドＢによって標識されたプライマーＰ4 ：Ｂ・Ｐ
4 リガンドＡに対するレセプターＲa が固定化された固
相：Ｒa 固定化固相 リガンドＣに対するレセプターＲc が固定化された固
相：Ｒc 固定化固相 検出用標識体Ｅによって標識されたリガンドＢに対する
レセプターＲb ：Ｒb・Ｅ
相およびレセプターを、本明細書中で以下のように略記
することがある。 リガンドＡによって標識されたプライマーＰ1 ：Ａ・Ｐ
1 リガンドＢによって標識されたプライマーＰ2 ：Ｂ・Ｐ
2 リガンドＣによって標識されたプライマーＰ3 ：Ｃ・Ｐ
3 リガンドＢによって標識されたプライマーＰ4 ：Ｂ・Ｐ
4 リガンドＡに対するレセプターＲa が固定化された固
相：Ｒa 固定化固相 リガンドＣに対するレセプターＲc が固定化された固
相：Ｒc 固定化固相 検出用標識体Ｅによって標識されたリガンドＢに対する
レセプターＲb ：Ｒb・Ｅ
【００１０】本発明の遺伝子の定量方法の工程を図１に
示した。該工程について、さらに詳しく説明する。 （１）本発明の方法においては、まず内部標準遺伝子が
選択される。検出対象遺伝子を含有するＰＣＲ用反応液
に所定量の内部標準遺伝子を共存させ、検出対象遺伝子
に対して特異的なリガンド標識プライマー（Ａ・Ｐ1 お
よびＢ・Ｐ2 ）、ならびに内部標準遺伝子に対して特異
的なリガンド標識プライマー（Ｃ・Ｐ3およびＢ・Ｐ4
）を加え、ＰＣＲを実施する。その結果、検出対象遺
伝子からはリガンドＡおよびＢを両末端に有する増幅遺
伝子が、また内部標準遺伝子からはリガンドＣおよびＢ
を両末端に有する増幅遺伝子が、それぞれ生成する。
示した。該工程について、さらに詳しく説明する。 （１）本発明の方法においては、まず内部標準遺伝子が
選択される。検出対象遺伝子を含有するＰＣＲ用反応液
に所定量の内部標準遺伝子を共存させ、検出対象遺伝子
に対して特異的なリガンド標識プライマー（Ａ・Ｐ1 お
よびＢ・Ｐ2 ）、ならびに内部標準遺伝子に対して特異
的なリガンド標識プライマー（Ｃ・Ｐ3およびＢ・Ｐ4
）を加え、ＰＣＲを実施する。その結果、検出対象遺
伝子からはリガンドＡおよびＢを両末端に有する増幅遺
伝子が、また内部標準遺伝子からはリガンドＣおよびＢ
を両末端に有する増幅遺伝子が、それぞれ生成する。
【００１１】（２）得られたＰＣＲ反応後の溶液の一部
を、Ｒa 固定化固相と、また、別の一部をＲc 固定化固
相と、それぞれ反応させる。かかる反応により、Ｒa 固
定化固相上にはＲa とリガンドＡの結合を介して検出対
象遺伝子から得られた増幅遺伝子が、またＲc 固定化固
相上にはＲc とリガンドＣの結合を介して内部標準遺伝
子から得られた増幅遺伝子が、それぞれ捕捉される。増
幅遺伝子が捕捉された固相は、洗浄して、結合していな
い遊離のプライマーや増幅遺伝子を除去しておく。
を、Ｒa 固定化固相と、また、別の一部をＲc 固定化固
相と、それぞれ反応させる。かかる反応により、Ｒa 固
定化固相上にはＲa とリガンドＡの結合を介して検出対
象遺伝子から得られた増幅遺伝子が、またＲc 固定化固
相上にはＲc とリガンドＣの結合を介して内部標準遺伝
子から得られた増幅遺伝子が、それぞれ捕捉される。増
幅遺伝子が捕捉された固相は、洗浄して、結合していな
い遊離のプライマーや増幅遺伝子を除去しておく。
【００１２】（３）検出対象遺伝子または内部標準遺伝
子から得られた増幅遺伝子が捕捉された固相に、Ｒb ・
Ｅを反応させる。これにより、検出対象遺伝子または内
部標準遺伝子から得られた増幅遺伝子の濃度に対応した
検出用標識体Ｅが結合した固相が得られる。遊離のＲb
・Ｅを除去するためにそれぞれの固相を洗浄する。
子から得られた増幅遺伝子が捕捉された固相に、Ｒb ・
Ｅを反応させる。これにより、検出対象遺伝子または内
部標準遺伝子から得られた増幅遺伝子の濃度に対応した
検出用標識体Ｅが結合した固相が得られる。遊離のＲb
・Ｅを除去するためにそれぞれの固相を洗浄する。
【００１３】（４）それぞれの固相上における検出用標
識体Ｅの活性を測定する。Ｒa 固定化固相およびＲｃ固
定化固相のそれぞれに対して信号強度ＳおよびＳo を得
る。次いで、信号強度比Ｓ／Ｓo を用いて被検出遺伝子
の濃度を算出する。
識体Ｅの活性を測定する。Ｒa 固定化固相およびＲｃ固
定化固相のそれぞれに対して信号強度ＳおよびＳo を得
る。次いで、信号強度比Ｓ／Ｓo を用いて被検出遺伝子
の濃度を算出する。
【００１４】本発明の方法において用いられる内部標準
遺伝子は、検出対象遺伝子と異なるものであれば特に制
限されないが、本発明において測定に供される検体はヒ
トまたは動植物等の生体から抽出された多種類の遺伝子
を含有する場合が多いので、内部標準遺伝子はそれらと
区別されるものでなければならない。そのためには、内
部標準遺伝子としては天然に存在する確率が低い人工的
な遺伝子を用いることが好ましい。内部標準遺伝子は、
通常の遺伝子の合成方法に従って合成することができる
が、市販されている人工的な遺伝子を使用することも可
能である。例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社が販売している各
種プラスミドベクター（ｐＧＥＭシリーズ、ｐＳＰシリ
ーズ、ｐＢＲシリーズ、ｐＣＡＴシリーズ等）またはラ
ムダベクター（ＬａｍｂｄａＧＥＭシリーズ、Ｌａｍｂ
ｄａｇｔシリーズ等）は純度が高く、安定で、取扱いが
容易であるので好適である。
遺伝子は、検出対象遺伝子と異なるものであれば特に制
限されないが、本発明において測定に供される検体はヒ
トまたは動植物等の生体から抽出された多種類の遺伝子
を含有する場合が多いので、内部標準遺伝子はそれらと
区別されるものでなければならない。そのためには、内
部標準遺伝子としては天然に存在する確率が低い人工的
な遺伝子を用いることが好ましい。内部標準遺伝子は、
通常の遺伝子の合成方法に従って合成することができる
が、市販されている人工的な遺伝子を使用することも可
能である。例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社が販売している各
種プラスミドベクター（ｐＧＥＭシリーズ、ｐＳＰシリ
ーズ、ｐＢＲシリーズ、ｐＣＡＴシリーズ等）またはラ
ムダベクター（ＬａｍｂｄａＧＥＭシリーズ、Ｌａｍｂ
ｄａｇｔシリーズ等）は純度が高く、安定で、取扱いが
容易であるので好適である。
【００１５】内部標準遺伝子はＰＣＲ反応のチューブ間
変動を補正するために使用されるものであるから、チュ
ーブ間変動要因の影響を十分に反映できる濃度で使用す
ることが必要である。そのためにはＲc 固定化固相の信
号強度Ｓo が信号強度測定系の検出可能域の中央付近に
なるように、内部標準遺伝子の使用量を選択することが
好ましい。Ｓo が測定系の検出下限あるいは上限の濃度
に近くなると、チューブ間変動要因の影響を十分に反映
できないため好ましくない。
変動を補正するために使用されるものであるから、チュ
ーブ間変動要因の影響を十分に反映できる濃度で使用す
ることが必要である。そのためにはＲc 固定化固相の信
号強度Ｓo が信号強度測定系の検出可能域の中央付近に
なるように、内部標準遺伝子の使用量を選択することが
好ましい。Ｓo が測定系の検出下限あるいは上限の濃度
に近くなると、チューブ間変動要因の影響を十分に反映
できないため好ましくない。
【００１６】プライマー対Ｐ1 およびＰ2 、またはＰ3
およびＰ4 は、検出対象遺伝子または内部標準遺伝子の
塩基配列の中から該遺伝子に特異的な配列を検索し、そ
の中から選択される。また、プライマー同士の相補鎖生
成を避けるために、両プライマーの３′側が相補性を有
しないこと、プライマー内にパリンドロームを形成しな
いこと等が必要である。さらに、プライマーＰ3 および
Ｐ4 の塩基配列については、人工的な内部標準遺伝子の
配列の中でも特に天然の存在確率が可能な限り低いもの
を選択して用いることが好ましい。プライマーの長さ
は、特に限定されないが、通常は１０塩基〜４０塩基、
好ましくは１５塩基〜３０塩基である。
およびＰ4 は、検出対象遺伝子または内部標準遺伝子の
塩基配列の中から該遺伝子に特異的な配列を検索し、そ
