JP2001504586A - イムノｒｎａにより蛋白質を検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 mRNAレベルが蛋白質の存在と相関する場合の、イムノ−RNAと呼ぶ技術を用いた、選択された蛋白質の検出方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 イムノＲＮＡにより蛋白質を検出する方法発明の分野 本発明は、本明細書にてイムノaRNAと呼ばれる技術によりサンプル中の選択さ れた蛋白質を検出する方法に関する。この方法により検出される選択された蛋白 質の量は、次に様々な疾患の存在と相関し得る。したがって、この方法は疾患の 診断に有用である。発明の背景 与えられた細胞における特定のmRNAレベルの分析はそのライフサイクル中のあ らゆる点におけるその特定の細胞の機能並びに分化状態に関する洞察を提供する 。しかしながら、mRNAレベルは細胞の機能状態の正確な描写を常に提供するわけ ではない。それはこれらのmRNAsの翻訳産物、例えばその機能を決定する細胞の リセプター、イオンチャンネル、酵素、および構造蛋白質である。 蛋白質を検出するために現在使用される技術は、様々な種類の免役アッセイ、 例えばELISA，免役組織化学および放射性免役アッセイに基づき、それらは興味 のある蛋白質に特異的な抗体を利用する。これらの免役アッセイは有用であるが 、抗体の検出の感度により制限される。標準標識方法は、蛍光、ラジオアイソト ープおよび酵素、例えばペルオキシダーゼおよびホスファターゼを含む。さらに 、二次抗体をしばしばビオチン化してそれらの感度を高める。また、これらの技 術は少量の特定の抗原を検出することがしばしばできない。さらに、これらの種 類の技術は特定の細胞の特定の蛋白質の検出に適していない。 電気生理学の技術は特定の細胞から蛋白質を検出できる。しかしながら、応用 はイオンチャンネル機能、並びにチャンネルとカップリングされた他のリセプタ ーまたは蛋白質の機能の監視に制限される。イオンチャンネルに直接カップリン グされない少量の他の蛋白質を検出することは難しく、それらの技術、例えば発 現プロフィーリングおよび免役組織化学の指標が存在して個々の細胞内で潜在的 に制御される。 最近、Sano et al.，1992 Science，258:120-122は、イムノポリメラーゼチェ イン反応（イムノ−PCR）と呼ばれる抗原検出技術を記載した。この方法は、蛋 白 質を検出するための極限の感度の方法を提供する。イムノ−PCRにおいては、DNA および抗体の両者に特異的な結合親和性を有するリンカー分子を用いて、マーカ ーDNA分子を特異的に抗原−抗体複合体に付加させ、即ち特定の抗原−抗体−DNA 配合体（conjugate）の形成をもたらす。付加したマーカーDNAは適切なプライマ ーを用いてPCRにより増幅できる。特定のサイズのPCR産物の存在は、マーカーDN A分子が特異的に抗原−抗体複合体に付加することを証明し、それにより抗原の 存在を示す。Sano et al.，1992に記載されるとおり、抗原をマイクロタイター プレートの表面上に固定化して、次にイムノ−PCRにより検出する。この技術を 用いて、アルカリホスファターゼ配合ELISAの約10⁵の感度の増大が得られた。イ ムノ−PCRの感度の利点は、マウス抗リポプロテインIgG(Ruzicka et al.，1993 Science，260:698-699)；ヒトプロトオンコジーン蛋白質(Zhou et al.，1993 Nu cleic Acids Res.，21:6038-6039)；および腫瘍壊死ファクターアルファ（Sanna et al.，1995Proc．Natl．Acad．Sci.，92：272-275）に関するアッセイにおい て続いて確認された。 より最近の報告は、イムノ−PCR技術の進歩を記載する。例えば、Joerger et al.，1995 Clin．Chem.，41(9):1371-1377）は、二本鎖DNA標識を直接抗体に付 加させて配合試薬がアッセイ前に調製されるのを可能にすることを証明する。Su zuki et al.，1995 Jpn．J．Cancer Res.，86:885-889は、２つのモノクローナ ル抗体を利用する二重決定基イムノポリメラーゼチェイン反応（二重決定基イム ノ−PCR）と呼ばれる方法を記載するが、該方法は抗原をサンドイッチして、特 定のDNA分子をマーカーとして用いる。抗原自体の代わりに、循環抗体に結合す る一次モノクローナル抗体を固定化して、ビオチン化二次モノクローナル抗体を 抗原に結合させ、そして遊離のストレプトアビジンを用いてビオチン化DNAを二 次モノクローナル抗体に付加させる。