の中から選択される。また、プライマー同士の相補鎖生
成を避けるために、両プライマーの３′側が相補性を有
しないこと、プライマー内にパリンドロームを形成しな
いこと等が必要である。さらに、プライマーＰ3 および
Ｐ4 の塩基配列については、人工的な内部標準遺伝子の
配列の中でも特に天然の存在確率が可能な限り低いもの
を選択して用いることが好ましい。プライマーの長さ
は、特に限定されないが、通常は１０塩基〜４０塩基、
好ましくは１５塩基〜３０塩基である。
【００１７】検出対象遺伝子の塩基配列のうち、１対の
プライマーに挟まれる塩基配列の領域が、ＰＣＲにより
増幅される領域となる。このＰＣＲ増幅領域の鎖長は、
特に限定されないが、通常は５０塩基〜５０００塩基、
好ましくは１００塩基〜５００塩基となるようにプライ
マー対を選択することが好ましい。さらに検出対象遺伝
子と内部標準遺伝子のＰＣＲ効率が、ＰＣＲ条件の予期
せぬ変動に対して並行的に応答するようにするために
は、両者のＰＣＲ増幅領域の鎖長が大きく異ならないこ
とが好ましい。すなわち内部標準遺伝子のＰＣＲ増幅領
域鎖長が、被検出遺伝子のＰＣＲ増幅領域鎖長の１／３
〜３倍、さらには１／２〜２倍であることが好ましい。
プライマーに挟まれる塩基配列の領域が、ＰＣＲにより
増幅される領域となる。このＰＣＲ増幅領域の鎖長は、
特に限定されないが、通常は５０塩基〜５０００塩基、
好ましくは１００塩基〜５００塩基となるようにプライ
マー対を選択することが好ましい。さらに検出対象遺伝
子と内部標準遺伝子のＰＣＲ効率が、ＰＣＲ条件の予期
せぬ変動に対して並行的に応答するようにするために
は、両者のＰＣＲ増幅領域の鎖長が大きく異ならないこ
とが好ましい。すなわち内部標準遺伝子のＰＣＲ増幅領
域鎖長が、被検出遺伝子のＰＣＲ増幅領域鎖長の１／３
〜３倍、さらには１／２〜２倍であることが好ましい。
【００１８】本発明の方法において、プライマーを標識
するために用いられるリガンドとは、該リガンドでプラ
イマーを標識した時にその反応性を阻害しない程度の比
較的低分子量で、かつ特定の蛋白質（抗体、レセプタ
ー、その他の結合性蛋白質）と結合する能力を有する化
合物を意味する。例えば、ビオチン等の特定の蛋白質
（アビジン）と結合し得る化合物；またはジゴキシゲニ
ン、フルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴ
Ｃと略記する。）、トリニトロフェノール、ジニトロフ
ェノール等の抗体と結合し得るハプテン等があげられ
る。
するために用いられるリガンドとは、該リガンドでプラ
イマーを標識した時にその反応性を阻害しない程度の比
較的低分子量で、かつ特定の蛋白質（抗体、レセプタ
ー、その他の結合性蛋白質）と結合する能力を有する化
合物を意味する。例えば、ビオチン等の特定の蛋白質
（アビジン）と結合し得る化合物；またはジゴキシゲニ
ン、フルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴ
Ｃと略記する。）、トリニトロフェノール、ジニトロフ
ェノール等の抗体と結合し得るハプテン等があげられ
る。
【００１９】プライマーにリガンド分子を結合させる方
法としては、プライマーの５′末端にアミノ基などの官
能基をまず導入し、該官能基と結合できるように修飾さ
れたリガンド分子を反応させる方法が、一般的に用いら
れる（例えば、斎藤監訳、ＰＣＲ実験マニュアル、ＨＢ
Ｊ出版局、１９９１年発行、８９頁を参照）。これとは
別に、プライマーをＤＮＡ合成装置で合成する際に、リ
ガンド分子で標識されたヌクレオチド三リン酸を取り込
ませる方法もある。前者の方法では、リガンドが５′末
端のみに導入されるのに対して、後者の方法では、プラ
イマーの鎖の中にいくつかのリガンドが導入される。
法としては、プライマーの５′末端にアミノ基などの官
能基をまず導入し、該官能基と結合できるように修飾さ
れたリガンド分子を反応させる方法が、一般的に用いら
れる（例えば、斎藤監訳、ＰＣＲ実験マニュアル、ＨＢ
Ｊ出版局、１９９１年発行、８９頁を参照）。これとは
別に、プライマーをＤＮＡ合成装置で合成する際に、リ
ガンド分子で標識されたヌクレオチド三リン酸を取り込
ませる方法もある。前者の方法では、リガンドが５′末
端のみに導入されるのに対して、後者の方法では、プラ
イマーの鎖の中にいくつかのリガンドが導入される。
【００２０】本発明の方法におけるレセプターとは、上
記のリガンドと結合しうる蛋白質を意味する。例えば、
ビオチンに対してはアビジン、ジゴキシゲニンに対して
は抗ジゴキシゲニン抗体、ＦＩＴＣに対しては抗ＦＩＴ
Ｃ抗体がそれぞれのリガンドに対するレセプターであ
る。リガンドとして各種のハプテンを用いる場合、それ
に対する抗体をレセプターとして用いることができる。
本発明の方法においてはＲa 、Ｒb およびＲc の３種の
レセプターが用いられる。Ｒa とＲc は固相に固定化し
て用い、Ｒb は検出標識体Ｅと結合させて用いる。
記のリガンドと結合しうる蛋白質を意味する。例えば、
ビオチンに対してはアビジン、ジゴキシゲニンに対して
は抗ジゴキシゲニン抗体、ＦＩＴＣに対しては抗ＦＩＴ
Ｃ抗体がそれぞれのリガンドに対するレセプターであ
る。リガンドとして各種のハプテンを用いる場合、それ
に対する抗体をレセプターとして用いることができる。
本発明の方法においてはＲa 、Ｒb およびＲc の３種の
レセプターが用いられる。Ｒa とＲc は固相に固定化し
て用い、Ｒb は検出標識体Ｅと結合させて用いる。
【００２１】本発明の方法において用いられる固相とし
ては、既知の酵素免疫測定法に用いられると同様のもの
を用いることができる。具体的には、マイクロタイター
プレート、チューブ、ビーズ、マイクロパーティクル、
さらには特開平１−２１２３４７号公報に記載されてい
る細径管等が用いられる。固相は、レセプターＲa 固定
化固相およびＲc 固定化固相の２種が用いられる。該レ
セプターの固相への固定化は通常の方法によって行われ
る。最も一般的にはプラスチック製の固相に物理吸着に
よってレセプターが吸着され、続いてウシ血清アルブミ
ン等によっていわゆるブロッキングが行われる。アミノ
基のような官能基を有する固相に共有結合でレセプター
を固定化することも可能である。
ては、既知の酵素免疫測定法に用いられると同様のもの
を用いることができる。具体的には、マイクロタイター
プレート、チューブ、ビーズ、マイクロパーティクル、
さらには特開平１−２１２３４７号公報に記載されてい
る細径管等が用いられる。固相は、レセプターＲa 固定
化固相およびＲc 固定化固相の２種が用いられる。該レ
セプターの固相への固定化は通常の方法によって行われ
る。最も一般的にはプラスチック製の固相に物理吸着に
よってレセプターが吸着され、続いてウシ血清アルブミ
ン等によっていわゆるブロッキングが行われる。アミノ
基のような官能基を有する固相に共有結合でレセプター
を固定化することも可能である。
【００２２】本発明の方法において用いられる検出用標
識体としては、既知の酵素免疫測定法に用いられると同
様のもの、例えば、ウレアーゼ、アルカリフォスファタ
ーゼ、ペルオキシターゼ等の酵素が用いられる。さらに
酵素の代りにＦＩＴＣ、ローダミンＤ、エリスロシンイ
ソチオシアネート等の蛍光性分子；アクリジニウムエス
テル類、ルミノール類等の化学発光性分子；ヨード１２
５等の放射性同位元素等が用いられる。
識体としては、既知の酵素免疫測定法に用いられると同
様のもの、例えば、ウレアーゼ、アルカリフォスファタ
ーゼ、ペルオキシターゼ等の酵素が用いられる。さらに
酵素の代りにＦＩＴＣ、ローダミンＤ、エリスロシンイ
ソチオシアネート等の蛍光性分子；アクリジニウムエス
テル類、ルミノール類等の化学発光性分子；ヨード１２
５等の放射性同位元素等が用いられる。
【００２３】検出用標識体として酵素を用いる場合の該
酵素活性の測定には、通常の酵素免疫測定法に用いられ
ると同様の手段が採用される。すなわち酵素に対する基
質が発色性のものであれば吸光光度計が、蛍光性のもの
であれば蛍光光度計が、また化学発光性のものであれば
発光光度計が、それぞれ用いられる。さらに上記特開平