抗原−抗体−ストレプトアビジンと複合し たビオチン化DNAをPCRにより増幅して、産物をサザンブロット分析により分析す る。この技術は伝統的な蛋白質検出法を越える利点、たとえな感度の増大を提供 するが、いくつかの注目に値する制限がまだ存在する。例えば、ポリメラーゼチ ェイン反応の使用は定量的でない。PCRを用いてマーカー配列を増幅することに より稀に生じる蛋白質を検出することができるが、この増幅は抗原濃度10倍の差 異に関して 定量的ではない。即ち、シグナル量と存在する蛋白質量の間に直接の相関はない 。イムノ−PCR法は、特定の細胞における抗原の存在を検出することを困難にさ せる固有の制限も有する。これは、特定の細胞種、例えばニューロンにおいて発 現された抗原がアッセイされる場合に特に関連性がある。さらに、これらの検出 技術は溶液または組織に存在する蛋白質をアッセイできるのみであり、しばしば 細胞種の混合物である。 したがって、半定量的であって、且つ特定の細胞に関して正確な蛋白質プロフ ィールを提供することができる、容易に適用可能な感度の高い検出法に関する要 求が存在する。発明の概要 本発明の目的は、イムノRNAにより、選択された蛋白質を検出する方法を提供 することである。この方法においては、選択された蛋白質を標的とする一次抗体 を固相に固定化する。固定化された一次抗体を有する固相を、次に、選択された 蛋白質に接触させて、その結果、選択された蛋白質を固定化抗体に結合させる。 次に、固相を、選択された蛋白質を標的とする二次抗体にカップリングさせたRN Aプロモーター推進cDNA配列に接触させて、その結果、二次抗体は、固相上の固 定化された一次抗体に結合した、選択された蛋白質に結合する。細胞中の選択さ れた蛋白質の量を、次に、結合したプロモーター推進cDNA配列を検出する増幅Ｒ ＮＡ技術により測定する。 次に、選択された蛋白質の量は疾患の存在と相関させることができる。例えば 、一つの態様において、本発明の方法を用いることにより単一の細胞例えばニュ ーロン中のtau蛋白質のレベルを測定することができた。tauの上昇したレベルは アルツハイマー病と相関した。したがって、本発明の方法は、疾患、例えば限定 されるものではないがアルツハイマー病の診断において有用である。 発明の詳細な説明 増幅されたRNA（aRNA）の合成として知られる技術が開発されて、プローブと しての用途のため(Melton et al.，1984 Nucl．Acids Res.，12:7035-7056)、イ ンビトロ翻訳の研究のため(Krieg and Melton，1984 Nucl．Acids Res.，12:705 7-7070)、合成オリゴヌクレオチドの生成のため(Milligan et al.，1987 Nu cl．Acids Res.，15:8783-8798)、および富裕性の低いメッセージの検出のため に(Sarker and Sinner，1989 Science，244:331-333；van Gelder et al.，1990 Proc．Natl．Acad．Sci.，87:1663-1667；Carpenter et al.，1993 Clin Chem. ，39(9):1934-1938；Eberwine et al.，1992 Proc．Natl．Acad．Sci.，89:30-1 0-30-14；およびMuckler and Eberwine，1993 Mol．Pharm.，44:308-315)、過去 数年間利用されてきた。 aRNA合成の技術は、稀なメッセージの検出のためにおそらくはより効果的に当 業者により利用されてきた。一般に、この方法の第１工程はRNAポリメラーゼプ ロモーター例えばT7またはSP6のプロモーターを用いて5'において伸長合成され るオリゴ（dT）プライマーを合成することを含む。このオリゴヌクレオチドを使 用することにより、cDNA合成のためのポリ（A+）mRNA集団をプライミングさせる ことができる。第１鎖cDNAが合成された後、第２鎖cDNAを作成して、RNAヌクレ アーゼ処理によりRNAを分解し、そしてT4 DNAポリメラーゼ処理により平滑末端 分子を生成する。この二本鎖cDNAは次に、RNA合成を指示するために、取り込ま れたRNAポリメラーゼプロモータ一を利用することによる増幅に使用することが できる。この種の技術を用いて合成されたaRNAは、集団中に存在する最初のメッ セージを量的に代表する(van Gelder et al.，1990 Proc．Natl．Acad．Sci.，8 7:1663-1667)。 