１−２１２３４７号公報に開示された系のように、細径
管内壁上に捕捉されたウレアーゼの活性を該細径管内基
質液のｐＨ変化として検出する場合には、検出器として
ｐＨ電極やｐＨ感応性電界効果トランジスターが用いら
れることもある。また、蛍光性分子、化学発光性分子ま
たは放射性同位元素を検出用標識体として用いる場合に
は、固相上に捕捉されたこれらの標識体を直接、蛍光光
度計、発光光度計、または放射能カウンターでそれぞれ
検出する。
酵素活性の測定には、通常の酵素免疫測定法に用いられ
ると同様の手段が採用される。すなわち酵素に対する基
質が発色性のものであれば吸光光度計が、蛍光性のもの
であれば蛍光光度計が、また化学発光性のものであれば
発光光度計が、それぞれ用いられる。さらに上記特開平
１−２１２３４７号公報に開示された系のように、細径
管内壁上に捕捉されたウレアーゼの活性を該細径管内基
質液のｐＨ変化として検出する場合には、検出器として
ｐＨ電極やｐＨ感応性電界効果トランジスターが用いら
れることもある。また、蛍光性分子、化学発光性分子ま
たは放射性同位元素を検出用標識体として用いる場合に
は、固相上に捕捉されたこれらの標識体を直接、蛍光光
度計、発光光度計、または放射能カウンターでそれぞれ
検出する。
【００２４】次に本発明の方法におけるＰＣＲ反応条件
について述べる。遺伝子増幅用のポリメラーゼとしては
通常耐熱性のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが用いられ
る。
について述べる。遺伝子増幅用のポリメラーゼとしては
通常耐熱性のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが用いられ
る。
【００２５】ポリメラーゼの基質としては、デオキシヌ
クレオシド ５′−トリフォスフェート（ｄＮＴＰ）；
すなわちアデニン−５′−三リン酸、グアニン−５′−
三リン酸、シトシン−５′−三リン酸、およびチミン−
５′−三リン酸である。
クレオシド ５′−トリフォスフェート（ｄＮＴＰ）；
すなわちアデニン−５′−三リン酸、グアニン−５′−
三リン酸、シトシン−５′−三リン酸、およびチミン−
５′−三リン酸である。
【００２６】標準的なＰＣＲ仕込み液の組成は以下の通
りである。 検出対象遺伝子 所定量の内部標準遺伝子 ０．５〜５００ｍＭのＫＣｌ １０〜２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＭＣｌ緩衝液（ｐＨ８．
３） ０．２５〜１５ｍＭのＭｇＣｌ2 ０．０１〜０．５重量％ゼラチン ２０〜２００μＭの各ｄＮＴＰ ０．０１〜１μＭの各リガンド標識プライマー １〜３ｕｎｉｔのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
りである。 検出対象遺伝子 所定量の内部標準遺伝子 ０．５〜５００ｍＭのＫＣｌ １０〜２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＭＣｌ緩衝液（ｐＨ８．
３） ０．２５〜１５ｍＭのＭｇＣｌ2 ０．０１〜０．５重量％ゼラチン ２０〜２００μＭの各ｄＮＴＰ ０．０１〜１μＭの各リガンド標識プライマー １〜３ｕｎｉｔのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
【００２７】ＰＣＲにおいては、まず９２℃〜９６℃で
１０秒から３分間加熱して、溶液中の遺伝子を１本鎖Ｄ
ＮＡに熱変性させる。次いで５５℃〜７２℃で１０秒〜
３分間アニーリングすることによってリガンド標識プラ
イマーを１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる。さらに
７０℃〜７３℃で３０秒〜３分間加熱してプライマーの
伸長反応を行う。この熱変性、アニーリングおよびプラ
イマーの伸長反応を順次複数回行うことによって、ＰＣ
Ｒ増幅領域の遺伝子の増幅が行われる。ＰＣＲのサイク
ル数は通常１０回〜５０回、好ましくは２０回〜３５回
である。以上に述べたＰＣＲ条件の中で、特に内部標準
遺伝子の量、リガンド標識プライマーの濃度、およびＰ
ＣＲのサイクル数については、通常十分な検討によって
決めることが必要である。
１０秒から３分間加熱して、溶液中の遺伝子を１本鎖Ｄ
ＮＡに熱変性させる。次いで５５℃〜７２℃で１０秒〜
３分間アニーリングすることによってリガンド標識プラ
イマーを１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる。さらに
７０℃〜７３℃で３０秒〜３分間加熱してプライマーの
伸長反応を行う。この熱変性、アニーリングおよびプラ
イマーの伸長反応を順次複数回行うことによって、ＰＣ
Ｒ増幅領域の遺伝子の増幅が行われる。ＰＣＲのサイク
ル数は通常１０回〜５０回、好ましくは２０回〜３５回
である。以上に述べたＰＣＲ条件の中で、特に内部標準
遺伝子の量、リガンド標識プライマーの濃度、およびＰ
ＣＲのサイクル数については、通常十分な検討によって
決めることが必要である。
【００２８】ＰＣＲが終了した後の反応液はそのまま酵
素免疫測定に供してもかまわないが、未反応のＡ・Ｐ1
およびＣ・Ｐ3 が残存すると増幅遺伝子が固相と反応す
るのを妨げるので、エタノール沈殿もしくは簡単なカラ
ム分離によって未反応のプライマーを除去した後に酵素
免疫測定に供することが望ましい。
素免疫測定に供してもかまわないが、未反応のＡ・Ｐ1
およびＣ・Ｐ3 が残存すると増幅遺伝子が固相と反応す
るのを妨げるので、エタノール沈殿もしくは簡単なカラ
ム分離によって未反応のプライマーを除去した後に酵素
免疫測定に供することが望ましい。
【００２９】次に酵素免疫測定の条件について述べる。
まずＰＣＲ反応後の溶液をそのまま、あるいは未反応プ
ライマーを分離除去した溶液を二分して、一方をＲa 固
定化固相と、他方をＲc 固定化固相と反応させる。この
時、溶液を適当な緩衝液に希釈し、さらに該緩衝液にウ
シ血清アルブミン等の動物血清成分を非特異吸着防止の
ために加えておいてもよい。ＰＣＲ反応後の溶液と固相
との反応は、通常０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃
の範囲で行われる。反応時間は、１０分間〜１晩、好ま
しくは１０分間〜２時間である。かかる反応後、固相を
洗浄用緩衝液で十分に洗浄する。
まずＰＣＲ反応後の溶液をそのまま、あるいは未反応プ
ライマーを分離除去した溶液を二分して、一方をＲa 固
定化固相と、他方をＲc 固定化固相と反応させる。この
時、溶液を適当な緩衝液に希釈し、さらに該緩衝液にウ
シ血清アルブミン等の動物血清成分を非特異吸着防止の
ために加えておいてもよい。ＰＣＲ反応後の溶液と固相
との反応は、通常０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃
の範囲で行われる。反応時間は、１０分間〜１晩、好ま
しくは１０分間〜２時間である。かかる反応後、固相を
洗浄用緩衝液で十分に洗浄する。
【００３０】次に該洗浄後の２つの固相をＲb ・Ｅの溶
液と反応させる。この場合にも非特異吸着防止のため
に、動物の血清やさらに必要に応じて界面活性剤を加え
ておいてもよい。反応温度は０〜５０℃、好ましくは２
５〜４０℃の範囲である。反応時間は、１０分間〜１
晩、好ましくは１０分間〜２時間の範囲である。反応後
には洗浄用緩衝液を用いて固相を洗浄する。最後に固相
上に捕捉された酵素の活性を測定するために、基質溶液
が加えられ、前述のような検出方法に従って基質の分解
速度、または所定時間内の基質の分解量が測定される。
液と反応させる。この場合にも非特異吸着防止のため
に、動物の血清やさらに必要に応じて界面活性剤を加え
ておいてもよい。反応温度は０〜５０℃、好ましくは２
５〜４０℃の範囲である。反応時間は、１０分間〜１
晩、好ましくは１０分間〜２時間の範囲である。反応後
には洗浄用緩衝液を用いて固相を洗浄する。最後に固相
上に捕捉された酵素の活性を測定するために、基質溶液
が加えられ、前述のような検出方法に従って基質の分解
速度、または所定時間内の基質の分解量が測定される。
【００３１】本発明の方法で遺伝子を実際に定量するた
めには、まず検量線を作成することが必要である。検量
線を作成するためには、検出対象遺伝子の代わりに、検
出対象遺伝子に対するプライマー対（Ｐ1 およびＰ2 ）
によって増幅される既知濃度の「外部標準遺伝子」を用
いて測定を行う。この外部標準遺伝子としては、検出対
象遺伝子をあらかじめ精製し、他の手段で濃度を決定し
たものを用いてもかまわないが、一般的に困難であり、
通常は組み換え技術によって人工的に作成される。外部
標準遺伝子は検出対象遺伝子の代わりに用いられるもの
であるので、上述のように検出対象遺伝子に対するプラ
イマー対によってＰＣＲ増幅される塩基配列を有してい
ること、すなわち少なくともプライマーがハイブリダイ
ズする領域の塩基配列は検出対象遺伝子のそれと同一で
なければならない。さらに、Ｐ1およびＰ2 によって増
幅される領域の鎖長が、内部標準遺伝子のＰＣＲ増幅領
域の鎖長とほぼ同じであることが望ましい。すなわち、
外部標準遺伝子のＰＣＲ増幅領域の鎖長は内部標準遺伝
子のそれの１／３倍〜３倍、さらには１／２倍〜２倍で
あることが好ましい。
めには、まず検量線を作成することが必要である。検量
線を作成するためには、検出対象遺伝子の代わりに、検
出対象遺伝子に対するプライマー対（Ｐ1 およびＰ2 ）
によって増幅される既知濃度の「外部標準遺伝子」を用
いて測定を行う。この外部標準遺伝子としては、検出対
象遺伝子をあらかじめ精製し、他の手段で濃度を決定し
たものを用いてもかまわないが、一般的に困難であり、
通常は組み換え技術によって人工的に作成される。外部
標準遺伝子は検出対象遺伝子の代わりに用いられるもの
であるので、上述のように検出対象遺伝子に対するプラ
イマー対によってＰＣＲ増幅される塩基配列を有してい
ること、すなわち少なくともプライマーがハイブリダイ
ズする領域の塩基配列は検出対象遺伝子のそれと同一で
なければならない。さらに、Ｐ1およびＰ2 によって増
幅される領域の鎖長が、内部標準遺伝子のＰＣＲ増幅領
域の鎖長とほぼ同じであることが望ましい。すなわち、
外部標準遺伝子のＰＣＲ増幅領域の鎖長は内部標準遺伝
子のそれの１／３倍〜３倍、さらには１／２倍〜２倍で
あることが好ましい。
【００３２】検出対象遺伝子がヒトの各種サイトカイン
あるいは各種成長因子の遺伝子である場合には、外部標
準遺伝子として、前述の「競合的ＰＣＲ法」において競
合遺伝子として用いられるｐＡＷ型のプラスミドを採用
することが可能である。該プラスミドは各種サイトカイ
ンあるいは成長因子の遺伝子のプライマー部分の配列を
リンカー配列でつなぎ合わせたものであり、単離精製
し、濃度を決定することができる。既知量の外部標準遺
伝子と所定量の内部標準遺伝子を用いて、本発明の定量
方法に従ってそれぞれに対する信号強度を測定し、Ｓ／
Ｓo を求める。いくつかの濃度の外部標準遺伝子に対し
てＳ／Ｓo を測定して、外部標準遺伝子濃度とＳ／Ｓo
との関係を求めることにより検量線が得られる。
あるいは各種成長因子の遺伝子である場合には、外部標
準遺伝子として、前述の「競合的ＰＣＲ法」において競
合遺伝子として用いられるｐＡＷ型のプラスミドを採用
することが可能である。該プラスミドは各種サイトカイ
ンあるいは成長因子の遺伝子のプライマー部分の配列を
リンカー配列でつなぎ合わせたものであり、単離精製
し、濃度を決定することができる。既知量の外部標準遺
伝子と所定量の内部標準遺伝子を用いて、本発明の定量
方法に従ってそれぞれに対する信号強度を測定し、Ｓ／
Ｓo を求める。いくつかの濃度の外部標準遺伝子に対し
てＳ／Ｓo を測定して、外部標準遺伝子濃度とＳ／Ｓo
との関係を求めることにより検量線が得られる。
【００３３】本発明の方法の検出対象遺伝子は直接的に
はＤＮＡである。しかし検出対象となる遺伝子がＲＮＡ
の場合でも、本発明の定量方法に従って、該ＲＮＡの定
量を行うことが可能である（以下、検出対象となるＲＮ
Ａを「検出対象ＲＮＡ」と略記する。）。すなわち、検
出対象ＲＮＡに対して内部標準遺伝子（以下、「内部標
準ＲＮＡ」と略記する。）を選択し、検出対象ＲＮＡお
よび内部標準ＲＮＡを逆転写酵素溶液の中に共存させ、
両者を同時に逆転写してそれぞれのｃＤＮＡを作成す
る。以下、本発明の定量方法に従い、得られたｃＤＮＡ
の定量を行う。
はＤＮＡである。しかし検出対象となる遺伝子がＲＮＡ
の場合でも、本発明の定量方法に従って、該ＲＮＡの定
量を行うことが可能である（以下、検出対象となるＲＮ
Ａを「検出対象ＲＮＡ」と略記する。）。すなわち、検
出対象ＲＮＡに対して内部標準遺伝子（以下、「内部標
準ＲＮＡ」と略記する。）を選択し、検出対象ＲＮＡお
よび内部標準ＲＮＡを逆転写酵素溶液の中に共存させ、
両者を同時に逆転写してそれぞれのｃＤＮＡを作成す
る。以下、本発明の定量方法に従い、得られたｃＤＮＡ
の定量を行う。
【００３４】一般的にＰＣＲに使用する試薬は高価であ
り、また検出対象遺伝子を含む検体も貴重な場合が多
い。従ってＰＣＲは可能な限り少量の溶液で実施するこ
とが望まれる。上述の特開平１−２１２３４７号公報に
開示された酵素免疫測定装置においては細径管先端内部
を免疫反応場および酵素反応場として用いるため、所要
試料容積が１μｌ以下で十分であるので、本発明の方法
用の酵素免疫測定装置として好適である。
り、また検出対象遺伝子を含む検体も貴重な場合が多
い。従ってＰＣＲは可能な限り少量の溶液で実施するこ
とが望まれる。上述の特開平１−２１２３４７号公報に
開示された酵素免疫測定装置においては細径管先端内部
を免疫反応場および酵素反応場として用いるため、所要
試料容積が１μｌ以下で十分であるので、本発明の方法
用の酵素免疫測定装置として好適である。
【００３５】
【実施例】以下、実施例によりさらに詳しく本発明を説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。
【００３６】実施例１ 健常者およびリウマチ患者の抹消血単核球、ならびにリ
ウマチ患者滑膜細胞中のｌＬ−１βのｍＲＮＡの定量を
以下のようにして行った。
ウマチ患者滑膜細胞中のｌＬ−１βのｍＲＮＡの定量を
以下のようにして行った。
【００３７】１．標識プライマーの調製 ヒトのＩＬ−１βのｍＲＮＡに対応する外部標準遺伝子
（ＲＮＡ）として、前述の「競合的ＰＣＲ法」において
競合遺伝子として用いられているｐＡＷ１０９ＲＮＡ
［Gene Amp社製；プロシーディングズ オブ ザ ナシ
ョナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ユー
エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、86巻、9717
頁（1989年）参照］を選択した。該外部標準ＲＮＡおよ
びヒトのＩＬ−１βのｍＲＮＡのそれぞれを逆転写して
得られるｃＤＮＡに対するプライマーとしては次の一対
を選択した。 センスプライマーＰ1 ：５′ＡＡＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧ
ＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧＧ ３′ アンチセンスプライマーＰ2 ：５′ＴＧＧＡＧＡＡＣＡ
ＣＣＡＣＴＴＧＴＴＧＣＴＣＣＡ ３′ プライマー対Ｐ1 およびＰ2 によるＰＣＲで増幅される
鎖長は、ＩＬ−１βｃＤＮＡで３８８塩基、ｐＡＷ１０
９ ｃＤＮＡで３０６塩基である。
（ＲＮＡ）として、前述の「競合的ＰＣＲ法」において
競合遺伝子として用いられているｐＡＷ１０９ＲＮＡ
［Gene Amp社製；プロシーディングズ オブ ザ ナシ
ョナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ユー
エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、86巻、9717
頁（1989年）参照］を選択した。該外部標準ＲＮＡおよ
びヒトのＩＬ−１βのｍＲＮＡのそれぞれを逆転写して