この方法は、単一細胞レベルにおける特定のmRNAの発現プロフィールをアッセ イするのにさらに洗練された。Eberwine et al.，1992 Proc．Natl．Acad．Sci. ，89:30-10-30-14。この技術の変更物を用い、ラット脳の規定された領域から短 時間で分離した細胞へ、パッチピペットを用いてプライマー、ヌクレオチドおよ び逆転写酵素をマイクロインジェクションすることにより、規定された単一細胞 からのmRNAを同定した。パッチクランプレコーディングピペットを普通に使用す ることにより、（イオンチャンネル機能に関する）細胞の脱分極に応答した電流 の変化を監視および記録する。この方法を用いることの第１の利点は、cDNA合成 を指示する成分が含まれた環境（即ち、細胞およびパッチピペット）においてmR NAと即座に接触するように利用されることである。これは、mRNAからcDNAへの変 換の効率を高めるように作用する。２ラウンドの増幅は出発物質の10⁶＞の増幅 に十 分であり、ラットの海馬細胞の発現プロフィールの分析に十分である。さらに、 パッチピペットと共にaRNA技術を用いることにより、いくつかの以前は未同定で あった海馬細胞のmRNAも検出した。これらのmRNAsのほとんどは、極めて低いコ ピー数のメッセージであるらしく、組織から単離される場合に個々のmRNAsの希 釈により通常は検出できない。この技術を用いたこれらの稀なメッセージの検出 は、aRNA方法の感度を証明する。 修飾されたaRNA技術が蛋白質の同定における使用のために開発された。本発明 の方法は、単一細胞レベルにおける蛋白質の同定において特に有用である。イム ノ−aRNAと呼ぶこの新規な方法は、同等にされたmRNAレベルの変化と蛋白質の存 在の間の関係を正確に相関させることができる。この方法において、興味のある 蛋白質、即ち選択された蛋白質の第１のエピトープを標的とする一次抗体を４℃ におけるインキュベーションにより固相に固定化する。付加されなかった一次抗 体はバッファーで洗浄することにより固相から除去する。固定化された一次抗体 を含むこの固相を次に選択された蛋白質と接触させ、選択された蛋白質を固定化 一次抗体に結合させる。次に、固相を、興味のある選択された蛋白質の第２エピ トープを認識し且つRNAプロモーター推進cDNA配列に共有カップリングされた二 次抗体に接触させて、二次抗体を、固相上に結合した選択された蛋白質に結合さ せる。二次抗体にカップリングさせたプロモーター推進cDNA配列は、次に、結合 した選択された蛋白質の存在を検出するためにaRNA増幅において使用される。aR NA合成は当業界において公知の技術である。 当業者には公知の様々なRNAプロモーターおよびRNAポリメラーゼをこの方法に 用いることができる。配合された抗体のaRNA検出は標準蛍光法またはペルオキシ ダーゼ検出法よりも感度がよい。増加した特異性が生じるのは、蛋白質の別の領 域を認識する２つの抗体が蛋白質に相互作用してシグナルを検出するに違いない からである。 エピトープ特異性のための抗体の生成および選択は当業界においてよく知られ ている。生成された二本鎖cDNAは、グルタルアルデヒドおよびエタノールアミン を用いて、延長されたインキュベーション期間、選択された抗体に付加させる。 抗体−DNA複合体は次の使用のために４℃において保存できる。 当業者にはよく知られている様々な固相をこの方法に用いることができる。限 定されないが、例は、シリコナイズされたパッチピペット、マイクロタイタープ レートおよびビーズを含む。しかしながら、好ましい態様においては、固相はパ ッチピペットからなる。この態様においては、一次抗体をコートしたピペットチ ップを用いて選択された蛋白質を含むサンプルを吸引する；一つの態様において は、個々の細胞から、別の態様においては血清から、または付加的な態様におい ては溶液からである。簡単にインキュベーションした後、ピペットチップを洗浄 してあらゆる非特異的結合蛋白質を除去して、DNA−二次抗体複合体をチップに 吸引する。この態様において、aRNAは次に例えばT7 RNAポリメラーゼ、３つの非 標識リボヌクレオチド、一つの³²Ｐ標識リボヌクレオチドおよびRNAsinを用いて 、パッチピペット中で転写される。インキュベーション後、反応物の一部をRNA 変性ゲルにて電気泳動する。ゲルを固定し、乾燥し、そしてＸ線現像のためのフ ィルム上に置く。標識RNA転写物の存在および量は存在する選択された蛋白質の 量の指標である。 本発明のイムノaRNA技術は、aRNA増幅の感度および正確性を取り入れることに より、少量の蛋白質−抗体複合体の検出を可能にする。