得られるｃＤＮＡに対するプライマーとしては次の一対
を選択した。 センスプライマーＰ1 ：５′ＡＡＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧ
ＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧＧ ３′ アンチセンスプライマーＰ2 ：５′ＴＧＧＡＧＡＡＣＡ
ＣＣＡＣＴＴＧＴＴＧＣＴＣＣＡ ３′ プライマー対Ｐ1 およびＰ2 によるＰＣＲで増幅される
鎖長は、ＩＬ−１βｃＤＮＡで３８８塩基、ｐＡＷ１０
９ ｃＤＮＡで３０６塩基である。
【００３８】内部標準ＲＮＡとしては、Ｔ７プロモータ
ー領域を有する人工的発現ベクターであるｐＲＳＥＴ
Ａ ＤＮＡ［Invitrogen Corp 社製；ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）、124 巻、83頁（1993年）参照］を転写して得られ
たＲＮＡを用いた。該内部標準ＲＮＡを逆転写して得ら
れるｃＤＮＡに対するプライマーとしては次の一対を選
択した。 センスプライマーＰ3 ：５′ＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴ
ＴＣＣＣＴＣＴＡ ３′ アンチセンスプライマーＰ4 ：５′ＧＡＴＣＡＡＧＣＴ
ＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴ ３′ プライマー対Ｐ3 およびＰ4 によるＰＣＲで増幅される
ｐＲＳＥＴ Ａ ｃＤＮＡの鎖長は２１０塩基である。
ー領域を有する人工的発現ベクターであるｐＲＳＥＴ
Ａ ＤＮＡ［Invitrogen Corp 社製；ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）、124 巻、83頁（1993年）参照］を転写して得られ
たＲＮＡを用いた。該内部標準ＲＮＡを逆転写して得ら
れるｃＤＮＡに対するプライマーとしては次の一対を選
択した。 センスプライマーＰ3 ：５′ＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴ
ＴＣＣＣＴＣＴＡ ３′ アンチセンスプライマーＰ4 ：５′ＧＡＴＣＡＡＧＣＴ
ＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴ ３′ プライマー対Ｐ3 およびＰ4 によるＰＣＲで増幅される
ｐＲＳＥＴ Ａ ｃＤＮＡの鎖長は２１０塩基である。
【００３９】これらのプライマーの合成は自動合成装置
（３８０Ｂ型；Applied BiosystemsInc. 社製）で行っ
た。
（３８０Ｂ型；Applied BiosystemsInc. 社製）で行っ
た。
【００４０】次いで、合成されたプライマーＰ1 をジゴ
キシゲニンで、プライマーＰ2 およびプライマーＰ4 を
ビオチンで、プライマーＰ3 をＦＩＴＣで、それぞれ次
のようにして標識した。まず各プライマーの５′末端に
アミノ基を導入した。該反応は、上記のＤＮＡ自動合成
装置でアミノリンク−２（Applied Biosystems Inc.社
製）を結合させることによって行った。次いで、アミノ
化されたプライマーＰ1 をジゴキシゲニン−３−ｏ−メ
チルカルボニル−ε−アミノカプロン酸 Ｎ−ヒドロキ
シサクシンイミドエステル（Digoxigenin-3-o-methylca
rbonyl- ε-aminocaproic acid-N-hydroxysuccinimide
ester ；Boehringer Mannheim Biochemica社製）と、ア
ミノ化されたプライマーＰ2 およびＰ4 をビオチンラベ
リングキット（Biotin Labeling Kit ；Clontech社製）
と、また、アミノ化されたプライマーＰ3 を５（６）−
カルボキシフルオレセイン Ｎ−ヒドロキシサクシンイ
ミドエステル（5(6)-carboxyfluorescein-N-hydroxysuc
cinimide ester；Boehringer Mannheim Biochemica社
製）とそれぞれ反応させることにより、ジゴキシゲニン
で標識されたプライマーＰ1 、ビオチンで標識されたプ
ライマーＰ2 およびプライマーＰ4 、ならびにＦＩＴＣ
で標識されたプライマーＰ3 をそれぞれ得た。各標識プ
ライマーは液体クロマトグラフィーで精製した。
キシゲニンで、プライマーＰ2 およびプライマーＰ4 を
ビオチンで、プライマーＰ3 をＦＩＴＣで、それぞれ次
のようにして標識した。まず各プライマーの５′末端に
アミノ基を導入した。該反応は、上記のＤＮＡ自動合成
装置でアミノリンク−２（Applied Biosystems Inc.社
製）を結合させることによって行った。次いで、アミノ
化されたプライマーＰ1 をジゴキシゲニン−３−ｏ−メ
チルカルボニル−ε−アミノカプロン酸 Ｎ−ヒドロキ
シサクシンイミドエステル（Digoxigenin-3-o-methylca
rbonyl- ε-aminocaproic acid-N-hydroxysuccinimide
ester ；Boehringer Mannheim Biochemica社製）と、ア
ミノ化されたプライマーＰ2 およびＰ4 をビオチンラベ
リングキット（Biotin Labeling Kit ；Clontech社製）
と、また、アミノ化されたプライマーＰ3 を５（６）−
カルボキシフルオレセイン Ｎ−ヒドロキシサクシンイ
ミドエステル（5(6)-carboxyfluorescein-N-hydroxysuc
cinimide ester；Boehringer Mannheim Biochemica社
製）とそれぞれ反応させることにより、ジゴキシゲニン
で標識されたプライマーＰ1 、ビオチンで標識されたプ
ライマーＰ2 およびプライマーＰ4 、ならびにＦＩＴＣ
で標識されたプライマーＰ3 をそれぞれ得た。各標識プ
ライマーは液体クロマトグラフィーで精製した。
【００４１】２．ピペットチップ型固相の作成 固相として用いたピペットチップを図２に示した。該ピ
ペットチップはポリプロピレンの成形品で、全長４８ｍ
ｍである。その最先端部の内外径はそれぞれ０．５５ｍ
ｍおよび１．００ｍｍである（図４）。抗ジゴキシゲニ
ン抗体または抗ＦＩＴＣ抗体は図４の破線１１で示され
る先端内壁部に固定化された。すなわち５０μｇ／ｍｌ
の抗ジゴキシゲニン抗体のＦａｂ部分（Boehringer Man
nheim Biochemica社製）、または１００μｇ／ｍｌの抗
ＦＩＴＣ抗体（DAKO社製）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．
４）１μｌをチップ先端内部に入れ、保湿箱中で、３７
℃で２時間インキュベートした。ついで該チップ先端部
をブロッキング溶液（１％ウシ血清アルブミンおよび１
０％ショ糖を含むＰＢＳ）で洗浄した後、同じブロッキ
ング溶液中に該チップの先端１５ｍｍの部分を侵漬し、
４℃で１６時間静置した。ブロッキング後のチップを真
空乾燥し、ポリエチレン袋の中で、８℃で保存した。
ペットチップはポリプロピレンの成形品で、全長４８ｍ
ｍである。その最先端部の内外径はそれぞれ０．５５ｍ
ｍおよび１．００ｍｍである（図４）。抗ジゴキシゲニ
ン抗体または抗ＦＩＴＣ抗体は図４の破線１１で示され
る先端内壁部に固定化された。すなわち５０μｇ／ｍｌ
の抗ジゴキシゲニン抗体のＦａｂ部分（Boehringer Man
nheim Biochemica社製）、または１００μｇ／ｍｌの抗
ＦＩＴＣ抗体（DAKO社製）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．
４）１μｌをチップ先端内部に入れ、保湿箱中で、３７
℃で２時間インキュベートした。ついで該チップ先端部
をブロッキング溶液（１％ウシ血清アルブミンおよび１
０％ショ糖を含むＰＢＳ）で洗浄した後、同じブロッキ
ング溶液中に該チップの先端１５ｍｍの部分を侵漬し、
４℃で１６時間静置した。ブロッキング後のチップを真