一つの態様において、こ の方法は、T7プロモーター推進cDNA配列を二次抗体と共有カップリングさせるこ とにより標準蛋白質検出方法論よりも増加した感度を提供し、その結果、ヌクレ オチド配列がT7 RNAポリメラーゼを用いて増幅されうる。二本鎖cDNA鎖が、T7 R NAポリメラーゼの転写のための鋳型としての使用のために合成される。この基質 を生成するために、全脾臓RNAを出発物質としての使用のために単離する。オリ ゴ−dT−T7プライマーを加え、そして全RNA中に存在するポリ（A+）RNAへのアニ ールを許す。cDNAの第１鎖を単離して精製し、そしてT4 DNAポリメラーゼ、クレ ノー断片、T7オリゴ(dT)、およびdNTPsを加えてcDNAの第２鎖を合成するために 使用する。その結果の二本鎖cDNAを単離して精製する。 本発明の実験対照は、陽性対照、３つの陰性対照、および特異性に関する３つ の対照を含む。陽性対照は、架橋結合した抗体とDNAからなる。シグナルの存在 は、cDNA合成が成功してaRNA増幅工程が進行しうることを証明する。陰性対照を 、抗体−DNA複合体の非特異的結合および／または非特異的aRNA増幅の試験に用 いる。 それらは、抗原を加えない場合、固相、好ましくはパッチピペットを含み、抗原 の代わりにBSAを用いる場合、固相、好ましくはパッチピペットを含み、そして 抗体−DNA複合体を加えない場合(非特異的増幅)、固相、好ましくはパッチピペ ットを含む。単一の細胞内での抗原検出の特異性を評価するのに使用される対照 は、BSAのみでコートされた固相、好ましくはパッチピペットを用いた細胞の回 収；蛋白質でコートされていない固相、好ましくはパッチピペットを用いて回収 された細胞含有量；および細胞培地のみの回収（抗体を含むピペット）を含む。 選択された細胞中の特定の蛋白質の検出を提供する本発明の方法は、特定の細 胞種中の特定の蛋白質の発現に関連した疾患の迅速な診断において特に有用であ る。例えば、本発明の方法を用いることにより、単一の海馬ニューロン中に存在 するtau蛋白質を検出した。血液中のtau蛋白質の存在を検出する方法は、アルツ ハイマー病の臨床診断を確認するのに有用であるとして当業界において開示され る。例えば、米国特許第5,492,812号を参照されたい。したがって、単一細胞中 においてより迅速にtau蛋白質レベルを検出するための手段を提供する本発明を 用いることにより、疾患のごく初期の段階においてアルツハイマー病を診断する ことができる。この開示を読んだ当業者には明らかなとおり、しかしながら、本 発明の方法は、特定の蛋白質の発現に相関したあらゆる疾患の診断に用いること ができる。 以下の実施例は、例示の目的のみのために提供され、そして本発明を限定する ことを意図しない。 実施例 実施例１：オリゴヌクレオチド-dT-T7プライマーを利用した二本鎖DNAタグの調 製 T7 RNAポリメラーゼは二本鎖のプロモーター部位を要求するため、一本鎖オリ ゴヌクレオチドから二本鎖cDNAを生成した。全脾臓RNA（約９μg）を３分間95℃ において変性して、５分間氷上で冷却して、鎖が離れたままにした。約20μｇの オリゴ-dT-T7オリゴヌクレオチド（5'-AAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTAT GGGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'）(配列番号：１)を、１Ｘ逆転写酵素バッ ファー(50mM Tris塩基、pH7.5；120mM KCl；10mM MgCl₂)、10mMジチオスレイト ール、各250μMの４つのdNTPs、および0.5μlのRNAsin存在下で、100μgの全RNA に加えた。 混合物を37℃において10分間置いて、全RNA中に存在するポリA+RNAをオリゴヌ クレオチドにアニールさせた。AMV−逆転写酵素（1.2U/μl）を加えて、反応物 を37℃において60分間インキュベートしてcDNA第１鎖を合成した。インキュベー ション後、一本鎖cDNAをフェノール抽出して沈殿させた。cDNAの第２鎖は、0.05 U/μlのT4 DNAポリメラーゼおよび0.05U/μlのクレノー断片を用いて、１Ｘ KFI バッファー(20mM Tris塩基、pH7.5；10mM MgCl₂；５mM NaCl；５mM DTT)、各250 μＭの４つのdNTPs、および5ng/μlのT7オリゴd(T)24存在下で合成した。14℃に おける16時間のインキュベーション後、二本鎖cDNAをフェノール抽出して沈殿さ せた。 実施例２：二本鎖cDNAタグのTau−１抗体への付加 tau-１抗体（100μg）を、精製された二本鎖cDNAタグ（10μg）に加えた。