空乾燥し、ポリエチレン袋の中で、８℃で保存した。
【００４２】３．アビジン・ウレアーゼ コンジュゲー
トの調製 まずアビジンにマレイミド基を導入した。６．４ｍｇの
ストレプトアビジン（５５３２ＬＹ；Gibco 社製）の
０．１Ｍ ＰＢＥ（ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ；ｐＨ７．０）
溶液２．５ｍｌに、８．７ｍｇのＥＭＣＳ［Ｎ−（ω−
マレイミドカプロイロキシ）サクシニミド］のＤＭＦ
（ジメチルホルムアミド）溶液０．８７ｍｌを加えて３
０分間反応させた。１Ｍグリシンを加えて反応を停止さ
せ、マレイミド化されたストレプトアビジンをＰＤ１０
カラム（Pharmacia 社製）で分離した。一方、ウレアー
ゼのＳＨ基を再生させるために、５０．２ｍｇのウレア
ーゼ（Ｕ−０３７６；Sigma 社製）のリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．５）２．１ｍｌに、０．４２ｍｌの０．１Ｍ Ｄ
ＴＴ（ジチオスレイトール）を加え、２５℃で３０分間
反応させ、ＰＤ１０カラムで生成物を分離した。８．０
１ｎｍｏｌのマレイミド化ストレプトアビジンおよび等
モルの還元ウレアーゼを、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）６．３６ｍｌ中でカプ
リングさせ、β−メルカプトエタノールを加えて反応を
停止させた。反応後の溶液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−
４００ＨＲ（Pharmacia 社製）で分画し、コンジュゲー
ト活性の高い画分を分取し、４℃で保存した。なお、各
画分のコンジュゲート活性は、ビオチン標識ヒツジＩｇ
Ｇ（E-Y Lab 社製）を固定化したマイクロプレートに生
成物を結合させ、そのウレアーゼ活性を測定することに
よって求めた。
トの調製 まずアビジンにマレイミド基を導入した。６．４ｍｇの
ストレプトアビジン（５５３２ＬＹ；Gibco 社製）の
０．１Ｍ ＰＢＥ（ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ；ｐＨ７．０）
溶液２．５ｍｌに、８．７ｍｇのＥＭＣＳ［Ｎ−（ω−
マレイミドカプロイロキシ）サクシニミド］のＤＭＦ
（ジメチルホルムアミド）溶液０．８７ｍｌを加えて３
０分間反応させた。１Ｍグリシンを加えて反応を停止さ
せ、マレイミド化されたストレプトアビジンをＰＤ１０
カラム（Pharmacia 社製）で分離した。一方、ウレアー
ゼのＳＨ基を再生させるために、５０．２ｍｇのウレア
ーゼ（Ｕ−０３７６；Sigma 社製）のリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．５）２．１ｍｌに、０．４２ｍｌの０．１Ｍ Ｄ
ＴＴ（ジチオスレイトール）を加え、２５℃で３０分間
反応させ、ＰＤ１０カラムで生成物を分離した。８．０
１ｎｍｏｌのマレイミド化ストレプトアビジンおよび等
モルの還元ウレアーゼを、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）６．３６ｍｌ中でカプ
リングさせ、β−メルカプトエタノールを加えて反応を
停止させた。反応後の溶液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−
４００ＨＲ（Pharmacia 社製）で分画し、コンジュゲー
ト活性の高い画分を分取し、４℃で保存した。なお、各
画分のコンジュゲート活性は、ビオチン標識ヒツジＩｇ
Ｇ（E-Y Lab 社製）を固定化したマイクロプレートに生
成物を結合させ、そのウレアーゼ活性を測定することに
よって求めた。
【００４３】４．臨床検体からのｍＲＮＡの抽出 臨床検体として健常人末梢血単核球（５検体）、リウマ
チ患者末梢血単核球（１０検体）およびリウマチ患者膝
関節から採取した滑膜細胞（５検体）の各１×１０7 個
を用いた。これらの細胞からのｍＲＮＡの単離はQuick
Prep Micro mRNA Purification Kit（Pharmacia 社製）
を使用して行い、精製したｍＲＮＡを４００μｌの緩衝
液［１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）］の溶液として得た。
チ患者末梢血単核球（１０検体）およびリウマチ患者膝
関節から採取した滑膜細胞（５検体）の各１×１０7 個
を用いた。これらの細胞からのｍＲＮＡの単離はQuick
Prep Micro mRNA Purification Kit（Pharmacia 社製）
を使用して行い、精製したｍＲＮＡを４００μｌの緩衝
液［１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）］の溶液として得た。
【００４４】５．内部標準ＲＮＡの調製 内部標準ＲＮＡとしては、前述のとおり、ｐＲＳＥＴ
Ａ ＤＮＡをＲＮＡに転写したものを用いた。転写は次
のようにして行った。まずプラスミドｐＲＳＥＴ Ａ
ＤＮＡを制限酵素Ｓｃａ Ｉ（宝酒造株式会社製）によ
って切断し、フェノール抽出、次いでエタノール沈殿を
行うことによって直線状ＤＮＡを得、これを蒸留水に溶
かすことによって２００ｎｇ／μｌの溶液を２０μｌ得
た。次に該直線状ＤＮＡ１μｇを鋳型、４種のリボヌク
レオシド−５′−三リン酸を基質として、Ｔ７ポリメラ
ーゼ（宝酒造株式会社製）で転写し、フェノール抽出、
次いでエタノール沈殿を行い、ＲＮＡを得た。得られた
ＲＮＡを１００μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を加えた蒸留水
に溶解することにより、内部標準ＲＮＡの原液を得、こ
れを２５０００倍に希釈したものを「内部標準用ｐＲＳ
ＥＴ ＲＮＡ溶液」として用いた。
Ａ ＤＮＡをＲＮＡに転写したものを用いた。転写は次
のようにして行った。まずプラスミドｐＲＳＥＴ Ａ
ＤＮＡを制限酵素Ｓｃａ Ｉ（宝酒造株式会社製）によ
って切断し、フェノール抽出、次いでエタノール沈殿を
行うことによって直線状ＤＮＡを得、これを蒸留水に溶
かすことによって２００ｎｇ／μｌの溶液を２０μｌ得
た。次に該直線状ＤＮＡ１μｇを鋳型、４種のリボヌク
レオシド−５′−三リン酸を基質として、Ｔ７ポリメラ
ーゼ（宝酒造株式会社製）で転写し、フェノール抽出、
次いでエタノール沈殿を行い、ＲＮＡを得た。得られた
ＲＮＡを１００μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を加えた蒸留水
に溶解することにより、内部標準ＲＮＡの原液を得、こ
れを２５０００倍に希釈したものを「内部標準用ｐＲＳ
ＥＴ ＲＮＡ溶液」として用いた。
【００４５】６．逆転写反応 逆転写反応溶液は下記のものを混合して調製した。 １０×ＰＣＲ用緩衝液 ９０．０μｌ １００ｍＭ ＤＴＴ ９０．０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ １４４．０μｌ ４０ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ阻害剤 ２６．３μｌ ３２ｕ／μｌ Reverse Transcriptase １．９μｌ １０μＭ ビオチン−Ｐ4 ３０．０μｌ ２０μＭ オリゴーｄＴ１８ １５０．０μｌ 「内部標準用ｐＲＳＥＴ Ａ ＲＮＡ溶液」 ３０．０μｌ 蒸留水 ２１７．８μｌ 合計 ７８０．０μｌ なお、上記組成の中で１０×ＰＣＲ用緩衝液とは、５０
０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．４）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍｇ／ｍｌウシ血
清アルブミンを含む蒸留水を意味する。また、オリゴー
ｄＴ１８はポリＡ配列を有する臨床検体由来ｍＲＮＡも
しくはｐＡＷ１０９ ＲＮＡを逆転写するためのプライ
マーとして用いた。
０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．４）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍｇ／ｍｌウシ血
清アルブミンを含む蒸留水を意味する。また、オリゴー
ｄＴ１８はポリＡ配列を有する臨床検体由来ｍＲＮＡも
しくはｐＡＷ１０９ ＲＮＡを逆転写するためのプライ
マーとして用いた。
【００４６】検量線作成に当たっては上記組成の逆転写
反応溶液２６μｌ中に０、１０2 、１０3 、１０4 、１
０5 または１０6 コピーのｐＡＷ１０９ ＲＮＡを含む
ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を各４μｌ加えて逆転写を実
施した。また、臨床検体の測定に当たっては、上記組成
の逆転写反応溶液２６μｌに１×１０5 個の臨床検体細
胞相当のｍＲＮＡを含むＴＥ緩衝液各４μｌを加えて逆
転写反応を実施した。逆転写反応はいずれも４３℃で１
時間行い、次いで９５℃で１０分間熱変性を行った後、
１０℃に急冷した。
反応溶液２６μｌ中に０、１０2 、１０3 、１０4 、１
０5 または１０6 コピーのｐＡＷ１０９ ＲＮＡを含む
ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を各４μｌ加えて逆転写を実
施した。また、臨床検体の測定に当たっては、上記組成
の逆転写反応溶液２６μｌに１×１０5 個の臨床検体細
胞相当のｍＲＮＡを含むＴＥ緩衝液各４μｌを加えて逆
転写反応を実施した。逆転写反応はいずれも４３℃で１
時間行い、次いで９５℃で１０分間熱変性を行った後、
１０℃に急冷した。
【００４７】７．ＰＣＲ ＰＣＲ溶液の組成は下記のとおりである。 １０×ＰＣＲ用緩衝液 ９０．０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ １４４．０μｌ ５ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ６．０μｌ １０μＭ ジゴキシゲニン−Ｐ1 ５０．０μｌ １０μＭ ビオチン−Ｐ2 ５０．０μｌ １０μＭ ＦＩＴＣ−Ｐ3 ２０．０μｌ １０μＭ ビオチン−Ｐ4 １０．０μｌ 蒸留水 ５３０．０μｌ 合計 ９００．０μｌ なお、上記組成の中で１０×ＰＣＲ用緩衝液とは、前記
逆転写反応において用いたと同じものを用いた。
逆転写反応において用いたと同じものを用いた。
【００４８】ＰＣＲ溶液４５μｌに、逆転写反応により
得られた溶液１５μｌを加え、９３℃で５分間熱変性さ
せた。次いで５５℃で４５秒間アニール、７２℃で２分
間プライマー伸長反応を行った。続いて９３℃で１分、
５５℃で４５秒、７２℃で２分のＰＣＲを２９サイクル
実施した。ＰＣＲ後の溶液をＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮカ
ラム（Clontech社製）にかけて、未反応のプライマーを
除去した。
得られた溶液１５μｌを加え、９３℃で５分間熱変性さ
せた。次いで５５℃で４５秒間アニール、７２℃で２分
間プライマー伸長反応を行った。続いて９３℃で１分、
５５℃で４５秒、７２℃で２分のＰＣＲを２９サイクル
実施した。ＰＣＲ後の溶液をＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮカ
ラム（Clontech社製）にかけて、未反応のプライマーを
除去した。
【００４９】８．増幅遺伝子の酵素免疫測定法による検
出 上記ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮカラムで処理したＰＣＲ溶
液１μｌを抗ＦＩＴＣ抗体固相化ピペットチップの先端
内部に、別の１μｌを抗ジゴキシゲニン抗体固相化ピペ
ットチップの先端内部に、それぞれ吸入し、室温で１０
分間静置後、ＰＢＳ（ｐＨ７．８）で洗浄した。次いで
２μｌのアビジン・ウレアーゼ コンジュゲート溶液を
各ピペットチップに吸引し、室温で５分間静置した後、
１０ｍＭ塩化アンモニウムと１５４ｍＭの食塩を含む溶
液で洗浄した。該反応後のピペットチップの先端内壁上
に捕捉されたウレアーゼの活性は、該ピペットチップを
図２に示されたセルに挿入することによって測定した。
出 上記ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮカラムで処理したＰＣＲ溶
液１μｌを抗ＦＩＴＣ抗体固相化ピペットチップの先端
内部に、別の１μｌを抗ジゴキシゲニン抗体固相化ピペ
ットチップの先端内部に、それぞれ吸入し、室温で１０
分間静置後、ＰＢＳ（ｐＨ７．８）で洗浄した。次いで
２μｌのアビジン・ウレアーゼ コンジュゲート溶液を
各ピペットチップに吸引し、室温で５分間静置した後、
１０ｍＭ塩化アンモニウムと１５４ｍＭの食塩を含む溶
液で洗浄した。該反応後のピペットチップの先端内壁上
に捕捉されたウレアーゼの活性は、該ピペットチップを
図２に示されたセルに挿入することによって測定した。
【００５０】該セルはウレアーゼの基質液（１５５ｍＭ
尿素、１０ｍＭ 塩化アンモニウムおよび１５４ｍＭ
食塩）の入口２および出口３を有するフローセル１か
らなる。ｐＨ感応性電界効果トランジスタ（以下、「ｐ
Ｈ−ＦＥＴ」と略記する。）６を先端に埋め込んだセン
サー体５がセルの下部から挿入、固定されている。セン
サー体の先端にはセンサーカプラー４が装着されてい
る。これはセル上部から挿入されるピペットチップ８と
ｐＨ−ＦＥＴとをカプリングさせるためのガイドとして
働く。７は液絡式比較電極である。ｐＨ−ＦＥＴとピペ
ットチップがカプリングした状態の上面および側面から
の拡大図および寸法を、それぞれ図３および図４に示
す。基質液の流れを停止した状態でピペットチップをセ
ルに挿入し、ｐＨ−ＦＥＴとカプリングさせ、チップ先
端内部での尿素の分解に伴うｐＨ変化をｐＨ−ＦＥＴの
ソース電位の変化速度として測定した。すなわちピペッ
トチップ挿入後１０秒から２０秒の間のソース電位を
０．１秒間隔で読み取り、その１０秒間の変化速度を最
小二乗法で算出した。チップ挿入直後の１０秒間は、出
力が不安定になることがあるので、データの採取を行わ
なかった。電位読み取り後、チップを抜き取り、基質液
を送入してセルを洗浄した。なお、図４における９は、
ｐＨ−ＦＥＴ素子上のｐＨ感応部を、図３および図４に
おける１０は基質溶液の流路を示す。また、図４におけ
る斜体の数字は寸法（単位ｍｍ）を例示する。
尿素、１０ｍＭ 塩化アンモニウムおよび１５４ｍＭ
食塩）の入口２および出口３を有するフローセル１か
らなる。ｐＨ感応性電界効果トランジスタ（以下、「ｐ
Ｈ−ＦＥＴ」と略記する。）６を先端に埋め込んだセン
サー体５がセルの下部から挿入、固定されている。セン
サー体の先端にはセンサーカプラー４が装着されてい
る。これはセル上部から挿入されるピペットチップ８と
ｐＨ−ＦＥＴとをカプリングさせるためのガイドとして
働く。７は液絡式比較電極である。ｐＨ−ＦＥＴとピペ
ットチップがカプリングした状態の上面および側面から
の拡大図および寸法を、それぞれ図３および図４に示
す。基質液の流れを停止した状態でピペットチップをセ
ルに挿入し、ｐＨ−ＦＥＴとカプリングさせ、チップ先
端内部での尿素の分解に伴うｐＨ変化をｐＨ−ＦＥＴの
ソース電位の変化速度として測定した。すなわちピペッ
トチップ挿入後１０秒から２０秒の間のソース電位を
０．１秒間隔で読み取り、その１０秒間の変化速度を最
小二乗法で算出した。チップ挿入直後の１０秒間は、出
力が不安定になることがあるので、データの採取を行わ
なかった。電位読み取り後、チップを抜き取り、基質液
を送入してセルを洗浄した。なお、図４における９は、
ｐＨ−ＦＥＴ素子上のｐＨ感応部を、図３および図４に
おける１０は基質溶液の流路を示す。また、図４におけ
る斜体の数字は寸法（単位ｍｍ）を例示する。
【００５１】９．ＩＬ−１β ｍＲＮＡの検量線の作成 上記のように一定量の内部標準用ｐＲＳＥＴ Ａ ＲＮ
Ａと０〜１０6 コピーの外部標準用ｐＡＷ１０９ ＲＮ
Ａを含む溶液を逆転写、ＰＣＲし、それぞれのＰＣＲ産
物を上記の酵素免疫測定法で検出し、その信号強度比を