等 量の0.1％グルタルアルデヒド（EMグレード）を10μlアリコートにて以下の添加 後に混合しながら加えた。抗体とcDNAを室温において３時間時々撹拌しながらイ ンキュベートした。1/20容量の１ＭエタノールアミンpH７を加えて、混合物をさ らに２時間室温においてインキュベートした。抗体−DNA複合体は次の使用まで ４℃に保存した。 実施例３：パッチピペットの調製 キャピラリー管（0.8-1.10Ｘ100mm、キマックスプロダクツ）をシリコナイズ してパッチピペット中に引っ張った(pulled)。精製していないtau-46（１μl） をピペットのチップ中に引っ張り、そしてピペットを４℃において一晩置いて、 抗体をチップ内部に付加させた。ピペットを３回リン酸緩衝塩（PBS）で洗浄し て４℃において必要となるまで保存した。 実施例４：組換えTau蛋白質とTau-1/DNA複合体の付加 組換えtau蛋白質（１μg）をピペットチップの中に流し(drawn)、４℃におい て30分間インキュベートした。ピペットを３回PBSで洗浄して、２μlの抗体/DNA 付加（約40ngのDNA）をピペットチップ中に流した。ピペットを４℃において30 分間インキュベートした。２回目のインキュベーションの後、ピペットを３回PB Sで洗浄して、ピペットのチップを壊してエッペンドルフチューブの底に入れた 。 実施例５：aRNA増幅 T7 RNAポリメラーゼ（100U/μl）を用いて、1ＸRNA増幅バッファー(40mM Tris -塩基、pH7.5，7mM MgCl₂；10mM MgCl₂；２mMスペルミジン)；５mMジチオスレイ トール；250μMのATP，UTP，GTP；12.5μMのCTP；30μCiのα-³²Ｐ-CTP；および 0.5μlのRNAsin存在下において、aRNA合成によりタグの増幅を実施した。反応混 合物を37℃において４時間インキュベートした。１／５の反応物をRNA変性ゲル （１％アガロース／ホルムアルデヒド）にのせて、50ボルトにて２時間電気泳動 した。ゲルは10％トリクロロ酢酸中に１時間、30分後に溶液を代えて浸した。ゲ ルをパラフィルム上において３Ｍワットマンペーパーを上にかぶせてペーパータ オルでそれを乾燥させた。ゲルを一晩乾燥し、Ｘ線フィルム上に３時間置いて24 時間露出した。増幅産物は陽性対照およびサンプル中に存在したが、陰性対照中 には存在しなかった。 実施例６：単一細胞中のTau蛋白質の検出に適用されるイムノ−aRNA 前記５つの実施例中に記載されたとおりの方法を用いて、単一の細胞から蛋白 質を回収した。用いた細胞は、初期培養（３週間）のラットの海馬ニューロンで あった。それらを当業界において知られている方法により抗体をコートしたパッ チピペットで細胞上に集めて(patched)、細胞含有物をピペット中に吸引した。 残りの方法は前記実施例中に記載されているとおりである。様々な対照を実施し て、技術の特異性を保証し：１）BSAでコートしたパッチピペットを用いた細胞 の回収、２）蛋白質がコートされていないパッチピペットを用いて回収された細 胞含有物、３）細胞培地のみの回収（Abを含むピペット）を含む。これらの対照 は、反応の特異性を示す。個々の細胞において観察された広い範囲のaRNAは、こ れらの細胞がtau蛋白質を含むことを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 ロジャーズ，ロリ アメリカ合衆国ペンシルバニア州19104, フィラデルフィア，サウス・フォーティフ ィフス・ストリード 1008，アパートメン ト ２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の工程： （ａ）選択された蛋白質を標的とする一次抗体を固相上に固定化し； （ｂ）選択された蛋白質に固相を接触させて、選択された蛋白質を固定化一次抗 体に結合させ； （ｃ）選択された蛋白質を標的とする二次抗体に共有カップリングさせたRNAプ ロモーター推進cDNA配列に固相を接触させて、二次抗体を固相上の結合した選択 された蛋白質に結合させ、そして （ｄ）結合した二次抗体に共有カップリングしたプロモーター推進cDNA配列を増 幅RNA技術により検出すること からなる、イムノ−aRNAにより選択された蛋白質を検出する方法。 ２．T7プロモーター推進cDNA配列を二次抗体に共有カップリングさせる、請求 項１記載の方法。 ３．選択された蛋白質がtauである、請求項１記載の方法。 ４．細胞中の選択された蛋白質の検出が疾患の存在と相関する、請求項１記載 の方法。 ５．疾患がアルツハイマー病である、請求項４記載の方法。