外部標準用ｐＡＷ１０９ ＲＮＡのコピー数に対してプ
ロットした結果を図５に示した。この図から、本法によ
つて１０2 から１０6 コピーのｐＡＷ１０９ ＲＮＡを
定量することが可能であることがわかる。
Ａと０〜１０6 コピーの外部標準用ｐＡＷ１０９ ＲＮ
Ａを含む溶液を逆転写、ＰＣＲし、それぞれのＰＣＲ産
物を上記の酵素免疫測定法で検出し、その信号強度比を
外部標準用ｐＡＷ１０９ ＲＮＡのコピー数に対してプ
ロットした結果を図５に示した。この図から、本法によ
つて１０2 から１０6 コピーのｐＡＷ１０９ ＲＮＡを
定量することが可能であることがわかる。
【００５２】１０．臨床検体中のＩＬ−１β ｍＲＮＡ
の定量 次に、同じく一定量の内部標準用ｐＲＳＥＴ Ａ ＲＮ
Ａと１０5 個の臨床検体由来細胞に相当するｍＲＮＡを
含む溶液を逆転写、ＰＣＲし、ｐＲＳＥＴ ＡＲＮＡと
ＩＬ−１βのＰＣＲ産物を上記の酵素免疫測定法で測定
した結果および両者の信号強度比を表１に示した。次に
該信号比と図５の検量線を用いて算出したＩＬ−１β
ｍＲＮＡのコピー数、さらには臨床検体細胞１個当たり
のＩＬ−１β ｍＲＮＡ発現数を表１に示した。なお、
表１中のＮ、ＲＡＢおよびＲＡＳは、それぞれ健常人末
梢血単核球、リウマチ患者末梢血単核球およびリウマチ
患者滑膜細胞を表す。
の定量 次に、同じく一定量の内部標準用ｐＲＳＥＴ Ａ ＲＮ
Ａと１０5 個の臨床検体由来細胞に相当するｍＲＮＡを
含む溶液を逆転写、ＰＣＲし、ｐＲＳＥＴ ＡＲＮＡと
ＩＬ−１βのＰＣＲ産物を上記の酵素免疫測定法で測定
した結果および両者の信号強度比を表１に示した。次に
該信号比と図５の検量線を用いて算出したＩＬ−１β
ｍＲＮＡのコピー数、さらには臨床検体細胞１個当たり
のＩＬ−１β ｍＲＮＡ発現数を表１に示した。なお、
表１中のＮ、ＲＡＢおよびＲＡＳは、それぞれ健常人末
梢血単核球、リウマチ患者末梢血単核球およびリウマチ
患者滑膜細胞を表す。
【００５３】
【表１】
【００５４】表１の結果をまとめると、各細胞当たりの
ＩＬ−１β ｍＲＮＡの発現個数の平均値±標準偏差
は、健常人末梢血単核球において０．０２１±０．０１
３、リウマチ患者末梢血単核球において０．０４９±
０．０６８、リウマチ患者滑膜細胞において０．１４６
±０．１３３であった。この傾向は従来から報告されて
いる傾向と一致する。
ＩＬ−１β ｍＲＮＡの発現個数の平均値±標準偏差
は、健常人末梢血単核球において０．０２１±０．０１
３、リウマチ患者末梢血単核球において０．０４９±
０．０６８、リウマチ患者滑膜細胞において０．１４６
±０．１３３であった。この傾向は従来から報告されて
いる傾向と一致する。
【００５５】
【発明の効果】操作が簡便であり、多数検体の測定や自
動化に適し、かつ高精度で定量的に増幅遺伝子を測定す
る方法が提供される。
動化に適し、かつ高精度で定量的に増幅遺伝子を測定す
る方法が提供される。
【図１】本発明の定量方法の工程を示す。
【図２】固相ピペットチップの先端内壁部に捕捉された
ウレアーゼの活性を測定するセルの一例を示す。
ウレアーゼの活性を測定するセルの一例を示す。
【図３】ｐＨ−ＦＥＴおよびピペットチップがカプリン
グした状態の上面からの拡大図および寸法を示す。
グした状態の上面からの拡大図および寸法を示す。
【図４】ｐＨ−ＦＥＴおよびピペットチップがカプリン
グした状態の側面からの拡大図および寸法を示す。
グした状態の側面からの拡大図および寸法を示す。
【図５】ＩＬ−１β ｍＲＮＡの検量線である。
１：フローセル ２：ウレアーゼの基質液の入口 ３：ウレアーゼの基質液の出口 ４：センサーカプラー ５：センサー体 ６：ｐＨ感応性電界効果トランジスタ（ｐＨ−ＦＥＴ） ７：液絡式比較電極 ８：ピペットチップ ９：ｐＨ感応部 １０：基質溶液の流路 １１：レセプターが固定化された部分
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鶴田 仁志 岡山県倉敷市酒津2045番地の１ 株式会 社クラレ内 (72)発明者 難波 敏彦 岡山県倉敷市酒津1621番地 株式会社ク ラレ内
Claims (4)
- 【請求項１】 リガンドＡによって標識されたプライマ
ーＰ1 およびリガンドＢによって標識されたプライマー
Ｐ2 からなるプライマー対を用いて、検出対象となる遺
伝子をポリメラーゼチェインリアクションによって増幅
させる工程、リガンドＡに対するレセプターＲa が固定
化された固相に増幅された遺伝子を反応させる工程、検
出用標識体Ｅによって標識されたリガンドＢに対するレ
セプターＲb を該固相に反応させる工程、および検出用
標識体Ｅの量を測定する工程からなる遺伝子の定量法に
おいて、該ポリメラーゼチェインリアクション反応液中
に一定量の内部標準遺伝子を共存させ、該内部標準遺伝
子をリガンドＣによって標識されたプライマーＰ3 およ
びリガンドＢによって標識されたプライマーＰ4からな
るプライマー対を用いて同時にポリメラーゼチェインリ
アクションを行い、得られた反応液の一部をリガンドＡ
に対するレセプターＲa が固定化された固相と、他の一
部をリガンドＣに対するレセプターＲc が固定化された
固相と、それぞれ反応させ、それぞれの固相に検出用標
識体Ｅによって標識されたリガンドＢに対するレセプタ
ーＲb を反応させ、それぞれの固相上の検出用標識体Ｅ
に対応する信号を測定し、両者の信号比を求めることを
特徴とする遺伝子の定量方法。 - 【請求項２】 検出用標識体がウレアーゼであることを
特徴とする請求項１記載の遺伝子の定量方法。 - 【請求項３】 検出用標識体の測定手段がｐＨ感応性電
界効果トランジスターであることを特徴とする請求項１
記載の遺伝子の定量方法。 - 【請求項４】 固相が細径管であることを特徴とする請
求項１記載の遺伝子の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12299394A JP2660661B2 (ja) | 1994-05-11 | 1994-05-11 | 遺伝子の定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12299394A JP2660661B2 (ja) | 1994-05-11 | 1994-05-11 | 遺伝子の定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07303499A JPH07303499A (ja) | 1995-11-21 |
| JP2660661B2 true JP2660661B2 (ja) | 1997-10-08 |
Family
ID=14849633
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12299394A Expired - Fee Related JP2660661B2 (ja) | 1994-05-11 | 1994-05-11 | 遺伝子の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2660661B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100863632B1 (ko) | 2000-03-31 | 2008-10-15 | 퍼듀 리서치 파운데이션 | 리간드-면역원 접합체를 사용한 치료 방법 |
| US6358679B1 (en) * | 2000-08-24 | 2002-03-19 | Pe Corporation (Ny) | Methods for external controls for nucleic acid amplification |
-
1994
- 1994-05-11 JP JP12299394A patent/JP2660661B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07303499A (ja) | 1995-11-21 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |